KR20220160647A

KR20220160647A - 신규한 지질 및 이의 나노입자 조성물

Info

Publication number: KR20220160647A
Application number: KR1020227037604A
Authority: KR
Inventors: 매튜 지. 스탠톤; 비르테 놀팅
Original assignee: 제너레이션 바이오 컴퍼니
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2022-12-06
Also published as: AU2021241696A1; IL296763A; CN115916163A; US20230159459A1; US20240294474A1; MX2022011988A; CA3173126A1; WO2021195529A3; BR112022019369A2; JP2023518985A; EP4125821A4; EP4125821A2; WO2021195529A2

Abstract

화학식 (I)을 갖는 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 본원에 제공된다:

(I)
[식 중, R¹, R², a 및 b는 본원에 정의된 바와 같음]. 화학식 (I)을 갖는 지질 및 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터(예를 들어, ceDNA)를 포함하는 지질 나노입자(LNP) 조성물이 또한 본원에 제공된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 양태에서, 이러한 LNP는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있다.

Description

신규한 지질 및 이의 나노입자 조성물

관련 출원

본 출원은 2020년 3월 27일자 출원된 미국 임시 출원 제63/000,990호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 전문은 본원에 참조로 인용된다.

서열목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자문서로 제출된 서열목록을 포함하며, 이러한 서열목록은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 2021년 3월 18일자 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 131698_07720_SL.txt이고, 크기는 417바이트이다.

유전자 치료는 비정상적인 유전자 발현 프로파일로 인한 유전적 장애 또는 후천성 질환을 앓고 있는 환자의 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 현재까지 질환을 치료하기 위한 약물로서 치료용 핵산을 환자의 세포에 전달하는 다양한 유형의 유전자 치료가 개발되어 왔다.

교정 유전자를 환자의 표적세포에 전달하여 발현시키는 것은, 조작된 바이러스성 유전자 전달 벡터, 및 잠재적으로 플라스미드, 미니유전자(minigene), 올리고뉴클레오타이드, 미니서클(minicircle) 또는 다양한 폐쇄형 DNA를 사용하는 것을 포함하는 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다. 다수의 이용 가능한 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등) 중에서, 재조합 아데노연관바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus)는 유전자 치료에서 다목적일뿐 아니라, 비교적 신뢰할 수 있는 벡터로 받아들여지고 있다. 하지만, 아데노연관 벡터와 같은 바이러스성 벡터는 면역원성이 높을 수 있고, 특히 재투여와 관련하여 효능을 손상시킬 수 있는 체액성 및 세포 매개 면역을 유도할 수 있다.

비바이러스성 유전자 전달은 바이러스 형질도입과 관련된 특정 단점, 특히 벡터 입자를 형성하는 바이러스 구조 단백질에 대한 체액성 및 세포성 면역반응, 및 임의의 새로운(de novo) 바이러스 유전자 발현으로 인한 단점을 회피한다. 비바이러스성 유전자 전달 기술 중 하나는 양이온성 지질을 담체로 사용하는 것이다.

이온화 가능한 지질은 크게 아민 모이어티와 지질 모이어티로 구성되어 있으며, 양이온성 아민 모이어티와 다가음이온 핵산이 정전기적으로 상호작용하여 양으로 하전된 리포좀 또는 지질막 구조를 형성한다. 따라서, 세포로의 흡수가 촉진되며, 핵산이 세포로 전달된다.

일부 널리 사용되는 이온화 가능한 지질은 CLinDMA, DLinDMA(DODAP로도 공지됨), 및 DOTAP와 같은 양이온성 지질이다. 참고로, 이러한 지질은 간으로의 siRNA 전달에 이용되었지만, 고용량에서의 간독성과 함께 최적이 아닌 전달 효율을 나타내는 문제가 있었다. 현재 양이온성 지질의 단점을 고려할 때, 당업계에는 독성의 감소와 함께 효능의 증강을 나타낼 뿐 아니라, 세포 흡수 및 지질 담체로부터의 핵산 방출과 같은 약동학 및 세포내 동역학의 개선을 나타내는 지질 스캐폴드를 제공하는 것이 필요하다.

하나의 양태에서, 화학식 (I)을 갖는 이온화 가능한 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 본원에 제공된다:

[식 중, R¹, R², a 및 b는 본원에 정의된 바와 같음].

개시된 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다.

본 개시내용의 또 다른 양태는, 본원에 기재된 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 핵산을 포함하는 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 핵산은 이온화 가능한 지질로 캡슐화되어 있다. 특정 구현예에서, 핵산은 폐쇄형 DNA(ceDNA)이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP는 스테롤을 추가로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 스테롤은 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤일 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 20% 내지 약 40%, 예를 들어 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30% 또는 약 30% 내지 약 35%의 몰 백분율로 존재하고, 이온화 가능한 지질은 약 80% 내지 약 60%, 예를 들어 약 80% 내지 약 65%, 약 80% 내지 약 70%, 약 80% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 60%, 약 75% 내지 약 65%, 약 75% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 60% 또는 약 70% 내지 약 60%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 20% 내지 약 40%, 예를 들어 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39% 또는 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 이온화 가능한 지질은 약 80% 내지 약 60%, 예를 들어 약 80%, 약 79%, 약 78%, 약 77%, 약 76%, 약 75%, 약 74%, 약 73%, 약 72%, 약 71%, 약 70%, 약 69%, 약 68%, 약 67%, 약 66%, 약 65%, 약 64%, 약 63%, 약 62%, 약 61% 또는 약 60%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 이온화 가능한 지질은 약 50%의 몰 백분율로 존재한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 콜레스테롤 또는 PEG-지질 접합체와, 비(非)양이온성 지질을 추가로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, PEG-지질 접합체는 약 1.5% 내지 약 3%, 예를 들어 약 1.5% 내지 약 2.75%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 약 1.5% 내지 약 2.25%, 약 1.5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 2.75%, 약 2% 내지 약 2.5%, 약 2% 내지 약 2.25%, 약 2.25% 내지 약 3%, 약 2.25% 내지 약 2.75% 또는 약 2.25% 내지 약 2.5%로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, PEG-지질 접합체는 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2%, 약 2.1%, 약 2.2%, 약 2.3%, 약 2.4%, 약 2.5%, 약 2.6%, 약 2.7%, 약 2.8%, 약 2.9% 또는 약 3%로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 30% 내지 약 50%, 예를 들어 약 30% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 50%, 약 35% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50% 또는 약 45% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%의 몰 백분율로 존재한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질을 추가로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, PEG-지질은 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP는 비양이온성 지질을 추가로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, PEG-지질 접합체는 약 1.5% 내지 약 4%, 예를 들어 약 1.5% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2.5% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 약 2.75%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 약 1.5% 내지 약 2.25%, 약 1.5% 내지 약 2%, 약 1.5% 내지 약 1.75%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 2.75%, 약 2% 내지 약 2.5%, 약 2% 내지 약 2.25%로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, PEG-지질 접합체는 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2%, 약 2.1%, 약 2.2%, 약 2.3%, 약 2.4%, 약 2.5%, 약 2.6%, 약 2.7%, 약 2.8%, 약 2.9% 또는 약 3%로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 약 42.5% 내지 약 62.5%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 약 42.5%, 약 43%, 약 43.5%, 약 44%, 약 44.5%, 약 45%, 약 45.5%, 약 46%, 약 46.5%, 약 47%, 약 47.5%, 약 48%, 약 48.5%, 약 49%, 약 49.5%, 약 50%, 약 50.5%, 약 51%, 51.5%, 약 52%, 약 52.5%, 약 53%, 약 53.5%, 약 54%, 약 54.5%, 약 55%, 약 55.5%, 약 56%, 약 56.5%, 약 57%, 57.5%, 약 58%, 약 58.5%, 약 59%, 약 59.5%, 약 60%, 약 60.5%, 약 61%, 약 61.5%, 약 62% 또는 약 62.5%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 약 2.5% 내지 약 12.5%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 이온화 가능한 지질은 약 52.5%의 몰 백분율로 존재하고, 비양이온성 지질은 약 7.5%의 몰 백분율로 존재하고, PEG-지질은 약 3%로 존재한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물은 덱사메타손 팔미테이트(dexamethasone palmitate)를 추가로 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP의 크기는 직경이 약 50 nm 내지 약 110 nm, 예를 들어 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 50 nm 내지 약 95 nm, 약 50 nm 내지 약 90 nm, 약 50 nm 내지 약 85 nm, 약 50 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 75 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 50 nm 내지 약 65 nm, 약 50 nm 내지 약 60 nm, 약 50 nm 내지 약 55 nm, 약 60 nm 내지 약 110 nm, 약 60 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 95 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm, 약 60 nm 내지 약 85 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 60 nm 내지 약 75 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 60 nm 내지 약 65 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 70 nm 내지 약 95 nm, 약 70 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 85 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 약 70 nm 내지 약 75 nm, 약 80 nm 내지 약 110 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 95 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 85 nm, 약 90 nm 내지 약 110 nm, 또는 약 90 nm 내지 약 100 nm 범위이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP의 크기는 약 100 nm 미만, 예를 들어 약 105 nm 미만, 약 100 nm 미만, 약 95 nm 미만, 약 90 nm 미만, 약 85 nm 미만, 약 80 nm 미만, 약 75 nm 미만, 약 70 nm 미만, 약 65 nm 미만, 약 60 nm 미만, 약 55 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 45 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 35 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 25 nm 미만, 약 20 nm 미만, 약 15 nm 미만 또는 약 10 nm 미만이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP의 크기는 약 70 nm 미만, 예를 들어 약 65 nm 미만, 약 60 nm 미만, 약 55 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 45 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 35 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 25 nm 미만, 약 20 nm 미만, 약 15 nm 미만 또는 약 10 nm 미만이다. 일부 구현예에 따르면, LNP의 크기는 약 60 nm 미만, 예를 들어 약 55 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 45 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 35 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 25 nm 미만, 약 20 nm 미만, 약 15 nm 미만 또는 약 10 nm 미만이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물의 총 지질 대 핵산의 비는 약 10:1이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물의 총 지질 대 핵산의 비는 약 20:1이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 핵산의 비는 약 30:1이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 핵산의 비는 약 40:1이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 핵산의 비는 약 50:1이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP는 조직 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 조직 표적화 모이어티는 암, 간, CNS 또는 근육과 같은 하나 이상의 특정 조직으로의 LNP의 전달에 사용될 수 있는 펩타이드, 올리고당 등일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 조직 표적화 모이어티는 PEG-지질 접합체에 연결된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 조직 표적화 모이어티는 간 특이적 수용체에 대한 리간드이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 간 표적화에 사용되는 간 특이적 수용체에 대한 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)과 같은 올리고당이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 지질 나노입자에 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% 또는 0.1%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.2%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.3%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.4%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.5%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.6%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.7%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.8%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 0.9%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 1.0%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 약 1.5%의 몰 백분율로 존재한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 LNP에 2.0%의 몰 백분율로 존재한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물은 말산과 같은 완충액 중에서 제조된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약 10 mM 내지 약 30 mM, 예를 들어 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 15 mM 내지 약 25 mM, 약 15 mM 내지 약 20 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM 말산 중에서 제조된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약 10 mM 말산, 약 11 mM 말산, 약 12 mM 말산, 약 13 mM 말산, 약 14 mM 말산, 약 15 mM 말산, 약 16 mM 말산, 약 17 mM 말산, 약 18 mM 말산, 약 19 mM 말산, 약 20 mM 말산, 약 21 mM 말산, 약 22 mM 말산, 약 23 mM 말산, 약 24 mM 말산, 약 25 mM 말산, 약 26 mM 말산, 약 27 mM 말산, 약 28 mM 말산, 약 29 mM 말산 또는 약 30 mM 말산 중에서 제조된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약 20 mM 말산을 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물은 약 30 mM 내지 약 50 mM NaCl, 예를 들어 약 30 mM 내지 약 45 mM NaCl, 약 30 mM 내지 약 40 mM NaCl, 약 30 mM 내지 약 35 mM NaCl, 약 35 mM 내지 약 45 mM NaCl, 약 35 mM 내지 약 40 mM NaCl, 또는 약 40 mM 내지 약 45 mM NaCl을 포함하는 용액 중에서 제조된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물은 약 30 mM NaCl, 약 35 mM NaCl, 약 40 mM NaCl 또는 약 45 mM NaCl을 포함하는 용액 중에서 제조된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물은 약 40 mM NaCl을 갖는 용액 중에서 제조된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LNP 조성물은 약 20 mM 내지 약 100 mM MgCl₂, 예를 들어 약 20 mM 내지 약 90 mM MgCl₂, 약 20 mM 내지 약 80 mM MgCl₂, 약 20 mM 내지 약 70 mM MgCl₂, 약 20 mM 내지 약 60 mM MgCl₂, 약 20 mM 내지 약 50 mM MgCl₂, 약 20 mM 내지 약 40 mM MgCl₂, 약 20 mM 내지 약 30 mM MgCl₂, 약 320 mM 내지 약 90 mM MgCl₂, 약 30 mM 내지 약 80 mM MgCl₂, 약 30 mM 내지 약 70 mM MgCl₂, 약 30 mM 내지 약 60 mM MgCl₂, 약 30 mM 내지 약 50 mM MgCl₂, 약 30 mM 내지 약 40 mM MgCl₂, 약 40 mM 내지 약 90 mM MgCl₂, 약 40 mM 내지 약 80 mM MgCl₂, 약 40 mM 내지 약 70 mM MgCl₂, 약 40 mM 내지 약 60 mM MgCl₂, 약 40 mM 내지 약 50 mM MgCl₂, 약 50 mM 내지 약 90 mM MgCl₂, 약 50 mM 내지 약 80 mM MgCl₂, 약 50 mM 내지 약 70 mM MgCl₂, 약 50 mM 내지 약 60 mM MgCl₂, 약 60 mM 내지 약 90 mM MgCl₂, 약 60 mM 내지 약 80 mM MgCl₂, 약 60 mM 내지 약 70 mM MgCl₂, 약 70 mM 내지 약 90 mM MgCl₂, 약 70 mM 내지 약 80 mM MgCl₂, 또는 약 80 mM 내지 약 90 mM MgCl₂을 포함하는 용액 중에서 제조된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 폐쇄형 선형 이중체 DNA이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 상기 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹(flank)하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR: inverted terminal repeat)을 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 2개의 ITR에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 2개의 ITR은 하나의 5' ITR과 하나의 3' ITR을 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 3' 말단에 있는 ITR(3' ITR)에 연결되어 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 5' 말단에 있는 ITR(5' ITR)에 연결되어 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 야생형 AAV ITR이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 변형된 ITR이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 5' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 3' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열의 길이는 적어도 5개 염기쌍 길이이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열의 길이는 5개 내지 100개 염기쌍 길이이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열의 길이는 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개 염기쌍 길이이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열의 길이는 5개 내지 500개 염기쌍 길이이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열의 길이는 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 125개, 130개, 135개, 140개, 145개, 150개, 155개, 160개, 165개, 170개, 175개, 180개, 185개, 190개, 195개, 200개, 205개, 210개, 215개, 220개, 225개, 230개, 235개, 240개, 245개, 250개, 255개, 260개, 265개, 270개, 275개, 280개, 285개, 290개, 295개, 300개, 305개, 310개, 315개, 320개, 325개, 330개, 335개, 340개, 345개, 350개, 355개, 360개, 365개, 370개, 375개, 380개, 385개, 390개, 395개, 400개, 405개, 410개, 415개, 420개, 425개, 430개, 435개, 440개, 445개, 450개, 455개, 460개, 465개, 470개, 475개, 480개, 485개, 490개 또는 495개 염기쌍 길이이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 닉(nick) 또는 갭(gap)을 갖는다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ITR은 AAV 혈청형에서 유도된 ITR, 거위바이러스의 ITR에서 유도된 ITR, B19 바이러스 ITR에서 유도된 ITR, 파르보바이러스(parvovirus) 유래의 야생형 ITR이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12를 포함하는 군에서 선택된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ITR은 돌연변이 ITR이고, ceDNA는 선택적으로 제1 ITR과 상이한 추가의 ITR을 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단 모두에 2개의 돌연변이 ITR을 포함하며, 선택적으로 여기서 2개의 돌연변이 ITR은 대칭 돌연변이이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 CELiD, DNA 기반 미니서클, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.

일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것에 따른 약학적 조성물의 유효량을 유전적 장애를 앓고 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 유전적 장애를 앓고 있는 대상에서 유전적 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 대상은 인간이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 겸상적혈구빈혈, 흑색종, A형 혈우병(응고인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson disease), 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사장애, 레쉬-니한증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상적혈구빈혈, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니빈혈(Fanconi's anemia), 색소성망막염, 모세혈관확장성 운동실조증, 블룸증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종, 점액다당류축적질환(예를 들어, 헐러증후군(Hurler syndrome)(MPS I형), 샤이에증후군(Scheie syndrome)(MPS I형 S), 헐러-샤이에증후군(MPS I형 H-S), 헌터증후군(Hunter syndrome)(MPS II형), 산필리포(Sanfilippo)증후군 A형, B형, C형 및 D형(MPS III형 A, B, C 및 D), 모르키오(Morquio)증후군 A형 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy syndrome)(MPS VI형), 슬라이증후군(Sly syndrome)(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-피크병(Niemann-Pick Disease) A/B형, C1형 및 C2형, 파브리병(Fabry disease), 쉰들러병(Schindler disease), GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병(Sandhoff Disease)), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 이염성 백질디스트로피(Metachromatic Leukodystrophy), 크라베병(Krabbe disease), 점액지질증 I형, II/III형 및 IV형, 시알산증 I형 및 II형, 글리코겐축적질환 I형 및 II형(폼페병(Pompe disease)), 고셰병(Gaucher disease) I형, II형 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병(Batten disease), 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 살라병(Salla disease), 다논병(Danon disease)(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증, 신경원성 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinoses)(CLN1-8, INCL 및 LINCL), 스핑고리피드증, 갈락토시알산증, 근위축측삭경화증(ALS), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 척수소뇌성 실조증, 척수근위축증, 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 뒤시엔느 근위축증(DMD: Duchenne muscular dystrophy), 베커 근위축증(BMD: Becker muscular dystrophy), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB: dystrophic epidermolysis bullosa), 엑토뉴클레오타이드 피로포스파타아제 1 결핍증, 유아기의 전신동맥석회화(GACI: generalized arterial calcification of infancy), 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis), 스타가르트 황반이영양증(Stargardt macular dystrophy)(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC: ornithine transcarbamylase) 결핍증, 어셔증후군(Usher syndrome), 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체증(PFIC: progressive familial intrahepatic cholestasis) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4) 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신(Cathepsin) A 결핍증으로 이루어지는 군에서 선택된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애 레베르 선천성 흑암시(LCA)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, LCA는 LCA10이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 니만-피크병이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 스타가르트 황반이영양증이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 글루코오스-6-포스파타아제(G6Pase) 결핍증(글리코겐축적질환 I형) 또는 폼페병(글리코겐축적질환 II형)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 B형 혈우병(인자 IX 결핍증)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 헌터증후군(점액다당류증(Mucopolysaccharidosis) II형)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 낭포성 섬유증이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 이영양성 수포성 표피박리증(DEB)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 페닐케톤뇨증(PKU)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 진행성 가족성 간내 담즙정체증(PFIC)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 윌슨병이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 고셰병 I형, II형 및 III형이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 연령 관련 황반변성이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 색소성망막염(RP1)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 어셔증후군이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증이다.

상기 간략하게 개략되어 있고 하기 보다 상세하게 논의되는 본 개시내용의 구현예는, 첨부된 도면에 도시된 본 개시내용의 예시적인 구현예를 참조로 이해될 수 있다. 하지만, 첨부된 도면은 본 개시내용의 단지 전형적인 구현예를 예시하는 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 본 개시내용은 다른 동등하게 효과적인 구현예를 허용할 수 있다.
도 1은, 연구 A에서 관찰된 바와 같이, SS-OP(예를 들어, LNP 1, LNP 2, 및 LNP 7 내지 LNP 12)와 비교하여 개시된 지질 나노입자(예를 들어, 지질 1을 포함하는 LNP 5 및 지질 3을 포함하는 LNP 6)를 이용하여 달성된 ceDNA-luc 발현의 개선을 보여준다.
도 2는, 연구 B에서 관찰된 바와 같이, SS-OP(즉, LNP 13)와 비교하여 개시된 지질 나노입자(예를 들어, 지질 2를 포함하는 LNP 16, 지질 1을 포함하는 LNP 17 및 지질 3을 포함하는 LNP 18)를 이용하여 달성된 ceDNA-luc 발현의 개선을 보여준다.
도 3은, 증가된 투여량 수준에 대한 반응성의 개선을 보여주는 것으로, 여기서 마우스에 투여된 투여량 증가는 연구 C에서 관찰된 바와 같이, SS-OP(즉, LNP 19)와 비교하여 개시된 지질 나노입자(예를 들어, 지질 1을 포함하는 LNP 20)를 이용하여 달성된 ceDNA-luc 발현의 더 큰 증가를 유도한다.
도 4a는, 연구 D에서 관찰된 바와 같이, SS-OP(즉, LNP 23)와 비교하여 개시된 지질 나노입자(예를 들어, 지질 6을 포함하는 LNP 24, 지질 7을 포함하는 LNP 25 및 지질 8을 포함하는 LNP 26)를 이용하여 달성된 ceDNA-luc 발현의 개선을 보여준다. 도 4b는, 대조군으로 사용된 이온화 가능한 지질 A(즉, LNP 22)와 비교하여 개시된 지질 나노입자(예를 들어, 지질 6을 포함하는 LNP 24, 지질 7을 포함하는 LNP 25 및 지질 8을 포함하는 LNP 26)를 이용한 경우 마우스에서의 내약성(체중의 변화로 측정됨)의 개선을 보여준다.
도 5a는, SS-OP(즉, LNP 27)와 비교하여 개시된 지질 나노입자(예를 들어, 지질 9를 포함하는 LNP 28 및 지질 10을 포함하는 LNP 29)를 이용하여 달성된 ceDNA-luc 발현의 개선을 보여준다. 도 5b는, 도 5a에 도시된 ceDNA-luc 발현의 개선이 마우스에서 개시된 지질 나노입자의 내약성을 손상시키지 않았음을 보여준다.

