KR20210020030A - A형 혈우병의 치료 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 (i) 인자 VIII(FVIII) 단백질 및 (ii) 폰빌레브란트 인자(VWF)의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서의 A형 혈우병의 치료 방법을 제공한다.
Description
우선권 출원에 대한 언급
본 출원은 2018년 5월 18일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/673,670호, 2018년 7월 31일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/712,880호, 2018년 11월 30일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/773,785호; 및 2019년 2월 5일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/801,576호에 대한 우선권의 유익을 주장하며, 이들 기초출원 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급
ASCII 텍스트 파일(파일명: SA9-461PC_SeqListing.txt; 용량: 922 킬로바이트; 생성일: 2019년 5월 14일)로 전자적으로 제출된 서열목록의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
A형 혈우병은 응고인자 VIII(FVIII)을 암호화하는 유전자의 결함에 의해 야기되는 출혈 장애이며, 10,000명의 남아 출생 중 1 내지 2명에 영향을 미친다. 문헌[Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005)]. A형 혈우병을 앓고 있는 환자는 정제되거나 또는 재조합적으로 생산된 FVIII의 주입에 의해 치료될 수 있다. 환자에 대한 빈번한 정맥내 투여를 필요로 하는 다수의 상업적으로 입수 가능한 FVIII 제품은 약 8 내지 12시간의 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다. 문헌[Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001]; 문헌[Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008)] 참조. 게다가, FVIII 반감기를 연장시키기 위한 다수의 접근이 시도되었다. 예를 들어, 응고 인자의 반감기를 연장시키기 위한 개발 중인 접근은 페길화(pegylation), 글리코페길화 및 알부민과의 접합을 포함한다. 문헌[Dumont et al., Blood. 119(13): 3024-3030 (2012)] 참조. 인간에서 일관된 결과가 입증되었고, 예를 들어, rFVIIIFc는 A형 혈우병 환자에서 애드베이트(ADVATE)®에 비해 반감기를 최대 ~1.7배까지 개선시키는 것으로 보고되었다. 문헌[Powell et al., Blood. 119(13): 3031-3037 (2012)] 참조. 따라서, 반감기 증가는, 약간의 개선에도 불구하고, 다른 반감기 제한 인자의 존재를 나타낸다. 문헌[Liu, T. et al., 2007 ISTH meeting, abstract #P-M-035]; 문헌[Henrik, A. et al., 2011 ISTH meeting, abstract #P=MO-181]; 문헌[Liu, T. et al., 2011 ISTH meeting abstract #P-WE-131] 참조.
현재 권장되는 치료 표준은 출혈 에피소드 수를 최소화하기 위해 FVIII의 정기적 투여(일상적 예방)를 수반한다. 일상적 예방은 장기간 결과의 개선과 연관되었지만, 빈번한 정맥내(IV) 투여에 대한 필요에 의해 제한되는 요구 요법(demanding regimen)이다. 문헌[Manco-Johnson et al., N Engl J Med. 357(6):535-44 (2007)] 참조. 반감기가 연장된 FVIII 제품은 예방을 위한 FVIII 투여 빈도를 감소시켰지만; 모두 폰빌레브란트 인자(von Willebrand factor: VWF)와 상호작용하며, 비슷한 순환 반감기를 갖는데, 이는 내인성 VWF의 반감기로 인한 rFVIII 변이체의 반감기에 대한 상한과 일치된다. 예를 들어, 문헌[Pipe et al., Blood. 128(16):2007-16 (2016)] 참조. 이들 FVIII 제품에 대한 예방적 투약은 3 내지 5일마다 1회이다.
덜 빈번한 투여를 초래하는 보다 장기간의 시간 동안 출혈 에피소드를 예방하고 제어하는 차세대 연장 반감기 FVIII 제품은 요구되는 예방적 요법에 대한 지속 이행(adherence) 문제를 잠재적으로 처리하며, 이는 결국 혈우병 환자의 삶의 질을 개선시킬 수 있었다.
본 개시내용의 특정 양상은 (i) 인자 VIII(FVIII) 단백질 및 (ii) 폰빌레브란트 인자(von Willebrand factor: VWF)의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서의 A형 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일마다 1회이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량은 적어도 2회 용량, 적어도 3회 용량, 적어도 4회 용량, 적어도 5회 용량, 적어도 6회 용량, 적어도 7회 용량, 적어도 8회 용량, 적어도 9회 용량, 적어도 10회 용량, 적어도 11회 용량, 적어도 12회 용량, 적어도 13회 용량, 적어도 14회 용량, 적어도 15회 용량, 적어도 16회 용량, 적어도 17회 용량, 적어도 18회 용량, 적어도 19회 용량, 적어도 20회 용량 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드의 발생률 또는 빈도를 제어하거나 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드를 예방하거나 치료하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 95 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 90 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 85 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 60 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 55 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 50 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 45 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 40 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 35 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 30 IU/㎏, 또는 약 20 IU/㎏ 내지 약 25 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 25 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 30 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 35 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 40 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 45 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 55 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 70 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 75 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 80 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 85 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 또는 약 90 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 25 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 약 30 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏, 약 35 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏, 약 40 IU/㎏ 내지 약 60 IU/㎏, 또는 약 45 IU/㎏ 내지 약 55 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏, 약 25 IU/㎏, 약 30 IU/㎏, 약 35 IU/㎏, 약 40 IU/㎏, 약 45 IU/㎏, 약 50 IU/㎏, 약 55 IU/㎏, 약 60 IU/㎏, 약 65 IU/㎏, 약 70 IU/㎏, 약 75 IU/㎏, 약 80 IU/㎏, 약 85 IU/㎏, 약 90 IU/㎏, 약 95 IU/㎏, 또는 약 100 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일, 적어도 약 22일, 적어도 약 23일, 적어도 약 24일, 적어도 약 25일, 적어도 약 26일, 적어도 약 27일, 적어도 약 28일, 적어도 약 29일, 적어도 약 30일 또는 적어도 약 31일이다.
일부 실시형태에서, 투약 빈도는 매주 적어도 1회, 2주마다 적어도 1회, 3주마다 적어도 1회 또는 4주마다 적어도 1회이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 매주 적어도 1회이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 2주마다 적어도 1회이다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 예방적 치료를 위해 투여된다.
일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 공유 결합에 의해 VWF 단편과 회합된다. 일부 실시형태에서, 공유 결합은 펩티드 결합 또는 이황화 결합이다.
일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 FVIII 폴리펩티드 및 제1 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 FVIII 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 FVIII 폴리펩티드의 B 도메인 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 서열번호 65의 아미노산 잔기 745에 대응하는 아미노산 바로 다음에 오는(immediately downstream) FVIII 폴리펩티드 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 링커에 의해 FVIII 폴리펩티드에 융합된다.
일부 실시형태에서, VWF 단편은 제2 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 VWF 단편의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 VWF 단편 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 VWF 단편의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 링커에 의해 VWF 단편에 융합된다.
일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티, 제2 반감기 연장 모이어티 또는 둘 다는 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(C-terminal peptide: CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린, 알부민-결합 모이어티, 또는 이들의 임의의 단편, 유도체, 변이체 및 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 제1 XTEN을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 XTEN은 서열번호 65의 아미노산 잔기 745에 대응하는 아미노산 바로 다음에 오는 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입된다.
일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 제2 XTEN을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 XTEN은 VWF 단편의 C-말단에 융합된다.
일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 제1 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 FVIII 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 FVIII 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 링커에 의해 FVIII 폴리펩티드에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 제1 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, VWF 단편은 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 VWF 단편의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 VWF 단편 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 VWF 단편의 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 링커에 의해 VWF 단편에 융합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 일부 실시형태에서, 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 제2 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, FVIII 단백질과 VWF 단편은 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인 사이의 공유 결합을 통해 서로 회합된다. 일부 실시형태에서, FVIII 단백질과 VWF 단편은 추가로 FVIII 단백질과 VWF 단편 사이의 비공유 상호작용을 통해 서로 회합된다.
일 양상에서, 본 명세서에서 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 A형 혈우병의 치료가 필요한 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서의 A형 혈우병을 치료하는 방법이 개시되되, 키메라 폴리펩티드는: (i) 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 제1 FVIII 폴리펩티드 단편; 서열번호 8의 아미노산 서열(AE288)을 포함하는 제1 XTEN 서열; 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 제2 FVIII 폴리펩티드 단편; 및 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제1 Fc 영역을 포함하는, FVIII 단백질; 및 (ii) 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D' 도메인; 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D3 도메인; 서열번호 58의 아미노산 서열(AE144_5A)을 포함하는 제2 XTEN 서열; 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 a2 링커; 및 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제2 Fc 영역을 포함하는, VWF 단백질을 포함하며, 제1 Fc 영역은 이황화 결합에 의해 제2 Fc 영역에 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 FVIII 폴리펩티드, 제1 XTEN 서열, 제1 Fc 영역을 포함하는 FVIII 단백질, 및 VWF의 D' 도메인, VWF의 D3 도메인, 제2 XTEN 서열, FVIII의 a2 링커 및 제2 Fc 영역을 포함하는 VWF 단백질을 포함하되, FVIII 폴리펩티드는 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 XTEN 서열은 AE288의 아미노산 서열(서열번호 8)을 포함하고 서열번호 215의 C-말단에 융합되며, FVIII 폴리펩티드는 추가로 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 Fc 영역은 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하며 서열번호 216의 C-말단에 융합되고; VWF의 D' 도메인은 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하며; VWF의 D3 도메인은 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 XTEN 서열은 AE144_5A의 아미노산 서열(서열번호 58)을 포함하고 VWF의 D3 도메인의 C-말단에 융합되며; a2 링커는 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하고 제2 XTEN 서열의 C-말단에 융합되며; 제2 Fc 영역은 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하고 a2 링커의 C-말단에 융합되며; 제1 Fc 영역은 이황화 결합에 의해 제2 Fc 영역에 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 신호 펩티드를 포함하는 FVIII 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 신호 펩티드를 포함하는 VWF 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D1D2 도메인을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 201, 서열번호 203 또는 서열번호 207에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질; 및 서열번호 202 또는 서열번호 205에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다.
일 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질 및 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질 및 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 FVIII-161(서열번호 69), FVIII-169(서열번호 70), FVIII-170(서열번호 71), FVIII-173(서열번호 72); FVIII-195(서열번호 73); FVIII-196(서열번호 74), FVIII199(서열번호 75), FVIII-201(서열번호 76); FVIII-203(서열번호 77), FVIII-204(서열번호 78), FVIII-205(서열번호 79), FVIII-266(서열번호 80), FVIII-267(서열번호 81), FVIII-268(서열번호 82), FVIII-269(서열번호 83), FVIII-271(서열번호 84), FVIII-272(서열번호 85), FVIII-312(서열번호 173), 또는 FVIII-312A(서열번호 203)로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질; 및 VWF031(서열번호 86), VWF034(서열번호 87), VWF059(서열번호 197), VWF059A(서열번호 202) 또는 VWF036으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 정맥내 주사, 정맥내 주입, 피하 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 비강 투여 및 폐 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 투여 후 키메라 폴리펩티드는 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9% 또는 적어도 약 10%의 FVIII 혈장 활성 수준을 초래한다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 3%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 5%이다.
일부 실시형태에서, 투여 후 키메라 폴리펩티드는 적어도 약 1 IU/㎗, 적어도 약 2 IU/㎗, 적어도 약 3 IU/㎗, 적어도 약 4 IU/㎗, 적어도 약 5 IU/㎗, 적어도 약 6 IU/㎗, 적어도 약 7 IU/㎗, 적어도 약 8 IU/㎗, 적어도 약 9 IU/㎗, 또는 적어도 약 10 IU/㎗의 FVIII 혈장 활성 수준을 초래한다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 3 IU/㎗이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 5 IU/㎗이다.
일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 키메라 폴리펩티드의 투여 후 적어도 약 5일에 적어도 약 10 IU/㎗이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 키메라 폴리펩티드의 투여 후 적어도 약 7일에 적어도 약 5 IU/㎗이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 키메라 폴리펩티드의 투여 후 적어도 약 8일에 적어도 약 3 IU/㎗이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 키메라 폴리펩티드의 투여 후 적어도 약 10일에 적어도 약 1 IU/㎗이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 5일이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 약 5일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 약 7일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 약 14일이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 1주이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 1주이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 1주이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 2주이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 2주이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 2주이다.
일부 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 약 5일 내지 약 14일이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 약 7일 내지 약 14일이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 약 10일 내지 약 21일이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 약 14일 내지 약 21일이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 약 14일이다.
일부 실시형태에서, 인간 대상체는 여성이다. 일부 실시형태에서, 인간 대상체는 소아이다. 일부 실시형태에서, 인간 대상체는 약 12세 이하, 약 11세 미만, 약 10세 미만, 약 9세 미만, 약 8세 미만, 약 7세 미만, 약 6세 미만, 약 5세 미만, 약 4세 미만, 약 3세 미만, 약 2세 미만, 또는 약 1세 미만의 소아이다.
일부 실시형태에서, 투여는 인간 대상체에서 FVIII에 대한 면역 관용(immune tolerance)을 유도한다. 일부 실시형태에서, 투여는 인간 대상체에서 FVIII에 대한 저해성 면역 반응(inhibitory immune response)을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, FVIII에 대한 저해성 면역 반응은 인간 대상체에서 고역가의 항-FVIII 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 투여는 투여의 약 7일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 20일, 약 24일, 약 25일, 약 28일, 약 30일 또는 약 35일 후에 FVIII 저해제를 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 투여는 투여의 약 28일 후에 FVIII 저해제를 유도하지 않는다.
도 1은 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 개략적으로 나타낸 것이다. FVIII: 인자 VIII; VWF: 폰빌레브란트 인자; A1, A2, A3, C1, C2: FVIII의 도메인; D'D3: VWF의 도메인; Fc: 면역글로불린 불변 영역의 Fc 영역.
도 2a 및 도 2b는 25 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여한 저용량 코호트(도 2a) 및 65 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여한 고용량 코호트(도 2b)에서 인간 환자에서의 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 안전성 및 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3b는 25 IU/㎏ rFVIII을 투여한 후 약효 세척 기간, 이어서, 25 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN(도 3a; 저용량 코호트) 또는 65 IU/㎏ rFVIII 다음에 약효 세척 기간, 이어서, 65 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN(도 3b; 고용량 코호트)을 투여한 중증의 A형 혈우병을 갖는 인간 대상체에서의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time: aPTT)에 기반한 기준-보정 FVIII 활성 수준의 그래프 표현이다. 수평 파선은 3%, 5%, 10%, 및 20% FVIII 활성을 나타낸다.
도 4는 중증의 A형 혈우병을 갖는 18 내지 65세(18세와 65세를 포함)의 이전에 치료된 환자(previously treated patient: PTP)인 성인 남성에서의 50 IU/㎏ 또는 65 IU/㎏의 용량으로 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 총 4회의 1주 1회 용량의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 임상 연구 설계의 개략적 표현이다. EOS = 연구 종료(End of Study); ET = 조기 종료(Early Termination); PK = 약물동태학.
도 2a 및 도 2b는 25 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여한 저용량 코호트(도 2a) 및 65 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여한 고용량 코호트(도 2b)에서 인간 환자에서의 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 안전성 및 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3b는 25 IU/㎏ rFVIII을 투여한 후 약효 세척 기간, 이어서, 25 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN(도 3a; 저용량 코호트) 또는 65 IU/㎏ rFVIII 다음에 약효 세척 기간, 이어서, 65 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN(도 3b; 고용량 코호트)을 투여한 중증의 A형 혈우병을 갖는 인간 대상체에서의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time: aPTT)에 기반한 기준-보정 FVIII 활성 수준의 그래프 표현이다. 수평 파선은 3%, 5%, 10%, 및 20% FVIII 활성을 나타낸다.
도 4는 중증의 A형 혈우병을 갖는 18 내지 65세(18세와 65세를 포함)의 이전에 치료된 환자(previously treated patient: PTP)인 성인 남성에서의 50 IU/㎏ 또는 65 IU/㎏의 용량으로 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 총 4회의 1주 1회 용량의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 임상 연구 설계의 개략적 표현이다. EOS = 연구 종료(End of Study); ET = 조기 종료(Early Termination); PK = 약물동태학.
본 개시내용은 (i) 인자 VIII(FVIII) 폴리펩티드 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 폰빌레브란트 인자(VWF) 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, 출혈 질환 또는 병태, 예를 들어, A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서의 출혈 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 5일마다 1회이다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 7일마다 1회이다.
I.
정의
용어 단수의 독립체는 하나 이상의 이러한 독립체를 지칭하며; 예를 들어 "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해됨을 주목해야 한다. 마찬가지로, 단수의 용어, "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
더 나아가, 본 명세서에서 사용된 "및/또는"은 두 가지의 명시된 특징 또는 구성요소의 각각을 다른 한 가지와 함께 또는 다른 한 가지 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A와 B", "A 또는 B", "A"(단독), "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 다음의 양상 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B와 C; A, B 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본 명세서에서 양상이 "포함하는(comprising)"이라는 말로 기재되는 경우에, 다르게는 "이루어진(consisting of)" 및/또는 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"이라는 용어로 기재된 유사한 양상도 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 문헌[Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에 사용된 많은 용어들에 대한 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.
단위, 접두어, 및 기호는 국제단위계(
International de Unites; SI) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노로부터 카르복시 배향에 있어서 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다. 본 명세서에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 양상의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의하는 용어들은 이들 전체가 본 명세서에 참조에 의해 보다 완전하게 정의된다.
용어 "약"은 대략적으로, 거의, ~쯤, 또는 ~한 정도를 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"이 숫자 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치 초과와 미만으로 경계를 확장함으로써 해당 범위를 변형한다. 일반적으로, 용어 "약"은 언급된 값 초과와 미만인 수치를 예를 들어 10%의 편차만큼 위 또는 아래로(보다 높게 또는 낮게) 변형할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포괄하는 것으로 의도되며, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어, 전령 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함한다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA로 의도된다. 예를 들어, 벡터에 함유된 인자 VIII 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가적인 예는 이종성 숙주 세포에서 유지되거나 또는 용액 중의 다른 폴리뉴클레오티드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 개시내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 추가로 합성에 의해 생산된 이러한 분자를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
포유류 세포에 의해 분비된 특정한 단백질은 조면 소포체에 걸쳐 증가되는 단백질 쇄의 유출이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단된 분비 신호 펩티드와 회합된다. 당업자는 신호 펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합되고, 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어서 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생산한다는 것을 알고 있다. 특정 실시 형태에서, 천연 신호 펩티드 또는 해당 서열의 기능성 유도체는 이와 작동 가능하게 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유한다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩티드, 예를 들어 인간 조직 플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator: TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제 신호 펩티드, 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩티드"를 포함하도록 의도되고, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 의미하고, 생성물의 구체적 길이를 지칭하지는 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 지칭하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 이것과 상호 호환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한, 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 또는 천연 비발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 폴리펩티드의 발현 후 변형의 산물을 의미하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 천연의 생물학적 공급원 또는 생산된 재조합 기술로부터 유래될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 이는 화학 합성을 포함하는 임의의 방식에 의해 생성될 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그의 천연 환경에는 존재하지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 수준의 정제가 필요하지는 않다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 고유 환경 또는 천연 환경으로부터 간단히 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현되는 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 같이, 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
폴리펩티드의 단편 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이 본 발명에 또한 포함된다. 용어 "단편" 또는 "변이체"는, 본 개시내용의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자를 언급할 때, 기준 폴리펩티드의 특성(예를 들어, FcRn 결합 도메인 또는 Fc 변이체에 대한 FcRn 결합 친화도, FVIII 변이체에 대한 응고 활성 또는 VWF 단편에 대한 FVIII 결합 활성) 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 특정 항체 단편에 추가로 단백질 분해 단편뿐만 아니라 결실 단편을 포함하지만, 천연 발생 전장 폴리펩티드(또는 성숙 폴리펩티드)를 포함하지 않는다. 본 개시내용의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 상기 기재된 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 천연 또는 비천연 유래일 수 있다. 비천연 유래 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기법을 이용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "VWF 단백질" 또는 "VWF 단백질들"은 FVIII와 상호작용하고, 전장 VWF에 의해 FVIII에 보통 제공되는 적어도 하나 이상의 특성을 보유하여, 예를 들어 FVIIIa로의 조기 활성화를 방지하고/하거나, 조기 단백질 분해를 방지하고/하거나, 조기 클리어런스(clearance)를 초래할 수 있는 인지질 막과의 회합을 방지하고/하거나, 네이키드(naked) FVIII에는 결합할 수 있지만 VWF-결합 FVIII에는 결합하지 않는 FVIII 클리어런스 수용체에 대한 결합을 방지하고/하거나, FVIII 중쇄 및 경쇄 상호작용을 안정화시키는, 임의의 VWF 단편을 의미한다. 본 명세서에서 언급되는 VWF 단편은 전장 VWF 단백질 미만인 VWF 폴리펩티드이되, VWF 단편은 FVIII와 상호작용하고/하거나 결합하는 능력을 보유한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩티드 내 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산으로 대체된다면, 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 다른 실시 형태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같은, 두 폴리펩티드 간의 "서열 동일성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본 명세서에서 논의될 때, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한지의 여부는 당업계에 공지되어 있는 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, BESTFIT 프로그램(위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 유닉스용 버전 8)을 이용하여 결정될 수 있다. BESTFIT는 두 서열 간의 최고의 상동성 세그먼트를 찾기 위해 문헌[Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 스미스(Smith)와 워터만(Waterman)의 국소 상동성 알고리즘을 사용한다. 특정 서열이, 예를 들어, 본 개시내용에 따른 기준 서열에 대해 95% 동일한지의 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 알고리즘 프로그램을 이용할 때, 물론, 동일성 백분율이 기준 폴리펩티드 서열의 전장에 대해 계산되고 기준 서열 내 아미노산 총 수의 최대 5%의 상동성에서 갭이 허용되도록 파라미터가 설정된다.
VWF 서열 또는 FVIII 단백질 서열에서 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "에 대응하는 아미노산" 또는 "동등한 아미노산"은 제1 VWF 또는 FVIII 서열과 제2 VWF 또는 FVIII 서열 간의 동일성 또는 유사성을 최대화하기 위한 정렬에 의해 동정된다. 제2 VWF 또는 FVIII 서열에서 동등한 아미노산을 동정하는 데 사용된 번호는 제1 VWF 또는 FVIII 서열에서 대응하는 아미노산을 동정하는 데 사용된 번호에 기반한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "삽입 부위"는 반감기 연장 모이어티 또는 이종성 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 바로 앞에 오는 FVIII 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에서의 위치를 지칭한다. "삽입 부위"는 숫자로서 구체화되고, 숫자는 삽입의 위치에 대해 바로 C-말단인 삽입 부위에 대응하는 성숙 천연 FVIII(서열번호 65)에서의 아미노산의 수이다. 예를 들어, 어구 "a3은 서열번호 65의 아미노산 1656에 대응하는 삽입 부위에서 이종성 모이어티를 포함한다"는 이종성 모이어티가 서열번호 65의 아미노산 1656 및 아미노산 1657에 대응하는 2개의 아미노산 사이에 위치한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "아미노산 바로 다음에 오는"은 아미노산의 말단 카르복실기의 바로 옆의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 성숙 야생형 FVIII 단백질에 대응하는 아미노산 745 바로 하류의 삽입 부위는 삽입 부위가 성숙 야생형 FVIII 단백질에 대응하는 아미노산 745와 아미노산 746 사이에 있다는 것을 의미한다. 유사하게, 어구 "아미노산의 바로 앞에 오는"은 아미노산의 말단 아민기 바로 옆의 위치를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "삽입 부위의 두 아미노산 사이"는 XTEN 또는 임의의 다른 폴리펩티드가 두 인접한 아미노산 사이에 삽입된 위치를 지칭한다. 따라서, 어구 "아미노산 바로 다음에 삽입된" 및 "삽입 부위의 두 아미노산 사이에 삽입된"은 "삽입 부위에서 삽입된"과 동의어로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "삽입된", "삽입되는", "내로 삽입된" 또는 문법적으로 관련된 용어는 천연 성숙 인간 FVIII에서의 유사한 위치에 대한 키메라 폴리펩티드에서의 XTEN의 위치를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어는 천연 성숙 인간 FVIII에 대한 재조합 FVIII 폴리펩티드의 특징을 지칭하고, 키메라 폴리펩티드가 생성되는 임의의 방법 또는 공정을 표시하거나, 의미하거나 암시하지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 키메라 폴리펩티드에 관해, 어구 "XTEN은 FVIII 폴리펩티드의 잔기 745 바로 하류에 삽입된다"는 키메라 폴리펩티드가 천연 성숙 인간 FVIII에서 아미노산 745에 대응하는 아미노산 바로 다음에 오는, 예를 들어, 천연 성숙 인간 FVIII의 아미노산 745 및 746에 대응하는 아미노산에 의해 결합된 XTEN을 포함한다는 것을 의미한다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 천연에서 자연적으로 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 보통 별개의 단백질에 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에 함께 놓일 수 있거나, 보통 동일한 단백질에 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드, 예를 들어, 본 개시내용의 인자 VIII 도메인과 Ig Fc 도메인의 융합에서의 새로운 배열에 위치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 화학 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 목적하는 관계에서 암호화되는 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 키메라 폴리펩티드는 공유, 비펩티드 결합 또는 비공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "연결된"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 공유로 또는 비공유로 결합된 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 직접적으로 결합되거나 병치될 수 있거나, 또는 대안적으로 개재 서열은 제1 서열을 제2 서열에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 용어 "연결된"은 C 말단 또는 N-말단에서의 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라, 제2 아미노산 서열(또는 각각 제1 아미노산 서열)에서의 임의의 2개의 아미노산 내로의 전체 제1 아미노산 서열(또는 제2 아미노산 서열)의 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 아미노산 서열은 펩티드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 제1 뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드(폴리펩티드 쇄의 경우) 또는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쇄(뉴클레오티드 쇄의 경우) 또는 임의의 화학 모이어티(폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 쇄 둘 다의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한 하이폰(-)으로 표시된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "~와 회합된"은 제1 아미노산 쇄와 제2 아미노산 쇄 사이에 형성된 공유 결합 또는 비-공유 결합을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "회합된"은 공유, 비펩티드 결합 또는 비공유 결합을 의미한다. 이 회합은 콜론, 즉 (:)으로 표시될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이는 펩티드 결합을 제외한 공유 결합을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 시스테인은 이황화 결합을 형성할 수 있는 티올기 또는 제2 시스테인 잔기 상의 티올기와의 브리지를 포함한다. 대부분의 천연 유래 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 회합되고, 2개의 중쇄는 카바트(Kabat) 넘버링 시스템(226번 또는 229번 위치, EU 넘버링 시스템)을 이용하여 239번 및 242번에 대응하는 위치에서 2개의 이황화 결합에 의해 회합된다. 공유 결합의 예는, 펩티드 결합, 금속 결합, 수소 결합, 이황화 결합(이황화 결합), 시그마 결합, 파이 결합, 델타 결합, 글리코시드 결합, 아그노스트 결합(agnostic bond), 굽은 결합, 쌍극자 결합, 파이 역결합(Pi backbond), 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 오중 결합, 육중 결합, 접합, 초접합, 방향족성, 햅티시티(hapticity), 또는 반결합(antibonding)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비공유 결합의 비제한적인 예는 이온 결합(예를 들어, 양이온-파이 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합(예를 들어, 2수소 결합, 2수소 복합체, 저-장벽 수소 결합, 또는 대칭 수소 결합), 반 데르 발스 힘, 런던 분산력, 기계적 결합, 할로겐 결합, 친금성(aurophilicity), 인터칼레이션(intercalation), 스태킹(stacking), 엔트로피 힘 또는 화학적 극성을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "절단 부위" 또는 "효소 절단 부위"는 효소에 의해 인식되는 부위를 지칭한다. 특정 효소 절단 부위는 세포내 가공 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 응고 캐스케이드 동안에 활성화되는 효소에 의해 절단되는 효소 절단 부위를 가지므로, 이러한 부위의 절단은 혈병 형성 부위에서 발생한다. 예시적인 이러한 부위는, 예를 들어, 트롬빈, 인자 XIa 또는 인자 Xa에 의해 인식되는 부위를 포함한다. 예시적인 FXIa 절단 부위는, 예를 들어, TQSFNDFTR(서열번호 1) 및 SVSQTSKLTR(서열번호 3)을 포함한다. 예시적인 트롬빈 절단 부위는, 예를 들어, DFLAEGGGVR(서열번호 4), TTKIKPR(서열번호 5), LVPRG(서열번호 6), ALRPR(서열번호 7), ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 106), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 88) 및 IEPRSFS(서열번호 194)를 포함한다. 다른 효소적 절단 부위는 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "가공 부위" 또는 "세포 내 가공 부위"는 폴리펩티드의 번역 후에 작용하는 효소에 대한 표적인 폴리펩티드 내의 효소 절단 부위의 유형을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 효소는 골지 내강(Golgi lumen)으로부터에 트랜스-골지 구획(trans-Golgi compartment)까지 수송되는 동안 작용한다. 세포 내 가공 효소는 단백질이 세포로부터 분비되기 전에 폴리펩티드를 절단한다. 이러한 가공 부위의 예는, 예를 들어, 엔도펩티다제의 PACE/퓨린(PACE는 쌍을 이룬 염기 아미노산 절단 효소(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)의 머리글자임) 패밀리에 의해 표적화되는 것들을 포함한다. 이들 효소는 골지 막에 국소화되어 서열 모티프 Arg-[임의의 잔기]-(Lys 또는 Arg)-Arg의 카르복시 말단측 상에서 단백질을 절단한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 효소의 "퓨린" 패밀리는, 예를 들어, PCSK1(PC1/PC3로도 알려짐), PCSK2(PC2로도 알려짐), PCSK3(퓨린 또는 PACE로도 알려짐), PCSK4(PC4로도 알려짐), PCSK5(PC5 또는 PC6으로도 알려짐), PCSK6(PACE4로도 알려짐), 또는 PCSK7(PC7/LPC, PC8 또는 SPC7로도 알려짐)을 포함한다. 다른 가공 부위는 당업계에 공지되어 있다.
하나 초과의 가공 또는 절단 부위를 포함하는 작제물에서, 이러한 부위는 동일하거나 상이할 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "가공성 링커(processable linker)"는 본 명세서의 다른 곳에서 기재되어 있는 적어도 하나의 세포 내 가공 부위를 포함하는 링커를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "반감기"는 생체 내 특정한 폴리펩티드의 생물학적 반감기를 의미한다. 반감기는 순환으로부터 클리어런스되는 대상체 및/또는 동물에서의 다른 조직에 투여되는 양이 절반으로 되는 데 필요한 시간으로 나타낼 수 있다. 주어진 폴리펩티드의 클리어런스 곡선이 시간의 함수로서 구성될 때, 곡선은 보통 빠른 α-상 및 더 긴 β-상을 갖는 2상이다. α-상은 전형적으로 혈관내 공간과 혈관외 공간 사이에서 투여된 Fc 폴리펩티드의 평형상태를 나타내고, 부분적으로 폴리펩티드의 크기에 의해 결정된다. β-상은 전형적으로 혈관내 공간에서의 폴리펩티드의 이화작용을 나타낸다. 일부 실시형태에서, FVIII 및 FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 1상이고, 이에 따라 알파 상을 갖지 않으며, 단지 단일 베타 상을 갖는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 반감기는 β-상에서의 폴리펩티드의 반감기를 지칭한다. 인간에서 인간 항체의 전형적인 베타상 반감기는 21일이다. 특정 실시형태에서, 반감기는 최종상의 반감기로서 표현된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 지혈 장애는 피브린 혈병을 형성하는 것의 손상된 능력 또는 불능으로 인해 자발적으로 또는 외상의 결과로서 대출혈에 대한 경향을 특징으로 하는 유전적인 선천적 또는 후천적 병태를 의미한다. 이러한 장애의 예는 혈우병을 포함한다. 3개의 주요 형태는 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증), B형 혈우병(인자 IX 결핍증 또는 "크리스마스병") 및 C형 혈우병(XI 인자 결핍증, 경증 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애는, 예를 들어 폰 빌레브란트 질환, 인자 XI 결핍증(PTA 결핍증), 인자 XII 결핍증, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII의 결핍증 또는 구조적 비정상, GPIb의 결함 또는 결핍증인 베르나르-술리에(Bernard-Soulier) 증후군을 포함한다. VWF에 대한 수용체인 GPIb에 결함이 있을 수 있고, 이는 일차 혈병 형성(1차 혈액응고)의 결여 및 출혈 경향의 증가, 및 글란즈만(Glanzman) 및 네겔리(Naegeli)의 혈소판 무력증(글란즈만 혈소판무력증)으로 이어질 수 있다. 간부전(급성 및 만성 형태)에서, 간에 의한 응고 인자의 불충분한 생산이 있고; 이는 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "투여하다" 또는 "투여하는"은 본 명세서에 기재된 조성물, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 전달하는 것을 지칭한다. 조성물, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 특히, 조성물은 정맥내로, 피하로, 근육내로, 진피내로 또는 임의의 점막면을 통해, 예를 들어, 경구로, 설하로, 협측으로, 비강으로, 직장으로, 질내로 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 키메라 폴리펩티드. 일부 실시형태에서, 투여는 자가-투여이다. 일부 실시형태에서, 부모는 키메라 폴리펩티드를 아이에게 투여한다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 건강관리 종사자, 예컨대 의사, 의대생 또는 간호사에 의해 대상체에게 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "용량"은 대상체에 대한 조성물의 단일 투여를 지칭한다. 단일 용량은 한번에, 예를 들어, 볼루스로서 또는, 예를 들어, 정맥내 주입을 통해 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 용어 "다회 용량"은 1회 초과의 용량, 예를 들어, 1회 초과의 투여를 의미한다.
1가지 초과의 조성물의 공동 투여를 언급할 때, 조성물 A의 용량은 조성물 B의 용량과 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 조성물 A의 용량은 조성물 B의 용량 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물 A와 조성물 B는 단일 제형으로 조합된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "간격" 또는 "투약 간격"은 조성물 A의 제1 용량과 대상체에게 투여되는 동일한 조성물의 후속 용량 사이에 경과되는 시간의 양을 지칭한다. 투약 간격은 제1 용량과 제2 용량 사이에 경과되는 시간을 지칭할 수 있거나, 또는 투약 간격은 다회 용량 사이에 경과되는 시간의 양을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "투약 빈도"는 특정 투약 간격당 투여되는 용량의 수를 지칭한다. 예를 들어, 투약 빈도는 1주에 1회, 2주마다 1회 등으로서 기재될 수 있다. 따라서, 7일의 투약 간격은 또한 7일에 1회 또는 1주마다 1회, 또는 1주에 1회로서 기재될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방적 치료"는 혈우병의 치료를 위한 요법의 투여를 지칭하며, 여기서, 이러한 치료는 혈우병의 한 가지 이상의 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드, 예를 들어, 하나 이상의 자발적 출혈 에피소드 및/또는 관절 손상의 중증도를 예방하거나 감소시키는 것으로 의도된다. 문헌[Jimenez-Yuste et al., Blood Transfus. 12(3):314-19 (2014)]을 참조한다. 중증의 이러한 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드 및 관절 질환의 진행을 예방하거나 감소시키기 위해, A형 혈우병 환자는 예방적 치료 요법의 부분으로서 응고 인자의 정기적 주입을 받을 수 있다. 이러한 예방적 치료의 기초는 1% 이상의 응고 인자, 예를 들어, FVIII 수준을 갖는 혈우병 환자가 자발적 출혈 에피소드를 거의 경험하지 않으며, 중증의 혈우병을 갖는 환자에 비해 소수의 혈우병-관련 동반질환을 가진다는 관찰이다. 예를 들어, 문헌[Coppola A. et al, Semin. Thromb. Hemost. 38(1): 79-94 (2012)] 참조. 이들 혈우병 환자를 치료하는 건강관리 종사자는 정기적 주입에 의해 인자 수준을 대략 1%에서 유지하는 것이 출혈 에피소드 및 관절 손상을 비롯한 혈우병 증상 위험을 잠재적으로 감소시킬 수 있었다는 것을 추정하였다. 이하 참조. 후속 연구는 중증 혈우병을 갖는 사람들에 대해 예방적 치료를 제공할 목적으로, 응고 인자에 의한 예방적 치료를 받은 소아 혈우병 환자에서 이들 이점을 확인하였다. 이하 참조.
"예방적" 치료는 또한 A형 혈우병의 한 가지 이상의 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드의 발생 또는 중증도를 제어하거나, 관리하거나, 예방하거나 감소시키기 위한, 대상체에 대한 본 명세서에 기재된 조성물, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드의 선제적 투여를 지칭할 수 있다. 응고 인자, 예를 들어, FVIII에 의한 예방적 치료는 중증의 A형 혈우병을 갖는 대상체에 대한 치료 표준이다. 예를 들어, 문헌[Oldenburg, Blood 125:2038-44 (2015)] 참조. 일부 실시형태에서, 예방적 치료는 A형 혈우병 중 한 가지 이상의 증상의 발생을 감소시키기 위해 본 명세서에 개시된 조성물을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 예방적 치료는 다회 용량의 투여를 포함할 수 있다. 예방적 치료에서 사용되는 다회 용량은 전형적으로 특정 투약 간격으로 투여된다. 특정 실시형태에서, 연간 출혈률은 10회 미만, 9회 미만, 8회 미만, 7회 미만, 6회 미만, 5회 미만, 4회 미만, 3회 미만, 2회 미만 또는 1회 미만으로 감소될 수 있다.
용어 "대증적(on-demand) 치료" 또는 "에피소드 치료"는 A형 혈우병의 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드의 증상에 반응한, 또는 출혈을 야기할 수 있는 활성 전에 키메라 분자의 "필요한 경우의" 투여를 지칭한다. 일 양상에서, 대증적 치료는 출혈이 시작할 때, 예컨대 손상 후 또는 출혈이 예상될 때, 예컨대 수술 전에 대상체에게 제공될 수 있다. 다른 양상에서, 대증적 치료는 접촉 스포츠와 같이 출혈의 위험을 증가시키는 활동 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대증적 치료는 단일 용량으로서 주어진다. 다른 실시형태에서, 대증적 치료는 제1 용량, 다음에 1회 이상의 추가적인 용량으로서 제공된다. 키메라 폴리펩티드가 대증적으로 투여될 때, 제1 용량 후 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간, 적어도 약 108시간 또는 적어도 약 120시간에 1회 이상의 추가적인 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 대증적 치료와 연관된 투약 간격은 예방적 치료를 위해 사용되는 투약 간격과 동일하지 않다는 것을 주목하여야 한다.
