EA010571B1

EA010571B1 - Способ диагностики немелкоклеточного рака легких и набор для его осуществления

Info

Publication number: EA010571B1
Application number: EA200701894A
Authority: EA
Inventors: Тамара Дмитриевна Машкова; Нина Юрьевна Опарина; Ольга Леонидовна Зиновьева; Евгений Павлович КОПАНЦЕВ; Татьяна Викторовна ВИНОГРАДОВА; Марина Валерьевна ЗИНОВЬЕВА; Ирина Борисовна Зборовская
Original assignee: Институт Молекулярной Генетики Российской Академии Наук (Имг Ран)
Priority date: 2006-08-15
Filing date: 2006-08-15
Publication date: 2008-10-30
Also published as: EA200701894A1; WO2008024009A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии. Предложен способ диагностики немелкоклеточного рака легких, основанный на определении уровня транскрипции гена TIMP3, а также набор для его осуществления. Сниженный уровень транскрипции в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легких. Предложенное изобретение позволяет с высокой достоверностью диагностировать немелкоклеточный рак легких, включая плоскоклеточный рак, в том числе на самой ранней стадии прогрессии опухолевой трансформации.

Description

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для ранней диагностики немелкоклеточного рака легких, включая плоскоклеточный рак.

Уровень техники

Рак легких остается одной из основных причин смерти онкологических больных в мире. Смертность от рака легких превышает смертность от рака молочной железы, толстой кишки и простаты, вместе взятых (1еша1 А., 8теде1 К., \Уагй Е., Миггау Т., Хи 1., 8т1да1 С., Тйип М.1. 2006. Сапсег зСШзйсз, 2006. СА Сапсег 1. С1ш. 56, 6-30). В России показатели смертности от рака легких у мужчин 68,2 случая на 100 тысяч населения, у женщин - 6,8 случая (Заридзе Д.Г. 2004. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований, стр. 29-85 - в кн. Канцерогенез/под ред. Д.Г. Заридзе. М.: Медицина). Различают два основных вида рака легких (РЛ): мелкоклеточный (МРЛ) и немелкоклеточный (НМРЛ), составляющих 15-20 и 75-80%, соответственно. К НМРЛ относят плоскоклеточный рак легких (ПРЛ), аденокарциному легких (АКЛ) и крупноклеточный рак. Среди разных форм рака легких по частоте встречаемости ПРЛ занимает первое место, АКЛ - второе.

Диагноз в половине случаев НМРЛ устанавливают на далеко зашедшей стадии опухолевого процесса, что делает малореальным радикальное излечение. Современные методы лечения повышают среднюю пятилетнюю продолжительность жизни больных НМРЛ не более чем на 15%. Этот показатель может быть существенно улучшен только с помощью разработки методов ранней диагностики.

Основными методами диагностики рака легких служат инструментальные - рентгеновские и эндоскопические. Используют также анализ мокроты на атипичные клетки, биопсию ткани легких, компьютерную томографию, флуоресцентную фиброскопию. Иммунологические методы диагностики находят пока ограниченное клиническое применение. Практическую значимость имеет определение опухолевых маркеров: СЕА - раково-эмбриональный антиген - онкомаркер рака прямой кишки, но может использоваться в оценке рака легких; Ν8Ε - нейрон-специфическая энолаза - в ряде случаев используют в оценке состояния пациентов с раком легких; тканевой полипептидный антиген (ТРА) - фрагмент цитокератина, более специфичный маркер рака легких. Эти маркеры применяют для контроля лечения, выявления рецидивов, но не для диагностики РЛ на ранней стадии. Для диагностики НМРЛ широко используют маркеры 8СС - антиген плоскоклеточной карциномы и фрагмент цитокератина-19 (СУРКА 21.1) (Раз1ог А., Мепепйех К., Сгешайез МЛ., Раз1ог V., Ь1ор1з К., Ахпаг 1. 1997. Эхадпозйс уа1ие о£ 8СС, СЕА апй СУРКА 21.1 ш 1ипд сапсег: а Вауез1ап апа1уз1з. Еиг Кезри 1. 10, 603-609; Виссйеп С., ТогсЫо Р., Ретдпо Ό. 2003. Сйшса1 Ес.|щуа1епсе о£ Т\со СуЮкегайп Магкегз ш №п-зта11 Се11 йппд Сапсег. А 81ийу о£ Т1ззие Ро1урерййе Апйдеп апй Су1окега1ш 19 РгадшеШз. Сйез1. 124, 622-632), но они также малопригодны для ранней диагностики РЛ.

Диагностическими признаками злокачественной трансформации клеток могут служить также изменения генома в опухолевых клетках - точечные мутации в кодирующих и регуляторных участках генов, микросателлитная нестабильность, аллельные потери, изменение уровня транскрипции или трансляции генов, метилирование промоторных участков гена и др. В отличие от белковых, молекулярно-генетические маркеры обладают значительно большей чувствительностью. Рак легких сопровождается изменением функциональной активности многих генов. В числе перспективных потенциальных маркерных генов, вовлеченных в канцерогенез разных форм НМРЛ, рассматривают ген Т1МР3 (Кейипеп Е., АпШ1а 8., 8еррапеп 1.К., Када1ашеп А., Ейдгеп Н., Ьшйзйош I., 8а1оуаага К., Мззеп А.М., 8а1о 1., Майзоп К., Но11теп 1., Кпиий1а 8., \У|ктап Н. 2004. Э|ПсгепЦа11у ехргеззей депез ш поп-зта11 се11 1ипд сапсег: ехргеззюп ргоГШпд о£ сапсег-гекИей депез т зцпатопз се11 1ипд сапсег. Сапсег Сепе1. СуЮдепек 149, 98-106; Эаттапп К., 81гипшкоуа М., 8сйадйагзигепдт и., Каз1ейег М., Раргйх М., Найепйогз! и.Е., НоГтапп Н.8., 8йЬег К.Е., Вигйасй 8., Напзеп С. 2005. СрС 1з1апй те1йу1айоп апй ехргеззюп оГ 1итопг-аззос1а1ей депез ш 1ипд сагстота. Еиг. 1. Сапсег. 41, 1223-1236).