본 개시내용은 세포의 세포질에서 핵으로 이동할 수 있고, 높은 수준의 발현을 유지할 수 있는 바이러스성 또는 비(非)바이러스성 벡터(예를 들어, 폐쇄형 DNA)와 같은 치료용 핵산(TNA)을 전달하기 위한 지질 기반 플랫폼을 제공한다. 예를 들어, 바이러스성 벡터 기반 유전자 치료와 관련된 면역원성은 기존 배경 면역으로 인해 치료될 수 있는 환자의 수를 제한할 뿐 아니라, 각 환자의 유효 수준으로 적정하거나 장기간에 걸쳐 효과를 유지하기 위해 환자에게 재투여하는 것을 막는다. 나아가, 다른 핵산 양식은 일련의 면역반응을 촉발시키는 선천성 DNA 또는 RNA 감지 메커니즘으로 인해 면역원성에 큰 문제가 있다. 기존 면역의 결여로 인해, 본원에서 기재된 TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는, 필요한 경우, mRNA, siRNA 또는 ceDNA와 같은 TNA의 추가 용량을 허용하며, 조직 성장 시 후속 용량이 필요할 수 있는 소아 집단을 포함하여 환자 접근을 추가로 확장시킨다. 나아가, 본 개시내용은, 특히 하나 이상의 3차 아미노기와 디설파이드 결합을 포함하는 지질 조성물을 포함하는 TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)가 TNA(예를 들어, ceDNA)의 더 효율적인 전달, 더 양호한 내약성 및 개선된 안전성 프로파일을 제공한다는 것을 발견하였다. 본원에 기재된 TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 바이러스 캡시드 내 공간에 의해 부가되는 패키징 제약이 없기 때문에, 이론상, TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 유일한 크기 제한은 숙주세포의 발현(예를 들어, DNA 복제 또는 RNA 번역) 효율에 있다.

특히 희귀 질환 치료제 개발에 있어서 가장 큰 장애물 중 하나는, 많은 수의 개별 병태이다. 지구 상에서 대략 3억 5천만명의 사람들이, 진단받은 사람이 200,000명 미만인 장애 또는 병태로 미국국립보건원(National Institutes of Health)에서 정의한, 희귀 장애를 갖고 살고 있다. 이러한 희귀 장애 중 약 80%는 유전적 기원이며, 이 중 약 95%는 FDA가 승인한 치료법이 없다(rarediseases.info.nih.gov/diseases/pages/31/faqs-about-rare-diseases). 본원에 기재된 TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 이점 중 하나는, TNA의 특정 방식으로 치료될 수 있는 다수의 질환, 특히 다수의 유전적 장애 또는 질환을 위한 치료의 현재 상태를 유의미하게 변경시킬 수 있는 희귀 단일유전자 질환에 신속하게 적용될 수 있는 접근법을 제공한다는 것이다.

I. 정의

"알킬"이라는 용어는 1가 포화, 직쇄(즉, 비분지형) 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 예시적인 알킬기에는, 비제한적으로, 에틸, 프로필, 이소프로필, 2-메틸-1-부틸, 3-메틸-2-부틸, 2-메틸-1-펜틸, 3-메틸-1-펜틸, 4-메틸-1-펜틸, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 2,2-디메틸-1-부틸, 3,3-디메틸-1-부틸, 2-에틸-1-부틸, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데카닐, 운데카닐, 도데카닐, 트리데카닐, 테트라데카닐, 펜타데카닐, 헥사데카닐, 헵타데카닐, 옥타데카닐, 노나데카닐, 에이코사닐 등이 포함된다.

"알케닐"이라는 용어는, 하나 이상(예를 들어, 1개 또는 2개)의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 지방족 탄화수소 라디칼을 나타내며, 여기서 알케닐 라디칼은 "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 대안적인 명명법에 따라 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다.

본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는, 본 발명의 이온화 가능한 지질의 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 염을 나타낸다. 예시적인 염에는, 비제한적으로, 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트 "메실레이트", 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌비스(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염, 알칼리 금속(예를 들어, 소듐 및 포타슘) 염, 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘) 염, 및 암모늄 염이 포함된다. 약학적으로 허용 가능한 염은 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온과 같은 또 다른 분자의 혼입을 포함할 수 있다. 반대이온은 모(parent) 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 나아가, 약학적으로 허용 가능한 염은 이의 구조에 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약학적으로 허용 가능한 염의 일부인 경우에는, 다수의 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 약학적으로 허용 가능한 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 "약"이라는 용어는, 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 나타낼 때, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 보다 더욱 바람직하게는 ±1%, 보다 더욱 바람직하게는 ±0.5% 및 더 더욱 바람직하게는 ±0.1%의 차이를 포함하는 것으로 의도되는 데, 이러한 차이가 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 적합하기 때문이다.

본원에 사용된 "포함하다", "포함하는" 및 "~으로 구성된"은, "포함되다", "포함하여" 또는 "함유하다", "함유하는"과 동의어임을 의미하는 것으로, 다음에 오는 것, 예를 들어 구성요소의 존재를 명시하는 포괄적이거나 개방적인 용어이며, 당업계에 공지된 또는 본원에 개시된 추가의 인용되지 않은 구성요소, 특징, 요소, 구성원, 단계의 존재를 배제하거나 제외시키지 않는다.

"~로 이루어진"이라는 용어는, 구현예의 설명에 인용되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 공정 및 이의 각 구성요소를 나타낸다.

본원에 사용된 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는, 주어진 구현예에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는, 본 발명의 구현예의 기본적인 및 신규한 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.

본원에 사용된 "투여", "투여하는"이라는 용어 및 이의 변형은, 대상에게 조성물 또는 작용제(예를 들어, 핵산, 특히 ceDNA)를 도입하는 것을 나타내며, 하나 이상의 조성물 또는 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함한다. "투여"는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. "투여"는 또한 시험관내 및 생체외 처리를 포함한다. 대상으로의 조성물 또는 작용제의 도입은, 경구, 폐, 비강, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 종양내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 이루어진다. 투여는 자가 투여와 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상의 정맥에 도입하는 방식으로 투여된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 양태에서, "투여"는 치료적 투여를 나타낸다.

본원에 사용된 "항-치료용 핵산 면역반응", "항-전달 벡터 면역반응", "치료용 핵산에 대한 면역반응", "전달 벡터에 대한 면역반응" 등의 구절은, 바이러스 또는 비바이러스 기원의 치료용 핵산에 대한 임의의 목적하지 않는 면역반응을 나타낸다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 목적하지 않는 면역반응은 바이러스성 전달 벡터 자체에 대한 항원 특이적 면역반응이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 면역반응은 이중가닥 DNA, 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA일 수 있는 전달 벡터에 특이적이다. 다른 구현예에서, 면역반응은 전달 벡터의 서열에 특이적이다. 다른 구현예에서, 면역반응은 전달 벡터의 CpG 함량에 특이적이다.

본원에 사용된 "담체" 및 "부형제"라는 용어는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 숙주에게 투여될 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA"라는 용어는, 합성 또는 그 이외의 다른 비바이러스성 유전자 전달을 위한 캡시드 미함유 폐쇄형 선형 이중가닥(ds) 이중체 DNA를 나타낸다. ceDNA에 대한 상세한 설명은, 2017년 3월 3일자 출원된 국제출원 PCT/US2017/020828에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 세포 기반 방법을 사용하는 다양한 역말단반복(ITR) 서열 및 구성을 포함하는 ceDNA의 특정 생산 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US18/49996 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 실시예 1에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 다양한 ITR 서열 및 구성을 포함하는 합성 ceDNA 벡터의 특정 생산 방법은, 예를 들어 2019년 1월 18일자 출원된 국제출원 PCT/US2019/14122에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다. 본원에 사용된 "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 폐쇄형 선형 이중체(CELiD) CELiD DNA이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 DNA 기반 미니서클이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE: minimalistic immunological-defined gene expression) 벡터이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 미니스트링 DNA이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 doggybone™ DNA이다.

본원에 사용된 "ceDNA-박미드"라는 용어는, 플라스미드로서 대장균에서 증식할 수 있고, 따라서 바큐로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있는, 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바큐로바이러스 게놈을 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스"라는 용어는, 바큐로바이러스 게놈 내에 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바큐로바이러스를 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-바큐로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주세포(비제한적으로, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 포함)를 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA 게놈"이라는 용어는, 적어도 하나의 역말단반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 나타낸다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 이중체 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 혼입된다.

본원에 사용된 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 비(非)코딩 서열(예를 들어, DNA 표적화 RNA) 또는 코딩 서열(예를 들어, 부위 지정 변형 폴리펩타이드 또는 Cas9/Csn1 폴리펩타이드)을 제공하고/하거나 이의 전사를 조절하고/하거나, 인코딩된 폴리펩타이드의 전사를 조절하는, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자, 단백질 분해 신호 등과 같은 전사 및 번역 제어 서열을 나타낸다.

본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는, 세포에 존재하는 물질로서 이의 본래의 근원이 아닌 물질을 나타낸다. 본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산(예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산) 또는 폴리펩타이드로서, 통상적으로 발견되지 않으며, 인간이 이러한 세포 또는 유기체에 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대안적으로, "외인성"은, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산 또는 폴리펩타이드로서, 비교적 낮은 수준으로 발견되며, 인간이, 예를 들어 이소성(ectopic) 발현 또는 수준을 생성하도록 이러한 세포 또는 유기체 내 핵산 또는 폴리펩타이드의 양을 증가시키고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대조적으로, 본원에 사용된 "내인성"이라는 용어는, 생물학적 시스템 또는 세포에 고유한 물질을 나타낸다.

본원에 사용된 "발현"이라는 용어는, 적용 가능한 경우, 비제한적으로, 예를 들어 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리를 포함하는, RNA 및 단백질의 생산, 및 적절한 경우, 단백질 분비에 관여하는 세포 과정을 나타낸다. 본원에 사용된 "발현 산물"이라는 구절에는, 유전자에서 전사된 RNA(예를 들어, 전이유전자), 및 유전자에서 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩타이드가 포함된다.

본원에 사용된 "발현 벡터"라는 용어는, 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 벡터를 나타낸다. 발현된 서열은 종종, 반드시는 아니지만, 숙주세포에 대해 이종성일 수 있다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있기 때문에, 2가지 유기체에서, 예를 들어 인간 세포에서 발현을 위해, 원핵 숙주에서 클로닝 및 증폭을 위해 유지될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.

본원에 사용된 "발현 카세트" 및 "발현 유닛"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, DNA 벡터, 예를 들어 합성 AAV 벡터의 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 프로모터 또는 다른 DNA 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 DNA 서열을 나타낸다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 조직 특이적 프로모터가 포함된다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.

본원에 사용된 "플랭킹"이라는 용어는, 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 나타낸다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B는 A와 C에 의해 플랭킹되어 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 플랭킹하는 서열은 플랭킹된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 플랭킹된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 플랭킹이라는 용어는, 선형 단일가닥 합성 AAV 벡터의 각 말단에 있는 말단반복서열을 나타낸다.

본원에 사용된 "유전자"라는 용어는, 시험관내 또는 생체내에서 주어진 RNA 또는 단백질의 발현과 관련된 핵산의 임의의 분절을 나타내는 것으로 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 발현된 RNA를 인코딩하는 영역(전형적으로 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함함), 및 종종 이의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝, 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있으며, 구체적으로 목적하는 매개변수를 갖도록 설계된 서열을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "유전 질환" 또는 "유전적 장애"라는 구절은, 부분적으로 또는 완전히, 직접적으로 또는 간접적으로, 게놈 내 하나 이상의 비정상에 의해 유발된 질환으로, 특히 출생 시부터 존재한 병태를 포함하는 질환을 나타낸다. 비정상은 유전자에서의 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 비정상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다.

본원에 사용된 "이종"이라는 용어는, 각각, 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 나타낸다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 자연 발생 핵산 서열(또는 이의 변이체)에 연결되어, 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오타이드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 변이형 폴리펩타이드에 연결되어, 융합 변이형 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성할 수 있다.

본원에 사용된 "숙주세포"라는 용어는, 본 개시내용의 핵산 치료제를 이용한 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 유형을 나타낸다. 비제한적인 예로서, 숙주세포는 단리된 1차 세포, 다능성줄기세포, CD34⁺ 세포, 유도된 다능성줄기세포, 또는 다수의 불멸화된 세포주 중 임의의 것(예를 들어, HepG2 세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주세포는 조직, 기관 또는 유기체의 제자리 또는 생체내 세포일 수 있다. 나아가, 숙주세포는, 예를 들어 포유류 대상(예를 들어, 유전자 치료를 필요로 하는 인간 환자)의 표적세포일 수 있다.

본원에 사용된 "유도성 프로모터"는, 유도제 또는 유도 작용제의 존재 하에 있거나, 이에 의해 영향을 받거나 또는 이와 접촉될 때 전사 활성을 개시하거나 증강시키는 것을 특징으로 하는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 "유도제" 또는 "유도 작용제"는, 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는 데 활성이 되는 방식으로 투여되는, 내인성, 또는 통상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 유도제 또는 유도 작용제, 즉, 화학물질, 화합물 또는 단백질은, 그 자체가 핵산 서열의 전사 또는 발현 결과일 수 있으며(즉, 유도제는 또 다른 구성요소 또는 모듈에 의해 발현된 유도제 단백질일 수 있음), 이는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 억제제와 같은 특정 작용제의 부재 하에서 유도된다. 유도성 프로모터의 예에는, 비제한적으로, 테트라시클린(tetracycline), 메탈로티오닌(metallothionine), 엑디손(ecdysone), 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유선종양바이러스 긴말단반복서열(MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드 반응성 프로모터, 라파마이신(rapamycin) 반응성 프로모터 등이 포함된다.

본원에 사용된 "시험관내"라는 용어는, 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 검정 및 방법을 나타내며, 세포를 포함하지 않는 배지와 같은 비(非)세포 시스템, 또는 세포 추출물과 같은 세포 시스템에 프로그래밍 가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 "생체내"라는 용어는, 다세포 동물과 같은 유기체에서 또는 유기체 내에서 일어나는 검정 또는 과정을 나타낸다. 본원에 기재된 일부 양태에서, 방법 또는 용도는, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때, "생체내"에서 일어난다고 할 수 있다. "생체외"라는 용어는, 다세포 동물 또는 식물의 체외, 예를 들어 특히 외식편, 배양된 세포(1차 세포 및 세포주 포함), 형질전환된 세포주 및 추출된 조직 또는 세포(혈액 세포 포함)에 있는 온전한 막을 갖는 살아있는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 나타낸다.

본원에 사용된 "지질"이라는 용어는, 비제한적으로, 지방산의 에스테르를 포함하고, 물에서는 불용성이지만, 다수의 유기 용매에서는 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물의 군을 나타낸다. 이는 통상적으로 적어도 3가지 부류로 분류된다: (1) 지방 및 오일뿐 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도된 지질".

인지질의 대표적인 예에는, 비제한적으로, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 및 디리놀레오일포스파티딜콜린이 포함된다. 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤 및 β-아실옥시산과 같은 인이 결여된 다른 화합물도, 양친매성 지질로 지정된 군에 속한다. 또한, 상기 기재된 양친매성 지질은 트리글리세리드와 스테롤을 비롯한 다른 지질과 혼합될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 조성물은 하나 이상의 3차 아미노기, 하나 이상의 페닐 에스테르 결합 및 디설파이드 결합을 포함한다.

본원에 사용된 "지질 접합체"라는 용어는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 응집을 저해하는 접합된 지질을 나타낸다. 이러한 지질 접합체에는, 비제한적으로, 예를 들어 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어 미국 특허 제5,885,613호 참조)와 같은 PEG-지질 접합체, 이온화 가능한 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체; 예를 들어 2010년 1월 13일자 출원된 미국 임시출원 제61/294,828호 및 2010년 1월 14일자 출원된 미국 임시출원 제61/295,140호 참조), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물이 포함된다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는, 국제공개 WO 2010/006282호에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키는 데 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 비에스테르 함유 링커 모이어티와 에스테르 함유 링커 모이어티가 포함된다. 특정 바람직한 구현예에서, 아미드 또는 카르바메이트와 같은 비에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 본원에 기재된 지질 접합체(예를 들어, PEG-지질 또는 PEG화 지질)는 당업계에 공지된 유용한 조직 표적화 모이어티(예를 들어, N-아세틸갈락토사민(GalNAc; 1개, 2개, 3개 또는 4개 가지(antennary) GalNAc))에 추가로 공유결합으로 연결될 수 있다.

본원에 사용된 "지질 캡슐화(된)"라는 용어는, 핵산(예를 들어, ASO, mRNA, siRNA, ceDNA, 바이러스성 벡터)과 같은 활성제 또는 치료제가 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 모두가 되도록 하는 지질 입자를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 지질 입자에 완전히 캡슐화되어 있다(예를 들어, 핵산 함유 지질 입자를 형성함).

본원에 사용된 "지질 입자" 또는 "지질 나노입자"라는 용어는, 핵산 치료제(TNA)와 같은 치료제를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)로 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형("TNA 지질 입자", "TNA 지질 나노입자", 또는 "TNA LNP"로 지칭됨)을 나타낸다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 전형적으로 이온화 가능한 지질, 비양이온성 지질, 및 선택적으로 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질로 형성된, 치료용 핵산 함유 지질 입자이다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료용 핵산과 같은 치료제는 입자의 지질 부분에 캡슐화되어, 효소적 분해로부터 보호될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자는 핵산(예를 들어, ceDNA)과, 하나 이상의 3차 아미노기, 하나 이상의 페닐 에스테르 결합 및 디설파이드 결합을 포함하는 지질을 포함한다.

본 발명의 지질 입자의 평균 직경은 전형적으로 약 20 nm 내지 약 120 nm, 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 55 nm, 약 60 nm, 약 65 nm, 약 70 nm, 약 75 nm, 약 80 nm, 약 85 nm, 약 90 nm, 약 95 nm, 약 100 nm, 약 105 nm, 약 110 nm, 약 115 nm, 약 120 nm, 약 125 nm, 약 130 nm, 약 135 nm, 약 140 nm, 약 145 nm 또는 약 150 nm이다.

본원에 사용된 "소수성 지질"이라는 용어는, 비제한적으로, 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로시클릭 기(들)로 선택적으로 치환된 이러한 기를 포함하는 비(非)극성기를 갖는 화합물을 나타낸다. 적합한 예에는, 비제한적으로, 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N,N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판이 포함된다.

본원에 사용된 "이온화 가능한 지질"이라는 용어는, 지질이 생리학적 pH(예를 들어, pH 7.4) 이하에서는 양으로 하전되고, 제2 pH, 바람직하게는 생리학적 pH 이상에서는 중성이 되도록, 적어도 하나의 양성자화 가능한 또는 탈양성자화 가능한 기를 갖는 지질, 예를 들어 양이온성 지질을 나타낸다. 당업자는, pH의 함수로서 양성자의 부가 또는 제거가 평형 과정이고, 하전된 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 종의 성질을 나타내며, 모든 지질이 하전된 또는 중성 형태로 존재할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질의 양성자화 가능한 기의 pKa는 약 4 내지 약 7 범위이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 "절단 가능한 지질" 또는 "SS-절단 가능한 지질"을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 "이온화 가능한 지질"이라는 용어는, 본 발명의 지질의 이온화된(또는 하전된) 형태와 중성 형태를 모두 포함한다.

본원에 사용된 "중성 지질"이라는 용어는, 선택된 pH에서 하전되지 않은 또는 중성의 쯔비터이온(zwitterionic) 형태로 존재하는 임의의 지질 종을 나타낸다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질에는, 예를 들어 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드 및 디아실글리세롤이 포함된다.

본원에 사용된 "음이온성 지질"이라는 용어는, 생리학적 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 나타낸다. 이러한 지질에는, 비제한적으로, 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 연결된 기타 음이온성 변형기가 포함된다.

본원에 사용된 "비양이온성 지질"이라는 용어는, 임의의 양친매성 지질뿐 아니라, 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질을 나타낸다.

본원에 사용된 "절단 가능한 지질" 또는 "SS-절단 가능한 지질"이라는 용어는, 디설파이드 결합 절단 가능한 단위를 포함하는 지질을 나타낸다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 막 불안정화를 위해 산성 구획, 예를 들어 엔도좀 또는 리소좀에 반응하는 3차 아민과, 세포질과 같은 환원 환경에서 절단될 수 있는 디설파이드 결합을 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 이온화 가능한 지질이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 양이온성 지질이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질이다. 절단 가능한 지질은 본원에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본원에 사용된 "유기 지질 용액"이라는 용어는, 지질을 갖는 유기 용매를, 전체적으로 또는 부분적으로, 포함하는 조성물을 나타낸다.

