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PT88168B - Metodo de amplificacao selectiva de sequencias alvo de polinucleotideo - Google Patents

Metodo de amplificacao selectiva de sequencias alvo de polinucleotideo Download PDF

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PT88168B
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James L Burg
Philippe J Pouletty
John C Boothroyd
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Board Trustees The Leland Stan
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Description

TITULAR: BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JÚNIOR UNIVERSITY
EPÍGRAFE: MÉTODO DE AMPLIFICAÇAO SELECTIVA DE SEQUÊNCIAS
ALVO DE POLINUCLEOTÍDEO
MEMÓRIA DESCRITIVA >
Campo da Invenção
Esta invenção está relacionada com testes dia. gnósticos nos quais tem sido detectada a presença de um gene particular, quer para detecção do próprio gene ou pa. ra detecção do organismo que contém o gene, e está particularmente relacionada com técnicas nas quais o número de cópias do gene a ser detectado é enzimaticamente aumentado antes do processo de detecção. Além disso está relacionada com todos os processos que requerem a formação de muitas cópias de uma sequência específica de polinucleotídeo.
Antecedentes da Invenção
Têm sido desenvolvidos um número de testes diji gnósticos que se baseiam na detecção da presença de uma sequência particular de DNA ou de RNA, como uma indicação da presença de um analítico , por exemplo, uma bactéria, virus, ou defeito genético, numa amostra. Em alguns casos, o gene diagnóstico está presente em quantidades suficientes para ser directamente detectado, quer por hibridação, reacção com um anticorpo específico, ou por qualquer outro método. Contudo, se o gene em estudo está presen te numa pequena quantidade ou os antecedentes causados por sequências semelhantes presentes na amostra são suficientemente elevados, é difícil uma detecção segura e pre cisa do gene em alvo. Um resultado ambíguo não é satisf^ tório num teste diagnóstico.
Têm sido desenvolvidas várias técnicas para aumentar a sensibilidade e a especificidade deste tipo de processos diagnósticos. A amplificação do alvo pela cultura da célula, uma técnica eficiente mas demorada, tem sido desde há muito tempo o único método seguro. Outras técnicas aumentam a sensibilidade do sistema de detecção utilizando grupos sensíveis ligados ao padrão que combinará com o alvo. Exemplos de grupos sensíveis incluiriam moléculas radioactivas e fluorescentes. Os enz_i_ mas , tais como a peroxidase ou a fosfatase alcalina, un_i_ dos ao padrão, também melhoram a sensibilidade através da sua acção catalítica no substrato cromoforos. Também se pode obter maior sensibilidade através de uma amplificação dos grupos repórteres. Esta amplificação tem sido conseguida por interacções avidina-biotina, com rede de ácidos nucleicos, ou reprodução enzimática directa de um grupo repórter de RNA. Esta última técnica gera mais de 1.000.000 de.cópias de RNA em cerca de 12 minutos. Outra técnica amplifica a sequência alvo de ácido nucleico preferível aos grupos repórteres utilizados no sistema de detecção.
Um método de amplificação do ácido nucleico alvo é conhecido pela reacção em cadeia de polimerase ou técnica PCR, e tem sido desenvolvida para detectar os genes responsáveis por defeitos genéticos. Este método utiliza os iniciadores o 1igonuc1eotídeos específicos em ciclos repetidos de desnaturação do DNA alvo, enrolamento dos iniciadores em espiral, e extensão com uma polimerase de DNA.
A extensão dos produtos gerados a partir de um iniciador serve como sequências alvo adicionais para o outro inici_a dor. 0 grau de amplificação de uma sequência alvo é controlado pelo número de ciclos que são efectuados e é teoricamente calculado pela fórmula simples 2n, em que o n é o número de ciclos. Dado que a eficiência média por ciclo varia entre 65% a 85%, são necessários 25 ciclos para produzir 0,3 a 4,8 milhões de cópias da sequência alvo.
Apesar da reacção em cadeia da polimerase ser muito sensível e ser um método prometedor, há algumas limitações e desvantagens inerentes a esta técnica. Por exemplo, cada ciclo de reacção em cadeia da polimerase fornece, na melhor das hipóteses, apenas uma amplificação dupla, e assim é exigido um elevado número de ciclos (entre 20 e 30), para atingir uma amplificação substancial. Além disso, a desnaturação a alta temperatura que ocorre em cada ciclo PCR inactiva, geralmente, o enzima utilizado e, por isso, exige adições repetidas de enzimas dispe_n d i osos.
Consequentemente, as técnicas que aumentam a taxa de amplificação do gene (exigindo desse modo menos enzima e menos ciclos) seriam altamente vantajosas para todas as técnicas de diagnóstico que envolvem a detecção de uma sequência alvo específica de nucleotídeo, e qualquer outro processo que necessite de um número maior de polinucleotideos especificamente amplificados (RNA ou DNA)
Literatura Importante método PCR é descrito em muitas publicações, incluindo Saiki et a 1., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis of sickle cell anemia, Science ( 1 985) 230:1350-1354;
Saiki et a 1., Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes, Nature (1986) 324:163-166; e Scharf et al., Direct cloning and sequence analysis of enzymaU cally amplified genomic sequences, Science (1986) 233: 1076-1078. Veja-se na publicação de Pedido de Patente Europeia N9.0 200 362 A2 (Pedido N?. 86302298-4), publica do em 10 de Dezembro de 1986 que reivindica prioridade
para três Pedidos de Patente norte americanos: N9 de Série 716,975, depositado em 28 de Março de 1985; N9 de Série 791,308, depositado em 10 de Outubro de 1985; e N9 de Série 828,144, depositado em 7 de Fevereiro de 1986.
Resumo da Invenção
A presente invenção fornece um método para rápida multiplicação (através de um ciclo enzimático) de um número de cópias de uma sequência alvo de polinucleotídeo, alternando dois processos que fazem cópias a partir de um padrão alvo. Numa primeira série de fases é produzido um polinucleotídeo intermediário de cadeia dupla incluindo um promotor seguido pela sequência alvo. 0 intermediário de cadeia dupla é então usado num segundo processo para preparar múltiplas cópias de RNA, utilizando uma polimera se de RNA que se une à região promotora do intermediário de cadeia dupla. Cada cópia de RNA pode ser então uti l_i_ zada como uma sequência alvo, para dar início a outro cj_ cio de amplificação preparando uma segunda (ou mais) colecção de intermediários contendo um promotor de cadeia dupla, utilizando a transcriptase inversa. Por isso, o processo de invenção fornece uma técnica que multiplica i n vitro o número de cópias de uma sequência alvo de poH nucleotídeo, presente numa amostra mais rápida do que nos processos anteriores. 0 método é aplicado numa incorporporação específica para um teste diagnóstico, para Toxoplasma gondii.
Breve Descrição do Desenho
A presente invenção será mais bem compreendida fazendo referência à seguinte descrição detalhada da invenção, quando considerada em conjunto com o desenho que faz parte da Memória Descritiva, no qual:
A Figura é um diagrama esquemático mostrando polinucleotídeos presentes em diferentes fases do método da invenção.
Descrição das Incorporações Especificas A presente invenção fornece um método para mu_l_ tiplicar o número de cópias de uma sequência alvo de p£
1inucleotídeo, e sendo, por isso, particu 1armente útil em testes diagnósticos que pretendem reconhecer sequências específicas de polinucleotídeo que estão presentes em pez quenas quantidades numa amostra. E Também útil em qualquer método que beneficie da origem rápida da sequência específica de polinucleotídeos.
A sequência alvo de polinucleotídeo pode ser apenas uma fracção de uma molécula maior ou pode apresentar-se inicialmente como uma molécula discreta, de forma a que a sequência específica constitua todo o ácido nucle_i_ co. Não é necessário que a sequência alvo a ser amplific_a da se apresente Inicialmente numa forma pura. Pode ser uma fracção menor de uma mistura complexa, como uma porção de uma sequência de ácido nucleico devido a um microorganismo particular, cujo organismo constitui apenas uma fracção menor de uma amostra biológica particular sob análise.
A mistura de reacção inicial contendo polinucleotídeos pode conter mais do que uma sequência alvo, se se pretender. Por isso, o presente processo é útil não apenas para produzir grandes quantidades de uma sequência alvo de po1inuc1eotídeo específica, mas também para amplificar simultâneamente mais do que uma sequência alvo diferente situada na mesma, ou em diferentes moléculas de po 1 inucleotídeo. Se se apresenta mais de uma sequência alvo, a única alteração exigida da presente invenção é a de fornecer iniciadores (abaixo referidos) para cada sequência alvo desejada.
Qualquer sequência alvo de polinucleotídeo específica pode ser amplificada pelo presente processo. Só é necessário que um número suficiente de nucleotídeos, em ambas as extremidades da sequência, seja conhecido em pormenor suficiente para que dois uniciadores oligonucleo tídeos possam ser preparados como abaixo se descreve.
Quanto maior fôr o conhecimento 'acerca das bases de ambas as extremidades da sequência, maior pode ser a especificidade dos iniciadores para a sequência alvo, e, por isso, maior a eficácia do processo. Compreender-se-á que a p_a lavra iniciador, aqui usada, pode referir-se a mais de um iniciador, sobretudo no caso em que há alguma ambiguidade na informação, no que respeita à sequência ou sequê£ cias terminais do alvo a serem amplificadas. Por exemplo, quando uma sequência de ácido nucleico é deduzida de uma sequência proteica .conhecida, um conjunto de iniciadores contendo sequências que representam todas as variações possíveis do codão, baseadas na degeneração do código genético, será usado para cada cadeia. Um iniciador deste conjunto será homólogo com a extremidade da sequência alvo.
método começa pela preparação de um intermediá. rio polinucleotídeo de cadeia dupla que contém a sequência alvo, e contém, adicionalmente, um promotor situado a montan te da sequência alvo. Este intermediário de cadeia dupla é preparado por uma série de fases usando pequenos oligonucle£ tídeos como sequências iniciadoras, e estendendo-se iniciadores utilizando a maior cadeia de po1inuc1eotídeo à qual o iniciador se une como padrão. A cadeia alvo complementar é obtida num estado de cadeia simples (se não estiver já nessa forma) e é hibridado para uma sequência oligonucleotídea contendo uma sequência promotora a montante de uma sequência de ligação complementar a uma região na cadeia complementar em, ou perto da extremidade 3' da região alvo na cadeia com plementar. A sequência de ligação neste iniciador é substancialmente equivalente a uma sequência na molécula alvo polinucleotídea onde se encontra 5', para a sequência alvo específica sendo copiada, ou sendo na extremidade 5' da se quência alvo. Este iniciador é utilizado para iniciar a síntese de uma molécula de DNA, usando uma polimerase de DNA (como a transcriptase inversa) do mesmo sentido que l__ i
a cadeia alvo original.