Тканевый ингибитор металлопротеиназы 3 - Т1МР3 - участвует в межклеточных взаимодействиях и индукции апоптоза, может подавлять рост многих опухолей, включая НМРЛ, ангиогенез, прорастание и метастазирование (Эгупйа А., Опах Р.Н., №шпапп М., уаи йег Ьаап \У.Н.. Рар С., Эгуийа 8., Мешеске I., Кекоте 1., Nеитаии ^., Ншхтда Т.^., №-штапп М., Кошд ^., Рар Т. 2005. Сепе 1гапзГег оГ йззие 1пЫЬйог о£ те1а11орго1етазез-3 геуегзез 1йе шЫЬйогу еГГес1з о£ ТМ-а1рйа оп Раз-шйисей арор!оз1з т гйеита1о1й аййгШз зупоу1а1 йЬгоЬ1аз!з. 1. 1ттипо1. 174, 6524-6531). Инактивацию гена наблюдали при раках шейки матки, ободочной и прямой кишки, предстательной железы, а также при НМРЛ, включая ПРЛ (Вгаеск1 ^.М., СготЬасй 1., \Уеш А., Кискей 8., Рогхпег М., Э|е1та1ег ^., Китте1е Р., Сгопег К.8., ВохЬегдег Р., Кйсйпег Т., НойепЬегдег ^., Найп Е.С., 1ппд А. 2005. А11ега(1опз т 1йе йззие 1пй1Ьйог о£ те1а11орго1етазе-3 (Т1МР-3) аге Гоипй Ггесщепйу ш йитап со1огес!а1 Штоигз Й1зр1ау1пд еййег Ш1сгоза1е11йе з!аЬййу (М88) ог 1пз1аЬ1Н(у (М81). Сапсег Ьей. 223, 137-42).

Ген Т1МР3 относят к потенциальным генам-супрессорам опухолевого роста. Потеря активности таких генов происходит в результате точечных мутаций, аллельных делеций, гомозиготных делеций или гиперметилирования СрС-островков генов, особенно в промоторных областях (Вейпзку 8.А., К1шде Э.М., Эеккег Ι.Ό., 8шйй М.^., Воск1аде Т.1., СШйапй Ρ.Ό., Сго\\'е11 К.Е., Кагр Ό.Ό., 8йй1еу С.А., РюсЫ М.А.

- 1 010571

2005. Сепе ргото!ег те!йу1айоп ίη р1азта апб зриШт шсгеазез \νί11ι 1ипд сапсег пзк. С1т. Сапсег Кез. 11, 6505-6511). Для гена Т1МР3 с использованием, в основном, методов иммуногистохимического окрашивания и иммуноблоттинга выявлено изменение количества соответствующего белка при НМРЛ (Кейипеп е! а1., 2004, зирга). Следует отметить, что транскрипционная активность этого гена в норме и опухолях остается малоизученной, хотя с диагностической точки зрения существенную роль при выборе кандидата на роль диагностического маркера играет высокая стабильность образующегося транскрипта.

Потеря транскрипционной активности при НМРЛ показана для нескольких генов. В работе (ТегаисП К., 8Ытаба 1., Иека^а Ν., Уао1 Т., Магиуата Μ., РизЫк1 8. 2006. Сапсег-аззоаа1еб 1озз оГ ТАК8Н депе ехргеззюп ш Ыитап рптагу 1ипд сапсег. 1. Сапсег Кез. Сйп. Опсо1. 132, 28-34) выявлено уменьшение транскрипции гена ТАК8Н, одного из генов, связанных со старением клеток, в опухолевых клеточных линиях и образцах НМРЛ по сравнению с нормой. На основе полученных результатов авторы выдвинули предположение о возможном использовании этого гена в качестве биомаркера для диагностики НМРЛ. Однако в данной работе проведен анализ только 8 образцов ПРЛ, наиболее распространенной формы РЛ. Данный аналог наиболее близок по технической сущности заявленному изобретению и принят за прототип.

Из изложенного ясно, что в данной области существует настоятельная потребность в поиске нового диагностического маркера НМРЛ, позволяющего достоверно и уже на самых ранних этапах диагностировать заболевание, и в разработке на его основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики немелкоклеточного рака легких.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа уровня транскрипции гена Т1МР3 в опухолевых тканях легких различного типа и на разных этапах их злокачественного перерождения и неожиданного открытия того факта, что уже ранние стадии развития злокачественной трансформации сопровождаются значительным снижением уровня транскрипции гена Т1МР3.

Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к новому маркеру для диагностики немелкоклеточного рака легких, который представляет собой уровень транскрипции гена Т1МР3. Сниженный уровень в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легких.

В одном из воплощений рак легких, маркером которого является уровень транскрипции гена Т1МР3, является плоскоклеточным раком легких.

В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению уровня транскрипции гена Т1МР3 в качестве маркера для диагностики немелкоклеточного рака легких человека.

