KR100249110B1 - 핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실질적으로 일정한 온도, 이온 강도 및 pH의 조건하에 1개의 프로모터-프라이머를 이용하여 표적 핵산 서열을 증폭시키는 방법. 이에 이용되는 조성물 및 키트에 관한 것이다. 증폭을 실시하기 위해, 프로모터 및 표적 서열의 3’-말단에 상보적인 프라이머를 가진 1개의 프로모터-프라이머 공급원, 및 역전사 효소 및 RNA 폴리머라제가 표적 서열을 포함한 혼합물에 제공하여 증폭을 실시한다. 본 발명은 임상적, 환경적, 법의학에서 특이적 핵산 서열 및 유사한 시료, 클로닝 및 생성 프로브를 정량화하기 위한 분석을 포함한 목적을 위해 핵산 표적 서열의 카피를 생산하는데 유용하다.
Description
[발명의 명칭]
핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트
[발명의 분야]
본 발명은 특정 핵산 서열 또는 “표적 서열”의 카피의 수를 증가시키는 방법(또는 증폭)에 관한 것이다. 표적 서열은 단독으로 또는 핵산의 동질성 또는 이질성 혼합물의 거대하거나 또는 작은 성분으로서 존재할 수 있다. 핵산의 혼합물은 진단 시험, 환경 시험, 연구, 클로닝과 같은 다른 과정을 위한 시약 또는 물질의 제조, 또는 다른 목적을 위해 취한 시료에서 발견된 것일 수 있다.
특정 핵산 서열의 선택적인 증폭은 진단 및 환경 분석, 및 다른 용도의 감도는 증가시키는 반면, 특이성을 유지하고, 다양한 연구 절차의 감도, 용이성, 정확도 및 신뢰도를 증가시키고, 다양한 목적을 위한 특정 올리고뉴클레오티드의 앰플 공급원을 제공하는데 유용하다.
본 발명은 실행상의 편리함으로 인해 환경 및 진단 시험에서 사용하기에 특히 적합하다.
[발명의 배경]
특정 핵산 서열의 검출 및(또는) 정량화는 미생물의 동정 및 분류, 감염 질병의 진단, 유전적 이상의 검출 및 특징화, 암과 관련된 유전적 변화의 확인, 질병에 대한 유전적 감수성의 연구, 및 다양한 유형의 치료에 대한 반응의 측정에 있어서 매우 중요한 기술이다. 그러한 절차는 또한 식료품, 환경 시료, 종자 원료 및 특정 미생물의 존재가 모니터될 필요가 있는 다른 유형의 물질에서의 미생물의 검출 및 정량화에 있어서 이용이 증가되고 있다. 핵산 서열의 관련성의 측정이 범죄 용의자를 확인하고, 부계(父系) 분쟁을 해결하고, 계통학적 및 계통 발생학적 체계를 세우고, 다양한 생활형의 분류를 돕는데 사용되는 법의 과학, 인류학, 고고학, 및 생물학에서도 이용될 수 있다.
특정 핵산 서열의 검출 및 정량화를 위한 통상의 방법은 핵산 혼성화이다. 이 방법은 이중 가닥 구조를 형성하는데 적절한 조건하에 상보적이거나 또는 반드시 상보적인 서열을 함유하는 2개의 핵산 가닥이 특별하게 결합하는 능력에 기초한 것이다. 특정 핵산 서열(“표적 서열”로 알려짐)을 검출하고 (또는) 정량화하기 위해 표지된 올리고뉴클레오티드 (“프로브”로 알려짐)는 표적 서열의 것에 상보적인 서열을 함유하는 것으로 제조된다. 통상적으로 “스크리닝”으로서 알려진 방법에서, 프로브는 표적 서열을 함유하는 것으로 추측되는 시료와 혼합되고 혼성체 형성에 적합한 조건을 형성된다. 프로브는 표적 서열이 시료에 존재한다면 그것과 혼성화된다. 그후에, 프로브-표적 혼성체는 다양한 방법 중의 하나로 단일 가닥 프로브로부터 분리된다. 그후에, 이 혼성체와 결합된 표지의 양은 시료 중의 표적 서열의 양의 지표로서 측정된다.
핵산 혼성화 분석의 감도는 주로 프로브의 특이적 활성, 혼성화 반응의 속도 및 정도, 혼성화된 프로브 및 혼성화되지 않은 프로브를 분리하는 방법의 수행, 및 표지가 검출될 수 있는 감도에 의해 제한된다. 최상의 조건하에 상기한 바와 같은 직접적인 혼성화 방법은 약 1×105내지 1×106개의 표적 분자를 검출할 수 있다. 그러나, 가장 민감한 절차는 스피드, 용이성 및 경제성과 같은 통상의 이상적 및 환경적 시험에 필요한 많은 특징이 결여되어 있다. 또한, 가장 민감한 절차에서 조차도 그 감도는 많은 목적하는 용도에 있어서 충분하지 않다.
이러한 유형의 분석의 다양한 성분들 및 성분 단계들 사이의 상호 작용의 결과로서 감도와 특이성은 거의 역의 관계에 있다. 그러므로, (프로브의 특이적 활성을 증가시키는 것과 같은)분석의 감도를 증가시키기 위해 취해진 단계들의 결과 잘못된 양성적인 시험 결과가 높은 비율로 나타날 수 있다. 감도와 특이성 사이의 연관 관계는 혼성화 분석의 감도를 개선시키는 데 있어서 중요한 장벽이다. 이러한 문제의 한가지 해결책은 증폭 절차를 이용하여 표적 서열의 존재량을 특이적으로 증가시키는 것이다. 시료의 남아있는 서열에서 코딩된 정보의 상당한 부분을 증폭시키지 않고 표적 서열의 독특한 부분을 증폭시킴으로써 감도는 효율적으로 증가시킬 수 있었지만 동시에 특이성은 해결하지 못하였다.
“폴리머라제 연쇄 반응” 또는 “PCR”로 칭하는, 핵산 서열을 특이적으로 증폭시키는 방법은 물리스 등의 문헌 [미합중국 특허 제4,683,195호, 동 제4,683,202호, 및 4,800,159 및 유럽 특허 출원 제86302298.4호, 동 제86302299.2호, 동 제87300203.4호 및 Methods in Exzymology, Volume 155, 1987, pp 335-350]에 기재되어 있다. PCR 반응은 주형으로서 상보적 서열의 각 가닥을 이용하여 동시에 발생하는 프라이머 의존성 핵산 합성의 반복된 사이클을 이용한다. PCR 절차에서, 상보적 서열의 양 가닥의 카피는 합성된다. PCR을 용이하게 하기 위하여, 프로그램가능한 열적 사이클 장치가 필요하다.
PCR 절차는 프로모터 서열을 PCR 반응에 사용된 프라이머 중의 하나에 혼입시킴으로써 이루어지는 RNA 전사 및 그후에 단일 가닥 RNA의 전사를 위한 주형으로서 이중 가닥 DNA를 이용하는 몇가지 사이클을 위한 PCR 절차에 의한 증폭과 연결된다 [Murakawa et al., DNA 7: 287-295(1988) 참조].
특정 핵산 서열의 증폭을 위한 다른 방법은 프로모터 서열을 함유한 프라이머의 이용을 통하여 프로모터 서열을 함유하는 중간체 이중 가닥 DNA 분자를 제공하기 위해 프라이며 혼성화, 연장 단계 및 변성 단계의 일련의 사이클로 이루어진다. 이중 가닥 DNA는 표적 서열의 다중 RNA 카피를 형성하는데 사용된다. 생성된 RNA 카피는 또 다른 카피를 생성하기 위한 표적 서열로서 사용될 수 있어, 다중 사이클이 실시될 수 있다 [Burg, et al., 국제 공개 제89/1050; Gingeras, et al., 국제 공개 제88/10315(때때로 “전사 증폭 시스템” 또는 TAS로 칭함); 카시안(Kacian) 및 풀츠(Fultz)의 EPO 출원 제89313154호; 데이비(Davey) 및 말렉(Melek)의 EPO 출원 제88113948.9호; 및 말렉 등의 국제 공개 제91/02818호 참조].
선행 기술로 인정될 수는 없지만, 워커 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 89: 392-296 (1992년 1월)]은 연장 반응 및 그에 따른 증폭을 가능케 하기 위해 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 DNA/DNA 복합체를 만들기 위한 초기 표적 서열 및 효소를 생산하기 위한 DNA 주형과 함께 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 이용 증폭 방법을 기재하고 있다. 벡커 등의 문헌 (EPO 출원 제88306717.5호)은 프라이머가 표적 서열과 혼성화되고 생성된 이중체가 연장 반응 및 증폭 전에 분열되는 증폭 방법을 기재하고 있다. 이 방법에서 프라이머가 혼성화 영역을 지나서 연장하는 경우에, 연장 전의 분열을 필요로 하며 프라이머는 증폭 전에 불필요한 연장 반응이 일어나는 것을 방지하기 위하여 그의 3’-말단에서 봉쇄되어야 한다. 크래머(Kramer) 등의 문헌(미합중국 특허 제4,786,600호)는 Qβ 카피를 이용하여 RAN 표적 서열 중에서 많은 프로브 서열의 카피를 형성하는 방법을 기재하고 있다. 우데아(Urdea)의 국제 공개 제91/10746호는 T7 프로모터 서열을 혼입하는 시그널 증폭 방법을 기재하고 있다.
