JPH05163289A - 新規な免疫抑制物質、ｍｉ７１０−５１ｆ６物質およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】免疫抑制活性と抗菌活性をもつ新規な抗生物
質、ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質に関し、またその製造法
に関する。 【構成】土壌から新たに分離したアミコラトプシス属に
属する微生物の培養液中に優れた免疫抑制活性を有する
抗生物質が生産され蓄積されることが認められた。その
物質は単離してＭＩ７１０−５１Ｆ６物質と命名され
た。この物質は免疫抑制活性とグラム陽性細菌に対する
高い抗菌活性を有する新規化合物である。それの化学構
造は未決定である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫抑制活性と抗菌活性
をもつ新規な抗生物質、ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質に関
し、またその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、微生物が生産する免疫抑制物質と
してサイクロスポリンＡ、ＦＫ５０６および１５−デオ
キシスパガリン等が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は臓器移植や免
疫不全疾患に有用な新規な免疫抑制物質を得ることを目
的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは微生物生産
物中に有用な免疫抑制物質を見出す目的で、天然の土壌
より数多くの微生物を単離し、その生産物について種々
の研究を行なった。その結果、本発明者らが土壌から新
たに分離したアミコラトプシス属に属する微生物の培養
液中に優れた免疫抑制活性を有する抗生物質が生産され
蓄積されることを認め、その物質を単離してＭＩ７１０
−５１Ｆ６物質と命名し、そしてそれの生物学的および
物理化学的性状を調べてこの物質が免疫抑制活性とグラ
ム陽性細菌に対する高い抗菌活性を有することおよび新
規化合物であることを見出した。

【０００５】すなわち、第１の本発明によると、下記の
理化学的性質を有する新規な免疫抑制物質、ＭＩ７１０
−５１Ｆ６物質が提供されるものである。

【０００６】第１の本発明によるＭＩ７１０−５１Ｆ６
物質の物理化学的性質は下記の通りである。

【０００７】（１）元素分析：元素分析の実測値を次に
示す。

【０００８】 Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ ６０．３３％ ９．５２％ ２７．４８％ ２．４４％ （２）ＦＡＢ（Fast Atom Bombardment)マススペクト
ル：ｍ／ｚ １３４３［Ｍ＋Ｈ］⁺ （３）高分解ＦＡＢ−ＭＳ（ＥＦ−ＦＡＢ［Ｐos. ］：
Ｃ₇₁Ｈ₁₂₇ Ｏ₂₁Ｎ₂ が推定された。なお、基準物質はＰ
ＥＧ１５００を用いた。

【０００９】（４）融点：１３７〜１３９℃

【００１０】

【００１１】（８） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００Ｍ
Ｈｚ）：添付図面の図５に示す通りである。重メタノー
ル中メタノール（３．３０ｐｐｍ）を基準物質として測
定した。

【００１２】（９）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００Ｍ
Ｈｚ）：添付図面の図６に示す通りである。重メタノー
ル中メタノール（４９．００ｐｐｍ）を基準物質として
測定した。

【００１３】（１０）溶解性：メタノールに可溶、水、
アセトン、エーテル、ｎ−ヘキサンに難溶または不溶で
ある。

【００１４】（１１）薄層クロマトグラフィー （メルク社製シリカゲル６０Ｆ₂₅₄ Ａｒｔ．５５５４使
用）：Ｒｆ値を次表に示す。

【００１５】

【００１６】（１２）呈色反応：バニリン硫酸およびア
ニスアルデヒド硫酸に対して陽性である。

【００１７】（１３）物質の色および性状：無色〜白色
の固体である。

【００１８】第１の本発明によるＭＩ７１０−５１Ｆ６
物質は後記の如き生物学的活性を有するので、下記の用
途に用いられる。すなわち、本発明によるＭＩ７１０−
５１Ｆ６物質は、グラム陽性菌に対して強い抗菌作用を
示すとともにＴ細胞に選択的なマイトジェンであるコン
カナバリンＡによるマウス脾細胞の増殖反応に対し阻害
活性を示し、また混合リンパ球培養反応(Mixed Lymphoc
yte Culture Reaction) において、組織適合抗原依存性
のＴ細胞増殖反応に対し阻害活性を示した。更に、in v
ivo において、羊赤血球を抗原としたマウスの遅延型過
敏症に抑制活性を示し、またラットの皮膚移植拒絶反応
抑制実験において、拒絶反応を強く阻害し移植片の生着
日数を延長した。

