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KR102390246B1 - 항체의 시험관내 글리코조작에 있어서의 효소의 재사용 - Google Patents

항체의 시험관내 글리코조작에 있어서의 효소의 재사용 Download PDF

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폰 로만 마티아스 프라이허
하이코 발흐
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원에서 보고되는 것은 Fc-영역에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 제조/생산 방법으로서, Fc-영역에서 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소와 함께 Fc-영역의 글리코실화를 정의된 형태로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계, 하나 이상의 크로마토그래피 단계에서 Fc-영역에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소로부터 분리하고 그에 의해 Fc-영역에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체 및 하나 이상의 재순환된 효소를 생산하는 단계, 인큐베이션 단계를 하나 이상의 재순환된 효소로 적어도 한 번 방법하는 단계를 포함하는 방법이다.

Description

항체의 시험관내 글리코조작에 있어서의 효소의 재사용
본 발명은 항체 조작 분야에 속한다. 더욱 상세하게는, 항체의 Fc-영역에서의 글리코실화의 시험관내 글리코조작 방법으로서, 사용된 효소가 회수되고 재사용되는 방법이 본원에서 보고된다.
IgG 는 가장 풍부한 항체 동형이며, IgG1 항체는 가장 유의한 정도 및 배열의 효과기 기능을 나타내는 서브클래스이다. IgG1 항체는 ADCC 및 CDC 가 종종 중요하게 여겨지는 면역요법에서 가장 흔히 사용되는 항체이다. 항체의 구조 내에서, CH2 도메인 뿐만 아니라 IgG 힌지 영역은 Fc 매개되는 항체 효과기 기능에서 주요한 역할을 한다. 각각의 CH2 도메인은 대략 위치 297 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 에 위치하는 아스파라긴 잔기에서 보존된 글리코실화 부위를 포함하며, 이 위치에서 글리칸 모이어티는 공유 결합되어 있다 (Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32). 성숙한 IgG 분자에서, 글리칸은 CH2 도메인 사이에 묻혀 있으며, IgG 분자의 삼차 구조에 영향을 미친다.
항체의 Fc-영역의 글리칸은 주로 고도 이종성 복합 바이안테너리 구조이다. 추가의 비-보존된 글리코실화 부위가 항체의 Fab 영역에 존재할 수 있지만, 그것의 효과기 기능에 대한 항체 글리코실화의 영향은 Fc-영역 글리코실화에 기인한 것이었다.
항체의 Fc-영역에 존재하는 N-연결된 글리칸은 항체가 효과기 기능 예컨대 ADCC 을 매개하는데 필수적인 것으로 알려져 있다 (Lively, M.R. et al. Glycobiol. 8 (1995) 813-822; Jefferis R. et al. Immunol ReV. 163 (1998) 59-76). N-연결된 글리칸의 조성은 IgG 분자의 Fc-영역의 구조에 영향을 미치고 그에 의해 항체 효과기 기능 예컨대 Fc-수용체 결합, ADCC 활성 및 CDC 활성을 변경하는 것으로 밝혀졌다 (Presta, L., Curr. Opin. Struct. Biol. 13 (2003) 519-525).
재조합 발현 시스템에서, 예를 들어 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서의 발현에 의해, 발현되는 IgG 항체 내에서 N-연결된 글리칸 구조는 개별 항체 분자 사이에서 다르다. 그러므로, 재조합 발현 시스템에서 생산되는 항체는 "항체의 집단" (본원에서 추가로 사용되는 용어) 으로 여겨질 수 있으며, 항체는 그들의 아미노산 서열에서 동일하지만 그들의 Fc-영역의 N-연결된 글리칸 패턴에 관해 이종성을 나타낸다.
Fc-영역 글리칸의 조성은 재조합 항체의 발현에 사용되는 상이한 숙주 세포 종 사이에서 다른 것으로 알려져 있다. 항체의 재조합 발현을 위해 두 가지 흔히 사용되는 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) 및 마우스 골수종 세포 (예를 들어 sp2/0, P3X63Ag8.653, NSO) 이다. CHO 세포는 말단 시알산 잔기가 실질적으로 없으며, 한편 글리칸 패턴의 주요 부분이 푸코실화되어 있는 재조합 항체를 발현한다. 대조적으로, 마우스 골수종 세포는 ~ 50 % (상대 빈도) 의 시알산 잔기를 갖지만 더 적은 푸코오스 잔기를 갖는 항체 집단을 생성한다.
글리칸 구조의 말단 잔기의 일부는 IgG 효과기 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 말단 푸코오스 잔기의 존재는 감소된 FcgammaRllla 결합 및 감소된 ADCC 에 기여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 말단 푸코오스 잔기를 결여하는 항체 ("아푸코실화된" 항체) 는 항체 집단에 의해 매개되는 ADCC 의 증가와 관련된다. ADCC 매개의 개선에 대한 아푸코실화의 영향은 당해 기술분야에서 널리 받아들여져 왔지만, ADCC 매개에 있어서의 Fc-영역 갈락토실화의 역할은 논란이 되게 보고된다. 여러 연구는 갈락토실화가 ADCC 에 대해 효과를 갖지 않는다고 시사한다 (Boyd, P.N., et al. Mol Immunol. 32 (1995) 1311-1318; Hodoniczky, J., et al. Biotechnol. Prog. 21 (2005) 1644-1652; Raju, T.S., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 471-478); 반면에 다른 연구는 IgG 의 갈락토실화가 FcgammaRllla 결합을 증가시킨다고 보고한다 (Houde, D., et al., Mol. Cell. Proteom. 9 (2010) 1716-1728; Kumpel, B.M., et al., Hum. Antibod. Hybridom. 6 (1995) 82-88; Thomann, M., et al., Mol. Immunol. 73 (2016) 69-75).
현재, 항체에 의해 매개되는 ADCC 를 개선하기 위한 IgG 분자의 조작은 IgG 분자의 푸코실화를 조정하는데 초점을 맞춘다. 재조합적으로 발현된 IgG 의 아푸코실화는 유전자 조작된 숙주 세포, 예를 들어 단백질 푸코실화가 결핍된 Lecl3 CHO 세포 또는 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 (FUT8) 유전자가 녹아웃된 CHO 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다.
그러나, 현재의 발현 시스템, 예를 들어 CHO 세포에 의해 생성되는 항체는, 이종 글리칸 패턴을 보이며, 생성된 항체의 상이한 뱃치 내에서 구별되는 글리칸 종의 분포에서 변이를 초래한다. 그러므로, 재조합 IgG 항체의 효과기 기능의 맞춤조정, 특히 치료적 항체에 의해 매개되는 ADCC 의 개선 수단의 제공에 대한 필요가 여전히 존재한다.
WO 2011/012297 에서 정의된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 생산 방법으로서, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 함유하는 친화도 크로마토그래피 칼럼 용출액을 제공하는 단계, 친화도 크로마토그래피 칼럼 용출액을 식물 기원의, 예를 들어 생 커피콩 (EC 3.2.1.22) 으로부터의 (a1,3)갈락토시다아제와 함께 인큐베이션하는 단계, 인큐베이션된 친화도 크로마토그래피 칼럼 용출액을 단백질 A 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계 및 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 단백질 A 크로마토그래피 물질로부터 회수하고 그에 의해 정의된 당구조를 갖는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편을 생성하는 단계를 포함하는 방법이 보고된다.
WO 2015/123754 에서 친화도 리간드 결합된 이종 글리코형 항체 샘플을 치료적 사용을 위한 실질적 동종 단일 요망되는 글리코형 항체 샘플로 재구조화하기 위한 효소적 방법 및 그 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다. 친화도 리간드 결합된 항체의 Fc 영역을 이종 글리코형으로부터 실질적 동종 단일 글리코형으로 효소적으로 변경하기 위한 방법은 하기 단계를 포함한다: 친화도 리간드 결합된 이종 글리코형 항체를 Fc 영역의 글리코형을 실질적 동종 단일 형태로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 특정 글리코형 변형을 위해 디자인된 반응 완충제와 접촉시키는 단계; 임의로 하나 이상의 뉴클레오티드 당 및/또는 보조인자를 첨가하는 단계; 및 실질적 동종 단일 글리코형 항체 샘플을 상기 친화도 리간드로부터 방출하는 단계. 본 발명은 또한 암 및 면역 장애의 치료를 위해 효소적으로 생산된 단일 글리코형 mAbs 및 폴리클로날 항체를 포함하는 생물약제 뿐만 아니라 단일 글리코형 항체를 생물약제로서 포함하는 조성물을 망라한다.
WO 2016/037947 에서 IgG1 동형의 갈락토조작된 재조합 항체, 상기 항체의 생산 방법 및 그의 용도가 보고된다.
본원에서 보고되는 것은 항체의, 하나의 구현예에서 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체의 시험관내 글리코조작 방법으로서, 사용된 효소(들)이 항체의 변형 후에 회수되고 재사용을 위해 조건화되는 방법이다. 본원에서 보고되는 방법은, 특히, 항체의 변형을 위한 개선된 방법, 특히 더욱 경제적인 방법이다.
본원에서 보고되는 방법으로 항체의 글리코실화의 변형에 사용되는 효소는 항체 제제로부터 제거되어 개선된 제제를 초래할 수 있다.
본원에서 보고되는 방법은 선행 업스트림 생산 공정 단계에 대한 변형의 필요 없이 임의의 모노클로날 항체의 변형에 유용하다. 본원에서 보고되는 방법은 기존 공정에 통합될 수 있다. 본질적으로 기존 항체 생산 세포주에 대한 유의한 변화가 요구되지 않으며, 그 이유는 다운스트림 가공 동안 본원에서 보고되는 방법에 의해 당구조 변형이 제공되기 때문이다.
효소적 활성의 해로운 상실 없이 동일한 반응을 위해 재조건화된 효소의 재사용을 허용하는 형태로 항체의 글리코실화의 변형을 위해 사용된 효소를 회수하는 것이 가능하다는 것이 발견되었다. 놀랍게도 효소적 활성 및 전환 효율의 유의한 상실 없이 효소가 적어도 한 번 재사용될 수 있다는 것이 발견되었다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 N-글리코실화 부위에서 변형된 (실질적 동종) 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 제조/생산 방법으로서, 글리코실화의 변형 후에 항체로부터 효소적 변형에 이용된 효소(들)의 분리 및 적어도 한 번의 효소의 재사용 (동일한 효소적 제조/생산 공정에서) 을 포함하는 방법이다.
하나의 구현예에서 분리는 크로마토그래피에 의해 수행된다. 하나의 구현예에서 크로마토그래피 단계는 친화도 크로마토그래피 단계 또는/및 양이온 교환 크로마토그래피 단계이다. 하나의 구현예에서 친화도 크로마토그래피 단계는 단백질 A 친화도 크로마토그래피 단계 또는 항체 경쇄 친화도 리간드를 사용하는 친화도 크로마토그래피이다. 하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 강 (strong) 양이온 교환 크로마토그래피 단계이다. 하나의 구현예에서 강 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 술포프로필 양이온 교환 기를 갖는 가교된 아가로오스 (SP-세파로오스) 의 매트릭스를 갖는다.
하나의 구현예에서 분리는 두 개의 크로마토그래피 단계에 의해 수행되며, 제 1 단계는 친화도 크로마토그래피 단계이고 제 2 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 단계이며, 친화도 크로마토그래피 단계는 단백질 A 친화도 크로마토그래피 단계 또는 항체 경쇄 친화도 리간드를 사용하는 친화도 크로마토그래피이고, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 단계이며, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 술포프로필 양이온 교환 기를 갖는 가교된 아가로오스 (SP-세파로오스) 의 매트릭스를 갖는다.
하나의 구현예에서 효소적 변형에서 항체는 용액에 있거나 또는 효소적 변형 동안 항체 (경쇄) 친화도 리간드에 결합된다. 하나의 구현예에서 효소적 변형은 용액에서 수행된다.
본원에서 보고되는 방법의 하나의 구현예에서 모노클로날 항체는 용액에서 하나 이상의 글리코실화 변형 효소와의 인큐베이션에 의해 변형되어 N-글리코실화 부위에서 변형된 당구조를 갖는 모노클로날 항체 제제를 생산하며, 인큐베이션 후에 항체 및 하나 이상의 효소는 친화도 크로마토그래피 또는/및 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리되고, 효소는 그 후 동일한 반응에서 적어도 한 번 재사용된다.
본원에서 보고되는 방법의 하나의 구현예에서 모노클로날 항체는 효소적 칼럼 상에서의 변형 동안 친화도 리간드, 특히 항체 경쇄 친화도 리간드에 결합되어 N-글리코실화 부위에서 변형된 당구조를 갖는 모노클로날 항체 제제를 생산하며, 반응 후에 효소는 항체로부터 분리되고 동일한 반응에서 적어도 한 번 재사용된다.
따라서, 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 N-글리코실화 부위에서 변형된 (실질적 동종) 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 제조/생산 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) N-글리코실화 부위에서 (비-변형된) 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소와 함께 N-글리코실화 부위를 정의된 (실질적 동종) 형태 (동종 글리코실화) 로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
b) N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소로부터 분리하고 그에 의해 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체 및 하나 이상의 재순환된 효소를 생산하는 단계, 및
c) 단계 a) 를 단계 b) 의 하나 이상의 재순환된 효소로 적어도 한 번 반복하는 단계.
하나의 구현예에서 인큐베이션은 용액에서 또는 항체 (경쇄) 친화도 리간드에 결합된 항체로 수행된다. 하나의 구현예에서 인큐베이션은 용액에서 수행된다.
놀랍게도 항체 경쇄 친화도 리간드 결합된 항체는 항체가 용액에 있는 경우처럼 효과적으로 효소적으로 변형될 수 있다는 것이 발견되었다.
따라서, 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 N-글리코실화 부위에서 변형된 (실질적 동종) 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 제조/생산 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 용액에서 N-글리코실화 부위에서 (비-변형된) 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소와 함께 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 정의된 (실질적 동종) 형태 (동종 글리코실화) 로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
b) 하나 이상의 크로마토그래피 단계에서 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소로부터 분리하고 그에 의해 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체 및 하나 이상의 재순환된 효소를 생산하는 단계, 및
c) 단계 a) 를 단계 b) 의 하나 이상의 재순환된 효소로 적어도 한 번 반복하는 단계.
따라서, 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 N-글리코실화 부위에서 변형된 (실질적 동종) 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 제조/생산 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 용액에서 N-글리코실화 부위에서 (비-변형된) 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소와 함께 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 정의된 (실질적 동종) 형태 (동종 글리코실화) 로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
b) N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소로부터 양이온 교환 크로마토그래피에서 분리하고, 그에 의해 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체 및 하나 이상의 재순환된 효소를 생산하는 단계, 및
c) 단계 a) 를 단계 b) 의 하나 이상의 재순환된 효소로 적어도 한 번 반복하는 단계.