핵산을 증폭시키는 다른 방법으로는 유럽 특허 공개 제320,308호에 기재된 리가제 연쇄 반응(LCR)을 들 수가 있으며, 여기서 적어도 4개의 분리된 올리고프로브가 사용되며, 2개의 올리고프로브는 제3 및 제4올리고프로브가 제1 및 제2올리고프로브와 혼성화하여 리게이션 시에 변성되고 검출될 수 잇는 연결된 프로브를 형성할 수 있는 적절한 배향하에 동일한 표적 가닥의 반대 말단과 혼성화한다. 선행 기술로 인정될 수는 없지만, 유럽 특허 공개 제 0 427 073 A2호(1991년 5월 15일에 공개됨)에 기재된 다른 방법에서는 헤어핀을 형성할 수 있고 헤어핀 중에 관능성 프로모터 영역을 가진 재발성 프로브가 표적 서열과 혼성화되고, 그 후에 RNA 전사가 이루어질 수 있도록 표적 서열에 혼성화된 제2올리고뉴클레오티드에 리게이션된다.
또다른 방법으로는 올리고뉴클레오티드 합성법 및 클로닝이 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 온도, pH 또는 이온 강도와 같은 반응 조건들을 변형시킬 필요 없이 또한 다른 다중 프라이머 또는 프로모터를 첨가할 필요없이 표적 핵산 서열의 다중 카피를 합성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 임상적, 환경적, 법의학에서 특정의 핵산 표적 서열 및 유사한 시료를 검출 및(또는) 정량화하거나 또는 다양한 용도를 위한 특정표적 서열의 DNA 및(또는) RNA의 많은 카피를 형성하기 위한 분석의 성분으로서 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 클로닝을 위한 핵산 표적 서열의 다중 DNA 또는 RNA 카피를 형성하거나, 또는 프로브를 생성하거나 또는 서열화를 위한 RNA 또는 DNA 카피를 형성하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 실질적으로 표적 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 혼성화하기 위해 표적 서열의 3’-말단에 충분히 상보적인 “복합화” 서열 (즉, 프라이머)을 가진 “프로모터-프라이머”로서 알려진 1개 이상의 올리고뉴클레오티드와 핵산 표적 서열 (DNA 또는 RNA)로 이루어진 혼합물을 배양시키는 것을 특징으로 한다. 프로모터-프라이머에는 또한 복합화 서열에 대해 5’에 위치한, RNA 폴리머라제를 위한 프로모터도 포함된다.
“에서 또는 그 근처에서”란 간단히 표적 자체의 3’-말단을 나타내는 것이지, 검출된 RNA 또는 DNA 분자 전체를 의미하는 것이 아니다. 예를 들면, “표적”은 달리 언급이 없으면 큰 RNA 분자 내의 RNA 분자의 작은 중심 부분일 수 있다.
“1개 이상”이란 반응 혼합물에 첨가된 프로모터-프라이머가 본 발명의 증폭이 진행될 수 있는 거의 동일한 위치(동일한 가닥 상의 플러스 또는 마이너스 약 10개의 염기)에서 동일한 표적 서열에 거의 결합할 수 있도록 충분히 유사한 것을 의미하는 것이다. 본 발명은 혼합물에 다른 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 프로모터-프라이머의 혼성화를 돕는 “헬퍼” 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 배제하지 않는다.
상기한 바와 같은 “필수적으로 이루어지는”이란 혼합물이 필요한 반응물 및 시약을 모두 함유하는 것을 의미한다. 그러나, 그러한 혼합물은 또한 본 발명의 증폭에 정성적으로 영향을 미치지 않는 효소 또는 다른 치환체를 함유할 수 있으며 그 혼합물은 동일한 표적 서열을 위한 다른 프로모터-프라이머 또는 “헬퍼” 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. “헬퍼” 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. “헬퍼” 올리고뉴클레오티드는 프로모터-프라이머 또는 프로브와 같은 복합화 핵산과 표적 서열의 사이의 복합화를 돕는 핵산서열이며, 그것은 표적 서열의 3’-말단에 존재하는 서열에 의해 결정될 것이다. 상기 본 발명에 따른 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 호간 등의 미합중국 특허 제5,030,557호에 기재된 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하는 혼성화 방법에 따라, 즉 표적 서열이 2차 구조를 갖는다 하더라도 그의 표적 핵산 서열에 대한 프로모터-프라이머의 결합을 돕는 것으로 이용된다. 그러한 헬퍼 올리고뉴클레오티드 이용의 유사성에도 불구하고, 그러한 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 놀랍게도 이러한 절차의 효능에 대한 역효과 없이 증폭 프로토콜에 사용될 수 있다.
프로모터-프라이며 및 표적 서열은 프로모터-프라이머/표적 서열 혼성체가 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건에 놓여진다. 이러한 반응에서 표적 서열의 3’-말단은 복합화 서열 및 표적 서열 사이의 혼성화된 복합체에 인접한 위치로부터 일어나는 DNA 연장 반응에서 연장되는 것으로 믿어진다. 프로모터 서열은 이러한 연장 반응을 위한 주형이며, 그것은 제1DNA 연장 생성물을 생성함으로써 이중 가닥 프로모터 서열이 형성된다. 프로모터-프라이머의 3’-말단도 또한 제2DNA 연장 반응을 위한 프라이머로서 제공될 수 있으며 그 반응은 표적 서열을 주형으로서 이용하여 그 결과 이중 가닥 핵산 복합체를 형성한다. RNA 표적 서열이 이용된다면 그 복합체는 DNA/RNA 복합체이고, DNA 표적 서열이 이용된다면 그 복합체는 DNA/DNA 복합체이다.
제1DNA 연장 생성물은 프로모터-프라이머의 프로모터를 인지하는 RNA 폴리머라제에 의해 이용되는 표적 서열의 다중 RNA 카피를 생성한다. 놀랍게도, 표적 서열이 RNA/DNA 복합체 또는 RNA 단독으로 이루어진 경우에, T7 RAN 폴리머라제와 같은 DNA 의존성 RNA 폴리머라제는 RNA/DNA 복합체 또는 RNA를 “해독”할 수 있고 단일 가닥 RNA를 형성하므로 본 발명에 효과적이다.
바람직한 실시태양에서, 프로모터-프라이머는 3’-말단 또는 그 근처에서 그 방향으로 핵산의 연장을 억제하거나 또는 저지하는 변형된 뉴클레오티드로 이루어질 수 있는 변형체를 함유한다. 놀랍게도 본 발명은 변형된 프로모터-프라이머의 3’-말단으로 수행될 수 있으며, 특히 놀라운 점은 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머의 혼합물 (또는 다르게 변형된 2개의 프로모터-프라이머)을 이용한 결과 고효율의 증폭을 실시하게 되고, 그러므로 비변형 또는 변형된 프로모터-프라이머 단독으로 사용한 경우 보다 더 많은 카피를 할 수 있다는 점이다. 프라이머 연장을 저지하거나 또는 감소시키기 위한 그러한 유용한 변형체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
표적 서열이 DNA 또는 RNA로 이루어지는 경우, 본 발명은 또다른 면에 따라서 화학적 또는 효소적 분해 또는 처리에 의해 표적 서열의 3’-말단이 생성되며 그 결과 프로모터-프라이머의 프로모터 영역을 따라 표적 서열의 3’-말단이 연장된다. 그러한 생성은 예를 들면 RNA:DNA 혼성체(예를 들면 DNA 프로모터-프라이머 및 RNA 표적 혼성체) 상에서의 RNAse H의 작용, 엑소뉴클레아제에 의한 처리 및 특정의 제한 엔도뉴클레아제(예를 들면, DNA 표적을 위한) 또는 리보자임(예를 들면, RNA 또는 DAN 표적에 의함)에 의한 분해에 의해 이루어질 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 반응 조성물에 1개 이상의 “헬퍼” 올리고뉴클레오티드를 혼입하는 것을 특징으로 한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 핵산의 표적 가닥의 5’-말단은 연장 반응 또는 전사 반응을 중지시키도록 한정될 수 있다. 그러한 한정을 실시하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며 표적 서열의 5’-말단에 적절한 핵산 서열 (예를 들면, 올리고뉴클레오티드)을 복합화하는 것 또는 표적 서열의 5’-말단을 변형시키는 것을 들 수가 있다.
본 발명은 또한 필수적으로 표적 서열, 프로모터-프라이머, RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 및(또는) 역전사 효소 및 시약으로 이루어진 조성물 및 증폭하기에 충분한 완충 조건을 특징으로 한다. 또다른 실시태양에서는, 프로모터-프라이머에 변형 및 비변형된 3’-말단이 모두 포함된다. 본 발명은 또한 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머 및(또는) 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 프로모터-프라이머의 혼합물을 포함한 조성물을 특징으로 한다.
