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CN104011221B - 用于双特异性抗体支架的经修饰的多肽 - Google Patents

用于双特异性抗体支架的经修饰的多肽 Download PDF

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Abstract

本技术部分涉及工程化抗体。具体地说，涉及多特异性工程化抗体。在一些方面，这类抗体可以用于诊断和治疗应用。

Description

用于双特异性抗体支架的经修饰的多肽
对电子提交序列表的引用
本申请通过引用结合作为文本文件与本申请一起提交的序列表，该序列表名称为AEMS_110WO_SL，创建于2012年12月17日，并且具有15.0千字节的大小。
领域
本技术部分涉及工程化抗体。在一些方面，这类抗体可以用于诊断和治疗应用。
背景
抗体(又称为免疫球蛋白(Ig))是脊椎动物的血液或其他体液中天然存在的蛋白质。抗体是结合并中和外来物如细菌和病毒的免疫系统试剂。
天然存在的抗体一般包括两个较大的重链和两个较小的轻链。在天然全长抗体的情况下，这些链连接在一起来形成一个“Y形”蛋白质。重链和轻链包括可以经由二硫键连接至彼此的半胱氨酸氨基酸。这类二硫键一般形成在游离半胱氨酸氨基酸的巯基侧链部分之间。这些重链通过每个链中的半胱氨酸氨基酸之间的二硫键来连接至彼此。每个轻链也通过这些链中的半胱氨酸氨基酸之间的二硫键来连接至一个重链。每个重链和轻链中的具体的半胱氨酸氨基酸有时被称为“链间半胱氨酸”，因为它们一般参与到抗体链之间的二硫键之中。
每个重链(HC)在一端具有一个可变结构域(VH)，之后是多个恒定结构域(CH)。每个轻链(LC)在一端具有一个可变结构域(VL)并且在另一端具有一个恒定结构域(CL)；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域(CH1)对准，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对准。在某些全长抗体中，这些可变结构域位于“Y形”蛋白质的每个臂的末端处。一个天然抗体内的可变结构域典型地具有针对每个可变重链组分的相同多肽序列和针对每个可变轻链组分的相同多肽序列，并且当完全组装时，每个臂可以各自结合至相同的抗原种类。在一些情况下，一个抗体可以被工程化，这样使得所述抗体具有带有不同多肽序列和不同抗原和/或表位特异性的可变结构域。这类分子经常被称为“双特异性”抗体并且可以用于诊断或治疗应用。
概述
在此提供了多种抗体，这些抗体包含一个修饰的重链，其中该修饰的重链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，和(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代；以及一个修饰的轻链，其中该修饰的轻链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，和(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。在某些方面，重链中的取代的半胱氨酸和轻链中的取代的半胱氨酸可以形成一个二硫键。在某些方面，这些抗体进一步包含一个第二重链和第二轻链，其中该第二重链和第二轻链不包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代。在仍然其他方面，第一重链和/或第二重链在Fc区中包含一个修饰。在一些方面，第一重链和第二重链两者的Fc区包含有利于第一重链与第二重链的链间配对的不同修饰。
在此提供了多种抗体，这些抗体包含：(i)一个第一修饰的重链，该第一修饰的重链包含导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代，和一个第一修饰的轻链，该第一修饰的轻链包含导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代；以及(ii)一个第二修饰的重链，该第二修饰的重链包含导致一个空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代，和一个第二修饰的轻链，该第二修饰的轻链包含导致一个补偿突起和/或空腔的至少一个氨基酸的取代，其中这些修饰有利于第一重链与第一轻链和第二重链与第二轻链的链间配对。在某些方面，第一重链中的一个或多个氨基酸取代与第二重链中的那些不同，并且第一轻链中的一个或多个氨基酸取代与第二轻链中的那些不同。在某些方面，第一重链和第一轻链和/或第二重链和第二轻链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代。在仍然其他方面，第一重链和/或第二重链在Fc区中包含一个修饰。在一些方面，第一重链和第二重链两者中的Fc区包含有利于第一重链与第二重链的链间配对的不同修饰。
还提供了包含任何以上抗体的组合物和使用这些组合物的方法。
还提供了编码一个修饰的重链多肽的核酸，其中该修饰的重链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，和(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代；以及编码一个修饰的轻链多肽的核酸，其中该修饰的轻链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，和(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。在某些方面，重链中的取代的半胱氨酸和轻链中的取代的半胱氨酸可以形成一个二硫键。在某些方面，这些核酸进一步编码一个第二重链和第二轻链，其中该第二重链和第二轻链不包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代。
在仍然其他方面，第一和/或第二重链在Fc区中包含一个修饰。在一些方面，第一和第二重链两者的Fc区包含有利于第一重链与第二重链的链间配对的不同修饰。
还提供了编码一个第一修饰的重链的核酸，该第一修饰的重链包含导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代；编码一个第一修饰的轻链的核酸，该第一修饰的轻链包含导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代；编码一个第二修饰的重链的核酸，该第二修饰的重链包含导致一个空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代，以及编码一个第二修饰的轻链的核酸，该第二修饰的轻链包含导致一个补偿突起和/或空腔的至少一个氨基酸的取代，其中这些修饰有利于第一重链与第一轻链和第二重链与第二轻链的链间配对。在某些方面，第一重链中的一个或多个氨基酸取代与第二重链中的那些不同，并且第一轻链中的一个或多个氨基酸取代与第二轻链中的那些不同。在某些方面，第一重链和第一轻链和/或第二重链和第二轻链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代。在仍然其他方面，第一和/或第二重链在Fc区中包含一个修饰。在一些方面，第一和第二重链两者的Fc区包含有利于第一重链与第二重链的链间配对的不同修饰。
还提供了包含任何以上核酸的载体和细胞以及表达任何以上核酸的方法。
某些方面进一步描述于以下说明书、实例、权利要求书以及附图中。
附图简要说明
这些附图示出了本技术的多个方面并且并非限制性的。为了清晰和容易说明起见，附图未按比例作出，并且在一些情况下，不同的方面可能被夸张或放大地示出以促进具体方面的理解。
图1示出了抗体图。图A中示出了亲本二价单特异性亲本抗体。图B中示出了代表性单价双特异性抗体(MBab)。在包含“孔洞(Hole)”的重链上的星形代表工程化来消除“孔洞”链的蛋白A结合。下文中涵盖且描述了另外的MBab构建体。左侧的MBab在一个臂上包含一个野生型HC-LC界面且在另一个臂上包含一个半胱氨酸工程化的HC-LC界面，以便重新定位链间二硫键。该二硫键可以重新定位在CH1-CL界面中，如图所示，或者可以重新定位至VL-VH界面，如在此所描述。右侧的MBab在每个臂上包含一个工程化的HC-LC界面，其中这些界面区已被工程化来促进特异性HC-LC界面的相互作用，该工程化的HC-LC界面可以包括形成CL区与CH1区之间的二硫键所涉及的天然半胱氨酸残基的取代(由虚线指示)。两种MBab均已在Fc区(例如，CH3)中工程化以便促进重链异二聚化。Fab区的结合特异性可以针对任何所希望的靶标。所指出的结合特异性是针对在此的实例中使用的抗体。亲本抗体可以结合以下四个抗原中的一个：IL-6、RAGE、EGFR或HER2。单价双特异性抗体(MBab)可以结合IL-6和RAGE两者，或EGFR和HER2两者。
图2示出了具有结合IL-6的一个臂和结合RAGE的一个第二臂的单价双特异性抗体(MBab)的三维表示。箭头指示了重链恒定区中促进异二聚化的重链突变的位置。在右侧放大地示出了括号内的Fab区。箭头指示了变体10(V10；HC：A141C-LC：F116C)中的修饰、变体11(V11；HC：H168C-LC：T164C)中的修饰、以及变体12(V12；HC：F126C-LC：S121C)中的修饰的位置。去除天然半胱氨酸(-Cys；例如，HC：C220V-LC：C214V)的另外的修饰并未示出、但存在于变体10至12(V10至V12)之中。
图3A至图3C示出了利用单个哺乳动物选择标记物的代表性MBab表达载体。图3A和图3B示出了用于表达两个κ或λ轻链的载体，并且图3C示出了用于表达两个重链的载体。可以容易地产生表达一个λ链和一个κ链的另一个轻链载体。使用这类载体，可以产生众多组合，包括例如：κWT/κV12、λWT/λV12、κWT/λV12以及λWT/κV12。每个载体可以表达两个不同的轻链或两个不同的重链。每个链使用它自身的启动子来单独表达。每个载体包含促进不同可变区的快速克隆的许多限制性位点。除了一个细菌复制起点和可以与EBNA序列组合使用来增强哺乳动物系统中的质粒维持和表达的一个oriP序列之外，每个载体还包含细菌选择标记物和哺乳动物选择标记物两者。来自一个第一载体的两个轻链和来自一个第二载体的两个重链的表达最小化了同二聚体化的重链和可能因用单个载体转化细胞所致的其他不希望的产物的产生。例如，重链在没有轻链的情况下典型地不有效地分泌，并且轻链在没有重链的情况下典型地无法通过蛋白质A色谱法来纯化。因此，分泌蛋白A结合抗体的任何细胞将携带表达两个轻链和两个重链的第一质粒和第二质粒两者。
图4示出了IL6/RAGE双特异性单价抗体(MBab)变体10、11以及12(V10、V11以及V12)在非还原条件下的SDS-PAGE分析，这些变体在分子的抗RAGE部分中各自具有一个替代的(即，重新定位的)链间二硫键。左图示出了如实例1和实例5中所描述用pMBab载体转染、以用于表达以下各物的HEK293F细胞的培养上清液：抗-IL6WT+抗-RAGE WT(泳道1)；抗-IL6WT+抗-RAGE(-Cys)(泳道2)；重抗-IL6WT+抗-RAGE V10(泳道3)；抗-IL6WT+抗-RAGE V11(泳道4)；以及抗-IL6WT+抗-RAGE V12(泳道5)。每个重链包括CH3修饰以促进HC异二聚化，并且V10、V11、以及V12修饰还包括-Cys修饰。在右图中，箭头各自指示：2H2L(约150kDa)—各自具有2重链和2轻链的IgG；2H1L(约125kDa)—失去一个轻链的IgG；以及1L(约25kDa)–游离轻链。-Cys变体导致一个未配对的轻链的产生，这可以通过引入在此描述的二硫键变体来补救，其中V12具有最有效的LC/HC配对。
图5示出了使用AlphaLISA筛选IL6/RAGE抗体的双特异性的确定。-Cys变体在抗-RAGE Fab中没有链间二硫键。V10、V11以及V12变体在抗-RAGEFab中具有替代性链间二硫键。V12变体产生近100％双特异性的IgG，而WTFabs产生小于30％。-Cys、V10以及V11变体各自示出了适度改善(分别是约42％、约40％以及约33％)。
图6A和图6B示出了抗-IL6WT/抗-RAGE变体12(V12)单价双特异性抗体(MBab)和亲本抗体的SEC和光散射分析。图6A示出了SEC纯化的亲本抗体(左上和右上)和SEC纯化的抗-IL6WT/抗-RAGE V12 MBab(下中)的SEC UV迹线。每个迹线均示出纯化的材料主要是单体的。抗-RAGE和抗-IL6亲本抗体分别具有24.61和26.27分钟的保留时间，而抗-IL6 WT/抗-RAGE V12MBab具有25.85的一个中间保留时间，这示出MBab展示出一个单体轮廓并且显示出两个亲本MAb的特性。图6B示出了蛋白A纯化的抗-IL6WT/抗-RAGE V12 MBab的SEC UV迹线(左图)和相应的光散射迹线(右图)，这示出蛋白A纯化的材料由具有2H2L的约85％完整的IgG、具有1H1L的约10％的IgG(半IgG)以及约5％聚集体构成。
图7A至图7C示出了包含用于抗原A(除了“RF”取代以外，抗原A重链包含“孔洞”)结合的一个λ轻链和用于抗原B(抗原重链包含“凸起(Knob)”)结合的一个κ轻链的一个MBab-RF构建体的分析。图7A示出了SDS-PAGE(左侧)分析，泳道1：蛋白A纯化的MBab-RF，非还原；泳道2：蛋白A纯化的MBab-RF，还原；以及蛋白A纯化的MBab-RF的SEC UV迹线(右侧)。图7B示出了蛋白A纯化的亲本抗体和MBab-RF抗体在非还原条件下的迁移曲线。图7C示出了在还原条件下的蛋白A纯化的MBab-RF(抗原A轻链(LC-A)、抗原B轻链(LC-B)、抗原A重链(HC-A)、抗原B重链(HC-B))的迁移曲线，指示出了迁移时间。
图8A至图8C示出了包含用于抗原A(除了“RF”取代以外，抗原A重链包含“孔洞”)结合的一个λ轻链和用于抗原B(抗原重链包含“凸起”)结合的一个κ轻链的LambdaSelect纯化的MBab-RF构建体的分析。图8A示出了SDS-PAGE(左侧)分析，泳道1、5：蛋白A纯化的MBab-RF；泳道2、6：蛋白A+LambdaSelect纯化的MBab-RF；泳道3、7：LambdaSelect流过；泳道4、8：蛋白A纯化的亲本B；以及蛋白A+LambdaSelect纯化的MBab-RF的SEC UV迹线(右侧)。图8B示出了LambdaSelect流过在还原条件下的迁移曲线。图8C示出了在还原条件下的蛋白A+LambdaSelect纯化的MBab-RF(抗原A轻链(LC-A)、抗原B轻链(LC-B)、抗原A重链(HC-A)、抗原B重链(HC-B))的迁移曲线，指示出了迁移时间。
图9A和图9B示出了如由Octet分析测定的抗-IL6WT/抗-RAGE变体12单价双特异性抗体(IL6/RAGE V12MBab)的双特异性。图9A示出了包括抗体捕获(10微克/ml)部分、基线、和RAGE结合部分以及IL6结合部分的全部迹线。图9B示出了迹线的基线、RAGE结合部分和IL6结合部分的扩展。两个亲本抗体示出了响应于结合它们的特异性抗原的单一信号增加，而抗IL6WT/抗-RAGE V12 MBab示出了响应于RAGE和IL6两者的信号增加，这证实了双特异性和同时抗原结合。抗-IL6WT/抗-RAGE V12 MBab具有与2X纯化的双特异性相同的一个并行结合曲线，该双特异性是通过共表达两个亲本抗体、之后在IL-6和RAGE亲和柱上进行顺序亲和纯化产生。
图10A和图10B示出了抗-IL6/抗-RAGE V12 MBab和亲本抗体的结合动力学。抗-IL6 WT/抗-RAGE V12 MBab对IL6(图10A)和RAGE(图10B)的结合亲和力与亲本抗体(抗-IL6和抗-RAGE)相当。
图11A至图11D示出了抗-EGFR WT/抗-HER2变体12单价双特异性抗体(EGFR/HER2V12 MBab)的表达和分析。图11A在右侧示出了EGFR/HER2V12 MBab在非还原条件下的SDS-PAGE分析、并且在左侧示出了EGFR/HER2V12 MBab的示意图。箭头指示2H2L(约150kDa)—具有2重链和2轻链的IgG，以及1H1L(约75kDa)—具有1重链和1轻链的半IgG。图11B示出了EGFR/HER2 V12 MBab的SEC分析。在SEC之前，蛋白A纯化的材料具有约90％单体、约10％半IgG以及小于3％的聚集体的SEC曲线(上图)。在制备性SEC之后，单体EGFR/HER2 V12 MBab表示大于99％的样品(下图)。图9C示出了SEC纯化的亲本抗体(左上和右上)和SEC纯化的抗-EGFR WT/抗-HER2 V12 MBab(下中)的SEC UV迹线。全部都主要是单体的。抗-EGFR和抗-HER2亲本抗体分别具有8.745和8.899分钟的保留时间，而抗-EGFR WT/抗-HER2 V12 MBab具有8.857的一个中间保留时间，这示出MBab展示出两个亲本中间的特性。图9D示出了抗-EGFR WT/抗-HER2 V12 MBab和亲本抗体的光散射迹线的重叠，这示出抗-EGFR WT/抗-HER2V12 MBab针对单体抗体具有约150kDa的期望分子质量。
图12A和图12B示出了如由Octet分析(捕获格式I)测定的抗-EGFR WT/抗-HER2V12单价双特异性抗体(EGFR/HER2 V12 MBab)的双特异性。图12A示出了包括抗体捕获(20微克/ml)部分、基线、和HER2结合部分以及EGFR结合部分的全部迹线。图12B示出了迹线的基线、HER2结合部分和EGFR结合部分的扩展。两个亲本抗体示出了响应于结合它们的特异性抗原的单一信号增加，而EGFR/HER2 V12 MBab示出了响应于HER2和EGFR两者的信号增加，这证实了双特异性和同时抗原结合。不结合HER2抑或EGFR的NMGC用作阴性对照抗体。
图13A和图13B示出了如由Octet分析(捕获格式II)确定的抗-EGFR WT/抗-HER2V12单价双特异性抗体(EGFR/HER2 V12 MBab)的双特异性。图13A示出了包括EGFR抗原上的抗体捕获、基线、和HER2抗原结合部分的全部迹线。图13B示出了包括HER2抗原上的抗体捕获、基线、和EGFR抗原结合部分的全部迹线。两个亲本抗体示出了响应于结合它们的特异性抗原的单一信号增加，而EGFR/HER2 V12 MBab示出了响应于HER2和EGFR两者的信号增加，这证实了双特异性和同时抗原结合。
图14A和图14B示出了使用差示扫描量热分析的热稳定性研究。图14A示出了抗-HER2(抗-HER2；左上)和抗-EGFR(抗-EGFR；右下)的热谱图。抗-HER2热谱图展示出两个过渡；Fab是非常稳定的并且它的TM在约81℃下与CH3 TM重叠，并且CH2具有约69℃的TM。抗-EGFR热谱图展示出四个过渡。图11B示出了抗-EGFR WT/抗-HER2变体12单价双特异性抗体(EGFR/HER2 V12 MBab)的热谱图。EGFR/HER2 V12 MBab热谱图(左上)的去卷积揭示出四个过渡；在约60℃下的过渡与西妥昔单抗抗-EGFR可变结构域相对应，在约73℃下的过渡与西妥昔单抗抗-EGFR CH1和Ck结构域相对应，在约70℃下的过渡与CH2和CH3(凸起-进入-孔洞)结构域相对应，在约81℃下的过渡与具有替代的二硫键的MBab中的工程化抗-HER2Fab相对应。这些对应还通过热谱图(右下)的重叠来示出。
图15A和图15B示出了如由流式细胞术分析测定的抗-EGFR WT/抗-HER2变体12单价双特异性抗体(EGFR/HER2 V12 MBab)的细胞结合特性。抗-EGFR/HER2 V12 MBab结合至表达不同水平的EGFR和HER2的细胞，这与靶标主要用于特定细胞类型的亲本抗体相似。图15A示出了与A431表皮细胞(左侧)和BxPC-3胰腺细胞(右侧)的结合。这些细胞表达较高水平的EGFR，并且表达较低水平的HER2。图15B示出了与SKBR-3乳腺细胞(左侧)和SK-OV-3卵巢细胞(右侧)的结合。这些细胞表达较高水平的HER2，并且表达较低水平的EGFR。抗-HuIgG Fc FITC用作用于检测的二级抗体。不结合HER2或EGFR的NMGC用作阴性对照抗体。表中示出了靶表达的水平。
图16A至图16C示出了如由生长抑制测定确定的抗-EGFR WT/抗-HER2变体12单价双特异性抗体(抗-EGFR/HER2 V12 MBab)的细胞毒性特性。抗-EGFR/HER2 V12 MBab抑制细胞生长，其程度与亲本抗体的组合抑制许多细胞类型的细胞生长的程度相同。当EGFR水平与HER2的水平相似或比它更高时，如对于A431和BxPC-3细胞所观察，实现了相加的杀伤作用。图16A示出了A431表皮细胞(上部)和BxPC-3胰腺细胞(下部)的生长抑制。这些细胞表达较高水平的EGFR，并且表达较低水平的HER2。图16B示出了SK-OV-3卵巢细胞(下部)和SKBR-3乳腺细胞(上部)的生长抑制。这些细胞表达较高水平的HER2，并且表达较低水平的EGFR。抗-Hu IgG Fc FITC用作用于检测的二级抗体。不结合HER2或EGFR的NMGC用作阴性对照抗体。表中示出了靶表达的水平。图16C示出了以直线图重新绘制的A431细胞的抑制数据。
图17A和图17B示出了FcγRIIIa和C1q结合以及ADCC活性。图17A示出了使用直接ELISA，纯化的抗-EGFR WT/抗-HER2变体12单价双特异性抗体(抗-EGFR/HER2 V12 MBab)和亲本抗体与FcγRIIIa(左上)和C1q(右下)的结合。图17B示出了使用A431细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)研究。MBab引发了与亲本抗体的组合处理相同水平的ADCC比活性。对照抗体NMGC和亲本抗-HER2未证实ADCC活性，而亲本抗-EGFR证实了较强的ADCC活性。-KC测定包括所有测定组分，杀伤细胞除外。
图18示出了描绘亲和力/亲合力调节MBab活性的作用的图。上图示出了在高MBab浓度下，亲合力作用不发生，因此，与受体的结合将通过高亲和力结合结构域来介导，因而没有受体交联/活化。下图示出了在低MBab浓度下，亲合力作用发生，因此，与受体的结合将通过两个结合结构域来介导，从而导致受体交联/活化。
图19示出了描绘MBab的应用的图，在该应用中，同二聚化或受体交联是不希望的和/或两个抗原选择性地受限于靶细胞/组织。左图示出了Mbab与非靶细胞的低亲合力单价结合，该结合不足以引发同二聚化。右图示出了MBab同时与靶细胞上的两个抗原的较高亲合力二价结合。二价结合可以通过同时结合两个靶标来增强与靶细胞的优先结合并且可以增强受体二聚化作用。
图20A至20C示出了Mbab的优先结合和改善的选择性。图20A示出了用于证实C/D-特异性Mbab与表达细胞表面抗原C和D的细胞的并行结合的生物检测测定的图。图20B的左图示出了亲本抗-C(空心符号)和抗-D(实心符号)抗体与表达C抗原(C-细胞，三角形)、D抗原(D-细胞，方形)或C和D抗原两者(C/D-细胞，圆形)的细胞的结合曲线。图20B的右图示出了C/D-MBab与表达C抗原(C-细胞，三角形)、D抗原(D-细胞，方形)或C和D抗原两者(C/D-细胞，圆形)的细胞的结合曲线。图20C示出了C/D-MBab结合至表达C抗原(C-细胞，三角形)、D抗原(D-细胞，方形)或C和D抗原两者(C/D-细胞，圆形)的细胞、之后结合标记的重组D蛋白(rD，左图)或标记的重组C蛋白(rC，右图)的结合曲线。
图21A和图21B示出了根据卡巴特(Kabat)(卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务，美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(Md.)(1991))中阐述的卡巴特索引，在本领域中已知的若干代表性轻链可变区(抗-CD52；抗-HER2；抗-VEGF；以及抗-EGFR)的氨基酸序列和编号。CDR区是以阴影表示的并且可能插入到编号方案中的位置(如下文所描述)由箭号和双箭号指示。对于相应的重链可变区，参见图23A和图23B。
图22示出了根据卡巴特(同上)中阐述的EU索引，IgG轻链恒定区(κ和λ)的氨基酸序列和编号。不同于κ的λ链残基是以阴影表示的并且已知等位基因变异的位点由星号(*)指示。
图23A和图23B示出了根据卡巴特(同上)中阐述的卡巴特索引，本领域中已知的若干代表性重链可变区(抗-CD52；抗-HER2；抗-VEGF；以及抗-EGFR)的氨基酸序列和编号。CDR区是以阴影表示的并且另外可能插入到编号方案中的位置(如下文所描述)由双箭号指示。对于相应的轻链可变区，参见图21A和图21B。
图24A至图24D示出了根据卡巴特(同上)中阐述的EU索引，IgG重链(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的氨基酸序列和编号。图24A至图24B示出了CH1和铰链区的氨基酸序列和编号。图24C示出了CH2区的氨基酸序列和编号。图24D示出了CH3区的氨基酸序列和编号。不同于IgG的残基是以阴影表示的并且已知等位基因变异的位点由星号(*)指示。
详细说明
在此提供了如下文更完整论述的工程化抗体，其中一个或多个链间半胱氨酸已被重新定位，在一些方面，这导致了一个链间二硫键在HC-LC界面处的重新定位。在一些方面，这涉及一个抗体内一个重链和相应轻链的修饰，借此一个天然半胱氨酸被一个非半胱氨酸氨基酸取代，并且一个天然非半胱氨酸氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸取代。在一些方面，在此提供的抗体是双特异性的，这意味着它们含有具有不同抗原和/或表位特异性的可变结构域。在某些方面，针对一个给定抗体的修饰的重链和轻链双链含有具有某种抗原特异性的一个可变结构域并且在同一抗体内的未修饰的重链和轻链双链含有具有不同的抗原特异性的一个可变结构域。用于产生双特异性抗体的方法是已知的。然而，这类方法经常受到多种可能的抗体形式的限制，这些抗体形式可能会包括错误的重链和轻链的配对的若干组合。这类错配会降低生产效率。其他方法要求使用一个公用轻链，这可能会影响一个或两个可变结构域的亲和力或依赖于scFv的使用，scFv的使用类似地可能会影响亲和力并且进一步是不太稳定和潜在的免疫原性结构。其他方法要求去除所有二硫键和在重链和轻链两者中引入众多突变以便改变这些链的静电相互作用，这可能会降低稳定性并且增加所得分子的免疫原性。在此提供的这些修饰的重链和修饰的轻链通过优先相互杂交，产生优选的双特异性单价抗体组装来克服这些限制。在此提供的BMab是容易产生的，稳定的并且可能因所涉及的突变数量有限而是非免疫原性的或较小免疫原性的。
术语
在此提供的方法经常并不限于特定的组合物或方法步骤，因此可以发生变化。而且，如在此所使用的单数形式“一种/一个”(“a”、“an”)和“该”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。术语“一个”(或“一种”)，以及术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个”在此可以互换地使用。
如在此使用的术语“约”是指基本参数的10％以内的值(即，加上或减去10％)，并且在一串值的起始处使用的术语“约”修饰每一个值(即，“约1、2以及3”是指约1、约2、以及约3)。例如，“约100克”的重量可以包括介于90克与110克之间的重量。另外，当在此描述多个值的列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。
另外，在此使用时，“和/或”旨在为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一个的特定披露。因此，如在此在措词如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。类似地，如在措词如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
除非另外定义，否则在此所使用的所有技术和科学术语具有与本技术涉及的领域中通常理解的相同的含义。例如，生物医学与分子生物学简明词典(Concise Dictionaryof Biomedicine and Molecular Biology)，乔培秀(Juo，Pei-Show)，第二版，2002，CRC出版社；细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第三版，1999，学术出版社(Academic Press)；以及生物化学与分子生物学牛津词典(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)提供了在此使用的许多术语的常用词典。
单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的标题不是对在此的技术的不同方面或实施例进行限制，这些标题可以通过参考整个说明书来得出。因此，紧接着在下文中定义的术语通过参考整个说明书来更全面地定义。
应理解，当在此用语言“包含”来描述多个方面或实施例时，还提供了以术语“由……组成”和/或“主要由……组成”来描述的其他类似方面或实施例。
在此经常通过公知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及氨基酸。同样地，常常通过普遍接受的单字母码提及核苷酸。
术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合一个靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质、其他半抗原或上述物质的组合的一个免疫球蛋白分子。如在此所使用的术语“抗体”(antibody)和“抗体”(antibodies)(又称为免疫球蛋白)涵盖单克隆单体(包括全长单克隆单体)、多克隆单体、包含至少两个不同的表位结合结构域的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼源化抗体、嵌合抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现出所希望的生物活性。具体来说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有至少一个抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以具有任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型/亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm，如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b、或c)，Am，Em，以及Km(1、2或3))。抗体可以来源于任何哺乳动物，包括但不限于人、猴子、猪、马、兔、狗、猫、小鼠、等等，或者其他动物如禽类(例如，鸡)。抗体可以是裸的或轭合至其他分子如毒素、放射性同位素等等。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独地抑或进行组合。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(又称为超变区)连接的四个构架区(FW)组成。每个链中的CDR由FW区紧密靠近地保持在一起，与来自另一个链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成。抗体的可变结构域、互补决定区(CDR)和构架区(FR)中氨基酸的编号遵循卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，美国国家卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)中阐述的卡巴特定义(在此又称为“卡巴特索引”或“卡巴特编号”)，除非另有指明。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短、或插入的较少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的一个氨基酸插入(根据卡巴特的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特，残基82a、82b、和82c等等)。
可以通过抗体序列与“标准”卡巴特编号序列在同源区的比对而针对给定的抗体确定残基的卡巴特编号。构架残基的最大比对常常需要在编号系统中插入“间隔”残基，如用于Fv区。另外，由于种间或等位基因差异，在任何给定的卡巴特位点编号处的某些单独残基的身份可以从抗体链变化到抗体链。如贯穿说明书所使用，所描述的VL和VH CDR序列与表1中所提供的经典卡巴特编号位置相对应，其中间插构架区被相应地编号。图15A、图15B、图17A和17B提供了来自若干代表性抗体的可变区(构架和CDR)的卡巴特编号。
表1
如在此所使用的Fc区(在此又简单地称为“Fc”)包括含有抗体的除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且还可以包括在这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的铰链的至少一部分。Fc可以是指孤立地这个区，或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的环境中的这个区。虽然Fc区的边界可以发生变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成包含其羧基末端的残基C226或P230，其中编号是根据基于卡巴特(卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，美国国家卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))中阐述的EU索引。对于κ和λ轻链恒定区的编号，参见图22，并且对于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区的编号，参见图24A至图24D，所有的恒定区编号是根据卡巴特中阐述的EU索引。已在多个不同Fc位置处观察到多态性，包括但不限于如由EU索引编号的位置270、272、312、315、356、以及358，并且因此所呈现的序列与现有技术序列之间可能存在略微的差异。
抗体
抗体是结合特异性抗原的免疫球蛋白。在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，抗体由成对的多肽重链和轻链构建成。每个链由两个相异的区(称为可变区(Fv)和恒定区(Fc))构成。轻链和重链Fv区含有分子的抗原结合决定簇并且负责结合靶抗原。Fc区定义抗体(例如，IgG)的类别(或同种型)并且负责结合许多天然蛋白质以便引发重要的生物化学事件。
每个轻链通过一个共价二硫键连接至一个重链。两个轻链-重链二聚体经由重链之间的二硫桥连接，从而形成一个Y形分子。这些重链之间的二硫键的数量可以在不同的免疫球蛋白同种型之间变化。Y的臂接触主干的区被称为铰链区，并且展现出一些柔性。
每个链包括代表抗体类别的恒定区和对每个抗体特异的可变区。该恒定区决定用于破坏抗原的机制。抗体基于它们的恒定区结构和免疫功能划分成五个主要类别：IgM、IgG、IgA、IgD、以及IgE。轻链和重链两者的可变区和恒定区在结构上折叠成称为结构域的功能单元。每个轻链由在一端的一个可变结构域(VL)和在其另一端的一个恒定结构域(CL)组成。每个重链在一端具有一个可变结构域(VH)，之后是三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3、CH4)。
Y的臂含有结合抗原的位点并且被称为Fab(片段，抗原结合)区。它由来自抗体的每个重链和每个轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对准。基于轻链恒定区的氨基酸序列，轻链被分类为λ链或κ链。一个κ轻链的可变结构域在此还可以表示为VK。
一个抗体的Fc区与包括Fc受体的许多配体和其他配体相互作用，从而赋予称为效应子功能的大量重要的功能能力。IgG类别的Fc受体的一个重要家族是Fcγ受体类(FcγR)。这些受体介导免疫系统的抗体与细胞性臂之间的通讯。在人体内，这个蛋白质家族包括FcγRI(CID64)，包括同工型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括同工型FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC；以及FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIA和FcγRIIB。这些受体典型地具有介导与Fc的结合的一个胞外结构域、一个跨膜区、以及可能介导细胞内的一些信号传导事件的一个细胞内结构域。这些不同的FcγR亚型在不同的细胞类型上表达。例如，在人体中，FcγRIIIB仅发现于嗜中性粒细胞上，而FcγRIIIA发现于巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞(NK)、以及T细胞的亚群体上。Fc/FcγR复合物的形成将效应子细胞募集至所结合的抗原的位点，从而典型地导致细胞内的信号传导事件以及随后的重要免疫应答如炎症介体的释放、B细胞激活、内吞作用、吞噬作用、以及细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶细胞的一种潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别一个靶细胞上的结合的抗体并且随后使该靶细胞溶解的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。用于介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIIIA，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII以及FcγRIII。
另一个重要的Fc配体是补体蛋白C1q。结合至C1q的Fc介导称为补体依赖性细胞毒性(CDC)的一个过程。C1q能够结合六个抗体，而结合至两个IgG就足以激活补体级联。C1q与C1r和C1s丝氨酸蛋白酶形成一种复合物，从而形成补体途径的C1复合物。
抗体的若干关键特征，包括但不限于对靶标的特异性、介导免疫效应子机制的能力以及较长血清半衰期，使得抗体和相关的免疫球蛋白分子成为强有力的治疗剂。抗体破坏肿瘤细胞有多种可能的机制，包括经由封闭所需生长途径抗增殖、导致细胞凋亡的细胞内信号传导、受体的增强的下调和/或转换、ADCC、CDC、以及一种适应性免疫应答的促进。
在此提供的抗体包括全长或完整抗体、抗体片段、天然序列抗体或氨基酸变体，人、人源化、翻译后修饰、嵌合或融合抗体，免疫轭合物、以及其功能性片段。在一些方面，抗体可以在Fc区中被修饰，并且某些修饰可以提供所希望的效应子功能或血清半衰期。如在以下部分中更详细论述，在具有适当的Fc区的情况下，在细胞表面上结合的一个裸抗体可以诱导细胞毒性：例如经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或通过在补体依赖性细胞毒性(CDC)中募集补体，或通过募集表达一个或多个效应子配体的非特异性细胞毒性细胞，这些效应子配体识别一个靶细胞上的结合的抗体并且随后在抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)中引起该靶细胞的吞噬作用；或一些其他机制。在希望消除或减少效应子功能以便于最小化副作用或治疗并发症的情况下，可以使用某些其他Fc区。抗体的Fc区可以被修饰来提高对FcRn的结合亲和力并且因此增加血清半衰期。可替代地，Fc区可以轭合至PEG或白蛋白以便增加血清半衰期，或可以是引起所希望效果的一些其他轭合作用。
在某些方面中，在此的抗体是分离的和/或纯化的和/或无热原的抗体。如在此使用的术语“纯化”是指已经从其天然环境的组分中鉴别和分离和/或回收的感兴趣的分子。因此，在一些方面，在此提供的抗体是一种纯化的抗体，其中它已经从其天然环境的一种或多种组分分离。如在此使用的术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同结构或抗原特异性的其他抗体分子的一种抗体。双或多特异性抗体分子是在基本上不含其他抗体分子时的一种分离抗体。因此，在一些方面，所提供的抗体是分离的抗体，它们已经从具有不同特异性的抗体分离。分离的抗体可以是一种单克隆抗体。然而，靶标的特异性结合至一个表位的分离的抗体、同种型或变体可以具有与例如来自其他物种(例如，物种同源物)的其他相关抗原的交叉反应性。所提供的分离的抗体可以基本上不含一种或多种其他细胞材料。在一些方面，“分离的”单克隆抗体的组合被提供，并且涉及具有不同特异性并被组合在一个限定的组合物中的抗体。在此其他地方描述了产生和纯化/分离抗体的方法。
所呈现的分离的抗体包括在此披露的抗体氨基酸序列，这些抗体氨基酸序列可以由任何适合的多核苷酸编码。分离的抗体有时是以配制的形式提供的。在一些方面，一种抗体结合至一种或多种蛋白质，并且借此部分地或基本上改变至少一种蛋白质的至少一种生物活性，例如，细胞增殖活性。
人源化抗体
