PT88562B - Metodo de ensaio de proteccao homogeneo para a deteccao de um analito - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

Ò presente invonto diz respoito a um método do ensaio diagnóstico homogéneo aperfeiçoado e a marcas para a detocção de um analito num meio quando o analito é um membro de um par de ligação especifica. Os métodos o marcas fornecom procedimentos para reduzir o fundo o aumentar a sonsibilidado. 0 parceiro do ligação do analito ó rareado com uma substância, cuja estabilidade varia dotoctávolmonto sempre quo o referido analito ostá ligado como um membro do par de ligação ospocifica.

ML TECIINOLOGY VENTURES, LP. ,

MÉTODO DE ENSAIO DE PROTECÇÃO HOMOGENEO PARA A DETECÇAO DE UM ANALITO

Num sistema intimamonto relacionado cora esto, o analito ó marcado com uma substância suscoptivol à dogradação diforoncial dependente do analito estar ou não ligado como um membro do sou par do ligação especifica.

Após incubação o degradação soloctiva ou alteração quimica ou bioquímica, a quantidade de ana lito ligado e dotectada por medição ou da variação da estabilidade ou da oxtonsão da degradação da marca.

Num sistema particular, são usadas sondas marcadas com éster do acridínio quimioluminiscente numa modalidado do onsaio do hibridização homogónoo para dotoctar sonsivelmento a presença do sequências polinuclootídicas alvo de qualquor complomento.

Esta memória descritiva c uma continuação de Arnold, L. J. , Jr. and Nelson, N. C. App. Son. No, 099,392, datada do Sotombro 21, 1987.

Antccodeiitos

Este invento está insorido no ramo dos processos o técnicas do diagnóstico, para a detecção o quantificação do quantidades diminutas do compostos orgânicos.

Mais particularmonto, esto invento rolaciona-so com ensaios do diagnóstico homogéneos, nos quais oxisto uma diforonça na ostabilidado da marca quando ostá ligada em oposição às suas formas não ligadas. Este invento rolaciona-so com a construção do ambientes, para sistemas de onsaio de diagnóstico, nos quais uma marca ó difrontemont3 degradada om ambas suas formas comparada ou ligada, quando compararia com as suas formas não complcxadas o não ligadas.

Antecedentes do Invento

Os ensaios de diagnóstico são uma técnica analítica comum para a detecção, localização ou quantificação do substâncias biológicas, através do emprego do reagentes do ligação marcados. Λ presença do reagente marcado podo depois ser detoctada usando uma variedade de métodos conhecidos. Este invonto pode ser aplicado a todas as formas do ensaios de diagnóstico conhecidos, incluindo, sem limitação, ensaios de competição o do ligação directos e de saturação sequencial. Um tipo particular de ensaio de diagnóstico

ο ο onsaio do hibridação do ácido nucloico. Os sistosas do onsaio do bibridação são basoados no facto quo os ácidos nuclaicos do cadoia simples (ADN ou ) nibridizam ou rocor.ibinam-so sob circunstâncias apropriadas com ácidos nucloi cos do cadoia simples complementar. Por marcação do ácido nucloico sonda complementar com una marca rapidamonto dotoctávol, é possivol dotoctar a presonça da sequência polinucleotídica alvo do interesso, numa amostra tosto, contendo sequências do ácido nucloico de cadeia simples.

Os sistonas do onsaio podem, do um modo grosseiro, sor caractorizados como homogéneos o heterogéneos. 0 termo heterogéneo aplicado a sistoraas do onsaio, significa aqueles onsaios de libação ospocificar que requerem uma separação de substância marcada da não marcada, a sor dotcctada. Por outro lado, sistemas do onsaio homogéneos não envolvom nenhuns passos de separação física. Porque os sistemas do ensaio homogónoo onvolvom um númoro minimo do passos manuseados, oles são -joralmento mais convoniontos o fáceis do usar do quo os sistoraas de onsaio hotorogénoos.

Por exemplo, um imuno-ensaio do sandwich tipico pode envolver a incubação de um anti-corpo imobilizado com um moio do tosto. Os antigenes so estiverem no meio ligar-se-ão ao anticorpo. Dopois da incubação, o antigénio não ligado o romovido, num passo de separação. Dopois do um segundo, ou de incubação simultânea com uma solução do anticorpo marcado, o antigénio ligado torna-so onsaduichaclo” ontre o anticorpo imobilizado e o anticorpo marcado. Dopois de um sogundo passo do separação a quantidade de anticorpo marcado podo sor detorminada como uma modida de antigénio no moio. Este sistema decorro duranto um determinado tempo, porquo onvolvo uma sorio do passos de incubação e de separação.

Um osforoo espocial da técnica antecodento ora onsaios do diagnóstico, tora vindo a sor dirigido para o dosonvolvinonto do onsaios liomogcnoos o de raarcas 'íor.iogóneas, quo podem doscriminar ontro diferenças monoros do quantidados do ligação, ora oposição a substancias não ligadas 'o interesso. Uri dos objoctivos do prosento invento ó obtor ura sistema do onsaio no qual a marca por si própria origina unia variação dotoctável, quo podo sor, por oxomplo, na sua capacidade de quiinioluminiscência, quando ostá na sua forma ligada, em oposição quando não ostá ligada. Outro objoctivo do prosento invento ó obtor um sistoma do onsaio no qual a marca e substancialraonto dogradada ou dostruida orna ambas as formas ligada ou não ligada, do modo a fornecer um moio rápido para identificação e quantificação do uma reacção de interesso.

uni objectivo do prosento invonto doscrovor um mótodo nolliorado para dotoctar com sensibilidade analitos, usando um tipo de onsaio homogéneo, n também um objoctivo dosto invonto fornecer niótodos r.iolhorados para aumontar a sonsibilidado dos onsaios quo onvolvom separação por combinação do métodos homogéneos descritos nesta memória descritiva com outros métodos do separação, para reduzir os fundos espocificos. 0 principio do invonto descrito nesta momória doscritiva ó baseado na ostabilidado diforoncial do uma marca para com roagontos quimicos o bioquímicos. Doscohi-so quo quando algumas marcas estão conjugadas a parceiros do ligação, a estabilidado das referidas marcas são ou podoni sor alteradas, quando o referido parceiro do ligação ostá ligado a uma substância de ligação do roforido parcoiro de ligação. É também objectivo deste invento descrever um método atravos do qual a roforida estabilidado da marca diforencial possa sor ompreguo na dotecção sensível de um analito, usando um sistema do ensaio do diagnóstico homogéneo. Ainda outro objoctivo do prosento invonto e descrever o uso do sondas do ADN marcadas com éster de acridinio quimioluminis-6-

conte nos roforidos onsaios do diagnóstico ho.-:oonaos, para a dotocção sonsivol da prosença do sequências do polinuclootídoos alvo complomontaros.

Ooscrição da técnica antorior

Existem uma sório do ensaios hor.ogonoos nos antecedentes da técnica anterior quo variam em complexidade. Em alguns sistemas, por oxomplo, a marca o um catalisador quo podo participar numa reacção química na pre sença do outros componontos, por oxemplo, enzimas, co-onzima o co-factoros. Por outro lado, não obstante sistemas relacionados, a marca ó um substracto por uma reacção quimica ou bioquímica. Nostes sistemas, a geração do uma substância rapidamonto dotoctávol especifica, por oxomplo, a glicose lactato ou álcool ó usada pira monitorizar o medir a reacção alvo. Num outro sistema do onsaio, o analito possui propriedades físicas únicas quo o permitem sor diroctamento dotoctc do, Exomplos dostes tipos de marcas incluem metais, hemoglobina e clorofila.

Ainda outros sistemee do onsaio homogónoos são baseados om roacçõos de ligação ospecifica do acoplamento a enzimas. Quando um analito ostá prosente, origina uma roacção de ligação especifica com um conjugado quo ó constituído por ura parcoiro do ligação ospocifico a uma substancia marcada. Tanto por concomência ou subscequôncia, outros substituintes são adicionados quo intoractuam com a marca. Λ actividade da marca o diforento quando o conjugado do qual a marca ó diforonto quando o conjugado do qual a mar· ca ó um corapononto, ostá numa forma complexa versus uma forma não complexa. Esses sistemas usam tipicamonto onzimas cono roagonto do marcação o subs^ractos quo produzon nm ponto final colorimétricos, f luorimétrico ou químicoluminosconto. Exomplos do inuno-onsaios onzimáticos homogéneos incluom as Patontcs U.S. Nos. 3.654.090, 3.817.837 o 4.190.496. Outros oxonplos do ensaios homogéneos envolvem o uso do cromoforos, quo fornam pares do fluoroscência/oxtinção podem sor encontrados nas Patontos N.S. Nos. 4.19^.559, 4.174.384 o 4.318.707. Contudo om alguns sistemas, a marca é uma outra substância do que uma enzima, por oxor.iplo, vitaminas, NAD, FAD ou biotina, quo todavia podo sor acoplado a uma reacção do monitorização. Um exomplo dosto tipo ostá na Patonto U.S. No. 4.383.O3I. Nostos sistomas, a reacção do monitorização é basoada numa variação ostrutural quo modifica a actividado da marca.

Noutros sistemas do ensaio homogénoo onvolvom a técnica de fluoroscôncia do polarização. AÍ, o analito compoto com um conjugado fluorosconto de baixo poso molecular, para a ligação a um parceiro do ligação especifica, do poso nolodular elovado. Dosdo que a polarização da fluoroscôncia vario quando a molécula mais poquona é separada da superfície da molécula maior, é possivol determinar a quantidado de analito oxistonto na solução. Um exemplo dosto tipo do sistoma de ensaio ostá na Patonto U.S. No.4.668.64o.

Ainda outro tipo do sistoma do ensaio homogéneo onvolvo a transferência do enorgia não radioactiva. Nostos sistemas, a absorção da luz de uma molécula para outra, quando duas moléculas so aproximam é usado como reacção do monitorização. Goralmonto, ostes métodos tôm vindo a ser descritos do duas maneiras, Num método, a primeira molécula o quimicoluminosconto e lopois da excitação uma porção da onorgia olectromagnética gorada o transferida a uma segunda molécula absorvente que dove estar nas aproximidades. So a onorgia e absorvida por uma segunda

molocula c emitida num comprimento do onda diferente, uma porção do luz mostrará um desvio espectral proporcional ao número de moléculas quimioluminoscontos que ostão nas aproxi midados das moléculas absorventes.

Noutro tipo do sistema do ensaio energético não radioactivo, a primeira molécula é fluoresconto o servo como um absorvente” do luz externa. Na prosonça do uma sogunda molécula fluorescente uma porção do enorjia e transferida o a luz ó omitida a um comprimento do onda diferonto. Λ lua emitida mostrará um desvio espectral proporcional ao número do moléculas absorventes o omissoras que ostão nas aproximidados do cada uma.

Um tipo diferonto do sistema do ensaio do sonda dupla é descrito na Patonto U. S. No. 4.670.379· Λ primeira sonda ó marcada com un catalisador, a segunda com um apoluminosconto. Ambas sondas fazem alvo nas áreas vizinhas na soquôncia do ácido nucloico alvo. Quando ambas as sondas ostivoron liibrid-izadas era conjunto com o alvo, o substracto ó adicionado. 0 catalisador converto o substracto a um radical transformador que, por sua voz, converto o apololuminoscente numa sogunda sonda a um luminosconto. Isto ocorro somente se a hibridização so dor. Bniprogando estos princípios, têm vindo a dosonvolvcr-se onsaios baseados em duas substâncias marcadas simultaneamente ligadas a um analito comum.

