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KR101403507B1 - 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트 - Google Patents

결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트 Download PDF

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KR101403507B1
KR101403507B1 KR1020130030409A KR20130030409A KR101403507B1 KR 101403507 B1 KR101403507 B1 KR 101403507B1 KR 1020130030409 A KR1020130030409 A KR 1020130030409A KR 20130030409 A KR20130030409 A KR 20130030409A KR 101403507 B1 KR101403507 B1 KR 101403507B1
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김정욱
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주식회사 현일바이오
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Abstract

본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용하여 타겟 유전자를 동시에 증폭하여 분석함으로써 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 타겟 유전자(구체적으로는, IS6110, 16S rRNA 및 β-actin)-특이적인 프라이머와 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 매우 높은 효율로 선택적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 결핵균과 비결핵 마이코박테리아의 시료 내 감염 여부를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.

Description

결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트{Methods for Selectively Detecting Mycobacterium tuberculosis complex and Nontuberculous mycobacteria and Kits Using the Same}
본 발명은 타겟 유전자의 동시 증폭 및 분석을 통해 시료 내 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 선택적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다.
비결핵 마이코박테리아(nontuberculous mycobacteria)은 결핵균과 나병균을 제외한 모든 마이코박테리아로, 약 140여종이 알려져 있으며 토양이나 물 등 자연환경 등에 널리 존재한다. 그러나, 1980년대부터 유행한 후천성면역결핍증(AIDS)에 대한 연구를 통해, 상기 균주가 후천성 면연결핍증 환자의 기회감염증의 주요 원인 균주로서 심각한 폐질환을 유발할 뿐 아니라 정상 환자에게서도 감염을 일으킬 수 있음이 알려지면서 임상적 중요성에 대한 인식이 확산되고 있다.
최근에는, 결핵균에 의한 유병률이 낮은 미국 및 유럽 여러 나라에서도 비결핵 마이코박테리아에 의한 감염증이 증가하고 있을 뿐 아니라, 국내에서도 결핵 유병율이 저하하고 있으나 상대적으로 비결핵 마이코박테리아에 의한 감염은 증가하는 추세이다. 또한, 결핵은 여전히 전세계적으로 심각한 보건 문제의 하나로 국내 결핵 유병률은 2011년 인구 10만명 당 78.9명의 수준으로 매우 높은 수준이다.
2009년에 액체 결핵배양법이 보험급여 됨에 따라 액체결핵배양 검사를 실시하는 검사실이 늘고 있으며 액체배지를 사용하여 결핵균을 배양하는 경우 기존의 고체배지를 사용한 결핵균 배양보다 비결핵 마이코박테리아 균주가 더 검출되고 있다. 최근 보고에 따르면, 일본, 홍콩, 우리나라의 경우 결핵균 도말 및 배양 양성 검체의 약 12%에서 비결핵 마이코박테리아가 분리되고 있으며, 객담에서 분리된 비결핵 마이코박테리아의 약 10-20%가 폐질환을 야기하고 미국, 캐나다, 서유럽 등에서는 약 40-50%가 폐질환을 야기하는 것으로 알려지고 있다. 특히, 미국의 경우, 임상 검체에서 분리된 마이코박테리아는 1979-1980년에 약 33% 및 1992년에 약 75% 정도가 비결핵 마이코박테리아를 포함하는 것으로 보고되었다.
무엇보다도, 비결핵 마이코박테리아에 의한 폐질환은 천천히 진행되는 폐결핵과 유사하여 오진되기 쉬우나, 결핵균과 비결핵 마이코박테리아에 감수성을 보이는 약제가 달라 치료 약제를 선택하기 위해 신속하고 정확한 결핵균과 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법을 개발할 필요성이 대두되고 있다.