따라서, 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 N-글리코실화 부위에서 변형된 (실질적 동종) 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 제조/생산 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 용액에서 N-글리코실화 부위에서 (비-변형된) 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소와 함께 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 정의된 (실질적 동종) 형태 (동종 글리코실화) 로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
b) N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 효소로부터 친화도 크로마토그래피에서 분리하고 그에 의해 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체 및 하나 이상의 재순환된 효소를 생산하는 단계, 및
c) 단계 a) 를 단계 b) 의 하나 이상의 재순환된 효소로 적어도 한 번 반복하는 단계.
따라서, 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 N-글리코실화 부위에서 변형된 (실질적 동종) 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 제조/생산 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 용액에서 N-글리코실화 부위에서 (비-변형된) 글리코실화를 갖는 항체 둘 이상의 효소와 함께 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 정의된 (실질적 동종) 형태 (동종 글리코실화) 로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
b) N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 둘 이상의 효소로부터 친화도 크로마토그래피에서 분리하고 그에 의해 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 단계,
c) 단계 b) 에서 항체로부터 분리된 둘 이상의 효소를 양이온 교환 크로마토그래피에서 분리하는 단계, 및
d) 단계 a) 를 단계 c) 의 둘 이상의 분리된 효소로 적어도 한 번 반복하는 단계.
하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 술포프로필 양이온 교환 기를 갖는 가교된 아가로오스 (SP-세파로오스) 의 매트릭스를 갖는다. 상기 방법은 가교된 폴리(스티렌 디비닐벤젠)의 매트릭스로는 효과가 없다는 것이 발견되었다.
하나의 구현예에서 하나 이상의 효소는 하나의 효소이다. 하나의 구현예에서 하나의 효소는 갈락토실트랜스퍼라아제 또는 시알릴트랜스퍼라아제이다.
하나의 구현예에서 둘 이상의 효소는 두 개의 효소이다. 하나의 구현예에서 둘 이상의 효소는 갈락토실트랜스퍼라아제 및 시알릴트랜스퍼라아제이다.
하나의 구현예에서 갈락토실트랜스퍼라아제는 β4GalT1 이다.
하나의 구현예에서 시알릴트랜스퍼라아제는 ST6 이다.
하나의 구현예에서 시알릴트랜스퍼라아제는 ST6Gal1 또는 ST6Gal2 이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 N-글리코실화 부위는 Fab 또는 Fc-영역에 있다.
하나의 구현예에서 양이온 교환 크로마토그래피는 하기 단계를 포함한다:
i) 갈락토실트랜스퍼라아제 및/또는 시알릴트랜스퍼라아제를 포함하는 용액 및 변형된 N-글리코실화 부위를 갖는 항체를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
ii) (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 임의로 세척하는 (그에 따라 미결합 화합물을 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 제거하는) 단계,
iii) 제 1 용액을 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 갈락토실트랜스퍼라아제 (존재하는 경우) 를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하는 단계,
iv) 제 2 용액을 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 변형된 N-글리코실화 부위를 갖는 항체를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하는 단계, 및
v) 선형 기울기를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 시알릴트랜스퍼라아제 (존재하는 경우) 를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하는 단계.
하나의 구현예에서 단계 i) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 i) 의 용액은 약 50 mM MES 를 포함하고 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서 단계 ii) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 ii) 의 용액은 약 50 mM MES 를 포함하고 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서 단계 iii) 의 용액은 pH 6.6 내지 pH 8.0 의 pH 값을 갖는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 iii) 의 용액은 약 40 mM TRIS 를 포함하고 약 pH 7.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서 단계 iv) 의 용액은 약 75 mM 내지 약 125 mM 염화 나트륨 (NaCl) 을 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 iv) 의 용액은 약 30 mM MES, 약 90 mM NaCl 을 포함하고 약 pH 5.6 의 pH 값을 갖는다.
pH 7.4 로부터 pH 6 미만, 예를 들어 pH 5.6 으로 pH 값의 감소는, 응집된 갈락토실트랜스퍼라아제의 용출을 초래한다는 것이 발견되었다.
하나의 구현예에서 선형 기울기는 단계 iv) 의 용액으로부터, 약 750 mM 내지 약 1250 mM 염화 나트륨 (NaCl) 을 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액으로이다. 하나의 구현예에서 선형 기울기는 단계 iv) 의 용액으로부터, 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는 약 50 mM MES, 약 1000 mM NaCl 을 포함하는 용액으로이다.
하나의 구현예에서 반복은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 번 수행된다. 하나의 구현예에서 반복은 1 내지 5 번 수행된다. 하나의 구현예에서 반복은 1 내지 3 번 수행된다.
하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 항체의 N-글리코실화 부위에서의 글리코실화의 (실질적 동종 글리코실화로의) 효소적 변형 방법에서 항체는 효소적 변형 동안 항체 경쇄 친화도 리간드에 결합된다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 방법은 하기 단계를 포함한다:
- N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 갖는 항체 경쇄 친화도 리간드-결합된 모노클로날 항체를 하나 이상의 효소와 함께 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 정의된 (실질적 동종) 형태 (동종 글리코실화) 로 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계.
모든 양상의 하나의 구현예에서 방법은 인큐베이션 단계에 앞서 하기 단계를 포함한다:
- N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 갖는 모노클로날 항체를 항체 경쇄 친화도 리간드에 결합하는 단계,
및 인큐베이션 단계 후에
- N-글리코실화 부위에서 정의된 (실질적 동종) 글리코실화를 갖는 항체를 경쇄 친화도 리간드로부터 방출하는 단계.
모든 양상의 하나의 구현예에서 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
- N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 갖는 항체를 포함하는 (완충) 용액을 고체 상 (항체 경쇄 친화도 리간드 크로마토그래피 물질) 에 결합된 항체 경쇄 친화도 리간드에 적용하여 항체가 리간드에 결합되는 (리간드-결합된 항체를 초래하는) 단계,
- 임의로 고체 상을 완충 용액으로 세척하는 단계,
- 하기에 의해 항체의 N-글리코실화 부위에서의 글리코실화를 효소적으로 변형하는 단계
- 제 1 글리코실화 변형 효소 (및 제 1 활성화된 당 잔기) 를 포함하는 제 1 (완충) 용액을 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 리간드-결합된 항체에 적용하고, 임의로 변형된 리간드-결합된 항체를 세척하고, 제 2 글리코실화 변형 효소 (및 제 2 활성화된 당) 를 포함하는 제 2 (완충) 용액을 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 변형된 리간드-결합된 항체에 적용하고, 임의로 변형된 리간드-결합된 항체를 두 번 세척하는 단계,
또는
- 제 1 글리코실화 변형 효소 (및 제 1 활성화된 당) 를 포함하는 제 1 (완충) 용액을 적어도 부분적 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 리간드-결합된 항체에 적용하고, 정의된 시간 후에 제 2 글리코실화 변형 효소 (및 제 2 활성화된 당) 를 포함하는 제 2 (완충) 용액을 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 변형된 리간드-결합된 항체에 적용하고, 임의로 변형된 리간드-결합된 항체를 두 번 세척하는 단계,
또는
- 제 1 및 제 2 글리코실화 변형 효소 (및 제 1 및 제 2 활성화된 당) 를 포함하는 (완충) 용액을 리간드-결합된 항체의 효소적 변형에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 적용하고, 임의로 변형된 리간드-결합된 항체를 세척하는 단계,
- N-글리코실화 부위에서 정의된 글리코실화를 갖는 항체를 항체 경쇄 친화도 리간드로부터 방출하는 단계.
본원에서 보고되는 방법에서 사용되는 항체는 Fab 단편, 단일 사슬 항체, 다중특이적 항체 및 항체 융합체를 포함하는 임의의 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
따라서, 본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 항체는 항체 Fab 단편, 전장 항체, 이가 단일특이적 항체, 이중특이적 항체, 이가 이중특이적 항체, 삼가 이중특이적 항체, 사가 이중특이적 항체, 삼가 삼중특이적 항체, 및 사가 사중특이적 항체로 이루어지는 항체의 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 항체는 이가 단일특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 항체는 이가 또는 삼가 또는 사가 이중특이적 항체이다.
하나의 구현예에서 항체는 키메라 또는 인간화된 또는 인간 항체이다.
하나의 구현예에서 항체는 폴리클로날 항체 제제이다.
하나의 구현예에서 항체는 모노클로날 항체이다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 항체 (제제) 는 인간 IgG 클래스의 항체 (제제) 이다. 하나의 구현예에서 항체는 인간 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 항체이다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 정의된 글리코실화는 G2 글리코형, G0 글리코형, M3 글리코형, S2 글리코형, A2B 글리코형, A2BG2 글리코형 및 S1 글리코형으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 글리코실화이다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 정의된 글리코실화는 말단 당으로서의 갈락토오스, 말단 당으로서의 GlcNAc, 말단 당으로서의 만노오스 및 말단 당으로서의 시알산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 글리코실화이다.
하나의 구현예에서 항체는 재조합적으로 생산된 항체이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 본원에서 보고되는 방법으로 생산된 항체이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 본원에서 보고되는 방법에 의해 생산된 정의된 글리코실화를 갖는 항체를 포함하는 약학적 제형이다.
본 발명의 또다른 양상은 하기 단계를 포함하는, N-글리코실화 부위에서 정의된 글리코실화를 갖는 항체 또는 그의 단편의 재조합 생산 방법이다:
a) 항체 (IgG1 동형의 항체) 또는 그의 단편을 항체 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 (포유류 또는 CHO) 세포에서 재조합적으로 생산하여, N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 갖는 항체 또는 그의 단편을 수득하는 단계,
b) N-글리코실화 부위에서 이종 글리코실화를 갖는 항체 또는 그의 단편을 단리 (회수 및 임의로 정제) 하는 단계,
c) N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 갖는 항체 또는 그의 단편을 갈락토실트랜스퍼라아제 및/또는 시알릴 트랜스퍼라아제로 효소적으로 변형하여, 적어도 70 % 상대량의 N-글리코실화 부위에서 바이-갈락토실화된 항체 (G2F 글리코형) 를 포함하는 (여기에서 100 % 는 G0F, G1F 및 G2F 글리코형의 양에 상응함) N-글리코실화 부위에서 정의된 글리코실화를 갖는 항체 또는 그의 단편을 수득하고, 후속적으로 본원에서 보고되는 방법으로 효소(들)로부터 변형된 항체를 분리하는 단계,
d) 변형된 항체 또는 그의 단편을 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해 임의로 정제하고,
그에 의해 N-글리코실화 부위에서 정의된 글리코실화를 갖는 항체 또는 그의 단편을 생산하는 단계.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 제 1 글리코실화 변형 효소는 갈락토실트랜스퍼라아제이다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 제 1 글리코실화 변형 효소는 갈락토실트랜스퍼라아제 및 제 2 글리코실화 변형 효소는 시알릴트랜스퍼라아제이다.
하나의 구현예에서 갈락토실트랜스퍼라아제는 β4GalT1 이다.
하나의 구현예에서 시알릴트랜스퍼라아제는 ST6 이다.
하나의 구현예에서 시알릴트랜스퍼라아제는 ST6Gal1 또는 ST6Gal2 이다.
하나의 구현예에서 (제 1) 완충 용액은 UDP-Gal 를 포함한다.
하나의 구현예에서 (제 2) 완충 용액은 CMP-NANA 를 포함한다.
하나의 구현예에서 인큐베이션은 실온 (20 - 25 ℃, 바람직하게는 약 22 ℃) 에서 수행된다.
하나의 구현예에서 인큐베이션은 25 ℃ 에서 수행된다.
하나의 구현예에서 인큐베이션은 37 ℃ 에서 수행된다.
하나의 구현예에서 인큐베이션은 7 내지 48 시간 동안 수행된다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 용액은 크로마토그래피 정제된 항체를 포함하고, (제 1) 글리코실화 변형 효소는 GalT1 이고, (제 1) 글리코실화 변형 효소와의 인큐베이션은 24 시간 동안 20-27 ℃ 또는 37 ℃ 에서 수행된다. 하나의 구현예에서 인큐베이션은 실온 (약 22 ℃) 에서 수행된다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 용액은 크로마토그래피 정제된 항체를 포함하고, (제 2) 글리코실화 변형 효소는 ST6 이고, (제 2) 글리코실화 변형 효소와의 인큐베이션은 24 시간 동안 20-27℃ 또는 37 ℃ 에서 수행된다. 하나의 구현예에서 인큐베이션은 실온 (약 22 ℃) 에서 수행된다.
본원에서 보고되는 모든 양상의 하나의 구현예에서 용액은 항체를 포함하는 완충되는, 무세포 배양 상청액이고, 제 1 글리코실화 변형 효소는 GalT1 이고, 제 2 글리코실화 변형 효소는 ST6 이고, 제 2 글리코실화 변형 효소는 제 1 글리코실화 변형 효소 후에 6 내지 24 시간, 바람직하게는 24 시간에 첨가되고, 총 인큐베이션 시간은 20-27℃ 또는 37 ℃ 에서 24 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 30 시간이다. 하나의 구현예에서 인큐베이션은 실온 (약 22 ℃) 에서 수행된다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 하기 순서로 포함하는 항체 생산 방법이다:
- 적어도 항체 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
- N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 갖는 항체 또는 그의 단편 (단편은 다음 단계 중 하나에서 사용되는 항체 경쇄 친화도 크로마토그래피 물질에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 적어도 하나의 경쇄를 포함한다) 의 발현에 적합한 조건 하에 세포를 배양하는 단계,
- 항체 또는 그의 단편을 세포 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계,
- 친화도 크로마토그래피 물질에 대한 항체 또는 그의 단편의 결합에 적합한 조건 하에 항체 경쇄 친화도 크로마토그래피 칼럼에 항체 또는 그의 단편을 포함하는 용액을 임의로 적용하는 단계,
- 본원에서 보고되는 방법으로 N-글리코실화 부위에서 항체 또는 그의 단편의 글리코실화를 변형하는 단계, 및
- N-글리코실화 부위에서 정의된 글리코실화를 갖는 변형된 항체 또는 그의 단편을 회수하고,
그에 의해 항체를 생산하는 단계.
하나의 구현예에서 방법은 하기 단계를 최종 단계로서 포함한다:
- 변형된 항체 또는 그의 단편을 하나 내지 세 개의 크로마토그래피 단계로 정제하는 단계.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 사용하는 갈락토실트랜스퍼라아제 또는/및 시알릴트랜스퍼라아제 및 항체를 포함하는 혼합물의 분리를 위한 크로마토그래피 방법이다:
i) 갈락토실트랜스퍼라아제 및/또는 시알릴트랜스퍼라아제를 포함하는 용액 및 항체를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
ii) (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 임의로 세척하는 (그에 따라 미결합 화합물을 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 제거하는) 단계,
iii) 제 1 용액을 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 갈락토실트랜스퍼라아제 (존재하는 경우) 를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하는 단계,
iv) 제 2 용액을 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 항체를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하는 단계, 및
v) 선형 기울기를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 시알릴트랜스퍼라아제 (존재하는 경우) 를 (강) 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수하는 단계.