人源化抗体是一种抗体或其变体或片段，它们能够结合至一个预定的抗原并且包含一个构架区，该构架区基本上具有一种人免疫球蛋白的氨基酸序列；和一个互补决定区(CDR)，该互补决定区基本上具有一种非人免疫球蛋白的氨基酸序列。互补决定区(CDR)经常是一个抗体中决定抗体对特定抗原的亲和力和特异性的最可变区。人源化抗体基本上包括至少一个、并且典型地两个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有的CDR区与一种非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些相对应，并且所有或基本上所有的构架区是具有一种人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包括一个免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是一种人免疫球蛋白的至少一部分。抗体可以含有轻链连同一个重链的至少可变结构域两者。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3、以及CH4区。
人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)以及任何同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。通常，恒定结构域是一个补体固定恒定结构域，其中希望人源化抗体展现出细胞毒性活性，并且类别典型地是IgG1。在这种细胞毒性活性不是令人希望的情况下，恒定结构域可以是IgG2或IgG4类别。人源化抗体可以包括来自一个以上类别或同种型的序列，并且用于选择具体的恒定结构域来优化所希望的效应子功能的方法在本领域中是已知的。
一个人源化抗体的构架区和CDR区不需要精确地与亲本序列对应，例如，供体CDR或共有构架可以通过至少一个残基的取代、插入或缺失来进行诱变，以使得在那个位点处的CDR或构架残基不与共有抗体或输入抗体相对应。然而，这类突变可能并不是大规模的。至少75％的人源化抗体残基可以与亲本构架区(FR)和CDR序列的那些相对应，其中对应性有时例如是90％或更大、或95％或更大。
人源化基本上可以按照本领域中已知的方法通过用高变区序列取代一个人抗体的相应序列来进行。确切地说，人源化抗体可以通过本领域中已知的方法来制备，这些方法包括CDR移植方法、镶饰或重塑、链改组策略、分子建模策略等等。这些一般方法可以与标准诱变和重组合成技术相组合以便产生在此具有所希望特性的抗体。
CDR移植通过用一个供体抗体(例如，一个非人抗体)的一个或多个CDR替换一个受体抗体(例如，一个人抗体)的一个或多个CDR来进行。受体抗体可以基于一个候选受体抗体与一个供体抗体之间的构架残基的相似性来选择，并且可以进一步被修饰来引入相似的残基。在CDR移植之后，可以在供体和/或受体序列中作出另外的变化来优化抗体结合和功能性。
缩略为CDR区的移植是一种相关方法。缩略的CDR区包括特异性决定残基和相邻的氨基酸，包括轻链中在位置27d-34、50-55以及89-96处的那些和重链中在位置31-35b、50-58以及95-101处的那些。特异性决定残基(SDR)的移植是基于以下理解：一个抗体结合位点的结合特异性和亲和力是由每个CDR区内的最高度可变的残基决定。抗体-抗原复合物的三维结构的分析组合可获得的氨基酸序列数据的分析用于基于CDR内每个位置处出现的氨基酸残基的结构相异性来对序列可变性进行建模。由接触残基(被称为SDR)组成的免疫原性最小的多肽序列被鉴别出并被移植到人构架区上。
构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基来取代以便改变，并且潜在地改善抗原结合。这些构架取代是通过本领域中已知的方法来鉴别，例如通过模拟CDR与构架残基的相互作用来鉴别对于抗原结合来说重要的构架残基、和用于鉴别在具体位置处的不寻常构架残基的序列比较。
镶饰或重塑是基于以下概念：通过重塑具有人氨基酸序列的抗体的溶剂可及外部来减少一个啮齿或其他非人抗体中的潜在免疫原性的氨基酸序列。因此，镶饰的抗体对于人细胞来说显得较不外源。一个非人抗体通过以下各项来镶饰：(1)鉴别该非人抗体中暴露的外部构架区残基，这些残基与一个人抗体的构架区中的相同位置处的那些不同；以及(2)用典型地占据人抗体中的这些相同位置的氨基酸来替换所鉴别的残基。
根据定义，人源化抗体是嵌合抗体。嵌合抗体是这样的抗体：其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源，而这个或这链的另一部分与源自另一物种的或属于另一个抗体类别或亚类的抗体、以及这类抗体的片段中的相应序列一致或同源，只要它们展现出所希望的生物活性即可。在此感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，这些抗体包含源自一个非人灵长类(例如，旧世界猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
人抗体
对于一些应用来说，包括抗体在人体内的体内应用和体外检测测定，可能适合的是使用人或嵌合抗体。完全人抗体对于人受试者的治疗性治疗可能是令人希望的。人抗体可以通过在本领域中已知的多种方法来制作，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的下文描述的噬菌体展示方法。
人抗体还可以使用转基因小鼠来产生，这些转基因小鼠不能表达功能内源性免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白基因。例如，可以随机地或通过同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物引入到小鼠胚胎干细胞之中。可替代地，除了人重链和轻链基因之外，还可以将人可变区、恒定区和多样区(diversity region)引入到小鼠胚胎干细胞之中。可以单独使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无功能，或在引入人免疫球蛋白基因座的同时通过同源重组来使这些免疫球蛋白基因无功能。具体地说，JH区的纯合缺失防止内源性抗体产生。修饰的胚胎干细胞扩增并且微注射到胚囊中以便产生嵌合小鼠。然后使嵌合小鼠繁殖以便产生表达人抗体的纯合子代。以正常方式用一个选择的抗原(例如，在此的抗体的多肽的全部或一部分)来对转基因小鼠免疫。
针对抗原的单克隆抗体可以使用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得。转基因小鼠所具有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并且随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可能产生治疗有用的IgG、IgA、IgM以及IgE抗体。此外，多个公司如梅达瑞克斯(Medarex)(普林斯顿(Princeton)，新泽西(NJ))提供针对一个所选择抗原的人抗体。
本领域中还已知的是一种“微基因座(minilocus)”方法。在微基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的碎片(单独的基因)来模拟一个外源Ig基因座。因此，一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、一个mu恒定区以及通常一个第二恒定区(有时是一个γ恒定区)形成在用于插入一个动物中的一个构建体之中。
来自小鼠的人抗体的产生也是本领域已知的，在这些小鼠中通过微细胞融合，已经引入大片的染色体、或整个染色体。例如，克林(Kirin)的Tc小鼠与梅达瑞克斯的微基因座(Humab)小鼠的杂交已产生拥有以下的小鼠：克林小鼠的人IgH转染色体和基因药物(Genpharm mice)公司的小鼠的κ链转基因。
还可以通过体外方法获得人抗体。适合的实例包括但不限于噬菌体展示(医学免疫公司(MedImmune(以前为CAT)、莫弗西斯生物公司(Morphosys)、Dyax、Biosite/梅达瑞克斯、Xoma、Symphogen、亚力兄公司(Alexion，(以前为Proliferon)、Affimed)、核糖体展示(医学免疫公司(以前为CAT))、酵母展示等等。可以使用噬菌体展示技术从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱系体外产生人抗体和抗体片段。根据这项技术，抗体V结构域基因是以框内方式克隆到一个丝状噬菌体(例如M13或fd)的一个主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的一个单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性的选择还导致编码展现那些特性的抗体的基因的选择。因而，噬菌体模拟B细胞的一些特性。能够以本领域中已知的多种型式进行噬菌体展示。已经从源自免疫小鼠的脾脏的V基因的一个小随机组合文库分离抗噁唑酮抗体的不同阵列。可以构建来自未免疫人供体的V基因谱系，并且可以遵循本领域中已知的技术而基本上分离针对抗原(包括自身抗原)的不同阵列的抗体。还可以由体外活化的B细胞产生人抗体。
多价抗体
抗体的典型的特征在于二价，这意指它们含有两个抗原结合位点(即，F(ab')2片段的每个臂上各一个)。还涵盖具有二价以上的抗体(例如，F(ab')2片段)的一个或两个臂上有一个以上抗原结合位点)。例如，可以制备三特异性抗体。因此，在此所呈现的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(它们是IgM类别以外的)(例如，四价抗体)，这些抗体可以通过编码抗体的多肽链的核酸的重组表达来容易地产生。多价抗体可以包含一个二聚体化结构域和三个或更多个抗原结合位点。在一方面，一个二聚体化结构域包含一个Fc区或一个铰链区，或由其组成。在这种情形下，抗体可以包含一个Fc区和Fc区的氨基末端和/或羧基末端的三个或更多个抗原结合位点。在某些方面，在此的多价抗体包含三个至约八个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一个多肽链，其中一个或多个多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，这个或这些多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是一个第一可变结构域，VD2是一个第二可变结构域，Fc是Fc区的一个多肽链，X1和X2代表一个氨基酸或多肽，并且n是0或1。例如，这个或这些多肽链可以包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。在此的多价抗体可以进一步包含至少两个轻链可变结构域多肽。在此的多价抗体可以(例如)包含从约两个至约八个轻链可变结构域多肽。在此涵盖的轻链可变结构域多肽包含一个轻链可变结构域，并且任选地进一步包含一个CL结构域。
双特异性抗体
在一些方面，在此提供的抗体是双特异性的。如在此所使用的双特异性抗体是对至少两个独立的抗原(或靶标)或同一抗原内的不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合至一个靶标的两个不同的表位，或者可以结合两个不同的靶标。其他这类抗体可以将一个第一靶结合位点与另一个靶标的一个第二结合位点相组合。一个靶结合臂有时可以与结合至一个白血球上的一个触发分子的臂相组合，该触发分子如T-细胞受体分子(例如，CD3)，或针对IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)以及FcγRIII(CD16)，以便于将细胞防御机制集中且定位至靶蛋白表达细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位至表达抗原的细胞。这类抗体可以拥有一个靶结合臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素、抗-干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲喋呤或放射性同位素)的一个臂。
在一些情况下，在给予制成的单个分子的情况下，双特异性抗体提供由同时靶向两个抗原而获得的相加的和/或协同的治疗效果。例如，具有适度表达的HER2的乳腺癌的癌症患者(该患者无法用抗-HER2mAb疗法进行治疗)可能会受益于靶向HER2和EGFR两者的一个双特异性的协同治疗，前提是肿瘤也表达EGFR。然而，用两个二价mAb或这两个mAb的二价双特异性衍生物的治疗可能会造成严重的治疗和/或中毒风险。考虑到两个mAb或二价双特异性抗体与同恶性转化相关联的两个受体反应，应提高治疗的肿瘤特异性。然而，由于组合的mAb治疗或二价双特异性抗体对具有抗原的适度表达的肿瘤细胞具有活性，所以可能会因具有低抗原表达的一些正常组织的存在而出现一些新的副作用。这些组织可能不对单个mAb敏感，但可能会变得对组合的mAb治疗或二价双特异性衍生物敏感。在因亲合力作用而展示出增强的抗原-细胞结合的二价或多价分子的情况下，这种潜在的风险可能会更显著。
在一些方面，在此提供的抗体是单价双特异性抗体(MBab)。在此描述的单价双特异性抗体支架提供一个优异的平台用于产生双特异性抗体，这些双特异性抗体实现与双特异性抗体相关联的所有益处，而同时降低上文提及的因它们的单价性质所致的潜在的治疗风险。另外，在此提供的MBab是容易表达的，稳定的并且可能具有低免疫原性。如在此所使用的术语“单价双特异性”(其可能是缩略的“Mbab”)是指双特异性抗体，其中每个臂可以特异性地结合至一个不同的靶抗原，并且针对给定的一对不同靶抗原(A和B)，MBab可以结合至每一个。在某些方面，单价双特异性抗体可以特异性结合至两个独立的抗原(或靶标)或同一抗原上的两个独立的表位。典型地，单价双特异性抗体包含两个不同的可变区。在一些方面，对两个独立的抗原的结合亲和力大约是相同的。在一些方面，对两个独立的抗原的结合亲和力是不同的。在一些方面，对同一抗原上的两个独立的表位的结合亲和力大约是相同的。在一些方面，对同一抗原上的两个独立的表位的结合亲和力是不同的。在仍然其他方面，每个臂具有相同的特异性(例如，结合相同的或一个重叠的表位)，但以不同的亲和力结合。在一些方面，亲和力可以相差3倍或以上。在组合抗体的具有不同的体内效能的可变区时，可能特别希望具有亲和力较高的一个臂和亲和力较低的一个臂，以防止这些臂中的一个的剂量过度或不足。
在某些方面，一个MBab以不同的亲和力结合同一抗原上的相同表位或一个重叠的表位(例如，一个受体)。具体地说，相同的表位或重叠的表位在抗原被二聚化时密切接近。取决于相对浓度，这种抗体将具有双特征。例如，在高浓度下，在MBab浓度使抗原浓度饱和的情况下，高亲和力结合结构域将竞争淘汰低亲和力结合结构域并且亲合力作用将几乎不或不发生。也就是说，抗体将主要起到一个单价结合实体的作用并且抗原交联/信号传导将几乎不或不发生(参见图18)。然而，在低浓度下，亲合力作用将发挥作用，并且MBab可以同时结合两个结合位点(优选地处于两个抗原分子上)，从而引起抗原交联/信号传导(参见图18)。以此方式，抗原信号传导可以通过MBab浓度来调节。
在某些方面，在抗原的同二聚化是不希望的、和/或两个抗原均独立地存在于非靶细胞/组织上、和一起存在于靶细胞/组织上的情况下，一个MBab结合两个不同的抗原(例如，不同的受体)。这种抗体将在非靶细胞上仅用一个臂结合，MBab的仅一个臂与非靶细胞/组织的这种低亲合力单价结合不足以引发同二聚(参见图19，左侧)。相比之下，MBab可以结合至靶细胞/组织上的两个抗原，同时结合至靶细胞上的两个抗原将导致可以增强与靶细胞的优先结合并且可以增强受体二聚化(参见图19，右侧)的一种更高的亲合力二价结合。
在一些方面，单价双特异性抗体进一步包含另外的结合位点。这些另外的结合位点可以对单克隆双特异性抗体(MBab)的一个或两个靶抗原(A和B)是特异性的、和/或可以对另外的靶抗原是特异性的。在一些方面，一个或多个单链可变片段(scFv)被添加至一个或两个重链和/或一个或两个轻链的N-末端或C-末端，其中一个或多个scFv特异性结合至一个或多个另外的靶抗原。例如，一个单价三特异性抗体可以通过将一个scFv(对抗原C具有特异性)添加至一个单价双特异性抗体(对抗原A和B具有特异性)的一个链来产生。在这种情况下，抗体对抗原A、B以及C来说将是单价的。如果一个scFv(对抗原C具有特异性)被添加至两个链(例如，两个重链、两个轻链、一个重链和一个轻链)，那么三特异性抗体对抗原A和B将是单价的并且对抗原C是二价的。对于在此的单价双特异性抗体来说，涵盖另外的结合位点的任何可能的组合(参见，例如，迪麦斯(Dimasi)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(2009)393:672–692)。预期另外的结合位点的结合亲和力可以与MBab的一个臂或两个臂大约相同、或者可能与MBab的一个臂或两个臂不同。如上所述，相对亲和力可以根据抗原和分子的预期用途来选择或定制。
双特异性抗体可以制成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。全长双特异性抗体的传统生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性。归因于免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤(四链瘤)产生10种不同抗体分子的一种潜在混合物，其中只有一个具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤进行的正确分子的纯化十分繁琐，并且产物产率可以是低的。
双特异性抗体包括交联的或“异轭合”抗体。例如，异轭合物中的抗体中的一个可以偶联至亲和素，另一个偶联至生物素。异轭合抗体可以使用任何便利的交联方法来制备。然而，这种方法典型地要求使用非人蛋白，该非人蛋白可以携带潜在的高免疫原性。另外，抗体片段有时几乎不或不具有效应子功能并且具有较短的半衰期。
双特异性抗体可以使用化学连接来制备。在一个程序中，完整的抗体被蛋白水解性地裂解以便产生F(ab′)2片段。这些片段在存在二硫醇复合剂(dithiol complexingagent)亚砷酸钠的情况下被还原，以便稳定邻近的二硫酚并且防止分子间二硫化物的形成。所产生的Fab′片段然后被转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原，Fab′-TNB衍生物中的一种被重新转化成Fab′-硫醇，并且与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以便形成双特异性抗体。然而，这种方法经常导致较差的产率，难以控制，并且产物可以携带潜在的高免疫原性。另外，抗体片段有时几乎不或不具有效应子功能，并且具有较短的半衰期。
Fab′-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，该片段可以化学偶联来形成双特异性抗体。一个完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子可以通过分别从大肠杆菌中分泌每一个Fab′片段并且进行体外定向化学偶联以形成双特异性抗体来产生。然而，这种方法经常导致较差的产率并且难以控制。另外，抗体片段有时几乎不或不具有效应子功能，并且具有较短的半衰期。
双特异性抗体还可以使用亮氨酸拉链来产生。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区处还原以形成单体，并且然后再次氧化以形成抗体异二聚体。这种方法还可以用于产生抗体同二聚体。所描述的“双体抗体(diabody)”技术提供了用于制作双特异性抗体片段的另一种机制。这些片段包含通过一个接头与一个VL连接的一个VH，该接头因太短而不能使同一个链上的两个结构域配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。通过使用单链Fv(sFv)二聚体制作双特异性抗体片段的另一种策略在本领域中是已知的。然而，这种方法经常导致较差的产率，难以控制，并且产物可以携带潜在的高免疫原性。另外，抗体片段有时几乎不或不具有效应子功能，并且具有较短的半衰期。
双特异性抗体还可以使用重链异二聚化方法来产生。这类方法包括“孔洞中凸起”和链交换工程化结构域(SEED)方法，以及改变整个Fc二聚体界面的电荷极性的那些。在此进一步详细描述了这类方法，并且这些方法进一步详细描述于例如美国专利第7,183,076号；麦钱特(Merchant)等人(1998)自然生物技术(Nat.Biotech)16:677-681；里奇韦(Ridgway)等人(1996)蛋白质工程(Protein Engineering)9:617-621；戴维斯(Davis)等人(2010)蛋白质工程设计与选择(Prot.Eng.Design & Selection)23:195-202；WO2007/110205；WO2007/147901；古纳斯卡兰(Gunasekaran)等人(2010)生物化学杂志(JBC)285:19637-46中。在这些方法中，一对抗体分子之间的界面可以被工程化来最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分率。在“孔洞中凸起”方法中，一个“突起”通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链来产生。大小与一个或多个大侧链相同或相似的补偿“空腔”通过用具有较小侧链的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换具有大侧链的氨基酸来在第二抗体分子的界面上产生。这提供一种机制用于提高异二聚体超出其他不想要的最终产物如同二聚体的产率。在SEED方法中，Fc同二聚体通过使人IgG和IgA CH3结构域的β-链区段相互交叉来转化成异二聚体。人IgG和IgA CH3结构域的这些衍生物产生了由人IgA和IgG CH3序列的交替区段构成的互补人SEED CH3异二聚体。当在哺乳动物细胞中表达时，所得的SEED CH3结构域对优先地缔合以便形成异二聚体。其他方法包括引入改变整个Fc二聚体界面的电荷极性的修饰，这样使得静电匹配的Fc区的共表达导致异二聚化。这些方法改善了重链异二聚化，但并未解决双特异性抗体形成过程中形成的轻链-重链错配对。在一些情况下，一个公用轻链的使用可以减少可能的错配对的数量，如WO 98/50431中所描述，但经常导致结合特异性和/或亲和力的损失或降低。
双重特异性抗体是可以产生的另一种类型的双特异性抗体(参见，例如，博斯特罗姆(Bostrum)等人(2009)科学(Science)323:1610-1614)。这类抗体可以通过产生在轻链(LC)互补决定区(CDR)中具有突变的变体来产生，这样使得这些抗体可以结合一个新抗原靶标，同时维持对其天然靶抗原的结合特异性。然而，抗原结合位点经常重叠，从而防止抗体同时结合两个抗原。另外，这些抗体难以产生并且可能不拥有对两个抗原中的每一个的所希望的亲和力。
在此提供的修饰的多肽可以用于产生双特异性抗体并且克服如上所述的限制和技术难题。在一些方面，一个抗体内的一个重链和一个轻链被修饰，借此一个天然半胱氨酸被一个非半胱氨酸氨基酸取代，并且一个天然非半胱氨酸氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸取代。在此提供的这类修饰在HC和LC结构域中产生并且导致一个HC-LC链间二硫桥的重新定位。当从四个单独的多肽产生一个双特异性抗体时，例如，在修饰的臂对一个靶标具有结合特异性并且未修饰的臂对一个不同的靶标具有结合特异性的情况下，四个多肽将组装以使得修饰的重链适当地与修饰的轻链杂交并且未修饰的重链适当地与未修饰的轻链杂交。如在此所使用的术语“未修饰的”是指不含有引入用于半胱氨酸和/或二硫桥的重新定位的HC-LC修饰的重链和轻链，如在此所描述。这类“未修饰的”重链和轻链可以包含其他修饰，例如像在此所描述和/或本领域中已知的CH2和/或CH3区内的异二聚化修饰。在此提供的HC-LC修饰可以与重链的、尤其是CH2和/或CH3区中的另外的修饰相组合，以便确保适当的重链异二聚化和/或增强一个重链异二聚体的纯化并且在下文中进行详细描述。
用于双特异性的测定
本领域中已知的用于测定双特异性的任何测定可以用于表征在此提供的抗体。用于双特异性的测定的非限制性实例包括免疫测定、直接结合测定、以及交联测定。例如，AlphaLISA测定(珀金埃尔默(Perkin Elmer))是可以用于测定一个抗体的双特异性的一种免疫测定。APLHLISA测定是基于使一个供体珠粒与受体珠粒密切接近，从而产生一个可记录的信号。对于一个双特异性抗体来说，一个抗体与两个抗原的同时结合使供体珠粒和受体珠粒密切接近并且产生一个信号。第一抗原可以被工程化来含有一个标签如FLAG标签，该标签可以与轭合至一个抗-标签抗体(例如，抗-FLAG)的受体珠粒结合。第二抗原可以被生物素化并且可以结合至涂覆有链霉亲和素的供体珠粒。对第一抗原和第二抗原具有双特异性的一个抗体将使供体珠粒和受体珠粒密切接近并且产生一个信号。在此的实例中例示了用于测定双特异性的另外的测定。
抗体功能
抗体可以实现若干功能，例如像抗原结合以及诱导一个免疫应答。
抗原结合
如在此所使用的术语“抗原”是指在引入到有机体内时引起免疫应答并且能够与特异性抗体结合的一种分子。抗体-抗原结合通过抗原与抗体之间的许多微弱的相互作用的总和来介导，这些相互作用包括例如氢键、范德瓦尔力(van der Waals forces)、以及离子性的和/或疏水性相互作用。
一个抗原结合至一个抗体上的互补区。抗原的一个或多个相应的区被称为一个“抗原决定簇”或“表位”。大多数抗原具有多个决定簇；如果2个或更多个是相同的，那么抗原是多价的。
一个抗体的亲和力反映了抗原决定簇与抗体结合位点之间的配合并且不依赖于结合位点的数量。结合的亲合力反映了抗体-抗原复合物的总稳定性。亲合力被定义为所有结合位点的总结合强度。因此，抗体对其抗原的亲和力和抗体和抗原两者的效价均会影响亲合力。在一个典型的IgG分子中，两个(而不是一个)多价结合位点的接合可以使结合加强多达10000倍。
许多抗体和抗原的多价性质可能会引起二级反应，如有机体内的沉淀、细胞聚集、以及补体固定。这类反应可以用于多种技术如蛋白质印迹法、ELISA、免疫沉淀等等。然而，这些反应在旨在用于治疗和/或诊断用途的一个分子中可能是不希望的。在此提供的双特异性抗体的单价性质因此提供了针对治疗和/或诊断目的的优点。
靶标的实例
在一些方面，具体分子对被如在此提供的抗体靶向。本披露的抗体可能能够结合选自以下的细胞因子对，这些细胞因子对例如IL-1α和IL-1β；1L-12和IL-18；TNFα和IL-23；TNFα和IL-13；TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-17；TNF和IL-15；TNF和VEGF；VEGFR和EGFR；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；TNFα和PGE4；IL-13和PED2；TNF和PEG2；HER2和HER3；HER1和HER2；HER1和HER3。
在某些方面，如在此提供的抗体可能能够结合选自以下的靶标对，这些靶标对例如CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CSPGs和RGM A；CTLA4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和ErbB2；IGFR和EGFR；ErbB2和ErbB3；ErbB2和CD64；IL-12和TWEAK；IL-13和IL-1β；MAG和RGMA；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；PDL-1和CTLA4；RGM A和RGM B；Te38和TNFα；TNFα和Blys；TNFα和CD-22；TNFα和CTLA-4；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；以及TNFα和RANK配体。
在一些方面，如在此提供的抗体可能能够结合选自以下的一个、两个或更多个生长因子、细胞因子、细胞因子相关蛋白、以及受体：例如BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、FGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFRL1、FGFR6、IGF1、IGF2、IGF1R、IGF2R、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1(EPSILON)、FIL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL2RA、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL28RA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVRL1、GFRA1、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF10A(Trail-受体)、TNFRSF10B(Trail-受体2)、TNFRSF10C(Trail-受体3)、TNFRSF10D(Trail-受体4)、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、KDR、FLT1、FLT4、NRP1、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN、ALK以及THPO。
在另外的方面，如在此提供的抗体可能能够结合选自以下的一个或多个趋化因子、趋化因子受体、以及趋化因子相关蛋白：例如CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞活化趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/二级淋巴组织趋化因子(exodus-2))、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145))、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2、以及VHL。
如在此提供的其他抗体可能能够结合选自以下的细胞表面蛋白，例如整合膜蛋白，包括离子通道、离子泵、G-蛋白偶联的受体；结构蛋白，粘着蛋白如整联蛋白、转运蛋白、膜结合酶，能量累积和转换中涉及的蛋白以及包括G蛋白和一些膜锚定激酶的脂锚定蛋白。如在此提供的抗体还可能能够结合酶如激酶，蛋白酶，脂酶，磷酸酶，脂肪酸合成酶，消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、以及胰凝乳蛋白酶，溶菌酶，以及聚合酶。如在此提供的抗体还可能能够结合至受体如激素受体、淋巴因子受体、单核因子受体、生长因子受体、G-蛋白偶联受体、以及更多。
在一些方面，如在此提供的抗体的多聚体性质将靶向标签或治疗剂的能力赋予特定的细胞类型或分子靶标。例如，如在此提供的一个抗体的一个抗原结合结构域可以在细胞的表面处结合至一个靶标，而同一抗体内的另一个抗原结合结构域结合至一个半抗原或用于检测的标记剂(labeling agent)。类似地，一个功能结构域可以结合至一个细胞靶，而一个第二功能结构域结合至一个毒素。由于结合反应均通过单个分子来介导，所以毒素可以放置在影响细胞毒性功能的细胞靶附近。
免疫功能
抗体结合并灭活病原体，可以通过巨噬细胞刺激病原体的去除并且通过涂覆病原体刺激其他细胞的去除，并且通过刺激其他免疫应答如补体途径来触发病原体的破坏。抗体通过结合至(例如)一个细菌或癌症细胞上的表面抗原来激活补体途径。抗体的Fc区然后与补体级联相互作用。抗体以及补体级联分子的结合吸引吞噬细胞并且对微生物或细胞进行标记以用于摄入。补体系统组分可以形成一种膜攻击复合物以帮助抗体直接杀伤细菌或细胞。
抗体结合可能会使病原体凝集。涂覆有抗体的病原体刺激细胞中识别抗体Fc区的效应子功能。效应子功能最终导致入侵微生物或病原性细胞的破坏，例如，吞噬细胞将吞噬，肥大细胞和嗜中性粒细胞将脱粒，并且天然杀伤细胞将释放细胞因子和细胞毒性分子。
转化的肿瘤细胞表达来自若干来源的异常抗原，这些来源包括致癌病毒、有机体自身的异常高的水平的蛋白质、以及诱导癌症的致癌基因。肿瘤抗原以与病毒抗原相似的方式呈现在主要组织相容性(MHC)I类分子上。抗原激活杀伤T-细胞并且还产生触发补体系统的抗体。
在此的一个抗体可以结合至一个肿瘤或其他病原性细胞抗原并且通过一种抗体功能来触发细胞毁灭。在某些方面，在此的一个抗体可以轭合至一个治疗分子(包括一个诊断分子或毒素)，并且借助于抗体-抗原亲和力将轭合的分子携带至选择的位点。
表位
如在此所使用的术语“表位”是指能够结合至一个抗体的一个分子决定簇。表位通常包括诸如氨基酸和/或糖侧链的分子的化学活性表面基团，并且通常具有特定的三维结构特征、以及特定的化学特征(例如电荷、极性、碱性、酸性、疏水性等等)。构象和非构象表位的区别在于：在存在变性溶剂下，与前者(而不是后者)的结合消失。
在某些方面，一个表位包含一个靶蛋白的至少一个细胞外的、可溶的、亲水的、外部的或胞浆部分。指定的表位可以包括靶蛋白的连续氨基酸的至少3个氨基酸残基乃至整个指定部分中的至少一个氨基酸序列的任何组合。在一些方面，表位是靶蛋白的连续氨基酸中的至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、或至少9个氨基酸残基乃至整个指定部分。
抗体片段
在某些方面，本发明抗体是抗体片段或包含这些片段的抗体。抗体片段包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd以及Fv片段。双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及多特异性抗体是从这些抗体片段形成的抗体。
在传统上，这些片段是使用本领域中已知的技术、经由完整抗体的蛋白水解消化而衍生的。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。所有Fab、Fv和scFv抗体片段都可以表达在大肠杆菌中并且从其分泌，因而允许大量这些片段的容易生产。在一方面，可以从在此其他地方讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。还可以将Fab'-SH片段直接从大肠杆菌回收，并且将其化学偶联以形成F(ab')2片段。还可以直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术是本领域中已知的。在某些方面，在此提供的抗体包含单链Fv片段(scFv)或其他抗原结合结构域。
在某些方面，在此的抗体包含结构域抗体，例如对应于人抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区的、含有抗体的小功能性结合单位的抗体。结构域抗体的实例包括但不限于从多曼提斯(Domantis)可获得的、对治疗靶有特异性的那些结构域抗体。可以使用结构域抗体的可商购文库来鉴别抗原结构域抗体。在某些方面，在此的抗体包含一个功能性结合单位以及一个Fcγ受体功能性结合单位。
在某些方面，在此的抗体包含疫苗体(vaccibodies)。疫苗体是二聚体多肽。一个疫苗体的每个单体由对APC上的一个表面分子具有特异性的scFv组成，该scFv通过一个铰链区和一个Cγ3结构域连接至一个第二scFv。在一些方面，含有缺乏链间半胱氨酸片段的一个抗体作为一个scFv的疫苗体可以用于将用于破坏的那些细胞与介导ADCC的一个效应子细胞并置。
在某些方面，在此的抗体是线性抗体。线性抗体包括一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，这些区段形成一对抗原结合区。线性抗体在某些方面可以是双特异性的。
HC和LC修饰
在一些方面，在此提供了工程化抗体，在这些抗体中一个或多个链间半胱氨酸已被重新定位，在一些方面，这导致了一个链间二硫键的重新定位。在一些方面，这涉及一个抗体内的一个重链和一个轻链的修饰，借此重链中的一个天然半胱氨酸和轻链中的一个天然半胱氨酸各自被一个非半胱氨酸氨基酸取代，并且重链中的一个天然非半胱氨酸氨基酸和轻链中的一个天然非半胱氨酸氨基酸各自被一个半胱氨酸氨基酸取代。在一些方面，重新定位的二硫桥处于一个抗体的两个CH1-CL界面中的一个上(即，在抗体的一个臂上)。经常，HC和LC区被修饰以使得每一个含有一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，以及一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，这样使得在修饰的HC与LC区之间形成的所得二硫桥处于与未修饰的HC与LC区之间形成的二硫桥不同的，沿着界面的位置上。在某些方面，每个重链进一步包含有利于重链异二聚化的一个修饰。在其他方面，一个重链进一步包含促进异二聚体的纯化的一个修饰，这个修饰可能是有利于重链异二聚化的一个修饰之外的修饰或是它的一个替代。
在一些方面，在此还提供了工程化抗体，其中一个或多个重链和相应一个或多个轻链已被工程化来有利于一个第一重链与一个第一轻链和一个第二重链与一个第二轻链的链间配对。在一些方面，这涉及一个第一重链和一个第一轻链的修饰，借此第一重链包含突起和/或一个空腔，并且第一轻链包含有利于第一重链与第一轻链的链间配对的一个补偿空腔和/或突起。在一些方面，这进一步涉及一个第二重链和一个第二轻链的修饰，借此第二重链包含突起和/或一个空腔，并且第二轻链包含有利于第二重链与第二轻链的链间配对的一个补偿空腔和/或突起。在一些方面，第一重链和第一轻链和/或第二重链和第二轻链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代。在某些方面，每个重链进一步包含有利于重链异二聚化的一个修饰。在其他方面，一个重链进一步包含促进异二聚体的纯化的一个修饰，这个修饰可能是有利于重链异二聚化的一个修饰之外的修饰或是它的一个替代。
在根据卡巴特中阐述的EU索引进行编号、在IgG重链或轻链的恒定区内含有一个取代的位置，以及在在此的表8和序列表中所阐述的序列中的相应位置的实例在以下表2中呈现。图22和图24分别示出了根据卡巴特中阐述的EU索引，轻链恒定区和重链恒定区的编号。
下表3中呈现了根据卡巴特定义进行编号、在IgG重链或轻链的可变区内含有一个取代的位置的实例。
表3提供了根据卡巴特定义的可变区的编号。图15A、图15B、图17A以及图17B提供了来自若干代表性抗体的可变区(构架和CDR)的卡巴特编号。
被非半胱氨酸氨基酸取代的天然半胱氨酸
在一些方面，天然半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，HC-LC界面内的链间半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，一个或多个链间半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，IgG1重链在位置220处具有一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG2重链在位置131和/或219和/220处具有一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG3或IgG4重链在位置131处具有一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在IgG轻链中，一个链间半胱氨酸被一个非半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，轻链是一个κ轻链并且在一些方面，轻链是一个λ轻链。在一些方面，IgG轻链在位置214处具有一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。这类非半胱氨酸氨基酸在一些方面包括天然存在的和/或非经典氨基酸。
天然存在的非半胱氨酸氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸。非经典氨基酸有时可以经由细胞表达系统(例如，原核细胞和/或真核细胞表达系统)来并入。非经典氨基酸的实例包括鸟氨酸、二氨基丁酸、正亮氨酸、吡啶丙氨酸(pyrylalanine)、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸以及苯基甘氨酸。非经典氨基酸的其他实例是α和α-二取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸*，天然氨基酸的卤化物衍生物如三氟酪氨酸*，对-X-苯丙氨酸(其中X是一个卤素如F、Cl、Br或I)*，烯丙基甘氨酸*，7-氨基庚酸*，甲硫氨酸砜*，正亮氨酸*，正缬氨酸*，对-硝基苯基丙氨酸*，羟基脯氨酸#，硫代脯氨酸*，苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*，Phe(4-氨基)#，Tyr(甲基)*，Phe(4-异丙基)*，Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*，二氨基丙酸，Phe(4-苯基)*，4-氨基丁酸(γ-Abu)*，2-氨基丁酸(α-Abu)*，6-氨基己酸(ε-Ahx)*，2-氨基异丁酸(Aib)*，3-氨基丙酸*，正缬氨酸*，羟基脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱氨酸，叔-丁基甘氨酸*，叔-丁基丙氨酸*，苯基甘氨酸*，环己基丙氨酸*，氟代氨基酸，设计者(designer)氨基酸如β-甲基氨基酸等等。符号*指示具有疏水特征的衍生物并且#指示具有亲水特征的衍生物。