본원에 사용된 "리포좀"이라는 용어는, 수성 외부와 분리된 내부 수성 용적을 캡슐화하는 구형 구성으로 어셈블링된 지질 분자를 나타낸다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 전형적으로 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "국소 전달"이라는 용어는, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 활성제를 유기체 내 표적 부위에 직접 전달하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 작용제는 종양과 같은 질환 부위 또는 염증 부위와 같은 다른 표적 부위, 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사하는 방식으로 국소적으로 전달될 수 있다.

본원에 사용된 "neDNA" 또는 "닉킹된(nicked) ceDNA"라는 용어는, 오픈리딩프레임(예를 들어, 발현시키고자 하는 프로모터와 전이유전자)의 스템 영역 또는 스페이서 영역 5' 업스트림에 2개 내지 100개 염기쌍의 닉 또는 갭을 갖는 폐쇄형 DNA를 나타낸다.

본원에 사용된 "핵산"이라는 용어는, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 함유하는 중합체(즉, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)를 나타내며, 이에는 DNA, RNA 및 이의 혼성체가 포함된다. DNA는, 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이러한 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클, 플라스미드, 박미드, 미니유전자, 미니스트링 DNA(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 폐쇄형 선형 이중체 DNA(CELiD 또는 ceDNA), doggybone™ DNA, 덤벨형 DNA, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스성 RNA(vRNA), 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산에는, 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지된 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예에는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA™) 및 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP, 및 상보적 서열뿐 아니라, 명백하게 제시된 서열을 암시적으로 포함한다.

본원에 사용된 "핵산 치료제", "치료용 핵산" 및 "TNA"라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 양식을 나타낸다. 본원에 사용된 이러한 구절은 RNA 기반 치료제와 DNA 기반 치료제를 나타낸다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 및 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다. 본원에 사용된 "TNA LNP"라는 용어는, 상기 기재된 바와 같은 TNA 중 적어도 하나를 함유하는 지질 입자를 나타낸다.

본원에 사용된 "뉴클레오타이드"는, 당 옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA), 염기, 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다.

본원에 사용된 "작동 가능하게 연결된"이란, 기재된 바와 같은 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 근접부위(juxtaposition)를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 할 수 있다. "작동 가능하게 연결된", "작동적으로 배치된", "작동적으로 연결된", "제어 하에 있는" 및 "전사 제어 하에 있는"이라는 구절은, 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 조절하는 핵산 서열에 대해 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 "역 프로모터"는, 코딩 가닥이 비코딩 가닥이 되고, 그 반대로도 되도록, 핵산 서열이 역 배향으로 존재하는 프로모터를 나타낸다. 역 프로모터 서열은 다양한 구현예에서 스위치의 상태를 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.

본원에 사용된 "프로모터"라는 용어는, 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있는 핵산 서열의 전사를 유도하는 방식으로 또 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 나타낸다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직 특이적, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사인자와 같은, 조절 단백질 및 분자에 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위뿐 아니라, RNA 폴리머라아제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵생물 프로모터는 종종, 항상은 아니지만, "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 함유할 것이다. 유도성 프로모터를 비롯한 다양한 프로모터는, 본원에 개시된 합성 AAV 벡터의 전이유전자의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 3' 말단에 결합될 수 있으며, 배경 위에서 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는 데 필요한 최소한의 염기 또는 요소의 수를 포함하도록 업스트림(5' 방향)으로 연장된다.

프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리하여 얻을 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 코딩 핵산 분절은 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 배치되며, 여기서 두 가지 프로모터는 모두 자연 환경에서 작동 가능하게 연결된 인코딩된 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 프로모터를 나타낸다. 유사하게, "재조합 또는 이종 인핸서"는, 자연 환경에서 주어진 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 인핸서를 나타낸다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포에서 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "자연 발생"이 아닌, 즉, 상이한 전사조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당업계에 공지된 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터와 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본원에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술(PCR 포함)을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호(이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용됨) 참조). 나아가, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비(非)핵 세포소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 이용될 수 있다고 고려된다.

본원에 사용된 "Rep 결합 부위"("RBS") 및 "Rep 결합 요소"("RBE")라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의해 결합될 때, Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 이의 부위 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있게 하는 Rep 단백질(예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 나타낸다. RBS 서열과 이의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 식별된 RBS 서열인 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'를 포함한다.

본원에 사용된 "재조합 벡터"라는 구절은, 이종 핵산 서열, 또는 생체내에서 발현 가능한 "전이유전자"를 포함하는 벡터를 나타낸다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 벡터가 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 벡터는 에피솜이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 대상에서 관심 뉴클레오타이드를 염색체외 DNA에 높은 카피수로 유지하여, 염색체 통합의 잠재적인 영향을 제거하는 수단을 제공한다.

본원에 사용된 "리포터"라는 용어는, 검출 가능한 판독물을 제공하는 데 사용될 수 있는 단백질을 나타낸다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 용이하게 관찰되는 단백질을 인코딩한다.

본원에 사용된 "센스" 및 "안티센스"라는 용어는, 폴리뉴클레오타이드에서의 구조 요소의 배향을 나타낸다. 요소의 센스 및 안티센스 버전은 서로 역 보체이다.

본원에 사용된 "서열 동일성"이라는 용어는, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 본 개시내용의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 상기 Rice 등의 문헌(2000) 참조)의 니들(Needle) 프로그램(바람직하게는 버전 3.0.0 이상)에서 구현된 바와 같이 니들만 브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(상기 Needleman 및 Wunsch의 문헌(1970) 참조)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 매개변수는 갭 오픈 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성"의 출력(-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)은 동일성%로 사용되며, 이는 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시뉴클레오타이드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬의 총 갭 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 25개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오타이드이다.

본원에 사용된 "스페이서 영역"이라는 용어는, 벡터 또는 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타낸다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, AAV 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 벡터 또는 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 클로닝 부위를 위한 편리한 위치 및 염기쌍의 설계 번호의 갭을 제공하여 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 "폴리링커" 또는 "다중클로닝 부위", 또는 공지된 단백질(예를 들어, 전사인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비오픈리딩프레임 서열은, 시스-작용 인자를 분리하기 위해, 예를 들어 6량체, 12량체, 18량체, 24량체, 48량체, 86량체, 176량체 등을 삽입하는 방식으로, 벡터 또는 게놈에 배치될 수 있다.

본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 본 발명에 따른 치료용 핵산으로 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 나타낸다. 통상적으로, 동물은, 비제한적으로, 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는, 비제한적으로, 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 스파이더 원숭이, 및 마카크(macaque), 예를 들어 레서스(Rhesus)가 포함된다. 설치류에는, 마우스, 래트, 마멋(woodchuck), 페럿(ferret), 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는, 비제한적으로, 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종류(예를 들어, 집고양이), 갯과 종류(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류(예를 들어, 닭, 에뮤, 타조) 및 어류(송어, 메기 및 연어)가 포함된다. 본원에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상은 포유류, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상은 남성(수컷) 또는 여성(암컷)일 수 있다. 또한, 대상은 유아 또는 어린이일 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상은 신생아 또는 태어나지 않은 대상, 예를 들어 자궁에 있는 대상일 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물에 대해 사용될 수 있다. 인간 대상은 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카시안(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상은 임상 환경에 있는 환자 또는 다른 대상일 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상은 이미 치료를 받고 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상은 배아, 태아, 신생아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상은 인간 태아, 인간 신생아, 인간 유아, 인간 아동, 인간 청소년 또는 인간 성인이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상은 동물 배아, 비인간 배아 또는 비인간 영장류 배아이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상은 인간 배아이다.

본원에 사용된 "이를 필요로 하는 대상"이라는 구절은, 이러한 구절의 맥락 및 용법이 달리 지시되지 않는 한 (i) 본원에 기재된 발명에 따른 TNA 지질 입자(또는 TNA 지질 입자를 포함하는 약학적 조성물)를 투여받게 되는 대상, (ii) 본원에 기재된 발명에 따른 TNA 지질 입자(또는 TNA 지질 입자를 포함하는 약학적 조성물)를 투여받고 있는 대상; 또는 (iii) 본원에 기재된 발명에 따른 TNA 지질 입자(또는 TNA 지질 입자를 포함하는 약학적 조성물)를 투여받은 적이 있는 대상을 나타낸다.

본원에 사용된 "억제하다", "감소시키다", "방해하다", "저해하다" 및/또는 "줄이다" (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 감소시키는 작용을 나타낸다.

본원에 사용된 "합성 AAV 벡터" 및 "AAV 벡터의 합성 생산"이라는 용어는, 완전한 무세포 환경에서의 AAV 벡터 및 이의 합성 생산 방법을 나타낸다.

본원에 사용된 "전신 전달"이라는 용어는, 유기체 내 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 활성제의 광범위한 생체분포를 유도하는 지질 입자의 전달을 나타낸다. 일부 투여 기술은 특정 작용제의 전신 전달로 이어질 수 있지만, 다른 것들은 그렇지 않다. 전신 전달은, 작용제의 유용한, 바람직하게는 치료적 양이 신체의 대부분에 노출되는 것을 의미한다. 광범위한 생체분포를 달성하기 위해서는, 일반적으로 작용제가 투여 부위에서 먼 질환 부위에 도달하기 전에 (예컨대, 일차 통과 기관(간, 폐 등)에 의해 또는 신속하고 비특이적인 세포 결합에 의해) 신속하게 분해되거나 제거되지 않도록 하는 혈액 수명을 필요로 한다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 전신 전달은, 예를 들어 정맥내, 피하 및 복강내를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 수단을 통해 이루어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 전신 전달은 정맥내 전달로 이루어진다.

본원에 사용된 "말단 분해 부위" 및 "TRS"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Rep가 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하여, 세포 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 DNA pol 델타 또는 DNA pol 엡실론을 통해 DNA 연장을 위한 기질로서 작용하는 3'-OH를 생성하는 영역을 나타낸다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 조정된 결찰 반응에 참여할 수 있다.

본원에 사용된 활성제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 TNA 지질 입자)의 "치료량", "치료적 유효량", "효과적인 양", "유효량" 또는 "약학적 유효량"이라는 용어는, 치료용 핵산의 부재 하에서 검출된 발현 수준과 비교하여 치료의 의도된 유익 또는 효과, 예를 들어 표적 서열의 발현 저해를 제공하는 데 충분한 양을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하는 데 적합한 검정에는, 예를 들어 도트 블롯(dot blot), 노던 블롯(northern blot), 제자리 혼성화, ELISA, 면역침강, 효소 기능과 같은 당업자에게 공지된 기술뿐 아니라, 당업자에게 공지된 표현형 검정을 사용하는 단백질 또는 RNA 수준의 검사가 포함된다. 투여량 수준은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 이용되는 특정 활성제를 포함하는 다양한 인자를 기반으로 한다. 따라서, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있으나, 의사가 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 또한, "치료량", "치료적 유효량" 및 "약학적 유효량"이라는 용어는, 본원에 기재된 발명의 조성물의 예방적 또는 예방용 양을 포함한다. 본원에 기재된 발명의 예방적 또는 예방용 적용에서, 약학적 조성물 또는 약제는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 다르게는 이의 위험이 있는 환자에게, 질환, 장애 또는 병태, 이의 합병증, 및 질환, 장애 또는 병태의 발달 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 또는 이의 발병을 지연시키는 데 충분한 양으로 투여된다. 최대 용량, 즉, 일부 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. "용량" 및 "투여량"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 양태에서, "치료량", "치료적 유효량" 및 "약학적 유효량"은 비(非)예방적 또는 비(非)예방용 적용이다.

본원에 사용된 "치료 효과"라는 용어는, 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료 결과를 나타낸다. 치료 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현 진행의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 치료제의 경우, 치료적 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델에서 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능을 기반으로 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 널리 공지된 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은, 당업자의 능력에 속한다. 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)](이는 본원에 참조로 인용됨)의 챕터 1에서 확인할 수 있는 치료 효과를 결정하는 일반 원리가 하기에 요약되어 있다.

약동학적 원리는, 허용 가능하지 않은 부작용을 최소화하면서 목적하는 정도의 치료 효능을 얻기 위해 투여 요법을 변경하는 기반을 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정될 수 있고 이것이 치료 범위와 관련이 있는 상황에서, 투여량 변경을 위한 추가 지침을 얻을 수 있다.

본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및/또는 "치료"라는 용어는, 병태의 진행을 중단시키거나, 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키는 것; 병태의 임상 증상을 개선하는 것; 또는 병태의 임상 증상의 출현을 예방하는 것을 통해 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하는 것을 포함한다. 치료는 나아가 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 나타낸다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 없었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 양태에서, "치료하다", "치료하는" 및/또는 "치료"라는 용어는, 병태의 진행을 중단시키거나, 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키는 것, 또는 병태의 임상 증상을 개선하는 것을 포함한다.

약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것이 포함된다.

본원에 사용된 "벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는, 세포 내 부착된 분절("발현 카세트")의 발현 또는 복제를 야기하도록, 또 다른 DNA 분절, 즉, "삽입물", "전이유전자" 또는 "발현 카세트"에 부착될 수 있는, 플라스미드, 박미드, 파지, 바이러스, 비리온 또는 코스미드(cosmid)와 같은 레플리콘을 나타낸다. 벡터는 숙주세포로의 전달, 또는 상이한 숙주세포 사이에서의 전달을 위해 설계된 핵산 구조체일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 최종 형태의 기원에서 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있다. 하지만, 본 개시내용의 목적을 위해, "벡터"는 일반적으로 합성 AAV 벡터 또는 닉킹된 ceDNA 벡터를 나타낸다. 따라서, "벡터"라는 용어는, 적절한 제어 요소와 결합될 때 복제 가능하고, 유전자 서열을 세포에 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다.

본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로, 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 확인되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 그룹에서 결실될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생하는 경우, 본 명세서는 본원에 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 기재를 충족시킨다.

임의의 양태의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 방법, 인간의 생식계열 유전자 정체성을 변형시키는 방법, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용, 또는 인간 또는 동물에게의 임의의 실질적인 의학적 유익 없이 고통을 야기할 수 있는 동물의 유전적 정체성을 변형시키는 방법, 및 또한 이러한 방법의 결과로서의 동물에 관한 것이 아니다.

다른 용어는 본 발명의 다양한 양태의 설명 내에서 본원에 정의된 바와 같다.

본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 다른 간행물(참고문헌, 등록된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 발명으로 인해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자가 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며, 이러한 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하는 것으로 여겨지지 않는다.

본 개시내용의 구현예의 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하거나, 완전한 것으로서 의도되지 않는다. 본 개시내용의 특정 구현예 및 이에 대한 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되었으며, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 구현예는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절한 경우 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 양태는, 필요한 경우, 본 개시내용의 추가의 구현예를 제공하기 위해 상기 참고문헌 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 변형될 수 있다. 나아가, 생물학적 기능 동등성을 고려할 때, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않는 한 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 및 다른 변경은 상세한 설명을 고려하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

전술한 구현예 중 임의의 것의 특정 요소는 조합되거나, 다른 구현예의 요소로 치환될 수 있다. 나아가, 본 개시내용의 특정 구현예와 관련된 이점이 이러한 구현예의 맥락에서 기재되어 있지만, 다른 구현예 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 본 개시내용의 범위 내에 속하기 위해 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요가 있는 것은 아니다.

본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 예는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 어떠한 방식으로든 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

II. 지질

제1 화학적 구현예에서, 화학식 (I)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 제공된다:

(I)

[식 중,

a는 1 내지 20 범위의 정수이고(예를 들어, a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20임);

b는 2 내지 10 범위의 정수이고(예를 들어, b는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);

R¹은 존재하지 않거나, (C₂-C₂₀)알케닐, -C(O)O(C₂-C₂₀)알킬, 및 (C₂-C₂₀)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;

R²는 (C₂-C₂₀)알킬임].

제2 화학적 구현예에서, 화학식 (I)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (II) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

(II)

[식 중, c 및 d는 각각 독립적으로1 내지 8 범위의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이고, 나머지 변수는 화학식 (I)에 기재된 바와 같음].

제3 화학적 구현예에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 c 및 d는 각각 독립적으로 2 내지 8, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 8, 5 내지 7, 또는 6 내지 8 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (I) 또는 화학식 (II)에 기재된 바와 같다.

제4 화학적 구현예에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질에서 c는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2 또는 제3 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제4 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 c 및 d는 각각 독립적으로 1, 3, 5 또는 7이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2 또는 제3 화학적 구현예에 기재된 바와 같다.

제5 화학적 구현예에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질에서 d는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2 또는 제3 또는 제4 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제5 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 c 및 d 중 적어도 하나는 7이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2 또는 제3 또는 제4 화학적 구현예에 기재된 바와 같다.

제6 화학적 구현예에서, 화학식 (I)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (III) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다:

(III)

[식 중, 나머지 변수는 화학식 (I)에 기재된 바와 같음].

제7 화학적 구현예에서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 b는 3 내지 9 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제7 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 b는 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 6 내지 9, 6 내지 8, 또는 7 내지 9 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 b는 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 구현예에 기재된 바와 같다.

제8 화학적 구현예에서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 a는 2 내지 18 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제8 구현예의 일부로서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 a는 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 18, 3 내지 17, 3 내지 16, 3 내지 15, 3 내지 14, 3 내지 13, 3 내지 12, 3 내지 11, 3 내지 10, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 18, 4 내지 17, 4 내지 16, 4 내지 15, 4 내지 14, 4 내지 13, 4 내지 12, 4 내지 11, 4 내지 10, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 18, 5 내지 17, 5 내지 16, 5 내지 15, 5 내지 14, 5 내지 13, 5 내지 12, 5 내지 11, 5 내지 10, 5 내지 9, 25 내지 8, 5 내지 7, 6 내지 18, 6 내지 17, 6 내지 16, 6 내지 15, 6 내지 14, 6 내지 13, 6 내지 12, 6 내지 11, 6 내지 10, 6 내지 9, 6 내지 8, 7 내지 18, 7 내지 17, 7 내지 16, 7 내지 15, 7 내지 14, 7 내지 13, 7 내지 12, 7 내지 11, 7 내지 10, 7 내지 9, 8 내지 18, 8 내지 17, 8 내지 16, 8 내지 15, 8 내지 14, 8 내지 13, 8 내지 12, 8 내지 11, 8 내지 10, 9 내지 18, 9 내지 17, 9 내지 16, 9 내지 15, 9 내지 14, 9 내지 13, 9 내지 12, 9 내지 11, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 10 내지 14, 10 내지 13, 11 내지 18, 11 내지 17, 11 내지 16, 11 내지 15, 11 내지 14, 11 내지 13, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 12 내지 14, 13 내지 18, 13 내지 17, 13 내지 16, 13 내지 15, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 15 내지 18, 15 내지 17, 또는 16 내지 18 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 구현예의 일부로서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질에서 a는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18이고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 구현예에 기재된 바와 같다.

제9 화학적 구현예에서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R¹은 존재하지 않거나, (C₅-C₁₅)알케닐, -C(O)O(C₄-C₁₈)알킬, 및 (C₄-C₁₆)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R¹은 존재하지 않거나, (C₅-C₁₅)알케닐, -C(O)O(C₄-C₁₆)알킬, 및 (C₄-C₁₆)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R¹은 존재하지 않거나, (C₅-C₁₂)알케닐, -C(O)O(C₄-C₁₂)알킬, 및 (C₄-C₁₂)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R¹은 존재하지 않거나, (C₅-C₁₀)알케닐, -C(O)O(C₄-C₁₀)알킬, 및 (C₄-C₁₀)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 기재된 바와 같다.

제10 화학적 구현예에서, R¹은 C₁₀ 알케닐이고, 나머지 변수는 전술한 구현에 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.

제11 화학적 구현예에서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R¹의 C(O)O(C₂-C₂₀)알킬, -C(O)O(C₄-C₁₈)알킬, -C(O)O(C₄-C₁₂)알킬 또는 -C(O)O(C₄-C₁₀)알킬 중 알킬은 비분지형 알킬이고, 나머지 변수는 전술한 구현예 중 어느 하나에 기재된 바와 같다. 하나의 화학적 구현예에서, R¹은 -C(O)O(C₉ 알킬)이다. 대안적으로, 제11 화학적 구현예에서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R¹의 -C(O)O(C₄-C₁₈)알킬, -C(O)O(C₄-C₁₂)알킬 또는 -C(O)O(C₄-C₁₀)알킬 중 알킬은 분지형 알킬이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 구현예 중 어느 하나에 기재된 바와 같다. 하나의 화학적 구현예에서, R¹은 -C(O)O(C₁₇ 알킬)이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 구현예 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.

제12 화학적 구현예에서, 화학식 (I), 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R¹은 하기 표 1에 열거된 임의의 기에서 선택되고, 여기서 각 기에서 물결 모양 결합은 지질 분자의 나머지 부분에의 해당 기의 부착 지점을 나타내고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 기재된 바와 같다. 본 개시내용은 표 1의 R¹ 기 중 어느 하나와 표 2의 R² 기 중 어느 하나의 조합을 추가로 고려하며, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 기재된 바와 같다.