이 방법으로 분리된 갈락토실트랜스퍼라아제 뿐만 아니라 분리된 시알릴트랜스퍼라아제는 효소적 전환에서 효소적 활성 또는/및 선택성의 유의한 상실 없이 여러 번, 즉 적어도 세 번 재사용될 수 있다는 것이 발견되었다.
하나의 구현예에서 단계 i) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 i) 의 용액은 약 50 mM MES 를 포함하고 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서 단계 ii) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 ii) 의 용액은 약 50 mM MES 를 포함하고 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서 단계 iii) 의 용액은 pH 6.6 내지 pH 8.0 의 pH 값을 갖는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 iii) 의 용액은 약 40 mM TRIS 를 포함하고 약 pH 7.4 의 pH 값을 갖는다.
하나의 구현예에서 단계 iv) 의 용액은 약 75 mM 내지 약 125 mM 염화 나트륨 (NaCl) 을 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이다. 하나의 구현예에서 단계 iv) 의 용액은 약 30 mM MES, 약 90 mM NaCl 을 포함하고 약 pH 5.6 의 pH 값을 갖는다.
7.4 로부터 5.6 으로의 pH 값의 감소는 응집된 갈락토실트랜스퍼라아제의 용출을 초래한다는 것이 발견되었다.
하나의 구현예에서 선형 기울기는 단계 iv) 의 용액으로부터, 약 750 mM 내지 약 1250 mM 염화 나트륨 (NaCl) 을 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액으로이다. 하나의 구현예에서 선형 기울기는 단계 iv) 의 용액으로부터, 약 pH 6.4 의 pH 값을 갖는 약 50 mM MES, 약 1000 mM NaCl 을 포함하는 용액으로이다.
모든 양상의 하나의 구현예에서 N-글리코실화 부위는 Fab 또는 Fc-영역에 있다.
본 발명의 상세한 설명
정의
본원에서 사용시, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 문헌 [Kabat, et al., Seqeunces of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 에 기재된 Kabat 넘버링 시스템에 따른 넘버링되고 본원에서 "Kabat 에 따른 넘버링" 으로 지칭된다. 특히, 문헌 [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 Kabat 넘버링 시스템 (647-660 페이지 참조) 은 카파 및 람다 동형의 경쇄 불변 도메인 CL에 대해 사용된다. 구체적으로 Kabat EU 인덱스 넘버링 시스템 (661-723 페이지 참조) 는 불변 중쇄 도메인 (CH1, 힌지, CH2 및 CH3, 이는 이 경우에 "Kabat EU 인덱스에 따른 넘버링" 을 참조하여 본원에서 더 명확해진다) 에 대해 사용된다.
본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용시, 단수형 "하나", "한" 및 "그" 는 명확히 다르게 명시하지 않으면 복수 언급대상을 포함한다는 점에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포" 에 대한 언급은 다수의 이러한 세포 및 당업자에게 공지된 이의 균등물 등을 포함한다. 역시, 용어 "하나" (또는 "한"), "하나 이상" 및 "적어도 하나" 는 본원에서 호환되게 사용될 수 있다. 용어 "포함하는", "포괄하는", 및 "갖는" 도 역시 호환되게 사용될 수 있다는 것에 주의한다.
예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열을, 이 아미노산 서열을 인코딩하는 상응하는 핵산 서열로 전환하는 절차 및 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그러므로, 핵산은 각각의 뉴클레오티드로 이루어진 그것의 핵산 서열 및 마찬가지로 이 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.
용어 "약" 은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 20% 범위를 의미한다. 하나의 구현예에서 용어 '약' 은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 10% 범위를 의미한다. 하나의 구현예에서 용어 '약' 은 이후에 후속되는 수치값의 +/- 5 % 범위를 의미한다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 요망되는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 비제한적으로 포함하는 다양한 항체 구조를 포함한다.
용어 "항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)" 은 Fc 수용체 결합에 의해 매개되는 기능이며, 효과기 세포의 존재 하에서 본원에서 보고되는 항체에 의한 표적 세포의 용해를 의미한다. ADCC 는 하나의 구현예에서 효과기 세포 예컨대 신선하게 단리된 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 또는 단핵구 또는 NK (자연 살해) 세포와 같은 버피 코트로부터 정제된 효과기 세포의 존재 하에서 본원에서 보고되는 항체로의 CD19 발현 적혈구 세포 (예를 들어, 재조합 인간 CD19 를 발현하는 K562 세포) 의 제제의 처리에 의해 측정된다. 표적 세포는 Cr-51로 표지되고 이후에 다중환형 융합 폴리펩티드와 인큐베이션된다. 표지된 세포는 효과기 세포와 인큐베이션되고 상청액을 방출된 Cr-51 에 대해 분석한다. 대조군은 항체 없이 효과기 세포와 표적 내피 세포의 인큐베이션을 포함한다. ADCC 를 매개하는 초기 단계를 유도시키는 항체의 능력은 Fcγ 수용체 발현 세포, 예컨대 FcγRI 및/또는 FcγRIIA 를 재조합적으로 발현하는 세포 또는 NK 세포 (본질적으로 FcγRIIIA 를 발현함) 와의 결합을 측정하여 조사된다. 바람직한 하나의 구현예에서 NK 세포 상의 FcγR 과의 결합이 측정된다.
"항체 단편" 은 미손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 미손상 항체의 일부를 포함하는 미손상 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 비제한적으로 포함한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 한편, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 나타낸다.
항체의 "클래스" 는 그의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 부위의 유형을 나타낸다. 5 개의 주요 클래스의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 지칭된다.
용어 "보체-의존적 세포독성 (CDC)" 은 보체의 존재 하에 본원에서 보고되는 항체에 의해 유도되는 세포의 용해를 나타낸다. CDC는 하나의 구현예에서 보체의 존재 하에서 본 명세서에 보고되는 항체로 CD19 발현 인간 내피 세포를 처리하여 측정된다. 세포는 하나의 구현예에서 칼세인으로 표지화된다. 항체가 30 ㎍/㎖ 의 농도에서 표적 세포의 20% 이상의 용해를 유도하는 경우, CDC 가 발견된다. 보체 인자 C1q 에 대한 결합은 ELISA 에서 측정될 수 있다. 이러한 검정에서 원칙적으로 ELISA 플레이트는 항체의 농도 범위로 코팅되는데, 이에 정제된 인간 C1q 또는 인간 혈청이 첨가된다. C1q 결합은 C1q 에 대해 유도되는 항체, 이후 퍼옥시다아제-표지된 접합체에 의해 검출된다. 결합 (최대 결합 Bmax) 의 검출은 퍼옥시다아제 기질 ABTS® (2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-술포네이트]) 에 대해 405 nm 에서의 광학 밀도 (OD405) 로서 측정된다.
"효과기 기능" 은 항체 클래스에 따라 가변적인 항체의 Fc-부위에 기인하는 이들 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
Fc 수용체 결합 의존적 효과기 기능은 항체의 Fc-부위와 Fc 수용체 (FcR) (조혈 세포 상 특화된 세포 표면 수용체임) 의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며, 면역 복합체의 식균작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 항체 의존적 세포 매개 세포독성 (ADCC) 을 통한 적혈구 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 기타 세포 표적 (예를 들어 종양 세포) 의 용해 둘 모두를 매개하는 것으로 나타난다 (예를 들어, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524 참조). FcR 은 면역글로불린 동형에 대한 그의 특이성에 의해 정의되고: IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR 로서 지칭된다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; 및 Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248] 에 기재되어 있다.
IgG 항체의 Fc-부위에 대한 수용체 (FcγR) 의 교차결합은, 면역 복합체 소거 및 항체 생성의 조절 뿐 아니라 식균작용, 항체-의존적 세포 세포독성, 및 염증 매개제의 배출을 포함하는 광범위한 효과기 기능을 촉발시킨다. 인간에서, 하기와 같은 3 개 클래스의 FcγR 이 특징화되어 있다:
- FcγRI (CD64) 은 고친화도으로 단량체성 IgG 에 결합하며 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구 상에서 발현된다. Fc-부위 IgG 에서 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나의 변형은 FcγRI 에 대한 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4 로 치환된, 위치 233-236 에서의 IgG2 잔기는 FcγRI 에 대한 결합을 103-배로 감소시켰으며, 항체-민감화 적혈구 세포에 대한 인간 단핵구 반응을 제거했다 (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).
- FcγRII (CD32) 는 중간 내지 저친화도으로 복합화된 IgG 에 결합하며 광범위하게 발현된다. 이러한 수용체는 2 개의 하위유형, FcγRIIA 및 FcγRIIB 로 분화될 수 있다. FcγRIIA 는 사멸에 관련되는 많은 세포 (예를 들어 대식세포, 단핵구, 호중구) 상에서 발견되며 사멸 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB 는 저해 과정에 있어서 역할을 하는 것으로 보이며 B-세포, 대식세포 및 비만 세포 및 호산구에서 발견된다. B-세포 상에서 이는 추가 면역글로불린 생성 및 예를 들어 IgE 클래스로의 동형 전환을 억제하는 기능을 하는 것으로 보인다. 대식세포 상에서, FcγRIIB 는 FcγRIIA 를 통해 매개되는 바와 같이 식균작용을 저해하는 작용을 한다. 호산구 및 비만 세포 상에서 B-형태는 그의 별개 수용체에 대한 IgE 결합을 통해 이들 세포의 활성화를 억제하는 것을 도울 수 있다. FcγRIIA 에 대한 감소된 결합은 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-부위를 포함하는 항체에 대해 발견된다.
- FcγRIII (CD16) 은 중간 내지 저친화도으로 IgG 에 결합하며 2 개 유형으로서 존재한다. FcγRIIIA 는 NK 세포, 대식세포, 호산구 및 일부 단핵구 및 T 세포 상에서 발견되며 ADCC 를 매개한다. FcγRIIIB 는 호중구 상에서 고도로 발현된다. FcγRIIIA 에 대한 감소한 결합이 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-부위를 포함하는 항체에 대해 발견된다.
Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 맵핑, 상술한 돌연변이 위치, 및 FcγRI 및 FcγRIIA 에 대한 결합 측정 방법이 [Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604] 에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 수용체" 는 수용체와 연관된 세포질 (cytoplasmatic) ITAM 서열의 존재에 의해 특징지어지는 활성화 수용체를 나타낸다 (예를 들어, Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290 참조). 이러한 수용체는 FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIIA 이다. 용어 "FcγR 에 대해 결합하지 않음" 은 10 ㎍/㎖ 의 항체 농도에서 본원에서 보고되는 항체의 NK 세포에 대한 결합이 WO 2006/029879 에서 보고된 바와 같이 항-OX40L 항체 LC.001 에 대해 발견된 결합의 10% 이하라는 것을 나타낸다.
IgG4 가 감소한 FcR 결합을 나타내지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강력한 결합을 나타낸다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물 손실), Pro329 및 234, 235, 236 및 237 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435 는, 변형되는 경우 또한 FcR 결합을 감소시키는 잔기이다 (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434).
본원에서 용어 "Fc-부위" 는 불변 부위의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하는데 사용된다. 용어는 선천적 (native) 서열 Fc-부위 및 변이체 Fc-부위를 포함한다. 한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-부위는 Cys226, 또는 Pro230 또는 Ala 231 로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 확장된다. 그러나, Fc-부위의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 보고되는 바와 같은 항체는 Fc-부위로서, 한 구현예에서는 인간 기원에서 유래한 Fc-부위를 포함한다. 한 구현예에서 Fc-부위는 인간 불변 부위의 모든 부분을 포함한다. 항체의 Fc-부위는 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관련된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향이 특정 조건에 따라 의존적이지만, C1q 에 대한 결합은 Fc-부위에서 정의된 결합 위치에 의해 초래된다. 이러한 결합 위치는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434 에 의해 기재되어 있다. 이러한 결합 위치는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 이다 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링). 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 통상 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 한편, IgG4 는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, C1q 에 결합하지 않으며 C3 을 활성화시키지 않는다. "항체의 Fc-부위" 는 당업자에게 널리 공지된 용어이며 항체의 파파인 절단을 기반으로 하여 정의된다. 한 구현예에서 Fc-부위는 인간 Fc-부위이다. 한 구현예에서 Fc-부위는 돌연변이 S228P 및/또는 L235E 및/또는 P329G (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 를 포함하는 인간 IgG4 서브클래스의 것이다. 한 구현예에서 Fc-부위는 돌연변이 L234A 및 L235A 및 임의로 P329G (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 를 포함하는 인간 IgG1 서브클래스의 것이다.
용어 "야생형 Fc-영역" 은 자연계에 존재하는 Fc-영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 인간 Fc-영역은 천연 인간 IgG1 Fc-영역 (비-A 및 A 알로타입), 천연 인간 IgG2 Fc-영역, 천연 인간 IgG3 Fc-영역, 및 천연 인간 IgG4 Fc-영역을 비롯하여 이의 천연 발생 변이체를 포함한다. 야생형 Fc-영역은 SEQ ID NO: 01 (IgG1, 코카시안 알로타입), SEQ ID NO: 02 (IgG1, 아프리카아메리칸 알로타입), SEQ ID NO: 03 (IgG2), SEQ ID NO: 04 (IgG3) 및 SEQ ID NO: 05 (IgG4) 로 표시된다.
변이체 (인간) Fc-영역은 함유하는 아미노산 돌연변이에 의해 정의된다. 따라서, 예를 들어, 용어 P329G 는 부모 (야생형) Fc-영역 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 에 비하여 아미노산 위치 329 에 프롤린이 글리신으로의 돌연변이를 갖는 변이체 Fc-영역을 의미한다. 야생형 아미노산의 정체가 명시되지 않을 수 있는데, 이러한 경우에서 상기 언급된 변이체는 329G 로 표시된다.
