PL195995B1

PL195995B1 - Wankoresmycyna, sposób jej wytwarzania, organizm Amycolatopsis z gatunku HIL-006734, zastosowanie wankoresmycyny oraz środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL195995B1
Application number: PL99347658A
Authority: PL
Inventors: Nirogi Venkata Satya Ramakrishna; Ravi Gayanan Bhat; Eyyammadichiyil Sankaranarayanan Sreekumar; Erra Koteswara Satya Vijayakumar; Shantilal Dayaram Naker; Uttara Vinayak Oak; Rajendra Prakash Tanpure; Cordula Hopmann; Michael Kurz; Joachim Wink; Gerhard Seibert; Beller Dominique Le; Jozsef Aszodi
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-04
Publication date: 2007-11-30
Also published as: BR9915161A; EP1129208B1; DE69903465T2; UA70974C2; HK1041026B; JP2002529477A; RU2228337C2; ES2181506T3; TR200101279T2; ZA200103191B; HU224610B1; SI1129208T1; US6387943B1; AU761782B2; KR100623405B1; CN1325656C; HK1041026A1; IL142848A0; CA2351222A1; ATE225854T1

Abstract

1. Wankoresmycyna, zwiazek o wzorze i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole, we wszystkich ich postaciach stereoizomerycznych i tautomerycznych. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wankoresmycyna, sposób jej wytwarzania, organizm Amycolatopsis z gatunku HIL-006734, zastosowanie wankoresmycyny oraz środek farmaceutyczny. Związek o nazwie wankoresmycyna można otrzymać na drodze hodowli drobnoustroju HIL-006734 (DSM 12216).

Wiadomo, że w wielu przypadkach wystąpienia stanów zakaźnych, takich jak zranienia i oparzenia przeważnie mają miejsce zakażenia Staphylococcus aureus (MRSA) oporne na metycylinę. Jedynymi dwoma antybiotykami stosowanymi w klinicznym leczeniu zakażeń MRSA są, należące do klasy glikopeptydów, wankomycyna i teikoplanina. Jednakże ze względu na pojawienie się ostatnio szczepów opornych na wankomycynę i teikoplaninę, zakażenia tymi szczepami uważa się za zagrażające i śmiertelne. Zatem rozpoczęto intensywne badania nad strukturalnie różnymi klasami związków o działaniu przeciwko szczepom opornym na wankomycynę i teikoplaninę. Przykładowo, cykliczny tiopeptyd, metylosulfomycynę I, opisano w publikacji europejskiego opisu patentowego nr 0818539 z 11 lipca 1996 r., jako związek o działaniu antybiotyku przeciwko szczepom opornym na wankomycynę i teikoplaninę.

Nieoczekiwanie stwierdzono, iż nowy związek o nazwie wankoresmycyna ma działanie antybiotyku.

Zatem wynalazek dotyczy wankoresmycyny, związku o poniższym wzorze:

i jej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, w tym wszystkich postaci stereoizomerycznych i wszystkich postaci tautomerycznych.

Wankoresmycynę o wzorze sumarycznym C71H126N2O21 (masa cząsteczkowa 1343,80) można scharakteryzować za pomocą któregokolwiek lub większej liczby jej właściwości fizykochemicznych i widm podanych poniżej, takich jak dane spektroskopowe ¹H NMR i dane spektroskopowe ¹³C NMR, oba rodzaje danych spektroskopowych podano w tabeli 2.

Wankoresmycynę można określić jako nowy antybiotyk o działaniu przeciwko szczepom opornym na wankomycynę i teikoplaninę. Wankoresmycyna jest związkiem o nie opisanej do tej pory budowie z ugrupowaniem kwasu tetramowego, zawierającego w pozycji 3 podstawnik acylowy z silnie utlenionym długim łańcuchem alkilowym podstawionym ugrupowaniem aminocukru. Po przeprowadzeniu badania literatury chemicznej w postaci skrótów ustalono, iż wankoresmycyna jest nowym związkiem. Żaden inny związek nie miał cech budowy wankoresmycyny.

Wankoresmycynę otrzymuje się na drodze hodowli drobnoustroju określonego jako hodowla nr HIL-006734 (określanego dalej HIL-006734). Ten drobnoustrój zastosowany do wytworzenia wankoresmycyny wyodrębniono z próbki gleby zebranej w Parku Narodowym Borivli, Mumbai, Indie. Drobnoustrój HIL-006734 należy do rzędu Actinomycetales, rodzaju Amycolatopsis i został zdeponowany czerwca 1998 r. w Niemieckim Zbiorze Drobnoustrojów i Hodowli Komórkowych (DSMZ - Deutsche

PL 195 995 B1

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Braunschweig, Niemcy i otrzymał numer dostępu DSM 12216.

