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KR20240051280A - Cd27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

Cd27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도 Download PDF

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KR20240051280A
KR20240051280A KR1020247011157A KR20247011157A KR20240051280A KR 20240051280 A KR20240051280 A KR 20240051280A KR 1020247011157 A KR1020247011157 A KR 1020247011157A KR 20247011157 A KR20247011157 A KR 20247011157A KR 20240051280 A KR20240051280 A KR 20240051280A
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프랑크 뷔르스켄스
로브 드 용
야니네 슈어만
에스더 씨 더블유 브레이즈
이실 알틴타스
파울린 린다 드 호이예
다비트 사테인
페터 보로스
우구르 사힌
프리데리케 기세케
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Abstract

본 발명은 인간 CD27과 결합할 수 있는 항체 및 항체의 Fc-Fc 상호작용을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형된 Fc 영역을 포함하는 그의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 항체를 포함하는 제약 조성물 및 특히 암 요법에서의 치료 및 진단 절차를 위한 항체의 용도를 제공한다.

Description

CD27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도
본 발명은 CD27과 결합할 수 있는 항체 및 Fc 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 그의 항체 변이체 및 이러한 항체 및 Fc 변이체의 용도에 관한 것이다.
CD27 (TNFRSF7)은 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 슈퍼패밀리 (TNFRSF)의 55 kDa 유형 I 막횡단 단백질 구성원이며, 이는 리간드 CD70과 결합한 후 T-세포 활성화를 공동 자극한다. 이는 인간에서 T, B, NK 세포 및 그들의 즉각적인 전구체 (이들 모두는 림프 계통의 일부임)의 세포막에서 발현된다. 인간 T 세포에서, CD27은 휴지기 αβ CD4+ (Treg 및 기존 T 세포), CD8+ T 세포, 줄기-세포 기억 세포, 및 중심 기억-유사 세포에서 발현된다. 인간 B 세포에서, CD27은 기억 B 세포 마커이며 CD27 신호전달은 B 세포의 형질 세포로의 분화를 촉진시킨다.
CD27에 대해 공지된 유일한 리간드는 유형 II 막횡단 단백질 CD70 (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 7, TNFSF7; CD27 리간드, CD27L)이며, 이는 T, B, NK 및 수지상 세포 (DC)를 포함한 활성화된 면역 세포에서 매우 제한적이고 일시적으로만 발현된다.
CD27이 CD70과 결합하면, 말단절단된 32 kDa 형태의 CD27이 매트릭스 메탈로프로테이나제의 작용을 통해 방출될 수 있다 (가용성 CD27, sCD27로서 공지됨).
CD27은 1차 면역 반응의 초기 생성에 역할을 하며 T 세포 면역의 생성 및 장기간 유지에 필요하다. CD27-CD70 결합은 NF-KB 및 MAPK8/JNK 경로의 활성화를 유도한다. 어댑터 단백질 TRAF2 및 TRAF5는 CD27 참여로 인한 신호전달을 매개하는 것으로 나타났다.
이펙터 기능을 잠금해제하기 위해, T 세포는 항원 제시 세포 (APC) 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 관련하여 동족 항원에 대한 T-세포 항원 수용체-매개된 인식과 공동 자극 수용체의 활성화를 필요로 한다. CD27과 CD28은 T 세포에서 발현되는 가장 중요한 공동 자극 수용체로 간주된다.
마우스에서, T-세포 활성화의 프라이밍 단계 동안의 CD27 자극은 IL-2-비의존적 생존 신호전달에 의해 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 클로날 확장을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다 (Carr JM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006 Dec 19; 130(51):19454-9). CD27은 또한 연속적인 분열을 통해 활성화된 T 세포의 아폽토시스를 방해하며 또한 마우스 CD8+ T 세포의 기억 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (van de Ven K, Borst J. Immunotherapy 2015;7(6):655-67). 결과적으로, CD27 자극은 림프계 기관에서 이펙터 T 세포의 생성을 촉진시키고 반응인자 T-세포 레퍼토리를 확대시킨다. 인간 나이브 T 세포에서, CD27 자극은 CD4+ T 세포의 T 헬퍼-1 (Th1) 분화를 촉진시키고 세포독성 T-림프구의 이펙터 분화를 지원한다 (Oosterwijk et al., Int Immunol. 2007 Jun; 19(6):713-8).
일부 혈액 악성종양 내의 종양 세포에서의 존재와는 반대로, 고형 악성종양 내의 종양 세포에서는 CD27 발현이 검출되지 않았다. 그러나, CD27 발현 림프계 세포는 혈액 악성종양과 고형 암 둘 다의 종양 미세환경에서 보고되었다.
암 치료에서, 면역 반응의 참여 및 자극은 항종양 면역을 유도 및/또는 향상시켜, 면역 체크포인트 억제제의 임상적 성공으로 예시된 바와 같은 임상 반응을 초래하는 것으로 나타났다. 활성 면역 반응 및/또는 기존 항종양 면역은 공동 자극 신호전달, 예를 들어 CD27 공동 자극 신호전달을 제공함으로써 증가될 수 있다.
마우스 종양 모델에서 T-세포 기능과 이에 따른 항종양 면역은 효능작용 CD27 항체에 의해 향상될 수 있다. hCD27-트랜스제닉 림프종 마우스 모델에서, 효능작용 항체를 사용한 CD27 활성화는 강력한 항종양 활성과 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의존적인 보호 면역의 유도를 제시하였다 (He LZ et al., J Immunol. 2013 Oct 15;191(8):4174-83). 더욱이, 모노클로날 항체를 사용한 CD27 활성화는 특히, 백혈병 (문헌 [Vitale et al., Keler T. Clin Cancer Res. 2012 Jul 15;18(14):3812-21]), 흑색종 (문헌 [Roberts DJ, et al., J Immunother. 2010 Oct;33(8):769-79]), 결장 암종 및 흉선종 (문헌 [He LZ, et al., J Immunol. 2013 Oct 15;191(8):4174-83])으로부터 유래된 모델을 포함한 마우스 이종이식편에서 종양 성장을 방지하였다.
인간 CD27에 대항한 모노클로날 IgG1 효능작용 항체는 선행 기술분야에 개시되어 있다.
WO2008/051424는 암, 감염, 염증, 알레르기, 및 자가면역의 치료 및 백신의 효능 향상을 위하여 단독으로 또는 또 다른 모이어티, 예컨대 면역 자극제 또는 면역 조정제와 연합된 CD27 효능제, 바람직하게는 효능작용 CD27 항체에 관한 것이지만, 임의의 CD27 항체의 서열은 개시되지 않았다.
WO2012/004367에는 인간화 항-인간 CD27 효능작용 항체 (hCD27.15로 지명됨)가 기재되어 있다. hCD27.15는 면역 반응의 CD27-매개된 공동 자극을 활성화하기 위해 FcγR 발현 세포에 의한 가교를 필요로 하지 않는 것으로 보고되었다. 그러나, 이러한 항체는 hCD27에서 빈번하게 발생하는 SNP (A59T)와 결합하지 않으며 시노몰구스 CD27과도 결합하지 않는다.
WO2011/130434에는 FcγR 발현 세포에 의한 가교 시 CD27을 활성화시키고 추가로 리간드 (sCD70) 차단성인, 1F5로 지명된 인간 효능작용 항-인간 CD27 항체가 개시되어 있다. 1F5는 표적 세포에 대해 CDC 및 ADCC 활성을 갖고 마우스 모델에서 면역 반응을 향상시키고 항종양 활성을 갖는 것으로 보고되었다.
WO2018/058022에는 효능작용 뮤린 항-인간 CD27 항체 131A 및 그의 인간화 버전이 개시되어 있다. 131A는 hCD27에서 빈번하게 발생하는 SNP (A59T) 및 시노몰구스 CD27과 결합하는 것으로 개시되어 있다. WO2018/058022에는 마우스 종양 모델에서 항체 131A가 항체 1F5와 비교하여 더 큰 항종양 반응을 나타냈다는 것이 추가로 개시되어 있다.
WO2019/195452에는 상기 언급된 CD27-항체 1F5보다 인간 및 시노몰구스 CD27에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것으로 보고된 BMS-986215로 지명된 비-리간드 차단 효능작용 항-인간 CD27 항체가 개시되어 있다. 리간드 CD70에 대한 결합에 의한 T 세포의 CD27 공동 자극은 BMS-986215의 존재 하에 발생하는 것으로 개시되어 있다. BMS-986215가 조절성 T-세포 (Treg)에 의한 CD4+ 반응인자 T 세포의 억제를 감소시킨다는 것과, BMS-986215가 보통 수준의 ADCC 및 낮은 수준의 ADCP, CDC를 유도하고 C1q와 결합한다는 것이 추가로 개시되어 있다. BMS-986215가 FcγR의 부재 하 및 가용성 CD70의 부재 하에서만 약한 효능제 활성을 갖는다는 것이 추가로 개시되어 있다.
항-CD27 항체는 CD27 효능작용을 유도하기 위해 원형질 막에서 CD27의 클러스터링을 유도해야만 한다. 야생형 IgG1 항체의 경우, CD27의 클러스터링은 막-결합된 CD27 항체와 FcγR 보유 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포, B 세포 및 기타 면역 세포의 상호작용을 통해 달성될 수 있다. 결과적으로, FcγR 발현 세포의 수가 제한되면 항-CD27 IgG1 분자는 덜 효율적일 수 있다. 또한, FcγR 참여는 바람직하지 않은 이펙터 기능, 에컨대 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포성 식균작용 (ADCP), 및 보체-의존적 세포독성 (CDC)의 활성화를 초래할 수도 있으며, 이는 CD27-양성 T 세포의 원치않는 고갈을 유발시킬 수 있다.
항체의 Fc 영역의 변형에 의한 이펙터 기능의 최적화는 암 또는 기타 질환을 치료하기 위한 치료용 항체의 유효성을 개선시킬 수 있으며, 예를 들어 항원 발현 세포에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 항체의 능력을 개선시킬 수 있다. 이러한 노력은, 예를 들어 WO 2013/004842 A2; WO 2014/108198 A1; WO2018/146317; WO2018/083126; WO 2018/031258 A1; 문헌 [Dall'Acqua, Cook et al. J Immunol 2006, 177(2): 1129-1138; Moore, Chen et al. MAbs 2010 2(2): 181-189; Desjarlais and Lazar, Exp Cell Res 2011, 317(9): 1278-1285; Kaneko and Niwa, BioDrugs 2011, 25(1): 1-11; Song, Myojo et al., Antiviral Res 2014, 111: 60-68; Brezski and Georgiou, Curr Opin Immunol 2016, 40: 62-69; Sondermann and Szymkowski, Curr Opin Immunol 2016, 40: 78-87; Zhang, Armstrong et al. MAbs 2017, 9(7): 1129-1142.; Wang, Mathieu et al. Protein & Cell 2018, 9(1): 63-73; Beurskens FJ et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3]에 기재되어 있다.
그러나 관련 기술분야에서의 이러한 노력 및 다른 노력에도 불구하고, 증가된 효능작용 및/또는 증가된 효능을 갖고/거나 FcγR-발현 세포의 수가 제한되는 경우에도 효능이 있는 효능작용 CD27 치료용 항체가 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 높은 효능 및 효능작용을 가지며 세포막에서 CD27의 클러스터링을 위한 2차 가교를 제공하는 FcgR 발현 세포의 수와 무관하게 T-세포 증식의 높은 활성화를 유도하는 항-CD27 항체를 제공하는 것이다. 따라서, 추가의 목적은 면역 반응의 CD27-매개된 공동 자극을 활성화시키기 위해 FcγR 발현 세포에 의한 가교를 필요로 하지 않는 항-CD27 항체를 제공하는 것이다. 추가의 목적은 인간 CD27과 결합하고 hCD27에서 빈번하게 발생하는 SNP (A59T)와 추가로 결합하고 시노몰구스 CD27과도 결합하는 항-CD27 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 C1q에 의한 2차 가교와 무관하게 또는 FcγR-비의존적 방식으로, 향상된 IgG 육량체 형성을 통해 CD27 효능작용을 유도하는 CD27 효능제 항체를 제공하는 것이다. 암과 관련하여, 이러한 항체는 항종양 면역을 증가시킬 수 있다. 항종양 면역 반응을 향상시키는 강력한 효능작용 활성을 나타내는 항-CD27 항체에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
본 발명은 CD27 결합 항체 및 그의 Fc 변이체에 관한 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 인간 CD27과 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체에 관한 것이며, 여기서 상기 항체는 서열식별번호(SEQ ID NO): 5, 6, 및 7에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열식별번호: 9, 10 및 11에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
한 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 8에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 8에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 포함하고 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 8에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 포함하고 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함하는 항체에 관한 것이며, 여기서 항체는 인간 IgG1 이소타입의 것이다.
한 측면에서 본 발명은 변형된 Fc 영역을 갖는 상기 기재된 바와 같은 항체에 관한 것이며, 여기서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345 또는 E430에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y를 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 측면에서 본 발명은 변형된 Fc 영역을 추가로 갖는 상기 기재된 바와 같은 항체 중 임의의 것에 관한 것이며, 여기서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 P329에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 R이다.
한 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 5, 6, 및 7에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열식별번호: 9, 10 및 11에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고 변형된 Fc 영역을 추가로 포함하는 항체에 관한 것이며, 여기서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345 및 P329에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 둘 다 R이다.
한 측면에서 본 발명은 인간 또는 인간화 항체에 관한 것이다.
한 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 항체에 관한 것이다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역;
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
c. 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역; 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
한 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 항체에 관한 것이다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역;
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
c. 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역; 및
d. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
한 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 생산하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 항체를 생산하는데 적합한 조건 하에 및 배양 배지에서 이러한 재조합 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에서 정의된 바와 같은 항체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체에 관한 것이다.
한 측면에서 본 발명은 질환을 치료하는 방법으로서, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 조성물, 또는 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 제약 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서 본 발명은 부분들의 키트, 예컨대 동반 진단으로 사용하기 위한/환자 집단 내에서 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 사용한 치료에 반응하는 경향이 있는 환자를 확인하기 위한 키트에 관한 것이다.
한 측면에서 본 발명은 본원의 어느 한 측면 또는 실시양태에서 정의된 바와 같은 CD27과 결합할 수 있는 항원-결합 영역과 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다.
도 1은 CD27 Jurkat 리포터 생물검정에서 결정된 바와 같은 항-CD27 항체 및 그의 육량체화-향상된 Fc 변이체의 CD27 효능제 활성을 제시한다. 해동-및-사용 글로리스판스(GloResponse) NFκB-luc2/CD27 Jurkat 리포터 세포를 표시된 항체의 항체 농도 시리즈 (좌측에서 우측으로: 0.04 μg/mL, 0.30 μg/mL, 2.50 μg/mL, 및 20 μg/mL)로 6시간 동안 인큐베이션하였다. CD27 세포내 신호전달에 대한 판독값으로서의 루시페라제 활성은 발광 (RLU: 상대 발광 단위)을 결정함으로써 정량화되었다. 하기 항체는 표시된 바와 같이, WT IgG1 및/또는 E430G 또는 E345R 돌연변이가 있는 변이체로서 포함되었다: E345R 돌연변이를 포함하는 비-결합 항-HIV-gp120 대조군 항체 (IgG1-b12-E345R, ctrl), 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B, IgG1-CD27-C, IgG1-CD27-D, IgG1-CD27-E 및 IgG1-CD27-F, 및 선행 기술의 항-CD27 벤치마크 항체 IgG1-CD27-131A 및 IgG1-CD27-15.
도 2는 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, PBMC 중의 T 세포 (A,C) 또는 CD27-형질감염된 HEK293F 세포 (B,D)에서 발현된 인간 (A,B) 및 시노몰구스 원숭이 (C,D) CD27에 대한 항-CD27 항체의 결합을 제시한다. 항체 결합은 중앙값 형광 강도 (MFI)로서 제시된다. 항-HIV-gp120 항체 IgG1-b12-FEAR (ctrl)은 비-결합 음성 대조군 항체로서 포함되었다.
도 3은 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, HEK293F 세포에서 발현된 인간 CD27-A59T 변이체에 대한 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B 및 IgG1-CD27-C의 결합을 제시한다. 항체 결합은 중앙값 MFI로서 제시된다. 항-HIV-gp120 항체 IgG1-b12-FEAL (ctrl)은 비-결합 음성 대조군 항체로서 포함되었다.
도 4는 CSFE 희석 검정에서 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, Fc 돌연변이 P329R, G237A 또는 K326A-E33A와 조합하여 Fc 돌연변이 E430R 또는 E345R을 보유하는 1 μg/mL CD27-특이적 항체 변이체 IgG1-CD27-A, -B 또는 -C의 존재 하에 TCR 자극된 CD8+ T 세포 (A) 및 CD4+ T 세포 (B)의 증식에 대한 히트맵을 제시한다. 4명의 건강한 인간 공여자로부터의 PMBC를 T 세포의 공급원으로서 사용하였다. T-세포 증식은 T-세포 분열 지수 또는 증식된 T 세포의 백분율로서 표현되었으며, 이는 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용함으로써 CFSE 희석을 거친 세포에 대한 게이팅에 의해 계산되었다 (CFSE낮은 피크).
도 5는 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, 건강한 인간 공여자 PBMC를 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 선행 기술의 항-CD27 클론 IgG1-CD27-131A, IgG1-CD27-CDX1127, 및 IgG1-CD27-BMS986215와 함께 인큐베이션한 후 비자극된 (A, B) 또는 TCR 자극된 (C-F) CD4+ T 세포 (A, C, E) 또는 CD8+ T 세포 (B, D, F)의 확장 지수 (E, F), 증식된 T 세포의 백분율 (A-D)을 제시한다. 항-HIV-gp120 항체 변이체 IgG1-b12-E345R-P329R (ctrl)은 비-결합 음성 대조군 항체로서 포함되었다. % 증식된 세포는 CFSE 희석을 거친 세포에 대한 게이팅에 의해 계산되었다 (CFSE낮은 피크). 확장 지수는 웰 내 세포의 증가 배수를 확인하고 플로우조 버전 10의 증식 모델링 도구를 사용하여 계산되었다. 보다 일관되게 존재하는 피크 수를 정의하기 위해 필요한 경우 피크에 대한 수동 조정이 이루어졌다.
도 6은 FACS에 의해 결정된 바와 같이, 본 발명의 막-결합된 CD27 항체에 대한 C1q의 결합을 제시한다. E430G 또는 E345R 육량체화-향상 돌연변이를 함유하는 IgG1-CD27-A 변이체 (IgG1-CD27-A-E430G 및 IgG1-CD27-A-E345R)와 P329R 돌연변이를 함유하는 IgG1-CD27-A 변이체 (IgG1-CD27-A-P329R-E345R)는 C1q와 결합할 수 있는 능력에 대해 시험되었다. 항-HIV-gp120 항체 IgG1-b12-F405L (ctrl)은 비-결합 음성 대조군 항체로서 포함되었다.
도 7은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 결정된 바와 같이 인간 Fc 수용체에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합을 제시한다. 비아코어(Biacore) 표면 칩은 항-His 항체와 공유적으로 연결되었고 재조합 His-태그부착된 Fc 수용체 (A) FcγRIa, (B) FcγRIIa-H, (C) FcγRIIa-R, (D) FcγRIIb, (E) FcγRIIIa-F, 또는 (F) FcγRIIIa-V로 코팅되었다. 항-HIV-gp120 항체 IgG1-b12 (ctrl)가 참조로서 포함되었다. 배경 공제 후 비아코어 SPR에 의해 결정된 바와 같은 절대 공명 단위가 제시된다 (Fc 수용체 유동-세포 없음).
도 8은 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, 건강한 인간 공여자 PBMC 샘플 내의 인간 (A) CD4+ 및 (B) CD8+ T-세포 서브세트에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합을 제시한다. 음성 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R (ctrl)은 P329R 및 E345R 돌연변이를 포함하는 항-HIV gp120 비-결합 이소타입 대조군 항체이다. 제시된 데이터는 이중물 샘플의 평균 MFI +/- SD이다.
도 9는 리포터 검정에서 결정된 바와 같이, FcγR-매개된 가교의 존재 및 부재 하에 항-CD27 항체의 CD27 효능제 활성을 제시한다. 고정된 수의 NFκB-luc2/CD27 Jurkat 리포터 세포를 (B,G) 1:1, (C,H) 1:1/3, (D,I) 1:1/9, 또는 (E,J) 1:1/27의 NFκB-luc2/CD27 Jurkat : FcγRIIb CHO-K1의 비율에서 FcγRIIb-CHO-K1 세포의 (A,F) 부재 또는 (B-J) 존재 하에, (A-E) IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 IgG1-CD27-A, (F-J) IgG1-CD27-131A, IgG1-CD27-CDX1127 또는 IgG1-CD27-BMS986215와 함께 배양하였다. IgG1-b12-P329R-E345R 및 IgG1-b12는 항-HIV gp120 비-결합 대조군 항체 (ctrl)이다. 발광은 CD27 활성화에 대한 판독값으로서 측정되었으며 상대 발광 단위 (RLU)로서 제시되었다.
도 10은 25 mg/kg IgG-CD27-A 또는 IgG-CD27-A-P329R-E345R 항체를 정맥내 주사한 후 SCID 마우스의 혈장 내 인간 IgG 수준을 제시한다. 총 인간 IgG 혈장 농도를 샌드위치 ELISA로 결정하고 주사 후 시간에 대항하여 플롯하였다. 제시된 데이터는 군당 혈액 샘플의 평균 혈장 농도 +/- SEM이다 (n=3마리 마우스).
도 11은 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 야생형 CD20 항체 IgG1-CD20의 존재 하에 hMDM (E:T = 2:1)과 함께 4시간 동안 공동 배양한 후 생육성 CD27+ Daudi 세포의 백분율을 제시한다. Daudi 세포를 셀트레이스(CellTrace)™ 바이올렛으로 표지하고 세포 생육력을 유동 세포계수법에 의해 측정하였다. 제시된 데이터는 2가지 실험에서 시험된 4명의 공여자 중 1명의 공여자에 대한 항체 없음 대조군에 대해 정규화된 생육성 Daudi 세포 (TO-PRO-3-CTV+CD11b-)의 이중물의 평균 ± SD 백분율이다.
도 12는 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 NHS에서 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 인큐베이션 시 C4d 침착을 제시한다. IgG1-b12-P329R-E345R은 이소타입 대조군 항체이고 IgG1-b12는 WT Fc 도메인을 갖는 대조군 항체이며; IgG1-b12-RGY는 C4d 침착을 위한 양성 대조군 항체이다 (용액 중 육량체 항체). 제시된 것은 수행된 3가지 실험 중 하나의 대표적인 실험의 삼중물의 평균 ± SD이다.
도 13은 항-CD27 항체에 의한 Daudi 세포에서의 CD70 결합의 억제를 제시한다. CD27+ Daudi 세포를 50 μg/mL의 비-결합 대조군 항체 (IgG1-b12-P329E-E345R 또는 IgG1-b12) 또는 CD27 항체 (IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-A-P329R-E345R, IgG1-CD27-CDX1127, IgG1-CD27-BMS986215, 또는 IgG1-CD27-131A)의 존재 또는 부재 하에 6 μg/mL 비오티닐화된 재조합 인간 CD70 ECD와 함께 인큐베이션하였다. Daudi 세포에 대한 비오티닐화된 CD70 단편의 결합은 BV421-표지된 스트렙타비딘을 사용하는 유동 세포계수법에 의해 검출되었다. 제시된 데이터는 수행된 3가지 실험 중 하나의 대표적인 실험의 이중물 웰로부터의 gMFI ± SD이다.
도 14는 항-CD27 항체로 처리 시 폴리클로날 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 T-세포 활성화 마커의 발현 수준을 제시한다. 건강한 인간 공여자 PBMC를 0.1 μg/mL CD3 항체 및 30 μg/mL의 IgG1-CD27-A-P329R-E345R, CD27 항체 벤치마크 또는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R과 함께 2일 또는 5일 동안 인큐베이션하였다. 항체 처리된 샘플에서 (A) CD4+ 및 (B) CD8+ T 세포의 표면 상에서의 T-세포 활성화 마커 HLA-DR, CD69, GITR, CD25, CD107a 및 4-1BB의 발현 수준을 유동 세포계수법에 의해 정량화하였고, 동일한 공여자의 비결합 대조군 샘플과 비교하여 MFI (±SD)에서의 평균 변화 배수로서 제시되었다. 점선은 비결합 대조군으로서 사용되었으며 1로 설정된 IgG1-b12-P329R-E345R로 처리된 세포에 대한 변화 배수를 표시한다. 제시된 데이터는 하나의 실험에서 이중으로 시험된 3명의 공여자로부터의 것이다.
도 15는 OVA로 면역화하고 항-CD27 항체로 처리한 후 hCD27-KI 마우스의 비장에서 OVA-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 제시한다. hCD27-KI 마우스에게 제0일, 제12일 및 제21일에 5 mg OVA를 s.c. 주사하였고, 동시에 30 mg/kg IgG1-CD27-A-P329R-E345R, IgG1-CD27-CDX1127 또는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R로 i.v. 처리하였다. 제28일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 절제한 후 단일 세포 현탁액으로서 프로세싱하였다. OVA 특이적 CD8+ T 세포의 확장은 유동 세포계수법에 의해 평가되었다. 제시된 데이터는 수행된 하나의 실험으로부터의 처리 군당 (군당 5마리 마우스) CD8+ 세포의 % OVA+의 평균 ± SD이다.
도 16은 IFNγ-ELISpot에 의해 측정된 바와 같이 OVA로 면역화하고 항-CD27 항체로 처리한 후 제28일에 IFNγ-생산 비장세포의 수를 제시한다. hCD27-KI 마우스에게 제0일, 제12일 및 제21일에 5 mg OVA를 s.c. 주사하였고, 동시에 30 mg/kg IgG1-CD27-A-P329R-E345R, IgG1-CD27-CDX1127 또는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R로 i.v. 처리하였다. 제28일에, 비장을 절제하고, 단일 세포 현탁액으로서 프로세싱하며, IFNγ-생산 비장세포를 IFNγ-ELISpot을 사용하여 검출하였다. 제시된 데이터는 수행된 하나의 실험으로부터의 각각의 처리 군 (군당 5마리 마우스)의 웰당 평균 스팟 수 ± SEM이다.
도 17은 OVA로 면역화하고 항-CD27 항체로 처리한 후 hCD27-KI 마우스의 비장에서 활성화된 CD8+ T 세포의 백분율을 제시한다. hCD27-KI 마우스에게 제0일, 제12일 및 제21일에 5 mg OVA를 s.c. 주사하였고, 동시에 30 mg/kg IgG1-CD27-A-P329R-E345R, IgG1-CD27-CDX1127 또는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R로 i.v. 처리하였다. 제28일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 절제한 후, 단일 세포 현탁액으로서 프로세싱하였다. CD8+ T 세포의 활성화는 유동 세포계수법에 의해 비장 내 CD8+ 세포의 PD-1+ 백분율을 측정함으로서 비장 샘플에서 평가되었다. 제시된 데이터는 수행된 하나의 실험으로부터의 처리 군당 (군당 5마리 마우스) 평균 ± SD이다.
도 18은 OVA로 면역화하고 항-CD27 항체로 처리한 후 hCD27-KI 마우스의 비장 내 이펙터 CD8+ T 세포의 백분율을 제시한다. hCD27-KI 마우스에게 제0일, 제12일 및 제21일에 5 mg OVA를 s.c. 주사하였고, 동시에 30 mg/kg IgG1-CD27-A-P329R-E345R, IgG1-CD27-CDX1127 또는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R로 i.v. 처리하였다. 제28일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 절제한 후, 단일 세포 현탁액으로서 프로세싱하였다. 기억 T 세포의 확장은 유동 세포계수법에 의한 CD44 및 CD62L의 발현으로써 평가되었다. 제시된 데이터는 수행된 하나의 실험으로부터의 처리 군당 (군당 5마리 마우스) 평균 ± SD이다. (A) CD45+ 세포의 CD8+CD44+CD62L- 이펙터 기억 백분율. (B) CD8+ T 세포의 CD44+CD62L- 이펙터 기억 백분율. (C) CD45+ 세포의 CD8+CD44-CD62L- 프리-이펙터 백분율. (D) CD8+ T 세포의 CD44-CD62L- 프리-이펙터 백분율.
도 19는 OVA로 면역화하고 항-CD27 항체로 처리한 후 hCD27-KI 마우스의 비장 내 T 세포의 백분율을 제시한다. hCD27-KI 마우스에게 제0일, 제12일 및 제21일에 5 mg OVA를 s.c. 주사하였고, 동시에 30 mg/kg IgG1-CD27-A-P329R-E345R, IgG1-CD27-CDX1127 또는 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R로 i.v. 처리하였다. 제28일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 절제한 후, 단일 세포 현탁액으로서 프로세싱하였다. 혈액 및 비장 내의 CD3+ 세포를 유동 세포계수법에 의해 평가하였다. 제시된 데이터는 수행된 하나의 실험으로부터의 처리 군당 (군당 5마리 마우스) 평균 ± SD이다.
도 20은 항원-특이적 연구에서 T-세포 시토카인 생산에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 효과를 제시한다. (A) 내인성 PD-1을 발현하거나 (B) PD-1을 과다발현하는 CLDN6-TCR 발현 CD8+ T 세포와 자가 CLDN6 발현 iDC의 공동 배양물을 10 μg/mL IgG1-CD27-A-P329R-E345R, CD27 벤치마크 항체 IgG1-CD27-131A 또는 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R과 함께 2일 동안 인큐베이션하였다. 공동 배양 상청액 중의 시토카인 수준을 다중 ECLIA로 분석하였다. 제시된 데이터는 수행된 2가지 실험에서 시험된 7명의 공여자 중 1명의 대표 공여자로부터의 삼중물 웰의 평균 농도 ± SD이다. 약어: CLDN6 = 클라우딘 6; ECLIA = 전기화학발광 검정; iDC = 미성숙 수지상 세포; PD-1 = 프로그램된 세포 사멸 단백질 1; SD = 표준 편차; TCR = T 세포 수용체.