하지만, 현재 시판되고 있는 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 검출하는데 사용되는 검사시약은 비결핵 마이코박테리아에만 고유한 부위가 아니고 결핵균에도 존재하는 염기서열 부위를 사용함으로써, 특정 농도 범위에서는 결핵균의 존재에도 불구하고 결핵균 검출 프라이머에는 반응하지 않고 비결핵 마이코박테리아의 프라이머에만 반응하여 비결핵 마이코박테리아로 잘못 동정되거나, 또는 비결핵 마이코박테리아과 결핵균이 동시에 존재하는 경우 비결핵 마이코박테리아만 검출되는 등 검출 및 진단 정확성이 떨어지는 문제가 발생하고 있다.
또한, 결핵균은 사람 간 전염성을 가지는 반면에 비결핵 마이코박테리아는 사람 간 전염되지 않는 등 양 균종 간의 병리생리학적 및 역학적 성격이 현저하게 다르기 때문에, 결핵균은 비결핵 마이코박테리아와 선택적으로 검출되어야 한다. 또한, 비결핵 마이코박테리아는 균종마다 병원성이 매우 다양하기 때문에 적절한 치료약제를 선택하기 위해 특이적으로 동정될 필요가 있다. 또한, 종래의 마이코박테리아의 배양 및 동정 검사는 2-4주의 시일이 걸리는 단점을 지닌다.
따라서, 결핵균에는 없고 비결핵 마이코박테리아의 고유염기서열을 인식할 수 있는 프라이머 세트 및/또는 프로브 및 이를 이용한 신속하고 정확한 결핵균과 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 선택적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 결핵균의 IS6110 유전자 및 비결핵 마이코박테리아의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 객담, 혈액, 타액 또는 소변)로부터 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 분리 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 분리 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비결핵마이코박테리아의 검출용 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비결핵마이코박테리아의 검출용 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 선택적 검출방법을 제공한다: (a) 시료를 준비하는 단계; (b) (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 결핵균 검출 세트; 및 (ii) 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 비결핵 마이코박테리아 검출 세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 결핵균 검출 세트; 및 (ii) 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 비결핵 마이코박테리아 검출 세트를 포함하는 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 선택적 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비결핵 마이코박테리아 검출용 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비결핵 마이코박테리아 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명자들은 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 선택적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 결핵균의 IS6110 유전자 및 비결핵 마이코박테리아의 16S rRNA 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하여 멀티플렉스 실-시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 객담, 혈액, 타액 또는 소변)로부터 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 방법은 시료 내에서 결핵균과 비결행 마이코박테리아를 매우 효과적이고 간편하게 분리 검출할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 대상-유래 시료로 객담, 혈액, 타액 또는 소변)에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
시료에서 DNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al ., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al ., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al ., Anal . Biochem . 162:156(1987)).
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 타겟 유전자(구체적으로는, IS6110 및 16S rRNA)를 적합한 방법으로 분석하여 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 선택적으로 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 타겟 유전자를 검출할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법을 DNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) IS6110 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머 쌍 및 프로브; 그리고 16S rRNA 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 형광을 통해 분석하는 단계를 포함하며 이를 통해 시료로부터 추출한 DNA에서 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 검출 또는 정량할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 비결핵 마이코박테리아 균주는 M. abscessus ATCC 19977, M. acapulcensis KCTC 9501, M. africanum ATCC 25420, M. agri KCTC 9502, M. alvei KCTC 19709, M. asiaticum KCTC 9503, M. aurum KCTC 19457, M. austroafricanum KCTC 9504, M. avium ATCC 25291, M. bolletii KCTC 19281, M. botniense KCTC 19646, M. bovis ATCC 19210, M. brumae KCTC 19711, M. celatum ATCC 51131, M. chelonae subsp chelonae KCTC 9505, M. chlorophenolicum KCTC 19089, M. chubuense KCTC 19712, M. diernhoferi KCTC 9506, M. fallax KCTC 9508, M. flavescens ATCC 14474, M. fortuitum ATCC 6841, M. frederiksbergense KCTC 19100, M. gadium ATCC 27726, M. gastri ATCC 15754, M. gilvum KCTC 19423, M. goodii ATCC BAA-955, M. gordonae KCTC 9513, M. haemophilum ATCC 29548, M. hassiacum ATCC 700660, M. interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950, M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M. malmoense ATCC 29571, M. mantobense KCTC 9977, M. marinum ATCC 927, M. massiliense KCTC 19086, M. microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M. neoaurum KCTC 19096, M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979, M. peregrinum KCTC 9615, KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689, M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108, M. szulgai KCTC 9520, KMRC 31125, M. terrae KCTC 