일부 실시형태에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 받고 있거나 곧 받을 예정이다. 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 수술 전에 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 또한 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 키메라 폴리펩티드가 수술 전에 투여될 때, 투여는 수술 전 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 또는 적어도 약 72시간일 수 있다. 키메라 폴리펩티드가 수술 후에 투여될 때, 투여는 수술 후 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 또는 적어도 약 72시간일 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제술, 치과 시술 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이들로 제한될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "급성 출혈"은 기저 원인과 상관없이 출혈 에피소드를 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 외상, 요독증, 유전성 출혈 장애(예를 들어, VII 인자 결핍증) 혈소판 장애 또는 응고 인자에 대한 항체의 발생으로 인한 내성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료한다", "치료", "치료하는"은, 예를 들어, 질환 또는 병태의 중증도 감소; 질환 과정의 지속기간의 감소; 질환 또는 병태와 연관된 한 가지 이상의 증상의 개선; 질환 또는 병태를 반드시 치유할 필요 없이 질환 또는 병태를 갖는 대상체에 대한 유리한 효과의 제공; 또는 질환 또는 병태와 연관된 한 가지 이상의 증상의 예방을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드 또는 VWF 단편을 투여함으로써 대상체에서 FVIII 트로프(trough) 수준을 적어도 약 1 IU/㎗, 2 IU/㎗, 3 IU/㎗, 4 IU/㎗, 5 IU/㎗, 6 IU/㎗, 7 IU/㎗, 8 IU/㎗, 9 IU/㎗, 10 IU/㎗, 11 IU/㎗, 12 IU/㎗, 13 IU/㎗, 14 IU/㎗, 15 IU/㎗, 16 IU/㎗, 17 IU/㎗, 18 IU/㎗, 19 IU/㎗ 또는 20 IU/㎗로 유지시키는 것을 의미한다. 혈우병 환자에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "트로프 수준"은, 다음 용량이 투여되기 전에, 인자 요법, 예를 들어, FVIII 요법에 의해 도달되는 최저 농도의 측정이다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 1 IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 3 IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 5 IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 약 1 내지 약 20 IU/㎗, 약 2 내지 약 20 IU/㎗, 약 3 내지 약 20 IU/㎗, 약 4 내지 약 20 IU/㎗, 약 5 내지 약 20 IU/㎗, 약 6 내지 약 20 IU/㎗, 약 7 내지 약 20 IU/㎗, 약 8 내지 약 20 IU/㎗, 약 9 내지 약 20 IU/㎗, 또는 약 10 내지 약 20 IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지하는 것을 의미한다.
질환 또는 병태의 "치료" 또는 이를 "치료하는"은 또한 대상체에서 FVIII 활성을, 비혈우병 대상체에서의 FVIII 활성의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%와 비슷한 수준으로 유지하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 1%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 2%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 3%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 4%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 5%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 6%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 7%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 8%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 9%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치료하는 또는 치료는 투약 간격 간에 적어도 약 10%의 FVIII 활성 수준을 유지하는 것을 의미한다. 치료에 필요한 최소 트로프 수준은 한 가지 이상의 공지된 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 aPTT 분석 또는 발색성 분석(chromogenic assay))에 의해 측정될 수 있고, 각각의 개인에 대해 조절될 수 있다(증가되거나 또는 감소됨).
II.
본 개시내용의 방법
본 개시내용의 특정 양상은 FVIII 단백질 및 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병의 치료가 필요한 대상체에서 A형 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 본 개시내용은 FVIII 단백질의 다회 용량 및 VWF 단편의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체에서 출혈 질환 또는 병태, 예를 들어, A형 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량은 적어도 2회 용량, 적어도 3회 용량, 적어도 4회 용량, 적어도 5회 용량, 적어도 6회 용량, 적어도 7회 용량, 적어도 8회 용량, 적어도 9회 용량, 적어도 10회 용량, 적어도 11회 용량, 적어도 12회 용량, 적어도 13회 용량, 적어도 14회 용량, 적어도 15회 용량, 적어도 16회 용량, 적어도 17회 용량, 적어도 18회 용량, 적어도 19회 용량, 적어도 20회 용량 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다회 용량은 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년, 적어도 약 4년, 적어도 약 5년, 적어도 약 10년, 적어도 약 15년, 적어도 약 20년 동안, 또는 적어도 약 25년 동안 투여된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 A형 혈우병을 치료하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드를 예방하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드를 치료하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드의 발생률 또는 빈도를 제어하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드의 발생률 또는 빈도를 감소하는 것을 포함한다.
A.
용량
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 단일 용량으로서 또는 다회 용량으로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 각각의 양은 동일하다. 다른 실시형태에서, 한 번 이상의 다회 용량은 한 번 이상의 다른 다회 용량과 상이하다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 5 IU/㎏ 내지 약 200 IU/㎏ 또는 약 10 IU/㎏ 내지 약 150 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 95 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 90 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 85 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 60 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 55 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 50 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 45 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 40 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 35 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 30 IU/㎏, 또는 약 20 IU/㎏ 내지 약 25 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 25 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 30 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 35 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 40 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 45 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 55 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 70 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 75 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 80 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 85 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 또는 약 90 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 150 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 140 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 130 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 120 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 110 IU/㎏, 또는 약 50 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 95 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 90 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 85 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 60 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 55 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 60 IU/㎏ 내지 약 150 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 140 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 130 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 120 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 110 IU/㎏, 또는 약 60 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 60 IU/㎏ 내지 약 95 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 90 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 85 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏, 또는 약 60 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 150 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 140 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 130 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 120 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 110 IU/㎏, 또는 약 65 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 95 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 90 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 85 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 또는 약 65 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 5 IU/㎏, 약 10 IU/㎏, 약 15 IU/㎏, 약 20 IU/㎏, 약 25 IU/㎏, 약 30 IU/㎏, 약 35 IU/㎏, 약 40 IU/㎏, 약 45 IU/㎏, 약 50 IU/㎏, 약 55 IU/㎏, 약 60 IU/㎏, 약 65 IU/㎏, 약 70 IU/㎏, 약 75 IU/㎏, 약 80 IU/㎏, 약 85 IU/㎏, 약 90 IU/㎏, 약 95 IU/㎏, 약 100 IU/㎏, 약 125 IU/㎏, 약 150 IU/㎏, 약 175 IU/㎏, 또는 약 200 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 30 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 35 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 40 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 45 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 55 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 60 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 70 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 75 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 85 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 90 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 95 IU/㎏이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 100 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 25 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 30 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 35 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 40 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 45 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 50 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 55 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 60 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 65 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 70 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 75 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 80 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 85 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 90 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 95 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 다회 용량의 각각의 용량은 약 100 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 예방적으로 투여된다. 예방적으로 투여될 때, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏일 수 있다. 특정 실시형태에서, 예방적으로 투여되는 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏, 약 30 IU/㎏, 약 35 IU/㎏, 약 40 IU/㎏, 약 45 IU/㎏, 약 50 IU/㎏, 약 55 IU/㎏, 약 60 IU/㎏, 약 65 IU/㎏, 약 70 IU/㎏, 약 75 IU/㎏, 약 80 IU/㎏, 약 85 IU/㎏, 약 90 IU/㎏, 약 95 IU/㎏, 또는 약 100 IU/㎏이다. 일부 실시형태에서, 예방적으로 투여되는 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이다. 다른 실시형태에서, 예방적으로 투여되는 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이다. 다른 실시형태에서, 예방적으로 투여되는 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이다. 다른 실시형태에서, 예방적으로 투여되는 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 대증적으로 투여된다. 대증적으로 투여될 때, 키메라 폴리펩티드는 단일 용량 또는 다회 용량으로서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏의 1회 이상의 용량으로서 투여된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 약 25 IU/㎏, 약 30 IU/㎏, 약 35 IU/㎏, 약 40 IU/㎏, 약 45 IU/㎏, 약 50 IU/㎏, 약 55 IU/㎏, 약 60 IU/㎏, 약 65 IU/㎏, 약 70 IU/㎏, 약 75 IU/㎏, 약 80 IU/㎏, 약 85 IU/㎏, 약 90 IU/㎏, 약 95 IU/㎏, 또는 약 100 IU/㎏의 1회 이상의 용량으로서 대증적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 약 25 IU/㎏의 1회 이상의 용량으로서 대증적으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 약 50 IU/㎏의 1회 이상의 용량으로서 대증적으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 약 65 IU/㎏의 1회 이상의 용량으로서 대증적으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 약 80 IU/㎏의 1회 이상의 용량으로서 대증적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 방법에 따른 키메라 폴리펩티드의 투여는 투여의 약 7일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 20일, 약 24일, 약 25일, 약 28일, 약 30일 또는 약 35일 후에 FVIII 저해제를 유도하지 않는다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 투여는 투여의 약 28일 후에 FVIII 저해제를 유도하지 않는다.
B.
투약 간격
특정 실시형태에서, 본질적으로 예방적 치료를 위해, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 다회 용량으로서 투약 간격을 두고 투여된다. 일부 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일, 적어도 약 22일, 적어도 약 23일, 적어도 약 24일, 적어도 약 25일, 적어도 약 26일, 적어도 약 27일, 적어도 약 28일, 적어도 약 29일, 적어도 약 30일 또는 적어도 약 31일이다.
특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 6일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 8일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 9일이다. 특정 실시형태에서, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 11일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 12일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 13일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 21일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 27일이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 30일이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 빈도는 1주마다 적어도 2회, 1주마다 적어도 1회, 2주마다 적어도 1회, 3주마다 적어도 1회, 4주마다 적어도 1회, 5주마다 적어도 1회 또는 6주마다 적어도 1회이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 1주마다 적어도 1회이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 2주이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 3주이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 4주이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 빈도는 3개월마다 약 2회, 1개월마다 약 1회, 1개월마다 약 2회, 1개월마다 약 3회, 1개월마다 약 4회, 1개월마다 약 5회, 1개월마다 약 6회, 1개월마다 약 7회 또는 1개월마다 약 8회이다. 특정 실시형태에서, 투약 빈도는 1개월마다 약 1회이다. 특정 실시형태에서, 투약 빈도는 1개월마다 약 2회이다. 특정 실시형태에서, 투약 빈도는 1개월마다 약 3회이다. 특정 실시형태에서, 투약 빈도는 1개월마다 약 4회이다. 특정 실시형태에서, 투약 빈도는 1개월마다 약 5회이다. 특정 실시형태에서, 투약 빈도는 1개월마다 약 6회이다.
일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 3 내지 5일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 4 내지 6일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 4 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 4 내지 8일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 4 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 4 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 5 내지 7일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 5 내지 8일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 5 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 5 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 6 내지 8일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 6 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 6 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 7 내지 9일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 7 내지 10일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 7 내지 11일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 7 내지 12일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 7 내지 13일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 7 내지 14일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 8 내지 14일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 9 내지 14일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 10 내지 14일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 11 내지 14일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 10 내지 21일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 12 내지 14일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 12 내지 15일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 13 내지 15일이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 투약 간격은 적어도 약 14 내지 21일이다.
일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 표 1에 기재된 용량 및 투약 빈도에 따라 투여된다.
[표 1A]
[표 1B]
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 25 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 10일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 8일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 9일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 11일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 12일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 13일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 9일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 10일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 11일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 12일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 13일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12 내지 15일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2 내지 10일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2 내지 8일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2 내지 9일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2 내지 11일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2 내지 12일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2 내지 13일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 4 내지 9일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 4 내지 10일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 4 내지 11일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 4 내지 12일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 4 내지 13일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 4 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8 내지 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 15일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10 내지 21일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13 내지 15일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14 내지 21일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 7일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 6일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 5일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 4일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 3일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 2일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 8일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 9일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 10일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 11일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 12일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 13일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 14일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 21일의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다.
일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 1주의 투약 간격으로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 예컨대 소아 대상체에서의 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 다회 용량 중 적어도 한 번은 적어도 약 1주마다 2회의 투약 빈도로 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏의 용량이 투여된다.
특정 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 특정 실시형태에서, 예컨대 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 투약 간격을 두고 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 8일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 9일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 11일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 12일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 13일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 15일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 16일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 17일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 18일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 19일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 20일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 21일이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 6일이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 A형 혈우병의 예방적 치료를 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 8일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 9일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 11일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 12일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 13일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 15일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 16일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 17일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 18일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 19일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 20일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 21일이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 다회 용량을 투약 간격을 두고 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 6일이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 A형 혈우병의 예방적 치료를 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 8일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 9일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 11일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 12일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 13일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 15일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 16일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 17일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 18일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 19일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 20일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 21일이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 다회 용량을 투약 간격을 두고 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 6일이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 A형 혈우병의 예방적 치료를 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 8일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 9일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 11일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 12일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 13일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 15일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 16일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 17일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 18일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 19일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 20일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 21일이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 5일이다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 6일이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 A형 혈우병의 예방적 치료를 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 7일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 8일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 9일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 10일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 11일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 12일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 13일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 14일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 15일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 16일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 17일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 18일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 19일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 20일이다. 특정 실시형태에서, 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏이고, 투약 간격은 적어도 약 21일이다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 A형 혈우병의 예방적 치료를 위해 투여된다. A형 혈우병의 예방적 치료는 지속적 또는 거의 지속적 기준으로 A형 혈우병 증상의 중증도를 완화하거나 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예방적 치료는 A형 혈우병의 증상 발생 전에, 예를 들어, 출혈 사건 전에 투여된다. 다른 실시형태에서, 예방적 치료는 정기적으로 증상의 개시 전에 증상의 개시를 방지하거나 중증도를 줄이기 위해, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 투약 간격을 두고 투여된다. 본 명세서에 개시된 임의의 투약 간격은 A형 혈우병의 예방적 치료에서 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 A형 혈우병의 한 가지 이상의 증상을 가져올 수 있는 활성 전에, 예를 들어, 대증적 치료로서 투여된다. 예를 들어, 대상체가 수술을 받거나 신체 외상 및/또는 출혈 사건의 위험을 달리 증가시키는 활동에 관여하기 전에 A형 혈우병을 앓고 있는 대상체에게 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 대증적으로 투여될 때, 키메라 폴리펩티드는 단일 용량 또는 다회 용량으로서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대증적 치료는 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간, 적어도 약 108시간 또는 적어도 약 120시간의 투약 간격을 두고 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 대증적 치료는 적어도 2회 용량, 적어도 3회 용량, 적어도 4회 용량 또는 적어도 5회 용량의 키메라 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 1회 이상의 FVIII 대체 요법으로 치료되었다. 특정 실시형태에서, 대상체는 이전의 FVIII 대체 요법에 반응하지 않았다. 특정 실시형태에서, FVIII 대체 요법은 엘록케이트(ELOCTATE)® 또는 애드베이트(ADVATE)®이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 성인이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 성인 남성이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 성인 여성이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 소아, 예를 들어, 약 12세 이하, 또는 약 11세 이하, 또는 약 10세 이하, 또는 약 9세 이하, 또는 약 8세 이하, 또는 약 7세 이하, 또는 약 6세 이하, 또는 약 5세 이하, 또는 약 4세 이하, 또는 약 3세 이하, 또는 약 2세 이하 또는 약 1세 이하이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 여성이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 남성이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 12세 이하의 여성이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 11세 이하의 여성이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 약 10세 이하의 여성이다.
본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 정맥내 주사, 정맥내 주입, 피하 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 비강 투여 및 폐 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 정맥내로 투여된다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 피하로 투여된다.
일부 실시형태에서, 투여 후 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN는 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9% 또는 적어도 약 10%의 FVIII 혈장 활성 수준을 초래한다. 특정 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 3%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 4%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 5%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 4%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 5%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 5.6%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 7%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 10%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 12%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 12.95%이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 혈장 활성 수준은 백분율(%)로서 표현된다. 대안적으로, 혈장 활성은 IU/㎗ 단위로 표현될 수 있되, 1%는 1 IU/㎗와 동일하다.
일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은, 예를 들어, 25 IU/㎏의 용량으로 키메라 폴리펩티드 투여 후 적어도 약 5일에 적어도 약 10%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은, 예를 들어, 25 IU/㎏의 용량으로 키메라 폴리펩티드 투여 후 적어도 약 5일에 적어도 약 12%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은, 예를 들어, 25 IU/㎏의 용량으로 키메라 폴리펩티드 투여 후 적어도 약 5일에 적어도 약 12.95%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은, 예를 들어, 25 IU/㎏의 용량으로 키메라 폴리펩티드 투여 후 적어도 약 7일에 적어도 약 5%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은, 예를 들어, 25 IU/㎏의 용량으로 키메라 폴리펩티드 투여 후 적어도 약 7일에 적어도 약 5.6%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은, 예를 들어, 25 IU/㎏의 용량으로 키메라 폴리펩티드 투여 후 적어도 약 8일에 적어도 약 3%이다. 일부 실시형태에서, FVIII 혈장 활성 수준은, 예를 들어, 25 IU/㎏의 용량으로 키메라 폴리펩티드 투여 후 적어도 약 10일에 적어도 약 1%이다.
본 개시내용은 또한 (i) FVIII 단백질 및 (ii) VWF 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 A형 혈우병을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 제1 제형에 존재하고, VWF 단편은 제2 제형에 존재한다. 다른 실시형태에서, FVIII 단백질 및 VWF 단편은 동일한 제형에 존재한다. 특정 실시형태에서, FVIII 단백질 및 VWF 단편은 단일 제형의 별개의 성분이다. 특정 실시형태에서, FVIII 단백질, 예를 들어, 단일 쇄 FVIII, FVIII-Fc, 페길화된 FVIII, 전장 성숙 FVIII, 또는 B 도메인 결실된 FVIII은 본 명세서에 개시된 용량, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 용량, 예를 들어, 25 IU/㎏, 30 IU/㎏, 35 IU/㎏, 40 IU/㎏, 45 IU/㎏, 50 IU/㎏, 55 IU/㎏, 60 IU/㎏ 또는 65 IU/㎏으로, 그리고 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일 또는 적어도 14일의 투약 간격으로 투여되고, VWF 단편은 투여되는 VWF 단편 대 FVIII 분자의 용량이 적어도 약 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 1000:1, 2000:1, 3000:1, 4000:1, 5000:1, 10,000:1, 50,000:1, 100,000:1, 또는 500,000:1으로 투여된다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질과 동시에, 직후에 또는 직전에 대상체에게 투여된다. 특정 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질 전 약 0.5시간, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 또는 약 6시간에 투여된다. 다른 실시형태에서, FVIII 단백질은 VWF 단편 전 약 0.5시간, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 또는 약 6시간에 투여된다.
C. 면역 관용 유도
본 개시내용의 특정 양상은 FVIII 단백질 및 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병의 치료가 필요한 대상체에서 A형 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이되, 키메라 폴리펩티드는 대상체에서 FVIII에 대한 면역 관용을 유도한다. 본 개시내용의 일부 양상은 FVIII 단백질 및 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병의 치료가 필요한 대상체에서 A형 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이되, 키메라 폴리펩티드는 대상체에서 FVIII에 대한 저해 반응을 감소시킨다. 본 개시내용의 일부 양상은 FVIII 단백질 및 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하는, A형 혈우병의 치료가 필요한 대상체에서 A형 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이되, 키메라 폴리펩티드는 투여 후 키메라 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도하지 않는다. 본 개시내용의 다른 양상은 (1) 유효량의 본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈우병을 갖는 인간에서 면역 관용을 유도하는 방법에 관한 것이되, 유효량의 키메라 폴리펩티드는 인간에서 면역 관용을 유도한다. FVIII 및 Fc를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 이용하는 면역 관용 유도의 다양한 방법은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 2018/102760 A1에 개시되어 있다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 (2) 조성물 또는 키메라 폴리펩티드의 점감 요법(tapering regimen)을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 다음의 면역 관용 유도를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 관용은 인간에서 저해 항체의 역가가 약 0.6 BU 미만일 때 일어난다. 특정 실시형태에서, 면역 관용은 인간에서 저해 항체의 역가가 약 0.6 BU 미만이고, 혈장에서 모니터링된 응고 인자의 회수율이 60%일 때 일어난다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (3) 점감 요법 후에, 응고 인자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 예방적 용량을 인간에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 양상에서, 인간은 이전에 응고 인자에 대한, 예를 들어, FVIII에 대한 면역 관용 요법으로 치료받은 적이 없다. 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은, 인간이 저해제 면역 반응이 발생되었다는 것을 결정한 임의의 시간에, 예를 들어, 인간에서 저해성 면역 반응 수준을 측정한 후에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 저해제 면역 반응의 발생을 방지하기 위해 아직 한 가지 이상의 저해제 면역 반응이 발생되지 않은 인간에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 저해제 면역 반응이 발생될 가능성(예를 들어, 가족력, 유전적 소인, 또는 나타나는 바이오마커)이 높은 인간에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 투여 이전에 저해성 면역 반응의 수준 또는 저해제 면역 반응의 발생 가능성을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은, 인간이 저해성 면역 반응이 발생되었거나 인간이 저해제 면역 반응 가능성을 갖는지를 결정한 후에, 예를 들어, 인간에서 저해제 면역 반응 수준 또는 저해제 면역 반응 가능성을 측정한 후에 약 1일 미만, 약 2일 미만, 약 3일 미만, 약 4일 미만, 약 5일 미만, 약 6일 미만, 약 7일 미만, 약 2주 미만, 약 3주 미만, 약 4주 미만, 약 2개월 미만, 약 3개월 미만, 약 4개월 미만, 약 5개월 미만, 약 6개월 미만, 약 1년 미만, 약 2년 미만, 약 3년 미만, 약 4년 미만 또는 약 5년에 인간에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은, 인간에서 저해제 면역 반응이 발생되었거나 인간에서 저해제 면역 반응의 발생 가능성이 있는 것으로 결정된 직후, 예를 들어, 인간에서 저해성 면역 반응의 수준 또는 저해제 면역 반응의 발생 가능성을 측정한 직후에 투여된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은, 인간에서 저해제 면역 반응이 발생되었거나, 인간에서 저해제 면역 반응의 발생 가능성이 높은 것으로 결정된 후, 예를 들어 인간에서 저해성 면역 반응의 수준 또는 저해제 면역 반응의 발생 가능성을 측정한 후, 약 5분 미만, 약 10분 미만, 약 15분 미만, 약 20분 미만, 약 30분 미만, 약 45분 미만, 약 1시간 미만, 약 2시간 미만, 약 3시간 미만, 약 4시간 미만, 약 5시간 미만, 약 6시간 미만, 약 7시간 미만, 약 8시간 미만, 약 9시간 미만, 약 10시간 미만, 약 11시간 미만, 약 12시간 미만, 약 18시간 미만, 또는 약 24시간 미만에 인간에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은, 인간에서 저해제 면역 반응이 발생되었거나, 인간에서 저해제 면역 반응의 발생 가능성이 높은 것으로 결정된 후, 예를 들어 인간에서 저해성 면역 반응의 수준 또는 저해제 면역 반응의 발생 가능성을 측정한 후, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 18시간, 또는 약 24시간에 인간에게 투여된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN은, 인간에서 저해제 면역 반응이 발생되었거나 인간에서 저해제 면역 반응의 발생 가능성이 있는 것으로 결정된 후 약 1일 미만에, 예를 들어, 인간에서 저해성 면역 반응의 수준 또는 저해제 면역 반응의 발생 가능성을 측정한 후에 투여된다.
면역 반응의 유도는 저해제의 수준이 특정 수준보다 낮아질 때까지 또는 저해제가 검출되지 않을 때까지 계속될 수 있다. 특정 실시형태에서, 유도 기간은 적어도 약 24주, 적어도 약 26주, 적어도 약 28주, 적어도 약 30주, 적어도 약 32주, 적어도 약 34주, 적어도 약 36주, 적어도 약 38주, 적어도 약 40주, 적어도 약 42주, 적어도 약 44주, 적어도 약 46주, 적어도 약 48주, 적어도 약 50주, 적어도 약 52주, 적어도 약 54주, 적어도 약 56주, 적어도 약 58주, 적어도 약 60주, 적어도 약 62주, 적어도 약 64주, 적어도 약 66주, 적어도 약 68주, 또는 적어도 약 70주 동안 계속될 수 있다. 특정 실시형태에서, 유도 기간은 60주 미만이다.
본 발명의 방법에 의해 치료되는 저해성 면역 반응은, 응고 인자 치료의 하나 이상의 효과에 나쁜 영향을 미치는, 인간 내의 임의의 반응을 포함한다. 일부 실시형태에서, 저해성 면역 반응은 응고 인자에 대한 저해 항체, 예를 들어, 저해 항-FVIII 항체의 생성을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하기 전에(예를 들어, 기준점에서) 그리고 투여한 후에 인간에서 한 가지 이상의 저해 항체의 역가를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 전의(예를 들어, 기준점에서) 저해 항체의 역가는 적어도 약 0.6 베데스다 단위(Bethesda Unit: BU)이다. 특정 실시형태에서, 투여 전의(예를 들어, 기준점에서) 저해 항체의 역가는 적어도 약 1 BU, 적어도 약 2 BU, 적어도 약 3 BU, 적어도 약 4 BU, 적어도 약 5 BU, 적어도 약 6 BU, 적어도 약 7 BU, 적어도 약 10 BU, 적어도 약 20 BU, 적어도 약 30 BU, 적어도 약 40 BU, 적어도 약 50 BU, 적어도 약 100 BU, 적어도 약 150 BU, 또는 적어도 약 200 BU이다. 하나의 특정 실시형태에서, 투여 전의(예를 들어, 기준점에서) 저해 항체의 역가는 적어도 약 5 BU이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 투여 전의 저해 항체의 역가에 비해 인간 대상체에서 저해 항체의 역가를 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 투여 후 저해 항체의 역가는 약 0.6 BU 미만이다. 일부 실시형태에서, 투여 후 저해 항체의 역가는 약 0.5 BU 미만, 약 0.4 BU 미만, 약 0.3 BU 미만, 약 0.2 BU 미만, 또는 약 0.1 BU 미만이다. 하나의 특정 실시형태에서, 투여 후 저해 항체의 역가는 약 0 BU이다. 다른 실시형태에서, 투여 후 저해 항체의 역가는 5 BU 미만, 4 BU 미만, 3 BU 미만, 2 BU 미만, 1 BU 미만, 0.9 BU 미만, 0.8 BU 미만, 0.7 BU 미만, 또는 0.6 BU 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 투여는 비치료 대조군 및 응고 인자 단독으로 처리한 인간에서의 대식세포 분화에 비해, M2-유사 표현형에 대해 인간에서 대식세포의 분화를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, M2-유사 표현형은 NRF2 경로, PPAR 감마 경로, 또는 NRF2 경로와 PPAR 감마 경로 둘 다의 상향 조절을 포함한다. 일부 실시형태에서, M2-유사 표현형은 CD206(MRC1)의 상향 조절을 포함한다. 일부 실시형태에서, M2-유사 표현형은 ARG1의 상향 조절을 포함한다. 일부 실시형태에서, M2-유사 표현형은 CD206(MRC1) 및 ARG1의 상향 조절을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 투여는 비치료 대상체에서 또는 응고 인자 단독으로 처리한 대상체에서의 한 가지 이상의 유전자의 발현에 비해, 인간에서의 한 가지 이상의 유전자의 더 큰 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 투여는 Hmox1, PPAR 감마, LPL, EGR2, SLCO4A1, 헴 옥시게나제 1(HO-1), 산화 스트레스 유도 성장 인자 1(OSGIN1), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1), 글루타티온-이황화물 환원효소(GSR), 글루탐산염-시스테인 리가제 촉매 서브유닛(GCLC), 글루탐산염-시스테인 리가제 변경인자 서브유닛(GCLM), NAD(P)H 퀴논 탈수소 효소 1(NQO1), 지방산 결합 단백질 5(FABP5), B7-H3(CD276), SLAM 패밀리 구성원 3(SLAMF3; 림프구 항원 9; LY9), SLAM 패밀리 구성원 7(SLAMF7), 만노스 수용체 C-형 1(MRC1), 용질 운반체 패밀리 12 구성원 4(SLC12A), 뉴로필린 1(NRP1), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 유전자의 더 큰 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 투여는 NRF2 경로의 한 가지 이상의 유전자의 더 큰 발현을 초래한다. 특정 실시형태에서, NRF2 경로의 한 가지 이상의 유전자는 HO-1, OSGIN1, SOD1, GSR, GCLC, GCLM, NQO1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 투여는 PPAR 감마 경로의 하나 이상의 유전자의 더 큰 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, PPAR 감마 경로의 한 가지 이상의 유전자는 PPAR 감마, LPL, FABP5, EGR2, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 투여는 B7-H3(CD276), SLAMF3, SLAMF7, MRC1, SLC12A, NRP1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 가지 이상의 유전자의 더 큰 발현을 초래한다. 특정 실시형태에서, 투여는 비치료 인간에서 또는 응고 인자 단독으로 치료된 인간에서의 하나 이상의 유전자의 발현에 비해 하나 이상의 유전자의 더 큰 발현을 초래하되, 발현은 적어도 약 1.5배 크거나, 적어도 약 2배 크거나, 적어도 약 2.5배 크거나, 적어도 약 3배 크거나, 적어도 약 3.5배 크거나, 적어도 약 4배 크거나, 적어도 약 4.5배 크거나, 또는 적어도 약 5배 더 크다.
일부 실시형태에서, 하 가지 이상의 유전자의 차별적 발현은 본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드, 예를 들어, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 투여 후 6시간 미만에 관찰된다. 일부 실시형태에서, 차별적 발현은 투여 후 12시간 미만에 관찰된다. 일부 실시형태에서, 차별적 발현은 투여 후 18시간 미만에 관찰된다. 일부 실시형태에서, 차별적 발현은 투여 후 24시간 미만에 관찰된다.
일부 실시형태에서, 저해성 면역 반응은 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 매개 면역 반응은 사이토카인의 방출을 포함한다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 면역 반응 증가와 관련된 임의의 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IL-1, IL-6, IL-16, IL-12, IL-4, IL-17, 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터페론 α, 인터페론 γ 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 세포 매개 면역 반응은 IL-12의 혈청 수준 증가를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 매개 면역 반응은 IL-4의 혈청 수준 증가를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 매개 면역 반응은 IL-17의 혈청 수준 증가를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 매개 면역 반응은 TNF-α의 혈청 수준 증가를 포함한다.
다양한 유전자 돌연변이는 저해성 면역 반응의 발생 위험 증가와 관련되어 있다. 예를 들어, TNF의 구성적 및 유도성 전사 수준의 증가와 연관된 Hap2 내의 TNF-α-308G>A 다형성은 저해성 면역 반응의 발생 위험 증가와 관련되어 있다. 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[Astermark et al., Blood 108: 3739-3745 (2006)] 참조. 따라서, 일부 실시형태에서, 인간은 TNF-α의 증가와 연관된 유전적 다형성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다형성은 TNF-α-308G>A 다형성이다. 일부 실시형태에서, 인간은 IL10 유전자에서의 다형성, 예를 들어 IL10의 분비 증가와 연관된 다형성을 갖는다. 일부 실시형태에서, FVIII-Fc는 IL10 유전자의 프로모터 영역에서 IL10G 미세부수체의 대립유전자 134를 가진 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[Astermark et al. Hemostatis, Thrombosis, and Vascular Biology 108: 3739-3745 (2006)]참조.
일부 실시형태에서, 인간은 CTLA-4(세포독성 T-림프구 항원 4)의 발현 감소와 연관된 유전적 다형성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 인간은 DR15(HLA-DR15) 또는 DQB0602 MHC(주조직 적합성 복합체) 클래스 II 분자에서 돌연변이를 갖는다. A형 혈우병을 갖는 대상체에서 저해성 면역 반응의 발생과 연관된 다른 MHC 클래스 II 분자는 A3, B7, C7, DQA0102, C2, DQA0103, DQB0603 및 DR13이다(문헌[Inhibitors in Patients with Hemophilia, E.C. Rodriguez-Merchan & C.A. Lee, Eds., Blackwell Science, Ltd,, 2002] 참조).
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 FVIII 단백질로 이루어진 폴리펩티드를 이용하여 이전에 치료를 받은 대상체에서의 하나 이상의 사이토카인의 수준에 비해 대상체에서의 하나 이상의 사이토카인의 수준을 감소시킨다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 투여 전에 대상체에서의 하나 이상의 사이토카인의 수준과 비해 대상체에서의 하나 이상의 사이토카인의 수준을 감소시킨다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 관용원성(tolerogenic) 분자의 발현은 본 개시내용의 방법에 따른 투여 전의 하나 이상의 관용원성 분자의 발현 수준에 비해 투여 이후에 증가된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 관용원성 분자는 IL-10, TGF-β, IL-35, IDO-1, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 면역 반응은 증가된 출혈 경향, 높은 응고 인자 소모, 응고 인자 요법에 대한 반응 결여, 응고 인자 요법의 감소된 효능, 응고 인자의 단축된 반감기, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 반응은 증가된 출혈 경향, 높은 응고 인자 소모, 응고 인자 요법에 대한 반응 결여, 응고 인자 요법의 감소된 효능, 혈장에서 모니터링할 때 응고 인자 활성의 감소된 회복, 응고 인자의 단축된 반감기, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 임상 증상을 포함한다.
특정 실시형태에서, 인간은 저해성 면역 반응을 가진 것으로 이전에 진단되었다. 이러한 진단은 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 인간이 다음 중 하나 이상을 갖는 경우, 인간은 FVIII과 같은 응고 인자에 대한 면역 반응을 갖는 것으로 특성규명될 수 있다: (A) 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 0.6 BU 이상임; (b) IL-12, IL-4, IL-17, 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 혈청 수준 증가; (c) 출혈 경향의 증가; (d) 응고 인자의 대량 소모; (e) 응고 인자 요법에 대한 반응 결여; (f) 응고 인자 요법의 효능 감소; (g) 응고 인자 반감기의 단축, 및 이들의 임의의 조합. 하나의 특정한 실시형태에서, 인간이 0.6 BU 이상인 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가를 갖는 경우, 인간은 응고 인자에 대한 면역 반응을 갖는 것으로 특성규명된다.
일부 실시형태에서, 인간은 투여 전 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 7개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 11개월, 적어도 약 12개월, 적어도 약 13개월, 적어도 약 14개월, 적어도 약 15개월, 적어도 약 16개월, 적어도 약 17개월, 적어도 약 18개월, 적어도 약 19개월, 적어도 약 20개월, 적어도 약 21개월, 적어도 약 22개월, 적어도 약 23개월, 적어도 약 24개월, 적어도 약 27개월, 적어도 약 30개월, 적어도 약 33개월, 적어도 약 36개월, 적어도 약 39개월, 적어도 약 42개월, 적어도 약 45개월, 적어도 약 48년, 적어도 약 51개월, 적어도 약 54개월, 적어도 약 57개월, 적어도 약 60개월, 적어도 약 6년, 적어도 약 7년, 적어도 약 8년, 적어도 약 10년, 적어도 약 15년, 또는 적어도 약 20년에 응고 인자에 대한 저해성 면역 반응이 발생된 것으로 이전에 진단되었다. 일 실시형태에서, 인간은 투여 전 적어도 약 5년에 응고 인자에 대한 저해성 면역 반응이 발생된 것으로 이전에 진단되었다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 면역 관용을 유도하는 표준 치료 방법에 비해 관용까지의 개선된 시간을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "관용까지의 시간"은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질의 제1 용량의 투여와 인간에서의 면역 관용 발생 사이의 기간을 지칭한다. 관용까지의 시간을 단축시키는 것은, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 관용을 달성하는 데 필요한 총 재정 부담 감소를 포함하여, 인간에게 상당한 이익을 줄 수 있다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 1 내지 약 24주, 약 1 내지 약 23주, 약 1 내지 약 22주, 약 1 내지 약 21주, 약 2 내지 약 20주, 약 2 내지 약 19주, 약 2 내지 약 18주, 약 2 내지 약 17주, 약 3 내지 약 16주, 약 3 내지 약 15주, 약 3 내지 약 14주, 약 3 내지 약 13주, 약 4 내지 약 12주, 약 4 내지 약 11주, 약 4 내지 약 10주, 약 4 내지 약 9주, 약 5 내지 약 8주, 약 5 내지 약 7주, 약 5 내지 약 6주, 약 1 내지 약 12주, 약 1 내지 약 11주, 약 1 내지 약 10주, 약 1 내지 약 9주, 약 1 내지 약 8주, 약 1 내지 약 7주, 약 1 내지 약 6주, 약 1 내지 약 5주, 또는 약 1 내지 약 4주이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 70주 미만, 약 65주 미만, 약 60주 미만, 약 58주 미만, 약 56주 미만, 약 54주 미만, 약 52주 미만, 약 50주 미만, 약 48주 미만, 약 46주 미만, 약 44주 미만, 약 42주 미만, 약 40주 미만, 약 38주 미만, 약 36주 미만, 약 34주 미만, 약 32주 미만, 약 30주 미만, 약 28주 미만, 약 26주 미만, 약 24주 미만, 약 23주 미만, 약 22주 미만, 약 21주 미만, 약 20주 미만, 약 19주 미만, 약 18주 미만, 약 17주 미만, 약 16주 미만, 약 15주 미만, 약 14주 미만, 약 13주 미만, 약 12주 미만, 약 11주 미만, 약 10주 미만, 약 9주 미만, 약 8주 미만, 약 7주 미만, 약 6주 미만, 약 5주 미만, 약 4주 미만, 약 3주 미만, 약 2주 미만, 또는 약 1주 미만이다. 특정 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 4주 또는 약 12주이다. 일 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 4주이다. 또 다른 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 12주이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 10개월 미만이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 9개월 미만이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 8개월 미만이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 7개월 미만이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 6개월 미만이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 5개월 미만이다. 일부 실시형태에서, 관용까지의 시간은 약 4개월 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 응고 인자 단독으로 치료한 후 관용까지의 시간에 비해, 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질로 치료한 후 인간에서 관용까지의 시간이 단축되는 결과를 야기한다.
일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 약 0.6 BU 미만인 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 약 0.5 BU 미만인 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 약 0.4 BU 미만인 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 약 0.3 BU 미만인 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 약 0.2 BU 미만인 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 약 0.1 BU 미만인 것을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 응고 인자에 대한 저해 항체의 역가가 0.0 BU인 것을 특징으로 한다. 특정 실시형태에서, 저해 면역 항체의 역가는 2회의 연속 측정에서, 예를 들어, 4주 기간 이내의 연속 2주에서 관찰된다.
일부 실시형태에서, 면역 관용의 발생은 66%를 초과하는 증분 회복률(incremental recovery)(예를 들어, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%의 증분 회복률)을 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "증분 회복률"은 주입 후 15 내지 30분의 피크 FVIII 수준을 지칭한다.