В одном из воплощений рак легких, в отношении которого уровень транскрипции гена Т1МР3 служит в качестве диагностического маркера, является плоскоклеточным раком легких.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики немелкоклеточного рака легких. Данный способ включает следующие стадии:

а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани;

б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;

в) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;

г) нормирование концентрации кДНК Т1МР3 по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке легких;

д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена Т1МР3 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров;

е) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК Т1МР3 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень транскрипции гена Т1МР3, причем уменьшение транскрипции гена Т1МР3 служит диагностическим признаком рака легких.

В одном из воплощений заявленный способ предназначен для диагностики плоскоклеточного рака легких.

В одном из воплощений способа изобретения на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(ДГ)-содержащих праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.

В следующем воплощении способа настоящего изобретения для амплификации кДНК на стадии д) используют олигонуклеотидные праймеры, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.

В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность праймеров

- 2 010571 представлена 8ЕС ΙΌ N0: 1 и 2.

Еще в одном воплощении способа настоящего изобретения на стадии д) количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена ΤΙΜΡ3 представляет собой полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени или стандартную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

В одном воплощении заявленного способа на стадии г) в качестве контрольного гена используют ген ΟΑΡΌΗ, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3, имеющих последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 1 и 2.

Перечень фигур

Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и фигуры, где фиг. 1 показывает результаты подбора условий определения уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3 в образцах тканей легких. Электрофоретическое разделение в агарозном геле продуктов ПЦР (размер 279 п.н.), полученных после 27, 30 и 34 циклов, проводили в 1,8% агарозном геле. М - маркер молекулярных масс ДНК (ДНК плазмиды рВК222/А1и1);

фиг. 2 показывает результаты ОТ-ПЦР-анализа уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3 при ПРЛ с центральной локализацией опухоли (после 30 циклов). Номера образцов указаны над дорожками. Т - опухоль, N - условная норма (прилежащие к опухоли ткани). Ν1-Ν3 - норма. Ген ΟΑΡΌΗ (28 циклов ПЦР) использовали как внутренний контроль. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 1,8% агарозном геле.

Осуществление изобретения

Данное изобретение обеспечивает новый генетический маркер для диагностики немелкоклеточного рака легких и основанный на определении уровня транскрипции этого маркера простой, надежный способ диагностики НМРЛ на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Достоверно обнаруживаемое различие в транскрипции гена ΤΙΜΡ3 в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения рака легких.

Образцы ткани легких для анализа

В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при бронхоскопии с прямой биопсией (центральный рак легких) и трансторакальной (чрескожной) пункции опухоли (периферический рак).

Выделение РНК из образцов ткани легких

Способы выделения суммарной РНК из образцов ткани млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1% агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков ткани можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например 0шш М1хег или М1сго-О18тешЬга1ог и фирмы 8аг1опи5 (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков (8атЬгоок 1., Ггйьсй Е.Г., Машайк Т., Мо1еси1аг С1ошпд. А 1аЬога1огу Мапиа1. 2пб Ебйюп еб. 1989, Со1б 8рппу НагЬоиг: С8НЬ Ρ1Ό55). Широко используют также метод с использованием реагента Тпхо1 (СШСО/ЬгГе Тес11по1още5). Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как игибитор ΚΝΑδίη плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.

Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; В№а8у кйь (О|ауеп); 8У То1а1 ΚΝΑ [8о1аНоп 8у§1ет, Бготеуа (США) и т.д.).

Чтобы исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК, применяют различные приборы, например ОшскСепе-810 (ЫГе 8аепсе, Япония). Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм). Это позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.

Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов ткани легких, и ее перевод в двуцепочечную форму

Процесс обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет от нестабильных молекул РНК перейти к более стабильным молекулам ДНК и амплифицировать с помощью полимеразной цепной ре

- 3 010571 акции до количеств, необходимых для детекции. ОТ-ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК (на уровне 1 нг), а, следовательно, и количество исследуемой легочной ткани, из которой выделяют РНК.

Реакцию обратной транскрипции можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (М-МЬУ), вируса миелобластоза птиц (АМУ), Ро\\'сгЗепр1 (точечная мутация М-МЬУ-ЯТ), С. ТНегш Ро1утегаке и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Тйеттик 1йетторЫ1и8 (Т1Н). обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Мп²⁺.

Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:

1) олиго(бТ),-содержащие праймеры, которые связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3'конце мРНК (число п обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(бТ)-последовательности часто добавляют на З'-конце нуклеотиды А, С или С, чтобы заякорить праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;

2) случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки), которые гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с прочной вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК;

3) гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олиго(бТ)-содержащими праймерами;

4) специфические олигонуклеотидные праймеры, которые используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.