【００１９】これらの結果から、Ｔ細胞を選択的に阻害
するＭＩ７１０−５１Ｆ６物質は、臓器移植や細胞性免
疫反応を介する過敏免疫状態である自己免疫疾患治療に
有用な薬剤としての用途がある。要約すると、ＭＩ７１
０−５１Ｆ６物質はグラム陽性菌感染症の治療に有用で
あり、またそれとともに臓器移植や自己免疫疾患に有用
な免疫抑制剤としての用途がある。

【００２０】本発明によるＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の
生理活性を後記の試験で評価した。試験例１ マイトジェンによる脾細胞の増殖反応に対する阻害活性 ＣＤＦ₁ マウスの脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０
％、牛胎児血清を含む）中にけん濁し、それに供試化合
物としてのＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を種々な濃度で添
加し、マイトジェン（コンカナバリンＡまたはＬＰＳ）
添加または無添加にて３７℃、５％炭酸ガス濃度条件下
にて脾細胞を７２時間培養後、細胞増殖を ³Ｈ−チミジ
ンの細胞内取り込み率を基準として判定した。その結果
を表１に示す。

【００２１】

【００２２】試験例２ 混合リンパ球培養反応(Mixed Lymphocyte CultureReact
ion) に対する阻害活性 混合リンパ球培養反応の刺激細胞としてＷＫＹラットの
脾細胞をマイトマイシンＣ５０μｇ／ｍｌで３７℃、２
０分間処理したもの、および反応細胞としてフィッシャ
ーＦ３４４ラットの脾細胞のナイロンウール非付着細胞
を用いて、それらの細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（５
％、牛胎児血清を含む）中にけん濁させ、供試化合物と
してのＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を種々の濃度で添加し
３７℃、５％炭酸ガス濃度条件下で５日間培養した。培
養終了の１６〜１８時間前に ³Ｈ−チミジンを添加し、
それの反応細胞への取り込み率を液体シンチレーション
カウンターにて測定した。その結果を表２に示す。

【００２３】

【００２４】試験例３ マウス遅延型過敏症に対する効果 ＣＤＦ₁ マウスに羊赤血球（１０⁵ 個／マウス）を静注
感作後、４日目に羊赤血球（１０⁸ 個／マウス）を足蹠
に皮下注射し遅延型過敏症を惹起した。試料は感作後１
〜３日目まで各濃度でＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を含む
溶液を腹腔内投与し、感作５日目にマウス足蹠の厚さを
測定する事により効果を判定した。その結果を表３に示
す。

【００２５】

【００２６】試験例４ ラット皮膚移植拒絶反応に対する抑制効果 ＷＫＹラット（オス、１３週令）の尾部より皮膚を採取
し、Ｆ３４４ラット（オス、１１週令）の背に移植し
た。移植後１〜９日目までＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を
腹腔内投与した。判定は薬剤無投与群の移植片離脱平均
日数を１００として評価した。その結果を表４に示す。

【００２７】

【００２８】更に、本発明によるＭＩ７１０−５１Ｆ６
物質は或る種の細菌に対して抗菌活性を有する。

【００２９】寒天平板希釈法によって測定した各種細菌
および糸状菌に対するＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の最小
生育阻止濃度（μｇ／ｍｌ）の測定結果を表５ａ及び表
５ｂに示す。

【００３０】

【００３１】

【００３２】更に、第２の本発明によると、アミコラト
プシス属に属するＭＩ７１０−５１Ｆ６物質生産菌を培
養し、その培養物からＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を採取
することを特徴とする新規な免疫抑制物質、ＭＩ７１０
−５１Ｆ６物質の製造法が提供される。

【００３３】本発明の方法に用いるＭＩ７１０−５１Ｆ
６物質生産菌はアミコラトプシス属の菌株でＭＩ７１０
−５１Ｆ６物質生産能を有するものであれば良く、特に
限定はない。使用できるＭＩ７１０−５１Ｆ６物質生産
菌の一例には昭和６３年３月、神奈川県葉山町の土壌よ
り分離された放線菌でＭＩ７１０−５１Ｆ６の菌株番号
が付された菌株がある。

