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JP2023518985A - 新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物 - Google Patents

新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物 Download PDF

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JP2023518985A JP2022558110A JP2022558110A JP2023518985A JP 2023518985 A JP2023518985 A JP 2023518985A JP 2022558110 A JP2022558110 A JP 2022558110A JP 2022558110 A JP2022558110 A JP 2022558110A JP 2023518985 A JP2023518985 A JP 2023518985A
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Abstract

Figure 2023518985000001
式（Ｉ）を有する脂質及びその薬学的に許容される塩が本明細書に提供され、式中、Ｒ１、Ｒ２、ａ、及びｂは、本明細書で定義されるとおりである。また、式（Ｉ）を有する脂質及びカプシド不含非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物も本明細書に提供される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、これらのＬＮＰを使用して、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達することができる。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年３月２７日に出願された、米国仮出願第６３／０００，９９０号に対する優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体の参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２１年３月１８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１３１６９８＿０７７２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、４１７バイトのサイズである。
遺伝子療法は、異常な遺伝子発現プロファイルによって引き起こされる遺伝性障害又は後天性疾患のいずれかに罹患している患者についての臨床成績を向上することを目的とする。疾患を治療するための薬剤として治療用核酸を患者の細胞に送達する様々な種類の遺伝子療法がこれまでに開発されてきた。
患者の標的細胞への修復遺伝子の導入及び発現は、操作されたウイルス遺伝子送達ベクター、及び潜在的にプラスミド、ミニ遺伝子、オリゴヌクレオチド、ミニサークル、又は様々な閉端ＤＮＡの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。利用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスなど）の中で、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において汎用的、かつ比較的安全なベクターとして受け入れられている。しかしながら、アデノ随伴ベクターなどのウイルスベクターは、免疫原性が高く、特に再投与に関して有効性を損なう可能性のある体液性免疫及び細胞性免疫を誘発し得る。
非ウイルス遺伝子送達は、ウイルス形質導入に関連する特定の不利な点、特にベクター粒子を形成するウイルス構造タンパク質に対する体液性及び細胞性免疫応答、並びに任意の新規ウイルス遺伝子発現に起因する不利な点を回避する。非ウイルス遺伝子送達技術の中には、担体としてのカチオン性脂質の使用がある。
イオン化可能な脂質は、大まかにアミン部分と脂質部分とで構成され、カチオン性アミン部分とポリアニオン核酸とが静電的に相互作用して、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造を形成する。したがって、細胞への取り込みが促進され、核酸が細胞に送達される。
広く使用されているイオン化可能な脂質には、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ（ＤＯＤＡＰとも呼ばれる）、及びＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質がある。注目すべきことに、これらの脂質は肝臓へのｓｉＲＮＡ送達に使用されてきたが、高用量での肝臓毒性とともに、最適でない送達効率に悩まされている。現在のカチオン性脂質の欠点を考慮して、毒性の低減とともに効力の増強を示すだけでなく、薬物動態並びに細胞取り込み及び脂質担体からの核酸放出などの細胞内動態を改善する脂質足場を提供する必要がある。
一態様では、式（Ｉ）を有するイオン化可能な脂質であって、
Figure 2023518985000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、ａ、及びｂが、本明細書で定義されるとおりである、脂質、並びにその薬学的に許容される塩が、本明細書に提供される。
開示されたイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物も提供される。
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩と、核酸と、を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、組成物に関する。本明細書における態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、核酸は、イオン化可能な脂質に封入される。特定の実施形態では、核酸は、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ステロールを更に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ステロールは、コレステロール又はベータ－シトステロールであり得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約２０％～約４０％、例えば約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３５％、約２５％～約３０％、又は約３０％～約３５％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約８０％～約６０％、例えば約８０％～約６５％、約８０％～約７０％、約８０％～約７５％、約７５％～約６０％、約７５％～約６５％、約７５％～約７０％、約７０％～約６０％、又は約７０％～約６０％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約２０％～約４０％、例えば約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、又は約４０％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約８０％～約６０％、例えば約８０％、約７９％、約７８％、約７７％、約７６％、約７５％、約７４％、約７３％、約７２％、約７１％、約７０％、約６９％、約６８％、約６７％、約６６％、約６５％、約６４％＜約６３％、約６２％、約６１％、又は約６０％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約４０％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約５０％のモルパーセンテージで存在する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、コレステロール、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び非カチオン性脂質を更に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％～約３％、例えば約１．５％～約２．７５％、約１．５％～約２．５％、約１．５％～約２．２５％、約１．５％～約２％、約２％～約３％、約２％～約２．７５％、約２％～約２．５％、約２％～約２．２５％、約２．２５％～約３％、約２．２５％～約２．７５％、又は約２．２５％～約２．５％で存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、又は約３％で存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約３０％～約５０％、例えば約３０％～約４５％、約３０％～約４０％、約３０％～約３５％、約３５％～約５０％、約３５％～約４５％、約３５％～約４０％、約２０％～約４０％、約４０％～約５０％、又は約４５％～約５０％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、又は約５０％のモルパーセンテージで存在する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質を更に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ－脂質は、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、非カチオン性脂質を更に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物からなる群から選択される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％～約４％、例えば約１．５％～約３％、約２％～約３％、約２．５％～約３％、約１．５％～約２．７５％、約１．５％～約２．５％、約１．５％～約２．２５％、約１．５％～約２％、約１．５％～約１．７５％、約２％～約３％、約２％～約２．７５％、約２％～約２．５％、約２％～約２．２５％で存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、又は約３％で存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、イオン化可能な脂質は、約４２．５％～約６２．５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、イオン化可能な脂質は、約４２．５％、約４３％、約４３．５％、約４４％、約４４．５％、約４５％、約４５．５％、約４６％、約４６．５％、４７．５％、約４８％、約４８．５％、約４９％、約４９．５％、約５０％、約５０．５％、約５１％、約５１．５％、約４７％約５２％、約５２．５％、約５３％、約５３．５％、約５４％、約５４．５％、約５５％、約５５．５％、約５６％、約５６．５％、約５７％、５７．５％、約５８％、約５８．５％、約５９％、約５９．５％、約６０％、約６０．５％、約６１％、約６１．５％、約６２％、又は約６２．５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、約２．５％～約１２．５％のモルパーセンテージで存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約４０％のモルパーセンテージで存在し、イオン化可能な脂質は、約５２．５％のモルパーセンテージで存在し、非カチオン性脂質は、約７．５％のモルパーセンテージで存在し、ＰＥＧ－脂質は、約３％で存在する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、直径が約５０ｎｍ～約１１０ｎｍ、例えば約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９５ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８５ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６５ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約５０ｎｍ～約５５ｎｍ、約６０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９５ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８５ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７５ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約６５ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９５ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８５ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約７５ｎｍ、約８０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９５ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約８５ｎｍ、約９０ｎｍ～約１１０ｎｍ、又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲のサイズにある。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約１００ｎｍ未満のサイズ、例えば約１０５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満又は約１０ｎｍ未満のサイズである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約７０ｎｍ未満のサイズ、例えば約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満、又は約１０ｎｍ未満のサイズである。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約６０ｎｍ未満のサイズ、例えば約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満又は約１０ｎｍ未満のサイズである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約１０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約２０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約３０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約４０：１の全脂質対核酸比を有する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約５０：１の全脂質対核酸比を有する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、組織標的化部分を更に含む。組織標的化部分は、がん、肝臓、ＣＮＳ、又は筋肉などの１つ以上の特定の組織へのＬＮＰの送達に使用できるペプチド、オリゴ糖などであることができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組織標的化部分は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートに結合している。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組織標的化部分は、肝臓特異的受容体のリガンドである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、肝臓標的化に使用される肝臓特異的受容体のリガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）などのオリゴ糖である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％のモルパーセンテージで脂質ナノ粒子中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．２％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．３％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．４％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．６％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．７％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．８％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、０．９％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、１．０％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、２．０％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、リンゴ酸などの緩衝液中で調製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭのリンゴ酸、例えば、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭで調製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１０ｍＭのリンゴ酸、約１１ｍＭのリンゴ酸、約１２ｍＭのリンゴ酸、約１３ｍＭのリンゴ酸、約１４ｍＭのリンゴ酸、約１５ｍＭのリンゴ酸、約１６ｍＭのリンゴ酸、約１７ｍＭのリンゴ酸、約１８ｍＭのリンゴ酸、約１９ｍＭのリンゴ酸、約２０ｍＭのリンゴ酸、２１ｍＭのリンゴ酸、約２２ｍＭのリンゴ酸、約２３ｍＭのリンゴ酸、約２４ｍＭのリンゴ酸、約２５ｍＭのリンゴ酸、約２６ｍＭのリンゴ酸、約２７ｍＭのリンゴ酸、約２８ｍＭのリンゴ酸、約２９ｍＭのリンゴ酸、又は約３０ｍＭのリンゴ酸で調製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約２０ｍＭのリンゴ酸を含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＮａＣｌ、例えば約３０ｍＭ～約４５ｍＭのＮａＣｌ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＮａＣｌ、約３０ｍＭ～約３５ｍＭのＮａＣｌ、約３５ｍＭ～約４５ｍＭのＮａＣｌ、約３５ｍＭ～約４０ｍＭのＮａＣｌ又は約４０ｍＭ～約４５ｍＭのＮａＣｌを有する溶液で調製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約３０ｍＭのＮａＣｌ、約３５ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭのＮａＣｌ又は約４５ｍＭのＮａＣｌを有する溶液で調製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約４０ｍＭのＮａＣｌを有する溶液で調製される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰ組成物は、約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＭｇＣｌ２、例えば約２０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約５０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約４０ｍＭのＭｇＣｌ２、約２０ｍＭ～約３０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３２０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＭｇＣｌ２、約３０ｍＭ～約４０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約４０ｍＭ～約５０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約５０ｍＭ～約６０ｍＭのＭｇＣｌ２、約６０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約６０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、約６０ｍＭ～約７０ｍＭのＭｇＣｌ２、約７０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２、約７０ｍＭ～約８０ｍＭのＭｇＣｌ２、又は約８０ｍＭ～約９０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する溶液中で調製される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む発現カセットを含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ポリアデニル化配列を含む発現カセットを含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、当該発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、発現カセットは、２つのＩＴＲに隣接し、２つのＩＴＲは、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、発現カセットは、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、修飾されたＩＴＲである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、５’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、３’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、少なくとも５塩基対長の長さである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、５～１００塩基対長の長さである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対長の長さである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、５～５００塩基対長の長さである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、又は４９５塩基対長の長さである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ニック又はギャップを有する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲであり、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来し、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来し、パルボウイルスからの野生型ＩＴＲである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２を含む群から選択される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、変異体ＩＴＲであり、ｃｅＤＮＡは、任意選択的に、第１のＩＴＲとは異なる追加のＩＴＲを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’及び３’末端の両方に２つの変異体ＩＴＲを含み、任意選択的に、２つの変異体ＩＴＲは、対称変異体である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリング（ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）ＤＮＡ、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含む。
いくつかの態様によれば、本開示は、対象における遺伝性障害を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかによる有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、対象は、ヒトである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｓ型）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイ・サックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、ファブリー病、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）Ｉ型（ＡＴＰ８Ｂ１欠損症）、ＩＩ型（ＡＢＣＢ１１）、ＩＩＩ型（ＡＢＣＢ４）、又はＩＶ型（ＴＪＰ２）、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＬＣＡは、ＬＣＡ１０である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ニーマンピック病である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）欠損症（グリコーゲン蓄積症Ｉ型）又はポンペ病（グリコーゲン蓄積症ＩＩ型）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、嚢胞性線維症である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ウィルソン病である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩ型である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、加齢関連黄斑変性症である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、網膜色素変性症（ＲＰ１）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、アッシャー症候群である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症である。
上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。
研究Ａで観察されるＳＳ－ＯＰ（例えば、ＬＮＰ１、２、及び７－１２）と比較した、開示された脂質ナノ粒子（例えば、脂質１を含むＬＮＰ５及び脂質３を含むＬＮＰ６）を使用することによって達成されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ発現の改善を示す。 研究Ｂで観察されるＳＳ－ＯＰ（すなわち、ＬＮＰ１３）と比較した、開示された脂質ナノ粒子（例えば、脂質２を含むＬＮＰ１６、脂質１を含むＬＮＰ１７、及び脂質３を含むＬＮＰ１８）を使用することによって達成されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ発現の改善を示す。 それによってマウスに投与される増加した投与量が、研究Ｃで観察されるＳＳ－ＯＰ（すなわち、ＬＮＰ１９）と比較した、開示された脂質ナノ粒子（例えば、脂質１を含むＬＮＰ２０）を使用することによって達成された、ｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ発現のより大きな増加をもたらす、増加した投与量レベルに対する応答性の改善を示す。 （図４Ａ）研究Ｄで観察されるＳＳ－ＯＰ（すなわち、ＬＮＰ２３）と比較した、開示された脂質ナノ粒子（例えば、脂質６を含むＬＮＰ２４、脂質７を含むＬＮＰ２５、及び脂質８を含むＬＮＰ２６）を使用することによって達成されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ発現の改善を示す。 （図４Ｂ）対照として使用されるイオン化可能な脂質Ａ（すなわち、ＬＮＰ２２）と比較した、開示された脂質ナノ粒子（例えば、脂質６を含むＬＮＰ２４、脂質７を含むＬＮＰ２５、及び脂質８を含むＬＮＰ２６）を使用することによって達成されたマウスにおける（体重の変化によって測定される）忍容性の改善を示す。 （図５Ａ）ＳＳ－ＯＰ（すなわち、ＬＮＰ２７）と比較した、開示された脂質ナノ粒子（例えば、脂質９を含むＬＮＰ２８及び脂質１０を含むＬＮＰ２９）を使用することによって達成されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ発現の改善を示す。 （図５Ｂ）図５Ａに示されるｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ発現の改善がマウスにおける開示された脂質ナノ粒子の忍容性を損なわなかったことを示す。
本開示は、ウイルス又は非ウイルスベクター（例えば、閉端ＤＮＡ）などの治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するための脂質ベースのプラットフォームを提供し、これは、細胞の細胞質から核に移動して、高レベルの発現を維持することができる。例えば、ウイルスベクターベースの遺伝子療法に関連する免疫原性は、既存のバックグラウンド免疫のために治療できる患者の数を制限し、かつ各患者の有効レベルまで滴定するための、又は長期にわたって効果を維持するため患者の再投与を妨げてきた。更に、他の核酸モダリティは、免疫応答のカスケードを誘発する生来のＤＮＡ又はＲＮＡセンシングメカニズムのために免疫原性に大きく悩まされている。既存の免疫が欠如しているため、本明細書に記載するＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、必要に応じて、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｃｅＤＮＡなどのＴＮＡの追加用量を可能にし、組織成長に応じて後続の投与を必要とし得る小児集団を含める患者アクセスを更に拡大させる。更に、特に、１つ以上の三級アミノ基を含む脂質組成物、及びジスルフィド結合を含むＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）のより効率的な送達、より良好な忍容性及び改善された安全性プロファイルを提供することが本開示の発見である。本明細書中に記載するＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ウイルスカプシド内の空間によって課されるパッケージングの制約がないため、理論的には、ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の唯一のサイズ制限は、宿主細胞の発現（例えば、ＤＮＡ複製、又はＲＮＡ翻訳）効率に存在する。
特に希少疾患における療法の開発における最大のハードルの１つは、多数の個々の病態である。地球上で約３億５０００万人が希少障害を抱えて生活しており、国立衛生研究所は、希少障害を、診断された人が２０万人未満の障害又は病態と定義している。これらの希少障害の約８０％は遺伝的起源であり、それらの約９５％はＦＤＡによって承認された治療（ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｐａｇｅｓ／３１／ｆａｑｓ－ａｂｏｕｔ－ｒａｒｅ－ｄｉｓｅａｓｅｓ）を有しない。本明細書に記載されるＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の利点の中には、ＴＮＡの特定のモダリティで治療することができる複数の疾患、特に多くの遺伝性障害又は疾患の治療の現在の状態を有意義に変更することができる希少な単一遺伝子疾患に迅速に適応することができるアプローチを提供することにある。
Ｉ．定義