본 발명을 특징화하기 위한 전형적인 분석의 일례에서는, 증폭될 표적 핵산 시료를 적절한 완충액, 염, 마그네슘, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 1개 이상의 프로모터-프라이머, 디티오트레이톨, 및 스페르미딘을 함유한 완충 농축액과 혼합시킨다. 이 반응물을 약 100℃에서 임의로 인큐베이션시켜 임의의 2차 구조를 변성시킨다 (이러한 단계는 표적이 단일 가닥 RNA이고, 프로모터-프라이머도 또한 단일 가닥일 경우 불필요하다). 실온으로 냉각시킨 후에, 역전사 효소 및 RNA 폴리머라제를 첨가하고 그 반응물을 수분 내지 수시간 동안 효소가 활성화되는 적절한 항온, 예를 들면 37 내지 42℃에서 인큐베이션시켰다. 프로브 용액을 첨가하고, 60℃에서 10 내지 30분 동안 인큐베이션시키고, 혼성화되지 않은 프로브를 선택적으로 가수분해시키기 위해 용액을 첨가하고, 반응물을 60℃에서 5 내지 10분 동안 인큐베이션시키고, 광도계로 남아 있는 화학 발광을 측정함으로써 반응물을 분석할 수 있다 [본 명세서에 참고로 인용한 Arnold 등의 PCT US88/02746 참조, “HPA” 방법으로 명명함]. 본 발명의 방법에 의한 생성물은 당업계의 숙련인에게 공지된 많은 다른 분석 시스템 또는 다른 용도를 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 성분을 포함하고 본 발명의 용이한 수행을 가능케 하는 키트를 특징으로 한다. 이러한 키트는 또한 또한 절차의 일부인 본 발명을 행할 수 있는 다른 물질을 포함할 수 있으며, 멀티-웰 기술에 적합할 수도 있다.
[정의]
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다음의 용어는 다른 언급이 없으면 다음의 의미를 갖는 것이다.
[A. 핵산]
“핵산”은 서열에 존재할 수 있고 본 발명의 실시를 방해하지 않는 임의의 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 분자와 함께 RNA 또는 DNA를 의미한다.
[B. 주형]
“주형”은 핵산 폴리머라제에 의해 카피될 수 있는 핵산 분자이다. 주형은 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 폴리머라제에 따라 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥일 수 있다. 합성된 카피는 주형에 대해 상보적이다.
[C. 프라이머]
“프라이머”는 (혼성화 조건, 예를 들면 엄격한 조건하에 수소 결합 또는 혼성화에 의해) 주형과 혼성화하여 역전사 효소와 같은 DNA 폴리머라제에 의한 합성의 개시에 적합한 프라이머/주형 복합체를 제공할 수 있도록 주형에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드이며, 그것은 주형에 상보적인 그의 3’-말단에 연결된 공유 결합된 염기의 첨가에 의해 연장된다. 그 결과 프라이머 연장 생성물이 형성된다. 사실상 공지된 (역전사 효소를 포함한) 모든 DNA 폴리머라제는 DNA 합성을 개시하기 위하여 단일 가닥 주형에 대한 올리고뉴클레오티드의 복합화 (“프라이밍”)를 요구한다. 적절한 상황 하에서, 프라이머는 프로모터-프라이머의 일부일 수 있다. 그러한 프라이머의 길이는 일반적으로 10 내지 100개 염기, 바람직하게는 20 내지 50개 염기의 길이이다.
[D. 프로모터 또는 프로모터 서열]
“프로모터” 또는 “프로모터 서열”은 핵산 분자에 결합하고 특정 부위에서 RNA의 전사를 시작하기 위한 시그널로서 DNA 의존성 RNA 폴리머라제(“전사 효소”)에 의해 인지되는 특정 핵산 서열이다. 결합하기 위하여, 그러한 전사 효소는 일반적으로 프로모터 및 그의 상보체가 이중 가닥이 되는 것을 필요로 하며 주형 부분은 이중 가닥일 필요는 없다. 개개의 DNA 의존성 RNA 폴리머라제는 프로모팅 전사의 효율 면에서 아주 다양할 수 있는 다른 여러 프로모터 서열을 인지한다. RNA 폴리머라제가 전사를 개시하기 위해 프로모터 서열에 결합할 때 프로모터 서열은 전사되는 서열의 일부가 아니다. 그러므로, 생성된 RNA 전사체는 프로모터 서열을 포함하지 않을 것이다.
[E. 프로모터-프라이머]
프로모터-프라이머는 프로모터 및 프라이머로 이루어진다. 그것은 표적 핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 복합화하기 위해 표적 핵산 서열의 3’-말단에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드이며, 그것은 프로모터-프라이머 복합체가, 증폭되는 핵산을 위한 분석, 시험, 클로닝 또는 다른 용도의 요건이 만족되는 표적 서열의 충분한 증폭을 가능케 하기에 충분한 정도로 표적 서열의 말단에 가까운 것을 의미한다. 프로모터-프라이머는 표적 핵산 서열의 3’-말단 (또한, 3’-말단(terminus)로서 알려짐)으로부터 연장되는 상보적인 핵산 서열을 형성하기 위해 주형으로서 사용되어 일반적으로 이중 가닥 프로모터를 형성하고 이중 가닥을 파괴할 수 있도록 임의로 변성시키거나 또는 효소적 활성화시킨다.
DNA 또는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제는 또한 프로모터-프라이머의 상보적인 영역에 대한 표적 서열 5’의 부분을 주형으로서 사용하여 표적 핵산 서열에 대한 상보적인 가닥을 형성한다.
프로모터-프라이머의 3’-말단은 그들로부터 일어나는 연장 반응을 저지하거나 또는 억제하기 위해 변형되거나 또는 봉쇄될 수 있다. 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머로 이루어진 프로모터-프라이머의 용액은 본 발명의 목적을 위해 필수적으로 동일한 핵산 서열로 이루어진다. 변형된 프로모터-프라이머는 비변형된 프로모터-프라이머와 다른 프로모터 또는 다른 인지 서열을 함유하지 않는다. 이것은 약 10개의 염기 내에서 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머가 동일한 RAN 폴리머라제에 의해 인지되고(비록 정확히 같은 위치에서 필요한 것은 아니지만) 동일한 표적 서열을 인지한다는 것을 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머 또는 변형된 프로모터-프라이머의 혼합물은 변형된 것을 제외하고는 동일하다. 프로모터-프라이머의 3’-말단은 당업계의 숙련인에게 공지된 여러 방법으로 봉쇄될 수 있다. 그러한 프로모터-프라이머의 길이는 일반적으로 40 내지 100개 염기, 바람직하게는 40 내지 60개 염기의 길이이다.
[F. 표적 핵산 서열, 표적 서열]
“표적 핵산 서열” 또는 “표적 서열”은 증폭되어야 할 목적으로 핵산 서열을 가지며, 그것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 증폭될 수 있거나 또는 증폭될 수 없는 증폭되는 서열의 5’ 또는 3’ 이외에 다른 서열을 포함할 수 있다.
표적 핵산 서열은 본 발명의 수행 중에 프로모터-프라이머가 혼성화되는 복합화 서열을 포함한다. 표적 핵산 서열이 원래 단일 가닥일 경우, 그 용어는 (+) 또는 (-) 가닥을 나타내며, 또한 표적 서열에 상보적인 서열을 의미할 것이다. 표적 핵산 서열이 원래 이중 가닥일 경우, 그 용어는 (+) 또는 (-) 가닥 모두를 나타낸다.
[G. 플러스(+) 및 마이너스(-) 가닥(들)]
핵산 합성의 논의는 핵산 이중체의 2개의 상보적인 가닥에 용어를 적용함으로써 간결화되고 명확해진다. 전형적으로, 단백질 또는 구조적 RNA를 생산하는데 사용되는 서열을 코딩하는 가닥은 “플러스” 가닥으로 칭해지며 그의 상보체는 “마이너스” 가닥으로 칭해진다. 많은 경우에 두 가닥이 모두 기능적이며 하나를 “플러스”로 칭하고 다른 것을 “마이너스”로 칭하는 것은 임의로 할 수 있는 것임이 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 그 용어는 핵산의 서열 배향을 지정하는데 매우 유용하며 프로모터-프라이머와 복합되는 원래의 표적 서열 가닥을 명명하는 “플러스” 가닥으로서 이러한 목적으로 위해 본 명세서에 사용할 것이다.
[H. DNA 의존성 DNA 폴리머라제]
“DNA 의존성 DNA 폴리머라제”는 DNA 주형으로부터 상보적인 DNA 카피를 합성하는 효소이다. 그 예로는 이. 콜리 및 박테리오파지 T7 DNA 폴리머라제로부터 얻은 DNA 폴리머라제 Ⅰ이 있다. 모든 공지된 DNA 의존성 DNA 폴리머라제는 합성을 개시하기 위해 상보적인 프라이머를 요구한다. 적합한 조건하에 DNA 의존성 DNA 폴리머라제는 RNA 주형으로부터 얻은 상보적인 DNA 카피를 합성할 수 있다는 것이 알려져 있다.