【００３４】以下、ＭＩ７１０−５１Ｆ６株の菌学的性
状について述べる。

【００３５】１．形態 よく分枝した基生菌糸は、しばしばジクザグ状を呈し、
また分断が認められる。気菌糸は直状あるいは波状で、
分断を認め、１０個以上の円筒形の胞子を形成する。胞
子の大きさは約０．３〜０．５×１．４ミクロンで、表
面は平滑である。なお、胞子のうおよび輪生枝形成は認
められない。非抗酸生である。 ２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル(Container Corporationof America
のcolor harmony manual) を用いた。

【００３６】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（３
０℃培養） 無色〜うす黄だいだい［３ea，Lt Melon Yellow ］の発
育上に、うす黄だいだい［３ca，Shell ］の気菌糸を着
生する。溶解性色素は認められない。

【００３７】（２）グルコース・アスパラギン寒天培地
（３０℃培養） 無色〜うす黄［２gc，Bamboo］の発育上に、茶白［３b
a，Pearl ］〜うす黄だいだい［３ca，Shell ］の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。

【００３８】（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地
（ＩＳＰ−培地５、３０℃培養） うす黄だいだい［３ea，Lt Melon Yellow ］の発育上
に、黄味灰［２ca，LtIvory］〜うす黄だいだい［３e
a，Lt Melon Yellow ］の気菌糸を着生し、溶解性色素
は認められない。

【００３９】（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ
−培地４、３０℃培養） うす黄の発育上に、黄味白〜黄味灰［２ca，Lt Ivory］
の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。

【００４０】（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地
７、３０℃培養） うす黄［２ic，Honey Gold］〜うす黄だいだい［３ea，
Lt Melon Yellow 〜３pc，Amber ］の発育上にうす黄だ
いだい［３ea，Shell 〜３ea，Lt Melon Yellow ］の気
菌糸を着生する。溶解性色素は認められない。

【００４１】（６）栄養寒天培地（３０℃培養） うす黄［２ic，Honey Gold］の発育上に、白の気菌糸を
うっすらと着生する。 溶解性色素は認められない。

【００４２】（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−
培地２、３０℃培養） うす黄だいだい［３gc，Lt Tan］の発育上に、ピンク白
［５ba，Shell Pink］ の気菌糸を着生する。溶解性色
素は認められない。

【００４３】（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培
地３、３０℃培養） 無色〜うす黄の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。

【００４４】（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（３０
℃培養） うす黄だいだい［３ea，Lt Melon Yellow ］〜うすオリ
ーブ〔１ 1/2 ie ，Lt Olive］の発育上に、黄味白〜う
す黄だいだい［３ca，Shell 〜３ea，Lt Melon Yellow
］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。

【００４５】（１０）スターチ寒天培地（３０℃培養） 無色〜うす黄の発育上に、黄味白の気菌糸を着生する。
溶解性色素は認められない。

【００４６】（１１）リンゴ酸石灰寒天培地（３０℃培
養） うす黄［２ic，Honey Gold］〜うす黄だいだい［３ea，
Lt Melon Yellow ］の発育上に、白〜うす黄だいだいの
気菌糸を着生する。溶解性色素は認められない。

【００４７】（１２）セルロース（濾紙片添加合成液、
３０℃培養） 発育は無色、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認めら
れない。

【００４８】（１３）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、無色〜う
す黄の発育上に、黄味白の気菌糸を着生する。グルコー
ス、ペプトン、ゼラチン培地（２７℃培養） において
は、発育はうす黄だいだい、白の気菌糸をわずかに着生
する。溶解性 色素は両者とも認められない。

【００４９】（１４）脱脂牛乳（３７℃培養） 発育はうす黄だいだい、白の気菌糸をわずかに着生し、
溶解性色素は認められない。

【００５０】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース １．
０％、アスパラギン０．０５％、リン酸二カリウム
０．０５％、紐寒天 ３．０％、ｐＨ７．０） を用
い、６℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、
５０℃の各温度で 試験した結果、６℃、５０℃を除い
て、そのいずれの温度でも発育したが、生 育至適温度
は２７℃〜３０℃付近と思われる。