Um segundo ol igonucleotídeo é então hibridado para esta nova cadeia sintetizada. Este segundo iniciador o 1igonucleotídeo é complementar a uma região correspondente à extremidade 3' da molécula alvo. 0 número de nucleotídeos entre as regiões iniciadoras é, de preferência, inferior a 300, e mais preferivelmente inferior a 200, mas superior a 10 e, de preferência, mais de 15. Quando o segun do iniciador é estendido formam-se uma cópia da sequência alvo e do primeiro iniciador. Por isso o produto daí resultante contém a região promotora 5' para a sequência alvo, isto é, o objecto desta primeira parte do método da iri venção.
po1inuc1eotídeo de cadeia dupla contendo o pro motor intermediário é então utilizado como um padrão para uma polimerase de RNA dependente de DNA, capaz de se ligar à região promotora que foi criada no intermediário. 0 enzima de polimerase copia a sequência alvo, produzindo desse modo múltiplas cópias de RNA da sequência alvo a juzante do promotor. 0 número de cópias produzidas depende do promotor, da polimerase de RNA usada, e das condições da reacção mas são imediatamente produzidas 10 cópias, e podem-se pre parar 100 cópias ou mais, seleccionando promotores fortes, polimerases de RNA activas e condições da reacção favoráveis.
Cada cópia de RNA pode ser usada como um padrão para produzir cópias adicionais do alvo específico. A reacção com o segundo oligonucleotídeo utilizado acima, a ex tensão do iniciador para dar a sequência complementar, a reacção com o primeiro iniciador, e extensão do híbrido resultante, em ambas as direcções (o primeiro iniciador actuando como iniciador para produzir a cópia alvo e o ter minai 3' da cadeia complementar actuando como iniciador, de forma a fazer-se uma cópia da região promotora), produ7 zirão um intermediário contendo um promotor de cadeia dupla semelhante, acima descrito, que foi utilizado como um padrão para preparar cópias de RNA. Os ciclos de pr_o dução de RNA utilizando a polimerase de RNA dependente do promotor podem então ser repetidos. Se são produzidas apenas 10 cópias de RNA por ciclo, 3 ciclos produzirão um aumento de 1000 vezes no número das sequências alvo, presente no meio de reacção. Se são produzidas 100 cópias de RNA por padrão, um milhão de cópias da sequência alvo serão produzidas por 3 ciclos.
método, como acima descrito, supõe a presença de um alvo polinucleotídeo de cadeia dupla incluindo uma cadeia alvo e uma cadeia complementar à cadeia alvo, ou a presença de uma cadeia alvo complementar se o alvo inicial é polinucleotídeo de cadeia simples, tal como o RNA. Se o alvo é inicialmente de RNA ou DNA, de cadeia simples, a cadeia alvo complementar pode ser preparada de forma semelhante à acima descrita, utilizando um iniciador oligonucleotídeo. Por exemplo, o segundo iniciador oligonucleotídeo acima descrito é complementar a uma região correspondente à extremidade 3' da molécula alvo. Pode-se usar este segundo iniciador ol igonucleotídeo, ou um iniciador diferente complementar a uma região 3' diferente para a sequência alvo, para preparar a cadeia comple mentar usada na primeira fase do processo. Outra variante é começar com o iniciador -ol igonucleotídeo que é compleme_n tar ãcadeia alvo (é preferível ao seu complementar). 0 in_i_ ciador contendo a sequência promotora é então hibridado para a cadeia complementar que é estendida a partir do primeiro iniciador
Os iniciadores oligonucleotídeos são seleccionados para serem substancialmente complementares às diferentes cadeias de cada sequência específica a ser ampH ficada.Isto significa que os iniciadores têm de ser suficientemente complementares para hibridar com as suas respectivas cadeias.
Por isso, a sequência iniciadora não precisa de reflectir a sequência exacta do padrão ao qual está ligada. Por exemplo, um fragmento nucleotídeo não complementar pode estar ligado à extremidade 5' do iniciador, sendo o restante da sequência iniciadora complementar â cadeia padrão. Com certeza, como acima se descreveu, um tal fragmento nucleotídeo não complementar será uma sequência promotora exigida pela invenção. Contudo, mesmo quando não está presente uma sequência promotora, outros fragmentos núcleo tídeos não complementares podem ser unidos. Por exemplo, uma sequência que produz um local de clivagem duma endonuclease de restrição pode permitir a preparação de sequências alvo amplificadas, prontas a serem inseridas num plasmídeo. Alternativamente, bases não complementares podem ser intercaladas na sequências de ligação do inicia, dor, desde que a sequência iniciadora tenha complementarie dade suficiente com a sequência da cadeia a ser amplificada (ou com a sua cadeia complementar) para com ela hibridar e formar um padrão para síntese do produto de extensão.
Por exemplo, um nucleotídeo simples pode ser substituido num iniciador de tamanho moderado (ex: cerca de 15 núcleo tídeos), a fim de produzir um local específico de clivagem de endonuclease de restrição.
Se se quizer, as sequências promotoras podem ser incluídas em ambos os iniciadores para multiplicar mais o número de cópias produzidas por um ciclo completo.
funcionamento do método de invenção pode ser imediatamente visto com referência à Figura e à descrição que se segue, mais pormenorizada. A numenclatura padrão e a orientação são usadas para os po1inuc1eotídeos de cadeia simples e dupla esquemáticos, demonstrados na Figura e na descrição seguintes. A extremidade esquerda da cadeia superior dos pol inucleotídeos de cadeia dupla é a extremj. dade 5', e a extremidade direita da mesma cadeia é a extremidade 3' (indicada por setas). Desde que as cadeias complementares tenham orientações opostas, a cadeia infe rior apresenta-se na sua extremidade 3' à esquerda, e na sua extremidade 5' à direita. Para evitar confusões a cadeia inferior é mostrada nesta orientação, mesmo quando não se apresenta como parte de um polinucleotídeo de cadeia dupla. Segue-se a mesma regra para sequências re feridas no texto (incluindo as reivindicações), nas quais as várias sequências são identificadas por letras e núme ros. Nem todos os produtos de cada etapa do processo es. tão mostrados; apenas estão ilustrados os que são relevantes para esta invenção.
Na primeira linha da Figura pode ser vista uma molécula polinucleotídea alvo de cadeia dupla, incluindo uma série de regiões , definida nas condições das operações que serão levadas a cabo nesta molécula durante as etapas posteriores. Como se discutiu anteriormente é fe_i_ to um alvo de cadeia dupla para a fase inicial, se o alvo original é uma molécula RNA (ou DNA) de cadeia simples Na extremidade 5' do polinucleotídeo há um segmento identificado como X1 que não será copiado nas operações poste riores. Este é seguido por um segmento da sequência P1 que compreende uma parte da sequência de um iniciador, utilizado numa fase posterior. A sequência P1 é seguida por uma sequência alvo T, que é a sequência a ser copiada. Uma sequência P2 que se liga com um iniciador diferente está presente na extremidade 3' do T. Podem estar presentes nucleotídeos adicionais depois de P2, mas não são copiados. Estes nucleotídeos estão designados na Figura por X2. Nem X1 nem X2 são necessários para o funi cionamento da presente invenção, e por isso estão facultativamente presentes, variando do número zero até várias centenas ou mesmo milhares de nucleotídeos. “Prime é uma designação que indica a sequência complementar presente na cadeia oposta. A molécula alvo de cadeia dupla é desnaturada na presença de um iniciador oligonucleotídeo, e, então, as condições alteram-se para permitir o enrolamento em espiral do ol igonucleotídeo e do alvo, c_o mo demonstrado na linha 2.
A linha 2 da Figura mostra um primeiro inici_a dor oligonucleotídeo, PR-P1 de estrutura complexa, mas incluindo a sequência P1 na sua extremidade 3', hibridado para o segmento P1' da molécula alvo desnaturada. A porção 5' deste iniciador oligonucleotídeo, PR, contém uma sequência que pode, na sua forma de cadeia dupla com preender um promotor funcional para uma polimerase de RNA A sequência PR pode conter nucleotídeos adicionais sem afectar negativamente a invenção. 0 iniciador PR-P1 é estendido por um enzima apropriado (seja uma polimerase de DNA dependente de DNA, para um alvo de DNA, ou uma polimerase de DNA dependente de RNA, para um alvo RNA e/ou DNA), para fornecer uma cadeia PR-P1-T-P2-X2, como representada na linha 3 da Figura. A natureza da cadeia simples da região promotora está designada na Figura, pela falta de contacto entre as duas cadeias nesta região e no texto da seguinte forma:
PR^
P1--T--P2--X2 X1»-P1’-T’-P2’-X2’.
Este (e outro) iniciador da invenção é, de preferência, relativamente pequeno. Isto é, 50 ou menos nucleotídeos, a fim de permitir uma rápida hibridação (enrolamento em espiral) e cíclica, sobretudo com equipamento automático.
Depois da desnaturação do polinucleotídeo de cadeia dupla, mostrado na linha 3 da Figura, um segundo iniciador da sequência P21 é adiccionado à mistura sob condições de enrolamento em espiral, como se pode ver na linha 4. A sequência P2' é equivalente à sequência P21 previamente identificada e, ela própria, é complementar ao seqmento P2 de PR-P1-T-P2-X2.
A linha 5 da Figura mostra o produto obtido da
I extensão da sequência iniciadora P21 no padrão apresenta do. A região promotora, nesta fase, é agora de cadeia dupla, e por isso pode ser usada para se ligar a uma pol_i merase de RNA dependente de DNA. No texto, este intermediário de cadeia dupla está escrito:
PR--P1--T--P2--X2 PR*-P1’-T’-P2'
As cópias produzidas pela polimerase de RNA são mostradas na linha 5 da Figura. Os segmentos copiados, todos a juzante da região promotora, são designados por P1 -T -P2R ( o R escrito em cima indica uma cópia de DNA).
Esta molécula de RNA pode ser a mesma ou um pouco maior ou menor que P1-T-P2, desde que contenha toda a sequência PR-P1 no, e depois do nucleotídeo inicial que é copiado pela polimerase de RNA. Se a cadeia alvo RR R original é um alvo DNA de cadeia simples, P1 -T -P2 é o RNA equivalente ao DNA original mais qualquer porção de segmento PR contendo o promotor, copiado pela polimerase RNA, ou menos qualquer nucleotídeo não copiado pela polimerase.
Se as cópias de RNA se destinam a serem recicladas para amplificação adicional, repetem-se as fases previamente discutidas para a preparação do intermediário de DNA de cadeia dupla contendo o promotor. Não é necessário utilizar os mesmos segmentos P1 e P2 1 iniciadores, ou o mesmo segmento promotor PR, apesar de o PR-P1 e P21 já estarem disponíveis e poderem ser usados sem alteração Se se usarem outras sequências iniciadoras, as cópias resultantes serão um pouco menores ou maiores que as primei ras cópias, mas isto não afecta negativamente a invenção, a menos que haja alguma necessidade ou alguma intenção de reter a sequência P1-T-P2 original. 0 enrolamento em espiral inicial, com um iniciador P21, seguida pela extensão do iniciador, produz o produto representado na linha da Figura. A desnaturação do intermediário de cadeia dupla e o enrolamento em espiral com o iniciador PR-P1 produz o produto mostrado na linha 8. Este intermediário pode ser estendido em ambas as direcções, desde que a sequência P1 actue como um iniciador usando a cadeia complementar como um padrão, e que a cadeia complementar actue como um iniciador utilizando a sequência pr como um padrão.
Se os mesmos iniciadores são usados nesta fase como foram usados nas fases indicadas desde a linha 1 â linha 5, então o produto será semelhante ao apresentado na linha 5, apenas diferindo na extensão da cadeia superior. Isto não afectará nenhumas polimerizações de RNA subsequentes, como apenas a inferior. A cadeia padrão é usada pela polimerase de RNA. Se forem usadas sequências iniciadoras diferentes, a cadeia padrão resultante pode ser maior ou menor dependendo dos iniciadores usados.