9614, M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M. vanbaalenii KCTC 9966, M. wolinskyi ATCC 700010 및 M. xenopi KMRC 42001을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 결핵균과 비결핵마이코박테리아를 다른 미생물들과 구분하기 위해 3개의 유전자(IS6110, 16S rRNA 및 β-actin)를 동시에 검출하는 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 검출할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 결핵균 검출 세트; (ii) 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 비결핵 마이코박테리아 검출 세트; 및 (iii) 서열목록 제11서열 및 서열목록 제12서열을 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제13서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군인 β-액틴 검출 세트를 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 이용되는 타겟 유전자는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브에 의해 검출되는 IS6110 유전자; 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브에 의해 검출되는 16S rRNA 유전자; 및 서열목록 제11서열 및 서열목록 제12서열을 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제13서열의 프로브에 의해 검출되는 β-액틴 유전자를 포함한다.
실-시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실-시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al ., PCR Methods Appl ., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 C t 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실-시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실-시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실-시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 C t 값이 산출된다.
실-시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요하 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques ., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실-시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al ., Clin Cancer Res ., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al ., Hum Mutat ., Vol 23(5): 513-521(2004)).
C t (cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 C t 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. C t 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. C t 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. C t 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al ., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, TaqMan 프로브는 서열목록 제1서열 및 제2서열에 의해 증폭되는 IS6110 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM (506), YO-PROTM-1 (509), YOYOTM-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorXTM (519), AlexaTM (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon GreenTM 500 (522), Oregon GreenTM 488 (524), RiboGreenTM (525), Rhodamine GreenTM (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium GreenTM (531), Calcium GreenTM (533), TO-PROTM-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3TM (570), AlexaTM 546 (570), TRITC (572), Magnesium OrangeTM (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium OrangeTM (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RedTM (590), Cy3.5TM (596), ROX (608), Calcium CrimsonTM (615), AlexaTM 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PROTM-3 (631), YOYOTM-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PROTM-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5TM (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), VIC (546), BHQ-1 (534), BHQ-2 (579), BHQ-3 (672), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HEX, VIC, FAM, BHQ-1 및 Cy5-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al ., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
또한, TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자에 이용되는 비형광성 물질은 마이너 그루브 결합 모이어티(minor groove binding(MGB) moiety)를 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브(MGB-conjugate probe)"는 프로브의 3'-말단에 MGB와 컨쥬게이션된 TaqMan 프로브를 의미한다. MGB는 높은 친화도로 DNA의 마이너 그루브에 결합하는 물질로서, DPI3(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide), 네트롭신(netropsin), 디스타마이신(distamycin), 렉시트롭신(lexitropsin), 미트라마이신(mithramycin), 크로모마이신(chromomycin) A3, 올리보마이신(olivomycin), 안트라마이신(anthramycin), 시비로마이신(sibiromycin), 펜타미딘(pentamidine), 스틸바미딘(stilbamidine), 베레닐(berenil), CC-1065, Hoechst 33258, DAPI(4'-6-diamidino-2-phenylindole), CDPI의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머, MPC(N-methylpyrrole-4-carbox-2-amide) 및 이의 다이머, 트리머, 테트라머 및 펜타머를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 Taqman 프로브와 MGB의 컨쥬게이션(conjugation)은 프로브와 이의 타겟 간에 형성되는 하이브리드의 안정성을 현저하게 증가시킨다. 보다 상세하게는, 증가된 안정성(즉, 혼성화 정도의 증가)는 정상 프로브와 비교하여 MGB-컨쥬게이트 프로브에 의해 형성된 하이브리드 듀플렉스의 증가된 Tm(melting temperature)을 유발한다. 따라서, MGB는 반데르발스 힘을 안정화시켜 프로브 길이의 증가 없이 MGB-컨쥬게이트 프로브의 Tm(melting temperature)를 증가시킴으로써 보다 엄격 조건 하의 Taqman 실-시간 PCR에서 더 짧은 프로브(예컨대, 21개 이하의 뉴클레오타이드)의 이용을 가능하게 해 준다.