「アルキル」という用語は、一価飽和、直鎖（すなわち、非分岐）又は分岐鎖炭化水素ラジカルを指す。例示的なアルキル基としては、エチル、プロピル、イソプロピル、２－メチル－１－ブチル、３－メチル－２－ブチル、２－メチル－１－ペンチル、３－メチル－１－ペンチル、４－メチル－１－ペンチル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、２，２－ジメチル－１－ブチル、３，３－ジメチル－１－ブチル、２－エチル－１－ブチル、ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デカニル、ウンデカニル、ドデカニル、トリデカニル、テトラデカニル、ペンタデカニル、ヘキサデカニル、ヘプタデカニル、オクタデカニル、ノナデカニル、エイコサニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アルケニル」という用語は、１つ以上（例えば、１つ又は２つ）の炭素－炭素二重結合を有する直鎖又は分岐脂肪族炭化水素ラジカルを指し、アルケニルラジカルは、「シス」及び「トランス」配向、又は代替命名法によって、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明のイオン化可能な脂質の薬学的に許容される有機又は無機の塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシレート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、パモエート（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、及びアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分であり得る。更に、薬学的に許容される塩は、その構造中に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有することができる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、開示された方法を実施するのに適切であるように指定の値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、更により好ましくは±０．５％、及び更により好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」という用語と同義であることを意味し、例えば、構成要素に続くものの存在を指定する包括的又は自由形式の用語であり、当該技術分野において既知であるか、又はそこに開示されている、追加の、引用されていない構成要素、特徴、エレメント、メンバー、ステップの存在を除外又は排除しない。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されていないいずれのエレメントも除いた、本明細書に記載される組成物、方法、プロセス、及びそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規又は機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさない追加のエレメントの存在を許容する。
本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語及びその変形は、組成物又は薬剤（例えば、核酸、特にｃｅＤＮＡ）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物又は薬剤の同時で連続的な導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、及び実験方法を指し得る。「投与」は、インビトロ及びエクスビボ治療も包含する。組成物又は薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、又は局所を含む任意の好適な経路による。投与には、自己管理及び他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路によって実行され得る。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、「投与」は、治療的投与を指す。
本明細書で使用される場合、「抗治療用核酸免疫応答」、「抗転移ベクター免疫応答」、「治療用核酸に対する免疫応答」、「転移ベクターに対する免疫応答」などの句は、その起源がウイルス性又は非ウイルス性の治療用核酸に対する任意の望ましくない免疫応答を指すことを意味する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、望ましくない免疫応答は、ウイルス転移ベクター自体に対する抗原特異的免疫応答である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、免疫応答は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡであり得る転移ベクターに特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターの配列に特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターのＣｐＧ含有量に特異的である。
本明細書で使用される場合、「担体」及び「賦形剤」という用語は、任意かつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含むことを意味する。医薬活性物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成又はその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８の国際出願に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号及び２０１８年１２月６日に出願された同第２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、その各々は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列及び構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」という用語は交換可能に使用される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖（ＣＥＬｉＤ）ＣＥＬｉＤ ＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＤＮＡベースのミニサークルである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクターである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ミニスタリングＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域を更に組み込む発現カセットを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域を更に含み得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミド又はウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指すことを意味し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド若しくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／若しくは調節し、かつ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指すことを意味する。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸又はポリペプチドをそのような細胞又は生物に導入することが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）又はポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞又は生物における核酸又はポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現又はレベルをもたらすことが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物などの生物系に導入された核酸又はポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、生物系又は細胞に対して天然である物質を指す。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及び処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「発現産物」という語句は、遺伝子（例えば、導入遺伝子）から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指すことを意味する。発現される配列は、多くの場合、宿主細胞に対して異種であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、並びにクローニング及び増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。発現ベクターは、組換えベクターであってもよい。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「発現ユニット」という用語は、交換可能に使用され、ＤＮＡベクター、例えば、合成ＡＡＶベクターの導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーター又は他のＤＮＡ調節配列に操作可能に連結される異種ＤＮＡ配列を指すことを意味する。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指すことを意味する。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡ及びＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前又は後に続くが、隣接される配列と連続している、又はすぐ隣である必要はない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状一本鎖合成ＡＡＶベクターの各末端における末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、インビトロ又はインビボでの所与のＲＮＡ又はタンパク質の発現に関連する核酸の任意のセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子には、発現されたＲＮＡ（通常はポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域、及び、多くの場合、それらの発現に必要な調節配列が含まれる。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング又は既知の若しくは予測された配列情報からの合成を含む、様々な供給源から得ることができ、特に所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「遺伝性疾患」又は「遺伝性障害」という語句は、ゲノム中の１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的又は完全に、直接的又は間接的に引き起こされる疾患を指すことを意味する。異常は、遺伝子における変異、挿入、又は欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響を与える可能性がある。
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸又はタンパク質には見られないヌクレオチド又はポリペプチド配列を指すことを意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（又はそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸治療薬による形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を指す。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞、又はいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、又は生物におけるインサイチュ若しくはインビボの細胞であり得る。更に、宿主細胞は、例えば、哺乳動物対象（例えば、遺伝子療法を必要とするヒト患者）の標的細胞であり得る。
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子若しくは誘導剤の存在下、それによって影響される場合、又はそれによって接触される場合に、転写活性を開始又は強化することによって特徴付けられるものを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「誘導因子」又は「誘導剤」は、内因性であり得るか、又は誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物又はタンパク質であり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、誘導因子又は誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、又はタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写又は発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の成分若しくはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、及びマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、並びに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイ及び方法を指すことを意味し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞又は細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中又は生物内で起こるアッセイ又はプロセスを指すことを意味する。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法又は使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物又は植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞及び細胞株を含む）、形質転換細胞株、及び抽出組織又は細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法及び使用を指す。
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されない有機化合物群を指すことを意味し、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分類される。（１）脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ－アシルオキシ酸など、リンを欠く他の化合物も両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。追加的に、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールを含む他の脂質と混合することができる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質組成物は、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合、及びジスルフィド結合を含む。
本明細書で使用される場合、「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を指すことを意味する。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、及びセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などのＰＥＧ－脂質コンジュゲート、イオン化ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート、例えば、２０１０年１月１３日に出願された米国仮出願第６１／２９４，８２８号、及び２０１０年１月１４日に出願された米国仮出願第６１／２９５，１４０号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）並びにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加例は、ＰＣＴ国際公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧ又はＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートするか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧ又はＰＯＺを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミド又はカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質又はＰＥＧ化脂質は、当該技術分野で知られる有用な組織標的化部分（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ、一本、二本、三本、又は四本側鎖ＧａｌＮＡｃ））に更に共有結合することができる。
本明細書で使用される場合、「脂質で封入する」という用語は、核酸（例えば、ＡＳＯ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｃｅＤＮＡ、ウイルスベクター）などの活性剤又は治療剤を、完全封入、部分封入、又はその両方で提供する脂質粒子を指すことを意味する。好ましい実施形態では、核酸は脂質粒子内に完全に封入される（例えば、核酸を含有する脂質粒子を形成するため）。
本明細書で使用される場合、「脂質粒子」又は「脂質ナノ粒子」という用語は、核酸治療薬（ＴＮＡ）などの治療剤を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用され得る脂質製剤を指すことを意味する（「ＴＮＡ脂質粒子」、「ＴＮＡ脂質ナノ粒子」又は「ＴＮＡ ＬＮＰ」と称される）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本発明の脂質粒子は治療用核酸含有脂質粒子であり、これは典型的にはイオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、及び任意選択的に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。他の好ましい実施形態では、治療用核酸などの治療剤を粒子の脂質部分に封入し、それにより酵素分解から保護することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子は、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）と、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合及びジスルフィド結合を含む脂質とを含む。
本発明の脂質粒子は、典型的には、約２０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、又は約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ又は約１５０ｎｍの平均直径を有する。
本明細書で使用される場合、「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、並びに１つ以上の芳香族、脂環式、又は複素環式基で任意選択的に置換された基を含むがこれらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。好適な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、脂質が生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下で正に帯電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性であるように、少なくとも１つのプロトン化可能又は脱プロトン化可能基を有する脂質、例えばカチオン性脂質を指すことを意味する。ｐＨの関数としてのプロトンの付加又は除去は平衡プロセスであり、荷電又は中性脂質への言及は優勢種の性質を指し、全ての脂質が荷電又は中性の形態で存在する必要はないことは、当業者によって理解されるであろう。一般に、イオン化可能な脂質は、約４～約７の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、「切断可能脂質」又は「ＳＳ切断可能脂質」を含み得る。したがって、本明細書で使用される「イオン化可能な脂質」という用語は、本発明の脂質のイオン化（又は荷電）形態及び中性形態の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する脂質種のいずれかを指すことを意味する。生理学的ｐＨでは、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが含まれる。
本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電するあらゆる脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、及び任意の他の中性脂質又はアニオン性脂質を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「切断可能脂質」又は「ＳＳ切断可能脂質」という用語は、ジスルフィド結合の切断可能な単位を含む脂質を指す。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、切断可能脂質は、酸性区画、例えば、膜不安定化のためのエンドソーム又はリソソーム、及び細胞質などの還元環境で切断され得るジスルフィド結合に応答する三級アミンを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、切断可能脂質は、イオン化可能な脂質である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、切断可能脂質は、カチオン性脂質である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、切断可能脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質である。切断可能脂質は、本明細書でより詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体又は一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、水性外部から分離された内部水性体積を封入する球形構成で組み立てられた脂質分子を指すことを意味する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再位置付けすることによって作用して、薬物又は活性製剤成分を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、典型的には、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「局所送達」という用語は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の、生物内の標的部位への直接の送達を指すことを意味する。例えば、薬剤は、腫瘍などの疾患部位、又は炎症部位などの他の標的部位、又は肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの標的器官への直接注射によって局所的に送達することができる。
本明細書で使用される場合、「ｎｅＤＮＡ」又は「ニックの入ったｃｅＤＮＡ」という用語は、オープンリーディングフレーム（例えば、発現されるプロモーター及び導入遺伝子）の５’上流のステム領域又はスペーサー領域に２～１００塩基対のニック又はギャップを有する閉端ＤＮＡを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態で少なくとも２つのヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むポリマーを指すことを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのハイブリッドを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、又はこれらのグループの誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基若しくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、及び天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体及び／又は修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、同様に、明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
本明細書で使用される場合、「核酸治療薬」、「治療用核酸」及び「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患又は障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬及びＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）又は非ウイルスＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、及びダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。本明細書で使用される場合、「ＴＮＡ ＬＮＰ」という用語は、上記のように、ＴＮＡの少なくとも１つを含有する脂質粒子を指す。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを許可する関係にある並列を指すことを意味する。例えば、プロモーターがその転写又は発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、又は転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、及び「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置及び／又は配向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節することができる。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質又はＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指すことを意味する。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。プロモーター配列内では、転写開始部位、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示される合成ＡＡＶベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含むように上流（５’配向）に伸びる。
プロモーターは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子又は配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組換えプロモーター」又は「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方は、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。同様に、「組換え又は異種エンハンサー」は、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在」しない合成プロモーター又はエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路及びモジュールに関して、ＰＣＲを含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。更に、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写及び／又は発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」（「ＲＢＳ」）及び「Ｒｅｐ結合エレメント」（「ＲＢＥ」）は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８又はＡＡＶ Ｒｅｐ６８）の結合部位を指すことを意味し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列及びその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’を含む。
本明細書で使用される場合、「組換えベクター」という語句は、異種核酸配列を含むベクター、又はインビボで発現することができる「導入遺伝子」を指すことを意味する。本明細書に記載されるベクターは、本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、他の好適な組成物及び療法と組み合わせることができることを理解されたい。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
本明細書で使用される場合、「レポーター」という用語は、検出可能な読み出しを提供するために使用可能なタンパク質を指すことを意味する。レポーターは、一般に、蛍光、色、又は発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞又は生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。
本明細書で使用される場合、「センス」及び「アンチセンス」という用語は、ポリヌクレオチド上の構造エレメントの配向を指すことを意味する。エレメントのセンスバージョン及びアンチセンスバージョンは、互いの逆相補体である。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指すことを意味する。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「スペーサー領域」という用語は、ベクター又はゲノム内の機能的エレメントを分離する介在配列を指すことを意味する。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＡＡＶスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ベクター又はゲノムの遺伝的安定性を提供するか、又は増大させる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、スペーサー領域は、クローニング部位及び塩基対の設計番号のギャップに便利な位置を提供することによって、ゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」若しくは「ポリクローニング部位」、又は既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をベクター又はゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明による治療用核酸での予防的治療を含む治療が提供される、ヒト又は動物を指すことを意味する。通常、動物は、限定されないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚、例えば、トラウト、ナマズ、及びサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類又はヒトである。対象は、男性又は女性であり得る。追加的に、対象は、幼児又は子供であり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、新生児又は胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患及び障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／又はペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、又は民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者又は他の対象であり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、すでに治療を受けている。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、又は成人である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、又はヒト成人である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、動物胚、又は非ヒト胚若しくは非ヒト霊長類胚である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