유도 기간 및 점감 기간이 완료된 후, 이어서, 대상체는 키메라 단백질의 예방 치료에 들어갈 수 있다. 예방적 투약 요법은 본 명세서에 개시된 임의의 투약 요법일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시의 방법을 사용해 치료된 인간은 면역 자극 치료를 받고 있거나 최근에 받은 적이 있다. 예를 들어, 인터페론을 이용한 치료를 받고 있는 HCV 양성 A형 혈우병 환자에서뿐만 아니라 항-레트로바이러스 요법과 연관된 면역 재구성 염증 증후군(immune reconstitution inflammatory syndrome)을 앓고 있는 HIV 양성 A형 혈우병 환자에서도 저해제가 보고된 적이 있다. 유럽 의약청의 Expert Meeting on FVIII Products and Inhibitor Development(2006년 2월 28일 내지 2006년 3월 2일) 보고서를 참조한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 인간은 인터페론 요법을 받는 중이다. 일부 실시형태에서, 인간은 항바이러스 요법을 받는 중이다. 일부 실시형태에서, 인간은 항레트로바이러스 요법을 받는 중이며 면역 재구성 염증 증후군을 앓고 있다.
특정 실시형태에서, 인간은 FVIII와 같은 응고 인자에 150 노출일(exposure day: ED) 미만으로 노출된 적이 있다. 일 실시형태에서, 인간은 50 ED 미만으로 노출된 적이 있다. 다른 실시형태에서, 인간은 20 ED 미만으로 노출된 적이 있다.
본 개시내용의 일부 양상은 응고 인자 및 Fc 영역을 포함하는 조성물 또는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 응고 인자에 대한 알레르기 반응이나 아나필락시스(anaphylactic) 반응의 발생 또는 이의 중증도를 감소시키는 것이 필요한 대상체에서 이를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 조성물 또는 키메라 단백질의 투여는 응고 인자에 대한 아나필락시스 반응의 중증도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 조성물 또는 키메라 단백질의 투여는 응고 인자에 대한 알레르기 반응의 중증도를 감소시킨다.
III.
키메라 폴리펩티드
본 개시내용에 유용한 키메라 폴리펩티드는 FVIII 폴리펩티드를 포함하는 FVIII 단백질 및 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함한다. VWF 단편은 FVIII 단백질이 내인성 VWF와 상호작용하는 것을 방지하거나 차단함으로써, 클리어런스 경로를 통해 FVIII 단백질이 클리어런스되는 것을 방지하는 데 사용된다. FVIII 단백질이 VWF 단편으로부터 해리되는 것을 방지하기 위해, 일부 실시형태에서, FVIII 단백질 및 VWF 단편은 FVIII과 VWF와의 천연 상호작용보다 더 강한 회합을 통해 서로 직접적으로 또는 간접적으로 회합된다.
특정 실시형태에서, FVIII 단백질은 공유 결합에 의해 VWF 단편과 회합된다. 공유 결합은 당업계에 공지된 임의의 공유 결합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 공유 결합은 이황화 결합이다. 일부 실시형태에서, 공유 결합은 펩티드 결합이다. 다른 실시형태에서, FVIII 단백질은 FVIII 단백질과 VWF 단편 간의 상호작용 강도를 증가시키도록 변형된다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질과 VWF 단편 간의 상호작용 강도를 증가시키도록 변형된다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질과 VWF 단백질은 둘 다 FVIII 단백질과 VWF 단편 간의 상호작용 강도를 증가시키도록 변형된다.
특정 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드를 포함하는 FVIII 단백질 및 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 FVIII 폴리펩티드 서열 내 적어도 하나의 아미노산과 VWF의 D' 및 D3 도메인 내 적어도 하나의 아미노산 사이의 적어도 하나의 공유 결합을 통해 간접적으로 회합된다. 다른 실시형태에서, FVIII 단백질과 VWF 단편은 FVIII 폴리펩티드 서열 내 적어도 하나의 아미노산과 VWF의 D' 및 D3 도메인과 직접적으로 융합된 이종성 서열 내 적어도 하나의 아미노산 사이의 적어도 하나의 공유 결합을 통해 간접적으로 회합한다. 다른 실시형태에서, FVIII 단백질 및 VWF 단편은 FVIII 폴리펩티드와 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 이종성 서열 내 적어도 하나의 아미노산과 VWF 단편 서열 내 적어도 하나의 아미노산 사이의 적어도 하나의 공유 결합을 통해 간접적으로 회합한다. 또 다른 실시형태에서, FVIII 단백질 및 VWF 단편은 VWF의 D' 및 D3 도메인과 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 이종성 서열 내 적어도 하나의 아미노산과 FVIII 폴리펩티드와 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 이종성 서열 내 적어도 하나의 아미노산 사이의 적어도 하나의 공유 결합을 통해 간접적으로 회합한다.
본 개시내용의 FVIII 단백질은 FVIII 폴리펩티드, 및 FVIII 폴리펩티드와 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 하나 이상의 이종성 모이어티, 예를 들어, 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 VWF 단편은 또한 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인, 및 VWF의 D' 및 D3 도메인과 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 하나 이상의 이종성 모이어티, 예를 들어, 반감기 연장 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 FVIII 단백질은 FVIII 폴리펩티드로 본질적으로 이루어지거나 이루어지고, 본 개시내용에 유용한 VWF 단편은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인, 및 VWF의 D' 및 D3 도메인과 직접적으로 또는 간접적으로 융합된 하나 이상의 이종성 모이어티, 예를 들어, 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 FVIII 폴리펩티드, 및 FVIII 폴리펩티드와 간접적으로 또는 직접적으로 융합된 하나 이상의 이종성 모이어티, 예를 들어, 반감기 연장 모이어티를 포함하고, 본 개시내용에 유용한 VWF 단편은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인으로 본질적으로 이루어지거나 이루어진다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 FVIII 폴리펩티드로 본질적으로 이루어거나 이루어진 FVIII 단백질 및 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인으로 본질적으로 이루어지거나 이루어진 VWF 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 폴리펩티드 또는 단백질은 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이량체이다. 일 실시형태에서, FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이량체 키메라 폴리펩티드는 하기를 포함한다: (i) FVIII 폴리펩티드, FVIII 폴리펩티드의 B 도메인 내에 삽입된 XTEN, 및 제1 Fc 영역을 포함하는, FVIII 단백질; 및 (ii) VWF 단편, 제2 XTEN 서열, a2 링커, 및 제2 Fc 영역을 포함하는, VWF 단백질. 예시적인 FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이량체, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 개략적 표현은 도 1에 제시한다.
구체적 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 rFVIIIFc-VWF-XTEN이다. 다른 구체적 실시형태에서, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 (i) 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질 및 (ii) 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 (i) FVIII 단백질 및 (ii) 이황화 결합을 통해 공유적으로 연결된 VWF 단백질을 포함한다.
III.A. 인자 VIII 폴리펩티드
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "인자 VIII"은 본 출원 전체적으로 "FVIII"로 약칭되며, 달리 명시되지 않는 한, 응고에서 정상적인 역할을 하는 기능적 FVIII 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 용어 FVIII는 기능적인 변이체 폴리펩티드를 포함한다. "FVIII 단백질"은, FVIII 단백질이 FVIII 기능/활성을 나타낸다면, FVIII 폴리펩티드(또는 단백질) 단독, 추가적인 폴리펩티드에 융합된 FVIII 폴리펩티드, 및 하나 이상의 추가적인 폴리펩티드와 연관된 FVIII 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "FVIII 폴리펩티드", "FVIII 부분" 및 "FVIII"은 FVIII 폴리펩티드 서열 단독을 지칭한다. FVIII의 기능/활성의 예는, 응고를 활성화하는 능력, 인자 IX에 대한 보조인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에 인자 IX와 테나제(tenase) 복합체를 형성하고, 이어서 인자 X를 활성화 형태인 Xa로 전환시키는 능력을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. FVIII 폴리펩티드는 인간, 돼지, 개, 래트 또는 뮤린 FVIII 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 인간과 다른 종으로부터의 FVIII 간의 비교를 통해 기능에 필요한 것으로 보이는 보존된 잔기를 확인하였다(Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); 미국 특허 제6,251,632호). 전장 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열은 많은 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 형태로서 알려져 있다. 다양한 FVIII 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 미국 공개 제2015/0158929 A1호, 제2014/0308280 A1호, 및 제2014/0370035 A1호, 및 국제 공개 제WO 2015/106052 A1호에 개시되어 있다. FVIII 폴리펩티드는, 예를 들어, 전장 FVIII, N-말단에서 Met이 결실된 전장 FVIII, 성숙 FVIII 폴리펩티드(신호 서열이 결실됨), N-말단에서 추가 Met를 갖는 성숙 FVIII 폴리펩티드 및/또는 B 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. FVIII 변이체는 B 도메인의 부분적 또는 전체적 결실을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 키메라 폴리펩티드의 FVIII 폴리펩티드는 혈장에서 FVIII 활성을 가진다. FVIII 활성은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 응고 시스템의 기능을 평가하기 위해 다음의 다수의 시험을 이용할 수 있다: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time: aPTT) 시험, 비색성 분석(chromogenic assay), ROTEM 분석, 프로트롬빈 시간(prothrombin time: PT) 테스트(INR 결정에도 사용됨), (종종 클라우스 방법(Clauss method)에 의한) 피브리노겐 검사, 혈소판 계수, (종종 PFA-100에 의한) 혈소판 기능 테스트(platelet function testing), TCT, 출혈 시간(bleeding time), 혼합 검사(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합되면 이상성이 교정되는지 여부), 응고 인자 분석, 항인지질 항체(antiphospholipie antibodies), D-이량체(D-dimer), 유전자 검사(예를 들어, 인자 V 라이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀 사독 시간(dilute Russell's viper venom time: dRVVT), 기타 혈소판 기능 검사(miscellaneous platelet function tests), 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography; TEG 또는 소노클롯(Sonoclot)), 트롬보엘라스토메트리(thromboelastometry: TEM®, 예를 들어, 로템(ROTEM)® 또는 유글로불린 용해 시간(euglobulin lysis time: ELT).
aPTT 검사는 "고유" 응고 경로(접촉 활성화 경로로도 지칭됨)와 공통 응고 경로 둘 다의 효능을 측정하는 성능 지표이다. 이러한 시험은 FVIII와 같은 상업적으로 이용 가능한 재조합 응고 인자의 응고 활성을 측정하는 데 공통적으로 사용된다. 이는 외인성 경로를 측정하는 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 사용된다. (예를 들어, 문헌[Kamal et al., Mayo Clin Proc., 82(7):864-873 (2007)] 참조). 일 실시형태에서, FVIII 활성이 BCS® XP 분석기(Siemens Healthcare Diagnostics) 상에서 데이드(Dade)® 액틴(Actin)® FSL 활성화 PTT 시약(지멘스 헬스 케어 다이아그노스틱스(Siemens Health Care Diagnostics))을 이용하여 측정되는 분석을 이용하여 aPTT가 시험된다. 추가 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 aPTT 시험에 의해 측정할 때 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 또는 약 20%의 혈장 FVIII 활성을 가진다.
aPTT 분석은 또한 환자 또는 대상체에 대한 투여 전에 키메라 폴리펩티드의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다(문헌[Hubbard AR, et al. J Thromb Haemost 11: 988-9 (2013)]). aPTT 분석은 추가로 환자 또는 대상체에 대한 투여 전에 또는 투여 후에 본 명세서에 기재된 임의의 분석과 함께 사용될 수 있다.
로템(ROTEM) 분석은 지혈의 전체 역학에 대한 정보를 제공한다: 응고 시간, 응고물 형성, 응고물 안정성 및 용해. 혈전탄성측정(thromboelastometry)에서의 상이한 파라미터는 혈장 응고 시스템, 혈소판 기능, 섬유소 용해, 또는 이러한 상호 작용에 영향을 미치는 많은 인자의 활성에 따라 달라진다. 이러한 분석은 2차 지혈에 대한 완전한 관점을 제공할 수 있다.
발색성 분석 메커니즘은, 활성화된 인자 IX, 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에 활성화된 FVIII가 인자 X의 인자 Xa로의 전환을 가속화시키는 혈액 응고 연쇄반응의 원리에 기반한다. 인자 Xa의 활성은 인자 Xa에 특이적인 p-니트로아닐라이드(pNA) 기질의 가수분해에 의해 평가된다. 405 nM에서 측정된 p-니트로아닐라이드의 초기 방출 속도는 인자 Xa의 활성에 정비례하므로, 샘플에서 FVIII의 활성에도 정비례한다. 일 실시형태에서, 발색성 분석은 바이오펜(BIOPHEN) FVIII:C 분석(프랑스 누빌 수 와즈에 소재한 하이펜 바이오메드(Hyphen Biomed))이다.
발색성 분석은 국제 혈전 지혈 학회(International Society on Thrombosis and Hemostatsis; ISTH)의 과학 및 표준화 위원회(Scientific and Standardization Committee; SSC) 산하 FVIII 및 인자 IX 소위원회(FVIII and Factor IX Subcommittee)에 의해 권고된다. 1994년 이후, 발색성 분석은 FVIII 농축 효능을 할당하기 위한 유럽 약전의 기준 방법이기도 하다. 따라서, 일부 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 성숙 FVIII 폴리펩티드 또는 BDD FVIII 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드와 비슷한 FVIII 활성을 가진다(예를 들어, 리컴비네이트(RECOMBINATE)®, 코게네이트(KOGENATE) FS®, 헬릭세이트(HELIXATE) FS®, 진타(XYNTHA)/레팍토(REFACTO) AB®, 헤모필(HEMOFIL)-M®, 모나크-엠(MONARC-M)®, 모노클레이트-피(MONOCLATE-P)®, 휴메이트-피(HUMATE-P)®, 알파네이트(ALPHANATE)®, 코에이트(KOATE)-DVI®, 앱스틸라(AFSTYLA)®, 및 하야트(HYATE):C®).
발색성 분석은 또한 환자 또는 대상체에 대한 투여 전에 키메라 폴리펩티드의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다(문헌[Hubbard AR, et al. J Thromb Haemost 11: 988-9 (2013)]). 발색성 분석은 추가로 환자 또는 대상체에 대한 투여 전에 또는 투여 후에 본 명세서에 기재된 임의의 분석과 함께 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 FVIII 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 성숙 FVIII 또는 BDD FVIII 폴리펩티드(예를 들어, 애드베이트(ADVATE)®, 리팍토(REFACTO)® 또는 엘록테이트(ELOCTATE)®)를 포함하는 키메라 폴리펩티드와 비슷한 인자 Xa 생성 속도를 갖는다.
인자 X를 인자 Xa로 활성화시키기 위해, 활성화된 인자 IX(인자 IXa)는 인자 X 내의 하나의 아르기닌-이소류신 결합을 가수분해하여 Ca2+, 막 인지질, 및 FVIII 공동 인자의 존재 하에 인자 Xa를 형성한다. 따라서, 응고 경로에 있어서는 FVIII와 인자 IX의 상호 작용이 중요하다. 특정 실시형태에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, 애드베이트®, 리팍토® 또는 엘록테이트®)를 포함하는 키메라 폴리펩티드와 비슷한 속도로 인자 IXa와 상호 작용할 수 있다.
또한, FVIII는 순환 중 비활성일 때 폰 빌레브란트 인자에 결합된다. FVIII는 VWF에 결합되지 않으면 급속히 분해되고, 트롬빈의 작용에 의해 VWF로부터 방출된다. 일부 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 폰빌레브란트 인자, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 VWF 단편에 성숙 FVIII 폴리펩티드 서열 또는 BDD FVIII 폴리펩티드(예를 들어, 애드베이트®, 리팍토® 또는 엘록테이트®)를 포함하는 키메라 폴리펩티드와 비슷한 수준으로 결합한다.
FVIII는 칼슘 및 인지질의 존재 하에 활성화된 단백질 C에 의해 비활성화될 수 있다. 활성화된 단백질 C는 A1 도메인 내의 336번 아르기닌 다음의 FVIII 중쇄를 절단하여 인자 X의 기질 상호 작용 부위를 파괴하고, A2 도메인 내의 562번 아르기닌 다음을 절단하여 A2 도메인의 해리를 촉진할 뿐만 아니라 인자 IXa와의 상호 작용 부위도 파괴한다. 또한, 이러한 절단은 A2 도메인(43 kDa)을 양분하여 A2-N(18 kDa) 및 A2-C(25 kDa) 도메인을 생성한다. 따라서, 활성화된 단백질 C는 중쇄 내 다중 절단 부위를 촉매할 수 있다. 일부 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 성숙 FVIII 폴리펩티드 서열 또는 BDD FVIII 폴리펩티드(예를 들어, 애드베이트®, 리팍토® 또는 엘록테이트®)를 포함하는 키메라 폴리펩티드과 비슷한 수준으로 활성화된 단백질 C에 의해 비활성화된다.
다른 실시형태에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, 애드베이트®, 리팍토® 또는 엘록테이트®)를 포함하는 키메라 폴리펩티드와 비슷한 생체내 FVIII 활성를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, HemA 마우스 꼬리 정맥 가로 절단 모델에서, FVIII 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 성숙 FVIII 폴리펩티드 서열 또는 BDD FVIII 폴리펩티드(예를 들어, 애드베이트®, 리팍토® 또는 엘록테이트®)를 포함하는 키메라 폴리펩티드와 비슷한 수준으로 HemA 마우스를 보호할 수 있다.
인간 FVIII 서열(전장)의 예는 이하에 나타낸다.
FVIII 폴리펩티드는 전장 FVIII, N-말단에서 Met이 결실된 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열이 결실됨), N-말단에서 추가 Met를 갖는 성숙 FVIII 및/또는 B 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 FVIII을 포함한다. 특정 실시형태에서, FVIII 변이체는 B 도메인의 부분적 또는 전체적 결실을 포함한다.
천연 성숙 인간 FVIII 폴리펩티드의 서열은 서열번호 65로서 제시된다. 천연 FVIII 폴리펩티드는 다음의 식을 가진다: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, 여기서 A1, A2 및 A3은 구조적으로 관련된 "A 도메인"이고, B는 "B 도메인"이며, C1 및 C2는 구조적으로-관련된 "C 도메인"이고, a1, a2 및 a3은 산성 스페이서 영역이다. 서열번호 65에서 1차 아미노산 서열 위치에 관해, 인간 FVIII의 A1 도메인은 Ala1로부터 약 Arg336까지 연장되고, a1 스페이서 영역은 약 Met337로부터 약 Val374로 연장되며, A2 도메인은 약 Ala375로부터 약 Tyr719까지 연장되고, a2 스페이서 영역은 약 Glu720으로부터 약 Arg740까지 연장되며, B 도메인은 약 Ser741로부터 약 Arg 1648까지 연장되고, a3 스페이서 영역은 약 Glu1649로부터 약 Arg1689까지 연장되며, A3 도메인은 약 Ser1690으로부터 약 Leu2025까지 연장되고, C1 도메인은 약 Gly2026으로부터 약 Asn2072까지 연장되며, C2 도메인은 약 Ser2073으로부터 Tyr2332까지 연장된다. 특정 단백질 분해 절단 부위 이외에, 도메인과 FVIII 영역 사이의 경계 위치의 표기는 참고문헌이 다른 경우에 달라질 수 있다. 따라서 본 명세서에 언급된 경계는 "약"이라는 용어의 사용에 의해 근사치로서 표기된다.
인간 FVIII 유전자는 포유류 세포에서 단리되고 발현되었다(Toole, J. J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; 및 미국 특허 제4,757,006호 참조). FVIII 아미노산 서열은 미국 특허 제4,965,199호에 나타낸 바와 같은 cDNA로부터 추론되었다. 또한, 부분적으로 또는 완전히 B-도메인 결실된 FVIII은 미국 특허 제4,994,371호 및 미국 특허 제4,868,112호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 인간 FVIII B-도메인은 미국 특허 제5,004,803호에 나타낸 바와 같은 인간 인자 V B-도메인으로 대체된다. 인간 인자 VIII을 암호화하는 cDNA 서열 및 아미노산 서열은 각각 미국 특허 출원 공개 제2005/0100990호의 서열번호 1 및 2에 나타낸다.
돼지 FVIII 서열은 문헌[Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986)]에 공개되어 있다. 추가로, 돼지 비장 cDNA 라이브러리로부터의 FVIII 서열의 PCR 증폭으로부터 얻은 완전한 돼지 cDNA 서열은 문헌[Healey, J. F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996)]에서 보고되었다. 모든 도메인, 모든 서브유닛 및 특정 아미노산 서열의 치환을 갖는 혼성체 인간/돼지 FVIII는 롤라(Lollar)와 런지(Runge)에 의한 미국 특허 제5,364,771호, 및 WO 93/20093에 개시되어 있다. 더 최근에, 돼지 FVIII의 A1 및 A2 도메인의 뉴클레오티드 및 대응하는 아미노산 서열 및 대응하는 인간 도메인을 치환하는 돼지 A1 및/또는 A2 도메인을 갖는 키메라 FVIII은 WO 94/11503에서 보고되었다. 롤라 제이. 에스.(Lollar, J. S.)의 미국 특허 제5,859,204호는 또한 돼지 cDNA 및 추론된 아미노산 서열을 개시한다. 미국 특허 제6,458,563호는 B-도메인-결실 돼지 FVIII을 개시한다.
롤라 제이. 에스.의 미국 특허 제5,859,204호는 감소된 항원성 및 감소된 면역반응성을 갖는 FVIII의 기능성 돌연변이체를 보고한다. 롤라 제이. 에스.의 미국 특허 제6,376,463호는 또한 감소된 면역반응성을 갖는 FVIII의 돌연변이체를 보고한다. 사엔코(Saenko) 등의 미국 특허 출원 공개 제2005/0100990호는 FVIII의 A2 도메인 내 기능성 돌연변이를 보고한다.
일부 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드(또는 키메라 폴리펩티드의 FVIII 부분)는 서열번호 67의 아미노산 1 내지 1438 또는 서열번호 65의 아미노산 1 내지 2332의 FVIII 아미노산 서열(신호 서열 없음) 또는 서열번호 64의 아미노산 1 내지 19 및 서열번호 67의 1 내지 1438 또는 서열번호 64의 아미노산 1 내지 19 및 서열번호 65의 아미노산 1 내지 2332의 FVIII 아미노산 서열(신호 서열 있음)에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있되, FVIII은 응고 활성을 가지며, 예를 들어, 인자 X를 활성화 인자 X로 전환시키는 보조인자로서 인자 IX를 활성화시킨다. FVIII 폴리펩티드(또는 키메라 폴리펩티드의 FVIII 부분)는 서열번호 67의 아미노산 1 내지 1438 또는 서열번호 65의 아미노산 1 내지 2332의 FVIII 아미노산 서열(신호 서열 없음)과 동일할 수 있다. FVIII 폴리펩티드는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 FVIII의 "B 도메인"은 내부 아미노산 서열 동일성 및 단백질 분해 절단의 부위에 의해 정해진 당업계에 공지된 B 도메인, 예를 들어 전장 인간 FVIII의 잔기 Ser741-Arg1648과 동일하다. 다른 인간 FVIII 도메인은 하기 아미노산 잔기에 의해 정해진다: A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; A3, 잔기 Ser1690-Asn2019; C1, 잔기 Lys2020-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 남아있는 서열인 잔기 Glu1649-Arg1689는 보통 a3 산성 영역으로서 지칭된다. 돼지, 마우스 및 개 FVIII에 대해, B 도메인을 포함하는 모든 도메인에 대한 경계의 위치는 또한 당업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, FVIII의 B 도메인은 결실된다("B-도메인-결실 인자 FVIII" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 예는 표 4에서 서열의 인자 VIII 부분과 동일한 서열을 갖는 리팍토®(재조합 BDD FVIII)이다. (BDD FVIII 중쇄는 이중 밑줄이며; B 도메인은 이탤릭체이고; BDD FVIII 경쇄는 일반 텍스트이다). 일부 실시형태에서, B 도메인 FVIII은 표 5에 나타낸 바와 같이 5개의 아미노산을 제외하고 완전한 B 도메인의 결실을 가진다(서열번호 68)(B 도메인은 이탤릭체임).
"B-도메인-결실 FVIII"은 미국 특허 제6,316,226호, 제6,346,513호, 제7,041,635호, 제5,789,203호, 제6,060,447호, 제5,595,886호, 6,228,620호, 제5,972,885호, 제6,048,720호, 제5,543,502호, 제5,610,278호, 제5,171,844호, 제5,112,950호, 제4,868,112호, 및 제6,458,563호, 미국 특허 공개 제2017/0073393 A1호 및 제2012/308641 A1호, 및 국제 특허 공개 WO 2011/041770 A1, WO 2015/106052 A1(PCT/US2015/010738), 및 WO 2016/025764에 개시되어 있는 완전한 또는 부분적 결실을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 사용된 B-도메인-결실 FVIII 서열은 미국 특허 제6,316,226호의 4란 4행 내지 5란 28행, 및 실시예 1 내지 5에 개시된(미국 특허 제6,346,513호에도 개시됨) 결실 중 어느 하나를 포함한다. 다른 실시형태에서, B-도메인 결실 인자 VIII은 S743/Q1638 B-도메인 결실 인자 VIII(SQ BBB FVIII)(예를 들어, 아미노산 744에서 아미노산 1637까지 결실된 인자 VIII, 예를 들어, 성숙 FVIII의 아미노산 1 내지 743 및 아미노산 1638 내지 2332를 갖는 인자 VIII)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법에 사용된 B-도메인-결실 FVIII은 미국 특허 제5,789,203호의 2란 26 내지 51행 및 실시예 5 내지 8에 개시된(미국 특허 제6,060,447호, 제5,595,886호, 및 제6,228,620호에도 개시됨) 결실을 갖는다. 일부 실시형태에서, B-도메인-결실 인자 VIII은 미국 특허 제5,972,885호의 1란 25행 내지 2란 40행; 미국 특허 제6,048,720호의 6란 1 내지 22행, 및 실시예 1; 미국 특허 제5,543,502호의 2란 17 내지 46행; 미국 특허 제5,171,844호의 4란 22행 내지 5란 36행; 미국 특허 제5,112,950호의 2란 55 내지 68행, 도 2, 및 실시예 1; 미국 특허 제4,868,112호의 2란 2행 내지 19란 21행 및 표 2; 미국 특허 제7,041,635호의 2란 1행 내지 3란 19행, 3란 40행 내지 4란 67행, 7란 43행 내지 8란 26행, 및 11란 5행 내지 13란 39행; 또는 미국 특허 제6,458,563호의 4란 25 내지 53행에 기재되어 있는 결실을 갖는다. 일부 실시형태에서, B-도메인-결실 FVIII은 WO 91/09122에 개시된 바와 같이 대부분의 B 도메인의 결실을 갖지만, 일차 번역 산물을 2개의 폴리펩티드 쇄로 생체 내에서 단백질 가수 분해 처리하는 데 필수적인 B 도메인의 아미노-말단 서열을 여전히 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 747 내지 1638이 결실된, 즉 B 도메인이 사실상 완전히 결실된 B-도메인-결실 FVIII 폴리펩티드가 작제된다. 문헌[Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)]. B-도메인-결실 인자 VIII 폴리펩티드는 아미노산 771 내지 1666 또는 아미노산 868 내지 1562의 결실을 포함할 수 있다. 문헌[Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988)]. 본 개시내용의 부분인 추가 B 도메인 결실은 예를 들어 아미노산 982 내지 1562 또는 760 내지 1639(Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 내지 1562(Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 내지 1646(Kaufman(국제 특허 출원 공개 WO 87/04187)), 747 내지 1560(Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741 내지 1648(Pasek (국제 특허 출원 88/00831)), 또는 816 내지 1598 또는 741 내지 1648(Lagner (문헌[Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25], 유럽 특허 제295597호))을 포함한다. 특정 실시형태에서, B-도메인-결실된 FVIII 폴리펩티드는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 포함한다(전장 FVIII의 결실 765 내지 1665의 결실에 대응). 다른 실시형태에서, B-도메인-결실된 FVIII 폴리펩티드는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 745 내지 1648의 결실을 포함한다(전장 FVIII의 결실 764 내지 1665의 결실에 대응).
다른 실시형태에서, BDD FVIII은 전장 FVIII 서열의 아미노산 서열에 대응하는 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위, 예를 들어, 잔기 757, 784, 828, 900, 963, 또는 선택적으로는 943을 보유한 B-도메인의 단편을 함유하는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. B-도메인 단편의 예는 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)], 문헌[Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008)], 및 문헌[Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)]에 개시된 바와 같은 B-도메인의 226개의 아미노산 또는 163개의 아미노산을 포함한다(즉, B 도메인의 처음 226개의 아미노산 또는 163개의 아미노산이 보유됨). 또 다른 실시형태에서, BDD FVIII은 BDD FVIII 폴리펩티드의 발현을 개선하기 위한 (Phe에서 Ser로의) 점 돌연변이를 잔기 309에서 추가로 포함한다. 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)]을 참고한다. 또 다른 실시형태에서, BDD FVIII은, B-도메인의 일부를 함유하되 하나 이상의 퓨린 절단 부위(예를 들어, Arg 1313 및 Arg 1648)는 함유하지 않는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. 문헌[Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)] 참조. 일부 실시형태에서, BDD FVIII은 성숙 전장 FVIII에 대응하는 아미노산 765 내지 1652의 결실을 함유하는 단쇄 FVIII(rVIII-단일쇄 및 앱스틸라(AFSTYLA)®로도 알려짐)을 포함한다. 미국 특허 제7,041,635호 참조. 상기 결실의 각각은 임의의 FVIII 서열에서 생성될 수 있다.
일부 실시형태에서, FVIII은 부분적 B-도메인을 가진다. 일부 실시형태에서, 부분적 B-도메인을 갖는 FVIII 폴리펩티드는 FVIII198이다. FVIII198은 단일 쇄 FVIIIFc 분자-226N6을 함유하는 부분적 B-도메인이다. 숫자 226은 FVIII B-도메인의 N-말단의 226개의 아미노산을 나타내고, N6은 B-도메인에서 6개의 N-글리코실화 부위를 나타낸다.
특정 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드는 국제 특허 출원 공개 WO 2017/117630 A1, WO 2018/087271 A1, 미국 특허 제9,878,017 B2호, 미국 특허 제8,575,104 B2호, 미국 특허 제8,754,194 B2호, 미국 특허 제7,939,632 B2호, 미국 특허 제2018/0161402 A1호, 미국 특허 제9,956,269 B2호, 미국 특허 제9,107,902 B2호, 미국 특허 제2017/209546 A1호에 개시된 FVIII 폴리펩티드로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, FVIII은 아미노산 1648(전장 인자 VIII 또는 서열번호 65에서), 아미노산 754(S743/Q1638 B-도메인 결실된 인자 VIII 또는 서열번호 67에서), 또는 대응하는 아르기닌 잔기에서(다른 변이체에서) 아르기닌 바로 다음에서 절단되어, 중쇄 및 경쇄를 생성한다. 다른 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드는 금속 이온-매개된 비-공유 결합에 의해 연결되거나 회합된 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
다른 실시형태에서, FVIII은 아미노산 1648(전장 FVIII 또는 서열번호 65에서), 아미노산 754(S743/Q1638 B-도메인-결실된 FVIII 또는 서열번호 67에서), 또는 대응하는 아르기닌 잔기에서(다른 변이체에서) 아르기닌 바로 다음에 절단되지 않은 단일 쇄 FVIII이다. 단일 쇄 FVIII은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 잔기 1648, 잔기 1645, 또는 전장 성숙 인자 VIII 폴리펩티드 둘 다(서열번호 65) 또는 잔기 754, 잔기 751, 또는 SQ BDD 인자 VIII 둘 다(서열번호 67)에 대응하는 잔기에서이다. 아미노산 치환은 아르기닌 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 티로신, 히스티딘, 오르니틴, 피롤리신 또는 타우린일 수 있다.
FVIII은 트롬빈에 의해 추가로 절단될 수 있고, 이어서, 활성화된 인자 IX(FIXa)에 대한 보조인자로서 작용하는 FVIIIa로서 활성화된다. 그리고 활성화된 FVIII과 함께 활성화된 FIX는 Xase 복합체를 형성하고, 인자 X를 활성화된 인자 X(FXa)로 전환시킨다. 활성화를 위해, FVIII은 아미노산 372, 740 및 1689에서(B-도메인 결실 FVIII 서열에서 아미노산 372, 740 및 795에 대응) 3개의 아르기닌 잔기 다음의 트롬빈에 의해 절단되며, 절단은 50kDa A1, 43kDa A2, 및 73kDa A3-C1-C2 쇄를 갖는 FVIIIa를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 FVIII 폴리펩티드는 비-활성 FVIII이다. 다른 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드는 활성화된 FVIII이다.
VWF 단백질에 연결되거나 회합된 FVIII 폴리펩티드를 갖는 단백질은 서열번호 65 또는 67에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있되, 서열은 FVIII 응고 활성을 가지며, 예를 들어, 인자 X를 활성화된 인자 X(FXa)로 전환시키기 위한 보조인자로서 인자 IX를 활성화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "혼성체" 또는 "키메라" 폴리펩티드 및 단백질은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼성체 또는 키메라 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 쇄, 예를 들어, FVIII 폴리펩티드 및 XTEN을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함한다. 예컨대, 본 명세서에서 전문이 참조에 의해 포함되는 미국 특허 제2015/0158929 A1호를 참조한다. 일부 실시형태에서, 혼성체 또는 키메라 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄, 예를 들어, XTEN 서열 및 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 VWF 단편과 제2 폴리펩티드 쇄, 예를 들어, 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 FVIII 폴리펩티드의 조합을 포함함으로써, 이형이량체를 형성한다. 예를 들어, 본 명세서에서 전문이 참조에 의해 포함되는 미국 특허 제2015/0266943 A1호, 미국 특허 제2016/0251408 A1호, 미국 특허 제2017/0073393 A1호를 참조한다. 일부 실시형태에서, 혼성체 내의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 전하-전하 또는 소수성 상호작용과 같은 단백질-단백질 상호작용을 통해 서로 회합될 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 VWF 단백질-XTEN-Fc 융합 단백질을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 FVIII-Fc 융합 단백질을 포함하여, 혼성체를 이형이량체로 만들되, XTEN은 288개 미만의 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 VWF 단백질-XTEN-Fc 융합 단백질을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 FVIII(X)-Fc 융합 단백질을 포함하여, 혼성체를 이형이량체로 만들되, XTEN은 288개 미만의 아미노산을 포함한다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 공유 결합, 예를 들어, 제1 Fc 영역과 제2 Fc 영역 사이의 이황화 결합을 통해 회합될 수 있다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 추가로 VWF 단편과 FVIII 폴리펩티드 사이의 결합에 의해 서로 회합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 폴리펩티드는 제1 FVIII 폴리펩티드 단편, XTEN 서열, 제2 FVIII 폴리펩티드 단편 및 Fc 영역을 포함하는 FVIII 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로, 제1 FVIII 폴리펩티드 단편이 XTEN 서열에 융합되고, 이것이 제2 FVIII 폴리펩티드 단편에 융합되고, 이것이 Fc 영역에 융합된 것을 포함한다. 구체적 실시형태에서, FVIII 단백질은 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 제1 FVIII 폴리펩티드 단편, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 XTEN 서열, 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 제2 FVIII 폴리펩티드 및/또는 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제1 Fc 영역을 포함한다.
하나의 구체적 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 rFVIIIFc-VWF-XTEN이고, 서열번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질을 포함한다. 다른 구체적 실시형태에서, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 서열번호 207의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 FVIII 신호 펩티드 서열을 추가로 포함한다. 하나의 구체적 실시형태에서, FVIII 단백질은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 신호 펩티드, 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 제1 FVIII 폴리펩티드 단편, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 XTEN 서열, 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 제2 FVIII 폴리펩티드 및/또는 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제1 Fc 영역을 포함한다.
하나의 구체적 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 rFVIIIFc-VWF-XTEN이고, 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질을 포함한다. 다른 구체적 실시형태에서, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 서열번호 204의 핵산 서열 또는 이의 단편에 의해 암호화된 FVIII 단백질을 포함한다. 본 명세서에 개시된 키메라 폴리펩티드의 FVIII 단백질에 관한 추가적인 예시적인 폴리펩티드 서열은 표 18 내지 19에 제공된다.
상기에 그리고 이하에서 논의되는 바와 같이, 상당히 많은 기능적 FVIII 변이체가 공지되어 있다. 또한, FVIII에서 수백 가지의 비 기능적 돌연변이가 혈우병 환자에서 동정되었으며, FVIII의 기능에 대한 이들 돌연변이의 효과는 치환의 성질로 인한 것이기보다는 이들이 FVIII의 3-차원 구조 내에 존재하는 것으로 인한 것으로 결정되었다(전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)]). 또한, 인간과 다른 종으로부터의 FVIII 간의 비교는 기능에 필요할 것 같은 보존된 잔기를 확인하였다(본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된 문헌[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)]; 미국 특허 제6,251,632호).
III.B.
폰빌레브란트 인자(VWF) 단편
VWF(F8VWF로도 알려짐)는 혈장에 존재하고 내피에서(바이벨-팔라드 소체에서), 거핵구(혈소판의 α-과립)에서 그리고 내피 하 결합 조직에서 구성적으로 생성된 거대한 다량체 당단백질이다. 기본적 VWF 단량체는 2813개의 아미노산 단백질이다. 각 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인, 즉 D'/D3 도메인(인자 FVIII에 결합됨), A1 도메인(혈소판 GPIb-수용체, 헤파린, 및/또는 가능하게는 콜라겐에 결합됨), A3 도메인(콜라겐에 결합됨), C1 도메인(활성화되는 경우, RGD 도메인이 혈소판 인테그린 αIIbβ3에 결합됨), 및 단백질의 C-말단 단부에 있는 "시스테인 매듭(cysteine knot)" 도메인(혈소판-유래 성장 인자(PDGF)와 함께 형질변환 생장 인자-β(TGFβ) 및 β-인간 융모성 성선 자극 호르몬(βHCG)을 공유함)을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "VWF 단편"은 내인성 VWF가 FVIII에 결합하는 것을 저해할 수 있는 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 기능성 VWF 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합한다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질 상의 VWF 결합 부위를 차단하여, FVIII 단백질과 내인성 VWF의 상호 작용을 저해한다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 내인성 VWF에 대한 FVIII의 결합을 차단하여, VWF-클리어런스 경로를 통한 FVIII 단백질의 클리어런스를 방지한다. VWF 단편은 VWF의 이러한 활성을 보유하는 유도체, 변이체, 돌연변이체, 또는 유사체를 포함한다.