제13 화학적 구현예에서, 화학식 (I)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R²는 하기 표 2에 열거된 임의의 기에서 선택되고, 여기서 각 기에서 물결 모양 결합은 지질 분자의 나머지 부분에의 해당 기의 부착 지점을 나타내고, 나머지 변수는 화학식 (I), 또는 제7, 제8, 제9, 제10 또는 제11 화학적 구현예에 기재된 바와 같다.

특정예가 하기 예시 섹션의 표 3에 제공되어 있으며, 이는 화학식 (I)의 이온화 가능한 지질에 대한 본원의 제14 화학적 구현예의 일부로 포함된다. 약학적으로 허용 가능한 염뿐 아니라, 이온화된 형태와 중성 형태도 포함된다.

추가의 양태에서, 화학식 (Ia), 화학식 (Ib) 또는 화학식 (Ic)의 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 본원에서 고려된다:

(Ia);

(Ib);

(Ic)

[식 중, R^q 및 R^z는 각각 독립적으로 지방족 기(알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클릴 포함) 또는 아릴기이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 구현예 중 어느 하나에 상기 기재된 바와 같음]. 하나의 구현예에서, R^q 및 R^z는 각각 독립적으로 수소 또는 C₁-C₆ 알킬이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 구현예 중 어느 하나에 상기 기재된 바와 같다. 상기 개시된 LNP, 조성물, 사용 방법 등은 또한 화학식 (Ia), 화학식 (Ib) 또는 화학식 (Ic)의 지질에도 적용된다. 화학식 (Ia), 화학식 (Ib) 또는 화학식 (Ic)의 지질은, 예를 들어 화학식 (I)의 지질을 아세토니트릴(CH₃CN) 및 클로로포름(CHCl₃) 중에서 클로로메탄(CH₃Cl)으로 처리하는 방식으로 제조될 수 있다.

나아가, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 지질, 또는 본원에 개시된 예시적인 지질 중 임의의 것은, 예를 들어 화학식 (I)의 지질을 아세토니트릴(CH₃CN) 및 클로로포름(CHCl₃) 중에서 클로로메탄(CH₃Cl)으로 처리하는 방식으로 상응하는 4차 지질(모두 본 개시내용에서 고려됨)로 전환될 수 있다.

본원에 기재된 이온화 가능한 지질과 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터(예를 들어, ceDNA)를 포함하는 지질 나노입자(LNP) 또는 이의 약학적 조성물은, 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 TNA를 이용하여 제조되고 로딩된다. 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US2018/050042호에 개시된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩되며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이는, 지질을 양성자화시키고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유용한 에너지를 제공하는, 낮은 pH에서의 에탄올성 지질과 ceDNA와 같은 수성 TNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다.

일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 약 10:1 대 60:1의 총 지질 대 핵산의 (질량 또는 중량)비로 제조된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 지질 대 핵산 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 60:1, 약 1:1 내지 약 55:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 45:1, 약 1:1 내지 약 40:1, 약 1:1 내지 약 35:1, 약 1:1 내지 약 30:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 약 6:1 내지 약 9:1; 약 30:1 내지 약 60:1 범위일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 약 60:1의 핵산(질량 또는 중량) 대 총 지질의 비로 제조된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 약 30:1의 핵산(질량 또는 중량) 대 총 지질의 비로 제조된다. 지질과 핵산의 양은 목적하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL 범위일 수 있다.

본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화하는 작용제를 포함한다. 이러한 작용제는 본원에서 응축제 또는 캡슐화제로도 지칭된다. 비제한적으로, 핵산을 응축 및/또는 캡슐화하는 당업계에 공지된 임의의 화합물은, 이것이 비(非)융합성인 한, 사용될 수 있다. 다시 말해서, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 거의 없거나 없는 작용제. 이론에 구애됨 없이, 응축제는 ceDNA와 같은 핵산을 응축/캡슐화하지 않을 때 어느 정도 융합 활성을 나타낼 수 있지만, 상기 응축제를 이용하여 형성된 핵산 캡슐화 지질 나노입자는 비융합성일 수 있다.

일반적으로, 이온화 가능한 지질 또는 양이온성 지질은 전형적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예를 들어 ceDNA를 응축시키고, 막 회합과 융합원성(fusogenicity)을 유도하는 데 이용된다. 일반적으로, 양이온성 지질은 산성 조건 하에서, 예를 들어 6.5 이하의 pH에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 양이온성 지질은 또한 이온화 가능한 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질일 수 있다. "비융합성 이온화 가능한 지질"이란, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 없거나 거의 없는 이온화 가능한 지질을 의미한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 20%(몰) 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질의 몰 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 20%(몰) 내지 70%(몰), 30%(몰) 내지 60%(몰), 40%(몰) 내지 60%(몰), 40% 내지 55%(몰), 또는 45%(몰) 내지 55%(몰)일 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 90 몰%를 차지한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 비양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비양이온성 지질은 융합원성을 증가시키고, 또한 형성 동안 LNP의 안정성을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 비양이온성 지질에는, 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다. 따라서, 비양이온성 지질은 중성의 하전되지 않은 지질, 쯔비터이온성 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 전형적으로 융합원성을 증강시키는 데 이용된다.

예시적인 비양이온성 지질에는, 비제한적으로, 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 디아실포스파티딜콜린과 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질도 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 지질 내 아실기는 바람직하게는 C₁₀-C₂₄ 탄소 사슬을 갖는 지방산, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일에서 유도된 아실기이다.

지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 사용하기에 적합한 비양이온성 지질의 다른 예에는, 예를 들어 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴계 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 디옥사데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 등과 같은 인을 함유하지 않는 지질이 포함된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질은 인지질이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로 이루어지는 군에서 선택된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 DSPC이다. 다른 구현예에서, 비양이온성 지질은 DOPC이다. 다른 구현예에서, 비양이온성 지질은 DOPE이다.

본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 약 20%(몰)를 차지할 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 0.5%(몰) 내지 15%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 5%(몰) 내지 12%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 5%(몰) 내지 10%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 6%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 7.0%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 7.5%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 8.0%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 9.0%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 10%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 11%(몰)이다.

예시적인 비양이온성 지질은 국제공개 WO2017/099823호 및 미국 특허출원공개 US2018/0028664호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 모두 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 지질 입자의 막 온전성과 안정성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자에 사용될 수 있는 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 또는 이의 유도체이다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예에는, 5α-콜레스탄올, 5β-코프로스탄올, 콜레스테릴-(2'-히드록시)에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-히드록시)부틸 에테르 및 6-케토콜레스탄올과 같은 극성 유사체; 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논 및 콜레스테릴 데카노에이트와 같은 비극성 유사체; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴-(4'-히드록시)부틸 에테르와 같은 극성 유사체이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴 헤미숙시네이트(CHEMS)이다.

예시적인 콜레스테롤 유도체는 PCT 공보 WO2009/127060 및 미국 특허 공보 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성요소는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 20%(몰) 내지 50%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 30%(몰) 내지 40%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 35%(몰) 내지 45%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 38%(몰) 내지 42%(몰)이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 접합된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 접합된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 접합된 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질이다. 일부 다른 구현예에서, 접합된 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예를 들어 PEG₂₀₀₀-DMG(디미리스토일글리세롤)이다.

예시적인 PEG-지질 접합체에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), PEG화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는, 예를 들어 미국 특허 제5,885,613호, 제6,287,591호, 미국 특허출원공개 US2003/0077829호, US2003/0077829호, US2005/0175682호, US2008/0020058호, US2011/0117125호, US2010/0130588호, US2016/0376224호 및 US2017/0119904호에 기재되어 있으며, 상기 모든 문헌들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, PEG-DAA 접합체는, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체) 및 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체가 PEG-지질 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은, PCT 특허 출원 공보 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 및 WO2010/006282; 미국 특허 출원 공보 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 및 US20110123453; 및 US 특허 US5,885,613, US6,287,591, US6,320,017 및 US6,586,559에 기재되어 있으며, 상기 모든 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.

본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체는 지질 나노입자에 약 0% 내지 약 20%의 몰비로 존재한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 0.5%(몰) 내지 10%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 1%(몰) 내지 5%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 1%(몰) 내지 3%(몰)이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 1.5%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 약 2%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 약 2.5%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 3%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 약 3%(몰)이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 약 3.5%(몰)이다.

본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, PEG-지질 접합체 또는 PEG화 지질과 같은 접합된 지질은, 지질 나노입자 내 총 지질의 약 2.0% 초과, 예를 들어 약 2.1% 또는 2.2% 또는 2.3% 또는 2.4% 또는 약 2.5% 내지 약 10%; 또는 약 2.1% 또는 2.2% 또는 2.3% 또는 2.4% 또는 약 2.5% 내지 약 7.5%; 약 2.1% 또는 2.2% 또는 2.3% 또는 2.4% 또는 약 2.5% 내지 약 5%; 약 3% 내지 약 5%; 약 3% 내지 약 4.5%; 약 3% 내지 약 4%; 약 3.5% 내지 약 5%; 약 3.5% 내지 약 4.5%, 약 2.5% 내지 약 4%; 약 2.5% 내지 약 3.5%, 또는 약 2.5% 내지 약 3%의 몰 백분율로 존재한다.

개시된 이온화 가능한 지질과 비양이온성 지질, 스테롤 및 PEG-접합된 지질의 몰비는 필요에 따라 달라질 수 있다고 이해된다. 예를 들어, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 30% 내지 70%의 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0% 내지 60%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0% 내지 30%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 1% 내지 10%의 PEG -접합된 지질을 포함할 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 40% 내지 60%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 30% 내지 50%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 5%의 PEG-접합된 지질을 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 40% 내지 60%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 30% 내지 40%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 10%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 5%의 PEG-접합된 지질이다. 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 60% 내지 70%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 25% 내지 35%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 10% 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 0% 내지 5%의 PEG-접합된 지질을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 또한 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 최대 45% 내지 55%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 35% 내지 45% 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 5%의 PEG-접합된 지질을 함유할 수 있다. 상기 제형은 또한, 예를 들어 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 8% 내지 30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 0% 내지 40%의 콜레스테롤; 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 4% 내지 25% 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 4% 내지 25%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 25%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 10% 내지 35%의 접합된 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 30%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 15%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 35%의 PEG-접합된 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 20%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 최대 90%의 이온화 가능한 지질 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 10%의 비양이온성 지질, 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 심지어 100%의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형일 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 지질 입자 제형은 이온화 가능한 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 지질 입자 제형은 이온화 가능한 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:10:38:2의 몰비로 포함한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 지질 입자 제형은 이온화 가능한 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:10:37:3의 몰비로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 이온화 가능한 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:7:40:3의 몰비로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 이온화 가능한 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:8:40:2의 몰비로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 이온화 가능한 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:9:39:2의 몰비로 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 이온화 가능한 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 약 50:9:38:3의 몰비로 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 이온화 가능한 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG화 지질(접합된 지질)을 포함하며, 여기서 이온화 가능한 지질의 몰비는 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 30 몰% 내지 60 몰%임)이고, 비양이온성 지질의 몰%는 0 몰% 내지 30 몰% 범위(여기서, 목표는 0 몰% 내지 15 몰%임)이고, 스테롤의 몰%는 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 30 몰% 내지 50 몰%임)이고, PEG화 지질(접합된 지질)의 몰%는 1 몰% 내지 6 몰% 범위(여기서, 목표는 2 몰% 내지 5 몰%임)이다.

ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US2018/050042호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용되고, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에의 사용을 위해 고려된다.

지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 크기는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK)을 사용하여 준탄성 광산란(quasi-elastic light scattering)에 의해 결정될 수 있으며, 직경은 대략 50 nm 내지 150 nm, 대략 55 nm 내지 95 nm, 또는 대략 70 nm 내지 90 nm이다.

제형화된 이온화 가능한 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 각각의 이온화 가능한 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정된다. PBS 중에 총 지질 농도 0.4 mM로 이온화 가능한 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-지질(50/10/38.5/1.5(몰%))을 포함하는 지질 나노입자는, 본원 및 다른 곳에 기재된 바와 같은 인라인(in-line) 공정을 사용하여 제조될 수 있다. TNS는 증류수 중에 100 mM 스톡 용액으로 제조될 수 있다. 소포는 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM 암모늄 아세테이트, 130 mM NaCl을 함유하는 완충액 2 mL 중에 24 mM 지질로 희석될 수 있으며, 여기서 pH는 2.5 내지 11 범위이다. 분취량의 TNS 용액을 첨가하여 최종 농도 1 mM을 제공하고, 볼텍싱 혼합 후, 실온에서 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광광도계로 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 광도를 측정한다. 시그모이드 최적합(sigmoidal best fit) 분석을 형광 데이터에 적용할 수 있으며, pKa는 최대 형광 강도의 절반이 되는 pH로 측정한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 상대 활성은 꼬리 정맥 주사를 통한 투여 4시간 후 간에서의 루시퍼라아제 발현을 측정하여 결정할 수 있다. 활성을 0.3 mg ceDNA/kg 및 1.0 mg ceDNA/kg 용량에서 비교하고, 투여 4시간 후에 측정된 루시퍼라아제 ng/간 g으로 표시한다.

비제한적으로, 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 포함한다. 일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터와, 이온화 가능한 지질 또는 이의 염을 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 이온화 가능한 지질/비양이온성 지질/스테롤/접합된 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형을 제공한다.

III. 치료용 핵산(TNA)

본 개시내용은 치료용 핵산(TNA)을 전달하기 위한 지질 기반 플랫폼을 제공한다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다. 이와 같이, 본 개시내용의 양태는 일반적으로 TNA를 포함하는 이온화 가능한 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 제공한다.

치료용 핵산

본 개시내용의 예시적인 치료용 핵산은, 비제한적으로, 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, 폐쇄형 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA, CELiD, 선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA("미니스트링"), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, 및 DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

RNA 간섭(RNAi)으로 불리는 과정을 통해 특정 단백질의 세포내 수준을 하향조절할 수 있는 siRNA 또는 miRNA가 또한 본 발명에서 핵산 치료제로 고려된다. siRNA 또는 miRNA가 숙주세포의 세포질에 도입된 후, 이러한 이중가닥 RNA 구조체는 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥은 RISC 복합체에 의해 제거된다. RISC 복합체는, 상보적 mRNA와 조합될 때, mRNA를 절단하고 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 mRNA의 특이적 파괴를 유도하여, 상응하는 단백질을 하향조절한다.

단백질로의 mRNA 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)와 리보자임은, 핵산 치료제일 수 있다. 안티센스 구조체의 경우, 이러한 단일가닥 데옥시핵산은 표적 단백질 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 가지며, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 mRNA에 결합할 수 있다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 번역을 방지하고/하거나 mRNA 전사체의 RNaseH 분해를 촉발시킨다. 그 결과, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 작용의 특이성(즉, 특정 질환 관련 단백질의 하향조절)이 증가했다.

본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물에서, 치료용 핵산(TNA)은 치료용 RNA일 수 있다. 상기 치료용 RNA는 mRNA 번역의 저해제, RNA 간섭 작용제(RNAi), 촉매 활성 RNA 분자(리보자임), 전달 RNA(tRNA), mRNA 전사체에 결합하는 RNA(ASO), 또는 단백질이나 다른 분자 리간드(압타머)에 결합하는 RNA일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법에서, RNAi 작용제는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA 또는 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물에서, 치료용 핵산(TNA)은 폐쇄형 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA, CELiD, 선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA("미니스트링"), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA, 덤벨 선형 DNA, 플라스미드, 미니서클 등)과 같은 치료용 DNA일 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예는 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산)를 발현시킬 수 있는 폐쇄형 선형 이중체(ceDNA)를 포함하는 방법 및 조성물을 기반으로 한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대안을 나타낸다.

ceDNA 벡터는 바람직하게는 비연속 구조라기보다는 선형 및 연속 구조이다. 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정적일 뿐 아니라, 재조합되어 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 ceDNA 벡터가 바람직한 구현예이다. 연속, 선형, 단일가닥 분자내 이중체 ceDNA 벡터는, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이, 공유결합으로 결합된 말단을 가질 수 있다. 이러한 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 이중체 핵산 분자인 플라스미드(본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 플라스미드의 상보적 가닥은 변성 후 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성하지만, 대조적으로, 상보적 가닥을 갖는 ceDNA 벡터는, 단일 DNA 분자이기 때문에, 변성되더라도 단일 분자로 남아있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터와 ceDNA-플라스미드는 구조(특히, 선형 대 원형)의 측면에서, 또한 이러한 상이한 대상을 생산하고 정제하는 데 사용되는 방법의 측면에서, 또한 ceDNA-플라스미드의 경우 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터의 경우 진핵생물 유형인 이의 DNA 메틸화의 측면에서 모두 상이하다.

공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자(ceDNA)가 본원에 제공된다. 이러한 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자는 2개의 상이한 역말단반복(ITR) 서열 사이에 배치된 이종 유전자(예를 들어, 전이유전자, 특히 치료용 전이유전자)를 함유하는 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스 또는 통합된 세포주)로부터의 허용 숙주세포에서 생산될 수 있으며, 여기서 ITR은 서로 상이하다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ITR 중 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이며; ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위(TRS)와 Rep 결합 부위를 포함한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 이중체이며, 예를 들어 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 걸쳐 자가 상보적이다(예를 들어, ceDNA는 이중가닥 원형 분자가 아님). ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖기 때문에, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 대한 내성이 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 양태에서, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로 비대칭이며, 즉, 서로 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR이고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 또는 그 반대로 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 변형된 것이지만, 상이한 서열이거나, 상이한 변형을 갖거나, 또는 동일한 변형된 ITR이 아니며, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는, WT-ITR에 대한 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 하나의 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭인 ITR이 변형된 비대칭 ITR 쌍을 갖고 서로에 대해 상이한 서열과 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 ITR을 갖는다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로에 대해 대칭이거나 실질적으로 대칭이며, 즉, ceDNA 벡터는, 이의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록, 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍은, 야생형 ITR이 아닌 변형된 ITR(예를 들어, mod-ITR)일 수 있다. mod-ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고, 서로 역 보체(역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대칭인 ITR 또는 실질적으로 대칭인 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 야생형(WT-ITR)일 수 있다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다.

본원에 제공된 야생형 또는 돌연변이된 또는 달리 변형된 ITR 서열은 ceDNA 벡터의 생산을 위한 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스)에 포함된 DNA 서열을 나타낸다. 따라서, ceDNA-플라스미드 또는 다른 발현 구조체로부터 생산된 ceDNA 벡터에 실제로 함유된 ITR 서열은, 생산 과정 동안 일어나는 자연 발생적인 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로, 본원에 제공된 ITR 서열과 동일할 수도 동일하지 않을 수도 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 갖는 발현 카세트를 포함하는 본원에 기재된 ceDNA 벡터는, 전이유전자의 발현을 가능하게 하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열(들)에 작동적으로 연결될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열을 포함하고, 여기서 관심 뉴클레오타이드 서열은 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열에 의해 플랭킹되어 있으며, 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 서로 비대칭이거나 서로 대칭이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사 후 조절 요소, 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함하는 2개의 ITR 사이에 위치한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 프로모터는 조절 가능하며, 즉 유도성 또는 억제성이다. 프로모터는 전이유전자의 전사를 용이하게 하는 임의의 서열일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터 또는 이의 변이체이다. 전사 후 조절 요소는 전이유전자의 발현을 조절하는 서열, 비제한적인 예로서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자의 발현을 증강시키는 3차 구조를 형성하는 임의의 서열이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 WPRE를 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 폴리아데닐화 및 종열 신호는 BGHpolyA를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 시스 조절 요소 또는 이의 조합, 예를 들어 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서 서열(USE), 또는 비제한적으로, 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)를 포함하는 다른 전사 후 처리 요소가 추가로 사용될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 5'→3' 방향으로의 발현 카세트 길이는, AAV 비리온에 캡시드화되는 것으로 공지된 최대 길이보다 더 크다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 상기 길이는 4.6 kb 초과, 또는 5 kb 초과, 또는 6 kb 초과, 또는 7 kb 초과이다. 다양한 발현 카세트가 본원에 예시된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 뉴클레오타이드, 또는 약 4000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 또는 10,000개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자를 위한 프로모터로서 작용할 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 제어하고 조절하기 위한 조절 스위치를 포함하며, 목적하는 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열 및/또는 제2 ITR 서열 중 적어도 하나는 상응하는 야생형 AAV2 ITR 서열에 대해 돌연변이된 것이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 치료 목적을 위해(예를 들어, 의학적, 진단적 또는 수의학적 용도로) 또는 면역원성 폴리펩타이드를 위해 사용된다.

발현 카세트는 치료용 핵산 서열인 임의의 전이유전자를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상에서의 임의의 관심 유전자를 포함하며, 이러한 관심 유전자에는, 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터의 발현 카세트, 발현 구조체 또는 공여체 서열에 제공된 서열은 숙주세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"라는 용어는, 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간의 세포에서 발현 증강을 위해 핵산 서열을 변경하는 과정으로서, 천연 서열(예를 들어, 원핵생물 서열) 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 유의한 수의 코돈을, 해당 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하는 과정을 나타낸다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다.

전형적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은, 예를 들어 Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171), 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.