【００５１】（２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチ
ン培地、２０℃培地；グルコース、ペプトン、ゼラチン
培地、２７℃培養） 共に、培養後５日目頃より液化を認め、その作用は強い
方である。

【００５２】（３）スターチの加水分解（スターチ・無
機塩寒天培地およびスターチ寒天培地、 いずれも３０
℃培養） スターチ・無機塩寒天培地においては培養後１４日目頃
より、水解性が認められるが、その作用は極めて弱く、
スターチ寒天培地では認められない。

【００５３】（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂
牛乳、３７℃培養） 培養後９日目頃、凝固することなくペプトン化が始ま
り、２〜３日で完了する。その作用は中等度〜強い方で
ある。

【００５４】（５）メラニン様色素の生成（トリプトン
・イースト・ブロス、ＩＳＰ−培地１； ペプトン、イ
ースト、鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；ＩＳＰ−培地
７；いずれ も３０℃培養） いずれの培地でも陰性である。

【００５５】（６）炭素源の利用性（プリドハム、ゴド
リーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９；３０℃で培養） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、シュクロース、イノシトール、ラム
ノース、Ｄ−マンニトールを利用して生育する。ラフィ
ノース、ラクトースもおそらく利用する。

【００５６】（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰
寒天培地、３０℃培養） 培養後３日目頃よりリンゴ酸石灰の溶解を認め、その作
用は中等度〜強い方である。

【００５７】（８）硝酸塩の還元反応（０．１％硝酸カ
リウム含有ペプトン水、ＩＳＰ−培地８、３０℃培養） 陽性である。

【００５８】（９）セルロースの分解（濾紙片添加合成
液、３０℃培養） 陰性である。

【００５９】以上の性状を要約すると、ＭＩ７１０−５
１Ｆ６株は、基生菌糸および気菌糸に分断を認め、また
基生菌糸は、しばしばジグザグ状を呈する。気菌糸上に
１０個以上の円筒形の胞子を形成し、その表面は平滑で
ある。らせん形成、輪生枝、胞子のうは認められない。
非抗酸生である。種々の培地で、うす黄だいだいの発育
上に、黄味白〜うす黄だいだいの気菌糸を着生する。溶
解性色素は認められない。メラニン様色素の生成は陰性
である。スターチの水解性は、極めて弱く、蛋白分解力
は中等度〜強い方である。硝酸塩の還元反応は陽性であ
る。

【００６０】ところで、ＭＩ７１０−５１Ｆ６株の菌体
成分は細胞壁に含まれる２，６−ジアミノピメリン酸が
メソ型であり、全菌体中の還元糖はアラビノース、ガラ
クトースを含むＡ型である。また、ミコール酸を含ま
ず、リン脂質はＰII型（ホスファチジルエタノールアミ
ンを含みホスファチジルコリンおよび未知のグルコサミ
ン含有リン脂質を含まない）、主要なメナキノンはＭＫ
−９（Ｈ₄ ）であり、ＭＫ−９（Ｈ₂ ）も認められた。

【００６１】以上の性状より、ＭＩ７１０−５１Ｆ６株
は、アミコラトプシス（Amycolatop sis ，文献，Intern
ational Journal of Systematic Bacteriology，３６
巻，２９〜３７頁，１９８６年）属に属するものと考え
られる。アミコラトプシス属の既知菌種を検索すると、
アミコラトプシス・オリエンタリス（Amycolatopsis or
ientalis, 文献同上）およびアミコラトプシス・メディ
テラネイ（Amycolatopsi s mediterranei，文献同上）
が、近縁の種としてあげられた。現在、ＭＩ７１０−５
１Ｆ６株と上記２種の本研究所保存菌株とを実地に比較
検討中である。そこで、現時点では、ＭＩ７１０−５１
Ｆ６株をアミコラトプシス・エスピー(Amyco latopsis s
p.) とする。

【００６２】なお、ＭＩ７１０−５１Ｆ６株を工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託申請し、平成３年２月２
０日、微工研菌寄第１２０２１号として受託された。