[I. DNA 의존성 RNA 폴리머라제 (전사 효소)]
“DNA 의존성 RNA 폴리머라제” 또는 “전사 효소”는 (일반적으로 이중 가닥인) 프로모터 서열을 가진 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥인 DNA 분자로부터 다중 RNA 카피를 합성하는 효소이다. 본 발명이 그들을 인지하는 RNA 폴리머라제와 함께 단일 가닥 프로모터를 포함한다는 것에 유의해야 한다. RNA 분자 (“전사체”)는 프로모터의 하류인 특정 위치에서 시작하는 RNA 분자의 5’-3’ 방향으로 합성된다. 전사 효소의 예는 이. 콜리 및 박테리오파지 T7, T3 및 SP6로부터 얻은 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 있다. 본 명세서에 나타낸 바와같은 적절한 조건하에 몇몇 전사 효소는 RNA 또는 RNA:DNA 공중합체를 주형으로서 사용할 수 있다.
[J. RNA 의존성 DNA 폴리머라제 (역전사 효소)]
“RNA 의존성 DNA 폴리머라제” 또는 “역전사 효소”는 RNA 주형으로부터 상보적인 DNA 카피를 합성하는 효소이다. 모든 공지된 역전사 효소는 또한 DNA 주형으로부터 상보적인 DNA 카피를 만드는 능력을 갖고 있으며, 따라서 그것은 RNA 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 모두를 포함한다. 프라이머는 RNA 또는 DNA 주형으로 합성을 개시하는데 필요하다.
[K. RNAse H.]
“RNAse H”는 RNA:DNA 이중체의 RNA 부분을 분해하는 효소이다. RNAse H는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 대부분의 역전사 효소 효소는 통상적으로 그들의 폴리머라제 활성 이외에 RNAse H 활성을 갖는다. 그러나, RNAse H의 다른 공급원은 결합된 폴리머라제 활성 없이 이용될 수 있다. 분해의 결과 RNA:DNA 복합체로부터 RNA가 분리될 수 있다. 별법으로, RNAse H는 RNA의 일부분이 용융되거나 또는 효소를 RNA의 일부에 감기지 않도록 하는 여러 위치에서 RNA를 간단히 절단할 수 있거나 또는 생성된 RNA 단편은 DNA 폴리머라제를 위한 프라이머로서 제공될 수 있다.
[L. 혼성화, 복합화]
“혼성화” 및 “복합화”라는 용어는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 통해 이중체 (“복합체”)를 형성하기에 충분히 상보적인 뉴클레오티드 서열들 사이의 이중체 형성을 의미한다. 프로모터-프라이머 또는 프라이머가 표적 (“주형”)과 “혼성화”하는 경우, 그러한 복합체 (또는 혼성체)는 DNA 합성을 개시하기 위해 DNA 폴리머라제에 의해 요구되는 프라이밍 기능을 제공하기에 충분히 안정하다.
[M. 변형된 프라이머 또는 프로모터-프라이머]
프라이머 또는 프로모터-프라이머의 3’-말단은 그들로부터 일어나는 연장 반응을 저지하거나 또는 억제하기 위해 변형되거나 또는 봉쇄될 수 있다. 변형 및 비변형된 프라이머 또는 프로모터-프라이머를 모두 갖는 프라이머 또는 프로모터-프라이머는 본 발명의 목적을 위해 필수적으로 동일한 핵산 서열로 이루어진다. 즉, 변형된 프라이머 또는 프로모터-프라이머는 변형 및 비변형된 올리고뉴클레오티드 모두가 표적 서열의 증폭이 저지되지 않도록 하는 표적 핵산 서열 상의 동일한 위치 (플러스 또는 마이너스 약 10 염기)에서 효율적으로 혼성화된다는 특이성 면에서 다른 복합화 서열 (프라이머)을 함유하지 않는다. 또한, 변형 프로모터-프라이머는 비변형된 프로모터-프라이머와 다른 인지 서열(프로모터)을 함유하지 않는다. 이것은 약 10개의 염기 내에서 변형 및 비변형된 프라이머 또는 프로모터-프라이머가 동일하고, 동일한 RNA 폴리머라제에 의해 인지되고 (비록 정확히 같은 위치에서 필요한 것은 아니지만) 동일한 표적 서열을 인지한다는 것을 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 변형 및 비변형된 프라이머 또는 프로모터-프라이머는 변형된 것을 제외하고는 동일하다.
프라이머 또는 프로모터-프라이머의 3’-말단은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 프로모터-프라이머에 대한 적절한 변형으로는 리보뉴클레오티드, 3’데옥시뉴클레오티드 성분 (예를 들면, 코르디세핀 (CO, Glen Research)), 3’,2’-디데옥시 뉴클레오티드 성분, 포스포로티오에이트와 같은 변형된 뉴클레오티드 및 아놀드 등의 문헌 (PCT US88/03173)에 기재된 바와 같은 비뉴클레오티드 연결 (RS) 또는 알칸-디올 변형 (Wilk et al., Nuc. Acids Res. 18:2065, 1990 참조)(RP)을 들 수가 있거나 또는 그 변형은 표적 핵산에 상보적이지 않은 프라이밍 서열에 대한 영역 3’으로 간단히 이루어질 수 있다. 물론, 다른 효율적인 변형도 마찬가지로 가능하다.
변형 및 비변형된 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 봉쇄된 올리고뉴클레오티드와 봉쇄되지 않은 올리고뉴클레오티드의 비율은 2:1 내지 1,000:1이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드와 다른 3’ 변형체의 혼합물이 이용될 수도 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 한정된 3’-말단을 가지므로 표적 서열에 대한 추가의 서열 3’은 갖지 않지만 표적 서열에 대한 추가의 서열 5’은 갖는 표적 핵산 및 프로모터-프라이머를 나타낸다.
제2도는 표적 서열의 복합화 영역에 추가의 서열 3’을 갖는 RNA 표적 서열을 나타낸다.
제3도는 올리고뉴클레오티드 (지그재그 선) 상에서 나타난 알칸 디올 변형 또는 RP의 도면이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 특정 핵산 표적 서열의 증폭 방법, 그에 사용되는 조성물 및 키트에 관한 것이다. 그러한 증폭된 표적 서열은 특정 핵산 표적 서열의 검출 및(또는) 정량화를 위한 분석 또는 다양한 용도를 위한 특정 표적 서열의 DNA 및(또는) RNA의 많은 카피 생산을 위한 분석에 유용하다.
제1도를 참고로 하여 보면, 본 발명은 RNA 또는 DNA일 수 있는 핵산 표적 서열(2)를 프로모터(6) 및 프라이머(8)을 갖는 프로모터-프라이머로 이루어진 올리고뉴클레오티드(4)로 처리하는 것으로 이루어지는 방법을 특징으로 하며, 그 방법에서 프라이머(8)은 표적 서열의 3’-말단(9)에서 또는 그 근처에서 복합화하기 위한 표적 서열의 3’-말단(9) 부분에 충분히 상보적이다. 프로모터-프라이머(4)는 필수적으로 증폭을 실시하기 위한 1개의 핵산 서열로만 이루어지고, 반응 혼합물에 다른 프로모터-프라이머를 첨가할 필요는 없다. 본 발명의 프로모터-프라이머에 적합한 프로모터는 그 서열에 결합하고 전사 과정을 개시함으로써 RNA 전사체를 생산하는 RNA 폴리머라제에 의해 특이적으로 인지되는 (자연적으로, 합성적으로 또는 제한 분해의 생성물로서 생산되는) 핵산 서열이다. 프로모터 서열은, 분해 과정에 안정성 또는 감도를 추가시키거나 또는 전사 효율을 증가시킬 수 있는, RNA 폴리머라제에 대한 실제적인 인지 부위를 지나서 연장되는 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 공지되어 시판되는 폴리머라제가 프로모터 서열에 특히 적합하다. 그러한 프로모터로는 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6 또는 이. 콜리로부터 얻은 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 것이 있다.
어떤 상황에서는, 프로모터-프라이머가 표적 서열과 복합화하는 것을 돕는 “헬퍼” 올리고뉴클레오티드를 혼합물에 첨가하는 것이 바람직할 수 있다.
프로모터-프라이머(4) 및 표적 서열(2)는 프로모터-프라이머/표적 서열 복합체(11)이 형성되고 DNA 합성이 개시될 수 있는 조건하에 놓여진다. 따라서, 반응 혼합물은 표적 서열의 다중 카피가 형성되기에 충분한 시간 동안 (리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트를 포함한) DNA 프라이밍 및 핵산 합성화 조건을 비롯하여, 프로모터-프라이머/표적 서열 복합체가 형성되는 조건하에서 인큐베이션된다. 그 반응은 증폭 반응 동안 반응 조건을 변화 또는 조절할 필요 없이 성분 효소와 같은 반응 성분의 안정성을 유지하기에 적합한 조건하에서 바람직하게 일어난다. 따라서, 반응은 실질적으로 등온성이며 실질적으로 일정한 이온 강도 및 pH를 유지하는 조건하에서 일어날 수 있다. 즉, 반응 조건은 효과적으로 일정할 수 있으며, 그것은 온도, pH 및 이온 농도가 반응 조건에 영향을 미칠 만큼 상당히, 고의적으로 변화되지 않는다는 것을 의미한다. 반응 혼합물의 성분은 단계별로 또는 동시에 혼합될 수 있다.