인간 VWF에 대한 2813개의 단량체 아미노산의 서열은 젠뱅크(Genbank)에서 수탁 번호 NP000543.2로서 보고된다. 인간 VWF를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 젠뱅크에서 수탁 번호 NM000552.3으로서 보고된다. 인간 VWF의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 20으로 표기된다. 서열번호 21은 전장 VWF의 아미노산 서열이다. VWF의 각각의 도메인은 표 6에 열거되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 VWF 단백질은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편일 수 있되, VWF 단편은 인자 VIII(FVIII)에 결합하고, FVIII에 대한 내인성 VWF(전장 VWF)의 결합을 저해한다. D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D1 도메인, D2 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 하나 이상의 이의 단편, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VWF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, VWF 단편은 하기를 포함하거나, 하기로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다: (1) VWF 또는 이의 단편의 D' 및 D3 도메인; (2) VWF 또는 이의 단편의 D1, D' 및 D3 도메인; (3) VWF 또는 이의 단편의 D2, D' 및 D3 도메인; (4) VWF 또는 이의 단편의 D1, D2, D' 및 D3 도메인; 또는 (5) VWF 또는 이의 단편의 D1, D2, D', D3 및 A1 도메인. 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 VWF 클리어런스 수용체에 대한 부위 결합을 함유하지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1274가 아니다. 본 개시내용의 VWF 단편은 VWF 단편에 연결되거나 융합된 임의의 다른 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 추가로 신호 펩티드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하거나 회합된다. 예를 들어, 미국 특허 제2015/0023959 A1호, 미국 특허 제2015/0266943 A1호, 미국 특허 제2016/0251408 A1호, 미국 특허 제2017/0073393 A1호, 미국 특허 제2018/185455 A1호, 미국 특허 제2018/0051067 A1호, 미국 특허 제2017/0152300 A1호, 미국 특허 제9,878,017 B2호, 미국 특허 제9,458,223 B2호, 미국 특허 제8,575,104 B2, WO 2017/117630 A1호, 미국 특허 제2018/0161402 A1호, WO 2017/117631 A1호, WO 2018/087271 A1호, 미국 특허 제9,107,902 B2호, WO 2017/222337 A1호, WO 2015/185758 A1호를 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된다. FVIII 단백질과의 결합 또는 회합에 의해, 본 개시내용의 VWF 단편은 FVIII을 프로테아제 절단 및 FVIII 활성화로부터 보호하며, FVIII의 중쇄 및 경쇄를 안정화하고, 스캐빈저 수용체에 의해 FVIII의 클리어런스를 방지한다. 다른 실시형태에서, VWF 단편은 FVIII 단백질에 결합하거나 회합하고, 인지질 및 활성화된 단백질 C에 대한 FVIII 단백질의 결합을 차단하거나 방지한다. FVIII 단백질과 내인성, 전장 VWF의 결합을 방지하거나 저해함으로써, 본 개시내용의 VWF 단편은 VWF 클리어런스 수용체에 의한 FVIII의 클리어런스를 감소시키고, 따라서 키메라 폴리펩티드의 반감기를 연장한다. 따라서 키메라 폴리펩티드의 반감기 연장은 FVIII 단백질에 대한 VWF 클리어런스 수용체 결합 부위를 결여하는 VWF 단편과의 결합 또는 회합 및 VWF 클리어런스 수용체 결합 부위를 함유하는 내인성 VWF로부터 VWF 단편에 의한 FVIII 단백질의 차폐 또는 보호로 인한 것이다. VWF 단편에 결합되거나 보호된 FVIII 단백질은 또한 FVIII 단백질의 재순환을 가능하게 할 수 있다. 전장 VWF 분자에 함유된 VWF 클리어런스 경로 수용체 결합 부위를 제거함으로써, 본 개시내용의 FVIII/VWF 이형이량체는 VWF 클리어런스 경로로부터 차폐되어, FVIII 반감기를 추가로 연장시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 VWF 단백질은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하되, D' 도메인은 서열번호 21의 아미노산 764 내지 866에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, VWF 단백질은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 저해한다. 다른 실시형태에서, VWF 단백질은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하되, D3 도메인은 서열번호 21의 아미노산 867 내지 1240에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, VWF 단백질은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VWF 단백질은 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1240에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나 이루어지되, VWF 단백질은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 저해한다. 다른 실시형태에서, VWF 단백질은 서열번호 21의 아미노산 23 내지 1240에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 D1, D2, D' 및 D3 도메인을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어지되, VWF 단백질은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지하거나 저해한다. 또 다른 실시형태에서, VWF 단백질은 이에 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 VWF 단백질은(1) D'D3 도메인, D1D'D3 도메인, D2D'D3 도메인 또는 D1D2D'D3 도메인 및 (2) 추가적인 VWF 서열 최대 약 10개의 아미노산(예를 들어, 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1250까지의 임의의 서열), 최대 약 15개의 아미노산(예를 들어, 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1255의 임의의 서열), 최대 약 20개의 아미노산(예를 들어, 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1260까지의 임의의 서열), 최대 약 25개의 아미노산(예를 들어, 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1265까지의 임의의 서열), 또는 최대 약 30개의 아미노산(예를 들어, 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1240으로부터 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1260의 아미노산까지의 임의의 서열)으로 본질적으로 이루어지거나 이루어진다. 일부 실시형태에서, D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하거나 본질적으로 이루어진 VWF 단백질은 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1274도 아니고 전장 성숙 VWF도 아니다. 일부 실시형태에서, D1D2 도메인은 D'D3 도메인과 트랜스로 발현된다. 일부 실시형태에서, D1D2 도메인은 D'D3 도메인과 시스로 발현된다.
다른 실시형태에서, D1D2 도메인에 연결된 D'D3 도메인을 포함하는 VWF 단백질은 추가로 세포내 절단 부위, 예를 들어, (PACE(퓨린) 또는 PC5에 의한 절단 부위)를 포함하여, 발현 시 D'D3 도메인으로부터의 D1D2 도메인의 절단을 가능하게 한다. 세포내 절단 부위의 비제한적 예는 본 명세서의 다른 곳에 개시되어 있다.
또 다른 실시형태에서, VWF 단백질은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하지만, (1) 서열번호 21에 대응하는 아미노산 1241 내지 2813, (2) 서열번호 21에 대응하는 아미노산 1270 내지 아미노산 2813, (3) 서열번호 21에 대응하는 아미노산 1271 내지 아미노산 2813, (4) 서열번호 21에 대응하는 아미노산 1272 내지 아미노산 2813, (5) 서열번호 21에 대응하는 아미노산 1273 내지 아미노산 2813, (6) 서열번호 21에 대응하는 아미노산 1274 내지 아미노산 2813, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 VWF 단백질은 D' 도메인, D3 도메인, 및 A1 도메인에 대응하는 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어지되, 아미노산 서열은 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1479에 대해 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, VWF 단백질은 FVIII에 대한 내인성 VWF의 결합을 방지한다. 특정 실시형태에서, VWF 단백질은 서열번호 21의 아미노산 764 내지 1274가 아니다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 VWF 단백질은 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하지만, (1) A1 도메인, (2) A2 도메인, (3) A3 도메인, (4) D4 도메인, (5) B1 도메인, (6) B2 도메인, (7) B3 도메인, (8) C1 도메인, (9) C2 도메인, (10) CK 도메인, (11) CK 도메인 및 C2 도메인, (12) CK 도메인, C2 도메인, 및 C1 도메인, (13) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, (14) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, (15) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인 및 B1 도메인, (16) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, 및 D4 도메인, (17) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, 및 A3 도메인, (18) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, A3 도메인, 및 A2 도메인, (19) CK 도메인, C2 도메인, C1 도메인, B3 도메인, B2 도메인, B1 도메인, D4 도메인, A3 도메인, A2 도메인, 및 A1 도메인, 및 (20) 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 VWF 도메인을 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, VWF 단백질은 D'D3 도메인 및 하나 이상의 도메인 또는 모듈을 포함한다. 이러한 도메인 또는 모듈의 예는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된 문헌[Zhour et al., Blood published online April 6, 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134]에 개시된 도메인 및 모듈을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, VWF 단백질은 A1 도메인, 2 도메인, 3 도메인, D4N 모듈, VWD4 모듈, C8-4 모듈, TIL-4 모듈, C1 모듈, C2 모듈, C3 모듈, C4 모듈, C5 모듈, C5 모듈, C6 모듈 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 모듈 및 D'D3 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, VWF 단백질은 이종성 모이어티에 연결되되, 이종성 모이어티는 VWF 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나 또는 VWF 단백질 내 하나 이상의 아미노산 바로 다음(예를 들어, 하나 이상의 XTEN 삽입 부위)에 삽입된다. 예를 들어, VWF 단백질 내 이종성 모이어티에 대한 삽입 부위는 D' 도메인, D3 도메인, 또는 둘 다에 있을 수 있다. 이종성 모이어티는 반감기 증량제일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 VWF 단백질은 다량체, 예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체 또는 더 고차의 다량체를 형성한다. 다른 실시형태에서, VWF 단백질은 하나의 VWF 단백질만을 갖는 단량체이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 VWF 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 변형을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, VWF 단백질이 이황화 결합을 형성하거나 이량체 또는 다량체를 형성할 수 없도록 VWF 단백질은 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 변형을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 아미노산 치환은 D' 도메인 및 D3 도메인 내이다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 VWF 단백질은 서열번호 21에 대응하는 잔기 1099, 잔기 1142, 또는 잔기 1099와 1142 둘 다에 대응하는 잔기에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다. 적어도 하나의 아미노산 치환은 야생형 VWF에서 자연적으로 발생되지 않는 임의의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 시스테인 이외의 임의의 아미노산, 예를 들어, 이소류신, 알라닌, 류신, 아스파라긴, 리신, 아스파르트산, 메티오닌, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 프롤린, 세린, 티로신, 아르기닌 또는 히스티딘일 수 있다. 다른 예에서, 아미노산 치환은 VWF 단백질이 다량체를 형성하는 것을 방지하거나 저해하는 하나 이상의 아미노산을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 유용한 VWF 단백질은 FVIII와의 상호 작용을 개선하기 위해, 예를 들어, FVIII에 대한 결합 친화도를 개선하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 비제한적 예로서, VWF 단백질은 서열번호 21의 아미노산 764에 대응하는 잔기에서 세린 잔기 및 서열번호 21의 아미노산 773에 대응하는 잔기에서 리신 잔기를 포함한다. 잔기 764 및/또는 773은 FVIII에 대한 VWF 단백질의 결합 친화도에 기여할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 VWF 단백질은 다른 변형을 가질 수 있는데, 예를 들어, 이 단백질은 페길화(pegylate), 글리코실화(glycosylate), 헵실화(hesylate), 또는 폴리시알산화(polysialylate)될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 키메라 폴리펩티드는 VWF 단편, XTEN 서열, FVIII의 a2 링커 및 Fc 영역을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, VWF 단백질은 N-말단으로부터 C-말단까지의 순서로, VWF 단편이 XTEN 서열에 융합되고, 이것이 a2 링커에 융합되며, 이것이 Fc 영역에 융합되는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, VWF 단백질은 서열번호 210의 아미노산 서열의 VWF의 D' 도메인, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D3 도메인, 서열번호 58의 아미노산 서열(AE144_5A)을 포함하는 XTEN 서열, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 a2 링커 및/또는 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
하나의 구체적 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 rFVIIIFc-VWF-XTEN이고, 서열번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, VWF 단백질은 VWF의 D1, D2, D', 및/또는 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, VWF 단편은 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D1D2 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, VWF 단백질은 VWF 신호 펩티드 서열을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, VWF 신호 펩티드는 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구체적 실시형태에서, VWF 단백질은 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 신호 펩티드, 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D1D2 영역, 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D' 도메인, 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D3 도메인, 서열번호 58의 아미노산 서열(AE144_5A)을 포함하는 XTEN 서열, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 a2 링커, 및/또는 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
하나의 구체적 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 rFVIIIFc-VWF-XTEN이고, 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질을 포함한다. 다른 구체적 실시형태에서, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 서열번호 206의 핵산 서열 또는 이의 단편에 의해 암호화된 VWF 단백질을 포함한다. 본 명세서에 개시된 키메라 폴리펩티드의 VWF 단백질에 관한 추가적인 예시적인 폴리펩티드 서열은 표 18 내지 19에 제공된다.
III.C. 반감기 연장 모이어티
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 하나 이상의 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 FVIII 폴리펩티드는 하나 이상의 반감기 연장 모이어티(즉, FVIII 단백질)에 융합되거나 회합된다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 적어도 2개의 반감기 연장 모이어티, FVIII 폴리펩티드에 융합된 제1 반감기 연장 모이어티 및 VWF의 D'D3 도메인에 융합된 제2 반감기 연장 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 FVIII 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 FVIII 폴리펩티드의 B 도메인 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제1 반감기 연장 모이어티는 서열번호 65의 아미노산 잔기 745에 대응하는 아미노산 바로 다음에 오는 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제1 이종성 모이어티는 링커에 의해 FVIII 폴리펩티드에 융합된다.
특정 실시형태에서, VWF 단편에서 VWF의 D'D3 도메인은 제2 반감기 연장 모이어티와 융합되거나 회합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 VWF 단편의 C-말단 또는 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 VWF 단편 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 VWF 단편의 C-말단에 융합된다. 특정 실시형태에서, 제2 반감기 연장 모이어티는 링커에 의해 VWF 단편에 융합된다.
다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 FVIII 폴리펩티드, 및 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하되, VWF의 D'D3 도메인은 하나 이상의 반감기 연장 모이어티에 융합되고, VWF의 D'D3 도메인 및 FVIII 폴리펩티드는 FVIII과 VWF 간의 천연 유래 결합보다 더 짧은 결합과 회합된다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 FVIII 폴리펩티드 및 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하되, VWF의 D'D3 도메인은 링커에 의해 FVIII 폴리펩티드에 융합된다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 일부 실시형태에서, VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인은 추가로 적어도 하나의 비-공유 결합에 의해 FVIII 폴리펩티드와 회합된다. 특정 실시형태에서, VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인은 Fc에 추가로 융합된다. 일부 실시형태에서, VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인은 링커에 의해 Fc에 융합된다. 일부 실시형태에서, Fc는 추가적인 링커에 의해 제2 Fc에 융합된다. 특정 실시형태에서, Fc 및 제2 Fc는 공유 결합, 예를 들어, 이황화 결합에 의해 서로 회합된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 출원 WO 2017/222337 A1에 개시된 바와 같은 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 및 FVIII 폴리펩티드를 포함한다.
제1 반감기 연장 모이어티, 제2 반감기 연장 모이어티, 또는 둘 다는 FcRn 결합 상대, 예를 들어, 알부민 또는 면역글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린, 알부민-결합 모이어티, 또는 임의의 단편, 유도체, 변이체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
III.C.1. Ig 불변 영역 또는 이의 일부
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 또한 선택적 링커에 의해 FVIII 폴리펩티드에 융합된 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입되거나, FVIII 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 VWF 단백질에 융합된 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 추가로 포함한다. 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 VWF 단편 내에 삽입되거나, VWF 단편의 C-말단 또는 N-말단에 융합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 Ig 불변 영역은 공유 결합, 예를 들어, 이황화 결합에 의해 제2 Ig 불변 영역에 연결되거나 회합된다.
Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 추가적인 이종성 모이어티, 예를 들어, XTEN 서열, 및 VWF 단백질과 조합하여 키메라 폴리펩티드의 약물동태학적 또는 약력학적 특성을 개선시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 분자의 반감기를 연장시킨다.
Ig 불변 영역은 CH(불변 중쇄) 도메인(CH1, CH2 등)으로 칭해지는 도메인을 포함한다. 아이소타입(즉, IgG, IgM, IgA IgD 또는 IgE)에 따라, 불변 영역은 3개 또는 4개의 CH 도메인을 포함할 수 있다. 일부 아이소타입(예를 들어, IgG) 불변 영역은 또한 힌지 영역을 함유한다. 문헌[Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.]을 참조한다.
본 개시내용의 키메라 폴리펩티드를 생산하기 위한 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 인간 Ig로부터 유래된다. 그러나, Ig 불변 영역 또는 이의 일부는, 예를 들어, 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그) 또는 비-인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 Ig로부터 유래될 수 있음이 이해된다. 또한, Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 Ig 클래스, 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 Ig 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1이 사용된다.
다양한 Ig 불변 영역 유전자 서열(예를 들어, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공개적으로 접근가능한 기탁물의 형태로 입수 가능하다. 면역원성을 감소시키기 위해 특정 효과기 기능을 갖거나(또는 특정 효과기 기능을 결여하거나) 특정 변형을 갖는 불변 영역 도메인 서열이 선택될 수 있다. 항체 및 항체-암호화 유전자의 많은 서열은 공개되어 있고, 적합한 Ig 불변 영역 서열(예를 들어, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 서열, 또는 이의 일부)은 당업계에서 인식된 기법을 이용하여 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 이어서, 임의의 전술한 방법을 이용하여 얻은 유전자 물질은 본 개시내용의 폴리펩티드를 얻도록 변경되거나 합성될 수 있다. 본 개시내용의 범주가 불변 영역 DNA 서열의 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함한다는 것이 추가로 인식될 것이다.
예를 들어, 관심 대상의 도메인을 증폭시키도록 선택되는 프라이머 및 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 Ig 불변 영역 또는 이의 일부의 서열이 클로닝될 수 있다. 항체로부터의 Ig 불변 영역 또는 이의 일부의 서열의 클로닝을 위해, mRNA는 하이브리도마, 비장 또는 림프 세포로부터 단리되고, DNA로 역전사되고, 항체 유전자가 PCR에 의해 증폭될 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 제4,683,195호; 미국 특허 제4,683,202호; 미국 특허 제4,800,159호; 미국 특허 제4,965,188호; 및 예를 들어 문헌["PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990)]; 문헌[Ho et al. 1989. Gene 77:51]; 문헌[Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270)]에 상세하게 기재되어 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기반한 공통(consensus) 불변 영역 프라이머 또는 더 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. 상기 논의된 바와 같은 PCR은 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 단리하는 데 사용될 수 있다. 이 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 프로브, 예컨대 마우스 불변 영역 프로브에 의해 선별될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 수많은 프라이머 세트가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 정제된 항체의 N-말단 서열에 기초한 5' 프라이머(문헌[Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509]); cDNA 말단의 신속한 증폭(문헌[Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33]); 항체 리더 서열(문헌[Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250])). 항체 서열의 클로닝은 1995년 1월 25일자로 출원된 뉴먼(Newman) 등의 미국 특허 제5,658,570호에 추가로 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 Ig 불변 영역은 모든 도메인 및 힌지 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 CH2 도메인, CH3 도메인, 및 힌지 영역, 즉 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "Fc 영역"은 천연 Ig의 Fc 영역에 대응하는 폴리펩티드의 부분, 즉, 이의 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인의 이량체 회합에 의해 형성된 것으로 정의된다. 천연 Fc 영역은 다른 Fc 영역과 동형이량체를 형성한다. 대조적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 융합된 Fc 영역" 또는 "단일 쇄 Fc 영역"(scFc 영역)은 단일 폴리펩티드 쇄 내에서 유전자 연결된(즉, 단일 인접 유전자 서열 형태로 암호화된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이량체 Fc 영역을 지칭한다.
일부 실시형태에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG에서의 잔기 216(중쇄 불변 영역의 제1 잔기가 114인 것으로 함))의 바로 앞에 오는 힌지 영역에서 시작되고 항체의 C-말단에서 끝나는 단일 Ig 중쇄의 부분을 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
Ig 불변 영역의 Fc 영역은, Ig 아이소타입에 따라, CH2, CH3 및 CH4 도메인, 및 힌지 영역을 포함할 수 있다. Ig의 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 증가한 안정성, 증가한 혈청 반감기(문헌[Capon et al., 1989, Nature 337:525] 참조)뿐만 아니라 Fc 수용체, 예컨대 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합(본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함되는 미국 특허 제6,086,875호, 제6,485,726호, 제6,030,613호; 국제 공개 제03/077834호; 미국 특허 제2003-0235536A1호)을 포함하는 키메라 단백질에 대해 몇몇 바람직한 특성을 부여한다.
Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 FcRn 결합 상대일 수 있다. FcRn은 성인 상피 조직에서 활성을 갖고, 장의 내강, 폐 기도, 비강 표면, 질 표면, 결장 및 직장 표면에서 발현된다(미국 특허 제6,485,726호). FcRn 결합 상대는 FcRn에 결합하는 Ig의 일부이다. FcRn 결합 상대의 다른 예는 이하에 추가로 기재되는 알부민이다.
FcRn 수용체는 인간을 포함하는 몇몇 포유류 종으로부터 단리되었다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 래트 FcRn 및 마우스 FcRn의 서열은 공지되어 있다(문헌[Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377)]. FcRn 수용체는 상대적으로 낮은 pH에서 IgG에 결합하고(IgA, IgM, IgD, 및 IgE와 같은 다른 Ig 부류에는 결합하지 않음), 내강에서 장막 방향으로 세포를 관통하여 능동적으로 IgG를 수송한 다음, 간질액에서 발견되는 상대적으로 더 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이는 폐 및 장 상피(문헌[Israel et al. 1997, Immunology 92:69), 신장 근위 세뇨관 상피(문헌[Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), 및 코 상피, 질 표면 및 담도계 표면을 포함하는, 성인 상피 조직(미국 특허 제6,485,726호, 미국 특허 제6,030,613호, 미국 특허 제6,086,875호; 국제 공개 제03/077834호; 미국 특허 출원 공개 공보 제2003-0235536A1호)에서 발현된다.
본 개시내용에서 유용한 FcRn 결합 상대는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn 수용체의 완전한 결합 영역을 포함하는 다른 단편을 포함하여 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X선 결정학에 기반하여 기재되었다(문헌[Burmeister et al. 1994, Nature 372:379]). Fc와 FcRn의 주요 접촉 면적은 CH2 도메인과 CH3 도메인의 접합부에 가깝게 있다. Fc-FcRn 접촉부는 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 상대는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함한다. 주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250 내지 257, 272, 285, 288, 290 내지 291, 308 내지 311, 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385 내지 387, 428, 및 433 내지 436을 포함한다. Ig 또는 Ig 단편 또는 영역의 아미노산 넘버링에 대한 언급은 모두 문헌[Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md]에 기반한다.
FcRn에 결합된 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 FcRn에 의해 상피 장벽을 가로질러 효과적으로 셔틀링될 수 있어서, 목적하는 치료적 분자를 전신으로 투여하기 위한 비침습적인 수단을 제공하게 된다. 추가로, Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함하는 융합 단백질은 FcRn을 발현하는 세포에 의해 내포작용화된다(endocytosed). 그러나 분해로 표지되는 대신에, 이 융합 단백질은 다시 순환계 내로 재순환되어서, 이 단백질의 생체 내 반감기가 증가된다. 특정 실시형태에서, Ig 불변 영역의 부분은, 전형적으로 이황화 결합 및 다른 비특이적 상호작용을 통해 다른 Fc 영역 또는 다른 FcRn 결합 상대와 회합하여 이량체 및 더 고차의 다량체를 형성하는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대이다.
2개의 FcRn 수용체는 단일 Fc 분자에 결합될 수 있다. 결정학적 데이터는 각각의 FcRn 분자가 Fc 동형이량체의 단일 폴리펩티드에 결합됨을 시사한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 활성 분자에 FcRn 결합 상대, 예를 들어, IgG의 Fc 단편을 연결하는 것은 경구로, 협측으로, 설하로, 직장으로, 질로, 비강 투여되는 에어로졸로서 또는 폐 경로를 통해, 또는 안구 경로를 통해 생물학적 활성 분자를 전달하는 수단을 제공한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 침습적으로, 예를 들어, 피하로, 정맥내로 투여될 수 있다.
FcRn 결합 상대 영역은 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있고, 그 결과, Fc 영역의 FcRn 수용체에 의해 능동적으로 수송되는, 분자 또는 이의 일부이다. 특이적으로 결합된은 2개의 분자가 생리학적 조건 하에서 상대적으로 안정한 복합체를 형성함을 지칭한다. 특이적 결합은 보통 내지는 높은 능력과 함께 보통 저친화도를 갖는 비특이적 결합과는 구별되는, 고친화도 및 낮은 내지는 보통의 능력을 특징으로 한다. 전형적으로, 결합은 친화도 상수 KA가 106 M-1 초과 또는 108 M-1 초과인 경우 특이적인 것으로 간주된다. 필요한 경우, 비특이적 결합은 결합 조건을 변화시킴으로써 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 감소될 수 있다. 적절한 결합 조건, 예컨대 분자의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 차단제(예를 들어, 혈청 알부민, 밀크 카세인)의 농도 등은 일상적인 기법을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 하나 이상의 절단된 Fc 영역을 포함하는데, 이들 영역은 절단되었음에도 불구하고 Fc 영역에 Fc 수용체(FcR) 결합 특성을 부여하기에 충분하다. 예를 들어, FcRn에 결합하는 Fc 영역의 일부(즉, FcRn 결합 부분)는 EU 넘버링으로, IgG1의 약 아미노산 282 내지 438을 포함한다(주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 248, 250 내지 257, 272, 285, 288, 290 내지 291, 308 내지 311, 및 314이고 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385 내지 387, 428, 및 433 내지 436임). 따라서, 본 개시내용의 Fc 영역은 FcRn 결합 부분을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 아이소타입의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다. 다른 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다.
다른 실시형태에서, "Fc 영역"은 Fc 도메인의 아미노산 서열 또는 Fc 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인(EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 약 아미노산 216 내지 230); CH2 도메인(EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 아미노산 231 내지 340); CH3 도메인(EU 넘버링에 따라 항체 Fc 영역의 약 아미노산 341 내지 438); CH4 도메인; 또는 이의 변이체, 일부, 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시형태에서, Fc 영역은 완전한 Fc 도메인(즉, 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), CH2 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인(또는 이의 일부), CH3 도메인(또는 이의 일부)에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부), 힌지 도메인(또는 이의 일부) 및 CH3 도메인(또는 이의 일부) 모두에 융합된 CH2 도메인(또는 이의 일부)을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, Fc 영역은 CH2 도메인의 적어도 일부(예를 들어, CH2 도메인의 모두 또는 일부)가 결여된다. 특정 실시형태에서, Fc 영역은 EU 넘버 221 내지 447에 대응하는 아미노산을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 명세서에서 F, F1 또는 F2로서 표시된 Fc 영역은 다수의 상이한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 Fc 영역은 인간 Ig로부터 유래된다. 그러나, Fc 영역은, 예를 들어, 설치류(예: 마우스, 랫트, 토끼, 또는 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 Ig로부터 유래될 수 있다는 것이 이해된다. 또한, Fc 도메인의 폴리펩티드 또는 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 Ig 클래스, 및 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 Ig 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 다른 실시형태에서, 인간 아이소타입 IgG1이 사용된다.
특정 실시형태에서, Fc 변이체는 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역에 의해 부여된 적어도 하나의 효과기 기능의 변화(예를 들어, Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q)에 결합하거나, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 식세포작용 또는 보체 의존성 세포독성(CDCC)을 촉발하는 Fc 영역의 능력의 개선 또는 감소)를 부여한다. 다른 실시형태에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 개시내용의 Fc 영역은 효과기 기능 및/또는 FcR 또는 FcRn 결합의 변화(예를 들어, 향상 또는 감소)를 부여하는 것으로 공지된 당업계에서 인식된 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용의 결합 분자는 국제 특허 출원 공개 WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, 및 WO06/085967A2; 미국 특허 공개 제2007/0231329호, 미국 특허 제2007/0231329호, 미국 특허 제2007/0237765호, 미국 특허 제2007/0237766호, 미국 특허 제2007/0237767호, 미국 특허 제2007/0243188호, 미국 특허 제20070248603호, 미국 특허 제20070286859호, 미국 특허 제20080057056호 ; 또는 미국 특허 제5,648,260호; 제5,739,277호; 제5,834,250호; 제5,869,046호; 제6,096,871호; 제6,121,022호; 제6,194,551호; 제6,242,195호; 제6,277,375호; 제6,528,624호; 제6,538,124호; 제6,737,056호; 제6,821,505호; 제6,998,253호; 제7,083,784호; 제7,404,956호 및 제7,317,091호(각각은 본 명세서에 참조로 통합됨)에 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서, 예를 들어, 변화(예를 들어, 치환)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정 치환)이 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서 이루어질 수 있다. 다른 실시형태에서, 아미노산 위치 중 하나 이상에서 상이한 변화(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)가 이루어질 수 있다.
IgG의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 FcRn에 의해 결합될 변형된 IgG 또는 Fc 단편 또는 이의 일부를 수득하도록 잘 인식된 절차, 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 등에 따라 변형될 수 있다. 이러한 변형은 FcRn 접촉 부위로부터 먼 변형, 및 FcRn에 대한 결합성을 보존하거나 심지어 향상시키는 접촉 부위 내의 변형을 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1 Fc(Fc□1)에서의 하기 단일 아미노산 잔기는 FcRn에 대한 Fc 결합 친화도의 유의한 손실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A 및 K447A, 여기서, 예를 들어 P238A는 238번 위치에서 야생형 프롤린이 알라닌에 의해 치환된 것을 나타냄. 예로서, 일부 실시형태는 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거하는 N297A 돌연변이를 혼입한다. 알라닌에 더하여, 다른 아미노산은 상기 특정된 위치에서 야생형 아미노산을 치환할 수 있다. 돌연변이는 Fc 내로 단독으로 도입되어서, 천연 Fc와 구별되는 100개 초과의 Fc 영역을 생성할 수 있다. 추가로, 이들 개별 돌연변이의 2개, 3개 또는 그 이상의 조합이 함께 도입되어서, 수 백개가 넘는 Fc 영역을 생성할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 작제물의 Fc 영역 중 하나는 돌연변이될 수 있고, 작제물의 다른 하나의 Fc 영역은 전혀 돌연변이되지 않거나, 둘 다가 상이한 돌연변이로 돌연변이될 수 있다.
소정의 상기 돌연변이는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대에 새로운 기능성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태는 N297A를 통합하여, 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거한다. 이 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시켜서, Fc 영역의 순환 반감기를 향상시키고, Fc 영역이 FcRn에 대한 친화도를 손상시키지 않으면서 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 결합할 수 없게 하는 것이다(문헌[Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847]; 문헌[Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632]; 문헌[Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591]). 상기 기재된 돌연변이로부터 생긴 새로운 기능성의 추가적인 예로서, FcRn에 대한 친화도는 일부 예에서 야생형의 친화도 이상으로 증가될 수 있다. 이러한 증가된 친화도는 증가된 "온(on)" 속도, 감소된 "오프(off)" 속도 또는 증가된 "온" 속도 및 감소된 "오프" 속도 둘 다를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 증가된 친화도를 부여하는 것으로 생각되는 돌연변이의 예는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(문헌[Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591)].
추가로, 적어도 3개의 인간 Fc 감마 수용체가 하부 힌지 영역, 일반적으로 아미노산 234 내지 237 내에서 IgG 상의 결합 부위를 인식하는 것으로 나타난다. 따라서, 예를 들어, 인간 IgG1 "ELLG"의 아미노산 233 내지 236을 (하나의 아미노산 결실을 갖는) IgG2 "PVA"로부터의 대응하는 서열로 대체함으로써, 새로운 기능 및 면역원성의 잠재적 감소에 대한 다른 예가 이러한 영역의 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 이러한 돌연변이가 도입되었을 때 다양한 효과기 기능을 매개하는 Fcγ□RI, Fcγ□RII 및 Fc□RIII이 IgG1에 결합하지 않는 것으로 나타났다. 문헌[Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77] 및 문헌[Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613].
일부 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 이의 일부, 예를 들어, Fc 영역은 서열 PKNSSMISNTP(미국 특허 제5,739,277호의 서열번호 89 또는 서열번호 3)를 포함하고, 선택적으로 HQSLGTQ(서열번호 90), HQNLSDGK(서열번호 91), HQNISDGK(서열번호 92), 또는 VISSHLGQ(서열번호 93)(또는 미국 특허 제5,739,277호의 각각 서열번호 11, 1, 2 및 31)로부터 선택된 서열을 추가로 포함하는 폴리펩티드이다.
다른 실시형태에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 다른 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부와 하나 이상의 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 또는 이의 일부에서의 아미노산 서열을 포함한다. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부에 의한 이황화 결합은 FVIII 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 VWF 단편을 함께 포함하는 제2 폴리펩티드를 위치시켜서, 내인성 VWF는 VWF 단편을 대체하지 않고 FVIII 폴리펩티드에 결합하지 않는다. 따라서, 제1 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부와 제2 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부 사이의 이황화 결합은 내인성 VWF와 FVIII 폴리펩티드 간의 상호작용을 방지한다. VWF와 FVIII 폴리펩티드 간의 상호작용의 이런 저해는 키메라 폴리펩티드의 반감기가 2배 제한을 넘어서는 것을 가능하게 한다. 힌지 영역 또는 이의 일부는 추가로 CH1, CH2, CH3 중 하나 이상의 도메인, 이의 단편 및 이들의 임의의 조합에 연결될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 힌지 영역 및 CH2이다.
특정 실시형태에서, Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 반-글리코실화(hemi-glycosylated)된다. 예를 들어, 2개의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 제1, 글리코실화된 Fc 영역(예를 들어, 글리코실화 CH2 영역) 또는 FcRn 결합 상대 및 제2, 비글리코실화된, Fc 영역(예를 들어, 비글리코실화 CH2 영역) 또는 FcRn 결합 상대를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 글리코실화 Fc 영역과 비-글리코실화 Fc 영역 사이에 개재될 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 완전히 글리코실화되며, 즉, Fc 영역 모두는 글리코실화된다. 다른 실시형태에서, Fc 영역은 비글리코실화될 수 있으며, 즉, Fc 모이어티의 어떤 것도 글리코실화되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 Ig 불변 영역의 항원 독립적 효과기 기능, 특히 단백질의 순환 반감기를 변경시키는 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 대한 아미노산 치환(예를 들어, Fc 변이체)을 포함한다.
이러한 단백질은 이러한 치환이 결여된 단백질에 비해 FcR에 대한 결합의 증가 또는 감소를 나타내므로, 각각 혈청 내에서 증가 또는 감소된 반감기를 갖는다. FcRn에 대한 친화도가 개선된 Fc 변이체는 더 긴 혈청 반감기를 가질 것이 예상되며, 이러한 분자는, 예를 들어, 만성 질환이나 장애를 치료하기 위해 투여되는 폴리펩티드의 긴 반감기가 요구되는 포유류의 치료 방법에서 유용하게 적용된다(예를 들어, 미국 특허 제7,348,004호, 제7,404,956호, 및 제7,862,820호 참조). 대조적으로, 감소된 FcRn 결합 친화도를 갖는 Fc 변이체는 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 예상되며, 이러한 분자는 또한, 예를 들어, 단축된 순환 시간이 유리할 수 있는 포유류에의 투여, 예컨대 생체 내 진단 영상화 또는 출발 항체가 연장된 기간 동안 순환계에 존재하는 경우 독성 부작용을 가지는 상황에서 유용하다. FcRn에 대한 결합 친화도가 감소된 Fc 변이체는 태반을 가로지를 가능성도 적으므로, 임신부에서 질환이나 장애를 치료하는 데에도 유용하다. 추가로, 감소된 FcRn 결합 친화도가 바람직할 수 있는 다른 적용예는 뇌, 신장 및/또는 간으로의 국소화가 바람직한 적용예를 포함한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 혈관으로부터 신장 사구체의 상피를 가로지를 때 수송 감소를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질은 뇌로부터 혈관 공간 내로 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier: BBB)을 가로지를 때 수송 감소를 나타낸다. 일부 실시형태에서, FcRn 결합이 변경된 단백질은 Ig 불변 영역의 "FcRn 결합 루프" 내의 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대(예를 들어, 1 또는 2개의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대)를 포함한다. FcR 결합 루프는, 일 실시형태에서는, 야생형 전장 Fc 영역의 아미노산 잔기 280 내지 299(EU 넘버링에 따름)를 포함한다. 다른 실시형태에서, FcRn 결합 친화도가 변경된 본 개시내용의 키메라 단백질 내 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 15 Å FcRn "접촉 구역(contact zone)" 내에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 영역 또는 FcRn을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 15 Å FcRn "접촉 구역"은 야생형, 전장 Fc 모이어티의 다음의 위치에서 잔기를 포함한다: 243 내지 261, 275 내지 280, 282 내지 293, 302 내지 319, 336 내지 348, 367, 369, 372 내지 389, 391, 393, 408, 424, 425 내지 440(EU 넘버링). 다른 실시형태에서, FcRn 결합 친화도가 변경된 본 개시내용의 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 다음의 EU 위치 중 임의의 하나에 대응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 적어도 하나의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대를 포함한다: 256, 277 내지 281, 283 내지 288, 303 내지 309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434(예를 들어, N434A 또는 N434K), 및 438. FcRn 결합 활성을 변경시키는 예시적인 아미노산 치환은 본 명세서에 참조에 의해 포함된 국제 특허 출원 공개 WO05/047327에 개시되어 있다.
본 개시내용에서 사용되는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 또한 키메라 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키는 당업계에 인식된 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, VWF 또는 FVIII 폴리펩티드의 D'D3 도메인에 연결된 키메라 폴리펩티드의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대는 감소된 글리코실화(예를 들어, N- 또는 O-연결된 글리코실화)를 야기하는 돌연변이를 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있거나, 또는 야생형 Fc 모이어티의 변경된 당형태(예를 들어, 저 푸코스 또는 무 푸코스 글리칸)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 미가공 키메라 폴리펩티드는 본 명세서에 기재되어 있는 Ig 불변 영역 또는 이의 일부로부터 독립적으로 선택된 구성적 Ig 불변 영역 또는 이의 일부 중 둘 이상을 갖는, 유전적으로 융합된 Fc 영역(scFc 영역)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이량체 Fc 영역의 Fc 영역은 동일하다. 다른 실시형태에서, Fc 영역 중 적어도 둘은 상이하다. 예를 들어, 본 개시내용의 단백질의 Fc 영역 또는 FcRn은 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함하거나, 이들의 길이는 하나 이상의 아미노산 잔기만큼(예를 들어, 약 5개의 아미노산 잔기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 잔기)만큼, 약 10개의 잔기만큼, 약 15개의 잔기만큼, 약 20개의 잔기만큼, 약 30개의 잔기만큼, 약 40개의 잔기만큼, 또는 약 50개의 잔기만큼) 상이할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 단백질의 Fc 영역 또는 FcRn은 하나 이상의 아미노산 위치에서 서열이 상이할 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 또는 FcRn 결합 상대 중 적어도 2개는 약 5개의 아미노산 위치(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 위치), 약 10개의 아미노산 위치, 약 15개의 아미노산 위치, 약 20개의 아미노산 위치, 약 30개의 아미노산 위치, 약 40개의 아미노산 위치, 또는 약 50개의 아미노산 위치에서 상이할 수 있다.
III.C.2. XTEN 서열
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "XTEN 서열"은 주로 작은 친수성 아미노산으로 구성된 비 천연 유래의, 실질적 비반복적인 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩티드를 지칭하고, 이때 상기 서열은 생리학적 조건 하에 2차 또는 3차 구조를 적은 정도로 갖거나 갖지 않는다. 키메라 폴리펩티드 상대로서, XTEN은 키메라 폴리펩티드를 생성하기 위해 본 개시내용의 VWF 단백질 또는 FVIII 서열에 연결될 때 소정의 바람직한 약물동태학적, 물리화학적 및 약제학적 특성을 부여하는 담체로서 작용할 수 있다. 이러한 바람직한 특성은 향상된 약물동태학적 파라미터 및 용해도 특징을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "XTEN"은 경쇄 또는 중쇄의 단일 쇄 항체 또는 Fc 단편과 같은 항체 또는 항체 단편을 특이적으로 배제한다.