在某些方面，HC-LC链间半胱氨酸被缬氨酸或丙氨酸替换。在一些方面，IgG1重链中位置220处的氨基酸被缬氨酸或丙氨酸替换。在一些方面，IgG2重链中位置131和/或219和/或220处的氨基酸被缬氨酸或丙氨酸替换。在一些方面，IgG3或IgG4重链中位置131处的氨基酸被缬氨酸或丙氨酸替换。在一些方面，IgG轻链中位置214处的氨基酸被缬氨酸替换。
被半胱氨酸取代的天然非半胱氨酸氨基酸
在一些方面，天然非半胱氨酸氨基酸被半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，在HC和LC内，天然非半胱氨酸氨基酸被半胱氨酸氨基酸替换。在CH1区和含有一个天然非半胱氨酸氨基酸的CL区内的任何位置处，天然非半胱氨酸氨基酸可以被半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，这类位置在天然氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸取代时允许链间二硫键的形成。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，一个天然非半胱氨酸氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在位置141处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在位置168处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在位置126处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在位置128处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
在一些方面，在IgG轻链中，一个天然非半胱氨酸氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，轻链是一个κ轻链并且在一些方面，轻链是一个λ轻链。在一些方面，IgG轻链在位置116处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG轻链在位置164处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG轻链在位置121处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG轻链在位置118处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，在位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，在位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，在位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，在位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代。在一些方面，在IgG轻链中，在位置116处的苯丙氨酸或苏氨酸被一个半胱氨酸取代。在一些方面，在IgG轻链中，在位置164处的苏氨酸或赖氨酸被一个半胱氨酸取代。在一些方面，在IgG轻链中，在位置121处的丝氨酸被一个半胱氨酸取代。在一些方面，在IgG轻链中，在位置118处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代。
在一些方面，在VH和VL区内，天然非半胱氨酸氨基酸被半胱氨酸氨基酸替换。在VH区和含有一个天然非半胱氨酸氨基酸的VL区内的任何位置处，天然非半胱氨酸氨基酸可以被半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，这类位置在天然氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸取代时允许链间二硫键的形成。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链可变区中，一个天然非半胱氨酸氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，在VH和VL的可变区内、在本领域中已知的一个位置处，一个天然非半胱氨酸氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸替换，参见例如布林克曼(Brinkmann)等人，1993，美国科学院院报(PNAS)，90:7538-42；朱(Zhu)等人，1997，蛋白质科学(Prot.Sci.)6:781-8；赖特尔(Reiter)等人，1994，生物化学(Biochem.)33:5451-9；赖特尔等人，1996，自然(Nature)14:1239-45；罗(Luo)等人，1995，生物化学杂志(J.Biochem.)118:825-31；杨(Young)等人，1995，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Let.)377:135-9；格勒诺布尔等人，1990，生物化学29:1362-7。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置37处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置44处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置45处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置55处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置98处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置100处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置101处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，一IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置105处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链在可变区的位置106处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。
在一些方面，在IgG轻链可变区中，一个天然非半胱氨酸氨基酸被一个半胱氨酸氨基酸替换。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置43处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置46处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置50处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置57处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置87处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置95处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置100处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置101处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。在一些方面，IgG轻链在可变区的位置105处具有一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。
突起和空腔
在一些方面，至少一个氨基酸的取代产生一个突起和/或一个空腔。产生一个突起和/或一个空腔的氨基酸取代可以位于CH1区和/或CL区内的任何位置。在一些方面，至少一个氨基酸的取代在CH1区内产生一个突起和/或一个空腔并且在CL区内产生一个补偿空腔和/或突起。在某些方面，这类取代有利于包含该空腔和/或突起的CH1与包含该补偿空腔和/或突起的CL的链间配对。在某些方面，除了产生一个突起和/或一个空腔的一个或多个取代之外，CH1和CL进一步包含用非半胱氨酸氨基酸替换HC-LC界面内的链间半胱氨酸的取代，如上所述。
在一些方面，至少一个氨基酸的取代在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中产生一个突起和/或一个空腔。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链的位置145被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链的位置183被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链的位置185被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链的位置147被具有一个小侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链的位置170被具有一个小侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置147被具有一个小侧链的一个氨基酸取代并且位置185被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置145被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，位置170被具有一个小侧链的一个氨基酸取代，位置183被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，并且位置185被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在某些方面，除了产生一个突起和/或一个空腔的一个或多个取代之外，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链进一步包含链间半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸的取代，如上所述。
在一些方面，至少一个氨基酸的取代在IgG轻链中产生一个突起和/或一个空腔。在一些方面，轻链是一个κ轻链并且在一些方面，轻链是一个λ轻链。在一些方面，IgG轻链的位置131被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG轻链的位置176被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG轻链的位置135被具有一个小侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，IgG轻链的位置178被具有一个小侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在IgG轻链中，位置131被具有一个大侧链的一个氨基酸取代并且位置135被具有一个小侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在IgG轻链中，位置176被具有一个大侧链的一个氨基酸取代，并且位置178被具有一个小侧链的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。在某些方面，除了产生一个突起和/或一个空腔的一个或多个取代之外，IgG轻链进一步包含链间半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸的取代，如上所述。
在一方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置145处的亮氨酸被一个苯丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置147处的亮氨酸被一个丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置170处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置183处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置185处的缬氨酸被一个色氨酸或苯丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置185处的缬氨酸被一个色氨酸取代，并且位置147处的赖氨酸被一个丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链中，位置145处的亮氨酸被一个苯丙氨酸取代，位置170处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，位置183处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，并且位置185处的缬氨酸被一个苯丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在某些方面，除了产生一个突起和/或一个空腔的一个或多个取代之外，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链进一步包含链间半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸的取代，如上所述。
在一方面，一个κ轻链的位置131处的丝氨酸或一个λ轻链的位置131处的苏氨酸被色氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，一个κ或λ轻链的位置176处的丝氨酸被一个苯丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，一个κ或λ轻链的位置135处的亮氨酸被一个甘氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一方面，一个κ轻链的位置178处的苏氨酸或一个λ轻链的位置178处的酪氨酸被一个丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在一个κ轻链中，位置131处的丝氨酸被一个色氨酸取代，并且位置135处的亮氨酸被一个丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在一个κ轻链中，位置176处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，并且位置178处的苏氨酸被丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
在一些方面，在一个λ轻链中，位置131处的苏氨酸被一个色氨酸取代并且位置135处的亮氨酸被一个丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。在一些方面，在一个λ轻链中，位置176处的丝氨酸被苯丙氨酸取代并且位置178处的苏氨酸被丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引的。在某些方面，除了产生一个突起和/或一个空腔的一个或多个取代之外，IgG轻链进一步包含链间半胱氨酸被非半胱氨酸氨基酸的取代，如上所述。
HC-LC氨基酸取代组合
在某些方面，在IgG重链和相应轻链中进行取代的组合。经常，取代的这类组合导致典型地在HC和LC区内的重链与轻链之间形成一个二硫桥的天然半胱氨酸的去除，以及能够在HC-LC界面内的一个不同位置处形成一个二硫桥的一对新的半胱氨酸的产生。该对新的半胱氨酸可以位于重链和轻链的可变区和/或CH1-LC内。下表4中总结了取代的这类组合。对于恒定区来说，位置编号是根据EU索引，并且对于可变区来说，位置编号是根据卡巴特索引。尽管表4中未具体指示，但轻链可以是一个κ(κ)或λ(λ)轻链。
在某些方面，本发明的一个双特异性抗体将包含相同Ig类型的两个不同的重链(例如，两个IgG1重链，一个具有半胱氨酸残基的修饰并且一个不具有这种修饰)以及两个不同的轻链(例如，一个具有半胱氨酸残基的修饰并且一个不具有这种修饰)，这两个不同的轻链可以是κ和/或λ的任何组合(即，两个κ轻链，两个λ轻链，或一个λ轻链和一个κ轻链)。在一个具体方面，本发明的一个双特异性抗体将包含相同Ig类型的两个不同的重链和一个λ轻链以及一个κ轻链。
虽然在此描述的不同修饰的使用极大地增强了二价抗体的形成，但可能因重链和轻链的错配对或因重链的同二聚化而产生一些错配对的抗体。两个不同的轻链恒定区的存在提供了通过使用对κ或λ型轻链具有特异性的亲和色谱介质(例如，树脂)来去除具有相同轻链的任何错配对抗体的一种便利的手段。与κ或λ轻链恒定结构域特异性地相互作用的亲和色谱介质在本领域中是已知的(例如，CaptureSelectκ和CaptureSelectλ亲和基质(BACBV，荷兰)。在某些方面，由于仅一个轻链过量，所以形成了仅一个类型的LC-错配对副产物。因此，如果过量的轻链是κ，那么LC-副产物将使用对λ轻链具有特异性的一种亲和色谱介质来去除并且如果过量的轻链是λ，那么副产物将使用对κ轻链具有特异性的一种亲和色谱介质来去除。
可替代地或任选地，轻链特异性亲和介质可以用于多步骤过程中以便纯化具有一个κ轻链和一个λ轻链的抗体。通过举例提供了一种代表性三步骤过程：(1)蛋白A和/或G树脂(适当时)用于捕获IgG(包括错配对产物的所有IgG将结合至蛋白质A和/或G)；(2)来自蛋白A和/或G介质的抗体穿过一种κ特异性介质以便捕获含有一个或多个κ轻链的IgG(包含一个或两个κ轻链的所有IgG将结合一种κ特异性介质，而包含两个λ链的抗体将流过)，(3)来自κ特异性介质的抗体穿过一种λ特异性介质以便捕获含有一个λ轻链的IgG(包含两个κ链的抗体将流过)。应注意，步骤的顺序可以改变并且应进一步注意，某些步骤可以被消去和/或用在抗体从污染物(例如，宿主细胞蛋白)纯化中有用的其他色谱方法替换。在此提供的的实例中例示了一个代表性两步骤过程。还参见国际专利公开WO 2012/023053以及在此提供的实例。
如在此所描述的氨基酸取代(例如，天然氨基酸残基、半胱氨酸和/或非半胱氨酸氨基酸残基的取代)可以使用本领域中已知的任何方法来进行。这些方法包括但不限于PCR延伸重叠诱变、定点诱变或盒式诱变(一般参见，桑布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆(Molecular Cloning)：实验室操作手册(A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbour)，纽约，1989；奥斯贝尔(Ausbel)等人，当代分子生物学方案(Current Protocols in MolecularBiology)，格林出版与威利国际科学出版社(Greene Publishing & Wiley-Interscience)，纽约，1993)。定点诱变试剂盒是可商购的，例如，定点诱变试剂盒(加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla)的斯特拉特基因公司(Stratagen))。盒式诱变可以基于韦尔斯(Wells)等人，1985，基因(Gene)，34:315-323来进行。可替代地，突变体可以通过全基因合成、通过重叠的寡核苷酸的退火、连接和PCR扩增以及克隆来制作。
Fc区修饰
在此提供了在可变和/或CH1和/或CL区内具有HC和LC修饰的抗体。在一些方面，还提供了下文所述的在Fc区内进一步包含一个或多个修饰的修饰的抗体。包含一个或多个修饰的Fc区在此被称为“变体Fc区”。
一对抗体分子之间的界面可以被工程化来最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分率。一个适当的界面包含CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，一个“突起”(此处又称为“凸起”)是通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链来产生。大小与一个或多个大侧链相同或相似的补偿“空腔”(在此又称为“孔洞”)通过用较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生。可替代地或另外，CH3区可以被修饰来包括引入能够形成一个二硫键的半胱氨酸残基的突变。这些修饰提供一种机制来用于提高异二聚体超出其他不想要的最终产物如同二聚体的产率。增强异二聚化的CH3修饰包括例如一个重链上的Y407V/T366S/L368A和另一个重链上的T366W；一个重链上的S354C/T366W和另一个重链上的Y349C/Y407V/T366S/L368A。导致一个链上的一个突起和另一个链上的一个空腔的另外的修饰提供于表5中并且描述于美国7,183,076；以及麦钱特等人，1998，自然生物技术16:677-681中。可以用于产生异二聚体的其他修饰包括但不限于改变整个Fc二聚体界面的电荷极性以使得静电匹配的Fc区的共表达导致异二聚化的那些。改变电荷极性的修饰包括但不限于表6中呈现的那些(还参见WO 2007/147901；古纳斯卡兰等人，2010，生物化学杂志285:19637-46)。此外，戴维斯等人(2010，蛋白质工程设计与选择23:195-202)描述了使用链交换工程化结构域(SEED)CH3区的一个异二聚体的Fc平台，该CH3区是人IgG和IgA CH3结构域的衍生物(还参见WO 2007/110205)。
恒定区的编号是根据EU索引
恒定区的编号是根据EU索引
增强在此描述的异二聚化的任何CH3修饰可以位于在此提供的抗体的任一链上，只要一个链具有一组修饰并且另一链具有补偿修饰即可。例如，如果T366W修饰处于具有一个未修饰的CH1区的重链中，那么上文描述的Y407V/T366S/L368A修饰可以处于含有在此描述的CH1修饰的同一个重链之中。相反地，如果T366W修饰处于含有在此描述的CH1修饰的重链中，Y407V/T366S/L368A修饰可以处于具有一个未修饰的CH1区的重链之中。在某些方面，用于增加和/或稳定异二聚体形成的另外的突变被引入到CH2和/或CH3区之中。在一些方面，CH2和/或CH3区内的一个或多个残基被突变为能够在两个重链之间形成链间二硫键的半胱氨酸残基，
本领域技术人员将理解具有不同的可变区的抗体可以在不同的水平下进行表达。因此，具有不同的可变区的、构成在此提供的MBab的重链和/或轻链可以在不同的水平下进行表达。这种不均匀的表达可能导致产生具有松散配对的同二聚体重链的抗体，这些松散配对的同二聚体重链可能分泌为半抗体或者可能分泌并且随后形成半抗体。在此提供了最小化半抗体的产生的方法。确切地说，在某些方面，在比一个第二重链更高的水平下表达的一个第一重链被工程化来在CH2和/或CH3区内包含使同二聚体配对极不稳定的一个突变。不希望受任何具体理论限制，使同二聚体对极不稳定的一个突变的存在导致这类同二聚体对降解而非分泌，从而最小化半抗体的产生。例如，在某些方面，T366W突变被并入到在更高水平下表达的任一重链的CH3区中，并且补偿的Y407V/T366S/L368A修饰被引入到另一个重链之中。如在此所描述，另外的突变可以被进一步并入到Fc区中以便进一步增加/稳定异二聚体形成和/或改变效应子功能和/或改变半衰期。本领域中已知的其他方法还可以用于平衡两个重链的表达水平，如强/弱启动子的使用。
在IgG的Fc区中的残基435(根据EU索引进行编号)位于与葡萄球菌蛋白A相互作用的位点(戴森霍氟(Deisenhofer)，1981，生物化学20:2361-2370)并且包含H435和Y436的IgG结合蛋白A，而包含R435和F436的IgG不结合蛋白A(吉恩德伯格(Jendeberg)等人，1997，免疫法杂志(J Immunol Methods)201:25-34)。此外，在一个重链上包含H435/Y436并且在另一个重链上包含R435/F436的抗体可以与包含在蛋白A介质上含有H435/Y436的两个重链的抗体分离(参见，例如，WO 2010/151792和在此提供的实例)。因此，将适当的突变并入一个重链CH3区提供了一种机制来促进使用蛋白A色谱的同二聚体的去除。因此，在一些方面，在此提供的抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且包含具有减少或消除蛋白A结合的一个突变的一个重链CH3区和维持结合至蛋白A的一个重链。在其他方面，在此提供的抗体是IgG3并且包含具有储存蛋白A结合的一个突变的一个重链CH3区和不结合至蛋白A的一个重链。在某些方面，在此提供的抗体包含具有H435的一个重链CH3区和具有R435的一个重链CH3。在其他方面，在此提供的抗体包含具有H435/Y436的一个重链CH3区和具有R435/F436的一个重链CH3。
已知VH3家族可变结构域结合蛋白A。因此，在某些方面，为了防止携带一个突变以除去蛋白A结合、但包含VH3家族可变结构域的孔洞重链的结合，使用了不结合VH3可变结构域的蛋白A的一种形式(例如，MabSelect SuRe LX蛋白A，通用医疗集团(GE Healthcare)。
改变在此描述的蛋白A结合的修饰可以位于在此提供的抗体的任一链上，只要只有一个重链单独在残基435处被修饰或在残基435处组合436被修饰，并且另一个链在435处是野生型的。如图24D中所示，野生型人IgG1、IgG2以及IgG4各自包含H435/Y436，而野生型人IgG3包含R435/F436。因此，突变的性质将取决于IgG的类型。确切地说，对于IgG1、IgG2或IgG4来说，H435R/Y436F突变将被引入到一个重链CH3中，而对于IgG3来说，435H/F436Y突变将被引入到一个重链之中。在某些方面，减少或消除蛋白A结合的一个替代突变被引入到IgG1、IgG2或IgG4中的仅一个重链之中。在某些其他方面，储存蛋白A结合的一个替代突变被引入到IgG3的仅一个重链之中。减少或消除蛋白A结合的位置435和/或436处的替代取代可以通过将任何其他18种标准氨基酸残基引入到一个常规IgG1、IgG2或IgG4抗体中的重链CH3区中并且筛选蛋白A结合的损失来鉴别。储存蛋白A结合的位置435和/或436处的替代取代可以通过将任何其他18种标准氨基酸残基引入到一个常规IgG3抗体中的重链CH3区中并且筛选蛋白A结合来鉴别。
虽然在此提供的某些Fc突变增强了二价抗体的形成(例如，表5中提供的那些)，但仍然可能因重链的同二聚化而产生一些错配对的抗体。具体地说，已知具有导致形成一个空腔(在此又称为一个“孔洞”)的一个或多个突变的重链会形成同二聚体，尤其是在过量的情况下(麦钱特等人，1998，自然生物技术16:677-681)。因此，在一些方面，用于增加异二聚体形成的Fc突变可以与用于改变与亲和介质的结合的Fc突变进行组合以便增强重链异二聚体的纯化。在某些方面，在此提供的抗体包含具有导致形成一个“空腔”和CH3残基R435/F436的Fc突变的一个重链；以及具有导致形成一个“突起”和CH3残基H435/Y436的Fc突变的一个重链。从本披露将理解，取决于IgG的类型，一个链或另一个链将包含位置435和436处的突变。在一个具体方面，Mbab是IgG1、IgG2或IgG4并且包含具有Fc突变Y407V/T366S/L368A/H435R和任选地Y436F的一个重链、以及具有Fc突变T366W的一个重链。在另一个具体方面，Mbab是IgG3并且包含具有Fc突变Y407V/T366S/L368A的一个重链、以及具有Fc突变T366W/R435H和任选地F436Y的一个重链。在另一个具体方面，Mbab是IgG1、IgG2或IgG4并且包含具有Fc突变Y349C/Y407V/T366S/L368A/H435R和任选地Y436F的一个重链、以及具有Fc突变S354C/T366W的一个重链。在另一个具体方面，Mbab是IgG3并且包含具有Fc突变Y349C/Y407V/T366S/L368A的一个重链以及具有Fc突变S354C/T366W/R435H和任选地F436Y的一个重链。
在某些方面，用于增加异二聚体形成的Fc修饰可以与用于改变效应子功能的其他已知的Fc修饰进行组合，如以下各项中描述的那些：格赫特(Ghetie)等人，1997，自然生物技术15:637-40；邓肯(Duncan)等人，1988，自然332:563-564；伦德(Lund)等人，1991，免疫学杂志(J.Immunol)147:2657-2662；伦德等人，1992，分子免疫学(Mol Immunol)29:53-59；阿雷格里(Alegre)等人，1994，移植(Transplantation)57:1537-1543；哈钦斯(Hutchins)等人，1995，美国国家科学院院刊(Proc Natl.Acad Sci U S A)92:11980-11984；杰弗里斯(Jefferis)等人，1995，免疫学快报(Immunol Lett.)44:111-117；伦德等人，1995，美国实验生物学会联合会杂志(Faseb J)9:115-119；杰弗里斯等人，1996，免疫学快报54:101-104；伦德等人，1996，免疫学杂志157:4963-4969；阿穆尔(Armour)等人，1999，欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)29:2613-2624；伊达索格(Idusogie)等人，2000，免疫学杂志164:4178-4184；雷迪(Reddy)等人，2000，免疫学杂志164:1925-1933；许(Xu)等人，2000，细胞免疫学(Cell Immunol)200:16-26；伊达索格等人，2001，免疫学杂志166:2571-2575；希尔兹(Shields)等人，2001，生物化学杂志(J Biol Chem)276:6591-6604；杰弗里斯等人，2002，免疫学快报82:57-65；普雷斯塔(Presta)等人，2002，生物化学会会刊(Biochem SocTrans)30:487-490；美国专利号5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；7,122,637；7,183,387；7,332,581；7,335,742；7,371,826；6,821,505；6,180,377；7,317,091；7,355,008；2004/0002587；以及WO 99/58572。本领域技术人员将容易地清楚Fc的其他修饰(例如，取代和/或添加和/或缺失)。
在一些情况下，Fc区的某些修饰(例如，氨基酸取代和/或添加和/或缺失)可以增强或减弱效应子功能。在某些方面，抗体的变体Fc区展现出与天然Fc相比一个相似水平的诱导效应子功能。在不同方面，如与具有天然Fc的相同抗体相比，具有一个变体Fc区的一个抗体展现出一个较高的效应子功能的诱导作用。如与具有天然Fc的相同抗体相比，具有一个变体Fc区的一个抗体有时展现出较低的效应子功能的诱导作用。在一些方面，如与具有天然Fc的相同抗体相比，具有一个变体Fc区的一个抗体展现出较高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的诱导作用。在某些方面，如与具有天然Fc的相同抗体相比，具有一个变体Fc区的一个抗体展现出较低的ADCC的诱导作用。在一些方面，如与具有天然Fc的相同抗体相比，具有一个变体Fc区的一个抗体展现出较高的补体依赖性细胞毒性(CDC)的诱导作用。在某些方面，如与具有天然Fc的相同抗体相比，具有一个变体Fc区的一个抗体展现出较低的CDC的诱导作用。
可以测定具有一个变体Fc区的任何具体抗体介导一个靶细胞通过ADCC溶解的能力。为了评定ADCC活性，将具有感兴趣的一个变体Fc区的一个抗体与免疫效应细胞组合添加至靶细胞，这些免疫效应细胞可以通过抗体抗原复合物来激活，从而导致靶细胞的细胞溶解。细胞溶解通常通过标签(例如，放射性底物、荧光染料或天然细胞内蛋白)从溶解的细胞的释放来检测。用于这类测定的效应细胞可以包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。体外ADCC测定的具体实例是本领域中已知的。
在某些方面，由IgG抗体引发的效应子功能很大程度上取决于连接至蛋白质的Fc区的碳水化合物部分(克劳蒂亚费拉拉等人，2006，生物技术与生物工程(Biotechnologyand Bioengineering)93:851-861)。因此，在此描述的一个抗体的Fc区的糖基化可以被修饰来增加或减少效应子功能(参见，例如，乌马纳(Umana)等人，1999，自然生物技术17:176-180；戴维斯等人，2001，生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)74:288-294；希尔兹等人，2002，生物化学杂志277:26733-26740；真川爱(Shinkawa)等人，2003，生物化学杂志278:3466-3473；美国专利号6,602,684；6,946,292；7,064,191；7,214,775；7,393,683；7,425,446；7,504,256；美国公开号2003/0157108；2003/0003097；2009/0010921；技术(Biowa公司，普林斯顿，新泽西)；糖基化工程技术(GLYCART技术AG，苏黎世，瑞士)。因此，在一方面，在此描述的一个抗体的Fc区包含改变的氨基酸残基的糖基化。在另一方面，改变的氨基酸残基的糖基化导致降低的效应子功能。在另一方面，改变的氨基酸残基的糖基化导致增加的效应子功能。在一个具体方面，Fc区具有减少的岩藻糖基化。在另一方面，Fc区是非岩藻糖基化的(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0226867)。在一方面，如宿主细胞(例如，CHO细胞，浮萍(Lemna minor))中产生的、具有增加的效应子功能(尤其是ADCC)的这些抗体被工程化来产生ADCC比通过亲本细胞产生的抗体高出100倍以上的高度去岩藻糖基化的抗体(莫里(Mori)等人，2004，生物技术与生物工程88:901–908；考克斯(Cox)等人，2006，自然生物技术24:1591-7)。
将唾液酸添加至IgG分子上的寡糖可以增强它们的抗炎活性并且改变它们的细胞毒性(例如，金子(Keneko)等人，科学，2006，313:670-673；斯卡隆(Scallon)等人，分子免疫学，2007年3月；44(7):1524-34)。因此，抗体治疗剂的功效可以通过选择最适于预期应用的糖型来优化。Fc区与其受体的结合中涉及插入在抗体的两个CH2结构域之间的两个寡糖链。具有增加的唾液酸化的IgG分子展现出抗炎特性，而具有减少的唾液酸化的IgG分子示出增加的免疫刺激特性。因此，一个抗体治疗剂可以针对一个具体的应用“定制”成具有一种适当的唾液酸化轮廓。用于调节抗体的唾液酸化状态的方法是本领域中已知的(例如，美国公开号2009/0004179和国际公开号WO 2007/005786)。
在一些方面，用于增加异二聚体形成的Fc修饰可以与相对于一种可比分子(例如，除了具有一个野生型Fc区以外，具有相同的氨基酸序列的一种蛋白质)，用于改变针对一种Fc配体(例如，一种Fc受体，CIq)的结合特性的其他修饰进行组合。结合特性的实例包括但不限于结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和缔合速率(分别为koff和kon)、结合亲和力和/或亲合力。一般理解的是，具有低Kon的一个结合分子如一个抗体可能优于具有高koff的一个结合分子。然而，在一些情况下，与KD的值相比，kon或koff的值可能更加有意义。本领域技术人员可以确定对一个给定抗体应用来说最重要的动力学参数。
一个Fc区对其配体的亲和力和结合特性可以通过本领域中已知用于测定Fc-FcγR相互作用、即，一个Fc区与一个FcR的特异性结合的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，包括但不限于平衡法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或放射免疫测定(RIA))，或动力学方法(例如，分析)，以及其他方法如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其他方法可以利用所检验的一个或多个组分上的一个标签和/或采用多种检测方法，包括但不限于比色标签、光谱测定标签、分光光度标签、荧光标签、发光标签或同位素标签。
在一些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的一个抗体具有增强的与一个或多个Fc配体的结合。在不同方面，具有一个变体Fc区的抗体具有增强的与一个Fc受体的结合。在一些方面，具有一个变体Fc区的抗体具有增强的与Fc受体FcγRIIIA的结合。在某些方面，具有一个变体Fc区的抗体具有增强的与Fc受体FcγR IIB的结合。相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体有时具有增强的与CIq的结合。在不同方面，具有一个变体Fc区的抗体具有增强的与Fc受体FcRn的结合。
在一些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的一个抗体具有增强的ADCC活性。在某些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的一个抗体具有增强的与Fc受体FcγRIIIA的结合增并且具有增强的ADCC活性。在一些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体具有增强的ADCC活性和增强的血清半衰期两者。
在某些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的一个抗体具有减弱的ADCC活性。在不同方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的一个抗体具有减弱的与Fc受体FcγRIIIA的结合并且具有减弱的ADCC活性。相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体有时具有减弱的ADCC活性和增强的血清半衰期两者。
在一些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的一个抗体具有增强的CDC活性。在某些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体具有增强的CDC活性和增强的血清半衰期两者。在一些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体具有减弱的与一个或多个Fc配体的结合。
在一些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体具有减弱的与一个Fc受体的结合。在某些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体具有减弱的与Fc受体FcγRIIIA的结合。相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体有时具有减弱的与Fc受体FcRn的结合。在一些方面，相对于具有天然Fc的相同抗体，具有一个变体Fc区的抗体具有减弱的与CIq的结合。
Fc区还可以被修饰来增大蛋白质的半衰期。半衰期的增大可以允许减少给予患者的药物的量并且降低给药频率。因此，在此的具有增大的半衰期的抗体可以通过修饰(例如，取代、缺失或添加)鉴别为Fc与FcRn受体之间的相互作用中所涉及的氨基酸残基来产生(U.S.7,083,784)。在某些方面，IgG1同型抗体的位置252处的一个甲硫氨酸、和/或位置254处的一个丝氨酸、和/或位置256处的一个苏氨酸可以分别被改变为酪氨酸、苏氨酸以及谷氨酸，这样使得所得抗体包括酪氨酸-252、苏氨酸-254以及谷氨酸-256(即，M252Y、S254T、T256E)。IgG1抗体的这种Fc区包括一个YTE修饰并且在IgG2、IgG3以及IgG4抗体中，对应位置可以进行类似地修饰。另外，在此的抗体的半衰期可以通过本领域中已知的技术通过轭合至PEG或白蛋白而增大。在某些方面，用于增加异二聚体形成的Fc修饰可以与以下相组合：用于改变抗体的半衰期的其他修饰，包括但不限于M252Y和/或S254T和/或T256E；和/或用于改变效应子功能和/或改变与一个或多个Fc配体的结合的其他已知的Fc修饰，包括在此描述的那些。
抗体合成
含有重新定位的链间半胱氨酸的一个抗体可以通过本领域中已知的用于抗体合成的任何方法，特别是通过化学合成或通过重组表达技术来产生。