IgG1 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 위치 227 의 시스테인 잔기에서 시작하여 위치 446 의 글리신 잔기로 종결되는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00001
돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00002
돌연변이 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00003
돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00004
돌연변이 L234A, L235A, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00005
돌연변이 L234A, L235A 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00006
돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00007
돌연변이 L234A, L235A, P329G, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00008
돌연변이 L234A, L235A, P329G 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00009
돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00010
돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00011
돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00012
돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C 및 T366W 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00013
돌연변이 I253A, H310A 및 H435A 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00014
돌연변이 H310A, H433A 및 Y436A 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00015
돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E 를 갖는 IgG1 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00016
IgG4 서브클래스의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00017
돌연변이 S228P 및 L235E 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00018
돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00019
돌연변이 S228P, L235E, P329G, T366S, L368A 및 Y407V 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00020
돌연변이 S228P, L235E, P329G 및 T366W 를 갖는 IgG4 서브클래스의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112019063375772-pct00021
용어 "전장 항체", "미손상 항체" 및 "전체 항체" 는 본원에서 선천적 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 본원에서 정의한 바와 같은 Fc-부위를 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타내는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "글리칸" 은 다당류, 또는 올리고당류를 의미한다. 글리칸은 또한 당단백질, 당지질, 당펩티드, 당단백질체, 펩티도글리칸, 지질다당류 또는 프로테오글리칸과 같은 당접합체의 탄수화물 부분을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 글리칸은 통상 단당류 사이의 β-글리코시드 연결로만 이루어진다. 글리칸은 단당류 잔기의 단독중합체 또는 이종중합체일 수 있고, 선형 또는 분지형일 수 있다.
용어 "글리코실트랜스퍼라아제" 는 올리고당 내의 당 분자와 같은 수용체 분자로 뉴클레오티드 당으로부터 단당류 잔기를 전달할 수 있는 효소를 나타낸다. 이러한 글리코실트랜스퍼라아제의 예로는 갈락토실트랜스퍼라아제 및 시알릴트랜스퍼라아제가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "힌지 부위" 는 야생형 항체 중쇄에서 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결시키는, 예를 들어 약 위치 216 에서 약 위치 230 의 (Kabat 의 EU 넘버 시스템에 따름), 또는 약 위치 226 에서 약 위치 230 의 (Kabat 의 EU 넘버 시스템에 따름) 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다. 다른 IgG 서브클래스의 힌지 부위는 IgG1 서브클래스 서열의 힌지-부위 시스테인 잔기에 맞추어 정렬함으로써 결정될 수 있다.
힌지 부위는 보통, 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이량체성 분자이다. 힌지 부위는 일반적으로 약 25 개의 아미노산 잔기를 포함하며 항원 결합 부위가 독립적으로 움직이도록 유연성이 있다. 힌지 부위는 3 개 도메인: 상부, 중부 및 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다 (예를 들어 Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083 참조).
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 통상 2 개 모두의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로는 인간 항체에서 유래한 항체 불변 부위의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태" 는, 인간화를 거친 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은, 서열에서 과가변인 아미노산 잔기 스트레치를 포함 ("상보성 결정 부위" 또는 "CDR") 하고/하거나 구조적으로 정의된 루프를 형성 ("과가변 루프") 하고/하거나 항원-접촉 잔기를 함유 ("항원 접촉부") 하는 항체 가변 도메인의 부위 각각을 나타낸다. 일반적으로, 항체는 6 개의 HVR 을 포함하는데; 3 개는 VH (H1, H2, H3) 에 있고, 3 개는 VL (L1, L2, L3) 에 있다.
HVR 은:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 에 존재하는 과가변 루프 (Chothia, C. 및 Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 에 존재하는 CDR (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) 및 93-101 (H3) 에 존재하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) 및 94-102 (H3) 을 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c) 의 조합
을 포함한다.
다르게 명시되지 않으면, 가변 도메인에서의 HVR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 Kabat et al. (상기 참조) 에 따라 넘버링된다.
"단리된" 항체는 그의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정되는 95% 또는 99% 초과 순도로 정제된다. 항체 순도 평가를 위한 방법의 검토를 위해서는, 예를 들어 [Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87] 를 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은 정상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하나, 핵산 분자는 염색체외 또는 그의 자연적 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
용어 "경쇄" 는 천연 IgG 항체의 보다 짧은 폴리펩티드 사슬을 의미한다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 호칭되는 2 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 대해 SEQ ID NO: 27 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인에 대해 SEQ ID NO: 28 을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동질 항체 집단, 즉 동일한 집단 및/또는 동일한 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는 개별 항체 (예를 들어, 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제물의 생성 동안 발생하는 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함), 가능한 변이체 항체는 제외) 에서 수득한 항체를 나타낸다. 통상 상이한 결정자 (에피토프) 에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 반대로, 모노클로날 항체 제제물의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 유도된다. 따라서, 변형어 "모노클로날" 은 항체의 실질적 동질 집단에서 수득되는 바와 같은 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로서 이해되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 모두 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 비제한적으로 포함하는 다양한 기법에 의해 만들어질 수 있으며, 이러한 방법 및 모노클로날 항체 생성을 위한 기타 예시적 방법이 본원에 기재된다.
"선천적 항체" 는 가변적 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 나타낸다. 예를 들어, 선천적 IgG 항체는 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄 (디술피드-결합됨) 로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역 (VH), 이후 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3) 을 가져, 그로써 첫 번째와 두번째 불변 도메인 사이에 힌지 부위가 위치한다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역 (VL), 이후 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 지칭되는 2 개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "N-연결된 올리고당" 은 아스파라긴-N-아세틸 글루코사민 연결에 의해, 아스파라긴 아미노산 잔기에서 펩티드 백본에 연결된 올리고당을 나타낸다. N-연결된 올리고당은 또한 "N-글리칸" 이라고도 불린다. 모든 N-연결된 올리고당은 Man3GlcNAc2 의 공통의 오당류 코어를 갖는다. 이들은 N-아세틸 글루코사민, 갈락토오스, N-아세틸 갈락토사민, 푸코오스 및 시알산과 같은 말초 당의 분지 (또한 안테나로 불림) 의 존재, 및 수가 상이하다. 임의로, 이 구조는 또한 코어 푸코오스 분자 및/또는 자일로오스 분자를 함유할 수 있다.
용어 "O-연결된 올리고당" 은 트레오닌 또는 세린 아미노산 잔기에서 펩티드 백본에 연결된 올리고당을 나타낸다.
용어 "시알산" 은 9-탄소 카르복실화 당의 패밀리의 임의의 일원을 나타낸다. 시알산 패밀리의 가장 일반적인 일원은 N-아세틸-뉴라민산 (2-케토-5-아세타미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노뉼로피라노스-1-온산 (종종 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA 로 약칭됨) 이다. 패밀리의 두번째 일원은 NeuAc 의 N-아세틸 기가 히드록실화된 N-글리콜릴 뉴라민산 (Neu5Gc 또는 NeuGc) 이다. 제 3 시알산 패밀리 일원은 2-케토-3-데옥시-노뉼로손산 (KDN) 이다 (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). 또한 9-치환된 시알산, 예컨대 9-O--C1-C6 아실-NeuSAc, 예컨대 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-O-아세틸-NeuSAc, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시Neu5Ac 가 포함된다. 시알산 패밀리의 리뷰를 위해서는, 예를 들어, 하기를 참고한다: Varki, Glycobiol. 2 (1992) 25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). 시알릴화 절차에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 WO 92/16640 에 보고되어 있으며, 그 개시 내용은 전체가 본 명세서에 포함된다.
항체와 관련하여, 용어 "실질적으로" 는 해당 상태가 단일 부위 또는 다중 부위에서 글리코실화를 포함하든 아니든, 각각의 생성물 (항체) 이 단일 글리코실화 상태를 갖는 것을 나타낸다. 전형적으로, 항체는 제제 중 항체의 중량을 기준으로 적어도 60% 를 구성하는 경우 실질적으로 순수하다. 예를 들어, 제제 중의 항체는 목적하는 항체의 중량을 기준으로 적어도 약 75%, 특정 구현예에서는 저겅도 약 80%, 특정 구현예에서는 약 85%, 특정 구현예에서는 적어도 약 90%, 특정 구현예에서는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 가장 바람직하게는 적어도 약 99% 이다.
용어 "글리코실화 상태" 는 항체의 특이적 또는 목적하는 글리코실화 패턴을 나타낸다. "글리코형" 은 특정 글리코실화 상태를 포함하는 항체이다. 이러한 글리코실화 패턴은 예를 들어, 항체의 Fc-영역의 위치 N-297 (Kabat 에 따른 넘버링) 에 하나 이상의 당을 부착시키는 것을 포함하며, 상기 당은 자연적으로, 재조합적으로, 합성적으로 또는 반-합성적으로 생산된다. 글리코실화 패턴은 당 업계에 공지된 많은 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 단백질 상의 탄수화물을 분석하는 방법이 US 2006/0057638 및 US 2006/0127950 에 보고되어 있다 (이들의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는 것에 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 부위 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 를 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91 페이지 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628 참조.
용어 "N-글리코실화 부위" 는 글리칸이 부착되거나 부착될 수 있는 N-글리코실화 부위 공통 서열 내의 아미노산 잔기를 나타낸다. 일반적으로 N-연결된 글리칸은 아스파라긴 아미노산 (Asn, N) 측쇄의 아미드 질소 원자에 부착된다. N-글리코실화 부위 공통 서열은 Asn-X-Ser/Thr 이고, 여기서 X 는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 용어 "N-연결된 글리코실화" 는 예를 들어, 아스파라긴의 아미드 질소 원자에 대한 당 분자 올리고당 (글리칸으로 나타냄) 의 부착 결과를 나타낸다.
항체 글리코실화
인간 항체는 중쇄 CH2 도메인의 약 위치 297 (Asn297) 의 아스파라긴 잔기에서 또는 다소간 푸코실화된 바이안테너리 복합체 올리고당 (상기 Kabat 에 따른 항체 아미노산 잔기 넘버링) 을 갖는 Fab 영역에서 주로 글리코실화된다. 바이안테너리 당구조는 각 팔에 있는 2 개 이하의 연속적인 갈락토오스 (Gal) 잔기에 의해 종결될 수 있다. 팔은 중앙 만노오스 잔기에 대한 글리코시드 결합에 따라 (1,6) 및 (1,3) 으로 표시된다. G0 로 나타낸 당구조는 갈락토오스 잔기를 포함하지 않는다. G1 로 나타낸 당구조는 한 팔에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다. G2 로 나타낸 당구조는 각 팔에 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 함유한다 (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 인간 불변 중쇄 영역은 Kabat (상기) 및 Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527 에 상세히 보고되어 있다. 항체 Fc-영역의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어 Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 에 기재되어 있다.
용어 "항체" 는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 T-세포 항원 고갈 항체와 같은 다양한 형태의 항체를 나타내며 포함한다 (예를 들어, WO 98/33523, WO 98/52976, 및 WO 00/34317 참조). 하나의 구현예에서, 본원에 보고되는 방법에서 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 항체의 유전 공학은 예를 들어 Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US　5,202,238 및 US 5,204,244; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125 에 기재되어 있다.
일반적으로 항체는 2 개의 소위 전장 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 전장 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함한다. 전장 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 항원과 상호작용하는, 결합 영역을 포함하는 가변 도메인 (가변 영역) (일반적으로 전장 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 전장 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 각각은 불변 영역 (일반적으로 카복시 말단 부분) 을 포함한다. 전장 중쇄의 불변 영역은 i) Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 가지고 있는 세포, 예컨대 식세포, 또는 ii) 브람벨 (Brambell) 수용체로도 알려져 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 가지고 있는 세포에 대한 항체의 결합을 매개한다. 이것은 또한 고전적인 보체 시스템의 인자, 예컨대 성분 (C1q) 를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다. 전장 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 분절, 즉 4 개의 프레임워크 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (CDR) 을 포함한다. "전장 항체 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역, 항체 불변 도메인 2 (CH2), 항체 불변 도메인 3 (CH3), 및 임의로는 서브클래스 IgE 의 항체의 경우 항체 불변 도메인 4 (CH4) 로 이루어지는 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어지는 폴리펩티드이다. 전장 항체 사슬은 CL-도메인과 CH1 도메인 사이 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역 사이의 인터-폴리펩티드 디설파이드 결합을 통해 함께 연결된다.
최근 수년간, 항체의 글리코실화 패턴, 즉 부착된 당구조의 당 조성 및 규모가 생물학적 특성에 강한 영향을 미친다고 보고되었다 (참고, 예를 들어, Jefferis, R., Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11-16). 포유동물 세포에 의해 생성된 항체는 2 내지 3 질량% 의 올리고당을 함유한다 (Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557). 이것은 예를 들어, 마우스 기원의 IgG 중의 2.3 올리고당 잔기 (Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394) 및 인간 기원의 IgG 중의 2.8 올리고당 잔기 (Parekh, R.B., et al., Nature 316 (1985) 452-457) 에 대한 클래스 G 의 항체 (IgG) 에서 동등하고, 일반적으로 2 개가 Asn297 의 Fc-영역에 위치하고 나머지는 가변 영역에 존재한다 (Saba, J.A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31).
본 출원에서 사용 된 용어 "당구조 (glycostructure)" 는 특정 아미노산 잔기에서 단일한, 정의된 N- 또는 O-연결된 올리고당을 나타낸다. 따라서, 용어 "G1 당구조를 가진 항체" 는 Kabat 넘버링 체계에 따른 대략 아미노산 위치 297 에 아스파라긴 아미노산 잔기에서 또는 FAB 영역에서 올리고당의 비-환원 말단에 오직 하나의 말단 갈락토오스 잔기를 포함하는 바이안테너리 올리고당을 포함하는 항체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "올리고당" 은 2 개 이상의 공유 연결된 단당류 단위를 포함하는 중합체성 당류를 나타낸다.
본 발명에서 상이한 N- 또는 O-연결된 올리고당의 표기법을 위해, 개별 당 잔기는 올리고당 분자의 비-환원 말단에서 환원 말단으로 나열된다. 가장 긴 당 사슬이 표기법의 기본 사슬로 선택된다. N- 또는 O-연결된 올리고당의 환원 말단은 항체의 아미노산 백본의 아미노산에 직접 결합되는 단당류 잔기인 반면, 기본 사슬의 환원 말단으로서 반대 말단에 위치하는, N- 또는 O-연결된 올리고당의 말단은 비-환원 말단으로 명명된다.
모든 올리고당은 본원에서 비-환원성 당류의 명칭 또는 약어 (즉, Gal) 를 기재하고, 이어서 글리코시드 결합의 배열 (α 또는 β), 고리 결합 (1 또는 2), 결합에 관여하는 환원당의 고리 위치 (2, 3, 4, 6 또는 8), 그 후 환원성 당류의 명칭 또는 약어 (즉, GlcNAc) 로 기술된다. 각각의 당류는 바람직하게는 피라노오스이다. 표준 당생물학 명명법의 리뷰에 관해 Essentials of Glycobiology Varki et al. eds., 1999, CSHL Press 를 참조한다.
용어 "정의된 당구조 (defined glycostructure)" 는 본 출원에서 당구조의 비-환원 말단의 단당류 잔기가 특정 종류의 것인 당구조를 나타낸다. 용어 "정의된 당구조" 는 본 출원에서 당구조의 비-환원 말단의 단당류 잔기가 정의되고 특정 종류의 것인 당구조를 나타낸다.
