CN118973615A - 用于向外周血单个核细胞递送核酸的脂质纳米粒子以及使用其向外周血单个核细胞递送核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够改善向外周血单个核细胞递送核酸效率的用于向外周血单个核细胞递送核酸的脂质纳米粒子以及使用其向外周血单个核细胞递送核酸的方法。一种用于将核酸向外周血单个核细胞递送的含有式(1)表示的离子性脂质、酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基为烯酰基的1,2‑二酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱的磷脂、胆固醇以及式：CH2(OR6)‑CH(OR7)‑CH2(OR8)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG的脂质纳米粒子(式中的符号定义如说明书中记载所述)以及使用其向外周血单个核细胞递送核酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于向外周血单个核细胞递送核酸的脂质纳米粒子以及使用其向外周血单个核细胞递送核酸的方法。
背景技术
为了将使用siRNA等寡核酸的核酸治疗、使用mRNA、pDNA等的基因治疗实用化，需要一种有效且安全的核酸递送载体。病毒载体虽然是表达效率良好的核酸递送载体，但也正在推进开发一种能够更安全地使用的非病毒核酸递送载体。
在体外的核酸递送中，除了病毒载体之外，电转染法的开发也正在推进。由于该电转染法为一种在细胞上开孔后物理性地导入核酸的方法，因此细胞应激、细胞毒性成为问题。另一方面，使用离子性脂质的脂质纳米粒子作为能够在体外、体内两方使用的低毒性核酸递送载体的开发也正在推进。
离子性脂质大致上由胺部分和脂质部分构成。例如，对于离子性脂质而言，通过在酸性条件下质子化的胺部分与聚阴离子的核酸发生静电相互作用，形成脂质纳米粒子，能够促进向细胞的导入，将核酸递送至细胞内。
作为通常广泛使用的公知的离子性脂质，可举出1,2-二油酰基-3-二甲氨基-丙烷(DODAP)。已知通过将这样公知的离子性脂质与磷脂、胆固醇以及PEG脂质组合形成脂质纳米粒子，可以向细胞内递送核酸(参考非专利文献1)。
例如，在专利文献1中，描述了一种具有通过表现出可生物降解性的二硫键将由1个或2个胺部分和1个脂质部分构成的化合物之间进行连接的结构的离子性脂质。在该专利文献1中显示该离子性脂质可改善血中稳定性、肿瘤靶向性等体内动力学。此外，通过改变胺部分周边的结构，除了将脂质膜结构体的pKa调整至有利于在细胞内的内体(endosome)逃逸的值之外，通过在细胞内切断二硫键，还表现出具有使核酸从脂质膜结构体解离的效果。实际上，由于相较于公知的离子性脂质DODAP，该离子性脂质表现出高核酸递送效率，因此其明显能够改善提升核酸的向细胞质内的递送效率等细胞内动力学。
例如，在专利文献2中示出了一种脂质膜结构体，通过使用除了叔胺部分、二硫键之外，还在脂质部分附近导入芳香环的离子性脂质，提高了与内体膜的融合能力，进一步地提高了向细胞质递送核酸的效率。
通过像上述那样提高内体逃逸效率、膜融合能力，可开发出一种改善了细胞内动力学的离子性脂质，显示能高效地向细胞株、生物体内递送核酸。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2014/0335157号说明书
专利文献2：国际公开第2019/188867号
专利文献3：国际公开第2020/039631号
非专利文献
非专利文献1：Molecular Therapy，25(7)：1467-1475(2017)
非专利文献2：Molecular Therapy,26(6):1509-1519(2018)
非专利文献3：Adv.Funct.Mater.,30:1910575(2020)
非专利文献4：Gene Therapy,23:699-707(2016)
非专利文献5：Nanomedicine:NBM,13:1377-1387(2017)
发明内容
发明要解决的问题
在以CAR-T疗法为代表的癌症免疫疗法、以iPS细胞的制作、分化为代表的再生医疗领域中，向外周血单个核细胞等血细胞有效地递送核酸十分重要。然而，由于向以从生物体内取出的T细胞为代表的外周血单个核细胞递送核酸的效率，在由离子性脂质构成的脂质纳米粒子方面并不充分，因此使用病毒载体、电转染法的开发尚在先行推进。
因此，为了更高效地经由脂质纳米粒子来导入核酸，需要进一步改善向外周血单个核细胞递送核酸的效率。例如，专利文献3中示出了通过在生理性pH的条件下使脂质纳米粒子表面具有阳离子性，由此提高向外周血单个核细胞递送核酸的效率。
然而，由于通常在生理pH条件下具有阳离子性的化合物的细胞毒性高，从面向实用化出发，期望使用细胞毒性低的中性脂质纳米粒子。
在这一点上，非专利文献2、非专利文献3以及非专利文献4中各自示出了有关用于肝脏递送的脂质纳米粒子，分别使用结构特征不同的离子性脂质。在这些文献中，不同的磷脂被用作脂质纳米粒子的构成成分，对于不同结构的离子性脂质，其与磷脂的最佳组合均不同。
另一方面，非专利文献5中示出了即使是使用相同离子性脂质的脂质纳米粒子，适合的磷脂也因基因导入的细胞种类不同而不同的例子。
如上所述，虽然存在使用脂质纳米粒子提升向外周血单个核细胞导入核酸的效率的例子，但是由于合适的磷脂组合根据离子性脂质的结构而不同，因此从面向实用化出发并不能充分满足，需要进一步改善核酸递送效率。
本发明鉴于上述问题，其目的在于提供一种能够改善向外周血单个核细胞递送核酸效率的用于向外周血单个核细胞递送核酸的脂质纳米粒子以及使用其向外周血单个核细胞递送核酸的方法。
用以解决问题的手段
如上所述，在脂质纳米粒子中，脂质纳米粒子与磷脂的合适的组合根据细胞种类而不同，为了有效递送核酸，需要优化离子性脂质与磷脂的组合。
本发明人鉴于上述问题，经过不懈努力，结果发现，使用具有适合于内体逃逸的pKa且在细胞内还原环境下特异性分解的离子性脂质和特定的1,-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱作为磷脂制造的中性的脂质纳米粒子能够改善向外周血单个核细胞递送核酸的效率。基于该发现的本发明如下所述。
[1]一种用于将核酸递送至外周血单个核细胞的脂质纳米粒子，其包含式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇以及式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG，
所述磷脂为酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基为烯酰基的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
[化1]
(式(1)中，
R1a和R1b各自独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，
Xa和Xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基的数量为1的非环状烷基叔氨基或碳原子数为2～5且叔氨基的数量为1～2的环状亚烷基叔氨基，
R2a和R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
Ya和Yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
Za和Zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，
na和nb各自独立地为0或1，
R3a和R3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、碳原子数1～40的脂肪族烃基、具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基，或式(4)表示的基团。
R9-O-CO-(CH2)a-(4)
(式(4)中，
R9表示碳原子数2～20的脂肪族烃基，
a表示2～10的整数。))
CH2(OR6)-CH(OR7)-CH2(OR8)(2)
(式(2)中，
R6、R7和R8的任意2个表示肉豆蔻酰基，剩余1个表示经由数均分子量1,000～3,000的聚乙二醇链连接的碳原子数1～6的烷基。)
[2]根据[1]记载的脂质纳米粒子，所述磷脂为由1,2-二(二十碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEiPC)、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DEPC)以及1,2-二神经酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DNPC)构成的群中选择的至少1种。
[3]根据[1]或[2]记载的脂质纳米粒子，式(1)表示的离子性脂质为下述式：