Desde que pelo menos um dos iniciadores utilizados nesta fase tenha na sua extremidade 5' uma sequência representando um promotor para uma polimerase de RNA, o material resultante continua a estar apto para outras amplificações Consequentemente, o intermediário de DNA de cadeia dupla contendo o promotor, da linha 9 da Figura, pode ser usado com a polimerase de RNA dependente de DNA, para produzir, novamente, múltiplas cópias de RNA.
Quando os iniciadores inicialmente usados hibridam com sequências involuntárias na mistura DNA coç tendo a molécula alvo, podem-se obter vantagens utilizaç do iniciadores diferentes quando se repete o ciclo. Por exem pio, se um nucleotídeo alvo particular é detectado numa análise bruta contendo muitas sequências pol inucleotídeas, tal como quando é detectada uma infecção bacteriana ou pç rasítica num fluido humano ou numa amostra de tecido, a hibridação dos oligonucleotídeos iniciadores com o hospe deiro DNA pode resultar numa amplificação de sequências hospedeiras involuntárias. Desde que uma sequência promotora esteja presente no material antecedente amplifica, do, um aumento significativo na quantidade de uma sequência antecedente específica é observado juntamente com o aumento na sequência alvo. A fim de evitar este proble: ma, podem ser usados iniciadores e/ou promotores diferentes durante diferentes ciclos para evitar a amplificação dos antecedentes. Por exemplo, uma região de ligação dj_ ferente (P1x e/ou P2,x) que se encontra dentro da sequêji cia alvo perto ou sobreposta na região de ligação do inj_ ciador original pode ser usada no segundo ciclo. Embora, podendo estar ligado a outras sequências polinucleotídeas antecedentes cuja amplificação não é desejada, é improvável que o mesmo material antecedente seja amplifj. cado. Os iniciadores usados nas fases consequentes podem ser descritos como sendo um conjunto ordenado de inj_ ciadores, se esta incorporação da invenção for continuada, desde que sucessivos pares de iniciadores sejam encontrados mais juntos nas cadeias complementares da molécula alvo. Os segundos (e sucessivos) ciclos também podem usar uma região promotora diferente (por exemplo:
PR ) que une uma polimerase de RNA diferente. A degradação da primeira polimerase de RNA permanece em solução seguida pela introdução de uma segunda polimerase que se liga ao PRX multiplicará as cópias alvo mas não as cópias antecedentes, apesar de poder surgir um grupo adicional de cópias antecedentes. Adicionalmente, iniciadores dos primeiros ciclos, que podem estar presentes em excesso, podem ser retirados se se quizer. Técnicas apropriadas para a remoção de iniciadores baseiam-se em características que os distinguem do alvo, como o tamanho ou a exis^ tência de iniciadores, como o DNA de cadeia simples, quari do o alvo está presente como DNA de cadeia dupla ou RNA. Por exemplo, a cromatografia em gel retirará pequenos iniciadores de alvos maiores, enquanto nucleases ou anticorpos específicos retirarão iniciadores de alvos de cadeia dupla.
Como um exemplo de utilização de, quer um co£ junto ordenado de iniciadores, ou de iniciadores difere_n tes com diferentes promotores, implica que num primeiro ciclo de amplificação a sequência alvo desejada seja mu_l_ tiplicada por um factor de cinquenta. Ao mesmo tempo, a ligação dos iniciadores a uma sequência antecedente dá-se de forma a que a sequência antecedente seja também mult_i_ plicada por um factor de cinquenta. Se o segundo ciclo de amplificação usa iniciadores ordenados, e se ocorre, outra vez, uma amplificação de cinquenta vezes, a sequência alvo será multiplicada por 2500, enquanto (na pior das hipóteses) haverá duas sequências antecedentes, cada uma multiplicada por cinquenta. Depois de três ciclos de iniciadores ordenados, o factor de multiplicação por alvo será de 125.000 com (na pior das hipóteses) três sequências antecedentes multiplicadas por cinquenta.
As fases individuais do método desta invenção são todas convencionais e podem ser levadas a cabo usando reagentes e técnicas conhecidos. Os únicos reagentes especia 1 mente designados são os iniciadores PR-P1 e P21. Contudo, estes segmentos podem ser imediatamente obtidos, ou por síntese total ou por isolamento das sequências desejadas de fontes naturais. A síntese total é mais facH mente praticada se as sequências P2 (e consequentemente a sua sequência complementar P2') e P1 forem identificadas na molécula alvo. A síntese total de segmentos DNA contendo sequências promotoras é prontamente concluída desde que as sequências promotoras tenham sido elas mesmas apresentadas. Se a sequência da molécula alvo não é conhecida, a molécula alvo pode ser segmentada por endonuc1eases de restrição ou outros processos e segmentos seleccionados para serem usados na invenção. A polimerase de RNA e a sua sequência promotora associada podem ser seleccionadas de várias fontes disponíveis destes com ponentes. Por exemplo, a polimerase de RNA T7 do bacteriófago T7 está disponível nos New England Biolabs. Ou15
Ή tras polimerases de RNA incluem SP6 do bacteriófago SP6, disponíveis nos New England Biolabs, ou K-12 de uma estirpe K-12 de _E. coli, que se encontra disponível no Sigman Chemical Compan.y, St. Louis, Missouri. Os promotores correspondentes podem ser isolados do organismo, a partir do qual a polimerase é obtida ou quimicamente sintetizada, onde é conhecida a sequência promotora.
Os outros reagentes bioquímicos usados no método da invenção incluiem um enzima capaz de estender sequências iniciadoras para formar polinucleotídeos de cadeia dupla. Tais enzimas incluem a transcriptase inversa e outras polimerases de DNA. Os enzimas particuiarmente preferidos são a transcriptase inversa AMV, do LifeScience Inc., ou a polimerase I (fragmento de Klenon), dos Bethesda Research Laboratories, Pharmacia, U.S. Biochemicals ou Biolabs.
As etapas individuais da presente invenção são facilmente adaptáveis ao automatismo. As reacções podem ser efectuadas num recipiente único, adicionando consequeji temente reagentes e alterando as condições, se necessário.
Geralmente as condições de desnaturação envolvem aumento de temperaturas, particuiarmente temperaturas que variam de 95°C a 100°C. 0 enrolamento em espiral e a extensão do iniciador dão-se a baixas temperaturas, tipicamente de 35°C a 50°C. Visto que muitas proteinas são desnaturadas juntamente com os polinucleotídeos nas elevadas temperaturas indicadas, podem ser adicionadas proteinas.adicionais se necessário. Outros reagentes presentes podem incluir tampões para ma_n ter a reacção no pH e condições iónicas apropriados, assim como trifosfatos mononuc1eotídeos (eventualmente rotulados ou modificados para fornecer um sinal detectável) a serem usados nas reacções de extensão.
Se se usarem temperaturas elevadas para desn_a turar polinucleotídeos de cadeia dupla, não há exigências )
.de separação dos reagentes ou soluções. Outras condições de desnaturação, tal como o uso de solventes, são menos desejadas por causa das etapas de separação acrescentadas, quando se passa das condições de enrolamento em espiral à desnaturação, e de volta às condições de enrolamento em espiral. Contudo, são conhecidas numerosas condições de desnaturação, enrolamento em espiral e extensão, e podem ser usadas se se pretender.
As múltiplas cópias das sequências alvo podem ser usadas de várias formas. Por exemplo, o método da invenção pode ser utilizado para preparar múltiplas cópias de um gene para se inserirem num plasmideo ou noutro alvo do processo de engenharia genética. Se utilizada num ensaio diagnóstico, para a sequência alvo, a etapa de detecção (hibridar com um padrão, reacção com um anticorpo ou com um ligando específico) pode ser realizada sem se isolar o alvo amplificado do meio de reacção, se os alvos padrão, anticorpo ou ligando estiverem na sequência T, i.e. não estiverem incluídos nas regiões iniciadoras ou promotoras. Pode-se seleccionar um alvo padrão nas regiões P1 e P2, mas é necessário a separação das cópias do gene alvo (p1-T-P2 ou P1R-TR-P2R) a fim de evitar a união ou interferência por moléculas iniciadoras. A ribose trifosfatos marcados (por exemplo, marcas radioactivos , marcas de biotina ou avidina) podem também ser usados nas etapas em que é produzido RNA. Outras aplicações adicionais dos produtos po 1 inuc 1 eotídeos gerados por esta inve_n ção incluiriam mutagénese, engenharia genética e clonagem, análise genética, terapia (terapia genética e quimioterapia), a produção de proteina (translacção in vitro e introdução em células), e quaisquer outros processos que beneficiam das múltiplas cópias das sequências polinucle^ tideas específicas. Por exemplo, podem ser produzidas moléculas reguladoras de RNA, em grandes quantidades.
Estando agora a invenção descrita na generali- 17 dade, será mais bem compreendida referindo os seguintes exemplos detalhados que são fornecidos apenas para ilustrar e não pretendendo limitar a invenção.
EXEMPLO
As técnicas da invenção foram avaliadas usando um gene cionado de Toxop1 asma gondi i, especificamente o gene antigene repetitivo trinta e cinco vezes identific_a do como gene B1. 0 gene indicado foi obtido de um patri_ mónio de DNA recombinado contendo suplementos de DNA genómico de T. gondi i (de uma estirpe RH). 0 património foi construido no vector de expressão lambda gt11 , e foi obtj_ do com antisera de um coelho imunizado. Os recombinados assim identificados foram subclonados e ainda caracterizai dos. 0 gene alvo usado nestes estudos foi detectado como parte de uma unidade 2.2 Kilobase-par (Kb) que é seguidamente repetida muitas vezes no genoma do T. gondi i. 0 mapa de identificação e de restrição deste gene tem sido publicado Boothroyd et a 1., Antigen and Tubulin Genes of Toxoplasma Gondi i11, em Molecular Strategies of Paras_i_ tic Invasion, de Ayabian et a 1, edições, UCLA Symposia, Vol. 42, pags 237-250, Alan Liss, Nova Iorque, 1987 ). A sequência nucleotídea de uma repetição completa tem sido determinada (mas não publicada). A porção da sequência relevante para este trabalho é abaixo reproduzida.
sistema de numeração utiliza medidas do local EcoRI, definindo a repetição no genoma. A sequência é apresentada como uma molécula de cadeia dupla, estando a cadeia superior na direcção 5'-3', da esquerda para a direita.
Os segmentos ol igonucleotídeos estam sublinhados na cadeia do mesmo sentido, e, por isso, da mesma sequência.
721
AAAAAATGTG GGAATGAAAG AGACGCTAAT GTGTTTGCAT AGGTTGCAGT CACTGACGAG TTTTTTACAC CCTTACTTTC TCTGCGATTA CACAAACGTA TCCAACGTCA GTGACTGCTC
OLIGO #0 OLIGO #1
781
CTCCCCTCTG CTGGCGAAAA GTGAAATTCA TGAGTATCTG TGCAACTTTG GTGTATTCGC GAGGGGAGAC GACCGCTTTT CACTTTAAGT ACTCATAGAC ACGTTGAAAC CACATAAGCG
OLIGO #2
841
AGATTGGTCG CCTGCAATCG ATAGTTGACC ACGAACGCTT TAAAGAACAG GAGAAGAAGA TCTAACCAGC GGACGTTAGC TATCAACTGG TGCTTGCGAA ATTTCTTGTC CTCTTCTTCT
OLIGO #3
Visto que o objectivo final da amplificação do gene era o do uso potencial do método num teste diagnóstico, o gene alvo foi testado para ver se se adaptava ao critério que persiste, necessário a um gene alvo para diagnóstico.