다수의 유기체는 성장하는 펩타이드 사슬에서 특정 아미노산의 삽입을 암호화하기 위해 특정 코돈을 사용하는 편향을 나타낸다. 유기체간 코돈 사용의 차이인 코돈 선호도 또는 코돈 편향은, 유전자 코드의 축퇴에 의해 부여되며, 다수의 유기체에서 잘 문서화되어 있다. 코돈 편향은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있으며, 이는, 특히 번역되는 코돈의 특성과 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 주어진 유기체에서 코돈 최적화에 기반하여 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.

다양한 동물, 식물 및 미생물 종에 대해 이용 가능한 다수의 유전자 서열을 고려할 때, 코돈 사용의 상대적인 빈도를 계산하는 것이 가능하다(문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]).

역말단반복서열(ITR)

본원에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 상보적 DNA의 연속 가닥으로 형성된 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA 분자(선형, 연속 및 비캡시드화된 구조)로서, 이는 서로 상이하거나 서로 비대칭인 5' 역말단반복(ITR) 서열과 3' ITR 서열을 포함한다. ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위와 복제 단백질 결합 부위(RPS)(때때로 복제성 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 포함한다. 일반적으로, ceDNA 벡터는 적어도 하나의 변형된 AAV 역말단반복서열(ITR), 즉, 다른 하나의 ITR에 대한 결실, 삽입 및/또는 치환과, 발현 가능한 전이유전자를 함유한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR, 예를 들어 야생형 AAV ITR이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 다른 하나의 ITR에 대해 변형된 ITR이며, 즉, ceDNA는 서로에 대해 비대칭인 ITR을 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비기능성 ITR이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 (1) 시스-조절 요소, 프로모터 및 적어도 하나의 전이유전자를 포함하는 발현 카세트; 또는 (2) 적어도 하나의 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 (3) 상기 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 자가 상보적 서열, 예를 들어 ITR을 포함하며, 여기서 ceDNA 벡터에는 캡시드 단백질이 결합되어 있지 않다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 AAV 게놈에서 발견되는 2개의 자가 상보적 서열(여기서 적어도 하나는 AAV의 작동적 Rep-결합 요소(RBE)와 말단 분해 부위(TRS), 또는 RBE의 기능성 변이체를 포함함)과, 전이유전자에 작동적으로 연결된 하나 이상의 시스-조절 요소를 포함한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 제어하고 조절하기 위한 조절 스위치를 포함하며, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 2개의 자가 상보적 서열은 임의의 공지된 파르보바이러스, 예를 들어 AAV(예를 들어, AAV1 내지 AAV12)와 같은 데펜도바이러스에서 유래한 ITR 서열일 수 있다. 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변적인 회문구조 서열에 더하여, 비제한적으로, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'와 같은 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(TRS)를 보유하는 변형된 AAV2 ITR 서열을 포함하는 임의의 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ITR은 합성일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형에서 유래한 ITR 서열을 기반으로 한다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 유래 서열을 갖지 않거나 일부만 갖지만, 상기 기재된 ITR 구조를 보존한다. 일부 양태에서, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호작용할 수 있거나, 또는 일부 경우에, 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열에 더하여, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'와 같은 기능성 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(TRS)를 보유하는 합성 ITR 서열이다. 일부 예에서, 변형된 ITR 서열은 RBS, TRS의 서열, 및 야생형 AAV2 ITR의 상응하는 서열에서 유래한 ITR 헤어핀 2차 구조 중 하나의 말단 루프 부분을 형성하는 Rep 결합 요소의 구조 및 위치를 보유한다. ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 ITR 서열은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US 18/49996호의 표 2 내지 표 9, 표 10A와 표 10B, 서열번호 2, 서열번호 52, 서열번호 101 내지 서열번호 449, 및 서열번호 545 내지 서열번호 547에 개시되어 있으며, 부분 ITR 서열은 도 26a 및 도 26b에 제시되어 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US 18/49996호의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 표 10A와 표 10B 중 임의의 하나 이상에 제시된 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 ITR에서의 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함하는 발현 구조체에서 생산될 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자를 위한 프로모터로서 작용할 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하는 추가 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 조절하는 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US 18/49996호에 기재된 바와 같은 조절 스위치, 또는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 또한 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 우드척 간염바이러스(WHP: Woodchuck Hepatitis Virus) 전사 후 조절 요소(WPRE)가 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용된다. 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로부터의 전사 후 요소와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비 서열, 예를 들어 VH-02 및 VK-A26 서열이 전이유전자에 연결될 수 있다. 발현 카세트는 당업계에 공지된 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변이체, 예컨대 소 BGHpA 또는 바이러스 SV40pA에서 단리된 자연 발생 서열, 또는 합성 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. USE는 SV40pA 또는 이종 polyA 신호와 조합하여 사용될 수 있다.

2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US2018/050042호(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 도 1a 내지 도 1c는, 비제한적이며 예시적인 ceDNA 벡터, 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열의 개략도를 보여준다. ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열 및/또는 제2 ITR 서열 중 적어도 하나는 상응하는 야생형 AAV2 ITR 서열에 대해 돌연변이된 것이다. 발현 가능한 전이유전자 카세트는 바람직하게는 인핸서/프로모터, ORF 리포터(전이유전자), 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA) 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함한다.

프로모터

상기 기재된 것들을 포함하는 적합한 프로모터는, 바이러스에서 유도될 수 있고, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 유기체를 포함하는 임의의 유기체에서 유도될 수 있다. 적합한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라아제(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터에는, 비제한적으로, SV40 초기 프로모터, 마우스 유선종양바이러스 긴말단반복(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순헤르페스바이러스(HSV) 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터 영역(CMVTE), 라우스육종(rous sarcoma)바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터(U6, 예를 들어, 문헌[Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)]), 증강된 U6 프로모터(예를 들어, 문헌[Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)], 인간 H1 프로모터(H1), CAG 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(HAAT) 프로모터 (및 그 이외의 것들)이 포함된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 이러한 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 이의 다운스트림 인트론 함유 말단에서 변경된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)를 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 대해 이질적이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 프로모터는 발현을 추가로 증강시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 시작 부위에서 수천 개 염기쌍 만큼 떨어져 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 억제제 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원에서 유도될 수 있다. 프로모터는, 유전자 구성요소의 발현을, 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발달 단계에 대해, 또는 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여, 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예에는, 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동자 프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터, 및 CMV IE 프로모터뿐 아니라, 하기에 열거된 프로모터가 포함된다. 이러한 프로모터 및/또는 인핸서는 임의의 관심 유전자(예를 들어, 치료용 단백질)의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 치료용 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 치료용 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는, 원숭이바이러스 40(SV40)으로부터의 프로모터, 마우스 유선종양바이러스(MMTV) 프로모터, 소 면역결핍바이러스(BIV) 긴말단반복(LTR) 프로모터와 같은 인간 면역결핍바이러스(HIV) 프로모터, 몰로니(Moloney) 바이러스 프로모터, 조류백혈병바이러스(ALV) 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터와 같은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 프로모터는 또한 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자 유래의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터, 예컨대 천연 또는 합성의 인간 알파 1-항트립신(HAAT) 또는 트랜스티레틴(TTR)과 같은 간 특이적 프로모터일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 간으로의 전달은, 간세포 표면에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체를 통해, 간세포에 대한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료용 단백질을 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료용 단백질을 인코딩하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고 특징분석되어 있다. 사용되는 프로모터 영역은 당업계에 공지된 인핸서(예를 들어, 세르핀 인핸서(Serpin Enhancer))와 같은 하나 이상의 추가 조절 서열(예를 들어, 천연)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비제한적인 예에는, 예를 들어 CAG 프로모터, HAAT 프로모터, 인간 EF1-α 프로모터 또는 EF1-a 프로모터의 단편, 및 래트 EF1-α 프로모터가 포함된다.

폴리아데닐화 서열

ceDNA 벡터에서 발현되는 mRNA를 안정화시키고, 핵 방출 및 번역을 돕기 위해, 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열이 ceDNA 벡터에 포함될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개 또는 그 이상의 아데닌 또는 디뉴클레오타이드를 포함한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개 내지 55개의 뉴클레오타이드, 약 45개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 35개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 개시된 범위 사이의 임의의 범위의 뉴클레오타이드를 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA는 2개의 상이한 역말단반복 서열(ITR)(예를 들어, AAV ITR) 사이에 작동적으로 배치된 이종 핵산을 인코딩하는 벡터 폴리뉴클레오타이드에서 수득될 수 있으며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 말단 분해 부위와 복제 단백질 결합 부위(RPS), 예를 들어 Rep 결합 부위(예를 들어, wt AAV ITR)를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 하나의 ITR, 예를 들어 기능성 ITR에 대해 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 숙주세포는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않고, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 임의의 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자도 없다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 핵산 분자에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에는 기능성 AAV cap 유전자와 AAV rep 유전자 둘 모두가 없다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 변형된 ITR을 갖지 않는다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원(또는 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US 18/49996호)에 개시된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.

IV. ceDNA 벡터의 생산

본원에 정의된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 생산 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US 18/49996호의 섹션 IV에 기재되어 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 본원에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터는, 예를 들어 하기 단계를 포함하는 공정에 따라 수득될 수 있다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다.

하지만, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, AAV 또는 다른 바이러스 기반 벡터에 자연적으로 부과되는 것과 같은 크기 제한이 없다.

숙주세포에서 단리된 ceDNA 벡터의 존재는, 숙주세포에서 단리된 DNA를 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화된 DNA 물질을 미변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어 문헌[Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재된 바와 같이, 비바이러스성 DNA 벡터의 생산에서 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 주형(ceDNA 주형)을 이의 자체 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주의 용도를 제공한다. 바람직하게는, Rep는 약 3의 MOI로 숙주 세포에 첨가된다. 숙주 세포주가 포유류 세포주, 예를 들어 HEK293 세포인 경우, 상기 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포에 도입하여, Rep 및 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 ceDNA의 절제 및 증폭을 가능하게 할 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 제조하는 데 사용되는 숙주세포는 곤충 세포이고, 바큐로바이러스는 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, ceDNA에 대한 비바이러스성 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형 둘 모두를 전달하는 데 사용된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 숙주세포는 Rep 단백질을 발현하도록 조작된다.

이어서, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리한다. 상기 세포에서 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존율, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 세포를 충분한 조건 하에서 성장시키고, ceDNA 벡터를 생산하기 위한 바큐로바이러스 감염 후, 하지만 바큐로바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 충분한 시간 동안 수거한다. DNA 벡터는 Qiagen Endo-Free 플라스미드 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.

DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로 정제된다. ceDNA 벡터의 존재는, 세포에서 단리된 벡터 DNA를 DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화 및 미소화된 DNA 물질을 겔 전기영동을 사용하여 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.

V. 지질 입자의 제조

지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 TNA(예를 들어, ceDNA)와 지질(들)의 혼합 시 자발적으로 형성될 수 있다. 목적하는 입자 크기 분포에 따라, 예를 들어 Lipex 압출기(Northern Lipids, Inc)와 같은 써모배럴(thermobarrel) 압출기를 사용하여 생성된 나노입자 혼합물을 막을 통해 압출할 수 있다(예를 들어, 100 nm 컷오프). 일부 경우에, 압출 단계는 생략될 수 있다. 에탄올 제거와 동시 완충액 교환은, 예를 들어 투석 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 달성될 수 있다.

일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 형성될 수 있다. 예를 들어, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는, 예를 들어 미국 특허출원공개 US2013/0037977호, US2010/0015218호, US2013/0156845호, US2013/0164400호, US2012/0225129호 및 US2010/0130588호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 상기 문헌들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 연속 혼합 방법, 직접 희석 방법 또는 인라인 희석 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 직접 희석 및 인라인 희석 방법을 사용하여 지질 나노입자를 제조하는 공정 및 장치는 미국 특허출원공개 US2007/0042031호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 단계적 희석 방법을 사용하여 지질 나노입자를 제조하는 공정 및 장치는 미국 특허출원공개 US2004/0142025호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 충돌 제트(impinging jet) 방법에 따라 제조될 수 있다. 일반적으로, 알코올(예를 들어, 에탄올)에 용해된 지질을, 완충액, 예를 들어 시트레이트 완충액, 소듐 아세테이트 완충액, 소듐 아세테이트와 염화마그네슘 완충액, 말산 완충액, 말산과 염화소듐 완충액, 또는 소듐 시트레이트와 염화소듐 완충액에 용해된 ceDNA와 혼합하여 입자를 형성한다. 지질 대 ceDNA의 혼합 비는 약 45% 내지 55%의 지질과 약 65% 내지 45%의 ceDNA이다.

지질 용액은 개시된 이온화 가능한 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질, 예컨대 DSPC, DOPE 및 DOPC), PEG-지질 접합된 분자(예를 들어, PEG-지질) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)을, 알코올, 예를 들어 에탄올 중에 5 mg/mL 내지 30 mg/mL, 보다 가능성 있게는 5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 가장 가능성 있게는 9 mg/mL 내지 12 mg/mL의 총 지질 농도로 함유할 수 있다. 지질 용액에서, 지질의 몰비는 양이온성 지질의 경우 약 25% 내지 98%, 바람직하게는 약 35% 내지 65%; 비이온성 지질의 경우 약 0% 내지 15%, 바람직하게는 약 0% 내지 12%; PEG-지질 접합된 지질 분자의 경우 약 0% 내지 15%, 바람직하게는 약 1% 내지 6%; 및 스테롤의 경우 약 0% 내지 75%, 바람직하게는 약 30% 내지 50% 범위일 수 있다.

ceDNA 용액은 pH가 3.5 내지 5 범위인 완충 용액 중에 0.3 mg/mL 내지 1.0 mg/mL, 바람직하게는 0.3 mg/mL 내지 0.9 mg/mL 범위의 농도로 ceDNA를 포함할 수 있다.

LNP 형성의 경우, 하나의 예시적인 비제한적인 구현예에서, 2개의 지질을 약 15℃ 내지 40℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지40℃ 범위의 온도까지 가열한 후, 예를 들어 충돌 제트 혼합기에서 혼합하여 즉시 LNP를 형성한다. 혼합 유량은 10 mL/분 내지 600 mL/분 범위일 수 있다. 튜브 ID는 0.25 mm 내지 1.0 mm 범위일 수 있고, 총 유량은 10 mL/분 내지 600 mL/분일 수 있다. 유량과 튜브 ID의 조합은 LNP의 입자 크기를 30 nm 내지 200 nm로 제어하는 효과를 나타낼 수 있다. 이어서, 용액을 더 높은 pH에서 1:1 내지 1:3 vol:vol 범위, 바람직하게는 약 1:2 vol:vol의 혼합비로 완충 용액과 혼합할 수 있다. 필요한 경우, 이러한 완충 용액은 15℃ 내지 40℃ 또는 30℃ 내지 40℃ 범위의 온도에 있을 수 있다. 이어서, 혼합된 LNP를 음이온 교환 여과 단계에 적용시킬 수 있다. 음이온 교환 전, 혼합된 LNP를 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 동안의 온도는 15℃ 내지 40℃ 또는 30℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다. 인큐베이션 후, 필터, 예컨대 0.8 μm 필터를 통해 용액을 여과한다(음이온 교환 분리 단계 포함). 이러한 공정은 1 mm ID 내지 5 mm ID 범위의 튜브 ID와 10 mL/분 내지 2000 mL/분의 유량을 사용할 수 있다.

형성 후, LNP를 농축시키고, 알코올을 제거하고, 완충액을 약 pH 7, 예를 들어 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4의 최종 완충 용액, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 교환하는 한외여과 공정을 통해 투석여과할 수 있다.

한외여과 공정은 30 kD 내지 500 kD 범위의 막 공칭 분자량 컷오프를 사용하는 접선 유동 여과 형식(TFF)을 사용할 수 있다. 막 형식은 중공 섬유 또는 평판 카세트이다. 적절한 분자량 컷오프를 이용한 TFF 공정은 잔류물에 LNP를 보유할 수 있고, 여과액 또는 투과물에는 알코올; 시트레이트 완충액 및 최종 완충액 폐기물이 함유되어 있다. TFF 공정은 초기 농도에서 1 mg/mL 내지 3 mg/mL의 ceDNA 농도까지의 다단계 공정이다. 농축 후, LNP 용액을 최종 완충액에 대해 10 부피 내지 20 부피로 투석여과하여 알코올을 제거하고, 완충액 교환을 수행한다. 이어서, 물질을 1배 내지 3배 추가로 농축시킬 수 있다. 농축된 LNP 용액을 멸균여과할 수 있다.

VI. 약학적 조성물 및 제형

TNA 지질 입자와, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 본원에 제공된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 치료용 핵산의 완전 캡슐화, 부분 캡슐화를 제공한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 핵산 치료제는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 완전히 캡슐화되어 핵산 함유 지질 입자를 형성한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 핵산은 입자의 지질 부분에 캡슐화되어, 효소적 분해로부터 보호될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 효과적인 전달을 보장하는 지질 입자의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 100 nm, 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm이다. 핵산 함유 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 및 이의 제조 방법은, 예를 들어 국제출원 PCT/US18/50042호, 미국 특허출원공개 20040142025호 및 20070042031호에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 크기는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK) 시스템을 사용하여 준탄성 광산란에 의해 결정될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 의도된 치료 효과를 제공하도록 선택된 평균 직경을 갖는다.

(예를 들어, 지질 나노입자)의 의도된 용도에 따라, 구성요소의 비율이 달라질 수 있으며, 특정 제형의 전달 효율은, 예를 들어 엔도좀 방출 매개변수(ERP) 검정을 사용하여 측정될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 응집을 방지하기 위해 다른 모이어티와 접합될 수 있다. 이러한 지질 접합체에는, 비제한적으로, 예를 들어 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어 미국 특허 제5,885,613호 참조)와 같은 PEG-지질 접합체, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체; 예를 들어 2010년 1월 13일자 출원된 미국 임시출원 제61/294,828호 및 2010년 1월 14일자 출원된 미국 임시출원 제61/295,140호 참조), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물이 포함된다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는, 국제공개 WO 2010/006282호에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키는 데 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 비에스테르 함유 링커 모이어티와 에스테르 함유 링커 모이어티가 포함된다. 특정 바람직한 구현예에서, 아미드 또는 카르바메이트와 같은 비에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 지질 위치에서 캡슐화될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 지질 위치에서 완전히 캡슐화되어, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 ceDNA는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 37℃에서 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출시킨 후, 실질적으로 분해되지 않는다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 ceDNA는 상기 입자를 혈청에서 37℃에서 적어도 약 30분, 45분 또는 60분, 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 또는 36시간 동안 인큐베이션한 후 실질적으로 분해되지 않는다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 대상, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 치료용 핵산을 포함하는 약학적 조성물은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)로 제형화될 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 치료용 핵산을 포함하는 지질 입자는 개시된 이온화 가능한 지질로 형성될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 치료용 핵산을 포함하는 지질 입자는 비양이온성 지질로 형성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")로 이루어지는 군에서 선택되는 치료용 핵산을 포함하는 개시된 이온화 가능한 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 지질 입자는 비양이온성 지질, 및 선택적으로 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자 제형은 수용액이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 동결건조된 분말이다.

일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 1종 이상의 약학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 입자 제형을 제공한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 수크로오스, 트리스(tris), 트레할로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본원에 개시된 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 대상의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상에게의 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약학적 조성물은 본원에 개시된 TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 치료용 투여(예를 들어, 비경구 투여)의 목적하는 경로에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다. 치료 목적의 약학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 필요한 경우, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 지질 입자는 국소, 전신, 양막내, 경막내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 경막내, 방광내, 결막(예를 들어, 안와외, 안와내, 안와후방, 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 간질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막(예를 들어, 구강, 설하, 비강) 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다.

TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 포함하는 약학적 활성 조성물은 핵산의 전이유전자를 수용체의 세포로 전달하여, 그 안에서 전이유전자의 치료적 발현을 유도하도록 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

치료 목적을 위한 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정하다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 필요한 경우, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 고체 코어 입자이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 비(非)이중층 구조, 즉, 비(非)라멜라(즉, 비이중층) 형태를 갖는다. 비제한적으로, 비이중층 형태는, 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방 대칭 등을 포함할 수 있다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 비라멜라 형태(즉, 비이중층 구조)는 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 사용되는 분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 기술에는, 비제한적으로, 저온 투과 전자 현미경법(Cryo-Transmission Electron Microscopy)("Cryo-TEM"), 시차 주사 열량측정법("DSC"), X-선 회절 등이 포함된다. 예를 들어, 지질 입자의 형태(라멜라 대 비라멜라)는, 예를 들어 미국 특허출원공개 US2010/0130588호에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가 및 특징분석될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 비라멜라 형태를 갖는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 전자 밀도가 높다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형을 제공한다. 지질 구성요소의 조성 및 농도를 제어하는 방식으로, 지질 접합체가 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)로부터 교환되는 속도, 및 결국, 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)가 융합원성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어할 수 있다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)가 융합원성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법이, 본 개시내용을 기반으로 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어하여 지질 입자 크기를 제어할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 제형화된 이온화 가능한 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 바람직한 pKa 범위는 약 5 내지 약 8이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 바람직한 pKa 범위는 약 6 내지 약 7이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 바람직한 pKa는 약 6.5이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 이온화 가능한 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 결정될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 ceDNA의 캡슐화는, 핵산과 회합될 때 형광이 증강되는 염료를 사용하는 막 불투과성 형광 염료 배제 검정, 예를 들어 Oligreen® 검정 또는 PicoGreen® 검정을 수행하는 방식으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 캡슐화는 염료를 지질 입자 제형에 첨가하고, 생성된 형광을 측정하고, 소량의 비이온성 세제의 첨가 시 관찰된 형광과 비교하는 방식으로 결정된다. 지질 이중층의 세제 매개 파괴는 캡슐화된 ceDNA를 방출하여, 막 불투과성 염료와의 상호작용을 가능하게 한다. ceDNA의 캡슐화는 다음과 같이 계산될 수 있다: E= (I₀ - I)/I₀(여기서, I 및 I₀는 세제 첨가 전후의 형광 강도를 나타냄).