Zatem wynalazek dostarcza sposób wytwarzania nowego związku o nazwie wankoresmycyna, który charakteryzuje się tym, że prowadzi się hodowlę drobnoustroju Amycolatopsis z gatunku HIL006734 (DSM 12216) w warunkach tlenowych w pożywce zawierającej źródła węgla i azotu, a następnie wyodrębnia się i oczyszcza znanym sposobem.

Korzystnie zgodnie ze sposobem według wynalazku ponadto prowadzi się reakcję wankoresmycyny z odpowiednim środkiem, z wytworzeniem farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Ponadto wynalazek dostarcza organizm Amycolatopsis z gatunku HIL-006734 (DSM 12216).

Ponadto wynalazek dostarcza określoną powyżej wankoresmycynę lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól, do stosowania jako lek.

Ponadto wynalazek dostarcza określoną powyżej wankoresmycynę lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól, do stosowania jako antybiotyk.

Ponadto wynalazek dostarcza środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera skuteczną ilość określonej powyżej wankoresmycyny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

Mutanty i odmiany drobnoustroju ST101170 mogą również posiadać zdolność syntezy związku według wynalazku. Takie mutanty można wytwarzać znanymi sposobami z zastosowaniem czynników fizycznych, przykładowo przez napromienianie, np. promieniami nadfioletowymi lub promieniami rentgena, lub z zastosowaniem chemicznych czynników mutagennych, takich jak metanosulfonian etylu (EMS), 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (MOB) lub N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG).

Wynik badania przesiewowego prowadzonego w celu wyodrębnienia odpowiednich mutantów i odmian zdolnych do wytworzenia związku według wynalazku można weryfikować poprzez oznaczenie aktywności biologicznej związków nagromadzonych w pożywce hodowlanej, przykładowo poprzez badanie działania przeciwbakteryjnego.

Oprócz źródeł węgla i azotu pożywka może zawierać również odżywcze sole nieorganiczne i/lub organiczne pierwiastki śladowe. Korzystnie pożywka zawiera źródła węgla, azotu i odżywcze sole nieorganiczne. Źródłami węgla są, przykładowo, skrobia, glukoza, sacharoza, dekstryna, fruktoza, melasy, gliceryna, laktoza lub galaktoza, korzystnie skrobia. Źródłami azotu są, przykładowo, mączka sojowa, mączka z orzeszków ziemnych, wyciąg z drożdży, bulion wołowy, pepton, wyciąg ze słodu, wyciąg namokowy kukurydzy, żelatyna lub kwasy casamion, korzystnie pepton i wyciąg z drożdży. Odżywczymi solami nieorganicznymi są, np. wodorofosforan sodu, wodorofosforan potasu, chlorek sodu, chlorek wapnia, węglan wapnia, azotan potasu, siarczan amonu lub siarczan magnezu, korzystnie węglan wapnia, chlorek sodu i siarczan magnezu.

Hodowlę HIL-006734 można prowadzać w temperaturze 25-35°C przy pH 6,0 -8,0. Korzystnie HIL-006734 hoduje się w 30°C (± 1°C) przy pH 7,0.

Hodowlę HIL-006734 korzystnie prowadzi się przez 60-96 godzin, w którym to czasie otrzymuje się optymalną wydajność antybiotyku według wynalazku. Korzystnie hodowlę prowadzi się poprzez fermentację przez 68-96 godzin w warunkach zanurzenia przykładowo w kolbach z wytrząsaniem jak również w fermentatorach laboratoryjnych. Postęp fermentacji i tworzenia wankoresmycyny można określić za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) i poprzez pomiar aktywności biologicznej hodowli bulionowej przeciwko gatunkom Staphylococcus i Enterococcus znanym sposobem oznaczania rozprzestrzeniania się drobnoustrojów na płytce z agarem. Korzystną hodowlą jest hodowla szczepu Staphylococcus aureus 3066, który to szczep jest oporny na metycylinę, b-laktamowy antybiotyk opisywany w literaturze i szczepu Enterococcus faecium (E. faecium VR-1), który jest oporny na wankomycynę. W otrzymanej hodowli bulionowej wankoresmycynę obecną w przesączu hodowlanym jak również w masie bakteryjnej można wyodrębnić stosując znane techniki rozdziału. Zatem, można ją odzyskać z przesączu hodowlanego poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikiem nie mieszającym się z wodą, takim jak octan etylu, dichlorometan, chloroform lub butanol, przy pH 5-8 lub poprzez chromatografię oddziaływań hydrofobowych z zastosowaniem żywic polimerowych, takich jak „Diaion HP-20^® (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japonia), „Amberlite XAD^® (Rohm and Hass Industries Stany Zjednoczone Ameryki), węgla aktywnego lub poprzez chromatografię jonowymienną przy pH 5-8. Korzystnym sposobem jest ekstrakcja octanem etylu. Substancję czynną można również odzyskiwać z masy bakteryjnej poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikiem mieszającym się z wodą, takim jak metanol, aceton, acetonitryl, n-propanol lub izopropanol lub rozpuszczalnikiem nie mieszającym się z wodą, takim jak octan etylu, dichlorometan, chloroform lub butanol przy pH 5-8, a korzystnym