도 21은 IgG1-CD27-A-P329R-E345R과 함께 인큐베이션된 항원-특이적 CD8+ T 세포에서 세포독성-연관 분자의 발현을 제시한다. CLDN6-TCR-전기천공된 CD8+ T 세포를 IgG1-CD27-A-P329R-E345R, CD27 벤치마크 IgG1-CD27-131A 또는 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R의 존재 하에 hCLDN6-MDA-MB-231 세포와 2일 동안 공동 배양하였다. GzmB 및 CD107a의 세포내 발현은 유동 세포계수법에 의해 결정되었다. CD8+ T 세포에서 GzmB 및 CD107a의 발현 수준 (IgG1-b12-P329R-E345R에 대해 정규화된 MFI) 뿐만 아니라 GzmB 및 CD107a 둘 다를 발현하는 CD8+ T 세포의 백분율이 제시된다. 제시된 데이터는 2가지 실험에서 단일 복제물로 시험된 6명의 공여자의 평균 ± SD이다. **, P<0.01; *, P<0.05; 던(Dunn)의 다중 비교 시험을 사용한 프리드만(Friedman) 시험. 약어: CLDN6 = 클라우딘 6; GzmB = 그랜자임 B; MFI = 평균 형광 강도; SD = 표준 편차; TCR = T-세포 수용체.
도 22는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 존재 하에 항원-특이적 CD8+ T-세포 매개된 종양 세포 사멸을 제시한다. hCLDN6-MDA-MB-231 세포의 CD8+ T-세포 매개된 사멸은 실시간 세포 분석에 의해 평가되었다. CLDN6 TCR 전기천공된 CD8+ T 세포를 IgG1-CD27-A-P329R-E345R, CD27 벤치마크 IgG1-CD27-131A 또는 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R의 존재 하에 5일 동안 hCLDN6-MDA-MB-231 세포와 공동 배양하였다. 세포 지수 값은 2시간 간격으로 시행된 임피던스 측정으로부터 유래되었다. AUC는 5일간의 공동 배양에 걸쳐 세포 지수 데이터로부터 수득되었다. 각각의 처리 조건의 AUC는 동일한 공여자로부터의 IgG1-b12-P329R-E345R 처리된 배양물에 대해 정규화되었다. 제시된 데이터는 2가지 실험에서 이중으로 시험된 6명의 공여자로부터의 평균 ± SD이다. **, P<0.01; 던의 다중 비교 시험을 사용한 프리드만 시험. 약어: AUC = 곡선하 면적; CLDN6 = 클라우딘 6; SD = 표준 편차; TCR = T-세포 수용체.
도 23은 IgG1-CD27-A-P329R-E345R로 처리한 후 원발성 종양 배양물에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 NK 세포의 절대 세포 수를 제시한다. 인간 NSCLC 종양 조직을 10 μg/mL IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 존재 또는 부재 하에 낮은 용량 IL-2 (45 내지 50 U/mL)와 함께 배양하였다. TIL 서브세트의 절대 세포 카운트는 처리 14일 후에 유동 세포계수법에 의해 결정되었다. 제시된 데이터는 수행된 4가지 실험 중 하나의 실험에서 시험된 5개의 종양 조직 중 1개로부터의 4개 복제물 웰의 평균 ± SD이다. 약어: IL = 인터류킨; NK = 자연 살해자; NSCLC = 비소세포 폐암; SD = 표준 편차; U/mL = mL당 단위.
도 24는 Daudi 세포와 huCD27-K562 세포의 세포 표면 상의 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 항체 간의 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET) 분석에 의해 결정된 분자 근접성을 제시한다. 세포를 NanoLuc- (공여자) 및 HaloTag- (수용자) 태그부착된 항체 (각각 5 μg/mL): 표시된 바와 같은 IgG1-CD27-A-P329R-E345R, WT IgG1-CD27-A 또는 비결합 대조군 IgG1-b12-P329R-E345R의 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 항체 쌍 IgG1-CD20-11B8-E430G-LNLuc 및 IgG1-CD37-37.3-E430G-LHalo를 양성 대조군으로서 사용하였다. BRET는 밀리BRET 단위 (mBU) = (618 nmem/460 nmem) x 1000으로 계산되었으며, 리간드가 없는 대조군 값을 공제함으로써 공여자 블리드-스루를 교정하였다. 제시된 데이터는 수행된 3가지 실험 중 하나의 대표적인 실험의 이중물 웰로부터의 교정된 BRET이다.
도 25는 FcγRIa 결합에 대한 양성 대조군으로서 무관한 항원-결합 영역을 갖는 WT IgG1 항체 (IgG1-b12), 및 P329R 및 E345R 돌연변이를 보유하는 동일한 항체의 변이체 (IgG1-b12-P329R-E345R)와 비교하여 M0 및 M1 대식세포에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합을 제시한다. 대식세포에 대한 항체의 결합은 PE-표지된 염소 항-인간 2차 항체를 사용하여 유동 세포계수법에 의해 검출되었다. 제시된 데이터는 시험된 두 공여자의 평균 + SD이다.
정의
본 발명의 맥락에서 용어 "항체" (Ab)는 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 갖는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 그 중 어느 하나의 유도체를 지칭한다. 본 발명의 항체는 이뮤노글로불린의 Fc-도메인 및 항원-결합 영역을 포함한다. 항체는 일반적으로 2개의 CH2-CH3 영역 및 연결 영역, 예를 들어 힌지 영역, 예를 들어 적어도 Fc-도메인을 함유한다. 따라서, 본 발명의 항체는 Fc 영역 및 항원-결합 영역을 포함할 수 있다. 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 또는 "Fc" 영역은 면역 체계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포)를 포함한 숙주 조직 또는 인자, 및 보체 시스템의 성분, 예컨대 보체 활성화의 고전적인 경로에서의 제1 성분인 C1q에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 문맥상 모순되지 않는 한, 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 전형적으로, 이뮤노글로불린 CH의 적어도 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 함유하고, 연결 영역, 예를 들어, 힌지 영역을 포함할 수 있다. Fc-영역은 전형적으로, 예를 들어, 2개의 힌지 영역을 연결하는 디술피드 브릿지 및/또는 2개의 CH3 영역 간의 비-공유 상호작용을 통해 이량체화된 형태이다. 이량체는 동종이량체 (2개의 Fc 영역 단량체 아미노산 서열이 동일한 경우) 또는 이종이량체 (2개의 Fc 영역 단량체 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산에 있어서 상이한 경우)일 수 있다. 전체 길이 항체의 Fc 영역-단편은, 예를 들어, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 전체 길이 항체를 파파인으로 소화시킴으로써 생성될 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 항체는, Fc 영역 및 항원-결합 영역 이외에, 이뮤노글로불린 CH1 영역 및 CL 영역 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 또한 다중-특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체 또는 유사한 분자일 수 있다. 용어 "이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한, 전형적으로 비-중첩 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 에피토프는 동일하거나 상이한 표적에 있을 수 있다. 에피토프가 상이한 표적에 있는 경우, 그러한 표적은 동일한 세포 또는 상이한 세포 또는 세포 유형에 있을 수 있다. 상기 표시된 바와 같이, 문맥상 달리 언급되거나 명백하게 모순되지 않는 한, 본원의 용어 항체는 Fc-영역의 적어도 일부분을 포함하고 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 임의의 공지된 기술, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성 및 재조합 발현 기술에 의해 제공될 수 있다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 "Ab" 또는 "항체" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 1가 항체 [젠맙(Genmab)에 의해 WO2007059782에 기재됨]; 2개의 중쇄로만 이루어지고, 예를 들어 낙타과에서 자연 발생하는 중쇄 항체 (예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446]); 티오Mab [로슈(Roche), WO2011069104]; 비대칭적 및 이중특이적 항체-유사 분자인 가닥 교환 조작된 도메인 (SEED 또는 시드바디) [머크(Merck), WO2007110205]; 트리오맙(Triomab) [파르마/프레세니우스 바이오테크(Pharma/Fresenius Biotech), 문헌 (Lindhofer et al. 1995 J Immunol 155:219); WO2002020039]; FcΔAdp [리제네론(Regeneron), WO2010151792], 아지메트릭 스캐폴드(Azymetric Scaffold) [지메웍스(Zymeworks)/머크, WO2012/058768], mAb-Fv [젠코르(Xencor), WO2011/028952], Xmab (젠코르); 이중 가변 도메인 이뮤노글로불린 [애보트(Abbott), DVD-Ig, 미국 특허 번호 7,612,181]; 이중 도메인 더블 헤드 항체 [유니레버(Unilever); 사노피 아벤티스(Sanofi Aventis), WO20100226923]; 디-디아바디 [임클론/일라이 릴리(ImClone/Eli Lilly)]; 놉-인투-홀 항체 포맷 [제넨테크(Genentech), WO9850431]; 듀오바디(DuoBody) (젠맙, WO 2011/131746); 이중특이적 IgG1 및 IgG2 [화이자/리나트(Pfizer/Rinat), WO11143545]; DuetMab [메드이뮨(MedImmune), US2014/0348839]; 정전기 스티어링 항체 포맷 [암젠(Amgen), EP1870459 및 WO 2009089004; 추가이(Chugai), US201000155133; 온코메드(Oncomed), WO2010129304A2]; 이중특이적 IgG1 및 IgG2 [리나트 뉴로사이언시스 코포레이션(Rinat neurosciences Corporation), WO11143545]; 크로스MAb (로슈, WO2011117329); LUZ-Y (제넨테크); 바이클로닉 [메루스(Merus), WO2013157953]; 이중 표적화 도메인 항체 [GSK/도만티스(Domantis)]; 투-인-원 항체 또는 2개의 표적을 인식하는 이중 작용 Fab [제넨테크, 노브이뮨(NovImmune), 애디맙(Adimab)]; 가교된 Mab [카르마노스 암 센터(Karmanos Cancer Center)]; 공유적으로 융합된 mAb (AIMM); CovX-바디 (CovX/화이자); 피노(Fyno)mAb [코바젠(Covagen)/얀센 일락(Janssen ilag)]; DutaMab [두탈리스(Dutalys)/로슈]; iMab (메드이뮨); IgG-유사 이중특이적 (임클론/일라이 릴리; 문헌 [Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74]); TIG-바디, DIG-바디 및 PIG-바디 [파르맙신(Pharmabcine)]; 이중 친화성 재표적화 분자 [Fc-DART 또는 Ig-DART; 매크로제닉스(Macrogenics), WO/2008/157379, WO/2010/080538]; BEAT [글렌마크(Glenmark)]; 지바디(Zybodies) [진게니아(Zyngenia)]; 공통의 경쇄 [크루셀(Crucell)/메루스, US7262028] 또는 공통의 중쇄 (κλ바디; 노브이뮨, WO2012023053)를 이용한 접근 방식 뿐만 아니라 Fc-영역 유사 scFv-융합물을 함유하는 항체 단편과 융합된 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질, 예컨대 BsAb [지모제네틱스(ZymoGenetics)/BMS], HERCULES [바이오젠 아이덱(Biogen Idec)] (US007951918); SCORPIONS [이머전트 바이오솔루션즈(Emergent BioSolutions)/트루비온(Trubion) 및 지모제네틱스/BMS]; Ts2Ab (메드이뮨/AZ (문헌 [Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92])); scFv 융합물 (제넨테크/로슈); scFv 융합물 [노바르티스(Novartis)]; scFv 융합물 [이뮤노메딕스(Immunomedics)]; scFv 융합물 [창저우 아담 바이오텍 인크(Changzhou Adam Biotech Inc)] (CN 102250246); TvAb (로슈, WO 2012025525, WO 2012025530); mAb2 (f-Star, WO2008/003116); 및 이중 scFv-융합물을 포함하나 제한되지 않는다. 용어 항체는 달리 명시되지 않는 한, 모노클로날 항체 (예컨대 인간 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일특이적 항체 (예컨대 2가 단일특이적 항체), 이중특이적 항체, 임의의 이소타입 및/또는 알로타입의 항체; 예를 들어, 심포젠(Symphogen) 및 메루스에 의해 이용된 기술 [올리고클로닉스(Oligoclonics)]에 의해 생성된 항체 혼합물 (재조합 폴리클로날), WO2015/158867에 기재된 바와 같은 다량체성 Fc 단백질, 및 WO2014/031646에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이들 상이한 항체 단편 및 포맷은 일반적으로, 항체의 의미 내에 포함되지만, 이들은 집합적으로 및 각각 독립적으로 상이한 생물학적 특성 및 유용성을 나타내는 본 발명의 독특한 특색이다.
자연 수용체에 대한 "효능작용 항체"는 수용체와 결합하여 수용체-항체 복합체를 형성하고 상기 수용체를 활성화시킴으로써, 경로 신호전달 및 추가의 생물학적 프로세스를 개시하는 화합물이다.
용어 "효능작용" 및 "효능작용"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 직접적으로 또는 간접적으로 CD27 생물학적 활성 또는 활성화를 실질적으로 유도, 촉진 또는 향상시킬 수 있는 항체를 지칭하거나 설명한다. 임의적으로, "효능작용 CD27 항체"는 CD70 (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 7, TNFSF7; CD27 리간드, CD27L)으로서 공지된 CD27에 대한 리간드와 유사한 메커니즘에 의해 CD27 수용체를 활성화할 수 있는 항체이며, 이는 NF-KB 및 MAPK8/JNK 경로의 활성화를 포함할 수 있는 하나 이상의 세포내 신호전달 경로의 활성화를 초래한다. 본원에 정의된 바와 같은 "효능작용"은 본원의 실시예 2에 따라 결정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 "CD27 항체" 또는 "항-CD27 항체"는 단백질 CD27, 특히 인간 CD27과 특이적으로 결합하는 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "변이체"는 모 또는 참조 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 변이체는, 예를 들어, 모 또는 참조 서열과 적어도 80%, 예컨대 90%, 또는 95%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한 또는 대안적으로, 변이체는 모 또는 참조 서열과 아미노산 잔기 12개 이하, 예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 돌연변이(들), 예컨대 치환, 삽입 또는 결실만큼 상이할 수 있다. 따라서, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "변이체 항체" 또는 "항체 변이체"는 모 또는 참조 항체와 비교 시, 예를 들어, 항원-결합 영역, Fc-영역 또는 둘 다에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 항체를 지칭한다. 마찬가지로, "변이체 Fc 영역" 또는 "Fc 영역 변이체"는 모 또는 참조 Fc 영역과 비교 시, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 Fc 영역을 지칭하며, 임의적으로 모 또는 참조 Fc 영역 아미노산 서열과 아미노산 잔기 12개 이하, 예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 돌연변이(들), 예컨대 치환, 삽입 또는 결실만큼 상이하다. 모 또는 참조 Fc 영역은 전형적으로, 문맥에 따라 특정한 이소타입일 수 있는 인간 야생형 항체의 Fc 영역이다. 변이체 Fc 영역은 이량체화된 형태로 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있으며, 예를 들어, 여기서 이량체화된 Fc 영역의 아미노산 서열 중 하나는 돌연변이를 포함하는 반면, 다른 하나는 모 또는 참조 야생형 아미노산 서열과 동일하다. Fc 영역 아미노산 서열을 포함하는 야생형 (전형적으로 모 또는 참조 서열) IgG CH 및 변이체 IgG 불변 영역 아미노산 서열의 예가 표 3에 제시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이뮤노글로불린 중쇄" 또는 "이뮤노글로불린의 중쇄"는 이뮤노글로불린의 중쇄 중 하나를 지칭하는 것으로 의도된다. 중쇄는 전형적으로 이뮤노글로불린의 이소타입을 규정하는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로서 약칭됨)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로, CH1, CH2 및 CH3의 3가지 도메인으로 구성된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "이뮤노글로불린"은 두 쌍의 폴리펩티드 쇄, 즉 한 쌍의 경쇄 (L) 저 분자량 쇄 및 한 쌍의 중쇄 (H)로 이루어진 구조적으로 관련된 당단백질의 특정 클래스를 지칭하는 것으로 의도되며, 4개 모두는 잠재적으로 디술피드 결합에 의해 상호-연결된다. 이뮤노글로불린의 구조는 널리 특징 규명되었다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 Paul, W., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] 참조). 이뮤노글로불린의 구조 내에서, 2개의 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디술피드 결합을 통해 상호-연결된다. 중쇄와 동등하게, 각각의 경쇄는 전형적으로, 여러 영역; 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로, 하나의 도메인, CL로 구성된다. 더욱이, VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는, 보다 보존되는 영역과 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되기도 하는 초가변성 영역 (또는 구조적으로 정의된 루프의 형태 및/또는 서열에 있어서 초가변일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서부터 카르복시-말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된다. 본원의 CDR 서열은 IMGT에 따라 정의된다 (문헌 [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999 and Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)] 참조).
본원에 사용되는 경우, 용어 "절반 분자", "Fab-아암" 및 "아암"은 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다. 이중특이적 항체가 제1 항체"로부터 유래된" 절반 분자 항체와 제2 항체"로부터 유래된" 절반 분자 항체를 포함하는 것으로 기재되는 경우, 용어 "로부터 유래된"은 이중특이적 항체가 임의의 공지된 방법에 의해, 상기 제1 및 제2 항체 각각으로부터의 상기 절반 분자를 재조합하여, 그 결과로 이중특이적 항체를 생성한다는 것을 나타낸다. 이러한 맥락에서, "재조합"은 임의의 특정한 재조합 방법에 의해 제한되도록 의도되지 않으며, 따라서 예를 들어 관련 기술분야에서 "Fab-아암 교환"으로서 기재된 "절반 분자 교환"에 의한 재조합 및 듀오바디® 방법 뿐만 아니라 핵산 수준에서의 재조합 및/또는 동일한 세포에서 2개의 절반 분자의 공동 발현을 포함한, 하기 본원에 기재된 이중특이적 항체를 생산하는 모든 방법을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항원-결합 영역" 또는 "결합 영역" 또는 항원-결합 도메인은 항원과 결합할 수 있는 항체의 영역을 지칭한다. 이러한 결합 영역은 전형적으로, 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는, 보다 보존되는 영역과 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되기도 하는 초가변성 영역 (또는 구조적으로 정의된 루프의 형태 및/또는 서열에 있어서 초가변일 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있는 항체의 VH 및 VL 도메인에 의해 정의된다. 항원은 임의의 분자, 예컨대 폴리펩티드일 수 있고, 예를 들어 세포, 박테리움 또는 비리온 상에 제시된다. 용어 "항원-결합 영역" 및 "항원-결합 부위" 및 "항원-결합 도메인"은 문맥상 모순되지 않는 한 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "항원" 및 "표적"은 문맥상 모순되지 않는 한, 본 발명의 문맥에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결합"은, 전형적으로 리간드로서 항체를 사용하고 분석물로서 항원을 사용하는 생물층 간섭계에 의해 결정된 경우에, 1E6 M 이하, 예를 들어 5E7 M 이하, 1E7 M 이하, 예컨대 5E8 M 이하, 예컨대 1E8 M 이하, 예컨대 5E9 M 이하, 또는 예컨대 1E9 M 이하의 KD에 상응하는 결합 친화도로 미리 결정된 항원 또는 표적에 대한 항체의 결합을 지칭하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)과의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 10배 더 낮은, 예컨대 적어도 100배 더 낮은, 예를 들어 적어도 1,000배 더 낮은, 예컨대 적어도 10,000배 더 낮은, 예를 들어 적어도 100,000배 더 낮은 KD에 상응하는 친화도로 상기 미리 결정된 항원과 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "KD" (M)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하며, kd를 ka로 나눔으로써 수득된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "kd" (sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 koff 값 또는 오프-레이트로서 지칭되기도 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "ka" (M-1 x sec-1)는 특정한 항체-항원 상호작용의 연합 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 kon 값 또는 온-레이트로서 지칭되기도 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CD27"은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 7 (TNFRSF7)로서 공지되기도 한, CD27이라는 제목의 인간 단백질을 지칭한다. 서열식별번호: 1 (유니프로트 ID P26842)에 제시된 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기 1-19는 신호 펩티드이고, 아미노산 잔기 20-240은 성숙한 폴리펩티드이다. 문맥상 모순되지 않는 한, CD27은 CD27의 변이체, 그의 이소형 및 오르토로그를 지칭할 수도 있다. A59T 돌연변이를 포함하는 인간 CD27의 자연 발생 변이체는 서열식별번호: 2에 제시되어 있다.
시노몰구스 원숭이 [마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)]에서, CD27 단백질은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는다 (젠뱅크 XP_005569963). 서열식별번호: 3에 제시된 240개의 아미노산 서열에서, 신호 펩티드가 정의되어 있지 않다.
용어 "항체 결합 영역"은 항체가 결합하는 에피토프를 포함하는 항원의 영역을 지칭한다. 항체 결합 영역은 생물층 간섭계를 사용하는 에피토프 결합에 의해, 알라닌 스캔에 의해, 또는 셔플 검정 (항원의 영역이 또 다른 종의 영역과 교환되는 항원 구축물을 사용하고 항체가 여전히 항원과 결합하는지 여부를 결정함)에 의해 결정될 수 있다. 항체와의 상호작용에 관여하는 항체 결합 영역 내의 아미노산은 수소/중수소 교환 질량 분석법 및 항원과 결합된 항체의 결정학에 의해 결정될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상적으로, 분자, 예컨대 아미노산, 당 측쇄 또는 그의 조합의 표면 그룹으로 이루어지며, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 가지고 있다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기 및 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 항원과 결합될 때 항체에 의해 효과적으로 차단되거나 덮이는 아미노산 잔기 (즉, 아미노산 잔기는 특이적 항체의 풋프린트 내에 있거나 밀접하게 인접해 있음)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "모노클로날 항체", "모노클로날 Ab", "모노클로날 항체 조성물", "mAb" 등은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 표시한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 표시하는 항체를 지칭한다. 인간 모노클로날 항체는 불멸화된 세포와 융합된, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스-염색체 비-인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스 또는 래트로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 재조합적으로 변형된 숙주 세포, 또는 항체를 코딩하는 핵산 서열의 시험관내 전사 및/또는 번역을 지원하는 세포 추출물을 사용하는 시스템으로부터 생산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 클래스 (예를 들어 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM) 또는 그의 임의의 알로타입, 예컨대 IgG1m(za) 및 IgG1m(f)을 지칭한다. 추가로, 각각의 중쇄 이소타입은 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 경쇄와 조합될 수 있다.
본원에 사용된 경우 용어 "전체 길이 항체"는 항체가 단편이 아니지만 자연에서 그 이소타입에 대해 정상적으로 발견되는 특정한 이소타입의 모든 도메인, 예를 들어 IgG1 항체에 대한 VH, CH1, CH2, CH3, 힌지, VL 및 CL 도메인을 함유한다는 것을 나타낸다. 전체 길이 변이체 항체에서, 중쇄 및 경쇄 불변 및 가변 도메인은 특히, 전체 길이 모 항체 또는 야생형 항체와 비교할 때 항체의 기능적 특성을 개선시키는 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 전체 길이 항체는 (i) 완전한 중쇄 서열 및 완전한 경쇄 서열을 포함하는 적합한 벡터에 CDR 서열을 클로닝하는 단계, 및 (ii) 적합한 발현 시스템에서 완전한 중쇄 및 경쇄 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다. CDR 서열 또는 전체 가변 영역 서열로부터 시작할 때 전체 길이 항체를 생산하는 것은 통상의 기술자의 지식 범위 내에 있다. 따라서, 통상의 기술자는 본 발명에 따른 전체 길이 항체를 생성하는 방법을 알고 있을 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 프레임워크 영역 및 인간 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함하는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 도입되거나 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 삽입 또는 결실) 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인간 항체"는 또 다른 비-인간 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상으로 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간화 항체"는 인간 가변 도메인과 높은 수준의 서열 상동성을 함유하도록 변형된 비-인간 가변 도메인 및 인간 항체 불변 도메인을 함유하는, 유전적으로 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 이는, 함께 항원 결합 부위를 형성하는 6개의 비-인간 항체 상보성 결정 영역 (CDR)을 상동 인간 수용자 프레임워크 영역 (FR) 상으로 이식함으로써 달성될 수 있다 (WO92/22653 및 EP0629240 참조). 모 항체의 결합 친화성과 특이성을 완전히 재구성하기 위해서는, 모 항체 (즉, 비-인간 항체)로부터의 프레임워크 잔기를 인간 프레임워크 영역으로 치환시키는 것 (복귀-돌연변이)이 요구될 수 있다. 구조적 상동성 모델링은 항체의 결합 특성에 중요한 프레임워크 영역 내의 아미노산 잔기를 확인하는데 도움을 줄 수 있다. 따라서, 인간화 항체는 비-인간 CDR 서열, 주로 비-인간 아미노산 서열로의 하나 이상의 아미노산 복귀-돌연변이를 임의적으로 포함하는 인간 프레임워크 영역, 및 전체 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 임의적으로, 반드시 복귀-돌연변이는 아닌 부가의 아미노산 변형을 적용하여, 바람직한 특징, 예컨대 친화성 및 생화학적 특성을 수반한 인간화 항체를 수득할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 항체의 N-말단 끝에서 C-말단 끝의 방향으로, 적어도 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역의 영역을 지칭한다. 항체의 Fc 영역은 면역 체계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포)를 포함한 숙주 조직 또는 인자 및 보체 시스템의 성분에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "모 폴리펩티드" 또는 "모 항체"는 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체와 동일하지만 문맥상 달리 언급되지 않거나 명백히 모순되지 않는 한, 모 폴리펩티드 또는 모 항체에 돌연변이가 없는 폴리펩티드 또는 항체로서 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 IgG1-CD27-A는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 모 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "힌지 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 힌지 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)]에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링 (Eu-지수)에 따른 아미노산 216-230에 상응한다. 그러나, 힌지 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 하위유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CH1 영역" 또는 "CH1 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH1 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH1 영역은 상기 카바트(Kabat) 문헌에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 118-215에 상응한다. 그러나, CH1 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 하위유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH2 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 상기 카바트 문헌에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 하위유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 이뮤노글로불린 중쇄의 CH3 영역을 지칭한다. 따라서, 예를 들어 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 상기 카바트 문헌에 제시된 바와 같은 Eu 넘버링에 따른 아미노산 341-447에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 본원에 기재된 바와 같은 다른 하위유형 중 임의의 것일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Fc-매개된 이펙터 기능" 또는 "Fc 이펙터 기능"은 상호교환가능하게 사용되며, 세포막 상의 그의 표적 또는 항원에 대한 폴리펩티드 또는 항체의 결합의 결과인 기능을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 Fc-매개된 이펙터 기능은 상기 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있다. Fc-매개된 이펙터 기능의 예는 (i) C1q 결합, (ii) 보체 활성화, (iii) 보체-의존적 세포독성 (CDC), (iv) 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), (v) Fc-감마 수용체 (FcγR)-결합, (vi) 항체-의존적 FcγR-매개된 항원 가교, (vii) 항체-의존적 세포성 식균작용 (ADCP), (viii) 보체-의존적 세포성 세포독성 (CDCC), (ix) 보체-향상된 세포독성, (x) 항체에 의해 매개된 옵소닌화된 항체의 보체 수용체에 대한 결합, (xi) 옵소닌화, 및 (xii) (i) 내지 (xi) 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "감소된 Fc 이펙터 기능(들)" 또는 "감소된 Fc-매개된 이펙터 기능"은 상호교환가능하게 사용되며 동일한 검정에서 모 폴리펩티드 또는 항체의 Fc 이펙터 기능과 직접 비교할 때 항체에 대해 감소되는 Fc 이펙터 기능을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "불활성", "불활성의" 또는 "비-활성화"는 적어도 임의의 FcγR과 결합할 수 없거나, FcγR의 Fc-매개된 가교를 유도할 수 없거나, 또는 개별 항체의 두 Fc 영역을 통해 표적 항원의 FcγR-매개된 가교를 유도할 수 없거나, 또는 C1q와 결합할 수 없는 Fc 영역을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서 Fc 영역은 불활성이다. 따라서, 특정 실시양태에서 Fc-매개된 이펙터 기능의 일부 또는 전부는 약화되거나 완전히 부재한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고머화"는 단량체를 유한한 중합도로 전환시키는 프로세스를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명에 따른 항체는 표적 결합 후, 예를 들어 세포 표면에서 Fc-영역의 비-공유 연합을 통해 올리고머, 예컨대 육량체를 형성할 수 있다. Fc:Fc 상호작용을 통한 세포 표면 결합 시 항-CD27 항체의 올리고머화는 CD27 클러스터링을 증가시켜 CD27 세포내 신호전달의 활성화를 초래할 수 있다. 세포 표면 결합 시 올리고머, 예컨대 육량체를 형성할 수 있는 E345R 또는 E430G 돌연변이를 포함하는 항체의 능력은 문헌 [de Jong RN et al., PLoS Biol. 2016 Jan 6;14(1):e1002344]에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 항체의 Fc-Fc-매개된 올리고머화는 이웃 항체 간의 Fc-영역의 분자간 연합을 통해 (세포) 표면에 표적이 결합한 후에 발생하며 E345R 또는 E430G 돌연변이 (Eu-지수에 따른 넘버링)의 도입에 의해 증가된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "클러스터링"은 비-공유 상호작용을 통한 항체의 올리고머화를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fc-Fc 향상"은 항체가 2개의 Fc-영역 함유 항체의 Fc 영역 간의 결합 강도를 증가시키거나 이러한 Fc 영역 간의 상호작용을 안정화시켜, 항체가 세포 표면 상에 올리고머, 예컨대 육량체를 형성하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 향상은 항체의 Fc 영역 내의 특정 아미노산 돌연변이, 예컨대 E345R 또는 E430G에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 용어 "1가 항체"는 단 하나의 항원 결합 도메인 (예를 들어 하나의 Fab 아암)을 갖는 항원 상의 특이적 에피토프와 상호작용할 수 있는 항체 분자를 지칭한다. 이중특이적 항체와 관련하여, "1가 항체 결합"은 단 하나의 항원 결합 도메인 (예를 들어 하나의 Fab 아암)을 갖는 항원 상의 하나의 특이적 에피토프에 대한 이중특이적 항체의 결합을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "단일특이적 항체"는 단 하나의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 항체는 단일특이적, 1가 항체 (즉, 단 하나의 항원 결합 영역을 보유함) 또는 단일특이적, 2가 항체 (즉, 2개의 동일한 항원 결합 영역을 갖는 항체)일 수 있다.