단위 투여량

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 조정될 수 있다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 맞게 조정된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸 생성기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 맞게 조정된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 맞게 조정된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경막내 또는 뇌실내 투여에 맞게 조정된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 수 있다.

VII. 치료 방법

본원에 기재된 이온화 가능한 지질 조성물 및 방법(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 TNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))은 숙주세포에 핵산 서열(예를 들어, 치료용 핵산 서열)을 도입하는 데 사용될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))를 사용한 숙주세포에의 핵산 서열의 도입은, 유전자 발현을 평가하기 위해 치료된 환자로부터의 적절한 바이오마커를 이용하여 모니터링될 수 있다.

본원에 제공된 LNP 조성물은 다양한 목적을 위해 전이유전자(핵산 서열)를 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는, 예를 들어 현장외, 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차, 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 사용될 수 있다.

대상에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께인, 치료적 유효량의 TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))를, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(예를 들어, 간세포, 근육세포, 신장세포, 신경세포, 또는 다른 영향을 받은 세포 유형)에 도입하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 구현된 TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 질환을 치료하는 데 유용한 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, TNA는, 대상에게 도입될 때, 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 본원에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 표적세포는 인간 대상에 있다.

진단적 또는 치료적 유효량의 TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 방법으로서, 일정량의 TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))를, TNA LNP로부터 전이유전자의 발현을 가능하게 하는 데 효과적인 시간 동안 이를 필요로 하는 대상의 세포, 조직 또는 기관에 제공하여, 대상에게 TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))에 의해 발현된 진단적 또는 치료적 유효량의 단백질, 펩타이드, 핵산을 제공하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 대상은 인간이다.

대상에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 일반적으로, 상기 방법은 적어도 TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))를, 이를 필요로 하는 대상에게, 대상에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 데 충분한 양으로 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 대상은 인간이다.

질환 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료하는 도구로서 TNA LNP를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 결함이 있는 유전자가 공지된 다수의 유전병이 존재하며, 이는 전형적으로 2개의 부류로 분류된다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질이 관여할 수 있으며, 전형적으로 우성 방식으로 유전되지만, 항상 우성 방식으로 유전되는 것은 아닌 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 대체 요법을 위해 영향을 받은 조직에 정상 유전자를 가져오기 위해 전이유전자를 전달하는 데 사용될 뿐 아니라, 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서는, 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성하는 데 사용될 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자)는 모델 시스템에서 질환 상태를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 질환 상태에 대응하기 위한 노력으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)) 및 방법은 유전 질환의 치료를 가능하게 한다. 본원에 사용된 질환 상태는, 질환을 유발하거나 이를 더 중증으로 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선하는 방식으로 치료된다.

일반적으로, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 연관된 증상을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 상기 기재된 바에 따라 임의의 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태에는, 비제한적으로, 낭성섬유증(및 다른 폐질환), A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 다른 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축측삭경화증, 뇌전증, 및 다른 신경계 장애, 암, 진성 당뇨병, 근디스트로피(예를 들어, 뒤시엔느형, 베커형), 헐러병, 아데노신 데아미나아제 결핍증, 대사 결함, 망막 퇴행성 질환(및 다른 눈의 질환), 미토콘드리아병증(예를 들어, 레베르 유전성 시신경 위축증(LHON: Leber's hereditary optic neuropathy), 리증후군(Leigh syndrome) 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증(예를 들어, 안면견갑상완 근병증(FSHD) 및 심근병증), 고형 기관(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환 등이 포함된다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 대사장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증)을 앓고 있는 개체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 TNA LNP는 유전자 또는 유전자 산물에서 돌연변이에 의해 유발되는 질환 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애에는, 비제한적으로, 대사 질환 또는 장애(예를 들어, 파브리병, 고셰병, 페닐케톤뇨증(PKU), 글리코겐축적질환); 요소회로 질환 또는 장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증); 리소좀 축적 질환 또는 장애(예를 들어, 이염성 백질디스트로피(MLD), 점액다당류증 II형(MPSII; 헌터증후군)); 간 질환 또는 장애(예를 들어, 진행성 가족성 간내 담즙정체증(PFIC); 혈액 질환 또는 장애(예를 들어, A형 및 B형 혈우병, 지중해빈혈 및 빈혈); 암 및 종양, 및 유전 질환 또는 장애(예를 들어, 낭성섬유증)가 포함된다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자)는 전이유전자 발현 수준(예를 들어, 호르몬 또는 성장인자를 인코딩하는 전이유전자)을 조절하는 것이 바람직한 상황에서 이종 뉴클레오타이드 서열을 전달하는 데 이용될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 질환 또는 장애를 초래하는 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능(예를 들어, 단백질의 부재 또는 이의 결함)을 교정하는 데 사용될 수 있다. TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 기능성 단백질을 생성하고/하거나 단백질 수준을 변경시켜, 단백질의 부재 또는 결함에 의해 유발되는 특정 질환 또는 장애로 인해 발생한 증상을 완화 또는 감소시키거나, 이러한 질환 또는 장애에 유익을 부여할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍증의 치료는 기능성 OTC 효소를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; A형 및 B형 혈우병의 치료는 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; PKU의 치료는 페닐알라닌 히드록실라아제 효소의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; 파브리병 또는 고셰병의 치료는, 각각, 기능성 알파 갈락토시다아제 또는 베타 글루코세레브로시다아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; MFD 또는 MPSII의 치료는, 각각, 기능성 아릴설파타아제 A 또는 이두로네이트-2-설파타아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 낭성섬유증의 치료는 기능성 낭성섬유증 막관통 전도 조절제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 글리코겐축적질환의 치료는 기능성 G6Pase 효소 기능을 회복시키는 방식으로 달성될 수 있고; PFIC의 치료는 기능성 ATP8B1, ABCB11, ABCB4 또는 TJP2 유전자를 생성하는 방식으로 달성될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 RNA 기반 치료제를 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. RNA 기반 치료제의 예에는, 비제한적으로, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. 예를 들어, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 안티센스 핵산을 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 RNAi 분자인 경우, 표적세포 내 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 전이유전자는 이를 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내 세포에 투여될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 DNA 기반 치료제를 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. DNA 기반 치료제의 예에는, 비제한적으로, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다. 예를 들어, 예를 들어, 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 미니서클을 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 미니서클 DNA인 경우, 표적세포 내 미니서클 DNA의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, 미니서클 DNA인 전이유전자는 이를 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 미니서클 DNA는 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내 세포에 투여될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 발현 카세트를 포함하는 TNA 벡터에 의해 인코딩된 예시적인 전이유전자에는, 비제한적으로, X, 리소좀 효소(예를 들어, 테이-삭스병과 연관된 헥소사미니다아제 A, 또는 헌터증후군/MPS II와 연관된 이두로네이트 설파타아제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 글로빈, 렙틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제뿐 아니라, 사이토카인(예를 들어, 인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-12, 과립구-대식세포 집락자극인자, 림프독소 등), 펩타이드 성장인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자-1 및 2, 혈소판유래성장인자(PDGF), 표피성장인자(EGF), 섬유아세포성장인자(FGF), 신경성장인자(NGF), 신경영양인자-3 및 4, 뇌유래신경영양인자(BDNF), 신경교유래성장인자(GDNF), 형질전환성장인자-a 및 -b, 등), 수용체(예를 들어, 종양괴사인자 수용체)가 포함된다. 일부 예시적인 구현예에서, 전이유전자는 하나 이상의 목적하는 표적에 특이적인 단클론 항체를 인코딩한다. 일부 예시적인 구현예에서, 하나 초과의 전이유전자가 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 예시적인 구현예에서, 전이유전자는 2개의 상이한 관심 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 전이유전자는 본원에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 인코딩한다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 전이유전자 서열은 자살 유전자 산물(티미딘 키나아제, 시토신 데아미나아제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나아제 및 종양괴사인자), 암 치료에 사용되는 약물에 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제 유전자 산물을 인코딩한다.

투여

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자)는 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자)는 생체외 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여될 수 있다.

일반적으로, 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 도입하는 데 통상적으로 사용되는 임의의 경로를 통해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에 널리 공지되어 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다. TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자)의 예시적인 투여 방식에는, 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 경막내, 안구내, 경피, 내피내, 자궁내(또는 알내(in ovo)), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면, 및 경피 투여), 림프내 등뿐 아니라, (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장근, 횡격막근 또는 뇌에의) 직접적인 조직 또는 기관 주사가 포함된다.

TNA LNP 유사 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA LNP)의 투여는, 비제한적으로, 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 이루어지는 군에서 선택되는 부위를 포함하는 대상의 임의의 부위에 이루어질 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA LNP의 투여는 또한 종양에(예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 근처에) 이루어질 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방하고자 하는 병태의 특성 및 중증도에 따라, 및 사용되는 특정 ceDNA LNP의 특성에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 하나 초과의 전이유전자를 단일 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 칵테일)로 투여하는 것을 가능하게 한다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 골격근에의 ceDNA LNP의 투여는, 비제한적으로, 사지(예를 들어, 상완(upper arm), 하완(lower arm), 상각(upper leg) 및/또는 하각(lower leg)), 등, 목, 머리(예를 들어, 혀), 흉곽, 복부, 골반/회음, 및/또는 손(발)가락의 골격근에의 투여를 포함한다. ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류(선택적으로, 다리 및/또는 팔의 격리된 사지 관류; 예를 들어 문헌[Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464] 참조), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, ceDNA LNP는 사지 관류, 선택적으로 격리된 사지 관류에 의해(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해), 대상(예를 들어, DMD와 같은 근디스트로피를 앓고 있는 대상)의 사지(팔 및/또는 다리)에 투여된다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, ceDNA LNP는 "유체역학적" 기술을 이용하지 않고 투여될 수 있다.

심장근에의 TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)의 투여는, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 격막에의 투여를 포함한다. TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 정맥내 투여, 대동맥내 투여와 같은 동맥내 투여, 직접 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실에) 및/또는 관상동맥 관류에 의해 심장근에 전달될 수 있다. 횡격막근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 투여는 평활근에, 이의 근처에 및/또는 이의 위에 존재하는 내피세포에 이루어질 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 (예를 들어, 근디스트로피 또는 심장질환(예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해) 골격근, 횡격막근 및/또는 심장근에 투여된다.

TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 CNS(예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여될 수 있다. TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 척수, 뇌간(연수, 교뇌), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑색질, 송과체), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함하는 대뇌, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구에 도입될 수 있다. TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다양한 영역에 투여될 수 있다. TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 (예를 들어, 요추천자에 의해) 뇌척수액에 전달될 수 있다. TNA LNP(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자)는 나아가 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS에 혈관내 투여될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는, 비제한적으로, 경막내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에서), 비강내, 이내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논낭하(sub-Tenon's region)) 전달뿐 아니라, 운동 뉴런으로의 역행 전달을 통한 근육내 전달을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 경로를 통해 CNS의 목적하는 영역(들)에 투여될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 직접 주사(예를 들어, 정위주사)를 통해 액체 제형으로 CNS 내 목적하는 영역 또는 구획에 투여된다. 다른 구현예에 따르면, TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 목적하는 영역에의 국소 적용 또는 에어로졸 제형의 비강내 투여를 통해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 점적액의 국소 적용을 통해 이루어질 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체 서방형 제형으로 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨) 참조). 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 운동 뉴런과 관련된 질환 및 장애(예를 들어, 근위축측삭경화증(ALS); 척수근위축증(SMA) 등)를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, TNA LNP(예를 들어, ceDNA LNP)는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직에 전달될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 치료제의 반복 투여는 적절한 발현 수준이 달성될 때까지 이루어질 수 있다. 따라서, 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 치료용 핵산은 다회 투여 및 재투여될 수 있다. 예를 들어, 치료용 핵산은 0일차에 투여될 수 있다. 0일차의 초기 치료 후, 두 번째 투여(재투여)는, 치료용 핵산을 이용한 초기 치료 후, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 또는 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 11년, 약 12년, 약 13년, 약 14년, 약 15년, 약 16년, 약 17년, 약 18년, 약 19년, 약 20년, 약 21년, 약 22년, 약 23년, 약 24년, 약 25년, 약 26년, 약 27년, 약 28년, 약 29년, 약 30년, 약 31년, 약 32년, 약 33년, 약 34년, 약 35년, 약 36년, 약 37년, 약 38년, 약 39년, 약 40년, 약 41년, 약 42년, 약 43년, 약 44년, 약 45년, 약 46년, 약 47년, 약 48년, 약 49년, 또는 약 50년 내에 수행될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 1종 이상의 추가 화합물이 또한 포함될 수 있다. 이러한 화합물은 별도로 투여될 수 있거나, 추가 화합물은 본 발명의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 포함될 수 있다. 다시 말해서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 TNA 이외의 다른 화합물, 또는 적어도 제1 TNA와 상이한 제2 TNA를 함유할 수 있다. 비제한적으로, 다른 추가 화합물은 소형 또는 대형 유기 또는 무기 분자, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당류, 펩타이드, 단백질, 펩타이드 유사체 및 유도체, 펩타이드 모방체, 핵산, 핵산 유사체 및 유도체, 생물학적 물질로 제조된 추출물, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 1종 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 따라서, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 치료제는 치료 목적 및 목적하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, LNP 내 TNA가 암 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항암제(예를 들어, 화학요법제, 표적화 암치료(비제한적으로, 소분자, 항체, 또는 항체-약물 접합체 포함)일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA를 함유하는 LNP가 감염의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항미생물제(예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, TNA를 함유하는 LNP가 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 면역반응을 조절하는 화합물(예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물, 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 상이한 화합물, 예컨대 상이한 단백질을 인코딩하는 TNA 또는 치료제와 같은 상이한 화합물을 함유하는 상이한 지질 입자의 상이한 칵테일이, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 하나의 구현예에서, 추가 화합물은 면역조절제이다. 예를 들어, 추가 화합물은 면역억제제이다. 본원의 양태 및 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역자극제이다.

실시예

하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다. 당업자는 이온화 가능한 지질이 하기에 기재되는 일반 합성 방법을 사용하여 설계되고 합성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

일반 합성

화학식 I의 이온화 가능한 지질은 하기 반응식 1에 도시된 바와 유사한 합성 방법을 사용하여 설계하고 합성하였다.

반응식 1

실시예 1:

1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 1)의 합성

절단 가능하고 이온화 가능한 헤드기 ((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)비스(2-(4-히드록시페닐)아세테이트) (7)의 합성

단계-1

디설판디일비스(에탄-2,1-디일) 디메탄설포네이트 (2)의 합성. 상업적으로 입수 가능한 2,2'-디설판디일비스(에탄-1-올) (1)(15 g, 97.2 mmol)을 아세토니트릴(143 ml)에 용해시킨 후, 트리에틸아민(NEt₃)(33.3 g, 328 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물에, 0℃에서 메탄설포닐 클로라이드(MsCl)(34.5 g, 300 mmol)를 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 에탄올(EtOH)(39 ml)을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과액을 디클로로메탄(DCM)(150 ml)과 10% 탄산수소소듐 수용액(150 ml) 사이에 분배하였다. 유기층을 물(100 ml)로 4회 세정하고, 황산마그네슘(MgSO₄) 상에서 건조시키고, 증발시켜 2(25 g, 81%)를 갈색 오일로 수득하고, 이를 정치시켜 고체화시켰다.¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.43-4.48 (t, 4H), 3.00-3.10 (m, 10H).

단계-2

2,2'-((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-1-올) (4)의 합성. 아세토니트릴(310 ml) 중 2(12 g, 38.7 mmol)의 용액에, 탄산포타슘(K₂CO₃)(13.4 g, 96.6 mmol), 이어서 2-(피페리딘-4-일)에탄-1-올 (3)(20 g, 155 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과액을 건조될 때까지 증발시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 DCM(100 ml)에 용해시키고, 물(50 ml)로 2회 세정하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 증발시켜 4를 황색 오일(11.8 g, 79%)로 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 3.63-3.68 (t, 4H), 2.78-2.90 (m, 8H), 2.62-2.65 (t, 4H), 1.94-2.02 (t, 4H), 1.70 (s, 2H), 1.65-1.70 (d, 4H), 1.27-1.48 (t, 4H), 1.40-1.50 (m, 2H), 1.23-1.27 (m, 4H).

단계-3

2-(4-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)페닐)아세트산 (5)의 합성. 디메틸포름아미드(DMF)(40 ml) 중 4-히드록시페닐아세트산 (5a)(10 g, 65 mmol)의 교반된 용액에, 0℃에서 NEt₃(10 g, 100 mmol), 이어서 tert-부틸디메틸실릴클로라이드(TBSCl)(15 g, 100 mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 물(200 ml) 및 DCM(150 ml)으로 처리하였다. 유기상을 분리하였다. 수성상을 DCM(100 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 중탄산소듐 포화 용액 및 염수로 세정하고, 황산소듐(Na₂SO₄) 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올(MeOH)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 5(4.8 g, 27%) 및 디-tert-부틸디메틸실릴 에테르(di-TBS) 부산물(10.5 g, 42%)을 수득하였다. 5의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.12 (d, 2H), 6.78 (d, 2H), 3.56 (s, 2H), 0.97 (s, 9H), 0.18 (s, 6H).

((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)비스(2-(4-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)페닐)아세테이트) (6)의 합성. DCM(100 ml) 중 단계-2에서 얻은 디설파이드 4(1.92 g, 5 mmol) 및 페닐아세트산 5(3.4 g, 12.8 mmol)의 교반된 용액에, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(1.5 g, 12.5 mmol), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDCI)(2.4 g, 12.5 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(200 ml) 및 염수(150 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 6(4.1 g, 92%)을 수득하였다. 6의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.12 (d, 4H), 6.75 (d, 4H), 4.1 (t, 4H), 3.5 (s, 4H), 2.82 (m, 8H), 2.62 (m, 4H), 1.93 (t, 4H), 1.61-1.45 (m, 8H), 1.26 (m, 6H), 0.97 (s, 18H), 0.17 (s, 4H).

단계-4

((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)비스(2-(4-히드록시페닐)아세테이트) (7)의 합성. 테트라히드로푸란(THF)(40 ml) 중 디설파이드 6(3.1 g, 3.6 mmol)의 교반된 용액에, 0℃에서 플루오린화수소 피리딘(1 ml, 3.8 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안, 이어서 실온에서 추가 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 중탄산소듐 포화 용액(200 ml)으로 처리하고, 에틸 아세테이트(2 × 150 ml)로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(100 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물 7(1.92 g, 82%)을 제공하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.13 (d, 4H), 6.70 (d, 4H), 4.1 (t, 4H), 3.5 (s, 4H), 2.89 (m, 8H), 2.70 (m, 4H), 1.95 (t, 4H), 1.48 (m, 8H), 1.17 (m, 6H).

9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산 (10)의 합성

9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산 (10)의 합성. 디클로로메탄(1000 ml) 중 노난디오산 (8)(7.34 g, 39 mmol) 및 헵타데칸-9-올 (8b)(5 g, 19 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(2.37 g, 19 mmol), 이어서 EDCI(3 g, 19 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 1 N HCl(250 ml) 및 물(250 ml)로 세정하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 10(6.2 g, 75%)을 백색 고체로 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.80-4.90 (m, 1H), 2.25-2.34 (m, 4H), 1.55-1.70 (m, 4H), 1.40-1.50 (m, 4H), 1.20-1.40 (m, 30H), 0.84-0.90 (t, 3H).

1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트의 합성

1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트 (11)의 합성. DMF(20 ml) 중 단계-4에서 제조된 디설파이드 7(580 mg, 0.9 mmol) 및 산 10(422 mg, 0.99 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(165 mg, 1.35 mmol), 이어서 EDCI(258 mg, 1.35 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(50 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(2 × 50 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(30 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물 11(427 mg, 45%)을 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.27 (d, 2H), 7.11 (d, 2H), 7.03 (d, 2H), 6.69 (d, 2H), 4.85 (m, 1H), 4.1 (m, 4H), 3.56 (s, 2H), 3.48 (s, 2H), 2.92 (d, 2H), 2.85-2.69 (m, 12H), 2.71 (t, 2H), 2.28 (t, 2H), 1.95 (t, 2H), 1.52-1.01 (m, 53H), 0.85 (m, 6H).

지질 1의 합성

1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 1)의 합성. 디클로로메탄(10 ml) 중 디설파이드 11(151 mg, 0.14 mmol) 및 올레산 12(61 mg, 0.22 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(28 mg, 0.22 mmol), 이어서 EDCI(42 mg, 0.22 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 1(126 mg, 68%)을 수득하였다. 지질 1의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.25 (d, 4H), 7.01 (d, 4H), 5.34 (m, 2H), 4.86 (m, 1H), 4.11 (t, 4H), 3.58 (s, 4H), 2.91-2.70 (m, 8H), 2.62 (m, 4H), 2.53 (t, 4H), 2.28 (t, 2H), 2.05-1.87 (m, 8H), 1.78-1.46 (m, 22H), 1.48-1.23 (m, 54H), 0.86 (t, 9H). MS [M+H]⁺1318.