Um exemplo especifico deste tipo do sistema do ensaio do transforôncia do energia o o Elazar et al., Podido do Patente Europeia No. S5105130, a publicação No.0159719, publicado cm Outubro 30, 19S5,quo descreve a utilização do duas sondas do ácido nudbico de cadeia simples, que são complomontaros à mesma cadeia ou cadoias opostas do matorial gonético alvo. Cada sonda é marcada com uma porção capaz de produzir um sinal unicamente quando as duas

marcas são aproximadas. Diforontomento ao invento aqui descrito o de Elazar ot al. , envolvo a formação e dotocção do híbridos ou multi-liíbridos duplos. Identicamonto, iiollon ot al., Aplicação da Patonto Europeia No.82303699,1, Publicação No.OO7OÓ85 datada do Janeiro 2b, 1983, o relacionado liorrison et al. , Aplicação da Patente Europoia No. 32303700,1 Publicação N0.OO706S6 da mosma data, dsscrevora sis tomas de onsaios horaogónoos usando duas sondas luninescontos. Polo monos uma das sondas do luz ó do tipo absorvente/emissor, do modo que quando as duas sondas ostão hibridizadas ao alvo, a transferência da energia ocorra. Entro as duas marcas. Isto causa que o absorvonto/emissor re-emita a um comprimontj de onda diferente. A segunda omissão dotecta a hibridização. Um ensaio antigonio dcsto tipo ó descrito om Morrisson et al., acima indicado.

Maior parte das substâncias biológi^ cas não podem sor rapidamente detectadas diroctamonte om qualquer nívol razoávol do sonsibilidade o requerer uma roacção do ligação do mesmo tipo. Como ó evidente da discussão anterior, 03 antccedontes da técnica são basoados na dotocção de atonuaçõos menores entro a marca ligada o não ligada. Os sistemas, nos antecedentes da tócnica, não são capazes da descrição significativamente entro a marca ligada e a não ligada. Descobriu-so que estes onsaios são útois para a detecção do analitos que estão presentes somente om altas concontraçõos, por exemplo na monitorização do várias drogas, no sanguo o na urina.

Existe uma necossidado na área dos diagnósticos clinicos para um onsaio homogónoo de detecção directa que seja baseado na capacidade quo dois parcoiros de ligação tom de modificar a estabilidade da marca, por oxemplo, resultante na remoção selectiva ou dostruição da marca, am ambas formas ligada e não ligada. Enquanto que

dirsclifie lei, em Florosconco Dackground Jiscriniination by Prcbloacliing J. Histochoniistry and Cytochor.iistry, 27/1, 9Ó-101 (1979) descrevo ui?.a tócnica eloctro-óptica do algum modo rolacionada, envolvendo branqueamento fotoquiriico , que podo destruir as moléculas da marca, ou polo monos a sua fluorescência. 0 invento descrito nesta memória descritiva, não ensina ou sugere o uso do branquoamonto fotoquímico ou qualquer outra tócnica para a romoção selectiva ou destruição do uma marca num ensaio do diagnóstico. 0 assunto do invento preencho a presonto necessidade nos ensaios do diagnóstico numa ordem do magnitude mais sonsivel do quo nos antocodontos da tócnica anterior. A gama do sensibilidade nos ensaios antecedentes da tócnica antorior não ó melhor do quo um limito do 10 molo, enquanto quo o pre

6 sente invonto ó sonsivel num limite do 10 ' molo.

Sumário do Invento

Com brevidade, osto invonto comproondo métodos o ensaios do diagnóstico. Omótodo podo sor usado para detoctar um analito num inoio, sendo o referido analito parte do um par do ligação ospocifico. Quando o meie suspoito do contor o analito ó combinado com um parceiro do ligação, uma substância da marca ligada ao parceiro do ligação ó capaz do originar uma avriação dotoctávol na estabilidade ou na dogrodaÇão diferencial, quando o analito so liga ao parceiro do ligação ospocifico. Num modo do roalinação ospocifico, sondas do ácido nucloico de cadeia simpios tom vindo a sor modificadas do modo a contor narcas ora virtualmento qualquer posição ou localização na sonda. As marcas na sonda são do estabilidades diforontos ou suscoptivois do degradação diferencial, dependendo se a sequência do ácido nucloico alvo ostá hibridizada com a sonda.

Notavolmonto, o prosonto invento compreende sisíor.as do ensaio ondo a marca na sonda ligada ostá estabilizada a uma sonda não ligada. 0 composto do intorcalação do DNA, incluindo estoros do acridinio, são particularmonte, mas não oxclusivamonto, adequados para o uso nostos sistemas do or.saio, do invento. Os intorcaladoros do D'TA são caractoristicanionto moléculas planas quo podom ser inseridos ontre pares de basos da bélico dupla do DNA. É ovidonto a indicação do quo os ostoros de acridinio so proforom insorir on rogiõos ricas em paros do basos da adonina o timidina.

Devo sor ontondio quo embora o prosonto invonto quo dopois ó aqui doscrito com particular referência a sondar marcadas com ostor do acridinio, contemple o uso do marcas oquivalontos o tipos do onsaio quo são suscoptivois a dogradação diforoncial ou variação em estabilidado, quando o conjugado no qual a marca ó um componente, ostá ligado. Gomo sorá aqui oxplicado ora maior dotalho, outros compostos do marca adequados, incluom substâncias que são dosostabilizados por aninas presentes nos ácidos nucloicos, particularmente aqueles nas vizinhanças da marca do sondas não hibridizadas. Além disso, as substâncias do marca quo podom intercatuar com ambientes hidrofóbicos, por exemplo, por intercalação ontre paros do basos, também podom sor usados.

Esto invonto tom aplicação goralraonto em qualquor sistema envolvondo a degradação substancie soloctiva da marca, quando comparada com as suas formas ligada o não ligada. Além disso, dovido à simplicidade rela tiva do sistema do onsaio, quo não envolvo qualquor passos do separação ou do lavagem, ó tanto mais rápido quanto monos dispendiosa, do quo os sistomas convencionais. 0 sistema podo ser mais sonsivol do que os sistoraas convencionais, naquoles casos em quo oxistem grandos diferenças ora estabi-12-

lidade entro as fornas conjugadas ligadas o não ligadas, ia naroa, porque virtualr.onto todo o rosiduo ou conjugado da marca não ligada o dostruida o, por isso, não ó detoctarla. Finalmonto, o sistoma o muito vorsátil o podo ser usado tanto sozinho, ou om combinação com outros métodos do separa ção para atingir un ruído do fundo muito baixo. 0 presonto invonto ó útil otn diagnósticos com sonda, incluindo dotocção do doonças infocciosas o gonóticas o virais o do diagnós tico do cancro.

Drevo doscrição dos Dosonhos

A figura 1 e uma roprosentação gráfica cia purificação por CLAR de uma sonda marcada com óstor acridínio.

A figura 2 ó uma roprosentação gráfica dos dos no Exomplo 2.

As figuras obtidos no

3-5 são roprosontações gráficas Exemplo 3.

resultados obtidos resultados

Λ figura 6 dos no Exemplo á.

ó uma represontação gráfica dos rosultados obtiA figura 7 no Exemplo q uma roprosentação

5.

gráfica dos rosultados obtidos

Λ figura 8 no Exemplo o uma roprosontagão 6.

gráfica dos resultados obtide s

Molhor MÓ bodo o Descrição DotaEiada dos Uodos do Roalinação

ProDoridos

As dofiniçõos seguintes serão asadas nesta doscrição:

1. óstor do acridínio: dorivado de acridínio possuindo un centro do anoto quatornário o dorivado na posição 9 para originar una porção do éster do fonilo lábil, ospocialnonto o 9-carboxilato-fluoro-sulfonato de 4-(2-succininidiΙσχίο arboni1-etil)fonil-10-motilacridínio:

O

2. Estoros do acridírtio : porçõos do tipo geral sojninto:

«4

Ri

R-^-alqui lo, alconilo, arilo, alquilo substituído, alconilo substituído, arilo substituído, alcoxi, arlloxi, ou está ausento quando X e halogéneo substituído, alco1^2”^, alquilo, alconilo, arilo, alquilo substituído, al nilo substituido, arilo substituído, alcoxi, arlloxi so o só so X for II.

amino, amido, acotilo, alquilo, alconilo, arilo, acotilo substituído, alquilo substituído, alconilo substituido, ondo arilo substituído, alcoxi, arlloxi.

R/j-alquilo, alconilo, arilo, alquilo substituido, alconilo substituido, arilo substituido.

X-O,N,S, halogónoo, fósforo substituido, enxofro substituido boro substituido, ou arsonio substituido

Y-O,S, ou NII

R^ e/ou Rg o/ou R^ c/ou R^ mito conjugação química.

tom um sitio roactivo quo por-

3. analito- qualquer substância capar: do suportar una reacção do ligação com um ou mais parceiros do ligação especifica, incluindo som limitação, antigónios o sous anticorpos, haptonos o seus anti-corpos; hormonas, drogas, motabolitos vitaminas, co-onzimas o sous parceiros do ligação, incluindo rocoptoros; polinuclootídoos; oligonuclootídoos e lixbridos do polinucleotidoos ou oligonuclootidoos o anticorpos o suas substâncias do ligação; polinucleotidoos ou oligonuclootideos o sous polinucleotidoos ou oligonucleotideos hibridizávois, notais o sous agontos quolantos.

4. parceiro do ligação - qualquer molécula ou substância capaz do suportar uma roacção do ligação especifica com um analito.

5. duplox: complexo do cadeia dupla fornada através da fusão do duas moléculas do ácido nucloicos do cadoia simplos.

6. híbridização: ou formação do duplexes ostávois entro duas moléculas do DNA ou RNA de cadoia simplos ou ontre uma molécula do DNA o RNA complementar. A formação dupla é espocifica para paros do basos complemontaros, por consoguinto, reproduzindo o código gonetico do gono especifico hibrizidado.

7. ligação: condição no qual uma intorcação do ligação tom vindo a sor formada ontro uma molécula o o sou parceiro do ligação ospocifico.

8. ostávol; rosistonto à degradação nuimica ou bioquímica à reacção, decomposição, substituição ou modificação.

9. Estabilidade: a resistência do ur.ia substância à degradação bioquímica ou quinlca à reacção, decomposição, substitui ção ou modificação.

á sabido quo ora solução os ésteros do acridxnio oxistem em equilíbrio cora as pondentes. A pll alto, a formação do bases espécies de azoto quaternário refornam-so suas bases corresó favorecida; as a pll baixo. IÍ também conhecido que a reacção quiraiolaminoscento podo sor afoctada pela adição do base, ospecialraento as soluções aquosa de hidróxido do sódio, contendo poróxido do hidrogénio. A quimioluminescência envolvo o ataque por iões Iiidroporóxido às espocios de acridínio, quo resulta na formação do N-motilacridona. olectronicamentc excitado. Vor goral monte Ueeks ot al., Acridinium Estors as High-Specific Activity Labols in ImnTanoassay, Clin. Chora. 2918, 1474-1479 (1983). Λ roacção está osqueraatizada a soguir.

Ο presente invento pode sor realizado na seguinto forma, Primeiro, os parceiros do libação geloccionados compreendendo urna substância de libação o um ou mais parceiros de ligação para o ensaio a sor realizado, Estes pares podem sor antigónios o seus anticorpos; liaptonos o sous anticorpos; hormonas, drogas, motabolitos, vita minas, co-onzimas o sous parceiros de ligação, incluindo roceptoros; polinuc loo tídoos , oligonuclootídoos. Iiibridos do polinucleotídeos ou oligonuclootidoos o anticorpos o suas substâncias do ligação; polinuclootídoos ou oligonucloo tidoos e sous polinuclootídoos ou oligonuclootídoos hibridizávois; motais o sous agontos quolantcs.

Sogundo, soloccionar o tipo do onsaio a ser usado. Esto podo sor soloccionado a partir do tipos que compreendem ensaios de ligação dirocta, ensaios de compotição, métodos de saturação sequencial, o ensaios sanduicho.