[化2]
表示的离子性脂质。
[4]根据[1]～[3]中任一项记载的脂质纳米粒子，相对于所述离子性脂质、所述磷脂以及所述胆固醇的总和，所述离子性脂质为20～60mol％，所述磷脂为5～20mol％，所述胆固醇为30～70mol％，所述二肉豆蔻酰甘油PEG脂质为0.5～1.5mol％。
[5]一种向外周血单个核细胞递送核酸的方法，其包括使包封有核酸的[1]～[4]中任一项记载的脂质纳米粒子与外周血单个核细胞相接触。
[6]脂质纳米粒子在制造用于向外周血单个核细胞递送核酸的药品中的使用，所述脂质纳米粒子包含式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇以及式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG，
所述磷脂为酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基为烯酰基的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
[化3]
(式(1)中，各符号如在[1]中定义所述。)
CH2(OR6)-CH(OR7)-CH2(OR8)(2)
(式(2)中，各符号如在[1]中定义所述。)
[7]根据[6]中记载的使用，所述磷脂为由1,2-二(二十碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEiPC)、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DEPC)以及1,2-二神经酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dinervonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DNPC)构成的群中选择的至少1种。
[8]根据[6]或[7]中记载的使用，式(1)表示的离子性脂质为下述式：
[化4]
表示的离子性脂质。
[9]根据[6]～[8]中任一项记载的使用，相对于所述离子性脂质、所述磷脂以及所述胆固醇的总和，所述离子性脂质为20～60mol％，所述磷脂为5～20mol％，所述胆固醇为30～70mol％，所述二肉豆蔻酰甘油PEG脂质为0.5～1.5mol％。
发明的效果
通过优化离子性脂质与磷脂的组合和脂质组成，本发明的脂质纳米粒子能够高效地向外周血单个核细胞递送核酸。
附图说明
[图1]表示实施例1、比较例1以及比较例2的脂质纳米粒子在小鼠初代T细胞中的基因表达活性的图。
[图2]表示实施例2、比较例3以及比较例4的脂质纳米粒子向小鼠初代T细胞的导入量的图。
[图3]表示实施例1和3～8以及比较例1的脂质纳米粒子在小鼠初代T细胞中的基因表达活性的图。
[图4]表示实施例6、7和9～14以及比较例1的脂质纳米粒子在小鼠初代T细胞中的基因表达活性的图。
[图5]表示实施例6和15～18以及比较例1的脂质纳米粒子在小鼠初代T细胞中的基因表达活性的图。
[图6]表示实施例6、比较例5和比较例6的脂质纳米粒子在人体初代T细胞中的基因表达活性的图。
具体实施方式
以下说明本发明的实施方式，但本发明并不限定于这些。本发明涉及一种含有式(1)表示的离子性脂质(即具有叔氨基、脂质部分以及作为可生物降解性基团的二硫键的离子性脂质)、酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基为烯酰基的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的磷脂、胆固醇以及式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG的脂质纳米粒子以及使用其向外周血单个核细胞递送核酸的方法。
脂质纳米粒子
本说明书中，“脂质纳米粒子”(LipidNanoparticle、本说明书中存在简称为“LNP”的情况)是指两亲性脂质的亲水性基团具有面向界面的水相一侧排列的膜结构，粒径低于1μm的粒子。“两亲性脂质”是指兼具亲水性基团和疏水性基团的脂质。
本发明的脂质纳米粒子的粒径优选为10nm～500nm，更优选为30nm～300nm。粒径的测定例如可以使用ZetasizerNano(Malvern公司)等粒度分布测定装置来进行。脂质纳米粒子的粒径可以通过脂质纳米粒子的制造方法进行适当调整。在本发明中，“粒径”是指通过动态光散射法测定的平均粒径(Z-Average)。
作为两亲性脂质，例如可举出：离子性脂质、磷脂、PEG脂质等。本说明书中，“PEG”是指聚乙二醇，“PEG脂质”是指使用PEG修饰的脂质，“使用X修饰的Y”(例如X：PEG、Y：脂质)是指X结合的Y。换言之，“PEG脂质”是指PEG结合的脂质。
本发明的脂质纳米粒子也可以含有式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇以及式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG以外的脂质(以下存在记载为“其他脂质”的情况)。作为其他脂质，例如可举出：胆固醇以外的甾醇、式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG以外的PEG脂质。
相对于脂质纳米粒子中的脂质总量，本发明的脂质纳米粒子中的其他脂质的量优选为0～50mol％，更优选为0～30mol％，进一步优选为0～10mol％。此时，对于“脂质纳米粒子中的脂质总量”，例如在脂质纳米粒子含有式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇和式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG以及其他脂质作为构成成分的情况时，是指“式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇和式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG以及其他脂质的总和量”。此外，在本说明书中，“相对于A的B的量(mol％)”是指“100×B的量(mol)/A的量(mol)”。例如，“相对于脂质总量的其他脂质的量”是指“100×其他脂质的量(mol)/脂质总量(mol)”。
本发明中不使用其他脂质，即，构成本发明的脂质纳米粒子的脂质最优选为由式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇以及式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG构成。
离子性脂质
本发明中使用的离子性脂质为下述式(1)表示的离子性脂质(本说明书中存在简称为“离子性脂质(1)”的情况)。离子性脂质(1)可以仅使用1种，也可以合用2种以上。
[化5]
(式(1)中，
R1a和R1b各自独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，
Xa和Xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基的数量为1的非环状烷基叔氨基或碳原子数为2～5且叔氨基的数量为1～2的环状亚烷基叔氨基，
R2a和R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
Ya和Yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
Za和Zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，
na和nb各自独立地为0或1，
R3a和R3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、碳原子数1～40的脂肪族烃基、具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基，或式(4)表示的基团：
R9-O-CO-(CH2)a-(4)
(式(4)中，
R9表示碳原子数2～20的脂肪族烃基，
a表示2～10的整数。))
R1a和R1b各自独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，可以为直链状，也可以具有支链，优选为直链状。该亚烷基的碳原子数优选为1～4，更优选为1～2。作为碳原子数1～6的亚烷基，具体地可举出：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基、四亚甲基、异亚丁基、五亚甲基、新亚戊基等。R1a和R1b优选各自独立地为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基或四亚甲基，最优选各自为亚乙基。