용어 "이중특이적 항체"는 2개의 비-동일한 항원 결합 도메인, 예를 들어 2개의 비-동일한 Fab-아암 또는 비-동일한 CDR 영역을 갖는 2개의 Fab-아암을 포함하는 항체를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖는다. 이러한 에피토프는 동일하거나 상이한 항원 또는 표적에 있을 수 있다. 에피토프가 상이한 항원에 있는 경우, 그러한 항원은 동일한 세포 또는 상이한 세포, 세포 유형 또는 구조, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 소포 및 가용성 단백질에 있을 수 있다. 따라서 이중특이적 항체는 다중 항원, 예를 들어 2개의 상이한 세포를 가교시킬 수 있다. 본 발명의 특정한 이중특이적 항체는 CD27 및 제2 표적과 결합할 수 있다.
용어 "2가 항체"는 1개 또는 2개의 표적 또는 항원 상의 에피토프와 결합하거나 동일한 항원 상의 1개 또는 2개의 에피토프와 결합하는 2개의 항원 결합 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 따라서, 2가 항체는 단일특이적, 2가 항체 또는 이중특이적, 2가 항체일 수 있다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있으며 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 아미노산은 각각의 아미노산에 특이적인 측쇄 (R 기)와 함께 아민 (-NH2) 및 카르복실 (-COOH) 작용기를 함유하는 유기 화합물이다. 본 발명의 맥락에서, 아미노산은 구조 및 화학적 특징을 기반으로 하여 분류될 수 있다. 따라서, 아미노산의 클래스는 하기 표 중 하나 또는 둘 다에 반영될 수 있다:
표 1. R 기의 구조 및 일반적인 화학적 특징을 기반으로 한 주요 분류
Figure pct00001
표 2. 아미노산 잔기의 대체 물리적 및 기능적 분류
Figure pct00002
하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 치환하는 것은 보존적 또는 비-보존적 치환으로서 분류될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "보존적 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것이며, 이러한 치환은 하나의 아미노산 잔기를 상기 2개의 표 중 임의의 것에서 정의된 바와 동일한 클래스의 또 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이며: 예를 들어, 류신은 이소류신으로 치환될 수 있는데, 이는 이들이 둘 다 지방족의 분지된 소수성 물질이기 때문이다. 유사하게, 아스파르트산은 글루탐산으로 치환될 수 있는데, 이는 이들이 둘 다 작고 음으로 하전된 잔기이기 때문이다.
본 발명의 맥락에서, 항체에서의 치환은 하기와 같이 표시된다:
원래 아미노산 - 위치 - 치환된 아미노산;
아미노산에 대해 널리 인식된 명명법을 참조하면, 3 문자 코드 또는 1 문자 코드가 사용되며, 이는 임의의 아미노산 잔기를 나타내는 코드 "Xaa" 또는 "X"를 포함한다. 따라서, Xaa 또는 X는 전형적으로 20개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것을 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "자연 발생"은 하기 아미노산 잔기 중 어느 하나를 지칭한다: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 및 시스테인. 따라서, 표기 "K409R" 또는 "Lys409Arg"는 항체가 아미노산 위치 409에서 리신이 아르기닌으로 치환된 것을 포함한다는 것을 의미한다.
주어진 위치에서의 아미노산이 임의의 다른 아미노산으로 치환되는 것은 하기와 같이 지칭된다:
원래 아미노산 - 위치; 또는 예를 들어 "K409"
원래 아미노산(들) 및/또는 치환된 아미노산(들)이 하나 초과의 아미노산을 포함할 수 있지만 모든 아미노산(들)을 포함하지 않는 변형의 경우, 하나 초과의 아미노산은 "," 또는 "/"로 구분할 수 있다. 예를 들어, 위치 409에서 리신이 아르기닌, 알라닌 또는 페닐알라닌으로 치환된 경우는 하기와 같다:
"Lys409Arg,Ala,Phe" 또는 "Lys409Arg/Ala/Phe" 또는 "K409R,A,F" 또는 "K409R/A/F" 또는 "K409에서 R, A, 또는 F로".
이러한 지명은 본 발명의 맥락에서 상호교환가능하게 사용될 수 있지만 동일한 의미와 목적을 갖는다.
더욱이, 용어 "치환"은 임의의 하나 또는 다른 19개의 자연 아미노산으로의 치환, 또는 다른 아미노산, 예컨대 비-자연 아미노산으로의 치환을 포괄한다. 예를 들어, 위치 409에서 아미노산 K의 치환은 하기 치환 각각을 포함한다: 409A, 409C, 409D, 409E, 409F, 409G, 409H, 409I, 409L, 409M, 409N, 409Q, 409R, 409S, 409T, 409V, 409W, 409P, 및 409Y. 그런데, 이는 지명 409X와 동일하며, 여기서 X는 원래 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지정한다. 이들 치환체는 또한 K409A, K409C 등 또는 K409A,C 등 또는 K409A/C/등으로 지정될 수 있다. 이는 이러한 치환 중 어느 하나를 본원에 구체적으로 포함하기 위해, 본원에 언급된 각각의 위치 및 모든 위치에 유추적으로 적용된다.
본 발명에 따른 항체는 또한 아미노산 잔기의 결실을 포함할 수 있다. 이러한 결실은 "del"로 표시될 수 있으며, 예를 들어 K409del로서 표기되는 것을 포함한다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 위치 409에서의 리신이 아미노산 서열로부터 결실되었다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정한 대상체 세포 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다는 것을 이해해야 한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들어, 형질감염 세포, 예컨대 CHO 세포, HEK-293 세포, Expi293F 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, 및 림프구 세포, 및 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 진핵 숙주, 예컨대 식물 세포 및 진균을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "형질감염 세포"는 항체 또는 표적 항원을 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, HEK-293 세포, Expi293F 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함한 진균을 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 간의 서열 동일성은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 이상의 니들(Needle) 프로그램에서 구현된 바와 같은 니들만-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (문헌 [Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453])을 사용하여 결정된다. 사용된 파라미터는 갭 오픈 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성" (-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)으로 표지된 니들의 출력은 동일성 퍼센트로서 사용되며 하기와 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 내의 갭의 총 수).
유사한 잔기의 보유는 또한 또는 대안적으로 BLAST 프로그램 (예를 들어, 표준 설정 BLOSUM62, 오픈 갭=11 및 연장된 갭=1을 사용하여 NCBI를 통해 이용가능한 BLAST 2.2.8)을 사용하여 결정된 바와 같은, 유사성 점수로써 측정될 수 있다. 적합한 변이체는 전형적으로 모 서열과 적어도 약 45%, 예컨대 적어도 약 55%, 적어도 약 65%, 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 (예를 들어, 약 99%)의 유사성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "내재화된" 또는 "내재화"는 분자, 예컨대 본 발명에 따른 항체가 세포막에 의해 삼켜지고 세포 내부로 유입되는 생물학적 프로세스를 지칭한다. 내재화는 "세포내 이입"으로서 지칭될 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 이펙터 시기에 관여하는 면역 세포를 지칭한다. 예시적인 면역 세포는 골수성 또는 림프계 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대 B 세포 및 세포 용해성 T 세포 (CTL)를 포함한 T 세포), 살해 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 다형핵 세포, 예컨대 호중구, 과립구, 비만 세포 및 호염기구를 포함한다. 일부 이펙터 세포는 Fc 수용체 (FcgR) 또는 보체 수용체를 발현하고 특이적 면역 기능을 수행한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포, 예컨대 예를 들어, 자연 살해 세포는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcgR을 발현하는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포 및 쿠퍼(Kupffer) 세포는 표적 세포의 특이적 사멸 및/또는 면역 체계의 다른 성분에 항원을 제시하거나 또는 항원을 제시하는 세포와 결합하는데 관여한다. 일부 실시양태에서 ADCC는 항체 구동된 고전적 보체 활성화에 의해 추가로 향상되어, 활성화된 C3 단편이 표적 세포 상에 침착된다. C3 절단 산물은 골수성 세포 상에 발현된 보체 수용체 (CR), 예컨대 CR3에 대한 리간드이다. 이펙터 세포 상에서 CR에 의한 보체 단편의 인식은 향상된 Fc 수용체-매개된 ADCC를 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서 항체 구동된 고전적 보체 활성화는 표적 세포 상에 C3 단편을 초래한다. 이들 C3 절단 산물은 직접적인 보체-의존적 세포성 세포독성 (CDCC)을 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체 결합에 의존할 수 있고 이펙터 세포에 의해 발현된 FcγR에 의해 매개될 수 있는 표적 항원, 표적 입자 또는 표적 세포를 포식할 수 있다. 이펙터 세포 상에서의 특정한 FcR 또는 보체 수용체의 발현은 체액 인자, 예컨대 시토카인에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 γ (IFN γ) 및/또는 G-CSF에 의해 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 향상된 발현은 표적에 대항한 FcγRI 보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원을 포식할 수 있거나 또는 표적 세포를 포식하거나 용해시킬 수 있다. 일부 실시양태에서 항체 구동된 고전적 보체 활성화는 표적 세포 상에 C3 단편을 초래한다. 이들 C3 절단 산물은 이펙터 세포에 의한 직접 식균작용을 촉진시킬 수 있거나 또는 항체 매개된 식균작용을 향상시킴으로써 간접적으로 촉진시킬 수 있다. 항체가 불활성 Fc 영역을 갖는 본원의 특정 실시양태에서, 항체는 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "이펙터 T 세포" 또는 "Teffs" 또는 "Teff"는 예컨대 종양 세포를 사멸시키고/거나 신체로부터 종양 세포를 제거할 수 있는 항종양 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 면역 반응의 기능을 수행하는 T 림프구를 지칭한다. Teff 표현형의 예는 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+를 포함한다. Teff는 마커, 예컨대 IFNγ, 그랜자임 B 및 ICOS를 분비, 함유 또는 발현할 수 있다. Teff는 이러한 표현형에 완전히 제한되지 않을 수 있는 것으로 인지된다.
본원에 사용된 바와 같은 "기억 T 세포"는 감염이 제거된 후에도 장기간 동안 체내에 남아 있는 T 림프구를 지칭한다. 기억 T 세포의 예는 중심 기억 T 세포 (CD45RA-CCR7+) 및 이펙터 기억 T 세포 (CD45RA-CCR7-)를 포함한다. 기억 T 세포는 이러한 표현형에 완전히 제한되지 않을 수 있는 것으로 인지된다.
본원에 사용된 바와 같은 "조절성 T 세포" 또는 "Treg"는 통상적으로 그들의 활성을 억제함으로써 다른 T 세포(들) 및/또는 다른 면역 세포의 활성을 조절하는 T 림프구를 지칭한다. Treg 표현형의 예는 CD3+CD4+CD25+CD127dim이다. Treg는 Foxp3을 추가로 발현할 수 있다. Treg는 이러한 표현형에 완전히 제한되지 않을 수 있는 것으로 인지된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "보체 활성화"는 표면 상의 항체-항원 복합체와 결합하는 C1이라고 하는 큰 거대분자 복합체에 의해 개시되는 고전적인 보체 경로의 활성화를 지칭한다. C1은 6개의 인식 단백질 C1q와 세린 프로테아제의 이종사량체인 C1r2C1s2로 이루어지는 복합체이다. C1은 C4를 C4a 및 C4b로 절단하고 C2를 C2a 및 C2b로 절단하는 것으로 시작하는 일련의 절단 반응을 수반하는 고전적인 보체 캐스케이드의 초기 이벤트에서 제1 단백질 복합체이다. C4b는 침착되어 C2a와 함께, C3 전환효소라고 불리는 효소적 활성 전환효소를 형성하며, C3 전환효소는 보체 성분 C3을 C3b 및 C3a로 절단하여 C5 전환효소를 형성한다. 이러한 C5 전환효소는 C5를 C5a 및 C5b로 분할하고 마지막 성분은 막에 침착되며, 결국에는 말단 보체 성분 C5b, C6, C7, C8 및 C9가 막 공격 복합체 (MAC)로 어셈블리되는 보체 활성화의 후기 이벤트를 촉발시킨다. 보체 캐스케이드는 보체-의존적 세포독성 (CDC)으로서 공지되기도 하는, 세포의 용해를 유발하는 세포막 내에 구멍을 생성시킨다. 항체가 불활성 Fc 영역을 갖는 본원의 특정 실시양태에서, 항체는 보체 활성화를 유도하지 않는다.
보체 활성화는 C1q 결합 효능, CDC 동역학 CDC 검정 (WO2013/004842, WO2014/108198에 기재된 바와 같음)을 사용하거나 또는 문헌 [Beurskens et al., J Immunol April 1, 2012 vol. 188 no. 7, 3532-3541]에 기재된 C3b 및 C4b의 세포성 침착 방법에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "C1q 결합"은 그의 항원과 결합된 항체에 대한 C1q의 결합과 관련하여 C1q의 결합을 지칭하도록 의도된다. 그의 항원과 결합된 항체는 본원에 기재된 맥락에서 생체내 및 시험관내 둘 다에서 발생하는 것으로 이해되어야 한다. C1q 결합은 예를 들어 본원의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 인공 표면에 고정화된 항체를 사용하거나 또는 세포성 또는 비리온 표면 상의 미리 결정된 항원과 결합된 항체를 사용함으로써 평가될 수 있다. 항체 올리고머에 대한 C1q의 결합은 높은 결합력의 결합을 초래하는 다가 상호작용으로서 본원에서 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 내에서의 돌연변이 도입으로 인해 발생하는 C1q 결합의 감소는 돌연변이된 항체의 C1q 결합을 그의 모 항체 (동일한 검정 내에서 돌연변이가 없는 본 발명의 항체)의 C1q 결합과 비교함으로써 측정될 수 있다.
용어 "치료"는 증상 또는 질환 상태를 완화, 개선, 저지 또는 근절 (치유)할 목적으로 본 발명의 치료상 활성 항체의 유효량을 투여하는 것을 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "치료상 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 항체의 치료상 유효량은 요인, 예컨대 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료상 유효량은 또한, 치료학적으로 유익한 효과가 항체 변이체의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약동학적 프로파일"은 본원의 실시예 12에 기재된 바와 같이 시간 경과에 따른 혈장 IgG 수준으로서 결정될 수 있다.
본 발명의 구체적 실시양태
제1 측면에서 본 발명은 인간 CD27과 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체를 제공하며, 여기서 상기 항체는 서열식별번호: 5, 6, 및 7에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열식별번호: 9, 10 및 11에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 추가 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 5, 6, 및 7에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열식별번호: 9, 10 및 11에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 상기 항원-결합 영역 2개를 포함하는 항체를 제공한다. 이로써 인간 CD27과 결합할 수 있고 A59T의 돌연변이를 포함하는 인간 CD27의 변이체와 추가로 결합할 수 있는 항-CD27 항체가 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서 항체는 예를 들어, T 세포 상의 CD27과 결합하고, 그의 표적과 결합 시 효능작용을 한다. 이로써 T-세포의 활성화 및 증식을 자극하는 항체가 제공된다. 항체는 T-세포의 기억 형성과 생존을 추가로 자극할 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 암 치료에 유용하다. 항체는 추가로 항체의 독성학적 연구에 유용한 시노몰구스 CD27과 결합할 수 있다.
예를 들어, 표적 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키고, 그의 잠재적인 면역원성을 감소시키고/거나 숙주 세포에 의해 발현된 항체의 수율을 증가시키기 위해 항체의 VH 및 VL에서의 돌연변이가 이루어질 수 있다는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 CDR, VH 및/또는 VL 서열의 변이체, 특히 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 8에 각각 제시된 바와 같은 VH 및/또는 VL 영역의 기능적 변이체를 포함하는 항체가 고려된다. 기능적 변이체는 모 VH 및/또는 VL 서열과 비교 시 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 하나 이상의 CDR이 상이할 수 있지만, 여전히 항원-결합 영역이 적어도 상당한 비율 (적어도 약 50 퍼센트, 60 퍼센트, 70 퍼센트, 80 퍼센트, 90 퍼센트, 95 퍼센트 또는 그 초과)을 유지하도록 허용하거나 또는 심지어 모 항체의 모든 친화성 및/또는 특이성을 모두 유지하도록 허용한다. 전형적으로, 이러한 기능적 변이체는 모 서열과 상당한 서열 동일성을 유지한다. 예시적인 변이체는 각각의 모 VH 또는 VL 영역과 아미노산 잔기 12개 이하, 예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 돌연변이(들), 예컨대 치환, 삽입 또는 결실만큼 상이한 변이체를 포함한다. 예시적인 변이체는 주로 보존적 아미노산 치환에 의해 모 서열의 VH 및/또는 VL 및/또는 CDR 영역과 상이한 것을 포함하며; 예를 들어, 변이체 내에서의 아미노산 치환 중 12개, 예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개가 보존적일 수 있다. 본 발명의 추가 측면에서 항체는 VH CDR 영역 및/또는 VL CDR 영역에서 각각 최대 1, 2 또는 3개의 돌연변이를 포함할 수 있다. 그러한 돌연변이는 치환일 수 있다. 이러한 치환은 본 발명의 항-CD27 항체의 결합 친화도 및/또는 결합 특이성을 유의미하게 변화시키지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항-CD27 항체의 변이체를 포괄하며, 여기서 변이체는 서열식별번호: 5, 6, 및 7에 제시된 바와 같은 VH 영역 CDR 서열, 및 서열식별번호: 9, 10 및 11에 제시된 바와 같은 VL 영역 CDR 서열을 포함하는 항체와 동일한 기능적 특색을 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 VH 영역과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 항체는 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 8에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 측면에서 본 발명의 항체는 단리된 항체이다.
한 실시양태에서 항체는 인간 항체이다. 또 다른 실시양태에서 항체는 인간화 항체이다. 또 다른 측면에서 항체는 키메라 항체이다.
본 발명의 항체는 바람직한 실시양태에서 전체 길이 항체이다. 따라서, 본 발명의 항체는 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함할 수 있다. CH는 바람직하게는 CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 인간 카파 경쇄인 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서 이는 인간 람다 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 IgG 이소타입의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이는 변형된 인간 IgG 불변 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 이러한 인간 IgG는 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역 내의 IgG 불변 영역을 변형함으로써, 예를 들어 항체의 Fc 이펙터 기능을 조절하거나 Fc-Fc 상호작용을 증가시켜 항체가 클러스터, 예컨대 육량체를 형성하는 경향이 있게 하는 것이 가능하다. 본 발명의 한 측면에서 인간 IgG 또는 변형된 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택된다. 한 실시양태에서 이는 IgG1이다. 또 다른 측면에서 이는 IgG2이다. 또 다른 측면에서 이는 IgG3이다. 추가 측면에서 이는 IgG4이다. 한 특정한 측면에서 IgG는 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG이다. 한 실시양태에서 이는 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1일 수 있다. 본 발명의 추가 측면에서 IgG1은 Fc 영역에 2개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서 IgG1 Fc 영역은 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
본 발명의 추가 측면에서, 변형된 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 Fc 영역에 최대 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 최대 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 최대 8개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 최대 7개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 최대 6개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 최대 5개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 최대 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 최대 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서 이는 Fc 영역에 최대 2개의 아미노산 치환을 포함한다.
인간 IgG1 중쇄 내의 E430, E345 및 S440에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기에서의 돌연변이 (여기서 아미노산 잔기는 EU 지수에 따라 넘버링됨)는 CDC를 유도할 수 있는 항체의 능력을 개선시킬 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이들 위치에서의 하나 이상의 아미노산(들)을 치환함으로써 항체의 올리고머화가 자극될 수 있고, 이에 의해, 예를 들어, C1q 결합, 보체 활성화, CDC, ADCP, 내재화 또는 생체내 효능을 제공할 수 있는 다른 관련 기능(들)을 증가시키도록 Fc-매개된 이펙터 기능을 조정할 수 있는 것으로 여겨진다.
본 발명은 한 측면에서 항원-결합 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 변이체 항체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 인간 CD27과 결합하는 항체 변이체는 하기를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 E430, E345 및 S440 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄로서, 여기서 아미노산 잔기는 EU 지수에 따라 넘버링되는 것인 중쇄;
(b) 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄.
다른 특정 실시양태에서, 인간 CD27과 결합하는 항체 변이체는 하기를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 4를 포함하는 VH 영역, 및 E430, E345 및 S440 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄로서, 여기서 아미노산 잔기는 EU 지수에 따라 넘버링되는 것인 중쇄; 및
(b) 서열식별번호: 8을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄.
본 발명의 변이체 항체는 변이체 Fc 영역, 또는 P329, E430 및 E345 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함하는 변이체 인간 IgG1 CH 영역을 포함한다. 하기에서, Fc 영역 내의 돌연변이에 대한 언급은 인간 IgG1 CH 영역 내의 돌연변이(들)에 유사하게 적용될 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본원에 기재된 바와 같은, Fc 영역에서 돌연변이될 아미노산의 위치는 Eu 지수에 따라 넘버링될 때, 자연 발생 (야생형) 인간 IgG1 중쇄 내의 위치와 관련하여 (즉, 이러한 위치에 "상응하여") 제공될 수 있다. 따라서, 모 Fc 영역이 이미 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 경우 및/또는 모 Fc 영역이, 예를 들어, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역인 경우, 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산의 위치, 예컨대 예를 들어, Eu 지수에 따라 넘버링된 인간 IgG1 중쇄 내의 E430은 정렬에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 모 Fc 영역은 인간 IgG1 중쇄 서열 내의 E430에 상응하는 위치에서의 잔기를 확인하도록 야생형 인간 IgG1 중쇄 서열과 정렬된다. 임의의 야생형 인간 IgG1 불변 영역 아미노산 서열은 표 3에 제시된 상이한 인간 IgG1 알로타입 중 어느 하나를 포함하여 이러한 목적에 유용할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서 IgG Fc 영역에서의 변형은 동일한 이소타입, 예컨대 IgG1의 야생형 IgG Fc 영역을 포함하는 동일한 항체와 비교하여 증가된 CD27 효능작용을 유도한다. 이는 예를 들어 Eu 넘버링에 따라 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345 및/또는 E430에 상응하는 아미노산 위치에 E 이외의 아미노산을 도입함으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된다: A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, P, R, S, T, V, W 및 Y. 본 발명의 또 다른 측면에서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E430에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 하기를 포함하는 군으로부터 선택된다: A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, P, R, S, T, V, W.
바람직한 실시양태에서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 R이다. 따라서, 본 발명의 항체는 Fc 영역에 E345R 치환을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E430에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 G이다. 따라서, 본 발명의 항체는 Fc 영역에 E430G 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 E430G, E345K, E430S, E430F, E430T, E345Q, E345R, E345Y를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
이로써, 항체 결합 시 세포 표면에서 CD27의 항체-의존적 클러스터링을 초래하여 본 발명의 항체의 효능작용을 증가시킬 수 있는 향상된 Fc-Fc 상호작용을 갖는 항체가 제공된다.
본 발명의 항체의 또 다른 실시양태에서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 P329에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다. 따라서, 본 발명의 항체는 위치 329에서의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에서 항체는 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 P329에 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 R을 갖는다. 따라서, 본 발명의 항체는 Fc 영역에 P329R 치환을 가질 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, Fc 영역 (예를 들어 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같음)에 E345R 돌연변이를 포함하는 본 발명의 항체는 혈청 제거율이 증가된 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 위치 329에 돌연변이, 예를 들어 P329R (예를 들어 서열식별번호: 15에 제시된 바와 같음)을 추가로 도입하면 본 발명의 항체의 제거율이, 예를 들어 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같이 wt IgG1을 포함하는 항체의 수준으로 회복되었다는 것을 발견하였다.
또 다른 바람직한 실시양태에서 Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 P329 및 E345에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기는 둘 다 R이다. 이로써 위치 329에 야생형 아미노산 P를 포함하고 위치 345에 야생형 아미노산 E를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하고 동일한 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체와 비교할 때, 증가된 CD27 수용체 효능작용 및 필적하는 약동학적 특성, 예컨대 예를 들어 혈청 제거율을 갖는 항체가 제공된다.
따라서, 한 실시양태에서 본 발명은 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하지만 예를 들어 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 야생형 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체의 약동학적 특성과 비교할 때, CD27와 결합 시 증가된 수용체 효능작용을 갖고 필적하는 약동학적 특성, 예컨대 유사하거나 심지어 동일한 약동학적 특성을 추가로 갖는 CD27 결합 항체를 제공한다. 다시 말해서, 본 발명은 야생형 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 CD27 결합 항체의 약동학적 특성과 유의미하게 상이하지 않은 약동학적 특성을 갖는 CD27 결합 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 실시양태에서 항체는 이전 섹션 중 어느 하나에 따른 변이체 Fc 영역을 포함하며, 이러한 변이체 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 IgG Fc 영역의 변이체이다. 즉, E430, E345 및 P329에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 돌연변이는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 IgG Fc 영역인 모 Fc 영역에서 만들어진다. 바람직하게, 모 Fc 영역은 자연 발생 (야생형) 인간 IgG Fc 영역, 예컨대 인간 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역, 또는 그의 혼합된 이소타입이다. 따라서, 변이체 Fc 영역은, (E430 및 E345 및 P329로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서의) 나열된 돌연변이를 제외하고는, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입, 또는 그의 혼합된 이소타입일 수 있다.
한 실시양태에서, 모 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은 야생형 인간 IgG1 이소타입이다.
따라서, 변이체 Fc 영역은, (E430 또는 E345 또는 P329에서의) 나열된 돌연변이를 제외하고는, 인간 IgG1 Fc 영역일 수 있다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은 인간 야생형 IgG1m(f) 이소타입이다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은 인간 야생형 IgG1m(z) 이소타입이다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은 인간 야생형 IgG1m(a) 이소타입이다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은 인간 야생형 IgG1m(x) 이소타입이다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은 혼합된 알로타입의 인간 야생형 IgG1, 예컨대 IgG1m(za), IgG1m(zax), IgG1m(fa) 등이다.
따라서, 변이체 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은, (E430 또는 E345 또는 P329에서의) 나열된 돌연변이를 제외하고는, 인간 IgG1m(f), IgG1m(a), IgG1m(x), IgG1m(z) 알로타입 또는 그의 임의의 둘 이상의 혼합된 알로타입일 수 있다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역 및/또는 인간 IgG1 CH 영역은 인간 야생형 IgG1m(za) 이소타입이다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역은 인간 야생형 IgG2 이소타입이다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역은 인간 야생형 IgG3 이소타입이다.
구체적 실시양태에서, 모 Fc 영역은 인간 야생형 IgG4 이소타입이다.
야생형 인간 IgG 이소타입 및 IgG1 알로타입의 구체적 예의 CH 영역 아미노산 서열이 표 3에 제시된다.
또 다른 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 제공한다: 서열식별번호: 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 36. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 갖는다. 한 측면에서 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 갖는다.
한 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
c. 서열식별번호: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
d. 서열식별번호: 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
상기 항체의 대안적 실시양태에서 CL 영역은 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
한 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다:
e. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역
f. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
g. 서열식별번호: 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역 및
h. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 실시양태에서 본 발명에 따른 항체는 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 변형을 제외하고는 동일한 항체에 비해 더 적은 정도로 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하도록 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 그의 예는 P329R 및 E345R 치환을 포함하는 본 발명의 CD27 결합 항체이다. 이러한 항체는 P329R 치환을 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 서열을 포함하는 항체와 비교하고 또한 P329R 및 E345R 치환을 포함하지 않는 것, 예컨대 야생형 IgG1 중쇄를 제외하고는 동일한 서열을 포함하는 동일한 항체와 비교하여 더 적은 정도로 하나 이상의 Fc-매개된 이펙터 기능(들)을 유도시킨다. 한 실시양태에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 20%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 30%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 40%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 50%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 60%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 70%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 80%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 Fc-매개된 이펙터 기능은 적어도 90%만큼 감소된다. 또 다른 측면에서 항체는 하나 이상의 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하지 않는다. 감소되거나 전혀 유도되지 않는 하나 이상의 Fc-이펙터 기능은 하기 군: 보체-의존적 세포독성 (CDC), 보체-의존적 세포-매개된 세포독성 (CDCC), 보체 활성화, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개된 식균작용 (ADCP), C1q 결합 및 FcγR 결합으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 항체는 야생형 IgG1 HC 불변 영역을 제외하고는 동일한 항체에 비해 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되거나, 또는 적어도 90%만큼 감소되는 정도로 CDC를 유도한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 CDC를 유도하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 야생형 IgG1 HC 불변 영역을 갖는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비해 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되거나, 또는 적어도 90%만큼 감소되는 정도로 CDCC를 유도한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 CDCC를 유도하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 야생형 IgG1 HC 불변 영역을 갖는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비해 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되거나, 또는 적어도 90%만큼 감소되는 정도로 ADCC를 유도한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 ADCC를 유도하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 야생형 IgG1 HC 불변 영역을 갖는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비해 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되거나, 또는 적어도 90%만큼 감소되는 정도로 ADCP를 유도한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 ADCP를 유도하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 야생형 IgG1 HC 불변 영역을 갖는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비해 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되거나, 또는 적어도 90%만큼 감소되는 정도로 C1q 결합을 유도한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 C1q 결합을 유도하지 않는다. 바람직하게는 C1q 결합은 실시예 8에서와 같이 결정된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 야생형 IgG1 HC 불변 영역을 갖는 것을 제외하고는 동일한 항체에 비해 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되거나, 또는 적어도 90%만큼 감소되는 정도로 FcγR 결합을 유도한다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 FcγR 결합을 유도하지 않는다. 바람직하게는 FcγR 결합은 실시예 9에서와 같이 결정된다.