Анализ транскрипции генов можно проводить, используя одноцепочечную или двуцепочечную и амплифицированную кДНК. Для синтеза второй цепи и ее амплификации наиболее часто используют специфичные праймеры. В продаже имеются наборы для синтеза кДНК, основанные на применении различных обратных транскриптаз и различных праймеров для затравки. Для получения кДНК разработан также ЗМАЯТ- метод (8\\'Цс1ипд тесйашкт а! Не 5' епб оГ КИА Гетр1аГек оГ геуегке ГгапкспрГаке), в основе которого лежит свойство обратных транскриптаз добавлять на З'-конец синтезированной первой цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно бС. Эта олиго(бС)-последовательность служит местом отжига олигонуклеотидного адаптера, имеющего комплементарную олиго(бС)-последовательность на З'-конце. Обратная транскриптаза воспринимает праймер как продолжение РНК-матрицы и продолжает синтез первой цепи (Зс1ишб1 ^.М., Мие11ег М.\У. 1999. СарЗе1есГ: а ЫдЫу кепкйтуе теГйоб Гог 5' САР-берепбеп! еппсйтеШ оГ Ги11-1епд(Н сЭЫА т РСК-теб1аГеб апа1у818 оГ тКИАк. Ыис1е1с Ас1бк Кек. 27, е31). Таким образом, первая цепь кДНК оказывается фланкирована с одной стороны последовательностью З'-праймера с олиго(бТ) на З'-конце, а с другой - последовательностью, комплементарной адаптеру. Эти праймеры имеют одинаковые внешние последовательности, отличаясь только на З'-конце. Затем первую цепь амплифицируют в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части З'-праймера и адаптора. Нуклеотидную последовательность общей части этих праймеров подбирают в зависимости от дальнейших целей, например получения клонотек, применения вычитающей гибридизации и т.д. В результате получают двухцепочечную ДНК, обогащенную полноразмерными последовательностями. За счет использования адаптера с заблокированным З'-концом достигается существенное снижение фоновой амплификации. При использовании модифицированного ЗМАВТ-метода за короткое время происходит амплификация исходного материала более чем в 10⁵ раз, поэтому можно работать с очень небольшими количествами РНК (меньше 1 нг), а, следовательно, и с небольшим количеством исследуемой ткани (Ζ1ιιι Υ.Υ., МасЫебет Е.М., СйепсЫк А., Ь1 К., ЗйеЬеП Ρ.Ό. 2001. Кеуетке ГгапкспрГаке 1етр1а1е 8\уЦс1ипд: а ЗМАК.Т арргоаск Гог Ги11-1епд111 сЭЫА ЕЬтату сопПгисбоп. ВюЮскшдиек З0, 892-897). Наборы для получения кДНК этим способом выпускают различные фирмы, например Евроген, Россия (набор МЮТ), С1ои1есй, США и т.п.

Анализ уровня транскрипции гена Т1МРЗ с помощью ПЦР

Используя первую или вторую цепь кДНК как матрицу, коммерчески доступную от широкого спектра производителей термостабильную ДНК-полимеразу (например, Тад, РГи, ТГ1, ТГй, Тта и т.д.) и специфические праймеры, сайты для которых расположены в представляющем интерес транскрипте, проводят стандартный, полуколичественный ПЦР, в котором амплифицируемый фрагмент транскрипта детектируется простым гель-электорофорезом, или количественный ПЦР в реальном времени. Выбор специфических праймеров осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области. Для подбора праймеров и температур отжига целесообразно использовать коммерчески доступные программы или программы, находящиеся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть ОНдо (версия 6.42), РптетЗе1есГ из пакета Еакетдепе (\ν\ν\ν.бηа8ιа^.сот). Рптет Ртет1ет 5, рптеткЗ (Ьбр://Ггобо;ет1.тй.еби/сд1-Ь1п/рг1тегЗ/рг1тегЗ_тетете.сд1С), ЕакуЕхопРптег (\Уи X., Мипгое Ό.Ι 2006. ЕакуЕхопРптет: Аи1ота1еб Рптет Эе81дп Гог Ехоп Зедиепсек. Арр1. ВютГогтайск. 5, 119-120), ЕхРптег

- 4 010571 (ЗапбНи Κ.8., Асйагуа Κ.Κ. 2005. ЕхРпшег: ΐο άοδίβη рптеге Ггот ехоп-ехоп )υηοΙίοη5. ВютГогтабск. 21, 2091-2092), Рег1Рптег. РаЧРСК (1Шр://\у\у\у.Ыосеп1ег.11е15тк|.П/Ы/Ргодгат5/Га51рсг.1ит). РптегЦпеЧ (1Шр://5СЙоо15.|Шк1а.сот/Рптегс.|ие51/). С учетом сложности анализируемого генома длина праймеров может быть выбрана в диапазоне от 18 до 25 п.н.

С целью упростить процедуру осуществления способа для целей клинического анализа и обеспечить максимальную сохранность содержащейся в образце РНК, необходимо свести к минимуму манипуляции с образцом ткани, которые потенциально могут приводить к разрушению РНК. В этой связи в одном из предпочтительных вариантов получения препарата РНК в данном изобретении не используют ДНКазу, свободную от РНКазы. При этом праймеры для ПЦР подбирают таким образом, чтобы они специфически гибридизовались с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК. Этого можно достигнуть, например, путем подбора праймеров к разным экзонам гена Т1МР3. При использовании геноспецифичных праймеров, комплементарных участкам разных экзонов, длина продукта ПЦР, амплифицированного с примесной геномной ДНК, будет значительно больше длины ожидаемого продукта ПЦР, амплифицированного с кДНК. Если хотя бы один из подобранных праймеров перекрывает границу между экзонами, примеси геномной ДНК не будут влиять на результаты реакции амплификации.

В предпочтительном воплощении используют праймеры

Т1МР3_Р (5ЕЕ) ΙΌ N0: 1) 5'-АССАТСААССАСАТСААСАТСТАСС-3' и

Т1МР3_В (5ЕЕ) ГО N0: 2) 5'-АСТТСАТСТТССАСТТАСААСССА-3'.