또한, MGB-컨쥬게이트 프로브는 백그라운드 형광을 보다 효율적으로 제거시켜 준다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브의 길이는 15-21 뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 FAM, VIC, HEX 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 및 MGB로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 서열목록 제3서열은 5'-말단의 형광물질로 HEX 및 3'-말단에 퀀처로 BHQ-1을 이용하고, 본 발명의 서열목록 제4서열은 5'-말단의 형광물질로 VIC 및 3'-말단에 퀀처로 MGB를 이용하며, 본 발명의 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM 및 3'-말단에 퀀처로 BHQ-1을 이용하고, 본 발명의 서열목록 제13서열은 5'-말단의 형광물질로 Cy5 및 3'-말단에 퀀처로 BHQ-2를 이용한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 TaqMan MGB-컨쥬게이트 프로브의 농도는 50-900 nM이며, 보다 구체적으로는 100-600 nM이고, 보다 더 구체적으로는 150-400 nM이며, 보다 더욱 더 구체적으로는 200-300 nM이다.
본 발명에서 이용되는 타겟 핵산은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함하며, 보다 바람직하게는 gDNA이다. 타겟 핵산이 RNA 분자인 경우에는 cDNA로 역전사 하여 사용한다. 타겟 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함하며, 보다 구체적으로는 진핵세포 핵산을 포함한다.
타겟 핵산을 연장 프라이머 및 프로브에 어닐링 또는 혼성화 시키는 방법은 당업계에 공지된 혼성화 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al ., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.
본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 가지는 효소이다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 바람직하게는 DNA 중합효소이다. 통상적으로 DNA 중합효소들은 5' to 3' 뉴클레아제 활성을 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 주형-의존성 핵산 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus, Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.
주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 촉매되는 주형-의존성 연장반응은 주형의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 합성하는 반응을 의미한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 실-시간 PCR에 의한 결핵균 또는 비결핵 마이코박테리아의 검출 또는 정량의 최소 DNA 양은 1 ng 이하이며, 보다 구체적으로는 100 fg 이하이고, 보다 더 구체적으로는 50 fg이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용한 3개의 타겟 유전자를 동시에 증폭하여 분석하여 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 진단키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법은 타겟 유전자(구체적으로는, IS6110, 16S rRNA 및 β-actin)-특이적인 프라이머와 프로브를 이용한 멀티플렉스 실-시간 PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)을 통해 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 매우 높은 효율로 선택적으로 검출할 수 있다.
(c) 또한, 본 발명의 키트는 시료 내 타겟 유전자들을 멀티플렉스 실-시간 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 결핵균과 비결핵 마이코박테리아의 시료 내 감염 여부를 선택적으로 용이하게 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 치료에 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 비결핵 마이코박테리아인 표준균주 M. xenopi KMRC 4200의 형광 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. A, 녹색채널(비결핵 마이코박테리아); B, 노랑채널(결핵균); 및 C, 빨강채널(내적 대조군, beta-actin).
도 2는 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 임상 검체 결핵균의 형광 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. A, 녹색채널(비결핵 마이코박테리아); B, 노랑채널(결핵균); 및 C, 빨강채널(내적 대조군, beta-actin).