Torcoiro, soloccionar uma marca para onsaio a sor roalizado. Esta podo sor uma marca quo possa ser dotoctada dlroctaraonto ou indirectamonto por meios colorimótricôs, fluorimotricôs, quimioluminosoentes ou bioluminescontos. Λ marca devo adicionalmonto tor a propriedade de podor ser quimicamonte ou bioquimicamonto degradada de modo a modificar a sua capacidade de sor dotoctada, sondo a referida degradação possivel sob condições que não advorsamonte afectom a ligação ontro o parceiro do ligação marcado e a sua substância de ligação e outros parceiros do ligaçao o substâncias da ligação quo possam participar na roacção. As marcas proforidas são aquelas quo são afectadas na sua capacidado do sorotn dotectadas dopois da exposição a ácidos, basos, ou agontos do oxidação selectiva como poroxidato ou enzimas.

Quarto, usando métodos químicos conhecidos no ramo, o ataque da marca à substância de ligação num local do modo a que a senslbilidado da marca rolativamento à degradação quimica ou bioquimica soja modificada através da intoracção do parceiro do ligação marcado cora a sua(s) substância(s) de ligação ospecifico(s ). Em alguns Casos, vários locais diferontos podem sor testados para que a união da marca e do local quo dá a melhor degradação diforencial possa sor usado.

Quinto, optimização das condições de degradação, sondo elas quimicas ou bioquímicas, para dar a molhor doscriminação de dotecção do parceiro do ligação marcado na presença o na ausência da sua substância de ligação.

Finalnonte, usando o tipo do ensaio pré-soloccionado, tostar a capacidade do sistema de ensaio para dotoctar quantitatlvamento ou qualitivamento o analito goralmcnte omprogando os passos de;

a. Incubação

b. Degradação selectiva

c. Dotecção

a. ou simultaneamente incubação o dogradação selectiva

b. Dotecção

Emprogando os to invento, sondas oligonucleotidicas marcadas com ósteros do acridínio quimioluminoscentos sao particularmente úteis para a dotecção de polinuclootidoos do sequência ospecifica através de hibridização. Os ósteros do acridínio podem ser unidos a um número do locais diforontos nas sondas do DNA e/ou polímeros

nuclootidicos/não nuclootidicos misturados como descrito no Podido de Patonto U.S. No. Sor. (ainda não cedido) datado do Sotombro 21, 1987, ontitulado de Non-Nuclootido Linking Roagonts for Nuclootidod Probos por Arnold, et al., Isto inclui a capacidade da marca do bases nuclootidicas, a parto principal fosfato, os rosiduos do açúcar, a extremidade 3’, o a extronidado 5} dos oligonuclootideos, assim como as unidados monoméricas não nuclootidicas do poliicoros nuclootidicos/não nuclootidicos misturados.

Estas sondas marcadas com éster do acridinio podom aprosontar estabilidade quimica cliferoncial significativa quando as sondas à qual elas estão unidas ostão livros em solução, quando comparadas quando ostão hibridizadas. Esta estabilidade diferencial é dopendonto da posição do óster do acridinio na sonda, dos rosiduos nuclootidicos na vizinhança da marca de éster de acridinio o da presença de outras moléculas sonda quo formam híbridos ostávois com o polinuclootídeo alvo. Uma representação gráfica está roprosontada a seguir.

Descobriu-so no curso da determinação de factoros quo contribuem para a ostabilidado diferencial do óstor do acridínio nas moléculas de sonda do DNA, quo as aninas livros nas basos das sondas não hibridizadas (ambos nuclootídoo o nuclootidoo/não nuclootideo misturado dostabilizam o óstor do acridínio, ospocialmontc nur. ambionte alcalino. Ao nosno tompo, so o óstor do acridínio ostá perto da oxtronidado da sonda, podo ser dosestabilizado à forna alcalina por aminas, contribuindo com soquôncias alvo, uma voz quo a hibridização ocorro. Quando a sonda hibridiza com um polinucleoticloo ospocifico (substância do ligação), as aminas da sonda participam no parolh.amon.to da baso com nucleotidoos complomontares o são restritos na sua capacidade para destabilizar o óstor do acridínio, ospccialmonto num ambiento alcalino. Λο mosmo tompo, doscobriu-so quo o óstor de acridínio foi ainda ostabilizado contra a dogradação por intorcalação no duplox do híbrido, particularmonte em regiões da donsidado do pares do baso adonina/timidina, Descobriu-se quo um númoro de outras rogiõos do inserção também dá boa hidrólise diforoncial, como explicado na socção seguinte.

Existem vários modos polos quais esto invonto podo ser aplicado à hibridizaÇao. Isto inclui som limitações:

1. Ataquo do óstor do acridínio à região contrai da sonda o porto do uma região do paros do basos adonina/timidina. Um mótodo proferido ó ligar um óstor do acridínio a uma unidado monomórica não nuclootidica como descrito no Podido do Patonto U. S',’ No. Sor. datada do Sotombro 21, 1987 intitulada do Non-Nuclootido Linking Roagonts for Nuclootido Probos do Arnold, ot al., quo ó ligado como uma insorção em unidados monoraóricas nucleotídicas quo são complomontaros a nucleotidoos imediatamonto adjacon-23-

tos cia sequência poli-nuclootidica alvo. Csta colocação sorvo para restringir as aminas das bases nuclootidicas com ambos os locais do óstor do acridinio o fornecer um local para a intercalação.

2. Ataquo do óstor do acridinio a ambas oxtromidades 3' ou 5’ da sonda o restrição dos ofoitos das aminas próximas quo contribuem no polinucleotideo alvo com uma segunda sonda hibridizada adjaconte à primeira. í também desejável se a referida segunda sonda cria uma região rica em pares de basos Λ/T na formação do duplex. Mesmo assim esta sonda dupla ou sistema de sanduicho dependente da formação de dois duplexes on voz do só um, pode fornocor um método para dotectar com sensibilidado variações menores om pares do bases quo possam sor descriminadas por sondas muito pequenas, isto ó, sondas de aproximadamonto de 5-15 nuclootideos ao comprimento.

Sob circunstâncias normais estas sondas pequenas tom a cagacidade de descriminar uma única má ligação sob condiçõos do hibridização apropriadas. Contudo, numa manoira prática, não sáo usados porque elas não são suficiontomente especificas para unirom-se a locais pollnuclootídicos únicos. Isto é, a pequena sonda pode h.ibldizar vários locais os -ecificos contidos num múltiplo de sequências de complexos do RNA ou DNA presentes. Com o roquorido adicionado, de quo duas sondas diforentos dovom hibridizar imodiatamente om rogiõos polinuclootidicas adjacontos, estas rogiõos podem sor ospocif icarionto atingidas o idontifiçadas. Assim, os bonoficios da doscriminação da poquona sonda pode ser utilizado enquanto mantém a especificidade da rogião atravessada por ambas as sondas.

3. Ataque do éster do acridínio no ou porto do local do uma má aliança com uma soquèrcia polinuclootidica, isto á não é o polinucleotidico alvo desojado. Dosto modo a doscriminação ontro as sequências polinuclootídicas diferem ora unicamente um nuclootidoo, podo sor atingida, dosdo quo na área à volta do duplox ura local do má ligação ostoja suficiontomento desestabilizada para rostituir o óster do acridinio (so está ligado na ou porto dosto local suscoptivol do dogradação.

4. Ataque do éster de acridinio a uma região da sonda do modo a monitorizar a ostabilidado local do ura híbrido sonda-alvo. Dosto modo, o óstor de acridinio podo servir para monitorizar porto a estabilidade do híbrido local sob condições no qual o duplex híbrido total não se encontra, mas sot o qual a região híbrida local parcialmonte fundo.

Um modo proferido para os três tipos antoriores o conduzir o passo da hidróliso diferencial à mesma temperatura do pa3so de hibridização tipicamente do 50 a 70?C.

Outro modo o conduzir um segundo passo do hidróliso diferencial à temperatura ambiento. Isto permite um pH na gama de 10-11, seja usado, originando ainda maiores diferenças na volocidade do hidróliso ontro sondas marcadas com óster do acridínio hibridizadas e não hibridizadas.

Métodos c Materiais Experimentais

Os exemplos seguintes são dados como forma de ilustração e não são meios de limitação. Estes exemplos são baseados cm dados correntomonte disponíveis o nas explicações o fonómenos mais provávois. Outros factoros e métodos podem tornar-so evidentes com uma pesquisa maior. Embora o invento tenha vindo a ser descrito em detallie pela via da ihstração o dos oxemplos usando marcas de éster de acridínio, algumas variações c modificações podem sor praticados no âmbito das reivindicações e outros sistemas de marca também podem sor empregues no âmbito das reivindicações.

EXEMPLO 1

Construção de sondas marcadas com éster de acridínio

Λ. Sinteso o purificação do sondas com braço de ligação amina

Sondas desoxioligonuclootidicas foram sintetizadas para conter um braço do ligação amina (isto é, um termina numa amina primária para a marcação com éster do acridínio) localizado tanto na oxtromidado 5* ou numa localização pro-solocclonada ospocifica ao longo da cadeia poli-fosfato, numa porção interna da sonda ou ligada a uma das bases nuclootídicas.

Para unir o braço de ligação 5'-amina à sonda, o composto seguinto foi usado:

d)

Este composto será referido como roagonte de braço do ligação amina terminal, aqui,por diante. Este reagente foi sintetizado da seguinte maneira; 6-amino-hexanol foi posto a reagir com S-etil-trifluorotio-acetato em acetato do etilo anidro. 0 produto da reacção foi precipitado em éter do potroloo, tratado com uma mistura do piridina a lOÇo om água durante 10 minutos para hidrolizar qualquor 0-trifluoro-acotilo quo possa tor sido formado o evaporado até à secura, na forma do uma goma. Esto composto foi depois fosfitilado do acordo com os procodimen tos padrão do litoratura (vor Nucleic Acids Research 12 (11), 4539 (1984)) originando o composto desejado, nomeada monto o roagonto do braço do ligação amina terminal (1).

Sondas contendo um braço de ligação 5'-amina foram sintetizadas da forma seguinte. Usando um sintotizador Appliod Biosystoms, Inc. Modol 38OA DNA, as sondas com a sequência nuclootidica desejada foram produzidas usando quimica fosforamidite padrão, construindo sondas a partir da extremidade 3' e da oxtremidado 5*. Depois da sequência desejada ter sido completada, o braço de ligação amina foi automaticamente acoplado ao grupo 5’-2Ί-

-hidróxilo da sonda usando o reagento do braço do ligação anina terminal, na mesma maneira outro nucleotidoo fosforarnidito torá sido acoplada ligando o procedimonto padrão, a sonda foi dopois separada do suporte sólido o desprotegida usando UI, OII o purificada por electroforese om gol do poli-acrilaraida soguido por croinatografia em Sopliadox G-25.

\ sonda seguinte foi sintetizada e purificada usando oste procedimonto:

o i> -υ.ξ-0⁵'-nh₂-(ch₂)₆'gctcgttgcgggacttaacccaacat-3’ em que NHg-CCHg)^ representa o braço de ligação aminá.

(i±)

Para incorporar um braço de ligação amina na porção interna de uma sonda, o roagente do braço de ligação amina interna, do tipo 1 (espaçamento de 4 átomos; Ver LI na patente citada abaixo), ou do tipo 2 (ospaçamonto de 2 átomos; ver L3 na patente citada abaixo) ou L7 (espaçamento de 9 átomos) foi usado como descrito na Pedido de Patente U.S. No. Sor. 099,050 intitulada de Non-Nucleotido Linking Reagents for Nucleotide Probes datada do Setembro 21, 1937, por Arnold et al., Novamento, as sondas foram sintetizadas usando quimica fosforamidite padrão e purificadas usando electroforese em gel de poliacrilamida e cromaiografia em Sephadox G25.

As sondas seguintos foram sintetizadas usando este procedimentoí

1.) Uma trisesima complementaridade das subunidados 165 do rRNA da E. coli. com um braço do ligação amina interno do tipo 1, substitui um resíduo adenina na posição 18 na sequência ituidocom um braço de ligação amina internos,do tipo TJ 5*-CCA CTG CTG CCT CCC G1^ GGA GTC TGG GCC-3'.