【００６３】ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の製造は、アミ
コラトプシス属に属するＭＩ７１０−５１Ｆ６生産菌を
適当な培地で好気的に培養し、培養物から目的物質を採
取することにより達成することができる。

【００６４】培地はＭＩ７１０−５１Ｆ６物質生産菌が
利用しうる任意の栄養源を含有するものでありうる。具
体的には、例えば、炭素源としてグルコース、フラクト
ース、マルトース、スターチおよび油脂類などが使用で
き、窒素源として大豆粉、綿実粕、乾燥酵母エキス、ポ
リペプトンおよびコーンスティープリカーなどの有機物
並びにアンモニウム塩または硝酸塩、例えば硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの
無機物が使用できる。また必要に応じて食塩、塩化カリ
ウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、重金属塩などの無機
塩類を添加することができる。発酵中の発泡を抑制する
ために常法に従って適当な消泡剤、例えばシリコーン系
消泡剤を添加することもできる。

【００６５】培養方法としては、一般に行なわれている
生理活性物質等の生産方法であればよく、特に好気的液
体深部培養法が適している。培養温度は２０〜３７℃が
適当であるが、２７〜３０℃が好ましい。この方法でＭ
Ｉ７１０−５１Ｆ６物質の生産量は、振盪培養、通気攪
拌培養共に培養３〜５日間で最高に達する。このように
してＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の貯蓄された培養物が得
られる。培養物中では、ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質は菌
体中および培養濾液中に存在するが、菌体中により多く
存在する。

【００６６】このような培養物からＭＩ７１０−５１Ｆ
６物質を採取するには、合目的な任意の方法が利用可能
である。そのひとつの方法は、抽出の原理に基づくもの
であって、具体的には、例えば、培養濾液中のＭＩ７１
０−５１Ｆ６物質については水不混和性の有機溶媒、例
えば酢酸ブチル、ｎ−ブタノールなどで抽出する方法、
あるいは菌体内のＭＩ７１０−５１Ｆ６物質については
濾過または遠心分離などで得た菌体集体をメタノール、
エタノール、アセトンなどで処理して回収する方法があ
る。菌体を分離せずに培養物そのままを上記の抽出操作
に付すこともできる。適当な溶媒を用いた向流分配法も
抽出の範ちゅうに入れることができる。例えばＣＰＣ(C
entrifugal Partition Chromatograph) （三鬼エンヂニ
アリング社製）も使用できる。

【００６７】培養物からＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を採
取する他の方法のひとつは、吸着の原理に基づくもので
ある。例えば、培養濾液あるいは上記のようにして抽出
操作を行なうことによって得られる抽出液を対象とし
て、適当な吸着剤、ゲル濾過剤、例えば、シリカゲル、
セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、トヨ
パールＨＷ−４０（東ソー社製）、ダイヤイオンＨＰ−
２０（三菱化成工業社製）などを用いたカラムクロマト
グラフィー、ヌクレオシル５Ｃ₁₈（西独ナーゲル社製）
などを用いた高速液体クロマトグラフィーその他によっ
てＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を吸着させ、その後溶離さ
せることによりＭＩ７１０−５１Ｆ６物質を得ることが
できる。このようにして得られたＭＩ７１０−５１Ｆ６
物質含有溶液を減圧下に濃縮乾固すれば、ＭＩ７１０−
５１Ｆ６物質の粗製品が得られる。

【００６８】このようにして得られるＭＩ７１０−５１
Ｆ６物質の粗製品を更に精製するためには、上記の抽出
法および吸着法を必要に応じて組み合わせ必要回数行な
えばよい。例えば、ダイヤイオンＨＰ−２０、セファデ
ックスＬＨ−２０などの吸着剤またはゲル濾過剤を用い
たカラムクロマトグラフィー、ＣＰＣを用いた遠心液々
分配クロマトグラフィー、シリカゲルを用いた順相クロ
マトグラフィーおよびヌクレオシル５Ｃ₁₈などを用いた
高速液体クロマトグラフィーを適宜組合わせて実施する
ことができる。