일부 실시형태에서, XTEN 서열이 VWF 단백질 및/또는 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합될 때, 더 짧은 XTEN 서열은 더 긴 XTEN 서열에 비해 개선된 반감기 연장 특성을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, VWF 단백질 및/또는 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 XTEN 서열은 길이가 288개 미만의 아미노산을 함유하며, 즉, 288개의 아미노산보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, VWF 단백질 및/또는 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 XTEN 서열은 길이가 12개의 아미노산 내지 287개의 아미노산인 아미노산 서열로 이루어진다. 다른 실시형태에서, VWF 단백질 및/또는 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 XTEN 서열은 적어도 약 36개의 아미노산, 적어도 약 42개의 아미노산, 적어도 약 72개의 아미노산 또는 적어도 약 144개의 아미노산을 포함하지만, 288개 미만의 아미노산이다. 다른 실시형태에서, VWF 단백질 및/또는 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 XTEN 서열은 AE36, AG36, AE42, AG42, AE72, AG72, AE144 또는 AG144로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, VWF 단백질 및/또는 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 XTEN 서열은 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 14에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열이되, 키메라 폴리펩티드는 XTEN 서열이 없는 키메라 폴리펩티드에 비해 개선된 반감기를 나타낸다.
본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 추가적인(제2, 제3 이상의) XTEN 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 XTEN 서열은 추가로 FVIII 폴리펩티드 또는 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합될 수 있다. 추가적인 XTEN 서열은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, FVIII 폴리펩티드 또는 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 추가적인 XTEN 서열은 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 또는 2000개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 추가적인 XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개의 아미노산 잔기, 약 30개 초과 내지 약 2500개의 잔기, 약 40개 초과 내지 약 2000개의 잔기, 약 50개 초과 내지 약 1500개의 잔기, 약 60개 초과 내지 약 1000개의 잔기, 약 70개 초과 내지 약 900개의 잔기, 약 80개 초과 내지 약 800개의 잔기, 약 90개 초과 내지 약 700개의 잔기, 약 100개 초과 내지 약 600개의 잔기, 약 110개 초과 내지 약 500개의 잔기 또는 약 120개 초과 내지 약 400개의 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드에 융합된 추가적인 XTEN은 적어도 약 288개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드에 융합된 추가적인 XTEN은 약 288개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시형태에서, FVIII 폴리펩티드에 융합된 추가적인 XTEN은 AE288의 아미노산 서열(서열번호 8)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
XTEN 서열(즉, VWF 단백질 및/또는 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합된 XTEN 서열 또는 FVIII 폴리펩티드 및/또는 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부에 융합되거나 FVIII 폴리펩티드 내의 하나 이상의 삽입 부위에 삽입된 XTEN 서열)은 9 내지 14개의 아미노산 잔기의 하나 이상의 서열 모티프 또는 서열 모티프에 대해 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있되, 모티프는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 4 내지 6가지 유형을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 미국 특허 제2010-0239554 A1호를 참조한다.
일부 실시형태에서, XTEN 서열은 비중복 서열 모티프를 포함하는데, 여기서 서열의 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 91% 또는 적어도 약 92% 또는 적어도 약 93% 또는 적어도 약 94% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 96% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%는 표 7로부터 선택된 단일 모티프 패밀리로부터 선택된 비중복 서열의 다중 단위로 이루어져서, 패밀리 서열을 생성한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "패밀리"는 XTEN이 단지 표 7로부터의 단일 모티프 카테고리로부터 선택된 모티프; 즉 AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, 또는 BD XTEN을 갖고, 패밀리 모티프로부터의 것이 아닌 XTEN에서의 임의의 다른 아미노산이 필요한 특성을 달성하도록, 예컨대 암호화 뉴클레오티드에 의한 제한효소 부위의 혼입, 절단 서열의 혼입을 허용하거나 FVIII에 대한 더 양호한 연결을 달성하도록 선택된다는 것을 의미한다. XTEN 패밀리의 일부 실시형태에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리 또는 AE 모티프 패밀리 또는 AF 모티프 패밀리 또는 AG 모티프 패밀리 또는 AM 모티프 패밀리 또는 AQ 모티프 패밀리 또는 BC 패밀리 또는 BD 패밀리의 비중복 서열 모티프의 다중 단위를 포함하고, 생성된 XTEN은 상기 기재된 상동성 범위를 나타낸다. 다른 실시형태에서, XTEN은 표 7의 2개 이상의 모티프 패밀리로부터의 모티프 서열의 다중 단위를 포함한다. 이들 서열은 이하에 더 충분히 기재되는, 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여된 순 전하, 친수성, 2차 구조의 결여 또는 반복성의 결여와 같은 특성을 포함하는 목적하는 물리적/화학적 특징을 달성하도록 선택될 수 있다. 이 단락에 기재된 이상의 실시형태에서, XTEN 내로 혼입되는 모티프들은 약 36개 내지 약 3000개의 아미노산 잔기의 XTEN을 달성하기 위해 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 선택되고 조립될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용된 XTEN 서열은 AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 및 AG2004로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 미국 특허 제2010-0239554 A1호를 참조한다.
일부 실시형태에서, XTEN 서열은 AE42(서열번호 9), AE72(서열번호 10), AE144_2A(서열번호 55), AE144_3B(서열번호 56), AE144_4A(서열번호 57), AE144_5A(서열번호 58), AE144_6B(서열번호 59), AG144_A(서열번호 60), AG144_B(서열번호 61), AG144_C(서열번호 62), AG144_F(서열번호 63), AE864(서열번호 15), AE576(서열번호 16), AE288(서열번호 8), AE288_2(서열번호 54), AE144(서열번호 11), AG864(서열번호 17), AG576(서열번호 18), AG288(서열번호 19), AG144(서열번호 14), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 다른 실시형태에서, XTEN 서열은 AE42(서열번호 9), AE72(서열번호 10), AE144_2A(서열번호 55), AE144_3B(서열번호 56), AE144_4A(서열번호 57), AE144_5A(서열번호 58), AE144_6B(서열번호 59), AG144_A(서열번호 60), AG144_B(서열번호 61), AG144_C(서열번호 62), AG144_F(서열번호 63), AE864(서열번호 15), AE576(서열번호 16), AE288(서열번호 8), AE288_2(서열번호 54), AE144(서열번호 11), AG864(서열번호 17), AG576(서열번호 18), AG288(서열번호 19), AG144(서열번호 14), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, XTEN 서열은 AE288이다. 본 개시내용의 특정 XTEN 서열에 대한 아미노산 서열은 표 8에 나타낸다.
해당 실시형태에서, XTEN 성분(들)은 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택된 아미노산 중 4, 5 또는 6가지 유형으로 이루어진 100% 미만의 아미노산, 또는 표 7로부터의 서열 모티프 또는 표 8의 XTEN 서열로 이루어진 서열의 100% 미만을 가지며, XTEN의 다른 아미노산 잔기는 임의의 다른 14종의 천연 L-아미노산으로부터 선택되지만, XTEN 서열이 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99%의 친수성 아미노산을 함유하도록 우선적으로는 친수성 아미노산으로부터 선택된다. 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)이 아닌 XTEN 아미노산은 XTEN 서열 전체적으로 산재되어 있고, 서열 모티프 내에 또는 사이에 위치되거나, 또는 XTEN 서열의 하나 이상의 짧은 신장부에 농축되어, 예를 들어, XTEN과 FVIII 또는 VWF 성분 사이에 링커를 생성한다. XTEN 성분이 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P) 이외의 아미노산을 포함하는 경우에, 얻어진 서열이 일반적으로 본 명세서에 개시된 방법에 의해 결정할 때 2차 구조를 결여하도록, 예를 들어, 2% 초과의 알파 나선 또는 2%의 베타-시트를 갖지 않도록 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 아미노산이 소수성 잔기인 것이 바람직하다. XTEN의 작제에 덜 선호되는 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌을 포함한다. 추가로, XTEN 서열이 하기 아미노산을 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만으로 함유하거나 함유하지 않도록 설계할 수 있다: 시스테인(이황화물 형성 및 산화를 피하기 위함), 메티오닌(산화를 피하기 위함), 아스파라긴 및 글루타민(탈아미드화를 피하기 위함). 따라서, 일부 실시형태에서, 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)에 추가로 다른 아미노산을 포함하는 XTEN 성분은 초우-파스만(Chou-Fasman) 알고리즘에 의해 측정한 바와 같은 알파-나선 및 베타-시트에 기여하는 잔기 중 5% 미만을 갖는 서열을 가지며, GOR 알고리즘에 의해 측정할 때 적어도 90%, 또는 적어도 약 95% 이상의 무작위 코일 형성을 가진다.
추가적인 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는 XTEN 서열은 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드의 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들어, 약물동태학에 영향을 미친다. 본 개시내용에서 사용되는 XTEN 서열은 다음의 유리한 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 입체배좌 가요성, 향상된 수용해도, 높은 정도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유류 수용체에 대한 낮은 결합성 또는 증가된 유체역학(또는 스토크스(Stokes)) 반경. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에서 FVIII 단백질에 연결된 XTEN 서열은 약물동태학적 특성, 예컨대 더 긴 최종 반감기를 증가시키거나 또는 곡선하 면적(AUC)을 증가시키고, 따라서 본 명세서에 기재된 키메라 폴리펩티드는 야생형 FVIII에 비해 증가된 기간 동안 생체내에 머무른다. 추가 실시형태에서, 본 개시내용에서 사용되는 XTEN 서열은 약물동태학적 특성, 예컨대 더 긴 최종 반감기를 증가시키거나 또는 곡선하 면적(AUC)을 증가시키고, 따라서 FVIII 단백질은 야생형 FVIII에 비해 증가된 기간 동안 생체내에 머무른다.
XTEN 서열을 포함하는 단백질의 물리적/화학적 특성을 결정하기 위해 다양한 방법 및 분석이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 분석적 원심분리, EPR, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, HPLC-역상, 광 산란, 모세관 전기영동, 원이색법, 시차주사 열량측정법, 형광, HPLC-이온 교환, HPLC-크기 배제, IR, NMR, 라만(Raman) 분광학, 굴절법 및 UV/가시광선 분광학을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적인 방법은 문헌[Amau et al., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006)]에 개시되어 있다.
본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 XTEN 서열의 추가적인 예는 미국 특허 공개 제2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 출원 공개 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, 또는 WO 20130122617 A1에 개시되어 있다.
III.C.2. 알부민
알부민 또는 이의 일부는 FcRn 결합 상대일 수 있다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 적어도 하나의 알부민 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 전장 형태의 609개의 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 유의한 비율의 혈청 삼투압을 초래하고, 또한 내인성 및 외인성 리간드의 운반체로서 작용한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "알부민"은 전장 알부민, 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체의 예는 미국 특허 공개 제2008/0194481 A1호, 미국 특허 공개 제2008/0004206 A1호, 미국 특허 공개 제2008/0161243 A1호, 미국 특허 공개 제2008/0261877 A1호 또는 미국 특허 공개 제2008/0153751 A1호, 또는 국제 공개 제2008/033413 A2호, 국제 특허 출원 제2009/058322 A1호 또는 국제 특허 출원 제2007/021494 A2호에 개시되어 있으며, 이들은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
알부민-결합 폴리펩티드(albumin-binding polypeptide: ABP)는 박테리아 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 펩티드, 또는 알부민에 결합할 수 있는 알부민-결합 항체 단편을 제한없이 포함할 수 있다. 문헌[Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996)] 및 문헌[Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 바와 같은 연쇄상 구균 단백질 G로부터의 도메인 3은 박테리아 알부민 결합 도메인의 예이다. 알부민-결합 펩티드의 예는 문헌[Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)]에 개시되어 있다. 알부민 결합 항체 단편의 예는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된 문헌[Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007)]; 문헌[Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007)], 및 문헌[Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)]에 개시되어 있다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 알부민에 결합할 수 있는 비-폴리펩티드 소분자, 변이체, 또는 유도체에 대한 적어도 하나의 부착 부위를 포함한다. 예를 들어, 키메라 단백질은 하나 이상의 유기 알부민-결합 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 알부민 결합 모이어티의 예로는 문헌[Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)]에 개시된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-요오도페닐)부탄아미도)헥사노에이트("Albu" 태그)가 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VWF 단편은 알부민에 융합된다. 일부 실시형태에서, VWF 단편-알부민 작제물은 동형이량체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 알부민에 융합된 VWF의 D'D3 도메인은 FVIII 폴리펩티드와 회합된다. 특정 실시형태에서, 알부민에 융합된 VWF의 D'D3 도메인은 야생형 FVIII과 VWF 사이의 비-공유 상호작용보다 더 강한 상호작용에 의해 FVIII 폴리펩티드와 회합된다. 특정 실시형태에서, VWF의 D'D3 도메인 및/또는 FVIII 폴리펩티드는 VWF의 D'D3 도메인과 FVIII 폴리펩티드 사이의 친화도를 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, VWF의 D'D3 도메인 및/또는 FVIII 폴리펩티드는 VWF의 D'D3 도메인 및/또는 FVIII 폴리펩티드 사이에 이황화 결합이 형성되는 것을 가능하게 하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
III.C.3. CTP
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에 사용된 키메라 단백질은 인간 융모성 성선 자극 호르몬 β 서브유닛의 적어도 하나의 C-말단 펩티드(CTP) 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. CTP 펩티드는 본 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 미국 특허 제5,712,122호를 참조하며, 본 명세서에 그 전문이 참조에 의해 포함된다. 비 제한적인 예시적 CTP 펩티드는 참조에 의해 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2009/0087411 A1호에 개시되어 있다.
III.C.4. PAS
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 적어도 하나의 PAS 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 PAS 펩티드 또는 PAS 서열은 주로 알라닌 및 세린 잔기를 포함하거나, 주로 알라닌, 세린, 및 프롤린 잔기를 포함하는 아미노산 서열로서, 생리학적 조건 하에서 무작위 코일 구조를 형성하는 아미노산 서열을 의미한다. 따라서, PAS 서열은 키메라 폴리펩티드에서 이종성 모이어티의 부분으로 사용될 수 있는 알라닌, 세린 및 프롤린을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 빌딩 블록, 아미노산 중합체 또는 서열 카세트이다. 부성분(minor constituent)으로서 알라닌, 세린, 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에 첨가되면 아미노산 중합체도 무작위 코일 구조를 형성할 수 있다. "부성분"이라는 용어는 알라닌, 세린, 및 프롤린 이외의 아미노산이 특정 정도로, 예를 들어, 최대 약 12%, 즉, PAS 서열의 100개의 아미노산 중 약 12개, 최대 약 10%, 최대 약 9%, 최대 약 8%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 즉, 약 2%, 또는 약 1%로 PAS 서열에 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린, 및 프롤린과 상이한 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생리학적 조건하에서, PAS 펩티드는 무작위 코일 구조를 형성하여, 본 개시내용의 재조합 단백질에 대한 생체 내 및/또는 시험관 내 안정성 증가를 매개할 수 있으며, 응혈원 활성을 갖는다.
PAS 펩티드의 비제한적 예는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2010/0292130 A1호 및 국제 특허 출원 공개 WO 2008/155134 A1; 및 유럽 특허 제2173890호에 개시되어 있다.
III.C.5. HAP
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 적어도 하나의 호모-아미노산 중합체(HAP) 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. HAP 펩티드는 적어도 50개의 아미노산, 100개의 아미노산, 120개의 아미노산, 140개의 아미노산, 160개의 아미노산, 180개의 아미노산, 200개의 아미노산, 250개의 아미노산, 300개의 아미노산, 350개의 아미노산, 400개의 아미노산, 450개의 아미노산, 또는 500개의 아미노산 길이를 갖는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다. HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장할 수 있다. HAP 서열의 비제한적인 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일 실시형태에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 또 다른 실시형태에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다. 예를 들어, 문헌[Schlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)]을 참조.
III.C.6. 트랜스페린
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 적어도 하나의 트랜스페린 펩티드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 임의의 트랜스페린이 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드와 융합될 수 있다. 예를 들어, 야생형 인간 Tf(Tf)는 대략 75 kDa(글리코실화는 제외함)인 679개의 아미노산 단백질이며, 유전자 복제에서 유래된 것으로 나타난 2개의 주요 도메인, 즉, N(약 330개의 아미노산) 및 C(약 340개의 아미노산)를 갖는다. 젠뱅크 수탁 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)을 참조하며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
트랜스페린은 트랜스페린 수용체(TfR)-매개 내포작용(endocytosis)을 통해 철을 수송한다. 철이 엔도솜 구획 내로 방출되고 Tf-TfR 복합체가 세포 표면으로 재순환된 후, Tf는 다음 주기의 철 수송을 위해 세포 외 공간으로 다시 방출된다. Tf는 14 내지 17일을 초과하는 긴 반감기를 가진다(Li et al., Trends Pharmacol. Sci. 23:206-209 (2002)]). 트랜스페린 융합 단백질은 반감기 연장, 암 요법의 표적화된 전달, 경구 전달 및 프로인슐린의 지속적 활성화에 대해 연구되었다(문헌[Brandsma et al., Biotechnol. Adv., 29: 230-238 (2011)]; 문헌[Bai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:7292-7296 (2005)]; 문헌[Kim et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 334:682-692 (2010)]; 문헌[Wang et al., J. Controlled Release 155:386-392 (2011)]).
III.C.7. PEG
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 비-폴리펩티드 이종성 모이어티 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 위한 적어도 하나의 부착 부위를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 응고 인자 및/또는 Fc 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에 부착된 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함할 수 있다.
단백질의 페길화는 단백질과 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 사이에 형성된 접합체를 지칭할 수 있다. PEG는 매우 다양한 분자량 및 평균 분자량 범위에서 상업적으로 입수 가능하다. PEG 평균 분자량 범위의 전형적인 예는 약 200, 약 300, 약 400, 약 600, 약 1000, 약 1300 내지 1600, 약 1450, 약 2000, 약 3000, 약 3000 내지 3750, 약 3350, 약 3000 내지 7000, 약 3500 내지 4500, 약 5000 내지 7000, 약 7000 내지 9000, 약 8000, 약 10000, 약 8500 내지 11500, 약 16000 내지 24000, 약 35000, 약 40000, 약 60000, 및 약 80000 달톤(Dalton)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 평균 분자량은 단지 예시로서 제공되며 어떤 방식으로도 제한을 의미하지 않는다.
본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 단백질은 모노- 또는 폴리-(예: 2 내지 4) PEG 모이어티를 포함하도록 페길화될 수 있다. 페길화는 당업계에 알려진 임의의 페길화 반응에 의해 수행될 수 있다. 페길화된 단백질 산물을 제조하기 위한 방법은 일반적으로 (i) 본 개시내용의 펩티드가 하나 이상의 PEG기에 부착되게 되는 조건 하에서, 폴리펩티드를 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 PEG의 반응 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계; 및 (ii) 반응 산물(들)을 수득하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 반응을 위한 최적 반응 조건은 알려진 파라미터와 목적하는 결과에 기반하여 사례별로 결정될 것이다.
당업자가 이용 가능한 다수의 방법이 있다, 예를 들어, 문헌[Malik F et al., Exp. Hematol. 20:1028-35 (1992)]; 문헌[Francis, Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992)]; 유럽 특허 공개 제0401384호, 유럽 특허 제0154316호 및 유럽 특허 제0401384호; 및 국제 특허 출원 WO92/16221 및 WO95/34326. 비 제한적 예로서, FVIII 변이체는 시스테인 치환을 함유할 수 있고, 시스테인은 PEG 중합체에 추가로 접합될 수 있다. 문헌[Mei et al., Blood 116:270-279 (2010)] 및 미국 특허 제7,632,921호를 참조하며, 이들 문헌은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편에 공유 결합된 단일 쇄 FVIII 폴리펩티드를 포함하되, FVIII 폴리펩티드는 B 도메인의 모두 또는 일부의 결실을 포함하고, FVIII 폴리펩티드는 페길화되며, VWF 단편은 FVIII 폴리펩티드(예를 들어, PEG-scFVIII-D'D3, "MG1121," 또는 LAFATE)의 N-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편에 공유 결합된 단일 쇄 FVIII 폴리펩티드를 포함하되, FVIII 폴리펩티드는 B 도메인의 모두 또는 일부의 결실을 포함하고, VWF 단편은 페길화되며, VWF 단편은 FVIII 폴리펩티드(예를 들어, scFVIII-D'D3-PEG)의 N-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 VWF의 D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편에 공유 결합된 단일 쇄 FVIII 폴리펩티드를 포함하되, FVIII 폴리펩티드는 B 도메인의 모두 또는 일부의 결실을 포함하고, FVIII 폴리펩티드 및 VWF 단편은 페길화되며, VWF 단편은 FVIII 폴리펩티드(예를 들어, scFVIII-D'D3-PEG)의 N-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다.
III.C.8. HES
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 적어도 하나의 히드록시에틸 전분(HES) 중합체를 포함한다. HES는 천연 유래 아밀로펙틴의 유도체이며, 체내의 알파-아밀라제에 의해 분해된다. HES는 유리한 생물학적 특성을 나타내며, 혈액량 대체제(blood volume replacement agent)로서 사용되고, 임상에서는 혈액희석 요법에 사용된다. 예를 들어, 문헌[Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie 8:271-278 (1987)]; 및 문헌[Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res. 41: 494-498 (1991)] 참조.
HES는 주로 분자량 분포 및 치환의 정도에 의해 특성규명된다. HES는 평균 분자량(중량 평균)이 1 내지 300 kD, 2 내지 200 kD, 3 내지 100 kD, 또는 4 내지 70 kD이다. 히드록시에틸 전분은 히드록시에틸기에 대해 0.1 내지 3, 0.1 내지 2, 0.1 내지 0.9, 또는 0.1 내지 0.8의 몰치환도(molar degree of substitution), 및 2 내지 20 범위의 C2:C6 치환 사이의 비를 더 나타낼 수 있다. 약 130 kD의 평균 분자량을 갖는 HES는 프레제니우스(Fresenius)의 볼루벤(Voluven)®이다. 볼루벤®은, 예를 들어, 저혈량증의 치료 및 예방을 위한 치료적 적응증에서 사용되는, 혈액량 대체(volume replacement)를 위한 인공 콜로이드이다. 다수의 HES 부착 방법, 예를 들어, 상기 기재한 것과 동일한 PEG 부착 방법을 당업자가 이용할 수 있다.
III.C.9. PSA
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 폴리펩티드는 적어도 하나의 폴리시알산(PSA) 중합체를 포함한다. PSA는 특정 박테리아 균주에 의해서 그리고 포유류의 특정 세포에서 생산되는 시알산의 천연 유래 비 분지형 중합체이다. 예를 들어, 문헌[Roth J. et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds. Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (
, Basel, Switzerland), pp. 335-348] 참조. PSA는 제한된 산 가수분해에 의하거나, 뉴라미니다제를 사용한 분해에 의하거나, 중합체를 천연의 박테리아 유도 형태로 분획화하는 것에 의해 n=약 80 이상의 시알산 잔기에서 n=2까지의 다양한 중합도(degree of polymerization)로 생산될 수 있다. 다수의 PSA 부착 방법, 예를 들어, 상기 기재한 것과 동일한 PEG 부착 방법을 당업자가 이용할 수 있다. 특정 양상에서, 활성화된 PSA는 또한, 예를 들어, FVIII 상의 응고 인자 내에서 또는 Fc 영역 내에서 시스테인 아미노산 잔기에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5846951호를 참조한다.
III.C.10. 클리어런스 수용체
특정 양상에서, 본 개시내용의 방법에서 사용된 키메라 단백질의 반감기는, 키메라 폴리펩티드의 응고 인자가 FVIII 폴리펩티드 및 FVIII 클리어런스 수용체의 적어도 하나의 단편 또는 FVIII-결합 단편, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하는 경우에 연장될 수 있다. 저밀도 지방단백질-관련 단백질 수용체인 LRP1, 또는 이의 단편과 같은 가용성 형태의 클리어런스 수용체의 삽입은 FVIII가 클리어런스 수용체에 결합하는 것을 차단하여 이의 반감기, 예를 들어, 생체 내 반감기를 연장할 수 있다. LRP1은, FVIII을 포함하여 다양한 단백질의 수용체-매개 제거에 관여하는 600 kDa의 내재 막 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Lenting et al., Haemophilia 16:6-16 (2010)]을 참조한다. 다른 적합한 FVIII 제거 수용체는, 예를 들어, LDLR(저밀도 지방단백질 수용체), VLDLR(초저밀도 지질단백질 수용체), 및 메갈린(LRP-2), 또는 이들의 단편이다. 예를 들어, 문헌[Bovenschen et al., Blood 106:906-912 (2005)]; 문헌[Bovenschen, Blood 116:5439-5440 (2010)]; 문헌[Martinelli et al., Blood 116:5688-5697 (2010)]을 참조한다.
III.D. 삽입 부위
일부 양상에서, FVIII 폴리펩티드에서 삽입 부위는 N-말단 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, B 도메인, C1 도메인, C2 도메인, C-말단, 또는 이들의 둘 이상의 조합인 FVIII 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인, 또는 A1 도메인과 a1 산성 영역, 및 a1 산성 영역과 A2 도메인, A2 도메인과 a2 산성 영역, a2 산성 영역과 B 도메인, B 도메인과 A3 도메인, 및 A3 도메인과 C1 도메인, C1 도메인과 C2 도메인, 또는 이들의 임의의 조합인 FVIII 폴리펩티드의 두 도메인 사이에 위치된다. 예를 들어, XTEN 서열이 삽입될 수 있는 삽입 부위는 N-말단과 A1 도메인, N-말단과 A2 도메인, N-말단과 A3 도메인, N-말단과 B 도메인, N-말단과 C1 도메인, N-말단과 C2 도메인, N-말단과 C-말단, A1과 A2 도메인, A1과 A3 도메인, A1과 B 도메인, A1과 C1 도메인, A1과 C2 도메인, A1 도메인과 C-말단, A2와 A3 도메인, A2와 B 도메인, A2와 C1 도메인, A2와 C2 도메인, A2 도메인과 C-말단, A3과 B 도메인, A3과 C1 도메인, A3과 C2 도메인, A3 도메인과 C-말단, B과 C1 도메인, B와 C2 도메인, B 도메인과 C-말단, C1과 C2 도메인, C1과 C-말단, C2 도메인과 C-말단, 및 이들의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
XTEN 서열이 FVIII 폴리펩티드 내 하나 이상의 아미노산 바로 다음에(예를 들어, 하나 이상의 XTEN 삽입 부위) 삽입되거나 또는 C-말단 또는 N-말단에 연결된 FVIII 폴리펩티드는 XTEN 서열에 대한 결합 또는 이에 의한 삽입 후에 FVIII 활성을 보유한다. 삽입이 FVIII 활성에 영향을 미치지 않도록(즉, FVIII 단백질이 여전히 응고 특성을 보유하도록) XTEN 서열은 1회 이상, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회로 FVIII 폴리펩티드에 삽입될 수 있다.
본 개시내용에 유용한 FVIII 폴리펩티드는 선택적 링커에 의해 FVIII 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 XTEN 폴리펩티드에 연결되거나 또는 하나 이상의 선택적 링커에 의해 FVIII 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산 바로 다음에(예를 들어, 하나 이상의 XTEN 삽입 부위) 삽입될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 XTEN은 FVIII의 B 도메인에 삽입된다. 일례에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 740 내지 1640 사이에 삽입되되, 아미노산 740과 1640 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 다른 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 741 내지 1690 사이에 삽입되되, 아미노산 740과 1690 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 다른 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 741 내지 1648 사이에 삽입되되, 아미노산 741과 1648 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 743 내지 1638 사이에 삽입되되, 아미노산 743과 1638 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 745 내지 1656 사이에 삽입되되, 아미노산 745와 1656 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 일부 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 745 내지 1657 사이에 삽입되되, 아미노산 745와 1657 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 특정 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 745 내지 1667 사이에 삽입되되, 아미노산 745와 1667 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 745 내지 1686 사이에 삽입되되, 아미노산 745와 1686 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 일부 다른 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 747 내지 1642 사이에 삽입되되, 아미노산 747과 1642 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 또 다른 예에서, XTEN은 서열번호 65에 대응하는 아미노산 751 내지 1667 사이에 삽입되되, 아미노산 751과 1667 사이의 FVIII 서열은 선택적으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, XTEN 서열은 성숙 FVIII 폴리펩티드의 아미노산 745 내지 746 사이에 또는 B-도메인 결실 FVIII 폴리펩티드의 대응하는 삽입 부위에 삽입된다. 특정 실시형태에서, AE288의 아미노산 서열(서열번호 8)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 XTEN 서열은 성숙 FVIII의 아미노산 745 내지 746 사이에 삽입되되, 성숙 FVIII은 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 가진다. 특정 실시형태에서, XTEN은 표 5의 B 도메인 결실된 FVIII의 아미노산 745(서열번호 68)의 바로 하류에 삽입된다.
III.E. 링커
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 FVIII 단백질에서 그리고/또는 VWF 단편에서 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다. 한 가지 유형의 링커는 대상체에게 생체내에서, 예를 들어, 응고 부위에 투여될 때 다양한 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 절단 가능한 링커이다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 XTEN 서열로부터, 그에 따라 응고 캐스케이드 부위에서 키메라 폴리펩티드로부터 모이어티, 예를 들어, VWF 단백질의 절단을 가능하게 하여, 활성화된 FVIII(FVIIIa)이 FVIIIa 활성을 갖는 것을 가능하게 한다. 다른 유형의 링커는 가공 가능한 링커인데, 이는 세포내 절단 부위를 함유하고 그에 의해 숙주 세포에서 세포내 가공 효소에 의해 절단되어, 폴리펩티드의 편리한 발현 및 키메라 폴리펩티드의 형성을 가능하게 한다.
하나 이상의 링커는 키메라 폴리펩티드 내 임의의 두 단백질 사이에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 (i) FVIII 폴리펩티드 및 (ii) 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 제1 폴리펩티드, 및 (iii) VWF 단백질, (iv) 링커(예를 들어, 절단 가능한 링커), (v) XTEN 서열, 및 (vi) 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 제2 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 (i) FVIII 폴리펩티드 및 (ii) 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 제1 폴리펩티드 및 (iii) VWF 단백질, (iv) XTEN 서열, (v) 링커(예를 들어, 절단 가능한 링커), 및 (vi) 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 제2 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 (i) FVIII 폴리펩티드 및 (ii) 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 제1 폴리펩티드 및 (iii) VWF 단백질, (iv) 제1 링커(예를 들어, 절단 가능한 링커), (v) XTEN 서열, (vi) 제2 링커(예를 들어, 절단 가능한 링커), 및 (vii) 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 링커, 예를 들어, FVIII 폴리펩티드와 제1 Ig 불변 영역 사이의 절단 가능한 링커를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 (i) FVIII 폴리펩티드, (ii) 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부, (iii) 링커(예를 들어, 가공 가능한 링커), (iv) VWF 단백질, (v) XTEN 서열, 및 (vi) 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 단일 쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 (i) FVIII 폴리펩티드, (ii) 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부, (iii) 제1 링커(예를 들어, 가공 가능한 링커), (iv) VWF 단백질, (v) 제2 링커(예를 들어, 절단 가능한 링커), (vi) XTEN 서열, 및 (vii) 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 단일 쇄를 포함한다. 가공 가능한 링커는 키메라 폴리펩티드가 숙주 세포에서 발현된 후에 가공될 수 있고; 따라서 숙주 세포에서 생산된 키메라 폴리펩티드는 2 또는 3개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 최종 형태일 수 있다.
본 개시내용에서 유용한 링커는 임의의 유기 분자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드에서 사용될 수 있는 링커의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제2011/0183907 A1호, 미국 특허 제2016/0229903 A1, 및 미국 특허 제2016/0251408 A1호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, 링커는 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 히드록시에틸 전분(HES)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열을 포함한다. 링커는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 1개 내지 5개의 아미노산, 1개 내지 10개의 아미노산, 1개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 100개의 아미노산, 100개 내지 200개의 아미노산, 200개 내지 300개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 400개 내지 500개의 아미노산, 500개 내지 600개의 아미노산, 600개 내지 700개의 아미노산, 700개 내지 800개의 아미노산, 800개 내지 900개의 아미노산 또는 900개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 XTEN 서열을 포함한다. XTEN의 추가적인 예는 본 개시내용에 따라 사용될 수 있고, 미국 특허 공개 제2010/0239554 A1호, 제2010/0323956 A1호, 제2011/0046060 A1호, 제2011/0046061 A1호, 제2011/0077199 A1호 또는 제2011/0172146 A1호 또는 국제 특허 출원 공개 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1 또는 WO 2011028344 A2에 개시되어 있다. 다른 실시형태에서, 링커는 PAS 서열이다.
특정 실시형태에서, 링커는 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 히드록시에틸 전분(HES)이다. 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 서열이다. 링커는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 1개 내지 5개의 아미노산, 1개 내지 10개의 아미노산, 1개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 100개의 아미노산, 100개 내지 200개의 아미노산, 200개 내지 300개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 400개 내지 500개의 아미노산, 500개 내지 600개의 아미노산, 600개 내지 700개의 아미노산, 700개 내지 800개의 아미노산, 800개 내지 900개의 아미노산 또는 900개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
링커의 예는 당업계에 잘 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 서열 Gn을 포함한다. 링커는 서열 (GA)n을 포함한다. 링커는 서열 (GGS)n을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 (GGGS)n(서열번호 101)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 서열 (GGS)n(GGGGS)n(서열번호 95)을 포함한다. 이들 예에서, n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 다른 예에서, n은 1 내지 20의 정수, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있다. 링커의 예는 GGG, SGGSGGS(서열번호 96), GGSGGSGGSGGSGGG(서열번호 97), GGSGGSGGGGSGGGGS(서열번호 98), GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열번호 99) 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 100)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 링커는 VWF 단백질 활성 또는 인자 VIII의 응고 활성을 제거하거나 감소시키지 않는다. 선택적으로, 링커는, 예를 들어, 추가로 입체 장애 효과를 감소시킴으로써 그리고 VWF 단백질 또는 인자 VIII부분을 이의 표적 결합 부위에 더 접근 가능하게 함으로써, VWF 단백질 활성 또는 인자 VIII의 응고 활성을 향상시킨다.
특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에 유용한 링커는 15 내지 25개의 아미노산 길이이다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에 유용한 링커는 15 내지 20개의 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에 대한 링커는 10 내지 25개의 아미노산 길이이다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에 대한 링커는 15개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에 대한 링커는 (GGGGS)n(서열번호 94)이며, G는 글리신을 나타내고, S는 세린을 나타내며, n은 1 내지 20의 정수이다.
III.F. 절단 부위
절단 가능한 링커는 하나의 분자를 다른 분자로부터 방출시키기 위해 화학적으로(예를 들어, 에스테르 결합의 가수분해), 효소적으로(즉, 프로테아제 절단 서열의 혼입), 또는 광분해에 의해(예를 들어, 발색단, 예컨대 3-아미노-3-(2-니트로페닐) 프로피온산(ANP))을 절단할 수 있는 모이어티를 혼입할 수 있다. 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드에 적합한 절단 가능한 링커의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제2016/0229903 A1호 및 미국 특허 제2016/0251408 A1호에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된다.
특정 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 다에서 하나 이상의 절단 부위를 포함한다. 다른 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 하나 이상의 절단 가능한 부위로 본질적으로 이루어지거나 이루어진다. 다른 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 본 명세서에 기재된 이종성 아미노산 링커 서열 또는 중합체 및 하나 이상의 절단 가능한 부위를 포함한다.