Специалисту в данной области будет понятно, что могут быть подобраны и другие пары праймеров, различающиеся, например, по своей длине, по своей локализации относительно последовательности транскрипта гена Т1МР3, которые будут обеспечивать специфическую и эффективную амплификацию фрагмента транскрипта гена Т1МР3 даже в присутствии примеси геномной ДНК.

Количественная оценка уровня транскрипции достигается с помощью параллельного проведения ПЦР с тестируемым транскриптом и контрольным/стандартным транскриптом. В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось нормирование продуктов амплификации исследуемого гена Т1МР3, выбран ген домашнего хозяйства - САРЭН, кодирующий глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназу. Экспрессия генов домашнего хозяйства (йоикекеертд депек) во всех клетках одинакова. Для гена САРЭН в случае НМРЛ показан наименьший разброс уровней транскрипции в нормальных и опухолевых тканях. (ТОЛУ. Ьш, 8.Т. СНеп, Н.Р. Ьш. Сйоюе оГ епбодепеоик соп!го1 Гог депе ехргекщоп ίη попкшаП 1ипд сапсег. 2005. Еиг. Кекрй. 1. 26, 1002-1008.)

Для анализа уровня транскрипции генов может быть использована не только стандартная ПЦР, но и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). В отличие от стандартного метода, где фиксируются только конечные продукты реакции, ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченные олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации, поэтому позволяет наблюдать накопление амплифицированных фрагментов в экспоненциальной фазе реакции, что увеличивает чувствительность метода. Зонд, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента, содержит на концах флуорофор и тушитель. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности Тац-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ может осуществляться в соответствии со стандартными рекомендациями производителя приборов для ПЦР-РВ. Если отсутствует необходимость мультиплексного анализа нескольких генов одновременно, экономичной альтернативой может быть система, использующая специфический к двухспиральной ДНК краситель ЗУВК Сгееп, интенсивность флуоресценции которого возрастает в реальном времени пропорционально увеличению количества ампликонов. В таком варианте можно использовать праймеры без зонда.

Для проведения ПЦР в реальном времени различными фирмами разработаны амплификаторы, например АВ1 Ргып 7000 Зецнепсе Эе1ес11оп ЗуЧет фирмы АррНеб ВюууЧепъ (США), СНгото4, МшЮрйсоп или 1Сус1ег 1Ц5 М1 КекеагсН (Вю-К.аб), а также отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология), АНК32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, Ы1р://тетете.8уп1о1.гц/ргобис1апк.Ыт) и т.д. Применение ПЦР-РВ позволяет также уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики. Процесс продолжается 2-3 ч (50 или 60 циклов ПЦР, соответственно) и включает одновременное проведение ПЦР, детекцию флуоресцентного сигнала, обработку данных и их представление в графическом виде (полной кинетической кривой) с помощью специального программного обеспечения. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения процесса и не требуют дополнительно очистки и анализа продуктов ПЦР. В качестве основного метода измерения уровня транскрипции генов обычно выбирают сравнительный метод (метод относительных измерений, ВЦ-метод), основанный на относительном измерении количества исследуемых полинуклеотидных последовательностей, позволяющий проводить двойное сравнение результатов - для контрольных и целевых генов, а также для нормальных и опухолевых образцов кДНК.

Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные при

- 5 010571 меры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения. При этом должно быть понятно, что изобретение не ограничивается этими описанными воплощениями. Напротив, предполагается, что оно включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.

Пример 1. Образцы тканей легких.

Анализировали 29 пар образцов легочных тканей (опухоль - условная норма) пациентов с НМРЛ: 25 пар образцов ПРЛ (19 образцов с центральной локализацией опухоли и 6 с периферической) и 4 пары образцов АКЛ. За условную норму принимали гистологически нормальные ткани легких, взятые из прилегающей к опухоли ткани ближе к краю резекции. Кроме того, использовали ткани легких, полученные постмортально от 10 человек, не имевших в анамнезе заболеваний раком (норма): 5 образцов, взятых в центральных областях легких, и 5 - в периферических областях. Средний возраст пациентов, среди которых 28 мужчин и 1 женщина, составляет 61 год (диапазон 34-76 лет). Диагноз в каждом случае устанавливали на основании результатов клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследований. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей ΤΝΜ, где Т Дцшот) - Т0-Т4 - категории, отражающие нарастание размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (поби1и8) - Ν0-Ν3 - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; М (шс1ак1ак1к) - М0-М1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации ΤΝΜ объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса. I стадия заболевания установлена у 6 больных, II - у 18, III - у 5. Признаков отдаленных метастазов не наблюдали ни у одного из пациентов. Никто из пациентов не подвергался до операции лучевой терапии и химиотерапии.

Пример 2. Выделение РНК из образцов тканей.

Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей. Образцы тканей гомогенизировали на приборе Мюто-ОйшсшЬтакт и (Зайотшк, Германия). Очистку РНК проводили стандартным методом с использованием гуанидинизотиоцианата и фенола с последующим осаждением этиловым спиртом (ЗашЬгоок с1 а1., 1989, кирга). Для удаления примесей гликопротеидов, которыми богаты ткани легких, использовали дополнительное осаждение РНК солевым раствором (С11отс/упкк| Р., Маскеу К. 1995. Моббтсабоп оГ 1Нс ТШ гсадсгИ ртоссбитс Гог 1ко1абоп оГ ΡΝΆ Ггош ро1укасс11апбс- апб рго1сод1усап-пс11 коигсск. Вю1сс11пк.|иск 19, 942-945). После солевого осаждения все препараты РНК очищали с помощью набора Япсаку М1ш кй (Цхадеп, США) согласно прилагаемому изготовителем протоколу. Такая трехэтапная процедура очистки РНК позволила эффективно избавиться не только от труднорастворимых осадков гликопротеидов, но и от низкомолекулярных РНК. Качество препарата РНК проверяли электрофорезом в 1% агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК определяли спектрофотометрически (ЗашЬгоок с1 а1., 1989, кирга).