항체 정제
본 출원에서 사용되는 "친화도 크로마토그래피" 라는 용어는 "친화도 크로마토그래피 물질" 을 사용하는 크로마토그래피 방법을 나타낸다. 친화도 크로마토그래피에서 항체는 크로마토그래피 물질의 크로마토그래피 기능 그룹에 대한 정전기 상호작용, 소수성 결합 및/또는 수소 결합 형성에 따라, 이들의 생물학적 활성 또는 화학적 구조에 근거하여 분리된다. 친화도 크로마토그래피 물질로부터 특이적으로 결합된 항체를 회수하기 위해, 경쟁자 리간드가 첨가될 수 있거나, 또는 완충제의 pH 값, 극성 또는 이온 강도와 같은 크로마토그래피 조건이 변화될 수 있다. 예시적인 "친화도 크로마토그래피 물질" 은 금속 킬레이트 크로마토그래피 물질, 예컨대 Ni(II)-NTA 또는 Cu(II)-NTA, 또는 항체 친화도 크로마토그래피 물질 예컨대 공유 연결된 단백질 A 또는 단백질 G 를 포함하는 크로마토그래피 물질, 또는 효소 결합 친화도 크로마토그래피 물질, 예컨대 크로마토그래피 기능 그룹으로서 공유 결합된 효소 기질 유사체, 효소 보조인자, 또는 효소 억제제를 포함하는 크로마토그래피 물질, 또는 렉틴 결합 크로마토그래피 물질, 예컨대 크로마토그래피 기능 그룹으로서 공유 연결된 다당류, 세포 표면 수용체, 당단백질, 또는 미손상 세포를 포함하는 크로마토그래피 물질이다.
하나의 구현예에서 항체 경쇄 친화도 리간드는 경쇄 불변 도메인 특이적인, 예를 들어, 카파 또는 람다 경쇄가 항체에 함유되어 있는지에 따라 카파 또는 람다 불변 경쇄에 특이적인, 포획 시약을 사용한다. 이러한 경쇄 불변 도메인 특이적 포획 시약의 예는 예를 들어, KappaSelect™ 및 LambdaFabSelect™ (GE Healthcare/BAC 로부터 이용가능) 이고, 이들은 대규모에서 높은 유속 및 낮은 배압을 허용하는 고도의 강성인 아가로오스 기반 매트릭스에 기반한다. 상기 물질은 카파 또는 람다 경쇄, 각각의 불변 영역에 결합하는 리간드를 함유한다 (경쇄의 불변 영역이 결핍된 항체 또는 그의 단편은 결합하지 않을 것임). 따라서 둘 다는 경쇄, 예를 들어, IgG, IgA 및 IgM 의 불변 영역을 함유하는 다른 표적 분자에 결합할 수 있다. 리간드는 이들을 표적 분자에 대한 결합을 쉽게 이용가능하게 만드는 긴 친수성 스페이서 팔을 통해 매트릭스에 부착된다. 이들은 인간 Ig 카파 또는 람다에 대해 스크리닝된 단일-사슬 항체 단편에 기반한다.
용어 "경쇄" 는 천연 IgG 항체의 더 짧은 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. 항체의 경쇄는 그것의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 호칭되는 두 가지 유형 중 하나에 지정될 수 있으며, 인간 카파 경쇄 불변 도메인에 관한 SEQ ID NO: 27 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인에 관한 SEQ ID NO: 28 을 참조한다.
본 출원에서 사용되는 "~ 에 적용하는" 이라는 구절 및 이의 문법적 동등 구절은 관심의 성분을 함유하는 용액을 정지상과 접촉시키는 정제 방법의 일부 단계를 나타낸다. 정제되어지는 관심의 성분을 함유하는 용액은 정지상을 통해 통과하여 정지상과 용액 내 성분 사이의 상호작용을 발생시킨다. 예를 들어, pH, 전도성, 염 농도, 온도, 및/또는 유속과 같은 조건에 따라, 용액의 일부 성분이 정지상에 결합되어 그와 함께 용액으로부터 제거된다. 기타 성분은 용액에 남는다. 용액 내에 남는 성분은 플로우-쓰루에서 발견될 수 있다. "플로우-쓰루 (flow-through)" 는 크로마토그래피 장치의 통과 후 수득된 용액을 나타내며, 이것은 관심의 성분을 함유하는 적용된 용액 또는 완충제일 수 있고, 이는 칼럼을 플러쉬하는데 또는 정지상에 결합된 하나 이상의 성분의 용출를 야기하는데 사용될 수 있다. 관심의 성분은 실질적으로 균질한 형태의 성분을 수득하기 위한 예를 들어, 침전, 염석, 초여과, 투석여과 (diafiltration), 동결건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 용매 부피 감소와 같이, 당업자에게 친숙한 방법에 의한 정제 단계 후 용액으로부터 회수될 수 있다.
당구조가 본원에 보고된 방법으로 변형될 수 있는 항체 또는 항체 단편은 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 재조합 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 진핵 세포 내 단백질 발현, 항체 또는 항체 단편의 후속 단리 및 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 항체 또는 항체 단편의 발현을 위해서는, 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어 있는 하이브리도마 세포 또는 진핵 세포가 사용된다. 하나의 구현예에서, 진핵 세포는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK 293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, BHK 세포, 토끼 세포, 또는 양 세포로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 진핵 세포는 CHO 세포, HEK 세포, 또는 토끼 세포로부터 선택된다. 발현 후, 항체 또는 항체 단편은 세포로부터 (용해 후 상청액으로부터 또는 세포로부터) 회수된다. 일반적인 항체의 재조합 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 예를 들어, [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880] 의 리뷰 논문에 보고되어 있다.
항체의 정제는 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로오스 젤 전기영동을 비롯한 표준 기술, 및 당업계에 공지된 기타 기술 (예를 들어, Ausubel, F.M, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005) 참조) 에 의해 세포 성분 또는 기타 오염물, 예를 들어, 기타 세포성 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환), 친황성 (thiophilic) 흡착 (예를 들어, 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드로의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어, 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 수지, 또는 m-아미노페닐보론산으로의), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질로의), 크기 배재 크로마토그래피, 및 전기영동 방법 (예컨대 젤 전기영동, 모세관 전기영동), 뿐 아니라 이들의 조합, 예컨대 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 상이한 방법도 또한 단백질 정제에 대해 성립되고 널리 사용된다 (예를 들어, Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102 참조). 일반적인 크로마토그래피 방법 및 이들의 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Heftmann, E. (ed.), Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z. (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C. F., and Poole, S. K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); 또는 Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (2005).
예를 들어, 세포 배양 방법에 의해 생성된 항체 또는 항체 단편의 정제를 위해, 일반적으로 상이한 크로마토그래피 단계의 조합이 사용될 수 있다. 일반적으로 (단백질 A) 친화도 크로마토그래피 다음에는 하나 또는 두 개의 추가의 분리 단계가 뒤따른다. 하나의 구현예에서, 추가의 크로마토그래피 단계는 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계이거나 또는 그 반대이다. 최종 정제 단계는 응집된 면역글로불린, 잔류 HCP (숙주 세포 단백질), DNA (숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소와 같은 미량의 불순물 및 오염 물질을 제거하기 위한 "연마 단계" 로 불린다. 하나의 구현예에서, 최종 정제 단계는 플로우-쓰루 (flow-through) 방식의 음이온 교환 크로마토그래피이다.
본원에서 보고되는 방법
재조합적으로 생산된 항체 또는 항체 단편의 당구조는 사용된 세포주 및 사용된 배양 조건에 의해 결정될 것이다. 종래의 다운스트림 프로세싱 기술을 사용하면 특정 당구조를 선택적으로 제거할 수 없다.
보다 상세하게는, 재조합적으로 생산된 모노클로날 항체는 일반적으로 글리코실화 부위에 글리코형의 이종 혼합물을 포함한다. 이러한 글리코실화 프로파일은 배양 배지뿐만 아니라 숙주 세포에 존재하는 효소 활성, 및 배양 조건과 같은 재조합 생산 동안 상이한 인자에 의해 영향을 받는다.
예를 들어 다른 것들 중에서도 치료 효과와 같이 널리 퍼져 있거나 또는 심지어 미리 결정된 글리코실화를 가진 항체를 생산할 필요가 있다.
본원에서 보고되는 방법은 N-글리코실화 부위에서 글리칸을 효소적으로 변형하고 그 후에 배양물로부터 항체를 수확함으로써, N-글리코실화 부위에서, 예를 들어 Fab 영역 또는 Fc-영역의 N-글리코실화 부위에서 정의된 글리코실화를 갖는, 즉 본질적으로 Fc-영역 글리코실화 부위에, 예를 들어 Fc-영역의 Asn297 에 부착된 단일 글리코형을 함유하는 항체를 제공하고, 동시에 변형에서 사용된 효소가 재순환되고 여러 번 재사용되는 것을 허용한다. 항체의 글리코실화는 요망되는 방식으로 변형될 수 있고, 그와 같이, 본원에서 보고되는 방법은 배양 상청액으로부터의 항체 정제에서 사용되는 표준 작업 절차에 용이하게 통합될 수 있다는 이점을 갖는다.
용어 "정의된 글리코실화를 갖는 항체" 또는 "정의된 당구조를 갖는 항체" 는 제한된 수의 상이한 글리칸이, 예를 들어 Asn297 의 Fc-영역 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링) 에 (미리결정된) 글리코실화 부위에 부착된 항체 분자의 집단을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 글리칸 중 하나는 G0F, G1F 및 G2F 글리코형의 50% 이상을 차지하거나 G0F, G1F, G2F, G1S1F, G2S1F 및 G2S2F 글리코형의 30% 이상을 차지한다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로" 는 화합물의 40% 이상, 하나의 구현예에서는 50% 이상이 동일한 글리코실화를 갖는, 즉 N-글리코실화 부위에, 예를 들어, Fc-영역에 Asn297 (Kabat 에 따른 넘버링) 에 동일한 글리칸을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 보고되는 방법으로, 유형 및 크기에 관계없이, 항체는 정의된 글리코형을 포함하도록 변형될 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어 Fc-영역에서 N-글리코실화 부위의 글리코실화는 예를 들어, 항체의 의도된 치료적 적용을 위해 맞춤화될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc-영역의 갈락토실화는 암의 치료에 유용하다. 또한, 예를 들어, 항체의 Fc-영역의 정의된 글리코형으로의 시알릴화는 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 상이한 용도에 있어서, Fc-영역의 탈-갈락토실화 및/또는 탈-시알릴화가 요구될 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, N-아세틸 글루코사민, GlcNAc; 또는 만노오스-N-아세틸 글루코사민-N-아세틸 글루코사민, Man-GlcNAc-GlcNAc 과 같이 GlcNAc 및 만노오스 잔기의 코어를 갖는 하이브리드 구조의 생산이 수행될 수 있다. 임의의 항체 및 상기 항체의 임의의 당구조가 본원에 보고된 방법을 일련의 방법으로 상이한 글리코실화 효소로 반복하여 요망되는 정의된 글리코형 항체를 생산함으로써 단계적으로 변형될 수 있으므로, 상기 임의의 것을 본원에 보고된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
예를 들어, G2 글리코형을 갖는 항체는 본원에 보고된 방법을 사용하여 모노클로날 항체의 이종 집단으로부터 생산될 수 있다. 동일한 방법을 사용하여 글리코조작 방법으로 생산될 수 있는, 비-푸코실화 이종 항체를 동종 G2-글리코형으로 전환시킬 수 있다. 또한, 항체의 갈락토실화의 배치 간의 가변성은 또한 본원에 보고된 방법을 사용하여 갈락토실화를 요망되는 수준으로 조절함으로써 해결될 수 있다.
간략히, 본원에서 보고되는 방법은 N-글리코실화 부위에서, 예를 들어 Fc-영역에서, 글리코실화를 갖는 항체를 하나 이상의 글리코실화 변형 효소와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 이러한 인큐베이션은 용액에서 또는 칼럼 상에서 수행될 수 있다. 반응 완충제는 선택된 이차 효소(들), 임의로 보조인자(들) 및 임의로 뉴클레오티드 당(들)의 부가에 의해 추가로 최적화될 수 있다. 혼합물은 그 후 실온에서 또는 약 37 ℃ 의 상승된 온도에서 인큐베이션된다. 변형된 항체 및 변형 효소는 그 후 분리된다. 예를 들어 변형이 용액에서 수행된 경우에 항체 또는 효소(들) 또는 둘 모두는 크로마토그래피 물질에 결합되고 순차적 용출에 의해 서로에게서 분리된다.
하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 방법은 N-글리코실화 부위에서, 예를 들어 Fc-영역에서, 글리코실화를 갖는 항체를 포함하는 용액을 고체 상/지지체에 부동화된 항체 (경쇄 또는 Fc-영역) 친화도 리간드에 적용하는 단계를 포함한다. 지지체는 세척 완충제로 세척한 후 상응하는 요망되는 효소 칼럼 상 당구조 변형에 적합한 반응 완충제 용액으로 세척되는 칼럼을 포함한다. 반응 완충제는 선택된 이차 효소(들), 임의로 조인자(들) 및 임의로 뉴클레오티드 당(들) 의 첨가로 더욱 최적화될 수 있다. 그 후 실온 또는 약 37℃ 의 승온에서 칼럼을 인큐베이션한다. 칼럼을 그 후 세척 완충제로 세척하고 용출 완충제를 사용하여 정의된 글리코형을 갖는 변형된 모노클로날 항체를 고체 지지체로부터 용출시킨다. 용출된 항체는 이어서 중화 완충제를 사용하여 중화될 수 있다.
하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 방법은 N-글리코실화 부위에서, 예를 들어 Fc-영역에서, 글리코실화를 갖는 항체를 포함하는 용액을 반응 완충제 중 하나 이상의 글리코실화 변형 효소와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 반응 완충제는 선택된 이차 효소(들), 임의로 보조인자(들) 및 임의로 뉴클레오티드 당(들)의 부가에 의해 추가로 최적화될 수 있다. 인큐베이션은 실온에서 또는 약 37 ℃ 의 상승된 온도에서 수행될 수 있다. 항체 및 변형 효소는 그 후 크로마토그래피 단계를 사용하여 분리된다.
반응 완충제에 사용하기 위한 뉴클레오티드 당은 UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA, UDP-Xyl, GDP-Man, GDP-Fuc, CMP-NeuSAc, CMP-NeuSGc 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 반응 완충제에서 사용되는 농도는 약 0.5 mM 내지 약 5 mM 의 범위, 약 1 mM 내지 약 1.5 mM 의 양상이다. 반응 완충제에 사용되는 조인자는 Mn2+, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, α-락트알부민 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 반응 완충제에서의 사용을 위한 조인자의 농도는 약 2 mM 내지 약 10 mM 의 범위일 수 있다.