【００６９】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。

【００７０】以下において「％」は「ｗ／ｖ ％」を示
す。

【００７１】実施例１ （１）種母の調製 使用した培地は、下記の表に示された組成の成分を１ｌ
の水に溶解したものである。ｐＨは無調整とした。

【００７２】

【００７３】上記培地１１０ｍｌを５００ｍｌの三角フ
ラスコに分注し殺菌後、アミコラトプシス・エスピーＭ
Ｉ７１０−５１Ｆ６株（微工研菌寄第１２０２１号）を
スラントより１白金耳摂取し、３０℃、１８０ｒｐｍの
ロータリシェーカーにて７２時間回転培養して得られた
培養物を種母とした。

【００７４】（２）培養 使用した培地は種母の調製に用いた培地と同じものを用
いた。この培地を１１０ｍｌずつ５００ｍｌの三角フラ
スコへ分注殺菌したものへ、上記種母２．２ｍｌを添加
し、ロータリーシェーカーを用いて２８℃、１８０ｒｐ
ｍにて回転培養を行なった。

【００７５】（３）ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の採取 上記（２）の条件で４日間の培養の後、培養液約２０ｌ
を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、１５分間）、菌体をメ
タノール処理後、メタノールを溜去した後、アセトニト
リルを添加し、５０％ アセトニトリル水溶液とし、１
０℃、一夜放置後、沈殿物を濾過分離し、少量のメタノ
ールにて抽出した。メタノール抽出液にアセトンを白濁
するまで加え、１０℃、一夜放置した。沈殿物を濾過分
離するとＭＩ７１０−５１Ｆ６粗抽出物３．５ｇが得ら
れた。得られた粗抽出物をセファデックスＬＨ−２０
（ファルマシア社製）を用いたゲルクロマトグラフィー
に付した。メタノールにて溶出を行ないＭＩ７１０−５
１Ｆ６物質を含む画分を集め減圧下にて濃縮乾固した。
得られたＭＩ７１０−５１Ｆ６粗精製物の約１．８ｇを
遠心液々分配クロマトグラフ（ＣＰＣ）（三鬼エンヂニ
アリング社製）に付した。クロロホルム−メタノール−
水（２：２：１）の下層を固定相とし、上層を移動相と
して２５℃、４００ｒｐｍ、１ｍｌ／分の条件下、上昇
法にて分離精製を行った。正溶出画分にＭＩ７１０−５
１Ｆ６物質は溶出され、これを減圧下に濃縮乾固した。
得られたＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の粗精製物約３５０
ｍｇをメタノールに溶解し、その一定量をカプセルパッ
ク５Ｃ₁₈（資生堂社製）のカラム（２０ｍｍφ×２５０
ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、メ
タノール−５０ｍＭ酢酸アンモニウム−アセトニトリル
（６５：３０：５）にて溶出し、ＭＩ７１０−５１Ｆ６
物質フラクションを得る。これを減圧下に濃縮乾固する
とＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の無色〜白色の固体２５０
ｍｇが得られた。

【００７６】

【発明の効果】以上詳細に説明した通り、本発明により
免疫抑制活性とグラム陽性菌に対する抗菌活性を有する
新規物質としてＭＩ７１０−５１Ｆ６物質が得られ、ま
たその製造方法が提供された。

【図面の簡単な説明】

【図１】メタノール溶液中のＭＩ７１０−５１Ｆ６物質
の紫外線吸収スペクトル図である。

【図２】０．０２Ｎ ＨＣｌ−メタノール溶液中のＭＩ
７１０−５１Ｆ６物質の紫外線吸収スペクトル図であ
る。

【図３】０．０２Ｎ ＮａＯＨ−メタノール溶液中のＭ
Ｉ７１０−５１Ｆ６物質の紫外線吸収スペクトル図であ
る。

【図４】ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質のＫＢｒディスク法
による赤外部吸収スペクトル図である。

【図５】ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の重メタノール中に
おける４００ＭＨｚでの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル図であ
る。

【図６】ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の重メタノール中に
おける１００ＭＨｚでの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル図であ
る。

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【手続補正書】

【提出日】平成４年１０月９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】 （１）元素分析：元素分析の実測値を次に示す。 Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ ６０．３３％ ９．５２％ ２７．４８％ ２．４４％