本明細書で使用される場合、「必要とする対象」という語句は、語句の文脈及び使用法が別段の指示をしない限り、（ｉ）記載された発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（若しくはＴＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を投与される予定であり、（ｉｉ）記載された本発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（若しくはＴＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けているか、又は（ｉｉｉ）記載された発明に従ってＴＮＡ脂質粒子（若しくはＴＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けた、対象を指す。
本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」及び／又は「低減する」という用語（並びに同様の用語）は、一般に、天然、予想若しくは平均に対して、又は対照条件に対して、直接的又は間接的に、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を低減する行為を指す。
本明細書で使用される場合、「合成ＡＡＶベクター」及び「ＡＡＶベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのＡＡＶベクター及びその合成産生方法を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「全身送達」という用語は、生物内での干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の広範な生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指すことを意味する。投与技術によっては、特定の薬剤の全身送達にいたることもあれば、そうでないものもある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体のほとんどの部分にさらされることを意味する。広範な生体内分布を得るには、一般に、薬剤が、投与部位より遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺など）によって、又は急速な非特異的細胞結合によって）急速に分解又は排出されないような血液寿命が必要である。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、例えば静脈内、皮下、及び腹腔内を含む、当技術分野で既知の任意の手段によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、静脈内送達による。
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」及び「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌデルタ又はＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’－ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指すことを意味される。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。
本明細書で使用される場合、活性剤（例えば、本明細書に記載されるＴＮＡ脂質粒子）の「治療量」、「治療有効量」、「有効な量」、「有効量」、又は「薬学的有効量」という用語は、治療の意図された利益又は効果、例えば、治療用核酸の不在下で検出された発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害を提供するのに十分な量を指すために交換可能に使用される。標的遺伝子又は標的配列の発現を測定するための好適なアッセイは、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、同様に当業者に既知の表現型アッセイなどの、当業者に既知の技法を使用するタンパク質又はＲＮＡレベルの検査を含む。投与量レベルは、傷害の種類、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、及び用いられる特定の活性剤を含む、多様な因子に基づく。したがって、投与計画は、大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師によって常套的に決定され得る。追加的に、「治療量」、「治療有効量」及び「薬学的有効量」という用語は、記載された本発明の組成物の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）量を含む。記載された発明の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）用途において、薬学的組成物又は薬剤は、疾患、障害又は状態の生化学的、組織学的及び／又は行動症状、その合併症、並びに疾患、障害又は状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害又は状態に罹患しやすい患者、又はそうでなければそのリスクがある患者に、リスクを排除若しくは低減するか、重症度を減少させるか、又は疾患、障害若しくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。「用量」及び「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、「治療量」、「治療有効量」、及び「薬学的有効量」は、非予防的（ｎｏｎ－ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は非予防的（ｎｏｎ－ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）用途を指す。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的又は間接的に、疾患症状の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的又は間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。
本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究及び／又は動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見い出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、阻害する、遅らせる、若しくは逆転させる、状態の臨床症状を改善する、又は状態の臨床症状の出現を防ぐ、有益な若しくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療されている障害に特徴的な症状の発症を限定すること、（ｃ）治療されている障害に特徴的な症状の悪化を限定すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者における障害の再発を限定すること、及び（ｅ）以前は障害に関して無症候性であった患者の症状の再発を限定することのうちの１つ以上を達成することを更に指す。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、阻害する、遅らせる、若しくは逆転させる、又は状態の臨床症状を改善することを含む。
薬理学的及び／又は生理学的効果などの有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサート」「導入遺伝子」又は「発現カセット」が、細胞において結合されたセグメント（「発現カセット」）の発現又は複製をもたらすために、結合され得るプラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、又はコスミドなどのレプリコンを指すことを意味する。ベクターは、宿主細胞への送達のために、又は異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、最終的な形態でウイルス起源、又は非ウイルス起源であり得る。しかしながら、本開示の目的のために、「ベクター」は、一般に、合成ＡＡＶベクター又はニックの入ったｃｅＤＮＡベクターを指す。したがって、「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的エレメントを包含する。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ベクターは、組換えベクター又は発現ベクターであり得る。
本明細書に開示される本発明の代替エレメント又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各郡のメンバーは、個別に、又は群の他のメンバー若しくは本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照及び主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、群に含まれるか、又は群から削除することができる。そのような任意の包含又は削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュグループの記述を満たす。
態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業若しくは商業目的でのヒト胚の使用、又は人間若しくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、及びそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、及び係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用される全ての特許及び他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などにいかなる様式でも限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。
ＩＩ．脂質
第１の化学的実施形態では、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質であって、
Figure 2023518985000003
式中、
ａが、１～２０の範囲の整数であり（例えば、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である）、
ｂが、２～１０の範囲の整数であり（例えば、ｂは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である）、
Ｒ１が、不在であるか、又は（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、及び（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
Ｒ２が、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルである、脂質、又はその薬学的に許容される塩が提供される。
第２の化学的実施形態では、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質は、式（ＩＩ）のもの、
Figure 2023518985000004
又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｃ及びｄは、各々独立して、１～８の範囲の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）であり、残りの変数は、式（Ｉ）について記載されるとおりである。
第３の化学的実施形態では、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｃ及びｄは、各々独立して、２～８、３～８、３～７、３～６、３～５、４～８、４～７、４～６、５～８、５～７、又は６～８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）について記載されるとおりである。
第４の化学的実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のイオン化可能な脂質におけるｃは、２、３、４、５、６、７、又は８であり、残りの変数は、式（Ｉ）又は第２若しくは第３の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第４の化学的実施形態の一部として、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｃ及びｄは、各々独立して、１、３、５、又は７であり、残りの変数は、式（Ｉ）又は第２若しくは第３の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第５の化学的実施形態では、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のイオン化可能な脂質におけるｄは、２、３、４、５、６、７、又は８であり、残りの変数は、式（Ｉ）又は第２若しくは第３の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第５の化学的実施形態の一部として、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｃ及びｄのうちの少なくとも１つは、７であり、残りの変数は、式（Ｉ）又は第２若しくは第３若しくは第４の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第６の化学的実施形態では、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質は、式（ＩＩＩ）のもの、
Figure 2023518985000005
又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は、式（Ｉ）について記載されるとおりである。
第７の化学的実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｂは、３～９の範囲の整数であり、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第７の化学的実施形態の一部として、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｂは、３～８、３～７、３～６、３～５、４～９、４～８、４～７、４～６、５～９、５～８、５～７、６～９、６～８、又は７～９の範囲の整数であり、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されるとおりである。別の代替では、第７の化学的実施形態の一部として、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｂは、３、４、５、６、７、８、又は９であり、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第８の化学的実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるａは、２～１８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第８の実施形態の一部として、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるａは、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、３～１８、３～１７、３～１６、３～１５、３～１４、３～１３、３～１２、３～１１、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、４～１８、４～１７、４～１６、４～１５、４～１４、４～１３、４～１２、４～１１、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、５～１８、５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、２５～８、５～７、６～１８、６～１７、６～１６、６～１５、６～１４、６～１３、６～１２、６～１１、６～１０、６～９、６～８、７～１８、７～１７、７～１６、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、７～９、８～１８、８～１７、８～１６、８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１、８～１０、９～１８、９～１７、９～１６、９～１５、９～１４、９～１３、９～１２、９～１１、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１１～１８、１１～１７、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１５～１８、１５～１７、又は１６～１８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されるとおりである。別の代替では、第８の実施形態の一部として、式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質におけるａは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８であり、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第９の化学的実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５～Ｃ１５）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１６）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第９の化学的実施形態の一部として、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５～Ｃ１５）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１６）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１６）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第９の化学的実施形態の一部として、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５～Ｃ１２）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１２）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１２）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。別の代替では、第９の化学的実施形態の一部として、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５～Ｃ１０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１０）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第１０の化学的実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１０アルケニルであり、式中、残りの変数は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。
第１１の化学的実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１のＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４～Ｃ１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４～Ｃ１０）アルキルにおけるアルキルは、非分岐アルキルであり、残りの変数は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。一化学的実施形態では、Ｒ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ９アルキル）である。代替的に、第１１の化学的実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１の－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４～Ｃ１０）アルキルにおけるアルキルは、分岐アルキルであり、残りの変数は、前述の化学的実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。一化学的実施形態では、Ｒ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１７アルキル）であり、式中、残りの変数は、前述の化学的実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。
第１２の化学的実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、若しくは（ＩＩＩ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、以下の表１に列挙される任意の基から選択され、基のそれぞれにおける波状結合は、脂質分子の残部への基の結合点を示し、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。本開示は更に、表１のＲ１基のうちのいずれか１つと表２のＲ２基のうちのいずれか１つとの組み合わせを企図し、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。
Figure 2023518985000006
第１３の化学的実施形態では、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ２は、以下の表２に列挙される任意の基から選択され、基のそれぞれにおける波状結合は、脂質分子の残部への基の結合点を示し、残りの変数は、式（Ｉ）、又は第７、第８、第９、第１０、若しくは第１１の化学的実施形態について記載されるとおりである。
Figure 2023518985000007
特定の例は、以下の表３の例示セクションに提供され、式（Ｉ）のイオン化可能な脂質の本明細書における第１４の化学的実施形態の一部として含まれる。薬学的に許容される塩並びにイオン化及び中性形態も含まれる。
Figure 2023518985000008
Figure 2023518985000009
Figure 2023518985000010
Figure 2023518985000011
Figure 2023518985000012
更なる態様では、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、若しくは（Ｉｃ）の脂質、
Figure 2023518985000013
又はその薬学的に許容される塩が本明細書において企図され、式中、Ｒｑ及びＲｚは、各々独立して、脂肪族基（アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリルを含む）又はアリール基であり、残りの変数は、前述の化学的実施形態のうちのいずれか１つにおいて上述されるとおりである。一実施形態では、Ｒｑ及びＲｚは、各々独立して、水素又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、残りの変数は、前述の化学的実施形態のうちのいずれか１つにおいて上述されるとおりである。開示されたＬＮＰ、組成物、使用の方法などは、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、又は（Ｉｃ）の脂質にも適用される。式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、又は（Ｉｃ）の脂質、例えば、式（Ｉ）の脂質は、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ３）中のクロロメタン（ＣＨ３Ｃｌ）での処理によって調製され得る。
更に、式（ＩＩ）若しくは（ＩＩＩ）の脂質、又は本明細書に開示される例示的な脂質のうちのいずれかは、対応する四級脂質（全て本開示で企図される）、例えば、式（Ｉ）の脂質にアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ３）中のクロロメタン（ＣＨ３Ｃｌ）での処理によって変換され得る。
本明細書に記載されるイオン化可能な脂質と、カプシド不含非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）とを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又はその薬学的組成物は、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）にカプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを送達するために使用され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、ＴＮＡで作製及びロードされる。一実施形態では、脂質粒子（脂質ナノ粒子）製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されるプロセスにより得られたｃｅＤＮＡで作製及びロードされる。これは、脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合及び核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質とｃｅＤＮＡなどの水性ＴＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去によって更に安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約１０：１～６０：１の全脂質対核酸（質量又は重量）比で調製される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質対核酸比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約６０：１、約１：１～約５５：１、約１：１～約５０：１、約１：１～約４５：１、約１：１～約４０：１、約１：１～約３５：１、約１：１～約３０：１、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、約６：１～約９：１、約３０：１～約６０：１の範囲内であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約６０：１の全脂質比に対する核酸（質量若しくは重量）で調製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約３０：１の全脂質比に対する核酸（質量若しくは重量）で調製される。脂質及び核酸の量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入するための薬剤を含む。このような薬剤は、本明細書では、凝縮剤又は封入剤とも称される。制限なしに、核酸を凝縮及び／又は封入するための当該技術分野で既知の任意の化合物は、それが非融合性である限り使用することができる。言い換えれば、薬剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合活性をほとんど又はまったく有しない。理論に拘束されることを望まないが、凝縮剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸を凝縮／封入しない場合、いくらかの融合活性を有する可能性があるが、当該凝縮剤で形成された脂質ナノ粒子を封入する核酸は、非融合性であり得る。
一般に、イオン化可能な脂質は、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、並びに膜会合及び膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、カチオン性脂質は、正に帯電した、又は例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。カチオン性脂質はまた、イオン化可能な脂質、例えば、イオン化可能なカチオン性脂質であり得る。「非融合性イオン化可能な脂質」とは、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合性活性を有しないか、又はほとんど有しないイオン化可能な脂質を意味する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、イオン化可能な脂質は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、イオン化可能な脂質モル含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、４０～６０％（ｍｏｌ）、４０～５５％（ｍｏｌ）又は４５～５５％（ｍｏｌ）であり得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非カチオン性脂質を更に含むことができる。非カチオン性脂質は、融合性を高め、形成中のＬＮＰの安定性を高めるのに役立ち得る。非カチオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、又はアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。
例示的な非カチオン性脂質としては、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用され得ることを理解されたい。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン－硫酸ラウリル、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリンなどの非亜リン脂質が挙げられる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質は、リン脂質である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭからなる群から選択される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥである。
本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の０～約２０％（ｍｏｌ）を占めることができる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０．５～１５％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１２％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約６％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．５％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約８．０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約９．０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１１％（ｍｏｌ）である。