특정 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 숙주 세포에서 절단될 수 있는 하나 이상의 절단 부위(즉, 세포내 가공 부위)를 포함한다. 절단 부위의 비제한적 예는 RRRR(서열번호 102), RKRRKR(서열번호 103) 및 RRRRS(서열번호 104)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 FVIII로부터의 a1 영역, FVIII로부터의 a2 영역, FVIII로부터의 a3 영역, X-V-P-R(서열번호 105) 및 PAR1 부위 외(exosite) 상호작용 모티프를 포함하는 트롬빈 절단 가능한 부위(여기서, X는 지방족 아미노산임), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 전장 FVIII에 대응하는 Glu720 내지 Arg740에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 a2 영역을 포함하되, a2 영역은 트롬빈에 의해 절단될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 유용한 절단 가능한 링커는 ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 106) 또는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 88)를 포함하는 a2 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용에 대한 절단 가능한 링커는 전장 FVIII에 대응하는 Met337 내지 Arg372에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 a1 영역을 포함하되, a1 영역은 트롬빈에 의해 절단될 수 있다. 특정 실시형태에서, a1 영역은 ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(서열번호 107)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 절단 가능한 링커는 전장 FVIII에 대응하는 Glu1649 내지 Arg1689에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 a3 영역을 포함하되, a3 영역은 트롬빈에 의해 절단될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 절단 가능한 링커는 ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDEN QSPRSFQ(서열번호 108)를 포함하는 a3 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 X-V-P-R(서열번호 105) 및 PAR1 부위 외 상호작용 모티프를 포함하는 트롬빈 절단 부위를 포함하고, PAR1 부위 외 상호작용 모티프는 S-F-L-L-R-N(서열번호 109)을 포함한다. PAR1 부위 외 상호작용 모티프는 P, P-N, P-N-D, P-N-D-K(서열번호 110), P-N-D-K-Y(서열번호 111), P-N-D-K-Y-E(서열번호 112), P-N-D-K-Y-E-P(서열번호 113), P-N-D-K-Y-E-P-F(서열번호 114), P-N-D-K-Y-E-P-F-W(서열번호 115), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(서열번호 116), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(서열번호 117), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(서열번호 118), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(서열번호 119), P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(서열번호 120) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지방족 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커를 포함하는 키메라 폴리펩티드가 대상체에게 투여된 후에 프로테아제에 의해 절단되는 하나 이상의 절단 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 부위는 인자 XIa, 인자 XIIa, 칼리크레인, 인자 VIIa, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 IIa(트롬빈), 엘라스타제-2, MMP-12, MMP-13, MMP-17 및 MMP-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로테아제에 의해 절단된다. 다른 실시형태에서, 절단 부위는 FXIa 절단 부위(예를 들어, KLTR↓서열번호 121)), FXIa 절단 부위(예를 들어, DFTR↓(서열번호 122)), FXIIa 절단 부위(예를 들어, TMTR↓(서열번호 123)), 칼리크레인 절단 부위(예를 들어, SPFR↓(서열번호 124)), FVIIa 절단 부위(예를 들어, LQVR↓(서열번호 125)), FIXa 절단 부위(예를 들어, PLGR↓(서열번호 126)), FXa 절단 부위(예를 들어, IEGR↓(서열번호 127)), FIIa(트롬빈) 절단 부위(예를 들어, LTPR↓(서열번호 128)), 엘라스타제-2 절단 부위(예를 들어, LGPV↓(서열번호 129)), 그랜자임-B 절단(예를 들어, VAGD↓(서열번호 130)), MMP-12 절단 부위(예를 들어, GPAG↓(서열번호 131)), MMP-13 절단 부위(예를 들어, GPAG↓(서열번호 132)), MMP-17 절단 부위(예를 들어, APLG↓(서열번호 133)), MMP-20 절단 부위(예를 들어, PALP↓(서열번호 134)), TEV 절단 부위(예를 들어, ENLYFQ↓(서열번호 135)), 엔테로키나제 절단 부위(예를 들어, DDDK↓(서열번호 136)), 프로테아제 3C(프레시전(PreScission)™) 절단 부위(예를 들어, LEVLFQ↓(서열번호 137)), 및 소르타제(Sortase) A 절단 부위(예를 들어, LPKT↓서열번호 138)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, FXIa 절단 부위는, 예를 들어, TQSFNDFTR(서열번호 1) 및 SVSQTSKLTR(서열번호 3)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비제한적인 예시적 트롬빈 절단 부위는, 예를 들어, DFLAEGGGVR(서열번호 4), TTKIKPR(서열번호 5), LVPRG(서열번호 6), DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 88), 또는 IEPRSFS(서열번호 194), 및 ALRPR(서열번호 7)(예를 들어, ALRPRVVGGA(서열번호 145))을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 절단 부위는 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(서열번호 146)이다. 다른 실시형태에서, 절단 부위는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 88) 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 절단 부위는 IEPRSFS(서열번호 194)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 절단 부위는 EPRSFS(서열번호 195)를 포함하되, 절단 부위는 FVIII의 전장 a2 영역이 아니다. 또 다른 실시형태에서, 절단 부위는 IEPR(서열번호 200)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 절단 부위는 IEPR(서열번호 200)을 포함하되, 절단 부위는 FVIII의 전장 a2 영역이 아니거나 FVIII의 전장 a2 영역을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 절단 부위는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 184), AYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 185), YLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 186), LLSKNNAIEPRSFS(서열번호 187), LSKNNAIEPRSFS(서열번호 188), SKNNAIEPRSFS(서열번호 189), KNNAIEPRSFS(서열번호 190), NNAIEPRSFS(서열번호 191), NAIEPRSFS(서열번호 192), AIEPRSFS(서열번호 193) 또는 IEPRSFS(서열번호 194)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 절단 부위는 DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 88), KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 139), NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 140), TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 141), GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 142), DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 143), YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 144), YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 176), EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 177), DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 178), SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 179), YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 180), EDISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 181), DISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 182), ISAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 183), SAYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 184), AYLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 185), YLLSKNNAIEPRSFS(서열번호 186), LLSKNNAIEPRSFS(서열번호 187), LSKNNAIEPRSFS(서열번호 188), SKNNAIEPRSFS(서열번호 189), KNNAIEPRSFS(서열번호 190), NNAIEPRSFS(서열번호 191), NAIEPRSFS(서열번호 192), AIEPRSFS(서열번호 193) 또는 IEPRSFS(서열번호194)를 포함하되, 절단 부위는 전장 FVIII a2 영역이 아니다. 특정 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 또는 당업계에 공지된 바와 같은 트롬빈 절단 분석에서 절단 가능하다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 (i) FVIII 폴리펩티드, 제1 XTEN 서열 및 제1 Fc 영역을 포함하는, FVIII 단백질; 및 (ii) VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인, 제2 XTEN 서열, FVIII의 a2 링커 및 제2 Fc 영역을 포함하는, VWF 단편을 포함하되,
(a) FVIII 단백질은 성숙 FVIII에 대응하는 아미노산 746 내지 1648의 결실을 갖고;
(b) 제1 XTEN 서열은 성숙 FVIII에 대응하는 아미노산 745 바로 하류의 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입되며;
(c) 제1 XTEN 서열은 AE288의 아미노산 서열(서열번호 8)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(d) 제1 Fc 영역은 FVIII 폴리펩티드의 C-말단에 융합되며;
(e) 제2 XTEN 서열은 VWF 단편의 C-말단에 융합되고;
(f) 제2 XTEN 서열은 AE144_5A의 아미노산 서열(서열번호 58)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
(g) a2 링커는 XTEN의 C-말단에 융합되고;
(h) a2 링커는 서열번호 88의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며;
(i) 제2 Fc 영역은 a2 링커의 C-말단에 융합되고;
(j) 제1 Fc 영역은 제2 Fc 영역에 공유결합된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 서열, 즉, FVIII-161(서열번호 69), FVIII-169(서열번호 70), FVIII-170(서열번호 71), FVIII-173(서열번호 72); FVIII-195(서열번호 73); FVIII-196(서열번호 74), FVIII199(서열번호 75), FVIII-201(서열번호 76); FVIII-203(서열번호 77), FVIII-204(서열번호 78), FVIII-205(서열번호 79), FVIII-266(서열번호 80), FVIII-267(서열번호 81), FVIII-268(서열번호 82), FVIII-269(서열번호 83), FVIII-271(서열번호 84) 또는 FVIII-272(서열번호 85)로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 서열 및 VWF031(서열번호 86), VWF034(서열번호 87) 또는 VWF-036으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 서열, 즉, 서열번호 201에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 서열; 및 VWF의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인 및 Fc 영역을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 제2 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 서열, 즉, FVIII 폴리펩티드 및 Fc 영역을 포함하는, 제1 폴리펩티드 서열; 및 서열번호 202에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 제2 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 서열, 즉, 서열번호 201에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 제1 폴리펩티드 서열 및 서열번호 202에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 제2 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 서열, 서열번호 201에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 서열 및 서열번호 202에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 서열을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 서열, 서열번호 201에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 서열 및 서열번호 202에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 서열을 포함하되, 제1 폴리펩티드 서열 및 제2 폴리펩티드 서열은 이황화 결합에 의해 서로 연결된다.
IV.
약제학적 조성물
본 개시내용의 키메라 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이들은 활성 화합물을 작용 부위에 대한 전달용으로 설계된 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 볼루스 주사에 의한 비경구 투여(즉, 정맥내, 피하 또는 근육내)용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투약 형태, 예를 들어 보존제가 첨가된 앰플 또는 다회용량 용기에 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어 무 발열원수를 이용한 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 또한 수용성 형태, 예를 들어 수용성 염 형태의 활성 화합물의 수성 용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서의 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어, 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은, 예를 들어, 카르복시메틸나트륨 셀룰로오스, 소르비톨 및 덱스트란을 포함하여, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 세포 또는 간질성 공간 내로의 전달을 위해 본 개시내용의 분자를 캡슐화하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적으로 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 활성 성분의 저장 수명 또는 유효성을 향상시키는 약제학적으로 허용 가능한 물질, 예컨대 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 포함한다.
본 개시내용의 조성물은, 예를 들어, 액체(예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액, 현탁액, 반고체 및 고체 투여 형태를 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료 적용분야에 따라 달라진다.
조성물은 용액, 마이크로 에멀션, 분산액, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 성분을 혼입하고, 이어서 필요한 경우, 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질, 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가적인 목적하는 성분 + 활성 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 발생될 수 있다.
활성 성분은 제어 방출 제형 또는 장치에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 제형 및 장치의 예는 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형 및 장치의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
주사용 데포 제형은 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 중의 약물의 마이크로캡슐화된 매트릭스의 형성에 의해 제조될 수 있다. 약물 대 중합체의 비 및 사용된 중합체의 특성에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 예시적인 생분해성 중합체는 폴리오르토에스테르 및 폴리언하이드라이드가 있다. 데포 주사용 제형은 또한 리포솜 또는 마이크로에멀션 중에 약물을 포집함으로써 제조될 수 있다.
보충적 활성 화합물이 조성물 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 폴리펩티드는 다른 응고 인자, 또는 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체를 이용하여 제형화된다. 예를 들어, 응고 인자는 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 또는 재조합 가용성 조직 인자(rsTF) 또는 임의의 전술한 것의 활성화 형태를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 지혈제의 응고 인자는 또한 항-섬유소 용해제, 예를 들어 엡실론-아미노-카프르산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료적 상황의 응급성에 의해 표시된 바와 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약 단위 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)]이다.
활성 화합물에 더하여, 액체 투약 형태는 비활성 성분, 예컨대 물, 에틸 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르를 함유할 수 있다.
적합한 약제학적 담체의 비제한적인 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 또한 기재되어 있다. 부형제의 일부 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 pH 완충 시약, 및 습윤제 또는 유화제를 또한 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 키메라 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 키메라 폴리펩티드 내 FVIII 단백질은 야생형 FVIII 단백질 또는 VWF 단편이 없는 대응하는 FVIII 단백질에 비해 연장된 반감기를 가진다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 반감기는 야생형 FVIII보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 더 길게 연장된다. 다른 실시형태에서, 인자 VIII의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 반감기는 야생형 FVIII에 비해 약 3배 연장된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 정맥내 또는 피하 투여일 수 있는 비경구 투여에 의해 투여된다.
다른 실시형태에서, 조성물은 출혈 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 출혈 질환 또는 병태는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈, 장요근초에서의 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 수술을 받을 예정이다. 또 다른 실시형태에서, 치료는 예방적 치료 또는 대증적 치료이다.
지금까지 본 발명을 상세하게 기술하였지만, 단지 예시의 목적으로 본 명세서에 포함되고 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는 다음의 실시예를 참조함으로써 본 발명을 보다 명확하게 이해할 수 있을 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 간행물 및 논문은 본 명세서에 참조에 의해 명확하게 그리고 구체적으로 포함된다.
실시예
실시예 1: FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이량체의 인간 연구에서의 우선점
인자-기반 대체 요법은 혈우병 치료의 초석이다. 통상적인 재조합 FVIII(rFVIII) 산물은 짧은 반감기를 가져서, 빈번한 투여가 필요하다. A형 혈우병에 대한 가장 긴 투약 간격; 예방적으로, 급성, 수술기 주위 및 응급 상황에서를 포함하는 적절한 출혈 제어; 관절 보호 및 개선된 삶의 질을 포함하는 출혈 제어 이상의 보호; 및 장기간의 일관되고 잘 특성규명된 안전성 프로파일을 포함하는, 환자 치료에 대한 유의한 진보가 rFVIIIFc(엘록테이트®)에 의해 초래되었다. 그러나, 매주의 또는 더 긴 인자 VIII 예방적 투약은 A형 혈우병을 갖는 대다수의 사람에 대해 궁극적인 필요가 여전히 남아있다.
본 연구는 (i) FVIII 폴리펩티드, FVIII 폴리펩티드의 B 도메인 내에 삽입된 XTEN, 및 제1 Fc 영역; 및 (ii) VWF 단편, 제2 XTEN 서열, a2 링커 및 제2 Fc 영역을 포함하는, 키메라 폴리펩티드인 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 안전성 및 약물동태학(PK)을 연구한다(도 1).
연구 설계
본 연구의 목적은 rFVIII에 비한 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 단일 용량의 안전성, 내약성 및 FVIII 활성(PK)을 평가하는 것이었다. 환자 집단은 FVIII 산물에 대한 적어도 150일의 노출에 의해 중증의 A형 혈우병(<1 IU/㎗ [<1%] 내인성 FVIII 활성 수준)을 갖는, 그리고 양성 저해제 검사 또는 FVIII 투여에 대한 감소된 반응의 임상 징후의 병력이 없는, 이미 치료된 성인 남성을 포함하였다. 1차 종점은 저해제 개발을 포함하는 연구소 검사에서의 유해 사건 및 임상적 이상이었다. 중요한 2차 종점은 제거 반감기(t1/2), 클리어런스(CL), 0에서부터 무한대까지의 곡선하 면적(AUC0-∞), 평균 체류 시간(MRT) 및 증분 회복(IR)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 약물동태학 파라미터를 포함하였다.
환자를 저용량 코호트(7명의 환자; 도 2a) 또는 고용량 코호트(9명의 환자; 도 2b)에 등록하였다. 각각의 환자에 rFVIII(애드베이트®)을 투약한 다음 PK 샘플링 기간이 이어졌다. 짧은 약효 세척 기간(저용량 코호트에 대해 3일 이상(도 2a) 및 고용량 코호트에 대해 4일 이상(도 2b)) 후에, 이어서, 각각의 대상체에 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여한 다음 PK 샘플링 기간이 이어졌다. 대상체는 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 주사 후 제14일 및 제28일에 저해제 평가를 위한 샘플 수집을 포함하는, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 주사 후 28일 동안의 안전성 관찰을 받았다. 저용량 코호트에서 환자는 25 IU/㎏의 rFVIII 및 25 IU/㎏의 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받았다. 고용량 코호트에서 환자는 65 IU/㎏의 rFVIII 및 65 IU/㎏의 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받았다.
방법
약물동태학적 파라미터는 변형 활성화된 부분적 트로보플라스틴 시간(aPTT) 응고 분석("1단계" 분석)에 의해 측정하였다. 간단히 말하면, BCS® XP 분석기(Siemens Healthcare Diagnostics) 상에서 데이드(Dade)® 액틴(Actin)® FSL 활성화 PTT 시약(지멘스 헬스 케어 다이아그노스틱스(Siemens Health Care Diagnostics))을 이용하여 변형된 aPTT 분석에서 FVIII 활성을 측정한다. rFVIIIFc-VWF-XTEN 특이적 캘리브레이터(calibrator)를 이용하여 7-점 교정 곡선(고: 1.500 내지 0.050 IU/㎖; 저: 0.150-0.0025IU/㎖)을 생성하였다. 높은 교정 곡선에 대해, rFVIIIFc-VWF-XTEN 캘리브레이터[1.000 IU/㎖]를 Tris/BSA 완충제(1% BSA를 함유하는 50 mM, 150 mM 염화나트륨, pH 7.4 +/- 0.2) 내로 희석시켰다. 이 희석은 사전 선택된 교정 FVIII 활성 수준을 생성하도록 BCS® XP 분석기에 의해 수행한다. 이어서, 이들을 Tris/BSA 완충제에서 제조한 1:2의 권장 희석(working dilution)으로 시험한다. 낮은 교정 곡선에 대해, rFVIIIFc-VWF-XTEN 캘리브레이터[1.000 IU/㎖]를 BCS® XP 분석기에 의해 면역-고갈 FVIII 결핍 혈장(지멘스 헬스케어 다이아그노스틱스(Siemens Healthcare Diagnostics))에서 희석시키고, 있는 그대로(neat)(권장 희석 없이) 시험한다. 교정을 2회 중복하여 수행한다. 곡선을 FVIII 활성(IU/㎖)(x-축) 및 응고 시간(초)(y-축)으로 플롯팅한다. 높은 교정 곡선과 낮은 교정 곡선은 둘 다 선형 log-lin 회귀 곡선 적합도를 사용한다.
샘플을 높은 교정 곡선 메타테스트(metatest)(Tris/BSA에서 1:2, 1:4 및 1:8의 권장 희석) 또는 낮은 교정 곡선 메타검정(있는 그대로, 면역-고갈 FVIII 결핍 혈장 중의 1:2 및 1:4 권장 희석)을 이용하여 2회 중복하여 시험한다. 적절한 권장 희석 후에, 모든 캘리브레이터, 환자 샘플 및 품질관리 샘플을 0.010 IU/㎖ 이하의 FVIII 활성 및 적어도 0.400 IU/㎖의 다른 응고 인자를 함유하는 면역-고갈 FVIII 결핍 혈장과 1:1로 혼합한다. 샘플을 이 혈장과 혼합한 후에, APTT 시약을 첨가하고, 혼합물을 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후에, 염화칼슘을 첨가하고, 혈병 형성까지의 시간을 광학적으로 측정한다. 이어서, 알고리즘은 개개 권장 희석 결과가 보고된 FVIII 활성을 결정하기 위한 평균의 +/- 15.0% 내에 속하는지의 여부를 시험한다. 정량화 하한(Lower Limit of Quantification: LLOQ) 근처를 제외하고 보고된 FVIII 활성을 결정하기 위해 최소 2회의 메타테스트 권장 희석 결과가 필요하다.
결과: 저용량 코호트
저용량 코호트에 7명의 대상체를 등록하였고; 1명의 대상체는 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받기 전 연구와 관련 없는 이유로 제외시켰다. 6명의 대상체는 단일, 저용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN(25 IU/㎏)을 받았다. 저용량 코호트에서 치료한 처음 4명의 대상체의 특징은 하기를 포함하였다: 중증의 A형 혈우병(<1 IU/㎗ [<1%] 내인성 FVIII 활성 수준)을 갖는 성인 남성 대상체는 이미 치료되었고; 모든 대상체는 코카서스인이며; 대상체의 연령은 19 내지 60세의 범위이며, 평균은 33세이고; 평균 체중은 85 ㎏(67.2 내지 100.6 ㎏ 범위)이었다.
모든 환자에서, rFVIIIFc-VWF-XTEN은 일반적으로 잘 용인되고, 투약 후 제14일 또는 제28일에 저해제는 관찰되지 않았다.
제5일에 단일 저용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN(25 IU/㎏)을 받는 처음 6명의 대상체에 대한 주입 후 평균 FVIII 활성은 약 12.0%였고, 제7일에 약 5.3%였다(도 3a). 평균 FVIII 활성은 10일 내내 1% 초과인 채로 있었다(도 3a). RFVIIIFc-VWF-XTEN(25 IU/㎏) 및 rFVIII(25 IU/㎏)에 대해 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 의해 측정한 약물동태학적 파라미터를 표 9에 나타낸다. rFVIIIFc-VWF-XTEN은 인간 대상체에서 평균 반감기가 약 37.6시간인 것이 관찰되었는데, 이는 동일한 용량으로 투여한 rFVIII에 대한 평균 반감기(약 9.12시간)보다 4배 더 높았다.
결과: 고용량 코호트
9명의 대상체를 고용량 코호트에 등록하였다. 대상체에 단일, 고용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN(65 IU/㎏)을 투여하였다. 1명의 대상체는 연구와 관련없는 이유로 인해 PK 파라미터에 대해 시험할 수 없었다. 고용량 코호트에서 치료한 대상체의 특징은 하기를 포함하였다: 중증의 A형 혈우병(<1 IU/㎗ [<1%] 내인성 FVIII 활성 수준)을 갖는 성인 남성 대상체는 이미 치료되었고; 9명의 대상체 중 7명은 코카서스인이며; 대상체의 연령은 32 내지 63세의 범위이며, 평균은 44세이고; 평균 체중은 81.1 ㎏(61.5 내지 100.7 ㎏ 범위)이었다.
제5일에 단일 고용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN(65 IU/㎏)을 받는 8명의 평가 대상체에 대한 주입 후 평균 FVIII 활성은 약 38.0%였고, 제7일에 약 17%였다(도 3b). 평균 FVIII 활성은 14일 내내 1% 초과로 남아이었다(도 3b). RFVIIIFc-VWF-XTEN(65 IU/㎏) 및 rFVIII(65 IU/㎏)에 대해 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 의해 측정한 약물동태학적 파라미터를 표 10에 나타낸다. rFVIIIFc-VWF-XTEN은 인간 대상체에서 평균 반감기가 약 42.5시간인 것이 관찰되었는데, 이는 동일한 용량으로 투여한 rFVIII에 대한 평균 반감기(약 13시간)보다 3배 더 높았다.
결론:
rFVIIIFc-VWF-XTEN은 단일 저용량(25 IU/㎏) 또는 단일 고용량(65 IU/㎏) 중 하나로 치료한 중증의 A형 혈우병을 갖는 모든 환자에서 잘 용인되었다. FVIII에 대한 저해제가 발생된 환자는 없었다. rFVIIIFc-VWF-XTEN은 rFVIII보다 3배 내지 4배 더 높은 반감기가 입증되었는데, 이는 VWF-도입된 반감기 상한의 급등(breakthrough)을 시사한다. 지속된, 높은 FVIII 활성은 모든 출혈 유형에 대해 장기간의 보호에 대한 잠재력을 가진다.
실시예 2: FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc 이형이량체의 반복 용량 연구
rFVIIIFc-VWF-XTEN은 잘-용인되고, 단일 용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받은 대상체 코호트에서 지속되는 FVIII 수준을 제공하였다(실시예 1). 본 연구는 반복 용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 안전성 및 내약성을 평가하고, 이의 약물동태학을 특성규명할 것이다(도 1).
연구 설계
FVIII 치료로 이미 치료하고, 적어도 150일간 이러한 FVIII 치료 노출을 받은 중증의 A형 혈우병을 갖는 성인 남성 환자에게 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 1주 1회 용량을 총 4회로 투여할 것이다. 18 내지 65세의 대략 10명의 성인 남성으로 각각 이루어진 2개의 코호트를 등록할 것이다. 코호트 1에서 각각의 대상체는 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 50 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN의 1주 1회 용량을 총 4회로 받을 것이다. 코호트 2에서 각각의 대상체는 제1일, 제8일, 제15일 및 제22일에 65 IU/㎏ rFVIIIFc-VWF-XTEN의 1주 1회 용량을 총 4회로 받을 것이다.
임상 연구 설계의 개략적 표현을 도 4에 도시한다. 투약 전 약물동태학적 샘플을 제1일에 취할 것이다. 추가로, 제1일 및 제22일에 투약 후 취한 다중 PK 샘플이 있으며, 트로프(168시간) 샘플은 제8일, 제15일 및 제22일에 투약 전에 생길 것이다. 대상체는 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 최종 투약 후 제14일 및 제28일에 저해제 평가를 포함하여, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 최종 투약 후 28일 동안 안전성 관찰 기간을 겪을 것이다. 모두 4회의 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 1주 1회 용량을 완료한 대상체에 대해, 안전성 관찰 기간은 제50일(+3일)에 연구 종료(EOS) 방문으로 종료할 것이다. 치료를 조기에 중단한 대상체에 대해, 안전성 관찰 기간은 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 최종 투약 후 28일에 조기 종료(ET) 방문으로 종료할 것이다.
연구의 1차적 목적은 정맥내(IV) rFVIIIFc-VWF-XTEN의 총 4회의 1주 1회 용량의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 1차 종점은 유해 사건(AE)의 발생, 및 네이메헨(Nijmegen)-변형 베데스다(Bethesda) 분석을 통해 결정할 때 저해제의 발생(FVIII을 표적화하는 중화 항체)을 포함하는 연구소 실험의 임상적으로 유의한 이상의 발생이다(Verbruggen et al, Thrombosis and Haemostasis, 73: 247-251 (1995)).
연구의 2차적 목적은 총 4회의 1주 1회 IV 용량 후 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 약물동태학의 특성규명이며, 실시예 1에 기재한 바와 같이 FVIII 활성을 1단계 활성화 부분적 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 응고 분석에 의해 결정하였다. 2차 종점은 최대 활성(Cmax), 반감기(t½), 정상 상태에서의 총 클리어런스(CLss), 축적 지수(accumulating index: AI), 투약 간격에 대해 0시간으로부터의 활성-시간 곡선하 면적(AUC0-tau), 정상 상태에서의 분포 용적(Vss), 평균 체류 시간(MRT), IR, 다음 용량이 투여되기 전에 약물이 도달하는 가장 낮은(트로프) 농도(Ctrough), 및 FVIII 활성에 대해 1% 초과 기준까지의 시간을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 파라미터의 추정값을 통해 평가한 약물동태학이다.
연구의 탐구적 목적은 총 4회의 1주 1회 IV 용량 후 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 약물동태학을 특성규명하는 것이며, FVIII 활성은 2단계 발색 응고 분석에 의해 결정하였다. 탐구적 종점은 Cmax, t½, CLss, AI, AUC0-tau, Vss, MRT, IR, Ctrough, 및 FVIII 활성에 대한 1% 초과 기준까지의 시간을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 파라미터의 추정을 통해 평가한 PK이다.
방법
FVIII 활성은 실시예 1에서 상기 상술한 바와 같은 변형된 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 응고 분석("1단계" 분석)에 의해 결정하였다.
2단계 발색 응고 분석은 BCS® XP 분석기(지멘스 헬스케어 다이아그노스틱스) 상에서 바이오펜(BIOPHEN) FVIII:C 분석(Hyphen Biomed 221402-RUO)을 이용하여 FVIII 활성을 측정한다. 간단히 말하면, 인지질, 칼슘 및 트롬빈 활성화된 FVIII:C는 일정한 양의 인자 IXa의 존재 하에 효소 복합체를 형성한다. 이 효소 복합체는 결국 일정한 농도 및 과량으로 인자 X(FX)를 인자 Xa(FXa)로 활성화시킨다. FX의 FXa로의 활성화는 일정한 그리고 과량의 인자 IXa의 존재 하에 제한 인자인 FVIII:C의 양과 직접적으로 관련된다. 이어서, 특이적 발색 FXa 기질인 SXa-11(하이펜 바이오메드(Hyphen Biomed))를 이용하여 일반화된 FXa의 활성을 측정한다. 인자 Xa는 SXa-11을 절단하고, 팔라나이트로아닐린(pNA)을 방출한다. 방출된 pNA의 양은 생성된 FXa의 양에 직접적으로 비례한다. 샘플 내 FVIII:C의 양, 생성된 FXa의 양과 방출된 pNA 양 사이에 직접적인 관계가 있다. pNA의 방출은 405 ㎚의 파장에서 색 발생에 의해 결정한다.
rFVIIIFc-VWF-XTEN 특이적 캘리브레이터를 이용하여 8-점 교정 곡선(고: 1.500 내지 0.150 IU/㎖; 저: 0.200 내지 0.008 IU/㎖)을 생성한다. 높은 교정 곡선에 대해, FVIII 활성의 사전 선택 교정 수준을 생성하기 위해 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 Tris/BSA 완충제에서 1IU/㎖로 희석시킨다. BCS®XP 분석기에 의해 이런 희석을 수행한다. FVIII 활성의 사전 선택 교정 수준을 Tris/BSA 완충제에서 1:4 권장 희석으로 시험한다. 낮은 교정 곡선에 대해, rFVIIIFc-VWF-XTEN을 1 IU/㎖로 선천적 FVIII 결핍 혈장(헬레나 래버러토리즈(Helena Laboratories))에서 1:4로 사전희석시키고, 이어서, 반응 셋업에서 추가적인 희석 없이 시험한 FVIII 활성의 사전 선택 교정 수준을 생성하기 위해 Tris/BSA 완충제에서 BCS® XP 분석기에 의해 추가로 희석시켰다.
교정을 2회 중복하여 수행한다. 곡선을 FVIII 활성(IU/㎖)(x-축) 및 변화(흡광도/분)(y-축)에 대해 플롯팅한다. 높은 교정 곡선에 대해, 선형 log-log 회귀 곡선 적합도를 사용한다. 낮은 교정 곡선에 대해, 선형 lin-lin 회귀 곡선 적합도를 사용한다. 샘플을 높은 교정 곡선 상에서 1:4 권장 희석으로 또는 낮은 곡선 상에서 선천적 FVIII 결핍 혈장에서의 1:4 희석을 이용하여 또는 있는 그대로(권장 희석 없이) 2회 중복하여 시험한다.
결과
인구통계 및 기준 특징
18 내지 65세(18세와 65세를 포함)의 10명의 성인 남성 대상체를 코호트 1(50 IU/㎏)에 등록하고, 18 내지 65세(18세와 65세를 포함)의 5명의 성인 남성 대상체를 코호트 2(65 IU/㎏)에 등록한다. 50 IU/㎏의 투약 코호트에서 모두 10명의 대상체는 4회 용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받았다. 5명의 대상체 중 3명을 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 적어도 1회 용량을 받은 65 IU/㎏ 투약 코호트에 등록하였다. 등록한 15명의 대상체는 모두 불가리아 소피아의 단일 장소 출신이었다. 등록한 15명의 대상체 중에서, 13명의 대상체는 적어도 1 용량의 BIVV001을 받았고, 인구 통계학 및 기준 특징의 요약에 포함시킨다. 모든 대상체는 남성이었다. 중위 연령은 35세(범위: 25 내지 55세)이고, 모든 대상체는 백인이었다. 중위 체중은 86.7 ㎏(범위: 51.0 내지 130.9 ㎏)이고, 중위 체질량지수는 25.9 ㎏/㎡(범위: 16.4 내지 40.9 ㎏/㎡)이다.
안전성 분석
중간 분석에 대해, 총 13명의 대상체를 안전성 분석 세트(Safety Analysis Set)에 포함시켰다(50 IU/㎏ 코호트로부터 n=10 및 65 IU/㎏ 코호트로부터 n=3). 모든 안전성 분석은 안전성 분석 세트에 기반하여 수행하였고, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 적어도 1회 용량을 받은 모든 대상체를 포함하였다.
약물 투약과 관련된 AE(treatment-emergent AE: TEAE)는 제1 rFVIIIFc-VWF-XTEN 투여 시 또는 투여 후에 그리고 최종 rFVIIIFc-VWF-XTEN 투여 후 28일 이내에 시작되는 임의의 유해 사건으로서 정의한다. 중단일이 투약일 전이 아니라면, 시작일이 잘못된 AE는 약물 투약 관련으로 추정한다. 일반적으로, AE는 코호트에 따라 그리고 전체적으로 대상체 발생률로 요약하고, 코호트 및 대상체에 따른 데이터 목록에 제시한다. 각각의 대상체에 대해 약물 투약과 관련된 심각한 유해 사건(Treatment-emergent serious adverse event: TESAE)을 또한 평가하였지만, 치료한 대상체에서 어떤 것도 관찰되지 않았다(표 11).
등록한 15명의 대상체 중에서, 13명의 대상체는 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 적어도 1회 용량을 받았고, 안전성 분석에 포함시켰다. 13명의 대상체 중 8명(61.5%)에서 19건의 TEAE가 보고되었다(표 11). 심각한 또는 관련된 TEAE는 보고되지 않았고, TEAE로 인해 연구를 중단한 대상체는 없었다. 가장 통상적인 TEAE는 관절통, 상부 호흡관 감염, 두통, 및 비염(각각 2/13의 대상체; 15.4%)이었다. FVIII에 대한 저해제 발생은 검출되지 않았고, 심각한 과민증 또는 아나필락시스의 보고는 없었다. 각각의 수준의 대상체 요약에서, 대상체가 1회 이상의 사건을 보고하였다면, 대상체는 1회를 카운팅한다. 표 11에서 보고한 백분율은 각각의 코호트 및 전체적으로 적어도 1회 용량의 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받은 대상체 수에 기반한다.
면역원성 분석
모든 대상체를 선별 시, 제1일, 제8일, 제15일, 제22일, 제36일 및 제50일(EOS 또는 ET 방문)에 저해제 발생 및 항-rFVIIIFc-VWF-XTEN 항체에 대해 평가하였다. 네이메헨-변형 베데스다 분석을 이용하여 중앙 연구소에 의해 저해제에 대한 시험을 수행하였다. 네이메헨-변형 베데스다 분석 결과가 0.6 BU/㎖ 이상으로 복귀된다면, 별개의 샘플을 수집하고, 2 내지 4주 이내에 저해제 발생의 확인에 대해 시험하였다. 중앙 연구소에서 입증된 rFVIIIFc-VWF-XTEN-특이적 항-약물 항체(ADA) 분석을 이용하여 잠재적 항체 형성에 대한 시험을 수행하였다. 확인된 양성 샘플을 FVIII, D'D3 또는 XTEN에 특이적인 항체에 대해 추가로 특성규명하였다. 저해제 발생에 대해 양성으로 시험된 대상체의 수 및 백분율과 항-rFVIIIFc-VWF-XTEN 항체에 대해 양성으로 시험된 대상체의 수 및 백분율을 안전성 분석 세트를 이용하여 코호트에 따라 요약하였다.
rFVIIIFc-VWF-XTEN 투여 후에 양성 항-약물 항체 분석을 진행한 대상체는 없었다.
약물동태학적 분석 및 결과
일반적으로, 연속 및 범주형 데이터에 대한 표준 요약 통계학을 이용하여 안전성 및 PK 데이터를 요약하였다. 데이터를 코호트에 따라 요약하였다. 비-상실 값의 수(n), 평균, 표준 편차(SD), 중위값, 최소값 및 최대값을 포함하는 기술통계를 이용하여 연속 변수를 요약하였다. 또한 기하평균 및 변이계수 백분율(CV%)을 이용하여 약물동태학적 파라미터를 요약하였다. 계수 및 백분율에 따라 범주형 변수를 요약하였다.
PK 분석 세트(PKAS)에 기반하여 모든 PK 분석을 수행하였고, rFVIIIFc-VWF-XTEN 투여 후 적절한 혈액 샘플 수집을 갖는 50 IU/㎏ 투약 코호트로부터의 9명의 대상체를 포함하였다.
FVIII 활성
총 4회의 1주 1회 IV 용량 후에 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 약물동태학을 특성규명하기 위해, 사전 특정한 시점에 각각의 대상체에서 FVIII 활성을 결정하였다. 코호트, 계획된 PK 방문 및 1단계(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간[aPTT]) 응고 분석과 발색 응고 분석 둘 다에 대한 시점에 따라 FVIII 활성을 요약하였다. 시간 프로파일에 대한 FVIII 활성을 FVIII 활성 분석에 대해 본래의 값과 로그 스케일 둘 다로 플롯팅하였다. 코호트에 따라 각각의 대상체에 대해 개개의 FVIII 활성을 열거하고, FVIII 활성 분석 둘 다에 대한 PK 방문 및 시점에 대해 계획하였다. 1단계 [aPTT] 분석에 따른 FVIII 활성에 대한 결과를 표 12에 도시한다. 발색성 분석에 따른 FVIII 활성에 대한 결과를 표 13에 도시한다.
간단히 말하면, 제1일의 투약 후에, 1단계 및 발색성 분석에 기반한 평균 FVIII 활성은 각각 72시간에 45.53% 및 29.37%였고, 120시간에 21.56% 및 13.49%였으며, 168시간에 7.91% 및 5.97%였다. 제22일의 투약 후에, 1단계 및 발색성 분석에 기반한 평균 FVIII 활성은 각각 72시간에 46.28% 및 30.46%였고, 120시간에 22.30% 및 14.48%였으며, 168시간에 9.83% 및 6.74%였다. 일반적으로 모든 환자, 시점 그리고 분석 둘 다에 걸쳐, 이런 중간 분석에서 rFVIIIFc-VWF-XTEN에 대한 Ctrough는 50 IU/㎏ QW에서 7 내지 10% 범위였다.
PK 파라미터
개개 PK 파라미터 추정치를 각각의 대상체에 대해 열거하고, 코호트, 계획된 PK 방문, 및 FVIII 활성 분석 둘 다에 대한 시점에 따라 서술하여 요약하였다.
이 중간 분석에서 50 IU/㎏ QW에서 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받는 모든 대상체에 대한 기하 평균 제거 반감기(t1/2)는 1단계 분석에 따라 41.24시간이었고(표 16B) 발색성 분석에 따라 43.87시간이었다(표 17B).
제1일의 투약 후에, 기하평균 최대 FVIII 활성(Cmax)은 1단계 분석에 의해 113 IU/㎗였고(표 14), 발색성 분석에 의해 108 IU/㎗였다(표 15). 제22일의 투약 후에, 정상 상태에서 기하평균 최대 FVIII 활성(Cmaxss)은 1단계 분석에 의해 127 IU/㎗였고(표 16A), 발색성 분석에 의해 115 IU/㎗였다(표 17A).
제1일의 투약 후에, 기하평균 누적 FVIII 활성(AUC0-tau)은 1단계 분석에 따라 7650 hr*IU/㎗였고(표 14) ㅂ라색 분석에 따라 5630 hr*IU/㎗였다(표 15). 제22일의 투약 후에, 기하평균 AUC0-tau는 1단계 분석에 따라 8270 hr*IU/㎗였고(표 16A), 발색성 분석에 따라 5880 hr*IU/㎗였다(표 17A).
제1일 및 제22일 투약에 대한 Cmax 및 AUC0-tau 데이터는 축적 지수(AI) 1.07(1단계 분석, 표 16B) 및 1.08(발색성 분석, 표 17B)에 의해 뒷받침되는 최소 축적을 나타내었다. 표 12 내지 표 17에 제시한 모든 PK 파라미터에 대해, 분석 목적을 위해 정량한계 미만(BLQ)의 값을 0으로 처리하였다. PK 파라미터의 계산에 필요한 경우, 주입 종료 시간이 포착되지 않았다면, 취급 및 투여를 위한 연구 방향 문서(study's Directions for Handling and Adminstration document)의 투여 가이드에 의거하여 주입 지속기간은 각각의 대상체에 대해 8분으로 생각하였다.
[표 16A]
[표 16B]
[표 17A]
[표 17B]
결론:
단일 용량 연구에서 관찰된 결과와 일치되게(실시예 1), rFVIIIFc-VWF-XTEN의 매주 투약은 일반적으로 잘 용인되며, 최종 rFVIIIFc-VWF-XTEN 투여 후 28일을 지나서 검출된 저해제는 없었다. rFVIIIFc-VWF-XTEN은 50 IU/㎏의 용량에서 1단계 및 발색성 분석에 의해 각각 41.24 및 43.87시간의 평균 제거 반감기(t1/2)를 나타내었다. 이들 중간 결과는 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 단일 투약에서 관찰된 향상된 반감기가 QW의 반복 투약에 의해 유지된다는 것을 입증하며, 이는 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 이점이 예방적 FVIII 투약 스케줄에 따라 치료를 받는 A형 혈우병 환자에 의해 실현될 수 있다는 것을 강하게 보여준다.
실시예 3: 중증의 A형 혈우병을 갖는 이미 치료된 환자에서의 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 3상 연구
본 연구는 50 IU/㎏의 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 1주 1회 투여의 안전성 및 내약성을 평가하고, 이의 약물동태학을 특성규명할 것이다(도 1). 연구의 1차적 목적은 FVIIIFc-VWF-XTEN 대증적 치료에 비교되는 rFVIIIFc-VWF-XTEN 예방적 치료의 효능을 평가하는 것이다. 연구의 2차 목적은 예방적 치료로서 rFVIIIFc-VWF-XTEN, 출혈 에피소드에 대한 이의 효과 및 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 소모, 관절 건강상태, 및 환자-보고 결과(Patient-Reported Outcome: PRO)에 의해 측정한 바와 같은 삶의 질을 평가하고, 대증적 치료에 대해 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 평가하는 것이다.
또한, 약물동태학적(PK) 목적은 모든 대상체에 대한 기준에서 rFVIIIFc-VWF-XTEN 예방의 PK를 특성규명하는 것이며, 3개월에 aPTT FVIII 활성 분석에 기반하여 대상체의 사전에 정한 소집단에 대해 반복하였다. 추가 목적은 수술을 받은 대상체에서 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 효능을 평가하고, rFVIIIFc-VWF-XTEN의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 추가로, 관절 건강 구조적 결과를 초음파를 통해 평가하고, 다른 삶의 질 측정 및 건강관리 자원 이용에 대한 치료 영향을 평가할 것이다.