반응의 수행 중에, 표적 서열의 3’-말단(9)는 주형으로서 프로모터-프라이머의 프로모터 서열을 이용하는 연장 반응에서 적절한 DNA 폴리머라제에 의해 연장되어 프로모터 서열에 상보적인 DNA 연장 생성물(10)을 제공한다. 프로모터-프라이머의 프라이머 영역의 3’-말단도 또한 적절한 역전사 효소를 이용하는 연장 반응에서 연장되어 표적 핵산 서열에 상보적인 가닥(12)를 형성한다. 그후에, 생성된 이중 가닥 프로모터를 이용하여 적절한 RNA 폴리머라제를 결합시키고, 생성된 이중 가닥 표적 핵산 서열을 이용하여 단일 가닥 RNA의 다중 카피(표적 서열의 (+) 가닥에 상보적이 될 것임)를 생성한다.
프로모터-프라이머의 연장을 위한 DNA 폴리머라제는 표적 서열이 RNA일 때 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 (즉, 역전사 효소)일 수 있다. 상반적으로, 표적 서열이 DNA로 이루어지는 경우, DNA 폴리머라제는 DNA 의존성 DNA 폴리머라제이다. 그러나, 모든 공지된 역전사 효소는 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 갖기 때문에, 프로모터-프라이머가 DNA이고 표적 서열이 RNA일 경우를 비롯한 연장 반응을 행하기 위하여 역전사 효소 이외의 DNA 의존성 DNA 폴리머라제를 첨가할 필요는 없다. 적합한 역전사 효소로는 AMV 역전사 효소 및 MMLV 역전사 효소를 들 수가 있다.
본 발명에 필요한 RNA 폴리머라제는 이. 콜리 및 박테리오파지 T7, T3 및 SP6로부터 얻은 RNA 폴리머라제와 같은 DNA 의존성 RNA 폴리머라제일 수 있으며, 놀랍게도 표적 서열이 RNA일 때 그러한 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 효과적이다.
표적 서열이 DNA인 경우에, 표적 서열의 3’-말단은 제1도에 나타낸 바와 같이, 프로모터-프라이머의 프라이머의 5’-말단과 거의 일치하도록 한정되어야 한다(즉, 표적 서열은 프라이머와 복합화된 영역을 지나 3’으로 연장하는 뉴클레오티드를 가질 필요가 없다). 물론, 그러한 생성은 RNA 표적 핵산 서열 상에서 실시될 수도 있다. 화학적 또는 효소적 분해 또는 처리에 의한 핵산 표적의 한정된 3’-말단의 생성법은 당업계에 공지되어 있다.
제2도에 나타낸 바와 같이, 증폭은 놀랍게도 프라이머와 복합된 영역(11)을 지나 3’으로 연장하는 뉴클레오티드의 가닥(16)을 갖는 RNA 표적 서열 (14) 상에서 수행될 수 있다.
본 발명의 특징은 DNA 또는 RNA의 다중 카피를 얻을 수 있는 것이다.
바람직한 실시태양에서, 프로모터-프라이머는 (표적 서열에 따른) 말단으로부터의 연장을 저지하거나 또는 감소시키기 위하여 그의 3’-말단에 변형체를 갖는다. 그러한 변형체를 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 놀랍게도 증폭은 그렇게 변형된 3’-말단으로 행해질 수 있으며, 또한 놀랍게도 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머의 혼합물을 사용한 결과 고효율의 증폭을 실시할 수 있다. 예를 들면, 약 150개의 변형된 프로모터-프라이머와 1개의 비변형된 프로모터-프라이머의 비율은 증폭의 효율 및 효능을 크게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이러한 비율은 프로모터-프라이머 및 표적 서열과 같은 반응 조건 및 시약에 따라 변화할 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명을 실시하는데 필요한 시약, 효소 및 프로모터-프라이머의 일부 또는 모두로 이루어진 키트를 특징으로 한다. 키트로 이루어진 아이템은 필요에 따라 분리된 바이알을 공급되거나 또는 함께 혼합될 수 있다.
[실시예]
[서론]
다음의 실시예는 본 발명의 기작 및 유용성을 입증하는 것이다. 이들은 한정적이지 않은 것으로서 그와 같이 고려되어서는 안된다.
하기 실시예에서 사용된 효소는 조류 골수아구증 바이러스(AMV) 역전사 효소, T7 RNA 폴리머라제, 몰로니(Moloney) 쥐 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사 효소, 및 베테스다 리서치 라보라토리즈(Bethesda Research Laboratories)로부터 구입한 Superscript(RNase H minus MMLV RT, “MMLV SC RT”)이다. 유사한 활성을 갖는 다른 효소 및 다른 기원으로부터 얻은 효소를 사용할 수 있다. 상이한 프로모터 특이성을 갖는 다른 RNA 폴리머라제들도 또한 사용하기에 적합하다.
달리 명시하지 않는 한, 하기 실시예에서 사용한 반응 조건들은 100㎕ 용적중의 50mM 트리스-HCI, pH 7.6, 25 mM KCl, 17.5 mM MgCl2, 5 mM 디티오트레이톨, 2 mM 스페르미딘 삼염산염, 6.5 mM rATP, 2.5 mM rCTP, 6.5 mM rGTP, 2.5 mM rUTP, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dTTP, 0.3 ㎛ 프로모터-프라이머, MMLV 역전사 효소 600 유닛 및 T7 RNA 폴리머라제 400 유닛 및 명시한 양의 주형이다. 그러나, 최상의 반응 조건은 주어진 용도 및 환경의 요구에 따라 변할 수 있으며, 본 명세서에 제공된 상기 조건들은 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다. 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 예시적인 것으로서 한정적인 것이 아니며, 이들 및 다른 표적 서열들에 대해서는 다른 서열들이 사용된다.
[실시예 1]
한정된 3’-말단을 갖는 표적 서열을 사용하여 본 발명을 입증하기 위하여, 유레아플라스마 유레알리티쿰(Ureaplasma Urealyticum) 5S rRNA의 3’-말단에 상보적인 서열을 함유하는 프로모터-프라이머 (서열 확인 번호 1)을 T7 RAN 폴리머라제 및 MMLV 역전사 효소의 존재 하에 RNA와 함께 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 일정 시점에서 반응 시료를 제거하여, 호간의 문헌 (미합중국 특허 제5,030,557호, Means for Enhancing Nucleic Acid Hybridization)에 기재된 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하는 혼성화 방법에 따라, 본 발명에 따른 헬퍼 프로브들(서열 확인 번호 4, 5)의 존재하에 표적 RNA와 동일한 센스의 2개의 프로브(서열 확인 번호 2, 3)와의 혼성화로 분석하였다.
[실시예 2]
본 발명의 3’에서 프로모터-프라이머 결합 부위까지의 뉴클레오티드를 함유하는 표적 서열과 함께 작용함을 입증하기 위하여, 이. 콜리 참고 서열 (서열 확인 번호 6)의 683-703 염기에 대응하는 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 21 염기들에 상보적인 서열을 함유하는 프로모터-프라이머를 하기 효소들의 존재하에 (+) 센스 에스. 뉴모니애 rRNA 1fmole과 함께 인큐베이션시켰다. 반응액 10㎕를 2개의 센스를 모두 갖는 아크리디늄 에스테르로 표지시킨 프로브(Seq. ID No. 7)로, 헬퍼 프로브들(서열 확인 번호 8, 9)로 또는 이들의 상보체로 분석 평가하였다. 별개의 실험으로, 반응액의 일부를 혼성화 전에 NaOH로 가수분해시켰다.
상기 결과는 본 발명의 증폭이 역전사 효소, T7 RNA 폴리머라제 및 RNase H 활성에 좌우되며, 생성된 주생성물은 표적 RNA에 상보적인 RNA라는 사실을 나타낸다.
[실시예 3]
증폭에 프로모터-프라이머의 3’말단의 연장이 필요한 지를 알아보기 위하여, 아놀드 등(RS; PCT US 88/03173) 또는 윌크 등(RP; Nucleic Acids Res.중의 제3도 18:2065, 1990)이 기술한 바와 같은 표준 화학적 방법 또는 코르디세핀(CO, Glen Research)을 이용하여 3’ 변형된 프로모터-프라이머를 합성하였다. 역전사 효소에 의한 연장에 대한 이들 변형의 효과를 하기 실험으로 시험하였다. 에스. 뉴모니애 16S rRNA(서열 확인 번호 6)에 상보적인 서열을 갖는 프로모터-프라이머를 표적과 혼성화시킨 다음 MMLV RT 존재하에 30분 동안 인큐베이션시켰다. 연장 반응 후반에 RNA 및 cDNA를 95℃에서 2분 동안 변성시키고, rRNA와 동일한 센스를 갖는 프로브(서열 확인 번호 7) 및 헬퍼 프로브들(서열 확인 번호 8, 9)과의 혼성화 보호 분석으로 분석 평가하였다.