R1a可以与R1b相同也可以不同，优选R1a是与R1b相同的基团。
Xa和Xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，优选各自独立地为碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基。
碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基中的碳原子数1～6的烷基可以是直链状，也可以是支链状，还可以是环状。该烷基的碳原子数优选为1～3。作为碳原子数1～6的烷基，具体地可举出：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等，优选甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选甲基。
碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基的优选的具体结构以X1表示。
[化6]
X1的R5表示碳原子数1～6的烷基，可以是直链状，也可以是支链状，还可以是环状。该烷基的碳原子数优选1～3。作为碳原子数1～6的烷基，具体地可举出：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等。优选甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选甲基。
碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基中的碳原子数优选为4～5。作为碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，具体为亚氮丙啶基、亚氮杂环丁基、亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚咪唑基、亚哌嗪基，优选亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚哌嗪基，最优选亚哌啶基。
碳原子数为2～5且叔氨基数为1的环状亚烷基叔氨基的优选的具体结构以X2表示。
[化7]
X2的p为1或2。p为1时，X2为亚吡咯烷基，p为2时，X2为亚哌啶基。优选p为2。
碳原子数为2～5且叔氨基数为2的环状亚烷基叔氨基的优选的具体结构以X3表示。
[化8]
X3的w为1或2。w为1时，X3为亚咪唑基，w为2时，X3为亚哌嗪基。
Xa可以与Xb相同也可以不同，优选Xa与Xb是相同的基团。
R2a和R2b各自独立地表示碳原子数8以下的亚烷基或氧二亚烷基，优选各自独立地为碳原子数8以下的亚烷基。
碳原子数8以下的亚烷基可以为直链状，也可以具有支链，优选直链状。该亚烷基中包含的碳原子数优选为6以下，最优选为4以下。作为碳原子数8以下的亚烷基，具体地可举出：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基、四亚甲基、异亚丁基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基等，优选亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基，最优选亚乙基。
在本说明书中，“碳原子数8以下的氧二亚烷基”是经由醚键连结的亚烷基(亚烷基-O-亚烷基，换而言之为“亚烷基氧亚烷基”)，是指存在的2个亚烷基的碳原子数的总和为8以下的基团。其中，存在的2个亚烷基可以相同，也可以不同，优选相同。作为碳原子数8以下的氧二亚烷基，具体地可举出：氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二(三亚甲基)基(即三亚甲基氧三亚甲基)、氧二(四亚甲基)基(即四亚甲基氧四亚甲基)等。优选氧二亚甲基、氧二亚乙基、氧二(三亚甲基)基，最优选氧二亚乙基。
R2a可以与R2b相同也可以不同，优选R2a是与R2b相同的基团。
Ya和Yb各自独立地为酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，优选各自独立地为酯键、酰胺键或氨基甲酸酯键，更优选各自独立地为酯键或酰胺键，最优选各自为酯键。Ya和Yb的键合方向没有限制，在Ya和Yb为酯键的情况下，优选呈现-Za-CO-O-R2a-和-Zb-CO-O-R2b-的结构。
Ya可以与Yb相同也可以不同，优选Ya是与Yb相同的基团。
Za和Zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团。该芳香族化合物中包含的碳原子数优选为6～12，最优选为6～7。此外，该芳香族化合物中包含的芳香环优选为1个。
作为碳原子数3～16的芳香族化合物中包含的芳香环的种类，关于芳香族烃环，可举出：苯环、萘环、蒽环，关于芳香族杂环，可举出：咪唑环、吡唑环、噁唑环、异噁唑环、噻唑环、异噻唑环、三嗪环、吡咯环、呋喃并噻吩环、嘧啶环、哒嗪环、吡嗪环、吡啶环、嘌呤环、蝶啶环、苯并咪唑环、吲哚环、苯并呋喃环、喹唑啉环、酞嗪环、喹啉环、异喹啉环、香豆素环、色酮环、苯并二氮环、吩噁嗪环、吩噻嗪环、吖啶环等，优选苯环、萘环、蒽环，最优选苯环。
芳香环可具有取代基，作为其取代基，可举出：碳原子数2～4的酰基、碳原子数2～4的烷氧基羰基、碳原子数2～4的氨基甲酰基、碳原子数2～4的酰氧基、碳原子数2～4的酰基氨基、碳原子数2～4的烷氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、碳原子数1～4的烷基亚硫酰基、碳原子数1～4的烷基磺酰基、碳原子数6～10的芳基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、碳原子数1～4的烷基、碳原子数1～4的脲基、碳原子数1～4的烷氧基、碳原子数6～10的芳基、碳原子数6～10的芳氧基等，作为优选例，可举出：乙酰基、甲氧基羰基、甲基氨基甲酰基、乙酰氧基、乙酰氨基、甲氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲基亚硫酰基、苯基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、脲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、苯基和苯氧基等。
作为Za和Zb的优选的具体结构，可举出Z1。
[化9]
式中，s表示0～3的整数，t表示0～3的整数，u表示0～4的整数，u个R4各自独立地表示取代基。
Z1的s优选为0～1的整数，更优选为0。
Z1的t优选为0～2的整数，更优选为1。
Z1的u优选为0～2的整数，更优选为0～1的整数。
Z1的R4是不阻碍该离子性脂质合成过程中的反应的碳原子数3～16的芳香族化合物中包含的芳香环(苯环)的取代基。作为该取代基，可举出：碳原子数2～4的酰基、碳原子数2～4的烷氧基羰基、碳原子数2～4的氨基甲酰基、碳原子数2～4的酰氧基、碳原子数2～4的酰基氨基、碳原子数2～4的烷氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、碳原子数1～4的烷基亚硫酰基、碳原子数1～4的烷基磺酰基、碳原子数6～10的芳基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、碳原子数1～4的烷基、碳原子数1～4的脲基、碳原子数1～4的烷氧基、碳原子数6～10的芳基、碳原子数6～10的芳氧基等，作为优选例，可举出：乙酰基、甲氧基羰基、甲基氨基甲酰基、乙酰氧基、乙酰氨基、甲氧基羰基氨基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子、甲基亚硫酰基、苯基磺酰基、硝基、三氟甲基、氰基、甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、脲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、苯基和苯氧基等。在多个R4存在的情况下，各R4可以相同，也可以不同。
Za可以与Zb相同也可以不同，优选Za是与Zb相同的基团。
na和nb各自独立地为0或1。
na可以与nb相同也可以不同，优选na与nb相同。
R3a和R3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、碳原子数1～40的脂肪族烃基、具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基，或式(4)表示的基团，优选各自独立地为来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基，最优选各自独立地为碳原子数12～22的脂肪族烃基。
R9-O-CO-(CH2)a-(4)
(式(4)中，
R9表示碳原子数2～20的脂肪族烃基，