Пример 3. Реакция обратной транскрипции.

Синтез первой цепи кДНК.

На матрице РНК, выделенной, как описано в примере 2, синтезировали одноцепочечную кДНК. Для получения кДНК использовали модифицированный ЗМАЯТ-метод (Ζ1ιι.ι Υ.Υ., МасЫсбст Ε.Μ., СНепсЫк А., Ы Я., 81сЬсг( Ρ.Ό. 2001. Ясусткс 1гапкспр1акс 1сшр1а1с к\\йс1ипд: а ЗМАЯТ арртоасй Гог Ги11-1спд(Н с^NА 11Ьтату сопк1гис0оп. Вю1сс11пк.|иск 30, 892-897), 2 нг-1 мкг суммарной РНК, праймеры

ЗМАЯТ (5'-АА6СА6Т66ТАТСААС6СА6А6ТАС6Сг6г6г0-3') и

СЭ8 (5'-А6СА6Т66ТАТСААС6СА6АОТАС(Т)зоК^-3'), и обратную транскриптазу Ро\\'сг8спр1 (С1ои1ссй, США).

Условия реакции.

Состав реакционной смеси, 10 мкл:

РНК, 1 мкг/мкл 1,0 мкл

Праймер ЗМАЯТ, 6 мкМ 2,0 мкл

Праймер СЭ8, 10 мкМ 1,0 мкл

Стерильная деионизованная вода 1,0 мкл

Прогревали пробу при 72°С, 3 мин и помещали в лед. Добавляли 5 мкл смеси:

Буфер (С1оп1есЬ) для построения 1-й цепи (5х) 2,0 мкл

6ΝΓΡ, 10 мМ 1,0 мкл

ОТТ, 20 мМ 1,0 мкл

Обратная транскриптаза Ро\\'сг8спр1 (С1оп1есЬ) 1,0 мкл

Инкубировали при 42°С, 60 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 65°С, 5 мин, добавляли 2 мкл 60 мМ ЭДТА и доводили объем пробы до 20 мкл.

Пример 4. Синтез второй цепи кДНК.

Для синтеза второй цепи кДНК и амплификации брали 1/10 часть от объема реакционной смеси, полученной в примере 3. Синтез проводили с помощью АбуаЩадс2 ΩΝΛ Ро1ушсгакс с праймером 5'АА0СА6Т66ТАТсАаС6СА6А0Т-3' согласно протоколу АбгаЩадс 2 РСЯ кй (Шокссй, Нс1бс1Ьсгд,

- 6 010571

Сегтапу).

Условия проведения ПЦР.

Состав реакционной смеси, 50 мкл:

ПЦР-буфер АбсаШаде 2 (С1оп1есй) (10х) 6ΝΤΡ, 2,5 мМ Праймер, 10 мкМ кДНК (одноцепочечная) АбсаШаде 2 ДНК-полимераза (С1оп1есй) Стерильная деионизованная вода

5,0 мкл 5,0 мкл 1,0 мкл 1,0 мкл 1,0 мкл 37,0 мкл

Условия амплификации:

95°С, 1,5 мин 95°С, 20 с; 65°С, 20 с; 72°С, 3 мин

1 цикл 14-17-20-23 цикла

Для каждого образца подбирали количество циклов, позволяющих получать одинаковое количество амплифицированного материала.

Пример 5. Подбор условий определения уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3 в образцах тканей легких. Протокол определения уровня транскрипции.

При подборе условий определения уровней транскрипции для амплификации двуцепочечной кДНК использовали геноспецифичные праймеры

ΤΙΜΡ3_Ε (НЕС) ΙΌ N0: 1) и

ΤΙΜΡ3_Κ (НЕС) ΙΌ N0: 2), которые были подобраны к разным экзонам гена ΤΙΜΡ3, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. В этих условиях примеси геномной ДНК не влияют на результаты амплификации.

Размер ПЦР-фрагмента составлял 279 п.н. Подбор условий проведения ПЦР осуществляли на нескольких образцах кДНК. Все праймеры подобраны с помощью программы Ρπιικγ Эекщпег. разработанной в ИМБ РАН. Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 67 мМ Трис-НС1, рН 8,8, 16,6 мМ (ΝΗ₄)₂δΟ₄, 0,1% ^^11-20, 2,5 мМ МдС1₂, 0,2 мМ каждого из 6ΝΤΡ, 0,1 мкг кДНК, 0,2 мкМ каждого из праймеров, 2 ед. активности ДНК-полимеразы Βίο-Τας (Ωίαΐαΐ Ь1б., Москва).