例示的な非カチオン性脂質は、ＰＣＴ国際公開第２０１７／０９９８２３号及び米国特許公開第２０１８／００２８６６４号に記載されており、これらの両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、脂質粒子の膜の統合性及び安定性を提供するために、ステロールなどの成分を更に含むことができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子に使用することができる例示的なステロールは、コレステロール又はその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定例としては、５α－コレスタノール、５β－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノン及びデカン酸コレステリルなどの非極性類似体、並びにそれらの混合物が挙げられる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、ヘミコハク酸コレストリル（ＣＨＥＭＳ）である。
例示的なコレステロール誘導体は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９／１２７０６０号及び米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８に記載されており、これらの両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ステロールなどの膜統合性を提供する成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を含み得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３０～４０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３５～４５％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３８～４２％（ｍｏｌ）である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲートされた脂質分子を更に含み得る。一般に、これらを使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害し、かつ／又は立体安定化を提供する。例示的なコンジュゲートされた脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－コンジュゲートされた脂質である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（ジミリストイルグリセロール）である。
例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、及びＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、それら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択することができる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、又はそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質複合体、ＡＴＴＡ－脂質複合体、及びカチオン性ポリマー－脂質は、ＰＣＴ国際特許出願公開第１９９６／０１０３９２号、同第１９９８／０５１２７８号、同第２００２／０８７５４１号、同第２００５／０２６３７２号、同第２００８／１４７４３８号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１５／０９５３４６号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１２／０００１０４号、及び同第２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１６／０３１７４５８号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１３／０３０３５８７号、及び同第２０１１／０１２３４５３号、並びに米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、同第６，３２０，０１７号、及び同第６，５８６，５５９号に記載されており、これらの全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質ナノ粒子中に約０％～約２０％のモル比で存在する。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中０．５～１０％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中１～５％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中１～３％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１．５％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中約２％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中約２．５％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約３％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中約３％（ｍｏｌ）である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中約３．５％（ｍｏｌ）である。
本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート又はＰＥＧ化脂質などの、コンジュゲート脂質は、脂質ナノ粒子中の全脂質の約２．０％を超えるモルパーセント、例えば、約２．１％、又は２．２％、又は２．３％、又は２．４％、又は約２．５％～約１０％；又は約２．１％、又は２．２％、又は２．３％、又は２．４％、又は約２．５％～約７．５％；約２．１％、又は２．２％、又は２．３％、又は２．４％、又は約２．５％～約５％；約３％～約５％；約３％～約４．５％；約３％～約４％；約３．５％～約５％；約３．５％～約４．５％、約２．５％～約４％；約２．５％～約３．５％、又は約２．５％～約３％で存在する。
開示されたイオン化可能な脂質と非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ－コンジュゲート脂質とのモル比は、必要に応じて変えることができることが理解される。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、組成物のモル又は全重量で３０～７０％の脂質、組成物のモル又は全重量で０～６０％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で０～３０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で１～１０％のＰＥＧ－コンジュゲートされた脂質を含むことができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、組成物は、組成物のモル又は全重量で４０～６０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は全重量で３０～５０％のコレステロール、及び組成物のモル又は全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で１～５％のＰＥＧ－コンジュゲートされた脂質を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、組成物は、組成物のモル又は全重量で４０～６０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は全重量で３０～４０％のコレステロール、及び組成物のモル又は全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で１～５％のＰＥＧ－コンジュゲートされた脂質である。組成物は、組成物のモル又は全重量で６０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は全重量で２５～３５％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で０～５％のＰＥＧ－コンジュゲートされた脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモル又は全重量で最大４５～５５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は全重量で３５～４５％のコレステロール、及び組成物のモル又は全重量で２～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で１～５％のＰＥＧ－コンジュゲートされた脂質を含有し得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル若しくは全重量で８～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル若しくは全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で０～４０％のコレステロール；組成物のモル若しくは全重量で４～２５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル若しくは全重量で４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモル若しくは全重量で２～２５％のコレステロール、組成物のモル若しくは全重量で１０～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で５％のコレステロール；又は組成物のモル若しくは全重量で２～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル若しくは全重量で２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモル若しくは全重量で１～１５％のコレステロール、組成物のモル若しくは全重量で２～３５％のＰＥＧ－コンジュゲート脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で１～２０％のコレステロール；又は更には組成物のモル若しくは全重量で最大９０％のイオン化可能な脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で２～１０％の非カチオン性脂質；又は更には組成物のモル若しくは全重量で１００％のイオン化可能な脂質を含む、脂質ナノ粒子製剤であってもよい。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を５０：１０：３８：２のモル比で含む。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を５０：１０：３７：３のモル比で含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：７：４０：３のモル比で含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：８：４０：２のモル比で含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：９：３９：２のモル比で含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、イオン化可能な脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：９：３８：３のモル比で含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を含み、脂質のモル比は、イオン化可能な脂質の場合、２０～７０モルパーセントの範囲であり（目標３０～６０）、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲であり（目標０～１５）、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲であり（目標３０～５０）、ＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）のモルパーセントは、１～６の範囲である（目標２～５）。
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、これはその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法及び組成物における使用が想定される。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用する準弾性光散乱によって決定され得、およそ５０～１５０ｎｍの直系、およそ５５～９５ｎｍの直径、又はおよそ７０～９０ｎｍの直径である。
製剤化されたイオン化可能な脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８，１７２－１７６（２０ １ ０）を参照されたく、それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、各イオン化可能な脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用して、脂質ナノ粒子中で決定される。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＰＢＳ中のイオン化可能な脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書及び他に記載されるインラインプロセスを使用して調製され得る。ＴＮＳは、蒸留水中の１００ｍＭストック溶液として調製され得る。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４ｍＭ脂質に希釈され得、ｐＨは、２．５～１１の範囲である。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１ｍＭの最終濃度にすることができ、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長及び４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ Ｓｅｒｉｅｓ ２発光分光光度計において室温で測定する。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、相対活性は、尾静脈注射を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって決定され得る。０．３及び１．０ｍｇ ｃｅＤＮＡ／ｋｇの用量で活性を比較し、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇ当たりのルシフェラーゼｎｇとして表される。
無制限に、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するように使用され得る脂質製剤を含む。一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクター及びイオン化可能な脂質、又はその塩を含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲートされた脂質を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。
ＩＩＩ．治療用核酸（ＴＮＡ）
本開示は、治療用核酸（ＴＮＡ）を送達するための脂質ベースのプラットフォームを提供する。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルスＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。したがって、本開示の態様は、一般に、ＴＮＡを含むイオン化可能な脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。
治療用核酸
本開示の例示的な治療用核酸としては、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、並びにそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡもまた、本発明によって核酸治療薬であると企図される。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体によって除去される。ＲＩＳＣ複合体は、相補的ｍＲＮＡと結合すると、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすｍＲＮＡの特異的破壊を誘導することによるものである。
タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及びリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有し、ワトソン－クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、かつ／又はｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅＨ分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節）を高めた。
本明細書で提供される方法及び組成物のいずれにおいても、治療用核酸（ＴＮＡ）は治療用ＲＮＡであり得る。当該治療用ＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の薬剤、触媒的に活性なＲＮＡ分子（リボザイム）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、又はｍＲＮＡ転写物（ＡＳＯ）、タンパク質若しくは他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）であり得る。本明細書で提供される方法のいずれにおいても、ＲＮＡｉの薬剤は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、又は三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。
本明細書で提供される方法組成物のいずれにおいても、治療用核酸（ＴＮＡ）は、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、ダンベル直鎖状ＤＮＡ、プラスミド、ミニサークルなど）などの治療用ＤＮＡであり得る。本開示のいくつかの実施形態は、導入遺伝子（例えば、治療用核酸）を発現することができる閉端直鎖状二重鎖（ｃｅＤＮＡ）を含む方法及び組成物に基づく。本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）並びにこれらの異なる対象物を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
本明細書で提供されるのは、共有結合性閉端を有する非ウイルスカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）である。これらの非ウイルスカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子は、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子（例えば、導入遺伝子、特に治療用導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス又は統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生され得、ＩＴＲは、互いに関して異なる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位（ＴＲＳ）及びＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して非対称である。すなわち、それらは、互いに異なる三次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異若しくは修飾されたＩＴＲであり得るか、又はその逆であり、第１のＩＴＲは、変異又は修飾されたＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、又は異なる修飾を有するか、又は同一の修飾されたＩＴＲではなく、異なる三次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを用いるｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する１つのＩＴＲのいかなる変更も他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを有するか、又は、代替的に非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合は、互いに対して異なる配列及び異なる三次元形状を有し得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称又は実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾されたＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、修飾されたＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾されたＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称な三次元形状を有し得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、又は実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）であり得る。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
本明細書に提供される野生型又は変異型又は他の方法で修飾されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ－プラスミド又は他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、治療用核酸配列である導入遺伝子を有する発現カセットを含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を可能にするか又は制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列及び第２のＩＴＲ配列を含み、目的のヌクレオチド配列は、第１及び第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１及び第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称であるか、又は互いに対して対称である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、並びにポリアデニル化及び終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターは、調節可能－誘導可能又は抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター又はその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調整する配列であり、非限定的な例として、治療用核酸配列である導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ポリアデニル化及び終結シグナルは、ＢＧＨポリＡを含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、又はその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（ＵＳＥ）又は他の転写後処理エレメント（限定されないが、単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む）が追加として使用され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、５’～３’方向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、又は５ｋｂ超、又は６ｋｂ超、又は７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、若しくは２０，０００ヌクレオチド、若しくは３０，０００ヌクレオチド、若しくは４０，０００ヌクレオチド、又は５０，０００ヌクレオチド、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の成分、例えば、導入遺伝子の発現を制御及び調節するための調節スイッチを含み、所望であれば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット及び第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され得、第１及び／又は第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に関して変異する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、若しくは獣医学的使用）又は免疫原性ポリペプチドに使用される。
発現カセットは、治療用核酸配列である任意の導入遺伝子を含むことができる。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、又はそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の目的の遺伝子を含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセット、発現構築物、又はドナー配列で提供される配列は、宿主細胞についてコドン最適化することができる。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、目的の脊椎動物、例えばマウス又はヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。
典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）又は別の公開データベースを使用して決定することができる。
多くの生物は、特定のコドンを使用して、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする偏向を示す。生物間のコドン使用頻度の違いであるコドン優先又はコドン偏向は、遺伝暗号の縮退によってもたらされ、多くの生物の間で十分に文書化されている。コドン偏向は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関関係があることが多く、特に翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。
多種多様な動物、植物、及び微生物種で利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．″Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ２０００″Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。
逆位末端反復（ＩＴＲ）
本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性末端（直鎖状で連続的な非カプシド構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されたカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、異なるか、又は互いに対して非対称である５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。ＩＴＲのうち少なくとも１つは、機能的末端分解部位及び複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含む。一般に、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、すなわち、他のＩＴＲに対する欠失、挿入、及び／又は置換、並びに発現可能な導入遺伝子を含有する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲに対する修飾されたＩＴＲであり、すなわち、ｃｅＤＮＡは、互いに対して非対称であるＩＴＲを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（１）シス調節エレメント、プロモーター、及び少なくとも１つの導入遺伝子を含む発現カセット、（２）少なくとも１つの導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、並びに（３）当該発現カセットに隣接する２つの自己相補的配列、例えば、ＩＴＲを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドタンパク質と関連していない。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中で見出される２つの自己相補的配列を含み、少なくとも１つは、操作的Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）及びＡＡＶの末端分解部位（ＴＲＳ）又はＲＢＥの機能的バリアント、並びに導入遺伝子に作動可能に連結された１つ以上のシス調節エレメントを含む。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の成分、例えば、導入遺伝子の発現を制御及び調節するための調節スイッチを含み、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、２つの自己相補的配列は、任意の既知のパルボウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２）などのディペンドウイルスからのＩＴＲ配列であり得る。ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’などのＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する修飾されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、合成であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶベース配列を含まない。更に別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、又はまったく有しない。いくつかの態様において、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐ若しくは特定の血清型のＲｅｐと優先的に相互作用し得るか、又は場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、変異Ｒｅｐによってのみ認識される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’などの機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する合成ＩＴＲ配列である。いくつかの例では、修飾されたＩＴＲ配列は、ＲＢＳ、ＴＲＳの配列、並びに野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの対応する配列からの１つのＩＴＲヘアピン二次構造の末端ループ部分を形成するＲｅｐ結合エレメントの構造及び位置を保持する。ｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＩＴＲ配列は、表２～９、１０Ａ及び１０Ｂ、配列番号２、５２、１０１～４４９及び５４５～５４７に開示され、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の図２６Ａ～２６Ｂに示される部分的なＩＴＲ配列。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ及び１０Ｂ ２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号のいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列又はＩＴＲ部分配列における修飾のうちのいずれかに対応するＩＴＲにおける修飾を伴うＩＴＲを含み得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせを更に含む発現構築物から産生され得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の成分、例えば、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、又はｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ－０２及びＶＫ－Ａ２６配列に連結され得る。発現カセットは、例えば、ウシＢＧＨｐＡ若しくはウイルスＳＶ４０ｐＡから単離された天然配列、又は合成配列などの、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列又はその変形を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