任何抗原都可以用于合成一个抗体。在此描述了抗原或“靶标”的实例。表达细胞表面的所希望抗原的细胞或由这类细胞制成的膜也可以用于产生抗体。可以使用标准重组DNA技术，在细菌或真核细胞中重组地产生抗原或从细菌或真核细胞中分离抗原。抗原可以被表达为一个带标记(例如，表位标记)的蛋白或其他融合蛋白，以便促进分离以及在不同测定中的鉴别。
单克隆抗体在多特异性的工程化抗体的情况下针对单个抗原位点或多个抗原位点是高度特异性的。而且，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比较，每种单克隆抗体是针对该抗原上的相同决定簇的。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的有利之处在于它们可以在不被其他抗体污染的情况下被合成。
可以使用本领域已知的多种多样的技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组、以及噬菌体展示技术、或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术、包括本领域中已知的那些来产生。如在此所使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体的克隆)的一种抗体，而不是产生单克隆抗体的方法。在一些方面，在此的抗体90％或以上是单克隆的。以下是用于产生单克隆抗体的代表性方法的描述(不是限制性的)，并且这些方法可以用来产生例如单克隆哺乳动物、嵌合、人源化、人、结构域、双体抗体(diabody)、疫苗体、线性和多特异性抗体。
用于使用杂交瘤技术产生并筛选特异性抗体的方法在本领域中是已知的。简单地说，小鼠可以用一种靶抗原(全长蛋白或其结构域，例如，细胞外结构域或配体结合结构域)来免疫并且一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到对靶抗原具有特异性的抗体，那么就收获小鼠的脾脏并且分离脾细胞。然后通过已知的技术将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞，例如从ATCC可获得细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。针对分泌能够结合在此的抗体的多肽的抗体的细胞，然后通过本领域中已知的方法来测定杂交瘤克隆。一般含有高水平抗体的腹水液可以用阳性杂交瘤克隆对小鼠免疫来产生。
因此，单克隆抗体可以通过培养分泌抗体的杂交瘤细胞来产生，其中杂交瘤是通过以下来产生：将用靶抗原免疫的小鼠中分离的脾细胞与骨髓瘤细胞相融合，并且然后针对分泌能够结合至特异性靶抗原的抗体的杂交瘤克隆，筛选从融合所得的杂交瘤。
另外，淋巴细胞可以被体外免疫。在免疫之后，分离淋巴细胞，并且然后使用一种适合的融合剂或融合配偶体(如聚乙二醇)与一个骨髓瘤细胞系融合从而形成一个杂交瘤细胞。在某些方面，选择的骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选择的抗体产生细胞的稳定高水平抗体产生、并且对针对未融合的亲代细胞而选择的一个选择性培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。在一方面，骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤系，如源自从美国加利福尼亚州圣地亚哥市的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California,USA)可获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的、以及从美国马里兰州罗克维尔市的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USA)可获得的SP-2和衍生物例如X63-Ag8-653细胞的那些。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系在本领域中也是已知的。
一旦产生具有所希望的特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞被鉴别出，就可以通过有限稀释程序而将这些克隆进行亚克隆并且通过标准方法使其生长。用于这个目的的适合的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在一种动物中体内生长为腹水瘤，例如通过将细胞腹膜内(i.p.)注射进入小鼠。
将由亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规抗体纯化程序(例如像，亲和色谱(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖凝胶或κ)或离子交换色谱、亲和标记、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、等等)而从培养基、腹水液、或血清适当地分离。示例性纯化方法在下文进行更详细地描述。
识别特异性靶抗原表位的抗体片段可以通过本领域中已知的任何技术来产生。例如，在此的Fab和F(ab’)2片段可以通过使用酶如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生F(ab’)2片段)的免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解来产生。F(ab’)2片段含有可变区，轻链恒定区以及重链的CH1结构域。另外，在此的抗体还可以使用本领域中已知并在下文更充分论述的各种噬菌体展示方法来产生，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库。
噬菌体展示技术
在噬菌体展示方法中，将功能抗体结构域展示在噬菌体颗粒的表面上，这些颗粒携带对其进行编码的多核苷酸序列。具体地说，编码VH和VL结构域的DNA序列是从动物cDNA文库(例如，淋巴组织的人或鼠类cDNA文库)来扩增。编码VH和VL结构域的DNA是通过PCR与一个scFv接头重组在一起并且克隆至一个噬菌粒载体(例如，p CANTAB6或pComb 3 HSS)之中。将载体电穿孔至大肠杆菌中并且大肠杆菌以辅助噬菌体来感染。这些方法中所使用的噬菌体典型地是包括fd和M13的丝状噬菌体，并且VH和VL结构域通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达结合所感兴趣的表位的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或结合或捕获于一个固体表面或珠粒上的抗原。噬菌体展示方法在本领域中是已知的。
在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并且用于产生包括人抗体的全抗体或任何其他所希望的抗原结合片段，并且表达在任何所希望的宿主之中，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、以及细菌，例如如下文所描述。重组地产生Fab、Fab’以及F(ab’)2片段的技术还可以使用本领域中已知的方法来加以采用。
为了产生全抗体，包括VH或VL核苷酸序列、一个限制性位点以及保护限制性位点的一个侧翼序列的PCR引物可以用于在scFv克隆中扩增VH或VL序列。利用本领域中已知的克隆技术，PCR扩增的VH结构域可以被克隆至表达一个VH恒定区(例如，人γ4恒定区)的载体中，并且PCR扩增的VL结构域可以被克隆至表达一个VL恒定区(例如，人κ或λ恒定区)的载体中。用于表达VH或VL结构域的载体有时包含一个启动子(例如，一个EF-1α启动子)、一个分泌信号(例如，一个pelB信号)、用于可变结构域的一个克隆位点、恒定结构域、以及一个选择标记物如新霉素。VH和/或VL结构域还可以被克隆至表达必要的恒定区的一个载体之中。如以下实例详细说明，两个VL结构域可以被克隆至表达必要的CL区的一个载体之中，以使得两个轻链可以从单个载体表达(参见，例如，图3A和图3B)，并且两个VH结构域可以被克隆至表达必要的恒定区的一个载体之中，以使得两个重链可以从单个载体表达(参见，例如，图3C)。重链载体和轻链载体然后共转染到细胞系中，以便使用本领域中已知的技术产生表达全长抗体(例如IgG)的稳定或瞬时的细胞系。实例1中描述了单价双特异性抗体链的克隆和表达的非限制性实例。
核酸
可以通过本领域中已知的任何方法来获得多核苷酸并且确定多核苷酸的核苷酸序列。由于抗体的氨基酸序列是已知的，所以编码这些抗体的核苷酸序列可以使用本领域中已知的方法来确定，例如，已知编码具体氨基酸的核苷酸密码子以这种方式被组装以便产生编码在此的抗体或其片段的一个核酸。编码抗体的这种多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸来组装，简言之，这涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、那些寡核苷酸的退火和连接、以及然后通过PCR进行连接的寡核苷酸的扩增。
在一些方面，编码抗体的多核苷酸可以从来自一个合适的来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆是不可用的，但抗体的序列是已知的，那么编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成，或通过PCR扩增使用与序列的3’和5’端可杂交的合成引物，或通过使用对具体基因序列特异的一个寡核苷酸探针来鉴别例如来自一个cDNA文库的编码抗体的cDNA克隆来进行克隆，从一个合适的来源(例如，一个抗体cDNA文库，或从以下产生的一个cDNA文库，或从以下分离的核酸(有时是多聚A+RNA)：表达抗体的任何组织或细胞)获得。可以使用本领域中已知的任何方法，然后将通过PCR产生的扩增核酸克隆至可复制的克隆载体之中。
一旦确定抗体的核苷酸序列，可以使用本领域中已知的用于操纵核苷酸序列的方法(例如重组DNA技术、定点诱变、PCR、等等)来操纵抗体的核苷酸序列，从而产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失、和/或插入，包括，例如在此提供的氨基酸取代。
在某些方面，使用重组DNA技术将一个或多个CDR插入构架区内。构架区可以是天然存在的或是共有的构架区，并且有时是人构架区。通过构架区与CDR的组合所产生的多核苷酸可以编码特异性结合至一个所选择的抗原或多个抗原或表位的一个抗体。在一些方面，可以在构架区中进行一个或多个氨基酸取代，并且氨基酸取代可以改进抗体与其抗原的结合。多核苷酸的其他变化涵盖于本披露和/或是本领域中已知的。
表达系统
在此的一个抗体、抗体重链、抗体轻链、其衍生物、类似物或片段的重组表达要求构建含有编码该抗体或其部分的一个多核苷酸或多个多核苷酸的一个表达载体。一旦在此已经获得编码一个抗体、或一个抗体的一个重链或轻链、或其一部分的一个多核苷酸，用于产生抗体的载体就可以通过重组DNA技术使用本领域中已知的技术来产生。因此，在此描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域中已知的方法来构建含有编码抗体的序列和适当转录以及翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、以及体内基因重组。
因此，在此提供了可复制的载体，这些载体包含可操作地连接至一个启动子的，编码在此的一个抗体、一个抗体的重链或轻链、一个抗体的重链或轻链可变结构域或其一部分、或者重链或轻链CDR的核苷酸序列。此类载体可以包括编码抗体的恒定区的核苷酸序列，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这种载体中，以用于表达整个重链、整个轻链、或整个重链和轻链两者。具体地说，提供了包含编码两个不同轻链的核苷酸序列的载体，这些轻链可以是κ和/或λ的任何组合(即，两个κ轻链、两个λ轻链、或一个λ轻链和一个κ轻链)。还提供了包含编码两个不同重链的核苷酸序列的载体，这两个重链可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链。特别预期的是，这些载体与在此提供的包含两个不同重链和两个不同轻链的一个抗体的表达组合使用。
通过常规技术将表达载体转移至一个宿主细胞，并且然后通过常规技术来培养所转染的细胞以便产生在此的一个抗体。因此，在此提供了含有可操作地连接至一个异源性启动子的编码在此的一个抗体或其片段、或其重链或轻链、或其部分、或在此的一个单链抗体的多核苷酸的宿主细胞。在某些用于表达双链抗体的方面中，编码重链和轻链两者的载体可以在宿主细胞中共表达，以用于表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。
多种宿主表达载体系统可以用以表达在此的抗体。此类宿主表达系统代表可以产生并随后纯化所感兴趣的编码序列的载体，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达在此的抗体的细胞。这些宿主细胞包括但不限于：微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤氏酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞系统，或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0、以及3T3细胞)，这些建构体含有衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
细菌细胞如大肠杆菌和真核细胞可以用于表达一个重组抗体。举非限制性实例来说，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)与一个载体如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的结合可以是用于抗体的一个有效的表达系统。
在细菌系统中，取决于所表达的抗体的预定用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，在产生大量的这种蛋白质以便产生一个抗体的药物组合物时，引导容易纯化的高水平的融合蛋白产物的表达的载体可能是令人希望的。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278，其中抗体编码序列可以单独地连接入载体中、与lac Z编码区同框，这样使得一个融合蛋白被产生；pIN载体等等。PGEX载体也可以用于表达作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。总体来说，这类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附并且结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠粒，随后在存在游离谷胱甘肽下洗脱来容易地从溶解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在一个昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus(AcNPV))用作表达外源基因的一个载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独克隆至病毒的非必要区中并且使其置于一个AcNPV启动子的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在一个腺病毒用作一个表达载体的情况下，所感兴趣的抗体编码序列可以连接至一个腺病毒转录/翻译控制复合体，例如，晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的一个非必要区(例如，El或E3区)中可能产生活的并能够在感染的宿主中表达抗体的重组病毒。特定的起始信号也可能被要求用于插入的抗体编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。另外，起始密码子必须与所希望的编码序列的阅读框同期以便确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，天然的和合成的。表达的效率可以通过包括适当的转录增强元件、转录终止子等来增强。
在一些方面，可以选择一种宿主细胞株，该宿主细胞株调节插入的序列的表达，或以所希望的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性的机制。可选择适当细胞系或宿主系统以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化、以及磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、NS1和T47D、NS0(不内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠类骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。
为了长期、高产率的产生重组蛋白，稳定表达是适宜的。例如，可以将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。代替使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以使用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)和可选择标记物来控制的DNA来转化。在引入外源DNA后，可以允许工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中并且生长以形成集落(foci)，进而可以将该集落克隆并且扩增到细胞系中。这种方法可以用于将表达抗体的细胞系工程化。这类工程化的细胞系可以用于筛选和评价直接地或间接地与抗体相互作用的组合物。
在某些方面，在此呈现的抗体被表达于具有抗体的瞬时表达的细胞系中。瞬时转染是引入一个细胞的核酸未整合到该细胞的基因组或染色体DNA中、而是在该细胞中维持作为一个染色体外元件例如作为一个游离体的一个过程。游离体的核酸的转录过程不受影响，并且由游离体的核酸编码的蛋白质产生。
稳定或瞬时转染的细胞系被维持在本领域中已知的导致抗体蛋白的表达和产生的细胞培养基和条件中。在某些方面，哺乳动物细胞培养基是基于可商购的培养基配制品，包括例如DMEM或汉姆氏(Ham's)F12。在一些方面，细胞培养基被改变来支持细胞生长和生物蛋白表达两者的增长。如在此所使用的术语“细胞培养基”、“培养基”、以及“培养基配制品”是指在一个多细胞有机体或组织以外的一个人工体外环境中用于细胞的维持、生长、繁殖、或扩增的营养液。可以将细胞培养基优化以用于特定的细胞培养用途，包括例如，被配制来促进细胞生长的细胞培养物生长培养基，或者被配制来促进重组蛋白产生的细胞培养物生产培养基。术语营养素、成分、以及组分(component)在此可互换地使用，是指组成细胞培养基的组分(constituent)。
在不同方面，使用一种补料分批法维持细胞系。如在此所使用的“补料分批法”是指在首先用一种基础培养基孵育之后，用另外的营养素供应给一个补料分批细胞培养物的方法。例如，一种补料分批法可以包括根据一个所确定的补料时间表在一个给定时期内添加补充培养基。因此，“补料分批细胞培养”是指这样一种细胞培养：其中最初将细胞(典型地为哺乳动物)和培养基供应至培养容器，并且在培养期间，连续地或以不连续增量方式将另外的培养营养素馈送至培养物，在培养终止之前有或没有定期的细胞和/或产物的收获。
所使用的细胞培养基以及其中含有的营养素在本领域中是已知的。在一些方面，细胞培养基包含一种基础培养基以及产生一种改良的基础培养基的至少一种水解产物，例如基于大豆的水解产物、基于酵母的水解产物、或这两种类型的水解产物的组合。另外的营养素有时可以仅包括一种基础培养基如一种浓缩的基础培养基，或者可以仅包含水解产物、或浓缩的水解产物。适合的基础培养基包括但不限于达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、DME/F12、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI1640、F-10、F-12、α-最低必需培养基(α-MEM)、格拉斯哥最低必需培养基(G-MEM)、PF CHO(参见，例如，CHO无蛋白质培养基(西格玛)或用于CHO细胞的无蛋白质的EX-CELLTM325PF CHO无血清培养基(SAFC生物科学公司))、以及伊斯科夫改良的达尔伯克培养基(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium)。可以用于在此的技术的基础培养基的其他实例包括BME基础培养基(Gibco-英杰(Invitrogen)；达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM，粉末)Gibco-英杰(#31600)。
在某些方面，基础培养基可以是无血清的，意指该培养基不含血清(例如，胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清、或本领域中已知的任何其他动物源的血清)，或没有动物蛋白的培养基或化学上定义的培养基。
可以改良基础培养基以便于去除在标准基础培养基中发现的某些非营养组分，如不同的无机和有机缓冲液、一种或多种表面活性剂、以及氯化钠。此类组分从基础细胞培养基中的去除允许剩余营养组分的浓度增加，并且可以改进总体的细胞生长和蛋白质表达。另外，可以根据细胞培养条件的要求，将省去的组分添加回到含有改良的基础细胞培养基的细胞培养基之中。在某些方面，细胞培养基含有一种改良的基础细胞培养基以及至少一种以下营养素：铁源、重组生长因子；缓冲液；表面活性剂；渗透性调节剂；能量源；以及非动物水解产物。另外，改良的基础细胞培养基可以任选地含有氨基酸、维生素、或氨基酸与维生素两者的组合。在一些方面，改良的基础培养基进一步含有谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺和/或氨甲蝶呤。
在一些方面，通过使用本领域中已知的补料分批、分批、灌注或连续进料生物反应器方法来大量地进行抗体产生。大规模生物反应器具有至少1000升的容量，有时大约1,000至100,000升的容量。这些生物反应器可以使用搅拌叶轮来分布氧和营养素。小规模生物反应器一般是指在不大于大致100升的体积容量中的细胞培养，并且范围可以是从约1升至约100升。可替代地，一次性生物反应器(SUB)可以用于大规模或小规模培养。
温度、pH、搅拌、曝气以及接种密度可以根据所使用的宿主细胞以及表达的重组蛋白而变化。例如，重组蛋白细胞培养可以被维持在30℃与45℃之间的一个温度下。可以在培养过程期间监测培养基的pH，以使得pH停留在最佳水平，对于某些宿主细胞来说，该最佳水平可以是在6.0至8.0的pH范围内。叶轮驱使的混合可以用于此类培养方法用来搅拌。叶轮的转速可以大致是50至200cm/秒叶尖速度，但根据所培养的宿主细胞的类型，可以使用本领域中已知的其他气升或其他混合/曝气系统。提供充足的曝气以便在培养物中维持大致20％至80％的空气饱和度的一个溶解氧浓度，这再次取决于所培养的所选择的宿主细胞。可替代地，一个生物反应器可以直接将空气或氧气喷射到培养基之中。存在其他供氧方法，包括采用中空纤维膜曝气器的无泡曝气系统。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯孢疹病毒胸苷激酶、谷氨酰胺合成酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶，它们可以分别用于tk-、gs-、hgprt-或aprt-细胞之中。而且，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择的基础：dhfr，其将抗性赋予氨甲喋呤；gpt，其将抗性赋予霉酚酸；neo，其将抗性赋予氨基糖苷G-418；以及hygro，其将抗性赋予潮霉素。
重组DNA技术领域中已知的方法可以应用来选择所希望的重组克隆，包括但不限于单纯孢疹病毒胸苷激酶、谷氨酰胺合成酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因，它们可以分别用于tk-、gs-、hgprt-或aprt-细胞之中。
而且，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择的基础：dhfr，其将抗性赋予氨甲喋呤；gpt，其将抗性赋予霉酚酸；neo，其将抗性赋予氨基糖苷G-418；以及hygro，其将抗性赋予潮霉素。重组DNA技术领域中已知的方法可以应用来选择所希望的重组克隆。
抗体蛋白的表达水平可以通过载体扩增来提高。当表达抗体蛋白的载体系统中的一个标记物可扩增时，存在于宿主细胞的培养物中的抑制剂的水平的增加可以使标记物基因的拷贝的数量增加。由于扩增区与抗体基因相关联，所以抗体蛋白的产生也可能增加。
对于在此提供的单价双特异性抗体的产生来说，宿主细胞可以与在此的抗体的两个表达载体共转染；其中，每个载体编码一个重链和一个轻链，这样使得在两个载体之间编码所有四个链(即，两个重链和两个轻链)。在每个载体编码一个重链和一个轻链时，优选的是每个载体包含一个不同的哺乳动物选择标记物。两个不同选择标记物的使用确保两个载体均存在于一个宿主细胞之中。可替代地，第一载体编码两个重链多肽(参见，例如，图3C)并且第二载体编码两个轻链多肽(参见，例如，图3A和图3B)。当每个载体仅表达重链或轻链时，两个载体可以含有相同的可选择标记物，因为仅包含两种质粒的宿主细胞将表达IgG并且它们很有可能主要是MBab。可替代地，可以使用编码并且能够表达所有重链和轻链多肽的单个载体。在这类情况下，可以将轻链放在重链之前以便避免过量的无毒重链。如在此所描述，许多方法可以用于使重链和轻链多肽的表达相等。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
在一些方面，宿主细胞与两个表达载体共转染；第一载体编码包含在此所描述的任何修饰的一个第一重链多肽，以及不具有修饰或具有补偿Fc修饰的一个第二重链多肽(参见，例如，图3C)；并且第二载体编码与第一重链对应的一个第一修饰的轻链多肽以及一个第二未修饰的轻链多肽(参见，例如，图3A和图3B)。在一些方面，每个链使用它自身的启动子来单独表达。来自单个载体的两个轻链和来自单个载体的两个重链的表达对于产生具有不同重链和轻链的抗体可以是特别有用的。另外，如在此所描述，引入每个重链的Fc区的突变的选择可以用于最小化半抗体的产生。
一旦具有一个修饰的HC-LC界面和一个未修饰的HC-LC界面的抗体已通过重组表达产生，它就可以通过在本领域中已知用于纯化一种免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过色谱法(例如离子交换、亲和力(特别是通过对于特定抗原的亲和力，蛋白A)，以及尺寸分级柱色谱法(sizing column chromatography))、离心、差别溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，在此的抗体或其片段可以融合至在此所描述的或者本领域中另外已知的异源多肽序列，以便促进纯化。
抗体纯化和分离
一旦在此的抗体蛋白已经通过重组来产生，就可以通过本领域中已知的用于一个免疫球蛋白分子的纯化的任何方法将其纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力(特别是通过对于特定抗原的亲和力、蛋白A或蛋白G)，以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质的纯化的任何其他标准技术。此外，本技术的抗体或其片段可以融合至以上所描述的或者本领域中另外已知的异源多肽序列(在此称为“标记”)，以便促进纯化。在一些方面，在此提供的抗体是通过包含两种或更多种亲和介质的一个多步骤过程来纯化。用于纯化在此提供的抗体的介质包括对Fc部分具有特异性的介质，例如，蛋白A或蛋白G；对轻链恒定区具有特异性的树脂，例如，CaptureSelect κ与CaptureSelect λ；对抗原结合结构域具有特异性的树脂，例如，合并抗原的全部或一部分的，或者包含一个抗-id抗体结合结构域的树脂。
在使用重组技术时，抗体蛋白可以在周质间隙中细胞内产生，或直接分泌到培养基之中。如果抗体是在细胞内产生，那么作为第一步，(例如)通过离心或超滤去除宿主细胞或溶解片段的颗粒碎片。例如，用于分离分泌到大肠杆菌的周质间隙中的抗体的程序是本领域中已知的。在抗体蛋白分泌到培养基中的情况下，通常首先使用一个可商购的蛋白浓缩滤器，例如一个Amicon或Millipore Pellicon超滤单元对来自此类表达系统的上清液进行浓缩。一种蛋白酶抑制剂如PMSF可以被包括在任何前述步骤中以便抑制蛋白水解，并且抗生素可以被包括来防止外来污染物的生长。
从细胞制备的抗体组合物可以单独使用例如羟磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、渗析和/或亲和色谱或与其他纯化步骤组合来纯化。蛋白A作为一种亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同型并且将被本领域技术人员理解。附接有亲和配体的基质最常为琼脂糖，但其他基质也是可用的。在机械上稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。在抗体蛋白包含一个CH3结构域的情况下，Bakerbond ABX树脂(马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker)，菲利普斯堡(Phillipsburg)，新泽西)可用于纯化。用于蛋白纯化的其他技术如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、二氧化硅上色谱、肝素上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上SEPHAROSE色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀，它们取决于所回收的抗体蛋白也是可用的。
在任何一个或多个初步纯化步骤之后，包含感兴趣的抗体和污染物的混合物可以经受低pH疏水性相互作用色谱，该色谱使用pH介于约2.5与4.5之间的一种洗脱缓冲液并且在低盐浓度(例如，从约0至0.25M盐)下进行。
因此，在某些方面，如在此提供的抗体是基本上纯化/分离的。在一方面，这些分离/纯化的重组表达的抗体可以给予患者以便介导预防或治疗作用。在一些方面，这些分离/纯化的抗体可以用于诊断疾病。
使用的诊断方法
在某些方面，在此的具有一个修饰的HC-LC界面的抗体和组合物可以用于体内和/或体外诊断与抗体分子相关联的疾病。这可以例如通过使测试的一个样品(任选地连同一个对照样品)与抗体在允许抗体与感兴趣的分子之间形成复合体的条件下相接触来实现。然后检测复合体形成(例如，使用ELISA)。当使用一个对照样品与测试样品时，检测在两种样品中的复合体，并且在样品之间复合体形成中的任何统计学显著性差异是指示测试样品中感兴趣的分子的存在。
在一些方面，在此的技术提供了在怀疑含有一种感兴趣的分子的一个样品中确定这种分子的存在的方法，该方法包括使该样品暴露在在此提供的抗体下，并且确定抗体与样品中感兴趣的分子的结合，其中抗体结合至样品中感兴趣的分子指示了样品中感兴趣的分子的存在。在一些方面，该样品是生物样品。在某些方面，生物样品来自正经历或怀疑经历与感兴趣的分子相关联的疾病或病症的一种哺乳动物。
在某些方面，在此提供的一个抗体可以用于使用体内诊断测定来检测感兴趣的分子的过度表达或扩增。在一些方面，将在此提供的抗体添加至一个样品，其中抗体结合用于检测的感兴趣的分子并且用一个可检测标签(例如，一个放射性同位素或一个荧光标签)来标记，并且从外部扫描患者以便定位标签。
可以在福尔马林固定的石蜡包埋的组织上进行FISH测定，如INFORMTM(由亚利桑那州的维塔纳(Ventana)出售)或PATHVISIONTM(威赛斯公司(Vysis)，伊利诺伊州)，从而确定一个感兴趣的分子在肿瘤中的过度表达的程度(如果有的话)。
在某些方面，在此提供的抗体可以用于一种诊断与表达感兴趣的分子的细胞的增加相关联的细胞增殖性病症的方法之中。在一些方面，该方法包括将一个生物样品中的测试细胞与在此提供的抗体相接触；通过检测在此提供的抗体的结合来确定样品中的测试细胞中的感兴趣的分子的水平；并且比较结合至一个对照样品中的细胞的抗体的水平，其中将结合的抗体的水平针对测试和对照样品中的表达感兴趣的分子的细胞的数量进行归一化，并且其中与对照样品相比测试样品中结合的更高水平的抗体指示了与表达感兴趣的分子的细胞相关联的细胞增殖性病症的存在。
在某些方面，在此提供的抗体可以用于一种检测血液或血清中感兴趣的可溶分子的方法之中。在一些方面，该方法包括使来自怀疑经历与感兴趣的分子相关联的病症的哺乳动物的血液或血清的一个测试样品与在此提供的抗体相接触，并且检测测试样品中相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的一个对照样品的感兴趣的可溶性分子的增加。在一些方面，检测方法作为诊断与哺乳动物的血液或血清中的感兴趣的可溶分子的增加相关的病症的方法是有用的。
使用的处理方法
在不同方面，将在此提供的抗体给予细胞，例如癌细胞。可以观察到在此提供的抗体的生物效应，包括但不限于细胞死亡、细胞增殖抑制、效果缺乏、细胞形态的变化、以及细胞生长模式的变化。在一些方面，在此提供的抗体包含一个可检测标签和/或将药物或毒素携带至肿瘤抗原。在某些方面，标签指示出细胞内肿瘤抗原的位置。
条件或过度增殖性病症的实例包括良性或恶性肿瘤、白血病以及淋巴恶性肿瘤。其他包括神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、下丘脑、腺体、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、以及间质恶性肿瘤。其他癌症或增殖性病症包括：头、颈、眼、口、咽喉、食道、胸、皮肤、骨、肺、结肠、直肠、结肠直肠、胃、脾、肾、骨骼肌、皮下组织、转移性黑色素瘤、子宫内膜、前列腺、乳腺、卵巢、睾丸、甲状腺、血液、淋巴结、肾、肝、胰脏、脑、或中枢神经系统的癌症。根据在此的方法可以预防、管理、治疗或改善的癌症的实例包括但不限于头、颈、眼、口、咽喉、食道、胸、骨、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、乳腺、卵巢、肾、肝、胰脏、及脑的癌症。另外的癌症包括但不限于以下各项：白血病如但不限于急性白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病如成髓细胞性、前髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病，以及脊髓增生异常综合征；慢性白血病如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤如但不限于霍奇金氏病、非霍奇金氏病；多发性骨髓瘤如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化骨髓瘤、浆细胞性白血病、孤立性浆细胞瘤、以及髓外浆细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；意义未明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨癌以及结缔组织肉瘤如但不限于骨肉瘤、骨髓瘤骨病、多发性骨髓瘤、胆脂瘤诱导的骨骨肉瘤、佩吉特氏骨病、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞肿瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、以及滑膜肉瘤；脑肿瘤如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、寡树突神经胶细胞瘤、非神经胶质肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑脊髓膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤、以及脑原发性淋巴瘤；乳腺癌包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、管内癌、乳房髓质癌、乳腺粘液癌、管状乳癌、乳头状乳癌、佩吉特氏病(包括青少年佩吉特氏病)以及发炎性乳癌；肾上腺癌如但不限于嗜铬细胞瘤以及肾上腺皮质癌；甲状腺癌如但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌、髓样甲状腺癌以及甲状腺未分化癌；胰腺癌如但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、升糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长抑素分泌型肿瘤、以及类癌瘤或胰岛细胞瘤；垂体癌症如但限于库兴氏病、催乳激素分泌型肿瘤、肢端肥大症、以及尿崩症；眼癌如但不限于眼部黑色素瘤如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、以及睫状体黑色素瘤、以及视网膜母细胞瘤；阴道癌如鳞状细胞癌、腺癌、以及黑色素瘤；外阴癌如鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤、以及佩吉特氏病；宫颈癌如但不限于鳞状细胞癌、以及腺癌；子宫癌如但不限于子宫内膜癌、以及子宫肉瘤；卵巢癌如但不限于卵巢上皮癌、边界肿瘤、生殖细胞肿瘤、以及基质肿瘤；食道癌如但不限于鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌、以及燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌如但不限于腺癌、蕈伞型(息肉)、溃疡型、浅表扩散型、弥散扩散型、恶性淋巴瘤、脂肉瘤、纤雏肉瘤以及癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌如但不限于肝细胞癌以及肝母细胞瘤；胆囊癌如腺癌；胆管癌如但不限于乳头状、结节性以及弥漫性；肺癌如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(上皮癌)、腺癌、大细胞癌以及小细胞肺癌；睾丸癌如但不限于胚组织瘤、精原细胞瘤、退化发育、经典(典型)、精母细胞瘤、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤)；前列腺癌如但不限于腺癌，平滑肌肉瘤以及横纹肌肉瘤；阴茎癌(penal cancer)；口癌如但不限于鳞状细胞癌；基底癌症；唾液腺癌症如但不限于腺癌，粘液表皮样癌、以及腺样囊性癌；咽癌如但不限于鳞状细胞癌以及疣型；皮肤癌如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌以及黑色素瘤、浅表性扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、小痣恶性黑色素瘤、肢端雀斑样黑色素瘤；肾癌如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管)；韦尔姆斯氏肿瘤；膀胱癌如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌以及乳头状腺癌。
还涵盖的是，由细胞凋亡畸变引起的癌症也可以通过在此的方法和组合物来治疗。这类癌症可以包括但不限于滤泡性淋巴瘤，伴有p53突变的癌，乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤以及癌前病变如家族性腺瘤样息肉病和脊髓发育不良综合征。
在此的抗体蛋白和组合物可用于许多目的，例如，作为各种各样的慢性和急性疾病以及病症的治疗剂，这些疾病和病症包括但不限于自体免疫性和/或发炎性病症，包括修格连综合症、类风湿性关节炎、牛皮癣样狼疮、动脉粥样硬化、糖尿病性以及其他视网膜病变、晶状体后纤维组织形成、年龄相关黄斑变性、新生血管性青光眼、血管瘤、甲状腺增生(包括格拉夫病)、角膜以及其他组织移植、以及慢性发炎、败血症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩氏病、再灌注损伤、败血病、内毒素性休克、囊性纤维化、心内膜炎、牛皮癣、关节炎(牛皮癣性关节炎)、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、脊髓损伤以及同种异体移植物排斥。