한 실시양태에서 본 발명의 항체는 P329R 치환을 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 C1q 결합 및 감소된 FcγR 결합을 갖는다.
한 실시양태에서, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체는, 상기 나열된 돌연변이를 제외하고는, 인간 항체이다.
본 발명의 한 실시양태에서 항체는 1가 항체이다.
또 다른 실시양태에서 항체는 2가 항체이다.
추가로, 본 발명의 항체는 단일특이적 항체일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체는 모노클로날 항체, 예컨대 인간 모노클로날 항체, 예컨대 인간 2가 모노클로날 항체, 예컨대 인간 2가 전체 길이 모노클로날 항체이다.
바람직한 실시양태에서, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체는, Fc 영역에서 임의적으로 나열된 돌연변이를 제외하고는, IgG1 항체, 예컨대 전체 길이 IgG1 항체, 예컨대 인간 전체 길이 IgG1 항체, 임의적으로 인간 모노클로날 전체 길이 2가 IgG1,κ 항체, 예를 들어 인간 모노클로날 전체 길이 2가 IgG1m(f),κ 항체이다.
본 발명에 따른 항체는 유리하게, 동일한 에피토프와 결합하는 2개의 항원-결합 영역을 포함하는 2가 단일특이적 포맷이다. 그러나, 항원-결합 영역 중 하나가 상이한 에피토프와 결합하는 이중특이적 포맷이 또한 고려된다. 따라서, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체는 문맥상 모순되지 않는 한, 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체일 수 있다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 인간 CD27과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 영역을 포함하고 인간 CD27 상의 상이한 에피토프와 결합할 수 있는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 인간 CD27과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 영역을 포함하고 상이한 표적과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체이다. 이러한 표적은 CD27과 상이한 세포에 있을 수 있거나 동일한 세포에 있을 수 있다.
본 발명의 한 측면에서 항체는 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 인간 CD27과 결합할 수 있다. 그러나, 인간 CD27은 일부 개체에서 그의 변이체로서 발현될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서 본 발명의 항체는 인간 CD27 변이체, 예컨대 예를 들어 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 인간 CD27 변이체와 추가로 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 시노몰구스 CD27과 추가로 결합할 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서 항체는 CD27-발현 인간 T 세포와 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 항체는 CD27-발현 시노몰구스 T 세포와 결합할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서 전체 길이 IgG1 항체는 잘려진 HC의 C-말단 리신을 갖는다. 이러한 항체는 또한 "전체 길이 항체"로 간주된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 항체는 인간 T 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T-세포, 예컨대 T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포의 증식을 유도할 수 있다. 이러한 활성은 본원의 실시예 6 또는 7에 기재된 바와 같이 검정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 항체는 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같은 인간 CD27-발현 Jurkat 리포터 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 항체는 본원의 실시예 11에 기재된 바와 같은 Fcγ 수용체 IIb 가교의 부재 하에 인간 CD27-발현 Jurkat 리포터 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 항체는 중심 기억 T 세포 표현형을 갖는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 항체는 IFN 감마 생산을 유도할 수 있다.
항체는 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있는 치료제로서 널리 공지되어 있다. 항체를 필요로 하는 대상체에게 항체를 투여하기 위한 또 다른 방법은 상기 항체의 생체내 발현을 위해 상기 항체를 코딩하는 핵산 또는 핵산의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
따라서 한 측면에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 중쇄는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 인간 IgG1 CH 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 중쇄는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 E430 및 E345 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하며, 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 상기 중쇄는 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 P329 및 E345 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하며, 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링된다.
한 측면에서 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 핵산 또는 핵산의 조합에 관한 것이다.
일부 실시양태에서 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산 또는 핵산의 조합에 관한 것이다:
a) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 항원-결합 영역, 및
b) 인간 IgG1 중쇄 내의 P329 및 E345에 상응하는 하나 또는 둘 다의 아미노산에서의 돌연변이를 포함하는 변이체 Fc 영역으로서, 여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링되는 것인 변이체 Fc 영역.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나의 핵산에 의해 코딩된다. 따라서, 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하나의 핵산 서열 또는 동일한 핵산 분자에 존재한다.
또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 핵산 서열의 조합, 전형적으로 2개의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서 상기 핵산 서열의 조합은 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 본 발명은 하기를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합에 관한 것이다:
a) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 P329 및 E345 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄로서, 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링되는 것인 중쇄;
b) 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나의 핵산에 의해 코딩된다. 따라서, 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하나의 핵산 또는 동일한 핵산 분자에 존재한다.
또 다른 실시양태에서 본 발명의 항체는 핵산 서열의 조합, 전형적으로 2개의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서 상기 핵산 서열의 조합은 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 핵산 서열은 치료용 단백질, 예컨대 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 공급하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA)일 수 있다. 치료용 단백질, 예컨대 항체의 생체내 발현에 적합한 DNA 및 DNA를 제조하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 문헌 [Patel A et al., 2018, Cell Reports 25, 1982-1993]에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 핵산은 리보핵산 (RNA), 예컨대 메신저 RNA (mRNA)일 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA는 자연 발생 뉴클레오티드 만을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 mRNA는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 변형된이란 자연 발생 뉴클레오티드와 화학적으로 상이한 상기 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서 mRNA는 자연 발생 뉴클레오티드와 변형된 뉴클레오티드 둘 다를 포함할 수 있다.
대상체에서 치료용 단백질, 예컨대 항체의 생체내 발현에 적합한 상이한 핵산 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 대상체에서 치료용 항체의 발현에 적합한 mRNA는 종종, 특이적 서열을 포함하는 비번역된 영역 (UTR)에 의해 플랭킹된 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하며, 5' 및 3' 말단은 캡 구조 및 폴리(A) 꼬리에 의해 형성된다 (예를 들어, 문헌 [Schlake et al., 2019, Molecular Therapy Vol. 27 No 4 April] 참조).
생체내 발현에 적합한 RNA 및 RNA 분자, 예를 들어, mRNA의 최적화를 위한 방법의 예는 US9254311; US9221891; US20160185840 및 EP3118224에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
생체내 발현을 위해 대상체에게 투여되는 네이키드 핵산 서열(들)은 분해되기 쉽고/거나 대상체에서 면역원성 반응을 유발하기 쉽다. 더욱이, 핵산 서열에 의해 코딩된 항체의 생체내 발현을 위해, 상기 핵산 서열은 전형적으로, 핵산 서열이 대상체의 세포에 유입되기에 적합한 형태로 투여된다. 생체내 발현을 위해 핵산 서열을 전달하기 위한 상이한 방법이 존재하며, 이는 기계적 및 화학적 수단을 수반하는 방법 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 이러한 방법은 피부 상에 핵산을 전기천공하거나 또는 문신을 하는 것을 수반할 수 있다 (Patel et al., 2018, Cell Reports 25, 1982-1993). 대상체에게 핵산 서열을 투여하는데 적합한 다른 방법은 핵산을 적합한 제형으로 투여하는 것을 수반한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 전달 비히클에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 전달 비히클은 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 따라서 한 실시양태에서 상기 핵산 서열은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 P329 및 E345 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄를 코딩할 수 있으며, 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 전달 비히클에 관한 것이다. 따라서 한 실시양태에서 상기 핵산 서열은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 전달 비히클 및 본 발명에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 전달 비히클을 포함하는 전달 비히클의 혼합물에 관한 것이다. 따라서 한 실시양태에서 상기 전달 비히클의 혼합물은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 E430 및 E345 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 전달 비히클 (여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링됨); 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 전달 비히클을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 전달 비히클은 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합을 포함한다.
따라서 한 실시양태에서 상기 전달 비히클은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 E430 및 E345 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄 (여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링됨); 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서 상기 전달 비히클은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 돌연변이 P329R 및 E345R을 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄 (여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링됨); 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서 상기 전달 비히클은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 WT 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄; 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 하나의 (동일한) 핵산 분자 내에 존재한다.
또 다른 실시양태에서 상기 전달 비히클은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 WT 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄를 코딩하는 핵산 서열; 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서 상기 전달 비히클은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 E430 및 E345 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄 (여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링됨)를 코딩하는 핵산 서열; 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서 상기 전달 비히클은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역, 및 P329R 및 E345R의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄 (여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링됨)를 코딩하는 핵산 서열; 및 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 항체 변이체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 별도의 또는 상이한 핵산 분자에 존재한다.
일부 실시양태에서 상기 전달 비히클은 지질 제형일 수 있다. 제형의 지질은 입자(들), 예컨대 지질 나노 입자(들) (LNP)일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합은 상기 입자 내에, 예를 들어, 상기 LNP 내에 캡슐화될 수 있다.
생체내 발현을 위해 대상체에게 핵산을 투여하기에 적합한 상이한 지질 제형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 지질 제형은 전형적으로, 지질, 이온화가능한 아미노 지질, PEG-지질, 콜레스테롤 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
치료용 항체의 발현을 위해 대상체에게 핵산 서열을 투여하기에 적합한 지질 제형를 제조하기 위한 다양한 형태 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 지질 제형의 예는 US20180170866 (Arcturus), EP 2391343 (Arbutus), WO 2018/006052 (Protiva), WO2014152774 (Shire Human Genetics), EP 2 972 360 (Translate Bio), US10195156 (Moderna) 및 US20190022247 (Acuitas)에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 측면 및 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 변이체를 코딩하는 단리된 핵산 서열 및 벡터 뿐만 아니라 이러한 변이체를 코딩하는 벡터 및 발현 시스템을 제공한다. 항체 및 그의 변이체에 적합한 핵산 구축물, 벡터 및 발현 시스템은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본 실시예에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 변이체 항체가 단일 폴리펩티드 (예를 들어, scFv-Fc 융합 단백질에서와 같음)에 함유되지 않고 별도의 폴리펩티드인 HC 및 LC를 포함하는 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이한 핵산 또는 벡터에 존재할 수 있다.
따라서, 한 측면에서 본 발명은 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 코딩하는 단리된 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합을 제공한다. 본 발명은 또한, 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
추가로, 본 발명은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
추가로, 본 발명은 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.
추가 측면에서 본 발명은 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 추가 측면에서 본 발명은 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 또 다른 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 영역 및 아미노산 잔기가 Eu 지수에 따라 넘버링된 P329 및/또는 E345의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH 영역을 포함하는 중쇄를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 또 다른 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL 영역 및 서열식별번호: 16에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 인간 카파 불변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 또 다른 측면에서 본 발명은 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL 영역 및 서열식별번호: 17에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 인간 람다 불변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합은 RNA 또는 DNA이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합은 mRNA이다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 핵산 서열 또는 그의 조합을 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 포유동물 세포에서의 발현에 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합에 관한 것이다.
추가 실시양태에서 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이며, 임의적으로 여기서 숙주 세포는 상기 기재된 발현 벡터를 포함한다. 특정 실시양태에서 재조합 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포이다.
또 다른 측면에서 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포를 배양 배지에서 및 항체 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 임의적으로, 배양 배지로부터 항체를 정제 또는 단리하는 단계를 포함하는, 본원의 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 핵산 또는 발현 벡터에 관한 것이다:
(i) 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체의 중쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(ii) 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체의 경쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(iii) (i)과 (ii) 둘 다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체 변이체의 중쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 또는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체의 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 임의적으로 동일한 숙주 세포에서 제1 및 제2 핵산의 조합 또는 제1 및 제2 발현 벡터의 조합에 관한 것이며, 여기서 제1은 (i)에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2는 (ii)에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 발현 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 핵산 벡터 (적합한 발현 제어 요소 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산은, 예를 들어, 선형 발현 요소 (예를 들어, 문헌 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355 59 (1997)]에 기재된 바와 같음), 압축된 핵산 벡터 (예를 들어, US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같음), 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "미지(midge)" 최소 크기 핵산 벡터 (예를 들어, 문헌 [Schakowski et al., Mol Ther 3, 793 800 (2001)]에 기재된 바와 같음)를 포함한 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터에 포함되거나, 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaP04-침전된 구축물 (예를 들어, WO200046147, 문헌 [Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551 55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), and Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)]에 기재된 바와 같음)로서 포함된다. 이러한 핵산 벡터 및 그의 사용 빈도는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참조).
한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 세포에서의 항체의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예는 발현 벡터, 예컨대 블루스크립트 [BlueScript; 스트라타젠(Stratagene)], pIN 벡터 (문헌 [Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503 5509 (1989)]), pET 벡터 [노바겐 (Novagen; 미국 위스콘신주 매디슨)] 등을 포함한다.
발현 벡터는 또한 또는 대안적으로, 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 이용될 수 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터를 포함한다 (문헌 [F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), and Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516 544 (1987)]에서 고찰됨).
발현 벡터는 또한 또는 대안적으로, 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터, 예를 들어, 선별가능한 마커로서 글루타민 신테타제를 포함하는 벡터, 예컨대 문헌 [Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175]에 기재된 벡터일 수 있다.
핵산 및/또는 벡터는 또한, 폴리펩티드, 예컨대 신생 폴리펩티드 쇄를 주변 세포질 공간으로 또는 세포 배양 배지로 표적화할 수 있는 분비/국재화 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있으며 분비 리더 또는 신호 펩티드를 포함한다.
발현 벡터는 임의의 적합한 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 촉진 요소를 포함하거나 이와 연합될 수 있다. 이러한 요소의 예는 강력한 발현 프로모터 (예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3 3, MMTV 및 HIV LTR 프로모터), 유효한 폴리 (A) 종결 서열, 이. 콜라이에서 플라스미드 산물에 대한 복제 기점, 선별가능한 마커로서의 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커)를 포함한다. 핵산은 또한 구성적 프로모터, 예컨대 CMV IE와는 대조적으로 유도성 프로모터를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체-코딩 발현 벡터는 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 또는 숙주 동물에 위치하고/거나 이에 전달될 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 바와 같은 항체를 생산하는 재조합 숙주 세포를 제공하며, 임의적으로 여기서 숙주 세포는 본 발명에 따른 단리된 핵산(들) 또는 벡터(들)를 포함한다. 전형적으로, 숙주 세포는 상기 핵산(들) 또는 벡터(들)로 형질전환되거나 형질감염되었다. 청구범위의 재조합 숙주 세포는, 예를 들어, 진핵 세포, 원핵 세포 또는 미생물 세포, 예를 들어, 형질감염 세포일 수 있다. 특정한 실시양태에서 숙주 세포는 진핵 세포이다. 특정한 실시양태에서 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 항체이다. 그러나, 대부분의 실시양태에서, 항체는 중쇄와 경쇄 둘 다를 함유할 것이므로, 상기 숙주 세포는 동일하거나 상이한 벡터 상에서 중쇄- 및 경쇄-코딩 구축물 둘 다를 발현한다.
숙주 세포의 예는 효모, 박테리아, 식물 및 포유동물 세포, 예컨대 CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6, NS0 세포, Sp2/0 세포 또는 림프구 세포를 포함한다. 한 실시양태에서 숙주 세포는 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 숙주 세포는 세포 게놈에 안정적으로 통합된 제1 및 제2 핵산 구축물을 포함할 수 있으며, 여기서 제1은 본원에 개시된 바와 같은 항체 변이체의 중쇄를 코딩하고 제2는 경쇄를 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 비-통합된 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공하며, 이는 상기에 명시된 바와 같은 제1 및 제2 핵산 구축물을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 단백질의 Asn-연결된 글리코실화가 가능한 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포이다.
한 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 항체 중쇄로부터 C-말단 리신 K447 잔기를 효율적으로 제거할 수 없는 숙주 세포이다. 예를 들어, 문헌 [Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426] (본원에 참조로 포함됨)의 표 2에는 다수의 이러한 항체 생산 시스템, 예를 들어, Sp2/0, NS/0 또는 트랜스제닉 유선 (염소)이 열거되며, 여기서는 C-말단 리신의 부분적인 제거 만이 수득된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포이다. 이러한 세포는 관련 기술분야에 보고되었으며, 본 발명의 변이체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1] 뿐만 아니라 EP1176195; WO03/035835; 및 WO99/54342를 참조한다. 조작된 글리코형을 생성하기 위한 부가의 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이는 문헌 [Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473], US6602684, WO00/61739A1; WO01/292246A1; WO02/311140A1; WO 02/30954A1)에 기재된 것; 포텔리젠트(Potelligent)™ 기술 [바이오와, 인크. (Biowa, Inc.; 미국 뉴저지주 프린스턴)]; 글리코MAb™ 글리코실화 조작 기술 [GLYCART 바이오테크놀로지 아게 (GLYCART biotechnology AG; 스위스 취리히)]; US 20030115614; 문헌 [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49]에 기재된 것 뿐만 아니라 WO2018/114877, WO2018/114878 및 WO2018/114879에 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
보다 더 추가 측면에서, 본 발명은 인간 중쇄 및 인간 경쇄의 1개 또는 2개 세트를 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물에 관한 것이며, 여기서 동물 또는 식물은 본원에 개시된 바와 같은 항체를 생산한다.
한 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능한 항체가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 인간 IgG1 중쇄의 Fc 영역에서 Eu-지수에 따라 넘버링된 E430, E345 및 P329에 상응하는 하나 이상의 아미노산 잔기(들)에서의 돌연변이를 항체 내로 도입하는 것을 포함하는, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 이펙터 기능을 증가 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 모 항체의 이펙터 기능, 예컨대 Fc-매개된 이펙터 기능을 증가시키거나 항체의 생물학적 활성, 예컨대 CD27 효능작용을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 모 항체는 Fc 영역 및 CD27과 결합하는 항원-결합 영역을 포함하고, 상기 방법은 인간 IgG1 중쇄의 Fc 영역 내의 E430 및 E345에 상응하는 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 Fc 영역 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링되며; 여기서 항원-결합 영역은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
다른 특정 실시양태에서, 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고 인간 IgG1 중쇄의 Fc 영역에서의 E345R의 아미노산 치환 (여기서 아미노산 잔기는 Eu 지수에 따라 넘버링됨)을 추가로 포함하는 모 항체의 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합 또는 FcgR 결합을 감소시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 Eu-지수에 따라 넘버링된, 인간 IgG1 중쇄의 P329에 상응하는 아미노산 위치에서의 Fc 영역에 추가의 아미노산 치환을 도입하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 상기 방법은 P329R의 치환을 포함한다. 이로써 모 항체의 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합 또는 FcgR 결합이 감소되거나 완전히 제거될 수 있다.
전술한 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 증가되는 이펙터 기능은 CD27 효능작용을 포함한다.
전술한 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 C1q 결합이다.
전술한 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 이펙터 기능은 FcgR 결합이다.
전술한 방법 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 감소되는 이펙터 기능은 C1q 결합과 FcgR 결합 둘 다를 포함한다.
전술한 방법 중 임의의 것의 한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 돌연변이는 E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y 및 P329K를 포함하는 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기(들)에서의 돌연변이는 E430G 또는 E345R을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
전술한 방법 중 임의의 것의 한 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 상기 나열된 돌연변이(들) 외에도, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역, 또는 그의 이소타입 혼합물이다. 임의적으로 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 및 서열식별번호: 36으로서 제시된 서열 중 하나의 Fc 영역을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 예를 들어, 항체는 인간 전체 길이 IgG1 항체, 임의적으로 인간 모노클로날 전체 길이 2가 IgG1,κ 항체일 수 있다. 부가적으로, 항체는 단일특이적 또는 이중특이적 항체, 예컨대 단일특이적 항체일 수 있다.
항체의 Fc 영역은 자연 발생 (야생형) 서열일 수 있지만, 일부 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 수득되거나 또는 수득가능한 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가 실시양태에서 본 발명에 따른 조성물은 전형적으로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다. 한 실시양태에서 제약 조성물은 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에서 정의된 바와 같은 항체, 또는 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 함유한다.
또한 추가 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다:
- 본원에 개시된 측면 및 실시양태 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 항체, 및
- 제약상 허용되는 담체.
한 실시양태에서 제약 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 임의의 측면 또는 실시양태에서 정의된 바와 같은 항체; 및 키트의 사용 지침을 포함하는 부분들의 키트, 예컨대 동반 진단으로서 사용하기 위한/환자 집단 내에서 본원에 정의된 바와 같은 항체를 사용한 치료에 반응하는 경향이 있는 환자를 확인하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 요법에 사용하기 위한 부분들의 키트에 관한 것이며, 임의적으로 여기서 부분들의 키트는 항체의 1회 초과의 투여량을 함유한다.
한 실시양태에서, 부분들의 키트는 하나 이상의 용기, 예컨대 바이알에 이러한 항체 또는 조성물을 포함한다.
한 실시양태에서, 부분들의 키트는 요법에서 동시에, 별도로 또는 순차적으로 사용하기 위한 이러한 항체 또는 조성물을 포함한다.
본 발명의 항체는 CD27을 발현하는 면역 세포를 활성화시킴으로써 치료될 수 있는 질환 및 장애의 치료를 수반하는 수많은 치료적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 항체는 다양한 장애 및 질환을 치료 또는 예방하기 위해, 배양 중인 세포에, 예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여될 수 있거나, 또는 인간 대상체에게, 예를 들어, 생체내 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 항체로부터 혜택을 얻거나 항체에 반응할 수 있는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체는 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포 집단이 확장되도록 CD27 기능을 조정함으로써 교정되거나 개선될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 인간 환자를 포함할 수 있다. 따라서, 항체는 T-세포 집단, 예컨대 T-헬퍼 세포 및 세포독성 T-세포의 생체내 또는 시험관내 증식을 유도하는데 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산 또는 핵산의 조합, 본 발명에 따른 전달 비히클, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 본 발명에 따른 조성물, 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산 또는 핵산의 조합, 본 발명에 따른 전달 비히클, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 본 발명에 따른 조성물, 또는 본 발명에 따른 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산 또는 핵산의 조합, 본 발명에 따른 전달 비히클, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 본 발명에 따른 조성물, 또는 본 발명에 따른 제약 조성물을 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 진단에 사용하기 위한 또는 진단 방법에 사용하기 위한, 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 전형적으로 치료상 유효량으로 및/또는 이러한 질환 또는 장애를 치료하는데 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체를 포함하는 제약 조성물을 전형적으로 치료상 유효량으로 및/또는 이러한 질환 또는 장애를 치료하는데 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00003
질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 선택하는 단계, 및
Figure pct00004
이러한 대상체에게 임의의 측면 또는 실시양태에 따른 항체, 또는 이러한 항체를 포함하는 제약 조성물을 전형적으로 치료상 유효량으로 및/또는 이러한 질환 또는 장애를 치료하는데 충분한 시간 동안 투여하는 단계.
한 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암, 즉 종양발생성 장애, 예컨대 예를 들어 혈액 암 또는 고형 종양 악성종양이다. 또 다른 실시양태에서 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 장애이다.
추가 측면에서, 본 발명은 CD27과 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체, 즉 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체와 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 본원에 기재된 바와 같이 CD27과 결합할 수 있는 항원-결합 영역과 결합한다.
항-이디오타입 (Id) 항체는 일반적으로 항체의 항원-결합 부위와 연합된 독특한 결정인자를 인식하는 항체이다. 항-Id 항체는 항-CD27 모노클로날 항체의 공급원과 동일한 종 및 유전적 유형의 동물을 항-Id가 제조되는 모노클로날 항체로 면역화함으로써 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 전형적으로, 이러한 이디오타입 결정인자에 대한 항체 (항-Id 항체)를 생산함으로써 면역화 항체의 이디오타입 결정인자를 인식하고 이에 대해 반응할 수 있다. 이러한 항체를 생산하는 방법은 예를 들어 US 4,699,880에 기재되어 있다. 이러한 항체는 본 발명의 추가 특색이다.
항-Id 항체는 또 다른 동물에서 면역 반응을 유도하여 소위 항-항-Id 항체를 생산하는 "면역원"으로서 사용될 수도 있다. 항-항-Id 항체는 항-Id 항체를 유도한 원래의 모노클로날 항체와 에피토프적으로 동일할 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체의 이디오타입 결정인자에 대한 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성을 갖는 항체를 발현하는 다른 클론을 확인하는 것이 가능하다. 항-Id 항체는 다양할 수 있고/거나 (이에 따라 항-Id 항체 변이체를 생산함) 본 발명의 CD27-특이적 항체와 관련하여 본원의 다른 곳에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 기술에 의해 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항-Id 항체는 운반체, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 커플링되어 BALB/c 마우스를 면역화하는데 사용될 수 있다. 이들 마우스로부터의 혈청은 전형적으로, 원래/모 항-CD27 항체와 동일하지는 않더라도 유사한 결합 특성을 갖는 항-항-Id 항체를 함유할 것이다.
Fc 영역은 C-말단에 리신을 가질 수 있다. 이러한 리신의 기원은 이러한 Fc 영역이 유래되는 인간에서 발견되는 자연 발생 서열이다. 재조합 항체의 세포 배양 생산 동안, 이러한 말단 리신은 내인성 카르복시펩티다제(들)에 의한 단백질분해에 의해 잘려질 수 있으며, 그 결과 동일한 서열을 가지지만 C-말단 리신이 결여된 불변 영역이 생성된다. 항체 제조 목적을 위해, 이러한 말단 리신을 코딩하는 DNA는 서열로부터 생략될 수 있어, 리신 없이 항체가 생산될 수 있다. 말단 리신을 코딩하거나 코딩하지 않는 핵산 서열로부터 생산된 항체는 서열 및 기능면에서 실질적으로 동일한데, 이는 예를 들어 CHO 기반 생산 시스템에서 생산된 항체를 사용하는 경우에는 말단 리신의 프로세싱 정도가 전형적으로 높기 때문이다 (Dick, L.W. et al. Biotechnol. Bioeng. 2008;100: 1132-1143). 따라서, 본 발명에 따른 단백질, 예컨대 항체는 말단 리신을 코딩하거나 코딩하지 않으면서 또는 이러한 리신을 갖거나 갖지 않으면서 생성될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명에 따르면, 말단 리신을 갖는 서열, 예컨대 말단 리신을 갖는 불변 영역 서열은 말단 리신이 없는 상응하는 서열로서 이해될 수 있고, 말단 리신이 없는 서열은 또한 말단 리신이 있는 상응하는 서열로서 이해될 수 있는 것으로 또한 이해된다.
실시예
실시예 1: 항-인간 CD27 항체 및 그의 Fc 변이체의 생성
면역화 및 하이브리도마 생성을 통한 항-인간 CD27 항체의 생성은 알데브론 게엠베하 (Aldevron GmbH; 독일 프라이부르크)에서 수행되었다. 인간 CD27 (전체 길이 및 ECD)을 코딩하는 cDNA를 알데브론 독점 발현 플라스미드에 클로닝하였다. 항-CD27 항체는 입자 충격용 휴대용 장치 ("유전자 총")를 사용하여 인간 CD27 cDNA-코팅된 금 입자를 피내 적용하여 옴니래트(OmniRat) 동물 [완전한 인간 이디오타입을 갖는 항체의 다양한 레퍼토리를 발현하는 트랜스제닉 래트; 리간드 파마슈티칼즈 인크.(Ligand Pharmaceuticals Inc.)]을 면역화함으로써 생성되었다. 일련의 면역화 후에 혈청 샘플을 수집하고, 전체 길이 인간 CD27 발현을 위해 전술한 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에 대해 유동 세포계수법으로 시험하였다. 항체 생산 세포를 래트 비장으로부터 단리하고 표준 절차에 따라 마우스 골수종 세포 (Ag8)와 융합시켰다. CD27-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 RNA를 시퀀싱을 위해 추출하였다.
71개의 CD27 항체 패널 중에서 6개의 항체가 1차 T 세포에 대한 결합 및 시험관내 CD27 결합 경쟁 검정의 다양성을 기반으로 하여 추가의 특징 규명를 위해 선택되었다. 이들 6개 항체는 본원에서 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B, IgG1-CD27-C, IgG1-CD27-D, IgG1-CD27-E 및 IgG1-CD27-F로 명명된다.
관심 중쇄 및 경쇄의 제조에 문제가 있는 것으로 간주되는 아미노산 잔기 (예를 들어, 유리 시스테인 또는 글리코실화 부위)를 제거하기 위한 단일 점 돌연변이가 있는 일부 경우의 가변 영역이 유전자 합성되었고 인간 항체 경쇄 및 인간 IgG1 중쇄에 대한 백본 서열을 함유하는 발현 벡터로 클로닝되었다.
Eu 넘버링에 따라 하기 아미노산 돌연변이 중 하나 이상을 도입하여 6개의 상이한 항체의 Fc 변이체를 생성하였다: E345R, E430G, P329R, G237A, K326A, E333A (하기 표 3 및 5 참조). 하기 기재된 바와 같이 시험관 내에서 기능적 특징 규명 후, CD27-특이적 IgG1-CD27-A가 가장 최적의 생물학적 특성을 갖는 것으로 간주되었다. 본원에서 벤치마크로서 사용된 선행 기술의 CD27-표적화 항체의 서열이 하기와 같이 수득되었다: IgG1-CD27-15 (WO2012004367; 서열식별번호: 3 및 4), IgG1-CD27-131A (WO2018/058022; 서열식별번호: 10 및 15), IgG1-CD27-CDX1127 (WO2016145085; 서열식별번호: 1 및 2), 및 IgG1-CD27-BMS986215 (WO2019195452A1; 서열식별번호: 8 및 9). 유형 I 항-인간 CD20 항체의 VH 및 VL 서열은 WO2019/145455A1 (서열식별번호: 35 및 39)에 이전에 기재되었다.