항체 (경쇄 또는 Fc-영역) 친화도 리간드는 정제 및 변형 과정 중에 칼럼에 보유된 고체상에 부동화된다. 고체상은 비-표적 단백질 및 변형 효소의 무시할 정도의 비-특이적 흡착을 제공하는, 아가로오스, 세파로오스, 폴리아크릴, 폴리스티렌 및 다른 합성 중합체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 친화도 리간드는 예를 들어 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르, 에폭시드, 알데히드 또는 시아노겐 브로마이드와 같은 다양한 화학 물질 중 임의의 것에 의해 고체상에 공유 결합된다. 이러한 접합 화학은 Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (Amsterdam, the Netherlands, Ed. 2008) 및 Wong, S., Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking, CRC Press (Boca Raton, Fla., 1991) 에 예시되는 바와 같이, 당업계에 잘 공지된다.
세척 완충제는 세척 단계 동안 항체와 친화도 리간드 사이의 높은 친화도가 유지되도록 한다. 예를 들어, 약 7.2 의 pH 를 갖는 인산 완충 식염수 용액 (PBS) 이 세척 완충제로서 사용될 수 있지만, 당업자는 pH 가 어느 정도 변할 수 있음을 이해한다. 세척 및 반응 완충제는 항체와 친화도 리간드 사이의 높은 친화도가 유지됨과 동시에 각각의 효소(들)의 활성이 유지되는 것을 보증한다. 세척 및 반응 완충제는 약 25℃ 내지 약 40℃ 의 온도 및 그 사이의 임의의 온도에서 사용된다. 약 37℃ 의 온도가 자주 사용된다. 경쇄 친화도 리간드에 대한 항체의 고 친화도을 위한 최적 pH 범위는 약 6.0 내지 약 8.0 이다. 이러한 pH 범위 내에서, 완충제는 본원에서 보고되는 방법에서 사용될 수 있는 친화도 리간드의 최적 pH 범위와 중첩된다. 이들은 TRIS 완충제, BIS-TRIS 완충제, MES 완충제, BES 완충제, MOPS 완충제 및 HEPES 완충제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
친화도 칼럼의 세척 조건은 비-특이적 결합을 최소화하여 효소 반응 및 그에 따른 항체 변형에 영향을 미친다. 세척 조건은 항체 경쇄 친화도 리간드와 표적 모노클로날 항체 사이의 결합을 파괴시키지 않는 조건이다.
본원에서 보고되는 방법에서의 사용에 적합한 효소는 만노실-글루코사민 트랜스퍼라아제 (MGAT1, MGAT2 및 MGAT3); 갈락토실트랜스퍼라아제 (β4GalT1, β4GalT2, β4GalT3, β4GalT4, β4GalT5, β4GalT6, β4GalT7), 시알릴트랜스퍼라아제 (ST6Gal1, ST6Gal2); 만노시다아제 (α 만노시다아제-I, α 만노시다아제-II, α(1-2) 만노시다아제, α(1-6) 만노시다아제, α(1-2,3) 만노시다아제, α(1-2,3,6) 만노시다아제); 헥소사미니다아제 (β-N-아세틸 헥소사미니다아제, β-N-아세틸 글루코사미니다아제, α-N-아세틸 글루코사미니다아제); 갈락토시다아제 (β-갈락토시다아제, β(1-4) 갈락토시다아제, α(1-3,6) 갈락토시다아제); 시알리다아제 (α(2-3,6,8) 시알리다아제, α(2-3) 시알리다아제), 푸코시다아제 (α-L-푸코시다아제, α(1-6) 푸코시다아제, α(1-2) 푸코시다아제, α(1-3,4) 푸코시다아제, α(1-2,3,4) 푸코시다아제) 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 변형에 따라 선택될 수 있다.
본원에 보고된 방법은 예를 들어 Fc-영역에서, 동종 G2 당구조를 갖는 항체의 생성을 위해 갈락토오스로부터 말단 시알산을 제거 또는 첨가하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 임의의 결합으로부터 시알산을 제거하는 비-특이적 뉴라미니다아제 효소 또는 각각의 시알산을 첨가하는 특정 시알리다아제를 사용할 수 있다. 이 효소는 갈락토실트랜스페라제와 조합으로 사용하여 갈락토실화 및 시알산의 제거 또는 첨가에 동시에 작용할 수 있다. 따라서, Fc-영역에, 정의된 G2 글리코형을 갖는 항체는 적어도 글리코형 G0, G1, G2, G1S1 및 G2S2 를 포함하는, Fc-영역에 글리코실화를 갖는 항체로부터 수득될 수 있다.
본원에서 보고되는 방법에 따른 항체의 글리코실화의 변형은 개별 효소와의 순차적 인큐베이션, 또는 반-순차적 인큐베이션 (여기에서 제 1 효소가 첨가되고 제 2 효소가 특정 시간 후에 첨가되는 한편 제 1 효소는 제거되지 않음), 또는 존재하는 둘 모두의 효소와 함께 동시 인큐베이션을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 프로토콜 중 임의의 것이든 용액 반응에서 완전히 변형된 것 또는 단백질 A 에 부동화된 항체로 변형된 것에 비해 개선된 변형을 초래한다.
본원에서 보고되는 방법에서 사용되는 효소 변형 단계는 상응하는 트랜스퍼라아제 효소의 사용에 의해 Fc-영역에 정의된 갈락토실화 및 시알릴화를 갖는 항체를 제공함으로써 하기에 예시된다.
칼럼 상에서의 갈락토실화
IgG1 서브클래스의 정제된 인간화된 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화도 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용했다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및 UDP-GAL 을 포함하는 완충 용액과 함께 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 항체가 항체 경쇄 친화도 리간드를 포함하는 칼럼에 결합될 때 더 많은 양의 갈락토실화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063375772-pct00022
G0F = 두 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
G1F = 한 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 한 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
G2F = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
Fc-영역에 동종 글리코실화 (동종 G2F 글리코형) 를 갖는 IgG1 서브클래스의 정제된 인간화된 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화도 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용했다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충 용액과 함께로 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 항체가 항체 경쇄 친화도 리간드를 포함하는 칼럼에 결합될 때 더 많은 양의 시알릴화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063375772-pct00023
Figure 112019063375772-pct00024
알칼리성 포스파타아제의 존재 또는 부재는 단백질 A 칼럼 (19 % G2F, 56 % G2S1F, 25 % G2S2F) 의 수율을 변화시키지 않았다. 용액에서 다음 결과를 얻을 수 있다:
Figure 112019063375772-pct00025
G2F = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
G2S1F = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기 (한 개가 시알리드화됨) 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
G2S2F = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기 (둘 다 시알리드화됨) 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
IgG4 서브클래스의 인간 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화도 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용했다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및 UDP-GAL 을 포함하는 완충 용액과 함께 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 항체가 항체 경쇄 친화도 리간드를 포함하는 칼럼에 결합될 때 더 많은 양의 갈락토실화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063375772-pct00026
G0F = 두 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
G1F = 한 개의 말단 N-아세틸 글루코사민 잔기 및 한 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
G2F = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기 및 푸코오스를 갖는 복합체 N-글리칸
Fc-영역에 동종 글리코실화 (동종 G2F 글리코형) 를 갖는 IgG4 서브클래스의 인간 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화도 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용했다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충 용액과 함께로 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 항체가 항체 경쇄 친화도 리간드를 포함하는 칼럼에 결합될 때 더 많은 양의 시알릴화가 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063375772-pct00027
n.d. = 확인되지 않음
Fab 에 부가적인 글리코실화 부위를 갖는 IgG1 서브클래스의 인간화된 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화도 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용했다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스페라제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충 용액과 함께로 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 이 예에서 Fab 에서의 N-갈락토실화 부위의 글리코실화가 변형되었다. 항체가 항체 경쇄 친화도 리간드를 포함하는 칼럼에 결합될 때 개선된 반응 동역학이 달성됨을 볼 수 있다.
Figure 112019063375772-pct00028
G2 = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기를 갖는 복합체 N-글리칸
G2S1 = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기 (한 개가 시알리드화됨) 를 갖는 복합체 N-글리칸
G2S2 = 두 개의 말단 갈락토오스 잔기 (둘 다 시알리드화됨) 를 갖는 복합체 N-글리칸
IgG1 서브 클래스의 인간화된 항체를 포함하는 무-세포 배양 상청액을 단백질 A 친화도 크로마토그래피 물질 및 항체 경쇄 친화도 리간드 크로마토그래피 물질 (GE Healthcare 사의 Kappa select) 에 적용했다. 결합된 항체를 순차적으로 첫번째는 갈락토실트랜스페라제 (GalT1) 및 UDP-GAL 을 포함하는 완충 용액과 함께, 두번째는 시알릴트랜스퍼라아제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충 용액과 함께 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다. 시알릴트랜스퍼라아제는 6 시간의 인큐베이션 시간 후에 첨가되었다.
단백질 A
Figure 112019063375772-pct00029
Kappa select
Figure 112019063375772-pct00030
정제된 벌크 물질에 대해서도 동일한 실험을 반복했다.
단백질 A
Figure 112019063375772-pct00031
Kappa select
Figure 112019063375772-pct00032
24 시간 후 시알릴트랜스페라제를 첨가한 kappa select 방법의 개선
Figure 112019063375772-pct00033
칼럼 상에서 사용될 때의 효소 재순환
IgG1 서브클래스의 재조합 인간화된 항체를 친화도 크로마토그래피 물질에 항체가 상기 물질에 결합되는 조건 하에 적용했다. 결합된 항체를 갈락토실트랜스퍼라아제 (GalT1) 및 UDP-GAL 를 포함하는 완충제과 함께 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 이러한 용액을 인큐베이션 후에 회수하고 추가의 효소적 변형 반응을 위해 농축 및 완충제 교환에 의해 재-조건화했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다 (24h 시점).
Figure 112019063375772-pct00034
갈락토실트랜스퍼라아제는 첫번째는 효소적 전환 효율의 상실 없이 및 두번째는 약 50 % 의 효소적 전환 효율의 상실로 재사용될 수 있다는 것을 볼 수 있다. IgG1 서브클래스의 재조합 인간화된 항체를 친화도 크로마토그래피 물질에 항체가 상기 물질에 결합되는 조건 하에 적용했다. 결합된 항체를 시알릴트랜스퍼라아제 (ST6) 및 CMP-NANA 를 포함하는 완충 용액과 함께 칼럼 상에서 인큐베이션했다. 이러한 용액을 회수하고 인큐베이션 후에 추가의 효소적 변형 반응을 위해 농축 및 완충제 교환에 의해 재-조건화했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다 (6h 시점).
효소 농도 4 ㎎/㎖
Figure 112019063375772-pct00035
효소 농도 1 ㎎/㎖
Figure 112019063375772-pct00036
시알릴트랜스퍼라아제는 효소적 전환 효율의 상실 없이 적어도 세 번 재사용될 수 있다는 것을 볼 수 있다.
용액에서 사용될 때의 효소 재순환
GalT 및 ST6 과의 공동-인큐베이션
UDP-GAL 및 CMP-NANA 를 포함하는 반응 완충제에서 IgG1 서브클래스의 인간화된 항체, 갈락토실트랜스퍼라아제 (GalT1) 및, 시알릴트랜스퍼라아제 (ST6) 를 공동-인큐베이션했다. 그 후 효소적으로 변형된 항체 및 효소를 양이온 교환 크로마토그래피 (S-세파로오스) 를 사용하여 분리했다. 회수된 효소의 특정 효소적 활성을 각각의 사용 주기 후에 확인했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다.
Figure 112019063375772-pct00037
반응 조건: 25 ㎎ 항체, 2.5 ㎎ GalT, 2.5 ㎎ ST6, 50 mM MES, pH 6.4, 10 ml 반응 부피
S-세파로오스 크로마토그래피 조건: 0.5x10 ㎝ S-세파로오스 칼럼; 20 칼럼 부피 40 mM TRIS pH 7.4 Tris-HCl 로 세척하여 GalT 의 용출을 초래했다; 30 mM MES, 95 mM NaCl, pH 5.6 로의 단계로 항체의 용출; 50 mM MES, pH 6.4, 1 M NaCl 로의 선형 기울기로 ST6 의 용출
SDS-page 겔 분석은 GalT 또는 ST6 의 붕괴 또는 응집 산물의 부재 및 양호한 분리를 보여줬다 (도 1 참조).
GalT, 변형된 항체 및 ST6 은 양이온 교환 칼럼 상에서 분리될 수 있었다.
GalT 과의 인큐베이션
UDP-GAL 를 포함하는 반응 완충제에서 IgG1 서브클래스의 인간화된 항체 및 갈락토실트랜스퍼라아제 (GalT1) 를 공동-인큐베이션했다. 그 후 효소적으로 변형된 항체 및 효소를 양이온 교환 크로마토그래피 (S-세파로오스) 를 사용하여 분리했다. 갈락토실트랜스퍼라아제를 세 번 재사용했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다.
Figure 112019063375772-pct00038
ST6 과의 인큐베이션
CMP-NANA 를 포함하는 반응 완충제에서 IgG1 서브클래스의 인간화된 항체 및 시알릴트랜스퍼라아제 (ST6) 를 공동-인큐베이션했다. 그 후 효소적으로 변형된 항체 및 효소를 양이온 교환 크로마토그래피 (S-세파로오스) 를 사용하여 분리했다. 시알릴트랜스퍼라아제를 세 번 재사용했다. 결과가 하기 표에 제시되어 있다.
Figure 112019063375772-pct00039
본원에서 보고되는 방법에서 사용되는 항체
키메라 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본원에서 보고되는 방법에서 변형된 항체는 키메라 항체이다.
특정 키메라 항체는 예를 들어, US 4,816,567; 및 Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855) 에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 부위 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래한 가변 부위) 및 인간 불변 부위를 포함한다. 추가예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모체 항체의 것으로부터 변화되는 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 이들이 본원에서 보고되는 방법에서 사용되는 항체 경쇄 친화도 리간드에 결합하는 한 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 통상, 비-인간 항체는 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화도을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 이의 일부) 이 비-인간 항체에서 유래하고, FR (또는 이의 일부) 이 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로는 또한, 인간 불변 부위의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에서의 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래하는 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도이 회복되거나 개선된다.
인간화된 항체 및 이의 생성 방법은 예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 에서 검토되며, 예를 들어 Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5, 821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, 및 US 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (특이성 결정 부위 (SDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재표면화 (resurfacing)" 를 기재함); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 을 기재함) 에서 추가로 기재된다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 부위는 비제한적으로 하기를 포함한다: "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 골격 부위 (예를 들어, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 부위의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열에서 유래한 골격 부위 (예를 들어, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이화됨) 골격 부위 또는 인간 생식세포 골격 부위 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝에서 유래한 골격 부위 (예를 들어, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618 참조).
인간 항체
특정 구현예에서, 본원에서 보고되는 방법에서 변형된 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기술을 사용해 제조될 수 있다. 인간 항체는 대체로 문헌 [van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374] 및 [Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459] 에 기술되어 있다.