a表示2～10的整数。)
来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基表示具有如下结构的基团：具有羟基的脂溶性维生素的羟基被*-O-CO-CH2-CH2-或*-O-CO-CH2-CH2-CH2-取代。*表示与脂溶性维生素的键合位置。来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基表示具有如下结构的基团：具有羟基的甾醇衍生物的羟基被*-O-CO-CH2-CH2-或*-O-CO-CH2-CH2-CH2-取代。*表示与甾醇衍生物的键合位置。
作为具有羟基的脂溶性维生素，例如可举出：视黄醇、麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、钙化醇、麦角钙化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速甾醇、生育酚、生育三烯酚等。具有羟基的脂溶性维生素优选生育酚。
作为具有羟基的甾醇衍生物，例如可举出：胆固醇、胆甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇和麦角甾醇等，优选胆固醇或胆甾烷醇。
碳原子数1～40的脂肪族烃基可以为直链状，也可以具有支链。该脂肪族烃基可以是饱和的，也可以是不饱和的。在不饱和脂肪族烃基的情况下，该脂肪族烃基中包含的不饱和键数通常为1～6个，优选为1～3个，更优选为1～2个。不饱和键包括碳-碳双键和碳-碳三键，优选碳-碳双键。该脂肪族烃基中包含的碳原子数优选为12～22，更优选为13～19，最优选为13～17。脂肪族烃基包括烷基、烯基、炔基等，优选包括烷基或烯基。作为碳原子数1～40的脂肪族烃·BR>F基，具体地可举出：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基、四十烷基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十碳六烯基、异硬脂基、1-己基庚基、1-己基壬基、1-辛基壬基、1-辛基十一烷基、1-癸基十一烷基等。碳原子数1～40的脂肪族烃基优选十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基，特别优选十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基。
在本发明的一个实施方式中，R3a和R3b表示的碳原子数1～40(优选碳原子数12～22)的脂肪族烃基来自脂肪酸。在该情况下，来自脂肪酸的羰基碳包含于式(1)中的-CO-O-中。作为脂肪族烃基的具体例，在使用亚油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳二烯基，在使用油酸作为脂肪酸的情况下，为十七碳烯基。
R3a和R3b中的具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基是指烷基链中具有至少1个环丙烷环的碳原子数3～40的烷基。烷基的碳原子数3～40不包括环丙烷环的碳原子数。该烷基所具有的环丙烷环数优选为1个。R3a和R3b中的具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基优选式(5)表示的基团。
[化10]
(式(5)中，b和c各自独立地为整数，b和c的总和为2～39。)
优选b为1～20的整数，c为1～19的整数。b更优选为2～18的整数，进一步优选为3～17的整数，更进一步优选为4～12的整数。c更优选为3～15的整数，进一步优选为3～11的整数，更进一步优选为3～9的整数。作为式(5)表示的基团，例如可举出：7-(2-辛基环丙基)庚基等。
在式(4)中，R9表示的碳原子数2～20的脂肪族烃基可以为直链状，也可以具有支链。该脂肪族烃基可以是饱和的，也可以是不饱和的。在不饱和脂肪族烃基的情况下，该脂肪族烃基中包含的不饱和键数通常为1～6个，优选为1～3个，更优选为1～2个。不饱和键包括碳-碳双键和碳-碳三键，优选碳-碳双键。该脂肪族烃基中包含的碳原子数优选为8～20，更优选为9～19，进一步优选为13～19，最优选为13～17。脂肪族烃基包括烷基、烯基、炔基等，优选包括烷基或烯基，更优选烷基。作为碳原子数2～20的脂肪族烃基，具体地可举出：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、异硬脂基、1-己基庚基、1-乙基壬基、1-丁基壬基、1-己基壬基、1-辛基壬基、1-辛基十一烷基、3-辛基十一烷基等。碳原子数2～20的脂肪族烃基优选十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基，特别优选十三烷基、十七烷基、十七碳烯基、十七碳二烯基。
在式(4)中，a优选为3～9的整数，更优选为3～7的整数，进一步优选为5～7的整数，最优选为5或7。
R3a可以与R3b相同也可以不同，优选R3a是与R3b相同的基团。
在本发明的一个实施方式中，R1a与R1b相同，Xa与Xb相同，R2a与R2b相同，Ya与Yb相同，Za与Zb相同，R3a与R3b相同。
作为式(1)表示的离子性脂质的优选例，可举出以下的离子性脂质。
[离子性脂质(1-1)]
离子性脂质(1)，其中，
R1a和R1b各自独立地为碳原子数1～6的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)；
Xa和Xb各自独立地为碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基(例如-N(CH3)-)，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基(例如亚哌啶基)；
R2a和R2b各自独立地为碳原子数8以下的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基)；
Ya和Yb各自独立地为酯键或酰胺键；
Za和Zb各自独立地为由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团(例如-C6H4-CH2-、-CH2-C6H4-CH2-)；
na和nb各自独立地为0或1；
R3a和R3b各自独立地为来自具有羟基的脂溶性维生素(例如生育酚)与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基，或碳原子数12～22的脂肪族烃基(例如十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基)。
[离子性脂质(1-2)]
离子性脂质(1)，其中，
R1a和R1b各自独立地为碳原子数1～4的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基)；
Xa和Xb各自独立地为碳原子数为1～3且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基(例如-N(CH3)-)，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1的环状亚烷基叔氨基(例如亚哌啶基)；
R2a和R2b各自独立地为碳原子数6以下的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基)；
Ya和Yb各自独立地为酯键或酰胺键；
Za和Zb各自独立地为由碳原子数为6～12且具有1个芳香环且可具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团(例如-C6H4-CH2-、-CH2-C6H4-CH2-)；
na和nb各自独立地为0或1；
R3a和R3b各自独立地为来自具有羟基的脂溶性维生素(例如生育酚)与琥珀酸酐的反应物的残基，或碳原子数13～19的脂肪族烃基(例如十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基)。
[离子性脂质(1-3)]
离子性脂质(1)，其中，
R1a和R1b各自独立地为碳原子数1～2的亚烷基(即亚甲基或亚乙基)；
Xa和Xb各自独立地为X1或X2，
[化11]
(式中，R5为碳原子数1～3的烷基(例如甲基)。)
[化12]
(式中，p为1或2。)
R2a和R2b各自独立地为碳原子数4以下的亚烷基(例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基)；
Ya和Yb各自独立地为酯键或酰胺键；
Za和Zb各自独立地为Z1，
[化13]
(式中，s为0～1的整数，t为0～2的整数，u为0～2的整数(优选为0)，u个R4各自独立地表示取代基。)；
na和nb各自独立地为0或1；
R3a和R3b各自独立地为来自具有羟基的脂溶性维生素(例如生育酚)与琥珀酸酐的反应物的残基，或碳原子数13～17的脂肪族烃基(例如十七碳烯基、十七碳二烯基、1-己基壬基)。