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】（２）ＦＡＢ（Fast Atom Bombardment)マ
ススペクトル：m/z 1343[M+H]⁺ （３）高分解ＦＡＢ−ＭＳ（ＥＦ−ＦＡＢ［Ｐos.]）：
Ｃ₇₁Ｈ ₁₂₆ Ｏ₂₁Ｎ₂ が推定された。なお、基準物質はＰ
ＥＧ１５００を用いた。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３５】１．形態 よく分枝した基生菌糸は、しばしばジグザク状を呈し、
また分断が認められる。気菌糸は直状あるいは波状で、
分断を認め、１０個以上の円筒形の胞子を形成する。胞
子の大きさは約０．３〜０．５×１．４ミクロンで、表
面は平滑である。なお、胞子のうおよび輪生枝形成は認
められない。非抗酸性である。 ２．各種培地における生育状態 色の記載について［ ］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル(Container Corporationof America
のcolor harmony manual) を用いた。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４８】（１３）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、無色〜う
す黄の発育上に、黄味白の気菌糸を着生する。グルコー
ス、ペプトン、ゼラチン培地（２７℃培養）において
は、発育はうす黄だいだい、白の気菌糸をわずかに着生
する。溶解性色素は両者とも認められない。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５０】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース １．
０％、アスパラギン０．０５％、リン酸二カリウム
０．０５％、紐寒天 ３．０％、ｐＨ７．０）を用い、
６℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０
℃の各温度で試験した結果、６℃、５０℃を除いて、そ
のいずれの温度でも発育したが、生育至適温度は２７℃
〜３０℃付近と思われる。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５４】（５）メラニン様色素の生成（トリプトン
・イースト・ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン、イー
スト、鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；ＩＳＰ−培地７；
いずれも３０℃培養） いずれの培地でも陰性である。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５９】以上の性状を要約すると、ＭＩ７１０−５
１Ｆ６株は、基生菌糸および気菌糸に分断を認め、また
基生菌糸は、しばしばジグザグ状を呈する。気菌糸上に
１０個以上の円筒形の胞子を形成し、その表面は平滑で
ある。らせん形成、輪生枝、胞子のうは認められない。
非抗酸性である。種々の培地で、うす黄だいだいの発育
上に、黄味白〜うす黄だいだいの気菌糸を着生する。溶
解性色素は認められない。メラニン様色素の生成は陰性
である。スターチの水解性は、極めて弱く、蛋白分解力
は中等度〜強い方である。硝酸塩の還元反応は陽性であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 濱田 雅 東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジデ ンス405号 (72)発明者 前田 謙二 東京都目黒区五本木２丁目46番11号 (72)発明者 竹内 富雄 東京都品川区東五反田５丁目１番11号 ニ ユーフジマンシヨン701

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する免疫抑制物
   質、ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質。 （１）元素分析：元素分析の実測値を下記に示す。 Ｃ Ｈ Ｏ Ｎ ６０．３３％ ９．５２％ ２７．４８％ ２．４４％ （２）ＦＡＢマススペクトル：ｍ／ｚ １３４３［Ｍ＋Ｈ］⁺ （３）融点：１３７〜１３９℃ （７） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ）：添付
   図面の図５に示す通りである。重メタノール中メタノー
   ル（３．３０ｐｐｍ）を基準物質として測定した。 （８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ）：添付
   図面の図６に示す通りである。重メタノール中メタノー
   ル（４９．００ｐｐｍ）を基準物質として測定した。 （９）溶解性：メタノールに可溶、水、アセトン、エー
   テル、ｎ−ヘキサンに難溶または不溶である。 （１０）物質の色および性状：無色〜白色の固体であ
   る。
2. 【請求項２】 アミコラトプシス属に属する請求項１記
   載の免疫抑制物質、ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質生産菌を
   培養し、その培養物から免疫抑制物質、ＭＩ７１０−５
   １Ｆ６物質を採取することを特徴とする新規な免疫抑制
   物質、ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質の製造法。
3. 【請求項３】 ＭＩ７１０−５１Ｆ６物質生産菌がアミ
   コラトプシス・エスピー(Amycolatopsis sp.) ＭＩ７１
   ０−５１Ｆ６株である請求項２記載の製造法。