Isto significa que o gene alvo está presente em quase todas ou em todas as estirpes do parasita, não estando presente nos genomas de outros agentes infecciosos (especia_l_ mente nos que podem ser confundidos no diagnóstico), e não detectáveis no genoma do hospedeiro. Investigações preliminares mostram que o gene está presente em todas as estirpes do parasita testado e que não existe reactivida_ de cruzada com os genomas de outros organismos testados, incluindo os do hospedeiro humano.
Foi calculado um número de iniciadores para serem usados no método da invenção. Estes iniciadores são identificados por estarem sublinhados na sequência acima mencionada. Os iniciadores eram 20-40 nucleotídeos (incluindo a sequência promotora facultativa) em comprimento, mostrando homologia com a sequência alvo para enrolamento em espiral eficiente. Um resíduo de guanosina (G) ou citosina (C) estava presente na extremidade 3' de cada iniciador, para assegurar um emparelhamento de base eficaz, do qual poderia ocorrer a extensão. Os iniciadores foram seleccionados não excedendo os 150 pares de base entre os iniciadores complementares para cadeias opostas, de forma a que a extensão fosse eficiente e rápida. Os iniciadores foram ainda seleccionados por falta de capacidade para for mar estruturas de pares de base estáveis com outros iniciadores ou dentro de um iniciador simples que iria impedir o enrolamento em espiral de um iniciador, à sequência alvo. Ap_e sar de não ser essencial às fases de multiplicação, os iniciadores foram escolhidos.para flanquear os locais de restn ção convenientes, para facilitara clonagem e construção de p_a drões para o DNA interno amplificado (ex: um padrão específico para o produto amplificado, mas que não hibridaria para os iniciadores. 0 DNA interno amplificado é equivalente à secção T na descrição e reivindicações gerais.
As condições de reacção usadas para a origem do fragmento de cadeia dupla incluindo o promotor de po l_i_ merase de RNA T7 eram semelhantes às previamente descritas (Saiki et aI. , Nature ( 1 986 ) 324:163-166 ). 0 meio de reacção contido num volume de 100 p1, 10 mM de Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1,5 mM dNTPs, 1,5 |iM de iniciadores de oligonucleotídeos, e quantidades variáveis do alvo contendo DNA dependendo da experiência (de 0,15 pg a 1,0 pg).
Cada ciclo consistiu na desnaturação a 90°C durante 2 minutos (excepto para o primeiro ciclo, onde a desnaturação ocorreu durante 10 minutos), um rápido resfriamento no gelo seco por 5 segundos, uma rotação (para eliminar a condensação na parte superior do tubo), o enrolamento em espiral dos iniciadores a 35°C durante 2 minutos, a adição de duas unidades de fragmentos Klenow da polimerase I de E. coli, e a extensão a 35°C durante 2 minutos.
método da invenção foi ainda executado inclui£ do um promotor para a polimerase de RNA do bacteriófago T7 na extremidade 5' de um dos o 1igonuc 1 eotídeos alvo de gene específico (oligo #1 acima identificado). A sequência promotora T7 é TAATACGACTCACTATAGGG. Estes 20 nucleotídeos adicionais estavam incorporados nos produtos de DNA de cadeia dupla amplificados das fases iniciais para proporcionar produtos que são 20 bp maiores do que no caso de se utilizarem ol igonucleotídeos, os quais faltam nesta sequência. Por exemplo, o DNA amplificado usando oligos #1 e #2 é 117 bp, 20 bp maiores do que 97 bp do alvo incluindo a
Ή homologia em relação aos ol igonucleotídeos (e semelhança, com oligos #1 e #3, o produto foi 151 bp= 131 bp + 20 bp).
Estas sequências adicionadas funcionaram como um promotor eficiente para a polimerase de RNA T7. As reacções de transcrição T7 in vitro rea1izaram-se de acordo com as instruções do fornecedor da polimerase de RNA T7. 0 padrão DNA foi retirado directamente das reacções acima descritas (que incorporavam a região promotora) sem trat_a mentos posteriores. Um autoradiograma de RNA T7 transcritos que são gerados in vitro confirmou que eram 17 núcleo tídeos mais pequenos que o padrão de DNA. Por outras palavras, o produto intermediário de DNA de cadeia dupla de 151 pares de base originou um RNA de 134 nt, 131 nt de se quências alvo e 3 nt (GGG) da sequência promotora T7. Pela incorporação Q32P] -UTP no RNA transcrito, um aumento de aproximadamente 3000 vezes na sensibilidade do produto amplificado de detecção foi obtido, se comparado com a coloração do brometo de etídio.
teste da invenção foi especificamente designado para dar uma elevada actividade específica, uma ba_i_ xa produção de RNA, não representando, por isso, um aumento máximo molar de sequências alvo originado de uma transcrição T7. Sabe-se, contudo, que sob elevadas condições de produção, a polimerase de RNA T7 produzirá de entre 50 e 100 moléculas de RNA por molécula padrão de DNA (Davanloo et a 1., Cloning and expression of the gene for the bacteriophage T7 RNA polymerase, Proc. Nat 1 . Acad.
Sei. USA ( 1984) EM: 2035-2039 ).
processo foi efectuado utilizando vários ciclos de amplificação T7RT demonstrados na Figura e acima descritos. Este processo é referido até aqui como a técn_i_ ca T7RT, por conveniência. Este processo tem várias vantagens sobre o anterior método PCR. Em primeiro lugar, a sequência alvo a ser amplificada pode ser, quer RNA como DNA,
o que é importante se o gene seleccionado está altamente expresso, desde que a transcriptase inversa AMV possa usar quer RNA ou DNA de cadeia simples, como um padrão.
Isto também é relevante para aplicações nas quais as sequências alvo são exclusivamente de RNA, como para a detecção do retrovirus. Em segundo lugar, a amplificação de cada ciclo completo, incluindo ambas as sequências, deve ser mais alta que com a técnica PCR (mais de 100 por cj. cio Dara T7RT, comparado comum máximo de 2 por ciclo para a técnica PCR), permitindo, assim, um número reduzido de ciclos (3 ciclos para uma amplificação de 10θ vezes para T7RT, contra, pelo menos, 20-25 para PCR) e o uso correspondente de uma menor quantidade de enzima. Em terceiro lugar, gra£ des quantidades de RNA podem ser produzidas para serem utilizadas em qualquer processo, quando o RNA é preferível ao DNA, como a translação em proteína, instabilidade quí mica, etc.
As investigações iniciais do método T7RT util iram os mesmos ol igonucleotídeos e sequências alvo, como des. crito nas secções anteriores. Como indica a Figura, são usados dois enzimas sucessivamente para cada ciclo: transcriptase inversa AMV, e polimerase de RNA T7. Fases repetidas de desnaturação, enrolamento em espiral e extensão são realizadas por alterações da temperatura da amostra (90-100°C para a desnaturação, 37-41°C para o enrolamento em espiral), e a adição do enzima a uma amostra contendo ácido nucleico a ser amplificado, um tampão adequado (indicado por fornecimentos de enzima), NTPs e dNTPs, excesso molar de iniciadores ol igonucleotídeos, e um inibidor de RNase.
Numa primeira experiência, o fragmento gene inicialmente sintetizado para conter uma sequência promotora (como acima descrito), foi usado para demonstrar a pratic_a bilidade do processo T7RT. Primeiro o substrato DNA foi transcrito pela polimerase de RNA T7, o que se esperava
I produzir um produto de RNA de 134 nt. Este material foi depois convertido de novo num DNA cadeia dupla, como se descreveu e mostrou na Figura uti 1 izando a transcriptase inversa AMV, na presença de dNTPs radio marcados. 0 pro duto maior de DNA esperado (e obtido) foi também 134 nt, com uma pequena quantidade de^material de 151 nt presente devido à presença contínua de fragmentos de gene que entram. Uma amostra de controlo foi tratada de forma se melhante excepto no facto de ser omitida a polimerase T7. Seguindo esta fase da transcriptase inversa, foi realiz_a do um segundo ciclo de amplificação directa por AMV RT, em cada amostra. Isto resultou na síntese de quantidades substanciais do produto de 151 nt , pela síntese do produto 134 nt utilizando oligo #1 (que tem o extra de 17 núcleo tídeos de promotor T7, na sua extremidade 5') como o inj_ ciador. Como o material de 134 nt era cerca de 10 vezes mais abundante (depois de um ciclo T7RT) do que o produto de 151 nt da reacção controlada, a amplificação T7 correspori deu à obtida por cerca de 4,5 ciclos do método PCR isolado. Esta amplificação foi conseguida sem optimizar o processo T7RT, para que se obtivessem maiores melhorias na eficácia e custo do método PCR.
Todas as publicações e Pedidos de patentes me_n cionados nesta Memória Descritiva são indicativos do grau de aptidão dos peritos no ramo, ao qual esta invenção diz respeito. Todas as publicações e Pedidos de patente estão aqui incorporados como referência â mesma extensão, como se cada publicação individual ou Pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.
Estando agora a invenção totalmente descrita, será evidente para qualquer pessoa com conhecimentos do ramo que podem ser feitas muitas alterações e modificações sem nos afastarmos do espírito ou âmbito das reivindicações anexas.

Claims (15)

    REIVINDICAÇÕES
  1. (1) a hibridação duma molécula de polinucleotídeo de cadeia simples, de sequência X1'-P1'-T1-P21-X2 ', que é complementar a uma molécula alvo de sequência X1-P1-T-P2-X2, com um primeiro iniciador de sequência PR-P1 para formar:
    PR x
    P1
    X1 '-P 1 1 -T '-P21 -X21;
    (1) sequencialmente, a hibridação duma molécula alvo de polinucleotídeo de cadeia simples, sendo as sequências iniciadoras seguidas pela extensão dos tais iniciadores, e pela desnaturação, em que , pelo menos um desses iniciadores contém uma sequência pro motora para produzir um DNA intermediário de cadeia dupla, tendo uma sequência promotora a montante de uma sequência alvo, e (2) o aumento das cópias de RNA múltiplas, dessa sequêri cia alvo, a partir do dito intermediário, utilizando uma polímera, se de RNA capaz de ligar o dito promotor.
    1- Um método de multiplicação do número de cópias de uma sequência alvo de polinucleotídeo, num meio de reacção, caracterizado pelo facto de compreender:
  2. (2) a extensão duma cadeia complementar, para formar:
    PR
    P1--T--P2--X2 X1'_P1'_t1-P21-X2 1 , seguida da desnaturação, para formar uma primeira colecção de po1 inucleotídeos de cadeia simples;
    2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter/ zado pelo facto de compreender, além disso, (1) a preparação duma segunda colecção de intermediários DNA de cadeia dupla, possuindo uma sequência promotora, a montante, a partir da referida sequência alvo das ditas cópias de RNA, pela hibridação das ditas cópias de RNA, com as sequências iniciadoras estendidas e desnaturadas, e (2) o aumento das cópias de RNA múltiplas, a partir da dita segunda colecção de intermediários DNA de cadeia dupla.