실시예 2: 1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-(노닐옥시)-9-옥소노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 3)의 합성

9-(노닐옥시)-9-옥소노난산 (9)의 합성

9-(노닐옥시)-9-옥소노난산 (9)의 합성. DCM(1000 ml) 중 노난디오산 (8)(13.2 g, 0.1 mol) 및 노난-1-올 (8a)(7.2 g, 0.05 mol)의 교반된 용액에, DMAP(6.1 g, 0.05 mol), 이어서 EDCI(7.7 g, 0.05 mol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 1 N 염산(HCl) 용액(500 ml) 및 물(500 ml)로 세정하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 9(12.6 g, 81%)를 백색 고체로 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.03-4.07 (t, 2H), 2.28-2.34 (m, 4H), 1.58-1.63 (m, 6H), 1.26-1.32 (m, 18H), 0.85-0.87 (t, 3H).

지질 3의 합성

1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-(노닐옥시)-9-옥소노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 3)의 합성. 디클로로메탄(10 ml) 중 디설파이드 11(실시예 1에 기재된 단계별 합성)(150 mg, 0.14 mmol) 및 산 9(62 mg, 0.22 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(28 mg, 0.22 mmol), 이어서 EDCI(42 mg, 0.22 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 3(114 mg, 60%)을 수득하였다. 지질 3의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.28 (d, 4H), 7.02 (d, 4H), 4.86 (m, 1H), 4.11 (t, 4H), 4.04 (t, 2H), 3.58 (s, 4H), 2.93-2.77 (m, 8H), 2.63 (m, 4H), 2.53 (t, 4H), 2.28 (m, 4H), 1.95 (t, 4H), 1.85-1.47 (m, 24H), 1.45-1.16 (m, 54H), 0.86 (t, 9H). MS [M+H]⁺1350.

실시예 3: 1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((5-(노닐옥시)-5-옥소펜타노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 2)의 합성

DCM(10 ml) 중 디설파이드 11(실시예 1에 기재된 단계별 합성)(150 mg, 0.14 mmol) 및 산 9a(산 9에 대한 실시예 1에 기재된 합성 참조, 여기서 출발 물질로 노난디오산 (8)을 상업적으로 입수 가능한 글루타르산으로 대체하여 노난-1-올 (8a)과 반응시켜 9a를 생성함)(57 mg, 0.22 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(28 mg, 0.22 mmol), 이어서 EDCI(42 mg, 0.22 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 2(151 mg, 81%)를 수득하였다. 지질 2의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.26 (d, 4H), 7.01 (d, 4H), 4.86 (m, 1H), 4.10-4.02 (t, 6H), 3.57 (s, 4H), 3.01 (d, 4H), 2.83-2.72 (m, 4H), 2.34-2.21 (m, 14H), 2.15-1.91 (m, 6H), 1.74-1.41 (m, 12H), 1.39-1.16 (m, 52H), 0.86 (t, 9H). MS [M+H]⁺ 1293.

실시예 4: 1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((5-(노닐옥시)-5-옥소펜타노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 4)의 합성

디클로로메탄(5 ml) 및 DMF(3 ml)의 혼합물 중 디설파이드 7(실시예 1에 기재된 단계별 합성)(150 mg, 0.23 mmol) 및 화합물 9(실시예 2에 기재된 합성)(146 mg, 0.46 mmol)의 교반된 용액에, 0℃에서 DMAP(70 mg, 0.57 mmol), 이어서 EDCI(109 mg, 0.57 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 15분 동안, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. DCM(20 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 4(180 mg, 63%)를 수득하였다. 지질 4의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.28 (d, 4H), 7.02 (d, 4H), 4.11 (t, 4H), 4.04 (t, 4H), 3.58 (s, 4H), 2.93-2.67 (m, 8H), 2.63-2.55 (m, 4H), 2.53 (t, 4H), 2.29 (t, 4H), 1.94 (t, 4H), 1.85-1.47 (m, 20H), 1.45-1.16 (m, 42), 0.87 (t, 6H). MS [M+H]⁺1237.

실시예 5: O'1,O1-((((((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(2-옥소에탄-2,1-디일))비스(4,1-페닐렌)) 9,9'-디(헵타데칸-9-일) 디(노난디오에이트) (지질 5)의 합성

DMF(20 ml) 중 디설파이드 7(실시예 1에 기재된 단계별 합성)(580 mg, 0.9 mmol) 및 산 10(실시예 1에 기재된 합성)(422 mg, 0.99 mmol)의 교반된 용액에, 0℃에서 DMAP(164 mg, 1.35 mmol), 이어서 EDCI(257 mg, 1.35 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 15분 동안, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. DCM(60 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 5(280 mg, 38%)를 수득하였다. 지질 5의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.26 (d, 4H),7.02 (d, 4H), 4.85 (m, 2H), 4.11 (t, 4H), 3.58 (s, 4H), 2.86-2.77 (m, 8H), 2.63 (m, 4H), 2.53 (t, 4H), 2.27 (t, 4H), 1.92 (t, 4H), 1.75-1.47 (m, 26H), 1.45-1.16 (m, 64H), 0.86 (t, 12H). MS [M+H]⁺1462.

실시예 6: 1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-(운데칸-3-일) 노난디오에이트 (지질 6)의 합성

9-옥소-9-(운데칸-3-일옥시)노난산 (9b)의 합성

9-옥소-9-(운데칸-3-일옥시)노난산 (9b)의 합성. DCM(500 ml) 중 노난디오산 (8)(10.9 g, 0.058 mol) 및 운데칸-3-올 (8b)(5 g, 0.029 mol)의 교반된 용액에, DMAP(3.5 g, 0.03 mol), 이어서 EDCI(4.5 g, 0.03 mol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 1 N HCl 용액(500 ml) 및 물(500 ml)로 세정하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 9b(6.5 g, 66%)를 백색 고체로 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.79-4.83 (t, 1 H), 2.28-2.34 (m, 4 H), 1.25-1.33 (m, 8 H), 1.26-1.32 (m, 18 H), 0.85-0.87 (t, 6 H).

4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐 올레에이트 (13)의 합성

4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐 올레에이트 (13)의 합성. DCM(200 ml) 중 디설파이드 7(실시예 1에 기재된 단계별 합성)(2.0 g, 3 mmol) 및 올레산(또는 실시예 1에 기재된 바와 같은 산 12)(0.79 g, 2.8 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(340 mg, 2.8 mmol), 이어서 EDCI(440 mg, 2.8 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(2 × 50 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(30 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 디클로로메탄 중 0%→5% 메탄올을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 13(1.6 g, 57%)을 백색 고체로 수득하였다. 생성물을 추가 특징분석 없이 바로 다음 단계에 사용하였다.

지질 6의 합성

1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-(운데칸-3-일) 노난디오에이트 (지질 6)의 합성. DCM(20 ml) 중 디설파이드 13(250 mg, 0.27 mmol) 및 산 9b(113 mg, 0.33 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(40 mg, 0.33 mmol), 이어서 EDCI(51 mg, 0.33 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 6(120 mg, 36%)을 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.31 (d, 4 H), 7.05 (d, 4 H), 5.36-5.40 (m, 2 H), 4.86 (m, 1 H), 4.11 (t, 4 H), 3.62 (t, 4 H), 2.77-2.90 (m, 8 H), 2.55-2.71 (m, 8 H), 2.30-2.34 (m, 2 H), 1.96-2.05 (m, 8 H), 1.77 (m, 4 H), 1.58-1.67 (m, 18 H), 1.30-1.58 (m, 40 H), 0.89 (t, 9 H).

실시예 7: 1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-(트리데칸-5-일) 노난디오에이트 (지질 7)의 합성

트리데칸올-5-올 (8c)의 합성

트리데칸-5-올 (8c)의 합성. 무수 THF(100 ml) 중 알데히드 8c-1(7.1 g, 0.05 mol)의 용액에, -78℃에서 THF 중 2 M 부틸리튬(BuLi) 용액(27 ml)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안, 이어서 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 1 N HCl과 에테르 사이에 분배하였다. 유기층을 수집하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 증발시켜 미정제 8c(10 g, 100%)를 황색 오일로 수득하고, 이를 추가 정제 없이 바로 다음 단계에 사용하였다.

9-옥소-9-(트리데칸-5-일옥시)노난산 (9c)의 합성

9-옥소-9-(트리데칸-5-일옥시)노난산 (9c)의 합성. DCM(500 ml) 중 노난디오산 (8)(9.4 g, 0.05 mol) 및 8c(5 g, 0.025 mol)의 교반된 용액에, DMAP(3.05 g, 0.025 mol), 이어서 EDCI(3.88 g, 0.025 mol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 1 N HCl 용액(500 ml) 및 물(500 ml)로 세정하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 9c(2.5 g, 27%)를 백색 고체로 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.84-4.87 (t, 1 H), 2.28-2.34 (m, 4 H), 1.58-1.63 (m, 7 H), 1.26-1.32 (m, 23 H), 0.85-0.87 (t, 6 H).

지질 7의 합성

1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-(트리데칸-5-일) 노난디오에이트 (지질 7)의 합성. DCM(20 ml) 중 디설파이드 13(실시예 6에 기재된 합성)(250 mg, 0.27 mmol) 및 산 9c(116 mg, 0.33 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(40 mg, 0.33 mmol), 이어서 EDCI(51 mg, 0.33 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 7(160 mg, 40%)을 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.29 (d, 4 H), 7.04 (d, 4 H), 5.29-5.34 (m, 2 H), 4.86 (m, 1 H), 4.11 (t, 4 H), 3.58 (t, 4 H), 2.77-2.90 (m, 8 H), 2.51-2.79 (m, 8 H), 2.28 (m, 2 H), 1.94-2.05 (m, 8 H), 1.70-1.80 (m, 4 H), 1.49-1.67 (m, 18 H), 1.10-1.40 (m, 46 H), 0.88 (t, 9 H).

실시예 8: 1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-(펜타데칸-7-일) 노난디오에이트 (지질 8)의 합성

펜타데칸-7-올 (8d)의 합성

펜타데칸-7-올 (8d)의 합성. 무수 THF(100 ml) 중 알데히드 8d-1(7.1 g, 0.05 mol)의 용액에, -78℃에서 THF 중 2 M 헥실마그네슘 브로마이드 용액(27 ml)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 1 N HCl과 에테르 사이에 분배하였다. 유기층을 수집하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 증발시켜 미정제 8d(11 g, 100%)를 백색 고체로 수득하고, 이를 추가 정제 없이 바로 다음 단계에 사용하였다.

9-옥소-9-(펜타데칸-7-일옥시)노난산 (9d)의 합성

9-옥소-9-(펜타데칸-7-일옥시)노난산 (9d)의 합성. DCM(1000 ml) 중 노난디오산 (8)(9.4 g, 0.05 mol) 및 펜타데칸-7-올 (8d)(5.7 g, 0.025 mol)의 교반된 용액에, DMAP(3.05 g, 0.025 mol), 이어서 EDCI(3.88 g, 0.025 mol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 1 N HCl 용액(500 ml) 및 물(500 ml)로 세정하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 9d(6.2 g, 62%)를 백색 고체로 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.86 (t, 1 H), 2.28-2.34 (m, 4 H), 1.58-1.63 (m, 8 H), 1.26-1.32 (m, 27 H), 0.85-0.87 (t, 6 H).

지질 8의 합성

1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-(펜타데칸-7-일) 노난디오에이트 (지질 8)의 합성. DCM(20 ml) 중 디설파이드 13(실시예 6에 기재된 합성)(250 mg, 0.27 mmol) 및 산 9d(120 mg, 0.33 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(40 mg, 0.33 mmol), 이어서 EDCI(51 mg, 0.33 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 8(170 mg, 40%)을 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.29 (d, 4 H), 7.04 (d, 4 H), 5.29-5.34 (m, 2 H), 4.86 (m, 1 H), 4.11 (t, 4 H), 3.58 (t, 4 H), 2.80-2.93 (m, 8 H), 2.51-2.68 (m, 8 H), 2.28 (m, 2 H), 1.97-2.05 (m, 8 H), 1.70-1.80 (m, 4 H), 1.50-1.70 (m, 18 H), 1.10-1.40 (m, 58 H), 0.87 (t, 9 H).

실시예 9: 1-노닐 9-(4-(2-옥소-2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-옥소-9-(운데칸-3-일옥시)노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 9)의 합성

1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-노닐 노난디오에이트 (14)의 합성.

1-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 9-노닐 노난디오에이트 (14)의 합성. 디클로로메탄(200 ml) 중 디설파이드 7(실시예 1에 기재된 단계별 합성)(3.1 g, 4.8 mmol) 및 9-(노닐옥시)-9-옥소노난산 (9)(실시예 1에 기재된 합성)(1.51 g, 4.8 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(587 mg, 4.8 mmol), 이어서 EDCI(746 mg, 4.8 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(50 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(2 × 50 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(30 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물 14(2.47 g, 55%)를 수득하였다. 생성물을 추가 특징분석 없이 바로 다음 단계에 사용하였다.

지질 9의 합성

1-노닐 9-(4-(2-옥소-2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-옥소-9-(운데칸-3-일옥시)노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 9)의 합성. 디클로로메탄(20 ml) 중 디설파이드 14(250 mg, 0.26 mmol) 및 산 9b(실시예 6에 기재된 합성)(110 mg, 0.32 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(46 mg, 0.37 mmol), 이어서 EDCI(50 mg, 0.32 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 9(230 mg, 68%)를 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.28 (d, 4 H), 7.04 (d, 4 H), 4.86 (m, 1 H), 4.06-4.12 (t, 4 H), 4.04 (t, 2 H), 3.59 (s, 4 H), 2.60-2.90 (m, 8 H), 2.27-2.60 (m, 10 H), 1.97 (t, 3 H), 1.52-1.80 (m, 18 H), 1.10-1.40 (m, 40 H), 0.88 (t, 9 H).

실시예 10: 1-노닐 9-(4-(2-옥소-2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-옥소-9-(트리데칸-5-일옥시)노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 10)의 합성

1-노닐 9-(4-(2-옥소-2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-옥소-9-(트리데칸-5-일옥시)노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 10)의 합성. 디클로로메탄(20 ml) 중 디설파이드 14(실시예 9에 기재된 합성)(330 mg, 0.35 mmol) 및 산 9c(실시예 7에 기재된 합성)(143 mg, 0.39 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(47 mg, 0.39 mmol), 이어서 EDCI(60 mg, 0.39 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 디클로로메탄 중 0%→5% 메탄올을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 10(150 mg, 33%)을 수득하였다. ¹H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.26 (d, 4 H), 7.03 (d, 4 H), 4.86 (m, 1 H), 4.05-4.11 (t, 6 H), 3.58 (s, 4 H), 2.80-2.90 (m, 8 H), 2.50-2.70 (m, 8 H), 2.26-2.29 (m, 4 H), 1.92-1.99 (m, 4 H), 1.50-1.80 (m, 24 H), 1.16-1.40 (m, 46 H), 0.87 (t, 9 H).

실시예 11: 1-노닐 9-(4-(2-옥소-2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-옥소-9-(펜타데칸-7-일옥시)노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 11)의 합성

1-노닐 9-(4-(2-옥소-2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-((9-옥소-9-(펜타데칸-7-일옥시)노나노일)옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)에틸)페닐) 노난디오에이트 (지질 11)의 합성. DCM(20 ml) 중 디설파이드 14(실시예 9에 기재된 합성)(260 mg, 0.28 mmol) 및 산 9d(실시예 8에 기재된 합성)(122 mg, 0.3 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(37 mg, 0.3 mmol), 이어서 EDCI(47 mg, 0.3 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 중탄산소듐 포화 용액(20 ml) 및 염수(20 ml)로 세정하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 11(110 mg, 30%)을 수득하였다. 지질 11의 ¹H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.26 (d, 4 H),7.02 (d, 4 H), 4.86 (m, 1 H), 4.05-4.11 (t, 6 H), 3.59 (s, 4 H), 2.80-2.90 (m, 8 H), 2.50-2.70 (m, 8 H), 2.27-2.29 (m, 4 H), 1.90-2.20 (t, 4 H), 1.50-1.82 (m, 24 H), 1.10-1.40 (m, 50 H), 0.87 (t, 9 H).

표 4의 하기 지질 12 내지 지질 20은 적절한 출발 물질 및 당업자의 지식에 속할 수 있는 기타 변형을 이용하여 유사한 절차에 따라 제조하였다.

실시예 2: 지질 나노입자의 제조

지질 나노입자(LNP)는 대략 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA의 중량비로 제조하였다. 간략하게, 본 발명의 이온화 가능한 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)), 막 온전성을 제공하기 위한 구성요소(예컨대, 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤) 및 접합된 지질 분자(예컨대, PEG-지질, 예를 들어 평균 PEG 분자량이 2000인 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤("PEG-DMG"))를, 예를 들어 50:10:37:3 또는 20:40:38:2의 몰비로 알코올(예를 들어, 에탄올)에 용해시켰다. ceDNA를 완충 용액 중에 목적하는 농도로 희석하였다. 예를 들어, ceDNA를 소듐 아세테이트, 소듐 아세테이트와 염화마그네슘, 시트레이트, 말산, 또는 말산과 염화소듐을 포함하는 완충 용액 중에 0.1 mg/ml 내지 0.25 mg/ml의 농도로 희석하였다. 하나의 예에서, ceDNA를 10 mM 내지 50 mM 시트레이트 완충액(pH 4) 중에 0.2 mg/mL로 희석하였다. 알코올성 지질 용액을, 예를 들어 시린지 펌프 또는 충돌 제트 혼합기를 사용하여 10 ml/분 초과의 총 유속으로, ceDNA 수용액과 약 1:5 내지 1:3(vol/vol)의 비로 혼합하였다. 하나의 예에서, 알코올성 지질 용액을 12 ml/분의 유속으로 ceDNA 수용액과 약 1:3(vol/vol)의 비로 혼합하였다. 알코올을 제거하고, 완충액을 투석을 통해 PBS로 대체하였다. 대안적으로, 완충액을 원심분리 튜브를 사용하여 PBS로 대체하였다. 알코올 제거 및 동시 완충액 교환은, 예를 들어 투석 또는 접선 유동 여과를 통해 수행하였다. 수득한 지질 나노입자를 0.2 μm 공극 멸균 필터를 통해 여과하였다.

하나의 연구에서, 대조군으로 SS-OP, DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2000(몰비 50:10:37:3)을 포함하는 지질 용액을 사용하여 예시적인 ceDNA를 포함하는 지질 나노입자를 제조하였다. 일부 예에서, N-아세틸갈락토사민(GalNAc)과 같은 조직 표적화 모이어티를 포함시켰다. 3개 가지 GalNAc(GalNAc3) 또는 4개 가지 GalNAc(GalNAc4)와 같은 GalNAc 모이어티를 당업계에 공지된 바와 같이(WO2017/084987 및 WO2013/166121 참고) 합성하여, 당업계에 널리 공지된 바와 같이(문헌[Resen et al., J. Biol. Chem. (2001) "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" 276:375577-37584] 참고) 지질 또는 PEG에 화학적으로 접합시킬 수 있다. 완충 용액 중 ceDNA의 수용액을 제조하였다. 지질 용액과 ceDNA 용액을 NanoAssembler에서 자체 개발된 절차를 사용하여 12 mL/분의 총 유속으로 1:3(v/v)의 지질 대 ceDNA 비로 혼합하였다.

종(수, 성별, 연령): CD-1 마우스(N = 65마리와 예비용 5마리, 수컷, 도착 시 약 4주령).

케이지 관찰: 케이지 관찰은 매일 수행하였다.

임상 관찰: 임상 관찰은 0일차에 시험 물질을 투여하고 약 1시간, 약 5시간 내지 약 6시간, 및 약 24시간 후에 수행하였다. 예외적으로 추가 관찰이 이루어졌다. 모든 동물의 체중을, 해당되는 경우, 0일차, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차 및 7일차(안락사 전)에 기록하였다. 필요에 따라 추가 체중을 기록하였다.

용량 투여: 0일차에, 측면 꼬리 정맥으로의 정맥내 투여로 시험 물품(LNP:ceDNA-Luc)을 군 1 내지 군 38에 5 mL/kg으로 투여하였다.

생전 이미지화(In-life Imaging): 4일차에, 2.5 mL/kg의 복강내(IP) 주사를 통해 모든 동물에게 루시페린을 150 mg/kg(60 mg/mL)으로 투여하였다. 각 루시페린 투여 후 15분 이내에; 모든 동물은 하기 기재된 생체내 이미지화 프로토콜에 따라 IVIS 이미지화 세션을 거쳤다.

마취 회복: 동물을 마취 하에 있는 동안, 회복하는 동안 및 움직일 때까지 지속적으로 모니터링하였다.

중간 혈액 채취: 0일차에, 시험 물질 투여 5시간 내지 6시간(5.0시간 이상, 6.5시간 이하) 후 모든 동물에서 중간 혈액을 채취하였다.

채취 후, 동물에게 젖산 링거액 0.5 mL 내지 1.0 mL를 피하 투여하였다.