도 3은 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아가 혼합된 임상 검체 시료의 형광 결과이다. Y축은 증폭 사이클에 따라 보정된 형광 세기(Norm. Fluoro.)를 나타낸다. A, 녹색채널(비결핵 마이코박테리아); B, 노랑채널(결핵균); 및 C, 빨강채널(내적 대조군, beta-actin).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
실험균주
본 발명은 임상 검체에서 분리된 186주의 결핵균주, 78주의 비결핵 마이코박테리아 균주 그리고 68주의 마이코박테리아(Mycobacterium) 표준균주를 이용하였으며, 상기 균주들은 액체배지(MGIT 마이코박테리아 배지)나 고체(Ogawa 배지) 배지에서 검출되었거나 객담 검체에서 직접 검출된 균주들이었다. 사용된 표준균주는 다음과 같다: M. abscessus ATCC 19977, M. acapulcensis KCTC 9501, M. africanum ATCC 25420, M. agri KCTC 9502, M. alvei KCTC 19709, M. asiaticum KCTC 9503, M. aurum KCTC 19457, M. austroafricanum KCTC 9504, M. avium ATCC 25291, M. bolletii KCTC 19281, M. botniense KCTC 19646, M. bovis ATCC 19210, M. brumae KCTC 19711, M. celatum ATCC 51131, M. chelonae subsp chelonae KCTC 9505, M. chlorophenolicum KCTC 19089, M. chubuense KCTC 19712, M. diernhoferi KCTC 9506, M. fallax KCTC 9508, M. flavescens ATCC 14474, M. fortuitum ATCC 6841, M. frederiksbergense KCTC 19100, M. gadium ATCC 27726, M. gastri ATCC 15754, M. gilvum KCTC 19423, M. goodii ATCC BAA-955, M. gordonae KCTC 9513, M. haemophilum ATCC 29548, M. hassiacum ATCC 700660, M. interjectum ATCC 51457, M. intermedium ATCC 51848, M. intracellulare ATCC 13950, M. intracellulare KCTC 9514, M. kansasii ATCC 12478, M. lentiflavum KMRC 70087, M. malmoense ATCC 29571, M. mantobense KCTC 9977, M. marinum ATCC 927, M. massiliense KCTC 19086, M. microti ATCC 19422, M. moriokaense KCTC 9516, M. mucogenicum KCTC 19088, M. neoaurum KCTC 19096, M. nonchromogenicum ATCC 19530, M. obuense KCTC 19097, M. parascrofulaceum KCTC 9979, M. peregrinum KCTC 9615, KMRC 75002, M. phlei KCTC 9689, M. porcinum KCTC 9517, M. pulveris KCTC 9518, M. scrofulaceum ATCC 19981, M. septicum ATCC 700731, M. simiae ATCC 25275, M. shimoidei ATCC 27962, M. smegmatis KCTC 9108, M. szulgai KCTC 9520, KMRC 31125, M. terrae KCTC 9614, M. triplex ATCC 700071, M. triviale KMRC 70093, M. tuberculosis ATCC 25177, ATCC 27294, M. ulcerans ATCC 19423, M. vaccae KCTC 19087, M. vanbaalenii KCTC 9966, M. wolinskyi ATCC 700010 및 M. xenopi KMRC 42001.
균주 배양 및 DNA 추출
ATCC 및 KCTC 균주는 액체배지에서 배양하여 사용하였고, KMRC 균주는 고체배지에서 배양하여 사용하였다.
액체배지에서 배양된 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 배양된 MGIT 마이코박테리아 배양튜브로부터 액체 배지 500 μl의 액체를 취해 1.5 ml 튜브에 넣고 14,000 rpm로 5분 동안 원심분리시켰다. 원심분리 후 상층액은 버리고 침전물(pellet)에 멸균증류수 300 μl를 첨가하고 끓는 물에서 10분 동안 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm로 5분 동안 원심분리시켜 얻은 상층액을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)의 DNA 템플레이트로 사용하였다.
고체배지에서 배양된 마이코박테리아의 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 1.5 ml 튜브에 멸균증류수 500 μl를 넣고 고체배지에서 1 루프(loop)를 취해 멸균증류수에 풀었다. 상기 튜브를 끓는 물에 10분 동안 중탕 가열한 후 14,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리시켜서 얻은 상층액을 PCR의 DNA 템플레이트로 사용하였다.