표 3 - 아미노산 서열의 목록
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 2: CD27 활성화 리포터 세포 검정에서 항-CD27 항체의 효능제 활성
E345R 또는 E430G 육량체화-향상 Fc 돌연변이가 있거나 없는 상이한 항-CD27 항체의 CD27 효능제 활성은 CD27 해동 및 사용 생물검정 키트 [프로메가(Promega), 맞춤형 검정 서비스, CAS # CS1979A25]를 사용하여 측정되었다. 상기 키트는 인간 CD27의 구성적 발현과 함께 NF-κB 반응 요소의 제어 하에 반딧불이 루시페라제 유전자를 발현하는 NF-κB 리포터-Jurkat 재조합 세포를 함유하며, 본질적으로 제조업체의 지침에 따라 사용되었다. 간단히 언급하면, 해동-및-사용 글로리스판스 NFκB-luc2/CD27 Jurkat 세포를 해동하고 바이오-글로 루시페라제 검정 완충액 내 항체 희석 시리즈 (최종 농도 범위 0.04 - 20 μg/mL)가 포함된 96-웰 평평한 바닥 배양 플레이트 [퍼킨엘머(PerkinElmer), Cat # 6005680]에서 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 항-CD27 항체는 야생형 (WT*) IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B, IgG1-CD27-C, IgG1-CD27-D, IgG1-CD27-E, IgG1-CD27-F, 및 E430G 또는 E345R 돌연변이를 보유하는 각각의 변이체였다. 항-CD27 벤치마크 항체는 IgG1-CD27-131A (WT 및 E430G 변이체) 및 비-육량체화 IgG1-CD27-15 (육량체화를 방지하는 Fc 돌연변이의 조합을 운반하는 IgG1-CD27-15-P329R-E345R-K439E이므로, 그 돌연변이는 본 실험의 맥락에서 기능적으로 관련이 없으므로 본 도면에서 WT로서 지칭됨) 및 E345R 돌연변이를 포함하는 IgG1-CD27-15의 육량체화 변이체였다. 항-HIV gp120 인간 항체인 IgG1-b12-E345R이 비-결합 음성 대조군 항체 (ctrl)로서 사용되었다. 항체 인큐베이션 후, 바이오-글로 루시페라제 검정 시약 (실온으로 평형화됨)을 각각의 웰에 부가하고 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 엔비젼 멀티라벨 판독기 (퍼킨엘머)를 사용하여 발광을 측정하고 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 생성된 막대 다이어그램에 상대 발광 단위 (RLU)로서 제시하였다.
육량체화-향상 Fc 돌연변이 (E345R 또는 E430G)의 도입은 항체 클론 IgG1-CD27-A 내지 -E 및 벤치마크 항체 IgG1-CD27-131A (E430G로 시험됨) 및 IgG1-CD27-15 (E345R로 시험됨)에 대해 상응하는 WT 항체와 비교하여 향상된 CD27 효능작용을 초래하였다 (도 1).
IgG-CD27-A, B 및 C는 시험된 모든 농도에서 E430G 또는 E345R을 도입한 후 향상된 CD27 효능제 활성을 명확히 나타낸 반면, 육량체화-향상 돌연변이를 함유하는 IgG1-CD27-D 및 E 변이체는 가장 낮은 항체 농도에서 증가된 효능작용을 나타내지 않았다. E430G 또는 E345R 돌연변이가 있는 IgG1-CD27-F 변이체는 시험된 가장 높은 항체 농도에서만 향상된 CD27 효능작용을 나타냈다. 변이체 IgG1-CD27-A 내지 -E의 경우, E345R 돌연변이의 도입으로 인해 E430G 돌연변이보다 CD27 활성화가 더 강력해졌다. E345R 돌연변이를 갖는 항체 IgG1-CD27-A 내지 -E는 E430G 돌연변이를 갖는 IgG1-CD27-131A 또는 E345R 돌연변이를 갖는 CD27-15 각각과 비교하여 더 높거나 유사한 CD27 활성화 수준을 나타냈다.
*IgG1-CD27-B 및 IgG1-CD27-F에 대한 WT 항체는 IgG Fc 도메인 내에 본 실험의 맥락에서 기능적으로 관련이 없는 F405L 돌연변이를 보유하였다.
실시예 3 재조합 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 CD27에 대한 항-인간 CD27 항체의 결합 친화도
재조합 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 CD27 단백질에 대한 5개의 항-인간 CD27 IgG1 항체 (IgG1-CD27-A, -B, -C, -D 및 -E)의 결합 친화도는 옥텟(Octet) HTX 장비 [포르테바이오 (ForteBio; 영국 포츠머스)]에서 무표지 생물층 간섭계를 사용하여 결정되었다. 하나의 CD27-특이적 Fab-아암과 비-결합 Fab-아암을 포함하는 이중특이적 항체를 사용하여 실험을 수행하였으므로, 항체는 CD27에 대해 1가이다. 이러한 이중특이적 항체는 CD27 항체와 비-결합 항체 간의 제어된 Fab-아암 교환에 의해 생성되었다 (문헌 [Labrijn AF et al., Nat Protoc. 2014 Oct;9(10):2450-63]에 기재된 바와 같음).
인간 및 마우스 CD27에 대한 CD27 항체의 친화도를 결정하기 위해, 100 nM 재조합 His-태그부착된 마우스 또는 인간 CD27 단백질 (시노 바이오로지칼(Sino Biological), Cat # 10039-H08B1 [인간], Cat # 50110-M08H [마우스])을 사전 컨디셔닝된 항-펜타-HIS (HIS1K) 바이오센서 (포르테바이오, Cat # 18-5120)에 600초 동안 로딩하였다.
시노몰구스 원숭이 CD27에 대한 CD27 항체의 친화도를 평가하기 위해, 5 μg/mL의 재조합 시노몰구스 원숭이 CD27-Fc 융합 단백질 (R&D 시스템즈, Cat # 9904-CD-100)을 활성화된 아민 반응성 2세대 (AR2G) 바이오센서 (포르테바이오, Cat # 18-5092)에 로딩하였다.
300초 동안 샘플 희석액 (포르테바이오, Cat # 18-1104)에서 기준선을 측정한 후, CD27 항체의 연합 (200초) 및 해리 (1,000초)를 샘플 희석액 중 2배 희석 단계를 통해 0.78 - 800 nM의 항체 농도 시리즈에 대해 결정하였다. 계산을 위해 150 kDa의 항체 분자 질량이 사용되었다. 참조 센서를 샘플 희석액과 함께 인큐베이션하였다.
데이터 수집 소프트웨어 v11.1.1.19 (포르테바이오)를 사용하여 데이터를 수집하고 데이터 분석 소프트웨어 v9.0.0.14 (포르테바이오)를 사용하여 분석하였다. 참조 센서를 빼서 항체별로 데이터 추적을 교정하였다. Y-축은 기준선의 마지막 10초로 정렬되었으며 해리에 대한 단계간 교정 정렬 및 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 필터링이 적용되었다. 반응이 < 0.05 nm이고 계산된 평형이 포화에 가까웠을 때 데이터 추적은 분석으로부터 제외되었다 (50초의 해리 시간을 사용한 경우 Req/Rmax > 95%). 데이터는 200초로 설정된 연합에 대한 관심 창과 50초로 설정된 해리 시간을 사용하여 1:1 모델에 맞춰졌다. 해리 시간은 곡선 맞춤 (우선적으로 > 0.98)의 우수성 추정치인 결정 계수 (R2), 곡선의 육안 검사, 및 연합 단계 동안 적어도 5%의 신호 감쇠를 기반으로 하여 선택되었다.
인간 CD27에 대한 친화도는 나노몰 범위의 K D 값으로 3개의 CD27 항체 (IgG1-CD27-A,B,C)에 대해 정확하게 결정될 수 있다 (표 4). IgG1-CD27-D 및 -E의 경우, 생물층 간섭계 실험을 통해 유사한 범위의 친화도로 인간 CD27과 결합하는 것이 확인되었지만, 최적 이하의 곡선 피팅으로는 정확한 K D 값을 계산할 수 없었다 (표 4에 표시된 바와 같음).
IgG1-CD27-A 및 -B는 또한 인간 CD27에 대해서와 동일한 범위의 K D 값으로 재조합 시노몰구스 원숭이 CD27에 대한 결합을 제시하였다. IgG1-CD27-C, -D 및 -E를 사용하여 수득된 결과에서도 유사한 범위의 친화도로 시노몰구스 원숭이 CD27과 결합하는 것이 확인되었지만, 최적 이하의 곡선 피팅으로는 정확한 K D 값을 계산할 수 없었다 (표 4에 표시된 바와 같음).
재조합 마우스 CD27에 대한 결합은 항체 IgG1-CD27-C에 대해서만 관찰되었다.
표 4. 표시된 종으로부터의 CD27에 대한 IgG1-CD27-A 내지 -E 항체의 결합 친화도
Figure pct00013
* : 결합이 관찰되었으나 KD, kon 및 kdis는 최적 이하의 곡선 피팅으로 인해 신뢰도가 떨어지는 값이므로, 1:1 모델을 사용하여 해석을 신뢰할 수 없다.
n.b.: 결합이 관찰되지 않음.
실시예 4: 세포 표면-발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD27에 대한 항-CD27 항체의 결합
세포 표면-발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD27에 대한 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A 내지 -E* 및 선행 기술의 IgG1-CD27-131A*의 결합은 일시적으로 형질감염된 HEK293F 세포와 CD27을 내인성으로 발현하는 1차 T 세포를 사용하는 유동 세포계수법으로 분석되었다. 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-FEAR이 음성 대조군 항체로서 사용되었다.
프리스타일 293-F 현탁 세포 (HEK293F; 써모피셔(ThermoFisher), Cat # R79007)를 제조업체의 지침에 따라 293펙틴 형질감염 시약 (써모피셔, Cat # 12347019)을 사용하여 전체 길이 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD27을 코딩하는 포유동물 발현 벡터 pSB로 일시적으로 형질감염시켰다.
인간 및 시노몰구스 원숭이 PBMC는 제조업체의 지침에 따라 림프구 분리 배지 (LSM; 코닝(Corning), Cat # 25-072CV)를 사용하여 저밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 인간 공여자 (산퀸 혈액 은행; 네덜란드) 또는 시노몰구스 원숭이 (BPRC; 네덜란드, Cat # S-1135)로부터 수득된 연막으로부터 정제되었다.
PBS [론자(Lonza), Cat # BE17-517Q] + 1% BSA (로슈, Cat # 10735086001) + 0.02% 소듐 아지드 [바이오-월드(Bio-World), Cat # 41920044-3]로 이루어진 FACS 완충액을 사용하여 그 사이에 세척 단계를 거치면서 순차적 인큐베이션을 위해 세포를 96-웰 플레이트 [웰당 100,000개 세포; 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-one), Cat # 650180]에 시딩하였다. 하기 인큐베이션이 적용되었다: 4℃에서 30분 동안 항체 농도 시리즈 (0.0001 - 10 μg/mL 최종 농도); 실온에서 20분 동안 생/사 마커 FVS510 (BD, Cat # 564406, PBS에서 1:1,000으로 희석됨); 4℃에서 30분 동안 PE 표지된 폴리클로날 염소 항-인간 IgG [잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research), Cat # 109-116-098, 1:500로 희석됨]; 및 4℃에서 30분 동안 T-세포 확인을 위한 항-CD3 항체 [항-인간 CD3: BD, Cat # 555335, 1:10으로 희석됨; 항-시노 CD3: 밀테니이(Miltenyi), Cat # 130-091-998, 1:10으로 희석됨]. 모든 샘플은 FACSCelesta 유동 세포계수기 (BD) 및 플로우조 소프트웨어에서 분석되었다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 데이터를 처리하고 시각화하였다.
시험된 모든 항체는 인간 T 세포와 형질감염된 HEK293F 세포 둘 다에서 인간 CD27에 대한 용량-의존적 결합을 제시하였다 (도 2 A,B). IgG1-CD27-A 및 IgG1-CD27-131A에 대한 중간 결합과 비교하여 IgG1-CD27-B 및 IgG1-CD27-C에 대해서는 가장 높은 최대 결합이 관찰되었고, IgG1-CD27-D 및 IgG1-CD27-E에 대해서는 낮은 결합이 관찰되었으며, 그 차이는 인간 T-세포를 사용한 경우에 가장 두드러졌다. 시노몰구스 원숭이 CD27 T 세포에 대한 결합의 경우에는, IgG1-CD27-B에 대해 가장 높은 결합이 관찰되었고, 그 다음으로 높은 결합은 Ig1-CD27-131A 및 IgG1-CD27-A에 대해 관찰되었다. IgG1-CD27-D 및 -E에 대해서는 더 낮은 결합이 관찰된 반면, IgG1-CD27-C는 시노몰구스 원숭이 T 세포에 대해 최소 결합을 나타냈다. 모든 CD27 항체는 시노몰구스 원숭이 CD27로 형질감염된 HEK 세포에 대한 용량-의존적 결합을 제시하였다. IgG1-CD27-B 및 IgG1-CD27-131-A에 대해 가장 높은 최대 결합이 관찰되었으며, IgG1-CD27-A, -D 및 -E에 대해서는 다소 더 낮은 결합이 관찰되었다. IgG1-CD27-C는 시노몰구스 원숭이 CD27로 형질감염된 HEK 세포에 대한 가장 낮은 결합을 제시하였다 (도 2 C,D).
결론적으로, IgG1-CD27-A 및 IgG1-CD27-B는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 T 세포에서 내인성으로 발현되고 형질감염된 HEK 세포에서 일시적으로 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD27에 대한 용량-의존적 결합을 제시하였다. IgG1-CD27-A 및 IgG-CD27-131A는 인간 T 세포에 대한 필적하는 결합을 보인 반면, IgG1-CD27-B는 더 높은 최대 결합을 나타냈다.
*주의: IgG1-CD27-A, -B, -C, -D 및 -E는 IgG Fc 도메인 내에 돌연변이 F405L-L234F-L235E-D265A를 보유했으며, 이는 본 실험과 관련하여 기능적으로 관련이 없다. IgG1-CD27-131A는 IgG1 Fc 도메인 내에 기능적으로 관련이 없는 F405L 돌연변이를 보유하였다.
실시예 5: 자연 인간 CD27-A59T 변이체에 대한 항-CD27 항체의 결합
인간 집단의 대략 19%가 세포외 도메인 (서열식별번호: 2)에 A59T 돌연변이를 보유하는 자연 CD27 변이체를 발현한다. 인간 CD27-A59T에 대한 결합은 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B, IgG1-CD27-C* 및 벤치마크 IgG1-CD27-131A에 대한 유동 세포계수법으로 시험되었다. 비-결합 항체 IgG1-b12-FEAL이 음성 대조군 항체로서 사용되었다. 인간 CD27-A59T를 발현하는 일시적으로 형질감염된 HEK293F 세포 (웰당 15,000개 세포)를 1차 시험 항체 IgG1-CD27-A 내지 -C의 농도 시리즈 (10배 희석 단계를 사용한 0.0001 - 10 μg/mL), 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12 (ctrl), 및 CD27-A59T와 결합하는 것으로 이전에 기재된 선행 기술의 벤치마크 IgG-CD27-131A (WO2018/058022)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 항체를 폴리클로날 염소 항-인간 IgG로 PE-표지하였다. 결합은 FACSCelesta 유동 세포계수기 (BD) 및 플로우조 소프트웨어에서 분석되었다. 그래프패드 프리즘 v.8을 사용하여 데이터를 처리하고 시각화하였다.
시험된 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B, IgG1-CD27-C 및 IgG1-CD27-131A는 상이한 항체 중에서 유사한 결합 곡선으로 CD27-A59T-형질감염된 HEK293F 세포에 대한 용량-의존적 결합을 제시하였다 (실시예 5).
*주의: IgG1-CD27-A, -B 및 -C는 IgG Fc 도메인 내에 본 실험의 맥락에서 기능적으로 관련이 없는 돌연변이 F405L-L234F-L235E-D265A를 보유하였다. IgG1-CD27-131A는 IgG1 Fc 도메인 내에 기능적으로 관련이 없는 F405L 돌연변이를 보유하였다.
실시예 6: 항-CD27 항체에 의한 인간 T 세포 증식의 유도
E345R 또는 E430G 돌연변이의 도입 시 Fc-Fc 상호작용을 통한 향상된 IgG 육량체화는 항 CD27 항체의 CD27 효능제 활성을 향상시켰기 때문에 (실시예 2), TCR 활성화된 T 세포의 증식을 증가시킬 수 있는 E430G 또는 E345R 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B 및 IgG1-CD27-C 항체 변이체의 능력을 시험관 내에서 시험하였다.
부가적으로, C1q 및 FcgR에 대한 결합을 감소시키는 것으로 보고된 Fc 돌연변이 (G237A 또는 P329R) 또는 C1q에 대한 결합을 향상시키는 것으로 보고된 Fc 돌연변이 (K326A/E333A 이중 돌연변이)를 도입하여 E345R 또는 E430G 돌연변이를 보유하는 CD27 항체의 CD27 효능제 활성에 대한 잠재적 효과를 시험하였다. K326A/E333A 이중 돌연변이는 이전에 C1q 결합을 향상시키고 Fc-Fc 상호작용 향상 돌연변이를 포함하는 DR5-특이적 인간화 IgG1 항체의 향상된 효능작용 활성에 기여하는 것으로 나타났다 (WO2018/146317A1). 돌연변이 G237A, P329R 또는 K326A/E333A가, E430G 또는 E345R 이외에, IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B 및 IgG1-C에 도입되었으며 (표 5) 또한 T-세포 증식에 대한 효과는 건강한 공여자로부터 수득된 인간 PBMC (산퀸 혈액 은행; 네덜란드)를 사용하여 결정되었다.
표 5. 항체 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B 또는 IgG1-CD27-C의 Fc 도메인 내의 돌연변이 및 그의 생물학적 효과
Figure pct00014
*IgG1-CD27-X에서의 X는 IgG1-CD27 클론 IgG1-CD27-A, IgG1-CD27-B 또는 IgG1-CD27-C를 지칭한다.
PBMC를 5 x 106개의 세포/mL의 밀도로 PBS에 재현탁시키고 제조업체의 지침에 따라 셀트레이스 CFSE 세포 증식 키트 [인비트로젠(Invitrogen), Cat # C34564; 1:10,000]를 사용하여 CFSE로 표지하였다. CFSE-표지된 PBMC (100,000개 세포/웰)는 T 세포를 활성화하기 위해 0.1 μg/mL 항-CD3 항체 클론 UCHT1 [스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies), Cat # 60011]과 함께 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat # 650180)에서 인큐베이션하고, CD27 항체 (1 μg/mL 최종 농도)를 37℃/5% CO2에서 96시간 동안 5% 정상 인간 혈청 (NHS; 산퀸, 제품 # B0625)으로 보충된 T-세포 활성화 배지 (ATCC, Cat # 80528190)에서 인큐베이션하였다. 유동 세포계수법을 통해 CD4+ 및 CD8+ T-세포 서브세트에서 생육성 세포를 확인하기 위해, 세포를 생/사 마커 FVS510 (1:1,000)과 함께 실온에서 20분 동안 순차적으로 인큐베이션하고, APC-eFluor780-표지된 항-인간 CD4 항체 (인비트로젠, Cat # 47-0048-42, 1:50), 알렉사플루오르700-표지된 항-인간 CD8a 항체 [바이오레전드(BioLegend), Cat # 301028; 1:100], PE-Cy7-표지된 마우스 항-인간 CD14 항체 [비디 바이오사이언스(BD Biosciences), Cat # 557742; 1:50] 및 BV785-표지된 항-인간 CD19 항체 (바이오레전드, Cat # 363028; 1:50)를 함유하는 림프구 마커에 대한 염색 혼합물과 함께 암실 내의 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플은 FACSCelesta (비디 바이오사이언스) 유동 세포계수기에서 측정되었으며, 생육성 CD4+ 및 CD8+ T-세포 서브세트 (FVS510-CD14-CD19-CD4+ 및 FVS510-CD14-CD19-CD8+) 내의 CFSE 희석 피크는 T-세포 증식에 대한 판독값으로서 플로우조 10 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. T-세포 증식은 플로우조 소프트웨어 (버전 10)를 사용하여 계산된 증식된 세포의 백분율 또는 분열 지수 둘 다로서 표현되었다. 증식된 (분열된) 세포의 백분율은 CFSE 희석을 거친 세포에 대한 게이팅에 의해 결정되었다 (CFSE낮은 피크). 분열 지수는 세포가 겪은 분열의 평균 수이다. 히트맵은 그래프패드 프리즘 버전 8을 사용하여 생성되었다. 4명의 상이한 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 증식 검정을 수행하였다.
E430G 또는 E345R 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A, -B 및 -C의 변이체는 시험된 4명의 공여자 중 2명에서 대조군 항체와 비교하여 CD8+ T 세포의 증식이 약간 증가하도록 유도하였다. E430G 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A, -B 또는 -C 변이체 내로 부가의 돌연변이 (P329R, G237A 또는 K326A/E333A)를 도입하면, 4명의 PBMC 공여자 전반에 걸쳐 CD8+ T 세포 증식에 다양한 효과가 나타났다. 대조적으로, E345R 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A 및 IgG1-CD27-C 변이체 내로 P329R 돌연변이를 도입하면, 활성화된 CD8+ T 세포의 증식을 향상시킬 수 있는 능력이 지속적으로 증가하였다. 이는 특히 IgG1-CD27-A에 적용되었다: 측정된 CD8+ T 세포 증식은 각각의 공여자에서 IgG-CD27-A-E345R, IgG1-CD27-B-E345R 및 IgG1-CD27-C-E345R에 대해 유사한 반면, 부가의 P329R 돌연변이의 도입은 IgG1-CD27-B-E345R 또는 IgG1-CD27-C-E345R과 비교하여 클론 IgG1-CD27-A-E345R에 대해 CD8+ T 세포 증식을 일관되게 더 증가시켰다. 따라서, TCR 활성화된 CD8+ T 세포의 증식에 대한 P329R 돌연변이와 조합된 E345R 돌연변이의 효과는 IgG1-CD27-B 및 IgG1-CD27-C에 대한 것보다 클론 IgG1-CD27-A에 대해 일관되게 더 컸다. 시험된 모든 항체 변이체 전반에 걸쳐, IgG1-CD27-A-E345R-P329R은 모든 공여자에서 CD8+ T 세포 증식의 가장 큰 증가를 유도하였다 (도 4A).
E345R 돌연변이를 보유하는 CD27 항체 변이체에 돌연변이 G237A 또는 K326A-E333A를 부가하면, 단일 돌연변이 E345R을 포함하는 항체와 비교 시 시험된 클론 중 임의의 것에서 CD8+ T 세포의 증식이 증가하지 않거나 최소한으로만 증가하였다 (도 4A).
또한 CD4+ T 세포에서는 IgG1-CD27-A-E345R-P329R의 존재 하에 T 세포 증식의 가장 높고 가장 일관된 증가가 관찰되었다. CD4+ T 세포 증식은 일반적으로 E430G 또는 E345R 돌연변이만을 보유하는 IgG1-CD27-A, -B 및 -C 변이체 간에 유사한 반면, 부가의 P329R 돌연변이의 도입은 E430G 또는 E345R 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A-E430G 또는 IgG1-CD27-B 또는 -C 변이체와 비교하여 E345R 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A 변이체에 대해 CD4+ T 세포 증식을 더 크게 증가시켰다. 이러한 효과는 시험된 4명의 공여자 중 3명에게서 관찰되었다. 공여자 1에서는, CD4+ T 세포 증식에 대한 E430G 또는 E345R 이외의 부가의 돌연변이의 효과가 일반적으로 작았으며, 이러한 공여자에서 관찰된 효과는 다른 3명의 공여자에서 재현되지 않았다.
E345R 돌연변이와 P329R 돌연변이의 조합은 또한 IgG1-CD27-C에 대해 CD4+ T 세포 증식을 지속적으로 증가시켰지만, E345R 돌연변이 단독과 E345R과 P329R의 조합 간의 차이는 클론 IgG1-CD27-A보다 클론 IgG1-CD27-C에 대해 더 작았다. 클론 IgG1-CD27-B의 경우, 4명의 공여자 중 2명에서 IgG1-CD27-B-E345R과 비교하여 IgG1-CD27-B-E345R-P329R의 경우 CD4+ T 세포 증식에 있어 보통 수준의 증가가 관찰되었다.
E430G 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A, -B 또는 -C 변이체 내로 P329R, G327A 또는 K326A/E333A 돌연변이를 도입하면, CD4+ T 세포 증식에 대한 효과가 유도되지 않거나 일관되게 유도되지 않았다. 유사하게, E345R 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A, -B 또는 -C 변이체에 G327A 또는 K326A/E333A를 도입한 후에는 효과가 없거나 일관성이 없는 효과가 관찰되었다.
요약하면, IgG1-CD27-A-E345R-P329R은 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 증식에서 가장 높은 증가를 지속적으로 유도했으며, 이는 IgG1-CD27-A-E345R-P329R이 가장 효율적인 CD27 효능작용을 유도한다는 것을 입증해준다. P329R 돌연변이가 있는 DR5-특이적 육량체화-향상된 항체는 이전에, P329R 돌연변이가 없는 DR5-특이적 육량체화-향상된 항체와 비교하여 DR5 효능작용을 유도할 수 있는 능력이 감소한 것으로 나타났다 (Overdijk et al., Mol Canc Ther 2020). 따라서 IgG1-CD27-A에 E345R 돌연변이 이외에 P329R 돌연변이를 도입하면 CD27 효능제 활성이 향상된다는 사실은 놀라운 것으로 간주되었다. 더욱이, E345R+P329R 돌연변이의 조합 효과가 IgG1-CD27-B 또는 IgG1-CD27-C보다 IgG1-CD27-A에 대해 지속적으로 더 큰 이유는 공지되어 있지 않다.
실시예 7: 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 의한 인간 T-세포 증식의 유도
TCR 자극된 인간 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 증식을 증가시킬 수 있는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 능력은 건강한 인간 공여자 PBMC를 사용하는 CSFE 희석 검정에서 분석하였고, 선행 기술의 항-CD27 클론 IgG1-CD27-131A*, IgG1-CD27-CDX1127 및 IgG1-CD27-BMS986215*와 비교하였다. T-세포 증식 검정은 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행되었으며 약간의 편차가 있었다 (75,000개 세포/웰; 농도 범위 0.002 - 10 μg/mL). 항-CD3 자극 없이 T-세포를 사용하는 샘플을 포함시켜 T-세포 수용체 활성화 없이 항체의 잠재적인 CD27 효능제 활성을 시험하였다 (도 5A 및 5B). 이러한 활성은 항체가 휴지기 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 경우 안전성 위험을 초래할 수 있으므로 바람직하지 않다.
증식된 T 세포의 백분율 (도 5A, B, C, D)은 CFSE 형광이 감소된 세포의 백분율로서 계산되었으며, 이는 플로우조 소프트웨어를 사용하여 세포 분열을 나타낸다. 확장 지수 (도 5E 및 5F)는 웰 내 세포의 증가 배수를 확인하고 플로우조 버전 10의 증식 모델링 도구를 사용하여 계산되었다. 보다 일관되게 존재하는 피크 수를 규정하기 위해 필요한 경우 피크에 대한 수동 조정이 이루어졌다.
본 발명의 CD27 항체 및 본원에서 시험된 선행 기술의 항체 중 어느 것도 비자극된 T 세포의 증식을 유도하지 못하였다 (즉, CD3 가교가 없는 경우) (도 5A 및 B).
대부분의 CD27 항체는 시험된 가장 높은 항체 농도에서 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T-세포의 일부 증식을 유도하였다 (도 5C 및 D). 이를 기반으로 하여, 확장 지수가 계산되었다 (도 5E 및 F). 본 발명의 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 선행 기술의 항-CD27 클론 IgG1-CD27-131A, IgG1-CD27-CDX1127 및 IgG1-CD27-BMS986215와 비교하여 시험관 내에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 더욱 현저하게 향상시켰다.
*IgG1-CD27-131A 및 IgG1-CD27-BMS986215의 경우, 본 실험의 맥락에서 기능적으로 관련이 없는 F405L 돌연변이를 보유하는 변이체가 사용되었다.
실시예 8: 막-결합된 CD27 항체에 대한 C1q 결합
P329R 돌연변이는 IgG1 항체와 C1q 및 FcgR의 상호작용을 감소시키는 것으로 이전에 기재되었다 (Overdijk et al., Molecular Cancer Therapeutics 2020). E345R 돌연변이를 포함하는 IgG1-CD27-A의 C1q 결합에 대한 P329R 돌연변이의 효과를 건강한 인간 공여자 T 세포를 사용하여 시험관내 세포성 C1q 결합 검정에서 시험하였다. 항-HIV gp120 항체 IgG1-b12-F405L이 비-결합 이소타입 대조군 항체 (ctrl)로서 사용되었다. 로제트셉(RosetteSep) 인간 T 세포 강화 칵테일 (스템셀, Cat # 15061)을 사용하여 건강한 인간 공여자 PBMC로부터 T 세포를 강화시키고, 배양 배지 (0.1% BSA 및 1% 펜/스트렙 [론자, Cat # DE17-603E]가 보충된 RPMI 1640 [깁코(Gibco), Cat # A10491-01])에 재현탁시켰다. T 세포 (2 x 106개 세포/웰)를 항체 희석 시리즈 (15 μg/mL 최종 검정 농도에서 시작하여 8x 5배 희석)가 포함된 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 37℃에서 15분 동안 사전 인큐베이션하여 항체가 T 세포와 결합할 수 있도록 하였다. 이어서, 세포를 얼음 위에서 냉각시키고, 인간 C1q의 공급원으로서 NHS (20% NHS 최종 검정 농도)를 보충하고 얼음 위에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 FITC-표지된 토끼 항-인간 C1q 항체 (DAKO, Cat # F0254; 20 μg/mL)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하고 TO-PRO-3 (써모피셔, Cat # T3605; 1:5,000 희석)이 포함된 FACS 완충액에 재현탁시켰다. C1q 결합은 살아있는 세포에 대한 FITC 신호를 측정하는 유동 세포계수법에 의해 결정되었다.