2.) Uma trisesima terceira complementaridado das subunidades lós do rRNA da Ch.lamydla trachomatis, com um braço de ligaçao amina interno, do tipo 1, substituido/um rosiduo adonina na posição 21 na sequoncia jàubstituido com um braço de ligação amina interno,do

5’-CGT TAC TCG GAT GCC CAA TCG CCA CAT TCG-3',

ou inserido ontre os rosiduos 21 o 22, mr^o~d-e ligaçao amina interno.do tipo 1 ou 4°. tzpe^inser^gg]' 5'-CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA^TCG CCA CAT TCG-3 .

(lii)

As bases nuclcotidicas contando o braço do ligação anána foram incorporadas numa sonda do seguinte modo. Oligonuclootidoos roforôncia e iniciador com as soquoncias sog lintes foram sintetizadas.

Roforôncia 3'- GCA AfG AGC CTA CGG GTT ΤΛΤ AGC GG - 5 ’ Iniciador 5 ’ -CGT TAC TCG GAT GCC CAA AT - 3 ' (As sequências oligonucleotideas do iniciador e do iniciador oxtendido são complementares às subsunidados 16S do C.· trachomatis.)

A extensão primária usando o fragmonto klonow foi realizado como descrito em Maniatis (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis, 1982, Cold Spring Ilarbor Laboratorios, Pubs.) com a excopção de o BSA foi omitido do tampão de tradução (10 x nlck) para incorporar a base amina modificada no braço de ligação amina (12) dUTP Calbiocliera, Califórnia). Λ sequência do oligómero resultante ó, por conseguinte:

CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA (amino-12-U)CG CC.

Λ purificação do complexo extendido primário foi atingida usando ura cartucho NENS0RB-20 (DuPont) soguido do procedimento recomendado pelo manipulador. (λ reacção de extensão primária foi diluida pela adição do 900 μΐ de reagente NENSORB Λ antes do carregar a coluna. Os oligómoros purificados foram diluidos com metanol a quo foi dopois removido com alto vácuo).

B. Marcação da sonda do braço de ligação amina com Éster do acridinio o Purificação subsequente

Uma solução dc reserva 25 rhM, do ácido do acridinio foi preparada om DMSO destilado. A quantidado desejada da sonda (ver a lista das sondas diferentes marcadas na gocção Λ, acima) foi evaporada ate à socura num tubo de polipropilono cónico do 1,5 ml. A mistura liquj. da soguinto foi foita por adição dos ingredientes seguintes pola ordem indicada:

3	μΐ	do	Π2°
1	μΐ	do	IIEPES ΓΙ (pll 8,0)
’t	μΐ	do	DI1S0 (dostilado)
2	μΐ	do	óstor do acridinio 25 mM om
(d	OS i	;ilado )

A mistura foi agitada om turbilhão numa raicrocontrifugadora duranto 2 segundos (para trazer a teores para o fundo do tubo), o incubado aos 37^0, durante 20 minutos. Os componentes seguintes foram depois adicionados na mistura liquida reaccional pola ordem indicada:

3,0 μΐ de éster do acridinio 25 :nl; ora. DZ.SO (destilado )

1,5 μΐ do Π_ο0

0,5 μΐ do IIXGS 1?· (pll 8,0)

A mistura líquida foi novamcnto agitada om turbilhão o incubada durante 20 minutos adicionais aos 37-C. A marca não roagida foi arrcfocida bruscamento usando um excosso do 5 vezos do lisina pela adição de 5 μΐ do lisina 0,125 M em IIEP2S 0,1 M (pll 8,0), DMSO a 50/, e incubada durante 5 minutos, à temperatura ambiente.

oligémero marcado com éster de acridinio foi depois purificado usando o método seguinte: A 20 μΐ da mistura roaccional arfofecida bruscamonto do roagir foram adicionados 30 y.1 de NaOAc 3M, (pll 5,θ), 2^5 μΐ do 11^0 o 5 μΐ do glicogéneo como um suporto (o glicogéneo foi pro-tratado para remover qualquer actividado da nucloase), A amostra foi agitada brovomonte em turbilhão 6^0 yl de EtOII absoluto foram adicionados. A amostra foi brevemente agitada em turbilhão o incubada, em golo durante 5-10 minutos, depois contrifugada duranto 5 minutos a 15 000 rpm numa microcentrifugadora. 0 sobrenadante foi cuidadosamonto removido e a polote foi rodissolvido em 20 ^il de NaOAc 0,lM (pll 5,0) SDS a 0,1/. As amostras foram depois purificadas por cromatografia liquida do alto rendimento (CLAR), como descrito abaixo.

As sondas marcadas com EA (éster de acridínio) contendo braços de ligação amina na extremidade 5’ o internos foram purificadas da maneira soguinto: pólete do 20 .μΐ redissolvida foi injoctado numa coluna do CLAR de permuta iónica Nucleogon-DEAE 60-7 montado num sistema do CLAR IBM¹¹ 9533. Todos os tampõos foram foitos com grau de

CLAR, a água, o acotonitrilo (CII^CN) (NaOAc) são de Fishon Scientific, e o o acotato de o ácido acético sódio glacial (lIOAc) o o LiC 1 foram de grau reagente. Todos os tampões foram filtrados através de filtros Nylon-66 com uma dimen são de poro de 0,45 μπι, antes de usados. Λ amostra foi olui da como descrito na Figura 1 do desenho (neste caso a son da foi o braço do ligação 5'-amina contendo o souion descrita na secção A acima). Imodiatamonto depois da realização, 5 μΐ do SDS a 10/j foram adicionados a cada um dos tubos, seguido por agitação cora turbilhão do cada tubo (isto foi feito para assegurar quo a sonda marcada com éster de acrid, nio não ficasse colada às paredes do tubo). Uma aliquota do 0,5 μΐ foi removida das fracçõos 21-42 o adicionada 200 μΐ do água num tubo do 12 x 75 mm (uma ponta do pipota em separado foi usado para cada uma aliquota para evitar um problema de sobrocarregamento). A quimioluminiscência do cada aliquota foi dopois determinada num Benthold Clinilumai usando a injocção automática soguinto o a soquôncia de leitura seguinto: injocção do 200 μΐ do IE,*0^ 0,25N, H₂°2 ^a com um segundo do atraso; uma injocção do 200 μΐ do NaOII IN; loitura da ciuimioluminiscôncia duranto 10 segundos.

As fracçõos 29-33 foram dopois precipitadas com EtOII da maneira soguinto: adição a cada fraeção do 5 μΐ do glicogeneo, agitação com turbilhão, adição do 1 ml do EtOII, agitação com turbilhão, incubação du-33-

ranto 5-10 minutos em golo, o centrifugação duram to 5 minutos a 15.000 rpm numa microcontrifugadora. Cada sobrcnadanto foi cuidadosamonto removido o peloto redissolvido ora 20 μ 1 do NaOAc 0,1’1, pll 5, SDS a Ifí, o as fraccõos foram juntas.

Dosto modo, eondas marcadas com cstor do acridinio altamonto puras foram obtidas. Λ actividado espocifica destas sondas foram tipicamente com con7 tagons do 5-10 x 10 de luz quimioluminiscente Berthold Clinilumat) por picomolo de oligómoro.

(ii)

Λ sonda marcada com EA contendo a base modificada com o braço de ligação de amina (amino-12-u) foi purificada goralruento como descrito acima, cora as excepções seguintes: Uma coluna do faso invortida Vyde CA foi usada, o tampão Λ foi acotato do tri-etilamónio 0,121 (Appliod Biosystems, Inc., Foster City, Califórnia) c o tampão B foi CH^CN; a sonda marcada foi eluida como um híbrido citando um gradiente linear com solvente B a 10-15^ durante 25 minutos, a uma velocidade do fluxo de 1 ml/min. 0 pico quimioluminiscente principal foi depois identificado o trabalhado como descrito acima.

Λ discussão procodonto geralmonte doscrovo como fazer o marcar sondas com éstor do acridinio. No exemplo especifico, as sondas foram marcadas na extremidade e internamento, assim como marcadas numa base nucleotídica.

EXEMPLO 2

Estabilidade a pll 6 do sondas internamento marcadas com éstor de acridinio hibridizadas versus não hibridizadas

Uma sonda 33 nor marcada internamento especifica para a Chamydia trachomatis foi preparada como proviamente descrito (substituição da adenina por um bra$o de ligação do tipo 1). Λ sonda foi hibridizada com rRNA alvo (neste caso de Chamydia trachomatis) do acordo com o procedimento soguinte:

Mistura do hjbridização μΐ de sonda com EA (0,5 pmol)

0,3 μΐ do SDS a 4£ (P:vol)

5,8 /11 de 1M pll 5

4,4 μΐ de rARN do C. trachomatis (2 ,ug), ou 4,4 μΐ do 11^0 para o controle.

As misturas de hibridização o de controlo foram incubadas duranto 4o minutos a ÓO^C, no ponto em que cada mistura foi analisada para a porcentagem do hibridização, usando hidroxi-apatito (ilAP) da soguinto forma. Uma aliquota do 0,1 μΐ da mistura do híbrido ou do controle foi adicionada a 200 μΐ do PB 0,14m, pH 6,8, contendo IlAP a 2ç£, Cada mistura rosultanto foi agitada em turbilhão duranto 5 segundos, incubada durante 5 minutos a 6O2C, agitada em turbilhão duranto 20 segundos, dopois centrifugada durante 30 segundos num microcontrifugadora a

15.000 rpm. 0 sobronadanto foi removido o recuperado, 200 pl do PB 0,1'tM, pll 6,8. Boi adicionado ao pelote do ΗΛΡ, a mistura foi agitada ora turbilhão durante 10 segundos, depois contrifugada durante 30 segundos numa microcentrifugadora a 15.000 rpm. 0 sobrenadanto foi removido e recilporadoc a pó lote foi rossuspensa om 200 ^1 do PB 0,1411, pll 6,8. Uma alíquota do 50 μΐ de IIAP rosusponso e cada um dos 2 sobrenadantes foram analisados por quimiolurainiscência como doscrito abaixo, o a çorcentagom da sonda hibridizada, i.o. a percentagem do sinal quimioluminescente associado com IIAP, foi calculado.

A estabilidado da sonda hibridizada versus sonda não hibridizada (i.o., controlo) foi tratada a pll 6 de acordo com o procedimento soguinto:

Estabilidade da mi stura teste

12,3 μΐ da mistura híbrida ou do controlo,acima μΐ de PB, 111 pll 6

2,5 μΐ de SDS a 4£ pl de H^O

Estas misturas foram brevemente agitadas em turbilhão, o aliquotas do 5 yl foram removidas imediatamonte (t_Q) θ analisadas por quimioluminiscência, como doscrito acima . 0 restante destas misturas foram incubadas a ÓO^C, e aliquotas de 5 μ1 foram removidas em vários pontos no tempo (ver abaixo) o analisadas imediatamente por quimioluminiscência.

	Λ quimioluminisconcia de cada amos
tra foi modida por	adição do uma aliquota amostra a 200 μΐ
do HgO num tubo do cia num Clinilumat	12 x 75 mm e modição da quiraioluminiscôn (injecção automática do 200 μΐ de HNO^
O,25N, II202 a 0,1/,	dopois seguido com um segundo do atraso,

por auto-injocção do 200 y.1 do PB de potássio 2M, pH 13,2 a leitura da quimioluminiscôncia durante 10 segundos).

Resultados:

1. Porcontagom do hibridização (Analiso com IlAP)

Híbrido - 96ç£

Controlo -l,3/> (ligação não ospocifica)

2. Variação da estabilidade ao longo do torapo.

Ver Fig. 2 do dosonho.