연구 설계
이는 중증의 A형 혈우병(1 IU/㎗ 미만의 [<1%] 내인성 FVIII로서 정함)을 갖는 12세 이상의 환자에서의 정맥내 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 안전성, 효능 및 PK의 중심, 3상, 개방 표지, 다기관 연구이다. 현재 대증적 요법 중인 대략 25명의 대상체는 26주 동안 대증적 기준으로 50 IU/㎏ IV 용량으로 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받을 것이고, 이어서, 26주 동안 예방적 치료 요법에 대해 1일 1회 50 IU/㎏ IV의 용량으로 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받았다. 현재 예방적 치료 요법 중인 대상체는 52주 동안 예방적 치료 요법에 대해 1주 1회 50 IU/㎏ IV의 용량으로 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 투여 받을 것이다.
12세 이상의 대략 140명의 대상체를 등록할 것이고; 12주에 대략 16명 대상체의 소집단에 대해 반복 PK 평가를 수행할 것이다.
대상체를 선별하고, 등록 기준을 충족시킨 후에, 50 IU/㎏ IV의 용량으로 rFVIIIFc-VWF-XTEN을 이용하는 2가지의 치료 요법(즉, 대증적 또는 예방적) 중 하나를 진행하였다. 모든 대상체는 약효 세척 기간(현재의 요법에 따라서 적어도 4 내지 5일) 후 기준 PK 평가를 받을 것이다). 대상체는 연구 내내 효능 및 안전성 평가를 받을 것이다. 이들 안전성 평가는 잠재적 저해제 형성을 위한 시험을 포함할 것이다. 대상체를 개방 표지 연장 연구에 등록하지 않는다면 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 마지막 용량 후 28일에 후속 안전성 방문 또는 전화 호출을 할 것이다.
기준이 둘 다 충족될 때 연구 종료(EOS)가 일어날 수 있다: (i) 적어도 104명의 대상체가 50 노출일(ED)에 도달되고, 50번째 ED 후에 유효 저해제 시험을 완료함; 및 (ii) 적어도 25명의 대상체가 26주의 예방적 치료 기간을 포함하는 연구의 대증적 아암(arm)을 완료하고, 연구로부터 조기에 제외됨. 또한, 연구 동안 수술을 받은 임의의 아암으로부터의 대상체는 수술 소집단에 포함시킬 것이다. 적어도 5명의 대상체에서 최소 10회의 큰 수술은 수술 상황에서 출혈의 제어 및 방지를 평가하는 것을 목표로 할 것이다.
대상체는 적격 결정을 위해 대략 28일의 선별 기간 이내에 클리닉으로 올 것이다. 선별 방문(들)에 추가로, 대상체는 기준, 4주, 12주, 26주, 36주, 52주 및 EOS/ET에 방문을 위해 클리닉으로 복귀할 것이다. 투약 기간은 52주 이상일 것이다. 예방적 치료 아암에 들어가는 대상체는 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 52주 1주 1회 용량 및 출혈 에피소드를 치료하는 데 필요한 추가적인 용량을 받을 것이다. 대증적 치료 아암에 들어가는 대상체는 26주의 대증적 치료 기간 동안 대증적 rFVIIIFc-VWF-XTEN 및 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 26회의 1주 1회 용량 및 후속 26주의 예방적 치료 기간 동안 출혈 에피소드를 치료하는 데 필요한 추가적인 용량을 받을 것이다. 안전성은 연구 내내 평가할 것이다. 대상체를 개방 표지 연장 연구에 등록하지 않는다면 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 마지막 용량 후 28일에 후속 안전성 방문 또는 전화 호출을 할 것이다.
연구의 1차 종점은 연간 출혈률(ABR)의 대상체 내 비교일 수 있지만, 대상체는 1주 1회 예방적 치료(26주)에 대비되는 rFVIIIFc-VWF-XTEN 대증적 치료(26주) 중이다.
연구의 2차 종점은 (i) (이전의 관찰 연구에 참여한 예방 중인 대상체에 대해) 병력 ABR에 비해 rFVIIIFc-VWF-XTEN 예방 중인 ABR의 대상체내의 비교; (ii) 출혈 에피소드의 발생 및 소모(유형 및 위치에 따른 전반적인 ABR, ABR 및 대상체당 총, 연간 계산된 rFVIIIFc-VWF-XTEN 소모); (iii) 치료에 대한 반응; (iv) 효능 지수(제7일에 L3%의 트로프 수준을 유지하는 대상체의 백분율; (v) 관절 건강상태; 및 (vi) 삶의 질 측정 변화(적어도 18세의 대상체에 대해 haem-A-QoL 및 PROMIS-SF 신체 기능; 및 18세 미만의 대상체에 대해 HAEMO-QoL 및 PROMIS 소아-SF 신체 활동을 포함할 것이다.
치료에 대한 반응은 (i) 출혈 에피소드를 해결하는 데 필요한 rFVIIIFc-VWF-XTEN의 주입 수 및 용량; (ii) 해결을 위해 단일 주입이 필요한 출혈 에피소드 백분율; (iii) 4-점 반응 스케일에 기반한 개개 출혈 에피소드의 rFVIIIFc-VWF-XTEN 치료에 대한 반응의 대상체 평가; (iv) 및 4-점 반응 스케일에 기반한 rFVIIIFc-VWF-XTEN 치료에 대한 대상체 반응의 연구자의 전반적 평가를 포함할 것이다.
관절 건강 평가는 (i) 관절 출혈 에피소드의 ABR; (ii) 국제혈전지혈학회(International Society on Thrombosis and Haemostasis: ISTH) 기준에 기반한 52주의 표적 관절 해상도; (iii) 기준으로부터 52주까지 변형된 혈우병 관절 건강상태 스코어(mHJHS) 또는 HJHS)에 의해 평가한 절대 변화에 기반한 기능적 결과; (iv) 52주에 mHJHS 또는 HJHS에 의해 평가한 관절 악화가 없는 대상체의 백분율을 포함할 것이다.
추가적인 종점은 (i) 최대(피크) 혈장 약물 농도(Cmax), 제거 반감기(t½), 축적 지수(AI), 혈장 농도-시간 곡선하 면적(AUC), 정상 상태에서의 겉보기 분포 용적(Vss), 평균 체류 시간(MRT), 증분적 회복(IR), 트로프 혈장 농도(Ctrough), 및 사전에 정한 FVIII 활성 수준을 초과하는 시간; (ii) 4-점 반응 스케일에서 rFVIIIFc-VWF-XTEN에 대한 대상체의 지혈 반응의 연구자 또는 외과의사의 평가, 수술 동안 지혈을 유지하는 데 필요한 주입의 수 및 용량, 수술 기간 동안 총 rFVIIIFc-VWF-XTEN 소모, 수술 동안 추정되는 혈액 손실, 수술 동안 필요한 혈액 성분 수혈의 수 및 유형, 및 수술 기간 동안의 수술 후 출혈 에피소드; (iii) 유해 사건(AE) 및 심각한 유해 사건(SAE), 신체 검사, 활력 징후 및 연구소 검사에서의 임상적으로 유의한 이상의 발생, 및 저해제(네이메헌-변형 베데스다 분석을 통해 결정할 때 FVIII를 표적화하는 중화 항체)의 발생; 및 (iv) 하위집단에서 초음파 영상화를 통한 해부학적인 구조적 관절 건강상태 결과, 다른 QoL 측정(EQ-5D-5L, PGIC(52주 단독), PROMIS 통증 강도, PROMIS-SF 통증 간섭(18세 이상의 대상체), PROMIS 소아-SF 통증 간섭(18세 미만의 대상체))의 변화, 및 HRU를 포함한다.
포함/제외 기준
적격인 후보는 다음의 적격 기준을 충족하여야 한다: (1) 사전 동의 시 12세 이상; (2) 보증된 임상 연구소에 의해 보고된 바와 같은 1 IU/㎗ 미만의 (<1%) 내인성 FVIII로서 정의되는 중증의 A형 혈우병; (3) 적어도 150 ED 동안 임의의 재조합 및/또는 혈장-유래 FVIII, 또는 동결침전제제(cryoprecipitate)를 이용하는 A형 혈우병에 대한 사전 치료(예방적 또는 대증적); (4) 현재 시판 FVIII 제품을 이용하여 예방적 치료 중이며, 연구 등록 전 12개월 내에 적어도 4회의 출혈 에피소드가 있거나, 또는 현재 시판 FVIII 제품을 이용하여 대증적 치료 중이며, 연구 등록 전 12개월 내에 적어도 12회의 출혈 에피소드가 있음; 및 (5) 선별 시 혈소판 계수 ≥100,000개의 세포/㎕(중앙 연구소에 의해 시험을 수행하고, 제1일 투약 전에 검토함). 대상체는 임의의 다음의 이유로 제외할 것이다: (1) A형 혈우병에 추가로 다른 알려진 응고 장애(들); (2) 임의의 FVIII 제품과 연관된 과민증 또는 아나필락시스의 병력; (3) 양성 저해제 검사 또는 FVIII 투여에 대한 감소된 반응의 임상 징후의 병력(저해제의 가족력은 대상체를 제외하지 않을 것임); (4) 선별 시 취한, 0.6 BU/㎖ 이상으로서 정의되는 양성 저해제 결과; (5) 선별 시 취한 혈청 크레아티닌이 2.0 ㎎/㎗ 초과인 것으로 정의되는 비정상적 신기능; (6) 선별 시 취한 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)가 5×상한(upper limit of normal: ULN)을 초과; (7) 선별 시 취한 혈청 총 빌리루빈이 3×ULN을 초과; (8) 선별 전 12주 이내에 피투시란 또는 에미시주맙 사용; (9) 선별 전 12주 이내에 단클론성 항체 치료제, rFVIIIFc 이외의 Fc 융합 단백질 또는 IV 면역글로불린을 이용한 치료; (10) 선별 전 2주 이내에 아세틸살리실산(ASA)을 이용한 치료 또는 각각의 제품에 대한 지역적 처방 정보에서 구체화된 최대 용량 이상에서 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)을 이용한 치료; (11) 선별 전 12주 이내에 C형 간염 바이러스[HCV] 또는 HIV의 치료를 제외하고, 화학요법 및/또는 다른 면역억제 약물을 이용하는 전신 치료; 14일 초과 동안 20 ㎎/일의 프레드니손 또는 이의 등가물로 매일 또는 격일로 제공되는 전신 코르티코스테로이드 치료를 제외하고 코르티코스테로이드의 사용이 허용되며; 국소, 국부 및/또는 흡입된 스테로이드 사용이 허용됨; 및 (12) 선별 전 8주 이내의 대수술(대수술은 항상은 아니지만, 보통 일반적 마취 및/또는 호흡 보조를 수반하는 임의의 외과적 절차(대기 수술 또는 응급 수술)로서 정의되며, 이때 주요 체강은 관통되고 노출되거나, 신체 또는 생리적 기능의 실질적인 손상이 생김(예를 들어, 개복술, 개흉술, 개두술, 관절 대체술, 또는 사지 절단)).
서열
특정 실시형태에 대한 전술한 설명은 당업계 기술 내의 지식을 적용함으로써 다른 사람이 본 개시내용의 일반적인 개념을 벗어나지 않고도 과도한 실험 없이 이러한 특정 실시형태를 다양한 적용분야에 맞도록 용이하게 수정 및/또는 개조할 수 있는 본 발명의 일반적인 속성을 완전히 밝힐 것이다. 따라서, 이러한 개조 및 수정은 본 명세서에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 실시형태의 등가물의 의미 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에서의 표현 또는 용어는 본 명세서의 용어 또는 표현이 본 발명의 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석될 수 있도록 기재하기 위한 것이며 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 명세서의 고려 및 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시에 의해 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서 간주되는 것으로 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 청구범위에 시사된다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 본 명세서에 그 전문이 참조에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Bioverativ Therapeutics Inc.
<120> Methods of treating hemophilia A
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gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcrgagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgcctgcttc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag 3780
gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga cctggtcttc 3840
ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa ggcctttgtg 3900
gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 3960
taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc gtcagagctg 4020
cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc 4080
ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc ctcccgcatc 4140
gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt tgtccgctac 4200
gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 4260
aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc cttcgtgctg 4320
agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt 4380
gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac tgtgggcccg 4440
gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct ggatgtggcg 4500
ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 4560
atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt cacggtgctg 4620
cagtactcct acatggtgac cgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac 4680
atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa cactgggctg 4740
gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg ggagcaggcg 4800
cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 4860
ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca ggagctggag 4920
aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag 4980
gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat ccccaccctc 5040
tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga tggctcctcc 5100
agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 5160
gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag catcaccacc 5220
attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc 5280
atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc tgtgcgatac 5340
ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt catcctggtc 5400
acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 5460
acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg gatcttggca 5520
ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg 5580
gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag gatttgcatg 5640
gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga ccagtgccac 5700
accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 5760
cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga agagacctgt 5820
ggctgccgct ggacctgccc ctgygtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc 5880
tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt tcaaaacaag 5940
gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc aaggcagggc 6000
tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagstgca cagtgacatg 6060
gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa catggaagtc 6120
aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca catcttcaca 6180
ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt tgcttcaaag 6240
acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat gctgagggat 6300
ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca gcggccaggg 6360
cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc ccactgccag 6420
gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc cacattctat 6480
gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat cgcctcttat 6540
gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga tttctgtgct 6600
atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc ccggcactgt 6660
gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg ccctccagat 6720
aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg cattggtgag 6780
gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc ctgtcagatc 6840
tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc cacggccaaa 6900
gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga ccagtgctgc 6960
cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt gcctcactgt 7020
gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc 7080
gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc gcaccgtttg 7140
cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa ctgtgtcaac 7200
tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaaccg ccaccaatga ctgtggctgt 7260
accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat ctaccctgtg 7320
ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg 7380
atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg tcggtcgggc 7440
ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc tgcctgtgag 7500
gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 7560
tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa ggaggaggtc 7620
tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc 7680
tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga gcgcatggag 7740
gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat cgatgtgtgc 7800
acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 7860
aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac aggtgaatgt 7920
tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca 7980
ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa ggtcaatgag 8040
agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga tgaacacaag 8100
tgtcttgctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 8160
gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg aagctgtaag 8220
tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac 8280
tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac acggacggag 8340
cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga ggttctcaat 8400
gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 8442
<210> 21
<211> 2813
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (2016)..(2016)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 21
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
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Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gly Ser
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115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
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<213> Artificial Sequence
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Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
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Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
65 70 75 80
Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
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Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
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<213> Artificial Sequence
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<223> XTEN AG144_C
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Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> AG144_F
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Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
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Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
85 90 95
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> FVIII Signal Peptide
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Cys Phe Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Mature Factor VIII
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Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
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Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
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Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
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Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
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His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
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His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
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Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
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Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
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Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
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Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
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Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
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Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
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Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
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Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
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Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
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Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
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Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
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Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
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Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
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Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
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Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
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Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
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Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
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Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
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Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
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Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
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Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
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Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
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Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
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Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
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Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
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Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
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Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
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Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
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Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
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Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
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Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
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Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
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Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
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Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
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Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
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Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
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Gln Asp Leu Tyr
2330
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<211> 7053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-Length FVIII
<400> 66
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accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
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accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
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gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
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attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
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agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820
tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880
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aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000
gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060
aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120
attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180
gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240
aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300
gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360
ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420
caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480
aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540
ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600
ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660
gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720
aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780
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aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900
aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960
agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020
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aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140
aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200
caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260
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aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440
ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500
aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560
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tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDD FVIII
<400> 67
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165 170 175
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530 535 540
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565 570 575
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885 890 895
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1100 1105 1110
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1220 1225 1230
Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro
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1250 1255 1260
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<211> 1429
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino Acid Sequence of B-domain Deleted Factor VIII (B-domain
deletion except 5 amino acid residues
<400> 68
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115 120 125
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275 280 285
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770 775 780
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850 855 860
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900 905 910
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980 985 990
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1145 1150 1155
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1175 1180 1185
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1295 1300 1305
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
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Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
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His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
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Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
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Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
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Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
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Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
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Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
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Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
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Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
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Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu
740 745 750
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
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Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
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Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
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Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
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Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr
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<210> 73
<211> 1984
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 195 (dual chain FVIIIFc with two 144 AE XTENs at amino acid
1656 and 1900)
<400> 73
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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595 600 605
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755 760 765
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850 855 860
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
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Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
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1130 1135 1140
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1220 1225 1230
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1265 1270 1275
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Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
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1685 1690 1695
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Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1745 1750 1755
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1760 1765 1770
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1775 1780 1785
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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1850 1855 1860
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1880 1885 1890
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1940 1945 1950
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1955 1960 1965
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1970 1975 1980
Lys
<210> 74
<211> 2134
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 196 (dual chain FVIIIFc with three 144 AE XTENs at amino
acid 26, 1656 and 1900)
<400> 74
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
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Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
130 135 140
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
165 170 175
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
180 185 190
Ala Ser Ser Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr
645 650 655
Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser
690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
705 710 715 720
Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
740 745 750
Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe
835 840 845
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850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
900 905 910
Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
915 920 925
Thr Leu Gln Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser
930 935 940
Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala
945 950 955 960
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr
965 970 975
Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr
980 985 990
Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala
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1010 1015 1020
Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
1025 1030 1035
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
1040 1045 1050
Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala
1055 1060 1065
Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ala Ser Ser Ser Asp
1070 1075 1080
Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys
1085 1090 1095
Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro
1100 1105 1110
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1130 1135 1140
Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
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1160 1165 1170
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Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
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1250 1255 1260
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1265 1270 1275
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1370 1375 1380
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Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
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Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1415 1420 1425
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1430 1435 1440
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1445 1450 1455
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
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Ser Ser Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
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1490 1495 1500
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1520 1525 1530
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
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1550 1555 1560
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1565 1570 1575
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1580 1585 1590
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1595 1600 1605
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Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1625 1630 1635
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1640 1645 1650
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1655 1660 1665
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1670 1675 1680
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1685 1690 1695
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1700 1705 1710
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1715 1720 1725
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1730 1735 1740
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1745 1750 1755
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1760 1765 1770
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1775 1780 1785
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1790 1795 1800
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1805 1810 1815
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1820 1825 1830
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1835 1840 1845
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1850 1855 1860
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1865 1870 1875
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1880 1885 1890
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1895 1900 1905
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1910 1915 1920
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1925 1930 1935
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1940 1945 1950
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1955 1960 1965
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1970 1975 1980
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1985 1990 1995
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
2000 2005 2010
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
2015 2020 2025
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
2030 2035 2040
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
2045 2050 2055
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
2060 2065 2070
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
2075 2080 2085
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
2090 2095 2100
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
2105 2110 2115
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
2120 2125 2130
Lys
<210> 75
<211> 1984
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 199 (single chain FVIIIFc with three 144 AE XTENs at amino
acid 1656 and 1900)
<400> 75
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
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450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Gly Ala Pro
770 775 780
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
835 840 845
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850 855 860
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
865 870 875 880
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
885 890 895
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900 905 910
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1010 1015 1020
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1055 1060 1065
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1100 1105 1110
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1130 1135 1140
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Cys Arg Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1175 1180 1185
Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
1190 1195 1200
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1205 1210 1215
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1220 1225 1230
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
1235 1240 1245
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1250 1255 1260
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
1295 1300 1305
Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ala
1310 1315 1320
Ser Ser Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
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1340 1345 1350
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1355 1360 1365
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1370 1375 1380
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1385 1390 1395
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1400 1405 1410
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1505 1510 1515
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1565 1570 1575
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1610 1615 1620
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1640 1645 1650
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1655 1660 1665
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1670 1675 1680
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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1685 1690 1695
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1730 1735 1740
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1745 1750 1755
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1760 1765 1770
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1775 1780 1785
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Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
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595 600 605
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Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
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Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
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675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
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Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
850 855 860
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
865 870 875 880
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885 890 895
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<211> 2128
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610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1235 1240 1245
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1250 1255 1260
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1265 1270 1275
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1280 1285 1290
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1295 1300 1305
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1310 1315 1320
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1325 1330 1335
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1340 1345 1350
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser
1355 1360 1365
Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1370 1375 1380
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
1385 1390 1395
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
1400 1405 1410
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1415 1420 1425
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1430 1435 1440
Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
1445 1450 1455
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
1460 1465 1470
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1475 1480 1485
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1490 1495 1500
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1505 1510 1515
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Asp Ile Gly
1520 1525 1530
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly
1535 1540 1545
Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1550 1555 1560
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1565 1570 1575
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
1580 1585 1590
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
1595 1600 1605
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
1610 1615 1620
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
1625 1630 1635
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
1640 1645 1650
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
1655 1660 1665
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
1670 1675 1680
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
1685 1690 1695
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
1700 1705 1710
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
1715 1720 1725
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
1730 1735 1740
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
1745 1750 1755
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
1760 1765 1770
Leu Ser Pro Gly Lys
1775
<210> 88
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 88
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
1 5 10 15
Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig constant region portion
<400> 89
Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro
1 5 10
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig constant region portion
<400> 90
His Gln Ser Leu Gly Thr Gln
1 5
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig constant region portion
<400> 91
His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig constant region portion
<400> 92
His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys
1 5
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ig constant region portion
<400> 93
Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln
1 5
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker, where the sequence can repeated between 1-20 times
<400> 94
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker, where the sequence can be repeated between 1-100 times or
1-20 times
<400> 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 96
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 97
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 98
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 99
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 100
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 101
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker, where the sequence can be repeated between 1-00 times or
1-20 times
<400> 101
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 102
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage site
<400> 102
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 103
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage site
<400> 103
Arg Lys Arg Arg Lys Arg
1 5
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavage site
<400> 104
Arg Arg Arg Arg Ser
1 5
<210> 105
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrombin cleavable site
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is an aliphatic amino acid
<400> 105
Xaa Val Pro Arg
1
<210> 106
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 106
Ile Ser Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp
1 5 10 15
Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser
20 25 30
Phe Ser
<210> 107
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 107
Ile Ser Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu
1 5 10 15
Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro
20 25 30
Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val
35 40
<210> 108
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 108
Ile Ser Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
1 5 10 15
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
20 25 30
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln
35 40 45
<210> 109
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 109
Ser Phe Leu Leu Arg Asn
1 5
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 110
Pro Asn Asp Lys
1
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 111
Pro Asn Asp Lys Tyr
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 112
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 113
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro
1 5
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 114
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 115
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp
1 5
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 116
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 117
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp
1 5 10
<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 118
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu
1 5 10
<210> 119
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 119
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu
1 5 10
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAR1 exosite interaction motif
<400> 120
Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Ser
1 5 10
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXIa cleavage site
<400> 121
Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr
1 5
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXIa cleavage site
<400> 122
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly
1 5
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXIIa cleavage site
<400> 123
Thr Met Thr Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kallikrein cleavage site
<400> 124
Ser Pro Phe Arg Ser Thr Gly Gly
1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIIa cleavage site
<400> 125
Leu Gln Val Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIXa cleavage site
<400> 126
Pro Leu Gly Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FXa cleavage site
<400> 127
Ile Glu Gly Arg Thr Val Gly Gly
1 5
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIIa (thrombin) cleavage site
<400> 128
Leu Thr Pro Arg Ser Leu Leu Val
1 5
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Elastase-2 cleavage site
<400> 129
Leu Gly Pro Val Ser Gly Val Pro
1 5
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Granzyme-B cleavage
<400> 130
Val Ala Gly Asp Ser Leu Glu Glu
1 5
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-12 cleavage site
<400> 131
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Gly Ala
1 5
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-13 cleavage site
<400> 132
Gly Pro Ala Gly Leu Arg Gly Ala
1 5
<210> 133
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-17 cleavage site
<400> 133
Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Arg
1 5
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-20 cleavage site
<400> 134
Pro Ala Leu Pro Leu Val Ala Gln
1 5
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TEV cleavage site
<400> 135
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enterokinase cleavage site
<400> 136
Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protease 3C (PRESCISSION) cleavage site
<400> 137
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 138
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sortase A cleavage site
<400> 138
Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Ser
1 5
<210> 139
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 139
Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 140
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 140
Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr
1 5 10 15
Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 141
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 141
Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 142
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 142
Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 143
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 143
Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser
1 5 10 15
Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 144
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cleavable linker
<400> 144
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
1 5 10 15
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
20 25
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrombin cleavage site
<400> 145
Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 146
Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr
1 5 10 15
Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys
20 25
<210> 147
<211> 4548
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF031
<400> 147
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
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<223> VWF050 (IHH triple mutant)
<400> 149
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gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 4080
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct ggcccaggac 4140
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 4200
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Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr
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accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
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gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
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755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
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Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
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1250 1255 1260
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Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1280 1285 1290
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Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1310 1315 1320
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1325 1330 1335
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
1340 1345 1350
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala
1355 1360 1365
Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1370 1375 1380
Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1385 1390 1395
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1400 1405 1410
Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
1460 1465 1470
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
1475 1480 1485
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
1490 1495 1500
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
1505 1510 1515
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
1520 1525 1530
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
1550 1555 1560
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
1580 1585 1590
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1595 1600 1605
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
1610 1615 1620
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
1625 1630 1635
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1640 1645 1650
<210> 153
<211> 5379
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF058 (VWF034 with IHH mutation)
<400> 153
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
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ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatcgggta cctcagagtc tgctaccccc gagtcagggc caggatcaga gccagccacc 3780
tccgggtctg agacacccgg gacttccgag agtgccaccc ctgagtccgg acccgggtcc 3840
gagcccgcca cttccggctc cgaaactccc ggcacaagcg agagcgctac cccagagtca 3900
ggaccaggaa catctacaga gccctctgaa ggctccgctc cagggtcccc agccggcagt 3960
cccactagca ccgaggaggg aacctctgaa agcgccacac ccgaatcagg gccagggtct 4020
gagcctgcta ccagcggcag cgagacacca ggcacctctg agtccgccac accagagtcc 4080
ggacccggat ctcccgctgg gagccccacc tccactgagg agggatctcc tgctggctct 4140
ccaacatcta ctgaggaagg tacctcaacc gagccatccg agggatcagc tcccggcacc 4200
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agtggtagtg agacaccagg atcagaacct gctacctcag ggtcagagac acccggatct 4380
ccggcaggct caccaacctc cactgaggag ggcaccagca cagaaccaag cgagggctcc 4440
gcacccggaa caagcactga acccagtgag ggttcagcac ccggctctga gccggccaca 4500
agtggcagtg agacacccgg cacttcagag agtgccaccc ccgagagtgg cccaggcact 4560
agtaccgagc cctctgaagg cagtgcgcca gattctggcg gtggaggttc cggtggcggg 4620
ggatccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccggtg gcgggggatc cctggtcccc 4680
cggggcagcg gaggcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagctcc agaactcctg 4740
ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat ggcctcccgg 4800
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 4860
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tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tggcccagga ctggctgaat 4980
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 5040
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgc 5100
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 5160
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 5220
cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 5280
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaacgcc 5340
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 5379
<210> 154
<211> 1792
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF058 (VWF034 with IHH mutation)
<400> 154
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1235 1240 1245
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1250 1255 1260
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1265 1270 1275
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1280 1285 1290
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1295 1300 1305
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1310 1315 1320
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1325 1330 1335
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1340 1345 1350
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser
1355 1360 1365
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1370 1375 1380
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
1385 1390 1395
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
1400 1405 1410
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
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Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
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Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
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Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
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Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
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Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1490 1495 1500
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
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Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Asp Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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1790
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<211> 5937
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 169
<400> 155
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<210> 156
<211> 6387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 263 (IHH triple mutant)
<400> 156
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aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 6180
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac 6240
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agcctctccc tgtctccggg taaatga 6387
<210> 157
<211> 2128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 263 (IHH triple mutant)
<400> 157
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1 5 10 15
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Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
50 55 60
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
65 70 75 80
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
100 105 110
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
115 120 125
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
130 135 140
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
165 170 175
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Ser Asp Leu Gly Glu
180 185 190
Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro
195 200 205
Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr
210 215 220
Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu
225 230 235 240
Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr
245 250 255
Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val
260 265 270
Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser
275 280 285
Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr
290 295 300
Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp
325 330 335
Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe
355 360 365
Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser
370 375 380
Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met
385 390 395 400
His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly
405 410 415
Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr
420 425 430
Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg
435 440 445
Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr
450 455 460
Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His
465 470 475 480
Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp
485 490 495
Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala
500 505 510
Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg
515 520 525
Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala
530 535 540
Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu
545 550 555 560
Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr
565 570 575
Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr
580 585 590
Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg
595 600 605
Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly
610 615 620
Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp
675 680 685
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690 695 700
Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu
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Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met
725 730 735
Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg
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Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala
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770 775 780
Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu
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850 855 860
Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys
865 870 875 880
Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
885 890 895
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900 905 910
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930 935 940
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945 950 955 960
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
965 970 975
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Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
1055 1060 1065
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Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
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Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
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1670 1675 1680
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1745 1750 1755
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1760 1765 1770
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1940 1945 1950
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1955 1960 1965
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1970 1975 1980
Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
2015 2020 2025
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
2120 2125
<210> 158
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 282
<400> 158
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
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gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
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gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
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cgccaggcta gcttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
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cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
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ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
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agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
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tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
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atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
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ttctctcaaa acggcgcgcc aacatcagag agcgccaccc ctgaaagtgg tcccgggagc 2340
gagccagcca catctgggtc ggaaacgcca ggcacaagtg agtctgcaac tcccgagtcc 2400
ggacctggct ccgagcctgc cactagcggc tccgagactc cgggaacttc cgagagcgct 2460
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agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc 4200
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ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag aagacaatga aagtcacagg agtaactact 4560
cagggagtaa aatctctgct taccagcatg tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt 4620
caagatggcc atcagtggac tctctttttt cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga 4680
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tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa 4860
ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 4920
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 4980
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 5040
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 5100
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tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 5280
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 5340
acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 5400
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 5460
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga 5505
<210> 159
<211> 1834
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 282
<400> 159
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
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Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Thr
755 760 765
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
770 775 780
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
785 790 795 800
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
805 810 815
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
820 825 830
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
835 840 845
Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
850 855 860
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
865 870 875 880
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
885 890 895
Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala
900 905 910
Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr
915 920 925
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser
930 935 940
Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1100 1105 1110
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1160 1165 1170
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Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1205 1210 1215
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1220 1225 1230
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1235 1240 1245
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
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Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
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1280 1285 1290
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1295 1300 1305
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1310 1315 1320
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1340 1345 1350
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1355 1360 1365
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1370 1375 1380
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1385 1390 1395
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1400 1405 1410
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1415 1420 1425
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1430 1435 1440
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1445 1450 1455
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1460 1465 1470
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1475 1480 1485
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1490 1495 1500
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1535 1540 1545
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1550 1555 1560
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1565 1570 1575
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1580 1585 1590
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1625 1630 1635
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1640 1645 1650
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1655 1660 1665
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1670 1675 1680
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1685 1690 1695
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1700 1705 1710
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1715 1720 1725
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1730 1735 1740
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1745 1750 1755
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1760 1765 1770
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1775 1780 1785
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1790 1795 1800
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1805 1810 1815
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1820 1825 1830
Lys
<210> 160
<211> 5937
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 283 (FVIII 169 with IHH triple mutation)
<400> 160
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcta gcttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acggcgcgcc aggtacctca gagtctgcta cccccgagtc agggccagga 2340
tcagagccag ccacctccgg gtctgagaca cccgggactt ccgagagtgc cacccctgag 2400
tccggacccg ggtccgagcc cgccacttcc ggctccgaaa ctcccggcac aagcgagagc 2460
gctaccccag agtcaggacc aggaacatct acagagccct ctgaaggctc cgctccaggg 2520
tccccagccg gcagtcccac tagcaccgag gagggaacct ctgaaagcgc cacacccgaa 2580
tcagggccag ggtctgagcc tgctaccagc ggcagcgaga caccaggcac ctctgagtcc 2640
gccacaccag agtccggacc cggatctccc gctgggagcc ccacctccac tgaggaggga 2700
tctcctgctg gctctccaac atctactgag gaaggtacct caaccgagcc atccgaggga 2760
tcagctcccg gcacctcaga gtcggcaacc ccggagtctg gacccggaac ttccgaaagt 2820
gccacaccag agtccggtcc cgggacttca gaatcagcaa cacccgagtc cggccctggg 2880
tctgaacccg ccacaagtgg tagtgagaca ccaggatcag aacctgctac ctcagggtca 2940
gagacacccg gatctccggc aggctcacca acctccactg aggagggcac cagcacagaa 3000
ccaagcgagg gctccgcacc cggaacaagc actgaaccca gtgagggttc agcacccggc 3060
tctgagccgg ccacaagtgg cagtgagaca cccggcactt cagagagtgc cacccccgag 3120
agtggcccag gcactagtac cgagccctct gaaggcagtg cgccagcctc gagcccacca 3180
gtcttgaaac gccatcaagc tgaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 3240
atcgattatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 3300
gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 3360
gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 3420
gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 3480
tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 3540
tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 3600
ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 3660
cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 3720
catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 3780
gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 3840
acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 3900
atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 3960
ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 4020
aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 4080
tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 4140
gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 4200
gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 4260
attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 4320
cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 4380
caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 4440
tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 4500
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 4560
atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 4620
accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 4680
cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 4740
cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 4800
agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 4860
acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 4920
caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 4980
ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 5040
atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 5100
gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 5160
ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 5220
gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tacgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 5280
ccagctccag aactcctggg cggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 5340
accctcatgg cctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 5400
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 5460
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 5520
gcccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 5580
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 5640
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 5700
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 5760
aactacaaga ccacgcctcc cgtgttggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 5820
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 5880
gaggctctgc acaacgccta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 5937
<210> 161
<211> 1978
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 283 (FVIII 169 with IHH triple mutation)
<400> 161
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
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545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly
755 760 765
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
770 775 780
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
785 790 795 800
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
805 810 815
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
820 825 830
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
835 840 845
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
850 855 860
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
865 870 875 880
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
885 890 895
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Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
915 920 925
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
930 935 940
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
945 950 955 960
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
965 970 975
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
980 985 990
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
995 1000 1005
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
1010 1015 1020
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1970 1975
<210> 162
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYNFVIII 010 (Dual chain FVIIIFc)
<400> 162
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
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acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
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gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
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cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
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gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
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gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
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ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
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attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
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cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400
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agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760
cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820
ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880
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ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180
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attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360
tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420
gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
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tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact 4380
cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc 4440
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860
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tctccgggta aatga 5055
<210> 163
<211> 1684
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYNFVIII 010 (Dual chain FVIIIFc)
<400> 163
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
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450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
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930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
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Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1445 1450 1455
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1475 1480 1485
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1490 1495 1500
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1505 1510 1515
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1520 1525 1530
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1535 1540 1545