막 결합된 WT IgG1-CD27-A 항체는 C1q 결합을 나타내지 않았다 (도 6). 육량체화-향상 돌연변이 E430G 또는 E345R의 도입으로 인해 (IgG1-CD27-A-E430G 및 IgG1-CD27-A-E345R), 세포 표면 상의 육량체 항체 환 구조에 대한 육량체 C1q 단백질의 결합력이 증가한 것과 일치하여, T-세포 표면 상의 CD27 항체에 대한 C1q의 결합이 초래되었다 (도 6). IgG1-CD27-A-E345R에 P329R 돌연변이가 도입되면 (IgG1-CD27-A-P329R-E345R) C1q 결합이 상실되었는데 (도 6), 이는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 C1q와 결합할 수 없다는 것을 입증해준다.
이러한 데이터는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 T 세포의 세포 표면 상의 CD27과 결합 시 C1q와 결합할 수 없다는 것을 제시한다. 이는 C1q 결합이 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 항체 유발 CD27 효능제 활성에 기여하지 않다는 것을 나타낸다. 이는 다른 육량체화-향상된 효능작용 항체에 대해 이전에 기재된 것과 대조적이다. 더욱이, C1q 결합의 결여는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 보체 활성화의 고전적 경로를 활성화시킬 수 없다는 것을 나타낸다. 따라서, IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 활성이 원치 않는 T 세포에 대한 보체 활성화 및 CDC를 유도할 것으로 예상되지 않는다.
실시예 9: 인간 Fc 수용체에 대한 항-CD27 항체의 결합
인간 FcγR 변이체에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합은 비아코어 표면 플라스몬 공명 (SPR) 시스템을 사용하여 분석하고 항-HIV gp120 항체 IgG1-b12 (ctrl)와 비교하였다. 제조업체의 지침에 따라 비아코어 시리즈 S 센서 칩 CM5 [시티바(Cytiva), Cat # 29104988]를 아민-커플링 및 His 포획 키트 (시티바, Cat # BR100050 및 Cat # 29234602)를 사용하여 항-His 항체로 공유 코팅하였다. 그 다음, HBS-P+ (시티바, Cat # BR100827) 내의 125 nM Fcγ-수용체 FcγRIa, FcγRIIa (167-His [H] 및 167-Arg [R]), FcγRIIb 또는 FcγRIIIa (176-Phe [F] 및 176-Val [V]) (시노 바이오로지칼, Cat # 10256-H08S-B, Cat # 10374-H27H, Cat # 10374-H27H1-B, Cat # 10259-H27H-B, Cat # 10389-H27H-B 및 Cat # 10389-H27H1-B)를 표면에 포획하였다. 3주기의 완충액 후, 항체 샘플을 36주기 동안 주사하여, FcγRI의 경우 0-3,000 nM의 항체 범위를 사용하고, 다른 FcγR의 경우에는 0-10,000 nM의 항체 범위를 사용하여 결합 곡선을 생성하였다. FcR-코팅된 표면 (활성 표면)에서 분석된 각각의 샘플은 배경 교정에 사용된 FcR (참조 표면)이 없는 평행 유동-세포에서도 분석되었다. 항-His-코팅된 표면으로부터의 해리는 10 mM 글리신-HCl pH 1.5 (시티바, Cat # BR100354)를 사용하여 표면을 재생시킴으로써 수행되었다. 비아코어 인사이트 평가 소프트웨어 (시티바)를 사용하여 센소그램을 생성하고 4-파라미터 로지스틱 (4PL) 피트를 적용하여 참조 샘플 (ctrl)에 대항한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 상대적 결합을 계산하였다.
높은 친화성 수용체 FcγRIa에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합은 ctrl 항체와 비교하여 크게 감소되었지만, 일부 결합은 더 높은 항체 농도에서 관찰되었다 (도 7A). IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 인간 낮은 친화성 수용체 FcγRIIa (도 7B 및 C), FcγRIIb (도 7D) 및 FcγRIIIa (도 7E 및 F)와 결합하지 않았다.
결론적으로, IgG1-CD27A-P329R-E345R은 인간 IgG Fc 수용체에 대한 결합이 최소이거나 (FcγRIa) 또는 결합이 없는 (FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa) 것으로 나타났다.
실시예 10: 인간 T 세포에 대한 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-E345R-P329R의 결합
건강한 인간 공여자 T 세포 상의 CD27에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합은 유동 세포계수법을 사용하여 더 자세히 특징 규명되었다. 항-HIV gp120 항체 변이체 IgG1-b12-P329R-E345R이 비-결합 대조군 항체 (ctrl)로서 사용되었다. 인간 PBMC는 건강한 인간 공여자로부터 수득된 연막으로부터 단리되었다. FACS 완충액 중 PBMC (1 x 105개 세포/웰)를 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, Cat # 650101)에 부가하고 4℃에서 3분 동안 300 xg로 원심분리함으로써 펠릿화하였다. 세포를 FACS 완충액 (3배 희석 단계에서 0.0015 내지 10 μg/mL 범위) 중 50 μL/웰 연속 항체 희석액에 재현탁시키고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 펠릿화하고, FACS 완충액으로 2회 세척한 후 FITC-접합된 2차 항체 (FITC 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이적, 잭슨 이뮤노리서치, Cat # 109-096-097, 1:100 희석)와 함께 50 μL/웰에서 암실 내의 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 펠릿화하고, FACS 완충액으로 2회 세척한 후, BV711-표지된 항-인간 CD19 항체 (바이오레전드, Cat # 302246, 1:50), 알렉사플루오르700-표지된 항-인간 CD8a 항체 (바이오레전드, Cat # 301028, 1:100), APC-eFluor780-표지된 항-인간 CD4 항체 (인비트로젠, Cat # 47-0048-42, 1:50), PE-CF594-표지된 마우스 항-인간 CD56 항체 (비디 바이오사이언스, Cat # 564849, 1:100), PE-Cy7-표지된 마우스 항-인간 CD14 항체 (비디 바이오사이언스, Cat # 557742, 1:50) 및 eFluor450-표지된 항-인간 CD3 항체 (인비트로젠, Cat # 48-0037-42, 1:200)를 함유하는, 림프구 마커에 대한 염색 혼합물 50 μL/웰에서 암실 내의 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 다시 펠릿화하고, FACS 완충액을 사용하여 2회 세척하고, 사멸 세포 마커 7-아미노 악티노마이신 D (7-AAD; 비디 바이오사이언스, Cat # 51-68981E, 1:240 희석됨)를 함유하는 80 μL FACS 완충액에 재현탁시켰다. 샘플은 LSRFortessa (BD) 유동 세포계수기에서 유동 세포계수법에 의해 측정되고 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 그래프패드 프리즘 8 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀 (가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응)를 사용하여 결합 곡선을 분석하였다.
항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해 유사한 결합 특징을 갖는 건강한 공여자 T 세포에 대한 용량-의존적 결합을 제시하였다 (도 8).
실시예 11: 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 의한 CD27 세포 신호전달의 FcγR-비의존적 유도
2차 FcγR-매개된 가교와 독립적으로 CD27 신호전달을 유도할 수 있는 CD27-특이적 모노클로날 항체는 FcγR 양성 세포의 부재 하에 면역자극성일 수 있으며, 이는 FcγR 보유 세포의 빈도가 낮은 종양에서 이점이 될 수 있다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 CD27 효능제 활성을 FcγR 보유 세포의 존재 또는 부재 하에 시험하고 상응하는 WT 항체 IgG1-CD27-A 및 선행 기술의 항체 IgG1-CD27-131A*, IgG1-CD27-CDX1127, 및 IgG1-CD27-BMS986215*와 비교하였다. 비-결합 항체 IgG1-b12-P329R-E345R이 음성 대조군 (ctrl)으로서 사용되었다. CD27 리포터 검정은, 본 실시예에서 해동-및-사용 글로리스판스 NFκB-luc2/CD27 Jurkat 세포가 막-결합된 항체의 FcgR-매개된 가교를 촉진시킬 수 있는 인간 FcγRIIb-발현 세포의 존재 하에 배양된 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다.
해동-및-사용 이펙터 FcγRIIb CHO-K1 세포 (프로메가, Cat # JA2251)를 96-웰 평평한 바닥 배양 플레이트 (퍼킨엘머, Cat # 0815)에 플레이팅하고, 희석시키지 않거나 3가지 증가 희석도 (1/3, 1/9, 1/27)로 희석시키며, 37℃/5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 부착 FcγRIIb 발현 세포의 상청액을 일련의 항체 희석액 (최종 농도 범위 0.0002 - 10 μg/mL)을 함유하는 바이오-글로 루시페라제 검정 완충액 (비희석된 FcγRIIb CHO-K1 세포에 대해 1:1의 NFκB-luc2/CD27 Jurkat:FcγRIIb CHO-K1 비율에서 시작함) 중 고정된 세포 농도의 해동-및-사용 NFκB-luc2/CD27 Jurkat 세포 현탁액으로 대체하였다. 37℃/5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 실온으로 평형화시키고 생물발광을 측정하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 RLU로서 제시하였다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 FcγRIIb 발현 세포와 독립적으로 용량-의존적 CD27 활성화를 유도시켰다 (도 9A). 대조적으로, E345R 육량체화-향상 돌연변이 및 P329R 돌연변이가 없는 상응하는 WT 항체 IgG1-CD27-A는 FcγRIIb 발현 세포의 존재 하에서만 CD27 효능작용을 나타냈다 (도 9A-E). 유사하게, 선행 기술의 항체 IgG1-CD27-131A, IgG1-CD27-CDX1127 및 IgG1-CD27-BMS986215에 의한 CD27 활성화는 또한 FcγRIIb 발현 세포의 존재에 의존적이었으며 NFκB-luc2/CD27 Jurkat : FcγRIIb CHO-K1 비율이 감소함에 따라 점진적으로 감소하였다 (도 9F-J).
결론적으로, 이들 데이터는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 2차 FcγR-매개된 가교와 독립적으로 CD27 효능작용을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 CD27 효능작용을 유도하기 위해 FcγR-보유 세포의 존재에 의존적이었던 선행 기술의 항-CD27 항체와 대조된다.
*IgG1-CD27-131A 및 IgG1-CD27-BMS986215의 경우, 본 실험의 맥락에서 기능적으로 관련이 없는 F405L 돌연변이를 보유하는 변이체가 사용되었다.
실시예 12: 마우스에서 연구된, 표적 결합의 부재 하에 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 약동학적 (PK) 분석
표적 결합의 부재 하에 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R*의 약동학적 특징을 마우스에서 분석하고 상응하는 WT 항체 IgG1-CD27-A*와 비교하였다. IgG1-CD27-A는 마우스 CD27과 결합하지 않으므로 (실시예 3, 표 4), 따라서 본 실험은 표적 결합의 부재 하에 생체 내에서 IgG1-CD27-A 및 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 약동학적 거동을 시험하도록 설계되었다. 본 연구는 승인된 IACUC 프로토콜 및 크라운 바이오사이언스, 인크.(Crown Bioscience, Inc.) 표준 운영 절차에 따라 크라운 바이오사이언스 (중국)에서 자격을 갖춘 인력에 의해 수행되었다. 11-12주령 암컷 SCID 마우스 [C.B-17, 바이탈 리버 실험실 동물 기술 캄파니, 리미티드 (Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) (VR; 중국 베이징; 군당 3마리 마우스)]에게 200 μL 주사 용량으로 500 μg 항체 (25 mg/kg)를 정맥내 주사하였다. 항체 투여 후 10분, 4시간, 1일, 2일, 7일, 14일 및 21일에 혈액 샘플 40 μL를 수집하였고, 혈액 샘플로부터 혈장을 수집하며, ELISA에 의해 총 인간 IgG 농도를 결정할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 96-웰 ELISA 플레이트 (그라이너, Cat # 655092)를 4℃에서 2 μg/mL 항-인간 IgG (산퀸; 네덜란드, 물품 # M9105, Lot# 8000260395)로 밤새 코팅한 후 PBSA (0.2% 소 혈청 알부민 [BSA, 로슈, Cat # 10735086001]이 보충된 PBS)로 1시간 동안 차단하였다. 그 다음, 그 사이에 세척 단계를 거치면서, 항-인간 IgG-코팅된 플레이트를 플레이트 진탕기에서, ELISA 완충액 (0.05% Tween 20이 보충된 PBSA [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), Cat # P1379])에 연속적으로 희석한 혈장 샘플과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 폴리클로날 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 IgG 2차 항체 (잭슨, Cat # 109-035-098)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하며, 마지막으로 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) (ABTS; 로슈, Cat # 11112422001)를 사용하여 순차적으로 인큐베이션하였다. 2% 옥살산 [리델 드 하엔(Riedel de Haen), Cat # 33506]을 부가함으로써 반응을 정지시켰다. 주사에 사용된 각각의 재료의 희석 시리즈를 사용하여 참조 곡선을 생성하였다. 흡광도는 EL808 미세역가 플레이트 판독기 (BioSPX)에서 405 nm 하에 측정되었으며 총 인간 IgG 농도 (μg/mL 단위)가 플롯되었다.
마우스에 정맥내 주사한 후 상이한 시점에서 혈장 IgG 수준을 측정함으로써 결정된 바와 같이, IgG1-CD27-A-P329R-E345R과 그 대응물인 WT 항체 IgG1-CD27-A의 PK 프로파일 간에는 실질적인 차이가 없었다 (도 10).
마우스에서 인간 IgG1에 대한 예측과 비교하여 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 및 그의 WT 대응물 (IgG1-CD27-A)에 대해 초기 (분포) 단계에서 더 가파른 감소가 관찰되었지만, 항체 둘 다의 말단 제거는 2-구획 모델을 기반으로 한 인간 야생형 IgG1에 대한 예측 비율과 일치하였다 (Bleeker WK, Teeling JL, Hack CE. Blood. 2001 Nov 15;98(10):3136-42).
취합하면, 이는 P329R 및 E345R 돌연변이의 도입이 표적 결합의 부재 하에 IgG1-CD27-A의 약동학 특성에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증해준다.
주의: 본 실시예에 기재된 실험에서는 본 실험의 맥락에서 기능적으로 관련이 없는 F405L 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A 및 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 변이체가 사용되었다.
실시예 13: 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 의한 항체-의존적 세포성 식균작용의 유도
항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)은 주로 NK 세포에 발현된 FcγRIIIa를 통해 매개되는 반면, 항체-의존적 세포성 식균작용 (ADCP)은 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIII를 통해 단핵구, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포에 의해 매개될 수 있다 (Hayes, J. M et al. 2016). FcγRIa 발현 면역 세포의 이펙터 기능에 대한 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 FcγRIa에 대한 잔여 결합의 효과 (실시예 9)를 이해하기 위해, ADCP를 유도할 수 있는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 능력은 CTV-표지된 CD27+ 버킷 림프종 Daudi 세포를 표적 세포로서 사용하고 인간 단핵구 유래 대식세포 (hMDM)를 이펙터 세포 (E:T = 2:1)로서 사용하여 시험관 내에서 분석하였다.
제조업체의 지침에 따라 CD14 마이크로비즈(MicroBeads) (밀테니이 바이오텍, cat. no. 130-050-201)를 사용하여 양성 선택을 통해 hMDM을 PBMC로부터 단리하였다. PBMC를 원심분리하고 (1,200 RPM, 5분, 실온) 빙냉 단핵구 단리 완충액 (PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)에 1.25 x 107개 PBMC/mL의 밀도로 재현탁시켰다. 80 μL의 PBMC 현탁액당 20 μL의 CD14 마이크로비즈를 부가하고 롤러뱅크에서 4℃에서 15분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 30 mL의 빙냉 단핵구 단리 완충액을 부가하고, PBMC/CD14 마이크로비즈 혼합물을 원심분리 (300 xg, 10분, 4℃)한 후 6 mL의 빙냉 단핵구 단리 완충액에 재현탁시켰다. LS 칼럼 (밀테니이 바이오텍, cat. no. 130-042-401)을 3 mL의 빙냉 단핵구 단리 완충액으로 세정하고 각각의 칼럼에 3 mL의 PBMC/CD14 마이크로비즈 혼합물을 로딩하였다. CD14- 세포를 통과시키고 빙냉 단핵구 단리 완충액에서 칼럼을 3회 세척한 후, 플런저를 사용하여 3 mL의 빙냉 단핵구 단리 완충액에서 CD14+ 단핵구를 회수하였다. CD14+ 세포는 비아스타인(ViaStain)™ 생육력 염료 아크리딘 오렌지/프로피듐 아이오다이드 (AOPI; 넥셀롬 바이오사이언스(Nexcelom Bioscience), cat. no. CS2-0106)를 사용하여 셀로미터 오토 2000 세포 생육력 카운터 (넥셀롬 바이오사이언스)에서 계수하고, UpCell™ 표면이 포함된 100 mm2 Nunc™ 디쉬에서 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF; 깁코, cat. no. PH9501; 50 ng/mL 최종 농도) 및 단핵구 현탁액 3 mL (즉, 2.4 x 106개 단핵구)가 보충된 셀진(Celgene®) GMP DC 배지 [셀제닉스(CellGenix), cat. no. 20801-0500]에서 0.8 x 106개 세포/mL의 밀도로 재현탁되었으며, 이를 통해 플레이트를 실온에 방치시킴으로써 세포 수거가 가능하였다 [써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), cat. no. 174902]. 3일 동안 인큐베이션한 후, 5x M-CSF를 함유하는 2 mL의 신선한 배지를 플레이트에 부가하였다. 7일 동안 인큐베이션한 후 (37℃, 5% CO2), 플레이트를 실온에서 1 내지 1.5시간 동안 방치시킴으로써 대식세포를 표면으로부터 분리하였다. 분리된 대식세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, AOPI를 사용하여 계수하고, 배양 배지 (10% DBSI가 포함된 RPMI 1640)에 1 x 106개 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다.
인간 버킷 림프종 Daudi 세포 (ATCC® CCL-213™)는 제조업체의 지침에 따라 셀트레이스™ 바이올렛 세포 증식 키트 (써모 피셔 사이언티픽, cat. no. C34557)를 사용하여 표지되었다. 간단히 언급하면, 셀 트레이스 바이올렛 (CTV)을 PBS 중 1 x 106개 Daudi 세포/mL에 0.2 μM의 최종 농도가 되도록 부가하고 암실 내의 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다 (인큐베이션 용적 15 mL). 비결합된 염료를 불활성화하기 위해 10 mL DBSI를 부가하였다. 세포를 원심분리 (300 xg, 5분)에 의해 펠릿화하고 PBS로 세척한 후 AOPI로 계수하였다. CTV-표지된 Daudi 세포를 배양 배지에 0.5 x 106개 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다.
ADCP 검정을 위하여, hMDM (50,000개 세포/웰) 및 CTV-표지된 Daudi 세포 (25,000개 세포/웰)를 최종 용적 150 μL 배양 배지 중의 96-웰 플레이트에 있는 얼음 위에 함께 시딩하고 (E:T = 2:1) 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 항-CD20 항체 IgG1-CD20 (10배 희석에서 0.000001 내지 10 μg/mL 농도 범위)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다 (37℃, 5% CO2). 인큐베이션 후, 100 μL 인간 BD Fc 블록™ (비디 바이오사이언스, cat. no. 564220; FACS 완충액 중 1:100)을 부가하고 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리 (300 xg, 5분)에 의해 펠릿화하고 PE-Cy7 접합된 항인간 CD11b 항체 (바이오레전드, cat. no. 301322; 1:80) 및 TO-PRO-3 (써모 피셔 사이언티픽, cat. no. T3605; 1:25,000)를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁시키고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, FACS 완충액에 재현탁시키고, 수집하여 FACSymphony™ A3 세포 분석기 (비디 바이오사이언스)에서 분석하였다. 생육성 표적 세포 수와 포식 hMDM을 측정하기 위해 플로우조 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 처리하고 시각화하였다.
각각의 조건에 대한 생육성 Daudi 세포의 백분율은 하기 공식에 따라 계산되었다.
Figure pct00015
각각의 조건에 대한 포식 hMDM의 양은 % TO-PRO-3-CD11b+CTV+ 세포로서 결정되었다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 4명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터의 hMDM을 사용한 식균작용 검정에서 포식 hMDM의 백분율을 증가시키지 않았거나 생육성 Daudi 세포의 백분율을 감소시키지 않았다. 이는 잔여 FcγRIa 결합이 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 대한 FcγRIa-매개된 이펙터 기능을 초래하지 않았음을 입증해준다 (도 11에 제시된 대표적인 건강한 인간 공여자로부터의 데이터). 양성 대조군 항체 IgG1-CD20은 높은 수준의 CD20을 발현하는 Daudi 세포의 식균작용을 효율적으로 유도했으며, 이는 포식 hMDM의 백분율이 증가하고 생육성 Daudi 세포의 백분율이 감소한 것으로써 입증된 바와 같다.
결론적으로, FcγRIa에 대한 잔여 결합은 CD27+ 세포의 IgG1-CD27-A-P329R-E345R-의존적 ADCP를 유도하기에 충분하지 않았다.
실시예 14: C4d 침착 측정에 의해 결정된 바와 같이 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 의한 유체상, 표적-비의존적, 보체 활성화
Fc-Fc 상호작용-향상된 항체는 일반적으로 용액 내에서 단량체성 IgG1 분자로서 존재하며, 표적 결합 시 세포 표면에서 육량체화되어 활성 Fc 영역의 경우 C1q 도킹 장소를 형성한다 (Diebolder, C. A et al. 2014; de Jong, R. N et al., 2016). 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 IgG Fc 도메인은 P329R 돌연변이의 도입에 의해 침묵되며, 이로 인해 막-결합된 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 대한 C1q 결합이 결여된다 (도 6). IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 표적 결합의 부재 하에 용액 내 보체를 활성화할 수 없다는 것을 확인하기 위해, 고전적 보체 경로의 활성화를 위한 척도로 간주되는 C4d 침착을 측정함으로써 유체상, 표적-비의존적, 보체 활성화를 조사하였다. IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 의한 유체상 C4d 단편 침착은 MicroVue™ C4d 효소 면역검정 [EIA; 퀴델(Quidel), cat. no. A008]를 사용하여 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)으로 분석되었으며 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 열 응집된 감마 글로불린 (HAGG; 보체 활성화제; 퀴델, cat. no. A114)이 검정을 위한 양성 대조군으로서 사용되었다. IgG1-b12 및 IgG1-b12-RGY (WO2014006217A1))가 대조군 항체로서 포함되었다. IgG1 항체에 E345R/E430G/S440Y (RGY) Fc 돌연변이를 도입하면, 용액에서 육량체의 형성을 유도하여 유체상 보체 활성화를 초래하는 것으로 보고되었다 (Diebolder, C. A et al., 2014; Wang, G., R. N et al., 2016; de Jong, R. N et al., 2016). IgG1-b12-P329R-E345R이 이소타입 대조군 항체로서 포함되었다.
항체 희석액은 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 1 mg/mL의 농도로 제조되었으며, HAGG는 10 mg/mL의 농도로 희석되었다. 그런 다음, 시험 샘플을 90% (최종 농도) 정상 인간 혈청 (NHS) [컴프테크(CompTech), Lot. no. 42a] 중 100 μg/mL (모노클로날 IgG의 경우) 또는 1,000 μg/mL (HAGG의 경우)의 농도로 추가로 희석하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이와 동시에, '항체 없음' 샘플 (항체 없음, 90% NHS) 및 'PBS 단독' 샘플 (항체 없음, NHS 없음)이 음성 대조군으로서 포함되었다. 그 다음으로, 샘플을 차가운 키트-제공된 보체 표본 희석액에 1:250으로 희석하였다. 그동안, 마우스 항-인간 C4d 항체로 코팅된 스트립을 96-웰 플레이트에 놓고 검정 웰을 첫 번째 세척 후 1분 대기 단계로 250 내지 300 μL 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 시험 샘플을 웰에 부가하고 (100 μL/웰) 음성 대조군으로서, 보체 표본 희석액 단독 (블랭크)이 ELISA에 사용되었다. 이와 동시에, 100 μL의 표준물 (표준 A-E) 및 키트에 의해 제공된 내부 대조군을 별도의 웰에 부가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 50 μL의 C4d 접합체 (퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 C4d)를 웰에 부가하고 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 기재된 바와 같이 세척 완충액을 사용한 5회 세척 단계 후, 100 μL의 C4d 기질 [0.7% 2-2'-아지노-디-(3-에틸벤즈티아졸린 술폰산 디암모늄 염]을 부가하고 다시 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 키트-제공된 정지 용액 50 μL를 부가하고 1시간 이내에 ELISA 플레이트 판독기 (EL808 BioSPX, BioTek)를 사용하여 405 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R 및 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R (IgG1-CD27-A-P329R-E345R과 동일한 Fc 백본을 가짐)은 100 μg/mL의 시험된 농도에서 유체상 C4d 침착을 유도하지 않았으며; 측정된 C4d 수준은 야생형 Fc 도메인이 있는 대조군 항체 (IgG1-b12) 및 항체 없는 대조군의 배경 수준과 유사하였다 (도 12). 대조적으로, 용액에서 육량체를 형성하는 것으로 공지되어 있는 양성 대조군 항체 IgG1-b12-RGY는 HAGG와 동일한 수준으로 C4d 침착을 유도하였다.
이러한 데이터는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 시험관 내에서 표적-비의존적인 유체상 보체 활성화를 유도하지 않았다는 것을 제시한다.
실시예 15: 리간드 결합을 놓고 CD70과 경쟁할 수 있는 항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 능력
항-CD27 항체 IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 CD27과 그의 자연 리간드 CD70의 상호작용을 방해하는지 결정하기 위해, 인간 버킷 림프종 세포주 Daudi에서 내인성으로 발현되는 포화 농도의 비오티닐화된 재조합 인간 CD70 세포외 도메인 (ECD)의 CD27에 대한 결합을 과잉 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 존재 및 부재 하에 연구하였다.
10% 공여자 소 혈청과 철 (DBSI; 깁코, cat. no. 20731-030)이 보충된 RPMI 1640 배지 (깁코, cat. no. A10491-01)에서 배양된 Daudi 세포 (ATCC® CCL-213™)를 둥근 바닥 96-웰 플레이트 (그라이너 바이오 원, cat. no. 650261)에 50,000개 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 원심분리 (300 xg, 3분, 4℃)에 의해 펠릿화하고 항-CD27 또는 대조군 항체 (50 μg/mL 최종 농도)를 함유하는 FACS 완충액 (PBS, 1% BSA [로슈, cat. no. 1073508600])에 재현탁시켰다. 비오티닐화된 재조합 인간 CD70 ECD [압캠(Abcam), cat. no. ab271443]를 포화 농도 (6 μg/mL)로 부가하고 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
세포를 2회 세척하고 브릴리언트 바이올렛 (BV) 421™ 표지된 스트렙타비딘 (바이오레전드, cat. no. 405225; 0.0025 μg/mL 최종 농도) 및 R 피코에리트린 (PE) 표지된 폴리클로날 아피니퓨어 F(ab')2 단편 염소-항-인간 IgG Fc (잭슨 이뮤노리서치, cat. no. 109 116098; 0.0025 μg/mL 최종 농도)를 함유하는 FACS 완충액에 4℃에서 30분 동안 재현탁시켰다. 세포를 2회 세척하고, TO-PRO-3 아이오다이드 (써모 피셔 사이언티픽, cat. no. T3605; 1:25,000)를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁하고 분석하였다. BD FACSymphony™ A3 유동 세포계수기 (비디 바이오사이언스)에서 데이터를 수집하고 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 보상을 위해, UltraComp eBeads™ 보상 비드 [라이프 테크놀로지스(Life Technologies), cat. no. 01-2222-42] 한 방울을 각각의 웰에 부가하였다. 각각의 항체 2 μL를 부가하고 혼합물을 20분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 스핀다운하고 비드를 FACS 완충액에 재현탁하여 측정하였다. 생육력 보상을 위해, 세포를 65℃에서 10분 동안 처리하고 생육성 세포와 1:1로 혼합하였다. 세포를 스핀다운하고 FACS 완충액에 희석된 TO-PRO-3에 재현탁시켰다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 데이터를 처리하고 시각화하였다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 IgG1-CD27-A는 CD27+ Daudi 세포에 대한 CD70 ECD의 결합을 차단시키지 않았는데, 이는 CD70 결합 수준이 비결합 이소타입 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R 또는 IgG1-b12와 함께 인큐베이션된 Daudi 세포 또는 항체가 없는 세포에 대한 수준에 필적하였기 때문이다 (도 13). 또한, 선행 기술의 항-CD27 항체 IgG1-CD27-BMS986215 및 IgG1-CD27-131A는 CD70 ECD에 대한 CD27 결합에 대해 약한 차단 효과를 나타냈다. 대조적으로, CD70은 이전에 리간드-결합을 차단시키는 것으로 보고된 (문헌 [Vitale et al., 2012]) 선행 기술의 항-CD27 항체 IgG1-CD27-CDX1127 (도 13)의 존재 하에 Daudi 세포 상의 표면 CD27과 결합할 수 없었다.