꼬리정맥 닉, 복재정맥 또는 안와정맥굴 천자를 통해 (흡입용 이소플루란 하에서) 혈청용 전혈을 채취하였다. 전혈을 혈전 활성화제가 포함된 혈청 분리기 튜브에 채취하고, 1개의 혈청 분취량으로 처리하였다.

생체내 이미지화 프로토콜

ㆍ 루시페린 스톡 분말을 공칭 -20℃에서 보관하였다.

ㆍ 2℃ 내지 8℃에서 1 mL 분취량으로 보관한 제형화된 루시페린을 빛으로부터 보호하였다.

ㆍ 제형화된 루시페린은 빛이 차단된 2℃ 내지 8℃에서 최대 3주 동안 안정하고, 실온에서(RT) 약 12시간 동안 안정하였다.

ㆍ 루시페린을 PBS 중에 60 mg/mL의 목표 농도로 충분한 부피로 용해시키고, 필요한 경우 5 M NaOH(약 0.5 μl/mg 루시페린) 및 HCl(약 0.5 μL/mg 루시페린)을 이용하여 pH=7.4로 조정하였다.

ㆍ 프로토콜에 따라 적어도 약 50% 과량을 포함하는 적절한 양으로 제조하였다.

주사 및 이미지화(참고: 최대 5마리 동물을 한번에 이미지화할 수 있음)

ㆍ (필요한 경우) 동물의 털을 면도하였다.

ㆍ 프로토콜에 따라, PBS 중 루시페린 150 mg/kg을 IP를 통해 60 mg/mL로 주사하였다.

ㆍ 투여 즉시 또는 투여 후 최대 15분 이내에 이미지화를 수행하였다.

ㆍ 이소플루란 기화기를 1% 내지 3%(통상적으로 2.5%)로 설정하여 이미지화 세션 동안 동물을 마취시켰다.

ㆍ 이미지화 세션 동안 이소플루란 마취:

○ 동물을 이소플루란 챔버 내에 위치시키고, 이소플루란 효과가 나타날 때까지 약 2분 내지 3분 동안 기다린다.

○ IVIS 기계 측면의 마취 수준이 "켜짐(on)" 위치에 위치해 있는지를 확인한다.

○ 동물(들)을 IVIS 기계에 위치시킨다.

최고 감도에 대한 설정으로 목적하는 획득 프로토콜을 수행하였다.

결과

연구 A

도 1에 도시된 바와 같이, 4일차에, 지질 1, 지질 2, 지질 3 또는 지질 5(각각, 도 1의 LNP 5, LNP 4, LNP 6 및 LNP 3)로 제형화된 ceDNA-루시퍼라아제(ceDNA-luc)로 처리된 마우스의 군은 연구 A에 사용된 양성 대조군 ceDNA LNP(LNP 1, LNP 2, 및 LNP 7 내지 LNP 12, 이들은 각각 SS-OP 지질로 제형화된 ceDNA-luc임)로 처리된 군과 비교하여 동등하거나 더 높은 루시퍼라아제 발현 및/또는 활성을 나타냈으며, 이는 본원에 기재된 이온화 가능한 지질이 지질 나노입자 전달 비히클로서 우수한 물리적 특성을 보유함을 시사한다.

연구 B

도 2에 도시된 바와 같이, 상기 연구 A의 도 1에서의 관찰과 일치하게, 4일차에, 지질 1, 지질 2, 지질 3 또는 지질 5(각각, 도 2의 LNP 17, LNP 16, LNP 18 및 LNP 15)로 제형화된 ceDNA-luc로 처리된 마우스의 군은 연구 B에 사용된 양성 대조군 ceDNA LNP(SS-OP 지질로 제형화된 ceDNA-luc인 LNP 13)로 처리된 군과 비교하여 동등하거나 더 높은 루시퍼라아제 활성을 나타냈으며, 이는 본원에 기재된 이온화 가능한 지질이 지질 나노입자 전달 비히클로서 우수한 물리적 특성을 보유함을 시사한다.

연구 C

연구 A 및 연구 B에서 최고 루시퍼라아제 발현 및/또는 활성을 나타낸 지질 1 및 지질 3을 연구 C에서 용량 반응에 대해 추가로 연구하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 연구 A 및 연구 B의 도 1 및 도 2에서의 관찰과 일치하게, 4일차에, 지질 1 또는 지질 3(각각, 도 1의 LNP 20 및 LNP 21)으로 제형화된 ceDNA-luc로 처리된 마우스의 군은 연구 C에 사용된 양성 대조군 ceDNA LNP(SS-OP 지질로 제형화된 ceDNA-luc인 LNP 19)로 처리된 군과 비교하여 25 mg/kg 및 1 mg/kg 둘 모두에서 더 높은 루시퍼라아제 발현 및/또는 활성을 나타냈으며, 이는 본원에 기재된 이온화 가능한 지질이 지질 나노입자 전달 비히클로서 우수한 물리적 특성을 보유함을 시사한다. 나아가, 도 3의 결과는, LNP 20이, 0.25 mg/kg에서 1 mg/kg으로 투여량이 증가되었을 때, 상기 동일한 2가지 투여량 수준에서 시험된 LNP 19와 비교하여 루시퍼라아제의 발현 및/또는 활성의 더 높은 증가를 나타냈음을 보여준다. 이러한 결과는, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질로 제형화된 LNP가 상이한 투여량 수준에 대해 더 민감하고, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질로 제형화된 LNP로 캡슐화된 ceDNA 내 전이유전자 삽입물의 발현 수준이 특정 질환에 대한 치료 효과를 발휘하는 데 필요한 수준으로 보다 용이하게 조정될 수 있음을 시사하며, 이에 따라 이러한 이온화 가능한 지질이 지질 나노입자 전달 비히클로서 보유하는 또 다른 바람직한 기술적 특징을 입증한다.

연구 D

연구 D에서, 지질 6, 지질 7 및 지질 8(각각, 도 4a 및 도 4b의 LNP 24, LNP 25 및 LNP 26)과 ceDNA-luc로 제형화된 LNP를 마우스에서 루시퍼라아제 발현 및/또는 활성, 및 또한 내약성에 대해 평가하고, 이온화 가능한 지질 A 및 SS-OP 지질(각각, 도 4a 및 도 4b의 LNP 22 및 LNP 23)과 ceDNA-luc로 제형화된 LNP와 비교하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 4일차에, 지질 6, 지질 7 및 지질 8로 제형화된 ceDNA-luc 구조체로 처리된 마우스의 군은 SS-OP 지질(즉, LNP 23)로 제형화된 ceDNA-luc로 처리된 군과 비교하여 동등하거나 더 높은 루시퍼라아제 발현 및/또는 활성을 나타냈다. 도 4b는, 지질 6, 지질 7 및 지질 8로 제형화된 ce-DNA-luc 구조체가 1일차에 마우스에서 체중 변화를 유발하지 않았기 때문에, 마우스에서 내약성도 우수했다는 것을 보여준다. 대조적으로, 도 4b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이온화 가능한 지질 A(즉, LNP 22)로 제형화된 ceDNA-luc로 처리된 마우스는 1일차에 상당한 체중 손실을 겪었으며, 이는 해당 지질이 동물에서 내약성이 우수하지 않았음을 나타낸다.

연구 E

연구 E에서, 지질 9, 지질 10 및 지질 11(각각, 도 5a 및 도 5b의 LNP 28, LNP 29 및 LNP 30)과 ceDNA-luc로 제형화된 LNP를 마우스에서 루시퍼라아제 발현 및/또는 활성, 및 또한 내약성에 대해 평가하고, SS-OP 지질(도 5a 및 도 5b의 LNP 27)과 ceDNA-luc로 제형화된 LNP와 비교하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 4일차에, 지질 9, 지질 10 및 지질 11로 제형화된 ceDNA-luc 구조체로 처리된 마우스의 군은 SS-OP 지질(즉, LNP 27)로 제형화된 ceDNA-luc로 처리된 군과 비교하여 동등하거나 더 높은 루시퍼라아제 발현 및/또는 활성을 나타냈다. 도 5b는, LNP 30에서 이상치 데이터 지점을 제외하고, 지질 9, 지질 10 및 지질 11로 제형화된 ce-DNA-luc 구조체가 1일차에 마우스에서 유의한 체중 변화를 유발하지 않았기 때문에, 일반적으로 마우스에서 내약성이 우수했다는 것을 보여준다.

따라서, 연구 A 내지 연구 E는 전반적으로 본 개시내용의 이온화 가능한 지질로 제형화된 LNP가, (i) ceDNA의 전이유전자 삽입물의 탁월한 생체내 발현 수준을 나타내고; (ii) 상이한 투여량 수준에 대해 반응하기 때문에, ceDNA의 전이유전자 삽입물의 생체내 발현 수준을 필요에 따라 조정할 수 있으며; (iii) 생체내에서 내약성이 우수하다는 것을 입증한다.

참고문헌

본 명세서 및 본원의 실시예에 인용된, 비제한적으로, 특허 및 특허 출원을 비롯한 모든 간행물 및 참고문헌은, 각각의 개별적인 간행물 또는 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 완전하게 기재된 것으로서 본원에 참조로 인용되는 것으로 표시된 바와 같이, 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원 또한 간행물 및 참고문헌에 대해 상기 기재된 방식으로 본원에 참조로 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENERATION BIO CO. <120> NOVEL LIPIDS AND NANOPARTICLE COMPOSITIONS THEREOF <130> 131698-07720 <140> <141> <150> 63/000,990 <151> 2020-03-27 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 1 gcgcgctcgc tcgctc 16

Claims

화학식 (I)을 갖는 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:

(I)
[식 중,
a는 1 내지 20 범위의 정수이고;
b는 2 내지 10 범위의 정수이고;
R¹은 존재하지 않거나, (C₂-C₂₀)알케닐, -C(O)O(C₂-C₂₀)알킬, 및 (C₂-C₂₀)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
R²는 (C₂-C₂₀)알킬임].
제1항에 있어서, 화학식 (II)를 갖는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:

(II)
[식 중, c 및 d는 각각 독립적으로 1 내지 8 범위의 정수임].
제2항에 있어서, c 및 d가 각각 독립적으로 2 내지 8 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항 또는 제3항에 있어서, c 및 d가 각각 독립적으로 4 내지 8 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, c 및 d가 각각 독립적으로 6 내지 8 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항에 있어서, c 및 d가 각각 독립적으로 1, 3, 5 또는 7인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, c 및 d 중 적어도 하나가 7인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 (III)을 갖는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:

(III).
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, b가 3 내지 9 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, b가 5 내지 7 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, b가 5 또는 7인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, a가 2 내지 18 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a가 3 내지 17 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a가 6 내지 18 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a가 4 내지 12 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a가 2 내지 5 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제16항에 있어서, a가 3인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a가 6 내지 8 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제18항에 있어서, a가 7인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제18항에 있어서, a가 8인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a가 16 내지 18 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제21항에 있어서, a가 17인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a가 9 내지 11 범위의 정수인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제23항에 있어서, a가 10인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 존재하지 않거나, (C₅-C₁₅)알케닐, -C(O)O(C₄-C₁₈)알킬, 및 (C₄-C₁₆)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 존재하지 않거나, (C₅-C₁₂)알케닐, -C(O)O(C₄-C₁₂)알킬, 및 (C₄-C₁₂)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 존재하지 않거나, (C₅-C₁₀)알케닐, -C(O)O(C₄-C₁₀)알킬, 및 (C₄-C₁₀)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 C₁₀ 알케닐인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, R¹에 대한 -C(O)O(C₂-C₂₀)알킬, -C(O)O(C₄-C₁₈)알킬, -C(O)O(C₄-C₁₂)알킬 또는 -C(O)O(C₄-C₁₀)알킬에서 알킬이 비분지형 알킬인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제29항에 있어서, R¹이 -C(O)O(C₉ 알킬)인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, -C(O)O(C₄-C₁₈)알킬, -C(O)O(C₄-C₁₂)알킬 또는 -C(O)O(C₄-C₁₀)알킬에서 알킬이 분지형 알킬인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제31항에 있어서, R¹이 -C(O)O(C₁₇ 알킬)인, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 표 1에 열거된 임의의 기에서 선택되는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, R²가 표 2에 열거된 임의의 기에서 선택되는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서, 지질이 표 3에 열거된 임의의 지질에서 선택되는, 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 핵산을 포함하는 지질 나노입자(LNP).
제36항에 있어서, 핵산이 지질로 캡슐화되어 있는, 지질 나노입자.
제36항 또는 제37항에 있어서, 핵산이 미니유전자(minigene), 플라스미드, 미니서클(minicircle), 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, ceDNA, 미니스트링(ministring), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비(非)바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, 지질 나노입자.
제38항에 있어서, 핵산이 폐쇄형 DNA(ceDNA)인, 지질 나노입자.
제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제40항에 있어서, 스테롤이 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤인, 지질 나노입자.
제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, PEG-지질 접합체를 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제42항에 있어서, PEG-지질 접합체가 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)인, 지질 나노입자.
제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 비(非)양이온성 지질을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제44항에 있어서, 비양이온성 지질이 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 지질 나노입자.
제45항에 있어서, 비양이온성 지질이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 지질 나노입자.
제46항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 1.5% 내지 약 4%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제47항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 2% 내지 약 3%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제48항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 2.5% 내지 약 3%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제49항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 3%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, PEG-지질 접합체가 DMG-PEG인, 지질 나노입자.
제36항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤이 약 20% 내지 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 지질이 약 80% 내지 약 60%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제52항에 있어서, 콜레스테롤 또는 베타-시토스테롤이 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 지질이 약 50%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤, PEG-지질 접합체 및 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제54항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 1.5% 내지 약 4%로 존재하는, 지질 나노입자.
제55항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 2% 내지 약 3%로 존재하는, 지질 나노입자.
제56항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 2.5% 내지 약 3%로 존재하는, 지질 나노입자.
제57항에 있어서, PEG-지질 접합체가 약 3%로 존재하는, 지질 나노입자.
제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤이 약 30% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, PEG-지질 접합체가 DMG-PEG2000인, 지질 나노입자.
제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 약 42.5% 내지 약 62.5%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 비양이온성 지질이 약 2.5% 내지 약 12.5%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤이 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 지질이 약 52.5%의 몰 백분율로 존재하고, 비양이온성 지질이 약 7.5%의 몰 백분율로 존재하고, PEG-지질 접합체가 약 3%로 존재하는, 지질 나노입자.
제36항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 덱사메타손 팔미테이트를 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제36항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 직경이 약 50 nm 내지 약 110 nm 범위인, 지질 나노입자.
제36항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 크기가 약 100 nm 미만인, 지질 나노입자.
제66항에 있어서, 크기가 약 70 nm 미만인, 지질 나노입자.
제67항에 있어서, 크기가 약 60 nm 미만인, 지질 나노입자.
제39항에 있어서, 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 10:1인, 지질 나노입자.
제39항에 있어서, 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 20:1인, 지질 나노입자.
제39항에 있어서, 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 30:1인, 지질 나노입자.
제39항에 있어서, 총 지질 대 ceDNA의 비가 약 40:1인, 지질 나노입자.
제36항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 특이적 표적화 모이어티를 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제73항에 있어서, 조직 특이적 표적화 모이어티가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이며; 여기서 GalNAc는 PEG-지질 접합체에 연결되고; GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체는 지질 나노입자에 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1.0%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2% 또는 약 0.1%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제74항에 있어서, GalNAc-연결된 PEG-지질 접합체가 지질 나노입자에 약 0.5%의 몰 백분율로 존재하는, 지질 나노입자.
제36항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 mM 내지 약 30 mM 말산을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제76항에 있어서, 약 20 mM 말산을 포함하는, 지질 나노입자.
제36항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 약 30 mM 내지 약 50 mM NaCl을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제78항에 있어서, 약 40 mM NaCl을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제36항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 mM 내지 약 100 mM MgCl₂을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제39항에 있어서, ceDNA가 폐쇄형 선형 이중체 DNA인, 지질 나노입자.
제39항에 있어서, ceDNA가 발현 카세트를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는, 지질 나노입자.
제82항에 있어서, 발현 카세트가 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 지질 나노입자.
제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가, 상기 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹(flank)하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR: inverted terminal repeat)을 포함하는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, 발현 카세트가 2개의 ITR에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 2개의 ITR은 하나의 5' ITR과 하나의 3' ITR을 포함하는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, 발현 카세트가 3' 말단에 있는 ITR(3' ITR)에 연결되어 있는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, 발현 카세트가 5' 말단에 있는 ITR(5' ITR)에 연결되어 있는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나가 야생형 AAV ITR인, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나가 변형된 ITR인, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, ceDNA가 5' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, ceDNA가 3' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함하는, 지질 나노입자.
제90항 또는 제91항에 있어서, 스페이서 서열의 길이가 적어도 5개 염기쌍 길이인, 지질 나노입자.
제92항에 있어서, 스페이서 서열의 길이가 5개 내지 100개 염기쌍 길이인, 지질 나노입자.
제92항에 있어서, 스페이서 서열의 길이가 5개 내지 500개 염기쌍 길이인, 지질 나노입자.
제38항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA가 닉(nick) 또는 갭(gap)을 갖는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, ITR이 AAV 혈청형에서 유도된 ITR, 거위바이러스의 ITR에서 유도된 ITR, B19 바이러스 ITR에서 유도된 ITR, 파르보바이러스 유래의 야생형 ITR인, 지질 나노입자.
제96항에 있어서, 상기 AAV 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12를 포함하는 군에서 선택되는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, ITR이 돌연변이 ITR이고, ceDNA가 선택적으로 제1 ITR과 상이한 추가의 ITR을 포함하는, 지질 나노입자.
제84항에 있어서, ceDNA가 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단 모두에 2개의 돌연변이 ITR을 포함하며, 선택적으로 여기서 2개의 돌연변이 ITR은 대칭 돌연변이인, 지질 나노입자.
제39항에 있어서, ceDNA가 CELiD, DNA 기반 미니서클, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA인, 지질 나노입자.
제36항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 지질 나노입자와 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제36항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 지질 나노입자의 유효량, 또는 제101항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 유전적 장애를 치료하는 방법.
제103항에 있어서, 대상이 인간인, 방법.
제103항 또는 제104항에 있어서, 유전적 장애가 겸상적혈구빈혈, 흑색종, A형 혈우병(응고인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson disease), 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사장애, 레쉬-니한증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상적혈구빈혈, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니빈혈(Fanconi's anemia), 색소성망막염, 모세혈관확장성 운동실조증, 블룸증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종, 점액다당류축적질환(예를 들어, 헐러증후군(Hurler syndrome)(MPS I형), 샤이에증후군(Scheie syndrome)(MPS I형 S), 헐러-샤이에증후군(MPS I형 H-S), 헌터증후군(Hunter syndrome)(MPS II형), 산필리포(Sanfilippo)증후군 A형, B형, C형 및 D형(MPS III형 A, B, C 및 D), 모르키오(Morquio)증후군 A형 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy syndrome)(MPS VI형), 슬라이증후군(Sly syndrome)(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-피크병(Niemann-Pick Disease) A/B형, C1형 및 C2형, 파브리병(Fabry disease), 쉰들러병(Schindler disease), GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병(Sandhoff Disease)), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 이염성 백질디스트로피(Metachromatic Leukodystrophy), 크라베병(Krabbe disease), 점액지질증 I형, II/III형 및 IV형, 시알산증 I형 및 II형, 글리코겐축적질환 I형 및 II형(폼페병(Pompe disease)), 고셰병(Gaucher disease) I형, II형 및 III형, 파브리병, 시스틴증, 바텐병(Batten disease), 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 살라병(Salla disease), 다논병(Danon disease)(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증, 신경원성 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinoses)(CLN1-8, INCL 및 LINCL), 스핑고리피드증, 갈락토시알산증, 근위축측삭경화증(ALS), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 척수소뇌성 실조증, 척수근위축증, 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 뒤시엔느 근위축증(DMD: Duchenne muscular dystrophy), 베커 근위축증(BMD: Becker muscular dystrophy), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB: dystrophic epidermolysis bullosa), 엑토뉴클레오타이드 피로포스파타아제 1 결핍증, 유아기의 전신동맥석회화(GACI: generalized arterial calcification of infancy), 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis), 스타가르트 황반이영양증(Stargardt macular dystrophy)(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC: ornithine transcarbamylase) 결핍증, 어셔증후군(Usher syndrome), 알파-1 항트립신 결핍증, 진행성 가족성 간내 담즙정체증(PFIC: progressive familial intrahepatic cholestasis) I형(ATP8B1 결핍증), II형(ABCB11), III형(ABCB4) 또는 IV형(TJP2), 및 카텝신(Cathepsin) A 결핍증으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 레베르 선천성 흑암시(LCA)인, 방법.
제106항에 있어서, LCA가 LCA10인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 니만-피크병인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 스타가르트 황반이영양증인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 글루코오스-6-포스파타아제(G6Pase) 결핍증(글리코겐축적질환 I형) 또는 폼페병(글리코겐축적질환 II형)인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증)인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 B형 혈우병(인자 IX 결핍증)인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 헌터증후군(점액다당류증 II형)인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 낭성섬유증인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 이영양성 수포성 표피박리증(DEB)인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 페닐케톤뇨증(PKU)인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 진행성 가족성 간내 담즙정체증(PFIC)인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 윌슨병인, 방법.
제105항에 있어서, 유전적 장애가 고셰병 I형, II형 또는 III형인, 방법.