自体免疫性和/或发炎性病症的实例包括但不限于斑形脱发、僵直性脊椎炎、抗磷脂综合症、自体免疫性阿狄森氏病、肾上腺的自体免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性卵巢炎以及睾丸炎、修格连综合症、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病性以及其他视网膜病变、晶状体后纤维组织形成、年龄相关黄斑变性、新生血管性青光眼、血管瘤、甲状腺增生(包括格拉夫疾病)、角膜以及其他组织移植、以及慢性发炎、败血症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩氏疾病、再灌注损伤、败血病、内毒素性休克、囊性纤维化、心内膜炎、牛皮癣、关节炎(牛皮癣性关节炎)、过敏性休克、器官缺血、再灌注损伤、脊髓损伤以及同种异体移植物排斥；自体免疫性血小板减少症、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜湾性皮炎(celiac sprue-dermatitis)、慢性疲劳免疫功能紊乱综合症(CFIDS)、慢性发炎性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮、肢端硬化综合症(CREST syndrome)、冷凝集素疾病、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维性肌炎、急性肾小球肾炎、格林-巴利综合症(guillain-barre)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、青少年性关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、耳性眩晕病、混合结缔组织病、多发性硬化症、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、多发性结节性动脉炎、多发性软骨炎、多腺体综合症、风湿性多肌痛、多发性肌炎以及皮肤肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、夏科氏肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺氏现象(Raynaud'sphenomenon)、赖特氏综合症(Reiter's syndrome)、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、修格连氏综合症、僵人综合症、全身性红斑狼疮、红斑狼疮、高安氏动脉炎(Takayasuarteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎血管炎、白癜风以及韦格纳氏肉芽肿(Wegener's granulomatosis)。
发炎性病症的实例包括但不限于哮喘、脑炎、发炎性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏病症、败血性休克、肺纤维化、未分化的脊椎关节炎(undifferentitatedspondyloarthropathy)、未分化的关节炎、关节炎、炎性骨质溶解以及慢性病毒性或细菌性感染所致的慢性炎症。
在此的组合物和方法可以与用于预防、管理或处理以上疾病的一种或多种常规疗法一起使用。在一些方面，还提供了使用抗体灭活不同感染剂如病毒、真菌、真核微生物、以及细菌的方法。在一些方面，在此的抗体可以用于灭活RSV、hMPV、PIV或流感病毒。在一些方面，在此的抗体可以用于灭活真菌性病原体，如但不限于纳氏虫属、曲霉属、芽生菌属、组织胞浆菌属、念珠菌属或癣属的成员。在一些方面，在此的抗体可以用于灭活真核微生物，如但不限于贾第虫虫属、弓形虫属、疟原虫属、锥虫属以及痢疾属的成员。在一些方面，在此的抗体可以用于灭活细菌性病原体，如但不限于葡萄球菌属、链球菌属、假单胞菌属、梭状芽胞杆菌属、疏螺旋体属、弧菌属以及奈瑟氏菌属的成员。
在此的抗体和组合物可用于许多目的，例如，作为针对多种多样的慢性和急性疾病和病症的治疗剂，这些疾病和病症包括但不限于感染病，包括病毒、细菌以及真菌性疾病)。病毒病原体的实例包括但不限于腺病毒科(例如，哺乳动物腺病毒以及禽类腺病毒)、疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、单纯疱疹病毒5型、以及单纯疱疹病毒6型)、光滑病毒科(例如，慢病毒、肠杆菌MS2期、异型小病毒)、痘病毒科(例如，脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒属、软体动物痘病毒、以及昆虫痘病毒亚科)、乳多空病毒科(例如，多瘤病毒和乳头瘤病毒)、副粘病毒科(例如，副粘病毒、副流感病毒1、运动病毒(例如，麻疹病毒)、腮腺炎病毒(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒(mumps virus))、肺炎病毒亚科(例如，肺炎病毒、人类呼吸多核体病毒)、以及偏肺病毒(例如，禽类肺炎病毒和人偏肺病毒))、细小核糖核酸病毒(例如肠道病毒、鼻病毒、肝病毒(例如，人类甲肝病毒)、心脏病毒、以及牛口蹄疫病毒)、呼肠孤病毒科(例如，正呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒、质型多角体病毒、矮缩病毒、植物呼肠孤病毒、以及水稻病毒)、反向病毒科(例如，哺乳动物B型反向病毒、哺乳动物C型反向病毒、禽类C型反向病毒、D型反向病毒组、BLVHTLV反向病毒、慢病毒(例如，人类免疫缺陷病毒1和人类免疫缺陷病毒2)、泡沫病毒)、黄病毒科(例如C型肝炎病毒)、嗜肝病毒科(例如乙型肝炎病毒)、披膜病毒科(例如甲病毒(例如油棉病毒)和风疹病毒(例如风湿疹病毒))、棒状病毒科(例如，水泡病毒、狂犬病毒、暂时热病毒、细胞质弹状病毒、以及胞核弹状病毒)、沙砾病毒科(例如，沙砾病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、爱皮病毒、以及拉沙病毒)、以及冠状病毒科(例如，冠状病毒和念状病毒)。
细菌性病原体的实例包括但不限于：水螺菌科、固氮螺菌科、固氮菌科、拟杆菌科、巴尔通氏体种、蛭弧菌科、弯曲杆菌种、衣原体种(例如，肺炎衣原体)、梭状芽胞杆菌、肠杆菌科(例如，柠檬酸细菌种、爱德华氏菌、产气肠杆菌、欧文氏菌种、大肠杆菌、哈夫尼菌种、克雷伯氏杆菌种、摩根氏菌种、普通变形杆菌属、普罗维登斯菌、沙门氏菌种、粘质沙门氏菌、以及弗氏志贺菌)、加蒂奈菌科、流感嗜血杆菌属、盐杆菌科、幽门螺杆菌科、军团菌科、李司忒氏菌种、甲基球菌科、分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌)、奈瑟氏球菌科、海洋螺菌科、巴斯德氏菌科、肺炎球菌种、假单胞菌种、根瘤菌科、螺旋菌科、螺状菌科、葡萄球菌(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及酿脓葡萄球菌)、链球菌(例如，肠炎链球菌、粪链球菌和肺炎链球菌)、蝙幅螺杆菌科以及蝙幅弧菌科。
真菌病原体的实例包括但不限于：犁头霉种(例如，伞枝梨头霉和分棘状棘子须霉)、曲霉种(例如，黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、以及土曲霉)、蛙生蛙粪霉、皮炎芽生菌、念珠菌种(例如，白色念珠菌、光滑念珠菌、克尔念珠菌、克鲁斯念珠菌、近平滑念珠菌、拟热带念珠菌、吉利蒙念珠菌、皱糟假丝酵母、星状念珠菌以及热带念珠菌)、粗球孢子菌、耳霉属种、新型隐球菌、小克银汉霉属种、皮肤真菌、荚膜组织胞众菌、石膏样小孢子菌、微小毛霉、巴西副球孢子菌、波氏假阿利什菌、西伯鼻孢子菌、卡氏肺囊虫、根霉属种(例如少根根霉、米根霉以及小孢根霉)、酵母属种、申克孢子丝菌、接合菌以及以下类别如：接合菌纲、子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲以及卵菌纲。
在一些方面，还提供了使用抗体消耗细胞群的方法。在一方面，在此的方法可以用于以下细胞类型的消耗：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞。
在某些方面，在此的抗体还可以用于疾病或其症状的诊断和检测之中。在一些方面，在此的组合物可以用于监测疾病进展。在不同方面，在此的组合物可以用于监测治疗方案。在某些方面，在此的组合物可用于一个离体应用如一个诊断试剂盒中的诊断。
在此的组合物可以用于靶抗原的可视化。在一些方面，靶抗原是内化的细胞表面受体。在某些方面，靶抗原是一个细胞内抗原。在一些方面，靶抗原是一个核内抗原。在一些方面，在此的一些抗体一旦结合，就内化至细胞。
轭合物
在此提供的抗体能够以非轭合形式使用或轭合至多个异源部分中的至少一个以便促进靶检测或用于成像或治疗。当进行纯化时，在纯化之前或之后可以标记或轭合抗体的Tn3支架。
许多异源部分缺少在此的抗体可以连接的合适的官能团。因此，在一些方面，效应分子通过一个接头附接至支架，其中该接头含有用于轭合的反应性基团。在一些方面，轭合至在此的一个抗体的异源部分可以用作一个接头。在其他方面，该部分经由可以可裂解或不可裂解的一个接头轭合至在此的一个抗体。在一方面，可裂解的连接分子是一个氧化还原可裂解的连接分子，这样使得连接分子具有低氧化还原电位的环境中是可裂解的，该环境如细胞质和具有高浓度的具有游离氢硫基基团的分子的其他区。因氧化还原电位变化而可以裂解的连接分子的实例包括含有二硫键的那些。
在一些方面，在此的一个抗体被工程化来提供用于轭合的反应性基团。在这类抗体中，N-末端和/或C-末端也可以用于提供用于轭合的反应性基团。在其他方面，N-末端可以轭合至一个部分(如但不限于PEG)，而C-末端轭合至另一个部分(如但不限于生物素)，或反之亦然。
术语“聚乙二醇”或“PEG”意指聚乙二醇化合物或其衍生物，具有或不具有偶联剂、偶联或活化部分(例如，具有硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙磺酸酯、氮杂环丙烷、环氧乙烷、N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺部分)。术语“PEG”旨在指示分子量介于500与150000Da之间的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端OH-基被一个甲氧基替换(称为mPEG)。
在此的抗体可以用聚乙二醇(PEG)来衍生。PEG是具有两个末端羟基的氧化乙烯重复单元的一种线性的水溶性聚合物。PEG根据范围典型地是从约500道尔顿至约40,000道尔顿的其分子量进行分类。在一个具体方面，所采用的PEG具有范围是从5,000道尔顿至约20,000道尔顿的分子量。偶联至在此的支架的PEG可以是支链的或非支链的。参见，例如，莫法蒂尼·C.(Monfardini,C.)等人，1995生物轭合化学(Bioconjugate Chem)6:62-69。PEG可商购自内克塔公司(Nektar Inc.)、西格玛化工公司(Sigma Chemical Co.)以及其他公司。这类PEG包括但不限于单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-丁二酰亚胺丁二酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(MePEG-TRES)、以及单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。
简单地说，所采用的亲水性聚合物例如PEG在一端通过一个非反应性基团如一个甲氧基或乙氧基封闭。之后，聚合物在另一端通过与一种合适的活化剂反应来活化，该活化剂如氰尿酰卤(例如，氰尿酰氯、氰尿酰溴或氰尿酰氟)、羰基二咪唑、酐试剂(例如，二卤代丁二酸酐，如二溴丁二酸酐)、酰基叠氮化物、对-重氮鎓苯甲基醚、3-(对-重氮鎓苯氧基)-2-羟丙基醚)等等。活化的聚合物然后与如在此所描述的一个多肽反应以便产生用聚合物衍生的一个多肽。可替代地，在此的一个抗体中的一个官能团可以被活化来与聚合物反应，或者两个基团可以使用已知的偶联方法来在一个一致的偶联反应中连接。将容易认识到，在此的多肽可以使用本领域中已知的许多其他反应方案用PEG来衍生。PEG可以在抗体的任一端处或抗体内的一个或多个官能团处偶联至在此的一个支架。在某些方面，PEG在N-末端抑或C-末端偶联。
在其他方面，在此的一个抗体、其类似物或衍生物可以轭合至一个诊断剂或检测剂。作为临床测试程序的一部分，这类抗体可以用于监测或预后疾病的发展或进展，如测定具体治疗的功效。
在此的技术进一步涵盖轭合至一个治疗部分的一个抗体的使用。在此的一个抗体可以轭合至一个治疗部分如细胞毒素，例如，细胞抑制或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，例如，α-发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
组合物
在某些方面，本披露提供组合物。这类组合物可以是包含编码在此提供的抗体的核酸分子的组合物。这类药物组合物还可以是包含在此提供的一个抗体、在此的抗体的组合、以及药学上可接受的赋形剂的组合物。在某些方面，本披露的组合物用作药剂。
在某些方面，在此的抗体或在此的抗体的组合(或编码一个或多个在此的抗体的核酸分子)可以与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂一起配制成药物组合物。在某些方面，这类药物组合物适于使用本领域中已知的方法经由任何一个或多个给予途径来给予人或非人动物。如熟练的业内人士将理解，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。术语“药学上可接受的载体”意指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如“雷明顿药物科学与实践(Remington:The Science & Practice of Pharmacy)”，第21版，利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins)(2005)以及“医师案头参考(Physician’sDesk Reference)”，第60版，医药经济出版社(Medical Economics)，蒙特维尔(Montvale)，新泽西(2005)中所列出。可以常规地选择对于所希望或所要求的给予方式、溶解度和/或稳定性来说合适的药学上可接受的载体。
在一方面，本披露的配制品是基本上不含内毒素和/或相关热原物质的无热原配制品。内毒素包括限制在微生物体内并且仅当微生物破坏或死亡时才释放出来的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物的外膜的诱导发热的热稳定的物质(糖蛋白类)。如果向人类给予这些物质，会引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，即使低量的内毒素也必须从静脉内给予的药物溶液中去除。食品与药物管理局(“FDA”)已经针对静脉内药物施用，设置了在单个一小时内每公斤体重每剂量的5个内毒素单位(EU)的上限(TheUnited States Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum(美国药典委员会，药典论坛)26(1):223(2000))。在某些特定方面，组合物中的内毒素和热原水平小于10EU/mg、或小于5EU/mg、或小于1EU/mg、或小于0.1EU/mg、或小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。
当用于体内给予时，本披露的配制品应是无菌的。本披露的配制品可以通过各种灭菌方法来灭菌，这些灭菌方法包括无菌过滤、辐射等等。在一个方面，配制品用一个预先灭菌的0.22-微米的滤器来过滤灭菌。用于注射的无菌组合物可以根据“雷明顿药物科学与实践”，第21版，利平科特威廉斯威尔金斯出版公司(2005)中描述的常规药学实践来配制。
本披露的治疗组合物可以配制用于特定的给予途经，如口服、经鼻、经肺、局部(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给药。如在此使用的措辞“肠胃外给予(parenteral administration)”和“肠胃外给予(administered parenterally)”是指除了肠道和局部给予以外的给予方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。本披露的适合于局部或经皮给药的配制品包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂以及吸入剂。iMer可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合、并且与可能要求的任何防腐剂、缓冲剂、或推进剂混合(美国专利号7,378,110；7,258,873；7,135,180；美国专利号2004-0042972；以及2004-0042971)。
这些配制品可以按照单位剂型常规地呈现并且可以通过药学领域中已知的任何方法来制备。本披露的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化以便于获得有效实现对于具体的患者、组合物、以及给予方式来说希望的治疗应答而对患者无毒的量(例如，“治疗有效量的”)的活性成分。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的具体组合物的活性、给予途径、给予时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。合适剂量的范围可以是从约0.0001至约100mg/kg体重或更大，例如约0.1、1、10、或50mg/kg体重，其中约1至约10mg/kg体重是合适的。
应注意，本披露类似地涵盖：还可以制备适于诊断和研究使用的配制品。这类配制品中的活性剂的浓度以及赋形剂和/或热原的存在或缺乏可以基于具体应用和预期用途来选择。
实施例
下文提供了本技术的某些实施例的非限制性实例。
A1.一种包含一个修饰的重链的抗体，其中该修饰的重链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代。
A2.如实施例A1所述的抗体，其中CH1区包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
A3.如实施例A1所述的抗体，其中该CH1区包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，并且VH区包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
A4.如实施例A1、A2或A3所述的抗体，其中重链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
A5.如实施例A1至A4中任一项所述的抗体，进一步包含一个修饰的轻链，其中该修饰的轻链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代。
A6.如实施例A5所述的抗体，其中CL区包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
A7.如实施例A5所述的抗体，其中该CL区包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，并且VL区包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
A8.如实施例A5、A6或A7所述的抗体，其中轻链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
A9.如实施例A5、A6、A7或A8所述的抗体，其中因该天然非半胱氨酸氨基酸至该半胱氨酸氨基酸的该取代而产生的该修饰的重链中的取代的半胱氨酸以及因该天然非半胱氨酸氨基酸至该半胱氨酸氨基酸的该取代而产生的该修饰的轻链中的取代的半胱氨酸可以形成一个二硫键。
A10.如实施例A1至A9中任一项所述的抗体，包含两个重链和两个轻链。
A11.如实施例A10所述的抗体，其中这两个重链和两个轻链是四个单独的多肽。
A12.如实施例A10所述的抗体，其中这两个重链和两个轻链是单个多肽。
A13.如实施例A1至A12中任一项所述的抗体，该抗体是一个全长抗体。
A14.如实施例A10至A13中任一项所述的抗体，其中这两个重链各自包含一个VH结构域、一个CH1结构域以及一个Fc区，其中这些VH结构域具有相同或不同的氨基酸序列，这些CH1结构域具有不同的氨基酸序列，并且这些Fc区具有不同的氨基酸序列。
A15.如实施例A14所述的抗体，其中这两个重链形成一个异二聚体。
A16.如实施例A10至A15中任一项所述的抗体，其中这两个轻链各自包含一个VL结构域和一个CL结构域，其中这些VL结构域具有相同或不同的氨基酸序列并且这些CL结构域具有不同的氨基酸序列。
A17.如实施例A1至A16中任一项所述的抗体，该抗体特异性结合至两个独立的抗原或同一抗原上的两个独立的表位。
A18.如实施例A17所述的抗体，其中对这两个独立抗原的结合亲和力是相同或不同的。
A19.如实施例A17所述的抗体，其中对同一抗原上的这两个独立表位的结合亲和力是相同或不同的。
A20.如实施例A17所述的抗体，该抗体以两个不同结合亲和力特异性结合至相同表位。
A21.如实施例A5至A20中任一项所述的抗体，其中该轻链是一个κ轻链或一个λ轻链。
A22.如实施例A10至A20中任一项所述的抗体，其中一个轻链是一个κ轻链并且一个轻链是一个λ轻链。
A23.如实施例A1至A22中任一项所述的抗体，该抗体包含(i)在CH1区中包含一个修饰的一个修饰的重链、和在CL区中包含一个修饰的一个修饰的相应轻链，以及(ii)一个第二重链和相应轻链，其中CH1和CL区未被修饰。
A24.如实施例A1至A23中任一项所述的抗体，该抗体是一个免疫球蛋白G(IgG)。
A25.如实施例A1至A24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在该CH1区位置220处包含的一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG1重链，其中编号是根据EU索引。
A26.如实施例A1至A24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在该CH1区的位置131和/或219和/或220处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
A27.如实施例A1至A24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在该CH1区的位置131和219和220中的每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
A28.如实施例A1至A24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在该CH1区的位置131和220中的每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
A29.如实施例A1至A24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在该CH1区的位置131处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG3或IgG4重链，其中编号是根据EU索引。
A30.如实施例A29所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在该CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A31.如实施例A24至A30中任一项所述的抗体，其中该非半胱氨酸氨基酸是一个缬氨酸或丙氨酸。
A32.如实施例A24至A31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在该CH1区的位置141处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A33.如实施例A32所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A34.如实施例A32所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A35.如实施例A32所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A36.如实施例A32、A33或A34所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A37.如实施例A32、A34、A35或A36所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A38.如实施例A32至A37中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在该CL区的位置116处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，并且在该CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A39.如实施例A32至A38中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苯丙氨酸或苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A40.如实施例A32至A39中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A41.如实施例A32至A39中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A42.如实施例A24至A31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在该CH1区的位置168处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A43.如实施例A42所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A44.如实施例A42所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A45.如实施例A42所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A46.如实施例A42至A44中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A47.如实施例A42、A44或A45所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A48.如实施例A42至A47中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在该CL区的位置164处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸的取代，并且在该CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A49.如实施例A42至A48中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置164处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个非半胱氨酸氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A50.如实施例A42至A49中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置164处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A51.如实施例A24至A31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在该CH1区的位置126处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A52.如实施例A51所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A53.如实施例A51所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A54.如实施例A51所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A55.如实施例A51至A53中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A56.如实施例A51或A53至A55所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A57.如实施例A51至A56中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在该CL区的位置121处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，并且在该CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A58.如实施例A51至A57中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置121处的丝氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A59.如实施例A51至A48中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置121处的丝氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A60.如实施例A24至A31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在该CH1区的位置128处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A61.如实施例A60所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A62.如实施例A60所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A63.如实施例A60所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A64.如实施例A60至A62中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A65.如实施例A60或A62至A64所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A66.如实施例A60至A65中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在该CL区的位置118处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，并且在该CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A67.如实施例A60至A66中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置118处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A68.如实施例A60至A67中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置118处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
A69.如实施例A24至A31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。
A70.如实施例A69所述的抗体，其中该修饰的重链是在该可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG1重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中CH区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A71.如实施例A69所述的抗体，其中该修饰的重链是在该可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A72.如实施例A69所述的抗体，其中该修饰的重链是在该可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG3或IgG4重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
A73.如实施例A69至A72中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在该可变区的位置100处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特；并且在该CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
A74.如实施例A14至A73中任一项所述的抗体，其中任一个或两个重链的Fc区包含一个或多个修饰。
A75.如实施例A74所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰促进这些重链的异二聚化。
A76.如实施例A74所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变蛋白A结合并且仅存在于一个重链之中。
A77.如实施例A75所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变蛋白A结合并且仅存在于一个重链中的修饰。
A78.如实施例A76或A77所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且改变蛋白A结合的这些Fc区修饰是氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
A79.如实施例A76或A77所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且改变蛋白A结合的这些Fc区修饰是氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
A80.如实施例A14至A75中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代T366W，并且第二重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，其中编号是根据EU索引。
A81.如实施例A80所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
A82.如实施例A80所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
A83.如实施例A14至A75中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，并且该第二重链包含含有氨基酸取代T366W的一个Fc0区，其中编号是根据EU索引。
A84.如实施例A83所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
A85.如实施例A83所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
A86.如实施例A80至A85中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C，其中编号是根据EU索引。
A87.如实施例A80至A85中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C，其中编号是根据EU索引。
A88.如实施例A74所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变该抗体的半衰期，其中该半衰期取决于FcRn结合亲和力。
A89.如实施例A57b至A59d中任一项所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变该抗体的半衰期的修饰，其中该半衰期取决于FcRn结合亲和力。
A90.如实施例A74中任一项所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变效应子功能，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
A91.如实施例A77至A89中任一项所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变效应子功能的修饰，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
A92.如实施例A1至A91中任一项所述的抗体，该抗体是一个人抗体。
A93.如实施例A1至A91中任一项所述的抗体，该抗体是一个人源化抗体。
A94.如实施例A1至A91中任一项所述的抗体，该抗体是一个嵌合抗体。
B1.一种包含修饰的重链的抗体，其中该修饰的重链在CH1区中包含导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代。
B2.如实施例B1所述的抗体，其中该修饰的重链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代。
B3.如实施例B2所述的抗体，其中重链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
B4.如实施例B1至B3中任一项所述的抗体，进一步包含一个修饰的轻链，其中该修饰的轻链在CL区中包含导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代。
B5.如实施例B4所述的抗体，其中这些修饰有利于该修饰的重链与该修饰的轻链的链间配对。
B6.如实施例B4或B5所述的抗体，其中该修饰的轻链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代。
B7.如实施例B6所述的抗体，其中轻链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
B8.如实施例B1至B7中任一项所述的抗体，进一步包含一个第二重链和一个第二轻链。
B9.如实施例B8所述的抗体，其中两个重链和轻链是四个单独的多肽。
B10.如实施例B8所述的抗体，其中这两个重链和两个轻链是单个多肽。
B11.如实施例B1至B10中任一项所述的抗体，该抗体是一个全长抗体。
B12.如实施例B8至B11中任一项所述的抗体，其中第一重链和第二重链各自包含一个VH结构域、一个CH1结构域以及一个Fc区，其中这些VH结构域具有相同或不同的氨基酸序列，这些CH1结构域具有不同的氨基酸序列，并且这些Fc区具有不同的氨基酸序列。
B13.如实施例B12所述的抗体，其中第一重链和第二重链形成一个异二聚体。
B14.如实施例B8至B13中任一项所述的抗体，其中第一轻链和第二轻链各自包含一个VL结构域和一个CL结构域，其中这些VL结构域具有相同或不同的氨基酸序列并且这些CL结构域具有不同的氨基酸序列。
B15.如实施例B1至B14中任一项所述的抗体，该抗体特异性结合至两个独立的抗原或同一抗原上的两个独立的表位。
B16.如实施例B15所述的抗体，其中对这两个独立抗原的结合亲和力是相同或不同的。
B17.如实施例B15所述的抗体，其中对同一抗原上的两个独立表位的结合亲和力是相同或不同的。
B18.如实施例B1至B14中任一项所述的抗体，该抗体以两个不同结合亲和力特异性结合至相同表位。
B19.如实施例B8至B18中任一项所述的抗体，其中第一轻链和第二轻链是κ轻链或是λ轻链。
B20.如实施例B8至B18中任一项所述的抗体，其中一个轻链是一个κ轻链并且一个轻链是一个λ轻链。
B21.如实施例B1至B20中任一项所述的抗体，该抗体包含(i)在CH1区中包含一个修饰的一个修饰的重链和在CL区中包含一个修饰的一个修饰的相应轻链，以及(ii)一个第二重链和相应轻链，其中CH1和CL区未被修饰。
B22.如实施例B8至B20中任一项所述的抗体，其中该第二重链是在CH1区中包含导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代的一个修饰的重链。