PL 195 995 B1 sposobem jest ekstrakcja octanem etylu. W wyniku zagęszczania i liofilizacji ekstraktów otrzymuje się nie oczyszczoną substancję czynną.

Antybiotyk, wankoresmycynę, według wynalazku, można odzyskiwać z substancji nie oczyszczonej przykładowo w poniższy następujący sposób.

Za pomocą frakcjonowania z zastosowaniem którejkolwiek z następujących technik: zwykłej chromatografii fazowej (z zastosowaniem żelu glinowego lub krzemionkowego, jako fazy nieruchomej i eluentów, takich jak eter naftowy, octan etylu, chlorek metylenu, aceton, chloroform, metanol lub ich mieszaniny oraz dodatków w postaci amin, takich jak NEt3), chromatografii z odwróconymi fazami (z zastosowaniem żelu krzemionkowego do chromatografii z układem faz odwróconych, takiego jak dimetylooktadecylosililowany żel krzemionkowy, zwany również jako RP-18, lub dimetylooktylosililowany żel krzemionkowy, zwany również jako RP-8 jako fazy nieruchomej i eluentów, takich jak woda, buforów, takich jak bufor fosforanowy, octanowy, cytrynianowy (pH 2-8) i rozpuszczalników organicznych, takich jak metanol, acetonitryl, aceton, tetrahydrofuran lub mieszaniny tych rozpuszczalników), chromatografii żelowej z zastosowaniem żywic, takich jak ®Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Szwecja), TSKgel ®Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japonia) w rozpuszczalnikach, takich jak metanol, chloroform, aceton, octan etylu lub ich mieszaniny, lub ®Sephadex G-10 i G-25 w wodzie lub za pomocą chromatografii przeciwprądowej z zastosowaniem dwufazowego układu eluentów sporządzonego z dwóch lub większej liczby rozpuszczalników, takich jak woda, metanol, etanol, izopropanol, n-propanol, tetrahydrofuran, aceton, acetonitryl, chlorek metylenu, chloroform, octan etylu, eter naftowy, benzen i toluen. Można stosować każdą z technik wielokrotnie lub łączyć różne techniki. Korzystną techniką jest chromatografia z zastosowaniem żelu krzemionkowego do chromatografii z odwróconymi fazami (RP-18).

Wankoresmycynę można przeprowadzać w farmaceutycznie dopuszczalne sole i pochodne, takie jak estry i etery oraz inne oczywiste chemiczne odpowiedniki, które w całości są objęte zakresem wynalazku. Sole i pochodne można wytwarzać zwykłymi sposobami znanymi fachowcom. Sole takie jak sól sodowa i sól potasowa, można przykładowo wytwarzać poprzez podziałanie na wankoresmycynę odpowiednią zasadą sodową lub potasową.

Estry i etery można wytwarzać sposobami podanymi w literaturze, przykładowo, w Advanced Organie Synthesis, wyd. 4, J. March, John Wiley & Sons. 1992.

Grupę aminową ugrupowania cukru można alkilować lub acetylować np. chlorkami kwasowymi, zwykłymi sposobami znanymi fachowcom.

Chemicznymi odpowiednikami mogą być trwałe kompleksy z jonami metali np. metali przejściowych; takimi jak La³⁺, Sm³⁺, Eu³⁺, Gd³⁺, typowymi dla pochodnych kwasu tetramowego, które można wytwarzać sposobami podanymi w literaturze (K. Tanaka i inni, Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1901. K. Matsuo, Chem. Pharm. Bull. 1980, 28, 2494).