Estos resultados demonstram quo a sonda hibridizada ó bom protogida contra a quebra o subsoquento porda da quimioluminisconcia (a meia vida paTa a por da da quimioluminisconcia iguala aos 3370 minutos), onde a sonda não hibridizada e muito susceptivol do quebrar o pordor a quimioluminisconcia (moia vida á igual a 29,2 minutos; por isso, a descriminação ontro a sonda hibridizada o não hibridizada ó igual a 115 vezes). Estos dados demonstram a capacidade do ensaio homogéneo aqui descrito para localizar a sequência do ADN alvo por dar a conhecer a estabilidade diferencial ontre a sonda hibridizada o não hibridizada e medição da tnesma,

EXEHPLO 3

Estabilidade a pH 9 da sonda internamento marcada com éster do acridinio hibridizada versus não hibridizada

A sonda internamento marcada (todas as sondas 33mer intornamonte marcadas descritas no Exoraplo 1 foram testadas) foi hibridizada com o seu rRNA alvo (neste caso do Cblamydia trachomatis)e analisada para a porcontagom do hibridização como descrito no Exomplo 2.

Λ ostabilidado da sonda hibridizada vorsus não hibridizada (i.o., do controlo) foi tostada a p’I 9 do acordo com a procodimonto soguinto:

Estabilidade da mistura testo vl da mistura do híbrido ou de controlo, acima

4,5 μΐ de borato de sódio 0,2M pll 9

As misturas foram depois incubadas amostradas o analisadas para a quimioluminiscencia como descrito no Exomplo 2.

Resultados:

1. Porcentagem de hibridização (análise com IIAP)

a. Substituição de adonina por um braço do ligação do tipo

Híbrido - 95(5

Controlo - 0,5/ (ligação não especifica)

b. Inserção do braço do ligação do tipo 1 Híbrido - 98/

Controlo - 0,3/

c. Insorção do braço de ligação do tipo 2 Híbrido - 98/

Controle -0,2/

2. Variação da estabilidado ao longo do tempo

Vor Figs. 3-5 dos desenhos Λ Fig.3 o um gráfico para a substituição da adonina por um braço da ligação do tipo 1; a Fig. 4 e um gráfico da insorção do braço da ligação do tipo 1; a Fig. 5 e um gráfico da inserção do braço do ligação do tipo 2.

Como no Exemplo 2, a sonda hibridizada ó protegida da degradação enquanto que a sonda não hibridizada não o e. Isto e verdade para todos os três tipos de sondas intornamonte marcadas. Neste exemplo, o borato do sódio a pll elevado acelera esta processo (quando comparado com o Exemplo 2) enquanto que ainda rotem as caracteristicas da degradação diferencial entre a sonda hibridizada e não hibridizada.

EXEMPLO 4

Estabilidade a pll 6 da sonda marcada na extremidade com éster de acridinio como híbrido com sonda adjacente versus não híbrido

Este exemplo envolve o uso de uma sonda de sequência:

5'- CCG GAC CGC TGG CAA CAA AGG ATA AGG GTT GC-3» (preparado usando química fosforamidite padrão) quo hibridiza o rRNA do E. coli imodiataraente adjacente à extremidade 5’ da sonda marcada com EA usada nosto Exemplo (ver abaixo) por conseguinte levando a capping off do todas as aminas no rRNA alvo na vizinhança da marca de éster de acri dínio.

A sonda marcada na oxtrcmidade com éster de acridinio (preparação descrita no Exemplo 1) depois aqui referida como sonda-EA) e a sonda adjacente descrita acima foram hibridizadas do acordo com o procedimento seguinte:

-4ο-

Mistura do Hibridização μΐ do sonda EA (θ,25 pmol) μΐ do rARN do E. c o li (2pg)

4,3 V1 ^do sonda adjacente (12 pmol)

0,3 μΐ do SDS a 4$

7,5 /11 PB, 1M pll 5

Mistura de controle μΐ de sonda EA (0,25

pmol)

5,4 μΐ do II20

5,8 μΐ do ΡΒ,ΙΜ pll 5

0,3 μΐ do SDS a 4$

As misturas do hibridização o do controlo foram incubadas duranto 4o minutos, a óO^C, o dopois analisadas para α percentagem do hibridização usando hidroxi-apatito como descrito no Exemplo 2.

A ostabilidado da sonda hibridizada com sonda adjacente vorsus sonda não hibridizada (i.e. controlo) foi testada a pll 6 oxactamento como descrito no Exomplo 2.

Rosultados.

1. Porcentagem do hibridização (análise com ILAP) Híbrido - 93,5$

Controlo-2,7$ (ligação não especifica)

2. Variação da estabilidade ao longo do temp9,vor Fig, 6 do desenho.

Corao no Exomplo 2, a sonda-ΕΛ hibridizada, nosto caso cora una sonda adjacente também hibridizada, foi protogida da degradação, enquanto quo a sonda não hibridizada não o foi, A protecção foi tão boa como no Exemplo 2, porque ó Opoudonte das duas hibridizações om voz de uma.

EXEMPLO 5

Estabilidade a pll 9 ha sonda marcada na extremidade com óstor de acridinio como híbrido com sonda adjacente versus não híbrido

Λ hibridização foi roalizada oxactamonto como descrito no Exemplo 4. Λ estabilidade da sonda hibridizada com sonda adjacente versus sonda não hibridizada (i.e., do controle) foi testada a pll 9 oxactamento como doscrito no Exemplo 2, excepto da composição da mistura do tosto da estabilidade quo ó a seguinte:

yl de híbrido ou de controlo μΐ do borato de sódio 0,2M, pll 9,0

A sonda-EA hibridizada com uma sonda adjaconte (também hibridizada) foi novamente protogida da degradação enquanto que a sonda não hibridizada não o foi. Como no Exemplo 3, o borato de sódio a pll elovado acelerou o processo, enquanto que ainda rotom as caractoristicas da degradação diforencial entre a sonda hibridizada e não hibridizada. Ver Fig. 7 para uma ropresentação gráfica destes resultados.

EXEMPLO 6

Estabilidado a pll 6 da sonda marcada na extremidade com óstor de acridínio como híbrido versas não híbrido

Λ sonda foi hibridizada no seu rARN alvo (neste caso do E.coli) do acordo com o procodimonto soguinto;

Mistura de Ilibridização

Mistura de controlo μΐ do sonda-EA (0,25 pmol) μΐ de rARN de E. coli (2μ&)

5,8 μΐ de PB, 124 pll 5

0,3 μΐ do SDS a 4$

3,4 μΐ de II₂0 μΐ de sonda-ΕΛ (θ,25 pmol

5,4 μΐ de II₂0

5,8 μΐ do ΡΒ,ΙΜ, pH 5

0,3 μΐ de SDS a 4^

As misturas do hibridização e do controlo foram incubadas durante 4o minutos a ÓO^C, e dopois analisadas para a percentagem de Ilibridização usando hidroxiapatito como descrito no Exemplo 2.

A estabilidade da sonda hibridizada vorsus sonda não hibridizada (i.e., controle) foi tostada a pll 6 exactamento como descrito no Exemplo 2.

-b3-

Rosultados:

1. Percentagem de liibridlzação

Híbrido - 9^/

Controlo- 2,7/ (ligação não especifica)

2. Variação da estabilidade ao longo do tompo.

A sonda não hibridizada foi novamonto profcroncialrionto degradada quando comparada com a sonda hibridizada, embora o diferoncial na degradação não é tão bomo como nos oxomplos anteriores. Isto e devido unicamente a uma porção do aminas foram cappod off na vizinhança da marca do oster de acridínio. Na vordade isto adicionalmente demonstra a capacidade para discriminar entre a sonda marcada na extromidade hibridizada na presença e na ausência da sonda adjacente hibridizada.

EXEMPLO 7

Estabilidado a pll 7,6 da sonda marcada numa base nucleotidica com éster de acridínio hibridizado vorsus não hibri dizada

Λ sonda marcada numa base nucleotídica (amino-12-4) com éstor de acridinio descrita no Exemplo 1, foi hibridizada com o sou rRNA alvo (neste caso de C. trachomatis) do acordo com o procedimento seguinte:

Μ-

Mistura do hibridização

Succinato do lítio 0,114, pll 5,^

Lauril-sulfato do litio a 10/ gg (1,3 pmol) do rARN de C. trachomatls ou água para o controlo

0,1 pmol de sonda-EA volume total -30 ,ul

As misturas do hibridização o de controle foram incubadas durante 5 minutos a 8O9C seguido por 6o minutos a 6O9G. As soluções resultantes foram cada uma diluídas a 300 μΐ com succinato de lítio O,1M, pll 5,^ lauri 1-sulfato de lítio a 10/. , analisadas para a porcentagem do hibridização usando hidroxi-apatite, como descrito no Exemplo 2.

A estabilidade da sonda hibridizadí. vorsus não hibridizada (i.e., de controle) foi tostada a pll 6 com várias amostras identicamonto preparadas de acordo com o procedimento seguinto:

Estabilidade da Mistura teste μΐ da híbrido ou do controlo indicado acima

100 μΐ do tetraborato de sódio 0,2/, pll 7,6, Triton X-100 a 5/.

Estas misturas foram depois incubadas a 6o⁵C, e amostras foram removidas em vários pontos no tempo e a quimioluminiscência foi determinada usando um Gen-Probe Leader^ I Luminometer usando injecção automática do 200 μΐ de H^Og O,1M, com 1 segundo de atraso, a injecção

automática do NaO’1 1'1, o loitura da quimioluminiscôncia durante 5 segundos. A partir dostos dados as volocidados do hidróliso foram dotcrninadas por análise regressiva.

Rosultados

1. Porcentagem do Hibridização (.Análise com ΗΛΡ)

Híbrido - 53,8$í

Controlo-0,

2. Estabilidado

Moia vida do hidróliso do óstor (min)

Razão das moias-vidas

Híbrido

Controlo

Ilíbrido/controlo

13,6

1,3

10,5

Como nos exemplos procodcntos, estes dados demonstram quo a sonda hibridizada ó protegida contra a degradação, enquanto quo a sonda não o ó, neste caso com a marca unida a uma baso da sonda. Isto demonstra o principio que os diforontos tipos do locais são acoitávois para a ligaçao do ΕΛ para a utilização no ensaio do protecção homogónoa descrito nesta memória descritiva.

EXEMPLO 8

Estabilidade a pll 7,6 do sondas internamento marcada3 com cstor do acridinio hibridizadas vorsus não hibridizadas numa sério do locais da sequência do dimoro usando ambos ai vo do rRNA ο ΏΝΛ

Sondas contendo um braço do ligação intorno, do tipo L7, insoridos, numa sório do locais do soquôncia do dimoro (ver abaixo) foram sintetizadas, marcadas com ΕΛ, o purificadas como no Exomplo 1. As sequoncias o a localização do braço do ligação dos tas sondas são as soguintos:

Sonda No»

Soquôncia;localização do braço do ligação titã

5' -GCT CGC TGC GGA CTT#AAA CCA ACA T-3'

5' -AGG TCG GTC T#TT CTC TCC TTT CGT CTA CG-3'

5' -CAA TCG TCG AAA CCA TT#G CTC CGT TCG A-3'

5' -CCG CTAfCCC GGT ACG TT- 3'

5' TTG CCC ACA CCG A#CG GCG- 3'

5' -TTG CCC ACA CCG CtCG GCG- 3'

Estas sondas foram Iiibridizadas como descrito no Exemplo 7 com a oxcepção quo o passo do incuba gão a 8O2C foi omitido, o as quantidades o tipos de ácidos nucloicos alvo usados foram as soguintos:

Sonda ácido nucleico alvo

1	1		de	rARN	de	E.	co li
2 & 3	1		do	r/JlN	do	Ç.	trachomatis
4	1		de	tARN	de	N.	gonorrhoeao

à 6

1,2 pmol de complonionto de ADN sintético exacto

A ostabilidado da sonda hibridizada vorsus não hibridizada foi tostada a pll 7,6 como descrito no Exemplo 7·

-48Rosultados:

Estabilidado

Razões das r.ioias vidas
Moia-Vida da hidrólise do	Híbrido/Controlo
éster Sonda	(min ) Ilíbrido	Controlo
1	41,2	0,9*»	*»3,7
2	24,2	0,71	34,5
3	40,7	0,96	42,4
4	15,7	1,2	13,1
5	11,1	1,0	11,1
6	22,6	o,7*»	30,5

Estos dados demonstram quo o braço de ligação (o por conseguinte o EA) podo sor inserido numa lar ga variodado do locais da sequência do dímoro o ainda ser substancialmonte protogido contra a hidrólise do éster, quardo na forma hibridizada. Alóm disso, este oxoraplo demonstra quo os alvos do DNA fornocem boa protecção das sondas-EA quando ompregues nestes tipos do onsaios homogéneos. Esto oxoraplo tambera demonstra quo o comprimento do braço de liga ção (9 átomos) aqui usado, origina velocidades do hidrólise diforoncial ossencialmento equivalentes aos outros braços dc ligação citados antoriormento nesta patento, estabelecendo que uma larga variedade de comprimentos dos braços do liga-

ção podem ser usados no testo ΙΙΛ?, descrito aqui.