作为离子性脂质(1)的具体例，可举出：以下的O-Ph-P3C1、O-Ph-P4C1、O-Ph-P4C2、O-Bn-P4C2、E-Ph-P4C2、L-Ph-P4C2、HD-Ph-P4C2、O-Ph-酰胺-P4C2、O-Ph-C3M、TS-P4C2。
此外，作为离子性脂质(1)的具体例，可举出：WO 2021/195529 A2中记载的脂质1至脂质20，特别地可举出：以下的脂质1、脂质5、脂质8。
[表1-1]
[表1-2]
[表1-3]
在离子性脂质(1)的具体例中，优选为SS-OP。即，离子性脂质(1)优选为下述式表示的离子性脂质。
[化14]
从核酸的包封效率、细胞内核酸的释放效率以及脂质纳米粒子的稳定性的观点出发，相对于离子性脂质(1)、磷脂和胆固醇的总和，本发明的脂质纳米粒子中的离子性脂质(1)的量优选为20～60mol％，更优选为25～55mol％，进一步优选为30～50mol％。
离子性脂质(1)可通过公知的方法(例如WO 2019/188867 A1、US 9708628 B2、WO2021/195529A2中记载的方法)进行制造。
磷脂
对于本发明的脂质纳米粒子而言，作为磷脂，含有酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基为烯酰基的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC)。此外，磷脂可以使用仅1种该(PC)，还可以将该(PC)与其他磷脂合用。另外，此时其他磷脂相对于该(PC)的比率只要在可表现本发明效果的范围内就没有特别限定。
作为酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基具有烯酰基的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的具体例，可举出：
1-花生酰基-2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(AEiPC)、
1-二十碳烯酰基-2-花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(EiAPC)、
1,2-二(二十碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEiPC)、
1-山嵛酰基-2-芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(BEPC)、
1-芥酰基-2-山嵛酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(EBPC)、
1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DEPC)、
1-二十四碳酰基-2-神经酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(LiNPC)、
1-神经酰基-2-二十四碳酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(NLiPC)、
1,2-二神经酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DNPC)。另外，本说明书中，磷脂存在以其简称进行记载的情况。例如，存在将1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱记载为PC，将1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱记载为DEPC的情况。此外，还存在使用脂肪酸的碳原子数和不饱和度，例如将1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱记载为C22：1PC的情况。
对于磷脂而言，优选酰基的碳原子数为20以上且在至少1侧的酰基上具有1个不饱和键的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，更优选酰基的碳原子数为20以上且在两个酰基上分别具有1个不饱和键的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，进一步地更优选为由DEiPC、DEPC和DNPC构成的群中选择的至少1种，最优选为DEPC。这些磷脂为类似的酰基链结构，因此可发挥相同的效果。酰基的碳原子数为包含羰基碳的碳原子数。酰基的碳原子数优选为20～26，更优选为20～24。
从核酸的包封效率、细胞内核酸的释放效率以及脂质纳米粒子的稳定性的观点出发，相对于离子性脂质(1)、磷脂和胆固醇的总和，本发明的脂质纳米粒子中的磷脂的量优选为5～20mol％，更优选为10～20mol％，进一步优选为10～15mol％。
胆固醇
本发明的脂质纳米粒子包含胆固醇。从核酸的包封效率、细胞内核酸的释放效率以及脂质纳米粒子的稳定性的观点出发，相对于离子性脂质(1)、磷脂和胆固醇的总和，本发明的脂质纳米粒子中的胆固醇的量优选为30～70mol％，更优选为35～65mol％，进一步优选为40～60mol％。
二肉豆蔻酰甘油PEG
本发明的脂质纳米粒子包含式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG(本说明书中存在简称为“二肉豆蔻酰甘油PEG(2)”的情况)。
CH2(OR6)-CH(OR7)-CH2(OR8)(2)
(式(2)中，
R6、R7和R8的任意2个表示肉豆蔻酰基，剩余1个表示经由数均分子量1,000～3,000的聚乙二醇(PEG)链连接的碳原子数1～6的烷基。)
式(2)中的PEG链的数均分子量为1,000～3,000，优选为1,500～2,500。为了形成该PEG链而使用的PEG的数均分子量可通过凝胶浸透色谱法(GPC)进行测定。
碳原子数1～6的烷基可以是直链状，也可以是支链状，还可以是环状。该烷基的碳原子数优选为1～3。作为碳原子数1～6的烷基，具体地可举出：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等。优选为甲基。
从核酸的包封效率、细胞内核酸的释放效率以及脂质纳米粒子的稳定性的观点出发，相对于离子性脂质(1)、磷脂和胆固醇的总和，本发明的脂质纳米粒子中的二肉豆蔻酰甘油PEG(2)的量优选为0.25～2mol％，更优选为0.5～1.5mol％，进一步优选为0.5～1.0mol％。
最佳组成
本发明的脂质纳米粒子中的离子性脂质(1)：磷脂：胆固醇：二肉豆蔻酰甘油PEG(2)的最佳摩尔比为40：10：50：0.75。
脂质纳米粒子的制造方法
本发明的脂质纳米粒子可通过将包含离子性脂质(1)、磷脂、胆固醇以及二肉豆蔻酰甘油PEG(2)的脂质原料分散于适当的分散介质(例如水性分散介质、醇性分散介质)中，根据需要进行诱导组装的操作而制造。
作为用于制造本发明的脂质纳米粒子的“诱导组装的操作”，例如可举出：使用微流体或涡流(vortex)的乙醇稀释法、简单水合法、超声波处理、加热、涡流、乙醚注入法、法式压(French Press)法、胆酸法、Ca2+融合法、冷冻-溶解法、逆相蒸发法等自身公知的方法，优选为使用微流体或涡流的乙醇稀释法，进一步优选为使用微流体的乙醇稀释法。在使用微流体的乙醇稀释法中，例如可通过使用NanoAssemblr(注册商标)(PrecisionNanoSystems公司)将含有核酸的酸性缓冲液与脂质的乙醇溶液进行混合，制造含有脂质纳米粒子的分散液。根据该方法制造的分散液含有脂质纳米粒子和分散介质(酸性缓冲液和乙醇)，可通过超滤、透析、稀释等操作进行分散介质(特别是乙醇)的去除、分散介质(特别是缓冲液)的交换等。
向外周血单个核细胞递送核酸的方法
本发明还提供一种向外周血单个核细胞递送核酸的方法，其包括使包封有核酸的本发明的脂质纳米粒子与对象外周血单个核细胞相接触。在该方法中，优选将包封有核酸的脂质纳米粒子转染至对象细胞。
作为核酸，例如可举出：DNA、RNA、RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂交链等，但不限于这些。此外，核酸可以使用1～3条链的任意数量，优选为1条链或2条链。核酸例如还可以为具有嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的核苷酸、具有非核苷酸骨架的寡聚体(例如市售的多肽核酸(PNA)等)或具有特殊键合的寡聚体(其中，该寡聚体含有具有允许如DNA、RNA中所见的碱基配对、碱基粘附的配置的核苷酸)等。