상기 결과는 3’ 변형된 프라이머가 비변형된 프라이머에 비해 역전사 효소에 의한 연장 반응을 변화시키지 않았다는 것을 나타내었다.
[실시예 4]
한정된 3’-말단을 갖는 표적 서열의 증폭에 3’-말단의 연장이 필요한 지를 알아보기 위해, 유레아플라스마 유레알리티쿰 5S rRNA (서열 확인 번호 1)의 3’-말단에 상보적인 프로모터-프라이머를 RS로 3’-말단을 변형시키고 표적 RNA, MMLV 역전사 효소 및 T7 RNA 폴리머라제 1 fmole과 함께 인큐베이션시켰다. 실시예 1에 기재한 바와 같은 프로브와의 혼성화는 프로모터-프라이머의 효율적인 연장이 증폭에 필요하지 않다는 것을 나타내었다. T7 RNA 폴리머라제 만을 함유한 반응에서 증폭 반응이 결여된 것으로 알 수 있는 바와 같이, 역전사 효소 활성은 필요하다.
[실시예 5]
3’에서 프로모터-프라이머 결합 부위까지의 서열을 함유한 표적의 증폭에 대한 3’ 변형의 효과를 시험하기 위해, 에스. 뉴모니애 16S rRNA에 대해 상보적인 서열 (서열 확인 번호 6)을 함유한 프로모터-프라이머를 3’ RS, 3’ RP 또는 3’ 코르디세핀 변형된 것으로 합성하였다. 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머를 에스. 뉴모니애 rRNA, MMLV 역전사 효소 및 T7 RNA 폴리머라제와 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응액 10㎕를 표적 RNA와 동일한 센스의 프로브로 분석하였다.
놀랍게도, 상기 데이타는 프로모터-프라이머의 3’-말단에 대한 변형이 이러한 증폭 기작으로 관찰된 시그널을 증가시켰다는 것을 나타내었다.
[실시예 6]
하기 실험은 비변형 또는 변형된 3’-말단을 갖는 프로모터-프라이머에 의한 생성물 축적의 동력학을 입증하기 위해 실시되었다. 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 23S rRNA에 대해 상보적인 서열을 함유한 프로모터-프라이머를 MMLV RT 및 T7 RNA 폴리머라제의 존재하에 엠. 튜베르쿨로시스 rRNA 1 fmol과 함께 인큐베이션시켰다. 하기한 바와 같은 시간대에. 시료를 제거하고 표적 RNA와 동일한 센스의 아크리디늄 에스테르로 표지시킨 프로브로 분석하였다. 표적물이 없는 반응으로부터 얻은 표준 RLU를 데이타에서 감하였다.
상기 데이타는 비변형 및 3’ RS 변형된 프로모터-프라이머는 선형 방식으로 생성물을 축적하는 반면, 3’ RP 프로모터-프라이머는 더욱 지수적인 방식으로 생성물을 축적함을 나타낸다. 이 결과는 예상치 못한 것이며, 반드시 일정한 온도, pH 및 이온 강도에서 일어나는 독특한 증폭 기작을 의미한다.
[실시예 7]
이 실험에서, 다른 프로모터-프라이머는 AMV 역전사 효소 600 유닛 및 T7 RNA 폴리머라제 400 유닛의 존재하에 에스. 뉴모니애와 함께 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 시료 10㎕를 표적 RNA와 동일한 센스의 아크리디늄 에스테르로 표지시킨 프로브로 분석하였다.
이 데이타는 3’ 변형된 프로모터-프라이머가 AMV 역전사 효소를 가진 비변형된 것에 비해 더 높은 시그널을 생성하였다는 것을 나타낸다.
[실시예 8]
하기 실험은 첨가제 (DMSO 및 글리세롤)는 증폭 시스템의 효능(감도)을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 변형 또는 비변형된 프로모터-프라이머 (서열 확인 번호 6)를 MMLV 역전사 효소 및 T7 RNA 폴리머라제의 존재하에 에스. 뉴모니애 rRNA에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응액 10㎕를 표적 RNA와 동일한 센스의 아크리디늄 에스테르로 표지시킨 프로브로 분석하고 음성 값을 감하였다.
상기 데이타는 첨가제가 비변형된 프로모터-프라이머에 의한 결과에는 거의 영향을 미치지 않지만, 3’ RP 변형에 의해 가장 뛰어난 효과를 갖는 3’ 변형된 프로모터-프라이머에 의한 시그널을 상당히 증가시킨다는 것을 나타내었다.
[실시예 9]
이번 실험에서, 엠. 튜베르쿨로시스 23S rRNA에 상보적인 서열을 갖는 프로모터-프라이머를 1 또는 2개의 3’ 리보시티딘 성분으로 대체된 1 (리보) 또는 2 (디리보) 3’-말단 데옥시시티딘으로 또는 3’-말단 포스포로티오에이트 (PS) 데옥시뉴클레오티드로 합성하였다. 이러한 변형된 프로모터-프라이머는 50mM 트리스 HCl, pH 8, 20 mM MgCl2, 35 mM KCl, 각각 4 mM의 GTP, ATP, UTP, CTP 및 각각 1 mM의 dTTP, dGTP, dCTP, 15 mM N-아세틸시스테인, 10% 글리세롤, 10% DMSO, MMLV 역전사 효소 600 유닛 및 T7 RNA 폴리머라제 400 유닛 중의 엠. 튜베르쿨로시스 rRNA를 42℃에서 4시간 동안 증폭시키는데 사용하였다. 각 반응액 5㎕를 95℃로 2분 동안 가열하고 rRNA 표적과 동일한 센스의 프로브 (서열 확인 번호 11)와 헬퍼 프로브 (서열 확인 번호 12 및 13)로 분석하였다.
상기 결과는 3’-말단에 1 또는 2개의 리보뉴클레오티드를 가진 프로모터-프라이머 또는 3’ 포스포로티오에이트 결합을 가진 프로모터-프라이머가 비변형된 프로모터-프라이머 보다 이 시스템에서 더 우수한 증폭을 일으킨다는 것을 나타내었다.
[실시예 10]
역전사 효소에 의한 프로모터-프라이머의 연장 반응을 변화시키기 위한 또다른 방법은 비변형된 프로모터-프라이머를 봉쇄된 크로디세핀 변형된 프로모터-프라이머와 혼합하는 것이다. 프로모터-프라이머의 혼합물의 사용은 다른 3’ 변형에 대해서 관찰된 바와같이 역전사 반응에서 관찰된 cDNA의 생성을 크게 감소시켰다. 하기 실험에서는 코르디세핀으로 변형된 또는 비변형된 엠. 튜베르쿨로시스 16S rRNA에 상보적인 서열 (서열 확인 번호 14)을 가진 프로모터-프라이머를 사용하였다. 프로모터-프라이머를, 10 mM 트리메틸 염화 암모늄을 사용한 것을 제외하고는 실시예 9에서와 동일한 조건을 이용하여 엠. 튜베르쿨로시스 rRNA 3 tmol, MMLV 역전사 효소 300 유닛 및 T7 RNA 폴리머라제 200 유닛과 함께 인큐베이션시켰다. 42℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 반응액 20㎕를 표적 RNA와 동일한 센스의 프로브 (서열 확인 번호 15, 헬퍼 프로브 16, 17도 포함)로 분석하였다. 결과는 5회 반복값의 평균이다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머의 혼합물은 완전히 변형된 프로모터-프라이머보다 더 우수하게 작용하였다. 변형된 프로모터-프라이머와 비변형된 프로모터-프라이머의 비율 (에를 들면, 1:1 내지 150:1)을 달리하면 증폭의 효율을 효과적으로 증가시켰다. 최적의 비율은 사용된 시약, 표적 서열 및 프로모터-프라이머를 포함한 반응 조건에 따라 변화할 것이다. 제공된 증폭을 위한 적절한 조건을 선택하는 것은 무리한 실험없이 당업계의 숙련인의 기술 범위내에 드는 것이다.
별개의 실험에서 증폭으로부터 얻은 시그널을 공지된 표준 시그널과 비교한 결과 증폭의 정도는 2.6×105배인 것으로 계산되었다.
[실시예 11]
실험에서, 비변형된 프로모터-프라이머 또는 RP 또는 CO로 변형된 프로모터-프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예10과 마찬가지로 반응을 실시하였다. 표적 30 tmol을 각 반응에 첨가하였다. 하기에 나타낸 바와 같이, 상이하게 3’ 변형된 프로모터-프라이머의 혼합물을 상당히 증폭시켰다.
생성된 비특이적 생성물의 양은 변형된 프라이머 보다 훨씬 낮은 것으로 나타났고, 이는 본 발명의 다른 잇점으로 증명되었다.