Условия проведения ПЦР.
Состав реакционной смеси, 25 мкл:
ПЦР-буфер (10х)	2,5 мкл
МдС1₂, 25 мМ	2,5 мкл
6ΝΤΡ, 10 мМ	0,5 мкл
Праймер ΤΙΜΡ3_Ε, 10 мкМ	0,5 мкл
Праймер ΤΙΜΡ3_Β, 10 мкМ	0,5 мкл
кДНК, 0,1 мкг/мкл	1,0 мкл
ΒίοΤ;·κ.\| ДНК-полимераза, 5 ед./мкл	0,3 мкл
Стерильная деионизованная вода	17,2 мкл
Условия амплификации:
94°С, 2 мин	1 цикл
94°С, 30 с; 56°С, 30 с; 72°С, 45 с	27, 30 и 34 цикла
72°С, 5 мин	1 цикл

Образцы кДНК нормировали по контрольному гену САБОН, кодирующему белок глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназу. Использовали праймеры, подобранные к разным экзонам гена САГОН, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами:

САОСН Е: 5'-ССАСΤСААСССАΤΤΤССΤС-3' и

САОСН И: 5'-ΤСССΤССААΤСАΤАΤΤССААСАΤ-3'.

Размер ПЦР-фрагмента составляет 139 п.н. Подбор условий проведения ПЦР осуществляли на нескольких образцах кДНК.

Условия амплификации:

предварительный прогрев при 94°С, 2 мин; 94°С, 30 с; 56°С, 30 с и 72°С, 30 с 72°С, 5 мин

28 и 30 циклов 1 цикл

ПЦР проводили на амплификаторе Мак1егСус1ег, ЕррепбогГ (Германия) с нагревающейся крышкой или амплификаторе Терцик, ДНК-технология (Россия). Продукты амплификации анализировали в 1,8% агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромида этидия (см. фиг. 1). В результате были подобраны оптимальные условия ОТ-ПЦР (27-30-33 циклов), при которых получали линейную зависимость между числом циклов и

- 7 010571 количеством продуктов ПЦР. Все реакции амплификации повторяли трижды.

Интенсивность флуоресценции полос после электрофоретического разделения продуктов ПЦР оценивали количественно с помощью программы для денситометрии фотографий СеиеРгоД1ег (1Шр:/Лу\у\г/8сапа1уйс8.сот) и выражали в виде значений относительной интенсивности норма/опухоль (Ν/Τ).

Амплифицированные фрагменты гена ΤΙΜΡ3 клонировали в векторе рСЕМ®-Т Еаку (Рготеда) и секвенировали. Их нуклеотидные последовательности полностью совпадали с последовательностями соответствующего фрагмента кДНК. Секвенирование проводили с помощью набора реактивов ΑΒΙ ΡΚΙ8Μ® В1дЭуе™ ТегштаЮг ν. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ΑΒΙ ΡΒΙ8Μ 3100-Атап1.

Пример 6. Определение уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3 в образцах нормальных и опухолевых тканей.

Протокол определения уровня транскрипции.

1. Приготовить тайег-пйх, смешав все компоненты ПЦР, кроме матрицы. Майег-тйх следует готовить из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца+1 дополнительная реакция объемом 25 мкл.

Состав реакционной смеси, 25 мкл:

ПЦР-буфер (10х) 2,5 мкл

МдС1₂, 25 мМ 2,5 мкл

6ΝΤΡ, 10 мМ 0,5 мкл

Праймер ΤΙΜΡ3_Ε, 10 мкМ 0,5 мкл

Праймер ΤΙΜΡ3_Β, 10 мкМ 0,5 мкл кДНК 1,0 мкл

ΒίοΤας ДНК-полимераза (Όί;·ι1;·ιΙ Ь1б., Москва), 5 ед./мкл 0,3 мкл

Стерильная деионизованная вода 17,2 мкл

2. В пробирки на 0,6 мл (помеченные для проведения 30 циклов амплификации) добавить по 24 мкл так1ег-т1х.

3. Добавить в пробирки по 1 мкл матрицы, перемешать пипетированием несколько раз.

4. В отдельной пробирке (контроль) смешать 24 мкл таЧег-иих и 1 мкл стерильной деионизованной воды.

5. Добавить в каждую пробирку по 1 капле минерального масла (МР ВютебВаИ, ЬЬС) и закрыть крышки пробирок (если ПЦР проводили на амплификаторе Терцик, ДНК-технология). В том случае, если ПЦР проводили на амплификаторе Μι^ΚιΌλΌΓΓ ЕррепбогГ. масло не добавляли.

6. Поместить пробирки в амплификатор и провести 27 циклов реакции амплификации.

7. После завершения реакции амплификации отобрать 4 мкл продуктов амплификации (27 циклов), продолжить реакции амплификации еще на 3 цикла, отобрать 4 мкл (30 циклов) и смешать с 2 мкл краски 6х Огапде Ьоабшд Эуе. Таким же образом проводили реакции при 30 и 33 циклах. Наносили образцы на 1,8% агарозный гель, содержащий 0,5 мг/л бромида этидия. Также наносили на гель маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (использовали ДНК плазмиды рВВ222/А1иЕ производства Сибэнзим, Россия). Гель-электрофорез проводили в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л бромида этидия. Длина разделения составляет 3-5 см геля. После гель-электрофореза визуализацию продуктов амплификации и их документирование проводить в ультрафиолете при длине волны 302 нм.

Результаты анализа уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3.

Подсчет средних значений изменения уровней транскрипции исследуемых генов и стандартных ошибок проводили с помощью компьютерной программы 8Ρ88 13.0 (8Ρ88 Вс., США). Достоверность наблюдаемых изменений оценивали, исходя из нормального распределения данных. Данные считали достоверными при Р<0,05, где Р - показатель статистической значимости (достоверности) данных.