인간 항체는 항원성 공격에 대응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체 또는 온전한 인간 항체를 생산하도록 변형된 유전자이식 동물에 면역원을 투여하여 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체에 무작위적으로 통합된, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 유전자이식 마우스에서, 내생성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 고찰을 위해, 문헌 [Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조한다. 또한 예를 들어, XENOMOUSE™ 기술을 설명하는 US 6,075,181 및 US 6,150,584; HuMab® 기술을 설명하는 US 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 US 7,041,870; VELOCIMOUSE® 기술을 설명하는 US 2007/0061900, 및 면역재구성 마우스를 설명하는 WO 2007/131676 을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체 유래의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역을 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법으로 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기술되어 있다 (예를 들어, 하기 문헌들을 참조함: [Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005]; [Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63]; 및 [Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95]). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌 [Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562] 에 기술되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어, US 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기술함) 및 [Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268] (인간-인간 하이브리도마를 기술함) 에 기술된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마 기술) 이 또한 문헌 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937] 및 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191] 에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 이후에 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 하기에 기술한다.
라이브러리-유래 항체
본원에서 보고되는 방법에서 변형된 항체는 바람직한 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 관해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 바람직한 결합 특징을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37] 에 검토되어 있고, 예를 들어, 하기 문헌들 [McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554]; [Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]; [Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597]; [Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175]; [Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; [Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; [Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 [Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132] 에 추가로 기술되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, 문헌 [Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455] 에 기술된 바와 같이 VH 및 VL 유전자의 레파토리를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 개별적으로 클로닝시키고 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합시키는데, 이것을 이후에 항원-결합 파지에 대해 스크리닝할 수 있다. 파지는 전형적으로 단쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서, 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원 유래의 라이브러리는 하이브리도마 제작 요구없이 면역원에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 [Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734] 에 기술된 바와 같이 천연 레파토리 (예를 들어, 인간 유래) 를 클로닝하여 임의의 면역화없이 광범위한 비자기-항원 및 또한 자기-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 천연 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388] 에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도의 가변적 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내에서 재배열을 수행하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하는 특허 공개물은 예를 들어, US 5,750,373, 및 US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, 및 US 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주한다.
다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에서 보고되는 방법에서 변형된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 둘의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 다중특이적 (이중특이적) 항체의 단편은 이들이 본원에서 보고되는 방법에서 사용되는 항체 경쇄 친화도 리간드에 결합하는 한 포함된다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기법은 비제한적으로 하기를 포함한다: 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조). 다중-특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체 분자를 만들기 위한 정전 스티어링 효과 (electrostatic steering effect) 조작 (WO 2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 단편의 교차결합 (예를 들어, US 4,676,980, 및 Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위한 류신 지퍼 사용 (예를 들어, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 단편을 생성하기 위한 "디아바디" 기술 사용 (예를 들어, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 및 단일 사슬 Fv (sFv) 이량체 사용 (예를 들어 Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 및 삼중특이적 항체 제조 (예를 들어, Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69 에 기재된 바와 같음) 에 의해 만들어질 수 있다.
"옥토푸스 (Octopus) 항체" 를 포함하는, 3 개 이상의 기능적 항원 결합 위치를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576 참조).
본원에서 보고되는 방법에서 변형된 항체 또는 단편은 또한 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF" (예를 들어 US 2008/0069820 참조) 을 포함한다.
본원에서의 항체 또는 단편은 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 및 WO 2010/145793 에 기재된 다중특이적 항체를 포함한다.
재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어, US 4,816,567 에 기재된 바와 같은, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 이들 방법을 위해 항체를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다.
천연 항체 또는 천연 항체 단편의 경우에 두 개의 핵산이 요구되며, 경쇄 또는 그의 단편을 위한 하나 및 중쇄 또는 그의 단편을 위한 하나이다. 그러한 핵산(들)은 항체의 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩한다 (예를 들어, 항체의 경 및/또는 중쇄(들)). 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 있을 수 있다.
이종이합체성 중쇄를 갖는 이중특이적 항체의 경우에 네 개의 핵산이 요구되며, 제 1 경쇄를 위한 하나, 제 1 이종단량체성 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 제 2 경쇄를 위한 하나, 제 2 경쇄를 위한 하나, 및 제 2 이종단량체성 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 제 2 중쇄를 위한 하나이다. 예를 들어, 이종이합체성 중쇄 중 하나는 소위 "놉 돌연변이" (T366W 및 임의로 S354C 또는 Y349C 중 하나) 를 포함하고, 다른 하나는 소위 "홀 돌연변이" (T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로 Y349C 또는 S354C 중 하나) (참조, 예를 들어, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73) 를 포함한다. 그러한 핵산(들)은 항체의 제 1 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제 1 이종단량체성 Fc-영역을 포함하는 제 1 VH 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제 2 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 제 2 이종단량체성 Fc-영역을 포함하는 제 2 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 제 1 및/또는 제 2 경 및/또는 제 1 및/또는 제 2 중쇄) 을 인코딩한다. 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 있을 수 있으며, 통상적으로 이들 핵산은 두 개 또는 세 개의 발현 벡터 상에 위치하며, 즉 한 개의 벡터는 이들 핵산 중 한 개 초과를 포함할 수 있다. 이들 이중특이적 항체의 예는 CrossMabs 및 T-세포 이중특이적 항체이다 (참조, 예를 들어 Schaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108 (2011) 11187-1191).
하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 방법에서 사용되는 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다.
추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어 이것으로 형질전환된다):
- 천연 항체 또는 천연 항체 단편의 경우에:
(1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는
(2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터.
- 이종이합체성 중쇄를 갖는 이중특이적 항체의 경우에:
(1) 아미노산 서열, 즉 항체의 제 1 VL 를 포함하는 하나 및 제 1 VH 를 포함하는 다른 하나를 인코딩하는 제 1 쌍의 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및
아미노산 서열, 즉 항체의 제 2 VL 를 포함하는 하나 및 제 2 VH 를 포함하는 다른 하나를 인코딩하는 제 2 쌍의 핵산을 포함하는 제 2 벡터, 또는
(2) 가변 도메인 중 하나 (바람직하게는 경쇄 가변 도메인) 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 제 1 핵산을 포함하는 제 1 벡터,
아미노산 서열, 즉 경쇄 가변 도메인을 포함하는 하나 및 제 1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 다른 하나를 인코딩하는 한 쌍의 핵산을 포함하는 제 2 벡터, 및
아미노산 서열, 즉 제 2 벡터와 다른 각각의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 하나 및 제 2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 다른 하나를 인코딩하는 한 쌍의 핵산을 포함하는 제 3 벡터, 또는
(3) 항체의 제 1 VL 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터,
항체의 제 1 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터,
항체의 제 2 VL 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 3 벡터, 및
항체의 제 2 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 4 벡터.
한 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 한 구현예에서, 항체의 생성 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를, 항체 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로는 항체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 회수하고, 본원에서 보고되는 방법으로 항체의 글리코실화를 변형하는 것을 포함한다.
항체의 재조합 생성을 위해, 상기 기재한 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석되거나 재조합 방법에 의해 생산되거나 화학적 합성에 수득될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523 을 참조한다 (또한 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 (대장균에서의 항체 단편 발현을 기재함) 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획물 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가 정제될 수 있다.
원핵세포에 추가로, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵세포성 미생물이 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 를 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생성을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 를 참조한다.
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 조정된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장 주 (예를 들어, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에서 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에서 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁 경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는, DHFR- CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 을 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268] 을 참조한다.
약학적 제형
본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 약학적 제형은 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로, 바람직한 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)). 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 적용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 제한없이 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염형성 반대이온 예컨대 소듐; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함한다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질성 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 을 포함한다. rhuPH20 을 포함하여, 일정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기술되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제형은 US 6,267,958 에 기술되어 있다. 수성 항체 제형은 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기술된 것들을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원에서 제형은 또한 치료하려는 특정 징후에 필요하다면 하나를 초과하는 활성 성분, 바람직하게 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수도 있다. 이러한 활성 성분은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 미세캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 미세에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀션에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)] 에 개시되어 있다.
지속-방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형 물품의 형태, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균성은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 임의의 항체는 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 약제로서 사용을 위한 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체가 제공된다. 추가 양상에서, 질환을 치료하는데 사용을 위한 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체가 제공된다. 일정 구현예에서, 치료 방법에 사용을 위한 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체가 제공된다. 일정 구현예에서, 본 발명은 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에서 사용을 위한 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체를 제공한다. 이러한 하나의 구현예에서, 이 방법은 적어도 하나의 추가적인 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체의 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체를 제공한다. 임의의 상기 구현예에 따라서 "개체" 는 바람직하게 인간이다.
추가 양상에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 약제는 질환의 치료를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 약제의 유효량을 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법에서 사용을 위한 것이다. 이러한 하나의 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 추가의 구현예에서, 약제는 약제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 구현예에 따라서 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 이 방법은 이러한 질환을 갖는 개체에게 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 하나의 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 임의의 상기 구현예에 따라서 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에서 사용을 위한, 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 임의의 항체를 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학적 제형은 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 임의의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 구현예에서, 약학적 제형은 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 임의의 항체 및 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 요법의 다른 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동 투여될 수 있다.
상기에 언급된 이러한 병용 요법은 조합 투여 (둘 이상의 치료제가 동일 또는 개별 제형에 포함된 경우), 및 개별 투여를 포괄하고, 이러한 경우에서, 본 발명의 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 투여는 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 이전에, 그와 동시에, 및/또는 그 이후에 일어날 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내, 또는 약 1 주, 2 주 또는 3 주 이내, 또는 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 6 일 이내에 일어난다. 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체는 또한 방사선 요법과 병용으로 사용될 수 있다.
본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체 (및 임의의 추가적인 치료제)는 비경구, 폐내, 및 비내, 및 국소 치료를 위해 바람직한 경우 병변내 투여를 포함하는, 임의의 적합한 수단으로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 부분적으로 투여가 단시간인지 또는 만성인지 여부에 따라서, 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 제한없이 다양한 시점에 단회 또는 다수회 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.
본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체는 양호한 의료 행위에 일관되는 방식으로 제형화되고, 용량화되고 투여되어진다. 이러한 점에서 고려되는 인자들은 치료하려는 특정 장애, 치료하려는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 항체는 그러할 필요는 없지만, 임의로 대상 장애를 예방하거나 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화된다. 그러한 다른 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 기술된 다른 인자들에 의존적이다. 이들은 일반적으로 본원에서 기술된 바와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 또는 본 명세서에 기술된 용량의 약 1 내지 99%, 또는 임의 용량으로, 실험적으로/임상적으로 적당하다고 결정된 임의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본원에서 보고되는 임의의 방법으로 변형된 항체의 적당한 용량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 조합하여 사용시)은 치료하려는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 이력 및 항체에 대한 반응, 및 참관의의 판단에 따라 좌우될 것이다. 항체는 1회 또는 일련의 치료 동안 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏ (예를 들어, 0.5 ㎎/㎏ - 10 ㎎/㎏) 의 항체가 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여나 연속 주입이건 간에, 환자에게 투여를 위한 초기의 후보 용량일 수 있다. 한가지 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자들에 따라서, 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상 동안 반복 투여를 위해서, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 바람직한 저해가 일어날 때까지 지속되어진다. 항체의 한가지 예시적인 용량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 의 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ (또는 이의 임의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6 용량의 항체를 받도록). 초기에 더 높은 적재 용량 이후에 하나 이상의 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 용량 계획이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 어세이를 통해 쉽게 모니터링된다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보의 개시내용은 그 전문이 참조로 본원에 편입된다.
하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이의 진정한 범주는 첨부된 청구항에 기재된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 기재된 절차에 변형이 가해질 수 있다는 것을 이해한다.
도면의 설명
도 1 본원에서 보고되는 및 실시예 5 에 따른 S-세파로오스 분리의 용출된 분획의 SDS-page.