  3. (3) a hibridação da dita primeira colecção de polinucle otídeos de cadeia simples, com um segundo iniciador de sequência P2 1 , para formar:
    PR-P1-T-P2-X2 Ρ21 ;
    3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter/ zado pelo facto da referida extensão compreender o contacto do d/ to meio de reacção com um enzima de transcriptase inversa.
  4. (4) a extensão duma cadeia complementar para formar:
    PR--P1--T--P2--X2 PR·-P1'-T’-P2' ; e
    4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter/ zado pelo facto do referido método compreender a hibridação da c_a deia invertida, duma molécula alvo de cadeia dupla, com um prime/ ro iniciador compreendendo uma sequência promotora, na sua extremidade 5', e uma sequência de ligação equivalente a uma sequência de cadeia não invertida 5', da molécula alvo, para a sequência a/ vo, a extensão duma primeira cadeia complementar, a partir do dito primeiro iniciador, utilizando a dita cadeia invertida como um padrão, desnaturada para formar uma primeira colecção de interme25 diários de po1inucleotídeo de cadeia simples, a hibridação da primeira colecção referida com um segundo iniciador que liga 3' à dita sequência alvo, na dita cadeia não invertida, a extensão duma cadeia complementar, a partir do segundo iniciador referido, utiH zando a dita primeira cadeia complementar como um padrão, para obter o dito intermediário de DNA de cadeia dupla, e o contacto do dito meio de reacção com uma polimerase de RNA capaz de ligar o d_i_ to promotor.
  5. (5) o aumento das cópias de RNA múltiplas de P1-T-P2,
    RR R tendo a fórmula P1 -T -P2 , utilizando uma polimerase de RNA capaz de ligar a região promotora de cadeia dupla
    PR
    PR1 ;
    em que:
    T é uma sequência alvo;
    T1 é uma sequência complementar a T;
    PR-P1 é um primeiro iniciador o 1igonuc1eotídeo , no qual PR compreende uma sequência promotora, e P1 é a sequência de ligação do primeiro iniciador referido;
    P11 é uma sequência complementar a P1;
    PR' é uma sequência complementar a PR;
    P21 é um segundo iniciador o 1igonuc1eotídeo ;
    P2 é uma sequência no alvo po1inuc1eotídeo , complementar a P2 ' ;
    X1 e X2 são sequências exteriores à sequência P1-T-P2, da referida molécula alvo, e podem, individualmente, estar presentes ou ausentes;
    X1 1 é uma sequência complementar a X1;
    Χ2' é uma sequência complementar a X2; e P1R-TR-P2R é uma molécula de RNA, em que P1R é uma
    R sequência equivalente a P1, T é uma sequência equivalente a T, e p
    P2 é uma sequência equivalente a P2.
    5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracter^ zado pelo facto de compreender:
  6. (6) hibridação das cópias de RNA múltiplas referidas, da
    RR R fórmula P1 -T -P2 , com o dito segundo iniciador, para formar:
    P1R-TR-P2R P2 1 ;
    6- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto do referido método compreender, além disso, as fases de:
  7. 7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterç zado pelo facto da referida molécula alvo de po 1 i nuc 1 eot í deo de c_a deia simples ser RNA.
    (7) extensão duma cadeia complementar, para formar:
    PlR_TR-P2R P11-T1-P2 ', seguida da desnaturação para formar uma terceira colecção de poH nucleotídeos de cadeia simples;
  8. 8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterç zado pelo facto da dita molécula alvo de po1inuc1eotídeo de cadeia simples ser DNA.
    (8) hibridação da terceira colecção de po1inucleotídeos de cadeia simples referida, com o referido primeiro iniciador, p_a ra formar:
    PR
    P11-T1-P21;
  9. 9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracter_i_ zado pelo facto da extensão compreender o contacto das sequências referidas, para que sejam estendidas com uma transcriptase inversa.
    (9) extensão das cadeias complementares, para formar:
    PR--P1--T--P2 PR 1-P1'-T'-P2' (10 ) repet ir a fase (5 ); e (11) facultativamente, repetir as fases (6)-(10), nas quais em cada ciclo de fases (6)-(10), cada PR-P1 e P21 de iniciador oligonucleotídeo representa o iniciador correspondente de um ciclo de fases precedente, ou um iniciador diferente do iniciador correspondente .
  10. 10- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterç zado pelo facto da dita polimerase de RNA ser uma polimerase de
    RNA T7.
  11. 11- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos ditos iniciadores compreenderem sequências de ligação de 10 a 30 nucleotídeos, em comprimento.
  12. 12- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos ditos iniciadores estarem separados por menos de 200 pares de base.
  13. 13- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracte29 rizado pelo facto da dita sequência promotora se encontrar no ter minai 5' dum iniciador.
  14. 14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da referida moléclula alvo de polinucleotídeo, de cadeia simples, ser DNA, sendo a extensão efectuada utilizando se a transcriptase inversa, e estando os ditos iniciadores presen tes no dito intermediário, separados em não mais do que 150 pares de base.
  15. 15- Um método de detecção duma sequência alvo de polinucleotídeo, numa amostra, caracterizado pelo facto de compreender:
    a multiplicação do número de cópias da dita sequência alvo, de acordo com a reivindicação 1, e a detecção da presença dessas cópias multiplicadas.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
IE72468B1 (en) * 1987-07-31 1997-04-09 Univ Leland Stanford Junior Selective amplification of target polynucleotide sequences
US6090591A (en) * 1987-07-31 2000-07-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
EP0359789B1 (en) * 1988-01-21 1993-08-04 Genentech, Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
JP2650159B2 (ja) * 1988-02-24 1997-09-03 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 核酸増幅方法
US5130238A (en) * 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
KR0148265B1 (ko) * 1988-12-16 1998-10-15 에프.지이.엠 헤르만스 자가-지속 서열 복제 시스템
US5112734A (en) * 1989-05-26 1992-05-12 Gene-Trak Systems Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
ATE466111T1 (de) 1989-06-02 2010-05-15 Pasteur Institut Nukleotidsequenzen des genoms von retroviren des typs hiv-1, hiv-2 und siv und deren anwendungen, insbesondere zur amplifikation von genomen dieser retroviren und für die in-vitro-diagnostik von durch diese viren ausgelösten infektionen
WO1990015881A1 (fr) * 1989-06-12 1990-12-27 Cis Bio International Procede de detection de sequences specifiques d'acides nucleiques et ses applications
FR2650839A1 (fr) * 1989-08-08 1991-02-15 Oris Ind Cie Procede de detection en phase homogene liquide de sequences specifiques d'acides nucleiques et ses applications
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
EP0731174B1 (en) * 1989-07-11 2004-11-17 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification methods
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
WO1991004340A1 (en) * 1989-09-20 1991-04-04 Cambridge Biotech Corporation In vitro, isothermal nucleic acid amplification
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
NO904633L (no) * 1989-11-09 1991-05-10 Molecular Diagnostics Inc Amplifikasjon av nukleinsyrer ved transkriberbar haarnaalsprobe.
IE65771B1 (en) * 1990-01-25 1995-11-15 Zeneca Ltd Amplification of nucleotide sequences using vectorette units
GB9002625D0 (en) * 1990-02-06 1990-04-04 Univ Singapore Human leukocyte antigen typing
US5194370A (en) * 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
US5707796A (en) * 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
FR2664290B1 (fr) * 1990-07-05 1993-01-29 Centre Nat Rech Scient Sondes genetiques specifiques de toxoplasma gondii, et leur utilisation pour la detection in vitro de toxoplasma gondii et pour le typage des souches toxoplasmiques.
US5162209A (en) * 1991-01-18 1992-11-10 Beth Israel Hospital Association Synthesis of full-length, double-stranded dna from a single-stranded linear dna template
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
DE4129653A1 (de) * 1991-09-06 1993-03-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis aehnlicher nukleinsaeuren
EP0648281A4 (en) * 1991-09-10 1997-06-04 Jack D Love TARGETED AMPLIFICATION OF DNA AND RNA AND SIGNAL AMPLIFICATION.
DE69214243T2 (de) * 1991-09-23 1997-02-06 Pfizer Verfahren für die Detektion von spezifische mRNS und DNS in Zellen
DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
DE4132133A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen herstellung von ribonukleinsaeuren
US5981179A (en) * 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US6100099A (en) * 1994-09-06 2000-08-08 Abbott Laboratories Test strip having a diagonal array of capture spots
JP4137996B2 (ja) * 1992-05-06 2008-08-20 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 核酸配列増幅方法，組成物及びキット
US5843640A (en) * 1992-06-19 1998-12-01 Northwestern University Method of simultaneously detecting amplified nucleic acid sequences and cellular antigens in cells
CA2167838C (en) * 1993-07-23 1999-11-23 Thomas B. Ryder Methods for enhancing nucleic acid amplification
FR2708288B1 (fr) 1993-07-26 1995-09-01 Bio Merieux Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé.