객담 검체는 다음과 같이 처리하였다. 15 ml 또는 50 ml 튜브에 담긴 객담량과 동일 용량의 1N NaOH를 첨가하여 10분 동안 방치하여 객담을 액화시켰다. 14,000 rpm에서 2분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 남아 있는 침전물에 멸균증류수 1 ml을 넣고 10초 동안 잘 혼합한 후 14,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 남아 있는 침전물에 멸균증류 1 ml을 넣고 10초 동안 잘 섞은 후 14,000 rpm에서 2분 동안 원심 분리한 후 상층액을 버렸다. 이후, 남아 있는 침전물에 5% 킬렉스 수지(chelex resin; Biorad, USA) 100 μl와 10 mg/ml 프로테나제 K 1 μl를 첨가하여 잘 혼합하였다. 56℃에서 15분 동안 방치하고 잘 혼합한 후 끓은 물에 10분 동안 중탕 가열하였다. 중탕 가열 후 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리시켜 얻은 상층액을 PCR의 DNA 템플레이트로 사용하였다.
서열 정렬에 기초하여, 본 발명자들은 목적 부위(regions of interest)를 찾고 the Primer 3 program(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 또는 수작업으로 프라이머들 및 프로브들을 제작하였다. 보다 상세하게는, NCBI의 데이터베이스에서 얻을 수 있는 마이코박테리아 균종의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 과다가변성 부위(hypervariable region)에서 비결핵 마이코박테리아에 특이한 염기서열 부위를 동정하여 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 본 연구에서 고안되어 이용된 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브들은 표 1에 제시되어 있다.
결핵균(IS6110), 비결핵 마이코박테리아(16S rRNA) 및 내적 대조군(beta-actin) 검출용 실-시간 PCR 프라이머 및 프로브.
대상유전자 서열(53) 예상 크기(bp)
IS6110 정방향 프라이머 atggcgaactcaaggagca 93
역방향 프라이머 cctcacggttcagggttagc
Taqman 프로브 Hex-ttacggtgcccgcaaagtgt-BHQ1 또는
VIC-ccaactacggtgtttacg-MGB
16S rRNA 정방향 프라이머 ttktggtggaaagcttttgc,
tggtggaaagcgtttggt 또는
tggtgwgtggtgcaaagctt		 146
역방향 프라이머 cgtaggagtctgggccgta
Taqman 프로브 FAM-cctgagagggtgwccggcc-BHQ1 또는
FAM-ctgtgggatgagcccgc-BHQ1
beta - 액틴 정방향 프라이머 aactggaacggtgaaggtg 148
역방향 프라이머 tggcaagggacttcctgta
Taqman 프로브 Cy5-agtcggttggagcgagcatc-BHQ2
멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응법( multiplex real - time PCR )
멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응은 Rotor-Gene multiplex PCR Kit(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)를 이용한 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)로 실시하였다. PCR 조건은 다음과 같다: (a) 전-변성(pre-denaturing) 단계, 95℃에서 5분; 및 (b) 40 사이클, 95℃에서 15초(변성 단계) 및 64℃에서 15초(어닐링 및 연장 단계)로 구성된 1사이클. 이때, 멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 2에 제시되어 있다. 하기 프라이머-프로브 혼합물(primer-probes mix)은 결핵균과 비결핵 마이코박테리아의 대상유전자를 검출하기 위한 10 pmole/μl의 정방향 프라이머, 10 pmole/μl의 역방향 프라이머, 그리고 4 pmole/μl의 프로브를 포함하였다. 따라서, MTC(mycobacterium tuberculosis complex)를 검출하기 위해 이용되는 프라이머-프로브 혼합물 1.25 μl는 정방향 및 역방향 프라이머가 각각 12.5 pmole, 그리고 프로브는 5 pmole을 포함한다. 하지만, 내적대조군(Internal control, IC)으로서 이용되는 대상 유전자를 검출하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 6.7 pmole/μl, 그리고 프로브는 2.7 pmole/μl을 포함한다. 중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 총 부피가 25 μl이기 때문에, 결핵균과 비결핵 마이코박테리아를 검출하는 프라이머의 농도는 0.5 μM(12.5 pmoles/25 μl), 프로브는 0.2 μM(5 pmole/25 μl)가 사용되었고, 내적 대조군인 대상유전자를 검출하는 프라이머의 농도는 0.27 μM(6.7 pmole/25 μl), 프로브는 0.11 μM(2.7 pmole/25 μl)이었다. NTM의 정방향 및 역방향 프라이머, 프로브의 농도는 MTC와 동일하게 사용되었다.