２０１８年９月７日に出願され、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号の図１Ａ～１Ｃは、非限定の例示的なｃｅＤＮＡベクター、又はｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット及び第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され得、第１及び／又は第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に関して変異する。発現可能な導入遺伝子カセットは、好ましくは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順序で含む。
プロモーター
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、又はそれらは、原核生物若しくは真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＴＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｌ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０，４９７－５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）、ＣＡＧプロモーター、ヒトアルファ１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、など）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更されて、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターは、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことにより、発現を更に増強する、並びに／又はその空間的発現及び／若しくは時間的発現を変更することができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織若しくは器官に関して、又は発現が起こる発達段階に関して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的又は示差的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ ＩＥプロモーター、並びに以下に列挙されるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーター及び／又はエンハンサーは、目的の任意の遺伝子、例えば、治療用タンパク質）の発現に使用できる。例えば、ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されるプロモーターを含み得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、治療用タンパク質コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然又は合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトアルファ１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）又はトランスサイレチン（ＴＴＲ）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーター及び他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、当該技術分野で知られるエンハンサー（例えば、Ｓｅｒｐｉｎエンハンサー）を更に含み得る。
本発明に従って使用するための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＨＡＡＴプロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーター、又はＥＦ１－αプロモーター及びラットＥＦ１－αプロモーターの断片が挙げられる。
ポリアデニル化配列
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、かつ核輸送及び翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０以上のアデニンジヌクレオチドを含む。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、又はその間の任意の範囲を含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位及び複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）、例えば、Ｒｅｐ結合部位（例えば、ｗｔ ＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲ、例えば機能的ＩＴＲに関する欠失、挿入、及び／又は置換を含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、宿主細胞はウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは任意のウイルスカプシドコード配列を欠いている。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠いているが、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、機能的なＡＡＶキャップ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、修飾されたＩＴＲを有しない。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される（又は、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号において）調節スイッチを含む。
ＩＶ．ｃｅＤＮＡベクターの産生
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターの産生のための方法は、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６のセクションＩＶに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾されたＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。
しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶ又は他のウイルスベースベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、並びに消化されたＤＮＡ物質を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐ及びヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除及び増幅を可能にする。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ｃｅＤＮＡの非ウイルスＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取及び収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但しほとんどの細胞がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ－ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソーム又は微粒子として精製される。ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、並びにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ物質及び未消化のＤＮＡ物質の両方を分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
Ｖ．脂質粒子の調製
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）及び脂質の混合時に自発的に形成することができる。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押し出しステップは省略することができる。エタノール除去及び同時緩衝液交換は、例えば、透析又はタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。
一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、当該技術分野において既知の任意の方法によって形成することができる。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、ＵＳ２０１３／００３７９７７、ＵＳ２０１０／００１５２１８、ＵＳ２０１３／０１５６８４５、ＵＳ２０１３／０１６４４００、ＵＳ２０１２／０２２５１２９及びＵＳ２０１０／０１３０５８８に記載されている方法によって調製することができ、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、連続混合法、直接希釈プロセス、又はインライン希釈プロセスを使用して調製することができる。直接希釈及びインライン希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するための装置のプロセス及び装置は、ＵＳ２００７／００４２０３１に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。段階希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するためのプロセス及び装置は、ＵＳ２００４／０１４２０２５に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、衝突ジェットプロセスによって調製することができる。一般に、粒子は、アルコール（例えば、エタノール）に溶解した脂質を、緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム及び塩化マグネシウム緩衝液、リンゴ酸緩衝液、リンゴ酸及び塩化ナトリウム緩衝液、又はクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウム緩衝液、に溶解したｃｅＤＮＡと混合することによって形成される。ｃｅＤＮＡに対する脂質の混合比は、約４５～５５％の脂質及び約６５～４５％のｃｅＤＮＡであり得る。
脂質溶液は、アルコール、例えばエタノール中に、５～３０ｍｇ／ｍＬ、よりおそらく５～１５ｍｇ／ｍＬ、最もおそらく９～１２ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度で、開示されたイオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＤＯＰＣなどのリン脂質）、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートされた分子（例えば、ＰＥＧ－脂質）、及びステロール（例えば、コレステロール）を含有することができる。脂質溶液において、脂質のモル比は、カチオン性脂質の場合、約２５～９８％、好ましくは約３５～６５％、非イオン性脂質の場合、約０～１５％、好ましくは約０～１２％、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートされた脂質分子の場合、約０～１５％、好ましくは約１～６％、ステロールの場合、約０～７５％、好ましくは約３０～５０％の範囲であり得る。
ｃｅＤＮＡ溶液は、３．５～５の範囲のｐＨを有する、緩衝溶液中に０．３～１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．３～０．９ｍｇ／ｍＬの濃度範囲でｃｅＤＮＡを含むことができる。
ＬＮＰを形成するために、１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、２つの液体は、約１５～４０℃、好ましくは約３０～４０℃の範囲の温度に加熱され、次いで、例えば、衝突ジェットミキサーにおいて混合され、即座にＬＮＰを形成する。混合流速は、１０～６００ｍＬ／分の範囲であり得る。チューブＩＤの範囲は、０．２５～１．０ｍｍ、総流速は、１０～６００ｍＬ／分を有することができる。流速及びチューブＩＤの組み合わせは、ＬＮＰの粒子サイズを３０～２００ｎｍに制御する効果を有することができる。次いで、溶液を、より高いｐＨで、１：１～１：３のｖｏｌ：ｖｏｌ、好ましくは約１：２のｖｏｌ：ｖｏｌの範囲の混合比で緩衝溶液と混合することができる。必要に応じて、この緩衝溶液は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度になり得る。次いで、混合されたＬＮＰは、アニオン交換濾過ステップを受けることができる。アニオン交換の前に、混合されたＬＮＰを一定期間、例えば３０分～２時間インキュベートすることができる。インキュベーション中の温度は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度になり得る。インキュベーション後、アニオン交換分離ステップを含む０．８μｍフィルターなどのフィルターで溶液を濾過する。このプロセスでは、１ｍｍのＩＤ～５ｍｍのＩＤの範囲のチューブＩＤ及び１０～２０００ｍＬ／分の流量を使用できる。
形成後、ＬＮＰを濃縮し、限外濾過プロセスを介して限界濾過することができ、このプロセスでは、アルコールが除去され、緩衝液が最終的な緩衝溶液、例えば、約ｐＨ７、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換される。
限外濾過プロセスでは、膜の公称分子量カットオフ範囲が３０～５００ｋＤのタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションフォーマット（ＴＦＦ）を使用できる。膜フォーマットは中空糸又はフラットシートカセットである。適切な分子量カットオフのＴＦＦプロセスでは、保持液にＬＮＰを保持することができ、濾液又は透過液はアルコール、クエン酸緩衝液及び最終緩衝液の廃棄物を含有する。ＴＦＦプロセスは、初期濃度が１～３ｍｇ／ｍＬのｃｅＤＮＡ濃度になる複数ステップのプロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を最終緩衝液に対して１０～２０容量で限界濾過し、アルコールを除去して緩衝液交換を実施する。次いで、物質を更に１～３倍に濃縮することができる。濃縮されたＬＮＰ溶液は滅菌濾過できる。
ＶＩ．薬学的組成物及び製剤
本明細書では、ＴＮＡ脂質粒子及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療用核酸の完全な封入、部分的な封入とともに提供される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、核酸治療薬は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に完全に封入されて、脂質粒子を含有する核酸を形成する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、核酸は、粒子の脂質部分内に封入され得、それによって、それを酵素分解から保護し得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子は、効果的な送達を保証するため、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、又は約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、若しくは１５０ｎｍの平均直径を有する。核酸含有脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）及びそれらの調製方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／５００４２、米国特許公開第２００４／０１４２０２５号及び同第２００７／００４２０３１号に開示されており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）サイズは、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）システムを使用して準弾性光散乱によって決定することができる。
一般に、本発明の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、意図した治療効果を提供するように選択された平均直径を有する。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の意図した使用に応じて、成分の割合は変化し得、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、凝集を防止するために他の部分とコンジュゲートされ得る。そのような脂質複合体には、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ複合体）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、及びセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）などのＰＥＧ－脂質複合体、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡ複合体、例えば、２０１０年１月１３日出願の米国仮出願第６１／２９４，８２８号、及び２０１０年１月１４日出願の米国仮出願第６１／２９５，１４０号）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質複合体）、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質複合体の追加例は、ＰＣＴ国際公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧ又はＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートするか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧ又はＰＯＺを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミド又はカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、粒子の脂質部分と複合され得るか、又は脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に封入され得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間のヌクレアーゼへの脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の曝露後に実質的に分解されない。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、若しくは６０分、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示の治療用核酸を含む薬学的組成物は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に製剤化され得る。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、開示されたイオン化可能な脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸を含有する脂質粒子であり、これは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）又は非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）からなる群から選択される治療用核酸を含む開示されたイオン化可能な脂質から形成される。
別の好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは非カチオン性脂質、及び任意選択的に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子製剤は、水溶液である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤を更に含む脂質粒子製剤を提供する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンを更に含む。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に開示される脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示のＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に適した薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
本明細書に開示される脂質粒子は、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、及び硝子体内）、蝸牛内、並びに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。
ＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定している。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。無制限に、非二層形態としては、例えば、三次元管、棒、立方対称性などを挙げることができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の非ラメラ形態（すなわち、非二層構造）は、当業者に既知であり、当業者によって使用される分析技法を使用して決定され得る。そのような技法としては、低温透過型電子顕微鏡（「Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ」）、示差走査熱量計（「ＤＳＣ」）、Ｘ線回折などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、脂質粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、容易に評価され、例えば、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、高電子密度である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかである脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。脂質成分の組成物及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子（脂質ナノ粒子）外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、製剤化されたイオン化可能な脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約８である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約６～約７である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、好ましいｐＫａは、約６．５である。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、イオン化可能な脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中で決定され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のｃｅＤＮＡの封入は、核酸と会合したときに蛍光を強化した色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えばＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを実施することによって決定され得る。一般に、封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたｃｅＤＮＡを放出し、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉｏ－Ｉ）／Ｉｏとして計算することができ、Ｉ及びＩｏは、界面活性剤の添加前及び添加後の蛍光強度を指す。
単位投与量
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与のために適合される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与のために適合される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、又は舌下投与のために適合される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のために適合される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内又は脳室内投与のために適合される。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体物質と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
ＶＩＩ．治療の方法
本明細書に記載されるイオン化可能な脂質組成物及び方法（例えば、本明細書に記載のＴＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、宿主細胞に核酸配列（例えば、治療用核酸配列）を導入することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用する宿主細胞への核酸配列の導入を、治療された患者からの適切なバイオマーカーでモニタリングして、遺伝子発現を評価することができる。
本明細書に提供されるＬＮＰ組成物を使用して、様々な目的のために導入遺伝子（核酸配列）を送達することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、例えば、エクスサイチュ、インビトロ及びインビボの適用、方法論、診断手順、及び／又は遺伝子療法計画を含む、様々な方法で使用することができる。
本明細書で提供されるのは、治療有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、肝細胞、筋細胞、腎細胞、神経細胞、又は他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法である。実装されるＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、疾患を治療するために有用な目的のヌクレオチド配列を含む。特に、ＴＮＡは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、本明細書に記載され、当該技術分野において既知の任意の好適な経路を介して投与することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、標的細胞は、ヒト対象にある。
本明細書で提供されるのは、診断的又は治療的有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象に提供するための方法であり、この方法は、ある量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象の細胞、組織、又は器官に、ＴＮＡ ＬＮＰからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的又は治療的有効量のＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））によって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を、対象に提供することを含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で提供されるのは、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための方法である。一般に、この方法は、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するのに十分な量及び時間にわたって投与するステップを少なくとも含む。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で提供されるのは、疾患又は疾患状態のうちの１つ以上の症状を治療するためのツールとしての、ＴＮＡ ＬＮＰを使用するための方法である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝性疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節又は構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、アンチセンス変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）を使用して、モデルシステムにおいて疾患状態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その疾患状態に反作用するように試みることができる。したがって、本明細書に開示されるＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））及び方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、疾患状態は、疾患を引き起こす、又はそれをより重篤にする欠乏又は不均衡を部分的又は全体的に修繕することによって治療される。