进一步地，核酸例如还可以为：加成了公知修饰的核酸、具有在该领域内已知的标记的核酸、封端(加帽)核酸、甲基化核酸、使用类似物将1个以上的天然核苷酸取代的核酸、核苷酸被修饰的核酸、具有非电荷键(例如甲磺酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸、具有带电荷键或含硫键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸、例如具有蛋白质(例如核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽、多聚-L-赖氨酸等)或糖(例如单糖等)等侧链基的核酸、含有嵌入化合物(例如吖啶、补骨脂素等)的核酸、含有螯合化合物(例如金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性金属等)的核酸、含有烷基化剂的核酸、具有被修饰键的核酸(例如α异构体型的核酸等)等。
可在本发明中使用的DNA的种类没有特别限制，可以根据使用目的进行适当选择。作为DNA，例如可举出：质粒DNA、cDNA、反义链DNA、染色体DNA、PAC、BAC、CpG oligo等，优选为质粒DNA、cDNA、反义链DNA，更优选为质粒DNA。质粒DNA等环状DNA可适当地被限制酶等消化，作为线形DNA使用。
可在本发明中使用的RNA的种类没有特别限制，可以根据使用目的进行适当选择。作为RNA，例如可举出：siRNA、miRNA、shRNA、反义链RNA、信使RNA(mRNA)、单链RNA基因组、双链RNA基因组、RNA复制子、转运RNA、核糖体RNA等，优选为siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反义链RNA、RNA复制子。
本发明中使用的核酸优选通过本领域技术人员通常使用的方法进行精制。
本发明中使用的核酸为用于在体外/离体(in vitro/ex vivo)的基因导入的核酸，具体为用于向CAR-T疗法等中使用的从生物体内取出的初代细胞导入基因的核酸。更具体地，本发明的核酸优选为对某种特定疾病的患者具有预防和/或治疗活性的核酸(所谓的用于预防/治疗的核酸)。作为那样的核酸，例如可举出用于所谓的基因治疗、细胞疗法的核酸等。
作为用于细胞疗法的核酸，例如可举出编码嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)的核酸等。
用于细胞疗法的编码CAR的核酸包括可特异性识别靶向免疫细胞应识别的表面抗原的抗体的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域以及细胞内T细胞信号转导结构域。
用于细胞疗法的编码TCR的核酸为编码可特异性识别靶向T细胞应识别的表面抗原的TCR的α链和β链的核酸。
作为编码CAR、TCR的核酸种类，例如可举出：DNA、RNA、RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂交链等，但不限定于这些。
包封有核酸的脂质纳米粒子的粒径没有特别限制，优选为10nm～500nm，更优选为30nm～300nm。粒径的测定例如可以使用ZetasizerNano(Malvern公司)等粒度分布测定装置来进行。包封有核酸的脂质纳米粒子的粒径可通过其制造方法进行适当调整。
包封有核酸的脂质纳米粒子的表面电位(ZETA电位)没有特别限制，优选为-15～+15mV、进一步优选为-10～+10mV。在以往的基因导入中，主要使用表面带正电的粒子。这将促进与带负电的细胞表面的硫酸乙酰肝素的静电相互作用，作为用于促进向细胞导入的方法有用。然而，存在因正的表面电位而导致(a)抑制基于细胞内与递送核酸的相互作用的核酸自载体的释放、(b)抑制基于mRNA与递送核酸的相互作用合成蛋白质的可能性。通过将表面电位(ZETA电位)调整至上述范围内，可解决该问题。表面电位(ZETA电位)的测定例如可以使用ZetasizerNano等ZETA电位测定装置来进行。脂质纳米粒子的表面电位(ZETA电位)可根据脂质纳米粒子的构成成分的组成进行调整。
通过使包封有核酸的本发明的脂质纳米粒子与外周血单个核细胞相接触，该脂质纳米粒子被导入外周血单个核细胞，包封于该脂质纳米粒子的核酸被递送至外周血单个核细胞。外周血单个核细胞为从外周血分离的单个核细胞的总称，作为导入该脂质纳米粒子的外周血单个核细胞只要为外周血中包含的单个核细胞就没有特别限定，例如可举出：T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核白血球等。作为对象细胞的生物群也没有特别限定，例如可举出：哺乳类(例如人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)、鸟类(例如鸡、鸵鸟等)、两栖类(例如蛙等)、鱼类(例如斑马鱼、鳉鱼(killifish)等)等的细胞。导入该脂质纳米粒子的对象优选为人或其他哺乳类的细胞。
作为向对象细胞内导入包封有核酸的脂质纳米粒子的方法，只要该脂质纳米粒子可将核酸递送至该细胞内就没有特别限定，可以适当选择自身公知的方法(例如转染、反向转染等)。作为使用本发明的脂质纳米粒子向对象细胞内导入核酸的方法，优选为转染。该脂质纳米粒子的用量可考虑对象细胞的种类、导入方法等进行适当选择。
在体外/离体(in vitro/ex vivo)使包封有核酸的脂质纳米粒子与外周血单个核细胞相接触的工序在以下进行具体的说明。
将外周血单个核细胞在与该脂质纳米粒子接触的数日前悬浮于适当的培养基，在适当的条件下进行培养。在培养时，可以添加活化因子(例如在T细胞的情况时，为抗CD3抗体/抗CD28抗体等)、生长因子(例如IL-2等)，也可以不添加。在与脂质纳米粒子接触时，细胞可以在增殖期，也可以不在。
进行该接触时的培养液可以为含有血清的培养基，也可以为不含有血清的培养基，培养基中的血清浓度优选为30重量％以下，更优选为20重量％以下。培养基中含有过量的血清等蛋白质时，存在阻碍该脂质纳米粒子与细胞接触的可能性。
进行该接触时的细胞密度没有特别限定，可考虑外周血单个核细胞的种类等进行适当设定，通常在1×104～1×107细胞/mL的范围。
向如此配制的细胞中，例如添加包封有上述核酸的脂质纳米粒子的悬浮液。该悬浮液的添加量没有特别限定，可考虑细胞数等进行适当设定。对于与细胞接触时的脂质纳米粒子的浓度而言，只要能够实现目的核酸向细胞内的导入，就没有特别限定，作为脂质浓度，通常为1～300nmol/mL，优选为10～200nmol/mL，作为核酸的浓度，通常为0.01～100μg/mL，优选为0.05～10μg/mL。
向上述悬浮液添加外周血单个核细胞后，培养该细胞。考虑外周血单个核细胞的种类适当设定培养时的温度、湿度、CO2浓度等。细胞为源自哺乳动物的细胞时，通常温度为约37℃，湿度为约95％，CO2浓度为约5％。此外，培养时间也可考虑使用的外周血单个核细胞的种类等条件进行适当设定，通常在0.1～120小时的范围，优选为0.2～96小时的范围，更优选为0.5～72小时的范围。上述培养时间过短时，核酸无法充分地导入至细胞内，培养时间过长时，存在细胞变弱的情况。
通过上述的培养，核酸向外周血单个核细胞内导入，但优选将培养基更换为新鲜的培养基，或者向培养基添加新鲜的培养基进一步继续培养。细胞为源自哺乳动物的细胞的情况时，新鲜的培养基优选含有血清或营养因子。
本发明的脂质纳米粒子可以直接或混合药学上可接受的载体而制造。
作为药学上可接受的载体，可使用常用的制剂材料，例如可使用赋形剂、滑剂、溶剂、增溶剂、悬浮剂、渗透剂、缓冲剂等。此外根据需要，还可以使用防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂等制剂添加物。
[实施例]
以下针对本发明的实施例进一步地详细说明，但本发明不受任何以下实施例的限定。
在以下的实施例等中，以上述表中记载的名称表示离子性脂质(1)。此外，在以下的实施例等中使用的简称的含义分别如下所示。
Chol：胆固醇
DEPC：1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱
DOPC：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
POPC：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
POPE：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺
DiD：1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二碳菁，4-氯苯磺酸盐
DMG-PEG2000：1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG的数均分子量(Mn)：2000)
MES：2-吗啉乙磺酸
PBS：磷酸缓冲生理盐水
DDW：脱离子蒸馏水
脂质组成的mol％以相对于离子性脂质(1)、磷脂和胆固醇的总和的mol％表示。
[制造例1]封入mRNA的LNP的配制
(1)脂质的乙醇溶液的配制
通过将10mM的SS-OP、5mM的磷脂、10mM的Chol混合至800nmol，添加1mM的DMG-PEG2000的乙醇溶液达到目的比例，添加乙醇至总量为360μL，配制脂质的乙醇溶液。