EXEMPLO 9

Estabilidade a plí 7,6 do sondas-EA intornamonto marcadas hibridizadas com alvo da aliança perfeita vorsus alvo com uma única má aliança

Uma complemento da sonda mer das 16s unidados de rRNA do E. coli. com um braço de ligação amina interno, do tipo L7, inserido entro os residuos 6 e 7 foi sintetizada. A sonda foi depois marcada com éster do acridínio o purificada como descrito no Exemplo 1. A soquoncia ó a soguinte ( = posição do braço da ligação):

5' -CAAGCT^TCC CAG ΤΛΤ CAG ATG CAG- 3’

Esta sonda tem uma única má aliança T-G na posição 6 (numerada a partir da oxtromidado 5’ da cadeia da sonda) com a subunidade 16s da Ç_. divorsius.

Λ sonda foi hibridizada com os seus rRlíA alvo (nesto caso de ambos E. coli ou (3. divorsius) do acordo com o procedimento descrito no Exomplo 8. A estabilidade das sondas hibridizadas resultantes, assim como uma amostra do sonda não hibridizada foi tostada a pll = 7,6 como descrito no Exemplo 7.

-5ο-

)s t abi lidado

Razão das meias vidas

Meia-vida da hidrólise: Ilíbrido/Controlo do éster (min)

Alvo	lííbxxLdo	Controlo
E. coli	18,6	0,8	23,3
C. diversius	1,1’	0,8	M

*

A meia vida baixa do bidróliso do óstor não foi devido a baixa oxtenção da hibridização, porque a análise cor.i ΙΙΛΡ (como descrito no Exemplo 2) rovolou uma hibridização em 73¹/.

Estes dados mostram que no caso do híbrido com o alvo ora aliança perfeita, a sonda-ΕΛ e protegida da hidróliso do óstor (como descrito nos exemplos procodontes), onquanto quo no híbrido com o alvo contendo uma má aliança do baso, a sonda-EA, á pobromonte protegida. Isto origina uma diferença de 17 vozes na velocidade de hidrólise da sonda-ΞΑ ontre o alvo perfeito e o alvo com um único local do má aliança. Por conseguinte, o método aqui descrito ó rapidamonto capaz de discriminar entre alvos de ácidos nucleicos contendo diferenças numa única base

EXEMPLO 10

Estabilidado à tompnratura ambionto sob várias condições de sondas internamonto marcadas com ostor de acridínio liibridi. zaclas vorsus não hibridizadas

Sondas internamonto marcadas (insonção, do tipo 1; vor Exomplo 1) foram hibridizadas com 1 çtg do rRNA de CL trachomatis como descrito no Exomplo 8. A estabilidade do sondas hibridizadas vorsus não hibridizadas foi medida à tomporatura ambionto sob uma serio do reagentes o condições do pll (vor Rosultados) de acordo com o procedimonto doscrito no Exomplo 7·

Rosultados:

Moías Vidas (Minutos) Razão das Moía

Tampão pll Tompo Ilibrido Controlo Vida

ME ME

O'''

Ό O •d -P 'd O ϋ rd

co		CM		co	co	CP CM	CM
o	CM	CO	co	P-	o	P- co	Co
•K		·»	*		·»	* ·»
co	Ό		o	CP		Ό CM	CP
cp	CP	CP	00	r-		MOg	Cp id

CO	co	a	rM CP
co	up		P-	cp			•k	«*
«k	•k	rd	*	Φ·			CM	rd
O		Ό	p-	rH	o		•â'4 Ό o	ME
							h Ό	s
							s—*	O
							CO IP	-P p*
		Γ-	ΪΡ	\o			PT tp	tj -
CP		<·		CP	o			>
rd		P-	*	•o	A		1P cO	rd m
«.	CM	O	co	co	ip		—V co	' p-
PT	P~	CP	03	Co			rd Cp	rd
CP	CM	CM	Pt
		O	o	o		0	O	O
		+>	-P	JJ		-P	-P	•P
		c	d	d		d	d	C
		0 φ	O 0	o o	O	o	O O	0 O
o	O	ft -d	ft-d	P< -d	P<	•d	P.-H	P< -d
Ol	Ol	Ξ -5	E £	Ξ £	E	£	E -9	E -9
s	O PT	£^	£1	£1	£	1	£3	£1

Ό	MO	oo	o	o	o	o	o ·»
«k	•o	*				·»	rH
		P-	co	o	r4	o	rd
				r4	r4	r4

»—< CM	Vtp	w-< CM	ip	CM	£	-t· F-< 0> ' CM IP
·»		•0				·,
o	d	o	d	o	d	o d
o	d	0	£4	o	d	o d
-P	o	-P	o	-P	o	+2 0
d	P	d	-u	d	+2	d -p
h	•d	P	•d	h	•d	Í4 -d
0		o		o	h	o 6
				h		£> H

				M	o
				O	1P
			o	O	o
S'··-		ÍK	o		u
CM 1P	CM	•d	d	•d
	—		-P		+5	d
O d	O	d	•d	ω	M
			tH	<=)		ω
o q	0	C		ω		Q
ψ5 O	•P	o	o	•κ	o	ω v-
d -p	d	4-3		b—< rà	Ό	ip
R -d	Í-C	•H	•d	â	•d	-O
O k	o	P	o	O	O	s *
		H	V4	IP	m:	á o

*

No sistoma do ácido fítico, as cinéticas da hidrólise fortim bifásicas. Rápido refere-so à primeira fase rápida do hidrólise o lonto roCoro-so à última fase lonta da hidrólise.

Estos dados domonstram quo existem uma larga variodade do condições sob as quais o onsaio de protocção homogónoo descrito aqui funciona, tornando-o adaptável numa larga gama do condições de ensaio, Alem disso, outros sistemas alem do borato são acei táveis, por exemplo, o sistorna do ácido fítico à temperatura ambionto, ondo volocidados de meia vida muito elevadas foram atingidas.

EXEMPLO 11

Dotocção do uma serio do diluições do rRNA do Chlamydia em tampão usando sonda intornamonte marcada com óster do acrdL dinio

Λ sonda intornamento marcada (como no Exomplo 2) foi hibridizada com quantidades decrescentes do sou rRNA alvo (neste caso do Chlamydia trachomatis) de acordo com o procodimonto seguinte:

Mistura elo hibridização

0,5 jil do sonda (12,5 fmol) pl de RNA (10², 1θ“³, 1θ^2ί ou 10“⁵ pg) pl de SDS a 20/

1.7 |il de II₂0

4.8 ul do PB 1M, pll 6,8

A mistura de controlo foi a mesma que mistura do hibridização oxcopto que continha água em vez do rRNA, e a mistura em branco do reagente foi a mesma que a mistura de controlo excepto que continha água ora vez de sonda. As misturas foram incubadas durante 20 minutos aos 6o^sC.

Dopois de hibridização, 90 μΐ de borato 0,2M, pll 9, forar.i adicionados a cada amostra, seguido de incubação aos ÓO^C duranto 14 minutos. Cada amostra foi depois lida para a quimioluminiscôncia como descrito no Exemplo 2, excopto que a injecção 1 foi unicamente do H₂0₂ a 0,1/, a injocção 2 foi a pH 13,8 em vez do 13,2 o o tempo do leitura foi do 7 segundos en voz do 10 sogundos.

Rosultados:

Kistura on branco do reagente - 116 riu

Controlo - 124 riu

Som controlo lo”⁵ |ig rARN - 126 riu -4 pg rARN - 210 riu ^J pg rARM - 1100 riu

10** pg rARN - 7809 riu riu riu

976 riu

7685 riu

Os dados da mistura em branco do roagonto o de controlo representam a módia do ensaios em triplicados; todos os outros representam a media de ensaios em duplicados.

Estos resultados demonstram que o invonto doscrito aqui, foi capaz do dotectar uma série de diluições linear do rARN alvo até um limito de sensi-4 bilidado de cerca de 10 pg num sistoraa do tampão puro.

EXEMPLO 12

Detecçao do uma sório de diluições do r/JRN do Chlamydia em moio clinico usando sonda internamento marcada cora óstor do acridinio

A sonda intomamento marcada (como no Exemplo 2) foi hibridizada num especimen clinico (mocha de algodão na garganta) om quantidades decrescontos dos seus ncARN alvo (neste caso do Chlamydia trachomatis) de acordo com o procedimento seguintej

Mistura de hibridjzação pl de mecha de algodão na garganta pl de 4,8M PB, pll 4,7 pl de rABN (3x1o²¹, 3x10^-3, 3x10^-2 ou 3x1o¹ yig) ul do sonda (1 pmol)

-5Ί-

Λ mistura cie controlo foi a mosma da mistura do hibridização exccpto que continha água oci voz de rRNA, o a mistura em branco do roagento foi a mosma quo a mistura de controlo excopto quo continha água om voz de sonda. As misturas foram incubadas durante 6o minutos, a ÔO^C.

Depois do hibridização, um torço de cada mistura (20 ul) foi adicionada a 50 μΐ do borato 0,211, pll final igual a 9 (depois do adição das misturas do hibridização) seguido por incubação aos ÓO^C, durante 4o minutos. Cada amostra foi depois lida para a quimio luminescência como doscrito no Exemplo 11.

Rosultados:

Mistura ora branco do roagento - 163 riu

Controlo - 65 60 riu

Som controlo

10-·3 |ig	rARN	-	8535 riu	1975
10’2 jig	rARN	-	27306 riu	20746
101 Jlg	rARN	-	258194 riu	251634

Os dados representara a média do valores de ensaios om duplicado.

Estes dados dononstram quo o invonto descrito aqui, foi capaz do dotecção do uma sório do diluições lineares do aARNalvo ató um limito do son_3 sibilidado do cerca de 10 jig, num sistema contido num meio clinico.

EXEMPLO 13

Detecção de uma série do diluições do rAEN do bactérias em urina, usando sonda intornamento marcada com éster do acridinio

Uma sonda 30 mor internamento marcada ospocifica para E. coli foi preparada com proviamonte descrito (substituição da adenina por um braço do ligação do tipo 1). A sonda foi hibridizada em urina com quantidades docrescontos dos seus rKNA alvo (neste caso de E. coli do acordo com o procedimento soguinto:

Mistura de hibridização

79,6 y.1 do urina

0,4 pl do EDTA O,25M EGTA O,25M ^11 do PB, 4,8M pll 6,8 pl do SDS a 20/ do sonda (0,125 pmol) |il do RNA (10“³, IO^-2 ou lo’¹ jig)

A mistura de controlo foi a mesma que a mistura do hibridização oxcopto quo continha água ora vez do rRNA, o a mistura em branco do roagente foi a mesma que a mistura de controlo excepto que continha água em vez de sonda. A mistura foi incubada duranto 30 minutos aos 6o?C.

Depois do hibridização 300 ^il do borato, 0,2M, píl 9, foi adicionado a cada amostra, soguido por incubação aos 6o^eC durante 16 minutos. Cada amostra foi depois lida para a quimioluminiscoôncia como descrito no Exemplo 11.

-6ο-

Resultados í

Mistura em branco do reagente - 6845 riu

Controlo

9250 riu

3οπι controlo

io“J	ug	rARN	- 9358 riu	8 riu
IO-2	ug	rARN -	14055 riu	4805 riu
10’1	ug	rARN -	61800 riu	52550 riu

Os resultados representam a modia do valores do ensaios em duplicado.