B23.如实施例B22所述的抗体，其中该第二修饰的重链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代。
B24.如实施例B23所述的抗体，其中该重链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
B25.如实施例B22至B24中任一项所述的抗体，其中该第二轻链是在CL区中包含导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代的一个修饰的轻链。
B26.如实施例B20所述的抗体，其中这些修饰有利于该第二修饰的重链与该第二修饰的轻链的链间配对。
B27.如实施例B25或B26所述的抗体，其中该第二修饰的轻链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代。
B28.如实施例B27所述的抗体，其中该轻链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
B29.如实施例B2至B28中任一项所述的抗体，其中该第一和/或第二修饰的重链是在该CH1区的位置220处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG1重链，其中编号是根据EU索引。
B30.如实施例B2至B28中任一项所述的抗体，其中该第一和/或第二修饰的重链是在CH1区的位置131和219和220中每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
B31.如实施例B2至B28中任一项所述的抗体，其中该第一和/或第二修饰的重链是在CH1区的位置131和220中每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
B32.如实施例B2至B28中任一项所述的抗体，其中该第一和/或第二修饰的重链是在CH1区的位置131处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG3或IgG4重链，其中编号是根据EU索引。
B33.如实施例B6至B32中任一项所述的抗体，其中该第一和/或第二修饰的轻链在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
B34.如实施例B2至B33中任一项所述的抗体，其中该非半胱氨酸氨基酸是一个缬氨酸或丙氨酸。
B35.如实施例B1至B34中任一项所述的抗体，其中在CH1区中的导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代是位置145处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、位置170处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代、位置183处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编号是根据EU索引。
B36.如实施例B35所述的抗体，其中位置145处的亮氨酸被苯丙氨酸取代，位置170处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，位置183处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，并且位置185处的缬氨酸被苯丙氨酸取代，其中编号是基于EU索引的。
B37.如实施例B35或B36所述的抗体，其中在CL区中的导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代是位置176处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的取代以及位置178处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编号是根据EU索引。
B38.如实施例B37所述的抗体，其中位置176处的丝氨酸被苯丙氨酸取代并且位置178处的苏氨酸或酪氨酸被丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
B39.如实施例B1至B28中任一项所述的抗体，其中在CH1区中的导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代是位置147处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的取代以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编号是根据EU索引。
B40.如实施例B39所述的抗体，其中位置147处的赖氨酸被丙氨酸取代并且位置185处的缬氨酸被色氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
B41.如实施例B39或B40所述的抗体，其中在CL区中的导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代是位置131处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的取代以及位置135处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编号是根据EU索引。
B42.如实施例B41所述的抗体，其中位置131处的丝氨酸或苏氨酸被色氨酸取代并且位置135处的亮氨酸被甘氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
B43.如实施例B24至B34中任一项所述的抗体，其中：
(a)该修饰的重链包含位置145处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、位置170处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代、位置183处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代；并且
(b)该修饰的轻链包含位置176处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置178处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，
其中编号是根据EU索引。
B44.如实施例B24至B34中任一项所述的抗体，其中
(a)该修饰的重链包含位置147处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代；并且
(b)该修饰的轻链包含位置131处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置135处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，
其中编号是根据EU索引。
B45.如实施例B25至B34中任一项所述的抗体，其中
(a)该第一修饰的重链包含位置145处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、位置170处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代、位置183处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代；并且
(b)该第一修饰的轻链包含位置176处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置178处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代；
(c)该第二修饰的重链包含位置147处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代；并且
(d)该第二修饰的轻链包含位置131处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置135处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，
其中编号是根据EU索引。
B46.如实施例B43所述的抗体，其中
(a)该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置145处的亮氨酸被苯丙氨酸取代，位置170处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，位置183处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，并且位置185处的缬氨酸被苯丙氨酸取代；
(b)该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置176处的丝氨酸被苯丙氨酸取代并且位置178处的苏氨酸或酪氨酸被丙氨酸取代，
其中编号是根据EU索引。
B47.如实施例B44所述的抗体，其中
(a)该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置147处的赖氨酸被丙氨酸取代并且位置185处的缬氨酸被色氨酸取代；并且
(b)该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置131处的丝氨酸或苏氨酸被色氨酸取代并且位置135处的亮氨酸被甘氨酸取代，
其中编号是根据EU索引。
B48.如实施例B45所述的抗体，其中
(a)该第一修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置145处的亮氨酸被苯丙氨酸取代，位置170处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，位置183处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，并且位置185处的缬氨酸被苯丙氨酸取代；
(b)该第一修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置176处的丝氨酸被苯丙氨酸取代并且位置178处的苏氨酸或酪氨酸被丙氨酸取代；
(c)该第二修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置147处的赖氨酸被丙氨酸取代并且位置185处的缬氨酸被色氨酸取代；并且
(d)该第二修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置131处的丝氨酸或苏氨酸被色氨酸取代并且位置135处的亮氨酸被甘氨酸取代，
其中编号是根据EU索引。
B49.如实施例B25至B34中任一项所述的抗体，其中
(a)该第一修饰的重链包含位置147处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代；并且
(b)该第一修饰的轻链包含位置131处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置135处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代；
(c)该第二修饰的重链包含位置145处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、位置170处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代、位置183处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代；
(d)该第二修饰的轻链包含位置176处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置178处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，
其中编号是根据EU索引。
B50.如实施例B49所述的抗体，其中
(a)该第一修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置147处的赖氨酸被丙氨酸取代并且位置185处的缬氨酸被色氨酸取代；并且
(b)该第一修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置131处的丝氨酸或苏氨酸被色氨酸取代并且位置135处的亮氨酸被甘氨酸取代；
(c)该第二修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置145处的亮氨酸被苯丙氨酸取代，位置170处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，位置183处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，并且位置185处的缬氨酸被苯丙氨酸取代；
(d)该第二修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置176处的丝氨酸被苯丙氨酸取代并且位置178处的苏氨酸或酪氨酸被丙氨酸取代，
其中编号是根据EU索引。
B51.如实施例B11至B50中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含一个或多个修饰。
B52.如实施例B51所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰促进这些重链的异二聚化。
B53.如实施例B51所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变蛋白A结合并且仅存在于一个重链之中。
B54.如实施例B52所述的抗体，进一步包含Fc区中的改变蛋白A结合并且仅存在于一个重链中的修饰。
B55.如实施例B53或B54所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且改变蛋白A结合的这些Fc区修饰是氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
B56.如实施例B53或B54所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且改变蛋白A结合的这些Fc区修饰是氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
B57.如实施例B11至B52中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代T366W，并且该第二重链包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，其中编号是根据EU索引。
B58.如实施例B57所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
B59.如实施例B57所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
B60.如实施例B11至B52中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，并且该第二重链包含氨基酸取代T366W，其中编号是根据EU索引。
B61.如实施例B60所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
B62.如实施例B60所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
B63.如实施例B57至B62中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C，其中编号是根据EU索引。
B64.如实施例B57至B62中任一项所述的抗体，其中该第一修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C，其中编号是根据EU索引。
B65.如实施例B51所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变该抗体的半衰期，其中半衰期取决于FcRn结合亲和力。
B66.如实施例B52至B64中任一项所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变该抗体的半衰期的的修饰，其中半衰期取决于FcRn结合亲和力。
B67.如实施例B51至B65中任一项所述的抗体，其中这一个或多个修饰改变效应子功能，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
B68.如实施例B52至B66中任一项所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变效应子功能的修饰，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
B69.如实施例B1至B68中任一项所述的抗体，该抗体是一个人抗体。
B70.如实施例B1至B468中任一项所述的抗体，该抗体是一个人源化抗体。
B71.如实施例B1至B68中任一项所述的抗体，该抗体是一个嵌合抗体。
C1.一种分离的核酸，该核酸包含编码修饰的重链多肽的核苷酸序列，其中该修饰的重链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代。
C2.如实施例C1所述的核酸，其中该修饰的重链多肽的CH1区包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
C3.如实施例C1所述的核酸，其中该修饰的重链多肽的该CH1区包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代并且该修饰的重链的VH区包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
C4.一种分离的核酸，该核酸包含编码修饰的重链多肽的核苷酸序列，其中该修饰的重链在CH1区中包含导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代。
C5.如实施例C2所述的核酸，其中该修饰的重链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代。
C6.如实施例C1、C2、C3或C5所述的核酸，其中重链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
C7.如实施例C1至C6中任一项所述的核酸，该核酸编码一个修饰的免疫球蛋白G(IgG)重链。
C8.如实施例C7所述的核酸，其中该修饰的重链是在CH1区的位置220处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG1重链，其中编号是根据EU索引。
C9.如实施例C7所述的核酸，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131和/或219和/或220处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
C10.如实施例C7所述的核酸，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131和219和220中每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
C11.如实施例C7所述的核酸，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131和220中每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
C12.如实施例C7所述的核酸，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG3或IgG4重链，其中编号是根据EU索引。
C13.如实施例C7至C12中任一项所述的核酸，其中该非半胱氨酸氨基酸是一个缬氨酸或丙氨酸。
C14.如实施例C7至C13中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链在CH1区的位置141处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
C15.如实施例C14所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C16.如实施例C14所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C17.如实施例C14所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C18.如实施例C14至C16中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C19.如实施例C14或C16至C18所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C20.如实施例C7至C13中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链在CH1区的位置168处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
C21.如实施例C20所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C22.如实施例C20所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C23.如实施例C20所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C24.如实施例C20至C22中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C25.如实施例C20或C22至C24中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C26.如实施例C7至C13中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链在CH1区的位置126处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
C27.如实施例C26所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C28.如实施例C26所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C29.如实施例C26所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C30.如实施例C26至C28中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C31.如实施例C26或C28至C30中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C32.如实施例C7至C13中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链在CH1区的位置128处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
C33.如实施例C32所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C34.如实施例C32所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C35.如实施例C32所述的核酸，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C36.如实施例C32至C34所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C37.如实施例C32或C34至C36中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C38.如实施例C7至C13中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。
C39.如实施例C38所述的核酸，其中该修饰的重链是在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG1重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C40.如实施例C38所述的核酸，其中该修饰的重链是在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C41.如实施例C38所述的核酸，其中该修饰的重链是在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG3或IgG4重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
C42.如实施例C2、C3或C7至C12中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含位置145处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、位置170处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代、位置183处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代、以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编码是根据EU索引。
C43.如实施例C42所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置145处的亮氨酸被苯丙氨酸取代，位置170处的苯丙氨酸被缬氨酸取代，位置183处的丝氨酸被苯丙氨酸取代，并且位置185处的缬氨酸被苯丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C44.如实施例C2、C3或C7至C12所述的核酸，其中该修饰的重链包含位置147处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置185处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编号是根据EU索引。
C45.如实施例C44所述的核酸，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此位置147处的赖氨酸被丙氨酸取代并且位置185处的缬氨酸被色氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
C46.如实施例C1至C45中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链包含一个Fc区。
C47.如实施例C46所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区包含一个或多个修饰。
C48.如实施例C47所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区中的这些修饰促进两个重链的异二聚化。
C49.如实施例C47所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区中的这些修饰改变蛋白A结合。
C50.如实施例C48所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区进一步包含改变蛋白A结合的修饰。
C51.如实施例C49或C50所述的核酸，其中该修饰的重链是IgG1、IgG2或IgG4并且改变蛋白A结合的这些修饰是氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
C52.如实施例C49或C50所述的核酸，其中该修饰的重链是IgG3并且改变蛋白A结合的这些修饰是氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
C53.如实施例C47或C48所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区包含一个氨基酸取代T366W，其中编号是根据EU索引。
C54.如实施例C53所述的核酸，其中该修饰的重链是IgG3重链并且进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
C55.如实施例C47或C48所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区包含一个氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，其中编号是根据EU索引。
C56.如实施例C55所述的核酸，其中该修饰的重链是IgG1、IgG2或IgG4重链并且进一步包含一个氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
C57.如实施例C53至C56中任一项所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区进一步包含一个氨基酸取代S354C或Y349C，其中编号是根据EU索引。
C58.如实施例C47所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区中的这些修饰改变该抗体的半衰期，其中半衰期取决于FcRn结合亲和力。
C59.如实施例C48至C57中任一项所述的核酸，在修饰的重链Fc区中进一步包含改变该抗体的半衰期的修饰，其中半衰期取决于FcRn结合亲和力。
C60.如实施例C47所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区中的这些修饰改变效应子功能，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
C61.如实施例C48至C59中任一项所述的核酸，在修饰的重链Fc区中进一步包含改变效应子功能的修饰，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
C62.如实施例C1至C61中任一项所述的核酸，该核酸处于一个表达载体之中。
C63.如实施例C62所述的核酸，其中该表达载体进一步包含编码一个第二重链的一个第二核酸，其中该第二重链包含未修饰的一个CH1区。
C64.如实施例C63所述的核酸，其中该表达载体进一步包含各自编码一个第一轻链和第二轻链的一个第三核酸和第四核酸，其中：
(a)该第一轻链是一个修饰的轻链，该修饰的轻链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代；并且
(b)该第二轻链未被修饰。
C65.如实施例C62所述的核酸，其中该表达载体进一步包含编码一个第二重链的一个第二核酸，其中该第二重链包含修饰的一个CH1区。
C66.如实施例C65所述的核酸，其中该第二修饰的重链在CH1区中包含导致一个突起和/或一个空腔的至少一个氨基酸的取代。
C67.如实施例C65或C66所述的核酸，其中该表达载体进一步包含各自编码一个第一轻链和第二轻链的一个第三核酸和第四核酸，其中
(a)该第一轻链是在CL区中包含导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代的一个修饰的轻链；并且
(b)该第二轻链是在CL区中包含导致一个补偿空腔和/或突起的至少一个氨基酸的取代的一个修饰的轻链，
其中这些修饰有利于该第一重链与该第一轻链和该第二重链与该第二轻链的链间配对。
C68.如实施例C63至C67中任一项所述的核酸，其中该第二重链包含一个Fc区。
C69.如实施例C68所述的核酸，其中该第二重链的该Fc区包含一个或多个修饰。
C70.如实施例C69所述的核酸，其中该第二重链Fc区中的这些修饰促进两个重链的异二聚化。
C71.如实施例C69所述的核酸，其中该第二重链Fc区中的这些修饰改变蛋白A结合。
C72.如实施例C70所述的核酸，其中该第二重链Fc区进一步包含改变蛋白A结合的修饰。
C73.如实施例C50a或C50b所述的核酸，其中该第二重链是IgG1、IgG2或IgG4并且改变蛋白A结合的这些修饰是氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
C74.如实施例C71或C72所述的核酸，其中该第二重链是IgG3，并且改变蛋白A结合的这些修饰是氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
C75.如实施例C69或C70所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，并且该第二重链Fc区包含氨基酸取代T366W，其中编号是根据EU索引。
C76.如实施例C75所述的核酸，其中这些重链是IgG1、IgG2或IgG4并且该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
C77.如实施例C75所述的核酸，其中这些重链是IgG3并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
C78.如实施例C69或C70所述的核酸，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代T366W，并且该第二重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，其中编号是根据EU索引。
C79.如实施例C78所述的核酸，其中这些重链是IgG1、IgG2或IgG4并且该第二重链Fc区进一步包含一个氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
C80.如实施例C78所述的核酸，其中这些重链是IgG3并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
C81.如实施例C75至C80中任一项所述的核酸，其中该第二重链Fc区进一步包含一个氨基酸取代S354C或Y349C，其中编号是根据EU索引。
C82.如实施例C69所述的核酸，其中该第二重链Fc区中的这些修饰改变该抗体的半衰期，其中该半衰期取决于FcRn结合亲和力。
C83.如实施例C69至C80中任一项所述的核酸，在第二重链Fc区中进一步包含改变该抗体的半衰期的的修饰，其中半衰期取决于FcRn结合亲和力。
C84.如实施例C49所述的核酸，其中该第二重链Fc区中的这些修饰改变效应子功能，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
C85.如实施例C69至C83中任一项所述的核酸，在第二重链Fc区中进一步包含改变效应子功能的修饰，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
D1.一种包含修饰的轻链的抗体，其中该修饰的轻链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代。
D2.如实施例D1所述的抗体，其中CL区包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
D3.如实施例D1所述的抗体，其中该CL区包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，并且VL区包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
D4.如实施例D1至D3中任一项所述的抗体，其中该轻链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
D5.如实施例D1至D4中任一项所述的抗体，进一步包含一个修饰的重链，其中该修饰的重链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代。
D6.如实施例D5所述的抗体，其中CH1区包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
D7.如实施例D5所述的抗体，其中该CH1区包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，并且VH区包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
D8.如实施例D5、D6或D7所述的抗体，其中重链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
D9.如实施例D5、D6、D7或D8所述的抗体，其中因该天然非半胱氨酸氨基酸至该半胱氨酸氨基酸的该取代而产生的该修饰的重链中的取代的半胱氨酸以及因该天然非半胱氨酸氨基酸至该半胱氨酸氨基酸的该取代而产生的该修饰的轻链中的取代的半胱氨酸可以形成一个二硫键。
D10.如实施例D1至D9中任一项所述的抗体，包含两个重链和两个轻链。
D11.如实施例D10所述的抗体，其中这两个重链和两个轻链是四个单独的多肽。
D12.如实施例D10所述的抗体，其中这两个重链和两个轻链是单个多肽。
D13.如实施例D1至D12中任一项所述的抗体，该抗体是一个全长抗体。
D14.如实施例D10至D13中任一项所述的抗体，其中这两个重链各自包含一个VH结构域、一个CH1结构域以及一个Fc区，其中这些VH结构域具有相同或不同的氨基酸序列，这些CH1结构域具有不同的氨基酸序列，并且这些Fc区具有不同的氨基酸序列。
D15.如实施例D14所述的抗体，其中这两个重链形成一个异二聚体。
D16.如实施例D10至D15中任一项所述的抗体，其中这两个轻链各自包含一个VL结构域和一个CL结构域，其中这些VL结构域具有相同或不同的氨基酸序列并且这些CL结构域具有不同的氨基酸序列。
D17.如实施例D1至D16中任一项所述的抗体，该抗体特异性结合至两个独立的抗原或同一抗原上的两个独立的表位。
D18.如实施例D17所述的抗体，其中对这两个独立抗原的结合亲和力是相同或不同的。
D19.如实施例D17所述的抗体，其中对同一抗原上的这两个独立表位的结合亲和力是相同或不同的。
D20.如实施例D1至D16中任一项所述的抗体，该抗体以两个不同结合亲和力特异性结合至相同表位。
D21.如实施例D1至D20中任一项所述的抗体，其中该轻链是一个κ轻链或一个λ轻链。
D22.如实施例D6至D20中任一项所述的抗体，其中一个轻链是一个κ轻链并且一个轻链是一个λ轻链。
D23.如实施例D1至D22中任一项所述的抗体，该抗体包含(i)在CH1区中包含一个修饰的一个修饰的重链和在CL区中包含一个修饰的一个修饰的相应轻链，以及(ii)一个第二重链和相应轻链，其中CH1和CL区未被修饰。
D24.如实施例D1至D23中任一项所述的抗体，该抗体是一个免疫球蛋白G(IgG)。
D25.如实施例D5至D24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在CH1区的位置220处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG1重链，其中编号是根据EU索引。
D26.如实施例D5至D24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131和/或219和/或220处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
D27.如实施例D5至D24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131和219和220中每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
D28.如实施例D5至D24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131和220中每一处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据EU索引。
D29.如实施例D5至D24中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链是在CH1区的位置131处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代的IgG3或IgG4重链，其中编号是根据EU索引。