Podwójne wiązania alkilowego łańcucha bocznego można redukować sposobami podanymi w literaturze, przykładowo w P.N. Rylander, „Hydrogenation Methods, Academic Press, New York (1985), rozdz. 2 lub można do nich przyłączać chlorowcowodór sposobami opisanymi przez H. O. House w „Modern Synthetic Reactions, W. A. Benjymin, Inc., New York (1972), str. 446-452. Pochodne hydroksylowane można wytwarzać na drodze reakcji podwójnych wiązań z reagentami, takimi jak OsO4 jak opisano w literaturze np. w Chem. Rev. 1980, 80, 187.

Pochodne można również wytwarzać poprzez przeprowadzenie podwójnych wiązań w epoksydy, na drodze utleniania np. MCPBA jak opisano w Advanced Organic Synthesis, wyd. 4, J. March, John Wiley & Sons., 1992.

Jak wspomniano powyżej, wankoresmycyna ma działanie przeciwbakteryjne. Poniżej w tabeli 3 podano minimalne stężenia hamujące wankoresmycyny działające na bakterie w szerokim zakresie gatunkowym. Wankoresmycynę i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole i pochodne można podawać zwierzętom, korzystnie ssakom, a zwłaszcza ludziom, pojedynczo jako leki, w mieszaninach jedna z drugą i w postaci środków farmaceutycznych umożliwiających podanie pozajelitowe.

Wankoresmycynę można podawać doustnie, domięśniowo, dożylnie lub innymi drogami podawania. Środki farmaceutyczne zawierające wankoresmycynę lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól lub pochodną, z innymi farmaceutycznie czynnymi substancjami można wytwarzać poprzez mieszanie substancji czynnych z jednym lub większą liczbą farmakologicznie tolerowanych środków pomocniczych i/lub zaróbek, takich jak, przykładowo wypełniacze, środki emulgujące, środki poślizgowe, środki maskujące smak i zapach, środki barwiące lub substancje buforujące, i nadanie mieszaninie odpoPL 195 995 B1 wiedniej postaci farmaceutycznej, takiej jak, np. tabletki, tabletki powlekane, kapsułki, granulki, proszki, emulsje, zawiesiny lub roztwory odpowiednie do podawania pozajelitowego.

Przykładowymi środkami pomocniczymi i/lub zaróbkami, które można wymienić, są tragakant, laktoza, talk, agar, poliglikole, etanol i woda. Odpowiednimi i korzystnymi do podawania pozajelitowego są zawiesiny lub roztwory w wodzie. Można również podawać substancje czynne jako takie, tj. bez nośników lub rozcieńczalników, w odpowiedniej postaci, np. w postaci kapsułek.

Preparat galenowy i sposób podawania, jak również zakres dawki odpowiednie w określonym przypadku zwykle zależą od gatunku osobnika poddanego leczeniu i od stadium określonego stanu lub choroby, przy czym można je optymalizować znanymi sposobami. Przeciętnie dawka dzienna substancji czynnej dla pacjenta ważącego około 75 kg wynosi co najmniej 0,001 mg do co najwyżej 10mg, korzystnie najwyżej 1,0 mg.

Wynalazek został zilustrowany poniższymi przykładami.

Przykład 1

Wyodrębnianie hodowli nr HIL-006734 z gleby a) Skład pożywki izolacyjnej

Skrobia kukurydziana : 10,0 g

Kazeina : 1,0 g

Pepton : 1,0 g

Bulion wołowy : 1,0 g

K2HPO4 : 0,5 g

Agar w proszku : 13,0 g

Woda demineralizowana : 1,0 litr pH : 7,5

b) Posiew z gleby na pożywce i wyodrębnianie

Dodano 10 g gleby zebranej z Parku Narodowego, Borivli, Mumbai, Indie do 90 ml sterylizowanej wody w 250 ml kolbie Erlenmeyera, którą wytrząsano przez 2 godziny w wytrząsarce obrotowej (220 obrotów na minutę). Powyższą zawiesinę gleby kolejno rozcieńczano dziesięciokrotnie do stężenia 10^-5. Z ostatniego rozcieńczenia pobrano 1 ml zawiesiny i umieszczono pośrodku sterylnej szklanej płytki Petriego (średnicy 15 cm), na którą nalano około 50 ml powyższej pożywki izolacyjnej wzbogaconej 25 μg/ml amfoterycyny B jako środkiem przeciw grzybom i ochłodzono do 45°C, a szalkę dokładnie zamieszano. Mieszaninę zawiesiny gleby i pożywki pozostawiono do odstania i inkubowano w28°C (±1°C) przez 7 dni. Wzrost na płytce okresowo monitorowano, a z wzrastających drobnoustrojów wyodrębniano HIL-006734 (hodowla nr Y-9439786).