(2)核酸的酸性缓冲溶液的配制
对于核酸的酸性缓冲溶液而言，将编码荧光素酶基因的mRNA混合于含有30mM的NaCl的20mM的酸性苹果酸缓冲液(pH3.0)至其浓度为0.0067μg/μL。
(3)通过乙醇稀释法配制LNP
使用NanoAssmblr(注册商标)超高速纳米药品制作装置(Precision NanoSystems制造)，将1000μL的核酸酸性缓冲溶液与360μL的脂质的乙醇溶液分别以3mL/min和1mL/min的流速进行混合，制得0.8mL的LNP溶液。使用3mL的20mM的MES缓冲液(pH6.5)将所得的LNP稀释，转移至Amicon Ultra 4(Millipore公司)。在离心条件(25℃，1000g，约10分钟)下，将转移的LNP溶液进行超滤，浓缩至约500μL。使用PBS将所得的浓缩物稀释至4mL，再次在离心条件(25℃，1000g，约10分钟)下，进行超滤，浓缩至约250μL。最后使用PBS将核酸浓度调整至10μg/mL。
[试验例1]各种封入mRNA的LNP的脂质组成
按照制造例1中记载的方法，配制下述表2所示脂质组成的封入mRNA的LNP。
[表2]
| 脂质组成 | |
| 实施例1 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝50/15/35/0.75 |
| 实施例2 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝50/15/35/0.75+DiD 0.2 |
| 实施例3 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝60/5/35/0.75 |
| 实施例4 | SS-0P/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝55/10/35/0.75 |
| 实施例5 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝45/20/35/0.75 |
| 实施例6 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝40/10/50/0.75 |
| 实施例7 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝35/15/50/0.75 |
| 实施例8 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝30/20/50/0.75 |
| 实施例9 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝60/10/30/0.75 |
| 实施例10 | SS～OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝50/10/40/0.75 |
| 实施例11 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝45/15/40/0.75 |
| 实施例12 | SS-OP/DEPC/chol/DMG-PEG2000＝30/10/60/0.75 |
| 实施例13 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝25/15/60/0.75 |
| 实施例14 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝20/10/70/0.75 |
| 实施例15 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG～PEG2000＝40/10/50/0.5 |
| 实施例16 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝40/10/50/1 |
| 实施例17 | SS…0P/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝40/10/50/1.25 |
| 实施例18 | SS-OP/DEPC/Chol/DMG-PEG2000＝40/10/50/1.5 |
| 比较例1 | SS-OP/POPC/Chol/DMG-PEG2000＝50/15/35/0.75 |
| 比较例2 | SS-0P/POPE/Chol/DMG-PEG2000＝50/15/35/0.75 |
| 比较例3 | SS-OP/POPC/Chol/DMG-PEG2000＝50/15/35/0.75+DiD 0.2 |
| 比较例4 | SS-OP/POPE/Chol/DMG-PEG2000＝50/15/35/0.75+DiD 0.2 |
| 比较例5 | SS-0P/DOPC/Chol/DMG-PEG2000＝50/15/35/0.75 |
| 比较例6 | SS-OP/POPE/Chol/DMG-PEG2000＝40/10/50/0.75 |
(表中，组成比以mol％表示)
[试验例2]小鼠初代T细胞中的基因表达活性评价
(1)小鼠初代T细胞的分离
切开C57BL/6JJcl小鼠(日本SLC公司)的腹腔，摘取脾脏后，在PBS上相互摩擦载玻片将脾脏破碎，分离出脾脏细胞。将细胞悬浮液通过100μm滤膜(MACS SmartStrainers(100μm)；Miltenyi Biotec公司)和30μm滤膜(MACS SmartStrainers(30μm)；Miltenyi Biotec公司)在离心条件(4℃，400g，3分钟)下制成细胞团块。去除上清液，使用90μL的MACS缓冲液(0.5％BSA、2mM EDTA溶于PBS)将细胞悬浮，通过添加10μL的CD90.2微珠(Miltenyi Biotec公司)后轻敲混合细胞，在冰上静置15分钟。之后，添加5mL MACS缓冲液在离心条件(4℃，400g，3分钟)下制成细胞团块。去除上清液，使用500μL的脱气MACS缓冲液将细胞悬浮。向与磁铁接触的色谱柱(MS Columns；Miltenyi Biotec公司)通入500μL的脱气MACS缓冲液，静置至无液体滴落，向色谱柱添加使用脱气MACS缓冲液悬浮的细胞悬浮液后静置。向其中通入500μL的脱气MACS缓冲液后静置，进一步地重复该过程2次。从磁铁中取出色谱柱，添加1mL的脱气MACS缓冲液，通过使用活塞挤出悬浮液，回收小鼠初代T细胞。在离心条件(4℃，400g，3分钟)下制成细胞团块，在去除上清液后，使用1mL的RPMI1640(10％FBS、1mM丙酮酸、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、4.5g/L葡萄糖、55μM的2-巯基乙醇、非必需氨基酸)将细胞悬浮。
(2)小鼠初代T细胞的培养
向6孔培养板(ThermoFisher)中添加2mL的PBS，分别添加抗CD3抗体(Ultra-LEAFTM纯化的抗小鼠CD3ε抗体；BioLegend公司)、抗CD28抗体(Ultra-LEAFTM纯化的抗小鼠CD28抗体；BioLegend公司)至10μg/mL、0.5μg/mL的浓度，静置3小时。之后，去除上清液，添加2mL的PBS。再次重复相同操作，去除上清液后以1.5×106cells/mL的浓度将2mL的在(1)中分离的小鼠初代T细胞种板，添加50U/mL的IL-2(IL-2，人，重组；PeproTech公司)。72小时后，添加2mL含有50U/mL的IL-2的培养基。进一步地，在48小时后，回收细胞用于各种实验。
(3)基因表达活性的测定
向培养的小鼠初代T细胞转染实施例1、比较例1和比较例2的LNP直至核酸量达到0.4μg。进一步地，添加D-荧光素钾盐水溶液(使用DDW配制)至荧光素的最终浓度为0.1mM。使用孵育型光度计(Kronos Dio；ATTO公司)进行转染后，进行100小时的发光测定，通过AUC计算得出总发光量作为基因表达量。结果如图1所示。在磷脂中使用DEPC的实施例1的LNP相对于比较例1和2，其小鼠初代T细胞中的基因表达活性提升。
[试验例3]向小鼠初代T细胞的LNP导入评价
(1)荧光标记化LNP的配制
向制造例1中记载的脂质乙醇溶液中添加DiD的乙醇溶液至相对于总脂质量达0.2mol％的浓度，配制加入了荧光色素的脂质乙醇溶液。通过使用该脂质乙醇溶液，按照制造例1中记载的步骤配制LNP，制得荧光标记化LNP。
(2)向小鼠初代T细胞的LNP导入评价
向培养的小鼠初代T细胞转染实施例2、比较例3和比较例4的LNP，回收24，48，72小时后的细胞。之后，使用流式细胞仪评价LNP的导入量。结果如图2所示。相对于比较例3和4的组成的LNP，使用DEPC的实施例2的组成的LNP在所有的时间点中，向初代T细胞的导入量均增加。
[试验例4]磷脂组成比对小鼠初代T细胞中的基因表达活性效果的影响