D30.如实施例D29所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D31.如实施例D25至D30中任一项所述的抗体，其中该非半胱氨酸氨基酸是一个缬氨酸或丙氨酸。
D32.如实施例D25至D31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在CH1区的位置141处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D33.如实施例D32所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D34.如实施例D32所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D35.如实施例D32所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D36.如实施例D32、D33或D34所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D37.如实施例D32、D33、D34或D35所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置141处的丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D38.如实施例D32至D37中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在CL区的位置116处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，并且在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D39.如实施例D32至D38中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苯丙氨酸或苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D40.如实施例D32至D39中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D41.如实施例D32至D39中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D42.如实施例D25至D33中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在CH1区的位置168处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D43.如实施例D42所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D44.如实施例D42所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D45.如实施例D42所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D46.如实施例D42至D44中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D47.如实施例D42、D44或D45所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置168处的组氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。D48.如实施例D42至D47中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在CL区的位置164处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸的取代，并且在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D49.如实施例D42至D48中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置164处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个非半胱氨酸氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D50.如实施例D42至D49中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置164处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D51.如实施例D25至D31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在CH1区的位置126处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D52.如实施例D51所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D53.如实施例D51所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D54.如实施例D51所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D55.如实施例D51至D53中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D56.如实施例D51或D53至D55中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置126处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D57.如实施例D51至D56中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在CL区的位置121处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，并且在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D58.如实施例D51至D57中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置121处的丝氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D59.如实施例D51至D58中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置121处的丝氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D60.如实施例D25至D31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在CH1区的位置128处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D61.如实施例D60所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG1重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D62.如实施例D60所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG2重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D63.如实施例D60所述的抗体，其中该修饰的重链是包含多个氨基酸取代的IgG3或IgG4重链，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D64.如实施例D60至D62中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置220处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D65.如实施例D60或D62至D64中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链包含多个氨基酸取代，借此该CH1区的位置128处的亮氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CH1区的位置131处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D66.如实施例D60至D65中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在CL区的位置118处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，并且在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D67.如实施例D60至D66中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置118处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D68.如实施例D60至D67中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置118处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
D69.如实施例D23至D31中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。
D70.如实施例D69所述的抗体，其中该修饰的重链是在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG1重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH区的位置220处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D71.如实施例D69所述的抗体，其中该修饰的重链是在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG2重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH1区的位置131和220中每一处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D72.如实施例D69所述的抗体，其中该修饰的重链是在可变区的位置44处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代的IgG3或IgG4重链，其中编号是根据卡巴特索引，并且其中该CH1区的位置131处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
D73.如实施例D69至D72中任一项所述的抗体，其中该修饰的相应轻链在可变区的位置100处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引；并且在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
D74.如实施例D14所述的抗体，其中该Fc区包含一个或多个修饰。
D75.如实施例D74所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰促进这些重链的异二聚化。
D76.如实施例D74所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变蛋白A结合并且仅存在于一个重链之中。
D77.如实施例D75所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变蛋白A结合并且仅存在于一个重链中的的修饰。
D78.如实施例D76或D77所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且改变蛋白A结合的这些Fc区修饰是氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
D79.如实施例D76或D77所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且改变蛋白A结合的这些Fc区修饰是氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
D80.如实施例D23至D75中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代T366W，并且第二重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，其中编号是根据EU索引。
D81.如实施例D80所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
D82.如实施例D80所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且该第一重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
D83.如实施例D23至D75中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，并且该第二重链包含含有氨基酸取代T366W的一个CH3区，其中编号是根据EU索引。
D84.如实施例D83所述的抗体，其中该抗体是IgG1、IgG2或IgG4并且该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代H435R/Y436F，其中编号是根据EU索引。
D85.如实施例D83所述的抗体，其中该抗体是IgG3并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代R435H/F436Y，其中编号是根据EU索引。
D86.如实施例D80至D85中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C，其中编号是根据EU索引。
D87.如实施例D80至D85中任一项所述的抗体，其中该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C，其中编号是根据EU索引。
D88.如实施例D74所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变该抗体的半衰期，其中半衰期取决于FcRn结合亲和力。
D89.如实施例D74至D88中任一项所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变该抗体的半衰期的修饰，其中半衰期取决于FcRn结合亲和力。
D90.如实施例D74所述的抗体，其中该Fc区中的这些修饰改变效应子功能，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
D91.如实施例D74至D89中任一项所述的抗体，在Fc区中进一步包含改变效应子功能的修饰，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
D92.如实施例D1至D91中任一项所述的抗体，该抗体是一个人抗体。
D93.如实施例D1至D91中任一项所述的抗体，该抗体是一个人源化抗体。
D94.如实施例D1至D91中任一项所述的抗体，该抗体是一个嵌合抗体。
E1.一种组合物，该组合物包含如实施例A1至A94中任一项所述的抗体。
E2.一种组合物，该组合物包含如实施例B1至B71中任一项所述的抗体。
E3.一种组合物，该组合物包含如实施例D1至D94中任一项所述的抗体。
F1.一种分离的核酸，该核酸包含编码修饰的轻链多肽的核苷酸序列，其中该修饰的轻链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代。
F2.如实施例F1所述的核酸，其中该修饰的轻链多肽的CL区包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
F3.如实施例F1所述的核酸，其中该修饰的轻链多肽的该CL区包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代并且该修饰的轻链多肽的VL区包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代。
F4.一种分离的核酸，该核酸包含编码修饰的轻链多肽的核苷酸序列，其中该修饰的轻链在CL区中包含导致一个空腔和/或一个突起的至少一个氨基酸的一个取代。
F5.如实施例F4所述的核酸，其中该修饰的轻链进一步包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代。
F6.如实施例F1、F2、F3或F5所述的核酸，其中轻链天然半胱氨酸能够形成一个链间二硫键。
F7.如实施例F1至F6中任一项所述的核酸，其中该修饰的轻链是一个κ轻链。
F8.如实施例F1至F6中任一项所述的核酸，其中该修饰的轻链是一个λ轻链。
F9.如实施例F1至F8中任一项所述的核酸，该核酸编码一个修饰的免疫球蛋白G(IgG)轻链。
F10.如实施例F9所述的核酸，其中该修饰的轻链在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
F11.如实施例F9所述的核酸，其中该修饰的轻链在CL区的位置116处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，并且在CL区的位置214处包含一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据EU索引。
F12.如实施例F11所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苯丙氨酸或苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被不是半胱氨酸的一个氨基酸取代，其中编号是根据EU索引。
F13.如实施例F12所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
F14.如实施例F12中任一项所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置116处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
F15.如实施例F5所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置164处的苏氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
F16.如实施例F9所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置121处的丝氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
F17.如实施例F9所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此该CL区的位置118处的苯丙氨酸被一个半胱氨酸取代，并且该CL区的位置214处的半胱氨酸被一个缬氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
F18.如实施例F9所述的核酸，其中该修饰的轻链在可变区的位置100处包含一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的取代，其中编号是根据卡巴特索引。
F19.如实施例F9或F10所述的核酸，其中该修饰的轻链包含位置131处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置135处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编号是根据EU索引。
F20.如实施例F19所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置131处的丝氨酸或苏氨酸被一个色氨酸取代，并且该CL区的位置135处的亮氨酸被一个甘氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
F21.如实施例F9或10所述的核酸，其中该修饰的轻链包含位置176处氨基酸被具有一个大侧链的一个氨基酸的一个取代以及位置178处氨基酸被具有一个小侧链的一个氨基酸的一个取代，其中编号是根据EU索引。
F22.如实施例F2所述的核酸，其中该修饰的轻链包含多个氨基酸取代，借此位置176处的丝氨酸被一个丙氨酸取代并且位置178处的苏氨酸或酪氨酸被丙氨酸取代，其中编号是根据EU索引。
F23.如实施例F1至F22中任一项所述的核酸，该核酸处于一个表达载体之中。
F24.如实施例F23所述的核酸，其中该表达载体进一步包含编码未修饰的一个第二轻链的一个第二核酸。
F25.如实施例F23所述的核酸，其中该表达载体进一步包含各自编码一个第一重链和第二重链的一个第三核酸和第四核酸，其中
(a).该第一重链是一个修饰的重链，该修饰的重链包含(i)一个天然半胱氨酸至一个非半胱氨酸氨基酸的一个取代，以及(ii)一个天然非半胱氨酸氨基酸至一个半胱氨酸氨基酸的一个取代；并且
(b).该第二重链未被修饰。
F26.如实施例F23所述的核酸，其中该表达载体进一步包含编码修饰的一个第二轻链的一个第二核酸。
F1.如实施例F26所述的核酸，其中该第二修饰的轻链在CL区中包含导致一个空腔和/或一个突起的至少一个氨基酸的取代。
F27.如实施例F26或F27所述的核酸，其中该表达载体进一步包含各自编码一个第一重链和第二重链的一个第三核酸和第四核酸，其中：
(a)该第一重链是在CH1区中包含导致一个补偿突起和/或空腔的至少一个氨基酸的取代的一个修饰的重链；并且
(b)该第二重链是在CH1区中包含导致一个补偿突起和/或空腔的至少一个氨基酸的取代的一个修饰的重链，
其中这些修饰有利于该第一轻链与该第一重链和该第二轻链与该第二重链的链间配对。
G1.一种细胞，该细胞包含如实施例C62至C85中任一项所述的核酸。
G2.一种细胞，该细胞包含如实施例F23至F28中任一项所述的核酸。
G3.一种细胞，该细胞包含如实施例C62、C63、C65、C66或C68至C85中任一项所述的核酸以及如实施例F23、F24、F26或F27所述的核酸。
H1.一种产生修饰的重链多肽和相应修饰的轻链多肽的方法，该方法包括使包含如实施例C62、C63、C65、C66或C68至C85所述的核酸以及如实施例F23、F24、F26或F27所述的核酸的多个细胞接触表达这些多肽的条件。
H2.如实施例H1所述的方法，其中这些细胞进一步包含编码未修饰的一个第二重链多肽的一个核酸以及编码未修饰的一个相应第二轻链多肽的一个核酸。
H3.如实施例H1所述的方法，其中这些细胞进一步包含编码修饰的一个第二重链多肽的一个核酸以及编码修饰的一个相应第二轻链多肽的一个核酸。
H4.一种产生以下各物的方法：(a)修饰的重链多肽、(b)相应的修饰的轻链多肽、(c)未修饰的第二重链多肽以及(d)相应的未修饰的轻链多肽，该方法包括使包含如实施例C63或C68至C85所述的核酸以及如实施例F24所述的核酸的多个细胞接触表达这些多肽的条件。
H5.一种产生以下各物的方法：(a)修饰的重链多肽、(b)相应的修饰的第一轻链多肽、(c)第二修饰的重链多肽以及(d)相应的第二修饰的轻链多肽，该方法包括使包含如实施例C65、C66或C68至C85所述的核酸以及如实施例F26所述的核酸的多个细胞接触产生这些多肽的条件。
H5.一种产生以下各物的方法：(a)修饰的重链多肽、(b)相应的修饰的轻链多肽、(c)包含未修饰的CH1区的第二重链多肽以及(d)相应的未修饰的轻链多肽，该方法包括使包含如实施例C64或C68至C85所述的核酸或如实施例F25所述的核酸的多个细胞接触表达这些多肽的条件。
H6.一种产生以下各物的方法：(a)第一修饰的重链多肽、(b)相应的修饰的轻链多肽、(c)修饰的第二重链多肽以及(d)相应的修饰的轻链多肽，该方法包括使包含如实施例C67或C68至C85所述的核酸或如实施例F28所述的核酸的多个细胞接触表达这些多肽的条件。
实例
在下文阐述的实例说明了某些方面并且不限制本技术。
实例1：材料与方法
在本实例中阐述的材料和方法用于进行随后实例中描述的实验。除非另有指明，所有的试剂均来自加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
pMBab-重和pMBab-轻哺乳动物表达载体的构建以及表达为MBab IgG1的免疫球蛋白基因的克隆
质粒pMBab-重和pMBab-轻(κ和λ)被设计用于在哺乳动物细胞培养物中产生单价双特异性人IgG1抗体(MBab)。pMBab-重载体含有两个人γ1重链(HC)盒以支持HC异二聚化，前一个重链在CH3结构域中携带“孔洞”突变组，而后者在CH3中携带补偿“凸起”突变，但是可以容易地逆转盒的顺序。为了避免重链和轻链的错配对，将与轻链形成界面二硫化物的“凸起”重链的CH1结构域中的天然半胱氨酸去除并且将一个替代的界面半胱氨酸插入CH1结构域中的其他地方或VH区中的其他地方，以便支持同源(在此又称为“相应的”)轻链和重链的同二聚化。可替代地，可以去除与轻链形成界面二硫化物的“孔洞”重链的CH1结构域中的天然半胱氨酸并且将一个替代的界面半胱氨酸插入CH1结构域中的其他地方或VH结构域中的其他地方，以便支持同源轻链和重链的二聚化。任选地，代替一个替代的界面半胱氨酸，将一个或多个取代引入到每个CH1中，从而产生一个空腔和/或突起，以便支持同源轻链和重链的二聚化，分别将VH结构域作为BssHII/NheI和BsrGI/SalI限制性片段引入到pMBab重载体中的“孔洞”和“凸起”HC盒之中。pMBab-轻-κ载体含有两个人κ轻链(LC)盒。分别将Vκ结构域作为BssHII/BsiWI和BsrGI/NotI限制性片段引入到pMBab-轻-κ载体中的LC盒之中。一个pMBab-轻-λ载体是使用相似的方法来制备。分别将Vλ结构域作为BssHII/KasI和BsrGI/HindIII限制性片段引入到pMBab-轻-λ载体中的LC盒之中。类似地，一个pMBab-轻载体可以被构建成具有含有一个κ结构域的一个盒以及含有一个λ结构域的一个盒。为了避免重链和轻链的错配对，将与重链形成界面二硫化物的CL(Cκ或Cλ)结构域的一个中的天然半胱氨酸去除并且改为将一个替代的界面半胱氨酸插入CL(Cκ或Cλ)结构域中的其他地方或VL中的其他地方，以与CH1结构域或VH结构域中的替代的半胱氨酸互补，以用于支持同源轻链和重链的二聚化。任选地，代替CL结构域中的一个替代的界面半胱氨酸，将一个或多个取代引入到每个CL中，从而产生一个补偿突起和/或空腔，以与CH1结构域中的空腔和/或突起互补以便支持同源轻链和重链的二聚化。使用这些载体，可以产生具有以下的一个MBab：两个重链以及(i)两个κ链；(ii)两个λ链；或(iii)一个λ链和一个κ链，其中已将取代引入到重链的至少一个和轻链的一个中，以便避免错配对并且支持同源轻链和重链的二聚化。
在用于产生哺乳动物人IgG1抗体的一个内部哺乳动物表达载体的主链上构建质粒pMBab-重和pMBab-轻(κ和λ)。为了构建pMBab-重载体，使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变将一个PmlI位点引入到铰链区序列中，以便促进工程化的恒定结构域的便利克隆。使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变将“凸起”突变(T366W)和一个稳定突变(S354C)引入到CH3结构域之中。将所得“凸起”CH2-CH3PCR产物作为PmlI/EcoRI限制性片段回克隆至载体中，从而使载体中的一个内部NotI位点去除。为了构建V12变体，使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变将两个突变C220V和F126C引入到“凸起”重链的CH1结构域中，其中前者使CH1中与轻链形成界面二硫化物的天然半胱氨酸突变并且后者将一个替代的界面半胱氨酸引入CH1中以便支持同源轻链和重链的同二聚化。为了构建V10、V11或VN变体，将一个C220V突变与一个A141C突变或一个H168C突变或一个L128C突变组合。为了构建V1变体，任选地将V185W和K147A突变与一个C220V突变组合。为了构建V3变体，任选地将L145F、F170V、S183F以及V185F突变与C220V组合。在以下详述的实例中，V1或V3变体经由产生合成基因片段而与C220V突变组合，并且插入到不同载体中的“凸起”重链盒中，并且随后与“孔洞”重链盒中的替代的变体配对(即，凸起盒中的V1与孔洞盒中的V3配对)(参见下文)。为了促进不希望的“孔洞-孔洞”同二聚体的去除，将另外的突变引入到IgG3Fc区的“凸起”CH3结构域中以便引入蛋白A结合。例如，已知R435H、F436Y突变将蛋白A结合引入到IgG3抗体中并且可以使用与下文详述的那些相似的方法来引入。
使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变将“孔洞”突变组T366S、L368A、Y407V以及一个稳定突变Y349C引入到一个第二载体的CH3结构域之中。所得“孔洞”VH-CH1-CH2-CH3PCR产物用BssHII/XbaI消化并且在用BssHII/NheI对载体线性化之后回插入携带“凸起”重链的载体之中。因此，“孔洞”重链片段替代了载体中的轻链区段并且进一步引入敲除一个内部NheI位点并插入一个新的HindIII位点的一个沉默突变。为了便利地将VH结构域克隆至“孔洞”重链区段，使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变使CH1结构域的5’处的内部SalI位点突变为NheI。在序列验证之后，所得质粒命名为pMBab-重。为了构建V1变体，任选地将V185W和K147A突变与一个C220V突变组合。为了构建V3变体，任选地将L145F、F170V、S183F以及V185F突变与C220V组合。在以下详述的实例中，V1和V3变体产生为不具有C220V突变的合成基因片段并且分别插入到包含“凸起”盒中的替代变体的pMBab-重载体的“孔洞”重链盒之中。为了促进不希望的“孔洞-孔洞”同二聚体的去除，将另外的突变引入到IgG1、IgG2或IgG4 Fc区的“孔洞”CH3结构域中以便减少或消除蛋白A结合。例如，如下文所描述引入已知消除蛋白A结合的H435R、Y436F突变。
为了构建包含V12变体的pMBab-轻载体，使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变将两个突变C214V和S121C引入到载体中的轻链盒之中。前者使Cκ结构域中与重链形成界面二硫化物的天然半胱氨酸突变并且后者将一个替代的界面半胱氨酸引入Cκ中以便与CH1结构域中替代的半胱氨酸互补，以用于支持同源轻链和重链的同二聚化。将所得V-Cκ PCR产物作为BsrGI/EcoRI限制性片段回引入到载体中，从而替代现存的重链盒。这进一步导致载体中一个内部NotI位点的去除。为了便利地将Vκ结构域克隆至半胱氨酸突变的轻链中，使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变使Cκ结构域的5’处的内部SalI位点突变为NheI。在序列验证之后，所得载体命名为pMBab-轻κ链。使用Vλ区制备的一个相似的载体包含替代第二轻链盒中的NotI位点的一个工程化HindIII位点，以及替代第一轻链盒中的BsiWI的一个KasI位点。所得载体命名为pMBab-轻λ链。为了构建V10、V11或VN变体，将一个C214V突变与一个F116C突变(κ)/T116C突变(λ)，或一个T164C突变(κ或λ)，或一个F118C突变(κ或λ)组合。
为了构建V1变体，任选地将一个S131W(κ)/T131W(κ)突变和一个L135G(κ或λ)突变与一个C220V突变组合。为了构建V3变体，任选地将一个S176F(κ或λ)突变和一个T178A(κ)/Y178A(λ)突变与C220V组合。在以下详述的实例中，V1或V3变体经由产生合成基因片段而与C214V突变组合并且插入到pMab-轻载体之中。仅在与具有C220V突变的相应的CH1配对的VL上包括C214V突变。
表达、亲和纯化以及蛋白定量
下文指示的所有构建体使用293fectinTM(英杰)作为转染试剂瞬时表达在悬浮的HEK293F细胞中并且在英杰的不含血清的FreestyleTM培养基中生长。载体的以下组合用于表达这些研究中使用的抗体：
1.pMBab-重抗-IL6WT+抗-RAGE WT+pMBab-轻抗-IL6 WT+抗-RAGE WT；
2.pMBab-重抗-IL6WT+抗-RAGE(-Cys)+pMBab-轻抗-IL6WT+抗-RAGE(-Cys)；3.pMBab-重抗-IL6 WT+抗-RAGE V10+pMBab-轻抗-IL6 WT+抗-RAGE V10；
4.pMBab-重抗-IL6WT+抗-RAGE V11+pMBab-轻抗-IL6 WT+抗-RAGE V11；5.pMBab-重抗-IL6 WT+抗-RAGE V12+pMBab-轻抗-IL6 WT+抗-RAGE V12；
5.pMBab-重抗-EGFR WT+抗-HER2 V12+pMBab-轻抗-EGFR WT+抗-HER2 V12；
6.pMBab-重抗-IL6 V1+抗-RAGE V3(-Cys)+pMab-轻抗-IL6 V1+抗-RAGE V3(-Cys)；
7.pMBab-重抗-IL6 V3+抗-RAGE V1(-Cys)+pMab-轻抗-IL6 V3+抗-RAGE V1(-Cys)；
8.pMBab-重抗-IL6 V1+抗-RAGE V3+pMab-轻抗-IL6 V1+抗-RAGE V3；以及
9.pMBab-重抗-IL6 V3+抗-RAGE V1+pMab-轻抗-IL6 V3+抗-RAGE V1。
在转染10天后收集培养基，并且根据制造商的方案(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西(GE Healthcare,Piscataway,NJ))通过标准蛋白A亲和色谱来纯化所有抗体形式，并且随后缓冲液交换成处于PBS(pH7.4)之中。在还原和非还原条件下使用SDS-PAGE、以及使用分析型尺寸排阻色谱来分析构建体的纯度(参见以下方法)。纯化的抗体的浓度通过读出280nm下的吸光度使用理论上测定的消光系数来测定。
在“孔洞”重链中携带“RF”突变的pMBab-重构建体的工程化、产生以及分析
为了消除“孔洞”重链中的蛋白A结合，使用重叠延伸PCR技术通过定点诱变来分别使CH3结构域中的hIgG1残基H435和Y436突变为相应的R435和F436(H435R/Y436F)，如在人IgG3中所发现。携带称为“RF”突变的突变H435R和Y436F的所得人IgG1“孔洞”重链缺乏与蛋白A结合的能力。携带RF突变的pMBab构建体使用293fectinTM(英杰)作为转染试剂瞬时表达在悬浮的HEK293F细胞中并且在英杰的不含血清的FreestyleTM培养基中生长。根据制造商的方案(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西)通过标准蛋白A亲和色谱来纯化培养物上清液，并且随后缓冲液交换处于PBS(pH7.4)之中。在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE，通过分析型尺寸排阻色谱(SEC)、以及在还原和非还原条件下通过逆相高压液相色谱(RP-HPLC)来分析和表征蛋白样品。根据制造商的方案(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西)通过CaptureSelectLC-κ或LC-λ亲和色谱来去除轻链错配对的副产物(即，包含错配对的轻链的重链异二聚体)并且随后缓冲液交换为处于PBS(pH7.4)之中。纯化的抗体的浓度通过读出280nm下的吸光度使用测定的消光系数来测定。
SEC-HPLC和光散射检测分析
在1ml/分钟的流率下，使用一个Superdex 200柱(通用电气医疗集团)来进行制备性SEC-HPLC。与一个光散射检测器串联联接的分析型SEC-HPLC(安捷伦1100毛细LC系统)用于测定亲本抗体和单价双特异性抗体(MBab)的绝对分子质量。
ELISA结合
ELISA板在4℃下用在PBS(pH7.4)中稀释的抗原涂布20小时并且在室温下用于PBS中的2％(v/v)脱脂乳+0.05％(v/v)吐温20封闭两小时。随后的所有步骤在室温下进行。将不同浓度的抗体涂覆到板上并且孵育1小时。HRP轭合的山羊抗-人用作一个二级抗体。使用发色HRP底物TMB来使ELISA板显色并且用1M H2SO4来终止颜色发展，并且在A450nm下读出获得的信号。
αLISA结合
所有αLISA试剂均来自珀金埃尔默(PerkinElmer)。在室温下，在柔和照明条件下进行用αLISA珠粒的孵育步骤。在白色96孔半区域OPTIPLATES中进行测定。在室温下，用于1×αLISA免疫测定缓冲中的αLISA抗-FLAG受体珠粒(40微克/ml)以及10nM生物素化的IL6和RAGE-FLAG抗原将不同的浓度的抗体液孵育1小时。以400微克/ml添加αLISA(SA)供体珠粒持续30分钟并且随后在一个ENVISION板读取器中读出测定板。
动力学和并行结合
使用两种不同的捕获方式通过在一个Octet384仪器(ForteBio)上进行生物层干扰测量来测量结合动力学。
方式I：在PBS pH7.4、1mg/ml BSA、0.05％(v/v)吐温(动力学缓冲液)中用抗体装载抗-hIgG-Fc捕获(AHC)生物传感器。在相同的缓冲液中洗涤装载的生物传感器，之后在指示的时刻用不同的抗原进行缔合和解离测量。使用OCTET软件v.6.1由数据的非线性拟合计算动力学参数(kon和koff)和亲和力(KD)。
方式II：在PBS pH7.4、1mg/ml BSA、0.05％(v/v)吐温(动力学缓冲液)中用生物素化的抗原装载链霉抗生物素蛋白高结合容量(动力学级)生物传感器。在相同的缓冲液中洗涤装载的生物传感器，之后在指示的时刻用抗体和抗原进行缔合和解离测量。使用Octet软件6.1版进行数据分析。
差示扫描量热分析
使用一个MICROCAL VP-DSC扫描微热量计(微量热公司，北安普顿，马萨诸塞州(Microcal,Northampton,MA))进行DSC实验。使用一个0.22微米滤器过滤用于DSC的所有溶液和样品并且在装载到热量计之前进行脱气。用于DSC研究的抗体大于95％是单体的，如通过分析型凝胶过滤色谱所判定。在DSC分析之前，在25mM组氨酸–HCl(pH6)中彻底透析(至少三次缓冲液交换)所有样品。然后将来自这次透析的缓冲液用作参考缓冲液以用于随后的DSC实验。在样品测量之前，获得极限测量值(缓冲液-对-缓冲液)以用于从样品测量值扣除。将透析的样品(浓度为1mg/ml)添加至样品孔(sample well)中并且以1℃/分钟的扫描速率进行DSC测量。使用微量热公司所提供的OriginTMDSC软件进行数据分析和去卷积。使用一个非两状态模型进行去卷积分析并且使用100个迭代循环来获得最佳拟合。对DSC去卷积结果的解释是基于以下事实：寡特异性抗体形式中的不同结构域在具有协作过渡的情况下独立地展开。
肽图
首先使用1mM N-乙基马来酰亚胺将样品中的游离巯基封端。然后在37℃下使样品在5mM磷酸铵氢二钠、100mM氯化钠以及6M胍的pH为7.0的溶液中变性30分钟。然后用pH为7.0的含有0.06mM EDTA的100mM磷酸盐缓冲液将变性溶液稀释2.5倍。以1:10酶:蛋白质比例添加内蛋白酶Lys-C并且在37℃下将反应混合物孵育16小时。以1:10酶:蛋白质比率添加另外的LysC并且在37℃下进一步孵育4小时。在Lys-C消化之后，通过添加DTT至30mM的最终浓度并且在37℃下孵育15分钟使每种反应混合物的还原。反应混合物的另一半在没有还原的情况下制备。消化的肽通过UPLC逆相色谱分析(沃特世ACCQUITY UPLC BEH RP C18柱；1.7微米100×2.1mm)来分离并且通过一个UV检测器和一个线上LTQ ORBITRAP质谱仪(热电公司(ThermoElectron))来分析。RP-UPLC移动相A是含0.02％TFA的水并且移动相B是含0.02％TFA的乙腈；使用增加的缓冲液B梯度洗脱样品。通过比较非还原(含有二硫键结的肽)肽图和还原(含有还原形式的肽)肽图的结果来鉴别和分析肽。基于蛋白质的已知序列，每个肽的序列使用MS(质量)来鉴别并且使用MS/MS(肽质量测序)数据来确认。二硫键结的肽通过MS数据来确认并且还作为仅存在于非还原样品中的肽。