EP1251182A3 (en) * 1993-12-01 2002-11-27 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method of amplifying and detecting target nucleic acid sequence by using thermostable enzymes
JPH09510351A (ja) 1994-03-16 1997-10-21 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 等温鎖置換核酸増幅法
FR2724934B1 (fr) * 1994-09-26 1997-01-24 Bio Merieux Oligonucleotide chimere et son utilisation dans l'obtention de transcrits d'un acide nucleique
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
US5652126A (en) * 1995-06-07 1997-07-29 Gen-Probe Incorporated Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
US6436638B1 (en) 1996-05-09 2002-08-20 Metropolitan Water District Of Southern California Cryptosporidium detection method
US5770368A (en) * 1996-05-09 1998-06-23 Metropolitan Water District Of Southern California Cryptosporidium detection method
WO1997044488A2 (en) 1996-05-22 1997-11-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the detection of mycobacterium kansasii
JPH1028585A (ja) * 1996-07-16 1998-02-03 Toyobo Co Ltd 耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法
JP2000514307A (ja) * 1996-07-16 2000-10-31 ジェン―プローブ・インコーポレーテッド 増加した標的特異的ｔ▲下ｍ▼を持つ修飾オリゴヌクレオチドを用いた核酸配列の検出および増幅のための方法
US7070925B1 (en) * 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
US5838267A (en) * 1996-10-09 1998-11-17 Ericsson, Inc. Method and apparatus for encoding and decoding digital information
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
JP3968810B2 (ja) * 1997-01-24 2007-08-29 東ソー株式会社 核酸配列分析方法
EP1591541B1 (en) 1997-04-01 2012-02-15 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
US5786182A (en) * 1997-05-02 1998-07-28 Biomerieux Vitek, Inc. Dual chamber disposable reaction vessel for amplification reactions, reaction processing station therefor, and methods of use
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6429007B1 (en) * 1997-05-02 2002-08-06 BIOMéRIEUX, INC. Nucleic acid amplification reaction station for disposable test devices
IL124275A (en) * 1997-05-02 2002-03-10 Bio Merieux Vitek Inc A method to produce sequences of nucleic acids
CA2287570C (en) * 1997-05-02 2008-10-28 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US6558901B1 (en) * 1997-05-02 2003-05-06 Biomerieux Vitek Nucleic acid assays
US6410275B1 (en) 1997-05-02 2002-06-25 Biomerieux, Inc. Disposable test devices for performing nucleic acid amplification reactions
US5989499A (en) * 1997-05-02 1999-11-23 Biomerieux, Inc. Dual chamber disposable reaction vessel for amplification reactions
US5932451A (en) * 1997-11-19 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Method for unbiased mRNA amplification
CA2737963C (en) 1998-05-01 2013-09-10 Gen-Probe Incorporated Automated diagnostic analyzer and method
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6153411A (en) * 1998-10-30 2000-11-28 American Water Works Company, Inc. Methods and kits for detection of Cryptosporidium parvum using immunomagnetic separation and amplification
US6582906B1 (en) * 1999-04-05 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Proportional amplification of nucleic acids
US6132997A (en) * 1999-05-28 2000-10-17 Agilent Technologies Method for linear mRNA amplification
US6864050B2 (en) * 1999-07-30 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Single-phase amplification of nucleic acids
AT410218B (de) 1999-08-20 2003-03-25 Baxter Ag Verfahren zur herstellung eines qualitätsgesicherten pools biologischer proben
US6692918B2 (en) * 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
JP3929775B2 (ja) 1999-09-13 2007-06-13 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド ポリヌクレオチド配列の線形等温増幅のための方法および組成物
WO2001038572A1 (fr) * 1999-11-19 2001-05-31 Takara Bio Inc. Methode d'amplification d'acides nucleiques
US6582938B1 (en) 2001-05-11 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US6794138B1 (en) 1999-12-16 2004-09-21 Affymetrix, Inc. Methods of small sample amplification
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
US6902891B2 (en) 1999-12-17 2005-06-07 Bio Merieux Process for labeling a nucleic acid
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
CA2412721A1 (en) 2000-06-26 2002-01-03 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
DE60040874D1 (de) 2000-09-01 2009-01-02 Gen Probe Inc Amplifizierung von hiv-1 sequenzen zur detektion ven einhergehen
ATE386821T1 (de) 2000-10-23 2008-03-15 Gen Probe Inc Zusammensetzungen und methoden zur detektion von humanem immundefizienz virus 2 (hiv-2)
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
WO2002048402A2 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
US6794141B2 (en) 2000-12-22 2004-09-21 Arcturus Bioscience, Inc. Nucleic acid amplification
US6867021B2 (en) 2001-02-20 2005-03-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Multiplex RT-PCR/PCR for simultaneous detection of bovine coronavirus, bovine rotavirus, Cryptosporidium parvum, and Escherichia coli
US7094536B2 (en) * 2001-03-09 2006-08-22 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of RNA sequences
AU2002252279B2 (en) 2001-03-09 2005-05-12 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of RNA sequences
WO2004059289A2 (en) * 2001-05-22 2004-07-15 Epicentre Technologies Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase
US8137911B2 (en) * 2001-05-22 2012-03-20 Cellscript, Inc. Preparation and use of single-stranded transcription substrates for synthesis of transcription products corresponding to target sequences
US6872529B2 (en) * 2001-07-25 2005-03-29 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US7297778B2 (en) 2001-07-25 2007-11-20 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
TWI335938B (en) * 2001-08-15 2011-01-11 Rna replication and amplification
US7045319B2 (en) 2001-10-30 2006-05-16 Ribomed Biotechnologies, Inc. Molecular detection systems utilizing reiterative oligonucleotide synthesis
KR100446621B1 (ko) * 2001-12-18 2004-09-07 삼성전자주식회사 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 ｍｏｄｙ３유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트
EP1458486B1 (en) * 2001-12-19 2008-09-17 Affymetrix, Inc. Array plates and method for constructing array plates
WO2003079667A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 Arcturus Bioscience, Inc. Improved nucleic acid amplification
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
JP4532264B2 (ja) 2002-05-17 2010-08-25 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 自動システム及び自動処理方法並びに核酸自動抽出方法
EP1513958B1 (en) 2002-06-14 2011-08-10 Gen-Probe Incorporated Compositions for detecting hepatitis b virus
KR100442832B1 (ko) * 2002-07-10 2004-08-02 삼성전자주식회사 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 ｍｏｄｙ２ 유전자의증폭을 위한 프라이머 세트
US7504215B2 (en) 2002-07-12 2009-03-17 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling methods
US20040009483A1 (en) * 2002-07-12 2004-01-15 Ilsley Diane D. Method of linear mRNA amplification using total RNA
US20050003369A1 (en) * 2002-10-10 2005-01-06 Affymetrix, Inc. Method for depleting specific nucleic acids from a mixture
WO2004036190A2 (en) 2002-10-16 2004-04-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
JP3867926B2 (ja) 2002-10-29 2007-01-17 独立行政法人理化学研究所 核酸の増幅法
US20040101844A1 (en) * 2002-11-21 2004-05-27 Amorese Douglas A. Methods and compositions for producing linearly amplified amounts of (+) strand RNA
CN1738914A (zh) 2002-11-21 2006-02-22 震源技术公司 使用编码双链启动子一条链的引物的方法
US6852494B2 (en) 2003-01-10 2005-02-08 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification
WO2004083806A2 (en) 2003-01-22 2004-09-30 University Of South Florida Autonomous genosensor apparatus and methods for use
AU2004230494A1 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
US20040248102A1 (en) 2003-06-03 2004-12-09 Diane Ilsley-Tyree Methods and compositions for performing template dependent nucleic acid primer extension reactions that produce a reduced complexity product
EP1633892A4 (en) 2003-06-10 2007-10-24 Univ Boston METHODS OF DETECTING PULMONARY DISORDERS
JP4790621B2 (ja) 2003-11-26 2011-10-12 アドバンディーエックス， インコーポレイテッド 特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の分析のためのペプチド核酸プローブ
AU2004303886B2 (en) 2003-12-19 2009-09-03 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting the nucleic acids of HIV-1 and HIV-2
US20050147975A1 (en) * 2003-12-24 2005-07-07 Schembri Carol T. Methods and compositions for amplification of genomic DNA
US8206902B2 (en) 2003-12-25 2012-06-26 Riken Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same
DE602005025424D1 (de) 2004-01-23 2011-01-27 Bio Merieux Inc Neuartiges Nukleotidgemisch für eine verbesserte Nukleinsäurenamplifikationsleistung
US20050191682A1 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Affymetrix, Inc. Methods for fragmenting DNA
WO2005083121A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-09 Seegene, Inc. Method for amplifying members of a gene family
CN103884698B (zh) 2004-06-07 2017-04-12 先锋生物科技股份有限公司 用于微流体器件的光学透镜系统和方法
WO2006007603A2 (en) 2004-07-13 2006-01-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of hepatitis a virus nucleic acid
WO2006006722A1 (ja) 2004-07-13 2006-01-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited 細胞機能の調節方法
US20080108059A1 (en) * 2004-07-30 2008-05-08 Tosoh Corporation Method Of Measuring Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein B1 (Hnrnp B1) Mrna
US7713697B2 (en) * 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
EP1970454B1 (en) * 2004-08-27 2012-09-19 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
US20060073506A1 (en) 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
WO2006039564A2 (en) 2004-09-30 2006-04-13 Gen-Probe Incorporated Assay for detecting and quantifying hiv-1
US20060073511A1 (en) 2004-10-05 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for amplifying and analyzing nucleic acids
US7682782B2 (en) 2004-10-29 2010-03-23 Affymetrix, Inc. System, method, and product for multiple wavelength detection using single source excitation
CA2524964A1 (en) 2004-10-29 2006-04-29 Affymetrix, Inc. Automated method of manufacturing polymer arrays
JP5192238B2 (ja) * 2004-11-09 2013-05-08 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ａ群連鎖球菌属を検出するための組成物及び方法
EP1841879A4 (en) * 2005-01-25 2009-05-27 Population Genetics Technologi ISOTHERMAL DNA AMPLIFICATION
WO2006081558A2 (en) 2005-01-28 2006-08-03 Duke University Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board
US20060177859A1 (en) * 2005-02-07 2006-08-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group B streptococci
JP4819064B2 (ja) 2005-02-18 2011-11-16 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド アルカリショックを取り入れたサンプル調製法
CN101128604A (zh) * 2005-02-28 2008-02-20 生物探索公司 用于进行涉及核酸分子的直接酶反应的方法
US20060223071A1 (en) * 2005-04-01 2006-10-05 Wisniewski Michele E Methods, compositions, and kits for detecting nucleic acids in a single vessel
EP2360279A1 (en) 2005-04-14 2011-08-24 Trustees Of Boston University Diagnostic for lung disorders using class prediction
EP2471805A3 (en) 2005-05-06 2013-01-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to specifically detect nucleic acid of influenza virus A or B
ATE545701T1 (de) 2005-05-17 2012-03-15 Ozgene Pty Ltd Sequentielles klonierungssystem
US7550264B2 (en) * 2005-06-10 2009-06-23 Datascope Investment Corporation Methods and kits for sense RNA synthesis
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
JP2009506788A (ja) * 2005-09-06 2009-02-19 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸の等温増幅のための方法、組成物及びキット
US7939258B2 (en) 2005-09-07 2011-05-10 Nugen Technologies, Inc. Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers
US20090291431A1 (en) 2005-10-17 2009-11-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect legionella pneumophila nucleic acid
ATE504044T1 (de) 2005-11-14 2011-04-15 Gen Probe Inc Parametrisches kalibrationsverfahren
WO2008018904A2 (en) 2006-01-18 2008-02-14 Argos Therapeutics, Inc. Systems and methods for processing samples in a closed container, and related devices
WO2007087262A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Selective genome amplification
US8192930B2 (en) 2006-02-08 2012-06-05 Illumina Cambridge Limited Method for sequencing a polynucleotide template
US20110143344A1 (en) * 2006-03-01 2011-06-16 The Washington University Genetic polymorphisms and substance dependence
US20090176878A1 (en) * 2007-10-05 2009-07-09 Washington University In St. Louis Genetic polymorphisms and substance dependence
EP1999472A2 (en) 2006-03-09 2008-12-10 The Trustees Of Boston University Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells
AU2007249286B2 (en) * 2006-05-12 2013-06-13 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect enterococci nucleic acid
EP2050828A3 (en) 2006-06-12 2009-08-26 Oncomethylome Sciences S.A. Methylation markers for early detection and prognosis of colon cancers
WO2008016988A1 (en) 2006-08-01 2008-02-07 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