결론적으로, IgG1-CD27-A-P329R-E345R 결합은 Daudi 세포에서 그의 자연 리간드 CD70에 의한 CD27 결합을 차단시키지 않는다.
실시예 16: 폴리클로날 방식으로 자극된 인간 PBMC와 항-CD27 항체의 인큐베이션 시 T-세포 활성화 마커 발현
폴리클로날 방식으로 활성화된 T 세포에서 T-세포 활성화 마커의 발현에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 효과는 3명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터 수득된 PBMC를 사용하여 연구되었다. HLA-DR, CD25, CD107a 및 4-1BB의 발현은 PBMC를 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 선행 기술의 항-CD27 항체와 함께 2일 및 5일 동안 인큐베이션한 후 분석되었다.
신선하게 단리된 75,000개 PBMC/웰을 세포 배양 배지 내 96-웰 U 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원)에 시딩하였다. 이중 웰을 항-CD3 항체 (UCHT1 클론; 스템셀; 0.1 μg/mL); 및 IgG1-CD27-A-P329R-E345R (3배 희석 시 0.0005 내지 30 μg/mL); 또는 선행 기술의 항-CD27 항체 IgG1-CD27-CDX1127, IgG1-CD27-131A 및 IgG1-CD27-BMS986215 (30 μg/mL); 또는 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R (10 μg/mL)과 동시에 인큐베이션하였다. 처리 없이 각각의 활성화 마커의 발현을 결정하기 위해, 미처리된 (항-CD3 또는 항-CD27 항체 없음) 세포가 있는 이중 대조군 웰에 배양 배지 단독을 보충하였다. 활성화 마커 양성 세포를 확인하기 위한 게이트를 설정하기 위해, 형광 마이너스 1 (FMO) 대조군을 사용하였다. FMO 대조군의 경우, 이중 웰 내의 활성화 마커에 상응하는 항체를 제외하고는 본 실험에 사용된 모든 항체를 항-CD3 항체로 활성화된 하나의 공여자로부터의 75,000개 PBMC/웰에 부가하였다. 염색 항체가 없는 단일 웰 내의 각각의 공여자로부터의 미처리된 세포가 음성 대조군으로서 포함되었다. 생육성 세포를 검출하기 위해, 각각의 공여자로부터의 미처리된 세포를 단일 웰에서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 단독으로 염색하였다.
2일 또는 5일 동안 인큐베이션한 후 (37℃, 5% CO2), 플레이트를 FACS 완충액으로 1회 세척하고 T-세포 활성화 마커 4-1BB, CD25, CD107a, 인간 백혈구 항원 (HLA)-DR에 대한 항체 및 유동 세포계수법에서 CD4+ 및 CD8+ T-세포 서브세트를 게이팅하기 위한 항체를 함유하는 FACS 완충액 중 항체 혼합물에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 모든 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 세포를 FACS 완충액에 재현탁시켰다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 상의 각각의 T-세포 활성화 마커에 대한 중앙값 형광 강도 (MFI) 및 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 플로우조 소프트웨어를 사용하여 BD LSRFortessa 세포 분석기에서 샘플을 분석하였다. T-세포 활성화 마커의 발현 수준에 있어서의 항-CD27 항체 유도된 변화는 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R과 비교한 항-CD27 항체 샘플의 MFI에서의 변화 배수로서 제시되었다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 BD LSRFortessa™ 세포 분석기 (비디 바이오사이언스)에서 샘플을 분석하였다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 활성화된 CD4+ T 세포에서 CD25, CD107a 및 4-1BB의 발현을 증가시켰다 (도 14A). 이러한 효과는 인큐베이션 5일 후보다 인큐베이션 2일 후에 더 두드러졌다. CD8+ T 세포에서는, IgG1-CD27-A-P329R-E345R과의 인큐베이션은 인큐베이션 2일 및 5일 후 둘 다에 HLA-DR, CD107a 및 4-1BB의 발현을 증가시켰다 (도 14B).
T-세포 활성화 마커의 발현은 또한 3가지 선행 기술의 항체와 함께 2일 및 5일 동안 인큐베이션하여 평가되었다. IgG1-CD27-131A 및 IgG1-CD27-BMS986215는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 HLA-DR, 4-1BB, CD25 및 CD107a의 발현에 있어서 비슷한 증가를 유도한 반면, T-세포 활성화 마커 발현에 대한 IgG1-CD27-CDX1127과 함께 2일 또는 5일 동안 인큐베이션한 효과는 덜 뚜렷하였다.
결론적으로, 폴리클로날 방식으로 활성화된 PBMC를 IgG1-CD27-A-P329R-E345R과 함께 인큐베이션하면 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 활성화 마커 HLA-DR, CD25, CD107a 및 4-1BB의 발현이 증가되었다.
실시예 17: 인간 CD27-KI 마우스 모델에서 항-CD27 항체의 주사 후 OVA 단백질-면역화된 마우스 내에서의 OVA-특이적 CD8 + T 세포의 백분율
비장세포의 hCD27 KI OVA 모델에서 항원-특이적 T 세포의 확장에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 처리의 효과를 유동 세포계수법으로 분석하였다.
C57BL/6 배경의 동형접합성 인간 CD27 (hCD27)-KI 마우스 (hCD27 KI 마우스)는 베이징 바이오사이토젠 캄파니, 리미티드(Beijing Biocytogen Co., Ltd.) (계통 명칭 C57BL/6-Cd27tm1(CD27)/Bcgen, Stock no. 110006)로부터 수득되었다. 이러한 계통은 크라운 바이오사이언스의 HuGEMM™ 플랫폼과 협력하여 개발되었으며, 기능적 면역 체계를 갖춘 마우스 내에서 인간화 약물 표적 (이러한 경우 CD27)을 특색으로 한다. hCD27 KI 마우스에서, 세포외 도메인을 코딩하는 마우스 CD27 유전자의 엑손 1-5가 인간 CD27 엑손 1-5로 대체되었다. OVA-특이적 T 세포는 hCD27-KI 마우스에 면역원 오브알부민 (OVA)을 피하 (s.c.) 주사하여 생체 내에서 유도되었으며 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 효능제 효과는 마우스에게 항체를 정맥내 (i.v.)로 동시에 투여함으로써 시험되었다.
제0일에, 마우스에게 5 mg OVA [인비보겐(InvivoGen), cat. no. vac-pova-100, lot. no. EFP-42-04]를 피하 주사하고 IgG1-CD27-A-P329R-E345R (30 mg/kg), IgG1-CD27-CDX1127 (30 mg/kg) 또는 IgG1-b12-P329R-E345R (30 mg/kg)를 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사함으로써 처리하였다. 제12일과 제21일에, 마우스를 OVA로 부스팅하고 제0일에서와 같이 항체로 처리하였다. 제10일, 제19일 및 제24일에, 디포타슘 에틸렌디아민테트라아세트산 (K2-EDTA; BD, cat. no. 365974)을 함유하는 BD Microtainer® 혈액 수집 튜브에서 볼 파우치 또는 사페나을 통해 혈액을 수집하고 즉시 추가 분석에 사용하였다. 제28일에, 마우스를 안락사시키고 비장을 멸균 조건 하에서 절제하였다.
RPMI1640 배지 (써모 피셔 사이언티픽, cat. no. C22400500BT) 중의 절제된 비장 조직을 gentleMACs™ C 튜브 (밀테니이 바이오텍, cat. no. 130-093-237)로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 gentleMACS™ 해리기 (밀테니이, cat. no. 130-093-235)을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 해리하였다. 해리 후, 세포 현탁액을 70 μm 세포 여과기 [팔콘(Falcon), cat. no. 352350]를 통해 여과하였다. 그 다음으로, 샘플을 3 mL 세척 완충액 (4% FBS [깁코, cat. no. 10099 141]가 보충된 멸균 PBS [하이클론(Hyclone), SH0256.01B])에 재현탁하여 2회 세척하였다. 세포를 셀로미터 오토 T4 (넥셀롬 바이오사이언스)에서 계수하고 세포 수를 튜브당 2 x 106개의 비장세포로 조정하였다.
2 x 106개의 비장세포를 FACS 튜브 (팔콘, cat. no. 352052)로 옮기고 1 μg/mL 정제된 래트 항-마우스 CD16/CD32 (마우스 BD Fc 블록™, 비디 바이오사이언스, cat. no. 553141)가 보충된 세척 완충액 (4% FBS [깁코, cat. no. 10099 141]가 보충된 멸균 PBS [하이클론, SH0256.01B])에 재현탁시켰다. 암실 내의 2-8℃에서 10분 동안 사전 인큐베이션한 후, 10 μL PE-표지된 OVA-사량체 (MBL 라이프 사이언스, cat. no. TS 5001 1C)를 부가하고, 샘플을 부드럽게 와동시킨 후 암실 내의 2-8℃에서 30-60분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 세척하지 않고, T-세포 서브세트의 유동 세포계수법 게이팅에 사용되는 표지된 항체 및 화합물을 부가하였다. 샘플을 부드럽게 와동시키고 암실 내의 2-8℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음으로, 샘플을 2 mL 세척 완충액에 재현탁하여 2회 세척하고 300 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 마지막으로, 세포를 250 μL 세척 완충액에 재현탁시키고 BD LSRFortessa™ X-20 세포 분석기 (비디 바이오사이언스)에서 분석하였다. 데이터는 칼루자(Kaluza) 분석 소프트웨어 [베크만 쿨터(Beckman Coulter)]를 사용하여 처리되었다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 OVA 단백질 백신접종을 동시에 주사한 마우스의 혈액과 비장에서 OVA-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 증가시켰다. 30 mg/kg IgG1-CD27-CDX1127로 처리된 마우스에서의 OVA-특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 IgG1-CD27-A-P329R-E345R-처리된 군보다 더 낮았고 IgG1-b12-P329R-E345R-처리된 군과 비슷하였다 (도 15).
실시예 18: 항-CD27 항체를 주사한 OVA-면역화된 마우스의 비장으로부터의 OVA-특이적 CD8 + T 세포에 의한 IFNγ 분비
RPMI1640 배지 중의 절제된 비장 조직 (실시예 17 참조)을 70 μm 세포 여과기 (팔콘, cat. no. 352350) 위에서 부드럽게 으깨고, 원심분리 (1,500 rpm, 5분)에 의해 펠릿화하고, 10 mL 염화암모늄-칼륨 (ACK) 용해 완충액 (인비트로젠, cat. no. A1049201)에 재현탁시켰다. 실온에서 3-5분 인큐베이션한 후, 샘플을 10-20 mL PBS로 2회 세척하고 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신 (펜/스트렙, 깁코, cat. no. 15070-063)이 보충된 5 mL 셀룰러 테크놀로지 리미티드(Cellular Technology Limited) (CTL) 시험™ 배지 [이뮤노스팟(ImmunoSpot), cat. no. CTLT-005]에 재현탁시켰다. 수집된 비장세포를 70 μm 세포 여과기를 통해 다시 여과하고 Vi-CELL™ XR 세포 생육력 분석기 (베크만 쿨터)에서 계수하여 펜/스트렙을 함유하는 CTL-시험 배지를 사용하여 농도를 3.125 x 106개 세포/mL로 조정하였다.
비장세포에 의한 IFNγ 생산은 본질적으로 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 마우스 IFN-γ ELISpotPLUS 키트 [마브텍(Mabtech), cat. no. 3321-4HPW-2]를 사용하여 분석되었다. 사전 코팅된 멀티스크린HTS IP 필터 (MSIP) 백색 플레이트 (mAb AN18)를 웰당 200 μL 멸균 PBS로 4회 세척하고 펜/스트렙을 함유한 200 μL CTL-시험 배지로 컨디셔닝하였다 (실온, 30분). 배지를 제거하고 웰당 5 x 105개의 비장세포를 2 μg/mL OVA257-264 펩티드 SIINFEKL (인비보겐, cat. no. vac-sin) 또는 스크램블드 대조군 펩티드 FILKSINE (SB-PEPTIDE, cat. no. SB073-1MG)과 함께 총 용적 180 μL/웰로 20시간 동안 가습 인큐베이터 (37℃, 5% CO2)에서 이중으로 인큐베이션하였다. IFNγ 생산에 대한 양성 대조군으로서, 비장세포를 500 ng/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA) 및 10 μg/mL 이오노마이신 (PMA+이오노마이신, 다케위 바이오텍(Dakewe Biotech), cat. no. DKW ST PI)으로 이루어진 세포 자극 칵테일과 병행하여 인큐베이션하였다. 펩티드가 없는 비장세포의 배양물이 음성 대조군으로서 포함되었다. 인큐베이션 후, 세포를 제거하고 플레이트를 PBS로 5회 세척하였다. 그 다음으로, 비오티닐화된 검출 mAb (R4-6A2; 실온, 2시간), 스트렙타비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP; 실온, 1시간) 및 마지막으로 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액 (모두 키트에 의해 제공됨)을 사용하여, 그 사이에 PBS로의 5회 세척 단계를 거쳐 플레이트를 순차적으로 인큐베이션하였다. 뚜렷한 스팟이 나타나면, 탈이온수로 광범위하게 세척하여 반응을 정지시켰다. SpotAID V8 소프트웨어 (AID)를 사용하여 AID iSpot ELISpot 판독기 (오토이뮨 다이아그노스티카 [AID] 게엠베하(Autoimmun Diagnostika [AID] GMBH), ELR08IFL)에서 스팟을 계수하였다. ELISpot 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석되고 막대 다이어그램으로 제시되었으며 처리군 (n=5)당 모든 마우스로부터의 웰당 평균 스팟 수 ± SEM으로서 제시되었다.
모든 IgG1-CD27-A-P329R-E345R-처리된 동물 군으로부터의 비장세포는 ELISpot 분석에 의해 입증된 바와 같이 OVA 펩티드 처리에 반응하여 IFNγ 생산이 증가한 것으로 나타났다 (도 16). 스크램블드 대조군 펩티드로 비장세포를 자극하면 IFNγ 생산이 전혀 유도되지 않거나 최소한으로 유도되었으며, 이는 IFNγ가 OVA-특이적 T 세포에 의해 생산되었다는 것을 시사한다. 대조적으로, 30 mg/kg IgG1-CD27-CDX1127로 처리된 마우스로부터의 비장세포에서는 IFNγ 생산이 관찰되지 않았다.
실시예 19: 생체 내에서 OVA-면역화된 마우스에서 T-세포 활성화에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 처리의 효과
CD8+ T-세포 활성화에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 처리의 효과는 OVA-처리된 hCD27-KI 마우스로부터 유래된 CD8+ T 세포에서 PD-1의 발현을 분석함으로써 생체 내에서 연구되었다. 실시예 17에 기재된 바와 같이 마우스를 처리하였다. 또한, FACS에 의해 비장세포를 수득하고 분석하는 방법이 실시예 17에 기재되어 있다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 제28일에 활성화 마커 PD-1을 발현하는 CD8+ T 세포의 백분율 증가를 유도하였다. CD8+PD-1+ T-세포 백분율은 IgG1-CD27-CDX1127 또는 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R로 처리된 동물에서 낮았다 (도 17).
실시예 20: OVA-면역화된 마우스에서 T-세포 서브세트의 생체내 유도에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 처리의 효과
T-세포 서브세트의 확장에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 효과는 OVA-처리된 hCD27-KI 마우스로부터의 비장세포 샘플에서의 CD44 및 CD62L의 발현을 분석함으로써 연구되었다. IgG1-CD27-A-P329R-E345R-처리되고 OVA-면역화된 hCD27-KI 마우스의 비장으로부터 유래된 기억 CD8+ T 세포를 유동 세포계수법으로 정량화하였다. 기억 T 세포는 이펙터 기억 T 세포 (CD44+CD62L-)와 프리-이펙터 T 세포 (CD44-CD62L-; 문헌 [Nakajima, Y., K et al. 2018])로서 분류되었다. 실시예 17에 기재된 바와 같이 마우스를 처리하였다. 또한, FACS에 의해 비장세포를 수득하고 분석하는 방법이 실시예 17에 기재되어 있다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R (30 mg/kg)은 IgG1-b12-P329R-E345R로 처리된 마우스의 비장세포와 비교했을 때 제28일에 비장에서 프리-이펙터 T 세포 및 이펙터 기억 CD8+ T 세포의 증가된 백분율을 유도하였다 (도 18). CD45+ 집단 내에서, IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 IgG1-CD27-CDX1127 (30 mg/kg)보다 더 높은 백분율의 프리-이펙터 T 세포 및 이펙터 기억 T 세포를 유도한 반면, 이들 T-세포 집단의 필적하는 평균 백분율은 비장세포의 CD8+ 분획에서 항-CD27 항체 둘 다에 의해 유도되었다.
실시예 21: OVA-면역화된 마우스에서 T 세포의 생체내 확장에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 처리의 효과
T 세포의 확장에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 효과는 OVA-처리된 hCD27-KI 마우스로부터의 비장세포 및 혈액 샘플에서 CD3의 발현을 분석함으로써 연구되었다. 실시예 17에 기재된 바와 같이 마우스를 처리하였다. 또한, 유동 세포계수법에 의해 비장세포 및 혈액 샘플을 수득하고 분석하는 방법이 실시예 17에 기재되어 있다.
OVA-면역화된 hCD27-KI 마우스를 30 mg/kg IgG1-CD27-A-P329R-E345R로 처리하면, 비-결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R를 사용한 처리와 비교하여 비장 내의 CD3+ T 세포의 백분율이 증가하지 않았다 (도 19). 대조적으로, 벤치마크 항체 IgG1-CD27-CDX1127 (30 mg/kg)로 처리하면, 비장 내의 CD3+ T 세포의 감소가 초래되었다. 말초 혈액 샘플에서도 유사한 관찰이 이루어졌다.
실시예 22: 항원-특이적 연구에서 T-세포 시토카인 생산에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 효과
시토카인 생산을 증가시킬 수 있는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 능력은 동족 항원에 의해 자극된 T 세포를 사용하여 연구되었다. PBMC는 제조업체의 지침에 따라 피콜-파크(Ficoll-Paque) 밀도 구배 분리 [지이 헬스케어(GE Healthcare), cat. no. 17 1440 03]를 통해 건강한 인간 공여자로부터 수득된 연막으로부터 단리되었다.
인간 자성 CD14 및 CD8 마이크로비즈 (밀테니이 바이오텍, 각각 cat. no. 130 050 201 및 130 045 201)는 CD14+ 단핵구의 양성 선택 및 인간 PBMC로부터의 CD14- PBL의 음성 선택, 및 동결된 PBL로부터의 CD8+ T 세포의 양성 선택에 사용되었다. 세포 현탁액을 원심분리하고 자성-활성화된 세포 분류 (MACS) 완충액 (5 μM EDTA 및 0.2% 인간 알부민을 포함하는 둘벡코의 인산염 완충 식염수 [DPBS])에 80 μL MACS 완충액당 1 x 107개의 살아있는 세포로 재현탁시켰다. 1 x 107개의 세포당 12 μL의 CD14 또는 CD8 마이크로비즈를 부가하였다. 후속 MACS 분리는 자동화된 자성 세포 분리 장비를 사용하거나 수동 분리를 통해 수행되었다. 제조업체의 지침에 따라 autoMACS® 프로 분리기 (밀테니이 바이오텍)를 사용하여 자동화된 MACS 분리를 수행하였다. 용출된 CD14+ 단핵구 및 CD8+ T 세포를 원심분리하고 (8분, 실온에서 300 xg), X-VIVO 15 배지 (론자)에 재현탁시키고 추가 사용을 위해 에리트로신 B 용액으로 계수하는데; 즉, iDC로의 단핵구 분화 또는 PD-1 및/또는 CLDN6-특이적 T-세포 수용체 (TCR) mRNA를 사용한 CD8+ T 세포의 전기천공을 수행하였다.
단핵구 유래 iDC의 생성을 위해, 최대 40 x 106개 PBMC 유래 CD14+ 단핵구를 100 ng/mL 인간 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF; 밀테니이 바이오텍, cat. no. 130-093-868) 및 50 ng/mL 인간 IL-4 (밀테니이 바이오텍, cat. no. 130093 924)가 보충된 DC 배지 (RPMI 1640, 5% 풀링된 인간 혈청 [PHS; 원 람다(One Lambda), cat. no. A25761], 1x 최소 필수 배지 비-필수 아미노산 용액 [MEM NEAA, 라이프 테크놀로지스, cat. no. 11140 035], 1 mM 피루브산나트륨 [라이프 테크놀로지스, cat. no. 11360 039]) 중 T175 플라스크에서 5일 동안 배양하였다 (37℃, 5% CO2). 배양 3일 후, 플라스크 당 배지의 절반을 교체하였다. 플라스크로부터 채취한 배지 내 비부착성 단핵구를 펠릿화하고 (8분, 실온에서 300 xg), 200 ng/mL GM-CSF 및 100 ng/mL IL-4가 보충된 신선한 DC 배지에 재현탁시킨 다음, 원래 플라스크로 되돌려 보냈다. 5일 동안 인큐베이션한 후, 2 mM EDTA를 함유하는 10 mL DPBS를 사용하여 배양 플라스크에 부착된 iDC를 분리하였다 (37℃, 10분). 단리된 iDC를 세척하고, 펠릿화하고 (8분, 실온에서 300 xg) CLDN6 mRNA를 사용한 전기천공에 사용하였다.
인간 CD8+ T 세포를 인간 CLDN6에 특이적인 마우스 TCR의 알파 및 베타 쇄를 코딩하는 RNA로 단독으로 또는 PD-1을 코딩하는 RNA와 함께 전기천공하고, 인간 단핵구 유래 iDC를 인간 CLDN6을 코딩하는 RNA로 전기천공하였다. 최대 5 x 106개 iDC 또는 15 x 106개 CD8+ T 세포를 ECM 830 구형파 전기천공 시스템 (BTX®)을 사용하여 실온에서 250 μL X-VIVO 15 배지에 전기천공하였다. 세포를 RNA와 혼합하고, 펄스를 적용한 후 (T 세포의 경우 500 V, 3 ms 또는 iDC의 경우 300 V, 12 ms) 미리 예열된 검정 배지 (5% PHS를 갖는 IMDM GlutaMAX [라이프 테크놀로지스, cat. no. 31980030]) 750 μL로 즉시 희석하였다. 전기천공된 iDC를 6- 또는 12-웰 플레이트로 옮기고 밤새 배양하였다 (37℃, 5% CO2). 밤새 인큐베이션 후, 전기천공된 CD8+ T 세포와 iDC는 세포 순도, 형질감염된 RNA의 발현 (CD8+ T 세포 상에서의 PD-1 및 CLDN6-TCR 및 iDC 상에서의 CLDN6), 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD27 및 PD-1, 및 iDC 상에서의 PD-L1의 기준선 발현을 평가하기 위해 유동 세포계수법으로 평가되었다. 전기천공된 CD8+ T 세포의 대략 78% 내지 93%, 78% 내지 92%, 및 36% 내지 98%가 CLDN6-TCR, PD-1 및 내인성 CD27을 각각 발현하였다. 전기천공된 iDC의 대략 47% 내지 91% 및 94% 내지 99%가 CLDN6 및 내인성 PD-L1을 각각 발현하였다 (제시되지 않음).
CD8+ T 세포와 iDC를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 10:1 비율 (웰당 7.5x104개 T 세포 및 7.5x103개 iDC)로 시딩하였다. IgG1-CD27-A-P329R-E345R을 검정 배지에 희석하고 25 μL의 희석된 IgG1-CD27-A-P329R-E345R을 웰에 부가하여 10 μg/mL의 최종 농도에 도달하였다. 유사하게, 대조군 항체 IgG1-CD27-131A 및 IgG1-b12-P329R-E345R을 부가하여 최종 농도 10 μg/mL에 도달하였다. 항체 처리 시 항원-특이적 T-세포 활성은, CLDN6을 발현하고 제시하기 위해 형질도입된 iDC와 공동 배양된 CLDN6-TCR을 발현하도록 형질도입된 T 세포의 상청액 중의 시토카인을 측정함으로써 시험관 내에서 분석되었다. 2일 후에 상청액을 수집하고, 다중 염증 유발성 시토카인 및 케모카인의 농도를 제조업체의 지침에 따라 10-스팟 U-PLEX 이뮤노온콜로지 그룹 1 (인간) 키트 (MSD; cat. no. K151AEL 2)를 사용하여 다중 전기화학발광 검정 (ECLIA)에 의해 결정하였다.
10-스팟 U-PLEX 이뮤노온콜로지 그룹 1 키트의 경우, 비오티닐화된 포획 항체를 비오틴-결합 도메인을 갖는 할당된 링커와 함께 실온에서 30분 동안 사전 인큐베이션한 후, 정지 용액과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 1시간 동안 진탕시키면서 실온에서 인큐베이션함으로써 플레이트를 링커 커플링된 포획 항체의 혼합물로 코팅하였다. 플레이트를 1x MSD 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 상청액 샘플 또는 키트 표준물을 검정 희석액에 1:2로 희석하고, 웰에 부가한 후 실온에서 2시간 동안 계속 진탕하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 키트로부터의 SULFO-TAG-접합된 검출 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 계속 진탕하면서 인큐베이션하였다. 전기화학발광 반응을 촉매하기 위해 판독 완충액 B를 부가하기 전에 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. MESO 퀵플렉스 SQ 120 영상화기 (MSD)에서 광 강도를 측정함으로써 플레이트를 즉시 분석하였다.
시토카인 생산에 있어서의 IgG1-CD27-A-P329R-E345R-유도된 변화는 인큐베이션 2일 후 CD8+ T 세포/iDC 공동 배양물로부터의 상청액에서 다중 ECLIA에 의해 평가되었다 (n=4명의 상이한 공여자). IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 내인성 수준의 PD-1을 발현하는 CD8+ T 세포와의 CD8+ T 세포/iDC 공동 배양물에서 GM-CSF 및 IFN-γ 생산의 상당한 증가를 유도한 한편 (도 20A), IL-13 및 TNFα 생산의 증가도 관찰되었다. 동일한 시토카인에 대한 상당한 증가가, PD-1-과다발현 T 세포를 함유하는 배양물에서 관찰되었다 (도 20B). T 세포가 PD-1을 과다발현할 때 시토카인 수준이 일반적으로 감소한 반면, IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 존재 하에서는 시토카인 생산에서의 상대적 증가 (증가 배수)는 이러한 설정에서 가장 높았다 (도 20A 및 B). 대조적으로, 선행 기술의 항-CD27 항체 IgG1-CD27-131A는 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R과 비교하여 시토카인 생산에 대한 최소한의 효과를 제시하였다 (도 20A 및 B).
실시예 23: IgG1-CD27-A-P329R-E345R과 함께 인큐베이션된 항원-특이적 CD8 + T 세포에 의한 세포독성-연관 분자의 발현
항체 처리 시 T-세포 매개된 세포독성의 유도는 CLDN6-TCR 및 MDA-MB-231_hCLDN6 표적 세포을 발현하도록 형질도입된 건강한 인간 공여자 T 세포의 공동 배양물에서 유동 세포계수법을 통해 항원-특이적 T 세포에 대한 세포독성-연관 분자의 발현을 분석함으로써 연구되었다.
MDA-MB-231_hCLDN6 세포는 렌티바이러스 형질도입에 의해 생성되었다. 이를 위해, 10% FBS (비-열-불활성화됨)가 보충된 250 μL 둘벡코의 변형 이글 배지 (DMEM, 써모 피셔 사이언티픽, cat. no. 31966-047) 중의 2x105개 MDA-MB-231 세포를 12-웰 조직 배양 플레이트에 웰당 시딩하였다. 세포를 37℃ (7.5% CO2)에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 인간 CLDN6 (pL64b42E(EF1a-hClaudin6)히그로-T2A-GFP)을 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 얼음 위에서 해동시키고 총 용적 750 μL DMEM/10% FBS로 희석하여 2x105, 8x104 및 3.2x104 TU/mL의 역가를 수득하였다. 이들 역가는 1, 0.4, 및 0.16의 MOI에 각각 상응한다. 그런 다음 상청액을 MDA-MB-231 세포에 부가하고, 세포를 방해 없이 37℃ (5% CO2)에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 본 실시예에 기재된 실험을 위해, MDA-MB-231-hCLDN6 세포를 DMEM/10% FBS에서 배양하였다. 실험을 위해 세포를 70% 내지 90% 합류점에서 계대배양하거나 수거하였다. 아큐타제 (써모 피셔 사이언티픽, cat. no. A11105010)로 5분 동안 처리함으로써 (37℃, 7.5% CO2) 세포를 분리한 후, 배양 배지를 부가하여 재현탁시켰다. 세포를 원심분리하고 (300 xg, 실온에서 4분) 계수하였다. MDA-MB-231_hCLDN6 세포는 20회 초과 계대 동안 배양되지 않았다.
MDA-MB-231_hCLDN6 세포를 96-웰 평평한 바닥 플레이트 (유동 세포계수법의 경우) 및 xCELLigence E-플레이트 [애질런트(Agilent), cat. no. 05232368001; 임피던스 측정의 경우]에 1.2 내지 1.5 x 104개 세포/웰로 시딩하고 실온에서 30분 동안 침전시켜 두었다. 그 다음으로, 플레이트를 인큐베이터 및 xCELLigence 실시간 세포 분석 (RTCA) 기기 (ACEA 바이오사이언스)에서 각각 하루 동안 인큐베이션하였다 (37℃, 5% CO2).