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1550 1555 1560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1565 1570 1575
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1580 1585 1590
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1595 1600 1605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1610 1615 1620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1625 1630 1635
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1640 1645 1650
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1655 1660 1665
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1670 1675 1680
Lys
<210> 164
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker, where the sequence can be repeated betweeen 1-10 times
<400> 164
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 165
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 165
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 166
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 166
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 167
<211> 314
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 169
<400> 167
Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
20 25 30
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
35 40 45
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
50 55 60
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
65 70 75 80
Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser
130 135 140
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro
145 150 155 160
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
165 170 175
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
180 185 190
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
195 200 205
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
210 215 220
Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr
225 230 235 240
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
245 250 255
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
275 280 285
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val
290 295 300
Leu Lys Arg His Gln Ala Glu Ile Thr Arg
305 310
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 310
<400> 168
Pro Arg Ser Phe Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
1 5 10 15
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
20 25 30
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
35 40 45
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
65 70 75 80
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
85 90 95
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
115 120 125
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
130 135 140
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
145 150 155 160
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
165 170 175
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser
180 185 190
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
195 200 205
Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
210 215 220
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu
225 230 235 240
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
245 250 255
Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
260 265 270
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
275 280 285
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile Thr Arg
290 295 300
<210> 169
<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 312
<400> 169
Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
20 25 30
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
35 40 45
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
50 55 60
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser
65 70 75 80
Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
100 105 110
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser
130 135 140
Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro
145 150 155 160
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
165 170 175
Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
180 185 190
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
195 200 205
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
210 215 220
Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr
225 230 235 240
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
245 250 255
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
275 280 285
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile Thr
290 295 300
Arg
305
<210> 170
<211> 5892
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 310 (encoding FVIII with complete B-domain deletion
except 2 amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa
742)
<400> 170
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttcggtacct cagagtctgc tacccccgag tcagggccag gatcagagcc agccacctcc 2340
gggtctgaga cacccgggac ttccgagagt gccacccctg agtccggacc cgggtccgag 2400
cccgccactt ccggctccga aactcccggc acaagcgaga gcgctacccc agagtcagga 2460
ccaggaacat ctacagagcc ctctgaaggc tccgctccag ggtccccagc cggcagtccc 2520
actagcaccg aggagggaac ctctgaaagc gccacacccg aatcagggcc agggtctgag 2580
cctgctacca gcggcagcga gacaccaggc acctctgagt ccgccacacc agagtccgga 2640
cccggatctc ccgctgggag ccccacctcc actgaggagg gatctcctgc tggctctcca 2700
acatctactg aggaaggtac ctcaaccgag ccatccgagg gatcagctcc cggcacctca 2760
gagtcggcaa ccccggagtc tggacccgga acttccgaaa gtgccacacc agagtccggt 2820
cccgggactt cagaatcagc aacacccgag tccggccctg ggtctgaacc cgccacaagt 2880
ggtagtgaga caccaggatc agaacctgct acctcagggt cagagacacc cggatctccg 2940
gcaggctcac caacctccac tgaggagggc accagcacag aaccaagcga gggctccgca 3000
cccggaacaa gcactgaacc cagtgagggt tcagcacccg gctctgagcc ggccacaagt 3060
ggcagtgaga cacccggcac ttcagagagt gccacccccg agagtggccc aggcactagt 3120
accgagccct ctgaaggcag tgcgccagcc tcgagcgaaa taactcgtac tactcttcag 3180
tcagatcaag aggaaatcga ttatgatgat accatatcag ttgaaatgaa gaaggaagat 3240
tttgacattt atgatgagga tgaaaatcag agcccccgca gctttcaaaa gaaaacacga 3300
cactatttta ttgctgcagt ggagaggctc tgggattatg ggatgagtag ctccccacat 3360
gttctaagaa acagggctca gagtggcagt gtccctcagt tcaagaaagt tgttttccag 3420
gaatttactg atggctcctt tactcagccc ttataccgtg gagaactaaa tgaacatttg 3480
ggactcctgg ggccatatat aagagcagaa gttgaagata atatcatggt aactttcaga 3540
aatcaggcct ctcgtcccta ttccttctat tctagcctta tttcttatga ggaagatcag 3600
aggcaaggag cagaacctag aaaaaacttt gtcaagccta atgaaaccaa aacttacttt 3660
tggaaagtgc aacatcatat ggcacccact aaagatgagt ttgactgcaa agcctgggct 3720
tatttctctg atgttgacct ggaaaaagat gtgcactcag gcctgattgg accccttctg 3780
gtctgccaca ctaacacact gaaccctgct catgggagac aagtgacagt acaggaattt 3840
gctctgtttt tcaccatctt tgatgagacc aaaagctggt acttcactga aaatatggaa 3900
agaaactgca gggctccctg caatatccag atggaagatc ccacttttaa agagaattat 3960
cgcttccatg caatcaatgg ctacataatg gatacactac ctggcttagt aatggctcag 4020
gatcaaagga ttcgatggta tctgctcagc atgggcagca atgaaaacat ccattctatt 4080
catttcagtg gacatgtgtt cactgtacga aaaaaagagg agtataaaat ggcactgtac 4140
aatctctatc caggtgtttt tgagacagtg gaaatgttac catccaaagc tggaatttgg 4200
cgggtggaat gccttattgg cgagcatcta catgctggga tgagcacact ttttctggtg 4260
tacagcaata agtgtcagac tcccctggga atggcttctg gacacattag agattttcag 4320
attacagctt caggacaata tggacagtgg gccccaaagc tggccagact tcattattcc 4380
ggatcaatca atgcctggag caccaaggag cccttttctt ggatcaaggt ggatctgttg 4440
gcaccaatga ttattcacgg catcaagacc cagggtgccc gtcagaagtt ctccagcctc 4500
tacatctctc agtttatcat catgtatagt cttgatggga agaagtggca gacttatcga 4560
ggaaattcca ctggaacctt aatggtcttc tttggcaatg tggattcatc tgggataaaa 4620
cacaatattt ttaaccctcc aattattgct cgatacatcc gtttgcaccc aactcattat 4680
agcattcgca gcactcttcg catggagttg atgggctgtg atttaaatag ttgcagcatg 4740
ccattgggaa tggagagtaa agcaatatca gatgcacaga ttactgcttc atcctacttt 4800
accaatatgt ttgccacctg gtctccttca aaagctcgac ttcacctcca agggaggagt 4860
aatgcctgga gacctcaggt gaataatcca aaagagtggc tgcaagtgga cttccagaag 4920
acaatgaaag tcacaggagt aactactcag ggagtaaaat ctctgcttac cagcatgtat 4980
gtgaaggagt tcctcatctc cagcagtcaa gatggccatc agtggactct cttttttcag 5040
aatggcaaag taaaggtttt tcagggaaat caagactcct tcacacctgt ggtgaactct 5100
ctagacccac cgttactgac tcgctacctt cgaattcacc cccagagttg ggtgcaccag 5160
attgccctga ggatggaggt tctgggctgc gaggcacagg acctctacga caaaactcac 5220
acatgcccac cgtgcccagc tccagaactc ctgggcggac cgtcagtctt cctcttcccc 5280
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 5340
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 5400
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 5460
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 5520
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 5580
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 5640
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 5700
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgt tggactccga cggctccttc 5760
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 5820
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 5880
ccgggtaaat ga 5892
<210> 171
<211> 1944
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 310 (FVIII with complete B-domain deletion except 2
amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa 742)
<400> 171
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
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465 470 475 480
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 312 (FVIII with complete B-domain deletion except 5
amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa 745- FVIII
B5 version)
<400> 172
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aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
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attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
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atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
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tccctgtctc cgggtaaatg 5900
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<211> 1947
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN FVIII 312 (FVIII with complete B-domain deletion except 5
amino acid residues and 288 AE-XTEN inserted after aa 745- FVIII
B5 version)
<400> 173
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35 40 45
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50 55 60
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Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
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Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
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Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
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Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
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Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
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Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
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Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> pSYN VWF073 (VWFD1D2D'D3- 144 AE XTEN- truncated a2 thrombin
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<400> 175
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325 330 335
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340 345 350
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
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835 840 845
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885 890 895
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980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
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Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
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Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
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His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
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His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
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Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Ala Pro Thr Ser Glu Ser Ala
1235 1240 1245
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
1250 1255 1260
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1265 1270 1275
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1280 1285 1290
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
1295 1300 1305
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1310 1315 1320
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1325 1330 1335
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
1340 1345 1350
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser
1355 1360 1365
Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
1370 1375 1380
Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1385 1390 1395
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1400 1405 1410
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gly
1415 1420 1425
Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1430 1435 1440
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
1460 1465 1470
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
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Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
1520 1525 1530
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
1550 1555 1560
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser
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<213> Artificial Sequence
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<223> Cleavable linker
<400> 195
Glu Pro Arg Ser Phe Ser
1 5
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<211> 4959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF059 (VWF D'D3-Fc with acidic region 2 (a2) thrombin site
in the linker)
<400> 196
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatcgggcg cgccaacatc agagagcgcc acccctgaaa gtggtcccgg gagcgagcca 3780
gccacatctg ggtcggaaac gccaggcaca agtgagtctg caactcccga gtccggacct 3840
ggctccgagc ctgccactag cggctccgag actccgggaa cttccgagag cgctacacca 3900
gaaagcggac ccggaaccag taccgaacct agcgagggct ctgctccggg cagcccagcc 3960
ggctctccta catccacgga ggagggcact tccgaatccg ccaccccgga gtcagggcca 4020
ggatctgaac ccgctacctc aggcagtgag acgccaggaa cgagcgagtc cgctacaccg 4080
gagagtgggc cagggagccc tgctggatct cctacgtcca ctgaggaagg gtcaccagcg 4140
ggctcgccca ccagcactga agaaggtgcc tcgatatctg acaagaacac tggtgattat 4200
tacgaggaca gttatgaaga tatttcagca tacttgctga gtaaaaacaa tgccattgaa 4260
ccaagaagct tctctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagctcc agaactcctg 4320
ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 4380
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 4440
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 4500
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 4560
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 4620
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 4680
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 4740
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 4800
cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 4860
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 4920
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 4959
<210> 197
<211> 1652
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSYN VWF059 (VWF D'D3-Fc with LVPR thrombin site in the linker)
<400> 197
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
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930 935 940
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<220>
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<400> 199
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130 135 140
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180 185 190
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Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
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355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
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420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
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450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
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Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
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625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
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Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
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Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
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835 840 845
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Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
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Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
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Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
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Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
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Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
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His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
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Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
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1250 1255 1260
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1265 1270 1275
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
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Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
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Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro
1310 1315 1320
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1325 1330 1335
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
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Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala
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Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
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Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
885 890 895
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr
900 905 910
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
915 920 925
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
930 935 940
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
945 950 955 960
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly
965 970 975
Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
980 985 990
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr
995 1000 1005
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
1010 1015 1020
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
1025 1030 1035
Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala
1040 1045 1050
Ser Ser Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu
1055 1060 1065
Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp
1070 1075 1080
Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
1085 1090 1095
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu
1100 1105 1110
Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg
1115 1120 1125
Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln
1130 1135 1140
Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu
1145 1150 1155
Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu
1160 1165 1170
Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg
1175 1180 1185
Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln
1190 1195 1200
Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu
1205 1210 1215
Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr
1220 1225 1230
Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val
1235 1240 1245
Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
1250 1255 1260
Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val
1265 1270 1275
Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
1280 1285 1290
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala
1295 1300 1305
Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr
1310 1315 1320
Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly
1325 1330 1335
Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser
1340 1345 1350
Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His
1355 1360 1365
Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr
1370 1375 1380
Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
1385 1390 1395
Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu
1400 1405 1410
His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys
1415 1420 1425
Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln
1430 1435 1440
Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala
1445 1450 1455
Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu
1460 1465 1470
Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile
1475 1480 1485
His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu
1490 1495 1500
Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys
1505 1510 1515
Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe
1520 1525 1530
Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn
1535 1540 1545
Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr
1550 1555 1560
Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu
1565 1570 1575
Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser
1580 1585 1590
Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala
1595 1600 1605
Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser
1610 1615 1620
Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln
1625 1630 1635
Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln
1640 1645 1650
Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu
1655 1660 1665
Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln
1670 1675 1680
Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr
1685 1690 1695
Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu
1700 1705 1710
Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met
1715 1720 1725
Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His
1730 1735 1740
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1745 1750 1755
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
1760 1765 1770
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
1775 1780 1785
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
1790 1795 1800
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
1805 1810 1815
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
1820 1825 1830
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
1835 1840 1845
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1850 1855 1860
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
1865 1870 1875
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
1880 1885 1890
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
1895 1900 1905
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
1910 1915 1920
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
1925 1930 1935
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
1940 1945 1950
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1955 1960 1965
<210> 204
<211> 5898
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Final nucleotide sequence of FVIII 312A (SEQ ID NO: 204)
<400> 204
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acggtacctc agagtctgct acccccgagt cagggccagg atcagagcca 2340
gccacctccg ggtctgagac acccgggact tccgagagtg ccacccctga gtccggaccc 2400
gggtccgagc ccgccacttc cggctccgaa actcccggca caagcgagag cgctacccca 2460
gagtcaggac caggaacatc tacagagccc tctgaaggct ccgctccagg gtccccagcc 2520
ggcagtccca ctagcaccga ggagggaacc tctgaaagcg ccacacccga atcagggcca 2580
gggtctgagc ctgctaccag cggcagcgag acaccaggca cctctgagtc cgccacacca 2640
gagtccggac ccggatctcc cgctgggagc cccacctcca ctgaggaggg atctcctgct 2700
ggctctccaa catctactga ggaaggaacc tcaaccgagc catccgaggg atcagctccc 2760
ggcacctcag agtcggcaac cccggagtct ggacccggaa cttccgaaag tgccacacca 2820
gagtccggtc ccgggacttc agaatcagca acacccgagt ccggccctgg gtctgaaccc 2880
gccacaagtg gtagtgagac accaggatca gaacctgcta cctcagggtc agagacaccc 2940
ggatctccgg caggctcacc aacctccact gaggagggca ccagcacaga accaagcgag 3000
ggctccgcac ccggaacaag cactgaaccc agtgagggtt cagcacccgg ctctgagccg 3060
gccacaagtg gcagtgagac acccggcact tcagagagtg ccacccccga gagtggccca 3120
ggcactagta ccgagccctc tgaaggcagt gcgccagcct cgagcgaaat aactcgtact 3180
actcttcagt cagatcaaga ggaaattgac tatgatgata ccatatcagt tgaaatgaag 3240
aaggaagatt ttgacattta tgatgaggat gaaaatcaga gcccccgcag ctttcaaaag 3300
aaaacacgac actattttat tgctgcagtg gagaggctct gggattatgg gatgagtagc 3360
tccccacatg ttctaagaaa cagggctcag agtggcagtg tccctcagtt caagaaagtt 3420
gttttccagg aatttactga tggctccttt actcagccct tataccgtgg agaactaaat 3480
gaacatttgg gactcctggg gccatatata agagcagaag ttgaagataa tatcatggta 3540
actttcagaa atcaggcctc tcgtccctat tccttctatt ctagccttat ttcttatgag 3600
gaagatcaga ggcaaggagc agaacctaga aaaaactttg tcaagcctaa tgaaaccaaa 3660
acttactttt ggaaagtgca acatcatatg gcacccacta aagatgagtt tgactgcaaa 3720
gcctgggctt atttctctga tgttgacctg gaaaaagatg tgcactcagg cctgattgga 3780
ccccttctgg tctgccacac taacacactg aaccctgctc atgggagaca agtgacagta 3840
caggaatttg ctctgttttt caccatcttt gatgagacca aaagctggta cttcactgaa 3900
aatatggaaa gaaactgcag ggctccctgc aatatccaga tggaagatcc cacttttaaa 3960
gagaattatc gcttccatgc aatcaatggc tacataatgg atacactacc tggcttagta 4020
atggctcagg atcaaaggat tcgatggtat ctgctcagca tgggcagcaa tgaaaacatc 4080
cattctattc atttcagtgg acatgtgttc actgtacgaa aaaaagagga gtataaaatg 4140
gcactgtaca atctctatcc aggtgttttt gagacagtgg aaatgttacc atccaaagct 4200
ggaatttggc gggtggaatg ccttattggc gagcatctac atgctgggat gagcacactt 4260
tttctggtgt acagcaataa gtgtcagact cccctgggaa tggcttctgg acacattaga 4320
gattttcaga ttacagcttc aggacaatat ggacagtggg ccccaaagct ggccagactt 4380
cattattccg gatcaatcaa tgcctggagc accaaggagc ccttttcttg gatcaaggtg 4440
gatctgttgg caccaatgat tattcacggc atcaagaccc agggtgcccg tcagaagttc 4500
tccagcctct acatctctca gtttatcatc atgtatagtc ttgatgggaa gaagtggcag 4560
acttatcgag gaaattccac tggaacctta atggtcttct ttggcaatgt ggattcatct 4620
gggataaaac acaatatttt taaccctcca attattgctc gatacatccg tttgcaccca 4680
actcattata gcattcgcag cactcttcgc atggagttga tgggctgtga tttaaatagt 4740
tgcagcatgc cattgggaat ggagagtaaa gcaatatcag atgcacagat tactgcttca 4800
tcctacttta ccaatatgtt tgccacctgg tctccttcaa aagctcgact tcacctccaa 4860
gggaggagta atgcctggag acctcaggtg aataatccaa aagagtggct gcaagtggac 4920
ttccagaaga caatgaaagt cacaggagta actactcagg gagtaaaatc tctgcttacc 4980
agcatgtatg tgaaggagtt cctcatctcc agcagtcaag atggccatca gtggactctc 5040
ttttttcaga atggcaaagt aaaggttttt cagggaaatc aagactcctt cacacctgtg 5100
gtgaactctc tagacccacc gttactgact cgctaccttc gaattcaccc ccagagttgg 5160
gtgcaccaga ttgccctgag gatggaggtt ctgggctgcg aggcacagga cctctacgac 5220
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagct ccagaactcc tgggcggacc gtcagtcttc 5280
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 5340
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta tgtggacggc 5400
gtggaagtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 5460
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccaa gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 5520
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 5580
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 5640
caagttagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 5700
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgtt ggactccgac 5760
ggctccttct tcctctactc caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 5820
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 5880
tccctgtctc cgggttga 5898
<210> 205
<211> 1646
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Final amino acid sequence of VWF059A polypeptide
<400> 205
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
1235 1240 1245
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
1250 1255 1260
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1265 1270 1275
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1280 1285 1290
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu
1295 1300 1305
Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
1310 1315 1320
Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
1325 1330 1335
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1340 1345 1350
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
1355 1360 1365
Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu
1370 1375 1380
Glu Gly Ala Ser Ser Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp
1385 1390 1395
Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
1400 1405 1410
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1415 1420 1425
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1430 1435 1440
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
1445 1450 1455
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
1460 1465 1470
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
1475 1480 1485
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
1490 1495 1500
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
1505 1510 1515
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
1520 1525 1530
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
1535 1540 1545
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
1550 1555 1560
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
1565 1570 1575
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
1580 1585 1590
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
1595 1600 1605
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
1610 1615 1620
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
1625 1630 1635
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1640 1645
<210> 206
<211> 4941
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Final nucleotide sequence of VWF059A
<400> 206
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540
acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840
gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900
tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080
acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140
aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200
aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260
cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320
acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380
ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440
cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740
gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800
ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980
tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220
agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280
agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340
ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400
agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460
tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520
acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580
catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640
ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700
aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820
gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940
tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000
ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060
tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120
tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180
agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240
ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300
tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360
aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420
gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480
gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600
gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660
cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
ggtacatcag agagcgccac ccctgaaagt ggtcccggga gcgagccagc cacatctggg 3780
tcggaaacgc caggcacatc cgagtctgca actcccgagt ccggacctgg ctccgagcct 3840
gccactagcg gctccgagac tccgggaact tccgagagcg ctacaccaga aagcggaccc 3900
ggaaccagta ccgaacctag cgagggctct gctccgggca gcccagccgg ctctcctaca 3960
tccacggagg agggcacttc cgaatccgcc accccggagt cagggccagg atctgaaccc 4020
gctacctcag gcagtgagac gccaggaacg agcgagtccg ctacaccgga gagtgggcca 4080
gggagccctg ctggatctcc tacgtccact gaggaagggt caccagcggg ctcgcccacc 4140
agcactgaag aaggtgcctc gtctgacaag aacactggtg attattacga ggacagttat 4200
gaagatattt cagcatactt gctgagtaaa aacaatgcca ttgaaccaag aagcttctct 4260
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gctccagaac tcctgggcgg accgtcagtc 4320
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 4380
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtatgtggac 4440
ggcgtggaag tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 4500
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caagactggc tgaatggcaa ggagtacaag 4560
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 4620
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 4680
aaccaagtta gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 4740
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gttggactcc 4800
gacggctcct tcttcctcta ctccaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 4860
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 4920
ctctccctgt ctccgggttg a 4941
<210> 207
<211> 1946
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII(XTEN)-Fc w lead A
<400> 207
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
740 745 750
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
755 760 765
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu
770 775 780
Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr
785 790 795 800
Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala
805 810 815
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
820 825 830
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
835 840 845
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
850 855 860
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro
865 870 875 880
Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
885 890 895
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly
900 905 910
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser
915 920 925
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser
930 935 940
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
945 950 955 960
Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser
965 970 975
Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser
980 985 990
Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr
995 1000 1005
Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr
1010 1015 1020
Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ile
1025 1030 1035
Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp
1040 1045 1050
Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
1055 1060 1065
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr
1070 1075 1080
Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
1085 1090 1095
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly
1100 1105 1110
Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp
1115 1120 1125
Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
1130 1135 1140
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn
1145 1150 1155
Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe
1160 1165 1170
Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala
1175 1180 1185
Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr
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Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe
1205 1210 1215
Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys
1220 1225 1230
Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr
1235 1240 1245
Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu
1250 1255 1260
Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr
1265 1270 1275
Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile
1280 1285 1290
Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala
1295 1300 1305
Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala
1310 1315 1320
Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn
1325 1330 1335
Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val
1340 1345 1350
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1370 1375 1380
Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met
1385 1390 1395
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1400 1405 1410
Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser
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Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr
1430 1435 1440
Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp
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Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys
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Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln
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Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr
1490 1495 1500
Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val
1505 1510 1515
Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile
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Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser
1535 1540 1545
Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser
1550 1555 1560
Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile
1565 1570 1575
Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro
1580 1585 1590
Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg
1595 1600 1605
Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln
1610 1615 1620
Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser
1625 1630 1635
Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser
1640 1645 1650
Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val
1655 1660 1665
Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn
1670 1675 1680
Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro
1685 1690 1695
Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly
1700 1705 1710
Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1715 1720 1725
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1760 1765 1770
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1775 1780 1785
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1790 1795 1800
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1805 1810 1815
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
1820 1825 1830
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
1835 1840 1845
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
1850 1855 1860
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
1865 1870 1875
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
1880 1885 1890
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
1895 1900 1905
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
1910 1915 1920
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
1925 1930 1935
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1940 1945
<210> 208
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 208
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys
20
<210> 209
<211> 741
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 209
Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr Ala Arg Cys Ser Leu Phe
1 5 10 15
Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly Ser Met Tyr Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly Cys Gln Lys Arg Ser Phe
35 40 45
Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys Arg Val Ser Leu Ser Val
50 55 60
Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu Phe Val Asn Gly Thr Val
65 70 75 80
Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro Tyr Ala Ser Lys Gly Leu
85 90 95
Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys Leu Ser Gly Glu Ala Tyr
100 105 110
Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly Asn Phe Gln Val Leu Leu
115 120 125
Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asn
130 135 140
Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln Glu Gly Thr Leu Thr Ser
145 150 155 160
Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala Leu Ser Ser Gly Glu Gln
165 170 175
Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser Ser Cys Asn Ile Ser Ser
180 185 190
Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln Cys Gln Leu Leu Lys Ser
195 200 205
Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu Val Asp Pro Glu Pro Phe
210 215 220
Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu Cys Ala Gly Gly Leu Glu
225 230 235 240
Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Arg Thr Cys Ala Gln Glu
245 250 255
Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His Ser Ala Cys Ser Pro Val
260 265 270
Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys Val Ser Pro Cys Ala Arg
275 280 285
Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met Cys Gln Glu Arg Cys Val
290 295 300
Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu Leu Asp Glu Gly Leu Cys
305 310 315 320
Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His Ser Gly Lys Arg Tyr Pro
325 330 335
Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn Thr Cys Ile Cys Arg Asn
340 345 350
Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys Pro Gly Glu Cys Leu Val
355 360 365
Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp Asn Arg Tyr Phe Thr Phe
370 375 380
Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg Asp Cys Gln Asp His Ser
385 390 395 400
Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys Ala Asp Asp Arg Asp Ala
405 410 415
Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu Pro Gly Leu His Asn Ser
420 425 430
Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val Ala Met Asp Gly Gln Asp
435 440 445
Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu Arg Ile Gln His Thr Val
450 455 460
Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu Asp Leu Gln Met Asp Trp
465 470 475 480
Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu Ser Pro Val Tyr Ala Gly
485 490 495
Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn Gly Asn Gln Gly Asp Asp
500 505 510
Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro Arg Val Glu Asp Phe Gly
515 520 525
Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln Asp Leu Gln Lys Gln His
530 535 540
Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met Thr Arg Phe Ser Glu Glu
545 550 555 560
Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe Glu Ala Cys His Arg Ala
565 570 575
Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys Arg Tyr Asp Val Cys Ser
580 585 590
Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly Ala Leu Ala Ser Tyr Ala
595 600 605
Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val Ala Trp Arg Glu Pro Gly
610 615 620
Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln Val Tyr Leu Gln Cys Gly
625 630 635 640
Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Glu
645 650 655
Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Gly Leu Tyr
660 665 670
Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys Ala Gln Cys Pro Cys Tyr
675 680 685
Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp Ile Phe Ser Asp His His
690 695 700
Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met His Cys Thr Met Ser Gly
705 710 715 720
Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val Leu Ser Ser Pro Leu Ser
725 730 735
His Arg Ser Lys Arg
740
<210> 210
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 210
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr
100
<210> 211
<211> 374
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 211
Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys
20 25 30
Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys
35 40 45
Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu
50 55 60
Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro
65 70 75 80
Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile
85 90 95
Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu
100 105 110
Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly
115 120 125
Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser
130 135 140
Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys
145 150 155 160
Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser
165 170 175
Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser
180 185 190
Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu
195 200 205
Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser
210 215 220
Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala
225 230 235 240
Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr
245 250 255
Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn
260 265 270
Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln
275 280 285
Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val
290 295 300
Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu
305 310 315 320
Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala
325 330 335
Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
340 345 350
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys
355 360 365
Glu Ala Cys Gln Glu Pro
370
<210> 212
<211> 239
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 212
Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr
1 5 10 15
Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys
20 25 30
Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu
35 40 45
Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile
165 170 175
Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala
180 185 190
Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln
195 200 205
Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala
210 215 220
Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly
225 230 235
<210> 213
<211> 1334
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (537)..(537)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 213
Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met
1 5 10 15
Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu
20 25 30
Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg
35 40 45
Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser
50 55 60
Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly
65 70 75 80
Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg
85 90 95
Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu
100 105 110
Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu
165 170 175
Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser
180 185 190
Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser
195 200 205
Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro
210 215 220
Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser
225 230 235 240
Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr
245 250 255
Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys
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275 280 285
Ser Gln Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser
290 295 300
Glu Met His Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu
305 310 315 320
Val Thr Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala
325 330 335
Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr
340 345 350
Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn
355 360 365
Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
370 375 380
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys
385 390 395 400
Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp Thr Leu
405 410 415
Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly Gln Thr Leu
420 425 430
Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys
435 440 445
Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg
450 455 460
Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val
465 470 475 480
Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val
485 490 495
Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly
500 505 510
Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val
515 520 525
Lys His Ser Ala Leu Ser Val Glu Xaa His Ser Asp Met Glu Val Thr
530 535 540
Val Asn Gly Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu
545 550 555 560
Val Asn Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu
565 570 575
Gly His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln
580 585 590
Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile
595 600 605
Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
610 615 620
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625 630 635 640
Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val Pro Asp
645 650 655
Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala Glu Cys His
660 665 670
Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys Gln Gln Asp Ser
675 680 685
Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu
690 695 700
Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys
705 710 715 720
Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly
725 730 735
Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro
740 745 750
Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser
755 760 765
Cys Val Pro Glu Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val
770 775 780
Gln His Gln Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln
785 790 795 800
Ile Cys Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro
805 810 815
Cys Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg
820 825 830
Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys
835 840 845
Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
850 855 860
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr
865 870 875 880
Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro Ser Cys
885 890 895
Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu
900 905 910
Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu
915 920 925
Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr
930 935 940
Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro
945 950 955 960
Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp
965 970 975
Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys
980 985 990
Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu
995 1000 1005
Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val
1010 1015 1020
Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val
1025 1030 1035
Gly Ser Gln Trp Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu
1040 1045 1050
Cys Val Arg Val Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val
1055 1060 1065
Ser Cys Pro Gln Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln
1070 1075 1080
Leu Ser Cys Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu
1085 1090 1095
Arg Met Glu Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly
1100 1105 1110
Lys Thr Val Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val
1115 1120 1125
Gln Val Gly Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr
1130 1135 1140
Thr Cys Asn Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr
1145 1150 1155
Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln
1160 1165 1170
Leu Arg Gly Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu
1175 1180 1185
Gln Asp Gly Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly
1190 1195 1200
Glu Tyr Phe Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp
1205 1210 1215
Glu His Lys Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro
1220 1225 1230
Gly Thr Cys Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile
1235 1240 1245
Thr Ala Arg Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu
1250 1255 1260
Val Glu Val Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys
1265 1270 1275
Ala Met Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser
1280 1285 1290
Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His
1295 1300 1305
Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met
1310 1315 1320
Glu Cys Lys Cys Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys
1325 1330
<210> 214
<211> 374
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VWF D3 region EAE
<400> 214
Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys
20 25 30
Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys
35 40 45
Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu
50 55 60
Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro
65 70 75 80
Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile
85 90 95
Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu
100 105 110
Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly
115 120 125
Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser
130 135 140
Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys
145 150 155 160
Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser
165 170 175
Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser
180 185 190
Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu
195 200 205
Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser
210 215 220
Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala
225 230 235 240
Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr
245 250 255
Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu
305 310 315 320
Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala
325 330 335
Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
340 345 350
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys
355 360 365
Glu Ala Cys Gln Glu Pro
370
<210> 215
<211> 745
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1 to 745 of FVIII
<400> 215
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn
740 745
<210> 216
<211> 684
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FVIII 1649-2332
<400> 216
Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr
20 25 30
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg
35 40 45
His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser
50 55 60
Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
65 70 75 80
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr
85 90 95
Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly
100 105 110
Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg
115 120 125
Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr
130 135 140
Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
145 150 155 160
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala
165 170 175
Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp
180 185 190
Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
195 200 205
Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr
210 215 220
Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser
225 230 235 240
Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn
245 250 255
Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala
260 265 270
Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln
275 280 285
Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn
290 295 300
Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
305 310 315 320
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu
325 330 335
Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys
340 345 350
Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
355 360 365
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile
370 375 380
Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
385 390 395 400
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr
405 410 415
Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile
420 425 430
Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu
435 440 445
Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
450 455 460
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly
465 470 475 480
Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile
485 490 495
Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser
500 505 510
Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met
515 520 525
Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala
530 535 540
Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
545 550 555 560
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn
565 570 575
Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val
580 585 590
Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
595 600 605
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr
610 615 620
Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
625 630 635 640
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg
645 650 655
Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg
660 665 670
Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
675 680
<210> 217
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc region
<400> 217
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 218
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XTEN AE288-3
<400> 218
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro
1 5 10 15
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
20 25 30
Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
35 40 45
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
65 70 75 80
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
85 90 95
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu
100 105 110
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
130 135 140
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
165 170 175
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
180 185 190
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro
195 200 205
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr
210 215 220
Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
225 230 235 240
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro
245 250 255
Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro
260 265 270
Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
275 280 285
Ala Ser Ser
290
Claims (89)
- A형 혈우병의 치료가 필요한 대상체에서의 A형 혈우병의 치료 방법으로서, (i) 인자 VIII(FVIII) 폴리펩티드 및 (ii) 폰빌레브란트 인자(von Willebrand factor: VWF)의 D' 도메인 및 VWF의 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편을 포함하는 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 상기 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되,
상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이고, 상기 투약 간격은 적어도 약 7일인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 FVIII 폴리펩티드는 공유 결합에 의해 상기 VWF 단편과 회합되는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공유 결합은 펩티드 결합 또는 이황화 결합인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 폴리펩티드는 제1 반감기 연장 모이어티를 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 제1 반감기 연장 모이어티는 상기 FVIII 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합되는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 제1 반감기 연장 모이어티는 상기 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입되는, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제1 반감기 연장 모이어티는 상기 FVIII 폴리펩티드의 상기 B 도메인 내에 삽입되는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 제1 반감기 연장 모이어티는 서열번호 65의 아미노산 잔기 745에 대응하는 아미노산 바로 다음에 오는(immediately downstream) 상기 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입되는, 방법.
- 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 반감기 연장 모이어티는 링커에 의해 상기 FVIII 폴리펩티드에 융합되는, 방법.
- 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 제2 반감기 연장 모이어티를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 제2 반감기 연장 모이어티는 상기 VWF 단편의 C-말단 또는 N-말단에 융합되는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 제2 반감기 연장 모이어티는 상기 VWF 단편 내에 삽입되는, 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제2 반감기 연장 모이어티는 상기 VWF 단편의 C-말단에 융합되는, 방법.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 반감기 연장 모이어티는 링커에 의해 상기 VWF 단편에 융합되는, 방법.
- 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 반감기 연장 모이어티, 상기 제2 반감기 연장 모이어티 또는 둘 다는 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(C-terminal peptide: CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린, 알부민-결합 모이어티, 또는 임의의 단편, 유도체, 변이체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 반감기 연장 모이어티는 제1 XTEN을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 XTEN은 서열번호 65의 아미노산 잔기 745에 대응하는 아미노산 바로 다음에 오는 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입되는, 방법.
- 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 반감기 연장 모이어티는 제2 XTEN을 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제2 XTEN은 상기 VWF 단편의 상기 C-말단에 융합되는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 폴리펩티드는 제1 면역글로불린(Ig) 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합되는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입되는, 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 상기 FVIII 폴리펩티드의 C-말단에 융합되는, 방법.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 링커에 의해 상기 FVIII 폴리펩티드에 융합되는, 방법.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 제1 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VWF 단편은 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 상기 VWF 단편의 C-말단 또는 N-말단에 융합되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 상기 VWF 단편 내에 삽입되는, 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 상기 VWF 단편의 C-말단에 융합되는, 방법.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 링커에 의해 상기 VWF 단편에 융합되는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 링커는 절단 가능한 링커인, 방법.
- 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 Ig 불변 영역 또는 이의 일부는 제2 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 FVIII 단백질과 상기 VWF 단편은 상기 제1 Fc 도메인과 상기 제2 Fc 도메인 사이의 공유 결합을 통해 서로 회합되는, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 FVIII 단백질과 상기 VWF 단편은 상기 FVIII 단백질과 상기 VWF 단편 사이의 비공유 상호작용을 통해 서로 추가로 회합되는, 방법.
- 인간 대상체에서의 A형 혈우병을 치료하는 방법으로서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 A형 혈우병의 치료가 필요한 상기 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하며, 상기 키메라 폴리펩티드는,
(i) 하기 (a) 내지 (d)를 포함하는 FVIII 단백질:
(a) 서열번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 제1 FVIII 폴리펩티드 단편;
(b) 서열번호 8의 아미노산 서열(AE288)을 포함하는 제1 XTEN 서열;
(c) 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 제2 FVIII 폴리펩티드 단편; 및
(d) 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제1 Fc 영역;
(ii) 하기 (a) 내지 (e)를 포함하는 VWF 단백질:
(a) 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D' 도메인;
(b) 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 VWF의 D3 도메인;
(c) 서열번호 58의 아미노산 서열(AE144_5A)을 포함하는 제2 XTEN 서열;
(d) 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 a2 링커; 및
(e) 서열번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 제2 Fc 영역
을 포함하되,
상기 제1 Fc 영역은 이황화 결합에 의해 상기 제2 Fc 영역에 공유결합되는, 방법. - 제35항에 있어서, 상기 FVIII 단백질은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 신호 펩티드를 더 포함하는, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 VWF 단백질은 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 신호 펩티드를 더 포함하는, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 VWF 단백질은 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 D1D2 도메인을 더 포함하는, 방법.
- 인간 대상체에서의 A형 혈우병을 치료하는 방법으로서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 A형 혈우병의 치료가 필요한 상기 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 상기 키메라 폴리펩티드는,
(i) 서열번호 173, 서열번호 201, 서열번호 203 또는 서열번호 207에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질; 및
(ii) 서열번호 197, 서열번호 202 또는 서열번호 205에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질
을 포함하는, 방법. - 인간 대상체에서의 A형 혈우병을 치료하는 방법으로서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 A형 혈우병의 치료가 필요한 상기 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 상기 키메라 폴리펩티드는,
(i) 서열번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질; 및
(ii) 서열번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질
을 포함하는, 방법. - 인간 대상체에서의 A형 혈우병을 치료하는 방법으로서, 키메라 폴리펩티드의 다회 용량을 A형 혈우병의 치료가 필요한 상기 대상체에게 투약 간격을 두고 투여하는 단계를 포함하되, 상기 키메라 폴리펩티드는,
(i) FVIII-161(서열번호 69), FVIII-169(서열번호 70), FVIII-170(서열번호 71), FVIII-173(서열번호 72); FVIII-195(서열번호 73); FVIII-196(서열번호 74), FVIII199(서열번호 75), FVIII-201(서열번호 76); FVIII-203(서열번호 77), FVIII-204(서열번호 78), FVIII-205(서열번호 79), FVIII-266(서열번호 80), FVIII-267(서열번호 81), FVIII-268(서열번호 82), FVIII-269(서열번호 83), FVIII-271(서열번호 84), FVIII-272(서열번호 85), FVIII-312(서열번호 173) 또는 FVIII-312A(서열번호 203)로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FVIII 단백질; 및
(ii) VWF031(서열번호 86), VWF034(서열번호 87), VWF059(서열번호 197), VWF059A(서열번호 202) 또는 VWF036으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VWF 단백질
을 포함하는, 방법. - 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 15 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏이고, 상기 투약 간격은 적어도 약 7일인, 방법.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 또는 약 65 IU/㎏이고, 상기 투약 간격은 적어도 약 5일 또는 약 7일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량은 적어도 2회 용량, 적어도 3회 용량, 적어도 4회 용량, 적어도 5회 용량, 적어도 6회 용량, 적어도 7회 용량, 적어도 8회 용량, 적어도 9회 용량, 적어도 10회 용량, 적어도 11회 용량, 적어도 12회 용량, 적어도 13회 용량, 적어도 14회 용량, 적어도 15회 용량, 적어도 16회 용량, 적어도 17회 용량, 적어도 18회 용량, 적어도 19회 용량, 적어도 20회 용량 이상을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드의 발생률 또는 빈도를 제어하거나 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A형 혈우병의 치료는 A형 혈우병의 치료가 필요한 인간 대상체에서 출혈 에피소드를 예방하거나 치료하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 95 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 90 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 85 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 60 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 55 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 50 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 45 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 40 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 35 IU/㎏, 약 20 IU/㎏ 내지 약 30 IU/㎏, 또는 약 20 IU/㎏ 내지 약 25 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제415항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 25 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 30 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 35 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 40 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 45 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 50 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 55 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 60 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 65 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 70 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 75 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 80 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 약 85 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏, 또는 약 90 IU/㎏ 내지 약 100 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏, 약 25 IU/㎏ 내지 약 75 IU/㎏, 약 30 IU/㎏ 내지 약 70 IU/㎏, 약 35 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏, 약 40 IU/㎏ 내지 약 60 IU/㎏, 또는 약 45 IU/㎏ 내지 약 55 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 20 IU/㎏, 약 25 IU/㎏, 약 30 IU/㎏, 약 35 IU/㎏, 약 40 IU/㎏, 약 45 IU/㎏, 약 50 IU/㎏, 약 55 IU/㎏, 약 60 IU/㎏, 약 65 IU/㎏, 약 70 IU/㎏, 약 75 IU/㎏, 약 80 IU/㎏, 약 85 IU/㎏, 약 90 IU/㎏, 약 95 IU/㎏, 또는 약 100 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 25 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 80 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 간격은 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일, 적어도 약 22일, 적어도 약 23일, 적어도 약 24일, 적어도 약 25일, 적어도 약 26일, 적어도 약 27일, 적어도 약 28일, 적어도 약 29일, 적어도 약 30일 또는 적어도 약 31일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 빈도는 매주 적어도 1회, 2주마다 적어도 1회, 3주마다 적어도 1회 또는 4주마다 적어도 1회인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 빈도는 1주마다 적어도 1회인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 빈도는 2주마다 적어도 1회인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 폴리펩티드는 예방적 치료를 위해 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 폴리펩티드는 정맥내 주사, 정맥내 주입, 피하 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 비강 투여 및 폐 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 폴리펩티드는 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9% 또는 적어도 약 10%의 FVIII 혈장 활성 수준을 초래하는, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 3%인, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 5%인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 후 상기 키메라 폴리펩티드는 적어도 약 1 IU/㎗, 적어도 약 2 IU/㎗, 적어도 약 3 IU/㎗, 적어도 약 4 IU/㎗, 적어도 약 5 IU/㎗, 적어도 약 6 IU/㎗, 적어도 약 7 IU/㎗, 적어도 약 8 IU/㎗, 적어도 약 9 IU/㎗, 또는 적어도 약 10 IU/㎗의 FVIII 혈장 활성 수준을 초래하는, 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 3 IU/㎗인, 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 적어도 약 5 IU/㎗인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 키메라 폴리펩티드의 상기 투여의 적어도 약 5일 후에 적어도 약 10 IU/㎗인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 상기 키메라 폴리펩티드의 상기 투여의 적어도 약 7일 후에 적어도 약 5 IU/㎗인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 상기 키메라 폴리펩티드의 상기 투여의 적어도 약 8일 후에 적어도 약 3 IU/㎗인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FVIII 혈장 활성 수준은 상기 키메라 폴리펩티드의 상기 투여의 적어도 약 10일 후에 적어도 약 1 IU/㎗인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량은 약 50 IU/㎏이고, 상기 투약 간격은 약 7일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 폴리펩티드의 상기 투여는 상기 투여의 약 7일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 20일, 약 24일, 약 25일, 약 28일, 약 30일 또는 약 35일 후에 FVIII 저해제를 유도하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 폴리펩티드의 상기 투여는 상기 투여의 약 28일 후에 FVIII 저해제를 유도하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 50 IU/㎏ 내지 약 65 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다회 용량 중 적어도 한 번은 약 65 IU/㎏ 내지 약 80 IU/㎏인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 간격은 적어도 약 7일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 간격은 약 7일 내지 약 14일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 간격은 적어도 약 10일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 간격은 약 10일 내지 약 21일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 간격은 약 14일 내지 약 21일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투약 간격은 약 14일인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 여성인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 소아인, 방법.
- 제85항에 있어서, 상기 인간 대상체는 약 12세 이하, 약 11세 미만, 약 10세 미만, 약 9세 미만, 약 8세 미만, 약 7세 미만, 약 6세 미만, 약 5세 미만, 약 4세 미만, 약 3세 미만, 약 2세 미만, 또는 약 1세 미만의 소아인, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 인간 대상체에서 FVIII에 대한 면역 관용(immune tolerance)을 유도하는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 상기 인간 대상체에서 FVIII에 대한 저해성 면역 반응(inhibitory immune response)을 감소시키는, 방법.
- 제88항에 있어서, FVIII에 대한 상기 저해성 면역 반응은 상기 인간 대상체에서의 고역가의 항-FVIII 항체를 포함하는, 방법.
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