Przykład 2

Utrzymywanie hodowli nr HIL-006734

Skład pożywki utrzymującej

HIL-006734 utrzymywano w następującej pożywce:

Wyciąg ze słodu : 10,0 g

Glukoza : 4,0g

Wyciąg z drożdży : 4,0 g

Aktidiol : 0,05 g

Agar w proszku : 13,0 g

Woda demineralizowana : 1 litr pH : 7,0-7,5

Po dokładnym rozpuszczeniu składników w wyniku ogrzewania, otrzymany roztwór rozdzielono do probówek i poddano sterylizacji w 121°C przez 20 minut. Probówki ochłodzono i pozostawiono do utwardzenia w pozycji do posiewu skośnego. Skosy agarowe posiano hodowlą HIL-006734 za pomocą ezy i inkubowano w 28°C (±1°C) do zaobserwowania dobrego wzrostu. Hodowle charakteryzujące się dobrym wzrostem przechowywano w chłodziarce w +8°C.

Wytwarzanie roboczej hodowli zaszczepiającej z gliceryną

Skład pożywki

Wyciąg z drożdży 4,0 g

Rozpuszczalna skrobia 15,0 g

K2HPO4 1,0 g

PL 195 995 B1

MgSO4 x7H2O 0,5 g

Woda demineralizowana 1 litr pH 7,0

Powyższą pożywkę rozdzielono w ilościach po 100 ml w 300 ml kolbach Erienmeyera i autoklawowano w 121°C przez 20 minut. Kolby ochłodzono do temperatury pokojowej i posiano hodowlą ze skosu agarowego. Inkubację prowadzono przez pięć dni w wytrząsarce obrotowej przy 180 obrotach na minutę i 28°C. Zmieszano 1,5 ml otrzymanej hodowli z 1,5 ml gliceryny (99%) i przechowywano w -20°C.

P r zyk ł a d 3

Fermentacja hodowli nr HIL-006734 w kolbach z wytrząsaniem

Skład pożywki do posiewu

Glukoza : 15,0 g

Mączka sojowa : 15,0 g

Wyciąg namokowy kukurydzy : 5,0 g

CaCO3 : 2,0 g

NaCl : 5,0 g

Woda demineralizowana : 1 litr pH : 6,8-7,0

Można stosować pożywkę z wyciągiem namokowym kukurydzy lub bez niego.

Powyższą pożywkę rozdzielono w ilościach po 100ml w 500 ml kolbach Erlenmeyera i autoklawowano przez 20 minut. Kolby ochłodzono do temperatury pokojowej, a każdą z kolb zaszczepiono wspomnianą powyżej hodowlą charakteryzującą się dobrym wzrostem z przykładu 2, w ilości odpowiadającej objętości ezy, i wytrząsano w wytrząsarce obrotowej przez 72 godzin przy 240 obrotach na minutę w 27°C (±1°C) otrzymując hodowlę zaszczepiającą.

Skład pożywki produkcyjnej

20,0 g 10,0 g 0,2 g 0,001 g 1 litr

6,8

Glukoza Mączka sojowa

CaCO₃

CoC^6H2O

Woda demineralizowana pH lub

Skrobia

Glukoza

Gliceryna 99%

Wyciąg namokowy kukurydzy Pepton

Wyciąg z drożdży

NaCl

CaCO₃

Woda demineralizowana pH

10,0 g

10,0 g 2,5 g 5,0 g 2,0 g 1,0 g

3,0 g 1 litr

7,2 (przed sterylizacją)

Pożywkę produkcyjną rozdzielono w ilościach po 100 ml w 500 ml kolbach Erlenmeyera i autoklawowano w 121°C przez 20 minut. Kolby ochłodzono do temperatury pokojowej i zaszczepiono wspomnianą powyżej hodowlą zaszczepiającą (2% udz. obj.). Fermentację prowadzano w wytrząsarce obrotowej przy 240 obrotach na minutę i 27°C (±1°C) przez 46 godzin. Wytwarzanie antybiotyku określono na drodze badania aktywności biologicznej przeciwko S. aureus 3066 i Ent. faecium VR-1 za pomocą znanej metody dyfuzji, znanym sposobem.