실시예
GalT 반응 용액 (5 mM MnCl2, 10 mM UDP-Gal, 100 mM MES, 0.05 ㎎/㎖ GalT, pH 6.5):
153 ㎎ UDP-Gal (MW=610.27 g/mol)
32 ㎎ MnCl2 (MW=125.84 g/mol)
일회 사용: 460 ㎕ GalT (c=5.43 ㎎/㎖; 10 ㎍/2 ㎎ 항체 --> 300 ㎕ 중 10 ㎍ = 0.033 ㎎/㎖)
다회 사용: 460 ㎕ GalT (c=5.43 ㎎/㎖; 15 ㎍/1 ㎎ AK --> 300 ㎕ 중 15 ㎍ = 0.05 ㎎/㎖)
100 mM MES 완충제 pH 6.5 중
ST6 반응 용액 (0.1 mM ZnCl2, 200 nM AP, 50 mM MES, 1.7 ㎎/㎖ CMP-NANA, 0.7 ㎎/㎖ ST6, pH 6.5):
50 ㎕ ZnCl (100 mM 용액: 1 ㎖ 50 mM MES 중 13.6 ㎎)
28 ㎕ 알칼리 포스파타아제 (AP) (c = 20 ㎎/㎖, MW = 56,000g/mol)
일회 사용: 167 ㎎ CMP-NANA (1000 ㎍/2 ㎎ 항체 --> 300 ㎕ 중 1000 ㎍ = 3.34 ㎎/㎖)
다회 사용: 83.5 ㎎ CMP-NANA (500 ㎍/1 ㎎ AK --> 300 ㎕ 중 500 ㎍ = 1.67 ㎎/㎖)
일회 사용: 6 ㎖ ST6 (c=5.45 ㎎/㎖, 표적: 300 ㎕ (2 ㎎ AK) 중 200 ㎍ = 0.67 ㎎/㎖)
다회 사용: 6 ㎖ ST6 (c=5.45 ㎎/㎖, 표적: 300 ㎕ (1 ㎎ AK) 중 200 ㎍ = 0.67 ㎎/㎖)
50 mM MES 완충제 pH 6.5 중
완충제:
재생 완충제 1 (0.1 M 인산)
재생 완충제 2 (3 M 구아니딘-HCl)
평형 완충제 (25 mM Tris, 25 mM NaCl, 5mM EDTA, pH7.1)
세척 완충제 1 (100 mM MES, pH 6.5): 1000 ㎖ H2O 중 21.3 ㎎ MES, pH 6.5 (50 % (w/v) NaOH 로 조정됨)
세척 완충제 2 (1 M Tris, pH 7.2)
세척 완충제 3 (50 mM MES, pH 6.5): 세척 완충제 100 mM MES 1:1, 증류한 H2O 함유
용출 완충제 Kappa select (0.1 M 글라이신, pH 2.7): 100 ㎖ H2O 중 750 ㎎ 글라이신, pH 2.7 (25 % (w/v) HCl 로 조정됨)
용출 완충제 단백질 A (25 mM Na-시트레이트, pH 2.8)
실시예 1
칼럼 상에서 벌크 물질의 갈락토실화
ㆍ 2 칼럼 부피 재생 완충제 1, 10 칼럼 부피 평형 완충제 및 4 칼럼 부피 세척 완충제 1 을 적용하여 단백질 A 각각의 Kappa select 칼럼을 재생, 평형 및 세척
ㆍ 2 ㎎ 의 IgG (벌크 물질) 을 칼럼 상에 적용
ㆍ 10 칼럼 부피 세척 완충제 1 로 세척
ㆍ 2 ㎖ 갈락토실화 반응 용액 (0.033 ㎎/㎖ GalT 함유) 을 적용하고, 0.8 ㎖ 가 통과해 흐르게 함
ㆍ 각각 25 ℃ 에서 (2, 7 또는 24 h) 인큐베이션
ㆍ 8 칼럼 부피 세척 완충제 1 로 세척
ㆍ 당해 용출 완충제 (단백질 A 의 경우 2 칼럼 부피; Kappa select 의 경우 8 칼럼 부피) 로 용출 및 pH 조정을 위해 1 M Tris 완충제 (pH 9.0) 를 사용
실시예 2
칼럼 (단백질 A) 상에서 IgG1 벌크 물질의 시알릴화
ㆍ 2 칼럼 부피 재생 완충제 1, 10 칼럼 부피 평형 완충제 및 10 칼럼 부피 세척 완충제 3 을 적용하여 단백질 A 각각의 Kappa select 칼럼을 재생, 평형 및 세척
ㆍ 2 ㎎ 의 IgG (벌크 물질) 을 칼럼 상에 적용
ㆍ 2 ㎖ 시알릴화 반응 용액 (1.7 ㎎/㎖ 대신에 3.3 ㎎/㎖ CMP-NANA, +/- AP) 을 적용하고, 0.8 ㎖ 가 통과해 흐르게 함
ㆍ 각각 37 ℃ (2, 7, 24 또는 48 시간) 및 25 ℃ (48 h) 에서 인큐베이션
ㆍ 4 칼럼 부피 세척 완충제 3 로 세척
ㆍ 2 칼럼 부피의 용출 완충제 (소듐 시트레이트) 로 용출 및 pH 조정을 위해 1 M Tris 완충제 (pH 9.0) 를 사용
칼럼 (Kappa select) 상에서 IgG1 벌크 물질의 시알릴화
ㆍ 2 칼럼 부피 평형 완충제, 3 칼럼 부피 재생 완충제 2, 4 칼럼 부피 평형 완충제 및 2 칼럼 부피 세척 완충제 3 을 적용하여 단백질 A 각각의 Kappa select 칼럼을 재생, 평형 및 세척
ㆍ 2 ㎎ 의 IgG (벌크 물질) 을 칼럼 상에 적용
ㆍ 3 칼럼 부피 세척 완충제 3 로 세척
ㆍ 2 ㎖ 시알릴화 반응 용액 (3.3 ㎎/㎖ CMP-NANA, +/- AP) 을 적용하고, 0.8 ㎖ 가 통과해 흐르게 함
ㆍ 각각 37 ℃ 에서 (2, 7, 및 24 h) 및 25 ℃ 에서 (24 h) 인큐베이션
ㆍ 3 칼럼 부피 세척 완충제 3 로 세척
ㆍ 8 칼럼 부피의 용출 완충제 Kappa select 로 용출 및 pH 조정을 위해 1 M Tris 완충제 (pH 9.0) 를 사용
실시예 3
세포 배양물 상청액의 순차적 갈락토실화 및 시알릴화
ㆍ 2 칼럼 부피 재생 완충제 1, 10 칼럼 부피 평형 완충제를 적용하여 단백질 A 각각의 Kappa select 칼럼을 재생 및 평형
ㆍ 1 ㎎ 의 IgG (상청액 중) 을 칼럼 상에 적용
ㆍ 10 칼럼 부피 평형 완충제, 그 후 2 칼럼 부피 세척 완충제 2 및 6 칼럼 부피 세척 완충제 1 로 세척
ㆍ 2 ㎖ 갈락토실화 반응 용액을 적용하고, 0.8 ㎖ 가 통과해 흐르게 함
ㆍ 25℃ 에서 약 6 내지 24 h 동안 인큐베이션 (충분한 갈락토실화를 허용하기 위해)
ㆍ 8 칼럼 부피 세척 완충제 1, 10 칼럼 부피 평형 완충제, 2 칼럼 부피 세척 완충제 2 및 6 칼럼 부피 세척 완충제 3 로 세척
ㆍ 2 ㎖ 시알릴화 반응 용액을 적용하고, 0.8 ㎖ 가 통과해 흐르게 함
ㆍ 인큐베이션 (예를 들어 25℃ 각각 2, 7 또는 24 h 또는 심지어 더 긴 시간 동안)
ㆍ 8 칼럼 부피 세척 완충제 1 로 세척
ㆍ 당해 용출 완충제 (단백질 A 의 경우 2 칼럼 부피; Kappa select 의 경우 8 칼럼 부피) 로 용출 및 pH 조정을 위해 1 M Tris 완충제 (pH 9.0) 를 사용
실시예 4
벌크 물질의 순차적 갈락토실화 및 시알릴화
ㆍ 2 칼럼 부피 재생 완충제 1, 10 칼럼 부피 평형 완충제 및 4 칼럼 부피 세척 완충제 1 을 적용하여 단백질 A 각각의 Kappa select 칼럼을 재생, 평형 및 세척
ㆍ 1 ㎎ 의 IgG (벌크 물질) 을 칼럼 상에 적용
ㆍ 10 칼럼 부피 세척 완충제 1 로 세척
ㆍ 2 ㎖ 갈락토실화 반응 용액을 적용하고, 0.8 ㎖ 가 통과해 흐르게 함
ㆍ 25℃ 에서 약 6 내지 24 h 동안 인큐베이션 (충분한 갈락토실화를 허용하기 위해)
ㆍ 8 칼럼 부피 세척 완충제 1, 10 칼럼 부피 평형 완충제, 2 칼럼 부피 세척 완충제 2 및 6 칼럼 부피 세척 완충제 3 로 세척
ㆍ 2 ㎖ 시알릴화 반응 용액을 적용하고, 0.8 ㎖ 가 통과해 흐르게 함
ㆍ 인큐베이션 (예를 들어 25℃ 각각 2, 7 또는 24 h 또는 심지어 더 긴 시간 동안)
ㆍ 8 칼럼 부피 세척 완충제 1 로 세척
ㆍ 당해 용출 완충제 (단백질 A 의 경우 2 칼럼 부피; Kappa select 의 경우 8 칼럼 부피) 로 용출 및 pH 조정을 위해 1 M Tris 완충제 (pH 9.0) 를 사용
실시예 5
용액 중 갈락토실화 및 시알릴화 및 효소 회수
ㆍ 10 ㎖ 50 mM MES 완충제 pH 6.4 중 25 ㎎ 항체, 2.5 ㎎ 갈락토실트랜스퍼라아제 및 2.5 ㎎ 시알릴트랜스퍼라아제의 인큐베이션
ㆍ 반응 후에 반응 용액을 50 mM MES pH 6.4 로 평형되는 S-세파로오스 칼럼 (0.5 x 10 ㎝) 에 적용
ㆍ 5 칼럼 부피의 50 mM MES pH 6.4 로 세척하여 미결합 물질을 제거
ㆍ 20 칼럼 부피 40 mM Tris 완충제 pH 7.4 로 칼럼을 세척하여 그에 의해 갈락토실트랜스퍼라아제를 용출
ㆍ 50 mM MES pH 6.4 로 재평형
ㆍ 30 mM MES pH 5.6 및 95 mM NaCl (40 칼럼 부피) 를 포함하는 완충 용액으로 항체를 용출
ㆍ 10 칼럼 부피에 걸쳐 50 mM MES pH 6.4 및 1 M NaCl 로의 선형 기울기로 시알릴트랜스퍼라아제를 용출
ㆍ 표적 효소 또는 인간화된 항체를 함유하는 분획을 모으고 (pooled) 초여과 장치 (Amicon Ultra-15, 10 kDa) 를 사용하여 농축
실시예 6
효소 재사용 시험
ㆍ 갈락토실트랜스퍼라아제: 78.5 ㎕ 반응 완충제 (100 mM MES, 10 mM UDP-Gal, 5 mM MnCl2, pH 6.5) 중 500 ㎍ 항체를 2.5 ㎍ 갈락토실트랜스퍼라아제와 함께 37 ℃ 에서 정의된 시간, 예를 들어 6.5 h 또는 24 h 동안 인큐베이션
ㆍ 시알릴트랜스퍼라아제: 61.8 ㎕ 물 중 500 ㎍ 항체, 물에 용해된 250 ㎍ CMP-NANA, 50 ㎍ 시알릴트랜스퍼라아제, 200 nM 알칼리 포스파타아제, 0.1 mM ZnCl2 를 37 ℃ 에서 정의된 시간, 예를 들어 6.5 또는 24 시간 동안 인큐베이션
ㆍ qTOF-ESMS 에 의한 갈락토실화의 분석: 샘플 (대략 250 ㎍ 항체, 4 M 구아니디늄, TCEP) 의 변성 및 환원; 1 % 포름산 함유 20 % 아세토니트릴로 완충제 교환; ESMS 분석
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Re-use of enzymes in in vitro glycoengineering of antibodies <130> P34038 <150> EP16205586.7 <151> 2016-12-21 <150> EP17157005.4 <151> 2017-02-20 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 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25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a knob mutation <400> 8 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 9 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with the mutations L234A, L235A <400> 9 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn 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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 13 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A, P329G and hole mutation <400> 13 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 14 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A, P329G and knob mutation <400> 14 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 15 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with the mutations L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A and Y407V <400> 15 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 16 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with a L234A, L235A, P329G and S354C, T366W mutation <400> 16 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 17 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with a L234A, L235A, P329G and S354C, T366S, L368A and Y407V mutation <400> 17 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 18 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with a L234A, L235A, P329G and Y349C, T366W mutation <400> 18 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 19 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with the mutations I253A, H310A and H435A <400> 19 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 20 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with the mutations H310A, H433A and Y436A <400> 20 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Ala 195 200 205 Asn His Ala Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 21 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 subclass with the mutations M252Y, S254T and T256E <400> 21 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 22 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 23 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P and L235E mutation <400> 23 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 24 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P, L235E and P329G mutation <400> 24 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 25 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P and L235E mutation <400> 25 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 26 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P, L235E and P329G mutation <400> 26 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 28 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (64)

  1. N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체의 효소적 생산 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a) N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 갖는 항체를 갈락토실트랜스퍼라아제와 시알릴트랜스퍼라아제 및 하나 이상의 활성화된 당 잔기와 함께 N-글리코실화 부위에서 글리코실화를 변형하기에 적합한 조건 하에 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계,
    b) 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 갈락토실트랜스퍼라아제와 시알릴트랜스퍼라아제로부터 분리하고 그에 의해 i) N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하고 ii) 재순환된 갈락토실트랜스퍼라아제 및 재순환된 시알릴트랜스퍼라아제를 얻는 단계, 및
    c) 단계 a) 를 단계 b) 의 재순환된 효소들로 적어도 한 번 반복하는 단계,
    여기서, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 술포프로필 양이온 교환 기를 갖는 가교된 아가로오스의 매트릭스를 가지고,
    양이온 교환 크로마토그래피는 하기 단계를 포함함:
    i) 갈락토실트랜스퍼라아제 및 시알릴트랜스퍼라아제를 포함하는 용액 및 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계,
    ii) 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 임의로 세척하는 단계,
    iii) 제 1 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 갈락토실트랜스퍼라아제를 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용출하는 단계,
    iv) 제 2 용액을 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용출하는 단계, 및
    v) 선형 기울기를 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하고 그에 의해 시알릴트랜스퍼라아제를 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 용출하는 단계,
    여기서,
    - 단계 i) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이고,
    - 단계 ii) 의 용액은 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이고,
    - 단계 iii) 의 용액은 pH 6.6 내지 pH 8.0 의 pH 값을 갖는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충 용액이고,
    - 단계 iv) 의 용액은 75 mM +/- 10% 내지 125 mM +/- 10% 염화 나트륨 (NaCl) 을 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액이고,
    - 선형 기울기는 단계 iv) 의 용액으로부터, 750 mM +/- 10% 내지 1250 mM +/- 10% 염화 나트륨 (NaCl) 을 포함하는 pH 5.0 내지 pH 6.5 의 pH 값을 갖는 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충 용액으로임.
  2. 제 1 항에 있어서, 인큐베이션이 용액에서 또는 항체 친화도 리간드에 결합된 항체로 수행되는 생산 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 항체 친화도 리간드가 항체 경쇄 또는 Fc-영역 친화도 리간드인 생산 방법.
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  9. 제 1 항에 있어서, 갈락토실트랜스퍼라아제가 β4GalT1 인 생산 방법.
  10. 제 2 항에 있어서, 갈락토실트랜스퍼라아제가 β4GalT1 인 생산 방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 갈락토실트랜스퍼라아제가 β4GalT1 인 생산 방법.
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  13. 제 1 항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라아제가 ST6 인 생산 방법.
  14. 제 2 항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라아제가 ST6 인 생산 방법.
  15. 제 3 항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라아제가 ST6 인 생산 방법.
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  17. 제 9 항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라아제가 ST6 인 생산 방법.
  18. 제 10 항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라아제가 ST6 인 생산 방법.
  19. 제 11 항에 있어서, 시알릴트랜스퍼라아제가 ST6 인 생산 방법.
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  38. 제 1 항에 있어서, 단계 ii) 의 세척하는 단계는 미결합 화합물을 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 제거하지만 N-글리코실화 부위에서 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 용출하지 않는 것인, 생산 방법.
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  57. 제 1 항에 있어서, 반복이 1 내지 3 번 수행되는 생산 방법.
  58. 삭제
  59. 제 1 항에 있어서, 항체가 이가 단일특이적 항체 또는 이가 이중특이적 항체 또는 항체 Fab 단편인 생산 방법.
  60. 제 1 항에 있어서, 항체가 키메라 또는 인간화된 또는 인간 항체인 생산 방법.
  61. 제 1 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 생산 방법.
  62. 제 1 항에 있어서, 항체가 인간 IgG1 또는 IgG4 서브클래스의 항체인 생산 방법.
  63. 제 1 항에 있어서, N-글리코실화 부위가 Kabat 에 따라 넘버링된, 아스파라긴 잔기 297 의 Fc-영역 N-글리코실화 부위 또는 Fab 영역 N-글리코실화 부위인 생산 방법.
  64. 제 1 항에 있어서, 선형 기울기는 선형 염 기울기인 생산 방법.
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