[실시예 12]
시간에 따른 표적 서열의 상보적인 카피 수의 증가는 역전사 효소 및 T7 RNA 폴리머라제를 필요로 한다. 프로모터-프라이머가 표적의 3’-말단과 혼성화할 경우, T7 프로모터 서열의 카피 결과 T7 RNA 폴리머라제에 의해 인지되고 표적 서열의 RNA 카피를 만드는데 이용될 수 있는 이중 가닥 DNA 프로모터가 생성되었다. 3’ 변형된 프로모터-프라이머에 의한 결과는 T7 꿈 폴리머라제가 RNA 합성에 대한 주형으로서 RNA를 사용하였다는 것을 나타낸다. 합성 올리고뉴클레오티드는 이러한 가정을 시험하기 위해 만들어졌다. 제1올리고뉴클레오티드는 3’표적 결합 서열에 연결된 5’ T7 프로모터 서열을 함유한 DNA 프로모터-프라이머였다. 프로모터 서열 만을 함유한 또다른 올리고뉴클레오티드도 또한 합성되었다. 표적 서열은 3’-말단에 부착된 T7 프로모터 서열의 DNA 상보체와 함께 5’ 합성 RNA 표적 서열을 함유한 RNA:DNA 키메릭 분자로 이루어졌다.
이 실험에서, RNA-DNA 키메릭 표적 10 또는 1 fmol은 RNA 표적 가닥을 단일 가닥으로 둔 채 T7 프로모터 및 표적 결합 서열, 또는 프로모터 서열 만을 함유한 프로모터-프라이머와 혼성화하였다. 이 혼성체를 T7 RNa 폴리머라제의 존재 또는 부재하에 인큐베이션시키고 생성물을 RNA 표적 서열과 같은 센스의 프로브와 혼성화시켰다.
놀랍게도, 상기 데이타는 RNA 단편이 RNA 전사를 위한 주형으로서 T7 RNA 폴리머라제에 의해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
[실시예 13]
하기 실시예는 RNA 가닥이 역전사 효소 및 T RNA 폴리머라제의 존재하에 RNA를 합성하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이 실험에서, RNA:DNA 키메릭 표적을 표적 서열만을 함유한 합성 RNA 단편과 비교하였다.
본 발명의 실시태양은 모든 면에서 예시적인 것으로 제공될 뿐 제한적인 것은 아니며, 상기 설명 보다는 첨부된 특허 청구 범위에 의해 나타낸 본 발명의 영역 및 특허 청구 범위의 등가물의 의미 및 범위내에 드는 모든 변화는 본 발명에 속한다.
[서열 표]
(1) 일반 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 다니엘 엘. 카시안
다니안 엘. 맥알리스터
쉐롤 에이치. 맥도나우
나니 부스 다타굽타
(ⅱ) 발명의 명칭 : 핵산 서열 증폭 방법, 이에 이용되는 조성물 및 키트
(ⅲ) 서열 수 : 17
(ⅳ) 연락 주소 :
(A) 수신인 : 리온 앤드 리온
(B) 거리명 : 웨스트 6번 스트리트 611
(C) 도시명 : 로스앤젤레스
(D) 주 : 캘리포니아주
(E) 국명 : 미합중국
(F) 우편번호 : 90017
(ⅴ) 컴퓨터 판독형 :
(A) 전달형 : 3.5″디스켓, 저장 용량 1.44 Mb
(B) 컴퓨터 : IBM 호환성
(C) 작동 시스템 : IBM P. C. DOS (버젼 5.0)
(D) 소프트웨어 : 워드퍼펙트 (버젼 5.1)
(ⅵ) 현 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(ⅶ) 선 출원 데이타 :
하기 출원을 포함한 총 선 출원 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(ⅷ) 변리사/대리인 정보 :
(A) 설명 : 와르버그, 리챠드 제이.
(B) 등록 번호 : 32,327
(C) 참고/정리 번호 :
(ⅸ) 통신 정보 :
(A) 전화 번호 : (213) 489-1600
(B) 팩스 번호 : (213) 955-0440
(C) 텔렉스 : 67-3510
(1) 서열 확인 번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 53
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 1:
AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGCG TAGCGATGAC CTATTTTACT TGC 53
(2) 서열 확인 번호 2에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 30
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 2:
CGAACACAGA AGTCAAGCAC TCTAGAGCCG 30
(3) 서열 확인 번호 3에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 36
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 3:
GTGATCATAT CAGAGTGGAA ATACCTGTTC CCATCC 36
(4) 서열 확인 번호 4에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 34
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 4:
GTAGTGATCA TATCAGAGTG GAAATACCTG TTCC 34
(5) 서열 확인 번호 5에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 26
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 5:
GCAAGTAAAA TAGGTCATCG CTACGC 26
(6) 서열 확인 번호 6에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 48
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 6:
AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACTA CGCATTTCAC CGCTACAC 48
(7) 서열 확인 번호 7에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 22
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 7:
GGCTTAACCA TAGTAGGCTT TG 22
(8) 서열 확인 번호 8에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 39
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 8:
GAGCGCAGGC GGTTAGATAA GTCTGAAGTT AAAGGCTGT 39
(9) 서열 확인 번호 9에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 36
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 9:
GAAACTGTTT AACTTGAGTG CAAGAGGGGA GAGTGG 36
(10) 서열 확인 번호 10에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 47
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 10:
AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCA GGCCACTTCC GCTAACC 47
(11) 서열 확인 번호 11에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 11:
GGAGGATATG TCTCAGCGCT ACC 23
(12) 서열 확인 번호 12에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 38
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 12:
CGGCTGAGAG GCAGTACAGA AAGTGTCGTG GTTAGCGG 38
(13) 서열 확인 번호 13에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 36
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 13:
GGGTAACCGG GTAGGGGTTG TGTGTGCGGG GTTGTG 36
(14) 서열 확인 번호 14에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 55
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 14:
GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC ACAGCCGTCA CCCCACCAAC AAGCT 55
(15) 서열 확인 번호 15에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 24
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 15:
GTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAG 24
(16) 서열 확인 번호 16에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 23
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 16:
CCGGATAGGA CCACGGGATG CAT 23
(17) 서열 확인 번호 17에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 서열 길이 : 20
(B) 서열형 : 핵산
(C) 가닥수 : 단일 가닥
(D) 토폴로지 : 선형
(ⅱ) 서열 표시 : 서열 확인 번호 17:
CGGTGTGGGA TGACCCCGCG 20
Claims (57)
- 필수적으로 RNA로 이루어진 표적 핵산 서열, 필수적으로 RNA 폴리머라제에 의해 인지될 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터에 대해 3’에 위치하며 상기 표적 리보핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 복합화될 수 있는 프라이머로 이루어진 1개의 핵산 서열로 이루어진 1개 이상의 프로모터-프라이머, 및 DNA 폴리머라제 및 상기 RNA 폴리머라제로 이루어진 혼합물을 상기 표적 리보핵산 서열의 증폭에 효과적인 온도 및 용액에서 인큐베이션시키는 것으로 이루어지는 리보핵산 서열의 증폭 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 역전사 효소인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인큐베이션 과정이 반드시 항온에서 이루어지는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머 중 적어도 1개가, 그의 3’-말단으로부터 핵산 확장 반응이 일어나는 것을 방지하거나 또는 감소시키기 위해 3’-말단에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 변형된 프로모터-프라이머인 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 증폭을 일으키는데 효과적인 비율의 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머로 이루어지는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 각각 약 150:1 내지 1:1의 비율의 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머로 이루어지는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 1개 이상의 리보뉴클레오티드의 첨가, 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드의 첨가, 또는 3’-RS, 3’-알칸디올 성분에 의해 3’-코르디세핀의 첨가에 의해 변형되는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 1개 이상의 리보뉴클레오티드의 첨가, 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드의 첨가, 또는 3’-RS, 3’-알칸디올 성분에 의해 또는 3’코르디세핀의 첨가에 의해 변형되는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 1개 이상의 리보뉴클레오티드의 첨가, 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드의 첨가, 또는 3’-RS, 3’-알칸디올 성분에 의해 또는 3’-코르디세핀의 첨가에 의해 변형되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합물 및 상기 프로모터-프라이머를 상기 DNA 폴리머라제 및 상기 RNA 폴리머라제의 첨가 전에 함께 접촉시키는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 용액이 추가로 RNAse H 활성을 갖는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 용액이 상기 표적 핵산 서열을 포함한 확장 반응이 한정 부분에서 중지하도록 상기 표적 핵산 서열의 5’-말단을 한정시키는 제제를 더 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 제제가 상기 온도 및 상기 용액에서 상기 표적 핵산 서열의 5’-말단과 복합화할 수 있는, 상기 표적 핵산 서열의 상기 5’-말단에 충분히 상보적인 한정성 핵산 서열로 이루어지는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열이 상기 표적 서열 및 상기 프로모터-프라이머 사이에 형성된 상기 복합체 내에 있지 않은 그의 3’-말단에 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열의 3’-말단이 화학적 또는 효소적 분해 또는 처리에 의해 형성되는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 화학적 또는 효소적 분해 또는 처리가 엑소뉴클레아제를 이용한 처리인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 혼합물이 비변형된 프로모터-프라이머로 이루어지고 상기 역전사 효소로 AMV 또는 MMLV 역전사 효소인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 혼합물이 변형된 프로모터-프라이머로 이루어지고 상기 역전사 효소가 AMV 또는 MMLV 역전사 효소인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 혼합물이 비변형된 프로모터-프라이머 및 변형된 프로모터-프라이머로 이루어지고 상기 역전사 효소가 AMV 또는 MMLV 역전사 효소인 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 변형된 프로모터-프라이머가 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드, 3’-RS, 3’-알칸디올 성분 또는 3’-코르디세핀으로 이루어지는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합물이 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머로 이루어지고, 상기 인큐베이션 결과 상기 표적 핵산 서열에 상보적인 핵산 가닥 또는 동일한 센스의 핵산 가닥이 50,000배 이상 증가되는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성분이 1개 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라제가 DNA 의존성 RNA 폴리머라제인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성분을 상기 인큐베이션 후에 프로브와 혼성화시켜 스크리닝하는 방법.