EP2057465A4 (en) 2006-08-09 2010-04-21 Homestead Clinical Corp SPECIFIC ORGAN PROTEINS AND METHODS OF USE
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
US9845494B2 (en) 2006-10-18 2017-12-19 Affymetrix, Inc. Enzymatic methods for genotyping on arrays
US20090275632A1 (en) * 2006-10-27 2009-11-05 Oncomethylome Sciences Sa Methods of diagnosis and treatment
EP2092074A4 (en) 2006-11-02 2010-06-09 Univ Yale ESTIMATION OF OOCYTE COMPETENCE
US8293684B2 (en) * 2006-11-29 2012-10-23 Exiqon Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids
US8198027B2 (en) 2006-12-21 2012-06-12 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US8183359B2 (en) * 2007-03-01 2012-05-22 Gen-Probe Incorporated Kits for amplifying DNA
WO2009006438A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Epicentre Technologies Corporation Copy dna and sense rna
CN101849019A (zh) 2007-07-09 2010-09-29 微敏医疗技术有限公司 基于其nad依赖性dna连接酶活性来检测微生物
EP2952588A1 (en) 2007-08-06 2015-12-09 Orion Genomics, LLC Single nucleotide polymorphism in igf2 for determining the allele-specific expression of the igf2 gene
CA2639416C (en) 2007-09-11 2019-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors
WO2009037438A1 (en) * 2007-09-17 2009-03-26 Oncomethylome Sciences Sa Improved detection of mage-a expression
WO2009036922A2 (en) 2007-09-17 2009-03-26 Oncomethylome Sciences Sa Novel markers for bladder cancer detection
US20100303832A1 (en) 2007-11-01 2010-12-02 Hageman Gregory S Genes and polymorphisms associated with amd
US7595164B2 (en) 2007-12-26 2009-09-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid
WO2009089598A2 (en) * 2008-01-18 2009-07-23 Katholieke Universiteit Leuven Msmb-gene methylation based diagnosis, staging and prognosis of prostate cancer
US20090203531A1 (en) 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
US20110117551A1 (en) 2008-02-19 2011-05-19 Oncomethylome Sciences Sa Detection and prognosis of lung cancer
US12060554B2 (en) 2008-03-10 2024-08-13 Illumina, Inc. Method for selecting and amplifying polynucleotides
US20110189653A1 (en) 2008-03-21 2011-08-04 Wim Van Criekinge Detection and prognosis of cervical cancer
WO2009117698A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
WO2009131683A2 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Gen-Probe Incorporated Method for detecting chikungunya virus
WO2009140666A2 (en) 2008-05-15 2009-11-19 Ribomed Biotechnologies, Inc. METHODS AND REAGENTS FOR DETECTING CpG METHYLATION WITH A METHYL CpG BINDING PROTEIN (MBP)
US8703421B2 (en) 2008-05-30 2014-04-22 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Salmonella
WO2010009060A2 (en) 2008-07-13 2010-01-21 Ribomed Biotechnologies, Inc. Molecular beacon-based methods for detection of targets using abscription
WO2010011506A2 (en) * 2008-07-23 2010-01-28 The Washington University Risk factors and a therapeutic target for neurodegenerative disorders
GB0814570D0 (en) 2008-08-08 2008-09-17 Diagnostics For The Real World Isolation of nucleic acid
CA2679750A1 (en) 2008-09-23 2010-03-23 Nexus Dx, Inc. Methods for detecting nucleic acids in a sample
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
EP2394170B1 (en) 2009-02-03 2015-04-01 MDxHealth SA Methods of detecting colorectal cancer
AU2010213727A1 (en) 2009-02-11 2011-09-29 Orion Genomics Llc Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of IGF2
WO2010093465A1 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
AU2010217928B2 (en) 2009-02-26 2013-06-06 Gen-Probe Incorporated Assay for detection of human parvovirus nucleic acid
US9388471B2 (en) 2009-03-13 2016-07-12 Mdxhealth Sa Methylation of the GATA4 gene in urine samples as a marker for bladder cancer detection
JP2012520086A (ja) 2009-03-15 2012-09-06 リボムド バイオテクノロジーズ インク アブスクリプションに基づく分子検出
KR20120002534A (ko) 2009-03-17 2012-01-05 엠디엑스헬스 에스에이 유전자 발현의 향상된 검출
WO2010126913A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
CA2763584A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Phthisis Diagnostics Advanced pathogen detection and screening
EP3450573B1 (en) 2009-06-23 2022-01-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
CA2766391C (en) 2009-07-01 2021-04-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for multiplex nucleic acid amplification
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
EP2669387B1 (en) 2009-08-25 2016-07-20 Illumina, Inc. Methods for selecting and amplifying polynucleotides
CN102858995B (zh) 2009-09-10 2016-10-26 森特瑞隆技术控股公司 靶向测序方法
US10174368B2 (en) 2009-09-10 2019-01-08 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods and systems for sequencing long nucleic acids
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
WO2011036173A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Oncomethylome Sciences S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
EP2494077A4 (en) 2009-10-27 2013-08-21 Caris Mpi Inc MOLECULAR PROFILING FOR PERSONALIZED MEDICINE
JP2013511991A (ja) * 2009-11-25 2013-04-11 クアンタライフ， インコーポレイテッド 遺伝子材料を検出する方法および組成物
US8501122B2 (en) 2009-12-08 2013-08-06 Affymetrix, Inc. Manufacturing and processing polymer arrays
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US20120258447A1 (en) * 2009-12-24 2012-10-11 Seegene, Inc Real-time multiplexing detection of target nucleic acid sequences with elimination of false signals
US9074246B2 (en) * 2010-01-25 2015-07-07 Rd Biosciences, Inc. Self-folding amplification of target nucleic acid
EP3604558B1 (en) 2010-02-17 2022-10-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
CA3074551C (en) 2010-04-21 2021-05-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acids
WO2011135058A2 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Mdxhealth Sa Methods for detecting epigenetic modifications
KR101223660B1 (ko) 2010-05-20 2013-01-17 광주과학기술원 ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
KR101176139B1 (ko) 2010-05-20 2012-08-22 광주과학기술원 관절염 동물모델로서 연골 특이적 ＨＩＦ?２α 형질전환 마우스 및 이의 용도
EP2576837B1 (en) 2010-06-04 2017-09-06 Chronix Biomedical Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers
WO2012009373A2 (en) 2010-07-12 2012-01-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect swine h1n1 influenza a virus, seasonal h1 influenza a virus and seasonal h3 influenza a virus nucleic acids
CN103551212B (zh) 2010-07-23 2016-01-20 贝克曼考尔特公司 试剂盒
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
US20130040375A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
WO2012024642A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Life Technologies Corporation Quantitative real-time pcr assay using fret dual-labeled primers
WO2012030856A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
WO2012040619A2 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for prognosing and/or detecting age-related macular degeneration
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
EP2625297B1 (en) 2010-10-04 2018-10-10 Gen-Probe Prodesse, Inc. Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
EP3940084A1 (en) 2011-02-09 2022-01-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
JP5808825B2 (ja) 2011-02-24 2015-11-10 ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド ネコの腎障害を診断および治療する組成物および方法
WO2012118745A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Arnold Oliphant Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination
EP3498864B1 (en) 2011-03-10 2024-10-09 Gen-Probe Incorporated Methods for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US20120252682A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Maples Corporate Services Limited Methods and systems for sequencing nucleic acids
AU2012249751B2 (en) 2011-04-25 2016-11-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
RU2593952C2 (ru) 2011-06-15 2016-08-10 Хилл'С Пет Ньютришн, Инк. Композиции и способы для диагностики и мониторинга гипертиреоза у животных семейства кошачьих
EP3564393A1 (en) 2011-06-21 2019-11-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
EP2732054B1 (en) 2011-07-15 2019-04-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting human parvovirus nucleic acid in single-plex or multiplex assays
WO2013024175A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Technische Universität München Diagnostic means and methods for type 2 diabetes
MX2014002307A (es) 2011-08-31 2014-08-26 Hoffmann La Roche Metodo para predecir el riesgo de hipertension asociado a la terapia antiangiogenesis.
WO2013030167A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Responsiveness to angiogenesis inhibitors
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
US9663829B2 (en) 2011-09-08 2017-05-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SG11201400724SA (en) 2011-09-19 2014-04-28 Genentech Inc Combination treatments comprising c-met antagonists and b-raf antagonists
GB201206209D0 (en) 2012-04-06 2012-05-23 Univ Leuven Kath Marker gene based diagnosis, staging and prognosis of prostate caner
EP2763701B1 (en) 2011-10-03 2018-12-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
FR2981088B1 (fr) 2011-10-06 2013-11-29 Biomerieux Sa Arn polymerases mutees
WO2013066641A1 (en) 2011-10-21 2013-05-10 Chronix Biomedical Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers
BR112014011043A2 (pt) 2011-11-07 2017-06-13 Beckman Coulter Inc detecção de recipiente de espécime
KR20140091032A (ko) 2011-11-07 2014-07-18 베크만 컬터, 인코포레이티드 검체 수송 시스템의 자기 감쇠
BR112014011035A2 (pt) 2011-11-07 2017-06-13 Beckman Coulter, Inc. sistema de aliquotagem e fluxo de trabalho
EP2776843B1 (en) 2011-11-07 2019-03-27 Beckman Coulter, Inc. Centrifuge system and workflow
WO2013070754A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Beckman Coulter, Inc. Robotic arm
US9910054B2 (en) 2011-11-07 2018-03-06 Beckman Coulter, Inc. System and method for processing samples
AU2012342682A1 (en) 2011-11-23 2014-05-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Responsiveness to angiogenesis inhibitors
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
AU2012352180A1 (en) 2011-12-16 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
BR112014014907A2 (pt) 2011-12-19 2017-06-13 Hills Pet Nutrition Inc composições e métodos para diagnóstico e tratamento de hipertireoidismo em animais de companhia
US9115394B2 (en) 2011-12-22 2015-08-25 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and reagents for reducing non-specific amplification
AU2013205010B2 (en) 2012-02-24 2016-10-20 Gen-Probe Incorporated Detection of Shiga toxin genes in bacteria
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
CA2865575C (en) 2012-02-27 2024-01-16 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151663A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
US9968901B2 (en) 2012-05-21 2018-05-15 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
GB201208926D0 (en) 2012-05-21 2012-07-04 Vela Operations Pte Ltd Extraction control for DNA
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
JP2015522293A (ja) 2012-07-19 2015-08-06 アリオサ ダイアグノスティックス インコーポレイテッドＡｒｉｏｓａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 多重化連続ライゲーションに基づく遺伝子変異体の検出
US9932628B2 (en) 2012-07-27 2018-04-03 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
AU2013202808B2 (en) 2012-07-31 2014-11-13 Gen-Probe Incorporated System and method for performing multiplex thermal melt analysis
EP2890814B1 (en) 2012-08-30 2019-11-13 Gen-Probe Incorporated Multiphase nucleic acid amplification
IN2015DN02893A (pt) 2012-10-04 2015-09-11 Univ Leland Stanford Junior
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
US10077475B2 (en) 2013-01-24 2018-09-18 California Institute Of Technology FRET-based analytes detection and related methods and systems
JP2016509480A (ja) 2013-01-24 2016-03-31 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 発色団に基づく特徴づけおよび検出方法
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
US20140287946A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid control panels
CA2899645C (en) 2013-03-15 2022-08-30 Gen-Probe Incorporated Calibration method, apparatus and computer program product
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
KR101403507B1 (ko) 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
JP2016517687A (ja) 2013-03-27 2016-06-20 サンプル テクノロジーズ，インコーポレイティド 組換えファージ及び細菌検出方法
KR101507505B1 (ko) 2013-04-18 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법
EP3004388B2 (en) 2013-05-29 2023-05-31 Chronix Biomedical Detection and quantification of donor cell-free dna in the circulation of organ transplant recipients
EP3663414B1 (en) 2013-06-13 2023-11-22 Roche Diagnostics GmbH Statistical analysis for non-invasive y chromosome aneuploidy determination
JP2016521996A (ja) 2013-06-19 2016-07-28 サンプルシックス テクノロジーズ，インコーポレイティド ファージベースの細菌検出アッセイ
WO2015018943A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Institut Pasteur Correlation of disease activity with clonal expansions of human papillomavirus 16-specific cd8+ t-cells in patients with severe erosive oral lichen planus