一般に、上記の説明に従ってＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、又は改善することができる。例示的な疾患状態としては、嚢胞性線維症（及び他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症及び他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん及び他の神経障害、がん、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（及び他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、及び亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）及び心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個人の治療において有利に使用され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、本明細書に記載されるＴＮＡ ＬＮＰを使用して、遺伝子又は遺伝子産物中の変異によって引き起こされる疾患又は障害を治療、改善、及び／又は予防することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））で治療され得る例示的な疾患又は障害としては、代謝疾患又は障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン蓄積症）；尿素サイクル疾患又は障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積疾患又は障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群））；肝疾患又は障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患又は障害（例えば、血友病Ａ及びＢ、サラセミア、及び貧血症）；がん及び腫瘍、並びに遺伝子疾患又は障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）を用いて、導入遺伝子（例えば、ホルモン又は増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、疾患又は障害をもたらす遺伝子産物の異常なレベル及び／又は機能（例えば、タンパク質中の不在又は欠損）を訂正することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、機能的タンパク質を産生し、かつ／又はタンパク質のレベルを修復して、タンパク質中の不在若しくは欠損によって引き起こされる特定の疾患若しくは障害から生じる症状を緩和若しくは低減するか、又は利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成され得る。血友病Ａ及びＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子のレベルを修正することによって達成され得る。ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを修正することによって達成され得る。ファブリー病又はゴーシェ病の治療は、それぞれ機能的アルファーガラクトシダーゼ又はベータグルコセレブロシダーゼを産生することによって達成され得る。ＭＦＤ又はＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ機能的アリールスルファターゼＡ又はイズロネート－２－スルファターゼを産生することによって達成され得る。嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子を産生することによって達成され得る。グリコーゲン蓄積症の治療は、機能的Ｇ６Ｐａｓｅ酵素機能を回復することによって達成され得る。ＰＦＩＣの治療は、機能的ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にＲＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＲＮＡベースの治療薬の例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にアンチセンス核酸を提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸又はＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子又はアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にＤＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＤＮＡベースの治療剤の例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶゲノム）又は非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にミニサークルを提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ミニサークルＤＮＡである場合、標的細胞中のミニサークルＤＮＡの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ミニサークルＤＮＡである導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。ミニサークルＤＮＡをインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、発現カセットを含むＴＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、テイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、又はハンター症候群／ＭＰＳ ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、並びにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子－３及び４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子－ａ及び－ｂなど）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、目的の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で定義されるように、全長抗体又は抗体断片を含む、抗体をコードする。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、及び腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、及び腫瘍抑制因子遺伝子産物をコードする。
投与
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、エクスビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。
一般に、投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応を提供し得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）の例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内（骨格、横隔膜、及び／又は心筋への投与を含む）、胸膜内、脳内、及び動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚及び粘膜表面への、並びに経皮投与）、リンパ内など、並びに直接組織又は器官注射（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、若しくは脳への）が挙げられる。
ｃｅＤＮＡベクターのようなＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）の投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、及び眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍又はリンパ節内又はその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、及び／又は予防される病態の性質及び重症度、並びに使用されている特定のｃｅＤＮＡ ＬＮＰの性質に依存するであろう。追加的に、ｃｅＤＮＡは、単一のベクター又は複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に２つ以上の導入遺伝子を投与することを可能にする。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰの、骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、及び／又は下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、及び／又は指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意選択的に、脚及び／若しくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照されたい）並びに／又は直接筋肉内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意選択的に単離された四肢灌流（例えば、静脈内又は動脈内投与による）によって投与される。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰは、「流体力学的」技法を使用せずに投与することができる。
ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）の心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、及び／又は中隔への投与が挙げられる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、及び／又は冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、及び／又はその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、骨格筋、横隔膜筋及び／又は心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィー又は心臓病（例えば、ＰＡＤ又はうっ血性心不全）を治療、改善、及び／又は予防するために）。
ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、ＣＮＳ（例えば、脳又は眼）に投与することができる。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、及び前頭葉、皮質、基底核、海馬、及び偏桃体を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、並びに下丘中に導入されてもよい。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）はまた、網膜、角膜、及び／又は視神経などの眼の異なる領域に投与され得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、（例えば、腰椎穿刺によって）脳脊髄液に送達され得る。ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、更に、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、及び眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、並びに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、ＣＮＳ中の所望の領域又は区画への直接注射（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態によれば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、所望の領域への局所適用によって、又はエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。更なる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）を、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療、改善、及び／又は予防することができる。例えば、ＴＮＡ ＬＮＰ（例えば、ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ）は、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、適切なレベルの発現が達成されるまで、治療用製品の反復投与を行うことができる。したがって、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、治療用核酸を複数回投与及び再投与することができる。例えば、治療用核酸は、０日目に投与することができる。０日目の初回治療に続いて、治療用核酸を用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、又は約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、又は約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１年、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年又は約５０年後に、２回目の投薬（再投与）を実施することができる。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、１つ以上の追加の化合物もまた含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得るか、又は追加の化合物は、本発明の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中に含まれ得る。言い換えれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ＴＮＡに加えて他の化合物、又は少なくとも第１のものとは異なる第２のＴＮＡを含有し得る。無制限に、他の追加の化合物は、小さい又は大きい有機又は無機分子、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びそれらの誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体及び誘導体、生体物質から作製される抽出物、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。したがって、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。治療剤は、所望の治療目的及び生物作用に従って選択され得る。例えば、本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＬＮＰ内のＴＮＡが、がんを治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗がん剤（例えば、化学療法剤、標的がん療法（小分子、抗体、又は抗体－薬物コンジュゲートを含むが、これらに限定されない）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質又は抗ウイルス化合物）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、ＴＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患又は障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、又は１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、異なるタンパク質又は異なる化合物（治療薬など）をコードするＴＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物及び方法で使用することができる。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかの一実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。本明細書の態様及び実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激性である。
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。イオン化可能な脂質は、以下に記載される一般的な合成方法を使用して設計及び合成することができることが当業者によって理解されるであろう。
一般的な合成
式Ｉのイオン化可能な脂質は、以下のスキーム１に示される同様の合成方法を使用して設計及び合成された。
Figure 2023518985000014
実施例１：
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質１）の合成
切断可能、イオン化可能な頭部基（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセテート）（７）の合成
ステップ－１
Figure 2023518985000015
ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル）ジメタンスルホネート（２）の合成。市販の２，２’－ジスルファンジイルビス（エタン－１－オール）（１）（１５ｇ、９７．２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１４３ｍｌ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（ＮＥｔ３）（３３．３ｇ、３２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物にメタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）（３４．５ｇ、３００ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。得られた反応混合物を、室温で３時間撹拌した。反応混合物にエタノール（ＥｔＯＨ）（３９ｍｌ）を添加して反応をクエンチし、不溶性物質を濾過により除去した。濾液をジクロロメタン（ＤＣＭ）（１５０ｍｌ）と１０％重炭酸ナトリウム／水（１５０ｍｌ）との間で分配した。有機層を１００ｍｌの水で４回洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、蒸発させて、２を褐色の油（２５ｇ、８１％）として得、これは静置すると固化した。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ４．４３～４．４８（ｔ、４Ｈ）、３．００～３．１０（ｍ、１０Ｈ）。
ステップ－２
Figure 2023518985000016
２，２’－（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－１－オール）（４）の合成。アセトニトリル（３１０ｍｌ）中の２（１２ｇ、３８．７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）（１３．４ｇ、９６．６ｍｍｏｌ）、続いて２－（ピペリジン－４－イル）エタン－１－オール（３）（２０ｇ、１５５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した後、濾過を通して不溶性物質を除去した。濾液を蒸発乾固させて粗生成物を得、これをＤＣＭ（１００ｍｌ）に溶解し、水で２回（５０ｍｌ）洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて４を黄色の油（１１．８ｇ、７９％）として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ３．６３－３．６８（ｔ、４Ｈ）、２．７８－２．９０（ｍ、８Ｈ）、２．６２－２．６５（ｔ、４Ｈ）、１．９４－２．０２（ｔ、４Ｈ）、１．７０（ｓ、２Ｈ）、１．６５－１．７０（ｄ、４Ｈ）、１．２７－１．４８（ｔ、４Ｈ）、１．４０－１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．２３－１．２７（ｍ、４Ｈ）。
ステップ－３
Figure 2023518985000017
２－（４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）酢酸（５）の合成。０℃のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４０ｍｌ）中の４－ヒドロキシフェニル酢酸（５ａ）（１０ｇ、６５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（１０ｇ、１００ｍｍｏｌ）、続いてｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＳＣｌ）（１５ｇ、１００ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで水（２００ｍｌ）及びＤＣＭ（１５０ｍｌ）で処理した。有機相を分離した。水相をＤＣＭ（１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を重炭酸ナトリウムの飽和溶液、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノール（ＭｅＯＨ）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、５（４．８ｇ、２７％）及びジ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテル（ジ－ＴＢＳ）副生成物（１０．５ｇ、４２％）を得た。５の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．１２（ｄ、２Ｈ）、６．７８（ｄ、２Ｈ）、３．５６（ｓ、２Ｈ）、０．９７（ｓ、９Ｈ）、０．１８（ｓ、６Ｈ）。
Figure 2023518985000018
（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）アセテート）（６）の合成。ＤＣＭ（１００ｍｌ）中のステップ－２から得られたジスルフィド４（１．９２ｇ、５ｍｍｏｌ）及びフェニル酢酸５（３．４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）、続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）（２．４ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで重炭酸ナトリウムの飽和溶液（２００ｍｌ）、ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、６（４．１ｇ、９２％）を得た。６の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．１２（ｄ、４Ｈ）、６．７５（ｄ、４Ｈ）、４．１（ｔ、４Ｈ）、３．５（ｓ、４Ｈ）、２．８２（ｍ、８Ｈ）、２．６２（ｍ、４Ｈ）、１．９３（ｔ、４Ｈ）、１．６１－１．４５（ｍ、８Ｈ）、１．２６（ｍ、６Ｈ）、０．９７（ｓ、１８Ｈ）、０．１７（ｓ、４Ｈ）。
ステップ－４
Figure 2023518985000019
（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセテート）（７）の合成。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（４０ｍｌ）中のジスルフィド６（３．１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、フッ化水素ピリジン（１ｍｌ、３．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を０℃で２時間、次いで室温で更に２時間撹拌した。反応混合物を重炭酸ナトリウムの飽和溶液（２００ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（２×１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し、所望の生成物７（１．９２ｇ、８２％）をもたらした。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．１３（ｄ、４Ｈ）、６．７０（ｄ、４Ｈ）、４．１（ｔ、４Ｈ）、３．５（ｓ、４Ｈ）、２．８９（ｍ、８Ｈ）、２．７０（ｍ、４Ｈ）、１．９５（ｔ、４Ｈ）、１．４８（ｍ、８Ｈ）、１．１７（ｍ、６Ｈ）。
９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（１０）の合成
Figure 2023518985000020
９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（１０）の合成。ジクロロメタン（１０００ｍｌ）中のノナン二酸（８）（７．３４ｇ、３９ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－オール（８ｂ）（５ｇ、１９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２．３７ｇ、１９ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（３ｇ、１９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで２５０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ及び２５０ｍｌの水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、１０（６．２ｇ、７５％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ４．８０－４．９０（ｍ、１Ｈ）、２．２５－２．３４（ｍ、４Ｈ）、１．５５－１．７０（ｍ、４Ｈ）、１．４０－１．５０（ｍ、４Ｈ）、１．２０－１．４０（ｍ、３０Ｈ）、０．８４－０．９０（ｔ、３Ｈ）。
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエートの合成
Figure 2023518985000021
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（１１）の合成。ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のステップ－４で生成されたジスルフィド７（５８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）及び酸１０（４２２ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（１６５ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（２５８ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍｌ）を添加した。反応混合物を、ジクロロメタン（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を、ブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し、所望の生成物１１（４２７ｍｇ、４５％）をもたらした。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２７（ｄ、２Ｈ）、７．１１（ｄ、２Ｈ）、７．０３（ｄ、２Ｈ）、６．６９（ｄ、２Ｈ）、４．８５（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｍ、４Ｈ）、３．５６（ｓ、２Ｈ）、３．４８（ｓ、２Ｈ）、２．９２（ｄ、２Ｈ）、２．８５－２．６９（ｍ、１２Ｈ）、２．７１（ｔ、２Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、１．９５（ｔ、２Ｈ）、１．５２－１．０１（ｍ、５３Ｈ）、０．８５（ｍ、６Ｈ）。
脂質１の合成
Figure 2023518985000022
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質１）の合成。ジクロロメタン（１０ｍｌ）中のジスルフィド１１（１５１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及びオレイン酸１２（６１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質１（１２６ｍｇ、６８％）を得た。脂質１の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２５（ｄ、４Ｈ）、７．０１（ｄ、４Ｈ）、５．３４（ｍ、２Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．１１（ｔ、４Ｈ）、３．５８（ｓ、４Ｈ）、２．９１－２．７０（ｍ、８Ｈ）、２．６２（ｍ、４Ｈ）、２．５３（ｔ、４Ｈ）、２．２８（ｔ、２Ｈ）、２．０５－１．８７（ｍ、８Ｈ）、１．７８－１．４６（ｍ、２２Ｈ）、１．４８－１．２３（ｍ、５４Ｈ）、０．８６（ｔ、９Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１３１８。
実施例２：１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－（ノニルオキシ）－９－オキソノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質３）の合成
９－（ノニルオキシ）－９－オキソノナン酸（９）の合成
Figure 2023518985000023
９－（ノニルオキシ）－９－オキソノナン酸（９）の合成。ＤＣＭ（１０００ｍｌ）中のノナン二酸（８）（１３．２ｇ、０．１ｍｏｌ）及びノナン－１－オール（８ａ）（７．２ｇ、０．０５ｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（６．１ｇ、０．０５ｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（７．７ｇ、０．０５ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）溶液（５００ｍｌ）及び水（５００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、９（１２．６ｇ、８１％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ４．０３－４．０７（ｔ、２Ｈ）、２．２８－２．３４（ｍ、４Ｈ）、１．５８－１．６３（ｍ、６Ｈ）、１．２６－１．３２（ｍ、１８Ｈ）、０．８５－０．８７（ｔ、３Ｈ）。
脂質３の合成
Figure 2023518985000024
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－（ノニルオキシ）－９－オキソノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質３）の合成。ジクロロメタン（１０ｍｌ）中のジスルフィド１１（実施例１に記載される段階的合成）（１５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及び酸９（６２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質３（１１４ｍｇ、６０％）を得た。脂質３の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２８（ｄ、４Ｈ）、７．０２（ｄ、４Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．１１（ｔ、４Ｈ）、４．０４（ｔ、２Ｈ）、３．５８（ｓ、４Ｈ）、２．９３－２．７７（ｍ、８Ｈ）、２．６３（ｍ、４Ｈ）、２．５３（ｔ、４Ｈ）、２．２８（ｍ、４Ｈ）、１．９５（ｔ、４Ｈ）、１．８５－１．４７（ｍ、２４Ｈ）、１．４５－１．１６（ｍ、５４Ｈ）、０．８６（ｔ、９Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１３５０。
実施例３：１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（５－（ノニルオキシ）－５－オキソペンタノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質２）の合成