Estos dados demonstram quo o invento descrito aqui, foi capaz de detectar uma sério do diluiçõos linonros do rARN alvo ate um limito de sensibilidado de aproximadamente 5 x 10 yig do RNA, num sistema contendo urina.

EXEMPLO 14

Degradação solectiva usada en combinação com um passo de separação para a detocção do uma serio de diluiçõos do rRNA de Chlamydia om moio clinico, usando sonda internamento marcada com óstor do acridinio

Λ sonda internamento marcada (como no Exemplo 2) foi hibridizada num espocimen clinico (mecha do algodão na garganta) como descrito no Exemplo 8, incluindo as misturas do controlo e om branco. Depois do Ilibridização, um torço do cada mistura foi removida e sujoita a degradação seloctiva exactamonte como doscrito no Exomplo 8, enquanto que um terço foi simplesmente removido e doixado ficar à temperatura ambiento (i.e., som dogradação solectiva). Ambos os passos das amostras, nomeadamonto com e som degradação solectiva foram dopois sujeitas à separação do sonda hibridizada da não hibridizada usando IIAP, como descrito no Exemplo 2 com as oxcopçãos seguintes:

a. 1 ml de solução de ΠΑΡ foi usado (em vez do 200 jil).

b. 1 ml do solução do lavagem foi usado (om vez de 200 ^11).

c. 3 lavagens foram realizadas (om voz da 1)

d. Os pelotes do ΗΛΡ finais foram rossuspensos om 100 ul do solução do lavagom, a totalidado do qual foi medido para quiraioluminescência (como doscrito no Exemplo 2).

Rosultados:

Degradação soloctiva

		Menos	S:B	Mais	S:B
Controle	(som rARN)	18		4,7	—
10~3	pg	do rARN	27	1,5	10	2,1
1θ2	F	de rARJJ	117	6,5	70	15
101	pg	de rARN	933	52	591	126
0,33		do rARN	2756	153	1755	373

Os resultados representam a média dos valores de ensaios em duplicado cor. o testo ora branco do roagcnte já subtraido. S:B = sinal rolativamente ao de fundo, i.o., quimioluminescência a uma concentração rDNA particular dividido pola quimioluminescência do controlo.

Estos dados demonstram quo a adição da dogradação soloctiva antos da separação resulta em fundos mais baixos levando a ura sinal mais olovados rolativaraonto ao do de fundo, e por conseguinte sensibilidade molhorada.

I

EXEMPLO 15

Rigidez melhorada usando hidróliso diforoncial

Λ sonda seguinte foi construída para conter um braço de ligação intorno, do tipo L7 (posição da inserção indicada por 4^abaixo), marcada cora óster de acridinio, o purificado como descrito no oxomplo 1:

ΛΤΤ CCG CAC A #TG TCA ΑΛΛ CCA G

Esta sonda e exactamento complementar à subunidado 16s de Neissoria gonorrhoeae. Contudo, ó também estreitamento relacionada com N. meningitidis. e uma reacção cruzada ó tipicamente observada sob condições de rigidez de Iiibridização citadas nos Exemplos 2 o 8. Esta sonda foi hibridizada com 0,5 Jig de N. meningitidis como descrito no Exemplo 8, (excepto nuin tipo de 200 μΐ) dopois também incubado durante 10 minutos aos 6o^C, om 1 ml do tetraborato do sódio 0,2M, pll 7,6, triton X-100 a 5/ para efoctuar a hidróliso diferencial (+ II.D.) ou não sujeito a estas condições de hidrólise diferencial (- H.D. ). Os híbridos resultantos foram depois separados era micro-esferas magnéticas o medidos para a quimioluminiscência como descrito abaixo.

Adição de 1 ml de PE 0,4m, pll 6,0, contendo 150 pg do microosforas do amina magnéticas (BioMag M410O, Advanced Magnotics, Inc., Cambridgo, Mass.). Agitação coci vórtox durante 10 segundos. Incubação aos 60SC durante 5 minutos. Agitação om turbilhão durante 10 segundos. Separação magnética das osforas da solução usando o dispositivo de separação magnética Pace-Hate^m (Gen-64-

-Frobo, Inc., San Diogo, CA). Descraga do liquido. Lavagem das esferas por adição de 1 ml de PB 0,3M, pll 6,0, agitação com vortéx durante 10 segundos, separação magnética e descarga do liquido. Popetição para um total do três lavagens. Eluiçào do híbrido por adição do 300 μΐ do PB 0,2··, pll 6,0 formamida a 50/, agitação em turbilhão durante 10 segundos incubação a 6o^?C durante 5 minutos, agitação em turbilhão durante 10 segundos, e separação magnética das esferas da solução. Transferencia da solução para um tubo Blinilumat e medição da quimioluminiscôncia como descrito no Exemplo 7· Resultados:

Condição Quimioluminiscôncia

-II. D. 178.03^ +11. D. 748 ¥

Sinal do híbrido menor o sinal de controlo (i.e., sem rARN), dado em unidades de luz relativa (riu). Sinal do alvo exacto (i.e., N. gonorrhooae) neste toste ó tipicamente 7-10. 10⁶ riu.

Em conclusão a aplicação da técnica de hidrólise diferencial descrita aqui como passo da descríminação de rigidez adicional grandomonto reduz o sinal das sequências obtidas da reacção cruzadas indesejadas, Nesto exemplo, a roacção cruzada do uma sonda N. gonorrhoaea como

N. moningitidis foi diminuida em mais do quo 200 vezes. 0 passo de hidrólise diforencial aumenta a sensibilidade dos híbridos instáveis, que estão em equilíbrio com a sonda não hibridizada, por constantemonte reduzir a quimioluminiscôncia

(via hidroliso) da sonda quando está na forma não hibridizada, baixando assim a quimioluminescência dovido à roacção cruzada.

EXEMPLO 16

Dotocção do uma sequência alvo quimérica associada com leucemia miologonosa crónica usando uma sonda intornamonte marcada com ácido do acridínio

Uma sonda 24 mor (sequência dada abaixo) com um braço de ligação intorno, do tipo L7, inserido como indicado foi sintetizado, marcado com ΕΛ e purificado como descrito no Exemplo 1. Esta sonda ó complementar ao mRNA quimérico transcrito (quebra comum) associado com a loucomia raielogenosa crónica (LMC) o sorá chamada do sonda bcr/abl. Esto ®RNA quimérico o um produto do gono quimérico formado por a translocação do uma rogião do gono abr no cromossoma 9 na rogião do cromossoma 22 contendo o gono bor.

Os alvos 6o mor do DNA sintético roprosentando a rogião da junção do ponto do quobra do alvo quimérico bor/abl, assim como os alvos abl o bor normais nos quais na mosma rogião, foram sintotizados como descrito no Exemplo 1 (sequências dadas abaixo). Também, um alvo mRNA foi produiido por cópia do um clono pGEN contendo um segmento nucleotídico 450 do um gone bor/abl quimérico centrado à volta do ponto do quebra. Uma cópia de mARN do mesme sogmento nuclootidico 450 no sontido da sonda foi também produzido como controlo negativo.

Soquôncia da sonda BCR/ABL

5¹-CCGCTGAAGGGCTTTT*GAACTCTGC-3'

Sequência do alvo sintético alvo BCR/ABL

5'ACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACT-3' alvo ABL

5'-ACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAATCTGTACTGCACCCTGGAGGTGGATTCCT-3 asterisco ingerido acima denota o local da insorção do um braço do ligação para a linião do ostor do acridínio e o sublirfhado indica as soquôncias ab 1.

A sonda bcr/abl foi liibridizada com aproximadaraonto 1 pmol de cada um dos alvos 11 stqrln<; acima como descrito no Exomplo 8, o a ostabilidado destos híbridos e da sonda não hibridizada foi testada a pll 7,6 como doscrito no Exomplo 7«

Rosultudo3:

Meia-Vida (min)

Alvos: mARN bcr/abl

-6η-

Razão*

27,7 39,6

ADN bcr/abl

15,0 21,4

Controlos: mARÍl no sentido da sonda

0,7

ADN abl	0,7	1
ADN bor	0,7	1
Sonda não hibridizada	0,7	w —

*

Meia vida do alvo ou do controle dividido pela meia vida da sonda não hibridizada.

. Estes dados demonstram que uma sonda marcada com EA designada para atravessar a região da junção do ponto de quobra da cópia do raARN bcr/abl quimérico associado com LMC foi capaz de descriminar entre o alvo quimérico e soquôncias normais (assim como a sonda não hibridizada) usando a tecnologia ΗΛΡ aqui descrita. Isto é uma demonstração que o método do invonto podo ser usado para especificamonto detectar alvos quiméricos (tipicamente associados com lesões genéticas) na presença de ácidos nucleicos de componentes não quiméricos normais.

Este exemplo demonstra ainda que outros alvos que o rRNA-neste caso ambos os mRNA e DNA -tem recursos para a protecção contra a hidroliso do EA quando hibridiza a sonda marcada com EA.

Claims (2)

1--. - Método para determinar, num meio, a presonça ou a quantidade do um analito que so combina com um parceiro do ligação para formar um par do ligação caracterizado por coraproondor;

a) a combinação com o reforido moio, ou cora uma sua porção, (1) do uma Cracção compreendendo o parceiro de ligação, o analito ou um análogo do analito que forma um par do ligação com o parceiro do ligação, om quo a roforida fraeção é conjugada cora uma substância cuja estabilidade soja dife rente quando a fraeção é um membro de um par de ligação quando comparada cora a sua estabilidade numa forma não ligada; o

2) so a roforida fraeção for o roferido analito ou o análogo, a combinação, no moio, do roferido parceiro do ligação;

b) a dogradação soloctiva da forma monos ostávol da substância; o

c) a rolação entre a quantidade do substancia quo porraanoce intacta após degradação da roforida substancia o a presença ou a quantidado do analito no meio.

- Método para determinar, num moio, a prosença ou quantidado do um analito quo so combina com um parcoiro do ligação quo para formar um par do ligação, caracterizado por comproonder:

a) a combinação com o roforido moio, ou com uma sua porção, do roforido parcoiro do ligação quo ó conjugado com uma substância cuja estabilidade soja diferonto quando o referido parcoiro do ligação ó um membro do um par de ligação quando comparada com a sua estabilidade numa forma não liga-Ó9-

b) a dogradação soloctiva da forna nonos ostávol da substância; e

c) a rolação entro a quantidade de substância que pormanoco intacta após a degradação da reforida substância o a presença ou a quaJitidado de analito no meio.

3*. _ Método para determinar, num meio, a presença pu a quantidado de um analito que se combina com um parceiro do ligação para formar um par do ligação caractorizado por comprcendor:

a) a combinação com o roforido meio, ou com uma sua porção (1) de uma fracção compreendendo o analito ou um análogo do analito que forma com par de ligação com o parceiro do ligação, om que a referida fracção ó conjugada com uma substân cia cuja estabilidade seja diforonte quando a fracção ó um membro de um par do ligação quando comparada com a sua estabilidade numa forma não ligada; e (2) do referido parceiro do ligação;

b) a degradação selectiva da forma menos estável da substância e

c) a rolação ontro a quantidade de substância que permanece intacta após a degradação da reforida substância e a presença ou a quantidade do analito no meio.

- Método para determinar, num meio, a presença ou a quantidade de um analito que se combina com um parceiro de ligação para formar um par de ligação, caractorizado por compreender:

a) a combinação com o referido meio, ou com uma sua porção, do um primeiro parceiro do ligação ao roforido ctnalito, om que o referido primoiro parceiro de ligação e conjugado com uma substância cuja estabilidade soja diferente quando o reforido primeiro parcoiro de ligação é um mombro do um par do ligação quando comparada com a sua estabilidade numa forma não ligada; o (2) do um segundo parceiro do ligação ao referido analito que reja diforonte do primeiro parceiro de ligação;

b) a dogradação selectiva da forma menos estável da substância; o

c) a rolação ontro a quantidade do substância quo permanece intacta após a degradação da referida substância o a presença ou a quantidade de analito no meio.