P r zyk ł a d 4

Prowadzenie hodowli nr HIL-006734 w fermentatorach

Wytwarzanie hodowli zaszczepiającej w kolbach z wytrząsaniem

Pożywkę zaszczepiającą z przykładu 3 rozdzielono w ilościach po 150 ml w 1000 ml kolbach

Erlenmeyera i autoklawowano w 121°C przez 20 minut. Hodowlę zaszczepiającą pozostawiono do wzrostu w tych kolbach jak opisano w przykładzie 3.

Fermentacja w dużej skali

PL 195 995 B1

Skład pożywki produkcyjnej:

Glukoza

Mączka sojowa

CaCO₃

CoC^6H2O

Woda demineralizowana pH lub

Skrobia

Glukoza

Gliceryna 99%

Wyciąg namokowy kukurydzy Pepton

Wyciąg z drożdży

NaCl

CaCO₃

Woda demineralizowana pH

20,0 g 10,0 g

0,2 g

0,001 g litr

7,0

10,0 g

10,0 g 2,5 g 5,0 g 2,0 g 1,0 g

3,0 g 1 litr

7,2 (przed sterylizacją)

Przeprowadzono sterylizację in situ 20 litrów pożywki produkcyjnej w fermentatorze o pojemności 22 litrów (w dwóch fermentatorach) i 9 litrów pożywki produkcyjnej w fermentatorze o pojemności 12 litrów (w dwóch fermentatorach) z 1 ml (/10 litrowy fermentator) (®Desmophenu jako środka przeciw pienieniu przez 40 minut w 121°C, ochłodzono do 27°C (±1°C) i zaszczepiono 1,5 litra (/22 litrowy fermentator) lub 0,75 litrowa (/12 litrowy fermentator) powyższej hodowli zaszczepiającej.

Fermentację prowadzono przy następujących parametrach:

Temperatura : 27°C (± 1°C)

Mieszanie : 200 obrotów na minutę

Natlenienie : 15 litrów/minutę /22 litrowy fermentator litrów/minutę/12 litrowy fermentator

Czas zbioru : 64 godziny

Wytwarzanie antybiotyku określono poprzez badanie aktywności przeciwko S. aureus 3066 i Ent. faecium VR-1 oraz za pomocą analizy HPLC. Końcowa wartość pH hodowli bulionowej wynosiła 7,0-7,5. Bulion hodowlany zebrano i odwirowano, a antybiotyk wyodrębniono i oczyszczono z przesączu hodowlanego i masy bakteryjnej sposobem opisanym w przykładach 5 lub 6.

P r zyk ł a d 5

Wyodrębnianie i oczyszczanie wankoresmycyny

Bulion hodowlany (60 litrów) zebrano i odwirowano w celu rozdzielenia masy bakteryjnej (2,5 kg) i przesączu hodowlanego (50 litrów, pH 7,3). Masę bakteryjną wyekstrahowano metanolem (2 x 20 litrów), a czynne ekstrakty połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 70 g nie oczyszczonego materiału. Przesącz hodowlany (50 litrów, pH 7,3) doprowadzono do pH 5,5 za pomocą 2N kwasu solnego i przepuszczono przez kolumnę z ®Diaion HP-20 (2,5 litra). Kolumnę przemyto wodą (10 litrów), a następnie 15 litrami roztworu metanol:woda (1:1). Stwierdzono obecność substancji czynnej w 15 litrach roztworu metanol:woda (3:1) i 30 litrach eluatów metanolowych. Sprawdzenie stopnia oczyszczenia przeprowadzono za pomocą testu biologicznego przeciwko S. aureus 3066 i Ent. faecium VR-1. Czynne eluaty połączono i zatężono z wytworzeniem 15 g substancji nie oczyszczonej. Połączoną substancję nie oczyszczoną poddano chromatografii na kolumnie ®Sephadex LH-20 (2,5 cm x 90 cm) w metanolu, z powtórzeniem, a czynne frakcje połączono i zatężono. Otrzymaną substancję następnie poddano chromatografii na kolumnie ®Toyopearl TSK HW 40F (6 cm x 35 cm) z metanolem. Czynne frakcje połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem 3 g częściowo oczyszczonej substancji. Końcowe oczyszczanie przeprowadzono za pomocą preparatywnej HPLC w następujących warunkach:

Częściowo oczyszczoną substancję oczyszczono na koniec drogą preparatywnej HPLC na kolumnie 25 mm x 250 mm Hibar-Lichrospher RP-18 (10 μ z zastosowaniem mieszaniny metanol:bufor fosforanowy (0,01 M, pH 6,5) 67,5:32,5 jako eluentu i przy prędkości przepływu wynoszącej 23 ml/minutę, z wykrywaniem przy 220 nm.