Нами показано, что в 76% образцов НМРЛ уровень транскрипции понижен в 3 и более раз в опухолях по сравнению с условной нормой (р<0,0001) (фиг. 2 и таблица). В 9 из 29 образцов транскрипция гена в опухолях практически отсутствует. В 2 образцах транскрипция гена не обнаружена ни в опухолях, ни в прилежащих к ним тканях. Отсутствие транскрипции гена в образцах ткани, смежной с дисплазией, но морфологически нормальной, показывает возможность распространения опухолевых клеток в нормальные клетки. В 6 образцах уровень транскрипции гена в опухолях приблизительно равен уровню в условной норме. Транскрипция гена обнаружена во всех 10 исследованных образцах нормальной легочной ткани. Связи между изменением уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3, гистологическими различиями и стадиями прогрессии опухоли не обнаружено, однако, в опухолях ПРЛ с периферической локализацией наблюдали меньшее изменение уровня транскрипции гена по сравнению с нормой, чем в образцах центрального ПРЛ (таблица). Возможно, что это связано с большей зависимостью развития центрального ПРЛ от курения пациентов, вредных условий их труда и других неблагоприятных факторов.

Настоящим изобретением также предусмотрено, что определение уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3

- 8 010571 будет полезным при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способом настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Повышение уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3 по ходу или по завершении курса лечения будет свидетельствовать о восстановлении активности гена-супрессора опухолевого роста ΤΙΜΡ3, что может говорить о положительных сдвигах при лечении. Понижение уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3 будет свидетельствовать о дальнейшем подавлении активности гена, что может говорить об отсутствии эффективности лечения.

Характеристика клинических образцов и изменение уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3 в образцах ПРЛ с центральной и периферической локализацией опухоли и АКЛ по сравнению с условной нормой

тип опухоли	№ образца	Описание опухолевых образцов	Изменение уровня транскрипции в опухоли по сравнению с условной нормой
ΤΝΜ	Стадия	Ороговение	ΤΙΜΡ3
центральный ПРЛ	4 9 80/05	Τ1Ν0Μ0	I	—
98/05	ΙΑ	+
21 26 497 300/05	Τ3Ν0Μ0	II	—

	6		пв
90/05	Τ2Ν1Μ0	пв	—
7	Τ3Ν0Μ0	II	+
13 15 77/05
5	пв
228/05	Τ3Ν1Μ0	III	—
290/05	+
466 14	Τ3Ν2Μ0
периферический ПРЛ	475	Τ1Ν0Μ0	I	—
2	Τ2Ν0Μ0	ΙΒ	—
451	Τ3Ν0Μ0	II	+
476	II	—
452	II	+
301/05	Τ3Ν1Μ0	III	+
АКЛ	311/05	Τ2Ν1Μ0	II	Н.Д.
304/05	Τ3ΝΟΜΟ	II	Н.Д.
406	II	н.д.
477	II	Н.д.

- 9 010571

Пояснения к таблице

О понижение (>3 раз) уровня транскрипции гена ΤΙΜΡ3.

уровень транскрипции не изменился или уменьшился незначительно (<3 раз).

отсутствие транскрипции в опухоли и в условной норме.

ΤΝΜ - клинико-морфологическая классификация опухолей:

Т0-Т4 - категории, отражающие местное распространение первичной опухоли;

Ν0-Ν3 - категории, отражающие различную степень метастатического поражения регионарных лимфатических узлов;

М0-М1 - характеризуют наличие отдаленных метастазов;

А - отсутствие метастазов;

В - поражение одиночных лимфатических узлов;

н. д. - нет данных.

Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенных в примерах со ссылкой на фигуры, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Список последовательностей <110> ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУК

ΙΝδΤΙΤυΤ ΜΟΙΈΚυΤΎΑΕΝΟΙ ΟΕΝΕΤΙΚΙ Κ088ΙΙ8ΚΟΙ АКАОЕМП ΝΑΙΙΚ <120> СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКИХ И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ <130> К06100200/44 <160> 2 <170> Ра1еп11п уегвюп 3.1 <210> 1 <211> 25 <212> ϋΝΑ <213> Аг11Г1С1а1 аециепсе <220>

<223> Ропуагй рптег Т1МРЗ_Г <400> 1 ассаСсаацс а§а1§аа§а1 еДасс 25 <210> 2 <211> 24 <212> ОМА <213> Аг11Г1с1а1 кеяиепсе <220>

<223> Реуегае рптег Т1МРЗ_К <400> 2 ас((§а!с(1 §са§Иасаа ссса 24

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ диагностики немелкоклеточного рака легких, включающий следующие стадии:

а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей гистологически нормальной (условно нормальной) ткани;

б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;

в) синтез одноцепочечной или двуцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонук

- 10 010571 леотидных праймеров;

г) нормирование концентрации кДНК Т1МР3 по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке легких;

д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена Т1МР3 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров, последовательность которых представлена 8ЕЦ ГО N0: 1 и 2;

е) сравнение количества амплифицированного фрагмента кДНК Т1МР3 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента кДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента кДНК отражают уровень транскрипции гена Т1МР3, причем уменьшение транскрипции гена Т1МР3 служит диагностическим признаком рака легких.
2. Способ по п.1, в котором рак легких представляет собой плоскоклеточный рак легких.
3. Способ по п.1, в котором на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олнго(бТ)-содержащих праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.
4. Способ по п.1, в котором на стадии д) количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена Т1МР3 представляет собой полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени или стандартную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
5. Способ по п.1, в котором на стадии г) в качестве контрольного гена используют ген САРИН, кодирующий белок глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу.
6. Набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения уровня транскрипции гена Т1МР3 в способе по п.1, имеющих последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1 и 2.