- 필수적으로 표적 리보핵산 서열, 변형 또는 비변형된 프로모터-프라이머 단독으로 이용된 것에 비해 더 많은 증폭을 일으키는데 효과적인 비율의 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머 모두로 이루어지며, 필수적으로 RNA 폴리머라제에 의해 인지될 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터에 대해 3’에 위치하며 상기 표적 리보핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 혼성화될 수 있는 프라이머로 이루어진 단일 핵산 서열로 이루어진 1개의 프로모터-프라이머 공급원, 및 역전사 효소 및 상기 RNA 폴리머라제로 이루어진 혼합물을 상기 표적 핵산 서열의 증폭에 효과적인 온도 및 용액에서 상기 증폭 중에 하온을 유지하는 조건하에 인큐베이션시키는 것으로 이루어지는 표적 리보핵산 서열의 증폭 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 용액이 상기 표적 핵산 서열을 포함한 확장 반응이 한정 부분에서 중지하도록 상기 표적 핵산 서열의 5’-말단을 한정시키는 제제를 더 포함하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열이 상기 표적 서열 및 상기 프로모터-프라이머 사이에 형성된 상기 복합체 내에 있지 않은 그의 3’-말단에 뉴클레오티드를 포함하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 역전사 효소가 AMV 또는 MMLV 역전사 효소인 방법.
- 제26항 또는 제29항에 있어서, 상기 변형된 프로모터-프라이머가 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드, 3’-RS, 3’-알칸디올 성분 또는 3’-코르디세핀인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 조성물이 1개 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 방법.
- 필수적으로 RNA 폴리머라제에 의해 인지될 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터에 대해 3’에 위치하며 상기 표적 리보핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 복합화할 수 있는 프라이머로 이루어진 1개의 핵산 서열로 이루어진 다수의 프로모터-프라이머를 리보핵산과 접촉시키는 것으로 이루어지며, 상기 프로모터-프라이머 중 1개 이상이 비변형된 프로모터-프라이머이고 1개는 증폭에 효과적인 조건하에 그의 3’-말단으로부터 핵산 확장 반응이 일어나는 것을 방지하거나 또는 감소시키기 위해 3’-말단에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 변형된 프로모터-프라이머인, 리보핵산의 증폭 방법.
- 표적 리보핵산 서열, 필수적으로 RNA 폴리머라제에 의해 인지될 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터에 대해 3’에 위치하며 상기 표적 리보핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 복합화할 수 있는 프라이머로 이루어진 1개의 핵산 서열로 이루어지고, 그 중 1개 이상이 그의 3’-말단으로부터 핵산 확장 반응이 일어나는 것을 방지하거나 또는 감소시키기 위해 3’-말단에 변형된 뉴클레오티드를 갖는 변형된 프로모터-프라이머인 1개 이상의 프로모터-프라이머, 역전사 효소, 상기 프로모터에 대해 특이적인 RNA 폴리머라제, 및 조성물의 증폭을 반드시 항온에서 일어나게 할 수 있는 시약의 용액으로 이루어지는 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 증폭을 일으키는데 효과적인 비율의 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머로 이루어지는 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 각각 약 1:1 내지 150:1의 비율의 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머로 이루어지는 조성물.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 1개 이상의 리보뉴클레오티드의 첨가, 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드의 첨가, 또는 3’-RS, 3’-알칸디올 성분에 의해 또는 3’-코르디세핀의 첨가에 의해 변형되는 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 온도 및 상기 용액에서 상기 표적 핵산 서열의 5’-말단과 복합화할 수 있도록 하기 위해 상기 표적 핵산 서열의 5’-말단에 충분히 상보적인 핵산 서열을 한정하는 것으로 이루어지는 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열이 상기 표적 서열 및 상기 프로모터-프라이머 사이에 형성된 상기 복합체 내에 있지 않은 그의 3’-말단에 뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 역전사 효소가 AMV 또는 MMLV 역전사 효소인 조성물.
- 제39항에 있어서, 상기 변형된 프로모터-프라이머가 3’-알칸디올 성분으로 이루어지는 조성물.
- 제33항에 있어서, 1개 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라제가 T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
- (a) 필수적으로 RNA 폴리머라제에 의해 인지될 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터에 대해 3’에 위치하며 상기 표적 리보핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 복합화될 수 있는 프라이머로 이루어진 1개의 핵산 서열을 포함하고, 그 중 1개 이상이 증폭을 일으키기에 효과적인 비율의 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머 모두로 이루어진, 1개 이상의 프로모터-프라이머, (b) DNA 폴리머라제, 및 (c) 상기 프로모터에 특이적인 RNA 폴리머라제로 이루어진 키트.
- 제43항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 3’RP 변형된 것인 키트.
- 제43항에 있어서, 상기 1개 이상의 프로모터-프라이머가 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드, 3’-RS, 3’-알칸디올 성분 또는 3’-코르디세핀으로 이루어지는 키트.
- 제43항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제가 역전사 효소인 키트.
- 제46항에 있어서, 상기 역전사 효소가 AMV 역전사 효소 또는 MMLV 역전사 효소인 키트.
- 제43항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라제 박테리오파지 T7, T3 또는 SP6로부터 얻은 DNA 의존성 RNA 폴리머라제인 키트.
- 제43항에 있어서, 1개 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 키트.
- 제43항에 있어서, 분석에 적합한 프로브를 더 포함하는 키트.
- (a) 필수적으로 RNA 폴리머라제에 의해 인지될 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터에 대해 3’에 위치하며 상기 표적 리보핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 복합화될 수 있는 프라이머로 이루어진 1개의 핵산 서열을 포함하고, 그 중 1개 이상이 증폭을 일으키기에 효과적인 비율의 변형된 프로모터-프라이머 및 비변형된 프로모터-프라이머 모두로 이루어진, 1개 이상의 프로모터-프라이머, (b) 역전사 효소, (c) 상기 프로모터에 특이적인 RNA 폴리머라제, (d) 1개 이상의 프로모터-프라이머, 상기 역전사 효소, 및 상기 RNA 폴리머라제로 이루어진 혼합물의 pH, 이온 강도 또는 온도의 효과적인 변화없이 증폭을 실시하는데 필요한 시약으로 이루어진 용액, (e) 1개 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드, 및 (f) 분석에 적합한 프로브로 이루어진 키트.
- 제51항에 있어서, 상기 변형 및 비변형된 프로모터-프라이머가 각각 약 1:1 내지 150:1의 비율로 존재하는 키트.
- 제51항에 있어서, 상기 역전사 효소가 AMV 또는 MMLV 역전사 효소이고, 상기 변형된 프로모터-프라이머가 3’RP 변형된 것인 키트.
- 제51항에 있어서, 상기 역전사 효소가 AMV 또는 MMLV 역전사 효소이고, 상기 변형된 프로모터-프라이머가 3’-말단 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오티드, 3’-RS, 3’-알칸디올 성분 또는 3’-코르디세핀으로 이루어지는 키트.
- 각각 필수적으로 RNA 폴리머라제에 의해 인지될 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터에 대해 3’에 위치하며 상기 표적 리보핵산 서열의 3’-말단에서 또는 그 근처에서 복합화할 수 있는 프라이머로 이루어진 1개의 핵산 서열로 이루어지며, 그 중 1개 이상이 제1변형 또는 비변형된 프로모터-프라이머이고, 1개는 제2변형된 프로모터-프라이머이고, 상기 제1 및 제2변형된 프로모터-프라이머는 증폭에 효과적인 조건하에 그의 3’-말단으로부터 핵산 확장 반응이 일어나는 것을 방지하거나 또는 감소시키기 위해 3’-말단에 변형된 뉴클레오티드를 가지며, 상기 변형된 리보뉴클레오티드가 상기 제1 및 제2프로모터-프라이머에서 서로 다른 것을 특징으로 하는 다수의 프로모터-프라이머로 이루어지는 키트.
- 필수적으로 서열 확인 번호 1 내지 17로부터 선택된 서열로 이루어지는 핵산.
- 제1항에 있어서, 상기 인큐베이션이 1개 이상의 DMSO 및 글리세롤의 존재하에 수행되는 방법.
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