US10047406B2 (en) 2013-08-14 2018-08-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid
KR102536833B1 (ko) 2013-08-28 2023-05-26 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
BR112016007255A2 (pt) 2013-10-03 2017-09-12 Moderna Therapeutics Inc polinucleotídeos que codificam receptor de lipoproteína de baixa densidade
CN105745528A (zh) 2013-10-07 2016-07-06 赛卢拉研究公司 用于以数字方式对阵列上的特征进行计数的方法和系统
ES2720728T3 (es) 2013-11-15 2019-07-24 Pasteur Institut Un marcador molecular de Plasmodium falciparum de resistencia a artemisinina
GB201322034D0 (en) 2013-12-12 2014-01-29 Almac Diagnostics Ltd Prostate cancer classification
JP2017516463A (ja) 2014-03-31 2017-06-22 デバイオファーム インターナショナル エスエイ Ｆｇｆｒ融合体
US10450562B2 (en) 2014-09-09 2019-10-22 Igenomx International Genomics Corporation Methods and compositions for rapid nucleic acid library preparation
JP7231326B2 (ja) 2014-11-10 2023-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｉｌ－３３媒介性障害のための治療及び診断方法
JP6944873B2 (ja) 2015-01-09 2021-10-06 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌性膣症を診断するための方法および組成物
KR101718800B1 (ko) 2015-01-21 2017-03-24 주식회사 디알나노 약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도
US10697010B2 (en) 2015-02-19 2020-06-30 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
CN107429297A (zh) 2015-03-16 2017-12-01 简·探针公司 用于检测细菌核酸和诊断细菌性阴道病的方法和组合物
EP3277843A2 (en) 2015-03-30 2018-02-07 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
CN107580632B (zh) 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
WO2016172632A2 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Atila Biosystems, Inc Amplification with primers of limited nucleotide composition
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
GB201510684D0 (en) 2015-06-17 2015-08-05 Almac Diagnostics Ltd Gene signatures predictive of metastatic disease
TWI710642B (zh) 2015-08-17 2020-11-21 美商庫拉腫瘤技術股份有限公司 以法呢基轉移酶（farnesyltransferase）抑制劑治療癌症病患之方法
US10619186B2 (en) 2015-09-11 2020-04-14 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for library normalization
EP3901279B1 (en) 2015-10-18 2023-05-17 Affymetrix, Inc. Multiallelic genotyping of single nucleotide polymorphisms and indels
KR101651817B1 (ko) 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
US11111549B2 (en) 2016-01-04 2021-09-07 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting Candida species
GB201605110D0 (en) 2016-03-24 2016-05-11 Mologic Ltd Detecting sepsis
WO2017184968A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Kura Oncology, Inc. Methods of selecting cancer patients for treatment with farnesyltransferase inhibitors
CN109072288A (zh) 2016-05-02 2018-12-21 赛卢拉研究公司 精确的分子条形编码
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP4407625A3 (en) 2016-05-26 2024-10-23 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
EP3469103B1 (en) 2016-06-10 2021-10-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting zika virus nucleic acid
EP3497237B1 (en) 2016-08-10 2022-05-04 Institut Pasteur Methods and reagents for detecting piperaquine-resistant plasmodium falciparum malaria
KR102363716B1 (ko) 2016-09-26 2022-02-18 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
JP7167013B2 (ja) 2016-10-19 2022-11-08 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Ｃ型肝炎ウイルスを検出または定量するための組成物および方法
HUE053927T2 (hu) 2016-11-03 2021-07-28 Kura Oncology Inc Farneziltranszferáz inhibitorok rák kezelésében történõ alkalmazásra
US11164659B2 (en) 2016-11-08 2021-11-02 Becton, Dickinson And Company Methods for expression profile classification
CN117056774A (zh) 2016-11-08 2023-11-14 贝克顿迪金森公司 用于细胞标记分类的方法
WO2018094171A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis b virus
US10427162B2 (en) 2016-12-21 2019-10-01 Quandx Inc. Systems and methods for molecular diagnostics
KR101936799B1 (ko) 2017-01-09 2019-01-11 주식회사 엠이티라이프사이언스 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법
JP7104048B2 (ja) 2017-01-13 2022-07-20 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 流体チャネルの親水性コーティング
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
EP3432883B1 (en) 2017-02-21 2021-07-28 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
US10137121B2 (en) 2017-02-21 2018-11-27 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
EP3601619B1 (en) 2017-03-24 2024-06-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of viral pathogens in samples
EP4282985A3 (en) 2017-03-24 2024-02-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
US11603557B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
US11441174B2 (en) 2017-06-02 2022-09-13 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
EP3635135A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Becton, Dickinson and Company Sample indexing for single cells
WO2018226798A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample
KR101956315B1 (ko) 2017-07-19 2019-03-08 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트
WO2019017680A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트
US10806730B2 (en) 2017-08-07 2020-10-20 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
CA3071854A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
US11859257B2 (en) 2017-08-11 2024-01-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
WO2019094578A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Assays and methods for determining expression of the lect2 gene
JP7068451B2 (ja) 2017-11-17 2022-05-16 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Ｃ１ｏｒｆ４３核酸を検出するための組成物および方法
JP2021506274A (ja) 2017-12-15 2021-02-22 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 毒素産生Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを検出するための組成物および方法
WO2019126209A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Cellular Research, Inc. Particles associated with oligonucleotides
CA3088557C (en) 2018-02-09 2024-02-27 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for mast cell-mediated inflammatory diseases
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CA3097976A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
AU2019286648B2 (en) 2018-06-13 2023-11-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group B Streptococcus nucleic acid
EP3830302B1 (en) 2018-08-01 2022-10-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
CA3108105A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
US20220074002A1 (en) 2018-08-21 2022-03-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
AU2019324196A1 (en) 2018-08-24 2021-03-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
CA3112651A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
JP2022511398A (ja) 2018-10-01 2022-01-31 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ５’転写物配列の決定
CA3116895A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human polyomavirus bk virus
CA3117968A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
WO2020097315A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Cellular Research, Inc. Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
CA3121170A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Caris Mpi, Inc. Next-generation molecular profiling
CN113195717A (zh) 2018-12-13 2021-07-30 贝克顿迪金森公司 单细胞全转录组分析中的选择性延伸
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
WO2020154247A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Cellular Research, Inc. Oligonucleotides associated with antibodies
CN113454234A (zh) 2019-02-14 2021-09-28 贝克顿迪金森公司 杂合体靶向和全转录物组扩增
GB201902458D0 (en) 2019-02-22 2019-04-10 Mologic Ltd Treatment stratification for an excerbation of inflamation
US20220142983A1 (en) 2019-03-01 2022-05-12 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
EP4407046A3 (en) 2019-03-22 2024-10-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group a streptococcus
CA3134825A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Kura Oncology, Inc. Methods of treating squamous cell carcinomas with farnesyltransferase inhibitors
WO2020205387A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
EP3956476A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 Igenomix S.L. Improved methods for the early diagnosis of uterine leiomyomas and leiomyosarcomas
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
US20220305001A1 (en) 2019-05-02 2022-09-29 Kura Oncology, Inc. Methods of treating acute myeloid leukemia with farnesyltransferase inhibitors
JP2022540801A (ja) 2019-07-03 2022-09-20 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 試料中のＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓの存在を決定する際に使用するためのオリゴヌクレオチド
WO2021016239A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
EP4018004A1 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
AU2020343334A1 (en) 2019-09-05 2022-04-07 Gen-Probe Incorporated Detection of Chlamydia trachomatis nucleic acid variants
GB201914538D0 (en) 2019-10-08 2019-11-20 Momentum Bioscience Ltd Microorganism capture from antimicrobial-containing solution
WO2021092386A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Becton Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
AU2020397802A1 (en) 2019-12-02 2022-06-16 Caris Mpi, Inc. Pan-cancer platinum response predictor
CA3163936A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Gen-Probe Incorporated Quantification of polynucleotide analytes from dried samples
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
EP4090768B1 (en) 2020-01-16 2024-03-13 DNAe Diagnostics Limited Compositions, kits and methods for isolating target polynucleotides
EP4114985A1 (en) 2020-03-04 2023-01-11 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting sars-cov-2 nucleic acid
JP2023516497A (ja) 2020-03-13 2023-04-19 メドイミューン・リミテッド Ｉｌ３３にリスクアレルを有する対象を治療するための治療方法
CN115698325A (zh) 2020-05-07 2023-02-03 盖立复诊断解决方案公司 用于检测SARS-CoV-2核酸的方法和组合物
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
WO2021246820A1 (ko) 2020-06-05 2021-12-09 주식회사 씨젠 호흡기 병원체 검출을 위한 검체수송 키트 및 이를 이용한 호흡기 병원체 검출방법
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
CA3188657A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Gen-Probe Incorporated Detection of macrolide-resistant mycoplasma genitalium
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
CA3218222A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting human adenovirus nucleic acid
CA3220932A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Gen-Probe Incorporated Enzyme formulations and reaction mixtures for nucleic acid amplification
EP4373965A1 (en) 2021-07-21 2024-05-29 DNAe Diagnostics Limited Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
EP4382622A3 (en) 2021-07-27 2024-08-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting shigella and at least one of salmonella, c. jejuni, c. coli, and stec
WO2023075394A1 (ko) 2021-10-29 2023-05-04 주식회사 씨젠 검체 채취 스왑 도구 및 호흡기 병원체의 검출 방법
EP4282980A1 (en) 2022-05-23 2023-11-29 Mobidiag Oy Methods for amplifying a nucleic acid
WO2024015331A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for multiple sclerosis
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024081776A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Gen-Probe Incorporated Cellularity control for nucleic acid assays
WO2024137379A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
EP4389887A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Mobidiag Oy Isolating and lysing cells
EP4389911A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Mobidiag Oy Methods and systems for isolating an analyte
WO2024161179A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Mobidiag Oy Compositions and methods for detecting stx nucleic acids
WO2024192338A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal parasites
EP4455303A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
EP4454758A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
EP4455304A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683194A (en) 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
AU606043B2 (en) 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DK171161B1 (da) 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
EP0224126A3 (en) * 1985-11-25 1989-02-01 The University of Calgary Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers
JPS63501923A (ja) * 1985-12-05 1988-08-04 フレツド　ハツチンソン　キヤンサ−　リサ−チ　センタ− レトロウイルス疾病状態の治療のためのアンチセンスｒｎａ
EP0272098A3 (en) * 1986-12-15 1990-06-06 City Of Hope National Medical Center Method for amplification and detection of rna sequences
IL86724A (en) * 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
IE72468B1 (en) * 1987-07-31 1997-04-09 Univ Leland Stanford Junior Selective amplification of target polynucleotide sequences
EP0400097A1 (de) 1988-04-30 1990-12-05 Korfmacher Trading Gmbh Lagerungs- oder stützmatte, insbesondere für verpackungszwecke
US5130238A (en) * 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
JP2905144B2 (ja) 1995-09-14 1999-06-14 有限会社野々川商事 棒状化粧料容器
DE19636774C2 (de) 1996-09-10 1999-04-22 Herberts Gmbh Verfahren zur Anpassung einer Farbrezeptur

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