PL 195 995 B1

Czynne eluaty połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia rozpuszczalnika, a następnie odsolono na kolumnie ®Diaion HP-20 (50 ml), przemyto roztworem acetonitryl:woda (80:20) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizowano, z wytworzeniem 70 mg czystego związku.

Przykład 6

Wyodrębnianie i oczyszczanie wankoresmycyny

Bulion hodowlany (200 litrów) zebrano i odwirowano w celu oddzielenia masy bakteryjnej i przesączu hodowlanego. Masę bakteryjną wyczerpująco wyekstrahowano metanolem (30 - 40 litrów), a ekstrakt zatężono 1:10, otrzymując bezbarwny osad, który odsączono z otrzymaniem 30 -50 g nie oczyszczonego materiału. Materiał ten następnie oczyszczono za pomocą HPLC:

1.) Kolumna: ™Fractogel TSK-HW 40 (4 litry, 500 x 100 mm)

Eluent: MeOH

Przepływ: 20 ml/minutę

Wykrywanie: 204 i 236 nm

Czynne frakcje eluowano po 125 minutach. Połączone frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizowano.

2.) Kolumna: Silica Gel 60 (Merck); Erimatech™ (300 x 20 mm, 100 ml)

Eluent: A) CH2Cl2 : MeOH 9:1 B) CH2Cl2 : MeOH 3:1 + 1% NEt3 C) MeOH

Gradient:

min.	%A	%B	%C
0	100	0	0
23	100	0	0
24	0	100	0
51	0	100	0
52	0	0	100
93	0	0	100

Szybkość przepływu: 25 ml/min

Wykrywanie: 236 i 288 nm

Frakcje zawierające wankoresmycynę eluowano po 32 minutach. Połączone frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i liofilizowano. Wydajność oczyszczania w dwóch kolumnach wynosiła 50%.

Właściwości fizykochemiczne i widma wankoresmycyny podano w tabelach 1i 2, a minimalne stężenia hamujące (MIC) względem różnych bakterii zamieszczono w tabeli 3.

Figury 1 i 2 odnoszą się do tabeli 1. Na fig. 1 przedstawiono wykrywanie wankoresmycyny metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej, a na fig. 2 przedstawiono widmo absoprcyjne w nadfiolecie wankoresmycyny w metanolu.

Tabela 1

Wygląd	: Biała substancja stała
Rozpuszczalność	: Metanol, DMSO
Temperatura topnienia	: 141-143°C
[a]D	: -13° (c 0,2, metanol)
TLC (Chromatografia cienkowarstwowa)	: Rf: 0,6
[płytka z żelu krzemionkowego (art. nr 5554, E. Merck); n-BuOH:MeOH:woda (4:1:2)]
HPLC (wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa)	: Czas retencji: 14,70 minuty
[Kolumna: LiChrocart™ (250 mm x 4 mm) RP Select B (5u; eluent: gradient 0,1% roztwór wodny kwasu ortofosforowego (pH 2,5) do CH3CN w ciągu 20 minut; szybkość przepływu: 1 ml/minutę; wykrywanie: 220 nm] Fig. 1 załączonego rysunku

PL 195 995 B1 lub Kolumna: Purospher Star RP.18e (Merck), x 4 mm, 3 μm

Eluent: CH3CN/0,01% H3PO4 (85%)

Gradient:

czas	%CHaCN
0,00	5,0
3,00	95,0
5,00	95,0
6,00	5,0
10,00	5,0

Przepływ: 2 ml/minutę

Temperatura: 40°C Wykrywanie: 210 nm, 254, 280, 320, 380

Czas retencji: 2,19 minuty

ESI-MS (Spektroskopia masowa z jonizacją metodą elektrorozpylania)	: 1342 (M-H)^-
HR-FAB-MS (Spektroskopia masowa wysokiej rozdzielczości z bombardowaniem szybkimi atomami)	: 1343,89142 (M+H)+ [Obliczono dla C71H127N2O21: 1343, 889915 (M+H)+]
Wzór sumaryczny:	C71H126N2O21
UV/VLS:	MeOH, lmax (log ε) = 234 nm (4,39), 280 (4,29) (Figura 2)
IR:	KBr, n=3384 cm'¹ (br), 2934 (m), 1674 (m), 1616 (s), 1456 (s), 1381 (m), 1064 (Fig. 3)
¹H NMR:	patrz tabela 2
¹³C NMR:	patrz tabela 2