Figure 2023518985000025
ＤＣＭ（１０ｍｌ）中のジスルフィド１１（実施例１に記載される段階的合成）（１５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及び酸９ａ（酸９について実施例１に記載される合成を参照し、ノナン二酸（８）を出発物質として市販のグルタル酸で置き換えて、ノナン－１－オール（８ａ）と反応させて９ａを生成した）（５７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質２（１５１ｍｇ、８１％）を得た。脂質２の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２６（ｄ、４Ｈ）、７．０１（ｄ、４Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．１０－４．０２（ｔ、６Ｈ）、３．５７（ｓ、４Ｈ）、３．０１（ｄ、４Ｈ）、２．８３－２．７２（ｍ、４Ｈ）、２．３４－２．２１（ｍ、１４Ｈ）、２．１５－１．９１（ｍ、６Ｈ）、１．７４－１．４１（ｍ、１２Ｈ）、１．３９－１．１６（ｍ、５２Ｈ）、０．８６（ｔ、９Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１２９３。
実施例４：１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（５－（ノニルオキシ）－５－オキソペンタノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質４）の合成
Figure 2023518985000026
ジクロロメタン（５ｍｌ）及びＤＭＦ（３ｍｌ）の混合物中のジスルフィド７（実施例１に記載される段階的合成）（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及び化合物９（実施例２に記載される合成）（１４６ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（７０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（１０９ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を０℃で１５分間、次いで室温で一晩撹拌した。ＤＣＭ（２０ｍｌ）を添加し、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質４（１８０ｍｇ、６３％）を得た。脂質４の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２８（ｄ、４Ｈ）、７．０２（ｄ、４Ｈ）、４．１１（ｔ、４Ｈ）、４．０４（ｔ、４Ｈ）、３．５８（ｓ、４Ｈ）、２．９３－２．６７（ｍ、８Ｈ）、２．６３－２．５５（ｍ、４Ｈ）、２．５３（ｔ、４Ｈ）、２．２９（ｔ、４Ｈ）、１．９４（ｔ、４Ｈ）、１．８５－１．４７（ｍ、２０Ｈ）、１．４５－１．１６（ｍ、４２）、０．８７（ｔ、６Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１２３７。
実施例５：Ｏ’１，Ｏ１－（（（（（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（オキシ））ビス（２－オキソエタン－２，１－ジイル））ビス（４，１－フェニレン））９，９’－ジ（ヘプタデカン－９－イル）ジ（ノナンジオエート）（脂質５）の合成
Figure 2023518985000027
ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のジスルフィド７（実施例１に記載される段階的合成）（５８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）及び酸１０（実施例１に記載される合成）（４２２ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（１６４ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（２５７ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。得られた混合物を０℃で１５分間、次いで室温で一晩撹拌した。ＤＣＭ（６０ｍｌ）を添加し、反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質５（２８０ｍｇ、３８％）を得た。脂質５の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２６（ｄ、４Ｈ）、７．０２（ｄ、４Ｈ）、４．８５（ｍ、２Ｈ）、４．１１（ｔ、４Ｈ）、３．５８（ｓ、４Ｈ）、２．８６－２．７７（ｍ、８Ｈ）、２．６３（ｍ、４Ｈ）、２．５３（ｔ、４Ｈ）、２．２７（ｔ、４Ｈ）、１．９２（ｔ、４Ｈ）、１．７５－１．４７（ｍ、２６Ｈ）、１．４５－１．１６（ｍ、６４Ｈ）、０．８６（ｔ、１２Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１４６２。
実施例６：１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－（ウンデカン－３－イル）ノナンジオエート（脂質６）の合成
９－オキソ－９－（ウンデカン－３－イルオキシ）ノナン酸（９ｂ）の合成
Figure 2023518985000028
９－オキソ－９－（ウンデカン－３－イルオキシ）ノナン酸（９ｂ）の合成。ＤＣＭ（５００ｍｌ）中のノナン二酸（８）（１０．９ｇ、０．０５８ｍｏｌ）及びウンデカン－３－オール（８ｂ）（５ｇ、０．０２９ｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（３．５ｇ、０．０３ｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４．５ｇ、０．０３ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで１Ｎ ＨＣｌ溶液（５００ｍｌ）及び水（５００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、９ｂ（６．５ｇ、６６％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ４．７９－４．８３（ｔ、１Ｈ）、２．２８－２．３４（ｍ、４Ｈ）、１．２５－１．３３（ｍ、８Ｈ）、１．２６－１．３２（ｍ、１８Ｈ）、０．８５－０．８７（ｔ、６Ｈ）。
４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニルオレエート（１３）の合成
Figure 2023518985000029
４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニルオレエート（１３）の合成。ＤＣＭ（２００ｍｌ）中のジスルフィド７（実施例１に記載される段階的合成）（２．０ｇ、３ｍｍｏｌ）及びオレイン酸（又は実施例１に記載される酸１２）（０．７９ｇ、２．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（３４０ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４４０ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）を添加した。反応混合物を、ジクロロメタン（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を、ブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。溶離液としてジクロロメタン中の０～５％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、１３（１．６ｇ、５７％）を白色の固体として得た。粗生成物を更に特徴分析することなく、次のステップで直接使用した。
脂質６の合成
Figure 2023518985000030
１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－（ウンデカン－３－イル）ノナンジオエート（脂質６）の合成。ＤＣＭ（２０ｍｌ）中のジスルフィド１３（２５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及び酸９ｂ（１１３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（４０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（５１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質６（１２０ｍｇ、３６％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．３１（ｄ、４Ｈ）、７．０５（ｄ、４Ｈ）、５．３６－５．４０（ｍ、２Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．１１（ｔ、４Ｈ）、３．６２（ｔ、４Ｈ）、２．７７－２．９０（ｍ、８Ｈ）、２．５５－２．７１（ｍ、８Ｈ）、２．３０－２．３４（ｍ、２Ｈ）、１．９６－２．０５（ｍ、８Ｈ）、１．７７（ｍ、４Ｈ）、１．５８－１．６７（ｍ、１８Ｈ）、１．３０－１．５８（ｍ、４０Ｈ）、０．８９（ｔ、９Ｈ）。
実施例７：１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－（トリデカン－５－イル）ノナンジオエート（脂質７）の合成
トリデカノール－５－オール（８ｃ）の合成
Figure 2023518985000031
トリデカン－５－オール（８ｃ）の合成。１００ｍｌの無水ＴＨＦ中のアルデヒド８ｃ－１（７．１ｇ、０．０５ｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中の２Ｍブチルリチウム（ＢｕＬｉ）（２７ｍｌ）の溶液を－７８℃で滴下した。得られた混合物を－７８℃で２時間、次いで室温で２時間撹拌した。反応を、水を加えることによってクエンチし、１Ｎ ＨＣｌとエーテルとに分配した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて粗８ｃ（１０ｇ、１００％）を黄色の油として得、これを更に精製することなく次のステップに直接使用した。
９－オキソ－９－（トリデカン－５－イルオキシ）ノナン酸（９ｃ）の合成
Figure 2023518985000032
９－オキソ－９－（トリデカン－５－イルオキシ）ノナン酸（９ｃ）の合成。ＤＣＭ（５００ｍｌ）中のノナン二酸（８）（９．４ｇ、０．０５ｍｏｌ）及び８ｃ（５ｇ、０．０２５ｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（３．０５ｇ、０．０２５ｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（３．８８ｇ、０．０２５ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで１Ｎ ＨＣｌ溶液（５００ｍｌ）及び水（５００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、９ｃ（２．５ｇ、２７％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ４．８４－４．８７（ｔ、１Ｈ）、２．２８－２．３４（ｍ、４Ｈ）、１．５８－１．６３（ｍ、７Ｈ）、１．２６－１．３２（ｍ、２３Ｈ）、０．８５－０．８７（ｔ、６Ｈ）。
脂質７の合成
Figure 2023518985000033
１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－（トリデカン－５－イル）ノナンジオエート（脂質７）の合成。ＤＣＭ（２０ｍｌ）中のジスルフィド１３（実施例６に記載される合成）（２５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及び酸９ｃ（１１６ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（４０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（５１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質７（１６０ｍｇ、４０％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２９（ｄ、４Ｈ）、７．０４（ｄ、４Ｈ）、５．２９－５．３４（ｍ、２Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．１１（ｔ、４Ｈ）、３．５８（ｔ、４Ｈ）、２．７７－２．９０（ｍ、８Ｈ）、２．５１－２．７９（ｍ、８Ｈ）、２．２８（ｍ、２Ｈ）、１．９４－２．０５（ｍ、８Ｈ）、１．７０－１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．４９－１．６７（ｍ、１８Ｈ）、１．１０－１．４０（ｍ、４６Ｈ）、０．８８（ｔ、９Ｈ）。
実施例８：１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－（ペンタデカン－７－イル）ノナンジオエート（脂質８）の合成
ペンタデカン－７－オール（８ｄ）の合成
Figure 2023518985000034
ペンタデカン－７－オール（８ｄ）の合成。１００ｍｌの無水ＴＨＦ中のアルデヒド８ｄ－１（７．１ｇ、０．０５ｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（２７ｍｌ）中の２Ｍヘキシルマグネシウムブロミドの溶液を－７８℃で添加した。得られた混合物を－７８℃で２時間、次いで室温で一晩撹拌した。反応を、水を加えることによってクエンチし、１Ｎ ＨＣｌとエーテルとに分配した。有機層を回収し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて粗８ｄ（１１ｇ、１００％）を白色の固体として得、これを更に精製することなく次のステップに直接使用した。
９－オキソ－９－（ペンタデカン－７－イルオキシ）ノナン酸（９ｄ）の合成
Figure 2023518985000035
９－オキソ－９－（ペンタデカン－７－イルオキシ）ノナン酸（９ｄ）の合成。ＤＣＭ（１０００ｍｌ）中のノナン二酸（８）（９．４ｇ、０．０５ｍｏｌ）及びペンタデカン－７－オール（８ｄ）（５．７ｇ、０．０２５ｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（３．０５ｇ、０．０２５ｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（３．８８ｇ、０．０２５ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで１Ｎ ＨＣｌ溶液（５００ｍｌ）及び水（５００ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、９ｄ（６．２ｇ、６２％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ４．８６（ｔ、１Ｈ）、２．２８－２．３４（ｍ、４Ｈ）、１．５８－１．６３（ｍ、８Ｈ）、１．２６－１．３２（ｍ、２７Ｈ）、０．８５－０．８７（ｔ、６Ｈ）。
脂質８の合成
Figure 2023518985000036
１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－（ペンタデカン－７－イル）ノナンジオエート（脂質８）の合成。ＤＣＭ（２０ｍｌ）中のジスルフィド１３（実施例６に記載される合成）（２５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及び酸９ｄ（１２０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（４０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（５１ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質８（１７０ｍｇ、４０％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２９（ｄ、４Ｈ）、７．０４（ｄ、４Ｈ）、５．２９－５．３４（ｍ、２Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．１１（ｔ、４Ｈ）、３．５８（ｔ、４Ｈ）、２．８０－２．９３（ｍ、８Ｈ）、２．５１－２．６８（ｍ、８Ｈ）、２．２８（ｍ、２Ｈ）、１．９７－２．０５（ｍ、８Ｈ）、１．７０－１．８０（ｍ、４Ｈ）、１．５０－１．７０（ｍ、１８Ｈ）、１．１０－１．４０（ｍ、５８Ｈ）、０．８７（ｔ、９Ｈ）。
実施例９：１－ノニル９－（４－（２－オキソ－２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－オキソ－９－（ウンデカン－３－イルオキシ）ノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）エチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質９）の合成
１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－ノニルノナンジオエート（１４）の合成。
Figure 2023518985000037
１－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）９－ノニルノナンジオエート（１４）の合成。ジクロロメタン（２００ｍｌ）中のジスルフィド７（実施例１に記載される段階的合成）（３．１ｇ、４．８ｍｍｏｌ）及び９－（ノニルオキシ）－９－オキソノナン酸（９）（実施例１に記載される合成）（１．５１ｇ、４．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（５８７ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（７４６ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍｌ）を添加した。反応混合物を、ジクロロメタン（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を、ブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し、所望の生成物１４（２．４７ｇ、５５％）をもたらした。粗生成物を更に特徴分析することなく、次のステップで直接使用した。
脂質９の合成
Figure 2023518985000038
１－ノニル９－（４－（２－オキソ－２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－オキソ－９－（ウンデカン－３－イルオキシ）ノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）エチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質９）の合成。ジクロロメタン（２０ｍｌ）中のジスルフィド１４（２５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及び酸９ｂ（実施例６に記載される合成）（１１０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（４６ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（５０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質９（２３０ｍｇ、６８％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２８（ｄ、４Ｈ）、７．０４（ｄ、４Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．０６－４．１２（ｔ、４Ｈ）、４．０４（ｔ、２Ｈ）、３．５９（ｓ、４Ｈ）、２．６０－２．９０（ｍ、８Ｈ）、２．２７－２．６０（ｍ、１０Ｈ）、１．９７（ｔ、３Ｈ）、１．５２－１．８０（ｍ、１８Ｈ）、１．１０－１．４０（ｍ、４０Ｈ）、０．８８（ｔ、９Ｈ）。
実施例１０：１－ノニル９－（４－（２－オキソ－２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－オキソ－９－（トリデカン－５－イルオキシ）ノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）エチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質１０）の合成
Figure 2023518985000039
１－ノニル９－（４－（２－オキソ－２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－オキソ－９－（トリデカン－５－イルオキシ）ノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）エチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質１０）の合成。ジクロロメタン（２０ｍｌ）中のジスルフィド１４（実施例９に記載される合成）（３３０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及び酸９ｃ（実施例７に記載される合成）（１４３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（４７ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（６０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてジクロロメタン中の０～５％メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質１０（１５０ｍｇ、３３％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２６（ｄ、４Ｈ）、７．０３（ｄ、４Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．０５－４．１１（ｔ、６Ｈ）、３．５８（ｓ、４Ｈ）、２．８０－２．９０（ｍ、８Ｈ）、２．５０－２．７０（ｍ、８Ｈ）、２．２６－２．２９（ｍ、４Ｈ）、１．９２－１．９９（ｍ、４Ｈ）、１．５０－１．８０（ｍ、２４Ｈ）、１．１６－１．４０（ｍ、４６Ｈ）、０．８７（ｔ、９Ｈ）。
実施例１１：１－ノニル９－（４－（２－オキソ－２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－オキソ－９－（ペンタデカン－７－イルオキシ）ノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）エチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質１１）の合成
Figure 2023518985000040
１－ノニル９－（４－（２－オキソ－２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（（９－オキソ－９－（ペンタデカン－７－イルオキシ）ノナノイル）オキシ）フェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）エチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質１１）の合成。ＤＣＭ（２０ｍｌ）中のジスルフィド１４（実施例９に記載される合成）（２６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）及び酸９ｄ（実施例８に記載される合成）（１２２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（３７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質１１（１１０ｍｇ、３０％）を得た。脂質１１の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ｄ－クロロホルム）：δ７．２６（ｄ、４Ｈ）、７．０２（ｄ、４Ｈ）、４．８６（ｍ、１Ｈ）、４．０５－４．１１（ｔ、６Ｈ）、３．５９（ｓ、４Ｈ）、２．８０－２．９０（ｍ、８Ｈ）、２．５０－２．７０（ｍ、８Ｈ）、２．２７－２．２９（ｍ、４Ｈ）、１．９０－２．２０（ｔ、４Ｈ）、１．５０－１．８２（ｍ、２４Ｈ）、１．１０－１．４０（ｍ、５０Ｈ）、０．８７（ｔ、９Ｈ）。
表４における以下の脂質１２～２０は、当業者の知識の範囲内である適切な出発物質及び他の修飾で同様の手順に従って調製した。
Figure 2023518985000041
Figure 2023518985000042
実施例２：脂質ナノ粒子製剤の調製
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、約１０：１～３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡの重量比で調製した。手短に言えば、本発明のイオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））、膜融合性をもたらすための成分（ステロールなど、例えば、コレステロール）、及び複合脂質分子（ＰＥＧ－脂質など、例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール、２０００（「ＰＥＧ－ＤＭＧ」）の平均ＰＥＧ分子量を有する））を、例えば、５０：１０：３７：３又は２０：４０：３８：２のモル比でアルコール（例えば、エタノール）に可溶化した。ｃｅＤＮＡを緩衝液で所望の濃度に希釈した。例えば、ｃｅＤＮＡを、酢酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化マグネシウム、クエン酸、リンゴ酸、又はリンゴ酸及び塩化ナトリウムを含む緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍｌ～０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。一例では、ｃｅＤＮＡを１０～５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。アルコール性脂質溶液を、例えば、シリンジポンプ又は衝突ジェットミキサーを使用して、約１：５～１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で、総流速が１０ｍｌ／分を超えるようにｃｅＤＮＡ水溶液と混合した。一例では、アルコール性脂質溶液を、１２ｍｌ／分の流速で約１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比率で水性ｃｅＤＮＡと混合した。アルコールを除去し、透析により緩衝液をＰＢＳに置き換えた。代替的に、緩衝液を、遠心分離管を使用してＰＢＳと置き換えた。アルコール除去及び同時緩衝液交換は、例えば、透析又はタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成された。得られた脂質ナノ粒子を、０．２μｍ孔無菌フィルターで濾過する。
一研究では、例示的なｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子を、ＳＳ－ＯＰ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（モル比５０：１０：３７：３）を含む脂質溶液を使用して調製した。いくつかの例では、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）のような組織標的部分が含まれていた。三本側鎖ＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ３）又は四本側鎖ＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ４）などのＧａｌＮＡｃ部分は、当該技術分野で知られるように合成することができ（ＷＯ２０１７／０８４９８７及びＷＯ２０１３／１６６１２１を参照されたい）、当該技術分野で周知のように脂質、又はＰＥＧに化学的にコンジュゲートすることができる（Ｒｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ”２７６：３７５５７７－３７５８４を参照されたい）。緩衝溶液中のｃｅＤＮＡの水溶液を調製した。脂質溶液及びｃｅＤＮＡ溶液を、１：３（ｖ／ｖ）の脂質対ｃｅＤＮＡの比、１２ｍＬ／分の全流量で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ上でインハウス手順を使用して混合した。
Figure 2023518985000043
Figure 2023518985000044
Figure 2023518985000045
Figure 2023518985000046
Figure 2023518985000047
Figure 2023518985000048
Figure 2023518985000049
Figure 2023518985000050
Figure 2023518985000051
Figure 2023518985000052
Figure 2023518985000053
種（数、性別、年齢）：ＣＤ－１マウス（Ｎ＝６５及び５匹の予備、雄、到着時に約４週齢）。
ケージ側の観察：ケージ側の観察を毎日行った。
臨床観察：臨床観察は、０日目の試験物質投与の約１、約５～約６、及び約２４時間後に実施した。例外ごとに追加の観察を行った。全ての動物の体重を、該当する場合、０、１、２、３、４、及び７日目（安楽死前）に記録した。必要に応じて、追加の体重を記録した。
用量投与：試験品（ＬＮＰ：ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃ）を、外側尾静脈への静脈内投与により、群１～３８に０日目に５ｍＬ／ｋｇで投与した。
インライフ画像化：４日目に、全ての動物に、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内（ＩＰ）注射を介して１５０ｍｇ／ｋｇ（６０ｍｇ／ｍＬ）でルシフェリンを投与した。各ルシフェリン投与後１５分以内に、全ての動物は、以下に記載されるインビボ画像化プロトコルに従ってＩＶＩＳ画像化セッションを受けた。
麻酔の回復：麻酔下の間、回復中、及び移動するまで、動物を継続的にモニタリングした。
中間採血：全ての動物は、０日目、試験物質投与の５～６時間後（５．０時間以上、６．５時間以下）に中間採血を行った。
採取後、動物は０．５～１．０ｍＬの乳酸リンゲル液を皮下に受けた。
血清のための全血を、尾静脈ニック、伏在静脈、又は眼窩洞穿刺（吸入イソフルラン下）によって収集した。全血は、凝固活性剤チューブを備えた血清分離器に収集され、１つ（１）の血清アリコートに処理された。
インビボ画像化プロトコル
●ルシフェリンストック粉末を表示上－２０℃で保存した。
●製剤化されたルシフェリンを１ｍＬのアリコート、２～８℃、光からの保護で保存した。
●製剤化されたルシフェリンは、２～８℃、光からの保護で最大３週間安定であり、室温（ＲＴ）で約１２時間安定であった。
●ルシフェリンをＰＢＳに十分な容量で６０ｍｇ／ｍＬの目標濃度に溶解し、必要に応じて５ＭのＮａＯＨ（約０．５μｌ／ｍｇルシフェリン）及びＨＣｌ（約０．５μＬ／ｍｇルシフェリン）でｐＨ＝７．４に調整した。
●少なくとも約５０％の超過分を含め、プロトコルに従って適切な量を調製した。
注射及び画像化（注：一度に最大５匹の動物を画像化してもよい）
●動物の被毛を剃った（必要に応じて）。
●プロトコルに従って、腹腔内を介して６０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中の１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注射した。
●画像化は、投与直後又は投与後１５分までに実施した。
●画像化セッション中に動物を麻酔するために、イソフルラン気化器を１～３％（通常は２．５％において）に設定した。
●画像化セッションのためのイソフルラン麻酔：
○動物をイソフルランチャンバーに入れ、イソフルランが有効になるまで約２～３分待った。
○ＩＶＩＳ機器の側面の麻酔レベルが「オン」の位置にあることを確認した。
○動物をＩＶＩＳ機器に入れた
最高感度の設定で所望の取得プロトコルを実施した。
結果
研究Ａ