木瓜蛋白酶消化的Q-TOF LC-MS分析
对于木瓜蛋白酶消化来说，将1mg/ml的抗体用0.4微克的木瓜蛋白酶工作溶液来处理并且在37±1℃的水浴中孵育4小时。Q-TOF MS用Q-TOF(四极正交加速飞行时间)类型质谱仪中的一个结合一个沃特世ACQUITY UPLCTM系统来进行。使用含0.1％FA、0.01％TFA的水的移动相A和含0.1％FA、0.01％TFA的乙腈的移动相B在BEH C41.7微米2.1×50mm柱上进行逆相色谱分离。使用增加的移动相B的一个25分钟线性梯度来洗脱样品。基于蛋白质的已知序列，使用MS(质量)数据鉴别Fab和Fc mAb片段。
细胞结合
通过流式细胞术测试单价双特异性IgG1抗体(MBab)和亲本mAb的细胞结合。所使用的细胞系是人表皮样癌A431细胞系、人乳腺癌细胞系SKBR3、人胰腺癌细胞系BxPC-3以及人卵巢癌细胞系SK-OV-3。每个实验中使用了近5×105个细胞。在胰蛋白酶消化之后，用FACS缓冲液(含1％BSA的D-PBS(无Ca++、mg++))将细胞洗涤两次。在4℃下，以10微克/ml将抗体添加至细胞管中，持续1小时。在用FACS缓冲液洗涤两次之后，在4℃下，添加FITC-标记的山羊抗-人，持续45分钟。结合抗体的检测是借助于流式细胞术在一个SLR II(碧迪公司，加利福尼亚州(Becton Dickinson,CA))上进行并且结果用FLOWJO程序来分析。
细胞活力测定
细胞杀伤活性是通过发光法细胞活力测定(普洛麦格公司(Promega))来测量。所使用的细胞系是人上表皮样癌A431细胞系、人乳腺癌细胞系SKBR3、人胰腺癌细胞系BxPC-3以及人卵巢癌细胞系SK-OV-3。在补充10％FCS的DMEM中，以5×103细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板之中。将不同浓度的抗体添加至四个重复样品中，并且在37℃下，在5％CO2氛围中，将细胞孵育96小时。在处理之后，将这些细胞在试剂下暴露20分钟并且使用一个ENVISION板读取器来测量发光。
Fc受体的结合动力学
使用稳态平衡结合测定在ProteOn上测定MBab抗体和人IgG1同型对多种人Fc受体的结合亲和力。将50ug/ml的抗体固定在pH5.0的ProteOn乙酸盐缓冲液中的一个GLC芯片表面上。使分析物以使用相同缓冲液按1:3连续稀释的5个浓度通过固定表面。在室温下进行结合研究并且测定每种分析物的平衡结合率并且将平衡结合率用于计算平衡解离常数(KD)。
ADCC研究
通过CYTOTOX 96非放射性细胞毒性测定(普洛麦格)测量ADCC。这个测定中使用了人上皮样癌A431细胞系。在补充3％FCS、不具有酚红的RPMI1640中，以4×104细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板。以1:1的比例将来自针对人CD16(FcγRIIIA)和FcεRIγ转基因的恶性非霍奇金淋巴瘤的人NK细胞系与靶细胞混合。将不同浓度的抗体添加至四个重复样品之中，并且在37℃下，在5％CO2氛围中，将细胞孵育5小时。在处理之后，将这些细胞在CYTOTOX 96试剂下暴露15分钟并且使用一个SPECTRAMAX 340PC板读取器来测量409nm下的OD。
优先结合研究
对于优先结合研究，产生包含抗-细胞表面抗原C(抗-C)和抗-细胞表面抗原D(抗-D)的MBab(C/D-MBab)。使用一个组合的群体培养系统来测量MBab与表达靶抗原(C和D)两者的细胞的优先结合，该组合的群体培养系统将仅表达抗原C的细胞(C细胞)、表达抗原D的细胞(D细胞)以及表达C和D两者的细胞(C/D细胞)混合在单个孔中以用于抗体染色。简单地说，C和C/D细胞各自用一种独特的识别示踪染料来染色，之后它们组合在培养基中：C细胞用670(eBioscience，目录号65-0840-90)、C/D细胞用CellTraceTM紫(英杰，目录号C34557)，而D细胞不染色。以此方式，可以在抗体染色之后的流式细胞术分析期间区分每个群体。以1:1:1的比例组合细胞并且用C/D-MBab和两个二价亲本IgG(抗-C和抗-D)的连续稀释液孵育细胞。在4℃下将一级抗体孵育进行1小时，将多余的抗体去除并且使用一个PE-标记的抗-人IgG检测细胞结合的抗体。在一个BD LSR II上进行分析，其中双联体基于物理性质(高度、宽度以及密度)来排除。
使用用亚历克萨荧光647(英杰，A30009)标记的重组靶蛋白以及流式细胞术分析来确定每个C/D-MBab臂与同一细胞上的其靶抗原的并行结合。用C/D-MBab(从5-.01nM)的连续稀释液孵育C/D细胞(表达两个靶抗原)，持续1小时，之后用FACS缓冲液(PBS+1％胎牛血清)洗涤两次去除未结合的C/D-MBab。使用PE-标记的抗-人IgG检测细胞结合的C/D-MBab并且可以使用用荧光亚历克萨荧光647微量蛋白标记试剂盒(英杰，A30009)染料标记的重组靶蛋白(C或D)检测未结合的C/D-MBab臂。为了确保在被测量的单个细胞上的并行结合，双联体(一起穿过流式细胞仪的两个或更多个细胞)严格地基于分析中包括的每个细胞的高度、宽度以及密度的物理特性来排除。
实例2：单价双特异性抗体(MBab)设计
图1B中呈现了一个单价双特异性IgG形式(MBab)的示意性表示。MBab是一个双特异性抗体，具有处于IgG形式中的一个单价结合位点用于每个抗原。对于两个相异重链的异二聚化来说，如里奇韦等人(1996)蛋白质工程9(7):617-21中所描述，平台利用CH3结构域中的经典“凸起-进入-孔洞”概念，并且如麦钱特等人(1998)自然生物技术16:677-681中所描述，还利用了一个链间二硫键在CH3结构域中的并入，该并入进一步增强稳定性和两个重链的异二聚化。另外地或可替代地，CH3结构域被工程化来在一个重链上包含氨基酸残基H435和Y436，并且在另一个重链上包含氨基酸残基R435和F436，以便消除一个链上的蛋白A结合。如上文所描述，在使用“凸起-进入-孔洞”平台的情况下，包含“孔洞”的重链可以包含氨基酸残基R435和F436(在图1B中由星形指示)。在图2的左图中所呈现的结构中，CH3结构域的位置由箭头指示。为了单价双特异性抗体中同源重链和轻链的正确配对，将在MBab构建体中的两个抗体的一个的重链与轻链之间形成二硫键的天然链间半胱氨酸去除并且改为将一个替代的链间二硫键插入CL-CH1界面中的其他地方以便支持同源重链和轻链的同二聚化。
实例3：在LC-HC界面中具有替代的半胱氨酸的变体的设计
可以实施若干方法来产生替代的LC-HC界面以便强制执行仅同源重链和轻链的正确配对，这些方法包括重塑MBab构建体中的两个抗体的一个中的链间二硫键。首先，在重链与轻链之间形成二硫键的天然链间半胱氨酸被一个非半胱氨酸氨基酸残基例如缬氨酸替换。接着，三个标准用于鉴别LC-HC界面中适于取代成半胱氨酸的氨基酸对。首先，相应的α碳之间的距离应与天然存在的二硫键中发现的(6.0至)相似。其次，β碳应间隔一定距离(4.0至)指向彼此。第三，残基对应属于不同的链。表7中提供了LC-HC界面中满足这些标准的七对残基。
*表6中的编号是根据如卡巴特等人(具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，美国国家卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))中阐述的EU索引。提供了λ(λ)和κ(κ)链中指示位置的相应残基。将理解，由于群体中存在同种异型和等位基因变异，所以这些位置处的野生型氨基酸残基可以与以上所列不同。无论是否是野生型氨基酸残基，一个给定对的每个位置都将由一个半胱氨酸取代。在此提供了多个同种异型和等位基因变异。
测试了三个变体；HC:A141/LC：F116、HC：H168/LC：T164和HC：F126/LC：S121分别与变体10、11以及12(V10、V11以及V12)对应。在图2的右图中所呈现的结构中，这些位置的定位由箭头指示。
在另一种方法中，一个替代的链间二硫键可以在抗体的可变区中、在VH与VL区之间工程化。具体地说，这种二硫键可以引入到构架区中以使得VL和VH区经由替代的二硫键来连接。在这种方法中，在重链与轻链之间形成二硫键的天然链间半胱氨酸被一个非半胱氨酸氨基酸残基(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸等等)替换并且通常在构架区内的、VH和VL区内的某些非半胱氨酸氨基酸被半胱氨酸替换。这些位置被选择以使得半胱氨酸残基可以形成一个二硫键。表8中提供了VH和VL区内满足这些标准的残基的位置。
表7中的编号是根据如卡巴特等人(具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，美国国家卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))中阐述的卡巴特索引。将理解，在这些位置处的野生型氨基酸残基将发生变化。无论是否是野生型氨基酸残基，一个给定对的每个位置都将由一个半胱氨酸取代。表1提供了根据卡巴特索引的若干代表性可变区的编号。
在仍然另一种方法中，CH1区可以被工程化来产生一个突起和/或一个空腔，而同源轻链被工程化来产生一个补偿空腔和/或突起。为了进一步强制执行仅同源重链和轻链的正确配对，CH1和CL区可以进一步被修饰来去除在重链与轻链之间形成二硫键的天然链间半胱氨酸。
可以产生双特异性抗体，其中仅一个臂的LC-HC界面如上所述被修饰，或可替代地，两个臂均可以被修饰。基于在此的教义将理解，每个臂的LC-HC界面将被不同地修饰以便强制执行同源重链和轻链的正确配对，同时最小化不正确配对。例如，但不是以限制性方式，一个臂可以被修饰来将天然二硫键重新定位至LC和CH1区内的一个不同的位置，并且另一个臂可以被工程化来将天然二硫键重新定位至VL-VH区。或者两个臂可以被修饰来将天然二硫键重新定位至LC和CH1界面内的一个不同的位置，或两个臂可以被修饰来在LC和CH1界面内的不同位置处并入一个空腔和/或突起。
实例4：用于在哺乳动物细胞中产生单价双特异性抗体的pMBab载体系统的发展
质粒pMBab-重和pMBab-轻被设计用于在哺乳动物细胞培养物中产生单价双特异性人IgG1抗体。pMBab-重载体(图3C)含有两个人γ1重链盒以支持HC异二聚化，前一个重链在CH3结构域中携带“孔洞”突变组，而后者在CH3结构域中携带补体“凸起”突变并且在CH1结构域中携带替代的半胱氨酸。分别将VH结构域作为BssHII/NheI和BsrGI/SalI限制性片段引入到pMBab-重载体中的“孔洞”和“突起”HC盒之中。pMBab-轻κ载体(图3A)含有两个人κ轻链(LC)盒，后者在Cκ结构域中携带与CH1结构域中的替代半胱氨酸互补的替代的界面半胱氨酸。分别将Vκ结构域作为BssHII/BsiWI和BsrGI/NotI限制性片段引入到pMBab-轻载体中的LC盒之中。强人巨细胞病毒早期启动子可以驱动两个pMBab载体中的轻链和重链基因。将两个重链和两个轻链放在单独的载体中消除了因单转染而产生任何亲本抗体的风险。另外，可以将具有较高表达水平的一个抗体的重链可变区克隆至包含“凸起”的恒定区盒以最小化半抗体的产生。另外，重链的CH3结构域可以如在此所述被工程化以使得仅一个链结合蛋白A。
实例5：变体的表达、纯化以及分析
变体被瞬时表达在HEK293F细胞中并且在还原和非还原条件下在SDS-PAGE上分析蛋白A亲和色谱之前和之后的培养物上清液。如图4中所示，在分子的抗-RAGE部分的重链与轻链之间形成二硫键的天然链间半胱氨酸的去除在非还原条件下导致了SDS-PAGE上轻链的分离并且产生与2H1L和一个分离的轻链对应的125kDa和25kDa的迁移曲线。对于包括V1和V3变体(其中一个臂缺乏天然链间半胱氨酸(数据未显示))的抗体，观察到一个相似的迁移曲线。蛋白A纯化部分中游离轻链的存在指示了抗体在溶液中适当地组装并且可以纯化为具有2个轻链和两个重链的完整抗体。测试缺乏天然链间半胱氨酸、但携带一个替代的链间二硫键的变体的重新构成150kDa迁移曲线的能力，该迁移曲线指示了替代的链间二硫键的形成以及两个重链对和轻链对的正确组装。虽然变体10和11(V10和V11)证明了150kDa迁移曲线的某种重构以及游离轻链的量的减少，但变体12(V12)证明了150kDa分子标记物的完全重构，具有与在Fab和CH3内的凸起-进入-孔洞中具有天然链间二硫键的WT IgG分子(凸起-进入-孔洞IgG)总体相同的迁移曲线(图4)。变体12(V12)的蛋白A纯化部分在一个分析型尺寸排阻HPLC(SEC-HPLC和SEC多角度光散射(SEC-MALS))上的寡糖状态的分析指示了单体MBab代表约85％，以及约10％的不成对的半IgG和约5％的聚集体(图6B)。在制备性SEC之后，变体12(V12)被纯化至近于均质，具有大于99％的单体以及与亲本抗RAGE和抗IL6mAb总体相似的SEC曲线。
携带Fab的V12的晶体结构被解析出。电子密度证实了新引入的半胱氨酸残基的位置处的重链与轻链之间的一个新二硫键的形成(数据未显示)。
构成MBab分子的4个链的不一致的表达可能导致3种类型的副产物的形成；孔洞-孔洞同二聚体，孔洞-半-IgG以及因轻链中的一个过量所致的LC-错配的副产物。之前已报导了“孔洞-孔洞”同二聚体副产物的形成(里奇韦等人(1996)蛋白质工程9:617-21；麦钱特等人(1998)自然生物技术16:677-681)。已证明，IgG1CH3结构域中His435被来自IgG3的相应的Arg435的取代消除了蛋白A结合能力(吉恩德伯格等人，1997，免疫法杂志201:25-34)。进行Tyr436Phe的另外的取代来通过保持所有人抗体序列来降低免疫原性(吉恩德伯格等人，同上)。为了有效去除“孔洞”相关副产物，将“孔洞”重链的CH3结构域中的残基H435和Y436分别突变为相应的R435和F436，如在IgG3中。所得的携带突变H435R和Y436的hIgG1“孔洞”重链命名为“孔洞-RF”。包含一个抗-抗原A(孔洞重链；λ轻链)和在“孔洞”重链中携带RF突变(标示为“MBab-RF”)的抗-抗原B(凸起重链；κ轻链)的一个MBab构建体被瞬时表达在HEK293F细胞之中。该表达产生了与两个亲本抗体(200至348mg/l)的表达曲线相关的MBab-RF(190mg/l)。蛋白A纯化的部分在非还原和还原条件下的SDS-PAGE分析示出了没有过量的“孔洞”重链，而具有相等分布的“孔洞”和“凸起”重链(图7A，左图，分别是泳道1和2)。蛋白A纯化的MBab-RF的SEC曲线指示了约97.5％的单体和约2.5％的聚集体，其中不存在不成对的半-IgG副产物(图7A，右图)。蛋白A纯化的亲本IgG和MBab-RF在非还原条件下的RP-HPLC的迁移曲线指示了MBab-RF具有在亲本B(14.7分钟)与亲本A(17.4分钟)之间迁移的约16.2分钟的一个洗脱中心(图7B)。这个数据再次证实了MBab-RF包含等量的“孔洞”和“凸起”重链，而不存在过量的“孔洞”重链。MBab-RF的蛋白A纯化部分在还原条件下通过RP-HPLC的寡糖状态的分析指示了抗原B轻链相对于抗原A轻链过量，比例是1.0至0.6，从而导致了约25％的抗原B的κ轻链错配对副产物(图7C)。
为了有效去除错配对的轻链副产物，实施了选择性轻链亲和色谱，如在此所描述使用对λ有选择性的亲和介质来捕获所希望的MBab并且允许去除包含两个κ链的错配对的抗体。如图8中所示，MBab-RF的蛋白A纯化部分在λFabSelect亲和柱上的随后分离导致抗原B轻链错配对副产物的去除，从而产生纯的且正确组装的MBab-RF产物。在还原和非还原条件下的SDS-PAGE分析示出了λFabSelect纯化样品的等量的两个轻链，而流过的蛋白质仅携带cMET轻链(图8A，左侧比较泳道6和7)。λFabSelect纯化的MBab-RF的SEC曲线指示了100％的单体，其中不存在聚集体(图8A，右侧)。MBab-RF的λFabSelect纯化的部分在还原条件下通过RP-HPLC的寡糖状态的分析指示了流过的蛋白质与抗原A轻链错配对副产物对应(图8B)，而洗脱部分中的蛋白质与包含等量的两个轻链的一个纯MBab对应(图8C)。
实例6：通过αLISA的变体双特异性的确定
为了确定两个结合位点的双特异性和并行结合，如实例1中所指示发展了一个αLISA测定。简单地说，两个结合位点与RAGE和IL6抗原的同时结合使供体和受体珠粒密切接近，从而导致一个记录信号。为了定量变体的双特异性水平，通过亲本抗-IL6和抗-RAGE抗体的DNA质粒在单个细胞中的共表达产生了一个参考单价双特异性IgG。轻链和重链的自发配对在理论上应导致总蛋白的12.5％产生为单价双特异性IgG。首先在一个IL6柱并且然后在一个RAGE柱上的顺序亲和色谱导致不涉及工程化的一个纯单价双特异性IgG。用2步骤纯化的单价双特异性获得的αLISA信号用于设置一个100％双特异性的参考(图5)。变体1和3的组合示出了αLISA双特异性测定中超过凸起-进入-孔洞IgG的些微增加，这进一步通过添加单个(-Cys)来增强。IL6V1和RAGEV3(-Cys)的组合示出了αLISA双特异性测定中超过凸起-进入-孔洞IgG的最大增加(图5A)。与SDS-PAGE分析相一致，虽然变体10和11(V10和V11)证明了αLISA双特异性测定中超过凸起-进入-孔洞IgG的适度改进，但变体12(V12)证明了近100％的双特异性(图5b)。
实例7：通过Octet分析的动力学和并行结合
变体12(V12)MBab的双特异性以及与RAGE和IL6抗原的并行结合进一步通过使用以上所述的捕获方式I在一个Octet384上进行生物层干扰测量来表征。以下抗体：变体12MBab、抗-RAGE、抗-IL6以及2步骤纯化的单价双特异性衍生物被捕获在抗-Fc传感器上并且然后测量它们的特异性抗原结合。虽然亲本抗-IL6和抗-RAGE证明了仅与其相对应的抗原的特异性结合，但变体12MBab和2步骤纯化的单价双特异性展现了与RAGE和IL6抗原相同的并行结合曲线(图9)。当测试与RAGE和IL6抗原的结合动力学时，变体12证明了有与亲本抗体对相对应的抗原相同的动力学亲和力(KD)，具有总体相似的kon和koff速率，如图10中所指示。
实例8：HER2/EGFR MBab的产生和分析
为了评价MBab分子的治疗意义并且为了进一步验证平台，产生了具有与两个临床批准的抗体和(西妥昔单抗)相似的结合特征的一个单价双特异性抗体(MBab)(图11A，左图)。与单独每个mAb的效果相比，用和西妥昔单抗的同时治疗可以在人异种移植物中产生效果大得多的肿瘤消退作用(拉博瑞特(Larbouret)等人，(2001)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)13:3356-3362)。在pMBab-重和pMBab-轻载体瞬时共转染在HEK293F细胞中之后，在蛋白A亲和色谱上纯化培养物上清液。在非还原条件下的SDS-PAGE分析示出了大多数抗体正确产生具有2个重链和2个轻链(图11A，右图)。MBab的表达产量(150mg/l)与两个亲本抗体(抗-HER2(200mg/l)和抗-EGFR(90mg/l))的表达曲线相关。蛋白A纯化的MBab的SEC-HPLC曲线指示了约90％的单体、约10％的不成对的半IgG以及小于3％的聚集体。在制备性SEC之后，HER2/EGFR MBab被纯化至近于均质，具有大于99％的单体(图11B)以及与亲本mAb总体相似的SEC曲线(图11C)。SEC-MALS分析指示了MBab的MW值是154.8KD并且抗-EGFR和抗-HER2的值分别是158.5KD和154.0KD。三个抗体的迁移曲线指示了MBab具有在抗-EGFR(9.20分钟)与抗-HER2(9.33分钟)之间迁移的约9.28分钟的一个洗脱中心(图11D)。
实例9：通过Octet分析的并行结合分析
HER2/EGFR MBab的双特异性和与HER2和EGFR抗原的并行结合使用以上所述的方式I通过Octet分析来确定。在一个抗-Fc传感器上捕获之后，Mbab证明了与HER2和EGFR抗原的并行结合曲线，而亲本抗体证明了仅与其相对应的抗原的特异性结合(图12)。
此外，Her2/EGFR MBab的双特异性和与HER2和EGFR抗原的并行结合使用一个替代的捕获方法(以上所述的方式II)通过Octet分析来确定。在链霉抗生物素蛋白高结合容量传感器上捕获生物素化的EGFR或生物素化的HER2之后，Mbab证明了与相应的未标记抗原的并行结合曲线，而亲本抗-HER2和抗-EGRF抗体证明了仅与其相对应的抗原的特异性结合(图13)。
实例10：通过差示扫描量热法的热稳定性分析
使用DSC评定抗-HER2、抗-EGFR、以及HER2/EGFR V12 MBab的热稳定性(图14)。抗-HER2的DSC热谱图示出了具有68.9℃和81.3℃的变性温度(Tm)的两个相异未展开过渡(图14A，左上)。这些过渡分别与CH2和Fab+CH3结构域的变性对应。抗-EGFR的DSC热谱图揭示了四个过渡(图14A，右下)。抗-EGFR的嵌合Fab结构域分别展现了73.5℃和63.1℃的CH1、Cκ和VH以及Vκ结构域的单独Tm值。抗-EGFR的CH2和CH3结构域分别证明了68.4℃和82.1℃的Tm值。HER2/EGFR V12 MBab DSC热谱图的去卷积揭示了4个过渡(图14B，左上)。通过比较HER2/EGFR V12 MBab的未展开过渡温度与亲本抗体的那些，推论出具有60.4℃的Tm的那个峰与抗-EGFR可变区的变性过渡对应。同时，具有73.5℃的Tm的那个峰与抗-EGFR CH1和Cκ结构域的变性过渡对应。在一些情况下，将凸起-进入-孔洞突变并入CH3结构域可以将CH3结构域的Tm从约80.0℃降至约69.0℃。因此，具有69.7℃的Tm的那个峰与CH2和CH3结构域的变性过渡对应。因此，具有80.6℃的Tm的那个峰与抗-HER2 Fab结构域的变性过渡对应。三个叠加的DSC热谱图(图14B，右下)指示了抗-HER2 Fab结构域的变性过渡在约80.0℃的Tm处与HER2/EGFR V12 MBab峰重叠。这指示了工程化至HER2/EGFR V12 MBab的抗-HER2Fab部分中的替代的链间二硫键并未使Fab支架的整体折叠不稳定。总之，热稳定性研究证实HER2/EGFR V12 Mbab展现了与常规IgG抗体相似的展开过渡。
实例11：木瓜蛋白酶消化的QTOF LC-MS定位
木瓜蛋白酶消化的Q-TOF LC-MS结果证实了HER2/EGFR V12 MBab蛋白的期望的Fab区。在10.7分钟洗脱的HER2/EGFR V12 MBab的Fab(B)区被鉴别为LC+抗-HER2(1-224)和LC+抗-HER2(1-227)。保留时间与裂解位点与亲本抗-HER2IgG、抗-HER2 Fab WT以及抗-HER2 V12 Fab样品一致。在11.9分钟洗脱的HER2/EGFR V12 MBab的Fab(A)区被鉴别为LC+抗-EGFR(1-226)。这个裂解位点和保留时间与亲本抗-EGFR IgG的Fab区一致。
实例12：通过流式细胞术的细胞结合
Her2/EGFR V12 MBab与表达不同水平的HER2和EGFR的四个肿瘤细胞系的细胞结合特性通过流式细胞术来测试并且与两个亲本抗体的细胞结合活性相比较。图15中所呈现的结果示出了亲本抗-HER2和抗-EGFR抗体的染色强度与不同肿瘤细胞上的HER2和EGFR抗原的水平对应。然而，MBab始终使在具有不同水平的HER2和EGFR的细胞中实现最高FACS信号的亲本抗体的染色强度最大。
实例13：细胞活力测定
为了评价Her2/EGFR V12 MBab的治疗应用，在体外细胞杀伤实验中测试了分子的效力。在一些情况下，用抗-EGFR和抗-HER2的组合治疗获得的相加或协同治疗活性可以出现在EGFR水平与HER2相似或比它更高的肿瘤中(参见，例如，拉博瑞特等人，(2001)临床癌症研究13:3356-3362)。为了证明这一点，选择了具有不同水平的HER2和EGFR的四个肿瘤细胞系。将MBab的细胞杀伤活性与亲本抗体单独以及两个亲本抗体的组合治疗的细胞杀伤活性相比较。图16中所呈现的结果示出了在表达的EGFR比HER2多约25倍的A431细胞的情况下，Her2/EGFR V12 Mbab证明了与两个亲本mAb的组合相似并且比单独每个mAb的有效活性多得多的一个相加的细胞杀伤活性。在表达约20倍更多的EGFR的BxPc3细胞以及还有表达相对相似水平的两个抗原的SK-OV-3细胞的情况下，观察到了相同的相加杀伤曲线。然而，对于表达的HER2比EGFR大40倍以上的SKBR3细胞来说，用MBab或两个亲本抗体的组合治疗无法获得相加的杀伤效果。MBab的细胞杀伤滴定曲线揭示了在高抗体浓度下，Her2/EGFRV12 MBab赋予相加的细胞杀伤活性至与组合治疗相同的水平以及比单独每个mAb更高的水平，然而，在低抗体浓度下，Her2/EGFRV12 Mbab证明了与组合治疗相比降低的活性(图16C)。这种行为最可能归因于导致缺乏亲合作用的、Her2/EGFR V12 MBab的单价性质。MBab的这种独特特性可能赋予较少的靶标相关毒性。
实例14：Fc受体的结合动力学
为了评定CL-CH1界面中凸起-进入-孔洞突变以及V12突变对与不同人Fc受体的结合的影响，产生了多种MBab构建体并且测量了它们与人Fc受体的结合动力学并且将该结合动力学与相应的亲本IgG1相比较。在ProteOn上通过稳态平衡结合测定确定了解离常数(KD)。这个研究中使用的亲本IgG是：亲本抗-EGFR、抗-HER2以及一个对照hIgG1(NMGC)。针对这个研究产生的MBab构建体包括以下组合：HER2/EGFR、EGFR/EGFR、HER2/HER2、EGFR/NMGC以及NMGC/HER2。表9中总结的KD值揭示了在MBab构建体与它们的相应亲本IgG之间未测试到与Fc受体中任一个的结合动力学差异以及人IgG1同型的报告值。
实例15：抗体-依赖性细胞毒性以及与FcγRIIIa和C1q的结合
维持与FcγRIIIa和C1q的结合的能力可以是一个抗体引出ADCC和CDC的能力的重要指示。在这个实例中，通过ELISA测试了MBab直接与FcγRIIIa和C1q结合并且还测试了其在A431细胞中引出ADCC的能力。图17A中所呈现的结果示出了MBab展现出与FcγRIIIa和C1q的结合。另外，在ADCC研究中，Mbab引出了与两个亲本抗体的组合相似的ADCC活性。单独的亲本抗-HER2示出没有ADCC活性，而西妥昔单单抗抗-EGFR展现出更强大的ADCC活性(图17B)。
实例16：通过对单个细胞上的两个抗原的并行结合引起的优先结合以及改进的选择性
为了证明通过对单个细胞上的两个细胞表面抗原(此处称为抗原C和D)的并行结合所引起的优先结合以及改进的选择性，产生了包含一个抗-C和一个抗-D的一个MBab(标示为C/D-MBab)。C/D-MBab与表达两个靶抗原(C和D)的细胞的优先结合借助于流式细胞术通过在单个孔中以1:1:1的比例混合预染色的细胞群体(仅表达C的细胞(C细胞)、仅表达D的细胞(D细胞)以及表达C和D的细胞(C/D细胞))、接着用亲本IgG或C/D-MBab孵育，来进行分析。如图所示(图20B左图和右图分别所示)，C/D-Mbab证明了与表达两个细胞表面抗原C和D抗原的C/D细胞的优先结合。为了证实与C/D细胞的优先结合是归因于与细胞表面抗原C和D两者的并行二价接合，用荧光亚历克萨荧光647标记的可溶重组C和D蛋白用于追踪C/D-MBab分子的未结合的臂。实质上，如果C/D-MBab单价地结合至细胞表面，那么一个臂将仍保持自由以便结合可溶荧光形式的C或D蛋白，这些蛋白可以通过流式细胞术分析检测(示意性描绘于20A)。研究的关键对照在于使用已知仅表达靶抗原中一个的细胞群体。在这种情况下，结合至表面的任何C/D-MBab仅可以单价地这样做，从而使未结合的臂自由，以便被亚历克萨荧光(Alexa Fluor)647标记的重组蛋白检测。C/D-MBab与不表达D的C细胞的孵育在与亚历克萨荧光(Alexa Fluor)647标记的重组D蛋白孵育之后产生一个浓度依赖性荧光信号，从而指示对于每个结合至细胞表面上的抗原C的C/D-MBab分子来说，抗-D臂自由地结合亚历克萨荧光(Alexa Fluor)标记的重组D蛋白(图20C，左图)。以此相同方式，C/D-MBab与仅表达抗原D而不表达抗原C的D细胞的孵育在添加亚历克萨荧光(Alexa Fluor)647标记的重组C蛋白之后产生一个浓度依赖性荧光信号，从而指示对于每个结合至细胞表面上的抗原D的C/D-MBab分子来说，抗-C臂自由地结合亚历克萨荧光(Alexa Fluor)标记的重组D蛋白(图20C，右图)。然而，在C/D-MBab用C/D细胞孵育时，在添加亚历克萨荧光(Alexa Fluor)标记的重组D蛋白或亚历克萨荧光(Alexa Fluor)标记的重组C蛋白之后，并未观察到荧光信号增加，从而指示两个C/D-MBab臂被并行结合并且两种重组蛋白都不可以结合至细胞抗体复合体，因此，仅观察到一个PE信号(图20C，两个图)。细胞表面上C/D-MBab的量与能够结合的可溶重组蛋白的量之间的关系最终提供了C/D-MBab与细胞表面的并行二价或单价结合的证据。在C/D-Mbab明显结合至细胞表面，但未检测到自由的臂的情况下，可以得出结论：两个臂与它们的靶抗原并行结合。
* * *
在此参考的每个专利、专利申请、出版物以及文件的全文特此通过引用结合在此。以上专利、专利申请、出版物以及文件的引用不是承认前述的任一项是相关的现有技术，它也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。另外，2011年12月20日提交的美国临时专利号61/577,956出于所有目的通过引用以其全部内容结合。
可以对上述内容进行修改而不脱离该技术的基本方面。虽然本技术已经参考一个或多个特定实施例描述了大量的细节，但本领域的普通技术人员将认识到可以对本申请中具体披露的实施例作出改变，然而这些修改和改进是在本技术的精神和范围之内。
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Claims (15)

1.一种双特异性抗体，该抗体包含：
(a)修饰的重链，其中该修饰的重链的CH1区包含(i)天然半胱氨酸至非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)天然非半胱氨酸氨基酸至半胱氨酸氨基酸的取代；以及
(b)修饰的相应轻链，其中该修饰的轻链的CL区包含(i)天然半胱氨酸至非半胱氨酸氨基酸的取代，以及(ii)天然非半胱氨酸氨基酸至半胱氨酸氨基酸的取代，
其中，所述修饰的重链和修饰的相应轻链选自以下变体：
(i)IgG1，包含
a.CH1结构域，其中，第141位氨基酸被取代为半胱氨酸，第220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第116位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(ii)IgG2，包含
a.CH1结构域，其中，第141位氨基酸被取代为半胱氨酸，第131、219和220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第116位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(iii)IgG2，包含
a.CH1结构域，其中，第141位氨基酸被取代为半胱氨酸，第131和220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第116位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(iv)IgG3，包含
a.CH1结构域，其中，第141位氨基酸被取代为半胱氨酸，第131位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第116位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(v)IgG4，包含
a.CH1结构域，其中，第141位氨基酸被取代为半胱氨酸，第131位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第116位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(vi)IgG1，包含
a.CH1结构域，其中，第168位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第164位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(vii)IgG2，包含
a.CH1结构域，其中，第168位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131、219和220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第164位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(viii)IgG2，包含
a.CH1结构域，其中，第168位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131和220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第164位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(ix)IgG3，包含
a.CH1结构域，其中，第168位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第164位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(x)IgG4，包含
a.CH1结构域，其中，第168位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第164位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(xi)IgG1，包含
a.CH1结构域，其中，第126位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第121位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(xii)IgG2，包含
a.CH1结构域，其中，第126位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131、219和220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第121位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(xiii)IgG2，包含
a.CH1结构域，其中，第126位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131和220位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第121位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(xiv)IgG3，包含
a.CH1结构域，其中，第126位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第121位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
(xv)IgG4，包含
a.CH1结构域，其中，第126位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第131位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
b.CL结构域，其中，第121位的氨基酸被取代为半胱氨酸，第214位的半胱氨酸被取代为非半胱氨酸氨基酸；
其中编号是按照EU索引。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，该抗体包含第二重链和第二相应轻链，其中
(a)该第二重链和该第二相应轻链不包含天然非半胱氨酸氨基酸至半胱氨酸氨基酸的取代，且不包含天然半胱氨酸至非半胱氨酸氨基酸的取代；
(b)两个轻链各自包含VL结构域和CL结构域，其中这些VL结构域具有不同的氨基酸序列并且这些CL结构域具有不同的氨基酸序列；和/或
(c)两个重链各自包含VH结构域、CH1结构域以及Fc区，其中这些VH结构域具有不同的氨基酸序列，这些CH1结构域具有不同的氨基酸序列，并且这些Fc区具有不同的氨基酸序列；
可选的，其中一个轻链是κ轻链，一个轻链是λ轻链。
3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其中两个重链形成异二聚体。
4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗体特异性地结合至两个独立的抗原或同一抗原上的两个独立的表位。
5.如权利要求2至4中任一项所述的双特异性抗体，其中任一个或两个重链的Fc区包含一个或多个修饰，可选的，所述修饰促进这些重链的异二聚化。
6.如权利要求5所述的双特异性抗体，其中所述Fc区包含第一重链和第二重链，第一重链和第二重链CH3区的修饰选自以下配对：
(i)T366Y和Y407T；
(ii)T366W和Y407A；
(iii)T366Y和Y407T
(iv)T394W和F405A；
(v)T366Y/F405A和T394W/Y407T；
(vi)T366W/F405W和T394S/Y407A；
(vii)F405W和T394S；
(viii)D399C和K392C；
(ix)T366W和T366S/L368A/Y407V；
(x)T366W/D399C和T366S/L368A/K392C/Y407V；
(xi)T366W/K392C和T366S/D399C/L368A/Y407V；
(xii)S354C/T366W和Y349C/T366S/L368A/Y/407V；
(xiii)Y349C/T366W和S354C/T366S/L368A/Y407V；
(xiv)E356C/T366W和Y349C/T366S/L368A/Y407V；
(xv)Y349C/T366W和Y349C/T366S/L368A/Y407V；
(xvi)E356C/T366W和Y349C/T366S/L368A/Y407V；
(xvii)Y349C/T366W和E357C/T366S/L368A/Y407V；
(xviii)K370E/D399K/K439D和D356K/E357K/K409D；
(xix)K409D和D399K；
(xx)K409E和D399K；
(xxi)K409E和D399R；
(xxii)K409D和D399R；
(xxiii)D339K和E356K；
(xxiv)D399K/E356K和K409D/K392D；
(xxv)D399K/E356K和K409D/K439D；
(xxvi)D399K/E357K和K409D/K370D；
(xxvii)D399K/E356K/E357K和K409D/K392D/K370D；
(xxviii)D399K/E357K和K409D/K392D；
(xxix)K392D/K409D和D399K；和
(xxx)K409D/K360D和D399K。
7.如权利要求5所述的双特异性抗体，其中重链之一或两条重链的Fc区包含改变蛋白A结合并且仅存在于一个重链中的一个或多个修饰，其中：
(a)该抗体是IgG1、IgG2或IgG4，并且Fc区中的改变蛋白A结合的修饰是氨基酸取代H435R/Y436F；或者
(b)该抗体是IgG3并且在该Fc区中的改变蛋白A结合的修饰是氨基酸取代R435H/F436Y；
其中编号是根据EU索引。
8.如权利要求5所述的双特异性抗体，其中
(a)修饰的重链Fc区包含氨基酸取代T366W，并且第二重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A；或者
(b)修饰的重链Fc区包含氨基酸取代Y407V/T366S/L368A，并且第二重链Fc区包含氨基酸取代T366W；
其中编号是根据EU索引。
9.如权利要求8所述的双特异性抗体，其中
(a)该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C；或者
(b)该修饰的重链Fc区进一步包含氨基酸取代Y349C，并且该第二重链Fc区进一步包含氨基酸取代S354C；
其中编号是根据EU索引。
10.如权利要求5所述的双特异性抗体，该抗体在Fc区中进一步包含改变该抗体的半衰期的修饰，其中所述半衰期取决于FcRn结合亲和力，和/或Fc区中进一步包含改变效应子功能的修饰，其中对Fcγ受体或C1q补体蛋白的结合亲和力增大或减小。
11.一种组合物，该组合物包含如以上权利要求中任一项所述的双特异性抗体以及赋形剂。
12.一种分离的核酸，包含编码权利要求1-10中任一项所述修饰的相应轻链多肽的核苷酸序列和编码权利要求2-10中任一项所述第二相应轻链的核苷酸序列，该分离的核酸是表达载体。
13.一种分离的核酸，包含编码权利要求1-10中任一项所述修饰的重链多肽的核苷酸序列和编码权利要求2-10中任一项所述第二重链的核苷酸序列，该分离的核酸是表达载体。
14.一种包含如权利要求12或13所述核酸的细胞。
15.一种表达双特异性抗体的方法，该方法包括使包含如权利要求12所述的核酸以及如权利要求13所述的核酸的多个细胞与表达多肽的条件相接触。
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