向培养的小鼠初代T细胞转染制造例1中配制的实施例1和3～8、比较例1的LNP直至核酸量达到0.4μg。进一步地，添加D-荧光素钾盐水溶液至荧光素的最终浓度为0.1mM。使用孵育型光度计(Kronos Dio；ATTO公司)进行转染后，进行100小时的发光测定，通过AUC计算得出总发光量作为基因表达量。结果如图3所示。使用10或15mol％DEPC的实施例6或7的组成表现出高基因表达活性。
[试验例5]胆固醇组成比对小鼠初代T细胞中的基因表达活性效果的影响
向培养的小鼠初代T细胞转染制造例1中配制的实施例6、7、9～14、比较例1的LNP直至核酸量达到0.4μg。进一步地，添加D-荧光素钾盐水溶液至荧光素的最终浓度为0.1mM。使用孵育型光度计(Kronos Dio；ATTO公司)进行转染后，进行100小时的发光测定，通过AUC计算得出总发光量作为基因表达量。结果如图4所示。使用50mol％胆固醇的实施例6的组成表现出最高的基因表达活性。
[试验例6]DMG-PEG2000组成比对小鼠初代T细胞中的基因表达活性效果的影响
向培养的小鼠初代T细胞转染制造例1中配制的实施例6、15～18、比较例1的LNP直至核酸量达到0.4μg。进一步地，添加D-荧光素钾盐水溶液至荧光素的最终浓度为0.1mM。使用孵育型光度计(Kronos Dio；ATTO公司)进行转染后，进行100小时的发光测定，通过AUC计算得出总发光量作为基因表达量。结果如图5所示。使用0.75mol％的DMG-PEG2000的实施例6的组成表现出最高的基因表达活性。
[试验例7]人初代T细胞中的基因表达活性评价
(1)人初代T细胞的培养
在37℃下，融解人外周血CD3+Pan T细胞(购入自Lonza公司)。在添加9mL的RPMI1640(10％FBS、1mM丙酮酸、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、4.5g/L葡萄糖、55μM 2-巯基乙醇、非必需氨基酸)后，在离心条件(4℃，300g，10分钟)下离心。去除上清液，使用10mL的培养基将其悬浮，以1×106cells/mL的浓度种板于12孔培养板(ThermoFisher)。添加Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Thermo Fisher公司)直至磁珠：T细胞比＝1：2，添加30U/mL的IL-2(PeproTech公司)。72小时后，细胞浓度裂解(split)至减半，进一步地在24小时后，添加1mL的含有30U/mL的IL-2的培养基。72小时后回收细胞去除Dynabeads，以2×105cells/mL进行细胞种板用于实验。
(2)基因表达活性的测定
向培养的人初代T细胞转染制造例1中配制的实施例6、比较例5和比较例6的LNP直至核酸量达到0.4μg。进一步地，添加D-荧光素钾盐水溶液至荧光素的最终浓度为0.1mM。使用孵育型光度计(Kronos Dio；ATTO公司)进行转染后，进行40小时的发光测定，通过AUC计算得出总发光量作为基因表达量。结果如图6所示。同样在人初代T细胞中，相对于比较例5和比较例6，使用DEPC的实施例6组成的LNP表现出高基因表达活性。
工业上的可利用性
本发明的脂质纳米粒子可用于向外周血单个核细胞递送核酸。
本申请以日本申请的特愿2022-051919为基础，其内容全部包含于本说明书。
Claims (6)
1.一种用于将核酸递送至外周血单个核细胞的脂质纳米粒子，其特征在于，包含式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇以及式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG；
所述磷脂为酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基为烯酰基的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；
式(1)中，
R1a和R1b各自独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，
Xa和Xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基的数量为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基的数量为1～2的环状亚烷基叔氨基，
R2a和R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
Ya和Yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
Za和Zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且具有或不具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，
na和nb各自独立地为0或1，
R3a和R3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、碳原子数1～40的脂肪族烃基、具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基，或式(4)表示的基团；
R9-O-CO-(CH2)a-(4)
式(4)中，
R9表示碳原子数2～20的脂肪族烃基，
a表示2～10的整数；
CH2(OR6)-CH(OR7)-CH2(OR8)(2)
式(2)中，
R6、R7和R8的任意2个表示肉豆蔻酰基，剩余1个表示经由数均分子量1,000～3,000的聚乙二醇链连接的碳原子数1～6的烷基。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，所述磷脂为由1,2-二(二十碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱DEiPC、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱DEPC以及1,2-二神经酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱DNPC构成的群中选择的至少1种。
3.根据权利要求1或2所述的脂质纳米粒子，式(1)表示的离子性脂质为下述式表示的离子性脂质，
4.根据权利要求1～3中任一项所述的脂质纳米粒子，相对于所述离子性脂质、所述磷脂以及所述胆固醇的总和，所述离子性脂质为20～60mol％，所述磷脂为5～20mol％，所述胆固醇为30～70mol％，二肉豆蔻酰甘油PEG脂质为0.5～1.5mol％。
5.一种向外周血单个核细胞递送核酸的方法，其特征在于，包括使包封有核酸的权利要求1～4中任一项所述的脂质纳米粒子与外周血单个核细胞相接触。
6.脂质纳米粒子在制造用于向外周血单个核细胞递送核酸的药品中的使用，所述脂质纳米粒子包含式(1)表示的离子性脂质、磷脂、胆固醇以及式(2)表示的二肉豆蔻酰甘油PEG；
所述磷脂为酰基的碳原子数为20以上且至少1侧的酰基为烯酰基的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；
式(1)中，
R1a和R1b各自独立地表示碳原子数1～6的亚烷基，
Xa和Xb各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基的数量为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基的数量为1～2的环状亚烷基叔氨基，
R2a和R2b各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，
Ya和Yb各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，
Za和Zb各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且具有或不具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，
na和nb各自独立地为0或1，
R3a和R3b各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、碳原子数1～40的脂肪族烃基、具有环丙烷环的碳原子数3～40的烷基，或式(4)表示的基团；
R9-O-CO-(CH2)a-(4)
式(4)中，
R9表示碳原子数2～20的脂肪族烃基，
a表示2～10的整数；
CH2(OR6)-CH(OR7)-CH2(OR8)(2)
式(2)中，
R6、R7和R8的任意2个表示肉豆蔻酰基，剩余1个表示经由数均分子量1,000～3,000的聚乙二醇链连接的碳原子数1～6的烷基。
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