단리된 CD8+ T 세포 (실시예 22 참조)를 CLDN6-특이적 TCR mRNA로 전기천공하고 밤새 인큐베이션하였다. CD8+ T-세포 단리 및 전기천공 후, T-세포 배양물은 49% 내지 99%의 CD8+ T 세포를 함유하였다. 이들 전기천공된 CD8+ T 세포 중에서, 대략 78% 내지 93%가 CLDN6-TCR을 발현하였고, CLDN6-TCR+ CD8+ 세포의 59% 내지 98%가 CD27+였다. 세포를 원심분리하고 (8분, 실온에서 300 xg), DMEM/10% FBS에 재현탁시키고 계수하였다. 세포를 다시 원심분리하고, DMEM/10% FBS에 3 x 106개 세포/mL로 재현탁시킨 다음, 이전에 시딩된 MDA-MB-231_hCLDN6 세포 (1.5 x 105개 CD8+ T 세포/웰; T 세포:종양 세포, 이펙터:표적, 비율 10:1)를 함유하는 웰에 부가하였다. IgG1-CD27-A-P329R-E345R, IgG1-CD27-131A 및 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R을 공동 배양물에 10 μg/mL로 부가하였다. CD107a 및 GzmB 발현은 유동 세포계수법에 의해 결정되었다.
10 μg/mL IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 존재 하에 2일 동안 인큐베이션한 후, GzmB+CD107a+CD8+ T 세포의 백분율은 비결합 대조군 항체 또는 선행 기술의 항-CD27 항체 IgG1-CD27-131A를 사용한 처리와 비교하여 유의미하게 향상되었다 (도 21).
결론적으로, 이들 데이터는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R이 활성화된 항원-특이적 T 세포에서 세포독성-연관 분자를 유도할 수 있었다는 것을 제시한다.
실시예 24: T-세포 매개된 종양 세포독성을 유도할 수 있는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 능력
T-세포 매개된 세포독성을 평가하기 위해, CLDN6-TCR-전기천공된 CD8+ T 세포는 실시예 23에서 기재된 바와 같이, 2시간 간격으로 임피던스를 측정하면서 xCELLigence 실시간 세포 분석 기기 (Acea 바이오사이언스)에서 IgG1-CD27-A-P329R-E345R, 선행 기술의 항-CD27 항체 IgG1-CD27-131A, 또는 비결합 대조군 항체 IgG1-b12-P329R-E345R의 존재 하에 MDA-MB-231_hCLDN6 세포와 5일 동안 공동 배양하였다. 세포 지수 값은 2시간 간격으로 시행된 임피던스 측정으로부터 유래되었다. 곡선하 면적 (AUC)은 5일간의 공동 배양에 걸쳐 세포 지수 데이터로부터 수득되었다. AUC는 IgG1-b12-P329R-E345R로 처리된 공동 배양물에 대해 정규화되었다. 임피던스의 크기는 세포 수, 세포 형태, 및 세포 크기 및 플레이트에 대한 세포 부착 강도에 따라 달라지며, 이러한 특정한 경우에는 종양 세포 덩어리의 간접적 판독값으로서 모두 사용된다. 이러한 실험 환경에서 임피던스 감소는 CD8+ T 세포에 의한 종양-세포 사멸의 대용으로 간주된다. 임피던스는 T 세포의 증식으로 인한 종양 세포 사멸을 과소평가할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 종양-세포 사멸을 나타내는 세포 지수의 감소를 유도하였다. IgG1-CD27-131A는 세포 지수에 가시적인 영향을 미치지 않았으며, 이는 종양-세포 사멸을 증가시킬 수 있는 최소 능력을 나타낸다 (도 22).
실시예 25: 종양 침윤 림프구의 확장을 유도할 수 있는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 능력
종양 침윤 림프구 (TIL) 서브세트 (CD4+ 및 CD8+ T 세포, NK 세포 및 조절성 T 세포 [Treg])의 확장을 유도할 수 있는 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 능력은 NSCLC 환자로부터 외과적으로 절제된 냉동보존된 종양을 사용하여 생체 외에서 평가되었다.
외과적으로 절제된 인간 NSCLC 조직을 수송 배지 (하이포써모솔(HypoThermosol®) FRS 보존 용액 [바이오라이프 솔루션즈(BioLife Solutions), cat. no. 101104], 7.5 μg/mL 암포테리신 B [써모 피셔 사이언티픽, cat. no. 15290026], 및 300 단위/mL (U/mL) 펜/스트렙 [써모 피셔 사이언티픽, cat. no. 15140-122])에 수용하였다. 샘플을 세척 배지 (5 mL X-VIVO 15 [론자], 2.5 μg/mL 암포테리신 B [써모 피셔 사이언티픽] 및 100 U/mL 펜/스트렙 [써모 피셔 사이언티픽])에서 3회 세척하고 세포 배양 디쉬로 옮겼다. 지방 조직과 괴사 부위를 메스를 사용하여 제거하고, 조직을 대략 5 mm3의 단편으로 커팅하였다. 각각의 단편을 개별 냉동 바이알에 넣고, 각각의 바이알에 1 mL 동결 배지 (FBS, 10% DMSO)를 부가하였다. 바이알을 제어된 냉동실 (미스터 프로스티 냉동 용기)로 옮겨 -80℃ 냉동고에 두었다. -80℃에서 적어도 16시간 후, 장기간 저장을 위해 바이알을 액체 질소로 옮겼다.
하나의 종양 표본으로부터 대략 5 mm3의 종양 단편을 함유하는 4개 내지 6개의 냉동보존 바이알을 실험당 37℃ 수조에서 대략 2분 동안 해동하고 세척 배지로 5회 세척한 후 세포 배양 디쉬로 옮겼다. 종양 단편을 메스를 사용하여 대략 1 mm3의 단편으로 추가로 절개하였다. 대부분의 단편은 IL-2 및 처리 항체와 함께 배양 시 TIL 확장에 사용되었으며 나머지 단편은 임의의 처리 없이 기준선에서 특이적 세포 표면 마커의 발현을 결정하는데 사용되었다.
웰당 2개의 종양 단편 (평균)을 45 내지 50 U/mL IL-2 [프로류킨 S; 노바티스 파르마(Novartis Pharma), cat. no. PZN-02238131]를 함유하는 0.1 mL 미리 예열된 TIL 배양 배지 (2% 인간 혈청 알부민 [HSA; CSL 베링, cat. no. PZN-00504775], 100 U/mL 펜/스트렙 [써모 피셔 사이언티픽], 및 2.5 μg/mL 암포테리신 B [써모 피셔 사이언티픽]가 포함된 X-VIVO 15 [론자]) 내의 24-웰 플레이트에 시딩하였다 (검정에 사용된 2 mL/웰의 총 용적 용량). IgG1-CD27-A-P329R-E345R을 45 내지 50 U/mL IL-2를 함유하는 TIL 배양 배지에 희석하고 이러한 희석액 중 900 μL를 적절하게 웰에 부가하였다. 웰 내 최종 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 농도는 1 또는 10 μg/mL였다. 대조군으로서, 항체가 없는 45 내지 50 U/mL IL-2를 함유하는 배지를 별도의 웰 내의 종양 단편에 부가하였다. 공여자당 각각의 실험 조건 (37℃, 5% CO2)에 대해 총 8 내지 16개의 웰을 인큐베이션하였다.
3일의 배양 후, 45 내지 50 U/mL IL-2 및 IgG1-CD27-A-P329R-E345R을 함유하는 신선한 TIL 배양 배지를 웰에 부가하였다 (1 mL/웰, 상기와 동일한 항체 농도). 검정 개시 후 제5일 내지 제14/17일에, 조직 단편으로부터 이동된 TIL의 증식과 TIL 마이크로클러스터의 형성에 대해 현미경을 사용하여 배양물을 정기적으로 모니터링하였다. 7일 또는 8일 배양 후 하나의 웰에서 >25 TIL 마이크로클러스터가 관찰된 경우, 동일하게 처리된 2개의 원래 웰로부터의 세포 및 조직 단편을 재현탁시키고 배양 배지가 있는 6-웰 플레이트 (검정에 사용된 5 내지 6 mL/웰의 총 용적 용량)의 하나의 웰에 풀링하고, 신선한 IL 2 함유 TIL 배양 배지를 부가하였다 (추정 33 U/mL IL-2 최종 농도).
2일 내지 3일마다 배양물에 신선한 IL-2 함유 TIL 배양 배지를 보충하였다. 배양물에 부가된 배지 내 IL-2 농도를 10 U/mL로 감소시키거나, 먼저 25 U/mL로 감소시킨 후 검정 전반에 걸쳐 웰에 배지를 보충한 후 10 U/mL로 감소시켰다. 제14일 또는 제17일에 유동 세포계수법 분석을 위해 세포를 수거하였다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 IL-2 단독으로 처리된 대조군 배양물과 비교하여 TIL 하위유형의 확장을 향상시켰으며, CD8+ T 세포 및 Treg에 대해 관찰된 세포 카운트의 상대적 증가가 가장 컸으며, 이어서 CD4+ T 세포 및 NK 세포가 뒤따랐다. 모든 TIL 서브세트의 경우, 10 μg/mL보다 1 μg/mL의 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에서 확장이 더 두드러졌다 (표 6 및 도 23).
표 6. IgG1-CD27-A-P329R-E345R-처리된 TIL의 확장 배수
인간 NSCLC 표본으로부터 유래된 종양 조직을 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 존재 또는 부재 하에 저용량 IL-2와 함께 배양하였다. 표시된 세포 서브세트의 절대 세포 카운트는 처리 14일 내지 17일 후에 유동 세포계수법으로 결정되었다. IL-2로 처리된 배양물에 비해 IgG1-CD27-A-P329R-E345R-처리된 배양물에 대한 세포 수의 차이 배수가 제시된다. 제시된 데이터는 5가지 독립적인 실험에서 시험된 개별 환자로부터의 5개 종양 조직으로부터 나온 것이다. P=0.0236, 1 μg/mL 대 10 μg/mL IgG1-CD27-A-P329R-E345R (이원 ANOVA).
Figure pct00016
a평균 및 SD 계산에서는 세포 집단 간의 더 나은 비교를 위해 환자 #561을 제외한다.
약어: ANOVA = 분산 분석; n.d. = 결정되지 않음; NK = 자연 살해자; NSCLC = 비소세포 폐암; SD = 표준 편차; TIL = 종양 침윤 림프구; Treg = 조절성 T 세포.
실시예 26: 세포 표면에서 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 분자의 분자간 상호작용을 평가하기 위한 BRET 분석
세포 표면 상의 CD27과 결합한 후 분자간 Fc-Fc 상호작용을 증가시킬 수 있는 육량체화-향상 돌연변이 (E345R)를 보유하는 CD27 항체의 능력은 생물발광 공명 에너지 전달 (BRET) 분석을 사용하여 결정되었다. 이러한 분자 근접성 기반 검정은 생물발광 단백질 공여자에서 형광 단백질 수용자로의 에너지 전달을 측정함으로써 단백질 상호작용을 검출한다. 에너지 전달은 공여자와 수용자가 근접해 있을 때만 발생한다 (<10 nm [Wu and Brand, 1994; Dacres et al., 2012]).
먼저, CD27 뿐만 아니라 CD20 및 CD37 (양성 대조군 분자로서)의 세포 표면 발현은 인간 CD27을 안정적으로 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 만성 골수성 백혈병 세포주인 huCD27-K562와 Daudi 세포에서 간접 면역형광 검정 (QIFIKIT, 애질런트 테크놀로지스, cat no. K0078)을 사용하여 결정되었다. 세포를 100,000개 세포/웰로 시딩하고 10 μg/mL 1차 항체 (CD27: IgG1-7730-143-C102S-FEAL; CD20: IgG1-11B8-FEAR; CD37: IgG1-3009-010-FEAR)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 규정된 수의 항체 분자로 코팅된 QIFIKIT 비드와 병행하여, FITC-표지된 폴리클로날 염소 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노 리서치, cat. no. 109-096-097)와 함께 인큐베이션하였다. 세포당 항체 분자의 수는 비드당 공지된 항체 분자 수에 대항하여 개별 비드 집단의 MFI를 플로팅함으로써 생성된 보정 곡선에 시험 샘플의 측정된 평균 형광 강도 (MFI)를 외삽함으로써 결정되었다. 샘플은 LSRFortessa 세포 분석기 유동 세포계수기 (비디 바이오사이언스)에서 측정하고 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
QiFi 분석은 Daudi 세포에서 중간 정도의 CD27 발현과 높은 CD20 및 CD37 발현을 보인 반면, huCD27-K562 세포는 높은 수준의 CD27을 발현했지만 CD20 및 CD37은 그렇치 못하였다 (표 7).
표 7. 세포당 항체 분자에서의 세포 표면 발현
Figure pct00017
BRET 검정 (NanoBRET™ 시스템, 프로메가, cat no. N1661)은 본질적으로 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. NanoLuc (공여자) 및 HaloTag (수용자) 태그부착된 항체를 생성하기 위해, NanoLuc 또는 HaloTag가 포함된 가변 경쇄 서열 (표 3, 서열 37-44)을 유전자 합성으로 제조하고, 적절한 발현 벡터에 클로닝한 다음, 실시예 1에 기재된 바와 같이 전체 길이 항체를 생산하였다. 분석을 위해, 0.5x105개 huCD27-K562 또는 Daudi 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (그라이너 바이오-원, cat. no. 650101)에 총 용적 100 μL로 시딩하였다. 세포를 원심분리 (300 xg에서 3분)에 의해 펠릿화하고 각각 5 μg/mL의 농도로 NanoLuc- 또는 HaloTag-태그부착된 항체 쌍의 혼합물을 함유하는 50 μL 검정 배지 (Opti-MEM I [깁코, cat. no. 11058-021] + 4% FBS [ATCC, cat. no. 30-2020])에 재현탁시켰다. 그 다음으로, 50 μL HaloTag NanoBret 618 리간드 (프로메가, cat. no. G980A, 검정 배지 중 1:1000 희석)를 부가하였다. 각각의 항체 혼합물에 대해, HaloTag NanoBret 618 리간드가 없는 배지 50 μL를 부가함으로써, 리간드가 없는 대조군 샘플을 동시에 제조하였다. 세포를 암실 내의 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 배지로 2회 세척한 후, FBS가 없는 100 μL 검정 배지에 재현탁시켰다. 25 μL NanoBRET NanoGLO 기질 (프로메가, cat. no. N1571, FBS가 없는 검정 배지 중 1:200 희석)을 각각의 웰에 부가하였다. 플레이트를 30초 동안 진탕시키고 각각의 샘플 120 μL를 옵티플레이트 (퍼킨 엘머, cat. no. 6005299)로 옮겼다. 엔비젼 멀티라벨 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 460 nm에서의 공여자 방출과 618 nm에서의 수용자 방출을 측정하였다.
BRET는 밀리BRET 단위 (mBU) = (618 nmem/460 nmem) x 1000으로 계산되었다.
결과는 공여자 기여 배경 또는 블리드스루에 대해 교정되고 mBU 리간드 - mBU 리간드 없는 대조군으로서 계산되는 교정된 BRET로서 보고된다.
세포 표면 상의 CD27과 결합한 후 NanoLuc- 및 HaloTag-표지된 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 항체의 근접성을 동일한 태그를 보유하는 WT IgG1-CD27-A 항체와 비교하였다. 육량체화를 유도하는 E430G 돌연변이를 함유하는 IgG1-CD20-11B8-E430G-LNLuc 및 IgG1-CD37-37.3-E430G-LHalo 항체 (WO2019243636A1)를 근접성-유도된 BRET에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. IgG1-CD20-11B8-E430G 및 IgG1-CD37-37.3-E430G는 이전에 분자 근접성 검정을 사용하여, CD20 및 CD37을 발현하는 세포와 결합 시 이종육량체를 형성하는 것으로 나타났다 (Oostindie, S.C. et al., Haematologica, 2019). 비결합 항체 IgG1-b12-P329R-E345R이 음성 대조군으로서 사용되었다.
BRET 신호 유도에 대한 양성 및 음성 대조군으로서, Daudi 세포 (높은 CD20 및 CD37 발현) 및 huCD27-K562 세포 (CD20 및 CD37 발현 없음)를 항체 쌍 IgG1-CD20-11B8-E430G-LNLuc 및 IgG1-CD37-37.3-E430G-LHalo로 옵소닌화하였다. BRET 유도는 Daudi 세포에서만 검출되었으며, CD20 및 CD37이 결여된 huCD27-K562 세포에서는 검출되지 않았다 (도 24). 유사하게, 비-결합 대조군 항체 쌍 (IgG1-b12-P329R-E345R-LNLuc + IgG1-b12-P329R-E345R-LHalo)은 세포주 중 하나에서 BRET를 유도하지 않았다. huCD27-K562 세포가 육량체화-향상 돌연변이를 보유하는 NanoLuc- 및 HaloTag-표지된 CD27 항체의 혼합물 (IgG1-CD27-A-P329R-E345R-LNLuc + IgG1-CD27-A-P329R-E345R-LHalo)로 옵소닌화되었을 때, 높은 BRET가 검출된 반면, Daudi 세포 상의 BRET는 배경 수준을 초과하지 못하였다 (도 24). IgG1-CD27-A-LNLuc 항체와 IgG1-CD27-A-LHalo (WT) 항체의 혼합물은 P329R 및 E345R 돌연변이를 보유하는 CD27 항체와 비교하여 huCD27-K562 세포에서 상당히 낮은 BRET를 유도했으며 Daudi 세포에서는 BRET를 유도하지 않았다. 이러한 결과는 BRET 신호가 더 높은 표적 발현과 연관되어 있다는 것을 나타낸다. huCD27-K562 세포 상에서의 CD27 발현은 Daudi 세포보다 ~26배 더 높은 것으로 밝혀진 반면, huCD27-K562 세포 상에서의 CD27-결합 IgG1-CD27-A-P329R-E345R에 대한 BRET 수준은 Daudi 세포보다 ~24배 더 높았다. NanoLuc- 및 HaloTag-표지된 비결합 및 CD27-결합 항체 쌍의 혼합물 (각각 IgG1-b12-P329R-E345R-LNLuc + IgG1-CD27-A-P329R-E345R-LHalo, 및 IgG1-CD27-A-P329R-E345R-LNLuc + IgG1-b12-P329R-E345R-LHalo)은 세포주 중 하나에서 BRET를 유도하지 않았다. 이는 관찰된 BRET가 세포 표면 표적과 결합된 공여자 및 수용자 항체의 동시 상호작용에 의존적이라는 것을 확인시켜 준다.
요약하면, IgG1-CD27-A-P329R-E345R은 WT 변이체와 비교하여 huCD27-K562 세포에서 높은 BRET를 유도하였다. 이러한 발견은 WT 변이체와 비교하여 막-결합된 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 분자 간의 향상된 근접성을 확인시켜 주며, 이는 세포 표면-결합된 항체 간의 E345R-향상된 Fc-Fc 상호작용과 일치한다.
주의: 본 실시예에 기재된 실험은 본 실험의 맥락에서 기능적으로 관련이 없는 F405L 돌연변이를 보유하는 IgG1-CD27-A의 변이체를 사용하였다.
실시예 27: FcγRIa + M0 및 M1 대식세포에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합
실시예 9는 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여 인간 FcγR 변이체에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합을 평가했으며, 이는 재조합 인간 IgG Fc 수용체 분자에 대한 결합이 최소 (FcγRIa)이거나 결합이 없는 (FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa) 것으로 나타났다. 이러한 잔여 FcγRIa 결합은 CD27+ 세포의 IgG1-CD27-A-P329R-E345R-의존적 ADCP를 유도하기에 충분하지 않았다 (실시예 13 참조). IgG1-CD27-A-P329R-E345R과 FcγRIa-양성 대식세포의 상호작용을 추가로 배제하기 위해, M0 및 M1 대식세포에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 Fc-매개된 결합을 결정하였다.
인간 CD14+ 단핵구는 실시예 13에 기재된 바와 같이 2명의 건강한 공여자로부터의 PBMC로부터 단리되었고, M0 대식세포를 수득하기 위해 50 ng/mL M-CSF (깁코, cat. no. PHC9501)가 보충되거나 또는 M1 대식세포로의 분화를 위해 50 ng/mL GM-CSF [이뮤노툴스(Immunotools), cat. no. 11343125]가 보충된 배지 (셀제닉스, cat. no. 20801-0500)에서 세포를 배양함으로써 단핵구 유래 대식세포로 분화되었다. 배양 6일 후, 표 8에 정의된 바와 같은 마커의 발현에 따라 FACS 분석을 통해 M0 및 M1 표현형을 확인하였다. 부가적으로, 대식세포 하위유형 둘 다가 인간 Fc 수용체 FcγRIa, FcγRII 및 FcγRIIIa를 발현하는 것으로 확인되었다 (표 8).
표 8:
Figure pct00018
M0 및 M1 대식세포에 대한 IgG1-CD27-A-P329R-E345R의 결합은 FcγRIa 결합에 대한 양성 대조군으로서 관련 없는 항원-결합 영역을 갖는 WT IgG1 항체 (IgG1-b12)의 결합, 및 FcγR과의 상호작용을 감소시키기 위해 이전에 기재된 P329R 돌연변이를 또한 보유하는 동일한 항체의 변이체 (IgG1-b12-P329R-E345R)의 결합과 비교되었다. 대식세포는 CD27을 발현하지 않아야 하기 때문에, 관찰된 임의의 결합은 1가 IgG와 결합하는 유일한 FcγR인 FcγRIa를 통해 발생하는 것으로 가정된다. 분화된 대식세포를 IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 대조군 항체 (DC 배지 중 30 μg/mL)와 함께 15분 동안 인큐베이션하고, PE-표지된 폴리클로날 염소 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노 리서치, cat. no. 109-116-097, 희석 1:200, 4℃에서 30분)와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 핵 염색 DAPI [비디 파밍겐(BD Pharmingen), cat. no. 564907, 1:5000 희석]를 함유하는 100 μL FACS 완충액에 재현탁시켰다. 샘플은 FACSymphony 유동 세포계수기 (비디 바이오사이언스)에서 측정하고 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
IgG1-CD27-A-P329R-E345R 또는 대조군 IgG1-b12-P329R-E345R에서는 2명의 독립적인 공여자로부터 단리된 M0 또는 M1 대식세포에 대한 배경 위의 결합 (2차 항체 단독)이 관찰되지 않았다 (도 25). 활성 Fc 영역을 함유하는 WT IgG1-b12는 M0 및 M1 대식세포 둘 다와 일관되게 결합하였다.
결론적으로, IgG1-CD27-A-P329R-E345R 및 대조군 IgG1-b12-P329R-E345R은 FcγRIa, FcγRII 및 FcγRIIIa를 발현하는 M0 또는 M1 대식세포와 결합하지 않는다.

Claims (65)

  1. 인간 CD27과 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 영역을 포함하는 항체로서, 여기서 상기 항체는 서열식별번호: 5, 6, 및 7에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열식별번호: 9, 10 및 11에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 CD27과 결합할 수 있는 2개의 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 상기 항체는 서열식별번호: 5, 6, 및 7에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 서열식별번호: 9, 10 및 11에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 8에 각각 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 및 VL 영역을 포함하는 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 또는 인간화 항체인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 추가로 포함하는 전체 길이 항체인 항체.
  8. 제7항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 인간 카파인 항체.
  9. 제7항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 인간 람다인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 IgG 이소타입의 것, 임의적으로 변형된 인간 IgG의 것인 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 항체.
  11. 제10항에 있어서, 인간 IgG 또는 변형된 인간 IgG가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택되고, 예컨대 인간 IgG1인 항체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, IgG가 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 IgG인 항체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 인간 IgG가 1개 이상의 아미노산 치환, 예컨대 2개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형된 인간 IgG1인 항체.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 인간 IgG 중쇄 불변 영역이 최대 10개의 아미노산 치환, 예컨대 최대 9개, 예컨대 최대 8개, 예컨대 최대 7개, 예컨대 최대 6개, 예컨대 최대 5개, 예컨대 최대 4개, 예컨대 최대 3개, 예컨대 최대 2개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 항체.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역에서의 변형이, 야생형 IgG1 항체 중쇄 불변 영역을 포함하는 것을 제외하고는 동일한 항체와 비교하여 증가된 CD27 효능작용을 유도하는 것인 항체.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345 또는 E430에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기가 A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 항체.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기가 R인 항체.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E430에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기가 G인 항체.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 P329에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기가 R인 항체.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Eu 넘버링에 따른 인간 IgG1 중쇄 내의 위치 E345 및 P329에 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기가 둘 다 R인 항체.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 야생형 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 모 항체로서의 약동학적 프로파일을 갖는 것인 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 36을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 15에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모 항체에 비해 더 적은 정도로 하나 이상의 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하도록 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 항체.
  25. 제24항에 있어서, 하나 이상의 Fc-매개된 이펙터 기능이 적어도 20%만큼, 예컨대 적어도 30%만큼 또는 적어도 40%만큼, 또는 적어도 50%만큼 또는 적어도 60%만큼 또는 적어도 70%만큼, 또는 적어도 80%만큼 또는 적어도 90%만큼 감소되는 것인 항체.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 항체가 하나 이상의 Fc-매개된 이펙터 기능을 유도하지 않는 것인 항체.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Fc-매개된 이펙터 기능이 하기 군: 보체-의존적 세포독성 (CDC), 보체-의존적 세포-매개된 세포독성 (CDCC), 보체 활성화, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개된 식균작용 (ADCP), C1q 결합 및 FcγR 결합으로부터 선택되는 것인 항체.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 항체가 실시예 8의 방법에 의해 측정 시 C1q 결합을 유도하지 않는 것인 항체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 항체인 항체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 2가 항체인 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체인 항체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 인간 CD27과 결합할 수 있는 제1 항원 결합 영역을 포함하고 인간 CD27 상의 상이한 에피토프와 결합할 수 있거나 또는 상이한 표적과 결합할 수 있는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체인 항체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD27이 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 인간 CD27 변이체를 포함하는 것인 항체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가
    a. 실시예 4 및 10에 기재된 바와 같이 CD27-발현 인간 T 세포와 결합할 수 있거나,
    b. 실시예 4에 기재된 바와 같이 CD27-발현 시노몰구스 T 세포와 결합할 수 있거나,
    c. 본원의 실시예 6 또는 7에 기재된 바와 같이 검정 시 인간 T 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 예컨대 T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포의 증식을 유도할 수 있거나,
    d. 인간 조절성 (CD4+) T 세포의 증식을 유도하지 않거나,
    e. 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같이 인간 CD27-발현 Jurkat 리포터 T 세포의 활성화를 유도할 수 있거나, 또는
    f. 본원의 실시예 11에 기재된 바와 같이 Fcγ 수용체 IIb 가교의 부재 하에 인간 CD27-발현 Jurkat 리포터 T 세포의 활성화를 유도할 수 있는 것인
    항체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 항체:
    a. 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역;
    b. 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
    c. 서열식별번호: 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CH 영역; 및
    d. 서열식별번호: 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CL 영역.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  39. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 항체.
  40. 제39항에 있어서, 질환의 치료에 사용하기 위한, 의약으로서 사용하기 위한 항체.
  41. 제40항에 있어서, 질환이 암인, 의약으로서 사용하기 위한 항체.
  42. 제41항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 혈액 암인, 의약으로서 사용하기 위한 항체.
  43. 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체, 제37항에 정의된 바와 같은 조성물, 또는 제38항에 정의된 바와 같은 제약 조성물을 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 방법이 암을 치료하기 위한 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 단리된 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합.
  46. 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 VH 영역을 코딩하는 핵산 서열.
  47. 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR2, 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 VL 영역을 코딩하는 핵산 서열.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 코딩하는 핵산 서열.
  49. 제45항 또는 제47항에 있어서, 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 코딩하는 핵산 서열.
  50. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열.
  51. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열.
  52. 제50항에 있어서, 상기 중쇄가 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VH 영역 및 아미노산 잔기가 Eu 지수에 따라 넘버링된 P329 및/또는 E345의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 CH 영역, 예컨대 서열식별번호: 13, 14, 15, 27, 29, 30 및 36 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 IgG1 CH 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  53. 제46항, 제48항, 제50항 및 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄가 서열식별번호: 24 또는 35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  54. 제51항에 있어서, 상기 경쇄가 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 VL 영역 및 서열식별번호: 16 또는 17, 바람직하게는 서열식별번호: 17에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 인간 불변 영역을 포함하는 것인 핵산 서열.
  55. 제47항, 제49항, 제51항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄가 서열식별번호: 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  56. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 RNA 또는 DNA, 예컨대 mRNA인 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 핵산 서열인 핵산 서열.
  58. 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열 또는 그의 조합을 포함하는 발현 벡터.
  59. 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포에서의 발현에 사용하기 위한 핵산 서열 또는 핵산 서열의 조합.
  60. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 재조합 숙주 세포로서, 임의적으로 여기서 숙주 세포는 제58항의 발현 벡터를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  61. 제60항에 있어서, 진핵 또는 원핵 세포인 재조합 숙주 세포.
  62. 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 또는 제58항에 정의된 바와 같은 발현 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  63. 제60항 또는 제61항의 재조합 숙주 세포를 배양 배지에서 및 항체를 생산하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 임의적으로, 배양 배지로부터 항체를 정제 또는 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 방법.
  64. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체; 및 키트의 사용 지침을 포함하는 부분들의 키트, 예컨대 동반 진단으로서 사용하기 위한/환자 집단 내에서 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체를 사용한 치료에 반응하는 경향이 있는 환자를 확인하기 위한 키트.
  65. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 CD27과 결합할 수 있는 항원-결합 영역과 결합하는 항-이디오타입 항체.
KR1020247011157A 2021-09-06 2022-09-06 Cd27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도 KR20240051280A (ko)

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