중합연쇄반응을 수행하는 반응물의 구성 및 농도.
성분 부피
(l) 		농도
2X Rotor-Gene Multiplex PCR Master Mix 12.5 1X
프라이머-프로브 혼합물 프라이머(10 pmole/μl):
IC 프라이머(6.7 pmole/μl)		 1.25 0.5 μM:
0.27 μM
프로브(4 pmole/μl):
IC 프로브(2.7 pmole/μl)		 0.2 μM:
0.11 μM
뉴클레아제-결핍 물 6.25 -
샘플 DNA 템플레이트 5 -
전체 25 -
멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 Rotor-Gene Q(QIAGEN Inc., Germantown, MD, USA)에서 측정한다. 상기 멀티플렉스 실-시간 중합효소연쇄반응 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 실-시간 중합효소연쇄반응의 매 주기마다 실-시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 실-시간 모니터 상에서 FAMTM이 발색되는 경우 녹색채널(510 ± 5nm), HexTM나 VICTM이 발색되는 경우 노랑채널(555 ± 5nm), Cy5TM이 발색되는 경우 빨강채널(660 ± 10nm)에서 표시하도록 지정하였다. 녹색채널(green channel), 노랑채널(yellow channel), 빨강채널(red channel)에서 형광을 관찰하였다.
실험결과
비결핵 마이코박테리아인 표준균주 M. xenopi KMRC 42001의 경우는 녹색채널에서만 형광이 관찰되었으며(도 1), 임상 검체에서 결핵균이 분리된 경우는 사람의 베타-액틴 유전자가 포함되어 있으므로 노랑채널 및 빨강채널에서 형광이 관찰되었다(도 2).
임상검체에서 결핵균과 비결핵 마이코박테리아가 혼합되어 있는 경우는 모든 채널(녹색, 노랑 및 빨강)에서 형광이 검출되었다(도 3).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 다음의 단계를 포함하는 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 선택적 검출방법:
    (a) 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
    (b) (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 결핵균 검출 세트; (ii) 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 비결핵 마이코박테리아 검출 세트; 및 (iii) 서열목록 제11서열 및 서열목록 제12서열을 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제13서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하는 단계로서 상기 프로브는 형광 표지로 표지화되어 있으며; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 DNA 시료는 객담, 혈액, 타액 또는 소변으로부터 유래된 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 선택적 검출방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭은 실-시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 선택적 검출방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 선택적 검출방법.
  6. 삭제
  7. (i) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 결핵균 검출 세트; (ii) 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 및 서열목록 제8서열의 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브로 이루어진 비결핵 마이코박테리아 검출 세트; 및 (iii) 서열목록 제11서열 및 서열목록 제12서열을 포함하는 프라이머 쌍, 그리고 서열목록 제13서열의 프로브로 이루어진 내적 대조군 검출 세트를 포함하는 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 선택적 검출용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실-시간 PCR에 따라 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 실-시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드를 포함하는 비결핵 마이코박테리아 검출용 뉴클레오타이드 분자.
  12. 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드를 포함하는 비결핵 마이코박테리아 검출용 프로브.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 5’-말단은 FAM, VIC, HEX 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3’-말단은 BHQ-1, BHQ-2 및 MGB로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 퀀처(quencher)로 표지된 것을 특징으로 하는 비결핵 마이코박테리아 검출용 프로브.
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