図１に示されるように、４日目に、脂質１、脂質２、脂質３、又は脂質５（図１の、それぞれ、ＬＮＰ５、４、６、及び３）で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ（ｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ）で処理されたマウスの群は、研究Ａで使用された陽性対照ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ（それぞれがＳＳ－ＯＰ脂質で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃであった、ＬＮＰ１、２、及び７～１２）で処理された群と比較して、等しい又はより高いルシフェラーゼ発現及び／又は活性を示し、本明細書に記載されるイオン化可能な脂質が脂質ナノ粒子送達ビヒクルとして優れた物理的属性を有することを示した。
研究Ｂ
図２に示されるように、上記研究Ａの図１における観察と一致して、４日目に、脂質１、脂質２、脂質３、又は脂質５（図２の、それぞれ、ＬＮＰ１７、１６、１８、及び１５）で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで処理されたマウスの群は、研究Ｂで使用された陽性対照ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ（ＳＳ－ＯＰ脂質で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃであった、ＬＮＰ１３）で処理された群と比較して、等しい又はより高いルシフェラーゼ活性を示し、本明細書に記載されるイオン化可能な脂質が脂質ナノ粒子送達ビヒクルとして優れた物理的属性を有することを示した。
研究Ｃ
研究Ａ及びＢにおける最高のルシフェラーゼ発現及び／又は活性を示した脂質１及び３を、用量応答について研究Ｃで更に研究した。図３に示されるように、研究Ａ及びＢからの図１及び２の観察と一致して、４日目に、脂質１又は脂質３（図１の、それぞれ、ＬＮＰ２０及び２１）で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで処理されたマウスの群は、研究Ｃで使用された陽性対照ｃｅＤＮＡ ＬＮＰ（ＳＳ－ＯＰ脂質で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃであった、ＬＮＰ１９）で処理された群と比較して、約２５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの両方でより高いルシフェラーゼ発現及び／又は活性を示し、本明細書に記載されるイオン化可能な脂質が脂質ナノ粒子送達ビヒクルとして優れた物理的属性を有することを示した。更に、図３の結果は、ＬＮＰ２０が、０．２５ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの投与量に増加される場合、同様に同じ２つの投与量レベルで試験されたＬＮＰ１９と比較して、ルシフェラーゼの発現及び／又は活性のより高い増加を示したことを示す。これらの結果は、本開示のイオン化可能な脂質で製剤化されたＬＮＰが、異なる投与量レベルに対してより応答性であり、本開示のイオン化可能な脂質で製剤化されたＬＮＰによってカプセル化されたｃｅＤＮＡにおける導入遺伝子インサートの発現レベルが、特定の疾患のためのその治療効果を発揮するために必要なレベルにより簡単に調整することができることを示し、それによってこれらのイオン化可能な脂質が脂質ナノ粒子送達ビヒクルとして有する別の望ましい技術的特徴を実証する。
研究Ｄ
研究Ｄでは、脂質６、脂質７、及び脂質８（図４Ａ及び４Ｂの、それぞれ、ＬＮＰ２４、２５、及び２６）及びｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで製剤化されたＬＮＰを、マウスにおけるルシフェラーゼ発現及び／又は活性について評価し、またイオン化可能な脂質Ａ及びＳＳ－ＯＰ脂質（図４Ａ及び４ＢのＬＮＰ２２及び２３）並びにｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで製剤化されたＬＮＰに対して比較した。図４Ａに示されるように、４日目に、脂質６、脂質７、及び脂質８で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ構築物で処理されたマウスの群は、ＳＳ－ＯＰ脂質（すなわち、ＬＮＰ２３）で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで処理された群と比較して、等しい又はより高いルシフェラーゼ発現及び／又は活性を示した。図４Ｂは、処理が１日目にマウスにおいて体重の変化を引き起こさなかったので、脂質６、脂質７、及び脂質８で製剤化されたｃｅ－ＤＮＡ－ｌｕｃ構築物も、マウスにおいて忍容性が良好であったことを示す。対照的に、図４Ｂに見られるように、イオン化可能な脂質Ａ（すなわち、ＬＮＰ２２）で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで処理されたマウスは、１日目に有意な体重減少を被り、それによって脂質が動物による忍容性が良好でなかったことを示した。
研究Ｅ
研究Ｅでは、脂質９、脂質１０、及び脂質１１（図５Ａ及び５Ｂの、それぞれ、ＬＮＰ２８、２９、及び３０）及びｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで製剤化されたＬＮＰを、マウスにおけるルシフェラーゼ発現及び／又は活性について評価し、ＳＳ－ＯＰ脂質（図５Ａ及び５ＢのＬＮＰ２７）及びｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで製剤化されたＬＮＰに対して比較した。図５Ａに示されるように、４日目に、脂質９、脂質１０、及び脂質１１で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃ構築物で処理されたマウスの群は、ＳＳ－ＯＰ脂質（すなわち、ＬＮＰ２７）で製剤化されたｃｅＤＮＡ－ｌｕｃで処理された群と比較して、等しい又はより高いルシフェラーゼ発現及び／又は活性を示した。図５Ｂは、ＬＮＰ３０における外れ値データ点を除いて、処理が１日目にマウスにおいて体重の有意な変化を引き起こさなかったので、脂質９、脂質１０、及び脂質１１で製剤化されたｃｅ－ＤＮＡ－ｌｕｃ構築物が、マウスにおいて一般に忍容性が良好であったことを示す。
したがって、研究Ａ～Ｅは、全体として、本開示のイオン化可能な脂質で製剤化されたＬＮＰが、（ｉ）ｃｅＤＮＡの導入遺伝子インサートの優れたインビボ発現レベルを有し、（ｉｉ）異なる投与量レベルに応答性であり、それによってｃｅＤＮＡの導入遺伝子インサートのインビボ発現レベルを必要に応じて調整することを可能にし、（ｉｉｉ）インビボで忍容性が良好であることを実証する。
参考文献
特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書及び本明細書の実施例で引用される全ての刊行物及び参考文献は、あたかも個々の刊行物又は参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それらの全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物及び参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (119)

  1. 式（Ｉ）を有する脂質であって、
    Figure 2023518985000054
    式中、
    ａが、１～２０の範囲の整数であり、
    ｂが、２～１０の範囲の整数であり、
    Ｒ１が、不在であるか、又は（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、及び（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
    Ｒ２が、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルである、脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  2. 前記脂質が、式（ＩＩ）のものであり、
    Figure 2023518985000055
    式中、ｃ及びｄが、各々独立して、１～８の範囲の整数である、請求項１に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  3. ｃ及びｄが、各々独立して、２～８の範囲の整数である、請求項２に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  4. ｃ及びｄが、各々独立して、４～８の範囲の整数である、請求項２若しくは３に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  5. ｃ及びｄが、各々独立して、６～８の範囲の整数である、請求項２～４のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  6. ｃ及びｄが、各々独立して、１、３、５、又は７である、請求項２に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  7. ｃ及びｄのうちの少なくとも１つが、７である、請求項２～６のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  8. 前記脂質が、式（ＩＩＩ）のものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の脂質、
    Figure 2023518985000056
    又はその薬学的に許容される塩。
  9. ｂが、３～９の範囲の整数である、請求項１～８のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  10. ｂが、５～７の範囲の整数である、請求項１～９のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  11. ｂが、５又は７である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  12. ａが、２～１８の範囲の整数である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  13. ａが、３～１７の範囲の整数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  14. ａが、６～１８の範囲の整数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  15. ａが、４～１２の範囲の整数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  16. ａが、２～５の範囲の整数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  17. ａが、３である、請求項１６に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  18. ａが、６～８の範囲の整数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  19. ａが、７である、請求項１８に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  20. ａが、８である、請求項１８に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  21. ａが、１６～１８の範囲の整数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  22. ａが、１７である、請求項２１に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  23. ａが、９～１１の範囲の整数である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  24. ａが、１０である、請求項２３に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  25. Ｒ１が、不在であるか、又は（Ｃ５～Ｃ１５）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４～Ｃ１８）アルキル、及び（Ｃ４～Ｃ１６）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  26. Ｒ１が、不在であるか、又は（Ｃ５～Ｃ１２）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４～Ｃ１２）アルキル、及び（Ｃ４～Ｃ１２）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  27. Ｒ１が、不在であるか、又は（Ｃ５～Ｃ１０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４～Ｃ１０）アルキル、及び（Ｃ４～Ｃ１０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  28. Ｒ１が、Ｃ１０アルケニルである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
  29. Ｒ１の－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１０）アルキルにおける前記アルキルが、非分岐アルキルである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  30. Ｒ１が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ９アルキル）である、請求項２９に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  31. －Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１０）アルキルにおける前記アルキルが、分岐アルキルである、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  32. Ｒ１が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１７アルキル）である、請求項３１に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  33. Ｒ１が、表１に列挙される任意の基から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  34. Ｒ２が、表２に列挙される任意の基から選択される、請求項１に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  35. 前記脂質が、表３に列挙される任意の脂質から選択される、請求項１に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩。
  36. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩と、核酸と、を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。
  37. 前記核酸が、前記脂質内に封入されている、請求項３６に記載の脂質ナノ粒子。
  38. 前記核酸が、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３６又は３７に記載の脂質ナノ粒子。
  39. 前記核酸が、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である、請求項３８に記載の脂質ナノ粒子。
  40. ステロールを更に含む、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  41. 前記ステロールが、コレステロール又はベータ－シトステロールである、請求項４０に記載の脂質ナノ粒子。
  42. ＰＥＧ－脂質コンジュゲートを更に含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  43. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である、請求項４２に記載の脂質ナノ粒子。
  44. 非カチオン性脂質を更に含む、請求項３６～４３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  45. 前記非カチオン性脂質が、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４４に記載の脂質ナノ粒子。
  46. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項４５に記載の脂質ナノ粒子。
  47. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約１．５％～約４％のモルパーセントで存在する、請求項４６に記載の脂質ナノ粒子。
  48. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２％～約３％のモルパーセントで存在する、請求項４７に記載の脂質ナノ粒子。
  49. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２．５％～約３％のモルパーセントで存在する、請求項４８に記載の脂質ナノ粒子。
  50. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約３％のモルパーセントで存在する、請求項４９に記載の脂質ナノ粒子。
  51. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＤＭＧ－ＰＥＧである、請求項４２～５０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  52. 前記コレステロール又はベータ－シトステロールが、約２０％～約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記脂質が、約８０％～約６０％のモルパーセンテージで存在する、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  53. 前記コレステロール又はベータ－シトステロールが、約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記脂質が、約５０％のモルパーセンテージで存在する、請求項５２に記載の脂質ナノ粒子。
  54. コレステロール、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び非カチオン性脂質を更に含む、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  55. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約１．５％～約４％で存在する、請求項５４に記載の脂質ナノ粒子。
  56. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２％～約３％で存在する、請求項５５に記載の脂質ナノ粒子。
  57. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約２．５％～約３％で存在する、請求項５６に記載の脂質ナノ粒子。
  58. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約３％で存在する、請求項５７に記載の脂質ナノ粒子。
  59. 前記コレステロールが、約３０％～約５０％のモルパーセンテージで存在する、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  60. 前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００である、請求項５４～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  61. 前記脂質が、約４２．５％～約６２．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項５３～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  62. 前記非カチオン性脂質が、約２．５％～約１２．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項５３～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  63. 前記コレステロールが、約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記脂質が、約５２．５％のモルパーセンテージで存在し、前記非カチオン性脂質が、約７．５％のモルパーセンテージで存在し、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約３％で存在する、請求項５３～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  64. パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む、請求項３６～６３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  65. 前記ナノ粒子が、約５０ｎｍ～約１１０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項３６～６４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  66. 前記ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満のサイズである、請求項３６～６４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  67. 前記粒子が、約７０ｎｍ未満のサイズである、請求項６６に記載の脂質ナノ粒子。
  68. 前記粒子が、約６０ｎｍ未満のサイズである、請求項６７に記載の脂質ナノ粒子。
  69. 前記粒子が、約１０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  70. 前記粒子が、約２０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  71. 前記粒子が、約３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  72. 前記粒子が、約４０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  73. 組織特異的標的化部分を更に含む、請求項３６～７２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  74. 前記組織特異的標的化部分が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり、ＧａｌＮａｃが、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートに結合しており、前記ＧａｌＮａｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、約１．０％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、又は約０．１％のモルパーセンテージで前記粒子中に存在する、請求項７３に記載の脂質ナノ粒子。
  75. 前記ＧａｌＮａｃ結合ＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、約０．５％のモルパーセンテージで前記粒子中に存在する、請求項７４に記載の脂質ナノ粒子。
  76. 約１０ｍＭ～約３０ｍＭのリンゴ酸を更に含む、請求項３６～７５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  77. 約２０ｍＭのリンゴ酸を含む、請求項７６に記載の脂質ナノ粒子。
  78. 約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＮａＣｌを更に含む、請求項３６～７７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  79. 約４０ｍＭのＮａＣｌを更に含む、請求項７８に記載の脂質ナノ粒子。
  80. 約２０ｍＭ～約１００ｍＭのＭｇＣｌ２を更に含む、請求項３６～７９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  81. 前記ｃｅＤＮＡが、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡである、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  82. 前記ｃｅＤＮＡが、発現カセットを含み、前記発現カセットが、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  83. 前記発現カセットが、ポリアデニル化配列を含む、請求項８２に記載の脂質ナノ粒子。
  84. 前記ｃｅＤＮＡが、前記発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  85. 前記発現カセットが、２つのＩＴＲに隣接し、前記２つのＩＴＲが、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  86. 前記発現カセットが、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  87. 前記発現カセットが、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  88. ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  89. ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾されたＩＴＲである、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  90. 前記ｃｅＤＮＡが、５’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  91. 前記ｃｅＤＮＡが、３’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  92. 前記スペーサー配列が、少なくとも５塩基対長の長さである、請求項９０又は９１に記載の脂質ナノ粒子。
  93. 前記スペーサー配列が、５～１００塩基対長の長さである、請求項９２に記載の脂質ナノ粒子。
  94. 前記スペーサー配列が、５～５００塩基対長の長さである、請求項９２に記載の脂質ナノ粒子。
  95. 前記ｃｅＤＮＡが、ニック又はギャップを有する、請求項３８～９４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
  96. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲであり、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来し、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来し、パルボウイルスからの野生型ＩＴＲである、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  97. 前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２を含む群から選択される、請求項９６に記載の脂質ナノ粒子。
  98. 前記ＩＴＲが、変異体ＩＴＲであり、前記ｃｅＤＮＡが、任意選択的に、第１のＩＴＲとは異なる追加のＩＴＲを含む、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  99. 前記ｃｅＤＮＡが、前記発現カセットの５’及び３’末端の両方に２つの変異体ＩＴＲを含み、任意選択的に、前記２つの変異体ＩＴＲが、対称変異体である、請求項８４に記載の脂質ナノ粒子。
  100. 前記ｃｅＤＮＡが、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリング（ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）ＤＮＡ、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである、請求項３９に記載の脂質ナノ粒子。
  101. 請求項３６～１００のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  102. 請求項１～２５のいずれか一項に記載の脂質、又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  103. 対象における遺伝性障害を治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項３６～１００のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は有効量の請求項１０１に記載の薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
  104. 前記対象が、ヒトである、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記遺伝性障害が、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｓ型）、ハーラー・シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイ・サックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、ファブリー病、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）Ｉ型（ＡＴＰ８Ｂ１欠損症）、ＩＩ型（ＡＢＣＢ１１）、ＩＩＩ型（ＡＢＣＢ４）、又はＩＶ型（ＴＪＰ２）、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  106. 前記遺伝性障害が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記ＬＣＡが、ＬＣＡ１０である、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記遺伝性障害が、ニーマンピック病である、請求項１０５に記載の方法。
  109. 前記遺伝性障害が、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである、請求項１０５に記載の方法。
  110. 前記遺伝性障害が、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）欠損症（グリコーゲン蓄積症Ｉ型）又はポンペ病（グリコーゲン蓄積症ＩＩ型）である、請求項１０５に記載の方法。
  111. 前記遺伝性障害が、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）である、請求項１０５に記載の方法。
  112. 前記遺伝性障害が、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）である、請求項１０５に記載の方法。
  113. 前記遺伝性障害が、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）である、請求項１０５に記載の方法。
  114. 前記遺伝性障害が、嚢胞性線維症である、請求項１０５に記載の方法。
  115. 前記遺伝性障害が、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）である、請求項１０５に記載の方法。
  116. 前記遺伝性障害が、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、請求項１０５に記載の方法。
  117. 前記遺伝性障害が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）である、請求項１０５に記載の方法。
  118. 前記遺伝性障害が、ウィルソン病である、請求項１０５に記載の方法。
  119. 前記遺伝性障害が、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ型である、請求項１０５に記載の方法。
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