5-. - líátodo para detectar uma soquência do nucleotídeos num melo, caractorizado por compreon dor:

a) a combinação com o roforido meio, ou com uma sua porção, da reforida sequência de nucleotxdoos e de uma sonda substâç cialmonte complementar com ela, em que a referida sonda c conjugada com uma substância cuja estabilidade seja diforente quando a referida sonda está hibridizada com a referida sequência do nucleotideos quando comparada com a sua estabilidade numa forma não hibridizada;

b) a dogradação soloctiva do forma monos ostávol da substância; o

c) a rolação ontro a quantidade de substância quo permanece intacta após a dogradação da referida substância e a presen-71- ça ou a quantidade do sequência de nuclootileos no moio.

. - Motodo para dotorminar, num moio, a presença ou a quantidado de um analito, que se combina com um parceiro do ligação para formar um par do ligação, caractorizado por compreender:

a) a combinação com o referido meio, ou com uma sua porção (1) do uma fracção comproendendo um primeiro parceiro do ligação (1) do uma fracção compreondondo um primoiro parcoiro do ligação ao roforido analito, ou um análogo do roferido parcoiro do ligação que forma um par do ligação que participa numa roacção do ligação, em quo a reforida fracção ó conjugada com uma substância cuja estabilidade seja diferente quando a fracção e um membro do um par do ligação quan do comparada com a sua estabilidade numa forma não ligada';

e (2) de um segundo parceiro de ligação ao referido analito diferente do primoiro parcoiro de ligação na reforida roacção de ligação;

b) a degradação soloctiva da forma menos estável da substância; o

c) a rolação ontro a quantidade do substância que pormanece intacta após a dogradação da referida substância e a presença ou a quantidade do analito no moio.

7-· - Motodo, do acordo com uma das Reivindicações 1 a 6, caracterizado por a substância sor um éstor de acridínio.

8s. - Motodo do acordo com uma das Roivindicaçõos 1 a 6, caracterizado por a substância sor um membro seloccionado a partir do grupo constituído por:

om quo X representa um membro do grupo constituído por 0, N, S, halogónio, fósforo substituído, enxofre substituído, boro substituído, ou argónio substituído; Y representa um membro do grupo constituído por 0, S, ou NII; R^ representa um nunebro do grupo constituído por alquilo, alquenilo, arilo alquilo substituído, alquonilo substituído, arilo substituído, alcoxi, ariloxi ou está ausento quando X e um halogónio;

ropresonta um membro do grupo constituído por II, alquilo, alquonilo, arilo, alquonilo substituído, arilo substituído, alcoxi ou ariloxi se o só X for N; do grupo constituido por II, amino,

R^ ropresonta um membro hldroxi, tior, halogónio, nitro, amido, acotilo, alquilo, alquonilo, arilo, acetilo substituído, alquilo substituído, alquenilo substituído, ari lo substituído, alcoxi ou ariloxi; Rj_| reprosenta um membro do grupo constituido por alquilo, alquonilo, arilo, alquilo substituído, alquenilo substituído ou arilo substituído; e pelo monos um do R^, R^, R^ ou R^ contem um local reactivo quo permito a conjugação química.

9-» - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6, caracterizado por apresentar o passo adicional de separação, em que o componente homogéneo e utilizado para aumentar o vigor e/ou reduzir os fundos.

103. - Motodo dc acordo cora a reivindicação 9, caracterizado por o passo do separação sor seloccionado a partir do grupo quo consiste em filtração em gol, liide oxi-apati to, microsferas magnéticas, suportes do soparação catiónicos, membranas do separação e suportes do separação à base do anti-corpos.

11?. - MÓtodo do acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8, caractorizado por ser roalizado à temperatura ambiente.

12?. - Utilização do método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8, para a detecção do sequências do ácido nucleico alvo quiméricas.

13^a. - Utilização do método do acordo com a roivindicação 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8, com uma sonda capaz do discriminar ontre sequências do ácido nucloico alvo o não alvo, que diforem das referidas soquências de ácido nucloico alvo por um único nuclootídoo na região de hibridização.

14?. - Sequência polimórica de cadoia simplos para utilização num onsaio homogéneo caractorizada por compreondor polo monos dois monómeros nucleotidicos ou pelo menos um monómero nucleotídeico o um monóraero não-nuclootidico, tendo a roferida sequência pelo monos um local do ligação marcado esterooquiraicamonto tolerante capaz de pormitir hibridização da roferida sequência polimórica com uma sequência do ácido nucleico substancialmento complementar.

15'-. - Sequência polimórica de cadeia simples do acordo com a roivindicação 14, caractorizada por o referido local esterooquimicamonto tolerante ostar localizado na extremidade 3’ da reforida sequência polimórica.

16‘3. - Sequência polimorica do cadeia simples, do acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o reforido local osterooquimicamonto tolerante estar localizado na oxtromidade 5' da referida soquôncia polimórica.

17-· - Sequência polimorica do cadeia simples, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o reforido local ostoreoquimicaraento toloranto ostar localizado na base nuclootidica de um dos nonónoros nuclootidicos que compreondom a referida sequência polimorica.

185. _ Sequência polimorica de cadoia simplos, do acordo com a roivindicação 14, caractorlzada por o reforido local ostereoquimicamonte toloranto estar localizado na cadeia principal fosfato de um dos monómoros nuclootidicos quo compreendem a roforida sequência polimórica.

19-· - Sequência polimorica da cadoia simples de acordo com a reivindicação 14. caracterizada por o reforido local estereoquimicamento toloranto ostar localizado num dos açucares num dos monómeros nucleotidicos quo compreendem a roforida sequência polimorica·

205. - Sequência polimorica do cadoia simplos do acordo com a roivindicação 14, caracterizada por o reforido local ostereoquimicamonte tolerante estar localizado num dos monómeros não nucleotidicos que compreendem a referida sequência polimorica.

213. - Sequência polimorica do cadeia simplos de acordo com a reivindicação 14 ou 15 ou 16 ou

17 ou 18 ou 19 ou 20, caracterizada por o roforido local ostar marcado com um óstor de acridinio.

223. - Sequência polimorica do cadeia simples do acordo com a reivindicação 14 ou 15 ou 16 ou 17 ou 18 ou 19 ou 20, caracterizado por o referido local ser marcado com um membro seloccionado a partir do grupo constituido por;

em quo

X representa um membro do grupo constituido por 0, N, S, halogenio, fósforo substituido, enxofre, substituído, boro substituído ou arsónio substituido; Y representa um membro do grupo constituido por 0, S, ou XII; R^ ropresenta um membro do grupo constituido por alquilo, alconilo, arilo, alqui lo substituido, alcenilo substituido, arilo substituido, alcoxi, ariloxi, ou ostá ausente quando X ser um halogenio;

Rg representa um membro do grupo constituido por II, alquilo alcenilo, arilo, alconilo substituido, arilo substituido, alcoxi ou ariloxi so só so X for N do grupo constituido por II, amino, representa hidroxi, tiol, um membro halogónio nitro, amido, acotilo, alquilo, alcenilo, arilo, acetilo substituido, alquilo substituido, alcenilo substituido, arilo substituido, alcoxi ou ariloxi; R^ representa um membro do grupo constituido por alquilo, alcenilo, arilo, alquilo substituido, alconilo substituido ou arilo substituido; o pelo monos um de R

1’

R^ e R^ contem um local reactivo que permito a conjugação quimica.

23*. - Sequência nolimórica do cadoin simplos para utilização num ensaio homogéneo, caractorizada por comproendor unidades nonomóricas quo podem sor unidados monoméricas nucleotídicas ou unidados monomcricas não nucleotxdicas ou uma sua mistura, em que uma marca é ligada a pelo menos uma unidade monomcrica num local estoreo quimicamente tolerante.

24 ¢. - Soquência polimérica do cadeia simples, de acordo com a reivindicação 23, caractorizada por a marca sor um éster de acridínio.

25-', - Sequência polimérica do cadoia simplos, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por a marca ser um membro seleccionado a partir do grupo constituído por:

em que

X representa um membro do grupo constituído por 0, N, S, halogénio, fésforo substituído, enxofre substituído, boro substituído ou arsénio substituído; Y representa um membro do grupo constituido por 0, S ou NII; roprosenta um membro do grupo constituido por alquilo, alconilo, arilo, alquilo substituído, alcenilo, substituído, arilo substituído, alcoxi, ariloxi, ou até está'ausente quando X for um halogénio;

R^ representa ura membro do grupo constituído por II, alquilo alconilo, arllo, alcenilo substituído, arilo substituído, alcoxi ou ariloxi, so o só so X for N; R^ roprosenta um membro do grupo constituído por II, amino, hidroxi, tiol, halogónio, nitro, amido, acotilo, alquilo, alconilo, arilo, acetilo substituído, alquilo substituído, alconilo substituído, arilo substituído, alcoxi ou ariloxi; R^ ropresonta um mombro do grupo constituído por alquilo, alconilo, arilo, alquilo substituído, alcenilo substituído ou arilo substituído; e polo monos um que permite α do R^, R^, R^ ou R^ contém um conjugação quimica.

local reactivo

2Ó5. - Sequência polimórica de cadoia simplos, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por o éster de acridinio estar ligado a polo menos uma unidade monomérica não nucleotidica da roforida sequência polimérica.

27-. - Sequência polimerica de cadoia simples, do acordo com a reivindicação 24, caractorizadi por a marca ostar ligada a polo menos uma unidade monomérica não nucleotidica da referida sequência polimérica.

285. - Soquência polimórica de cadeia simplos do acordo com a reivindicação 24, caractorizada por o éster do acridinio estar ligado a polo monos uma unidade monomérica não nucleotidica da referida sequência po limérica.

29⁵· - Sequência polimórica de cadoia limitada, do acordo com a reivindicação 24, caracterizada por a marca estar ligada a polo menos uma unidade monomérica não nucleotidica, que substitui polo menos uma unidade monomérica originalmente presente na referida sequência polimérica, -78-

303. - Sequência polirnérica do cadoia siraplos do acordo com a reivindicação 24, caractorizado por o éstor do acridinio estar ligado a pelo monos uma unidado monomérica não nuclootidica quo é inserida entro dois monomoros adjacentes originalmente presentes na referida soquôncia polimérica.

31*. - Sequência polimérica do cadeia simples do acordo com a reivindicação 24, caractorizada por a marca estar ligada a polo menos uma unidade monomérica não nuclootidica quo é inserida entre dois monémoros adjacentes originalmonte presentes da roforida sequência polimérica.

323. - Método de utilização das sequências poliméricas da reivindicação 2ó ou 27 ou 28 ou 29 ou 30 ou 31 para detoctar a estabilidade híbrida local num duplo sonda-alvo usando degradação diferencial.

33-. - Método, de acordo com a reivindicação 12, para a dotecção da leucemia mielogénea crénica.

Lisboa, 21 de Setombro do 1988

FIG. /.

FOLHA 2 (8 FOLHAS)

Substituição de adenina por sonda marcada mente , do tipo 1 interna-

FIG. 2

FOLHA 3 (8 FOLHAS)

Substituição de adenina por sonda marcada internamente, do tipo 1

LOG % quimioluminescência

FIG. 3.

FOLHA 4 (8 FOLHAS)

Inserção de sonda marcada internamente , do tipo 1

FIG. 4

FOLHA 5 (8 FOLHAS)

Inserção de uma sonda marcada internamente ,

FIG. 5.

FOLHA 6 (8 FOLHAS)

Sonda marcada na extremidade com sonda adjacente

LOG % quimioluminescência

FIG. 6.

FOLHA 7 (8 FOLHAS)

Sonda marcada na extremidade com sonda

Minutos

FIG. 7.

FOLHA 8 (8 FOLHAS)

Sonda marcada na extremidade sem sonda