T ab el a 2

Dane spektroskopowe przy ¹H i ¹³C NMR wankoresmycyny w MeOD przy 300 K

	¹H	¹³C
1	2	3
1	0,85	14,76
2	0,97	20,83
3	1,86	31,20
4	3,40	82,19
5	1,69	39,54
6	0,77	13,64
7	3,53	80,19
8	1,65	36,40
9	0,86	12,75
10	1,43	31, 20
11	1,43	36,52
12	3,74	72,03
13	1,60/1,54	44,90

PL 195 995 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
14	3,75	72,03
15	1,57/1,38	36,61
16	1,49/1,16	30,18
17	1,94	38,60
18	0,92	15,04
19	3,86	81,67
20	4,59	103,48
21	3,83	72,03
22	2,48	57,61
23	-	-
24	3,08	75,08
25	3,21	74,66
26	1,27	18,29
27	1,52/1,42	39,35
28	3,96	65,82
29	1,49	42,39
30	3,79	72,47
31	4,31	73,26
32	6,61	142,09
33	_-	138,52
34	1,82	12,75
35	-	206,04
36	4,20	41,01
37	1,14	17,77
38	5,36	128,35
39	_-	138,72
40	1,67	12,75
41	3,98	80,53
42	1,63	41,30
43	0,88	8,10
44	3,58	73,85
45	1,48	36,52
46	1,62/1,32	23,51
47	1,55/1,32	33,36
48	3,79	75,08
49	1,73	42,71
50	0,77	11,91
51	3,40	77,82
52	1,61	36,28
53	0,85	12,70
54	1,54/1,33	31,34
55	1,61/1,44	36,28
56	3,77	71,83
57	1,67/1,62	44,53

PL 195 995 B1 cd. tabeli 2

1	2	3
58	3,90	71,28
59	2,29	37,53
60	5,75	129,78
61	-	141,66
62	1,82	13,98
63	_-	195,36
64	_-	174,52
65	3,22	27,78
66	_-	136,51
67	-	183,80
68	_-	100,31
69	5,35	116,05
70	3,07	26,50
71	1,09	24,46
72	1,09	24,46

T ab el a 3

Organizm badany	MIC (pg/ml)
1	2
Staphylococcus aureus 209P	0,05
S. aureus 20240	0,05
S. aureus E-710	0,10
S. aureus SG511	0,05

PL 195 995 B1 cd. tabeli 3

1	2
S. aureus 3066	0,10
S. warneri 6563 II (2)	0,10
S. aureus E-712	0,10
S. aureus 20424	0,10
S. aureus Chantot 31153	0,05
S. aureus Wein 11	0,05
S. aureus Wein 12	0,05
S. aureus 503 (Mers)	0,025
S. aureus Brussel 4115	0,05
S. aureus MLS-16	0,39
S. haemolyticus 809	0,05
S. epidermidis 825	0,10
S. epidermidis 823	0,20
S. epidermidis 607	0,10
S. epidermidis 5747 IW	0,10
Enterococcus faecalis ATCC 29212	0,39
Ent. faecalis D 21777	0,39
Ent. faecalis D 23241	0,39
Ent. faecalis D 756	0,39
Ent. faecalis D 26777	0,39
Ent. faecalis D 7F	0,39
Ent. faecium D-65	0,39
Ent. faecium 5601 (H)	0,39
Ent. faecium P-1	0,39
Ent. faecium P-2	0,39
Ent. faecium VR-1	0,39
Ent. hirae 55	0,39
Ent. durans 4939H	0,39
Escherichia coli 9632	>100
E. coli super sen. 2231	>100
Pseudomonas aerugrinosa M35	>100

PL 195 995 B1

Claims

i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole, we wszystkich ich postaciach stereoizomerycznych i tautomerycznych.
2. Sposób wytwarzania wankoresmycyny określonej w zastrz. 1 lub jej soli, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę drobnoustroju Amycolatopsis z gatunku HIL-006734 (DSM 12216) w warunkach tlenowych w pożywce zawierającej źródła węgla i azotu, a następnie wyodrębnia się i oczyszcza znanym sposobem.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że ponadto prowadzi się reakcję wankoresmycyny z odpowiednim środkiem, z wytworzeniem farmaceutycznie dopuszczalnej soli.
4. Organizm Amycolatopsis z gatunku HIL-006734 (DSM 12216).
5. Wankoresmycyna określona w zastrz. 1 lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania jako lek.
6. Wankoresmycyna lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól, określona w zastrz. 1, do zastosowania jako antybiotyk.
7. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera skuteczną ilość wankoresmycyny określonej w zastrz. 1 lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli.