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KR101271635B1 - 알부민 융합 단백질 - Google Patents

알부민 융합 단백질 Download PDF

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KR101271635B1
KR101271635B1 KR1020127015659A KR20127015659A KR101271635B1 KR 101271635 B1 KR101271635 B1 KR 101271635B1 KR 1020127015659 A KR1020127015659 A KR 1020127015659A KR 20127015659 A KR20127015659 A KR 20127015659A KR 101271635 B1 KR101271635 B1 KR 101271635B1
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albumin fusion
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fusion protein
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크라이그 에이. 로젠
윌리엄 에이. 하젤타인
폴 에이. 무어
제이슨 비. 복
아담 벨
양구 시
데이비드 라플리우
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휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자, 이들 핵산을 함유하는 벡터, 이들 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포, 및 이들 핵산, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 이용하여 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다. 추가로, 본 발명은 알부민 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물, 및 본 발명의 알부민 융합 단백질을 이용하여 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나, 예방하거나, 완화시키는 방법을 포함한다.

Description

알부민 융합 단백질{ALBUMIN FUSION PROTEINS}
본원은 "1본", "2본", "3본"으로 라벨링된 세개의 동일한 콤팩트 디스크(CD-R)의 전자 문서로서 제공되는 하기 "서열 목록"에 관한 것이다.
본 발명은 일반적으로 알부민 또는 알부민의 단편 또는 변이체와 융합된 치료 단백질(하나 이상의 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 또는 이들의 단편 및 변이체를 포함하나 이에 제한되지 않음)에 관한 것이다. 본 발명은 치료 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 치료 알부민 융합 단백질, 조성물, 약학적 조성물, 제형 및 키트를 포함한다. 치료 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 형질전환된 숙주 세포가 또한 본 발명에 포함되고, 상기 폴리누클레오티드, 및/또는 숙주 세포를 이용하여 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법도 포함된다.
성숙한 형태에서 585 아미노산의 단백질(도 1(SEQ ID NO:1)에 도시됨)인 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 혈청의 삼투압에 중요한 부분을 책임지고, 내인성 및 외인성 리간드의 담체로서도 작용한다. 현재, 임상적 용도를 위한 HA가 인간 혈액으로부터의 추출에 의해 생성된다. 미생물에서의 재조합 HA(rHA)의 생성이 EP 330 451 및 EP 361 991에 기술되어 있다.
통상적으로, 천연 상태 또는 재조합으로 생성되는 치료 단백질, 예를들어 인터페론 및 성장 호르몬은 특히 수용액에서 포뮬레이팅되는 경우에 짧은 저장-수명을 나타내는 불안정한 분자이다. 투여를 위해 포뮬레이팅되는 경우에 이러한 분자의 불안정성은 다수의 분자가 저장 동안 항상 냉동 건조되고 냉각되어, 분자를 수송하고/하거나 저장하기 어렵게 만드는 것을 의미한다. 저장 문제는 약학적 제형이 병원 환경의 외부에서 저장되고 투약되어야 하는 경우에 특히 심각하다.
불안정한 단백질 분자의 저장 문제에 대한 소수의 실질적인 해법이 제안되어 왔다. 따라서, 바람직하게는 저장후 최소 조작을 요하는 간단한 제형으로 용이하게 투약되는, 단백성 치료 분자의 장기간 지속되는 안정화된 제형이 필요하다.
생체 투여시, 천연 상태 또는 재조합적으로 생성된 치료 단백질, 예를들어 인터페론 및 성장 호르몬은 혈류로부터의 신속한 제거에 의해 짧은 혈장 안정성을 나타낸다. 따라서, 상기 단백질에 의해 제공되는 치료 효과는 일시적이다. 따라서, 생체내에서의 요망되는 치료 효과를 유지하기 위해, 혈류로부터의 상기 단백질의 신속한 제거는 치료 분자가 보다 높은 용량으로 보다 빈번히 투여되어야 한다는 것을 의미한다. 그러나, 치료 단백질의 투여에 대해 용량 스케줄을 증가시키는 것은 종종 환자의 주입 부위 반응, 부작용, 및 독성을 증가시킨다. 유사하게, 치료 단백질의 보다 높은 용량의 투여는 또한 환자의 독성 및 부작용을 보통 증가시킨다.
*화학적 컨쥬게이션을 포함하는, 제안된 치료 분자의 혈장 안정성을 증가시키기 위한 소수의 실질적 해법은 환자에게 제한된 이익을 제공한다. 일반적으로, 대부분의 경우, 이들 화학적으로 변형된 치료 분자는 여전히 환자의 현저한 주입 부위 반응, 부작용, 및 독성을 보유하면서 빈번한 투여 스케줄로 투여된다. 따라서, 천연 또는 재조합적으로 생성된 치료 분자보다 생체내에서 보다 높은 혈장 안정성을 지니고, 덜 빈번하게 투여됨으로써 환자의 잠재적인 부작용을 감소시킬 수 있는 안정된 형태의 치료 분자가 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 알부민 또는 알부민의 단편(일부) 또는 변이체에 융합된 치료 단백질(예를들어, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 또는 이들의 단편 또는 변이체)를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 알부민 또는 알부민의 단편(일부) 또는 변이체에 융합된 치료 단백질(예를들어, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 또는 이들의 단편 또는 변이체)를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나, 이로 구성되는 폴리누클레오티드를 포함한다. 본 발명은 또한 치료 단백질의 저장 수명을 연장하고, 융합되지 않은 상태에 비해 치료 단백질의 혈장 안정성을 증가시키기고/거나 시험관내 및/또는 생체내에서 용액(또는 약학적 조성물)에서의 치료 단백질 및/또는 이의 활성을 안정화시키기에 충분한, 알부민 또는 알부민의 단편(일부) 또는 변이체에 융합된 치료 단백질(예를들어, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 또는 이들의 단편 또는 변이체)를 포함하는 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나, 이로 구성되는 폴리누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질이 또한 본 발명에 포함되고, 본 발명의 폴리누클레오티드로 형질전환된 숙주 세포, 및 본 발명의 폴리누클레오티드, 및/또는 숙주 세포를 이용하여 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는 방법이 포함된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 알부민 융합 단백질은 표 2에 기술된 것 및 상기 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 제형을 포함한다. 이러한 제형은 키트 또는 용기에 존재할 수 있다. 이러한 키트 또는 용기는 치료 단백질의 연장된 저장 수명에 관한 지시에 의해 패키징될 수 있다. 이러한 포뮬레이션은 환자에게 약학적 제형을 투여하는 단계를 포함하여, 환자, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간의 질병 또는 질병 증상을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키거나, 진단하는 방법에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 질병 또는 장애를 예방하거나, 치료하거나, 개선시키는 방법을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 질병 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기에 효과적인 양의 표 1의 "치료 단백질:X"(표 1의 "바람직한 적응증:Y" 단락에 나열된 치료되는 질병 또는 장애와 동일한 행)에 기술된 치료 단백질 또는 치료 단백질에 상응하는 일부(또는 이의 단편 또는 변이체)를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 치료, 예방 또는 개선이 요망되는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 표 1의 "바람직한 적응증:Y" 단락에 기술된 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
한 구체예에서, 표 1 또는 2에 기술된 알부민 융합 단백질은 연장된 저장 수명을 지닌다.
두번째 구체예에서, 표 1 또는 2에 기술된 알부민 융합 단백질은 표 1에 기술된 상응하는 융합되지 않은 치료 분자보다 안정한다.
본 발명은, 바람직하게는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현시키기 위해 변형된 본 발명의 핵산 분자(표 1 및 2에 기술된 폴리누클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않음)를 함유하도록 변형된 트랜스제닉 유기체를 추가로 포함한다.
도 1A-D는 인간 알부민의 성숙한 형태(SEQ ID NO:1) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열을 도시한다. SEQ ID NO:2의 1 내지 1755 누클레오티드는 인간 알부민의 성숙한 형태(SEQ ID NO:1)를 엔코딩한다.
*도 2는 pPPC0005 클로닝 벡터(ATCC 기탁된 PTA-3278)의 제한효소 지도를 도시한다.
도 3은 pSAC35 효모(S. cerevisiae) 발현 벡터(Sleep et al., BioTechnology 8:42(1990))의 제한효소 지도를 도시한다.
도 4는 ISRE-SEAP/293F 리포터 세포에서의 SEAP 활성에 대해 CID 2011 및 2053에 포함된 DNA에 의해 엔코딩된 IFNb 알부민 융합 단백질의 다양한 희석액의 효과를 도시한 것이다(실시예 76 참조). 단백질은 DMEM/10% FBS에서 5e-7 내지 1e-14 g/㎖로 연속적으로 희석되고, ISRE-SEAP/293F 리포터 세포를 치료하기 위해 사용된다. 24시간 후에, 리포터 세포로부터 상층액을 분리하고, SEAP 활성을 검정하였다. IFNb 알부민 융합 단백질을 세개의 안정된 클론 293F/#2011, CHO/#2011 및 NSO/#2053으로부터 정제하였다. 바이오젠(Biogen)사의 포유동물 유래 IFNb인 아보넥스(Avonex)는 2.0e5 IU/㎍의 특정 활성을 지니는 것으로 보고되었다.
도 5는 Hs294T 흑색종 세포에서의 CID 3165(CID 3165 단백질) 및 재조합 IFNa(rIFNa)에 의해 엔코딩된 IFN 알부민 융합 단백질의 항증식 활성을 비교한다. 세포를 다양한 농도의 CID 3165 단백질 또는 rIFNa으로 배양하였고, 배양후 3일째에 BrdU 혼합에 의해 증식을 측정하였다. CID 3165 단백질은 10 ng/㎖ 초과의 농도에서 세포 증식을 측정가능한 억제를 야기하였고, 약 200 ng/㎖에서 50% 억제가 달성되었다. (■)=CID 3165 단백질, (◆)=rIFNa.
도 6은 ISRE-SEAP/293F 리포터 세포에서의 SEAP 활성에 대해 IFNa 알부민 융합 단백질의 다양한 희석액의 효과를 도시한다. 알부민의 IFNa 융합된 업스트림의 하나의 제조물(◆) 뿐만 아니라, 알부민의 IFNa 융합된 다운스트림의 두개의 상이한 제조물(●) 및 (■)를 시험하였다.
도 7은 치료되는 원숭이의 OAS(p41)의 mRNA 수준에 대해 작제물 2249(CID 2249)에 포함된 DNA에 의해 엔코딩된 IFNa 융합 단백질의 시간 및 용량의 효과를 도시한다(실시예 78 참조). 시간 포인트 당: 첫번째 막대 = 비히클 대조군, 두번째 막대 = 1일(정맥내) 30 ㎍/㎏ CID 2249 단백질, 세번째 막대 = 1일(피하) 30 ㎍/㎏ CID 2249 단백질, 네번째 막대 = 1일(피하) 300 ㎍/㎏ CID 2249 단백질, 다섯번째 막대 = 1, 3 및 5일(피하) 40 ㎍/㎏ 재조합 IFNa.
도 8은 NPR-A/293F 리포터 세포에서의 활성화된 cGMP 형성에 대해 작제물 CID 3691 및 3618(CID 3691 및 3618 단백질)에 포함된 DNA에 의해 엔코딩된 BNP 알부민 융합 단백질의 용량-반응 관계를 도시한다(실시예 80 및 81 참조). 재조합 BNP(■) 뿐만 아니라, 알부민(□) 및 (●)의 BNP 융합된 업스트림의 두개의 상이한 제조물을 시험하였다.
도 9는 자발성 고혈압 래트의 평균 동맥압에 대한 BNP 알부민 융합 단백질의 효과를 도시한다(실시예 80 참조). 비히클(□), 재조합 BNP 단백질(●), 또는 BNP 알부민 융합 단백질(○)을 꼬리 정맥 주사를 통해 전달하였다. 수축 혈압 및 확장 혈압을 커프스(cuff)-꼬리 방법으로 기록하였다.
도 10은 재조합 BNP 단백질(●) 또는 BNP 알부민 융합 단백질(○)의 정맥내 주사후 11 내지 12주의 수컷 C57/BL6 마우스에서의 혈장 cGMP 수준을 도시한다(실시예 80 참조). 정맥내 주사후 여러 시간에서 수거된 꼬리 혈액으로부터 제조된 혈장으로부터 cGMP 수준을 결정하였다.
도 11은 탠덤 GLP-1(7-36A8G)2x-HSA 융합(CID 3610)(◇), 단량체 GLP-1(7-36A8G)-HSA 융합(△), 또는 HSA 단독(●)의 단일 투여 후 24시간 째에 단식된 ~8주의 당뇨병 db/db 마우스에서의 혈중 글로코오스 수준을 도시한다. 혈중 글루코오스 수준은 경구 글루코오스 내성 시험에 의해 측정하였다. 단식된 ~8주의 당뇨병 db/db 마우스로의 단일한 투여후 24시간 째에 탠덤 GLP-1(7-36A8G)2x-HSA 융합(CID 3610)(◇)은 예기치 않게 단량체 GLP-1(7-36A8G)-HSA 융합(△)보다 효능있는 글루코오스 정상화 활성을 지녔다.
상세한 설명
정의
본원을 통해 사용된 특정 용어의 이해를 돕기 위해 하기의 정의를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "폴리누클레오티드"는 구조 내에서 하나 이상의 치료 단백질 X(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합된 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자; SEQ ID NO:Y(표 2의 단락 6에 기술된 바와 같음)의 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자; SEQ ID NO:X에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자; SEQ ID NO:Z의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자; 표 2 또는 실시예에 기술된 바와 같이 생성된 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자; 본 발명의 치료 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자, 표 2에 기술된 알부민 융합 작제물에 함유된 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자, 또는 ATCC에 기탁된 알부민 융합 작제물(표 3에 기술된 바와 같음)에 포함된 누클레오티드 서열을 지니는 핵산 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "알부민 융합 작제물"은, 예를들어 (1) 기능적 자가-복제 벡터(셔틀 벡터, 발현 벡터, 통합 벡터, 및/또는 복제 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않음), (2) 전사 개시를 위한 영역(예를들어, 프로모터 영역, 예를들어 조절성 또는 유도성 프로모터, 항시성(constitutive) 프로모터), (3) 전사 종결을 위한 영역, (4) 선도 서열, 및 (5) 선별 마커와 같은 요소중 하나 이상을 추가로 포함하는, 구조 내에서 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드에 결합된 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자; 구조 내에서 표 2 또는 실시예에 기술된 바에 따라 생성된 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드에 결합된 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자; 또는 구조 내에서 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드에 결합된 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자를 의미한다.
본 발명은 일반적으로 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드; 알부민 융합 단백질; 및 알부민 융합 단백질 또는 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리펩티드를 이용하여 질환 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "알부민 융합 단백질"은 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자에 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자의 융합에 의해 형성된 단백질을 의미한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 유전학적 융합에 의해 서로 결합된, 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체 및 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함한다(즉, 알부민 융합 단백질은 치료 단백질의 모두 또는 일부를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 구조 내에서 알부민의 전부 또는 일부를 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 결합된 핵산의 전사에 의해 생성됨). 치료 단백질 및 알부민 단백질, 알부민 융합 단백질의 일부는 알부민 융합 단백질의 "일부", "영역" 또는 "부분"으로 언급될 수 있다(예를들어, "치료 단백질 일부" 또는 "알부민 단백질 일부"). 매우 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료 단백질 X의 또는 이의 단편 또는 변이체(치료 단백질 X의 성숙한 형태를 포함하나 이에 제한되지 않음)의 하나 이상의 분자 및 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체(알부민의 성숙한 형태를 포함하나 이에 제한되지 않음)를 포함한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 숙주 세포에 의해 가공되고, 주위 배양 배지로 분비된다. 발현을 위해 사용된 숙주의 분비 경로에서 발생하는 미성숙한 알부민 융합 단백질의 가공은 신호 펩티드 절단; 이황화 결합의 형성; 적절한 폴딩; 탄수화물의 첨가 및 가공(예를들어, N- 및 O-형 당화); 특이적 단백분해 절단; 및 중합체 단백질로의 어셈블리를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 바람직하게는 가공된 형태이다. 대부분의 바람직한 구체예에서, "알부민 융합 단백질의 가공된 형태"는 N-말단 신호 펩티드 절단을 겪은 알부민 융합 단백질을 의미하고, 본원에서는 "성숙한 알부민 융합 단백질"을 또한 의미한다.
여러 예에서, 본 발명의 알부민 융합 작제물을 함유하는 대표적 클론은 미국 미생물 보존센터(본원에서는 "ATCC?"로 언급됨)에 기탁되어 있다. 더욱이, 당 분야에 공지되고 본원의 다른 곳에 기술된 기술에 의해 기탁소로부터 제공된 알부민 융합 작제물을 회복시키는 것이 가능하다. ATCC?은 미합중국 20110-2209 버지니아주, 머내서스, 유니버시티 불러바드 10801(10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA)에 위치하고 있다. ATCC? 기탁은 특허 절차의 목적상 미생물의 기탁의 국제적 승인에 대한 부타페스트 조약에 따라 이루어진다.
한 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 표 2에 기술된 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열이 표 2의 SEQ ID NO:Y로 나타낸 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 융합 단백질의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 혈청 알부민 단백질 성분은 혈청 알부민의 성숙한 일부이다. 본 발명은 추가로 이들 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질, 및 혈청 알부민의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질, 및 혈청 알부민의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 추가의 바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분은 치료 단백질의 세포외 가용성 도메인이다. 본 발명은 추가로 이들 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편 또는 변이체, 및 혈청 알부민의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질의 성숙한 일부 및 혈청 알부민의 성숙한 일부를 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 이들 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 추가로 포함한다.
치료 단백질
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 폴리누클레오티드는 ,바람직하게는 유전학적 융합에 의해 서로 결합되는 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체, 및 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 단백질을 엔코딩한다.
추가의 구체예는 화학적 컨쥬게이션에 의해 서로 연결된 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체, 및 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 단백질"은 하나 이상의 치료적 및/또는 생물학적 활성을 지니는 단백질, 폴리펩티드, 항체, 펩티드 또는 이들의 단편 또는 변이체를 의미한다. 본 발명에 의해 포함되는 치료 단백질은 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 및 생물제제를 포함하나 이에 제한되지 않는다(용어 펩티드, 단백질, 및 폴리펩티드는 본원에서 상호교화적으로 사용됨). 특히, 용어 "치료 단백질"은 항체 및 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명의 단백질은 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체, 및/또는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 함유할 수 있다. 추가로, 용어 "치료 단백질"은 치료 단백질의 내생적으로 또는 자연적으로 발생하는 관련물을 의미할 수 있다.
"치료 활성"을 나타내는 폴리펩티드 또는 "치료적으로 활성"인 단백질은 치료 단백질, 예를들어 본원에 기술되거나 당 분야에 달리 공지된 치료 단백질중 하나 이상과 관련하여 하나 이상의 공지된 생물학적 및/또는 치료적 활성을 지니는 폴리펩티드를 의미한다. 비제한적 예로서, "치료 단백질"은 질병, 질환 또는 자애를 치료하거나, 예방하거나, 개선시키는데 유용한 단백질이다. 비제한적인 예로서, "치료 단백질"은 특정 세포 유형(정상(예를들어, 림프구) 또는 비정상(예를들어, 암세포))에 특이적으로 결합함으로써, 특이적 세포 유형으로 화합물(약물, 또는 세포독성제)를 표적화하는데 사용될 수 있는 단백질이다.
예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 포함될 수 있는 "치료 단백질" 부분의 완전하지 않은 목록은 GLP-1, GLP-2, PACAP-27, PACAP-28, VIP, CD4M33, 세크레틴, 글리센틴, 옥신노모듈린, PHM, IFNα, IFNβ, ANP, BNP, NGF, BDNF, GDNF, 및 소마토스타틴을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
인터페론 하이브리드가 또한 알부민의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합되어 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질을 형성할 수 있다. 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질은 인터페론 활성, 예를들어 항바이러스 반응, 세포 성장의 조절, 및 면역 반응의 조절을 향상시키거나 억제할 수 있다(Lebleu et al., PNAS USA, 73:3107-3111 (1976); Gresser et al., Nature, 251:543-545 (1974); and Johnson, Texas Reports Biol Med, 35:357-369 (1977)). 각각의 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질이 바이러스 감염(예를들어, 간염(예를들어, HCV); 또는 HIV), 다발성 경화증, 또는 암을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 인터페론 하이브리드 부분은 인터페론 알파-인터페론 알파 하이브리드(본원에서는 알파-알파 하이브리드로 언급됨)를 포함한다. 예를들어, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 알파-알파 하이브리드 부분은 인터페론 알파 D에 융합된 인터페론 알파 A로 구성되거나 이를 포함한다. 추가의 구체예에서, A/D 하이브리드는 인터페론 알파 D에 대해 일반적인 BgⅢ 제한 부위에서 융합되고, 여기서 A/D 하이브리드의 N-말단 부분은 인터페론 알파 A의 아미노산 1-62에 해당하고, C-말단 부분은 인터페론 알파 D의 아미노산 64-166에 해당한다. 예를들어, 이러한 A/D 하이브리드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112012047901064-pat00001
여기서, X1은 R 또는 K이고, X2는 A 또는 V이다(예를들어, 작제물 ID #2875 참조). 추가의 구체예에서, A/D 하이브리드는 PvuⅢ 제한 부위에서 융합되고, 여기서 A/D 하이브리드의 N-말단 부분은 인터페론 알파 A의 아미노산 1-91에 해당하고, C-말단 부분은 인터페론 알파 D의 아미노산 93-166에 해당한다. 예를들어, 이러한 A/D 하이브리드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112012047901064-pat00002
여기서, X1은 R 또는 K이고, 두번째 X2는 A 또는 V이다(예를들어, 작제물 ID #2872 참조). 이러한 하이브리드는 전체 내용이 본원에 포함된 미국 특허 제 4,414,510호에 추가로 기술되어 있다.
추가의 구체예에서, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 알파-알파 하이브리드 부분은 인터페론 알파 F에 융합된 인터페론 알파 A로 구성되거나 이를 포함한다. 추가의 구체예에서, A/F 하이브리드는 일반적인 PvuⅢ 제한 부위에서 융합되고, 여기서 A/F 하이브리드의 N-말단은 인터페론 알파 A의 아미노산 1-91에 해당하고, C-말단 부분은 인터페론 알파 F의 아미노산 93-166에 해당한다. 예를들어, 이러한 A/F 하이브리드는 하기와 같은 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112012047901064-pat00003
여기서, X는 R 또는 K이다(예를들어, 작제물 ID #2874 참조). 이러한 하이브리드는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제 4,414,510호에 추가로 기술되어 있다. 추가의 구체예에서, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 알파-알파 하이브리드 부분은 인터페론 알파 B에 융합된 인터페론 알파 A로 구성되거나 이를 포함한다. 추가의 구체예에서, A/B 하이브리드는 일반적인 PvuⅢ 제한 부위에서 융합되고, 여기서 A/B 하이브리드의 N-말단 부분은 인터페론 알파 A의 아미노산 1-91에 해당하고, C-말단 부분은 인터페론 알파 B의 아미노산 93-166에 해당한다. 예를들어, A/B 하이브리드는 하기의 아미노산 서열을 지닌다:
Figure 112012047901064-pat00004
여기서, X는 R 또는 K이고, X2 내지 X5는 SCVM 또는 VLCD이다(예를들어, 작제물 ID #2873 참조). 이러한 하이브리드는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제 4,414,510호에 추가로 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 인터페론 하이브리드 부분은 인터페론 베타-인터페론 알파 하이브리드(본원에서는 베타-알파 하이브리드로 언급됨)를 포함한다. 예를들어, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 베타-알파 하이브리드 부분은 인터페론 알파 D(인터페론 알파-1으로도 언급됨)에 융합된 인터페론 베타-1으로 구성되거나 이를 포함한다. 추가의 구체예에서, 베타-1/알파 D 하이브리드가 융합되고, 여기서 N-말단 부분은 인터페론 베타-1의 아미노산 1-73에 해당하고, C-말단 부분은 인터페론 알파 D의 아미노산 74-167에 해당한다. 예를들어, 이러한 베타-1/알파 D 하이브리드는 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure 112012047901064-pat00005
여기서, X는 A 또는 V이다. 이러한 하이브리드는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제 4,758,428호에 추가로 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 인터페론 하이브리드 부분은 인터페론 알파-인터페론 베타 하이브리드(본원에서는 알파-베타 하이브리드로 언급됨)를 포함한다. 예를들어, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 알파-베타 하이브리드 부분은 인터페론 베타-1에 융합된 인터페론 알파 D(인터페론 알파-1으로도 언급됨)로 구성되거나 이를 포함한다. 추가의 구체예에서, 알파 D/베타-1 하이브리드가 융합되고, 여기서 N-말단 부분은 인터페론 알파 D의 아미노산 1-73에 해당하고, C-말단 부분은 인터페론 베타-1의 아미노산 74-166에 해당한다. 예를들어, 알파 D/베타-1 하이브리드는 하기의 아미노산 서열을 지닌다:
Figure 112012047901064-pat00006
이러한 하이브리드는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제 4,758,428호에 기술되어 있다.
추가의 구체예에서, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 인터페론 하이브리드 부분은 알파-알파 인터페론 하이브리드, 알파-베타 인터페론 하이브리드, 및 베타-베타 인터페론 하이브리드의 추가의 조합을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질의 인터페론 하이브리드 부분은 인터페론 하이브리드의 아미노산 서열에 대한 돌연변이, 치환, 결실 또는 첨가를 포함하여 변형될 수 있다. 예를들어, 생산 수준을 개선시키거나, 안정성을 증가시키거나, 활성을 증가 또는 감소시키거나, 새로운 생물학적 특성을 수여하기 위해 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질에 대한 이러한 변형이 이루어질 수 있다.
상기 기술된 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질은 본 발명에 의해 포함되고, 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하는 숙주 세포 및 벡터도 포함된다. 한 구체예에서, 상기 기술된 바와 같은 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질은 연장된 저장 수명을 지닌다. 추가의 구체예에서, 상기 기술된 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 인터페론 하이브리드 알부민 융합 단백질은 상응하는 융합되지 않은 인터페론 하이브리드 분자보다 시험관내 및/또는 생체내에서 보다 긴 혈청 반감기 및/또는 용액(또는 약학적 조성물)에서의 보다 안정된 활성을 지닌다.
또 다른 비제한적인 예에서, "치료 단백질"은 생물학적 활성, 특히 질병의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 활성을 지니는 단백질이다. 치료 단백질이 지닐 수 있는 생물학적 활성의 비제한적인 목록은 세포의 HIV-1 감염의 억제, 장 상피 세포 증식의 자극, 장 상피 세포 투과의 감소, 인슐린 분비 자극, 기관지 확장 및 혈관확장의 유도, 알도스테론 및 레닌 분비의 억제, 혈압 조절, 신경 성장 촉진, 면역 반응 향상, 염증반응 향상, 식욕의 억제, 또는 하기의 "생물학적 활성" 단락 및/또는 표1의 소정의 치료 단백질(컬럼 2)에 기술된 생물학적 활성중 하나를 포함한다.
한 구체예에서, IFN-베타-HSA 융합체는 에볼라 바이러스 및 SARS 바이러스(토론토-2 균주)의 활성을 억제하는데 사용된다. 예를들어, 성숙된 HSA (CID 2053 단백질)의 업스트립과 융합된 IFN-베타의 시험관내 항바이러스 활성을 베로(Vero) 세포에서의 에볼라 바이러스 및 SARS 바이러스에 대해 평가하였다. 이들 세포는 세포병변효과(CPE) 및 세포 생활력의 뉴트럴 레드 검정에 기초한 CID 2053 단백질의 보호 효과를 평가하는데 사용된다. 시험관내 신호 전달은 유전자 발현의 분석에 의해 평가된다. 또한, CID 2053 단백질의 약동학 및 약역학을 레서스 멍키에서 평가하였다. 상기 결과는 바람직한 안전 지수와 함께 효능있는 시험관내 항바이러스 활성이 달성되었음을 나타낸다. CID 2053 단백질에 대한 IC50은 에볼라에 대해 0.4 ng/ml이고 SARS 바이러스에 대해 5 ng/ml이었다. 어레이 분석은 CID 2053 단백질 및 IFN-베타가 유전자의 유사한 세트를 발현시키고, IFN-자극된 반응 요소 (ISRE) 신호 전달 경로를 트리거링(triggering)시키는 것을 나타내었다. 레서스 멍키에서 50 ug/kg(정맥내 또는 피하) 또는 300 ug/kg(피하) 용량의 CID 2053 단백질을 투여하였고, 말기 반감기는 36 내지 40시간이었다. CID 2053 단백질의 투여는 혈청 네오프테린 수준 및 OASI mRNA 발현의 지속적인 증가를 유도하였다.
추가의 구체예에서, IFN-베타-HSA 융합체는 카테고리 A-필로(Filo)(Ebola), 아레나(Arena)(Pichende), 카테고리 B-토가(Toga)(VEE) 또는 카테고리 C-분야(Bunya)(Punto toro), 플라비(Flavi)(Yellow fever, West Nile)로 분류된 바이러스 억제제에 사용된다. 예를들어, HSA의 다운스트림에 융합된 IFN-알파(CID 3165 단백질)의 항바이러스 활성을 평가하기 위해 CPE 억제, 뉴트럴 레드 염색 및 바이러스 수득률 검정을 사용하였다. 시노몰구스(cynomolgus) 멍키 및 인간 피검체에서 CID 3165 단백질의 약동학 및 약역학을 평가하였다. 상기 결과는 바람직한 안전 지수와 함께 모든 RNA 바이러스에 대해 항바이러스 활성이 달성되었음을 나타낸다. CPE 검정에서 IC50 값은 <0.1 ng/ml (Punta Toro A) 내지 19 ng/ml (VEE)이었다. 시노몰구스 멍키에서, CID 3165 단백질의 반감기는 90시간이었고, 투여후 14일까지 검출가능하였다. 인간 피검체에서, CID 3165 단백질은 안전하고, 매우 내약성이 있다. 단일 주사 투여 후의 Cmax는 용량 비례적이었다. 500 ug 코호트에서의 평균 Cmax는 22 ng/ml이었고, 평균 t1 /2는 150시간이었다. 2 내지 4주에 한번 또는 그 이상의 투여는 약동학에 의해 지지된다. C형 간염에 대한 항바이러스 반응은 단일 주사 코호트(120-500 ug)의 피검체 대부분에서 관찰되었다.
추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 만성 C형 간염 감염(HCV)를 지닌 환자를 치료하는데 사용된다. 백혈구 인페론으로도 공지된 인터페론 알파는 HCV에 감염된 환자의 치료를 위한 치료 표준물질이다. 용어 "인터페론 알파"는 항바이러스 활성을 지닌 고도로 상동한 관련 폴리펩티드족을 의미한다. IFN-알파-HSA 융합체의 인터페론 알파 부분은 당 분야에 공지된 임의의 인터페론 알파 또는 이의 단편으로 구성되거나 이를 포함한다. 본 발명에 포함되는 인터페론 알파의 비제한적인 예는 표 1의 치료 단백질 컬럼에 기술된 인터페론 알파 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 인터페론 알파 부분은 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2c, 콘센서스(consensus) 인터페론, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파-n1, 인터페론 알파-n3, 임의의 시판되는 형태의 인터페론 알파, 예를들어 INTRON?A (Schering Corp., Kenilworth, N.J.), ROFERON?A (Hoffman-La Roche, Nutley, N.J.), 베로포르 알파 인터페론(Berofor alpha inteferon, Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefied, Conn.), OMNIFERONTM(Viragen, Inc., Plantation, FL), MULTIFERONTM(Viragen, Inc., Plantation, FL), WELLFERON?(GlaxoSmithKline, London, Great Britian), INFERGEN?(Amgen, Inc., Thousands Oaks, CA), SUMIFERON?(Sumitomo, Japan), BELEROFON?(Nautilus Biotech, France) 또는 임의의 정제된 인터페론 알파 제품 또는 이의 단편으로 구성되거나 이들을 포함한다. 추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합 단백질의 인터페론 알파 부분은 화학 부분의 부착에 의해 변형될 수 있다. 예를들어, 인터페론 알파 부분은 페길레이션(pegylation)에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합 단백질의 인터페론 알파 부분은 인터페론 알파-2a, 2b, 또는 콘센서스 인터페론의 페길화된 형태로 구성되거나 이들을 포함하고, 시판되는 페길화된 인터페론 알파, 예를들어 PEG-INTRON?(Schering Corp., Kenilworth, N.J.), PEGASYS?(Hoffman-La Roche, Nutley, N.J.), PEG-OMNIFERONTM (Viragen, Inc., Plantation, FL) 또는 이들의 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, "IFN-알파-HSA" 융합체는 당 분야에 공지된 임의의 인터페론 알파 단백질 또는 이의 단편에 융합된 HSA를 의미한다.
HCV로 감염된 환자는 HCV 감염의 치료를 위한 인터페론 요법에 대한 사전의 노출에 기초한 두개의 카테고리 내에 해당될 수 있다. "미경험 환자"는 인터페론 요법으로 치료된 적이 없는 환자이다. "경험 환자"는 인터페론 요법으로 치료된 적이 있거나 치료되고 있는 환자이다. "미반응자"는 인터페론 요법으로 기존에 치료되었으나 치료의 제1차 종료점, 예를들어 조기 바이러스 부하 감소(EVR) 또는 치료 종료 반응(ETR)을 충족시키는데 실패한 경험 환자이다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, "HCV 환자"는 HCV에 감염되고, 미경험, 경험 또는 미반응 환자를 의미한다.
또한, C형 간염 바이러스는 네개의 유전형, 즉 유전형 1, 2, 3 또는 4로 분류될 수 있다. 일반적으로, HCV 환자를 감염시키는 C형 간염 바이러스는 단일한 유전형을 포함한다. 그러나, 간염 바이러스는 두개 이상의 유전형의 조합을 포함할 수 있다. 게다가, C형 간염 바이러스의 유전형은 또한 공지된 HCV 유전형중 하나의 변이체일 수 있다. 추가의 구체예에서, HCV 환자의 C형 간염 바이러스는 유전형 1 또는 이의 변이체이다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, "HCV"는 임의의 유전형의 C형 간염 바이러스 또는 이의 조합물 또는 변이체를 의미한다.
HCV를 지닌 환자를 위한 표준 치료 요법은 항바이러스제, 예를들어 리바비린(ribavirin)과 조합된 인터페론 알파를 이용한 치료를 포함한다. 일반적으로, 인터페론 알파는 매일, 1주일에 2회, 또는 매주 투여되고, 라바비린은 매일 투여된다. 그러나, 최근의 연구는 또한 HCV의 치료를 위해 인터페론 알파와 기타 항바이러스제가 조합되어 사용된다. 따라서, 추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 단독으로 또는 항바이러스제, 예를들어 리바비린과 조합되어 HCV 환자에게 투여될 수 있다.
상기 기술되 바와 같이, CID 3165 단백질의 약동학은 2 내지 4주에 1회 또는 그 이상의 투여 스케줄을 지지한다. 따라서, 추가의 구체예에서, HCV 환자는 2 내지 4주에 1회로 IFN-알파-HSA 융합체 단독 또는 유효한 양의 항바이러스제와의 조합물로 투여됨으로써 치료된다. 바람직한 구체예에서, HCV 환자는 2 내지 4주에 1회로 IFN-알파-HSA 융합체와 유효한 양의 항바이러스제와의 조합물로 투여됨으로써 치료된다. 추가의 바람직한 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 4주에 1회 HCV 환자에게 투여된다. 추가의 바람직한 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 4주에 1회 이상으로 HCV 환자에게 투여된다. 추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 4주에 1회 또는 그 이상으로 HCV 환자에게 투여되고, 상기 치료는 또한 유효한 양의 항바이러스제의 투여를 포함한다.
또 다른 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 HCV 요법의 유지를 위한 저용량 단독요법으로 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 HCV의 치료를 위해 리바비린 및 하나 이상의 기타 항바이러스제와의 조합으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 HCV의 치료를 위해 리바비린인 아닌 하나 이상의 항바이러스제와의 조합으로 사용될 수 있다.
추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 기타 바이러스 감염의 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를들어, 한 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 B형 간염(HBV)의 치료를 위해 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 인체 유두종 바이러스(HPV)의 치료를 위해 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, IFN-알파-HSA 융합체는 모발상세포 백혈병, 악성흑색종, 소포림프종, 만성 골수백혈병, 카포시 육종과 관련된 AIDS, 다발골수종, 또는 신세포암을 포함하나 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, GLP-1-HSA 융합체는 당뇨병 환자의 혈중 글루코오스 수준을 조절하기 위해 사용된다. 추가의 구체예에서, 야생형 또는 돌연변이 GLP-1의 탠덤(tandem) 융합체는 백혈병 환자의 혈중 글루코오스 수준을 조절하기 위해 사용된다. 예를들어, 혈중 글루코오스 수준을 조절하기 위한 단량체 GLP-1(7-36A8G)-HSA 및 탠덤 GLP-1(7-36A8G)-HSA (CID 3610) 융합체의 능력은 8주된 당뇨병 db/db 마우스에서 GLP-1-HSA 단백질의 피하 주사 후, 경구 글루코오스 내성 시험(경구 위관 영양법에 의한 1 g 글루코오스/kg)을 이용하여 평가되었다. 이러한 글루코오스 내성 시험은 GLP-1-HSA 융합체의 피하 주사 후 경구 위관 영양법에 의해 kg당 1 g의 글루코오스를 투여함으로써 이루어진다. 절식된 당뇨병 db/db 마우스에 단량체 또는 탠덤 GLP-1-HSA 융합체의 당몰 용량(100 및 171 nmol/kg)으로 투여되고, 경구 글루코오스 내성 시험은 단일 투여 후 6 또는 24시간째에 수행된다. 매우 놀랍고 예상치 않게, 탠덤 GLP-1(7-36A8G)-HSA 융합체(CID 3610)은 단량체 GLP-1(7-36A8G)-HSA 융합체와 비교하는 경우 투여후 6시간 째에 혈중 글루코오스를 감소시켰다. 또한, 단량체 GLP-1(7-36A8G)-HSA와 탠덤 GLP-1(7-36A8G)-HSA (CID 3610) 융합체 사이의 차이는 당뇨병 db/db 마우스가 주사후 24시간 째에 투여되는 경우 더욱 극적이었다. 도 Ⅱ에 나타난 바와 같이, 탠덤 GLP-1(7-36A8G)-HSA 융합체(CID 3610)(◇)는 예기치 않은 효능있는 글루코오스-정상화 활성을 함유한 반면, 단일 GLP-1(7-36A8G)-HSA(△) 융합체에 대한 단식 혈중 글루코오스 수준은 HSA 단독(●)으로 투여되고 사실상 명백하게 당뇨병인 동물과 유사하였다.
본원에서 사용되는 "치료 활성" 또는 "활성"은 효과가 인간의 요망되는 치료 결과와 일치하는 활성, 또는 비인간 포유동물 또는 기타 종 또는 유기체의 요망되는 효과를 의미할 수 있다. 치료 활성은 생체내 또는 시험관내에서 측정될 수 있다. 예를들어, 요망되는 효과는 세포 배양물에서 검정될 수 있다. 이러한 시험관내 또는 세포 배양 검정은 당 분야에 기술된 바와 같이 다수의 치료 단백질에 대해 통상적으로 이용가능하다. 검정의 예는 본원의 실시예 부분 또는 표 1의 "예시적 활성 검정" 컬럼(컬럼 3)에 기술된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분, 예를들어 세포 표면 및 분비 단백질에 해당하는 치료 단백질은 하나 이상의 올리고당 그룹의 부착에 의해 종종 변형된다. 당화로 언급되는 변형은 단백질의 물리적 특성에 극적으로 영향을 줄 수 있고, 단백질 안정성, 분비 및 국소화에 중요할 수 있다. 당화는 폴리펩티드 백본을 따라 특정 위치에서 발생한다. 보통, 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착되는 O-형 올리고당으로 특징되는 당화; 및 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열에 위치한 아라파라긴 잔기에 부착되는 N-형 올리고당으로 특징되는 당화의 두개의 주요한 유형의 당화가 있고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. N-아세틸뉴라민산(시알산으로도 공지됨)은 보통 N-형 및 O-형 올리고당 둘 모두의 말단 잔기이다. 단백질 구조 및 세포 유형과 같은 변수는 다양한 당화 부위에서의 사슬 내의 탄수화물 단위의 수 및 특성에 영향을 준다. 당화 이성질체는 또한 소정의 세포 유형 내의 동일한 부위에서 일반적이다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질, 및 이의 유사체 및 변이체는 이들이 발현되는 숙주 세포에 의하거나, 이들의 발현의 기타 상태로 인해, 하나 이상의 부위에서의 당화가 이들의 핵산 서열의 조작의 결과로서 변경되어 변형될 수 있다.
예를들어, 당화 이성질체는, 예를들어 아미노산 잔기의 치환 및 결실, 예를들어 아스파라긴에 대한 글루타민의 치환에 의해 당화 부위를 제거하거나 도입시킴으로써 생성될 수 있거나, 당화되지 않은 재조합 단백질은 이들을 당화시키지 않는 숙주 세포, 예를들어 대장균 또는 당화-결핍 효모에서 단백질을 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 이들 방법은 하기에 보다 상세히 기술되어 있고, 당 분야에 공지되어 있다.
치료 단백질, 특히 표 1에 기술된 치료 단백질, 및 이들의 핵산 및 아미노산 서열은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 화학약품 초록 서비스 데이터베이시즈(Chemical Abstracts Services Databases)(예를들어, CAS 레지스트리), 유전자은행(GenBank)과 같은 공개 데이터베이트, 및 데이터베이스에 제공된 서브스크립션(subscription), 예를들어 GenSeq(예를들어, Derwent)에서 이용가능하다. 본 발명의 폴리누클레오티드를 유도하기 위해 사용될 수 있는 치료 단백질의 예시적 누클레오티드 서열은 표 2의 컬럼 7의 "SEQ ID NO:X"에 제시되어 있다. SEQ ID NO:X으로 나타낸 서열은 소정의 치료 단백질을 엔코딩하는 야생형 폴리누클레오티드 서열(예를들어, 전장 또는 성숙)이거나, 몇몇 예에서 상기 서열은 야생형 폴리누클레오티드 서열의 변이체(예를들어, 야생형 치료 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드(여기서, 폴리누클레오티드의 DNA 서열은, 예를들어 특정 종에서의 발현에 최적화되었음); 야생형 치료 단백질의 변이체(즉, 부위 특이적 돌연변이; 대립 돌연변이)를 엔코딩하는 폴리누클레오티드)일 수 있다. 동렬에 기술된 작제물을 유도하기 위해 SEQ ID NO:X로서 나타낸 서열을 사용하는 것은 당업자의 능력에 포함된다. 예를들어, SEQ ID NO:X가 전장의 단백질에 해당하나, 상기 단백질의 일부만이 특정 CD를 생성시키기 위해 사용되는 경우, 특정 단편을 증폭시키기 위해 분자 생물학적 기술, 예를들어 PCR을 이용하고, 적절한 벡터로 이를 클로닝시키는 것은 당업자의 기술내에 해당한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 일부에 해당하는 추가의 치료 단백질은 표 1의 "치료 단백질 X" 컬럼(컬럼 1)에 기술된 치료 단백질 또는 펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체중 하나를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
표 1은 본 발명의 알부민 융합 단백질, 또는 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 일부에 해당하는 치료 단백질의 비제한적인 목록을 제공한다. 첫번째 컬럼의 "치료 단백질 X"는 치료 단백질 분자 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 단백질의 학명 및 상표명을 함유하는 삽입구의 뒤에 올 수 있는 치료 단백질 분자를 기술한다. 본원에서 사용되는 "치료 단백질 X"는 개별적 치료 단백질 분자를 의미하거나, 본 컬럼에 기술된 소정의 치료 단백질 분자와 관련된 치료 단백질의 전체 그룹을 의미할 수 있다. "생물학적 활성" 컬럼(컬럼 2)은 치료 단백질 분자와 관련된 생물학적 활성을 기술한다. 컬럼 3의 "예시적 활성 검정"은 치료 다백질:X 또는 치료 단백질 X(또는 이의 단편) 부분을 포함하는 알부민 융합 단백질의 치료적 및/또는 생물학적 활성을 시험하기 위해 사용될 수 있는 검정을 기술하는 참조를 제공한다. "예시적 활성 검정" 컬럼에 인용된 각각의 참조는, 특히 표 1의 "생물학적 활성"에 기술된 생물학적 활성을 검정하기 위한 참조(예를들어, 본원의 방법 섹션)에 기술된 각각의 활성 검정의 기술에 대해서, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되어 있다. 네번째 컬럼 "바람직한 적응증:Y"는 치료 단백질 X 또는 치료 단백질 X(또는 이의 단편) 부분을 포함하는 알부민 융합 단백질에 의해 치료, 예방, 진단, 및/또는 개
선될 수 있는 질병, 장애, 및/또는 질환을 기술한다. "작제물 ID" 컬럼(컬럼 5)은 참조된 치료 단백질 X(또는 이의 단편) 부분을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 표 2에 기술된 예시적 알부민 융합 작제물에 대한 링크를 제공한다.
[표 1]
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[표 2]
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표 2는 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는 본 발명의 폴리누클레오티드의 비제한적인 목록을 제공한다. 첫번째 컬럼인 "융합 번호"는 각각의 폴리누클레오티드에 대한 융합 번호를 제공한다. 컬럼 2인 "작제물 ID"는 본 발명의 각각의 폴리누클레오티드에 대한 독특한 수의 식별자를 제공한다. 작제물 ID는 표 1의 해당하는 열에 나열된 소정의 치료 단백질:X에 해당하는 치료 단백질 부분을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 확인하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 작제물 ID는 컬럼 5에 제시된다. "작제물명" 컬럼(컬럼 3)은 소정의 알부민 융합 작제물 또는 폴리누클레오티드를 제공한다.
표 2의 네번째 컬럼인 "기재사항"은 소정의 알부민 융합 작제물의 일반적 기재사항을 제공하고, 다섯번째 컬럼인 "발현 벡터"는 소정의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는 폴리누클레오티드가 클로닝되는 벡터를 기술한다. 벡터는 당 분야에 공지되어 있고, 시판되거나 다른 곳에 기술되어 있다. 예를들어, 실시예에 기술된 바와 같이, (1) 소정의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드, (2) 선도 서열, (3) 프로모터 영역, 및 (4) 전사 종결자중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성되는 "발현 카세트"는 편리한 클로닝 벡터로 어셈블링된 후, 예를들어 효모 발현 벡터 또는 포유동물 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터와 같은 대안적 벡터로 이동될 수 있다.
한 구체예에서, 효모(S.cervisiae)에서의 발현을 위해, 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는 발현 카세트를 pSAC35로 클로닝된다. 또 다른 구체예에서, CHO 세포에서의 발현을 위해, 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는 발현 카세트가 pC4로 클로닝된다. 추가의 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는 폴리누클레오티드는 pC4:HSA로 클로닝된다. 추가의 구체예에서, NS0 세포에서의 발현을 위해, 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는 발현 카세트는 pEE12로 클로닝된다. 기타 유용한 클로닝 및/또는 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 본 발명의 범위내에 속한다.
컬럼 6의 "SEQ ID NO:Y"은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 전장 아미노산 서열을 제공한다. 대부분의 예에서, SEQ ID NO:Y는 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 가공되지 않은 형태를 나타내는데, 다시 말하면 SEQ ID NO:Y는 신호 서열, HSA 부분, 및 특정 작제물에 의해 엔코딩되는 모든 치료 부분을 나타낸다. 본 발명에 의해 특히 고려되는 것은 SEQ ID NO:Y를 엔코딩하는 모든 폴리누클레오티드이다. 이들 폴리누클레오티드가 세포로부터 엔코딩된 단백질을 발현시키는데 사용되는 경우, 세포의 자연 분비 및 가공 단계는 표 2의 컬럼 4 및/또는 11에 나열된 신호 서열이 결여된 단백질을 생성시킨다. 나열된 신호 서열의 특정 아미노산 서열은 본 발명의 명세서에 후에 제시되거나 당 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 가장 바람직한 구체예는 세포(표 2의 컬럼 4 및/또는 11에 제시된 선도 서열이 결핍된 세포)에 의해 생성된 알부민 융합 단백질을 포함한다. 또한, 가장 바람직한 것은 표 2의 컬럼 4 및/또는 11에 나열된 특정 선도 서열이 없는 SEQ ID NO:Y를 포함하는 폴리펩티드이다. 약학적 조성물을 포함하는, 이러한 두개의 바람직한 구체예를 포함하는 조성물이 또한 바람직하다. 더욱이, 가공된 알부민 융합 단백질의 분비를 촉진시키기 위해 2의 컬럼 4 및/또는 11에 나열된 신호 서열을 본 명세서에 후에 기술되는 것과 같은 다양한 신호 서열로 대체하는 것은 당업자의 능력에 속한다.
일곱번째 컬럼 "SEQ ID NO:X"는 소정의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 유래될 수 있는 선조 핵산 서열을 제공한다. 한 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 유도될 수 있는 선조 핵산 서열은 표 1의 치료 단백질을 엔코딩하는 야생형 유전자 서열을 포함한다. 대안적 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 유도될 수 있는 선조 핵산 서열은 표 1에 도시된 치료 단백질을 엔코딩하는 야생형 유전자 서열의 변이체 또는 유도체, 예를들어 치료 단백질을 엔코딩하는 야생형 유전자 서열의 합성 코돈 최적화된 변이체를 포함한다.
여덟번째 컬럼 "SEQ ID NO:Z"는 선조 핵산 서열(SEQ ID NO:X)의 예상 전사를 제공한다. 이러한 선조 서열은 특정 작제물 선조 단백질의 성숙한 부분, 야생형 단백질의 변이체 또는 단편, 또는 기술된 작제물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 인공 서열을 유도하기 위해 사용되는 전장의 선조 단백질일 수 있다. 당업자는 소정의 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 아미노산 잔기가 치료 단백질에 의해 제공되었는지 결정하기 위해 SEQ ID NO:Z에 도시된 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 더욱이, 동렬에 기술된 작제물을 유도하기 위해 SEQ ID NO:Z에 도시된 서열을 사용하는 것은 당업자의 능력에 속한다. 예를들어, SEQ ID NO:Z가 전장의 단백질에 해당하나 단백질의 일부만이 특정 CID 생성시키기 위해 사용되는 경우, 특정 단편을 증폭시키기 위해 분자 생물학적 기술, 예를들어 PCR을 이용하고, 적절한 벡터로 이를 클로닝시키는 것은 당업자의 기술에 속한다.
컬럼 9 및 10에 각각 제공된 증폭 프라이머인 "SEQ ID NO:A" 및 "SEQ ID NO:B"는 소정의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이로 구성되는 폴리누클레오티드를 생성하기 위해 사용되는 예시적 프라이머이다. 본 발명의 한 구체예에서, 컬럼 9 및/또는 10(SEQ ID NOS:A 및/또는 B)에 도시된 서열을 지니는 올리고누클레오티드 프라이머는 주형 DNA로서 상응하는 열의 컬럼 7에 제공된 누클레오티드 서열(SEQ ID NO:X)을 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자를 이용하여 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 PCR 증폭시키기 위해 사용된다. PCR 방법은 당 분야에 잘 확립되어 있다. 추가의 유용한 프라이머 서열은 당업자에 의해 용이하게 구상되고 이용될 수 있다.
대안적 구체예에서, 올리고누클레오티드 프라이머는 주형 DNA 서열 내에 돌연변이를 생성시키기 위해 오버래핑(overlapping) PCR 반응에 사용될 수 있다. PCR 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 기술된 특정 알부민 융합 작제물은 ATCC?에 기탁되었다.
작제물 ID 작제물명 ATCC 기탁 번호/날짜
1812 pSAC35:IL2.A21-T153.HSA PTA-3759
2001년 10월 4일
2053 pEE12:IFNb-HSA
pEE12.1:IFNβ-HSA로도 명명됨		 PTA-3764
2001년 10월 4일
2054 pEE12:HSA-IFNb PTA-3941
2001년 12월 19일
2249 pSAC35:IFNa2-HSA
pSAC23:IFNα2-HSA로도 명명됨		 PTA-3763
2001년 10월 4일
2343 pSAC35.INV-IFNA2.HSA PTA-3940
2001년 12월 19일
2381 pC4:HSA-IFNa2(C17-E181) PTA-3942
2001년 12월 19일
2382 pC4:IFNa2-HSA PTA-3939
2001년 12월 19일
2492 pC4.IFNb(델타M22).HSA PTA-3943
2001년 12월 19일
3165 pSAC35:HSA.IFNa
CID 3165, pSAC35:HSA.INFα로도 명명됨		 PTA-4670
2002년 9월 16일
당 분야에 공지되고 본원의 다른 곳(예를들어, 실시예 10)에 기술된 기술에 의해 기탁으로부터 소정의 알부민 융합 작제물을 회수하는 것이 가능하다. ATCC는 미국 버지니아주 20110-2209 매너서스 10801 유니버시티 불러바드에 위치하고 있다. ATCC? 기탁은 특허 절차의 목적상 미생물의 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 이루어진다.
본 발명의 추가의 구체예에서, (1) 소정의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드, (2) 선도 서열, (3) 프로모터 영역, 및 (4) 전사 종결자중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성되는 "발현 카세트"는 한 벡터에서 또 다른 벡터로 이동되거나 "서브클로닝"될 수 있다. 서브클로닝되는 단편은 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를들어 PCR 증폭(예를들어, SEQ ID NO:A 또는 B에 도시된 서열을 지니는 올리고누클레오티드 프라이머를 이용함), 및/또는 제한 효소 분해에 의해 생성될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 표 1의 해당하는 열에 나열된 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질의 치료 활성 및/또는 생물학적 활성에 해당하는 치료 활성 및/또는 생물학적 활성을 지닐 수 있다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적으로 활성인 단백질 부분은 표 2의 SEQ ID NO:X에 도시된 서열에 의해 엔코딩된 단백질의 단편 또는 변이체이고, 치료 단백질에 해당하는 치료 활성 및/또는 생물학적 활성을 지닐 수 있다.
폴리펩티드 및 폴리누클레오티드 단편 및 변이체
단편
본 발명은 추가로 표 1에 기술된 치료 단백질, 알부민 단백질, 및/또는 알부민 본 발명의 알부민 융합 단백질의 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 표 1에 기술된 치료 단백질, 알부민 단백질, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 단편을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다.
단백질의 N-말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실이 치료 단백질, 알부민 단백질, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 손실되더라도, 기타 치료 활성 및/또는 기능성 활성(예를들어, 생물학적 활성, 다중화 능력, 리간드에 결합하는 능력)은 여전히 유지될 수 있다. 예를들어, 폴리펩티드의 완전하거나 성숙한 형태를 인지하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하기 위한 N-말단 결실을 지닌 폴리펩티드의 능력은 완전한 폴리펩티드 잔기의 과반수 이하가 N-말단으로부터 제거되는 경우 유지될 수 있다. 완전한 폴리펩티드의 N-말단 잔기가 결핍된 특정 폴리펩티드가 상기 면역학적 활성을 유지하는지의 여부는 본원에 기술되고 당 분야에 달리 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 다수의 N-말단 아미노산 잔기가 결실된 뮤테인이 몇몇 생물학적 또는 면역학적 활성을 보유할 수 있는 것이 바람직하다. 사실, 6개의 아미노산만큼 적은 아미노산으로 구성된 펩티드가 종종 면역 반응을 야기시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질의 단편은 전장 단백질 뿐만 아니라 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩티드(즉, 표 1에 언급된 치료 단백질, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분)를 포함한다. 특히, N-말단 결실은 일반식 m 대 q로 기술될 수 있고, 여기서 q는 참조 폴리펩티드(예를들어, 표 1에 언급된 치료 단백질, 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분, 또는 표 2에 기술된 폴리펩티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분)에서의 아미노산 잔기의 전체 수를 나타내는 정수이고, m은 2 내지 q-6중 임의의 정수로 정의된다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 해당하는 혈청 알부민 폴리펩티드의 단편은 전장 단백질 뿐만 아니라 참조 폴리펩티드(즉, 혈청 알부민, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 혈청 알부민 부분)아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, N-말단 결실은 일반식 m 대 585로 기술될 수 있고, 여기서 585는 성숙한 인간 혈청 알부민(SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기의 전체 수를 나타내는 정수이고, m은 2 내지 579중 임의의 정수로 정의된다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다. 추가의 구체예에서, N-말단 결실은 일반식 m 대 609로 기술될 수 있고, 여기서 609는 전장의 인간 혈청 알부민(SEQ ID NO:3)의 아미노산 잔기의 전체 수를 나타내는 정수이고, m은 2 내지 603중 임의의 정수로 정의된다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 단편은 전장의 알부민 융합 단백질 뿐만 아니라 알부민 융합 단백질(예를들어, 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질; 또는 표 2의 컬럼 6에 기술된 아미노산 서열을 지니는 알부민 융합 단백질)의 아미노말단으로부터 하나 이사의 잔기가 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 특히, N-말단 결실은 일반식 m 대 q로 기술될 수 있고, 여기서 q는 알부민 융합 단백질의 아미노산 잔기의 전체 수를 나타내는 정수이고, m은 2 내지 q-6중 임의의 정수로 정의된다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 상기에서 언급된 바와 같이, 참조 폴리펩티드(예를들어, 치료 단백질; 혈청 알부민 단백질; 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질)의 N-말단 또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산이 결실되어 단백질의 하나 이상의 생물학적 기능이 변형되거나 손실되더라도, 기타 기능적 활성(예를들어, 생물학적 활성, 다중화 능력, 리간드에 결합하는 능력) 및/또는 치료 활성은 여전히 유지될 수 있다. 예를들어, 폴리펩티드의 완전하거나 성숙한 형태를 인지하는 항체를 유도하고/하거나 결합하기 위한 C-말단 결실을 지니는 폴리펩티드의 능력은 일반적으로 완전하거나 성숙한 폴리펩티드의 잔기의 과반수 이하가 C-말단으로부터 제거되는 경우에 유지될 것이다. 참조 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 잔기가 결핍된 특정 폴리펩티드가 치료 활성을 유지하는지의 여부는 당 분야에 기술되고/되거나 달리 당 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분(예를들어, 표 1에 언급된 치료 단백질, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분)에 해당하는 치료 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩티드를 제공한다. 특히, C-말단 결실은 일반식 1 대 n으로 기술될 수 있고, 여기서 n은 6 내지 q-1중 임의의 정수이고, q는 참조 폴리펩티드(예를들어, 표 1에 언급된 치료 단백질, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분)의 아미노산 잔기의 전체 수를 나타내는 정수이다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분(예를들어, 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 혈청 알부민 또는 알부민 단백질 부분)에 해당하는 알부민 단백질의 아미노산 서열의 카르복시 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩티드를 제공한다. 특히, C-말단 결실은 일반식 1 대 n으로 기술될 수 있고, 여기서, n은 6 내지 584중 임의의 정수이고, 584는 성숙한 인간 혈청 알부민(SEQ ID NO:1)의 아미노산 잔기의 전체 수-1을 나타내는 정수이다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다. 특히, C-말단 결실은 일반식 1 대 n으로 기술될 수 있고, 여기서 n은 6 내지 608중 임의의 정수이고, 608은 혈청 알부민(SEQ ID NO:3)의 아미노산 잔기의 전체 수-1을 나타내는 정수이다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 카르복시 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩티드를 제공한다. 특히, C-말단 결실은 일반식 1 대 n으로 기술될 수 있고, 여기서 q는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 아미노산 잔기의 전체 수를 나타내는 정수이다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
또한, 상기 기술된 N- 또는 C-말단 결실중 어떠한 것도 N- 및 C-말단 결실된 참조 폴리펩티드를 생성하기 위해 조합될 수 있다. 본 발명은 또한 아미노 및 카르복실 말단 둘 모두로부터 하나 이상의 아미노산이 결실된 폴리펩티드를 제공하고, 이는 참조 폴리펩티드(예를들어, 표 1에 언급된 치료 단백질, 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 치료 단백질 부분, 또는 혈청 알부민(예를들어, SEQ ID NO:1), 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 단백질 부분, 또는 알부민 융합 단백질, 또는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질)의 잔기 m 내지 n을 지니는 것으로 일반적으로 기술될 수 있고, 여기서 n 및 m은 상기 기술된 바와 같은 정수이다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
본 출원은 또한 본원에 나열된 참조 폴리펩티드(예를들어, 표 1에 언급된 치료 단백질, 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 치료 단백질 부분, 또는 혈청 알부민(예를들어, SEQ ID NO: 1), 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분, 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 단백질 부분, 또는 알부민 융합 단백질, 또는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질) 서열과 80% 이상, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일한 폴리펩티드 또는 이의 단편을 함유하는 단백질에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 출원은 상기 기술된 바와 같은 N- 및 C-말단 결실의 아미노산 서열을 지니는 참조 폴리펩티드와 80% 이상, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 폴리펩티드를 포함하는 단백질에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 바람직한 폴리펩티드 단편은 아미노산 서열이 단편인 치료 단백질 또는 혈청 알부민 단백질의 폴리펩티드 서열의 치료 활성 및/또는 기능적 활성(예를들어, 생물학적 활성)을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 단편이다.
기타 바람직한 폴리펩티드 단편은 생물학적으로 활성인 단편이다. 생물학적으로 활성인 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 활성과 유사하나, 반드시 동일하지는 않는 활성을 나타내는 단편이다. 단편의 생물학적 활성은 개선된 요망 활성, 또는 감소된 바람직하지 않은 활성을 포함할 수 있다.
변이체
"변이체"는 참조 핵산 또는 폴리펩티드와 다르지만, 이의 본질적인 특정을 보유하는 폴리누클레오티드 또는 핵산을 의미한다. 일반적으로, 변이체는 참조 핵산 또는 폴리펩티드와 전반적으로 유사하고, 많은 영역에서 이와 동일하다.
본원에서 사용되는 "변이체"는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분, 또는 치료 단백질(예를들어, 표 1의 "치료" 컬럼 참조), 알부민 단백질, 및/또는 알부민 융합 단백질 각각과 서열에서 상이하나 본원 다른곳에 기술되거나 달리 당 분야에 공지된 하나 이상의 기능적 및/또는 치료 특정을 보유하는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 관한 것이다. 일반적으로, 변이체는 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질, 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 해당하는 알부민 단백질, 및/또는 알부민 융합 단백질의 아미노산 서열과 전반적으로 매우 유사하고, 많은 영역에서 이와 동일하다. 이러한 변이체를 엔코딩하는 핵산이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한, 예를들어 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질(예를들어, 표 1에 기술된 치료 단백질:X의 아미노산 서열; 또는 표 1 및 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분의 아미노산 서열, 또는 이들의 단편 또는 변이체), 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 해당하는 알부민 단백질(표 1 및 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분의 아미노산 서열; SEQ ID NO:1에 도시된 아미노산 서열, 또는 이들의 단편 또는 변이체), 및/또는 알부민 융합 단백질의 아미노산과 80% 이상, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되는 단백질에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드의 단편이 또한 제공된다(예를들어, 본원에 기술된 단편). 본 발명에 의해 포함되는 추가의 폴리펩티드는 엄격한 하이브리드화 조건(예를들어, 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)중에서 DNA가 결합된 필터로 하이브리드화시킨 후, 약 50-65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상 세척), 매우 엄격한 조건(예를들어, 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)중에서 DNA가 결합된 필터로 하이브리드화시킨 후, 약 68℃)에서 0.1X SSC, 0.2% SDS에서 1회 이상 세척), 당업자에게 공지된 기타 엄격한 하이브리드화 조건(see, for example, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, at pages 6.3.1 - 6.3.6 and 2.10.3) 하에서 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 보충물에 대해 하이브리드화되는 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
예를들어, 조회 아미노산 서열에 대해 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드는, 대상 폴리펩티드 서열이 문의 아미노산 서열의 100개의 아미노산 당 5개 이상의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열이 문의 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 문의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일한 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 대상 서열의 아미노산 잔기의 5% 이하가 삽입되거나, 결실되거나, 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 참조 서열의 이러한 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치 또는 상기 말단 위치 사이의 아무곳에서 발생할 수 있고, 참조 서열의 잔기 사이에서 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 그룹에 산재할 수 있다.
실무적 문제로서, 임의의 특정 폴리펩디드가, 예를들어 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 단편(예를들어, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분 또는 알부민 융합 단백질의 알부민 부분)의 아미노산 서열과 80% 이상, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 지의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 전역 서열 정렬로도 언급되는, 문의 서열(본 발명의 서열)과 대상 서열 사이의 최적의 전체 매치를 결정하기 위한 바람직한 방법은 브루트래그 등(Brutlag et al.)(Comp. App. Biosci.6:237-245 (1990))의 알고리듬에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 문의 및 대상 서열은 둘 모두 누클레오티드 서열 또는 둘 모두 아미노산 서열이다. 상기 전역 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로 나타난다. FASTDB 아미노산 정렬에서 사용되는 바람직한 파라미터는 매트릭스=PAM 0, k-터플(tuple)=2, 미스매치 패널티=l, 접합 페널티=20, 무작위화 그룹 길이=0, 컷오프 스코어=l, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 페널티=5, 갭 크기 페널티=0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 아미노산 서열의 길이이고, 어느 것이나 보다 작았다.
대상 서열이 내부 결실 때문이 아니라 N- 또는 C-말단 결실로 인해 문의 서열보다 짧은 경우, 상기 결과에 대해 수동 교정이 이루어져야 한다. 이는 FASTDB 프로그램은 전역 퍼센트 동일성을 계산하는 경우, 대상 서열의 N- 및 C-말단 트렁케이션을 고려하지 않기 때문이다. 문의 서열에 비하여 N- 및 C-말단에서 트렁케이션된 대상 서열에서, 퍼센트 동일성은 해당하는 대상 잔기와 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 N- 및 C-말단인 문의 서열의 잔기의 수를 문의 서열의 전체 염기의 퍼센트로서 계산함으로써 정정된다. 잔기가 매치/정렬되는 지의 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이후, 이러한 백분율은 퍼센트 동일성으로부터 감해지고, 특정 파라미터를 이용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산되어 최종 퍼센트 동일성 스코어에 도달하게 된다. 이러한 최종 퍼센트 동일성 스코어가 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. 문의 서열과 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기들 만이 퍼센트 동일성 스코어를 수동 조절하기 위한 목적에 고려된다. 즉, 단지 문의 잔기는 대상 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기 외부에 위치한다.
*예를들어, 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 90개의 아미노산 잔기의 대상 서열은 100개의 잔기의 문의 서열과 정렬된다. 결실은 대상 서열의 N-말단에서 발생하고, 따라서 FASTDB 정렬은 N-말단에서의 최초의 10개의 잔기의 매칭/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 이루지 못한 잔기는 서열의 10%(매치되지 않은 N- 및 C-말단에서의 잔기의 수/문의 서열의 잔기의 전체수)로 나타나고, 10%는 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성 스코어로부터 감해진다. 잔여 90개의 잔기가 완전하게 매치되는 경우, 최종 퍼센트 동일성은 90%가 될 것이다. 또 다른 예에서, 90개 잔기의 대상 서열은 100개 잔기의 문의 서열과 비교된다. 이 때, 결실은 내부 결실이어서, 대상 서열의 N- 또는 C-말단에서 잔기가 존재하지 않아 문의 서열과 매치/정렬되지 않는다. 이 경우에서, FASTDB에 의해 계산된 퍼센트 동일성은 수동 정정되지 않는다. 또 다시, FASTDB 정렬에서 나타난 바와 같이, 단지 잔기가 대상 서열의 N- 및 C-말단 외부에 위치하는 경우, 문의 서열과 매치/정렬되지 않아 수동 정정되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해 기타 수동 정정이 이루어지지 않았다.
변이체는 보통 정상 길이의 HA 또는 변이체와 동일한 길이인 치료 단백질과 75% 이상(바람직하게는, 80% 이상, 90%, 95% 또는 99%)의 서열 동일성을 지닐 것이다. 누클레오티드 또는 아미노산 서열 수준에서의 상동성 또는 동일성은 서열 유사성 검색을 위해 제작된 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn and tblastx (본원에 참조로서 포함된 Karlin et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) 및 Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993))에 의해 사용된 알고리듬을 이용한 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 분석에 의해 결정된다.
BLAST 프로그램에 의해 사용된 방법은 먼저 문의 서열 및 데이터베이스 서열 사이의 유사한 부분을 고려한 후, 확인되는 모든 매치의 통계적 유의성을 평가하고, 최종적으로 사전선택된 유의성 한계를 만족시키는 매치들만을 요약하는 것이다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에서의 기본적 문제를 논의하기 위해서는, 본원에 참조로서 완전히 포함된 문헌[Altschul et al ., (Nature Genetics 6: 119-129 (1994))]을 참조하라. 막대그래프, 기재사항, 정렬, 기대치(즉, 데이터베이스 서열에 대한 매치를 보고하기 위한 통계적 유의성 한계), 컷오프, 매트릭스 및 필터는 디폴트 세팅에 있다. blastp, blastx, tblastn, 및 tblastx에 의해 사용된 디폴트 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스(Henikoff et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992), fully incorporated by reference)이다. blastn에 대해서는, 스코어링 매트릭스는 M(즉, 매칭되는 잔기쌍에 대한 보상 스코어) 대 N(즉, 미스매칭되는 잔기에 대한 페널티 스코어)의 비에 의해 세팅되고, 여기서 M 및 N에 대한 디폴트 값은 각각 5 및 -4이다. 네개의 blastn 파라미터는 하기와 같이 조정될 수 있다: Q=10 (갭 생성 페널티); R=10 (갭 연장 페널티); wink=l (문의 서열 사이의 매 윙크쓰(winkth) 위치에서 워드 적중을 발생시킴); 및 갭=16 (갭이 생성된 정렬이 발생하는 범위 내의 윈도우 폭을 세팅). 상응하는 Blastp 파라미터 세팅은 Q=9; R=2; wink=l; 및 gapw=32이었다. GCG 패키지 버전 10.0으로 시판되는, 서열 사이의 최적접합(Bestfit) 비교는 DNA 파라미터 GAP=50 (갭 생성 페널티) 및 LEN=3 (갭 연장 페널티)를 사용하고, 단백질 비교에서의 상응하는 세팅은 GAP=8 및 LEN=2이다.
본 발명의 폴리누클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 둘 모두에 변경을 함유할 수 있다. 특히 바람직한 것은 사일런트 치환, 첨가, 또는 결실을 생성하는 변경을 포함하나, 엔코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성이 변화되지 않는 폴리누클레오티드 변이체이다. 유전 부호의 변성으로 인한 사일런트 치환에 의해 생성된 누클레오티드 변이체가 바람직하다. 더욱이, 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만, 10개 미만, 또는 5-50, 5-25, 5-10, 1-5, 또는 1-2개의 아미노산이 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 폴리펩티드 변이체가 또한 바람직하다. 폴리누클레오티드 변이체가 다양한 이유, 예를들어 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화시키기 위해 생성될 수 있다(인간 mRNA의 코돈을 세균 숙주, 예를들어 효모 또는 대장균에 바람직한 코돈으로 변경).
바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 알부민 부분을 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드는 효모 또는 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드는 효모 또는 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된다. 또 다른 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 효모 또는 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된다.
대안적 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 코돈 최적화된 폴리누클레오티드는 본원에 기술된 엄격한 하이브리드화 조건하에서 치료 단백질을 엔코딩하는 야생형 폴리누클레오티드에 하이브리드화되지 않는다. 추가의 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 알부민 부분을 엔코딩하는 코돈 최적화된 폴리누클레오티드는 본원에 기술된 엄격한 하이브리드화 조건하에서 알부민 단백질을 엔코딩하는 야생형 폴리누클레오티드에 하이브리드화되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 코돈 최적화된 폴리누클레오티드는 본원에 기술된 엄격한 하이브리드화 조건하에서 치료 단백질 부분 또는 알부민 단백질 부분을 엔코딩하는 야생형 폴리누클레오티드에 하이브리드화되지 않는다.
추가의 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 상기 치료 단백질의 자연 발생 서열을 포함하거나 이로 구성되지 않는다. 추가의 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 알부민 단백질의 자연 발생 서열을 포함하거나 이로 구성되지 않는다. 대안적 구체예에서, 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 치료 단백질 부분 또는 알부민 단백질 부분의 자연 발생 서열을 포함하거나 이로 구성되지 않는다.
자연 발생 변이체는 "대립형질 변이체"로 언급되고, 이는 유기체의 염색체에 주어진 유전자좌를 차지하는 유전자의 여러 교대 형태중 하나를 의미한다(Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). 이러한 대립형질 변이체는 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드 수준에서 다양할 수 있고, 본 발명에 포함된다. 대안적으로, 비-자연 발생 변이체는 돌연변이유발 기술 또는 직접적 합성에 의해 생성될 수 있다.
단백질 공학 및 재조합 DNA 기술을 이용하여, 변이체는 본 발명의 폴리펩티드의 특성을 개선시키거나 변화시키도록 생성될 수 있다. 예를들어, 생물학적 기능의 실질적 손실 없이 하나 이상의 아미노산이 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 예로서, 문헌[Ron et al. (J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993))]에는 변이체 KGF 단백질이 3, 8 또는 27개의 아미노-말단 아미노산 잔기가 결실된 후에도 헤파린 결합 활성을 지니는 것으로 보고되어 있다. 유사하게, 인터페론 감마는 이 단백질의 카르복시 말단으로부터 8-10개의 아미노산 잔기가 결실된 후에소 10배 이하의 보다 높은 활성을 나타내었다(Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).
더욱이, 다양한 증거가 변이체가 종종 자연 발생 단백질의 활성과 유사한 생물학적 활성을 보유함을 입증한다. 예를들어, 게일 및 동료(J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993))는 인간 사이토카인 IL-1a의 광범위한 돌연변이 분석을 수행하였다. 이들은 무작위 돌연변이 유발을 이용하여 분자의 전장에 걸쳐 변이체 당 평균 2.5개의 아미노산 변화를 지닌 3,500개 이상의 개별적 IL-1a 돌연변이를 생성시켰다. 다중 돌연변이는 매 가능한 아미노산 위치에서 시험되었다. 연구자들은 "대부분의 분자가 결합 또는 생물학적 활성에 거의 영향이 없이 변경되었음"을 확인하였다. 사실상, 시험된 3,500개 이상의 누클레오티드 서열중 단지 23개의 유일무이한 아미노산 서열이 야생형의 활성과는 현저하게 다른 단백질을 생성시켰다.
더욱이, 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실이 하나 이상의 생물학적 기능의 변형 또는 손실을 일으키더라도, 기타 생물학적 활성은 여전이 유지될 수 있다. 예를들어, 분비된 형태의 잔기의 과반수 미만이 N-말단 또는 C-말단으로부터 제거되는 경우에 분비된 형태를 인지하는 항체를 유도하고/하거나 이에 결합하기 위한 결실 돌연변이의 능력이 유지될 것이다. 단백질의 N- 또는 C-말단 잔기가 결핍된 특정 폴리펩티드가 상기 면역학적 활성을 유지하는지의 여부는 본원에 기술되고 달리 당분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 기능적 활성(예를들어, 생물학적 활성 및/또는 치료 활성)을 지니는 폴리펩티드 변이체를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질의 하나 이상의 생물학적 및/또는 치료 활성에 해당하는 기능적 활성(예를들어, 생물학적 활성 및/또는 치료 활성)을 지니는 알부민 융합 단백질의 변이체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질의 하나 이상의 생물학적 및/또는 치료 활성에 해당하는 기능적 활성(예를들어, 생물학적 활성 및/또는 치료 활성)을 지니는 알부민 융합 단백질의 변이체를 제공한다. 이러한 변이체는 활성에 거의 영향이 없도록 결실, 삽입, 역위, 반복, 및 당 분야에 공지된 일반적 방식에 따라 선택된 치환을 포함한다. 이러한 변이체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 변이체는 보존적 치환을 지닌다. "보존적 치환"은 족내에서의 교환, 예를들어 지방족 또는 소수성 아미노산인 Ala, Val, Leu 및 Ile의 교체; 히드록실 잔기인 Ser 및 Thr의 교체; 산성 잔기인 Asp 및 Glu의 교체; 아미드 잔기인 Asn 및 Gln의 교체; 염기성 잔기인 Lys, Arg, 및 His의 교체; 방향족 잔기인 Phe, Tyr, 및 Trp의 교체; 및 소규모 아미노산인 Ala, Ser, Thr, Met, 및 Gly의 교체를 의미한다.
표현형적으로 변화가 없는 아미노산을 제조하는 방법과 관련된 지침은, 예를들어 문헌[Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)]에 제공되고, 여기서 저자는 변화에 대한 아미노산 서열의 허용을 연구하기 위해 두개의 주요 방법이 있음을 기술한다.
첫번째 방법은 진화의 과정 동안 자연 선택에 의한 아미노산 치환의 허용을 이용한다. 상이한 종에서 아미노산 서열을 비교함으로써, 보존된 아미노산이 확인될 수 있다. 이러한 보존된 아미노산은 단백질 기능에 중요할 것이다. 대조적으로, 자연 선택에 의해 치환이 허용된 아미노산 위치는 이러한 위치가 단백질 기능에 중요하지 않다는 것을 나타낸다. 따라서, 아미노산 치환을 허용하는 위치는 단백질의 생물학적 활성을 여전히 유지하면서 변형될 수 있다.
두번째 방법은 단백질 기능에 중요한 영역을 확인하기 위해 클로닝된 유전자의 특정 부위에서 아미노산 변화를 유도하는 유전공학을 이용한다. 예를들어, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(분자의 매 잔기에 단일의 알라닌 돌연변이를 도입)이 사용될 수 있다. 문헌[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]을 참조하라. 생성된 돌연변이 분자는 이후 생물학적 활성에 대해 시험될 수 있다.
저자들이 언급한 바와 같이, 이들 두 방법은 단백질이 아미노산 치환에 놀라운 허용을 나타내었다. 저자들은 아미노산 변화가 단백질의 특정 아미노산 위치에서 허용될 수 있음을 추가로 기술한다. 예를들어, 대부분의 매몰된(단백질의 3차 구조 내에 매몰) 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 필요로 하는 반면에, 표면 측의 사슬의 몇몇 특징은 일반적으로 보존되어 있다. 더욱이, 허용되는 보존 아미노산 치환은 지방족 또는 소수성 아미노산인 Ala, Val, Leu 및 Ile의 교체; 히드록실 잔기인 Ser 및 Thr의 교체; 산성 잔기인 Asp 및 Glu의 교체; 아미드 잔기인 Asn 및 Gln의 교체; 염기성 잔기인 Lys, Arg, 및 His의 교체; 방향족 잔기인 Phe, Tyr, 및 Trp의 교체; 소규모 아미노산인 Ala, Ser, Thr, Met, 및 Gly의 교체를 포함한다. 보존성 아미노산 치환 이외에, 본 발명의 변이체는 (ⅰ) 치환된 아미노산 잔기가 유전 부호에 의해 엔코딩된 것이거나 엔코딩되지 않은 것인 하나 이상의 비-보존성 아미노산 잔기의 치환을 함유하는 폴리펩티드, 또는 (ⅱ) 치환기를 지니는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 함유하는 폴리펩티드, 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물, 예를들어 폴리펩티드의 안정성 및/또는 용해성을 증가시키는 화합물(예를들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되거나 화학적으로 컨쥬게이션된 폴리펩티드, (ⅳ) 추가의 아미노산, 예를들어 IgG Fc 융합 영역 펩티드를 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변이체 폴리펩티드는 당 분야의 범위, 본원의 교시로부터의 분야 내에 해당하는 것으로 생각된다.
예를들어, 하전된 아미노산의 또 다른 하전된 아미노산 또는 중성 아미노산으로의 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩티드 변이체는 개선된 특성, 예를들어 집성을 지니는 단백질을 생성할 수 있다. 약학적 포뮬레이션의 집성은 활성을 감소시키고 집성체의 면역원성 활성으로 인한 청소율을 증가시킨다. 문헌[Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)]을 참조하라.
특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 알부민 융합 단백질의 아미노산 서열, 치료 단백질 및/또는 인간 혈청 알부민의 아미노산 서열의 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 단편 또는 변이체는 참조 아미노산 서열과 비교하는 경우에 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 또는 50-150개의 아미노산 잔기 첨가, 치환, 및/또는 결실을 지닌다. 바람직한 구체예에서, 아미노산 치환은 보존되어 있다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 아미노산, 즉 펩티드 동배체로 구성될 수 있고, 20개의 유전자 엔코딩된 아미노산과는 다른 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 자연적 과정, 예를들어 번역후 과정 또는 당 분야에 널리 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 기본서 및 보다 상세한 전공논문, 뿐만 아니라 풍부한 연구 문헌에 잘 기술되어 있다. 변형은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 폴리펩티드의 어느 곳에서도 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있음이 인식될 것이다. 또한, 소정의 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는, 예를들어 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 이들은 고리형이거나, 분지를 지니거나 지니지 않을 수 있다. 고리형, 분지형, 및 분지된 고리형 폴리펩티드는 번역후 자연 과정으로부터 발생할 수 있거나, 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 부분의 공유 결합, 누클레오티드 또는 누클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해성 가공, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설파화, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개성 첨가, 예를들어 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함한다(예를들어, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifler et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992) 참조).
기능적 활성
"기능적 활성을 지니는 폴리펩티드"는 전장의 치료 단백질의 프로-단백질, 및/또는 성숙한 형태와 관련된 하나 이상의 공지된 기능적 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 기능적 활성은 생물학적 활성, 항원성[항-폴리펩티드 항체에 결합(또는 폴리펩티드와 결합에 대해 경쟁)하는 능력], 면역원성(본 발명의 특정 폴리펩티드에 결합하는 항체를 발생시키는 능력), 본 발명의 폴리펩티드를 지닌 중합체를 형성하는 능력, 및 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 결합하는 능력을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"생물학적 활성을 지니는 폴리펩티드"는 용량 의존성을 지니거나 지니지 않고 특정 생물학적 검정으로 측정되는 경우 성숙한 형태를 포함하는 본 발명의 치료 단백질의 활성과 유사하지만 필수적으로 동일하지는 않는 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 용량 의존성이 존재하는 경우, 폴리펩티드의 용량 의존성과 동일할 필요는 없으나, 본 발명의 폴리펩티드에 비교하는 경우 소정의 활성에서의 용량-의존성과 실질적으로 유사할 필요는 있다(즉, 후보자 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드와 비교하여 보다 큰활성을 나타내거나 약 25배 미만의 활성, 바람직하게는 약 10배 미만의 활성, 가장 바람직하게는 약 3배 미만의 활성을 나타낼 것이다).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 알부민과 융합되지 않는 경우에 치료 단백질 부분(또는 이의 단편 또는 변이체)과 관련된 하나 이상의 생물학적 및/또는 치료학적 활성을 가진다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 융합되지 않은 상태에서 치료 단백질 부분(또는 이의 단편 또는 변이체)와 비교하여 증가된 혈장 안전성을 지닌다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 융합되지 않은 치료 단백질 부분의 혈장 안전성은 당 분야에 공지된 검정법 또는 통상적으로 변경된 검정법을 이용하여 검정될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 당 분야에 공지된 검정법 또는 통상적으로 변형된 검정법, 뿐만 아니라 본원에 기술된 검정법을 이용하여 기능적 활성(예를들어, 생물학적 활성)에 대해 검정될 수 있다. 추가로, 당업자는 표 1의 해당열(예를들어, 표 1의 컬럼 3)에 참조된 검정법을 이용하여 활성에 대해 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질의 단편을 통상적으로 검정할 수 있다. 추가로, 당업자는 당 분야에 공지된 검정법 및/또는 하기 실시예 섹션에 기술된 검정법을 이용하여 활성에 대해 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 해당하는 알부민 단백질의 단편을 통상적으로 검정할 수 있다.
예를들어, 항-치료 폴리펩티드 항체 및/또는 항-알부민 항체에 결합하기 위한 치료 단백질에 결합하거나 이와 경쟁하기 위한 알부민 융합 단백질의 능력을 검정하는 한 구체예에서, 당 분야에 공지된 방사선면역검정법, ELISA(효소면역측정법), "샌드위치" 면역검정법, 면역방사측정법, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정법, 인 시튜 면역검정법(예를들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원소 라벨을 이용함), 웨스턴 블로팅, 침강 반응, 응집 검정법(예를들어, 겔 응집 검정법, 적혈구응집 검정법), 보체 결합 검정법, 면역형광검사, 단백질 A 검정법, 및 면역전기이동 검정법 등과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 검정 시스템을 포함하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 항체 결합은 일차 항체에 대한 라벨을 검출함으로써 검출된다. 또 다른 구체예에서, 일차 항체는 이차 항체 또는 일차 항체에 대한 작용제의 결합을 검출함으로써 검출된다. 추가의 구체예에서, 이차 항체는 라벨링된다. 면역검정에서의 결합을 검출하기 위한 많은 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 이는 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 구체예에서, 치료 단백질의 결합 파트너(예를들어, 수용체 또는 리간드)가 확인되는 경우, 융합체의 치료 단백질 부분과 같은 치료 단백질을 포함하는 알부민 융합 단백질에 의해 결합 파트너에 결합하는 것이, 예를들어 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를들어 환원성 및 비-환원성 겔 크로마토그래피, 단백질 친화성 크로마토그래피, 및 친화성 블로팅에 의해 검정될 수 있다. 문헌[Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995)]을 참조하라. 또 다른 구체예에서, 융합체의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 폴리펩티드의 기질에 결합하는 알부민 융합 단백질의 생리적 상관 능력이 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 통상적으로 검정될 수 있다.
대안적 구체예에서, 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를들어 환원성 및 비-환원성 겔 크로마토그래피, 단백질 친화성 크로마토그래피, 및 친화성 블로팅에 의해 알부민 융합 단백질이 중합화되는 능력이 평가되고, 중합체의 기타 성분과의 회합이 검정될수 있다. 상기 문헌[Phizicky et al.]을 참조하라.
바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 알부민 융합 단백질은 알부민과 융합되지 않는 경우 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체와 관련된 하나 이상의 생물학적 및/또는 치료적 활성(예를들어, 폴리펩티드 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 활성)을 지닌다. 기타 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 알부민 융합 단백질의 생물학적 활성 및/또는 치료 활성은 치료 단백질에 결합하는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 폴리펩티드와 관련된 생물학적 활성 및/또는 치료 활성중 하나 이상의 억제(즉, 길항작용) 또는 활성화(즉, 작용)이다.
치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 다양한 방법으로 특성규명될 수 있다. 특히, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 본원에 기술된 기술 또는 당 분야에 공지된 통상적으로 변형된 기술을 이용하여 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질에 결합하는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 검정될 수 있다.
특이적 단백질 또는 에피토프에 (특이적으로)결합하는 알부민 융합 단백질(예를들어, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 것)의 능력에 대한 검정은 용액 중에서(예를들어, Houghten, Bio/Techniques 13:412-421(1992)), 비드 상에서(예를들어, Lam, Nature 354:82-84 (1991)), 칩 상에서(예를들어, Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), 세균에서(예를들어, U.S. Patent No. 5,223,409), 포자상에서(예를들어, Patent Nos. 5,571,698; 5,403,484; 및 5,223,409), 플라스미드 상에서(예를들어, Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869 (1992)) 또는 파아지 상에서(예를들어, Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990) 수행될 수 있다; (Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); and Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991))(이들 참조문헌의 각각은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다). 치료 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 또한 본원에 기술된 기술된 검정법 또는 통상적으로 변형된 기술 또는 달리 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 특정 단백질 또는 에피토프에 대해 이들의 특이성 및 친화성이 검정될 수 있다.
치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 기타 항원(예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 분자(들)과 함께 서열/구조 보존성을 지니는 분자)을 이용하여 교차-반응성이 검정될 수 있다.
(면역특이적) 결합 및 교차-반응성을 검정하기 위해 웨스턴 블로팅, 방사선면역검정법, ELISA (효소 면역측정법), "샌드위치" 면역검정법, 면역침강 검정법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정법, 응집 검정법, 보체-결합 검정법, 면역방사 검정법, 형광 면역검정법, 및 단백질 A 면역검정법과 같은 기술을 이용하는 경쟁 및 비-경쟁 검정 시스템을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이러한 검정법은 통상적으로 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를들어, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, which is incorporated by reference herein in its entirety 참조). 예시적 면역검정법은 하기에 간단히 기술되어 있다(그러나, 이에 제한하고자 하는 것은 아니다).
면역침강 프로토콜은 일반적으로 RIPA 완충용액과 같은 용해 완충용액(pH 7.2의 1% 트라시롤(Trasylol)에서 1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 인산 나트륨)에서 세포 집단을 용해시키고, 단백질 포스파타아제 및/또는 프로테아제 억제제(예를들어, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 나트륨 바나데이트)를 보충하고, 세포 용해질에 본 발명의 알부민 융합 단백질을 첨가하고(예를들어, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함함), 40℃에서 일정 기간(예를들어, 1 내지 4시간) 동안 인큐베이팅시키고, 세포 용해질에, 예를들어 항-알부민 항체에 결합하는 세파로오즈 비드를 첨가하고, 40℃에서 약 1시간 이상 동안 인큐베이팅시키고, 용해 완충용액에서 비드를 세척하고, SDS/샘플 완충용액에서 비드를 재현탁시키는 것을 포함한다.
특정 항원을 면역침강시키는 알부민 융합 단백질의 능력은 예를들어 웨스턴 블로팅 검정법에 의해 평가될 수 있다. 당업자는 항원에 대한 알부민 융합 단백질의 결합을 증가시키고 백그라운드를 감소시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터를 인지할 것이다(예를들어, 세파로오즈 비드를 이용하여 세포 용해질을 예비 세척함). 면역침강 프로토콜에 관한 추가의 논의는,예를들어 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1]을 참조하라.
웨스턴 블로팅 검정법은 일반적으로 단백질 샘플을 제조하고, 폴리아크릴아미드 겔(예를들어, 항원의 분자량에 따라 8%- 20% SDS-PAGE)에서 단백질 샘플을 전기영동시키고, 폴리아크릴아미드 겔로부터의 단백질 샘플을 막, 예를들어 니트로셀룰로오즈, PVDF 또는 나일론에 옮기고, 블로킹 용액(예를들어, 3% BSA 또는 비-지방유)에서 막을 블로킹시키고, 세척 완충용액(예를들어, PBS-Tween 20)에서 막을 세척하고, 막에 본 발명의 알부민 융합 단백질(블로킹 완충용액중에서 희석됨)을 적용시키고, 세척 완충용액중에서 막을 세척하고, 블로킹 완충용액 중에 희석된 효소 기질(예를들어, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제) 또는 방사성 분자(e.g., 32P or 125I)에 컨쥬게이션된 이차 항체(알부민 융합 단백질, 예를들어 항-인간 혈청 알부민 항체)를 인지함)를 적용시키고, 세척 완충용액중에서 막을 세척하고, 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키고 백그라운드 노이즈를 감소시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터를 인지할 것이다. 웨스턴 블로팅 프로토콜에 관한 추가의 논의는, 예를들어 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1]을 참조하라.
ELISA는 항원을 제조하고, 항원을 이용하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 코팅시키고, 웰에 결합하지 않는 항원을 세척하고, 웰에 효소 기질(예를들어, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제)와 같은 검출가능한 화합물에 컨쥬게이션된 본 발명의 알부민 융합 단백질(예를들어, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함함)을 첨가하고, 일정 기간 동안 인큐베이션시키고, 결합되지 않거나 특이적으로 결합되지 않은 알부민 융합 단백질을 세척하고, 웰을 코팅하는 항원에 특이적으로 결합된 알부민 융합 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함한다. ELISA에서, 알부민 융합 단백질은 검출가능한 화합물에 컨쥬게이션되지 않고, 대신 검출가능한 화합물에 컨쥬게이션된 이차 항체(알부민 융합 단백질을 인지함)가 웰에 첨가될 수 있다. 추가로, 항원을 이용하여 웰에 코팅하는 대신, 알부민 융합 단백질은 웰에 코팅될 수 있다. 이 경우, 검출가능한 분자는 검출가능한 화합물, 예를들어 효소 기질(예를들어, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제)에 컨쥬게이션된 항원일 수 있다. 당업자는 검출되는 신호 및 당 분야에 공지된 ELISA의 기타 변형을 증가시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터를 인지할 것이다. ELISA에 관한 추가의 논의는, 예를들어 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1]을 참조하라.
단백질, 항원, 또는 에피토프에 대한 알부민 융합 단백질의 결합 친화성 및 알부민 융합 단백질-단백질/항원/에피토프 상호작용의 오프-레이트(off-rate)는 경쟁적 결합 검정법에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 검정법의 한 예는 증가된 양의 라벨링되지 않은 항원의 존재하에서 본 발명의 알부민 융합 단백질과 라벨링된 항원(예를들어, 3H 또는 125I)의 인큐베이션, 및 라벨링된 항원에 결합된 항체의 검출을 포함하는 방사선면역측정법이다. 특정 단백질, 항원, 또는 에피토프에 대한 알부민 융합 단백질의 친화성 및 결합 오프-레이트는 스캐차드 플롯 분석에 의한 데이터로부터 결정될 수 있다. 알부민 융합 단백질과 같은 동일한 단백질, 항원 또는 에피토프에 결합하는 이차 단백질과의 경쟁은 방사선면역측정법을 이용하여 결정될 수 있다. 이 경우, 단백질, 항원 또는 에피토프는 본 발명의 알부민 융합 단백질과 같은 동일한 단백질, 항원, 또는 에피토프에 결합하는 라벨링되지 않은 이차 단백질의 증가된 양의 존재하에서 라벨링(예를들어, 3H 또는 125I)되지 않은 화합물에 컨쥬게이션된 알부민 융합 단백질과 인큐베이션된다.
바람직한 구체예에서, BIAcore 동역학 검정은 단백질, 항원 또는 에피토프에 대한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 결합 및 오프-레이트를 결정하는데 사용된다. BIAcore 동역학 분석은 표면에 특정 폴리펩티드, 항원 또는 에피토프 또는 알부민 융합 단백질이 각각 고정된 칩으로부터 알부민 융합 단백질, 또는 특정 폴리펩티드, 항원 또는 에피토프의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질에 결합하는 항체는 또한 소정의 단백질 또는 항원, 바람직하게는 항체들이 특이적으로 결합하는 항원에 대한 결합 친화성에 관하여 기술되거나 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지닌 것을 포함한다. 더욱 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-5 M, 10-5 M, 5 X 10-6 M, l0-6 M, 5 X 10-7 M, 107 M, 5 X 10-8 M 또는 10-8 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지닌 것이다. 더욱 더 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지닌 것이다. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 알부민 융합 단백질(치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함함)의 원자가 및 상응하는 항체의 원자가를 고려하여 치료 단백질에 결합하는 항체(알부민에 융합되지 않음)에 해당하는 것과 유사한 소정의 단백질 또는 에피토프에 대한 친화성을 지닌다. 게다가, 본원(실시예 및 표 1을 참조)에 기술되고 당 분야에 달리 공지된 검정법은 통상적으로 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분 및/또는 알부민 부분과 관련된 생물학적 활성 및/또는 치료 활성(시험관내 또는 생체내)을 유도하기 위한 알부민 융합 단백질 및 이의 단편, 변이체 및 유도체의 능력을 측정하기 위해 적용될 수 있다. 기타 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이고, 이는 본 발명의 범위에 속한다.
알부민
상기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 바람직하게는 유전적 융합에 의해 서로 회합되는 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체 및 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함한다.
추가의 구체예는 화학적 컨쥬게이션에 의해 서로 결합된 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체 및 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함한다.
용어 인간 혈청 알부민(HSA) 및 인간 알부민(HA)는 본원에서 교환하여 사용될 수 있다. 용어 "알부민" 및 "혈청 알부민"은 보다 광범위하고, 인간 혈청 알부민(및 이의 단편 및 변이체) 뿐만 아니라 기타 종으로부터의 알부민(이의 단편 및 변이체)를 포함한다.
본원에서 사용되는 "알부민"은 집합적으로 알부민의 하나 이상의 기능적 활성(예를들어, 생물학적 활성)을 지니는 알부민 단백질 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 의미한다. 특히, "알부민"은 인간 알부민 또는 이의 단편(예를들어, EP 201 239, EP 322 094 WO 97/24445, W095/23857 참조), 특히 도 1 및 SEQ ID NO:1에 도시된 인간 알부민의 성숙한 형태, 또는 기타 척추동물로부터의 알부민 또는 이의 단편, 또는 이들 분자의 유사체 또는 변이체 또는 이의 단편을 의미한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 사용되는 인간 혈청 알부민 단백질은 SEQ ID NO:1에 참조된 하기의 점 돌연변이의 세트중 하나 또는 둘 모두를 함유한다: Ala으로의 Leu-407의 돌연변이, Val으로의 Leu-408의 돌연변이, Ala으로의 Val-409의 돌연변이 및 Ala으로의 Arg-410의 돌연변이; 또는 Ala으로의 Arg-410의 돌연변이, Gln으로의 Lys-4l3의 돌연변이 및 Gln으로의 Lys-414의 돌연변이(예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 국제 출원 번호 W095/23857 참조). 더욱 더 바람직한 구체예에서, 점 돌연변이의 상기 기술된 세트중 하나 또는 둘 모두를 함유하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 효모 숙주 세포에서 발현되는 재조합 알부민 융합 단백질의 생성을 증가시키는 효모 Yap3p 단백질 분해에 대한 개선된 안정성/내성을 지닌다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료 단백질의 치료 활성 또는 혈장 안정성 또는 반감기를 연장시키기에 충분한 알부민의 부분은 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분의 반감기 또는 혈장 안정성은 융합되지 않은 상태의 반감기 또는 혈장 안정성과 비교하여 연장되거나 늘어나기 위한 단백질의 치료 활성 또는 혈장 안정성을 안정시키거나 연장시키기 위한 길이 또는 구조에 충분한 알부민의 부분을 의미한다. 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 상기 기술된 바와 같은 전장의 HA 서열을 포함하거나, 치료 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 이의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 10개 이상의 아미노산 길이일 수 있거나, HA 서열로부터의 약 15, 20, 25, 30, 50개 이상의 연속적 아미노산을 포함할 수 있거나, HA의 특정 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 예를들어, 최초 두개의 면역글로불린 유사 도메인을 스패닝하는 HA의 하나 이상의 단편이 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, HA 단편은 HA의 성숙한 형태이다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 정상적인 HA의 변이체일 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분은 또한 본원에 기술된 바와 같은 치료 단백질의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존성이거나 비보존성인 삽입, 결실 및 치환을 포함하고, 이러한 변화는 치료 단백질의 치료 활성을 수여하는 알부민, 또는 활성 부위, 또는 활성 도메인의 종양, 유용한 리간드-결합 및 비-면역원성 특성중 하나 이상을 실질적으로 변경시키기 않는다.
특히, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 자연 발생하는 인간 알부민의 다형 변이체 및 인간 알부민의 단편, 예를들어 EP 322 094(즉, HA (Pn), 여기서 n는 369 내지 419임)에 기술된 인간 알부민의 단편을 포함한다. 알부민은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를들어 인간, 소, 양, 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비-포유동물 알부민은 닭 및 연어를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 치료 단백질보다 다양한 동물로부터 유래될 수 있다.
일반적으로 말하면, HA 단편 또는 변이체는 100개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 150개 이상의 아미노산 길이일 것이다. HA 변이체는 하나 이상의 전체 도메인의 HA, 예를들어 도메인 1(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-194), 도메인 2(SEQ ID NO:1의 아미노산 195-387), 도메인 3(SEQ ID NO:1의 아미노산 388-585), 도메인 1 및 2((SEQ ID NO:1의 1-387), 도메인 2 및 3(SEQ ID NO:1의 195-585), 또는 도메인 1 및 3(SEQ ID NO:1의 아미노산 1-194 및 SEQ ID NO:1의 아미노산 388-585)으로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 각각의 도메인은 그 자체가 잔기 Lys106 내지 Glul 19, Glu292 내지 Val 315 및 Glu492 내지 Ala511을 포함하는 유연성이 있는 서브도메인간 링커 영역을 지닌 두개의 상동 서브도메인, 즉 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 및 512-585로 구성된다.
바람직하게는, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 HA의 하나 이상의 서브도메인 또는 도메인 또는 이의 보존적 변이체를 포함한다. 융합체가 서브도메인에 기초하는 경우, 인접한 링커의 일부 또는 전부는 바람직하게는 치료 단백질 부분에 링크되기 위해 사용된다.
치료 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 치료 단백질이다.
본 발명은 또한 표 1에 기술된 치료 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 용어 "치료 단백질"은 치료 단백질(예를들어, 표 1의 컬럼 1에 기술된 것) 및 이의 단편 및 변이체에 결합하는 항체를 포함하는 것으로 특히 간주된다. 따라서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체, 및/또는 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체을 함유할 수 있다.
항체 구조 및 백그라운드
기본 항체 구조 단위는 테트라머를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 테트라머는 각각의 사슬이 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kD)을 지니는, 폴리펩티드 사슬의 두개의 동일한 쌍으로 구성된다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인지를 주로 책임지는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시 말단 부분은 효과기 기능을 주로 책임지는 불변영역으로 정의된다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타 , 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, 1gG, IgA, and IgE으로 항체의 동형으로 정의된다. 문헌[Fundamental Immunology Chapters 3-5 (Paul, W., ed., 4th ed. Raven Press, N.Y. (1998)]을 참조하라(모든 목적에 대해 전체 내용이 참조로서 포함됨). 각각의 경쇄/중쇄쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다.
따라서, 본래의 IgG 항체는 두개의 결합 부위를 지닌다. 이작용성 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 두개의 결합 부위는 동일하다.
사슬은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 언급되는 세개의 고변이 부위에 의해 결합된 비교적 보존된 골격 영역(FR)의 일반 구조를 나타낸다. 일반적으로, CDR 영역은 항원과 접촉하게 되고 이의 특이성을 결정하는 항체의 일부이다. 각각의 쌍의 중쇄 및 경쇄로부터의 CDR은 특이적 에피토프에 결합을 가능하게 하는 골격 영역에 의해 정렬된다. N-말단 내지 C-말단으로부터, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 둘 모두는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 가변 영역은 중쇄 또는 경쇄 불변 영역에 연결된다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 지정은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Chothia & Lesk J Mol. Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.
본원에서 사용되는 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역적으로 활성인 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자(예를들어, 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 함유하는 분자)를 의미한다. 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응할 수 있는 항체는 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화되거나 키메라 항체, 단일 사슬 항체(예를들어, 단일 사슬 Fvs), Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-이디오타입(항-ID) 항체(예를들어, 본 발명의 항체에 특이적인 항-ID 항체를 포함함), 및 상기중 임의의 에피토프-결합 단편(예를들어, VH 도메인, VL 도메인, 또는 하나 이상의 CDR 영역)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 단백질에 결합하는 항체
본 발명은 치료 단백질(예를들어, 표 1에 기술된 것) 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다.
치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체는 새 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 뮤린(예를들어, 마우스 및 래트), 원숭이, 양, 토끼, 염소, 기니아피그, 낙타, 말, 또는 닭 항체이다. 가장 바람직하게는, 항체는 인간 항체이다. 본원에서 사용되는 "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 지니는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리 및 인간 항체를 생성하기 위해 유전학적으로 설계된 제노마우스(xenomice) 및 기타 유기체로부터 단리된 항체를 포함한다.
치료 단백질에 결합하고 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체 분자는 임의의 유형(예를들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를들어, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체 분자는 IgG1이다. 기타 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 면역글로불린 분자는 IgG2이다. 기타 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질에 해당할 수 있는 면역글로불린 분자는 IgG4이다.
가장 바람직하게는, 치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 본 발명의 인간 항원-결합 항체 단편이고, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fvs (scFv), 단일-사슬 항체, 이황화물-결합된 Fvs (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단일-사슬 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 영역(들) 단독 또는 경첩 부위, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 전체 또는 일부와의 조합을 포함할 수 있다.
치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 비특이적이거나, 이중특이성이거나, 삼중특이성이거나 그 이상의 다중특이성일 수 있다. 다중특이적 항체는 치료 단백질의 다양한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 치료 단백질 뿐만 아니라 이종성 에피토프, 예를들어 이종성 폴리펩티드 또는 고형물 지지 물질에 대해 특이적일 수 있다. 예를들어, PCT 출원 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; 문헌[Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); U.S. Patent Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)]을 참조하라.
치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체는 이중특이성이거나 이작용성일 수 있고, 이는 항체가 두개의 상이한 중쇄/경쇄쌍 및 두개의 상이한 결합 부위를 지니는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 결합을 포함하는 다양한 방법에 의해 성성될 수 있다. 예를들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann Clin . Exp . Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J Immunol . 148:1547 1553 (1992)]을 참조하라. 게다가, 이중특이성 항체는 "디아바디(diabody)"(Holliger et al. "'Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) 또는 "야누신(Janusin)"(Traunecker et al. "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991) and Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int JCancer Supp17:51-52 (1992))으로 형성될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술되거나 당 분야에 달리 공지된 항체의 단편 또는 변이체(유도체를 포함함)를 포함하는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 분자를 엔코딩하는 누클레오티드 서열에 돌연변이를 유도하기 위해 , 예를들어 아미노산 치환을 발생시키는 부위-특이적 돌연변이유발 및 PCR-매개성 돌연변이유발을 포함하는 당업자에게 공지된 표준 기술이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 변이체(유도체를 포함함)는 참조 VH 도메인, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 도메인, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3에 비해 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 엔코딩한다. 특정 구체예에서, 변이체는 VHCDR3의 치환을 엔코딩한다. 바람직한 구체예에서, 변이체는 하나 이상의 예상된 비-필수 아미노산 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 지닌다.
치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 이들이 인지하거나 특이적으로 결합하는 치료 단백질의 에피토프(들) 또는 부분(들)에 관해 기술되거나 특정될 수 있다. 치료 단백질 또는 치료 단백질의 특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 또한 포함된다. 따라서, 본 발명은 치료 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하고, 동일한 것을 제외하는 것이 허용된다. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질 항체 그 자체의 융합되지 않은 단편 또는 변이체와 같은 에피토프에 결합한다.
치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 또한 이들의 교차-반응성에 관해 기술되거나 특정될 수 있다. 치료 단백질의 임의의 기타 유사체, 오소로그, 또는 동족체에 결합하지 않는 항체가 포함된다. 치료 단백질에 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 50% 이상의 서열 동일성(당 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산됨)을 지닌 폴리펩티드에 결합하는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 특정 구체예에서, 치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 인간 단백질 및 이의 상응하는 에피토프의 뮤린, 래트 및/또는 토끼 동족체와 교차-반응한다. 치료 단백질에 대해 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 서열 상동성(당 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산됨)을 지니는 폴리펩티드에 결합하지 않는 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 특정 구체예에서, 상기 기술된 교차-반응성은 임의의 단일 특이적 항원성 또는 면역원성 폴리펩티드, 또는 본원에 기술된 특정 항원 및/또는 면역원성 폴리펩티드의 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 조합에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 특정 항체 그 자체의 단편 또는 변이체에 비해 유사하거나 실질적으로 동일한 교차 반응 특성을 지닌다.
본 발명에 추가로 포함되는 것은 엄격한 하이브리드화 조건(본원에 기술된 바와 같음)하에서 치료 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 하이드리드되는 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 결합하는 항체이다. 치료 단백질에 결합하고 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 이들의 결합 친화성과 관련하여 기술되거나 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지닌 것이다. 더욱 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-5 M, 10-5 M, 5 X 10-6 M, l0-6 M, 5 X 10-7 M, 107 M, 5 X 10-8 M 또는 10-8 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지닌 것이다. 더욱 더 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지니는 것이다. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 알부민 융합 단백질(치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함함)의 원자가 및 상응하는 항체의 원자가를 고려하여 치료 단백질에 결합하는 항체(알부민에 융합되지 않음)에 해당하는 것과 유사한 소정의 단백질 또는 에피토프에 대한 친화성을 지닌다.
본 발명은 또한 경쟁적 결합을 결정하기 위한 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를들어 본원에 기술된 면역검정법에 의해 결정된 바와 같은 치료 단백질의 에피토프에 대한 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상으로 에피토프에 대한 결합을 경쟁적으로 억제한다. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 치료 단백질의 에피토프에 대한 이차 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 기타 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상으로 치료 단백질의 에피토프에 대한 이차 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
치료 단백질에 결합하고 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 치료 단백질의 작용제 또는 길항제로 작용할 수 있다. 예를들어, 본 발명은 부분적으로 또는 완전히 본 발명의 폴리펩티드와 수용체/리간드 상호작용을 중단시키는 항체를 포함한다. 본 발명은 수용체-특이적 항체 및 리간드-특이적 항체 둘 모두를 기술한다. 본 발명은 또한 리간드 결합을 방지하지 않으나 수용체 활성화를 방지하는 수용체-특이적 항체를 기술한다. 수용체 활성화(즉, 신호)는 본원에 기술되거나 당 분야에 달리 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를들어, 수용체 활성화는 수용체의 인산화(예를들어, 티로신 또는 세린/트레오닌) 또는 면역침강후 웨스턴 블로팅 분석법(예를들어, 상기 기술된 바와 같은 분석법)에 의한 수용체의 기질을 검출함으로써 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체의 부재하에서 활성의 95% 이상, 90 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상, 또는 50% 이상으로 리간드 활성 또는 수용체 활성을 억제하는 항체가 제공된다. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 치료 단백질에 결합하는 항체의 융합되지 않은 단편 또는 변이체와 비교하여 리간드 결합의 방지 및/또는 수용체 활성화의 방지에 관하여 유사하거나 실질적으로 유사한 특성을 지닌다.
본 발명은 또한 리간드 결합 및 수용체 활성화 뿐만 아니라 수용체-리간드 복합체를 인지하는 항체를 방지하고, 바람직하게는 결합되지 않은 수용체 또는 결합되지 않은 리간드를 특이적으로 인지하지 않는 수용체-특이적 항체를 기술한다. 또한, 리간드에 결합하여 수용체에 대한 리간드의 결합을 방지하는 중화 항체 뿐만 아니라 리간드에 결합하여 수용체 활성화를 방지하지만 수용체에 대한 리간드의 결합을 방지하지 않는 항체가 본원에 포함된다. 수용체를 활성화시키는 항체가 본원에 추가로 포함된다. 이들 항체는 , 예를들어 수용체의 이합체화를 유도시킴으로써 리간드-매개된 수용체 활성화의 생물학적 활성의 전부 또는 서브셋을 효력을 더하거나 활성화시킴으로써 수용체 작용제로서 작용할 수 있다. 항체는 치료 단백질(예를들어 표 1에 기술된 것)의 특정 생물학적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대해 작용제, 길항제 또는 역작용제로 특정될 수 있다. 상기 항체 작용제는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[PCT 공개 WO 96/40281; U.S. 특허 제 5,811,097호; Deng et al., Blood 92(6):1981-1988 (1998); Chen et al., Cancer Res. 58(16):3668-3678 (1998); Harrop et al., J. Immunol. 161(4):1786-1794 (1998); Zhu et al., Cancer Res. 58(15):3209-3214 (1998); Yoon et al., J. Immunol. 160(7):3170-3179 (1998); Prat et al., J. Cell. Sci. 11 l(Pt2):237-247 (1998); Pitard et al., J. Immunol. Methods 205(2):177-190 (1997); Liautard et al., Cytokine 9(4):233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272(17):11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14(4):755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9):1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1):14-20 (1996)]을 참조하라. 바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 치료 단백질에 결합하는 항체의 융합되지 않은 단편 또는 변이체와 유사하거나 실질적으로 동일한 작용제 또는 길항제 특성을 지닌다.
치료 단백질에 결합하고 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는, 예를들어 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 방법 둘 모두를 포함하여 치료 단백질을 정제하고, 검출하고, 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 예를들어, 항체는 생물학적 샘플에서 치료 단백질의 수준을 정성적 및 정량적으로 측정하기 위한 면역 검정법에 사용된다. 예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조하라. 또한, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은, 예를들어 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 방법 둘 모두를 포함하여 치료 단백질을 정제하고, 검출하고, 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
치료 단백질에 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 항체에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 결합에 의해 변형되는 유도체를 포함한다. 예를들어, 항체 유도체는 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/블로킹기에 의한 유도, 단백질 분해, 세포내 리간드 또는 기타 단백질 등에 의해 변형된 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 임의의 다양한 화학적 변형이 특이적 화학적 분해, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 하나 이상의 비고전 아미노산을 함유할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 상기 기술된 바와 같이 변형될 수 있다.
치료 단백질에 결합하는 항체를 제조하는 방법
치료 단백질에 결합하고 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 당 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 생성될 수 있다. 관심 항원에 대한 폴리클로날 항체는 당 분야에 너리 공지된 다양한 공정에 의해 생성될 수 있다. 예를들어, 치료 단백질은 항원에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청의 생성을 유도하기 위해 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물로 투여될 수 있다. 프로인트(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예를들어 알루미늄 히드록시드, 표면 활성 물질, 예를들어 리소레시틴, 플루론산 폴리올, 다음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애쥬번트, 예를들어 BCG(칼메트-게랑 간균) 및 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 애쥬번트가 숙주 종에 따른 면역학적 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 애쥬번트는 또한 당 분야에 널리 공지되어 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 표시 기술, 또는 이들의 조합의 이용을 포함하는 당 분야에 공지된 광범위한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를들어, 모노클로날 항체는 당 분야에 공지되고, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]에 교시된 것을 포함하는 하이브리도마 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵세포, 원핵세포, 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 의미하고, 이는 상기 방법에 의해 생성되지 않는다.
하이브리도마 기술을 이용하여 특정 항체를 생성하거나 스크리닝하는 방법은 통상적이고 당 분야에 널리 공지되어 있다. 비제한적인 예에서, 마우스는 치료 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체, 알부민 융합 단백질, 또는 이러한 치료 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체 또는 알부민 융합 단백질을 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 예를들어 항원에 대해 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되는 바와 같이 면역 반응이 검출된 후, 마우스 비장이 수거되고 비장세포가 단리된다. 이후, 비장세포는 널리 공지된 기술에 의해 임의의 적합한 골수종 세포, 예를들어 ATCC로부터 입수가능한 세포주 SP20으로부터의 세포로 융합된다. 하이브리도마가 선택되고 제한적인 희석에 의해 클로닝된다. 이후, 하이브리도마 클론은 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당 분야에 공지된 방법에 의해 검정된다. 높은 수준의 항체를 일반적으로 함유하는 복수는 마우스를 양성 하이브리도마 클론으로 면역화시킴으로써 생성될 수 있다.
따라서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생성하는 방법 뿐만 아니라 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된 항체를 제공하고, 여기서 바람직하게는 하이브리도마는 본 발명의 항원을 이용하여 면역화된 마우스로부터 단리된 비장세포와 골수종 세포를 융합시킨 후, 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대한 융합으로부터 생성된 하이브리도마를 스크리닝함으로써 생성된다.
폴리클로날 및 모노클로날 인간 B 세포주 둘 모두를 생성하기 위한 또 다른 널리 공지된 방법은 엡스타인 바 바이러스(EBV)를 이용하는 형질전환이다. EBV-형질전환된 B 세포주를 생성하기 위한 프로토콜은,예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., 1994, John Wiley & Sons, NY]의 7.22장에 개요된 프로토콜과 같이 통상적으로 당 분야에 공지되어 있다. 형질전환을 위한 B세포원은 통상적으로 인간 말초혈액이나, 형질전환을 위한 B 세포는 또한 림프절, 편도, 비장, 종양 조직, 및 감염된 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 공급원으로부터 유래될 수 있다. 조직은 일반적으로 EBV 형질전환에 앞서 단일 세포 현탁액으로 만들어진다. 추가로, 물리적으로 제거하거나 B 세포 함유 샘플중의 T 세포를 비활성화(예를들어, 시클로스포린 A를 이용한 처리에 의함)시키는 단계가 이루어지는데, 이는 항-EBV 항체에 대한 개별적 양성혈청반응으로부터의 T 세포가 EBV에 의한 B 세포 불멸화를 억제할 수 있기 때문이다.
일반적으로, 인간 B 세포를 함유하는 샘플은 EBV로 접종되고, 3-4주 동안 배양된다. EBV 형질전환의 통상적인 공급원은 B95-8 세포주(ATCC #VR-1492)의 배양 상층액이다. EBV 형질전환의 물리적 징후는 일반적으로 3-4주의 배양 기간의 종료 가까이에서 관찰될 수 있다. 위상차 현미경에 의해, 형질전환된 세포가 크고, 선명하고, 조야하게 보일 수 있고, 이는 세포의 빈틈없는 군집으로 집합하는 경향이 있다. 최초로, EBV 세포주는 일반적으로 폴리클로날이다. 그러나, 세포 배양의 기간이 연장됨에 따라, EBV 세포주는 특정 B 세포 클론의 선택적 생성의 결과로서 모노클로날 또는 폴리클로날이 될 수 있다. 대안적으로, 폴리클로날 EBV 형질전환된 세포주는 적절한 융합 파트너에 서브클로닝(예를들어, 제한 희석 배양에 의함)되거나 융합될 수 있고, 모노클로날 B 세포주를 수득하기 위해 제한 희석에서 플레이팅될 수 있다. EBV 형질전환된 세포주에 대한 적절한 융합 파트너는 마우스 골수종 세포주(예를들어, SP2/0, X63-Ag8.653), 헤테로골수종 세포주(인간 × 마우스; 예를들어, SPAM-8, SBC-H20, 및 CB-F7), 및 인간 세포주(예를들어, GM 1500, SKO-007, RPMI 8226, 및 KR-4)를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 인간 B 세포의 EBV-형질전환을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 인간 항체를 생성하는 방법을 제공한다.
특정 에피토프를 인지하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생성시킴) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성시킴)과 같은 효소를 이용하여 면역글로불린 분자의 단백질 분해에 의해 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.
예를들어, 치료 단백질에 결합하는 항체는 또한 당 분야에 공지된 다양한 파지 표시 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 파지 표시 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이들을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 지니는 파지 입자의 표면에 표시된다. 특정 구체예에서, 이러한 파지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를들어, 인간 또는 뮤린)로부터 발현된 항원 결합 도메인을 표시하기 위해 사용될 수 있다. 관심 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예를들어 라벨링된 항원 또는 고형의 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 항원으로 선택되거나 확인될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 통상적으로 파지 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화물 안정화된 Fv 항체 도메인을 지닌 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 섬유상 파지이다. 치료 단백질에 결합하는 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 표시 방법의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et at., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원 번호 PCT/GB91/01134; PCT 출원 번호 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 U.S. 특허 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108]에 기술된 것을 포함한다.
상기 참조에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역이 단리될 수 있고, 인간 항체, 또는 임의의 기타 요망되는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 세균, 예를들어 하기에 상세하게 기술되는 것을 포함하는 임의의 요망되는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 기술이 또한 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[PCT 공개 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); and Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); and Better et al., Science 240:1041-1043 (1988)]에 기술된 것과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 사용될 수 있다.
단일-사슬 Fvs 및 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 기술의 예는 문헌[U.S. 특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); and Skerra et at., Science 240:1038-1040 (1988)]에 기술된 것을 포함한다. 인간 및 시험관내 검출 분석에서의 항체의 생체내 용도를 포함하는 몇몇 용도에 대해, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 키메라 항체는 항체의 다양한 부분이 다양한 동물 종, 예를들어 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 지니는 항체로부터 유래된다. 키메라 항체를 생성하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Patent Nos. 5,807,715; 4,816,567; and 4,816397]을 참조하라. 인간화된 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 골격 영역을 지니는 요망되는 항원에 결합하는 비-인간 종 항체로부터의 항체 분자이다. 종종, 인간 골격 영역의 골격 잔기는 항원 결합을 변화, 바람직하게는 개선시키기 위해 CDR 공여 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이러한 골격 치환은 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를들어 특정 위치에서의 이상한 골격 잔기를 확인하기 위한 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 확인하기 위한 CDR과 골격 잔기의 상호작용의 모델링에 의해 확인된다(예를들어, 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Queen et at., U.S. 특허 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)] 참조). 항체는, 예를들어 CDR-이식(EP 239,400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Patent Nos. 5,225,539; 5,530,101; and 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(shuffling)(U.S. Patent No. 5,565,332)을 포함하는 당 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 인간화될 수 있다.
전적으로, 인간 항체는 인간 환자의 치료에 대해 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 이용하는 상기 기술된 파지 표시 방법을 포함하는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를들어, 각각의 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[U.S. 특허 4,444,887 및 4,716,111; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741]을 참조하라.
인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없으나, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 예를들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위적으로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역은 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 함께 별개로 또는 동시에 비-기능적이 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합 결실은 내인성 항체 생성을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포는 포배로 확장되고 미세주입되어 키메라 마우스를 생성시킨다. 이후, 키메라 마우스는 개량되어 인간 항체를 발현하는 동형접합 자손을 생성시켰다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 이용하여 일반적인 방식으로 면역화시켰다. 항원에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 이용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 수득될 수 있다. 인간 면역글로불린 형질전환 유전자(transgene)는 B 세포 분화 동안 트랜스제닉 마우스에 의해 잠복되고, 이후 종류 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 이용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성하는 것이 가능한다. 인간 항체를 생성하기 위한 이러한 기술의 개관은 문헌[Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]을 참조하라. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 위한 이러한 기술 및 이러한 항체를 생성하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해서는, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[PCT 공개 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; European Patent No. 0 598 877; U.S. Patent Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 5,939,598; 6,075,181; and 6,114,598]을 참조하라. 게다가, 알제닉스, 인크(Abgenix, Inc., Freemont, CA) 및 젠팜(Genpharm, San Jose, CA)과 같은 회사가 상기 기술된 것과 유사한 기술을 이용하여 선택된 항원에 대해 특이적인 인간 항체를 제공할 수 있다.
전적으로, 선택된 에피토프를 인지하는 인간 항체는 "가이디드 셀렉션(guided selection)"으로 언급되는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이 방법에서, 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를들어 마우스 항체는 동일한 에피토프를 완전하게 인지하는 인간 항체의 선택을 유도하기 위해 사용된다(Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)).
항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드
본 발명은 항체 및 이의 단편을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같이 엄격하거나 덜 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 항체, 바람직하게는 치료 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 보다 바람직하게는 표 2의 "SEQ ID NO:Z" 컬럼에 기술된 "치료 단백질:X"의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 하이브리드되는 폴리누클레오티드를 포함한다.
당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 폴리누클레오티드가 수득될 수 있고, 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열이 결정될 수 있다. 예를들어, 항체의 누클레오티드 서열이 공지된 경우, 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 요컨대, 항체를 엔코딩하는 서열의 일부를 함유하는 오버래핑 올리고누클레오티드의 합성, 이들 올리고누클레오티드의 어닐링 및 라이게이션 후, 라이게이션된 올리고누클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 것을 포함하는 화학적으로 합성된 올리고누클레오티드(예를들어, 문헌[Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)]에 기술된 것과 같음)로부터 어셈블링될 수 있다.
대안적으로, 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 적절한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 엔코딩하는 핵산을 함유하는 클론을 구입가능하지 못하나, 항체 분자의 서열이 공지되어 있는 경우, 면역글로불린을 엔코딩하는 핵산은 서열의 3'말단 및 5' 말단에 하이브리드가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭 또는 확인하기 위한 특정 유전자 서열에 대해 특이적인 올리고누클레오티드 프로브, 예를들어 항체를 엔코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 이용하는 클로닝에 의해 화학적으로 합성되거나 적절한 공급원(예를들어, 항체를 발현하기 위해 선택된 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예를들어 하이브리도마 세포로부터 단리된 항체 cDNA 라이브러리, 또는 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리)으로부터 수득될 수 있다. PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 이후 당 분야에 널리 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다(실시예 65 참조).
항체의 누클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 항체의 누클레오티드 서열은 상이한 아미노산 서열을 지니는 항체를 생성하기 위해, 예를들어 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 생성하기 위해 누클레오티드 서열의 조작을 위해 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를들어 재조합 DNA 기술, 부위 특이적 돌연변이유발, PCR 등을 이용하여 조작될 수 있다(예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]에 기술된 기술 참조).
특정 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를들어 서열 과변이의 영역을 결정하기 위한 기타 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열에 대한 비교에 의해 상보성 결정 영역(CDR)의 서열을 확인하기 위해 검사될 수 있다. 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하여, CDR중 하나 이상이 골격 영역, 예를들어 상기 기술된 바와 같이 비-인간 항체를 인간화시키기 위해 인간 골격 영역으로 삽입될 수 있다. 골력 영역은 자연 발생 또는 콘센서스 골격 영역, 바람직하게는 인간 골격 영역일 수 있다(예를들어, 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) for a listing of human framework regions]을 참조하라). 바람직하게는, 골격 영역과 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리누클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 엔코딩한다. 바람직하게는, 상기 논의된 바와 같이, 하나 이상의 아미노산의 치환이 골격 영역 내에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는 아미노산 치환은 항원에 대한 항체의 결합을 개선시킨다. 추가로, 이러한 방법은 하나 이상의 사슬내 이황화 결합이 결핍된 항체 분자를 생성하기 위한 사슬내 이황화 결합에 관여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 이루기 위해 사용될 수 있다. 폴리누클레오티드에 대한 기타 변경은 본 발명 및 당 분야에 포함된다.
게다가, 적절한 생물 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱시킴으로써 "키메라 항체"의 생성에 대해 개발된 기술이 사용될 수 있다(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)). 상기에 기술된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 다양한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예를들어 뮤린 mAb으로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역, 예를들어 인간화된 항체를 지니는 분자이다.
대안적으로, 단일 사슬 항체의 생성을 위해 기술된 기술(U.S. Patent No. 4,946,778; Bird, Science 242:423- 42 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature 334:544-54 (1989))이 단일 사슬 항체를 생성하기 위해 적용될 수 있다. 단일 사슬 항체는 단일 사슬 폴리펩티드를 생성시키는 아미노산 브리지(bridge)를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시킴으로써 형성된다. 대장균에서의 기능적 Fv 단편의 어셈블링을 위한 기술이 또한 사용될 수 있다(Skerra et al., Science 242:1038- 1041 (1988)).
항체의 재조합 발현
항체 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체(예를들어, 항체 또는 단일 사슬 항체의 중쇄 또는 경쇄)의 재조합 발현은 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 작제물을 필요로 한다. 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 일부(바람직하게는, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 영역을 함유함)를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 수득되면, 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 항체 분자의 생성을 위한 벡터가 생성될 수 있다. 따라서, 항체 엔코딩 누클레오티드 서열을 함유하는 폴리누클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하느 방법이 본원에 기술되어 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전적 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 실시가능하게 연결된 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예를들어, PCT 공개 WO 86/05807; PCT 공개 WO 89/01036; 및 U.S. 특허 No. 5,122,464 참조), 항체 분자의 가변 영역은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위한 벡터로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포로 이동되고, 이후 트랜스펙션된 세포는 항체를 생성하기 위해 통상적인 기술에 의해 배양된다. 따라서, 본 발명은 이조유래 프로모터에 사용가능하게 연결된 본 발명의 항체, 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 단일 사슬 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중-사슬 항체의 발현을 위한 바람직한 구체예에서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 엔코딩하는 벡터는 하기에 상세하게 기술되는 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에서 공동발현될 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 발현시키기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생성된 후 정제될 수 있는 비히클을 나타내고, 또한 적절한 누클레오티드 코딩 서열이 형질전환되거나 트랜스펙션되는 경우 제자리에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예를들어, 대장균, 고초균); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를들어, 사카로마이세스, 피키아); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를들어, 꽃양배추 모자이크바이러스, CaMV; 담배 모자이크병 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예르들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 유전체(예를들어, 금속티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예를들어, 아데노바이러스 레이트 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 작제물을 포함하는 포유동물 세포 시스템(예를들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)와 같은 미생물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특히, 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 바람직하게는 세균 세포, 예를들어 대장균, 더욱 바람직하게는 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를들어, 인간 사이토메갈로 바이러스로부터의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 성분(major intermediate early gene promoter element)과 같은 벡터와 관련한 포유동물 세포, 예를들어 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)는 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et at., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
세균 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 항체 분자를 위한 용도에 따라 이롭게 선택될 수 있다. 예를들어, 매우 다량의 이러한 단백질이 생성되는 경우, 항체 분자의 약학적 조성물의 생성을 위해, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준의 발현과 관련된 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 항체 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역을 지닌 골격내의 벡터로 단독으로 라이게이션되어 융합 단백질이 생성될 수 있는 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)를 지닌 융합 단백질과 같은 외부 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온-아가로오스 비드에 대한 흡수 및 결합 후 자유 글루타티온의 존재하에서 용리에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 고안되어 있어, 클로닝된 표적 유전자 생성물은 GST 부분으로부터 방출될 수 있다.
곤충 시스템에서, 핵다각체병 바이러스(AcNPV)가 외부 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용된다. 바이러스는 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예를들어, 폴리헤드린 유전자)으로 단독으로 클로닝될 수 있고, AcNPV 프로모터(예를들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절하에 위치될 수 있다.
*포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기재 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를들어 레이트 프로모터 및 셋으로 나뉜 선도 서열로 라이게이션될 수 있다. 이후, 이러한 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 유전체로 삽입될 수 있다. 바이러스 유전체의 비-필수 영역(예를들어, E1 또는 E3) 내의 삽입은 가변적이고 감염된 숙주의 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 발생시킬 것이다(예를들어, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984) 참조). 특정 개시 신호가 또한 삽입된 항체 코딩 서열의 효과적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 더욱이, 개소 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위한 요망되는 코딩 서열의 판독틀과 일치하여야 한다. 이러한 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 발생원일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인헨서 성분, 전사 종결자 등의 포함에 의해 향상될 수 있다(Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987) 참조).
또한, 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 요망되는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변경하고 가공하도록 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예를들어, 당화) 및 가공(예를들어, 분해)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 다양한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 가공 및 변형에 대해 특징적이고 특정한 메커니즘을 지닌다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 이를 위해서, 일차 전사체의 적당한 가공, 당화, 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포내 기구를 소유하는 진핵세포 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, 및 특히 유방암 세포주, 예를들어 BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, 및 정상적인 유선 세포주, 예를들어 CRL7030 및 Hs578Bst를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
장기간, 재조합 단백질의 고수율 생성, 안정한 발현이 바람직하다. 예를들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주가 고안될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 이용하기 보다, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예를들어, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐레이트 부위 등)에 의해 조절되는 DNA, 및 선택 표지를 이용하여 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 고안된 세포는 보강 배지에서 1-2일 동안 성장하게 한 후, 선택 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드의 선택 표지는 선택에 대한 내성을 수여하고, 세포는 이들의 염색체 내로 플라스미드를 안정적으로 통합되도록 하고, 차례로 클로닝되고 세포주내로 확장될 수 있는 유전자좌를 형성하도록 성장된다. 이러한 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 고안하기 위해 이롭게 사용될 수 있다. 이러한 고안된 세포주는 항체 분자와 직접적 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특이 유용할 수 있다.
각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에 사용될 수 있는 단순헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라아제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라아제(Lowy et at., Cell 22:817 (1980)) 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성이 하기의 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 내성을 수여하는 dhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 미코페놀린산에 내성을 수여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 내성을 수여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215 (1993)); 및 히그로마이신에 내성을 수여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). 제조합 DNA 기술의 당 분야에 일반적으로 공지된 방법이 요망되는 재조합 클론을 선택하기 위해 통상적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법은, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(개관을 위해 문헌[Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987))] 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템의 표지가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 표지 유전자의 복제의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되어 있으므로, 항체의 생성이 또한 증가할 것이다(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
선택 표지로서 글루타민 합성효소(GS) 또는 DHFR을 사용하는 벡터는 각각 메티오닌 설폭시민 또는 메토트렉세이트의 존재하에서 증폭될 것이다. 글루타민 합성효소 기재 벡터의 장점은 글루타민 합성효소 읍성인 세포주(예를들어, 뮤린 골수종 세포주, NSO)의 이용가능성이다. 글루타민 합성효소 발현 시스템은 또한 내인성 유전자의 기능을 방지하기 위한 추가의 억제제를 제공함으로써 글루타민 합성효소 발현 세포(예를들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)에서 기능을 할 수 있다. 글루타민 합성효소 발현 시스템 및 이의 성분은 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된 PCT 공개 W087/04462; WO86/05807; WO89/01036; W089/10404; 및 WO91/06657에 상세하기 기술되어 있다. 추가로, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 글루타민 합성효소 발현 벡터는, 예를들어 론자 바이오로직스, 인크(Lonza Biologics, Inc., Portsmouth, NH)를 포함하는 공급업체로부터 시판된다. 뮤린 골수종 세포의 GS 발현 시스템을 이용하는 모노클로날 항체의 발현 및 생성은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Bebbington et al ., Bio / technology 10:169(1992) and in Biblia and Robinson Biotechnol . Prog . 11:1 (1995)]에 기술되어 있다.
숙주 세포는 본 발명의 두개의 발현 벡터, 즉 중쇄 유래 폴리펩티드를 엔코딩하는 첫번째 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 엔코딩하는 두번째 벡터와 함께 공동-트랜스펙션될 수 있다. 두개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택 표지를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두를 엔코딩하고, 이의 발현을 가능하게 하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 과량의 유독한 자유 중쇄를 회피하기 위해 중쇄 전에 위치되어야 한다(Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 유전체 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생성되거나, 화학적으로 합성되거나, 재조합적으로 발현된 후, 이는 면역글로불린 분자의 정제에 대해 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를들어 크로마토그래피(예를들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후의 특이적 항원에 대한 친화성, 및 크기 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도차, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 기타 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 치료 단백질에 결합하고 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체 또는 이의 단편은 정제를 촉진하기 위해 본원에 기술되거나 당 분야에 달리 공지된 이종유래 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
항체의 변형
치료 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 항체는 표지 서열, 예를들어 정제를 촉진하는 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표지 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예를들어 pQE 벡터에 제공된 태그(tag)(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) 등이고, 이들중 다수는 시판된다. 예를들어, 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 기술된 헥사-히스티딘이 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그는 인플루엔자 적혈구응집소 단백질로부터 유래된 에피토프에 해당하는 적혈구응집소 태그("HA 태그"로도 언급됨)(Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) 및 "플래그" 태그를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 추가로 진단제 또는 치료제에 컨쥬게이션된 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 항체는, 예를들어 소정의 치료법의 효력을 결정하기 위한 임상 시험 과정의 일부로서 종양의 발달 또는 진행을 모니터하는데 진단적으로 사용될 수 있다. 항체를 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 검출이 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보조 분자족, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자방출 단층촬영을 이용하는 양전자방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 검출가능한 물질은 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 중간물질(예를들어, 당 분야에 공지된 링커)을 통해 항체(또는 이의 단편)에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 예를들어, 본 발명에 따른 진단법으로 사용하기 위해 항체와 컨쥬게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서는 U.S. 특허 No. 4,741,900를 참조하라. 적절한 효소의 예는 호스라디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린스테라아제를 포함하고; 적절한 보조 분자족 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적절한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 형광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라아제, 루시페린, 및 애큐오린을 포함하고; 적절한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc를 포함한다. 검출가능한 물질의 기타 예는 본원의 어딘가에 기술되어 있다.
추가로, 본 발명의 항체는 치료 부분, 예를들어 세포독소, 예를들어 세포증식 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를들어 알파-방출기, 예를들어 213Bi에 컨쥬게이션될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 작용제를 포함한다. 이의 예는 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀올, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는 항대사물질(예를들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를들어, 메클로르에타민, 티오에파클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(Ⅱ)(DDP) 시스플라틴, 안트라사이클린(예를들어, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를들어, 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안크라마이신(AMC)), 및 유사분열 억제제(예를들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 컨쥬게이트는 소정의 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용될 수 있고, 치료제 또는 약물 부분은 고전적인 화학적 치료제에 제한되는 것으로 간주되는 것은 아니다. 예를들어, 약물 부분은 요망되는 생물학적 활성을 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를들어 독소, 예를들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를들어 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 13-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 아폽토시스 작용제, 예를들어 TNF-알파, TNF-베타, AIM I(국제 공개 WO 97/33899 참조), AIM II (국제 공개 WO 97/34911 참조), Fas 리간드(Takahashi et al ., Int . Immunol ., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (See, International Publication No. WO 99/23105), 혈전용해제 또는 항혈관형성제, 예를들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 조절물질, 예를들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("1L-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 집락 자극인자("GM-CSF"), 과립구 집락 자극인자("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자를 포함할 수 있다.
항체는 또한 표적 항원의 면역검정 또는 정제에 특히 유용한 고형의 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고형의 지지체는 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
항체에 대한 이러한 치료 부분을 컨쥬게이션시키는 기술은 널리 공지되어 있다. 예를들어 문헌[Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)]을 참조하라.
대안적으로, 항체는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Segal in U.S. 특허 제4,676,980호]에 기술된 바와 같이 항체 헤테로컨쥬게이트를 형성하기 위해 이차 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
치료 부분이 컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않은 항체는 단독으로 또는 치료제로 사용될 수 있는 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토카인과 함께 투여된다.
항체-알부민 융합
치료 단백질에 결합하고 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당할 수 있는 항체는 표 1의 "치료 단백질 X" 컬럼에 기술된 치료 단백질에 결합하는 항체, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VH 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 하나, 두개 또는 세개의 VH CDR을 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VH CDR1을 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VH CDR2를 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VH CDR3를 포함하거나 이로 구성된다.
기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VL 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 하나, 두개 또는 세개의 VL CDR을 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VL CDR1을 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VL CDR2를 포함하거나 이로 구성된다. 기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 VL CDR3를 포함하거나 이로 구성된다.
기타 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 하나, 두개, 세개, 네개, 또는 여섯개의 VH 및/또는 VL CDR을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직한 구체예에서, 치료 단백질에 면역특이적으로 결합하고 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 항체의 단편 또는 변이체는 (Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO:4)와 같은 펩티드 링커에 의해 치료 항체의 VL 도메인에 결합된 치료 단백질의 VH 도메인을 포함하는 scFv를 포함하거나 이로 구성된다.
면역표현형검사
치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 세포주 및 생물학적 샘플의 면역표현형검사에 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 단백질은 세포-특이적 표지, 더욱 특히 특정 세포 유형의 분화 및/또는 성숙의 다양한 단계에서 다양하게 발현되는 세포내 표지로서 유용할 수 있다. 특정 에피토프, 또는 에피토프의 조합에 대한 모노클로날 항체(또는 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질)는 표지를 발현하는 세포내 집단의 스크리닝을 가능하게 한다. 모노클로날 항체(또는 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질)를 이용하여 표지(들)을 발현하는 세포내 집단의 스크리닝을 위해 다양한 기술이 사용될 수 있고, 이는 항체-코팅된 자기 비드를 이용하는 자기 분리, 고형 매트릭스에 부착된 항체를 이용한 "패닝(panning)", 및 유세포 분석을 포함한다(예를들어, U.S. Patent 5,985,660; and Morrison et al ., Cell , 96:737-49 (1999) 참조).
이들 기술은 혈액학적 암(즉, 급성 백혈병 환자의 최저잔류병(MRD))및 이식-대-숙주병(GVHD)을 방지하기 위한 이식의 "비-자기" 세포를 이용하여 발견될 수 있는 세포의 특정 집단의 스크리닝을 가능하게 한다. 대안적으로, 이들 기술은 인간 제대혈에서 발견될 수 있는 바와 같은 증식 및/또는 분화를 겪을 수 있는 조혈간세포 및 프로제니터 세포의 스크리닝을 가능하게 한다.
치료 단백질에 결합하는 항체 및 치료 단백질에 결합하는 항체의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질의 특성규명
본 발명의 항체 또는 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 다양한 방법으로 특성규명될 수 있다. 특히, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 본원에 기술된 기술 또는 당 분야에 공지된 통상적으로 변형된 기술을 이용하여 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 결합하는 항체에 상응하는 치료 단백질에 결합하는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 검정될 수 있다.
특정 단백질 또는 에피토프에 (특이적으로) 결합하는 본 발명의 항체 또는 특정 단백질 또는 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 능력에 대한 검정은 용액중(예를들어, Houghten, Bio/Techniques 13:412-421(1992)), 비드상(예를들어, Lam, Nature 354:82-84 (1991)), 칩상(예를들어, Fodor, Nature 364:555-556 (1993)), 세균(예를들어, U.S. Patent No. 5,223,409), 포자(예를들어, Patent Nos. 5,571,698; 5,403,484; and 5,223,409), 플라스미드(예를들어, Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869 (1992)) 또는 파지(예를들어, Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990); and Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991))(각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨)에서 수행될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 본원에 기술되거나 당 분야에 달리 공지된 통상적으로 변형된 기술을 이용하여 특정 단백질 또는 에피토프에 대한 이들의 특이성 및 친화성에 대해 검정될 수 있다.
치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 기타 항원(예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 해당하는 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체에 의해 특이적으로 결합되는 분자(들)과 서열/구조 보존성을 지니는 분자)을 이용하여 교차-반응성에 대해 검정될 수 있다.
(면역특이적) 결합 및 교차-반응성을 검정하기 위해 사용될 수 있는 면역검정법은 웨스턴 블로팅, 방사선면역측정법, ELISA(효소 면역측정법), "샌드위치" 면역검정법, 면역침강 검정법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정법, 응집 검정법, 보체-결합 검정법, 면역방사 검정법, 형광 면역검정법, 및 단백질 A 면역검정법 등과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 검정법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 검정법은 통상적이고 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를들어, 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). 예시적 면역검정법은 하기에 간단히 기술되어 있다(이에 제한되지는 않는다).
면역침강 프로토콜은 일반적으로 용해 완충용액, 예를들어 단백질 포스파타아제 및/또는 프로테아제 억제제(예를들어, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 나트륨 바나데이트)로 보충된 RIPA 완충용액(1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 인산나트륨(pH 7.2), 1% 트라실롤)중에 세포 집단을 용해시키고, 세포 용해물에 본 발명의 항체 또는 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 첨가하고, 40℃에서 일정 기간(예를들어 1 내지 4시간) 동안 인큐베이팅시키고, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로오즈 비드(또는 알부민 융합 단백질이 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 경우에 적절한 항-이디오타입 항체 또는 항-알부민 항체로 코팅된 비드)를 세포 용해물에 첨가하고, 40℃에서 약 1시간 이상 인큐베이팅시키고, 용해 완충용액에서 비드를 세척하고, SDS/샘플 완충용액에서 비드를 재현탁시키는 것을 포함한다. 특정 항원을 면역침강시키는 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질의 능력은 , 예를들어 웨스턴 블로팅 검정에 의해 측정될 수 있다. 당업자는 항원에 대한 항체 또는 알부민 융합 단백질의 결합을 증가시키고 백그라운드를 감소시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터를 인지할 것이다(예를들어, 세파로오즈 비드를 이용한 세포 용해물의 사전-세척). 면역침강 프로토콜에 대한 추가의 논의는, 예를들어 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1]을 참조하라.
웨스턴 블로팅 검정은 일반적으로 단백질 샘플을 준비하고, 폴리아크릴아미드 겔(예를들어, 항원의 분자량에 따른 8%- 20% SDS-PAGE)에서 단백질 샘플의 전기영동시키고, 폴리아크릴아미드 겔로부터의 단백질 샘플을 막, 예를들어 니트로셀룰로오스, PVDF 또는 나일론으로 이동시키고, 블로킹 용액(예를들어, 3% BSA 또는 무지방유)에서 막을 블로킹시키고, 세척 완충용액(예를들어, PBS-Tween 20)에서 막을 세척하고, 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질(블로킹 완충용액에 희석됨)을 막에 적용시키고, 세척 완충용액에서 막을 세척하고, 블로킹 완충용액에 희석된 효소 기질(예를들어, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제) 또는 방사성 분자(예를들어, 32P or1250)에 컨쥬게이션된 이차 항체(알부민 융합 단백질, 예를들어 항-인간 혈청 알부민 항체를 인지함)를 적용시키고, 완충 용액중에서 막을 세척하고, 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키고 백그라운드 노이즈를 감소시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터를 인지할 것이다. 웨스턴 블로팅 프로토콜에 대한 추가의 논의는, 예를들어 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1]을 참조하라.
ELISA는 항원으로 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 코팅시키고, 웰에 결합하지 않는 항원을 세척하고, 검출가능한 화합물, 예를들어 효소 기질(예를들어, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제)과 컨쥬게이션된 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질(치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함함)을 웰에 첨가하고, 일정 기간 동안 인큐베이팅시키고, 결합되지 않거나 비-특이적으로 결합된 알부민 융합 단백질을 세척하고, 웰을 코팅하는 항원에 특이적으로 결합된 항체 또는 알부민 융합 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함한다. ELISA에서, 항체 또는 알부민 융합 단백질은 검출가능한 화합물에 컨쥬게이션되지 않고, 대신 검출가능한 화합물에 컨쥬게이션된 이차 항체(항체 또는 알부민 융합 단백질을 각각 인지함)가 웰에 첨가될 수 있다. 추가로, 항원으로 웰을 코팅하는 대신, 항체 또는 알부민 융합 단백질이 웰에 코팅될 수 있다. 이 경우, 검출가능한 분자는 검출가능한 화합물, 예를들어 효소 기질(예를들어, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제)에 컨쥬게이션된 항원일 수 있다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키기 위해 변형될 수 있는 파라미터 뿐만 아니라 당 분야에 공지된 ELISA의 변형을 인지할 것이다. ELISA에 대한 추가의 논의는, 예를들어 문헌[Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1]을 참조하라.
단백질, 항원 또는 에피토프에 대한 알부민 융합 단백질의 결합 친화성 및 항체- 또는 알부민 융합 단백질-단백질/항원/에피토프 상호작용의 오프-레이트는 경쟁적 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예는 증가되는 양의 라벨링되지 않은 항원의 존재하에서 라벨링된 항원(예를들어, 3H or 125I)과 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질의 인큐베이션, 및 라벨링된 항원에 결합된 항체의 검출을 포함하는 방사면역측정법이다. 특정 단백질, 항원 또는 에피토프에 대한 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질의 친화성 및 결합 오프-레이트는 스캐챠드 플롯 검정(Scatchard plot analysis)에 의한 데이터로부터 결정될 수 있다. 항체 또는 알부민 융합 단백질로서 동일한 단백질, 항원 또는 에피토프에 결합하는 이차 단백질과의 경쟁은 또한 방사면역측정법을 이용하여 결정될 수 있다. 이 경우, 단백질, 항원 또는 에피토프는 본 발명의 알부민 융합 단백질과 동일한 단백질, 항원 또는 에피토프에 결합하는 증가되는 양의 라벨링되지 않은 이차 단백질의 존재하에서 라벨링된 화합물(예를들어, 3H or125I)에 컨쥬게이션된 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질과 인큐베이션된다.
바람직한 구체예에서, BIAcore 동역학 검정은 단백질, 항원 또는 에피토프에 대한 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질의 결합 및 오프-레이트를 결정하기 위해 사용될 수 있다. BIAcore 동역학 검정은 표면에 특정 폴리펩티드, 항원 또는 에피토프, 항체 또는 알부민 융합 단백질이 고정된 칩으로부터 각각 항체, 알부민 융합 단백질, 또는 특정 폴리펩티드, 항원 또는 에피토프의 결합 및 해리를 검정하는 것을 포함한다.
치료 용도
본 발명은 추가로 기술된 질병, 장애 또는 질환중 하나 이상을 치료하기 위해 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 환자에게 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는 항체-기재 요법에 관한 것이다. 본 발명의 치료 화합물은 본 발명의 항체(본원에 기술된 이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함함), 본 발명의 항체(본원에 기술된 이의 단편, 유사체 및 유도체, 및 이디오타입 항체를 포함함)를 엔코딩하는 핵산, 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질, 및 이러한 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 본원에 기술된 질병, 장애 또는 질환중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 치료 단백질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나, 억제하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 치료 단백질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 장애 또는 질환의 치료 및/또는 예방은 상기 질병, 장애 또는 질환과 관련된 증상을 완화시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질이 당 분야에 공지되거나 본원에 기술된 약학적으로 허용되는 조성물로 제공될 것이다.
특정의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 신경 장애, 면역계 장애, 근 장애, 생식 장애, 위장 장애, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 증식성 장애, 및/또는 암성 질병 및 질환., 및/또는 본원에 기술된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 질병, 장애 또는 질환을 치료하기 위해 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간 환자에게 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 투여하는 것을 포함하는 항체-기재 요법에 관한 것이다. 본 발명의 치료 화합물은 본 발명의 항체(예를들어, 포유동물 세포의 세포 표면에서 발현된 전장의 단백질에 대한 항체; 치료 단백질의 에피토프에 대한 항체) 및 본 발명의 항체(본원에 기술된 바와 같이, 이의 단편, 유사체 및 유도체, 및 항-이디오타입 항체를 포함함)를 엔코딩하는 핵산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 항체는 본원에 기술된 질병, 장애 또는 질환중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는 치료 단백질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다. 치료 단백질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 장애 또는 질환의 치료 및/또는 예방은 상기 질병, 장애 또는 질환과 관련된 증상을 완화시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 당 분야에 공지되거나 본원에 기술된 약학적으로 허용되는 조성물로 제공될 수 있다.
*치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질이 치료적으로 사용될 수 있는 방법의 개요는 체내에 치료 단백질을 국소적으로 또는 전신적으로 결합시키거나, 예를들어 보체(CDC) 또는 효과기 세포(ADCC)에 의해 매개되는 바와 같은 항체의 직접적인 세포독성에 의해 결합시키는 것을 포함한다. 이들 방법중 일부는 하기에 보다 상세하게 기술되어 있다. 본원에 제공된 교시에 의해, 당업자는 과도한 실험 없이 진단, 모니터 또는 치료 목적을 위해 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질을 사용하는 방법을 인지할 것이다.
치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 알부민 융합 단백질은 유리하게는 기타 모노클로날 또는 키메라 항체, 또는 림포카인 또는 조혈 성장 인자(예를들어, IL-2, IL-3 및 IL-7)와 함께 사용되어, 항체와 상호작용하는 효과기 세포의 수 또는 활성을 증가시킬 수 있다.
치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 항체 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 단독으로 또는 기타 유형의 치료(예를들어, 방사선 요법, 화학 요법, 호르몬 요법, 면역요법 및 항-종양제)과 조합되어 투여될 수 있다. 일반적으로, 환자의 종과 동일한 종인 종 유래 또는 종 반응성(항체의 경우)의 생성물을 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 인간 항체, 이의 단편, 유도체, 유사체, 또는 핵산이 치료 또는 예방을 위해 인간 환자에게 투여된다.
본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 단편과 관련된 면역검정 및 장애의 요법을 위해 치료 단백질, 이의 단편 또는 영역에 대한 고 친화성이고/이거나 생체내에서 효능있는 억제되고/되거나 중화된 항체(또는 이와 관련된 알부민 융합 단백질)를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체, 단편, 또는 영역은 바람직하게는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 단편에 대해 친화성을 지닐 것이다. 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, l0-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 포함한다. 더욱 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-5 M, l0-5 M, 5 X l0-6 M, 10-6 M, 5 X 10-7 M, 107 M, 5 X 10-8 M 또는 10-8 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지닌 것을 포함한다. 더욱 더 바람직한 결합 친화성은 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리상수 또는 Kd를 지니는 것을 포함한다.
유전자 요법
특정 구체예에서, 치료 단백질에 결합하는 항체를 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산 또는 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질이 치료 단백질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 장애를 치료하거나, 억제하거나, 예방하기 위해 유전자 요법에 의해 투여된다. 유전자 요법은 발현되거나 발현가능한 핵산을 피검체에 투여함으로써 수행되는 요법을 의미한다. 본 발명의 구체예에서, 핵산은 치료 효과를 매개하는 이들의 엔코딩된 단백질을 생성한다.
당 분야에서 이용가능한 유전자 요법에 대한 임의의 방법이 본 발명에 사용될 수 있다. 예시적 방법은 본 출원의 어딘가에 보다 상세하게 기술되어 있다.
치료 또는 예방 활성의 입증
본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물은 바람직하게는 인간에게 사용되기 이전에 요망되는 치료 또는 예방 활성에 대해 시험관내에서 시험된후, 생체내에서 시험된다. 예를들어, 화합물 또는 약학적 조성물의 치료 또는 예방 용도를 입증하기 위한 시험관내 검정은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 화합물의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 화합물 또는 조성물의 효과는 로제트 형성 검정 및 세포 용해 검정을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 특정 화합물의 투여가 징후를 나타내는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 검정은 환자 조직 샘플이 배양되어 성장되고, 달리 투여된 화합물에 노출되어, 조직 샘플에 대한 화합물의 효과가 관찰되는 시험관내 세포 배양 검정을 포함한다.
치료/예방 투여 및 조성물
본 발명은 유효량의 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물을 환자에게 투여함으로써 치료하고, 억제하고, 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 화합물은 실질적으로 정제(예를들어, 효과를 제한하거나 요망되지 않는 부작용을 일으키는 물질을 실질적으로 제거)된다. 피검체는 바람직하게는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 동물이고, 바람직하게는 포유동물이고, 가장 바람직하게는 인간이다.
화합물이 핵산 또는 면역글로불린을 포함하는 경우 사용될 수 있는 포뮬레이션 및 투여 방법은 하기에 기술되어 있고; 추가의 적절한 포뮬레이션 및 투여 경로는 본원의 하기에 기술된 것으로부터 선택될 수 있다.
다양한 전달 시스템, 예를들어 리포솜내 인캡슐레이션, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포내이입(예를들어, 문헌[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 참조), 레트로바이러스 또는 기타 벡터의 일부로서 핵산의 작제 등이 본 발명의 화합물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근내, 복막매, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 및 구강 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를들어 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막피부 내막(예를들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 화합물 또는 조성물을 뇌실내 및 수막강내 주사를 포함하는 임의의 적절한 경로에 의해 중추신경계로 도입시키는 것이 바람직할 수 있고; 뇌실내 주사는 뇌실내 카테터, 예를들어 저장소, 예를들어 옴마야(Ommaya) 저장소에 부착된 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 폐 투여는 또한, 예를들어 흡입 또는 분무기, 및 분무제를 지닌 포뮬레이션의 사용에 의해 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 약학적 화합물 또는 조성물이 치료를 요하는 부위에 국소적으로 투여되는 것이 요망될 수 있고; 이는, 예를들어 수술중 국소 주입, 예를들어 수술 후의 상처 드레싱과 관련한 국소 적용, 주사, 카테터, 좌약, 임플란트(이는 다공성, 비다공성, 또는 실라스틱막 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 젤라틴성 물질임)에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 포함하는 단백질이 투여되는 경우, 단백질이 사용하는 물질에 흡수되지 않도록 주의해야 한다.
또 다른 구체예에서, 화합물 또는 조성물은 비히클, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.] 참조).
또 다른 구체예에서, 화합물 또는 조성물은 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다(예를들어, 문헌[Langer, supra ; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)] 참조). 또 다른 구체예에서, 중합 물질이 사용될 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); see also Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J.Neurosurg. 71:105 (1989)] 참조). 또 다른 구체예에서, 조절 방출 시스템이 치료 표적, 예를들어 뇌의 부근에 위치될 수 있어, 단지 전신 용량의 일부만 요구될 수 있다(예를들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra , vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조).
기타 조절 방출 시스템이 문헌[Langer (Science 249:1527-1533 (1990))]이 리뷰에 논의되어 있다.
본 발명의 화합물이 단백질을 엔코딩하는 핵산인 특정 구체예에서, 레트로바이러스 벡터(U.S. Patent No. 4,980,286 참조)의 사용에 의하거나, 직접 주사에 의하거나, 미세입자 봄바드먼트(bombardment)(예를들어, 유전자총; Biolistic, Dupont), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션 작용제의 사용에 의하거나, 이를 핵으로 진입하는 것으로 공지된 호메오박스-유사 펩티드와 연관하여 투여함으로써 세포내에 존재하게 하기 위하여, 핵산은 이를 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고, 이를 투여함으로써 핵산의 코딩되는 단백질의 발현을 촉진시키기 위해 생체내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 세포내로 도입되어 상동 재조합에 의해 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내로 통합될 수 있다.
본 발명은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료적 유효량의 화합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 구체예에서, 용어 "치료적으로 허용되는"은 연방 또는 주정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 동물, 더욱 특히 인간에 대해 U.S. 약전 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에 기술된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형체, 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예를들어 물 및 오일, 예를들어 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예를들어 낙화생유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액은 또한, 특히 주사용 액체를 위한 액체 담체로 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 곡분, 초크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 요망되는 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀션화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 지효성 방출 포뮬레이션 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예를들어 트리글리세라이드와 함께 좌약으로 포뮬레이팅될 수 있다. 경구용 포뮬레이션은 표준 담체, 예를들어 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함할 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은, 환자에게 투여하기에 적절한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 담체와 함께 바람직하게는 정제된 형태로 치료적 유효량의 화합물을 함유할 것이다. 포뮬레이션은 투여 모드에 적합해야 한다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 인간에게 정맥내 투여되는 약학적 조성물에 적합한 통상적인 방법에 따라 포뮬레이팅된다. 통상적으로, 정맥내 투여하기 위한 조성물은 멸균된 등장성의 수성 완충용액이다. 필요시, 조성물은 또한 용해보조제 및 주사 부위의 동통을 완화시키기 위한 국소 마취제, 예를들어 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 또는 단위 복용 형태, 예를들어 밀봉된 용기, 예를들어 활성제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사케트(sachette) 내의 동결건조된 분말 또는 물이 제거된 농축물로 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균된 약학적 등급의 물 도는 염수를 함유하는 주입병으로 조제될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀은 성분이 투여전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로 포뮬레이팅될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 음이온과 함께 형성된 염, 예를들어 염산, 포스포르산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 염 및 양이온과 함께 형성된 염, 예를들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 염을 포함한다.
치료 단백질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 장애의 치료, 억제 및 예방에 유효할 본 발명의 화합물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 게다가, 시험관내 검정법이 적절한 용량 범위의 확인을 보조하기 위해 임의로 사용될 수 있다. 포뮬레이션에 사용되기 위한 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질병 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
항체에 대해서는, 환자에게 투여되는 용량은 통상적으로 환자 체중의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 용량은 환자 체중의 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 더욱 바람직하게는 환자 체중의 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 기타 종으로부터의 항체 보다 인간 체내에서 긴 반감기를 지닌다. 따라서, 인간 항체의 보다 낮은 용량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능한다. 추가로, 본 발명의 항체의 투여의 용량 및 빈도는 변형, 예를들어 지질화(lipidation)에 의해 항체의 흡수 및 조직 투과(예를들어, 뇌로의 투과)를 향상시킴으로써 감소될 수 있다.
진단 및 영상
치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)(치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질도 포함함)에 결합하는 라벨링된 항체 및 이의 유도체 및 유사체는 치료 단백질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 장애 및/또는 질환을 검출하거나, 진단하거나, 모니터하기 위한 진단 목적에 사용될 수 있다. 본 발명은 (a) 관심 폴리펩티드에 특이적인 하나 이상의 항체를 이용하여 개체의 세포 또는 체액 내의 치료 단백질의 발현을 검정하고, (b) 유전자 발현의 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하고, 이에 의해 표준 발현 수준에 비한 검정된 치료 단백질 발현 수준의 증가 또는 감소가 이상 발현의 표시임을 포함하는, 치료 단백질의 이상 발현의 검출이 제공된다.
본 발명은 (a) 치료 단백질에 특이적인 하나 이상의 항체 또는 치료 단백질에 특이적인 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 이용하여 개체의 세포 또는 체액에서 치료 단백질의 발현을 검정하고, (b) 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하고, 이에 의해 표준 발현 수준에 비한 검정된 치료 단백질 발현 수준의 증가 또는 감소가 특정 장애의 표시임을 포함하는, 장애를 진단하기 위한 진단 검정법을 제공한다. 암에 대해서, 개체로부터의 생검된 조직의 비교적 과다한 양의 전사체의 존재는 질병의 발달에 대한 소인을 나타낼 수 있거나, 실제 임상 증상의 출현에 앞서 질병을 검출하기 위한 방법을 제공할 수 있다. 이러한 유형의 보다 명확한 진단은 건강 전문가로 하여금 보다 이른 예방 방법 또는 적극적인 치료를 가능하게 하여 암의 발달을 예방하거나 추가의 진행을 예방하게 한다.
본 발명의 항체 또는 치료 단백질에 특이적인 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법을 이용하여 생물학적 샘플에서의 단백질 수준을 검정하는데 사용될 수 있다(예를들어, 문헌[Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell . Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참조). 단백질 유전자 발현을 검출하기 위해 유용한 기타 항체-기재 방법은 면역검정법, 예를들어 효소면역측정법(ELISA) 및 방사면역측정법(RIA)을 포함한다. 적절한 항체 검정 라벨은 당 분야에 공지되어 있고, 효소 라벨, 예를들어 글루코오스 옥시다아제; 방사성동위원소, 예를들어 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99Tc); 발광 라벨, 예를들어 루미놀; 및 형광 라벨, 예를들어 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다.
본 발명의 하나의 일면은 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간의 치료 단백질의 이상 발현과 관련된 질병 또는 장애의 검출 및 진단이다. 한 구체예에서, 진단은 a) 관심 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 라벨링된 분자의 유효량을 피검체에 투여(예를들어, 비경구, 피하, 또는 복막내 투여)하고, b) 투여후 라벨링된 분자가 치료 단백질이 발현되는 피검체의 부위에 우선적으로 농축되도록(또한 결합되지 않은 라벨링된 분자가 백그라운드 수준으로 제거되도록) 허용되는 기간 동안 기다리고, c) 백그라운드 수준을 결정하고, d) 피검체의 라벨링된 수준을 검출하여, 백그라운드 수준 이상의 라벨링된 분자의 검출이 피검체가 치료 단백질의 이상 발현과 관련된 특정 질병 또는 장애를 지님을 나타내는 것을 포함한다. 백그라운드 수준은 특정 시스템에 대해 미리 결정된 표준값에 대해 검출된 라벨링된 분자의 양을 비교하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
피검체의 크기 및 사용되는 영상 시스템이 진단 영상을 생성하기 위해 필요한 영상 부분의 양을 결정하게 되는 것을 당업자는 이해할 것이다. 인간 피검체에 대한 방사성동위원소 부분의 경우에서, 주입되는 방사성동위원소의 양은 일반적으로 약 5 내지 20 밀리큐리의 99mTc 범위일 것이다. 라벨링된 항체, 항체 단편 또는 치료 단백질에 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 이후 특정 치료 단백질을 함유하는 세포의 위치에 우선적으로 축적될 것이다. 생체내 종양 영상은 문헌[S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)]에 기술되어 있다.
사용되는 라벨의 유형 및 투여 모드를 포함하는 여러 변수에 따라, 투여 후의 라벨링된 분자가 피검체의 부위에 우선적으로 농축되고, 결합되지 않은 라벨링된 분자가 백그라운드 수준으로 제거되도록 허용되도록 하는 시간 간격은 6 내지 48시간 또는 6 내지 24시간 또는 6 내지 12시간이다. 또 다른 구체예에서, 투여 후의 시간 간격은 5 내지 20일 또는 5 내지 10일이다.
한 구체예에서, 질병 또는 장애의 모니터링은 , 예를들어 최초 진단 후 1개월, 최초 진단 후 6개월, 최초 진단 후 1년 등과 같이 질병 또는 장애를 진단하기 위한 방법을 반복함으로써 수행된다.
라벨링된 분자의 존재는 생체내 스캐닝에 대해 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 환자에서 검출될 수 있다. 이들 방법은 사용되는 라벨의 유형에 좌우된다. 당업자는 특정 라벨을 검출하기 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에 사용될 수 있는 방법 및 장치는 전산화 단층촬영법(CT), 전신 스캔, 예를들어 양전자 방출 단층촬영(PET), 자기공명영상(MPI), 및 초음파촬영술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 분자는 방사성동위원소를 이용하여 라벨링되고, 방사선 반응 외과 기구를 이용하여 환자에서 검출된다(Thurston et al., U.S. Patent No. 5,441,050). 또 다른 구체예에서, 분자는 형광 화합물로 라벨링되고, 형광 반응 스캐닝 기구를 이용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 구체예에서, 분자는 양전자 방출 금속으로 라벨링되고, 양전자방출 단층촬영을 이용하여 환자에서 검출된다. 또 다른 구체예에서, 분자는 상자성체 라벨로 라벨링되고, 자기공명영상(MRI)를 이용하여 환자에서 검출된다. 알부민 융합 단백질을 특이적으로 검출하나 알부민 또는 치료 단백질 단독을 검출하지 않는 항체가 바람직한 구체예이다. 이는 본 명세서를 통해 기술된 알부민 융합 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
키트
본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 항체, 바람직하게는 정제된 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 키트 내에 포함된 항체와 특이적으로 면역반응되는 에피토프를 포함하는 실질적으로 단리된 폴리펩티드를 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 키트는 관심 폴리펩티드와 반응하지 않는 조절 항체를 추가로 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 키트는 관심 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 검출하는 방법을 함유한다(예를들어, 항체는 검출가능한 기질, 예를들어 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물에 컨쥬게이션될 수 있거나, 제1의 항체를 인지하는 제2의 항체가 검출가능한 기질에 컨쥬게이션될 수 있다).
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 키트는 증식성 및/또는 암성 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 함유하는 혈청의 스크리닝에 사용하기 위한 진단 키트이다. 이러한 키트는 관심 폴리펩티드와 반응하지 않는 조절 항체를 포하할 수 있다. 이러한 키트는 하나 이상의 항-폴리펩티드 항원 항체와 특이적으로 면역반응되는 에피토프를 포함하는 실질적으로 단리된 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 키트는 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 방법을 포함한다(예를들어, 항체는 유세포분석에 의해 검출될 수 있는 형광 화합물, 예를들어 플루오레세인 또는 로다민에 컨쥬게이션될 수 있다). 특정 구체예에서, 키트는 재조합적으로 생성되거나 화학적으로 합성된 폴리펩티드 항원을 포함할 수 있다. 키트의 폴리펩티드 항원은 또한 고형 지지체에 부착될 수 있다.
더욱 특정의 구체예에서, 상기 기술된 키트의 검출 방법은 폴리펩티드 항원이 부착되는 고형 지지체를 포함한다. 이러한 키트는 또한 비-부착성의 리포터-라벨링된 항-인간 항체를 포함할 수 있다. 이 구체예에서, 폴리펩티드 항원에 대한 항체의 결합은 리포터 라벨링된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 항원을 함유하는 혈청 스크리닝에 사용하기 위한 진단 키트를 포함한다. 진단 키트는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 항원과 특이적으로 면역반응하는 실질적으로 단리된 항체, 및 항체에 대한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 결합을 검출하기 위한 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 고형 지지체에 부착된다. 특정 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 키트의 검출 방법은 제2의 라벨링된 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 검출 방법은 라벨링된 경쟁 항원을 포함할 수 있다.
한 진단 형태에서, 시험 혈청은 본 발명의 방법에 의해 수득된 표면-결합된 항원을 지니는 고상 작용제와 반응된다. 작용제에 대한 특정 항원 항체와의 결합 및 세척에 의한 결합되지 않은 혈청 성분의 제거 후, 작용제는 고형 지지체에 결합된 항-항원 항체의 양에 비례하여 작용제에 대해 리포터를 결합시키기 위한 리포터-라벨링된 항-인간 항체와 반응된다. 작용제는 결합되지 않은 라벨링된 항체를 제거하기 위해 다시 세척되고, 작용제와 관련된 리포터의 양이 결정된다. 통상적으로, 리포터는 적절한 방사성, 발광 또는 비색 기질(Sigma, St. Louis, MO)의 존재하에서 고상을 인큐베이팅시킴으로써 검출되는 효소이다.
상기 검정의 고형 표면 작용제는 고형 지지체 물질, 예를들어 중합 비드, 딥 스틱(dip stick), 96-웰 플레이트 또는 필터 물질에 단백질 물질을 부착시키기 위한 공지된 기술에 의해 제조된다. 이러한 부착 방법은 일반적으로 지지체에 대한 단백질의 비-특이적 흡착 또는 통상적으로 자유 아민기를 통한 고형 지지체 상의 화학적 반응기, 예를들어 활성화된 카르복실, 히드록실, 또는 알데히드기에 대한 단백질의 공유적 부착을 포함한다. 대안적으로, 스트렙타비딘 코팅된 플레이트가 비오티닐화된 항원(들)와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 이러한 진단 방법을 수행하기 위한 검정 시스템 또는 키트를 제공한다. 키트는 일반적으로 표면-결합된 재조합 항원, 및 표면-결합된 항-항원 항체를 검출하기 위한 리포터-라벨링된 항-인간 항체를 지닌 지지체를 포함한다.
알부민 융합 단백질
본 발명은 일반적으로 알부민 융합 단백질 및 질병 또는 장애를 치료하거나, 예방하거나, 개선하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "알부민 융합 단백질"은 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자에 대한 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자의 융합에 의해 형성된 단백질을 의미한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 바람직하게는 유전적 융합(즉, 알부민 융합 단백질은 치료 단백질의 전부 또는 일부를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 알부민의 전부 또는 일부를 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 인-프레임(in-frame) 연결된 핵산의 전사에 의해 생성됨)에 의해 서로 연결되거나 다른 하나에 연결되는 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체 및 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함한다. 알부민 융합 단백질의 일부인 치료 단백질 및 알부민 단백질은 각각 알부민 융합 단백질의 "일부", "영역" 또는 "부분"으로 언급될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 표 1 또는 표 2에 기술된 폴리누클레오티드 또는 알부민 융합 작제물에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질을 제공한다. 이러한 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 바람직한 알부민 융합 단백질은 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드에 인-프레임 연결된 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자; 표 1, 표 2 또는 실시예에 기술된 바와 같이 생성된 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드에 인-프레임 연결된 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자; 또는, 예를들어 (1) 기능적 자가-복제 벡터(셔틀 벡터, 발현 벡터, 통합 벡터, 및/또는 복제 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않음), (2) 전사 개시 영역(예를들어, 프로모터 영역, 예를들어 조절성 또는 유도성 프로모터, 지속적 프로모터), (3) 전사 종결 영역, (4) 선도 서열, 및 (5) 선택 표지중 하나 이상의 요소를 추가로 포함하는, 치료 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드에 인-프레임 연결된 알부민(또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 핵산 분자에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질(예를들어, 표 1에 기술된 것) 및 혈청 알부민 단백질을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 기타 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 기타 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질 및 혈청 알부민 단백질의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 혈청 알부민 단백질 성분은 혈청 알부민의 성숙한 부분이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질, 및 혈청 알부민의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질, 및 혈청 알부민의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분은 치료 단백질의 성숙한 부분이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편 또는 변이체 및 혈청 알부민의 생물학적으로 활성이고/이거나 치료적으로 활성인 단편 또는 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 치료 단백질의 성숙한 부분 및 혈청 알부민의 성숙한 부분을 포함하거나 이로 구성되는 알부민 융합 단백질을 제공한다.
바람직하게는, 알부민 융합 단백질은 N-말단 부분으로서 HA, 및 C-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함한다. 대안적으로, C-말단 부분으로서 HA, 및 N-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함하는 알부민 융합 단백질이 또한 사용될 수 있다.
기타 구체예에서, 알부민 융합 단백질은 알부민의 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 융합된 치료 단백질을 지닌다. 바람직한 구체예에서, N- 및 C-말단에 융합된 치료 단백질은 동일한 치료 단백질이다. 대안적인 바람직한 구체예에서, N- 및 C-말단에 융합된 치료 단백질은 상이한 치료 단백질이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, N- 및 C-말단에 융합된 치료 단백질은 동일하거나 관련된 질병, 장애, 또는 질환(예를들어, 표 1의 "바람직한 적응증:Y" 컬럼에 기술된 것)을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, N- 및 C-말단에 융합된 치료 단백질은, 통상적으로 동시에, 동반하여, 또는 연속적으로 환자에게서 발생하는 것으로 당 분야에 공지되거나, 또 다른 질병 또는 장애와 관련하여 통상적으로 환자에게서 발생하는 질병 또는 장애(예를들어, 표 1의 "바람직한 적응증:Y" 컬럼에 기술된 것)을 치료하거나, 개선하거나, 예방하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 N- 또는 C-말단, 및/또는 알부민 또는 이의 변이체의 N- 및/또는 C-말단에 융합된 소정의 치료 단백질 X 또는 이의 변이체의 하나, 두개, 세개, 네개 또는 그 이상의 분자를 함유하는 단백질을 포함한다. 소정의 치료 단백질 X 또는 이의 변이체의 분자는 '헤드 투 헤드(head to head)' 배향(예를들어, 치료 단백질 X의 하나의 분자의 N-말단은 치료 단백질 X의 또 다른 분자의 N-말단에 융합됨), 또는 '헤드 투 테일(head to tail)' 배향(예를들어, 치료 단백질 X의 하나의 분자의 C-말단은 치료 단백질 X의 또 다른 분자의 N-말단에 융합됨)을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수의 배향일 수 있다.
한 구체예에서, 하나, 두개, 세개 또는 그 이상의 직렬로 배향된 치료 단백질 X 폴리펩티드(또는 이의 단편 또는 변이체)는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 N- 또는 C-말단, 및/또는 알부민 또는 이의 변이체의 N- 및/또는 C-말단에 융합된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 N- 또는 C-말단, 및/또는 알부민 또는 이의 변이체의 N- 및/또는 C-말단에 융합된 소정의 치료 단백질 X 또는 이의 변이체의 하나, 두개, 세개, 네개, 또는 그 이상의 분자를 함유하는 단백질을 추가로 포함한다. 예로서 U.S. 특허 제 5,073,627호(참조로서 본원에 포함됨)에 기술된 펩티드 링커를 포함한다. 펩티드 링커에 의해 분리된 다중 치료 단백질 X 폴리펩티드를 포함하는 알부민 융합 단백질은 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 링커는 큰 HSA 분자에 작은 펩티드가 융합되는 경우 특히 중요하다. 펩티드 그 자체가 펩티드의 탠덤 카피의 융합에 의한 링커일 수 있거나, 기타 공지된 링커가 사용될 수 있다. 링커가 포함된 작제물이 표 2에 기술되어 있고, 이는 SEQ ID NO:Y를 시험하는 경우에 명백하다.
추가로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 분자내 및/또는 분자간 중합체 형태가 형성되도록 하기 위한 방식으로 알부민 또는 이의 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단에 치료 단백질 X 또는 이의 변이체를 융합시킴으로써 생성될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 알부민 융합 단백질은 단량체 또는 중합체 형태(즉, 이량체, 삼량체, 사량체 및 그 이상의 중합체)일 수 있다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분은 단량체 형태 또는 중합체 형태(즉, 이량체, 삼량체, 사량체 및 그 이상의 중합체)일 수 있다. 특정 구체예에서, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분은 중합체 형태(즉, 이량체, 삼량체, 사량체 및 그 이상의 중합체)이고, 알부민 단백질 부분은 단량체 형태이다.
알부민 부분이 치료 단백질 부분의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되는 알부민 융합 단백질 이외에, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 치료 단백질 또는 관심 펩티드(예를들어, 표 1에 기술된 치료 단백질 X, 또는 치료 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 항체)를 HA의 내부 영역으로 삽입시킴으로써 생성될 수 있다. 예를들어, HA 분자의 단백질 서열 내에는 이황화결합에 의해 안정화되는 다수의 루프 또는 턴이 α-나선의 말단 및 시작 사이에 존재한다. 대부분의 부분에 대해 HA(PDB 인식자 1AO6, 1BJ5, 1BKE, IBMO, 1E7E 내지 1E71 및 1UOR)의 결정 구조로부터 결정된 루프는 분자의 본체로부터 넓게 펼쳐져 있다. 이들 루프는 특정 생물학적 활성을 지닌 알부민 분자를 본질적으로 생성하기 위해 치료적으로 활성 펩티드, 특히 기능 또는 치료 단백질이 되기 위한 이차 구조를 요하는 펩티드의 삽입, 또는 내부 융합에 유용하다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 생성하기 위해 펩티드 또는 폴리펩티드가 삽입될 수 있는 인간 알부민 구조의 루프는 Va154-Asn61, Thr76-Asp89, A1a92-Glu1OO, Gln170-Ala176, His 247-Glu252, Glu266-Glu277, Glu280-His288, Ala362-Glu368, Lys439-Pro447, Val462-Lys475, Thr478-Pro486, 및 Lys560-Thr566를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 성숙한 인간 알부민(SEQ ID NO:1)의 Va154-Asn61, Gln170-Ala176, 및/또는 Lys560-Thr566 루프로 삽입된다.
삽입되는 펩티드는 특정 생물학적 활성에 대해 스크리닝된 파지 표시 또는 합성 펩티드 라이브러리 또는 요망되는 기능을 지닌 분자의 활성 부분으로부터 유래될 수 있다. 추가로, 무작위 펩티드 라이브러리가 특정 루프 내에서 또는 HA 분자의 특정 루프로 무작위화된 펩티드의 삽입에 의해 생성될 수 있고, 이는 아미노산의 모든 가능한 조합을 나타낸다.
이러한 라이브러리(들)은 하기의 방법중 하나 이상에 의해 HA 또는 HA의 도메인 단편에 대해 생성될 수 있다:
HA 또는 HA 도메인 단편의 하나 이상의 펩티드 루프 내에 무작위로 아미노산을 돌연변이 시킴. 루프 내의 하나 내지 모든 잔기는 하기의 방식으로 돌연변이화 될 수 있음:
HA 또는 HA 도메인 단편의 하나 이상의 루프 내로(즉, 내부 융합) 길이 Xn의 무작위화 펩티드(들)의 대체 또는 삽입(X는 아미노산이고, n은 잔기의 수이다);
(a) 및/또는 (b)에 대한 N-, C- 또는 N- 및 C-말단 펩티드/단백질 융합체의 첨가.
HA 또는 HA 도메인 단편은 또한 다양한 표적에 대한 다양한 루프의 다양한 스크리닝으로부터 유래된 펩티드를 동일한 HA 또는 HA 도메인 단편으로 이식함으로써 다기능적이 될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 인간 혈청 알부민의 루프 내로 삽입된 펩티드는 표 1에 기술된 펩티드 단편 또는 치료 단백질의 펩티드 변이체이다. 더욱 특히, 본 발명은 인간 혈청 알부민의 루프 내로 삽입된 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상 길이의 펩티드 단편 또는 펩티드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 인간 혈청 알부민의 N-말단에 융합된 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 또는 40개 이상의 아미노산의 펩티드 단편 또는 펩티드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 인간 혈청 알부민의 C-말단에 융합된 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 또는 40개 이상의 아미노산의 펩티드 단편 또는 펩티드 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질을 포함한다. 예를들어, 표 1 및 2에 기술된 짧은 펩티드(예를들어, 치료 Y)는 알부민 루프 내로 삽입될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 하나의 HA 유래된 영역 및 하나의 치료 단백질 유래된 영역을 지닐 수 있다. 그러나, 각각의 단백질의 다중 영역은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 치료 단백질은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 예를들어, 치료 단백질은 HA의 N- 및 C-말단 둘 모두에 융합될 수 있다. 이러한 형태에서, 치료 단백질 부분은 동일하거나 상이한 치료 단백질 분자일 수 있다. 이작용성 알부민 융합 단백질의 구조는 X-HA-Y 또는 Y-HA-X로 나타낼 수 있다.
예를들어, 항-BLySTM scFv-HA-IFNα-2b 융합체가 항-BLySTM scFv에 의한 IFNα-2b에 대한 면역 반응을 조절하여 제조될 수 있다. 대안은 작용성, 반감기 등에 따라 다양한 비로 HA-융합체, 예를들어 HA-항-BLySTM scFv 융합체와 혼합된 HA-IFNα-2b 융합체의 이작용성(또는 다중작용성) 용량을 제조하는 것이다.
이작용성 또는 다중작용성 알부민 융합체 단백질은 또한 HA의 반대 말단에서 단백질 또는 펩티드를 통해 표적 기관 또는 세포 유형으로 융합체의 치료 단백질 부분을 표적화시켜 제조될 수 있다.
공지된 치료 분자의 융합체에 대한 대안으로서, 펩티드가 통상적으로, 6, 8, 12, 20 또는 X개(여기서, X는 아미노산(aa)이고, n은 잔기의 수와 동일함)의 아미노산의 모든 가능한 조합이 포함되는 무작위화 아미노산의 HA의 N-, C- 또는 N- 및 C-말단, 또는 HA의 도메인 단편에 대한 융합체로 작제된 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 이러한 방법의 특정 이점은 펩티드가 HA 분자에 대해 제자리에서 선택될 수 있고, 이에 따라 펩티드의 특성은 이후 HA에 부착되는 임의의 기타 방법에 의해 유래된 펩티드에 대한 경우에서 변형될 수 있는 것 보다 잠재적으로 덜 변형되어 선택될 수 있다는 점이다.
추가로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 융합된 부분 사이에 링커 펩티드를 포함하여 부분 사이의 물리적 분리를 크게 하여 치료 단백질 부분의, 예를들어 이의 동종 수용체에 대한 결합에 대한 접근성을 최대화시킬 수 있다. 링커 펩티드는 아미노산으로 구성되어 유연할 수 있거나 보다 단단할 수 있다.
링커 서열은 프로테아제에 의하거나 화학적으로 분해되어 성장 호르몬 관련 부분을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제는 숙주에 의해 자연적으로 생성되는 것, 예를들어 효모(S. cerevisiae) 프로테아제 kex2 또는 상응하는 프로테아제이다.
따라서, 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 화학식 R1-L-R2; R2-L-R1; 또는 R1-L-R2-L-R1을 지닐 수 있고, 여기서 R1은 하나 이상의 치료 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열이고, 동일한 치료 단백질일 필요는 없으며, L은 링커이고, R2는 혈청 알부민 서열이다.
바람직한 구체예에서, 치료 단백질을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 알부민에 융합되지 않는 경우의 동일한 치료 단백질의 혈장 안정성에 비해 보다 높은 혈장 안전성을 지닌다. 통상적으로 혈장 안전성은 치료 단백질이 생체내에 투여되어 혈류 내로 운반되는 경우와 치료 단백질이 분해되어 혈류로부터 제거되어 기관, 예를들어 신장 또는 간으로 운반되어 최종적으로 신체로부터 치료 단백질이 제거되는 경우 사이의 기간을 의미한다. 혈장 안정성은 혈류 내에서의 치료 단백질의 반감기에 의해 계산된다. 혈류 내의 치료 단백질의 반감기는 당 분야에 공지된 통상적인 검정법에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 치료 단백질을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 알부민에 융합되지 않은 동일한 치료 단백질의 저장 수명에 비해 연장된 저장 수명을 지닌다. 저장 수명은 통상적으로 용액 또는 몇몇 기타 저장 포뮬레이션에서의 치료 단백질의 치료 활성이 치료 활성의 과도한 손실 없이 안정적인 기간을 의미한다. 다수의 치료 단백질은 이들의 융합되지 않은 상태에서 고도로 불안정하다. 하기에 기술되는 바와 같이, 이들 치료 단백질의 통상적인 반감기는 본 발명의 알부민 융합 단백질로의 통합에 따라 현저하게 연장된다.
"연장된" 반감기를 지닌 본 발명의 알부민 융합 단백질은 동일한 저장 및 처리 조건에 적용된 표준에 비해 보다 높은 치료 활성을 나타낸다. 표준은 융합되지 않은 전장의 치료 단백질일 수 있다. 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분이 유사체, 변이체이거나, 달리 변형되거나 상기 단백질에 대한 완전한 서열을 포함하지 않는 경우, 치료 활성의 연장은 대안적으로 유사체, 변이체, 변형된 펩티드 또는 불완전한 서열의 융합되지 않은 동등물에 비교될 수 있다. 예로써, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 소정의 시각에서 비교하는 경우 표준과 동일한 저장 및 처리 조건에 적용되는 경우 표준의 약 100% 초과의 치료 활성, 또는 약 105%, 110%, 120%, 130%, 150% 또는 200% 초과의 치료 활성을 보유할 것이다.
저장 기간은 또한 저장이 시작되는 경우의 치료 활성에 정규화된, 저장 후에 잔여하는 치료 활성에 의해 평가될 수 있다. 연장된 치료 활성으로 나타나는 바와 같은 연장된 저장 기간을 지닌 본 발명의 알부민 융합 단백질은 동일한 조건에 적용되는 동등한 융합되지 않은 치료 단백질의 치료 활성의 약 50% 초과의 치료 활성, 약 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상의 치료 활성을 보유할 수 있다.
융합 단백질의 발현
본 발명의 알부민 융합 단백질은 효모, 미생물, 예를들어 세균, 또는 인간 또는 동물 세포주로부터의 분비에 의한 재조합 분자로서 생성될 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 분비된다.
본 발명의 특정 구체예는 효모에서의 직접적인 분비를 위해 효과적인 신호 서열, 특히 효모 유래 신호 서열(특히 숙주 효모에 상동인 것), 및 본 발명의 첫번째 양태의 융합된 분자를 엔코딩하는 DNA 작제물을 포함하고, 여기에는 신호 서열 및 성숙한 폴리펩티드 사이에 효모 유래 프로(pro) 서열이 없다.
사카로마이세스 세레비지애 역전효소 신호는 효모 유래 신호 서열의 바람직한 예이다.
별개로 제조된 폴리펩티드는 화학적 가교에 의해 결합된 문헌[Poznansky et al., (FEBS Left. 239:18 (1988)]에 의해 제조된 종류의 컨쥬게이트는 고려되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현시키기 위해 형질전환된 본 발명의 세포, 바람직하게는 효모 세포를 포함한다. 형질전환된 숙주 세포 그 자체 이외에, 본 발명은 또한 영양 배지 중의 이들 세포의 배양물, 바람직하게는 모노클로날(클론에 의하여 균질한) 배양물, 또는 모노클로날 배양물로부터 유래된 배양물이 고려된다. 배지는 폴리펩티드가 분비되는 경우세포와 함께, 또는 여과되거나 원심분리된 경우 세포 없이 폴리펩티드를 함유할 것이다. 세균(예를들어, 대장균 및 고초균), 효모(예를들어, 사카로마이세스 세레비지애, 클루이베로마이세스 락티스 및 피키아 파스토리스), 사상 진균(예를들어, 아스페르길루스), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포)을 포함하는 많은 발현 시스템이 공지되어 있고, 사용될 수 있다.
알부민 융합 단백질의 생성에 사용되는 바람직한 효모 균주는 D88, DXY1 및 BXP1O이다. D88[leu2 -3, leu2 -122, can ], prat , ubc4]은 선조 균주 AH22his +의 유도체이다(DB1로도 공지되어 있음; see, e.g., Sleep et al . Biotechnology 8:42-46 (1990). 균주는 LEU2 유전자를 함유하는 2 미크론-기재 플라스미드의 영양요구 선택을 가능하게 하는 leu2 돌연변이를 함유한다. D88은 또한 글루코오스 과량에서 PRB 1의 탈억제를 나타낸다. PRB 1 프로모터는 글루코오스 수준 및 성장 단계를 모니터하는 두개의 체크포인트에 의해 정상적으로 조절된다. 프로모터는 글루코오스 고갈에 따른 야생형 효모에서 활성화되고 정지기로 진입한다. 균주 D88은 글루코오스에 의한 억제를 나타내나, 정지기로의 진입에 따른 유도를 유지를 나타낸다. PRAT 유전자는 ER에 국한되는 효모 공포 프로테아제, YscA 엔도프로테아제 A를 엔코딩한다. UBC4 유전자는 유비퀴틴화 경로에 있고, 유비퀴틴 의존 분해에 대한 단생 및 비정상 단백질의 표적화에 수반된다. 이러한 ubc4 돌연변이의 단리는 세포 내의 발현 플라스미드의 카피 수를 증가시키고, 플라스미드로부터 발현된 요망되는 단백질의 발현의 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(예를들어, 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된 국제 공개 번호 W099/00504).
D88의 유도체인 DXY1는 하기의 유전형을 지닌다: [leu2 -3, leu2 -122, can ], pral, ubc4, ura3:.yap3]. D88에서 단리된 돌연변이 이외에, 이러한 균주는 또한 YAP3 프로테아제의 녹아웃을 지닌다. 이러한 프로테아제는 대개 이염기 잔기(RR, RK, KR, KK)의 분해를 야기하나, 단백질의 단일 염기 잔기에서의 분열도 촉진할 수 있다. 이러한 yap3 돌연변이의 단리는 보다 높은 수준의 전장 HSA 생성을 일으킨다(예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 U.S. 특허 제5,965,386호 및 문헌[Kerry-Williams et al., Yeast 14:161-169 (1998)] 참조).
BXP10는 하기의 유전형을 지닌다: leu2 -3, leu2 -122, can ], pro ], ubc4 , ura3, yap3:: URA3, lys2, hsp150::LYS2, pmtl:: URA3. DXY1에서 단리된 돌연변이 이외에, 이러한 균주는 또한 PMT1 유전자 및 HSP150 유전자의 녹아웃을 지닌다. PMT1 유전자는 돌리칠-포스페이트-D-만노오스 단백질 O-만노실트랜스페라아제(Pmts)의 진화적으로 보존된 패밀리의 일원이다. Pmtlp의 막횡단 국소 해부학은 O-결합 당화에서 역할을 하는 소포체의 통합 막단백질임을 암시한다. 이러한 돌연변이는 HSA 융합체의 O-결합 당화를 감소/제거한다(예를들어, 전체내용이 참조로서 ㅂ본원에 포함된 국제 공개 번호 W000/44772 참조). 연구들은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 rHA로부터 효과적이지 않게 분리되는 것을 나타낸다. HSP 150 유전자에서의 돌연변이는 표준 정제 기술에 의해 제거되기 어려운 것으로 판명된 잠재적 오염원을 제거한다. 예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 U.S. 특허 번호 제5,783,423호를 참조하라.
요망되는 단백질은 통상적인 방법, 예를들어 숙주 염색체 또는 자유 플라스미드에 삽입된 코딩 서열로부터 생성된다. 효모는 보통의 방법중 임의의 방법, 예를들어 전기 천공으로 요망 단백질에 대한 코딩 서열로 형질전환된다. 전기 천공에 의한 효모의 형질전환 방법은 문헌[Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol . 194, 182]에 기술되어 있다.
성공적으로 형질전환된 세포, 즉 본 발명의 DNA 작제물을 함유하는 세포는 널리 공지된 기술에 의해 확인될 수 있다. 예를들어, 발현 작제물의 도입으로부터 생성된 세포는 성장되어 요망되는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 세포는 수거되어 용해될 수 있고, 이들의 DNA 함량은 문헌[Southern (1975) J. Mol . Biol . 98, 503 or Berent et al . (1985) Biotech . 3, 208]에 의해 기술된 것과 같은 방법을 이용하여 DNA의 존재에 대해 시험될 수 있다. 대안적으로, 상층액에서의 단백질의 존재는 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
유용한 효모 플라스미드 벡터는 pRS403-406 및 pRS4I3-416를 포함하고, 일반적으로 스트라타진 클로닝 시스템(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA)에서 시판된다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406는 효모 통합 플라스미드(YIp)이고, 효모 선택 표지 HISS, 7RPI, LEU2 및 URA3를 포함한다. 플라스미드 pRS413-416는 효모 동원체 플라스미드(Ycp)이다.
효모에서의 발현을 위한 알부민 융합 단백질을 제조하기 위한 바람직한 벡터는 pPPC0005, pScCHSA, pScNHSA, 및 실시예 1에 상세하게 기술되어 있는 pC4:HSA를 포함한다. 도 2는 HA-융합체를 형성시키기 위해 치료 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 내로 클로닝될 수 있는 기본 벡터로 사용될 수 있는 pPPC0005 플라스미드의 맵을 나타낸다. 이는 PRBI S.세레비지애 프로모터(PRB1p), 융합체 선도 서열(FL), DNA 엔코딩 HA (rHA) 및 ADHI S.세레비지애 종결자 서열을 함유한다. 융합체 선도 서열의 서열은 인간 혈청 알부민의 신호 서열(SEQ ID N0:3)의 최초 19개 아미노산 및 교배 인자 알파 1 프로모터(SLDKR, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 EP-A-387 319 참조)의 마지막 5개의 아미노산으로 구성된다.
플라스미드 pPPC0005, pScCHSA, pScNHSA, 및 pC4:HSA는 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20 1 1 0-2209)에 2001년 4월 11일에 기탁되었고, 각각 기탁 번호 PTA-3278, PTA-3276, PTA-3279, 및 PTA-3277이 주어졌다. 효모에서의 알부민 융합 단백질 발현에 유용한 또 다른 벡터는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Sleep et al ., BioTechnology 8:42 (1990)]에 기술된 pSAC35 벡터이다.
알부민 융합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 효모 프로모터는 MET25 프로모터이다. 예를들어, 문헌[Dominik Mumburg, Rolf Muller and Martin Funk. Nucleic Acids Research, 1994, Vol. 22, No. 25, pp. 5767-5768]을 참조하라. Met25 프로모터는 383개의 염기 길이(염기 -382 내지 -1)이고, 이러한 프로모터에 의해 발현된 유전자는 또한 Met15, Metl7, 및 YLR303W으로 공지되어 있다. 바람직한 구체예에서는 하기 서열을 사용되고, 여기서 하기 서열의 5' 말단에서 클로닝에서 사용되는 Not 1에 밑줄이 있고, 3' 말단에서 ATG 시작 코돈에 밑줄이 있다:
Figure 112012047901064-pat00022
효모에서 알부민 융합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있는 추가의 프로모터는 하기를 포함한다:
a) cbh1 프로모터:
Figure 112012047901064-pat00023
b) 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)로부터의 cycD 프로모터:
Figure 112012047901064-pat00024
c) 하기 서열을 지니는 변형된 cbh1 프로모터:
Figure 112012047901064-pat00025
d) 하기 서열을 지니는 아스퍼길루스 니둘란스로부터의 cycD 프로모터:
Figure 112012047901064-pat00026
상보성 접착 말단을 통해 DNA를 벡터에 작업적으로 연결시키는 다양한 방법이 개발되었다. 예를들어, 상보성 동질중합체 트랙트(tract)가 DNA 단편에 첨가되어 벡터 DNA로 삽입될 수 있다. 이후, 벡터 및 DNA 단편은 상보성 동질중합체 꼬리 사이의 수소 결합에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성한다.
하나 이상의 제한 부위를 함유하는 합성 링커는 DNA 단편을 벡터로 결합시키는 대안적 방법을 제공한다. 엔도누클레아제 제한 소화에 의해 생성된 DNA 단편은 박테리오파지 T4 DNA 중합효소 또는 대장균 DNA 중합효소Ⅰ, 프로트루딩(protruding)을 제거하는 효소, 이들의 3' 5'-엑소누클레아제 활성을 지닌 감마-단일-가단 말단으로 처리되고, 이들의 중합 활성을 지닌 리세싱(recessing)된 3'-말단을 사용할 수도 있다.
따라서, 이들 활성의 조합은 블런트(blunt)-말단의 DNA 단편을 생성한다. 블런트-말단의 단편은 이후 블런트-말단의 DNA 분자의 라이게이션을 촉매할 수 있는 효소, 예를들어 박테리오파지 T4 DNA 리가아제의 존재하에서 매우 과량의 몰의 링커 분자로 인큐베이팅된다. 따라서, 반응의 생성물은 이들의 말단에 중합 링커 서열을 지니는 DNA 단편이다. 이후, 이들 DNA 단편은 적절한 제한 효소로 분해되고, DNA 단편의 제한 부위와 양립하는 말단을 생성하는 효소로 분해된 발현 벡터로 라이게이션된다.
다양한 제한 엔도누클레아제 부위를 함유하는 합성 링커는 인터내셔널 바이오테크놀리지스 인크(International Biotechnologies Inc, New Haven, CT, USA)를 포함하는 다수의 공급원에서 시판된다.
예를들어, HA 변이체가 제조되어야 하는 경우, 본 발명에 따른 DNA를 변형시키는 바람직한 방법은 문헌[Saiki et al . (1988) Science 239, 487-491]에 기술된 중합효소 연쇄반응을 이용하는 것이다. 이 방법에서, 효소적으로 증폭되는 DNA는 스스로 증폭된 DNA로 통합되는 두개의 특정 올리고누클레오티드 프라이머에 의해 플랭킹(flanking)된다. 특정 프라이머는 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 발현 벡터로 클로닝을 위해 사용될 수 있는 제한 엔도누클레오티드 인지 부위를 함유할 수 있다.
알부민 융합 단백질을 발현하기 위해 숙주로서 본 발명의 실시에 사용되기에 유용한 것으로 생각되는 효모의 예시적 종류는 피키아(Pichia(Hansenula)), 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 캔디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 토룰라스포라(Torulaspora), 스크조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 시테로마이세스(Citeromyces), 파키솔렌(Pachysolen), 데바로마이세스(Debaromyces ), 메추니코비아(Metschunikowia), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 류코스포리듐(Leucosporidium), 보트리오아스쿠스(Botryoascus), 스포리디오볼루스(Sporidiobolus), 엔도마이콥시스(Endomycopsis) 등이다. 바람직한 종류는 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia) 및 토룰라스포라(Torulaspora)로 구성된 군으로부터 선택된 것이다. 사카로마이세스 종의 예는 S.세레비지애(S. cerevisiae ), S.이탈리쿠스(S. italicus) 및 S.룩시(S.rouxii)이다.
클루이베로마이세스 종의 예는 K.프라길리스(K. fragilis), K.락티스(K. lactis) 및 K.마르크시아누스(K.marxianus)이다. 적절한 토룰라스포라 종은 T.델브루에키(T. delbrueckii)이다. 피키아(Hansenula) 종의 예는 P.앙구스타(P. angusta(이전에는 H. polymorpha)), P.아노말라(P. anomala(이전에는 H. anomala) 및 P.파스토리스(P. pastoris)이다. S.세레비지애의 형질전환의 방법은 일반적으로 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 EP 251 744, EP 258 067 및 WO 90/01063에 교시되어 있다.
사카로마이세스의 바람직한 예시적 종은 S.세레비지애(S. cerevisiae), S.이탈리쿠스(S. italicus), S.디아스타티쿠스(S. diastaticus), 및 지고사카로마이세스 룩시(Zygosaccharomyces rouxii)를 포함한다. 클루이베로마이세스의 바람직한 예시적 종은 K.프라길리스(K. fragilis) 및 K.락티스(K.lactis)이다. 한세눌라의 바람직한 예시적 종은 H.폴리모르파(H.polymorpha(현재 Pichia angusta), H.아노말라(H.anomala(현재 Pichia anomala), 및 피키아 캡슐라타(Pichia capsulata)이다. 피키아의 추가의 바람직한 예시적 종은 P.파스토리스(P.pastoris)를 포함한다. 아스퍼길루스의 바람직한 예시적 종은 A.니게르(A. niger) 및 A.니둘란스(A.nidulans)를 포함한다. 야로이야(Yarrowia)의 바람직한 예시적 종은 Y.리폴리티카(Y.lipolytica)를 포함한다. 다수의 바람직한 효모 종은 ATCC로부터 입수가능하다. 예를들어, 하기의 바람직한 효모 종은 ATCC로부터 입수가능하고, 알부민 융합 단백질의 발현에 유용하다: 사카로마이세스 세레비지애 Hansen, 유성생식형 균주 BY4743 pmtl 돌연변이(ATCC 기탁 번호 4023792); 사카로마이세스 세레비지애 Hansen, 유성생식형(ATCC 기탁 번호 20626; 44773; 44774; 및 62995); 사카로마이세스 디아스타티쿠스 Andrews et Gilliland ex van der Walt, 유성생식형(ATCC 기탁 번호 62987); ㅋ크클루이베로마이세스 락티스(Dombrowski) van der Walt, 유성생식형(ATCC 기탁 번호 76492); 피키아 앙구스타(Teunisson et al.) Kurtzman, Hansenula polymorpha de Morais et Maia으로 기탁된 유성생식형, 유성생식형(ATCC 기탁 번호 26012); 아스퍼킬루스 니게르 van Tieghem, 무성생식형 (ATCC 기탁 번호 9029); 아스퍼길루스 니게르 van Tieghem, 무성생식형 (ATCC 기탁 번호 16404); 아스퍼길루스 니둘란스(Eidam) Winter, 무성생식형(ATCC 기탁 번호 48756); 및 야로이아 리폴리티카(Wickerham et al.) van der Walt et von Arx, 유성생식형 (ATCC 기탁 번호 201847).
S.세레비지애를 위한 적절한 프로모터는 PGKI 유전자, GAL1 또는 GAL1O 유전자, CYC1, PH05, TRPI, ADH1, ADH2, 글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 데카르복셀라아제, 포스포프룩토키나아제, 트리오스 포스페이트 이소메라아제, 포스포글루코오스 이소머라아제, 글루코키나아제, 알파-교배 인자 페로몬, [교배 인자 페로몬]에 대한 유전자, PRBI 프로모터, GUT2 프로모터, GPDI 프로모터, 및 5' 조절 영역의 부분과 기타 프로모터의 5' 조절 영역 또는 업스트립 활성화 부위의 하이브리드를 포함하는 하이브리드 프로모터(예를들어, EP-A-258 067의 프로모터)와 관련된 것을 포함한다.
스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)에 사용하기 위한 편리한 조절성 프로모터는 문헌[Maundrell (1990) J. Biol . Chem . 265, 10857-10864]에 기술된 nmt 유전자로부터의 티아민-억제성 프로모터이고, 문헌[Hoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816]에 기술된 글루코오스 억제성 jbpl 유전자이다.
외래 유전자의 발현을 위해 피키아(Pichia)를 형질전환시키는 방법은, 예를들어 문헌[Cregg et al . (1993)], 및 다양한 필립스 특허(참조로서 본원에 포함됨)에 교시되어 있고, 피키아 발현 키트는 인비트로젠(Invitrogen BY, Leek, Netherlands, and Invitrogen Corp., San Diego, California)에서 시판된다. 적절한 프로모터는 AOX1 및 AOX2를 포함한다. 문헌[Gleeson et al . (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 3459-3465]에는 한세눌라(Hansenula) 벡터 및 형질전환에 대한 정보, MOX1 및 FMD1인 적절한 프로모터를 포함하는 반면; 문헌[EP 361 991, Fleer et al. (1991)] 및 Rhone-Poulenc Rorer로부터의 기타 간행물에는 클루이베로마이세스 종에서의 외래 백질을 발현시키기 위한 방법, PGKI인 적절한 프로모터가 교시되어 있다.
전사 종결 신호는 바람직하게는 전사 종결 및 폴리아데닐레이션에 대한 적절한 신호를 함유하는 진핵세포 유전자의 3' 플랭킹 서열이다. 적절한 3' 플랭킹 서열은, 예를들어 사용되는 발현 조절 서열에 자연적으로 연결될 수 있는 유전자의 서열, 즉 프로모터에 해당할 수 있는 서열일 수 있다. 대안적으로, S.세레비지애 ADHI 유전자의 종결 신호가 바람직한 경우 다양할 수 있다.
*요망되는 알부민 융합 단백질은 선택된 효모에서 효과적인 임의의 선도 서열일 수 있는 분비 선도 서열로 최초로 발현될 수 있다. 효모에서 유용한 선도 서열은 하기를 포함한다:
a) MPIF-1 신호 서열(예를들어, 유전자 은행 등록번호 AAB51134의 아미노산 1-21) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA(SEQ ID NO:6)
b) 스태니오칼신(stanniocalcin) 신호 서열(MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID NO:7)
c) HSA 신호 서열의 프레-프로(pre-pro) 영역(예를들어, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEQ ID NO:8)
d) HSA 신호 서열의 프레 영역(예를들어, MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEQ ID NO:9) 또는 이의 변이체, 예를들어 MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEQ ID NO:10)
e) 역전효소 신호 서열(예를들어, MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEQ ID NO:11)
f) 효모 교배 인자 알파 신호 서열(예를들어, MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGV SLEKR, SEQ ID NO:12 또는 MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAV IGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR, SEQ ID NO:12)
g) K.락티스(K. lactis) 살해 독소 선도 서열
h) 하이브리드 신호 서열(예를들어, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEQ ID NO:13)
i) HSA/MFα-1 하이브리드 신호 서열(HSA/kex2로도 공지됨)(예를들어, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, SEQ ID NO:14)
j) K.락티스 살해/MFα-1 융합 선도 서열(예를들어, MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, SEQ ID NO:15)
k) 면역글로불린 Ig 신호 서열(예를들어, MGWSCIILFLVATATGVHS, SEQ ID NO:16)
l) 피불린 B 전구물질 신호 서열(예를들어, MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEQ ID NO:17)
m) 클러스테린 전구물질 신호 서열(예를들어, MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEQ ID NO:18)
n) 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 4 신호 서열(예를들어, MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEQ ID NO:19)
o) HSA 신호 서열의 프레-프로-영역의 변이체, 예를들어
MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEQ ID NO:20),
MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEQ ID NO:21),
MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEQ ID NO:22),
MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEQ ID NO:23),
변형된 HSA 선도 서열 HSA #64 - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO:24);
변형된 HSA 선도 서열 HSA #66 - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO:25);
변형된 HSA (A14) 선도 서열 - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO:26);
변형된 HSA (S14) 선도 서열(also known as 변형된 HSA #65로도 공지됨) - MKWVTFISLLFLFSGVSG (SEQ ID NO:27),
변형된 HSA (G14) 선도 서열 - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO:28), 또는 MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEQ ID NO:29)
p) 콘센서스 신호 서열(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ ID NO:30)
q) 산 포스파타아제(PH05) 선도 서열(예를들어, MFKSVVYSILAASLANA SEQ ID NO:31)
r) MFoz-1의 프레-서열
s) O 글루카나아제의 프레-서열(BGL2)
t) 살해 독소 선도 서열
u) 살해 독소의 프레-서열
v) K.락티스 살해 독소 프레프로(29개 아미노산; 프레의 16개 아미노산 및 프로의 13개 아미노산) MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEQ ID NO:32)
w) S.디아스타티쿠스(S. diastaticus) 글루코아밀라아제 Ⅱ 분비 선도 서열
x) S.칼스버겐시스(S. carlsbergensis) α-갈락토시다아제(MELT) 분비 선도 서열
y) 캔디다 글루코아밀라아제 선도 서열
z) EP-A-387 319에 기술된 하이브리드 선도 서열(본원에 참조로서 포함됨)
aa) gp67 신호 서열(배큘로바이러스 발현 시스템과 관련됨)(예를들어, 유전자 은행 등록번호 AAA72759의 아미노산 1-19) 또는
bb) 치료 단백질 X의 자연 선도 서열;
cc) JP 62-096086에 기술된 S.세레비지애 역전효소(SUC2) 선도 서열(본원에 참조로서 포함된 승인된 특허 911036516); 또는
dd) 이눌리나아제 - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEQ ID NO:33).
ee) 변형된 TA57 프로펩티드 선도 서열 변이체 #1 - MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR (SEQ ID NO:34)
ff) 변형된 TA57 프로펩티드 선도 서열 변이체 #2 - MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR (SEQ ID NO:35)
gg) 콘센서스 신호 펩티드 - MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (SEQ ID NO:1 11)
hh) 변형된 HSA/kex2 신호 서열 - MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR (SEQ ID NO:112)
ii) 콘센서스 신호 펩티드 #2 - MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEQ ID NO:105)
알부민 융합 단백질의 재조합 및 합성 생성의 추가 방법
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터, 숙주 세포, 및 합성 및 재조합 기술에 의한 알부민 융합 단백질의 생성에 관한 것이다. 벡터는, 예를들어 파지, 플라스미드, 바이러스, 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 적격 또는 복제 결손일 수 있다. 후자의 경우에서, 바이러스 증식은 일반적으로 상보성 숙주 세포에서만 발생할 것이다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 숙주에서의 증식을 위한 선택 표지를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를들어 칼슘 포스페이트 침전물로 도입되거나, 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 이는 적절한 세포주 패키징을 이용하여 시험관내에서 패키징되어 이후 숙주 세포로 도입될 수 있다.
폴리누클레오티드 삽입은 적절한 프로모터, 예를들어 파지 람다 PL 프로모터, 대장균 lac , trp , phoA and tac 프로모터, SV40 얼리(early) 및 레이트(late) 프로모터 및 레트로바이러스 LTRs의 프로모터 등에 작업적으로 연결되어야 한다. 기타 적절한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 발현 작제물은 추가로 전사 개시, 종결을 위한 부위, 및 전사된 영역에 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 함유할 것이다. 작제물에 의해 발현된 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 번역되는 폴리펩티드의 말단에 적절하게 위치한 시작 및 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)에서 번역 개시 코돈을 포함할 것이다.
기술된 바와 같이, 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택 표지를 포함할 것이다. 이러한 표지는 디히드로폴레이트 환원효소, G418, 글루타민 합성효소, 또는 진핵세포 배양을 위한 네오마이신 내성, 및 테트라사이클린, 대장균 및 기타 세균을 배양하기 위한 카나마이신 또는 앰피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적 예는 세균 세포, 예를들어 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 진균 세포, 예를들어 효모 세포(예를들어, 사카로마이세스 세레비지애 또는 ㅍ피키아 파스토리스(ATCC 기탁 번호 201178)); 곤충 세포, 예를들어 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예를들어 CHO, COS, NSO, 293, 및 보웨스(Bowes) 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적절한 배양 배지 및 상기 기술된 숙주 세포를 위한 조건은 당 분야에 공지되어 있다.
세균에 사용하기에 바람직한 벡터 중에서 키아젠, 인크(QIAGEN, Inc.)에서 시판되는 pQE70, pQE60 및 pQE-9; 스트라타진 클로닝 시스템즈, 인크(Stratagene Cloning Systems, Inc.)에서 시판되는 pBluescript 벡터, Phagescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 및 파르마시아 바이오테크, 인크(Pharmacia Biotech, Inc)에서 시판되는 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5를 포함한다. 바람직한 진핵세포 벡터는 스트라타진에서 시판되는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI 및 pSG; 및 파르마시아에서 시판되는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이다. 효모 시스템에서 사용되는 바람직한 발현 벡터는 pYES2, pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, 및 PAO815(모두 인비트로젠(Carlbad, CA)에서 시판됨)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 기타 적절한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 원핵세포 또는 진핵세포의 특정 구획에 대해 본 발명의 단백질의 국소화를 위하고/거나 진핵세포 또는 진핵세포로부터 본 발명의 단백질의 분비를 위한 신호 서열에 융합될 수 있다. 예를들어, 대장균에서 원형질막 주위공간에 대한 단백질의 발현을 위한 것일 수 있다. 세균의 원형질막 주위공간에 대해 폴리펩티드의 직접적 발현을 위해 융합될 수 있는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 대한 신호 서열 또는 단백질(또는 이의 단편)의 예는 pelB 신호 서열, 말토오스 결합 단백질(MBP) 신호 서열, MBP, ompA 신호 서열, 원형질막 대장균 열-민감 장독소 B-서브유닛, 및 알칼라인 포스파타아제의 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 여러 벡터는 단백질의 국소화에 특이적일 융합 단백질의 작제물, 예를들어 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)에서 시판되는 pMAL 벡터 시리즈(특히, pMAL-p 시리즈)로 시판된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 폴리누클레오티드는 그람-음성 세균의 폴리누클레오티드의 발현 및 정제의 효율을 증가시키기 위해 pe1B 펙테이트 리아제 신호 서열에 융합될 수 있다. 예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 U.S. 특허 제5,576,195호 및 제5,846,818호를 참조하라.
포유동물 세포에서의 분비를 위한 본 발명의 알부민 융합 단백질에 융합될 수 있는 신호 펩티드의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
a) MPIF-1 신호 서열(예를들어, 유전자 은행 등록번호 AAB51134의 아미노산 1-21) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA (SEQ ID NO:6)
b) 스태니오칼신 신호 서열 (MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID NO:7)
c) HSA 신호 서열의 프레-프로 영역 (예를들어, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEQ ID NO:8)
d) HSA 신호 서열의 프레 영역 (예를들어, MKWVTFISLLFLFSSAYS, SEQ ID NO:9) 또는 이의 변이체, 예를들어 MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEQ ID NO:10)
e) 역전효소 신호 서열 (예를들어, MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEQ ID NO:11)
f) 효모 교배 인자 알파 신호 서열 (예를들어, MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR, SEQ ID NO:12 또는 MRFPSIFTAVLAFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR, SEQ ID NO:12)
g) K.락티스 살해 독소 선도 서열
h) 하이브리드 신호 서열 (예를들어, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEQ ID NO:13)
i) HSA/MFα-1 하이브리드 신호 서열 (HSA/kex2로도 공지됨) (예를들어, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR, SEQ ID NO:14)
j) K.락티스 살해/MFα-1 융합 선도 서열 (예를들어, MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, SEQ ID NO:15)
k) 면역글로불린 Ig 신호 서열 (예를들어, MGWSCIILFLVATATGVHS, SEQ ID NO:16)
l) 피불린 B 전구물질 신호 서열 (예를들어, MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEQ ID NO:17)
m) 클러스테린 전구물질 신호 서열 (예를들어, MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEQ ID NO:18)
n) 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 4 신호 서열 (예를들어, MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEQ ID NO:19)
o) HSA 신호 서열의 프레-프로-영역의 변이체, 예를들어
MKWVSFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEQ ID NO:20),
MKWVTFISLLFLFAGVLG (SEQ ID NO:21),
MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEQ ID NO:22),
MKWVTFISLLFLFGGVLG (SEQ ID NO:23),
변형된 HSA 선도 서열 HSA #64 - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO:24);
변형된 HSA 선도 서열 HSA #66 - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO:25);
변형된 HSA (A14) 선도 서열 - MKWVTFISLLFLFAGVSG (SEQ ID NO:26);
변형된 HSA (S14) 선도 서열 (변형된 HSA #65로도 공지됨) - MKWVTFISLLFLFSGVLG (SEQ ID NO:27),
변형된 HSA (G14) 선도 서열 - MKWVTFISLLFLFGGVSG (SEQ ID NO:28), 또는 MKWVTFISLLFLFGGVLGDLHKS (SEQ ID NO:29)
p) 콘센서스 신호 서열 (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG, SEQ ID NO:30)
q) 산 포스파타아제 (PH05) 선도 서열 (예를들어, MFKSVVYSILAASLANA SEQ ID NO:31)
r) MFoz-1의 프레-서열
s) 0 글루카나제(BGL2)의 프레-서열
t) 살해 독소 선도 서열
u) 살해 독소의 프레서열
v) K.락티스 살해 독소 프레프로 (29 아미노산; 프레의 16개 아미노산 및 프로의 13개 아미노산) MNIFYIFLFLLSFVQGLEHTHRRGSLDKR (SEQ ID NO:32)
w) S.디아스타티쿠스 글루코아밀라아제 Ⅱ 분비 선도 서열
x) S.칼스버젠시스 α-갈락토시다아제 (MELT) 분비 선도 서열
y) 캔디다 글루코아밀라아제 선도 서열
z) EP-A-387 319에 기술된 하이브리드 선도 서열 (참조로서 본원에 포함됨)
aa) gp67 신호 서열 (배큘로바이러스 발현 시스템과 관련됨) (예를들어, 유전자 은행 등록번호 AAA72759의 아미노산 1-19) 또는
bb) 치료 단백질 X의 자연 선도 서열;
cc) JP 62-096086에 기술된 S.세레비지애 역전효소(SUC2) 선도 서열(본원에 참조로서 포함된 승인된 특허 911036516); 또는
dd) 인슐리나아제 - MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR (SEQ ID NO:33)
ee) 변형된 TA57 프로펩티드 선도 서열 변이체 #1 - MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR (SEQ ID NO:34)
ff) 변형된 TA57 프로펩티드 선도 서열 변이체 #2 - MKLKTVRSAVLSSLFASQVLGQPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAEEGEPKR (SEQ ID NO:35)
gg) 콘센서스 신호 펩티드 - MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA (SEQ ID NO:111)
jj) 변형된 HSA/kex2 신호 서열 - MKWVSFISLLFLFSSAYSGSLDKR (SEQ ID NO:112)
kk) 콘센서스 신호 펩티드 #2 - MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG (SEQ ID NO:105)
바람직한 구체예에서, 변형된 HSA/kex2 신호 서열 (SEQ ID NO:112)은 알부민 및 본원에 기술된 바와 같은 치료 단백질, 뿐만 아니라 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 W093/15199; W097/24445; W003/6007I; WO03/59934; 및 PCT/US04/01369에 기술된 알부민 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 알부민 융합 단백질의 아미노 말단에 융합된다. 변형된 HSA/kex2 신호 서열은, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Sleep et al., Biotechnology 1990, vol. 8, pp. 42-46]; 및 US 특허 5,302,697에 기술된 HSA/kex2 신호 서열 (SEQ ID NO:14)에 기초한다. 본원에 기술된 변형된 HSA/kex2 선도 서열은 선조 신호 펩티드의 잔기 19에 비-보존적 아미노산 치환(Arg 에서 Gly)을 함유한다. 변형된 HSA/kex2 신호 펩티드는 효모에서 발현되는 경우 변형되지 않은 HSA/kex2 신호 서열보다 알부민 융합 단백질의 예상치 않은 보다 나은 발현량 및/또는 보다 나은 분해 효율을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 변형된 HSA/kex2 신호 펩티드의 변이체가 또한 본 발명에 포함된다. 특히, SEQ ID NO:112의 위치 19에서의 Gly 잔기는 Pro 잔기로 치환될 수 있다. 변형된 HSA/kex2 신호 서열의 기타 보존적인 치환이 또한 고려된다. SEQ ID NO:112의 변형된 HSA/kex2 신호 서열을 엔코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 이의 보존적 치환 변이체가 또한 본 발명에 포함된다.
선택 표지로서 글루타민 합성효소(GS) 또는 DHFR을 사용하는 벡터는 각각 약제 메티오닌 설폭시민 또는 메토트렉세이트의 존재하에서 증폭될 수 있다. 글루타민 합성효소 기재 벡터의 이점은 글루타민 합성효소 음성인 세포주(예를들어, 뮤린 골수종 세포주, NSO)의 이용가능성이다. 글루타민 합성효소 발현 시스템은 또한 내인성 유전자의 기능화를 예방하기 위한 추가의 억제제를 제공함으로써 글루타민 합성효소 발현 세포(예를들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)에서 작용할 수 있다. 글루타민 합성효소 발현 시스템 및 이의 성분은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 PCT 공개 W087/04462; W086/05807; WO89/01036; W089/10404; 및 W091/06657에 상세하게 기술되어 있다. 추가로, 글루타민 합성효소 발현 벡터는 론자 바이오로직스, 인크(Lonza Biologics, Inc., Portsmouth, NH)로부터 수득될 수 있다. 뮤린 골수종 세포에서의 GS 발현 시스템을 이용한 모노클로날 항체의 발현 및 생성은 참조로서 본원에 포함된 문헌[Bebbington et al ., Bio / technology 10:169(1992) and in Biblia and Robinson Biotechnol . Prog . 11:1 (1995)]에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 상기 기술된 벡터 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이고, 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 하나 이상의 이종유래 조절 영역(예를들어, 프로모터 및/또는 인핸서)과 작업적으로 관련된 본 발명의 누클레오티드 서열을 함유하는 숙주 세포를 추가로 포함한다. 숙주 세포는 보다 고등한 진핵 세포, 예를들어 포유동물 세포(예를들어, 인간 유래 세포), 또는 보다 저등한 진핵 세포, 예를들어 효모 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를들어 세균 세포일 수 있다. 숙주 균주는 요망되는 특정 방식으로 삽입된 유전자 서열의 발현을 조절하거나, 유전자 산물을 변형시키고 가공되도록 선택될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 유도인자의 존재하에서 상승될 수 있고; 이에 따라 유전적으로 고안된 폴리펩티드의 발현이 조절될 수 있다. 더욱이, 다양한 숙주 세포는 단백질의 번역 및 번역후 가공 및 변형(예를들어, 인산화, 분해)에 대한 특징적이고 특정한 메커니즘을 지닌다. 적절한 세포주는 발현되는 외래 단백질의 요망되는 변형 및 가공을 보장하도록 선택될 수 있다.
본 발명의 핵산 및 핵산 작제물의 숙주 세포로의 도입은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 양이온 지질-매개 트랜스펙션, 전기 천공, 형질도입, 감염, 또는 기타 방법에 의해 실행될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 표준 실험 매뉴얼, 예를들어 문헌[Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)]에 기술되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 사실상 재조합 벡터가 결핍된 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 것이 특히 고려된다. 본원에 기술된 벡터 작제물을 함유하는 숙주 세포를 포함하는 것 이외에, 본 발명은 또한 내인성 유전적 물질을 결실시키거나 대체(예를들어, 치료 단백질에 해당되는 코딩 서열은 치료 단백질에 해당하는 알부민 융합 단백질로 대체될 수 있음)하고/하거나 유전적 물질을 포함(예를들어, 이종유래 폴리누클레오티드 서열, 예를들어 치료 단백질에 해당하는 본 발명의 알부민 융합 단백질이 포함될 수 있음)하도록 고안된 척추동물, 특히 포유동물 유래의 일차, 이차, 및 무한증식 숙주 세포를 포함한다. 내인성 폴리누클레오티드와 작업적으로 관련된 유전적 물질은 내인성 폴리누클레오티드를 활성화, 변경, 및/또는 증폭시킬 수 있다.
또한, 당 분야에 공지된 기술이 동종 재조합을 통해 이종유래 폴리누클레오티드(예를들어, 알부민 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드) 및/또는 이종유래 조절 영역(예를들어, 프로모터 및/또는 인핸서)과 치료 단백질을 엔코딩하는 내인성 폴리누클레오티드 서열을 작업적으로 회합시키는데 사용될 수 있다(예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 US Patent Number 5,641,670, issued June 24, 1997; International Publication Number WO 96/29411; International Publication Number WO 94/12650; Koller et a!., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 86:8932-8935 (1989); and Zijlstra et al ., Nature 342:435-438 (1989) 참조).
본 발명의 알부민 융합 단백질은 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시라파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 널리 공지된 방법에 의한 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 정제에 사용된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 Q-세파로오스, DEAE 세파로오스, 포로스(poros) HQ, 포로스 DEAE, 토요펄(Toyopearl) Q, 토요펄 QAE, 토요펄 DEAE, 리소스(Resource)/소스(Source) Q 및 DEAE, 프락토겔(Fractogel) Q 및 DEAE 컬럼을 포함하나 이에 제한되지 않는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 SP-세파로오스, CM 세파로오스, 포로스 HS, 포로스 CM, 토요펄 SP, 토요펄 CM, 리소스/소스 S 및 CM, 프락토겔 S 및 CM 컬럼 및 이들의 동등물 및 유사한 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 페닐, 부틸, 메틸, 옥틸, 헥실-세파로오스, 포로스 페닐, 부틸, 메틸, 옥틸, 헥실, 토요펄 페닐, 부틸, 메틸, 옥틸, 헥실 리소스/소스 페닐, 부틸, 메틸, 옥틸, 헥실, 프락토겔 페닐, 부틸, 메틸, 옥틸, 헥실 컬럼 및 이들의 동등물 및 유사한 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 세파로오스 S100, S200, S300, 수퍼덱스(superdex) 레진 컬럼 및 이들의 동등물 및 유사한 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 HSA 또는 "융합 표적" 분자에 선택적인 유사 염료(Mimetic Dye) 친화성, 펩티드 친화성 및 항체 친화성 컬럼을 포함하나 이에 제한되지 않는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 상기 기술된 하나 이상의 크로마토그래피를 이용하여 정제된다. 기타 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 크로마토그래피 컬럼, Q 세파로오스 FF 컬럼, SP 세파로오스 FF 컬럼, Q 세파로오스 고성능 컬럼, 블루 세파로오스 FF 컬럼, 블루 컬럼, 페닐 세파로오스 FF 컬럼, DEAE 세파로오스 FF, 또는 메틸 컬럼중 하나 이상을 이용하여 정제된다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 PCT 국제 공개 WO 00/44772에 기술된 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 당업자는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 정제에 사용하기 위해 상기 기술된 방법을 용이하게 변형시킬 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 화학적 합성 방법의 생성물; 및 예를들어 세균, 효모, 보다 고등한 식물, 곤충, 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생성된 생성물로부터 회수될 수 있다. 재조합 생성 방법에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 당화되거나 당화되지 않을 수 있다. 게다가, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 몇몇 경우에서 숙주-매개 공정의 결과로서 초기 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 따라서, 번역 초기 코돈에 의해 엔코딩된 N-말단 메티오닌이 모든 진핵 세포에서 번역후 임의의 단백질로부터 고효율로 제거되는 것이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 대부분의 단백질에서의 N-말단 메티오닌이 또한 대부분의 원핵생물에서 효과적으로 제거되는 반면, 몇몇 단백질에 대해서는 N-말단 메티오닌이 공유적으로 결합된 아미노산의 특성에 따라 원핵생물 제거 공정이 비효율적이다.
한 구체예에서, 효모 피키아 파스토리스가 진핵생물 시스템에서 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현시키기 위해 사용된다. 피키아 파스토리스는 이의 유일한 탄소원으로서 메탄올을 물질 대사시킬 수 있는 메탄올자화 효모이다. 메탄올 물질대사 경로에서의 주요 단계는 O2를 이용한 메탄올에서 포름알데히드로의 산화이다. 이러한 반응은 효소 알코올 옥시다아제에 의해 촉매된다. 유일한 탄소원으로서 메탄올을 물질대사하기 위하여, 피키아 파스토리스는 부분적으로 O2에 대한 알코올 옥시다아제의 비교적 낮은 친화성으로 인해 고수준의 알코올 옥시다아제를 생성시켜야 한다. 그 결과로서, 주 탄소원으로서 메탄올에 의존한 성장 배지에서, 두개의 알코올 옥시다아제 유전자중 하나(AOX1)의 프로모터 영역은 고도로 활성이다. 메탄올의 존재하에서, AOX1 유전자로부터 생성된 알코올 옥시다아제는 피키아 파스토리스에서의 전체 가용성 단백질의 약 30% 이하를 포함한다. 문헌[Ellis, S.B., et al ., Mol . Cell . Biol . 5:1111-21 (1985); Koutz, P.J, et al ., Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J.F., et al ., Nucl . Acids Res . 15:3859-76 (1987)]을 참조하라. 따라서, AOX1 조절 서열의 전부 또는 일부의 전사 조절하에서, 이종유래 코딩 서열, 예를들어 본 발명의 폴리누클레오티드는 메탄올의 존재하에서 피키아 효모 성장에서 예외적으로 고수준으로 발현된다.
한 예에서, 플라스미드 벡터 pPIC9K는 문헌[" Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology," D.R. Higgins and J. Cregg, eds]에 기술된 바와 같이 본질적으로 피키아 효모 시스템에서 본원에 배열된 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 발현시키기 위해 사용된다. 이러한 발현 벡터는 다중 클로닝 부위(MCS)의 업스트림에 위치한 피키아 파스토리스 알칼라인 포스파타아제(PHO) 분비 신호 펩티드(즉, 선도 서열)에 연결된 강한 AOX1 프로모터에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 가능하게 한다.
제안된 발현 작제물이 필요에 따라 인-프레임 AUG를 포함하여 전사, 번역, 분비(요망되는 경우) 등을 위한 적절히 위치된 신호를 제공하는 한, pPIC9K 대신에 당업자가 용이하게 인식할 수 있는 많은 기타 효모 벡터, 예를들어 pYES2, pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalpha, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-S 1, pPIC3.5K, 및 PAO815가 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이종유래 코딩 서열, 예를들어 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 고수준의 발현은 본 발명의 이종유래 폴리누클레오티드를 발현 벡터, 예를들어 pGAPZ 또는 pGAPZ알파로 클로닝하고, 메탄올의 부재하에서 효모 배양물을 성장시킴으로써 달성될 수 있다.
게다가, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다(예를들어, 문헌[Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., and Hunkapiller et al., Nature , 310:105-111 (1984)] 참조). 예를들어, 폴리펩티드의 단편에 해당하는 폴리펩티드는 펩티드 합성기의 사용에 의해 합성될 수 있다. 더욱이, 요망되는 경우, 비고전 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 폴리펩티드 서열로의 치환 또는 첨가로서 도입될 수 있다. 비고전 아미노산은 통상적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, a-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥사논산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, b-알라닌, 플루오로-아미노산, 변조 아미노산, 예를들어 b-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, Na-메틸 아미노산, 및 대체로 아미노산 유사체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 더욱이, 아미노산은 D(우선회) 또는 L(좌선회)일 수 있다.
본 발명은 , 예를들어 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/블로킹기에 의한 유도, 단백질 분해,항체 분자 또는 기타 세포 리간드에 대한 결합 등에 의해 번역 동안 또는 번역 후의 차별적으로 변형되는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 포함한다. 임의의 다수의 화학적 변형이 브롬화 시아노겐, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특이적 화학 분해; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 투니카마이신의 존재항서의 물질대사 합성; 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 포함되는 추가의 변역후 변형은, 예를들어 N-결합 또는 O-결합 탄수화물 사슬, N-말단 또는 C-말단의 가공, 아미노산 백본에 대한 화학 부분의 부착, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 사슬의 화학적 변형, 및 원핵생물 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 첨가 또는 결실을 포함한다. 알부민 융합 단백질은 또한 검출가능한 라벨, 예를들어 단백질의 검출 및 단리를 가능하게 하는 효소, 형광, 동위원소 또는 친화성 라벨로 변형될 수 있다.
적절한 효소의 예는 호스라디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린스테라아제를 포함하고; 적절한 보조군의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적절한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오로세인, 플루오로세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오로세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시페라아제, 루시페린, 및 애큐오린을 포함하고; 적절한 방사성 물질의 예는 요오드(121I, 123I, 125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(111In, 121In, 113 mIn, 115 mIn), 테크네튬(99Tc, 99mTc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브데늄(99Mo), 크세논(133Xe), 플루오르(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 및 97Ru를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체는 폴리펩티드에 대해 117Lu, 90Y, 166Ho, 및 153Sm를 포함하나 이에 제한되지 않는 방사성금속 이온과 회합된 거대고리 킬레이트제에 부착된다. 바람직한 구체예에서, 거대고리 킬레이트제와 회합된 방사성금속 이온은 111In이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 거대고리 킬레이트제와 회합된 방사성금속 이온은 90Y이다. 특정 구체예에서, 거대고리 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA)이다. 기타 특정 구체예에서, DOTA는 링커 분자에 의해 본 발명의 항체 또는 이의 단편에 부착된다. 폴리펩티드에 DOTA를 컨쥬게이팅시키는데 유용한 링커 분자의 예는 당 분야에 통상적으로 공지되어 있고, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[DeNardo et al., Clin Cancer Res. 4(10):2483-90 (1998); Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7 (1999); and Zimmerman et al, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50 (1999)]을 참조하라.
언급된 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 자연적인 공정, 예를들어 번역후 공정, 또는 당 분야에 널리 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 동일한 유형의 변형이 소정의 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있음이 인식될 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는, 예를들어 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 이들은 분지를 지니거나 지니지 않는 고리형일 수 있다. 고리형, 분지형, 및 분지된 고리형 폴리펩티드는 번역후 자연 공정으로부터 생성될 수 있거나, 합성 방법에 의해 이루어질 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 부분의 공유 부착, 누클레오티드 또는 누클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노지톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황화결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길화, 단백질분해 공정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 술파화, 아르기닐화와 같은 단백질에 대한 아미노산의 트랜스퍼-RNA 매개 첨가, 및 유비퀴틴화를 포함한다(예를들어, 문헌[PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)] 참조).
본 발명의 알부민 융합 단백질 및 치료 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합하는 항체는 정제를 촉진하는 펩티드와 같은 표지 서열에 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표지 아미노산 서열은 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) 등에서 제공된 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩티드이고, 이들 중 다수는 시판된다. 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 기술된 바와 같이, 예를들어 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 해당하는 "HA" 태그(Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) 및 "플래그" 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가로, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료 부분, 예를들어 세포독소, 예를들어 세포증식 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 도는 방사성 금속 이온, 예를들어, 알파-방출기, 예를들어 213Bi에 컨쥬게이팅될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 작용제를 포함한다. 예로서 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이드의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는 항대사물질(예를들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를들어, 메클로에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안크라사이클린(예를들어, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를들어, 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안크라마이신(AMC)), 및 항유사분열제(예를들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 컨쥬게이트는 소정의 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용될 수 있고, 치료제 또는 약물 부분은 고전 화학 치료제에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를들어, 약물 부분은 요망되는 생물학적 활성을 소유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를들어 독소, 예를들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를들어 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 13-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 아폽토시스 작용제, 예를들어 TNF-알파, TNF-베타, AIM I(국제 공개 WO 97/33899 참조), AIM II(국제 공개 WO 97/34911 참조), Fas 리간드(Takahashi et al ., Int . Immunol ., 6:1567-1574 (1994)), VEGI(국제 공개 WO 99/23105 참조), 혈전 작용제 또는 항혈관형성 작용제, 예를들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 집락 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 집락 자극 인자("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자를 포함할 수 있다. 이러한 치료 부분을 단백질(예를들어, 알부민 융합 단백질)에 컨쥬게이팅시키는 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
알부민 융합 단백질은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 결합되거나, 이에 결합하거나, 이와 회합되는 폴리펩티드의 면역검정 또는 정제에 특히 유용한 고형 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고형의 지지체는 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
단독으로 또는 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토카인(들)과 함께 투여되는, 컨쥬게이팅된 치료 단백질 부분을 지니거나 이를 지니지 않는 알부민 융합 단백질이 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질이 치료 단백질에 결합하는 항체의 VH 도메인만을 포함하는 구체예에서, 융합 단백질과 치료 단백질에 결합하는 동일한 항체의 VL 도메인을 공동발현시키는 것이 필요하고/하거나 요망될 수 있고, VH-알부민 융합 단백질 및 VL 단백질은 전사후에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 회합될 것이다.
본 발명의 알부민 융합 단백질이 치료 단백질에 결합하는 항체의 VL 도메인만을 포함하는 구체예에서, 융합 단백질과 치료 단백질에 결합하는 동일한 항체의 VH 도메인을 공동발현시키는 것이 필요하고/하거나 요망될 수 있고, VL-알부민 융합 단백질 및 VH 단백질은 전사후에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 회합될 것이다.
몇몇 치료 항체는 이중특이성 항체이고, 이는 치료 단백질에 결합하는 항체가 두개의 상이한 중쇄/경쇄쌍 및 두개의 상이한 결합 부위를 지니는 인공 하이브리드 항체임을 의미한다. 치료 단백질에 해당하는 알부민 융합 단백질을 생성하기 위해, 알부민 단백질 부분의 N- 및 C-말단 둘 모두에 융합된 scFv 단편을 지니는 알부민 융합 단백질을 생성시키는 것이 가능하다. 더욱 특히, 알부민의 N-말단에 융합된 scFv는 치료 단백질에 결합하는 본래의 항체의 중쇄/경쇄(VH/VL)쌍중 하나에 해당할 것이고, 알부민의 C-말단에 융합된 scFv는 치료 단백질에 결합하는 본래의 항체의 기타 중쇄/경쇄(VH/VL)에 해당할 것이다.
또한, 본 발명에 의해 제공되는 것은 추가의 이점, 예를들어 증가된 폴리펩티드의 용해도, 안정성 및 순환시간, 또는 감소된 면역원성을 제공할 수 있는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 화학적으로 변형된 유도체이다(예를들어, U.S. Patent No. 4,179,337). 유도화를 위한 화학적 부분은 수용성 중합체, 예를들어 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등으로부터 선택될 수 있다. 알부민 융합 단백질은 분자 내의 무작위 위치, 또는 분자 내의 미리 예정된 위치에서 변형될 수 있고, 하나, 두개, 세개 도는 그 이상의 부착된 화학적 부분을 포하할 수 있다.
중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 대해, 바람직한 분자량은 취급 및 제조에 용이하기 위해 약 1kDa 내지 약 100 kDa(용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜에서 몇몇 분자가 표준 분자량 보다 많거나 약간 적은 것을 나타내는 것임)이다. 요망되는 치료 프로파일(예를들어, 요망되는 지효성 방출 기간, 효과, 생물학적 활성, 취급의 용이, 항원성의 정도 또는 결핍 및 치료 단백질 또는 이의 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 기타 공지된 효과)에 따라 기타 크기가 사용될 수 있다. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜은 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, 또는 100,000 kDa의 평균 분자량을 지닐 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 분지된 구조를 지닐 수 있다. 분지된 폴리에틸렌 글리콜은, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[U.S. Patent No. 5,643,575; Morpurgo et al ., App(. Biochem . Biotechnol . 56:59-72 (1996); Vorobjev et al ., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); and Caliceti et al ., Bioconjug . Chem . 10:638-646 (1999)]에 기술되어 있다.
폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 기타 화학적 부분)는 단백질의 기능 또는 항원 도메인에 대한 효과를 고려하여 단백질에 부차되어야 한다. 다수의 부착 방법, 예를들어 본원에 참조로서 포함된 EP 0 401 384(G-CSF에 대한 PEG 커플링)에 기술된 방법이 당업자가 이용가능하고, 또한 트레실 클로라이드를 이용하여 GM-CSF의 페길화를 보고하는 문헌[Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992)]을 참조할 수 있다. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜은 반응성기, 예를들어 자유 아미노 또는 카르복실기를 통해 아미노산 잔기를 통해 공유결합될 수 있다. 반응성기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합될 수 있는 것이다. 자유 아미노기를 지니는 아미노산 잔기는 리신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있고; 자유 카르복실기를 지니는 아미노산 잔기는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 술프히드릴기가 또한 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착하기 위한 반응성 기로 사용될 수 있다. 치료 목적에 바람직한 것은 아미노기에서의 부착, 예를들어 N-말단 또는 리신기에서의 부착이다.
상기 암시된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 임의의 다수의 아미노산 잔기에 대한 결합을 통해 단백질에 부착될 수 있다. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜은 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 또는 시스테인 잔기에 대한 공유 결합을 통해 결합될 수 있다. 하나 이상의 반응 화학 작용이 단백질의 특정 아미노산 잔기(예를들어, 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 또는 시스테인) 또는 단백질의 하나 이상의 유형의 아미노산 잔기(예를들어, 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 이들의 조합)에 폴리에틸렌 글리콜을 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
하나는 N-말단에서 화학적으로 변형된 요망 단백질일 수 있다. 본 조성물의 예증으로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 하나가 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지도 등에 의해), 반응 혼합물에서 단백질(폴리펩티드) 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비, 수행되는 페길화 반응의 유형, 및 선택된 N-말단 페길화 단백질을 수득하는 방법으로부터 선택될 수 있다. N-말단 페길화된 제조물을 수득하는 방법(즉, 필요시 기타 모노페길화된 부분으로부터 이러한 부분을 분리시키는 방법)이 페길화된 단백질 분자의 집단으로부터 N-말단 페길화된 물질의 정제에 의해 수행될 수 있다. N-말단 변형에서 화학적으로 변형된 선택적 단백질은 특정 단백질에서의 유도화에 이용가능한 일차 아미노기(리신 대 N-말단)의 다양한 유형의 차별적 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의해 달성될 수 있다. 적절한 반응 조건하에서, 중합체를 함유하는 카르보닐기를 지닌 N-말단에서 단백질의 실질적으로 선택적 유도화가 달성된다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 페길화는 임의의 수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜은 직접적으로 또는 중간 링커에 의해 알부민 융합 단백질에 부착될 수 있다. 단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜을 부착시키기 위한 링커 부재의 시스템은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992); Francis et al., Intem. J. of Hematol. 68:1-18 (1998); U.S. Patent No. 4,002,531; U.S. Patent No. 5,349,052; WO 95/06058; and WO 98/32466]에 기술되어 있다.
중간 링커 없이 단백질의 아미노산 잔기에 직접적으로 폴리에틸렌 글리콜을 부착시키는 한 시스템은 트레실클로라이드(CISO2CH2CF3)를 이용한 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(MPEG)의 변형에 의해 생성되는 트레실화된 MPEG를 사용한다. 단백질과 트레실화된 MPEG의 반응에 따라, 폴리에틸렌 글리콜은 단백질의 아민기에 직접적으로 부착된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 단백질과 2,2,2-트리플루오로에탄 설포닐기를 지니는 폴리에틸렌 글리콜 분자의 반응에 의해 생성된 단백질-폴리에틸렌 글리콜 컨쥬게이트를 포함한다.
폴리에틸렌 글리콜은 또한 다수의 다양한 중간 링커를 이용하여 단백질에 부착될 수 있다. 예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 U.S. 특허 제5,612,460호에는 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 연결하기 위한 우레탄 링커가 기술되어 있다. 폴리에틸렌 글리콜이 링커에 의해 단백질에 부착되는 단백질-폴리에틸렌 글리콜 컨쥬게이트는 또한 단백질과 화합물, 예를들어 MPEG-숙신이미딜숙시네이트, 1,1'-카르보닐디이미다졸로 활성화된 MPEG, MPEG-2,4,5-트리클로로페닐카르보네이트, MPEG-p-니트로페놀카르보네이트, 및 다양한 MPEG-숙시네이트 유도체의 반응에 의해 생성될 수 있다. 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 부착시키기 위한 다수의 추가 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 반응 화학 작용이 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 국제 공개 WO 98/32466에 기술되어 있다. 본원에 기술된 반응 화학 작용을 이용하여 생성된 페길화된 단백질 생성물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 각각의 알부민 융합 단백질에 부착되는 폴리에틸렌 글리콜 부분의 수(즉, 치환의 정도)가 또한 다양할 수 있다. 예를들어, 본 발명의 페길화된 단백질은 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20개 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합될 수 있다. 유사하게, 단백질 분자당 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, 또는 18-20개의 폴리에틸렌 글리콜 부분과 같은 범위 내로 평균 치환 정도가 존재할 수 있다. 치환의 정도를 결정하는 방법은, 예를들어 문헌[Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)]에 논의되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는 표준 방법에 의한 화학적 합성 및 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")가 정제를 위해 사용된다. 폴리펩티드가 단리 및/또는 정제 동안 변성되는 경우 활성 입체형태를 재생시키기 위해 리폴딩(refolding) 단백질에 대해 널리 공지된 기술이 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 존재 및 양은 당 분야에 널리 공지된 면역검정법인 ELISA를 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질을 검출/정량하기에 유용할 수 있는 하나의 ELISA 프로토콜은 항-인간 혈청 알부민 항체로 ELISA 플레이트를 코팅하는 단계, 비-특이적 결합을 방지하기 위해 플레이트를 블로킹하는 단계, ELISA 플레이트를 세척하는 단계, (하나 이상의 다양한 농도로)본 발명의 알부민 융합 단백질을 함유하는 용액을 첨가하는 단계, 검출가능한 라벨(본원에 기술되거나 당 분야에 달리 공지됨)에 커플링된 이차 항-치료 단백질 특이적 항체를 첨가하는 단계, 및 이차 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 이 프로토콜의 대안적 버전에서, ELISA 플레이트는 항-치료 단백질 특이적 항체로 코팅될 수 있고, 라벨링된 이차 시약이 항-인간 알부민 특이적 항체일 수 있다.
폴리누클레오티드의 용도
본원에 확인된 각각의 폴리누클레오티드는 시약으로서 다양한 방법에 사용될 수 있다. 하기의 기술은 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 공지된 기술을 이용하여야 한다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 생성하는데 유용하다. 하기에 보다 상세히 기술되는 바와 같이, (알부민 융합 단백질을 엔코딩하는) 본 발명의 폴리누클레오티드는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 알부민 융합 단백질을 발현하는 세포, 세포주, 또는 조직을 제조하기 위한 유전적 고안에 유용한 재조합 DNA 방법에 유용할 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 또한 유전자 요법에 유용하다. 유전자 요법의 하나의 목적은 유전적 결함을 바로잡기 위해 정상적인 유전자를 결합 유전자를 지니는 유기체로 삽입시키는 것이다. 본 발명에 기술된 폴리누클레오티드는 매우 정확한 방식으로 이러한 유전적 결함을 표적화하는 방법을 제공한다. 또 다른 목적은 숙주 유전체에 존재하지 않는 새로운 유전자를 삽입하여, 숙주 세포에서 새로운 형질을 생성시키는 것이다. 본 발명에 포함되는 유전자 요법 방법의 추가의 비제한적인 예는 본원 어딘가에 보다 충분히 기술되어 있다(예를들어, "유전자 요법" 제목의 섹션, 및 실시예 61 및 62참조)
폴리펩티드의 용도
본원에서 확인된 각각의 폴리펩티드는 다양한 방법에 사용될 수 있다. 하기의 기술은 예시로 간주되어야 하며, 공지된 기술을 이용하여야 한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 조직(들)(예를들어, 면역조직화학 검정, 예를들어 ABC 면역과산화효소(Hsu et al., J. Histochem. Cytochem. 29:577-580 (1981)) 또는 세포 유형(들)(예를들어, 면역세포화학 검정)의 다양한 확인을 위한 면역학적 프로브를 제공하는데 유용하다.
알부민 융합 단백질은 당업자에게 공지된 고전 면역조직학적 방법을 이용하여 생물학적 샘플에서 폴리펩티드의 수준을 검정하는데 사용될 수 있다(예를들어, 문헌[Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참조). 단백질 유전자 발현을 검출하기에 유용한 기타 방법은 면역검정법, 예를들어 효소면역측정법(ELISA) 및 방사면역측정법(RIA)을 포함한다. 적절한 검정 라벨은 당 분야에 공지되어 있고, 효소 라벨, 예를들어 글루코오스 옥시다아제; 방사성 동위원소, 예를들어 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115 mIn, 113 mIn, 112In, 111In), 및 테크늄(99Tc, 99 mTc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 크세논(133Xe), 플루오르(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru; 발광 라벨, 예를들어 루미놀; 및 형광 라벨, 예를들어 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 영상에 의해 생체내에서 검출될 수 있다. 단백질의 생체내 영상화를 위한 라벨 또는 표지는 X-방사선촬영, 핵 자기 공명(NMR) 또는 전자 스핀 이완(ESR)에 의해 검출가능한 것을 포함한다. X-방사선촬영에 대해, 적절한 라벨은 검출가능한 방사선을 방출하나 피검체에게 명백하게 해롭지 않은 바륨 또는 세슘과 같은 방사성 동위원소를 포함한다. NMR 및 ESR에 대해 적절한 표지는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현하는 세포주에게 주어진 영양소의 라벨링에 의해 알부민 융합 단백질로 통합될 수 있는 검출가능한 특징적 스핀, 예를들어 중수소를 지닌 것을 포함한다.
적절한 검출가능한 영상 부분, 예를들어 방사성 동위원소(예를들어, 131I, 112In, 99 mTc, (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(115 mIn, 113mIn, 112In, 111In), 및 테크튬(99Tc, 99 mTc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 크세논(133Xe), 플루오르(18F, 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru), 방사선 비투과 물질, 또는 핵 자기 공명에 의해 검출가능한 물질로 라벨링된 알부민 융합 단백질이 포유동물 내로 도입(예를들어, 비경구, 피하 또는 복막내로 도입)되어 면역계 장애에 대해 검사된다. 피검체의 크기 및 사용되는 영상 시스템이 진단 영상을 생성하기에 필요한 영상 부분의 양을 결정하는 것이 당 분야에서 이해될 것이다. 방사선 동위원소 부분의 경우에서, 인간 피검체에 대해, 주입되는 방사능의 양은 일반적으로 99 mTc의 5 내지 20 밀리퀴리의 범위일 것이다. 라벨링된 알부민 융합 단백질은 이후 바람직하게는 하나 이상의 수용체, 리간드 또는 물질(본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는데 사용되는 치료 단백질의 물질에 해당함)이 위치한 신체(예를들어, 기관, 세포, 세포외공간 또는 세포외기질)의 위치에 축적될 것이다. 대안적으로, 알부민 융합 단백질이 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 경우, 라벨링된 알부민 융합 단백질은 이후 바람직하게는 치료 단백질에 의해 결합된 것(본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는데 사용됨)에 해당하는 폴리펩티드/에피토프가 위치한 신체(예를들어, 기관, 세포, 세포외공간 또는 세포외기질)의 위치에 축적될 것이다. 생체내 종양 영상화는 문헌[S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Chapter 13 in Tumor Imaging : The Radiochemical Detection of Cancer , S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982))]에 기술되어 있다. 여기에 기술된 프로토콜은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 이용하기 위해 당업자에 의해 용이하게 변형될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 이종유래의 폴리펩티드 또는 핵산과 회합된 본 발명의 알부민 융합 단백질(예를들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 항체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드)을 투여함으로써 세포에 본 발명의 알부민 융합 단백질을 특이적으로 전달하는 방법을 제공한다. 한 예에서, 본 발명은 표적 세포 내로 치료 단백질을 전달하는 방법을 제공한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 표적화된 세포 내로 단일 가닥의 핵산(예를들어, 안티센스 또는 리보자임) 또는 이중 가닥의 핵산(예를들어, 세포의 유전체로 통합되거나 에피솜으로 복제될 수 있고, 전사될 수 있는 DNA)을 전달하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 독소 또는 세포독성 전구약물과 관련된 본 발명의 알부민 융합 단백질을 투여함으로써 세포의 특이적 파괴(예를들어, 종양 세포의 파괴)하는 방법을 제공한다.
"독소"는 내인성 세포독성 효과기 시스템, 방사성 동위원소, 홀로톡신(holotoxin), 변형된 독소, 독소의 촉매 서브유닛, 또는 규정된 조건하에서 세포 사멸을 야기하는 세포의 표면 내 또는 표면 상에 일반적으로 존재하지 않는 임의의 분자 또는 효소에 결합하고 활성화시키는 하나 이상의 화합물을 의미한다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 독소는 당 분야에 공지된 방사성 동위원소, 화합물, 예를들어 내인성 세포독성 효과기 시스템에 선천적으로 결합하거나 이를 유도하는 항체(또는 이의 부분을 함유하는 보체 결합 항체), 티미딘 키나아제, 엔도누클레아제, RNas, 알파 독소, 리신, 아브린, 슈도모나스 엑소톡신 A, 디프테리아 독소, 사포린, 모모르딘, 겔로닌, 억새풀 항바이러스 단백질, 알파-사르신 및 콜레라 독소를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "독소"는 또한 세포증식 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를들어 알파-방출기, 예를들어 103Pd, 133Xe, 131I, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 90Yt, 트리튬, 117Tin, 186레늄, 166홀뮴, 및 188레늄; 발광 라벨, 예를들어 루미놀; 및 형광 라벨, 예를들어 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 방사성 동위원소 90Y와 회합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 항체를 투여함으로써 세포를 특이적으로 파괴(예를들어, 종양 세포의 파괴)하는 방법을 제공한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 방사성 동위원소 111In과 회합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 항체를 투여함으로써 세포를 특이적으로 파괴(예를들어, 종양 세포의 파괴)하는 방법을 제공한다. 추가의 특이적 구체예에서, 본 발명은 방사성 동위원소 131I와 회합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 항체르 투여함으로써 세포를 특이적으로 파괴(예를들어, 종양 세포의 파괴)하는 방법을 제공한다.
본 발명의 불안정한 폴리펩티드에 적용시키기 위해 당 분야에 공지된 기술이 적용될 수 있다. 이러한 기술은 이작용성 컨쥬게이팅 작용제의 사용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(예를들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 U.S. Patent Nos. 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274;119; 4,994,560; 및 5,808,003 참조).
본 발명의 알부민 융합 단백질은 포유동물, 바람직하게는 인간의 다양한 장애의 진단, 치료, 예방 및/또는 예후에 유용하다. 이러한 장애는 하기의 제목 "생물학적 활성"의 섹션 하에 본원에 기술된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 본 발명은 (a) 본 발명의 알부민 융합 단백질을 이용하여 개체의 세포 또는 체액에서의 특정 폴리펩티드의 발현 수준을 검정하고, (b) 검정된 폴리펩티드 발현 수준을 표준 폴리펩티드 발현 수준과 비교함으로써, 표준 발현 수준에 비한 검정된 폴리펩티드 발현 수준에서의 증가 또는 감소가 장애를 나타내는지 확인하는 것을 포함하여, 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 암에 대해서, 개체로부터의 생검 조직에서의 비교적 높은 양의 전사체의 존재는 질병의 발달에 대한 소인을 나타낼 수 있고, 실제 임상 징후의 출현에 앞서 질병을 검출하기 위한 방법을 제공할 수 있다. 이러한 유형의 보다 명확한 진단은 건강 전문가로 하여금 보다 이른 예방 방법 또는 적극적인 치료를 가능하게 하여 암의 발달을 예방하거나 추가의 진행을 예방하게 한다.
더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 신경 장애, 면역계 장애, 근 장애, 생식 장애, 위장 장애, 폐 장애, 심혈관 장애, 신장 장애, 증식성 장애, 및/또는 암 질병 및 질환과 같은 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 예를들어, 환자에게 본 발명의 폴리펩티드폴리펩티드(예를들어, 인슐린)의 부재 또는 감소된 수준을 대체하기 위해, 다양한 폴리펩티드(예를들어, 헤모글로빈 B에 대한 헤모글로빈 S, SOD, 카탈라아제, DNA 복구 단백질)의 부재 또는 감소된 수준을 보충하기 위해, 폴리펩티드의 활성을 억제(예를들어, 종양유전자 또는 종양 억제제)하기 위해, 폴리펩티드의 활성을 활성화시키기 위해(예를들어, 수용체에 대한 결합에 의해), 자유 리간드(예를들어, 염증을 감소시키는데 사용되는 가용성 TNF 수용체)에 대해 이를 경쟁시킴으로써 막 결합 수용체의 활성화를 감소시키기 위해, 요망되는 반응(예를들어, 혈관 성장 억제, 세포 또는 조직을 증식시키기 위한 면역 반응의 향상)을 발생시키기 위해 본 발명의 폴리펩티드가 투여될 수 있다.
특히, 치료 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질이 또한 질병(상기 기술된 것, 및 본원의 어딘가에 기술된 것)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를들어, 치료 단백질의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질의 투여는 알부민 융합 단백질에 특이적으로 결합시키기 위해 사용되는 치료 항체에 대해 폴리펩티드를 결합시키고/거나 중화시킬 수 있고/있거나 알부민 융합 단백질을 특이적으로 결합시키기 위해 사용되는 치료 단백질에 대해 폴리펩티드의 과생성을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 치료 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질의 투여는 막(수용체)에 대한 폴리펩티드의 결합에 의해 알부민 융합 단백질을 특이적으로 결합시키기 위해 사용되는 치료 항체에 대해 폴리펩티드를 활성화시킬 수 있다.
적어도, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 SDS-PAGE 겔 또는 분자체 겔 여과 컬럼에 대한 분자량 표지로 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 항체를 상승시키기 위해 사용될 수 있고, 차례로 이는 숙주 세포, 또는 생물학적 샘플의 형질전환을 측정하는 방법으로서 재조합 세포로부터 본 발명의 치료 단백질, 알부민 단백질, 및/또는 알부민 융합 단백질의 단백질 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 본원에 기술된 생물학적 활성을 시험하기 위해 사용될 수 있다.
진단 검정
본 발명의 화합물은 포유동물, 바람직하게는 인간의 다양한 장애의 진단, 치료, 예방 및/또는 예후에 유용하다. 이러한 장애는 표 1의 해당렬의 각각의 치료 단백질에 대해 기술된 것이 기술되어 있고, 본원에서 "면역 활성", "혈액 관련 장애", "과증식 장애", "신장 장애", "심혈관 장애", "호흡기 장애", "항-혈관형성 활성", "세포 수준에서의 질병", "상처 치유 및 상피 세포 증식", "신경 활성 및 신경계 질병", "내분비 장애", "생식계 장애", "감염성 질병", "재생", 및/또는 "위장 장애" 등의 제목의 섹션하에 기술되어 있다.
다수의 장애에 대해, 유전자 발현의 실질적으로 변화(증가 또는 감소)된 수준은 "표준" 유전자 발현 수준, 즉 장애를 지니지 않는 개체로부터의 조직 또는 체액에서의 발현 수준에 비해 상기 장애를 지니는 개체로부터 수득한 조직, 세포 또는 체액(예를들어, 혈청, 혈장, 뇨, 정액, 윤활액 또는 척수액)에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명은 장애의 진단 동안 유용한 진단 방법을 제공하고, 이는 개체로부터의 조직, 세포 또는 체액에서 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하고, 측정된 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교함으로써, 표준에 비한 유전자 발현의 수준(들)의 증가 또는 감소가 장애를 나타내는지 확인하는 것을 포함한다. 이러한 진단 검정법은 생체내 또는 시험관내, 예를들어 혈액 샘플, 생검 조직 또는 부검 조직에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 예후 지시제로서 유용하고, 이에의해 향상되거나 감소된 유전자 발현을 나타내는 환자는 보다 나쁜 임상 결과를 경험할 것이다.
"폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 발현 수준을 검정"은 특정 폴리펩티드(예를들어, 표 1에 기술된 치료 단백질에 해당하는 폴리펩티드)의 수준 또는 직접적(예를들어, 순수 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 결정하거나 측정함) 또는 비교적(예를들어, 이차 생물학적 샘플의 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준을 비교함)으로 일차 생물학적 샘플에서의 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 mRNA의 수준을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 평가하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 일차 생물학적 샘플에서의 폴리펩티드 발현 수준 또는 mRNA 수준이 측정되거나 평가되고, 표준 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준에 비교되고, 표준은 장애를 지니지 않는 개체로부터 수득된 이차 생물학적 샘플로부터 수득되거나 장애를 지니지 않는 개체의 집단으로부터의 평균 수준에 의해 결정된다. 당 분야에서 인지되는 바와 같이, 표준 폴리펩티드 수준 또는 mRNA 수준이 공지되면, 이는 비교를 위한 표준으로 반복적으로 사용될 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플, 세포주, 조직 배양물, 또는 본 발명의 폴리펩티드(이의 부분을 포함함) 또는 mRNA를 함유하는 기타 공급원을 의미한다. 기술된 바와 같이, 생물학적 샘플은 체액(예를들어, 혈청, 혈장, 뇨, 윤활액 및 척수액) 및 폴리펩티드 또는 mRNA의 전장 또는 이의 단편을 발현하는 것으로 밝혀진 조직원을 포함한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 생물학적 샘플이 mRNA를 포함하는 경우, 생검이 바람직한 공급원이다.
전체 새포 RNA는 임의의 적절한 기술, 예를들어 문헌[Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)]에 기술된 단일-단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법을 이용하여 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 mRNA의 수준은 이후 임의의 적절한 방법을 이용하여 검정된다. 이는 노던 블로팅 검정, S1 누클레아제 맵핑(mapping), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 중합효소 연쇄 반응과 조합된 역전사(RT-PCR), 및 리가아제 연쇄 반응과 조합된 역전사(RT-LCR)를 포함한다.
본 발명은 또한 진단 검정, 예를들어 폴리펩티드의 정상 및 비정상 수준의 결정을 포함하여, 생물학적 샘플(예를들어, 세포 및 조직)에서 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합되거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드의 수준을 검출하기 위한 정량 및 진단 검정법에 관한 것이다. 따라서, 예를들어, 정상 대조군 조직 샘플에 비해 알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드의 비정상적 발현을 검출하기 위한 본 발명에 따른 진단 검정법은 종양의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 숙주로부터 유래된 샘플 내의 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드의 수순을 결정하기 위해 사용될 수 있는 검정 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 검정 방법은 방사면역측정법, 경쟁적-결합 검정법, 웨스턴 블로팅 검정법 및 ELISA 검정법을 포함한다. 생물학적 샘플에서 폴리펩티드 수준을 검정하는 것은 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
생물학적 샘플 내의 폴리펩티드 수준을 검정하는 것은 다양한 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 예를들어, 조직에서의 폴리펩티드 발현은 고전 면역조직학 방법(Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell . Biol. 105:3087-3096 (1987))으로 연구될 수 있다. 폴리펩티드 유전자 발현을 검정하기에 유용한 기타 방법은 면역검정법, 예를들어 효소면역측정법(ELISA) 및 방사면역측정법(RIA)을 포함한다. 적절한 항체 검정 라벨은 당 분야에 공지되어 있고, 효소 라벨, 예를들어 글루코오스 옥시다아제, 및 방사성 동위원소, 예를들어 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(112In), 및 테크네튬(99mTc), 및 형광 라벨, 예를들어 플루오로세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다.
검정되는 조직 또는 세포 유형은 일반적으로 관심 유전자(예를들어, 암)를 발현시키는 것으로 공지되거나 혐의가 있는 것(예를들어, 암)을 포함한다. 본원에서 사용되는 단백질 단리 방법은, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Harlow and Lane (Harlow, E. and Lane, D., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)]에 기술된 것일 수 있다. 단리된 세포는 세포 배양물 또는 환자로부터 유래될 수 있다. 배양물로부터 수득된 세포의 검정은 세포-기재 유전자 요법 기술의 일부로서 사용될 수 있는 세포의 평가에 필요한 단계이거나, 대안적으로 유전자의 발현에 대한 화합물의 효과를 시험하기 위해 필요한 단계일 수 있다.
예를들어, 알부민 융합 단백질은 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드의 존재를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이는, 예를들어 광학 현미경, 유세포분석, 또는 형광측정 검출과 커플링된 형광적으로 라벨링된 알부민 융합 단백질을 이용하는 면역형광 기술에 의해 달성될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본원에 기술(예를들어, 표 1에 기술된 치료 단백질)되거나 당 분야에 달리 공지된 하나 이상의 치료 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 변이체를 포함하는 알부민 융합 단백질은 유전자 생성물 또는 보존된 변이체 또는 이의 펩티드 단편의 존재를 정량적 또는 정성적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이는, 예를들어 광학 현미경, 유세포분석, 또는 형광측정 검출과 커플링된 형광적으로 라벨링된 항체를 이용하는 면역형광 기술에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 추가로 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드의 제자리 검출을 위해 면역형광, 면역전자 현미경 검사 또는 비-면역학적 검정과 같이 조직학적으로 사용될 수 있다. 제자리 검출은 환자로부터의 조직학적 견본을 제거하고, 여기에 본 발명의 라벨링된 항체 또는 폴리펩티드를 적용시킴으로써 달성될 수 있다. 알부민 융합 단백질은 바람직하게는 생물학적 샘플상에 라벨링된 알부민 융합 단백질을 입힘으로써 적용된다. 이러한 과정의 이용을 통해, 알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드의 존재 뿐만 아니라, 시험되는 조직에서의 이의 분포도 결정하는 것이 가능하다. 본 발명을 이용하여, 당업자는 임의의 광범위한 조직학적 방법이 제자리 검출을 달성하기 위해 변형될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드를 검출하는 면역검정법 및 비-면역검정법은 통상적으로 유전자 생성물 도는 보존된 변이체 또는 이의 펩티드 단편에 결합할 수 있는 검출가능한 라벨링된 항체의 존재하에서 샘플, 예를들어 생물학적 액체, 조직 추출물, 새로이 수거된 세포, 또는 세포 배양물에서 인큐베이팅된 세포의 용해질을 인큐베이팅하고, 당 분야에 널리 공지된 임의의 다수의 기술에 의해 결합된 항체를 검출하는 것을 포함할 것이다.
생물학적 샘플은 고형상 지지체 또는 담체, 예를들어 니트로셀룰로오스, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 기타 고형 지지체에 접촉되고 고정될 수 있다. 지지체는 이후 적절한 완충용액으로 세척된 후, 본 발명의 검출가능하게 라벨링된 알부민 융합 단백질로 처리된다. 고형상 지지체는 이후 결합되지 않은 항체 또는 폴리펩티드를 제거하기 위해 두번째로 완충용액으로 세척될 수 있다. 임의로, 항체는 차후에 라벨링된다. 고형 지지체 상에 결합된 라벨의 양은 이후 통상적인 방법에 의해 검출될 수 있다.
"고형상 지지체 또는 담체"는 폴리펩티드(예를들어, 알부민 융합 단백질, 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드)에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 의미한다. 널리 공지된 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 반려암, 및 자철광을 포함한다. 담체의 특성은 본 발명의 목적상 다소 가용성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 실질적으로 커플링된 분자가 폴리펩티드에 결합할 수 있는 한 임의의 가능한 구조 형태를 지닐 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드와 같이 구형이거나 시험관의 내면 또는 막대의 외면과 같이 원통형일 수 있다. 대안적으로, 표면은 시트, 검사대 등과 같이 편평할 수 있다. 바람직한 지지체는 폴리스티렌 비드를 포함한다. 당업자는 항체 또는 항원을 결합시키기 위한 다수의 기타 적절한 담체를 인지할 것이고, 통상적인 실험을 이용하여 이를 확인할 수 있을 것이다.
소정의 다수의 알부민 융합 단백질의 결합 활성은 널리 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 당업자는 통상적인 실험을 수행함으로써 각각의 결정을 위한 작용적 및 최적의 검사 조건을 결정할 수 있을 것이다.
개체로부터 수득된 생물학적 샘플에서의 폴리펩티드 수준을 검정하는 것 이외에, 폴리펩티드는 또한 영상화에 의해 생체내에서 검출될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 병들거나 신생물 세포를 영상화하기 위해 사용된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 생체내 영상화를 위한 라벨 또는 표지는 X-방사선촬영, NMR, MRI, CAT-스캔 또는 ESR에 의해 검출가능한 것을 포함한다. X-방사선촬영에 대해, 적절한 라벨은 검출가능한 방사선을 방출하나 피검체에게 명백하게 해롭지 않은 방사성 동위원소, 예를들어 바륨 또는 세슘을 포함한다. NMR 및 ESR에 대해 적절한 표지는 고안된 세포주(또는 세균 또는 효모 균주)의 영양소의 라벨링에 의해 알부민 융합 단백질로 통합될 수 있는 검출가능한 특징적 스핀, 예를들어 중수소를 지닌 것을 포함한다.
추가로, 존재가 검출될 수 있는 본 발명의 알부민 융합 단백질이 투여도리 수 있다. 예를들어, 방사선 비투과 물질 또는 기타 적절한 화합물로 라벨링된 본 발명의 알부민 융합 단백질은 라벨링된 항체에 대해 상기에 기술된 바와 같이 생체내로 투여되어 시각화될 수 있다. 추가로, 이러한 폴리펩티드는 시험관내 진단 방법에 사용될 수 있다.
적절한 검출가능한 영상화 부분, 예를들어 방사성 동위원소(예를들어, 131I, 112In, 99 mTc), 방사선 비투과 물질, 또는 핵 자기 공명에 의해 검출가능한 물질로 라벨링된 폴리펩티드 특이적 항체 또는 항체 단편은 장애에 대해 시험되는 포유동물 내로 도입(예를들어, 비경구, 피하 또는 복막내)된다. 피검체의 크기 및 사용되는 영상화 시스템이 진단 영상을 생성하기 위해 필요한 영상화 부분의 양을 결정하는 것이 당 분야에서 인지될 것이다. 방사성 동위원소 부분의 경우, 인간 피검체에 대해, 주입되는 방사능의 양은 일반적으로 99 mTc의 약 5 내지 20 밀리퀴리의 범위일 것이다. 라벨링된 알부민 융합 단백질은 이후 바람직하게는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되거나 이와 회합되는 폴리펩티드 또는 기타 물질을 함유하는 신체 내의 위치에 축적될 것이다. 생체내 종양 영상화는 문헌[S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Chapter 13 in Tumor Imaging : The Radiochemical Detection of Cancer , S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982))]에 기술되어 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질이 검출가능하게 라벨링될 수 있는 방법중 하나는 이를 리포터 효소를 결합시키고 효소 면역검정법(EIA)에서 결합된 생성물을 이용하는 것이다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD); Voller et al., J. Clin . Pathol . 31:507-520 (1978); Butler, J.E., Meth . Enzymol . 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL,; Ishikawa, E. et al., (eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo). 항체에 결합되는 리포터 효소는, 예를들어 분광 광도 분석, 형광측정법 또는 시각적 방법에 의해 검출될 수 있는 화학적 부분을 생성하기 위한 방식으로 적절한 기질, 바람직하게는 색소 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하게 라벨링하기 위해 사용될 수 있는 리포터 효소는 말레이트 데히드로게나아제, 포도구균 누클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라아제, 효모 알코올 데히드로게나아제, 알파-글리세로포스페이트, 데히드로게나아제, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 호스라디쉬 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보누클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린스테라아제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 검출은 리포터 효소에 대한 색소 기질을 사용하는 비색 방법에 의해 달성될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준과 비교하여 기질의 효소 반응의 범위의 시각적 비교에 의해 달성될 수 있다.
알부민 융합 단백질은 또한 방사선 라벨링되고, 임의의 다양한 기타 면역검정법에 사용될 수 있다. 예를들어, 알부민 융합 단백질을 방사선 라벨링시킴으로써, 방사면역측정법에서 알부민 융합 단백질을 이용하는 것이 가능하다(예를들어, 참조로서 본원에 포함된 문헌[Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, which is incorporated by reference herein] 참조). 방사성 동위원소는 감마 계측기, 신틸레이션 계측기, 또는 자가방사선술을 포함하나 이에 제한되지 않는 방법에 의해 검출될 수 있다.
추가로, 킬레이트제 분자는 당 분야에 공지되어 있고, 알부민 융합 단백질을 라벨링하기 위해 사용될 수 있다. 킬레이트제 분자는 방사선핵종 또는 형광 라벨을 포함하는 금속 이온을 지닌 상기 단백질의 라벨링을 촉진시키기 위해 본 발명의 알부민 융합 단백질에 부착될 수 있다. 예를들어, 문헌[Subramanian, R. and Meares, C.F., "Bifunctional Chelating Agents for Radiometal-labeled monoclonal Antibodies," in Cancer Imaging with Radiolabeled Antibodies (D. M. Goldenberg, Ed.) Kluwer Academic Publications, Boston; Saji, H., "Targeted delivery of radiolabeled imaging and therapeutic agents: bifunctional radiopharmaceuticals." Crit . Rev . Ther . Drug Carrier Syst . 16:209-244 (1999); Srivastava S.C. and Mease R.C., "Progress in research on ligands, nuclides and techniques for labeling monoclonal antibodies." Int . J. Rad . Appl . Instrum. B 18:589-603 (1991); and Liu, S. and Edwards, D.S., "Bifunctional chelators for therapeutic lanthanide radiopharmaceuticals. " Bioconjug . Chem . 12:7-34 (2001)]을 참조하라. 상기 알부민 융합 단백질에 공유 결합될 수 있는 임의의 킬레이트제가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 킬레이트제는 추가로 알부민 융합 단백질에 대한 킬레이트 부분을 연결하는 링커 부분을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 무고리 킬레이트제, 예를들어 디에틸렌 트리아민-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(DPTA), DPTA의 유사체, 및 DPTA의 유도체에 부착된다. 비제한적인 예로서, 킬레이트제는 2-(p-이소티오시아네이토벤질)-6-메틸디에틸렌트리아민펜타아세트산(1B4M-DPTA, MX-DTPA로도 공지됨), 2-메틸-6-(로-니트로벤질)-1,4,7-트리아자헵탄-N,N,N',N",N"-펜타아세트산(니트로-1B4M-DTPA 또는 니트로-MX-DTPA); 2-(p-이소티오시아네이토벤질)-시클로헥실디에틸렌트리아민펜타아세트산(CHX-DTPA), 또는 N-[2-아미노-3-(로-니트로페닐)프로필]-트랜스-시클로헥산-1,2-디아민-N,N',N"-펜타아세트산(니트로-CHX-A-DTPA)일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 무고리 테르피리딘 킬레이트제, 예를들어 6,6"-비스[[N,N,N",N"-테트라(카르복시메틸)아미노]메틸]-4'-(3-아미노-4-메톡시페닐)-2,2':6',2"-테르피리딘(TMT-아민)에 부착된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 부착되는 거대고리 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA)이다. 기타 특정 구체예에서, DOTA는 링커 분자를 통해 본 발명의 알부민 융합 단백질에 부착된다. 폴리펩티드에 DOTA를 컨쥬게이팅시키기 위해 유용한 링커 분자의 예는 당 분야에 통상적으로 공지되어 있고, 예를들어 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[DeNardo et al ., Clin . Cancer Res . 4(10):2483-90, 1998; Peterson et a!., Bioconjug . Chem . 10(4):553-7, 1999; and Zimmerman et al ., Nucl . Med . Biol. 26(8):943-50, 1999]을 참조하라. 또한, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 U.S. 특허 제5,652,361호 및 제5,756,065호에는 항체에 컨쥬게이팅될 수 있는 킬레이트제, 및 이를 제조하고 이를 이용하는 방법이 기술되어 있다. U.S. 특허 제5,652,361호 및 제5,756,065호는 항체에 대한 킬레이트제의 컨쥬게이션에 초점을 두고 있지만, 당업자는 기타 폴리펩티드에 대해 킬레이트제를 컨쥬게이팅시키기 위해 여기에 기술된 방법을 용이하게 적합시킬 수 있다.
활성화된 암, 또는 작용기를 통해 리간드의 탄소 백본에 결합되는 컨쥬게이션에서 거대고리 리간드에 기초한 이작용성 킬레이트제가 문헌[M. Moi et al ., J. Amer. Chem . Soc . 49:2639 (1989) (2p-nitrobenzyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N"'-tetraacetic acid); S. V. Deshpande et a!., J. Nucl . Med . 31:473 (1990); G. Ruser et al ., Bioconj . Chem . 1:345 (1990); C. J. Broan et al ., J. C. S. Chem . Comm . 23:1739 (1990); and C. J. Anderson et al., J. Nucl . Med . 36:850 (1995)]에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 거대고리 킬레이트제, 예를들어 하나 이상의 카르복시, 아미노, 히드록사메이트, 포스포네이트, 또는 포스페이트기를 임의로 함유하는 폴리아자거대고리 킬레이트제가 본 발명의 알부민 융합 단백질에 부착된다. 또 다른 구체예에서, 킬레이트제는 DOTA, DOTA의 유사체, 및 DOTA의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 부착될 수 있는 적절한 킬레이트제 분자는 DOXA(1-옥사-4,7,10-트리아자시클로도데칸트리아세트산), NOTA(1,4,7-트리아자시클로노난트리아세트산), TETA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸테트라아세트산), 및 THT(4'-(3-아미노-4-메톡시-페닐)-6,6"-비스(N',N'-디카르복시메틸-N-메틸히드라지노)-2,2':6',2"-테르피리딘), 및 이들의 유사체 및 유도체를 포함한다. 예를들어, 문헌[Ohmono et al ., J. Med . Chem . 35: 157-162 (1992); Kung et al ., J. Nucl . Med . 25: 326-332 (1984); Jurisson et al ., Chem . Rev. 93:1137-1156 (1993); and U.S. Patent No. 5,367,080. Other suitable chelators include chelating agents disclosed in U.S. Patent Nos. 4,647,447; 4,687,659; 4,885,363; EP-A-71564; W089/00557; and EP-A-232751]을 참조하라.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 사용될 수 있는 적절한 거대고리 카르복실산 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N',N"-테트라아세트산(DOTA); 1,4,8,12-테트라아자시클로펜타데칸-N,N',N",N"-테트라아세트산(15N4); 1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N"-트리아세트산(9N3); 1,5,9-트리아자시클로도데칸-N,N',N"-트리아세트산(12N3); 및 6-브로모아세트아미도-벤질-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸- N,N',N',N"-테트라아세트산(BAT)을 포함한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질에 부착될 수 있는 바람직한 킬레이트제는 MeO-DOTA-NCS로도 공지된 α-(5-이소티오시아네이토-2-메톡시페닐)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산이다. α-(5-이소티오시아네이토-2-메톡시페닐)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산의 염 또는 에스테르가 또한 사용될 수 있다.
기술된 것과 같은 킬레이트제가 공유적으로 부착될 수 있는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료, 진단, 또는 치료 및 진단 둘 모두의 목적에 적합한 방사선핵종으로 (킬레이트제의 배위 부위를 통해) 라벨링될 수 있다. 적절한 금속의 예는 Ag, At, Au, Bi, Cu, Ga, Ho, In, Lu, Pb, Pd, Pm, Pr, Rb, Re, Rh, Sc, Sr, Tc, TI, Y, 및 Yb를 포함한다. 진단 목적에 사용되는 방사선핵종의 예는 Fe, Gd, 111In, 67Ga, 또는 68Ga이다. 또 다른 구체예에서, 진단 목적에 사용되는 방사선핵종은 111In 또는 67Ga이다. 치료 목적에 사용되는 방사선핵종의 예는 166Ho, 165Dy, 90Y, 115mIn, 52Fe, 또는 72Ga이다. 한 구체예에서, 진단 목적에 사용되는 방사선핵종은 166Ho 또는 90Y이다. 치료 및 진단 둘 모두의 목적에 사용되는 방사선핵종의 예는 153Sm, 177Lu, 159Gd, 175Yb, 또는 47Sc를 포함한다. 한 구체예에서, 방사선핵종은 153Sm, 177Lu, 175Yb, 또는 159Gd이다.
바람직한 금속 방사선핵종은 90Y, 99 mTc, 111In, 47Sc, 67Ga, 51Cr, 177 mSn, 67Cu, 167Tm, 97Ru, 188Re, 177Lu, 199Au, 47Sc, 67Ga, 51Cr, 177 mSn, 67Cu, 167Tm, 95Ru, 188Re, 177Lu, 199Au, 203Pb 및 141Ce를 포함한다.
특정 구체예에서, 킬레이트제가 공유적으로 부착될 수 있는 알부민 융합 단백질은 90Y, 111In, 177Lu, 166Ho, 215Bi, 및 225Ac로 구성된 군으로부터 선택된 금속 이온으로 라벨링될 수 있다.
더욱이, γ-방출 방사선핵종, 예를들어 99 mTc, 111In, 67Ga, 및 169Yb가 진단 영상화를 위한 연구에 승인된 반면, β-방출, 예를들어 67Cu, 111Ag, 186Re, 및 90Y가 종양 요법에 적용하기에 유용하다. 또한, 기타 유용한 방사선핵종은 γ-방출기, 예를들어 99mTc, 111In, 67Ga, 및 169Yb, 및 β-방출기, 예를들어 67Cu, 111Ag, 186Re, 188Re 및 90Y, 뿐만 아니라 기타 관심 방사선핵종, 예를들어 211At, 212Bi, 177Lu, 86Rb, 105Rh 153Sm, 198Au, 149Pm, 85Sr, 142Pr, 214Pb, 109Pd, 166Ho, 208Tl, 및 44Sc를 포함한다. 킬레이트제가 공유적으로 부착되는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 상기 기술된 방사선핵종으로 라벨링될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 킬레이트제에 공유적으로 부착되는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 21-29, 42, 43, 44, 또는 57-71개의 원자수를 지니는 금속과 같은 전이 금속 및 란탄족 금속의 이온, 특히 Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, 및 Lu을 포함하는 상자성 금속 이온으로 라벨링될 수 있다. 자기 공명 영상화를 위한 조성물에 사용되는 상자성 금속은 22 내지 29, 42, 44 및 58-70개의 원자수를 지니는 원소를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 킬레이트제에 공유적으로 부착되는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 란탄족, 특히 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu (예를들어, 152Eu), Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, 및 Lu를 포함하는 형광 금속 이온으로 라벨링될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 킬레이트제에 공유적으로 부착되는 본 발명의 알부민 융합 단백질은 Mo, Bi, Si, 및 W의 원소를 포함할 수 있는 중금속 함유 리포터로 라벨링될 수 있다.
형광 화합물로 알부민 융합 단백질을 라벨링시키는 것이 또한 가능한다. 형광으로 라벨링된 항체가 적절한 파장의 빛에 노출되는 경우, 이의 존재는 이후 형광으로 인해 검출될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 형광 라벨링 화합물은 플루오로세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 옵트알데히드 및 플루오레카민이다.
알부민 융합 단백질은 또한 형광 방출 금속, 예를들어 152Eu, 또는 기타 란탄족 계열을 이용하여 검출가능하게 라벨링될 수 있다. 이러한 금속은 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트제를 이용하여 항체에 부착될 수 있다.
알부민 융합 단백질은 또한 이를 화학발광 화합물에 커플링시킴으로써 검출가능하게 라벨링될 수 있다. 화학발광-태그된 알부민 융합 단백질의 존재는 이후 화학 반응의 과정 동안 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 라벨링 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 열 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
또한, 생물발광 화합물이 본 발명의 알부민 융합 단백질을 라벨링시키기 위해 사용될 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견된 화학발광의 유형이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 라벨링의 목적상 중요한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시퍼라아제 및 애큐오린이다.
트랜스제닉 유기체
본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 유기체가 또한 본 발명에 포함된다. 트랜스제닉 유기체는 재조합, 외인성 또는 클로닝된 유전 물질이 이동된 유전적으로 변형된 유기체이다. 이러한 유전적 물질은 종종 형질전환 유전자로 언급된다. 형질전환 유전자의 핵산 서열은 하나 이상의 전사 조절 서열 및 기타 핵산 서열, 예를들어 최적의 발현 및 엔코딩된 단백질의 분비에 필요할 수 있는 인트론을 포함할 수 있다. 형질전환 유전자는 유기체 및 유기체에 의해 생성된 생성물, 예를들어 유기체의 밀크, 혈액 , 뇨, 알, 모발 또는 종자로부터의 회수를 촉진하는 방식으로 엔코딩된 단백질의 발현에 특이적으로 고안될 수 있다. 형질전환 유전자는 표적 동물의 종과 동일한 종 또는 상이한 종의 유전체로부터 유래된 핵산으로 구성될 수 있다. 형질전환 유전자는 특정 핵산 서열이 달리 일반적으로 밝혀지지 않은 유전체의 유전자좌 또는 형질전환 유전자에 대해 일반적인 유전자좌에 통합될 수 있다.
용어 "생식 세포주 트랜스제닉 유기체"는 유전적 정보의 유전적 변화가 생식 세포주로 도입되어 트랜스제닉 유기체에 후손에게 유전적 정보를 전달하는 능력을 수여하는 트랜스제닉 유기체를 의미한다. 이러한 후손이 실제로 유전적 정보의 일부 또는전부의 변화를 소유하는 경우, 이들 역시 트랜스제닉 유기체이다. 변화 또는 유전적 정보는 수용자가 속하는 유지체의 종에 대해 외래이거나, 특정 개체 수용자에 대해서만 외래일 수 있거나, 수용자에 의해 이미 소유된 유전적 정보일 수 있다. 후자의 경우, 변화되거나 도입된 유전자는 선천적인 유전자와는 다르게 발현될 수 있다.
트랜스제닉 유기체는 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물일 수 있다. 트랜스제닉 동물은 배아 줄기 세포 및 재조합 바이러스 및 레트로바이러스 감염에서의 트랜스펙션, 전기천공, 미세주입, 유전자 표적화(gene targeting)를 포하하는 매우 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다(예를들어, 문헌[U.S. Patent No. 4,736,866; U.S. Patent No. 5,602,307; Mullins et al . (1993) Hypertension 22(4):630-633; Brenin et al . (1997) Surg. Oncol. 6(2)99-110; Tuan (ed.), Recombinant Gene Expression Protocols , Methods in Molecular Biology No. 62, Humana Press (1997))] 참조). 재조합 적격 포유동물 세포로의 핵단 단편의 도입 방법은 다중 핵산 분자의 공동 형질전환을 촉진하는 임의의 방법일 수 있다. 트랜스제닉 동물을 생성하기 위한 상세한 방법은 U.S. 특허 제5,489,743호 및 U.S. 특허 제5,602,307호의 기술을 포함하여 당업자에 의해 용이하게 이용가능하다.
다수의 재조합 또는 트랜스제닉 마우스가 활성화된 종양유전자서열을 발현하고(U.S. 특허 제4,736,866호); 원숭이 SV40 T-항원을 발현하고(U.S. 특허 제5,728,915호); 인터페론 조절 인자 1(IRE-1)이 결핍되고(U.S. 특허 제5,731,490호); 도파민 기능 장애를 나타내고(U.S. 특허 제5,723,719호); 혈압 조절에 관여하는 하나 이상의 인간 유전자를 발현하고(U.S. 특허 제5,731,489호); 자연 발생 알츠하이머병 질환과 매우 유사성을 나타내고(U.S. 특허 제5,720,936호); 세포 부착을 매개하는 감소된 능력을 지니고(U.S. 특허 제5,602,307호); 우 성장 호르목 유전자를 지니는(Clutter et al . (1996) Genetics 143(4):1753-1760) 것을 포함하도록 생성되었거나, 이는 안전한 인간 항체 반응을 생성시킬 수 있다(McCarthy (1997) The Lancet 349(9049):405).
마우스 및 래트는 대부분의 트랜스제닉 실험을 위한 선택 동물이나, 몇몇 예에서는 대안적 동물 종을 사용하는 것이 바람직하거나 필요하다. 트랜스제닉 방법은 양, 염소, 돼지, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 햄스터, 토끼, 소 및 기니아 피그를 포함하는 다양한 비-뮤린 동물을 성공적으로 이용하였다(예를들어, 문헌[Kim et al . (1997) Mol. Reprod. Dev. 46(4):515-526; Houdebme 099)) xeprod. Nutr. Dev. 35(6):609-6I7; Petters (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6(5):643-645; Schnieke et al . (1997) Science 278(5346):2130-2133; and Amoah (1997) J. Animal Science 75(2):578-585)] 참조).
트랜스제닉 포유동물의 밀크 내로 본 발명의 형질전환 유전자 엔코딩된 단백질의 분비를 특정하기 위해, 바람직하게는 포유동물 상피 세포에서 활성화되는 프로모터의 조절하에 둘 수 있다. 밀크 단백질을 엔코딩하는 유전자를 조절하는 프로모터, 예를들어 카세인, 베타 락토글로불린, 유장 산 단백질, 또는 락타부민에 대한 프로모터가 바람직하다(예를들어, 문헌[DiTullio (1992) BioTechnology 10:74-77; Clark et al . (1989) BioTechnology 7:487-492; Gorton et al . (1987) BioTechnology 5:1183-1187; and Soulier et al . (1992) FEES Letts. 297:13)] 참조). 트랜스제닉 포유동물, 예를들어 염소, 소, 낙타 또는 양의 선택은 보다 큰 부피의 밀크를 생성할 것이고, 긴 수유 기간을 지닐 것이다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 트랜스제닉 식물, 예를들어 DNA 형질전환 유전자가 핵 또는 플라스티드 유전체로 삽입된 식물에서 발현될 수 있다. 식물 세포 또는 원형질체로 외래 핵산을 도입시키기 위해 사용되는 식물 형질전화 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를들어, 문헌[Methods in Enzymology Vol. 153 ("Recombinant DNA Part D") 1987, Wu and Grossman Eds., Academic Press and European Patent Application EP 693554]을 참조하라. 유전적으로 고안된 식물의 생성 방법은 참조로서 본원에 포함된 US 특허 제5,283,184호, US 특허 제5,482,852호, 및 유립 특허 출원 EP 693 554호에 추가로 기술되어 있다.
약학적 또는 치료 조성물
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 제형은 비경구(예를들어, 피하 또는 근내) 주사 또는 정맥내 주입을 포함하는 임의의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있다. 처리는 단일 용량 또는 일정 기간에 걸친 다수의 용량으로 구성된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질이 단독으로 투여되는 것이 가능하나, 이는 하나 이상의 허용되는 담체와 함께 약학적 조성물로 존재하는 것이 바람직하다. 담체(들)은 알부민 융합 단백질과 양립되고 이의 수용자에 대해 해롭지 않은 면에서 "허용"되어야 한다. 통상적으로, 담체는 멸균되거나 피로겐이 제거되는 물 또는 염수일 것이다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 이들의 용액에서의 연장된 저장 수명으로 인해 수성 담체, 예를들어 멸균된 피로겐 제거된 물, 염수 또는 기타 등장성 용액에서 포뮬레이팅되는 것에 특히 적합하다. 예를들어, 본 발명의 약학적 조성물은, 예를들어 투약되기 수주 또는 수개우러 또는 그 이상의 기간 전에 사전에 수성 형태로 포뮬레이팅될 수 있다.
예를들어, 알부민 융합 단백질을 함유하는 포뮬레이션은 수성 포뮬레이션에서의 알부민 융합 단백질의 연장된 저장 기간을 고려하여 제조될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 다수의 이러한 치료 단백질의 저장 기간은 HA 대한 융합 후 현저하게 증가되거나 연장된다.
에어로졸 투여가 적합한 경우, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 표준 방법을 이용하여 에어로졸로 포뮬레이팅될 수 있다. 용어 "에어로졸"은 세기관지 또는 비내 통로로 흡입될 수 있는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 임의의 가스-함유 현탁상을 포함한다. 특히, 에어로졸은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 비말의 가스-함유 현탁액을 포함하고, 이는 계량된 용량 흡입기 또는 분무기, 또는 연무 스프레이기로 생성될 수 있다. 에어로졸은 또한 흡입 장치로부터의 흡입법에 의해 전달될 수 있는 공기 또는 기타 담체 가스에 현탁된 본 발명의 화합물의 건조 분말 조성물을 포함한다. 문헌[Ganderton & Jones, Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood (19 87); Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313; and Raebum et al ,. (1992) Pharmacol . Toxicol . Methods 27:143-159]을 참조하라.
본 발명의 포뮬레이션은 또한 통상적으로 알부민 융합 단백질의 화합물의 용도가 적절한 종으로부터 유래되기 때문에 부분적으로 비-면역원성이다. 예를들어, 인간 용도에 대해, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 및 알부민 부분 둘 모두는 통상적으로 인간일 것이다. 몇몇 경우에서, 성분이 비 인간 유래인 경우, 이 성분은 특정 에피토프가 인간 면역계에 대해 외래가 아니라 천연의 인간인 것으로 나타나도록 하기 위해 중요 아미노산의 치환에 의해 인간화될 수 있다.
포뮬레이션은 편리하게는 단위 복용 형태로 존재할 수 있고, 약학 분야의 당업자에게 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 알부민 융합 단백질을 하나 이상의 부수 성분을 구성하는 담체와 함께 회합시켜 생성시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 포뮬레이션은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 세분된 고형 담체와 균일하고 밀접하게 회합시킨 후, 필요시 생성물을 형상화시킴으로써 제조된다.
비경구 투여에 적합한 포뮬레이션은 항산화제, 완충용액, 제균제 및 포뮬레이션이 수용자에게 적합하게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포뮬레이션은 단위-용량 또는 다용량 용기, 예를들어 밀봉된 앰풀, 바이얼 또는 주사기로 존재할 수 있고, 사용하기 직전에 멸균수 담체, 예를들어 주사용 물의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조된 상태로 저장될 수 있다. 임시 주사액 및 현탁액이 멸균 분말로부터 제조될 수 있다. 투여량 포뮬레이션은 본 발명의 다수의 알부민 융합 단백질에 의해 나타나는 연장된 혈청 저장 기간이 주어진 치료 단백질에 대하여 융합되지 않은 표준 포뮬레이션에 비해 보다 낮은 몰 농도 또는 보다 낮은 용량의 치료 단백질을 함유할 수 있다.
예로써, 본 발명의 알부민 융합 단백질이 치료 단백질 영역중 하나 이상으로 표 1의 "치료 단백질:X" 컬럼에 기술된 단백중 하나를 포함하는 경우, 복용 형태는 천연 치료 단백질의 저장 기간과 비교한 알부민 융합 단백질의 연장된 혈청 반감기 및 저장 기간을 고려하여 치료 단백질 단독의 효능에 비한 알부민 융합 단백질의 효능을 기초로 계산될 수 있다. 예를들어, 치료 단백질이 통상적으로 0.3 내지 30.0 IU/㎏/주, 또는 0.9 내지 12.0 IU/㎏/주로 투여되는 경우, 1년에 3 또는 7회로 분배된 용량 또는 그 이상으로 주어진다. 치료 단백질에 융합된 전장의 HA로 구성된 알부민 융합 단백질의 경우, 단위와 관련된 동등한 용량은 보다 무거운 중량의 작용제를 지닐 것이나, 복용 빈도는, 예를들어 1주일에 2회, 1주일에 1회 또는 그 미만으로 감소될 것이다.
본 발명의 포뮬레이션 또는 조성물은 알부민 융합 단백질 성분의 연장된 저장 기간을 언급하는 설명서 또는 패키지 삽입물과 함께 패키징되거나 이를 지닌 키트에 포함될 것이다. 예를들어, 이러한 설명서 또는 패키지 삽입물은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 연장된 저장 기간을 고려하여 시간, 온도 및 빛과 같은 권장 저장 조건을 다룰 것이다. 이러한 설명서 또는 패키지 삽입물은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 특정 이점, 예를들어 현장, 제어된 병원, 임상 또는 연구실 조건의 외부에서 사용을 필요로 할 수 있는 포뮬레이션에 대한 저장의 용이성을 다룰 것이다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 포뮬레이션은 수성 형태일 수 있고, 치료 활성의 현저한 손실 없이 덜 이상적인 환경하에서 저장될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 기능식품에 포함될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 특정 알부민 융합 단백질은 알부민 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 동물로부터 수득된 밀크 또는 유제품을 포함하는 천연 제품에 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 알부민 융합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 식물로부터 수득된 식물 또는 식물 제품을 포함할 수 있다. 알부민 융합 단백질은 또한 기타 공지된 첨가제, 담체, 충전재 및 희석제와 함께 또는 이를 포함하지 않는 분말 또는 정제 형테로 제공될 수 있다. 기능식품은 문헌[Scott Hegenhart, Food Product Design, Dec. 1993]에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체 내의 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드("알부민 융합 폴리누클레오티드")의 유효량을 피검체에게 투여함으로써 질병 또는 장애(예를들어, 본원에 기술된 질병 또는 장애중 임의의 하나 이상)을 치료하고/하거나 예방하는 방법을 제공한다.
알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 개별적 환자의 임상적 상태(특히, 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드 단독 치료의 부작용), 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 전문의에게 공지된 기타 요인을 고려하여, 우수한 의학적 실시와 일치하는 방식으로 포뮬레이팅되고 투여된다. 본 발명의 목적상 "유효량"은 따라서 이러한 고려에 의해 결정된다.
일반적 제안으로서, 용량 당 비경구적으로 투여되는 알부민 융합 단백질의 전체 약학적 유효량은 환자 체중의 약 1 ㎍/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일의 범위일 것이나, 상기 기술된 바와 같이 이는 치료적 판단에 종속될 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 용량은 0.01 ㎎/㎏/일 이상이고, 인간에 대해 가장 바람직하게는 호르몬에 대해 약 0.01 내지 1 ㎎/㎏/일 것이다. 연속적으로 주어지는 경우, 알부민 융합 단백질은 통상적으로, 예를들어 미니-펌프를 이용하여 일당 1-4 주사 또는 연속적 피하 주입에 의해 약 1 ㎍/㎏/시간 내지 약 50 ㎍/㎏/시간의 용량률로 투여된다. 정맥내 백 용액이 또한 사용될 수 있다. 치료 후에 발생하는 반응에 대한 변화 및 간격이 관찰되기에 필요한 치료 기간은 요망되는 효과에 따라 다양하다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료 단백질 부분(또는 이의 단편 또는 변이체) 단독에 비해 보다 높은 혈장 안정성을 지닌다. 혈장 안성성의 이러한 증가는 용량 당 투여되는 알부민 융합 단백질의 유효량 및 용량 투여 스케줄을 결정하는 경우 고려되어야 한다. 특히, 보다 높은 혈장 안정성은 알부민 융합 단백질이 동일한 투여 빈도에서 보다 낮은 용량으로 투여되도록 하거나, 대안적으로 알부민 융합 단백질이 보다 적은 복용 수로 투여되도록 한다. 바람직하게는, 보다 높은 안정성은 본 발명의 알부민 융합 단백질이 보다 적은 복용 수로 투여되는 것이다. 더욱 바람직하게는, 알부민 융합 단백질은 2주에 1회 투여될 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 알부민 융합 단백질은 알부민 융합 단백질의 약동학에 따라 3주, 4주, 5주, 또는 기 이상의 주에 1회로 투여될 수 있다. 예를들어, 상기 기술된 바와 같이, IFN-알파-HSA 융합 단백질의 약동학은 2-4주에 1회 또는 그 이상의 복용 요법, 및 4주에 1회 또는 4주의 1회 이상의 간격으로 복용된다.
알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 경구, 직장, 비경구, 수조내, 질내, 복막내, 국소(예를들어, 분말, 연고, 젤, 점적 또는 경피 패치), 구강, 또는 경구 또는 비내 스프레이로서 투여될 수 있다. "약학적으로 허용되는 담체"는 비-독성 고형물, 반고형물 또는 액체 충전재, 희석제, 인캡슐레이팅 물질 또는 임의의 포뮬레이션 보조물을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근내, 복막내, 복장내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 모드를 의미한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 또한 지효성 방출 시스템에 의해 적절하게 투여된다. 지효성 방출 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드의 예는 경구, 직장, 비경구, 수조내, 질내, 복막내, 국소(분말, 연고, 젤, 점적 또는 경피 패치), 구강, 또는 경구 또는 비내 스프레이로 투여된다. "약학적으로 허용되는 담체"는 비-독성 고형물, 반고형물 또는 액체 충전재, 희석제, 인캡슐레이팅 물질 또는 임의의 유형의 보조 포뮬레이션을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근내, 복막내, 복장내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 모드를 의미한다. 지효성 방출 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드의 추가의 예는 적절한 중합 물질(예를들어, 형상화된 물품 형태의 반투과성 중합 기질, 예를들어 필름 또는 마이크로캡슐), 적절한 소수성 물질(예를들어, 허용되는 오일의 에멀션) 또는 이온 교환 레진, 및 난용성 유도체(예를들어, 난용성 염)를 포함한다.
지효성 방출 기질은 폴리락티드(U.S. Pat. No. 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolyrners 22:547-556 (1983)), 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), and Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., Id.) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988)을 포함한다.
지효성 방출 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 또한 본 발명의 리포솜에 의해 엔트래핑(entrapping)된 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드를 포함한다(예를들어, 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer , Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 317 -327 and 353-365 (1989)] 참조). 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드를 함유하는 리포솜은 문헌[DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Pat. Appl. 83-118008; U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and EP 102,324]에 공지된 방법에 의해 제조된다. 보통, 리포솜은 지질의 함량이 최적의 치료를 위해 조정된 선택된 비율인 약 30몰% 콜레스테롤 초과의 작은(약 200-800Å) 단층 유형이다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 펌프에 의해 전달된다(문헌[Langer, supra ; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)] 참조).
기타 조절되는 방출 시스템은 문헌[Langer ( Science 249:1527-1533 (1990))]의 개관에 논의되어 있다.
비경구 투여를 위해, 한 구체예에서, 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 일반적으로 요망되는 순도로 약학적으로 허용되는 담체, 즉 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비-독성이고 포뮬레이션의 기타 성분과 양립되는 담체와 함께 주사가능한 단위 복용 형택(용액, 현탁액, 또는 에멀션)로 혼합시킴으로써 포뮤레이팅된다. 예를들어, 포뮬레이션은 바람직하게는 치료에 유독한 것으로 공지된 산화제 및 기타 화합물을 포함하지 않는다.
일반적으로, 포뮬레이션은 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드를 액체 담체 또는 미세하게 분할된 고형 담체 또는 둘 모두와 접촉시킴으로써 제조된다. 이후, 필요시 생성물은 요망디는 포뮬레이션으로 형상화된다. 바람직하게는, 담체는 비경구 담체, 더욱 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장성인 용액이다. 이러한 담체 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 및 덱스트로오스 용액을 포함한다. 비수성 비히클, 예를들어 고정된 오일 및 에틸 올리에이트, 뿐만 아니라 리포솜이 또한 본원에서 유용하다.
담체는 소량의 첨가제, 예를들어 등장력 및 화학적 안전성을 향상시키는 물질을 함유한다. 이러한 물질은 사용되는 복용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를들어 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산, 및 기타 유기산 또는 이들의 염; 항산화제, 예를들어 아스코르브산; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드, 예를들어 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예를들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를들어 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 또는 아르기닌; 단당류, 이당류, 및 셀룰로오스 또는 이의 유도체, 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예를들어 EDTA; 설탕 알코올, 예를들어 만니톨 또는 소르비톨; 카운터이온, 예를들어 나트륨; 및/또는 비이온성 표면활성제, 예를들어 폴리소르베이트(예를들어, 트윈-20 포함), 폴록사머, 또는 PEG를 포함한다.
알부민 융합 단백질은 통상적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 1-10 mg/ml의 농도, 약 3 내지 8의 pH에서 상기 비히클내로 포뮬레이팅된다. 전술한 특정 부형제, 담체, 또는 안정제의 사용이 폴리펩티드 염의 형성을 발생시키는 것을 인지할 것이다.
치료 투여를 위해 사용되는 임의의 약물은 멸균될 수 있다. 멸균은 멸균 여과막(예를들어, 0.2 마이크론 막)을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 일반적으로 멸균 접근 포트, 예를들어 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 지니는 정맥내 용액 백 또는 바이얼을 지니는 용기에 위치된다.
알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 보통 재구성을 위한 수용액 또는 동결건조된 포뮬레이션으로서 단위 또는 다용량 용기, 예를들어 밀봉된 앰풀 또는 바이얼로 저장될 것이다. 동결건조된 포뮬레이션의 예로서, 10 ml 바이얼은 5 ml의 멸균 여과된 1%(w/v) 수성 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드 용액으로 채워지고, 생성된 혼합물은 동결건조된다. 주입 용액은 정균성 워터-포-인젝션(Water-for-Injection)을 이용하여 동결건조된 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드를 재구성시킴으로써 제조된다.
특정의 바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질 포뮬레이션은 0.01 M 인산나트륨, 0.15 mM 염화나트륨, 0.16 마이크로몰의 나트륨 옥타노에이트/밀리리터의 융합 단백질, 15 ㎍/㎖ 폴리소르베이트 80(pH 7.2)를 포함한다. 또 다른 특정의 바람직한 구체예에서, 알부민 융합 단백질 포뮬레이션은 0.01 M 인산나트륨, 0.15 mM 염화나트륨, 0.16 마이크로몰 나트륨 옥타노에이트/밀리그램의 융합 단백질, 15 ㎍/㎖ 폴리소르베이트 80(pH 7.2)로 구성된다. pH 및 완충용액은 생리학적 환경과 매치되는 것으로 선택되고, 염은 토니시피어(tonicifier)로서 첨가된다. 나트륨 옥타노에이트는 용액에서의 단백질의 열 안전성을 증가시키는 이의 보고된 능력으로 인해 선택된다. 최종적으로, 폴리소르베이트는 용액의 표면 장력을 낮추고 용기 폐쇄 시스템에 대한 알부민 융합 단백질의 비-특이적 흡수를 낮추는 일반명 표면활성제이다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드의 성분중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)와 관련하여 인간 투여에 대한 제조, 용도 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영하는 것으로 공지되는 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 통제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 공지될 수 있다. 게다가, 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 기타 치료 화합물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 단독으로 또는 애쥬번트와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 애쥬번트는 백반, 백반 + 데옥시콜레이트(ImmunoAg), MTP-PE(Biocine Corp.), QS21(Genentech, Inc.), BCG(예를들어, THERACYS?), MPL 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)의 무생육성 제조물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 백반과 함께 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 QS-21과 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 추가의 애쥬번트는 모노포스포릴 지질 면역조절 물질, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, 알루미늄염, MF-59, 및 바이로솜 애쥬번트 기술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 백신은 MMR(홍역, 멈프스, 풍진), 폴리오, 수두, 파상풍/디프테리아, A형 간염, B형 간염, 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B, 백일해, 폐렴, 인플루엔자, 라임병, 로타바이러스, 콜레라, 황열병, 일본 뇌염, 회색질척수염, 광견병, 장티푸스, 및 백일해에 대한 보호에 관련된 백신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조합물은 동반하여, 예를들어 혼합물로 단독이지만 동시에 투여될 수 있거나, 순차적으로 투여될 수 있다. 이는 결합된 작용제가 치료 혼합물로서 함께 투여되는 프레젠테이션, 및 결합된 작용제가 개별적으로 투여되나 동시에, 예를들어 동일한 개체로 별개의 정맥주사선을 통해 투여되는 공정을 포함한다. "조합되는" 투여는 추가로 소정의 제1의 화합물 또는 작용제중 하나의 별개의 투여 후, 제2의 화합물 또는 작용제중 하나의 별개의 투여를 포함한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 단독으로 또는 기타 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 조합되어 투여될 수 있는 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드 작용제는 화학요법제, 항생제, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제, 통상적인 면역요법제, 및/또는 하기 기술된 치료적 치료법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
조합물은 동반하여, 예를들어 혼합물, 개별적이지만 동시에 또는 동시에 투여될 수 있거나; 순차적으로 투여될 수 있다. 이는 조합된 작용제가 치료 혼합물로서 함께 투여되는 프레젠테이션, 및 조합된 작용제가 개별적이지만 동시에, 예를들어 동일한 개체로 별개의 정맥주사선을 통해 투여되는 방법을 포함한다. "조합되는" 투여는 추가로 소정의 제1의 화합물 또는 작용제중 하나의 별개의 투여 후, 제2의 화합물 또는 작용제중 하나의 별개의 투여를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 항응고제와 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항응고제는 헤파린, 저분자량 헤파린, 와파린 나트륨(예를들어, COUMADIN?), 디쿠마롤, 4-히드록시쿠마린, 아니스인디온(예를들어, MIRADONTM), 아세노쿠마롤(예를들어, 니쿠말론, SINTHROMETM), 인단-1,3-디온, 펜프로쿠몬(예를들어, MARCUMARTM), 에틸 비스쿠마세테이트(예를들어, TROMEXANTM), 및 아스피린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 헤파린 및/또는 와파린과 함께 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 와파린과 함께 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 와파린 및 아스피린과 함께 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 헤파린과 함께 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 헤파린 및 아스피린과 함께 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 혈전용해 약물과 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 혈전용해 약물은 플라스미노겐, lys-플라스미노겐, 알파2-항플라스민, 스트렙토키나아제(예를들어, KABIKINASETM), 안티레스플레이스(antiresplace)(예를들어, EMINASETM), 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA, 알테바아제(altevase), ACTIVASETM), 우로키나아제(예를들어, ABBOKINASETM), 사우루플라아제(sauruplase), (프로우로키나아제, 단일 사슬 우로키나아제), 및 아미노카프로산(예를들어, AMICARTM)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 조직 플라스미노겐 활성제 및 아스피린과 조합되어 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 항혈소판 약물과 조합되어 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항혈소판 약물은 아스피린, 디피리다몰(예를들어, PERSANTINETM), 및 티클로피딘(예를들어, TICLIDTM)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 조합된 항응고제, 혈전용해 및/또는 항혈소판 약물의 사용은 혈전증, 동맥 혈전증, 정맥 혈전증, 혈전색전증, 폐색전증, 죽상경화증, 심근경색증, 일과성 허혈 발작, 불안전형 협심증의 예방, 진단 및/또는 치료에 고려된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 조합된 항응고제, 혈전용해 약물 및/또는 항혈소판 약물의 사용은 혈관성형술 과정에 수반될 수 있는 주변절차(periprocedural)상 혈전증의 위험을 감소시키고, 비류마티스 심방세동을 포함하는 심방세동을 지닌 환자에서의 뇌졸중의 위험을 감소시키고, 기계적 심판막 및 승모판막 질병과 관련된 색전증의 위험을 감소시키기 위해 두렁 이식의 폐색의 방지에 대해 고려된다. 본 발명의 치료제 단독 또는 항혈소판제, 항응고제, 및/또는 혈전용해 약물과의 조합에 대한 기타 용도는 체외 장치(예를들어, 혈액투석 환자에서의 혈관내 삽입관, 혈관통로 션트, 및 심폐기)에서의 폐색의 방지를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 안티레트로바이러스 제제, 누클레오시드/누클레오티드 역전사효소 억제제(NRTI), 비-누클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTI), 및/또는 프로테아제 억제제(PI)와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 NRTI는 RETROVIRTM (지도부틴/AZT), VIDEXTM (디다노신/ddI), HIVIDTM(잘시타빈/ddC), ZERITTM (스타부딘/d4T), EPIVIRTM(라미부딘/3TC), 및 COMBIVIRTM (지도부딘/라미부딘)을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 NNRTI는 VIRAMUNETM (네비라핀), RESCRIPTORTM (델라비르딘), 및 SUSTIVATM (에파비렌즈)를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 프로테아제 억제제는 CRIXIVANTM (인디나버), NORVIRTM (리토나버), INVIRASETM(사퀴나버), 및 VIRACEPTTM (넬피나버)을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 특정의 구체예에서, 안티레트로바이러스 제제, 누클레오시드 역전사효소 억제제, 비-누클레오시드 역전사효소 억제제 및/또는 프로테아제 억제제는 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 어떠한 조합으로 사용되어 AIDS를 치료하고/거나 HIV 감염증을 예방 또는 치료할 수 있다.
추가의 NRTI는 LODENOSINETM (F-ddA; 산-안전성 아데노신 NRTI; Triangle/Abbott; COVIRACILTM ( 엠트리사이타빈/FTC; 구조적으로 라미부딘(3TC)와 관련있지만, 시험관내에서 3- 내지 10-배 더 큰 활성을 지님; Triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, 라미부딘과 역시 구조적으로 관련이 있지만, 라미부딘 내성 분리체의 실질적인 부분에 대해서 활성을 보유함; Biochem Pharma); 아데포버(Adefovir : FDA에 의해서 항-HIV 치료제로 승인 거절; Gilead Sciences); PREVEON?(아데포버 디피복실(Adefovir Dipivoxil), 아데포버의 활성 프로드러그; 이의 활성형은 PMEA-pp이다); TENOFOVIRTM (비스-POC PMPA, PMPA 프로드러그; Gilead); DAPD/DXG (DAPD의 활성 대사체; Triangle/Abbott); D-D4FC (3TC와 연관됨, AZT/3TC-내성 바이러스에 대해서 활성을 지님); GW420867X (Glaxo Wellcome); ZIAGENTM (아바카버/159U89; Glaxo Wellcome Inc.); CS-87 (3'아지도-2',3'-디데옥시우리딘; WO 99/66936); 및 β-L-FD4C 및 β-L-FddC의 S-아실-2-티오에틸 (SATE)-함유 프로드러그 형태 (WO 98/17281)를 포함한다.
추가의 NNRTI는 COACTINONTM (에미비린/MKC-442, HEPT 류의 효능적 NNRTI; Triangle/Abbott); CAPRAVIRINE TM (AG-1549/S-1153, K103N 돌연변이를 함유하는 바이러스에 대해 활성을 지니는 차세대 NNRTI; Agouron); PNU-142721 (선행 델라비르딘 보다 20- 내지 50-배 더 큰 활성을 지니며 K103N 돌연변이에 대해서 활성임; Pharmacia & Upjohn); DPC-961 및 DPC-963 (K103N 돌연변이를 지니는 바이러스에 대해서 활성이도록 고안된 제 2 세대 에파비렌즈(efavirenz) 유도체; DuPont); GW-420867X (HBY097에 비해서 25-배 더 큰 활성을 지니며 K103N 돌연변이체에 대해서 활성임; Glaxo Wellcome); CALANOLIDE A (라텍스(latex) 나무로부터의 천연 제제; Y181C 및 K103N 돌연변이 중 하나 또는 둘 모두를 함유하는 바이러스에 대해서 활성); 및 프로폴리스(Propolis)(WO 99/49830)를 포함한다.
추가의 프로페아제 억제제는 LOPINAVIR TM(ABT378/r; Abbott Laboratories); BMS-232632 (아자펩티드; Bristol-Myres Squibb); TIPRANAVIRTM (PNU-140690, 비펩티드성 디히드로피론; Pharmacia & Upjohn); PD-178390 (비펩티드성 히드로피론; Parke-Davis); BMS 232632 ( 아자펩티드; Bristol-Myers Squibb); L-756,423 (인디나버(indinavir) 유사체; Merck); DMP-450 (시클릭 우레아 화합물; Avid & DuPont); AG-1776 (프로테아제 억제제 내성 바이러스에 대해서 시험관내 활성을 나타내는 펩티도의태체; Agouron); VX -175/ GW -433908 (앰프레나버의 포스페이트 프로드러그; Vertex & Glaxo Welcome); CGP61755 (Ciba); 및 AGENERASETM (암프레나버; Glaxo Wellcome Inc.)를 포함한다.
추가의 안티레트로바이러스 제제는 융합 억제제/gp41 결합제를 포함한다. 융합 억제제/gp41 결합제는 T-20(이의 휴지 상태에서 gp41에 결합하며 용해성 상태로의 변형을 방지하는 HIV gp41 경막 단백질 엑토도메인의 잔기 643-678로부터의 펩티드; Trimeris) 및 T-1249(제2 세대 융합 억제제; Trimeris)를 포함한다.
추가의 안티레트로바이러스 제제는 융합 억제제/케모킨 수용체 길항제를 포함한다. 융합 억제제/케모킨 수용체 길항제는 CXCR4 길항제, 예컨대, AMD 3100(바이시클람), SDF-1 및 이의 유사체, 및 ALX40-4C (양이온 펩티드), T22(18 아미노산 펩티드; Trimeris) 및 T22 유사체 T134 및 T140; CCR5 길항제, 예컨대, RANTES (9-68), AOP-RANTES, NNY-RANTES, 및 TAK-779; 및 CCR5/CXCR4 길항제, 예컨대, NSC 651016 (디스타마이신 유사체)를 포함한다. 또한, CCR2B, CCR3, 및 CCR6 길항제가 포함된다. 케모킨 수용체 효능제, 예컨대, RANTES, SDF-1, MIP-1α, MIP-1β, 등은 또한 융합을 억제할 수 있다.
추가의 안티레트로바이러스 제제는 인테그라제 억제제를 포함한다. 인테그라제 억제제는 디카페오일퀸산(dicaffeoylquinic (DFQA) acid); L-키코르산(L-chicoric acid)(디카페오일타르타르산: DCTA); 퀴날리자린(quinalizarin: QLC) 및 이와 관련된 안트라퀴논; ZINTEVIRTM (AR 177, 진정한 인테그라제 억제제이기 보다는 아마도 세포 표면에서 작용하는 올리고누클레오티드; Arondex); 및 나프톨, 예컨대, WO 98/50347호에 개시된 나프톨)을 포함한다.
추가의 안티레트로바이러스 제제는 히드록시우레아 유사 화합물, 예컨대, BCX-34 (퓨린 누클레오시드 포스포릴라제 억제제; Biocryst); 리보누클레오티드 리덕타제 억제제, 예컨대, DIDOXTM(건강용 분자); 이노신 모노포스페이트 데히드로게나제(IMPDH) 억제제, 예컨대, VX -497 (Vertex); 및 마이코폴산, 예컨대,CellCept (마 이코페놀레이트 모페틸 : mycophenolate mofetil ; Roche)을 포함한다.
추가의 안티레트로바이러스 제제는 바이러스 인테그라제의 억제제, 바이러스 게놈 핵 전좌 억제제, 예컨대, 아릴렌 비스(메틸케톤) 화합물; HIV 유입 억제제, 예컨대, AOP-RANTES, NNY-RANTES, RANTES-IgG 융합 단백질, RANTES와 글리코사미노글리칸(GAG)의 가용성 복합체, 및 AMD-3100; 누클레오캡시드 아연 핑거 억제제, 예컨대, 디티안 화합물; HIV Tat 및 Rev의 표적; 및 파마코인핸서(pharmacoenhancer), 예컨대, ABT-378을 포함한다.
다른 안티레트로바이러스 치료제 및 부가 치료제는 시토킨 및 림포킨, 예컨대, MIP-1α, MIP-1β, SDF-1α, IL-2, PROLEUKINTM(알데스류킨/L2-7001; Chiron), IL-4, IL-10, IL-12, 및 IL-13; 인터페론, 예컨대, IFN-알파2a, IFN-알파2b, 또는 IFN-베타; TNF, NFκB, GM-CSF, M-CSF, 및 IL-10의 길항제; 시클로스포린 및 프레트니손과 같이 면역 활성화를 조절하는 제제; 백신, 예컨대, RemuneTM (HIV 면역원), APL 400-003 (Apollon), 재조합 gp120 및 이의 단편, 바이밸런트(bivalent) (B/E) 재조합 엔벨로트 당단백질, rgp120CM235, MN rgp120, SF-2 rgp120, gp120/가용성 CD4 복합체, 델타 JR-FL 단백질, 불연속 gp120 C3/C4 도메인으로부터 유래된 분지형 합성 펩티드, 융합-경쟁 면역원, 및 Gag, Pol, Nef, 및 Tat 백신; 유전자-기재 치료제, 예컨대, 유전 억제 요소(genetic suppressor element: GSE; WO 98/54366), 및 인트라킨(새롭게 합성된 CCR5의 표면 발현을 차단하도록 ER에 대해 표적된 유전적으로 변형된 CC 케모킨(Yang et al ., PNAS 94:11567-72 (1997); Chen et al ., Nat . Med . 3:1110-16 (1997)); 항체, 예컨대, 안티-CXCR4 항체 12G5, 안티-CCR5 항체 2D7, 5C7, PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, 및 PA14, 안티-CD4 항체 Q4120 및 RPA-T4, 안티-CCR3 항체 7B11, 안티-gp120 항체 17b, 48d, 447-52D, 257-D, 268-D 및 50.1, 안티-Tat 항체, 안티-TNF-α 항체, 및 모노클로날 항체 33A; 아릴 탄화수소 (AH) 수용체 효능제 및 길항제, 예컨대, TCDD, 3,3',4,4',5-펜타클로로바이페닐, 3,3',4,4'-테르라클로로바이페닐, 및 α-나프토플라본 (WO 98/30213); 및 항산화제, 예컨대, γ-L-글루타밀-L-시스테인 에틸 에스테르 (γ-GCE; WO 99/56764)를 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 항바이러스제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 항바이러스제는 아시클로버, 리바비린, 아만타딘, 라만티딘, 막사민, 또는 티말파신을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 특히, 인터페론 알부민 융합 단백질이 이들 제제 중 어떠한 제제와 함께 투여될 수 있다. 또한, 인터페론 알파 알부민 융합 단백질이 또한 이들 제제 중 어떠한 제제와 함께 투여될 수 있으며, 바람직하게는, 인터페론 알파 2a 또는 2b 알부민 융합 단백질이 이들 제제 중 어떠한 제제와 함께 투여될 수 있다. 또한, 인터페론 베타 알부민 융합 단백질이 또한 이들 제제 중 어떠한 제제와 함께 투여될 수 있다. 또한 IFN 하이브리드 알부민 융합 단백질 중의 어떠한 단백질이 이들 제제 중 어떠한 제제와 함께 투여될 수 있다.
가장 바람직한 구체예에서, 인터페론 알부민 융합 단백질이 리바비린과 함께 투여된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 인터페론 알파 알부민 융합 단백질이 리바비린과 함께 투여된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 인터페론 알파 2a 알부민 융합 단백질이 리바비린과 함께 투여된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 인터페론 알파 2b 알부민 융합 단백질이 리바비린과 함께 투여된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 인터페론 베타 알부민 융합 단백질이 리바비린과 함께 투여된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 하이브리드 인터페론 알부민 융합 단백질이 리바비린과 함께 투여된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 안티-기회 감염 제제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 안티-기회 감염 제제는 트리메토프림-설파메톡사졸TM (TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM), 답손TM (DAPSONETM), 펜타미딘TM (PENTAMIDINETM), 아토바쿠온TM (ATOVAQUONETM), 이소니아지드TM (ISONIAZIDTM), 리팜핀TM (RIFAMPINTM), 피라진아미드TM (PYRAZINAMIDETM), 에탐부톨TM (ETHAMBUTOLTM), 리파부틴TM (RIFABUTINTM), 클라리트로마이신TM (CLARITHROMYCINTM), 아지트로마이신TM (AZITHROMYCINTM), 간시클로버TM (GANCICLOVIRTM), 포스카르네트TM (FOSCARNETTM), 시도포버TM (CIDOFOVIRTM), 플루코나졸TM (FLUCONAZOLETM), 이트라코나졸TM (ITRACONAZOLETM), 케토코나졸TM (KETOCONAZOLETM), 아시클로버TM (ACYCLOVIRTM), 팜시콜버TM (FAMCICOLVIRTM), 피리메타민TM (PYRIMETHAMINETM), 류코보린TM (LEUCOVORINTM), 뉴포젠TM (NEUPOGENTM)(필그라스팀: filgrastim/G-CSF), 및 류킨TM (LEUKINETM)(사르그라모스팀: sargramostim/GM-CSF)을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 특정의 구체에에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 트리메토프림-설파메톡사졸TM (TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLETM), 답손TM (DAPSONETM), 펜타미딘TM (PENTAMIDINETM) 및/또는 아토바쿠온TM (ATOVAQUONETM)와 어떠한 조합으로 사용되어 기회적 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii ) 폐 감염을 예방적으로 치료하거나 방지한다. 다른 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누크레오티드는 이소니아지드TM (ISONIAZIDTM), 리팜핀TM (RIFAMPINTM), 피라진아미드TM (PYRAZINAMIDETM), 및/또는 에탐부톨TM (ETHAMBUTOLTM)과 어떠한 조합으로 사용되어 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 복합 감염을 예방적으로 처리하거나 방지한다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 리파부틴TM (RIFABUTINTM), 클라리트로마이신TM (CLARITHROMYCINTM), 및/또는 아지트로마이신TM (AZITHROMYCINTM)과 어떠한 조합으로 사용되어 기회적 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 예방적으로 처리하거나 방지한다. 또 다른 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 간시클로버TM (GANCICLOVIRTM), 포스카르네트TM (FOSCARNETTM), 및/또는 시도포버TM (CIDOFOVIRTM)과 어떠한 조합으로 사용되어 기회적 사이토메갈로바이러스 감염을 예방적으로 처리하거나 방지한다. 또 다른 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 플루코나졸TM (FLUCONAZOLETM), 이트라코나졸TM (ITRACONAZOLETM), 및/또는 케토코나졸TM (KETOCONAZOLETM)과 어떠한 조합으로 사용되어 기회적 진균 감염을 예방적으로 처리하거나 방지한다. 또 다른 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 아시클로버TM (ACYCLOVIRTM) 및/또는 팜시클로버TM (FAMCICOLVIRTM)와 어떠한 조합으로 사용되어 기회적 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 I 및/또는 타입 II 감염을 예방적으로 처리하거나 방지한다. 또 다른 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 피리메타민TM (PYRIMETHAMINETM) 및/또는 류코보린TM (LEUCOVORINTM)과 어떠한 조합으로 사용되어 기회적 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) 감염을 예방적으로 처리하거나 방지할 수 있다. 또 다른 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 류코보린TM (LEUCOVORINTM) 및/또는 뉴포젠TM (NEUPOGENTM)과 어떠한 조합으로 사용되어 기회적 박테리아 감염을 예방적으로 처리하거나 방지한다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 항생제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 사용될 수 있는 항생제는 아목시실린(amoxicillin), 베타-락타마제, 아미노글리코시드, 베타-락탐(글리코펩티드), 베타-락타마제, 클린다마이신(Clindamycin), 클로람페니콜, 세팔로스포린, 시프로플록사신, 에리트로마이신, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드(macrolide), 메트로니다졸(metronidazole), 페니실린, 퀴놀론, 라파마이신, 리팜핀, 스트렙토마이신, 설폰아미드, 테트라사이클린, 트리메토프림(trimethoprim), 트리메토프림-설파메톡사졸, 및 반코마이신(vancomycin)을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 면역자극제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 면역자극제는 레바미솔(예를 들어, ERGAMISOLTM), 이소프리노신(예를 들어, INOSIPLEXTM), 인터페론(예를 들어, 인터페론 알파), 및 인터루킨(예를 들어, IL-2)를 포함하지만, 이로 한정되는 것을 아니다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 면역억제제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 면역억제제는 스테로이드, 시클로스포린, 시클로스포린 유사체, 시클로포스파미드 메틸프레드니손, 프레트니손, 아자티오프린, FK-506, 15-데옥시스페르구알린, 및 반응하는 T 세포의 작용을 억제함으로써 작용하는 그 밖의 면역억제제를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 다른 면역 억제제는 프레드니솔론, 메토트렉세이트, 탈리도미드, 메톡살렌, 라파마이신, 레플루노미드, 미조리빈(BREDININTM), 브레퀴나르(brequinar), 데옥시스페르구알린, 및 아자스피란(SKF 105685), 오르토클론 OKT?3(ORTHOCLONE OKT?3) (무로모나브-CD3: muromonab-CD3), 산디문TM (SANDIMMUNETM), 뉴랄TM (NEORALTM), 상다이아TM (SANGDYATM) (시클로스포린), 프로그라프?(PROGRAF?)(FK506, 타크로리무스: tacrolimus), 셀셉트?(CELLCEPT?)(마이코페놀레이트 모테필: mycophenolate motefil, 이의 활성 대사체는 마이코페놀산이다), 이뮤란TM (IMURANTM)(아자티오프린), 글루코코르티코스테로이드, 부신피질 스테로이드, 예컨대, 델타손TM (DELTASONETM) (프레드니손) 및 하이델트라솔TM (HYDELTRASOLTM)(프레트니솔론), 폴렉스TM (FOLEXTM) 및 메세이트TM (MEXATETM) (메토트렉세이트), 옥스소랄렌-울트라TM (OXSORALEN-ULTRATM) (메톡살렌) 및 라파문TM (RAPAMUNETM) (시롤리무스)를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 특정의 구체예에서, 면역억제제는 기관 또는 골수 이식의 거부를 억제하는데 사용될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 단독으로 또는 하나 이상의 정맥내 면역 글로불린 제제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 정맥내 면역 글로불린 제제는 감마르TM (GAMMARTM), 이베감TM (IVEEGAMTM), 산도글로불린TM (SADOGLOBULINTM), 감마가드 S/DTM (GAMMAGARD S/DTM), 아트감TM (ATGAMTM)(안티티모사이트 글루불린), 및 가미문TM (GAMIMUNETM)을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 이식 치료법(예, 골수 이식)에서 정맥내 면역 글로불린 제제와 함께 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 단독으로 또는 조합 치료의 일부로서, 암의 치료를 위한 환자에 대한 생체내 또는 세포에 대한 시험관내 투여될 수 있다. 특정의 구체예에서, 알부민 융합 단백질, 특히, IL-2-알부민 융합 단백질은 암의 수동 면역치료, 예컨대, 본원에서 참조로 통합되고 있는 문헌[Dudley et al., Science Express, 19 September 2002., at www.scienceexpress.org]에 기재된 전이성 흑색종에 대한 입양 세포전달 치료 동안 반복적으로 투여된다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 단독으로 또는 소염제와 함계 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 소염제는 코르티코스테로이드(예, 베타메타손, 부데소니드, 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 및 트리암시놀론), 비스테로이드성 소염약(예, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플록타페닌, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 페닐부타존, 피록시캄, 설린닥, 테녹시캄, 티아프로펜산, 및 톨메틴) 뿐만 아니라 항히드타민, 아미노아릴카르복실산 유도체, 아릴아세트산 유도체, 아릴부티르산 유도체, 아릴카르복실산, 아릴프로피온산 유도체, 피라졸, 피라졸론, 살리실산 유도체, 티아진카르복사미드, e-아세타미도카프로산, S-아데노실메티오닌, 3-아미노-4-히드록시부티르산, 아믹세트린, 벤다작, 벤지다민, 부콜롬, 디펜피라미드, 디타졸, 에모르파존, 구아이아줄렌, 나부메톤, 니메술리드, 오르고테인, 옥사세프롤, 피라닐린, 페리속살, 피폭심, 프로쿠아존, 프록사졸, 및 테니답을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 항혈관형성제와 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항혈관형성제는 안지오스타틴(Angiostatin) (Entremed, Rockville, MD), 트로포닌(Troponin-1) (Boston Life Sciences, Boston, MA), 항침습인자(anti-Invasive Factor), 레티노산 및 이의 유도체, 파클리탁셀 (택솔: Taxol), 수라민(Suramin), 메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제, 메탈로프로테이나제-2의 조직 억제제, VEGI, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 플라스미노겐 활성화제 억제제-2, 및 "d-그룹" 경 전이금속의 다양한 형태를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
"d 그룹" 경 전이금속은, 예를 들어, 바나듐, 몰리브덴, 텅스텐, 티탄, 니오븀, 및 탄탈 종을 포함한다. 그러한 전이금속종은 전이금속 착물을 형성할 수 있다. 상기 전이금속종의 적합한 착물은 옥소(oxo) 전이금속 착물을 포함한다.
바나듐 착물의 대표적인 예는 옥소 바나듐 착물, 예컨대, 바나데이트 및 바나딜 착물을 포함한다. 적합한 바나데이트 착물은 메타바나데이트 및 오르토바나데이트 착물, 예컨대, 암모늄 메타바나데이트, 소듐 메타바나데이트, 및 소듐 오르토바나데이트를 포함한다. 적합한 바나딜 착물은, 예를 들어, 바나딜 아세틸아세토네이트 및 바나딜 설페이트 모노- 및 트리하이드레이트와 같은 바나딜 설페이트 하이드레이트를 포함한 바나딜 설페이트를 포함한다.
텅스텐 및 몰리브덴 착물의 대표적인 예는 또한 옥소 착물을 포함한다. 적합한 옥소 텅스텐 착물은 텅스테이트 및 텅스텐 산화물 착물을 포함한다. 적합한 텅스테이트 착물은 암모늄 텅스테이트, 칼슘 텅스테이트, 소듐 텅스테이트 디하이드레이트, 및 턴스텐산을 포함한다. 적합한 텅스텐산화물은 텅스텐(IV) 산화물 및 텅스텐 (VI) 산화물을 포함한다. 적합한 옥소 폴리브덴 착물은 몰리브데이트, 몰리브덴 산화물, 및 몰리브데닐 착물을 포함한다. 적합한 몰리브데이트 착물은 암모늄 몰리브데이트 및 이의 수화물, 소듐 몰리브데이트 및 이의 수화물, 및 칼륨 몰리브데이트 및 이의 수화물을 포함한다. 적합한 몰리브덴 산화물은 몰리브덴(VI) 산화물, 몰리브덴(VI) 산화물, 및 몰리브덴산을 포함한다. 적합한 몰리브데닐 착물은, 예를 들어, 몰리브데닐 아세틸아세토네이트를 포함한다. 다른 적합한 텅스텐 및 몰리브덴 착물은, 예를 들어, 글리세롤, 타르타르산, 및 당으로부터 유도된 히드록소 유도체를 포함한다.
광범위하게 다양한 다른 항혈관형성 인자가 또한 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다. 대표적인 예는 혈소판 인자 4; 프로타민 설페이트; 설페이트화된 키틴 유도체(퀸 크렙 껍질로부터 제조됨), (Murata et al., Cancer Res. 51:22-26, (1991)); 설페이트화된 폴리사카라이드 펩티도글리칸 복합체 (SP-PG) (이러한 화합물의 작용은 스테로이드, 예컨대, 에스트로겐, 및 타목시펜 시트레이트의 존재하에 증진될 수 있다); 스타우로스포린; 예를 들어, 프롤린 유사체, 시스히드록시프롤린, d,L-3,4-데하이드로프롤린, 티아프롤린, 알파,알파-디피리딜, 아미노프로피오니트릴 푸마레이트를 포함한 매트릭스 대사 조절제; 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3H)-옥사졸론; 메토트렉세이트; 미톡산트론; 헤파린; 인터페론; 2 마크로글로불린-혈청; ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992)); 키모스타틴(Tomkinson et al., Biochem J. 286:475-480, (1992)); 시클로텍스트린 테트라데카설페이트; 에포네마이신; 캄프토테신; 푸마길린 (Ingber et al., Nature 348:555-557, (1990)); 골드 소듐 티오말레이트 ("GST"; Matsubara and Ziff, J. Clin. Invest. 79:1440-1446, (1987)); 항콜라게나제-혈청; 알파2-안티플라스민 (Holmes et al., J. Biol. Chem. 262(4):1659-1664, (1987)); 비스안트렌(National Cancer Institute); 로벤자리트 디소듐 (N-(2)-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 디소듐 또는 "CCA"; (Takeuchi et al., Agents Actions 36:312-316, (1992)); 및 메탈로프로테이나제 억제제, 예컨대, BB94를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 범위내에서 사용될 수 있는 추가의 항혈관형성 인자는 탈리도미드, (Celgene, Warren, NJ); 혈관억제 스테로이드; AGM-1470 (H. Brem and J. Folkman J Pediatr . Surg . 28:445-51 (1993)); 인테그린 알파 v 베타 3 길항제 (C. Storgard et al., J Clin . Invest . 103:47-54 (1999)); 카르복시나미놀미다졸 (carboxynaminolmidazole); 카로복시아미도트리아졸(CAI) (National Cancer Institute, Bethesda, MD); 콘브레타스타틴 A-4(Conbretastatin A-4: CA4P) (OXiGENE, Boston, MA); 스쿠알아민 (Magainin Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA); TNP-470, (Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL); ZD-0101 아스트라제네카(ZD-0101 AstraZeneca) (London, UK); APRA (CT2584); 베네핀, 비로스타틴-1(Byrostatin-1) (SC339555); CGP-41251 (PKC 412); CM101; 덱스라족산 (ICRF187); DMXAA; 엔도스타틴; 플라보프리디올; 제네스테인(Genestein); GTE; ImmTher; 이레사(Iressa) (ZD1839); 옥트레오티드(Octreotide) (Somatostatin); 판레틴(Panretin); 페나실아민(Penacillamine); 포토포인트(Photopoint); PI-88; 프리노마스타트(Prinomastat) (AG-3340) 푸르리틴(Purlytin); 수라디스타(Suradista) (FCE26644); 타목시펜(Tamoxifen)(Nolvadex); 타자로텐(Tazarotene); 테트라티오몰리브데이트(Tetrathiomolybdate); 젤로다(Xeloda) (Capecitabine); 및 5-플루오로우라실을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
본 발명의 화합물과 함께 투여될 수 있는 항혈관형성제는 세포외 매트릭스의 단백질 분해를 억제하고, 내피 세포-세포외 매트릭스 유착 분자의 작용을 차단하고, 혈관형성 유도자, 예컨대, 성장인자의 작용에 길항작용하고, 내피 세포를 증식시키는데 발현된 인테그린 수용체를 억제함을 포함하지만 이로 한정되는 것이 아닌 다양한 메카니즘을 통해서 작용할 수 있다. 세포외 매트릭스 단백질 분해를 방해하고 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항혈관형성 억제제의 예는 AG-3340 (Agouron, La Jolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven, CT), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ), CGS-27032A (Novartis, East Hanover, NJ), 마리마스타트(Marimastat) (British Biotech, Oxford, UK), 및 메타스타트(Metastat) (Aeterna, St-Foy, Quebec)를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 내피세포-세포외 매트릭스 유착 분자의 작용을 차단함으로써 작용하며 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항혈관형성 억제제의 예는 EMD-121974 (Merck KcgaA Darmstadt, Germany) 및 비탁신(Vitaxin) (Ixsys, La Jolla, CA/Medimmune, Gaithersburg, MD)을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 혈관형성 유도자를 직접적으로 길항화하거나 억제함으로써 작용하고 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 항혈관형성제의 예는 안지오자임(Angiozyme) (Ribozyme, Boulder, CO), 항-VEGF 항체 (Genentech, S. San Francisco, CA), PTK-787/ZK-225846 (Novartis, Basel, Switzerland), SU-101 (Sugen, S. San Francisco, CA), SU-5416 (Sugen/ Pharmacia Upjohn, Bridgewater, NJ), 및 SU-6668 (Sugen)를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 그 밖의 항혈관형성제는 혈관형성을 간접적으로 억제하도록 작용한다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 간접적인 혈관형성 억제제의 예는 IM-862 (Cytran, Kirkland, WA), 인터페론-알파, IL-12 (Roche, Nutley, NJ), 및 펜토산 폴리설페이트(Georgetown University, Washington, DC)를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
특정의 구체예에서, 항혈관형성제와 함께 본 발명의 조성물을 사용하는 것은 자가면역질환, 예컨대, 본원에 기재된 자가면역질환을 치료, 예방, 및/또는 완화시키기 위한 것이다.
특정의 구체예에서, 항혈관형성제와 함께 본 발명의 조성물을 사용하는 것은 관절염을 치료, 예방, 및/또는 완화시키기 위한 것이다. 또 다른 구체예에서, 항혈관형성제와 함께 본 발명의 조성물을 사용하는 것은 류머티스 관절염을 치료, 예방, 및/또는 완화시키기 위한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 혈관형성 단백질, 또는 혈관형성 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 함께 투여된다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 혈관형성 단백질의 예는 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자, VEGF-l, VEGF-2, VEGF-3, 표피성장 인자 알파 및 베타, 혈소판 유도된 내피세포 성장인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 종양 괴사인자 알파, 간세포 성장 인자, 인슐린 유사 성장인자, 콜로니 자극인자, 대식세포 콜로니 자극인자, 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자, 및 산화질소 합성효소를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 화학치료제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 화학치료제는 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드(예를 들어, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 시클로포스파미드 이포스파미드, 멜팔란(L-사르콜리신), 및 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜아민(예를 들어, 헥사메틸멜아민 및 티오테파), 알킬 설포네이트(예를 들어, 부설판), 니트로소우레아(예를 들어, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 세무스틴 (메틸-CCNU), 및 스트렙토조신(스트렙토조토신)), 트리아젠 (예를 들어, 다카르바진(DTIC; 디메틸트리아제노이미다졸카르복사미드)), 폴산 유사체 (예를 들어, 메토트렉세이트(아메토프테린)), 피리미딘 유사체 (예를 들어, 플루오로우라실 (5-플루오로우라실; 5-FU), 플록수리딘(플루오로데옥시우리딘; FudR), 및 사이타라빈(시토신 아라비노시드)), 푸린 유사체 및 이와 관련된 억제제(예를 들어, 메르캅토푸린(6-메르캅토푸린; 6-MP), 티오구아닌 (6-티오구아닌; TG), 및 펜토스타틴 (2'-데옥시코포르마이신)), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈블라스틴(VLB, 빈블라스틴 설페이트)) 및 빈크리스틴(빈크리스틴 설페이트)), 에피포도필로톡신(예를 들어, 에토포시드 및 테니포시드), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신 (다우노마이신; 루비도마이신), 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 및 미토마이신 (미토마이신 C), 효소(예를 들어, L-아스파라기나제), 생물학적 반응 개질제(예를 들어, 인터페론-알파 및 인터페론-알파-2b), 백금 배위 화합물(예를 들어, 시스플라틴(시스-DDP) 및 카르보플라틴), 안트라센디온 (미톡산트론), 치환된 우레아(예를 들어, 히드록시우레아), 메틸히드라진 유도체 (예를 들어, 프로카르바진(N-메틸히드라진; MIH), 아드레노코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손), 프로게스틴 (예를 들어, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론, 메트록시프로게스테론 아세테이트, 및 메게스트롤 아세테이트), 에스트로겐 (예를 들어, 디에틸스틸베스트롤 (DES), 디에틸스틸레스트롤 디포스페이트, 에스트라디올, 및 에티닐 에스트라디올), 항에스트로겐 (예를 들어, 타목시펜), 안드로겐 (테스토스테론 프로프리오네이트, 및 플루옥시메스테론), 항안드로겐 (예를 들어, 플루타미드), 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체(예를 들어, 류프롤리드), 그 밖의 호르몬 및 호르몬 유사체(예를 들어, 메틸테스토스테론, 에스트라무스틴, 에스트라무스틴 포스페이트 소듐, 클로로트리아니센, 및 테스토락톤), 및 그 밖의 물질(예를 들어, 디카르바진, 글루탐산 및 미토탄)을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 다음 약물과 함께 투여된다: 인플릭시맵(infliximab)(또한, 레미케이드TM(remicadeTM)으로 공지됨, Centocor, Inc.), 트로케이드(Trocade) (Roche, RO-32-3555), 레플루노미드(Leflunomide)(또한, 아라바TM(AravaTM)으로도 공지됨, Hoechst Marion Roussel), 키네레트TM(KineretTM)(아나킨라(Anakinra)로 공지된 IL-I 수용체 길항제, Amgen, Inc.).
특정의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니손)과 함께, 또는 CHOP 성분 중 하나 이상의 조합과 함께 투여된다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항-CD20 항체, 사람 모노클로날 항-CD20 항체와 함께 투여된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항-CD20 항체 및 CHOP, 항-CD20 항체 및 CHOP 성분중 하나 이상의 어떠한 조합, 특히, 시클로포스파미드 및/또는 프레드니손과 함께 투여된다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 리툭시맵(Rituximab)과 함께 투여된다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 리툭시맵 및 CHOP, 또는 리툭시맵 및 CHOP 성분 중 하나 이상의 어떠한 조합, 특히 시클로포스파미드 및/또는 프레드니손과 함께 투여된다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 토시투모맵(tositumomab)과 함께 투여된다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 토시투모맵 및 CHOP, 또는 토시투모맵 및 CHPO 성분 중 하나 이상의 조합, 특히, 시클로포스파미드 및/또는 프레드니손과 함께 투여된다. 항-CD20 항체는 방사성동위원소, 톡신 또는 세포독성 프로드러그와 임의적으로 연관될 수 있다.
*또 다른 특정의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 제발린TM(ZevalinTM)과 함께 투여된다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 제발린TM 및 CHOP, 또는 제발린TM 및 CHPO 성분중 하나 이상의 조합, 특히, 시클로포스파미드 및/또는 프레드니손과 함께 투여된다. 제발린TM은 하나 이상의 방사성동위원소와 연관될 수 있다. 특히 바람직한 방사성동위원소는 90Y 및 111In이다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 시토킨과 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 시토킨은 IL2, IL3, ILA, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, 항-CD40, CD40L, IFN-감마 및 TNF-알파를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 IL-1 알파, IL-1베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, 및 IL-21을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 어떠한 인터루킨과 함께 투여될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 TNF 패밀리의 구성원과 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 TNF, TNF-관련된 또는 TNF-유사 분자는 TNF-알파의 가용형, 림포톡신-알파(LT-알파, TNF-베타로도 공지됨), LT-베타(복합 헤테로트리머 LT알파2-베타에서 발견됨), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1 BBL, DcR3, OX40L, TNF-감마 (국제공개 WO96/14328호), AIM-I(국제공개 WO 97/33899호), 엔도킨-알파(국제공개 WO 98/07880호), OPG, 및 뉴트로킨-알파 (국제공개 WO 98/18921호, OX40, 및 신경성장 인자(NGF), 및 Fas, CD30, CD27, CD40 및 4-IBB의 가용형, TR2 (국제공개 WO 96/34095호), DR3 (국제공개 WO 97/33904호), DR4 (국제공개 WO 98/32856호), TR5 (국제공개 WO 98/30693호), TRANK, TR9 (국제공개 WO 98/56892호),TR10 (국제공개 WO 98/54202호), 312C2 (국제공개 WO 98/06842호), 및 TR12, 및 가용형 CD154, CD70, 및 CD153을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 혈관신행 단백질과 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 혈관 신생 단백질로는, 유럽 특허 EP-399816에 기술된 바와 같은 글리오마 유래된 성장 인자(Glioma Derived Growth Factor (GDGF)); 유럽 특허 EP-682110에 기술된 바와 같은 혈소판 유래된 성장 인자-A (PDGF-A); 유럽 특허 EP-282317에 기술된 바와 같은 혈소판 유래된 성장 인자-B (PDGF-B); 국제 특허 출원 공개 WO 92/06194에 기술된 바와 같은 태반 성장 인자(PIGF); 문헌(Hauser et al., Growth Factors, 4:259-268 (1993))에 기술된 바와 같은 태반 성장 인자-2 (PIGF-2); 국제 특허 출원 공개 WO 90/13649에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자; 유럽 특허 EP-506477에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-A (VEGF-A); 국제 특허 출원 공개 WO 96/39515에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-2 (VEGF-2); 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-3); 국제 특허 출원 공개 WO 96/26736에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자 B-186 (VEGF-B186); 국제 특허 출원 공개 WO 98/02543에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-D (VEGF-D); 국제 특허 출원 공개 WO 98/07832에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-D (VEGF-D); 및 독일 특허 DE 19639601에 기술된 바와 같은 혈관 내피 성장 인자-E (VEGF-E)가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 언급된 문헌은 그 전체가 본원에서 참고 문헌으로 인용된다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 섬유아세포 성장 인자와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 섬유아세포 성장 인자로는 FGF-l, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, 및 FGF-15가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 조혈 성장 인자와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 조혈 성장 인자로는, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF) (사르그라모스팀(sargramostim), LEUKINETm, PROKINETM), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) (필그라스팀(filgrastim), NEUPOGENTM), 마크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF, CSF-1), 에리트로포이에틴(erythropoietin) (에포에틴 알파(epoetin alfa), EPOGENTM, PROCRITTM), 줄기 세포 인자(SCF, c-키트 리간드, 스틸(steel) 인자), 거핵구 콜로리 자극 인자, PIXY321 (GMCSF/IL-3 융합 단백질), 인터류킨, 특히 IL-1 내지 IL-12 중 하나 이상, 인터페론-감마 또는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 아드레날린 차단제, 예를 들어, 아세부톨(acebutolol), 아테놀롤(atenolol), 베탁솔롤(betaxolol), 비소프롤롤(bisoprolol), 카르테올롤(carteolol), 라베탈롤(labetalol), 메토프롤롤(metoprolol), 나돌롤(nadolol), 옥스프레놀롤(oxprenolol), 펜부톨롤(penbutolol), 핀돌롤(pindolol), 프로프라놀롤(propranolol), 소탈롤(sotalol) 및 티몰롤(timolol)과 함께 투여된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 항부정맥 약물(예컨대, 아데노신(adenosine), 아미도아론(amidoarone), 브레틸륨(bretylium), 디지탈리스(digitalis), 디곡신(digoxin), 디기톡신(digitoxin), 딜리아젬(diliazem), 디소피라미드(disopyramide), 에스몰롤(esmolol), 플레카이니드(flecainide), 리도카인(lidocaine), 멕실레틴(mexiletine), 모리시진(moricizine), 페니토인(phenytoin), 프로카인아미드(procainamide), N-아세틸 프로카인아미드, 프로파페논(propafenone), 프로프라놀롤(propranolol), 퀴니딘(quinidine), 소탈롤(sotalol), 토카이니드(tocainide) 및 베라파밀(verapamil))과 함께 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 이뇨제, 예를 들어, 탄산 탈수효소 억제제(예컨대, 아세타졸아미드, 디클로르펜아미드 및 메타졸아미드), 삼투 이뇨제(예컨대, 글리세린, 이소소르비드, 만니톨 및 우레아), Na+-K--2Cl- 공수송을 억제하는 이뇨제 (예컨대, 푸로세미드(furosemide), 부메타니드(bumetanide), 아조세미드(azosemide), 피레타니드(piretanide), 트리파미드(tripamide), 에타크린산(ethacrynic acid), 무졸리민(muzolimine), 및 토르세미드(torsemide)), 티아지드 및 티아지드 유사 이뇨제(예컨대, 벤드로플루메티아지드, 벤즈티아지드, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히들로플루메티아지드, 메티클로티아지드, 폴리티아지드, 트리크로메티아지드, 클로르탈리돈(chlorthalidone), 인다파미드(indapamide), 메톨라존(metolazone), 및 퀸에타존(quinethazone)), 칼륨 보존성 이뇨제(예컨대, 아밀로리드(amiloride) 및 트리암테렌(triamterene)), 및 미네랄코르티코이드 수용체 길항제(예컨대, 스피로놀락톤(spironolactone), 칸레논(canrenone) 및 칼륨 칸레노에이트(potassium canrenoate))와 함께 투여된다.
일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 내분비 및/또는 호르몬 불균형 질환의 치료제와 함께 투여된다. 내부비 및/또는 호르몬 불균형 질환 치료제로는 127I, 131I 및 123I와 같은 요오드의 방사선 동위원소; 재조합 성장 호르몬, 예컨대 HUMATROPETM(재조합 소마트로핀(recombinant somatropin)); 성장 호르몬 유사체, 예컨대 PROTROPINTM(소마트렘(somatrem)); 도파민 길항제, 예컨대 PARLODELTM (브로모크립틴(bromocriptine)); 소마토스타틴 유사체, 예컨대 SANDOSTATINTM (옥트레오티드(octreotide)); 성선자극호르몬(gonadotropin) 제제, 예컨대, PREGNYLTM, A.P.L.TM 및 PROFASPTM(융모성 성선자극호르몬(CG)), PERGONALTM(메노트로핀스(menotropins)), 및 METRODINTM (우로폴리트로핀(urofollitropin) (uFSH)); 합성 사람 성선자극호르몬 방출 호르몬 제제, 예컨대 FACTRELTM 및 LUTREPULSETM(고나도렐린 히드로클로라이드(gonadorelin hydrochloride)); 합성 성선자극호르몬 길항제, 예컨대, LUPRONTM (류프롤리드 아세테이트), SUPPRELINTM (히스트렐린 아세테이트(histrelin acetate)), SYNARELTM (나파렐린 아세테이트(nafarelin acetate)), 및 ZOLADEXTM (고세렐린 아세테이트(goserelin acetate)); 갑상선자극호르몬 방출 호르몬의 합성 제제, 예컨대, RELEFACT TRHTM 및 THYPINONETM (프로티렐린(protirelin)); 재조합 사람 TSH, 예컨대 THYROGENTM; 갑상선 호르몬의 천연 이성질체의 나트륨 염의 합성 제제, 예컨대, L-T4 TM, SYNTHROIDTM 및 LEVOTHROIDTM (레보티록신 나트륨(levothyroxine sodium)), L-T3 TM, CYTOMELTM 및 TRIOSTATTM (리오티로인 나트륨(liothyroine sodium)), 및 THYROLARTM (리오트릭스(liotrix)); 항갑상선 화합물, 예컨대 6-n-프로필티오루라실(프로필티오우라실), 1-메틸-2-메르캅토이미다졸 및 TAPAZOLETM (메티마졸(methimazole)), NEO-MERCAZOLETM (카르비마졸(carbimazole)); 베타-아드레날린 수용체 길항제, 예컨대, 프로프라놀롤 및 에스몰롤; Ca2 + 채널 차단제; 덱사메타손 및 요오드화된 방사선 컨트라스트제(contrast agent), 예컨대 TELEPAQUETM (요오판산) 및 ORAGRAFINTM (나트륨 이포데이트)가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
내분비 및/또는 호르몬 불균형 질환의 추가 치료제로는 에스트로겐 또는 컨쥬게이트된 에스테르겐, 예컨대, ESTRACETM (에스트라디올), ESTINYLTM (에티닐 에스트라디올), PREMARINTM, ESTRATABTM, ORTHO-ESTTM, OGENTM 및 에스트로피페이트(에스트론), ESTROVISTM (퀸에스트론), ESTRADERMTM (에스트라디올), DELESTROGENTM 및 VALERGENTM (에스트라디올 발레레이트), DEPO-ESTRADIOL CYPIONATETM 및 ESTROJECT LATM(에스트라디올 시피오네이트); 항에스트로겐, 예컨대 NOLVADEXTM (타목시펜(tamoxifen)), SEROPHENETM 및 CLOMIDTM (클로미펜(clomiphene)); 프로게스틴, 예컨대 DURALUTINTM (히드록시프로게스테론 카프로에이트), MPATM 및 DEPO-PROVERATM (메드록시프로게스테론 아세테이트), PROVERATM 및 CYCRINTM (MPA), MEGACETM (메게스트롤 아세테이트), NORLUTINTM (노레틴드론), 및 NORLUTATETM 및 AYGESTINTM (노레틴드론 아세테이트); 프로게스테론 임플란트, 예컨대 NORPLANT SYSTEMTM (노메게스트렐의 피하 임플란트); 항프로게스틴, 예컨대 RU 486TM (미페프리스톤(mifepristone)); 호르몬 피임약, 예컨대 ENOVIDTM (노르에티노드렐(norethynodrel) + 메스트라놀(mestranol)), PROGESTASERTTM (프로게스테론을 방출하는 자궁내 장치), LOESTRINTM, BREVICONTM, MODICONTM, GENORATM, NELONATM, NORINYLTM, OVACON-35TM 및 OVACON-50TM (에티닐 에스트라디올/노르에틴드론), LEVLENTM, NORDETTETM, TRI-LEVLENTM 및 TRIPHASIL-21TM (에티닐 에스트라디올/레보노르게스트렐(levonorgestrel)) LO/OVRALTM 및 OVRALTM (에티닐 에스트라디올/노르게스트렐), DEMULENTM (에티닐 에스트라디올/에티노디올 디아세테이트), NORINYLTM, ORTHO-NOVUMTM, NORETHINTM, GENORATM, 및 NELOVATM (노르에틴드론/메스트라놀), DESOGENTM 및 ORTHO-CEPTTM (에티닐 에스트라디올/데소게스트렐(desogestrel)), ORTHO-CYCLENTM 및 ORTHO-TRICYCLENTM (에티닐 에스트라디올/노르게스티메이트), MICRONORTM 및 NOR-QDTM(노르에틴드론(norethindrone)), 및 OVRETTETM (노르게스트렐)이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
내분비 및/또는 호르몬 불균형 질환의 추가 치료제로는 테스토스테론 에스테론, 예컨대 메테놀론 아세테이트 및 테스토스테론 운데카노에이트; 비경구 및 경구 안드로겐, 예컨대, TESTOJECT-50TM(테스토스테론), TESTEXTM (테스토스페론 프로피오네이트), DELATESTRYLTM (테스토스테론 에난테이트), DEPO-TESTOSTERONETM (테스토스페론 시피오네이트), DANOCRINETM (다나졸), HALOTESTINTM (플루옥시메스테론), ORETON METHYLTM, TESTREDTM 및 VIRILONTM (메틸테스토스테론), 및 OXANDRINTM (옥산드롤론); 테스토스페론 경피 시스템, 예컨대 TESTODERMTM; 안드로겐 수용체 길항제 및 5-알파-환원효소 억제제, 예컨대 ANDROCURTM (시프로테론 아세테이트), EULEXINTM (플루타미드), 및 PROSCARTM(피나스테리드(finasteride)); 부신피질자극 호르몬 제제, 예컨대 CORTROSYNTM (코신트로핀(cosyntropin)); 부신피질 스테로이드 및 이들의 합성 유사체, 예컨대 ACLOVATETM (알클로메타손 디프로피오네이트(alclometasone dipropionate)), CYCLOCORTTM (암시노니드(amcinonide)), BECLOVENTTM 및 VANCERILTM (베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate)), CELESTONETM (베타메타손(betamethasone), BENISONETM 및 UTICORTTM (베타메타손 벤조에이트), DIPROSONETM (베타메타손 디프로피오네이트), CELESTONE PHOSPHATETM (베타메타손 소듐 포스페이트), CELESTONE SOLUSPANTM (베타메타손 소듐 포스페이트 및 아세테이트), BETA-VALTM 및 VALISONETM (베타메타손 발레레이트), TEMOVATETM (클로베타솔 프로피오네이트(clobetasol propionate)), CLODERMTM (클로코르톨론 피발레이트(clocortolone pivalate)), CORTEFTM 및 HYDROCORTONETM (코르티솔(하이드로코르티손)(cortisol(hydrocortisone)), HYDROCORTONE ACETATETM (코르티솔(하이드로코르티손)아세테이트), LOCOIDTM (코르티솔(하이드로코르티손)부티레이트), HYDROCORTONE PHOSPHATETM (코르티솔(하이드로코르티손) 소듐 포스페이트), A-HYDROCORTTM 및 SOLU CORTEFTM (코르티솔(하이드로코르티손) 소듐 석시네이트), WESTCORTTM (코르티솔(하이드로코르티손) 발레레이트), CORTISONE ACETATETM (cortisone acetate)), DESOWENTM 및 TRIDESILONTM (데소니드(desonide)), TOPICORTTM (데속시메타손(desoximetasone)), DECADRONTM (덱사메타손(dexamethasone)), DECADRON LATM (덱사메타톤 아세테이트), DECADRON PHOSPHATETM 및 HEXADROL PHOSPHATETM (덱사메타손 소듐 포스페이트), FLORONETM 및 MAXIFLORTM (디플로라손 디아세테이트(diflorasone diacetate)), FLORINEF ACETATETM (플루드로코르티손 아세테이트), AEROBIDTM 및 NASALIDETM (플루니솔리드(flunisolide), FLUONIDTM 및 SYNALARTM (플루오시놀론 아세토니드(fluocinolone acetonide)), LIDEXTM (플루오시노니드(fluocinonide)), FLUOR-OPTM 및 FMLTM (플루오로메톨론(fluorometholone)), CORDRANTM (플루란드레놀리드(flurandrenolide)), HALOGTM (할시노니드(halcinonide)), HMS LIZUIFILMTM (메드리손(medrysone)), MEDROLTM (메틸프레드니솔론(methylprednisolone)), DEPO-MEDROLTM 및 MEDROL ACETATETM (메틸프레드니손 아세테이트(methylprednisone acetate)), A-METHAPREDTM 및 SOLUMEDROLTM (메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트), ELOCONTM (모메타손 푸로에이트(mometasone furoate)), HALDRONETM (파라메타손 아세테이트(paramethasone acetate)), DELTA-CORTEFTM (프레드니솔론(prednisolone)), ECONOPREDTM (프레드니솔론 아세테이트), HYDELTRASOLTM (프레드니솔론 소듐 포스페이트), HYDELTRA-T.B.ATM (프레드니솔론 테부테이트), DELTASONETM (프레드니손(prednisone)), ARISTOCORTTM 및 KENACORTTM (트리암시놀론(triamcinolone)), KENALOGTM (트리암시놀론 아세토니드(triamcinolone acetonide)), ARISTOCORTTM 및 KENACORT DIACETATETM (트리암시놀론 디아세테이트), 및 ARISTOSPANTM (트리암시놀론 헥스아세토니드); 부신피질 스테로이드의 생합성 및 작용 억제제, 예컨대 CYTADRENTM (아미노글루테티미드(aminoglutethimide)), NIZORALTM (케토콘아졸(ketoconazole)), MODRASTANETM (트릴로스탄(trilostane)), 및 METOPIRONETM (메티라폰(metyrapone)); 소, 돼지 또는 사람 인슐린 또는 이의 혼합물; 인슐린 유사체; 재조합 사람 인슐린, 예컨대 HUMULINTM 및 NOVOLINTM; 경구용 혈당강하제, 예컨대ORAMIDETM 및 ORINASETM (톨루부타미드(tolbutamide)), DIABINESETM (클로르프로파미드(chlorpropamide)), TOLAMIDETM 및 TOLINASETM (톨라자미드(tolazamide)), DYMELORTM (아세토헥사미드(acetohexamide), 글리벤클라미드(glibenclamide)), MICRONASETM, DIBETATM 및 GLYNASETM (글리부리드(glyburide)), GLUCOTROLTM (글리피지드(glipizide)), 및 DIAMICRONTM (글리크라지드(gliclazide)), GLUCOPHAGETM (메트포르민(metformin)), 시글리타존(ciglitazone), 피오글리타존(pioglitazone), 및 알파-글리코시다제 억제제; 소 또는 돼지 글루카곤; 소마토스타틴, 예컨대 SANDOSTATINTM (옥트레오티드(octreotide)); 및 디아즈옥시드(diazoxide), 예컨대 PROGLYCEMTM (디아족시드가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 자궁 운동성 질환 치료제와 함께 투여된다. 자궁 운동성 질환 치료제로는, 에스트로겐 약물, 예컨대 컨쥬게이트된 에스트로겐(예를 들어, PREMARIN? 및 ESTRATAB?), 에스트라디올(예를 들어, CLIMARA? 및 ALORA?), 에스트로피페이트, 및 클로로트리아니센(chlorotrianisene); 프로게스틴 약물(예를 들어, AMEN?(메트록시프로게스테론(medroxyprogesterone), MICRONOR?(노르에티트론 아세테이트(norethidrone acetate)), PROMETRIUM? 프로게스테론 및 메게스트롤 아세테이트); 및 에스트로겐/프로게스테론 병합 치료제, 예컨대 컨쥬게이트된 에스트로겐/메트록시프로게스테론(예를 들어, PREMPROTM 및 PREMPHASE?) 및 노르에틴드론 아세테이트/에티닐 에스트라디올(예를 들어, FEMHRTTM)가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 철분 결핍증 및 저색소성 빈혈을 치료하는 데 효과적인 약물과 함께 투여되며, 이러한 약물로는 황산 제1철(황산철, FEOSOLTM), 푸마르산철(예를 들어, FEOSTATTM), 글루콘산철(예를 들어, FERGONTM), 폴라사카라이드-철 착물(예를 들어, NIFEREXTM), 철 덱스트란 주사물(예를 들어, INFEDTM), 황산구리, 피록시딘(pyroxidine), 리보플라빈(riboflavin), 비타민 B12, 시아노코발라민 주사물(예를 들어, REDISOLTM, RUBRAMIN PCTM), 히드록소코발라민, 폴산(예를 들어, FOLVITETM), 류코보린(폴린산, 5-CHOH4PteGlu, 시트로보룸(citrovorum) 인자) 또는 WELLCOVORIN (류코보린의 칼슘 염), 트랜스페린(transferrin) 또는 페리틴(ferritin)이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 정신과 질환을 치료하는 데 사용되는 작용제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 정신과 약물로는, 항정신병 약물(예를 들어, 클로르프로마진(chlorpromazine), 클로프프로틱센(chlorprothixene), 클로자핀(clozapine), 플루페나진(fluphenazine), 할로페리돌(haloperidol), 록사핀(loxapine), 메소르다진(mesoridazine), 몰린돈(molindone), 올란자핀(olanzapine), 페르페나진(perphenazine), 피모지드(pimozide), 쿠에티아핀(quetiapine), 리스페리돈(risperidone), 티오리다진(thioridazine), 티오틱센(thiothixene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 및 트리플루프로마진(triflupromazine)), 항조증 약물(예를 들어, 카르바마제핀(carbamazepine), 디발프로엑스 소듐(divalproex sodium), 리튬 카르보네이트, 및 리튬 시트레이트)), 항우울제(예를 들어, 아미트립틸린(amitriptyline), 아목사핀(amoxapine), 부프로피온(bupropion), 시탈로프람(citalopram), 클로미프라민(clomipramine), 데시프라민(desipramine), 독세핀(doxepin), 플루복사민(fluvoxamine), 플루옥세틴(fluoxetine), 이미프라민(imipramine), 이소카르복사지드(isocarboxazid), 마프로틸린(maprotiline), 미르타자핀(mirtazapine), 네파조돈(nefazodone), 노르트립틸린(nortriptyline), 파록세틴(paroxetine), 페넬진(henelzine), 프로트립틸린(protriptyline), 세르트랄린(sertraline), 트라닐시프로민(tranylcypromine), 트라조돈(trazodone), 트리미프라민(trimipramine), 및 벤라팍신(venlafaxine)), 항불안제(예를 들어, 알프라졸람(alprazolam), 부스피론(buspirone), 클로르디아제폭시드(chlordiazepoxide), 클로라제페이트(clorazepate), 디아제팜(diazepam), 할라제팜(halazepam), 로라제팜(lorazepam), 옥사제팜(oxazepam), 및 프라제팜(prazepam)), 및 자극제(예를 들어, d-암페타민(d-amphetamine), 메틸페니데이트(methylphenidate), 및 페몰린(pemoline))이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 신경계 질환을 치료하는 데 사용된 작용제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 신경작용제로는 항간질제(예를 들어, 카르바마제핀(carbamazepine), 클로나제팜(clonazepam), 에토석시미드(ethosuximide), 페노바르비탈(phenobarbital), 페니토인(phenytoin), 프리미돈(primidone), 발프로산(valproic acid), 디발프로엑스 소듐(divalproex sodium), 펠바메이트(felbamate), 가바펜틴(gabapentin), 라모트리긴(lamotrigine), 레베티라세탐(levetiracetam), 옥스카르바제핀(oxcarbazepine), 티아가빈(tiagabine), 토피라메이트(topiramate), 조니사미드(zonisamide), 디아제팜(diazepam), 로라제팜(lorazepam), 및 클로나제팜(clonazepam)), 항파킨슨씨병 약물(예를 들어, 레보도파/카르비도파(levodopa/carbidopa), 셀레길린(selegiline), 아만티딘(amantidine), 브로모크립틴(bromocriptine), 페르골리드(pergolide), 로피니롤(ropinirole), 프라미펙솔(pramipexole), 벤즈트로핀(benztropine); 비페리덴(biperiden); 에토프로파진(ethopropazine); 프로시클리딘(procyclidine); 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl), 톨카폰(tolcapone)), 및 ALS 치료약(예를 들어, 릴루졸(riluzole))이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 혈관확장제 및/또는 칼슘 채널 차단제와 함께 투여된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 혈관확장제로는, 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin Converting Enzyme (ACE)) 억제제(예를 들어, 파파베린(papaverine), 이속수프린(isoxsuprine), 베나제프릴(benazepril), 카프토프릴(captopril), 실라자프릴(cilazapril), 에날라프릴(enalapril), 에날라프릴레이트(enalaprilat), 포시노프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 모엑시프릴(moexipril), 페린도프릴(perindopril), 퀴나프릴(quinapril), 라미프릴(ramipril), 스피라프릴(spirapril), 트라돌라프릴(trandolapril), 및 닐리드린(nylidrin)), 및 질산염(예를 들어, 이소소르비드 디니트레이트(isosorbide dinitrate), 이소소르비드 모노니트레이트(isosorbide mononitrate), 및 니트로글리세린(nitroglycerin))이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 칼슘 채널 차단제의 예로는 암로디핀(amlodipine), 베프리딜(bepridil), 딜티아젬(diltiazem), 펠로디핀(felodipine), 플룬아리진(flunarizine), 이스라디핀(isradipine), 니카르디핀(nicardipine), 니페디핀(nifedipine), 니모디핀(nimodipine), 및 베라파밀(verapamil)이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 위장관 질환 치료제와 함께 투여된다. 본원 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드와 함께 투여될 수 있는 위장관 질환 치료제로는, H2 히스타민 수용체 길항제(예를 들어, TAGAMETTM (시메티딘(cimetidine)), ZANTACTM (라니티딘(ranitidine)), PEPCIDTM (파모티딘(famotidine)), 및 AXIDTM (니자티딘(nizatidine))); H+, K+ ATPase의 억제제 (예를 들어, PREVACIDTM (란소프라졸(lansoprazole)) 및 PRILOSECTM (오메프라졸(omeprazole))); 비스무트 화합물(예를 들어, PEPTO-BISMOLTM (비스무트 서브살리실레이트(subsalicylate)) 및 DE-NOLTM (비스무트 서브시트레이트(subcitrate))); 여러 제산제; 수크랄페이트(sucralfate); 프로스타글란딘 유사체(prostaglandin analogs) (예를 들어, CYTOTECTM (미소프로스톨(misoprostol))); 무스카린 콜린성 길항제; 하제(예를 들어, 계면활성 하제, 자극성 하제, 염수 및 삼투성 하제); 지사제(예를 들어, LOMOTILTM (디페녹실레이트), MOTOFENTM (디페녹신(diphenoxin)), 및 IMODIUMTM (로페라미드 히드로클로라이드)), 소마토스타틴의 합성 유사체, 예컨대 SANDOSTATINTM (옥트레오티드(octreotide)), 진토제(예를 들어, ZOFRANTM (온단세트론), KYTRILTM (그란이세트론 히드로클로라이드), 트로피세트론(tropisetron), 돌라세트론(dolasetron), 메토클로프라미드(metoclopramide), 클로르프로마진(chlorpromazine), 페르페나진(perphenazine), 프로클로르페라진(prochlorperazine), 프로메타진(promethazine), 티에틸페라진(thiethylperazine), 트리플루프로마진(triflupromazine), 돔페리돈(domperidone), 할로페리돌(haloperidol), 드로페리돌(droperidol), 트리메토벤즈아미드(trimethobenzamide), 덱사메타손(dexamethasone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 드로나비놀(dronabinol), 및 나빌론(nabilone)); D2 길항제(예를 들어, 메토클로프라미드(metoclopramide), 트리메토벤즈아미드(trimethobenzamide) 및 클로르프로마진(chlorpromazine)); 담즙 염; 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid); 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid); 및 판크레아틴 효소 제제, 예컨대 판크레아틴(pancreatin) 및 판클레리파제(pancrelipase)가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 그 밖의 치료 또는 예방 섭생, 예를 들어 방사선 치료와 함께 투여된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 포함하는 약제 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 의약 팩 또는 키트를 제공한다. 임의적으로 이러한 용기에는 사람 투여를 위한 제조, 용도 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영하는, 약품 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 규정하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 안내문이 동반될 수 있다.
유전자 치료
본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 작제물은 알부민 융합 단백질의 치료 유효 용량을 전달하는 유전자 치료 프로토콜의 일부로서 사용될 수 있다. 핵산을 세포에 생체내 도입하기 위한 바람직한 방법은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 바이러스 벡터에 의한 세포의 감염은 높은 비율의 표적화된 세포가 핵산을 수용할 수 있다는 이점을 갖는다. 추가로, 바이러스 벡터내에, 예를 들어 바이러스 벡터에 함유된 cDNA에 의해 엔코딩된 분자는 바이러스 벡터 핵산이 도입된 세포에서 효과적으로 발현된다.
레트로바이러스 벡터 및 아데노 부속 바이러스 벡터는 생체내 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 외인성 핵산 분자의 운반을 위한 재조합 유전자 전달계로서 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 핵산을 세포과 효과적으로 전달하고, 전달된 핵산은 숙주의 염색체 DNA에 안정하게 통합된다. 복제 결핍 레트로바이러스만을 생성하는 특화된 세포주("패키징 세포"로 명명됨)의 개발은 유전 치료를 위해 레트로바이러스의 유용성을 증가시켰으며, 결핍 레트로바이러스는 유전 치료 목적을 위한 유전자 전달에 사용되도록 특징화된다[참조예: Miller, A.D. (1990) Blood 76:27 1]. 복제 결핍 레트로바이러스는 표준 기법에 의해 헬퍼 바이러스를 사용하므로써 표적 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있는 비리온(virion)으로 패키징될 수 있다. 재조합 레트로바이러스를 생성하고, 이러한 바이러스로 시험관내 또는 생체내 세포를 감염시키기 위한 프로토콜은 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al ., (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14) 및 그 밖의 표준 실험 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 유용한 또 다른 바이러스 유전자 전달계는 아데노바이러스 유래된 벡터를 사용한다. 아데노바이러스의 게놈은 대상이 되는 유전자 생성물을 엔코딩하고 발현시키나, 정상적인 용해 바이러스 수명 사이클에서의 복제능에 대해서는 불활성화되도록 조작될 수 있다[참조예:Berkner et al ., BioTechniques 6:616 (1988); Rosenfeld et al ., Science 252:431-434 (1991); and Rosenfeld et al ., Cell 68:143-155 (1992)]. 아데노바이러스 스트레인 Ad 타입 5 dl324로부터 또는 다른 아데노바이러스 스트레인으로부터 유래된 적합한 아데노바이러스 벡터(예를 들어, Ad2, Ad3, Adz 등)가 당업자들에게 공지되어 있다. 재조합 아데노바이러스는 비분화 세포를 감염시킬 수 있고, 상피 세포를 포함하는 광범위 세포 타입을 감염시키는 데 사용될 수 있다는 점에서 특정 환경에서 유리할 수 있다[참조: 상기 인용된 Rosenfeld et al ., (1992)). 추가로, 바이러스 입자는 정제 및 농축에 대해 비교적 안정하고 순응적이며, 상기와 같이 감염 스펙트럼에 영향을 받도록 개질될 수 있다. 추가로, 도입된 아데노바이러스 DNA(및 그 안에 함유된 외래 DNA)는 숙주 세포의 게놈으로 통합되지 않고 에피솜(episomal)으로 남아 있으므로써, 도입된 DNA가 숙주 게놈(예를 들어, 레트로바이러스 DNA)으로 통합되는 상황에서 삽입 돌연변이 유발의 결과로서 발생할 수 있는 잠재적 문제점을 피한다. 또한, 외래 DNA에 대한 아데노바이러스 게놈은 운반 용량은 다른 유전자 전달 벡터에 비해 크다(8킬로염기 이하로)[참조: Berkner et al ., cited supra; Haj-Ahmand et al ., J. Virol. 57:267 (1986)].
또 다른 구체예에서, 본 발명의 비바이러스 유전자 전달계는 표적 세포에 의해 대상이 되는 누클레오티드 분자의 도입을 위한 세포내 경로에 의존한다. 이러한 타입의 유전자 전달계의 예로는 리포솜 유래계, 폴리-리신 컨쥬게이트 및 합성 바이러스 엔벨로프(envelope)가 포함된다. 대표적 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 그 표면에 양전하를 지니고(예컨대, 리포펙틴), (임의로) 표적 조직의 세포 표면 항원에 대한 항체로 태깅된(tagged) 리포솜에 포획될 수 있다[참조:Mizuno et a1 . (1992) No Shinkei Geka 20:547-551; PCT 출원 공개 W091/06309; 일본 특허 출원 1047381; 및 유럽 특허 공개 EP-A-43075].
본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 유전자에 대한 유전자 전달계는 다수의 방법에 의해 환자에게 도입될 수 있다. 예를 들어, 유전자 전달계의 약제학적 제제는 예를 들어, 정맥내 주입에 의해 전신 도입될 수 있으며, 표적 세포내 단백질의 특이적 형질도입이 수형체 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 서열 또는 이의 조합으로 인해 유전자 전달 비히클, 세포 타입 또는 조직 타입 발현에 의해 제공된 트랜스펙션의 특이성으로부터 우세하게 일어난다. 다른 구체예에서, 재조합 유전자의 초기 전달은 상당히 편재화된 동물로의 도입으로 보다 제한된다. 예를 들어, 유전자 전달 비히클은 카테테르(참조: 미국 특허 제 5,328,470호)에 의해, 또는 정위적 주입(Stereotactic injection)(예를 들어, Chen et al . (1994) PNAS 91: 3 054-3 05 7)에 의해 도입될 수 있다. 유전자 치료 작제물의 약제학적 제제는 필수적으로 허용되는 희석제 중의 유전자 전달계로 이루어지거나, 유전자 전달 비히클이 삽입된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 알부민 융합 단백질이 재조합 세포, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터로부터 온전하게 생성될 수 있는 경우, 상기 약제학적 제제는 알부민 융합 단백질을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
추가의 유전자 치료 방법
또한, 질환, 질병 및 병태를 치료하거나 예방하는 유전자 치료 방법에 본 발명에 포함된다. 유전자 치료 방법은 핵산(DNA, RNA 및 안티센스 DNA 또는 RNA) 서열을 동물에게 도입하여 본 발명의 알부민 융합 단백질의 발현을 달성하는 것과 관련된다. 이 방법은 프로모터 및 표적 조직에 의한 융합 단백질의 발현에 필요한 그 밖의 유전 요소에 조작에 의해 연결된 본 발명의 알부민 융합 단백질을 코딩하는 폴리누클레오티드를 필요로 한다. 이러한 유전자 치료 및 전달 기술은 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로 인용된 WO 90/11092호에 공지되어 있다.
따라서, 예를 들어, 환자로부터의 세포는 생체외에서 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 조작에 의해 연결된 프로모터를 포함하는 폴리누클레오티드(DNA 또는 RNA)로 조작될 수 있으며, 이후, 조작된 세포는 본 발명의 융합 단백질로 처리되어야 하는 환자에게 제공된다. 이러한 방법은 당해 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 문헌(Belldegrun, A., et al., J. Natl. Cancer Inst. 85: 207-216 (1993); Ferrantini, M. et al., Cancer Research 53: 1107-1112 (1993); Ferrantini, M. et al., J. Immunology 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T., et al., Int. J. Cancer 60: 221-229 (1995); Ogura, H., et al., Cancer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodonato, L., et al., Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, L., et al., Gene Therapy 4:1246-1255 (1997); 및 Zhang, J.-F. et al., Cancer Gene Therapy 3: 31-38 (1996))을 참조하라. 일 구체예에서, 조작된 세포는 동맥 세포이다. 동맥 세포는 동맥, 동맥을 둘러싸고 있는 조직으로의 직접 주입을 통해 또는 카테테르 주입을 통해 환자에게 재도입될 수 있다.
하기에서 보다 자세히 논의되는 바와 같이, 폴리누클레오티드 작제물은 동물의 세포에 주입가능한 물질을 전달하는, 예컨대 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간 등)의 간질 공간으로 주입하는 임의의 방법에 의해 전달될 수 있다. 폴리누클레오티드 작제물은 약제학적으로 허용되는 액체 또는 수성 담체로 전달될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 네이키드(naked) 폴리누클레오티드로서 전달된다. 용어 "네이키드" 폴리누클레오티드, DNA 또는 RNA는 바이러스 서열, 바이러스 분자, 리포솜 포뮬레이션, 리포펙틴(lipofectin) 또는 침전화제 등을 포함하는 세포로의 도입을 보조하거나, 촉진하거나 용이하게 하는 전달 비히클을 함유하지 않는 서열을 말한다. 그러나, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 리포솜 포뮬레이션으로 전달될 수 있으며, 리포펙틴 포뮬레이션 등은 당업자들에게 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,593,972호, 제 5,589,466호 및 제 5,580,859호에 기술되어 있다.
유전자 치료 방법에 사용되는 폴리누클레오티드 벡터 작제물은 바람직하게는 숙주 게놈에 통합되지도 않고, 복제를 허용하는 서열을 함유하지도 않는 작제물이다. 적합한 벡터로는 스트라타진(Stratagene)사로부터 입수할 수 있는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI 및 pSG; 파마시아(Pharmacia)사로부터 입수할 수 있는 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 인비트로겐(Invitrogen)사로부터 입수할 수 있는 pEF1N5, pcDNA3.1, 및 pRc/CMV2이 포함된다. 그 밖의 적합한 벡터는 당업자들에게 자명할 것이다.
당업자들에 공지되어 있는 강력한 프로모터가 폴리누클레오티드 서열의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 적합한 프로모터로는 아데노바이러스 프로모터,예컨대, 아데노바이러스 메이져 레이트 프로모터(adenoviral major late promoter); 이종 프로모터, 예컨대, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터; 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 프로모터; 유도성 프로모터, 예컨대 MMT 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터; 열쇼크 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAl 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 예컨대, 단순포진 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스 LTR; b-악틴 프로모터; 및 사람 성장 호르몬 프로모터가 포함된다. 또한, 프로모터는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적인 단백질 부분에 상응하는 유전자에 대한 천연 프로모터일 수 있다.
다른 유전자 치료 기술과는 달리, 네이키드 핵산 서열을 표적 세포에 도입하는 것의 주요 이점중 하나는 세포내 폴리누클레오티드 합성의 일과성(transitory natrue)이다. 연구로부터, 비복제 DNA 서열이 6개월 이하의 기간 동안 목적하는 폴리펩티드를 생성하기 위해 세포에 도입될 수 있는 것으로 나타났다.
폴리누클레오티드 작제물은 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선(gland), 및 연결 조직을 포함하는 동물내 조직의 간질 공간에 전달될 수 있다. 조직의 간질 공간은 세포간 유체, 기관 조직의 세망 조직, 관 또는 챔버 벽내 탄성 섬유, 섬유상 조직의 콜라겐 섬유 사이에서 뮤코폴리사카라이드 매트릭스, 또는 연결 조직 초성 근육 세포내에서 또는 뼈의 소공에서의 그러한 매트릭스를 포함한다. 순환계의 혈장 및 림프 채널의 림프액에 의해 점유되는 공간의 유사하다. 근육 조직의 간질 공간으로의 전달은 하기 논의되는 이유로 바람직하다. 상기 작제물은 이들 세포를 포함하는 조직으로의 주입에 의해 용이하게 전달될 수 있다. 상기 작제물은, 전달 및 발현이 전혀 분화되지 않거나 덜 완전히 분환된 세포, 예를 들어, 혈액의 줄기 세포 또는 피부 섬유아세포에서 달성될 수 있기는 하지만, 바람직하게는 분화되는 지속적인 비분열 세포에 전달되고 발현된다. 생체내 근육 세포가 폴리누클레오티드의 도입 및 발현능에서 특히 유능하다.
네이키드 핵산 서열 주입을 위해, DNA 또는 RNA의 효과적인 투여량은 약 0.05mg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다. 바람직하게는, 투여량은 약 0.005mg/kg 내지 약 20mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.05mg/kg 내지 약 5mg/kg이다. 물론, 당업자들에게 주입되는 조직 부위에 따라 상기 투여량이 달라질 것이라는 것은 자명하다. 핵산 서열의 적합하고 효과적인 투여량은 당업자들에게 용이하게 결정될 수 있으며, 처리되는 상태 및 투여 경로에 의존할 수 있다.
바람직한 투여 경로는 조직들의 간질 공간에 비경구 경로로 주입하는 것이다. 그러나, 예컨대, 특히 폐 또는 기관지 조직, 목 또는 코의 점막으로의 전달을 위한 에어로졸 포뮬레이션의 흡입과 같은 그 밖의 비경구 경로도 사용될 수 있다. 또한, 네이키드 DNA 작제물은 상기 절차에 사용되는 카테테르에 의한 혈관성형술 동안에 동맥에 전달될 수 있다.
네이키드 폴리누클레오티드는 전달 부위에서의 직접적 니들 주사, 정맥 주사, 국부적(topical) 투여, 카테터 주입, 및 소위 "유전자 건(gene gun)"을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 전달된다. 이러한 전달 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
또한, 작제물은 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포솜 제형, 리포펙틴, 침전제 등과 같은 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 이러한 전달 방법은 당 분야에 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 폴리누클레오티드 작제물은 리포솜 제제에서 복합체화된다. 본 발명에서 사용되는 리포솜 제제는 양이온성 (양 하전됨), 음이온성 (음 하전됨) 및 중성 제제를 포함한다. 그러나, 양이온 리포솜이 특히 바람직한데, 이는 양이온성 리포솜 및 다가음이온성 핵산 사이에 전하 복합체(charge complex)가 형성될 수 있기 때문이다. 양이온성 리포솜은 작용성 형태의 플라스미드 DNA (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음); mRNA (Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:6077-6081; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음); 및 정제된 전사 인자 (Debs et al., J. Biol. Chem. (1990) 265:10189-10192; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음)의 세포내 전달을 매개하는 것으로 밝혀졌다
양이온성 리포솜은 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어, N[1-2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄 (DOTMA) 리포솜이 특히 유용하며, 이는 깁코 비알엘 (GIBCO, BRL, Grand Island, N.Y. )로부터 리포펙틴(Lipofectin)이라는 상표명으로 입수할 수 있다 (참조: Felgner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA (1987) 84:7413-7416; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 다른 시판되는 리포솜으로는 트랜스펙타세(transfectace) (DDAB/DOPE) 및 DOTAP/DOPE (Boehringer)가 있다.
다른 양이온성 리포솜은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 입수할 수 있는 물질로부터 제조될 수 있다 (DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판) 리포솜의 합성에 관한 설명에 대해서는 PCT 공개공보 제 WO 90/11092호를 참조하라; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). DOTMA 리포솜의 제조는 문헌에 설명되어 있다 (참조: P. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 유사한 방법이 다른 양이온성 지질 물질로부터 리포솜을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
유사하게는, 음이온성 및 중성 리포솜은 예를 들어 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids) (Birmingham, Ala.)로부터 용이하게 입수할 수 있거나, 용이하게 입수할 수 있는 물질을 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 이러한 물질로는 특히 포스파티딜, 콜린, 콜레스테롤, 포스파티딜 에탄올아민, 디올레오일포스파티딜 콜린 (DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤 (DOPG), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE)이 있다. 또한, 이들 물질은 적절한 비로 DOTMA 및 DOTAP 출발 물질과 혼합될 수 있다. 이들 물질을 사용하여 리포솜을 제조하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 시판되는 디올레오일포스파티딜 콜린 (DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤 (DOPG) 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE)은 콜레스테롤을 첨가하거나 첨가하지 않고 통상적인 리포솜을 제조하기 위해 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 DOPG/DOPC 소포는 질소 기체의 스트림하에 각각 50 mg의 DOPG 및 DOPC를 초음파처리 바이알내로 건조시킴으로써 제조될 수 있다. 샘플은 진공 펌프하에서 밤새 정치되고, 다음날 탈이온수로 수화된다. 그 후, 샘플은, 배쓰(bath)가 15℃에서 순환되며 최대 세팅에서 반전된 컵 (배쓰 유형) 프로브가 구비된 히트 시스템즈 모델(Heat Systems model) 350 초음파처리기를 사용하여 마개를 씌운 바이알에서 2시간 동안 초음파처리된다. 또한, 음 하전된 소포는 다층소포를 생성시키도록 초음파처리 없이 제조될 수 있거나 별개의 크기의 단일층 소포를 생성시키도록 핵공(nucleopore) 막을 통한 압출에 의해 제조될 수 있다. 다른 방법들이 공지되어 있으며, 당업자는 이들 방법을 이용할 수 있다.
리포솜은 다층 소포 (MLV), 작은 단일층 소포 (SUV) 또는 커다란 단일층 소포 (LUV)를 포함할 수 있으며, SUV가 바람직하다. 다양한 리포솜-핵산 복합체가 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조된다 (참조: Straubinger et al., Methods of Immunology (1983), 101:512-527; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 예를 들어, 핵산을 함유하는 MLV는 유리관의 벽상에 인지질의 박막을 침착시킨 후, 캡슐화시키려는 물질의 용액으로 수화시킴으로써 제조될 수 있다. SUV는 단일층 리포솜의 균질한 집단을 생성시키도록 MLV의 연장된 초음파처리에 의해 제조된다. 포획하려는 물질은 사전 형성된 MLV의 현탁액에 첨가된 후, 초음파처리된다. 양이온성 지질을 함유하는 리포솜을 사용하는 경우, 건조된 지질 막이 적합한 용액, 예를 들어 멸균수 또는 등장 완충 용액, 예를 들어 10 mM Tris/NaCl 중에 재현탁되고, 초음파처리된 후, 사전 형성된 리포솜이 DNA와 직접 혼합된다. 리포솜과 DNA는 양이온성 DNA에 대한 양 하전된 리포솜의 결합으로 인해 매우 안정한 복합체를 형성한다. SUV는 작은 핵산 단편과 관련하여 사용된다. LUV는 당 분야에 널리 공지된 다수의 방법에 의해 제조된다. 일반적으로 사용되는 방법은 Ca2+-EDTA 킬레이트화 (Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394:483; Wilson et al., Cell 17:77 (1979)); 에테르 주사 (Deamer, D. and Bangham, A., Biochim. Biophys. Acta 443:629 (1976); Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836 (1977); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348 (1979)); 세정제 투석 (Enoch, H. and Strittmatter, P., Proc. Natl Acad. Sci. USA 76:145 (1979)); 및 역상 증발 (REV) (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255:10431 (1980); Szoka, F. and Papahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145 (1978); Schaefer-Ridder et al., Science 215:166 (1982))를 포함하며, 상기 기재된 문헌들은 본 명세서에 참조로 포함된다.
일반적으로, DNA 대 리포솜의 비는 약 10:1 내지 약 1:10 이다. 바람직하게는, 비는 약 5:1 내지 약 1:5 이다. 더욱 바람직하게는, 비는 약 3:1 내지 약 1:3 이다. 더욱 더 바람직하게는, 비는 약 1:1 이다.
미국 특허 제 5,676,954호 (본 명세서에 참조로 포함되어 있음)에는 양이온성 리포솜 담체와 복합체화된 유전 물질을 마우스에 주입하는 것에 관해 보고되어 있다. 미국 특허 제 4,897,355호, 제 4,946,787호, 제 5,049,386호, 제 5,459,127호, 제 5,589,466호, 제 5,693,622호, 제 5,580,859호, 제 5,703,055호 및 국제 공개공보 제 WO 94/9469호 (이들 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음)에는 세포 및 포유류내로 DNA를 트랜스펙션시키는데 사용되는 양이온성 지질이 제공되어 있다. 미국 특허 제 5,589,466호, 제 5,693,622호, 제 5,580,859호, 제 5,703,055호 및 국제 공개공보 제 WO 94/9469호에는 DNA-양이온성 지질 복합체를 포유류에 전달하기 위한 방법이 제공되어 있다.
특정 구체예에서, 세포는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 서열을 포함하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 공학처리된다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로바이러스로는 비제한적으로 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), 비장 괴사 바이러스, 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma Virus), 하베이 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈증 바이러스, 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스가 있다.
레트로바이러스 플라스미드 벡터가 패키징 세포주를 형질도입시켜서 프로듀서(producer) 세포주를 형성하기 위해 사용된다. 트랜스펙션될 수 있는 패키징 세포의 예로는 본 명세서에 전체 내용이 참조로 포함되어 있는 밀러(Miller)의 문헌 [Human Gene Therapy 1:5-14 (1990)]에 기재된 PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DAN 세포주가 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 벡터는 당 분야에 공지된 임의의 수단을 통해 패키징 세포를 형질도입시킬 수 있다. 이러한 수단으로는 비제한적으로 일렉트로포레이션, 리포솜의 사용 및 CaPO4 침전이 있다. 한 가지 대안에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 리포솜내로 캡슐화되거나 지질에 커플링된 후, 숙주에 투여될 수 있다.
프로듀서 세포주는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성시킨다. 그 후, 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 시험관내 또는 생체내에서 진핵 세포를 형질도입시키기 위해 사용될 수 있다. 형질도입된 진핵 세포는 본 발명의 융합 단백질을 발현시킨다.
다른 특정한 구체예에서, 세포는 아데노바이러스 벡터에 함유된 폴리누클레오티드를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 공학처리된다. 아데노바이러스는 이것이 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하고 발현하는 동시에 정상적 용균성 바이러스 생활환에서 복제할 수 있는 능력면에서 비활성화되도록 조작될 수 있다. 아데노바이러스 발현은 숙주 세포 염색체내로 바이러스 DNA를 삽입시키지 않고 이루어지며, 이에 따라 삽입 돌연변이에 대한 우려를 완화시킨다. 또한, 아데노바이러스는 수 년간 우수한 안전성 프로파일을 나타내며 살아있는 장용 백신으로서 사용되어 왔다 (Schwartz et al. Am. Rev. Respir. Dis.109:233-238 (1974)). 최종적으로, 아데노바이러스 매개성 유전자 전달은 알파-1-항트립신 및 CFTR을 코튼 래트(cotton rat)의 폐로 전달하는 것을 포함하는 다수의 경우에서 입증되었다 (Rosenfeld, M. A. et al. (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155). 또한, 아데노바이러스를 인간 암에서 원인 물질로서 정립하려는 방대한 연구는 한결같이 부정적이었다 (Green, M. et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:6606)
본 발명에 유용한 적합한 아데노바이러스 벡터는 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 문헌들 [Kozarsky and Wilson, Curr. Opin. Genet. Devel. 3:499-503 (1993); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Engelhardt et al., Human Genet. Ther. 4:759-769 (1993); Yang et al., Nature Genet. 7:362-369 (1994); Wilson et al., Nature 365:691-692 (1993); 및 미국 특허 제 5,652,224호]에 기재되어 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 Ad2가 유용하고, 인간 293 세포에서 증식될 수 있다. 이러한 세포는 아데노바이러스의 E1 영역을 함유하고, Ela 및 Elb를 구성적으로 발현시키며, 이는 벡터로부터 결실된 유전자의 생성물을 제공함으로써 결손 아데노바이러스를 보완한다. Ad2 이외에, 그 밖의 다양한 아데노바이러스 (예를 들어, Ad3, Ad5 및 Ad7)가 또한 본 발명에서 유용하다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 아데노바이러스는 복제 결핍성이다. 복제 결핍성 아데노바이러스는 감염성 입자를 형성하기 위해 헬퍼 바이러스 및/또는 패키징 세포주의 도움을 필요로 한다. 생성되는 바이러스는 세포를 감염시킬 수 있고, 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 폴리누클레오티드를 발현시킬 수 있지만, 대부분의 세포에서 복제될 수 없다. 복제 결핍성 아데노바이러스는 유전자 Ela, Elb, E3, E4, E2a, 또는 LI 내지 L5의 전부 또는 일부 중 하나 이상에서 결실될 수 있다.
다른 특정 구체예에서, 세포는 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 공학처리된다. AAV는 감염성 입자를 생성하기 위해 헬퍼 바이러스를 필요로 하는 천연 결손 바이러스이다 (Muzyczka, N., Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 158:97 (1992)). 또한, 이는 이의 DNA를 비분열 세포내로 삽입시킬 수 있는 몇 안되는 바이러스 중 하나이다. AAV의 300개의 적은 염기쌍을 함유하는 벡터는 패키징되고, 삽입될 수 있지만, 외인성 DNA에 대한 공간은 약 4.5 kb로 제한된다. 이러한 AAV를 생성하고 사용하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다 [참조: 미국 특허 제 5,139,941호, 제 5,173,414호, 제 5,354,678호, 제 5,436,146호, 제 5,474,935호, 제 5,478,745호 및 제 5,589,377호]
예를 들어, 본 발명에 사용되는 적합한 AAV 벡터는 DNA 복제, 캡시드화 및 숙주 세포 삽입을 위해 필요한 모든 서열을 포함한다. 폴리누클레오티드 작제물은 표준 클로닝 방법, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)]에서 발견되는 방법을 이용하여 AAV 벡터내로 삽입된다. 그 후, 재조합 AAV 벡터는 리포펙션, 일렉트로포레이션, 칼슘 포스페이트 침전 등을 포함하는 임의의 표준 기술을 이용하여 헬퍼 바이러스로 감염된 패키징 세포내로 트랜스펙션된다. 적합한 헬퍼 바이러스로는 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스, 백시니아 바이러스 또는 포진 바이러스가 있다. 패키징 세포가 트랜스펙션되고 감염된 경우, 이들은 폴리누클레오티드 작제물을 함유하는 감염성 AAV 바이러스 입자를 생성시킨다. 그 후, 이러한 바이러스 입자는 생체외 또는 생체내에서 진핵 세포를 형질도입시키기 위해 사용된다. 형질도입된 세포는 이의 게놈내로 삽입된 폴리누클레오티드 작제물을 함유하며, 본 발명의 융합 단백질을 발현시킨다.
유전자 요법의 또 다른 방법은 상동 재조합에 의해 이종성 조절 영역 및 내인성 폴리누클레오티드 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩함)을 작동가능하게 연결시키는 것을 포함한다 (참조: 1997년 6월 24일에 특허된 미국 특허 제 5,641,670호; 1996년 9월 26일에 공개된 국제 공개공보 제 WO 96/29411호; 1994년 8월 4일에 공개된 국제 공개공보 제 WO 94/12650호; Koller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); 및 Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989); 이들 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 이러한 방법은 표적 세포에 존재하지만 세포에서 정상적으로 발현되지 않거나 요망되는 수준 보다 낮은 수준으로 발현되는 유전자를 활성화시키는 것을 포함한다.
프로모터와 이를 플랭킹(flanking)하는 표적화 서열을 함유하는 폴리누클레오티드 작제물은 당 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 제조된다. 적합한 프로모터는 본 명세서에 기재되어 있다. 표적화 서열은 프로모터-표적화 서열이 내인성 서열과 상동 재조합될 수 있도록 내인성 서열과 충분히 상보적이다. 표적화 서열은 상동 재조합시에 프로모터가 내인성 서열과 작동가능하게 연결되도록 요망되는 내인성 폴리누클레오티드 서열의 5' 말단에 충분히 근접하게 위치한다.
프로모터 및 표적화 서열은 PCR을 이용하여 증폭될 수 있다. 바람직하게는, 증폭된 프로모터는 5' 및 3' 말단상에 별개의 제한 효소 부위를 함유한다. 바람직하게는, 제 1 표적화 서열의 3' 말단은 증폭된 프로모터의 5' 말단과 동일한 제한 효소 부위를 함유하고, 제 2 표적화 서열의 5' 말단은 증폭된 프로모터의 3' 말단과 동일한 제한 부위를 함유한다. 증폭된 프로모터 및 표적화 서열은 분해되고, 함께 연결된다.
프로모터-표적화 서열 작제물은 네이키드 폴리누클레오티드로서 또는 상기 더욱 상세히 설명되어 있는 리포솜, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 전체 바이러스, 리포펙틴, 침전제 등과 같은 트랜스펙션 촉진제와 함께 세포로 전달된다. P 프로모터-표적화 서열이 임의의 방법에 의해 전달될 수 있으며, 이러한 방법으로는 니들 주사, 정맥 주사, 국부적 투여, 카테터 주입, 입자 가속기 등이 있다. 이러한 방법은 하기 더욱 상세히 설명된다.
프로모터-표적화 서열 작제물은 세포에 의해 흡수된다. 작제물과 내인성 서열 사이에 상동 재조합이 일어나서, 내인성 서열이 프로모터의 조절을 받게 된다. 그 후, 프로모터는 내인성 서열의 발현을 유도시킨다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 단백질의 분비를 촉진하는 분비 신호 서열을 함유할 수 있다. 전형적으로, 신호 서열은 코딩 서열의 5' 말단쪽으로 또는 5' 말단에서 발현되도록 폴리누클레오티드의 코딩 영역에 위치해 있다. 신호 서열은 관심있는 폴리누클레오티드에 대해 동종성이거나 이종성일 수 있고, 트랜스펙션시키려는 세포에 대해 동종성이거나 이종성일 수 있다. 또한, 신호 서열은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학 합성될 수 있다.
치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 하나 이상의 분자를 발현시키는 한은 상기 기재된 폴리누클레오티드 작제물 중 어느 하나의 임의의 투여 방식이 사용될 수 있다. 이는 직접적 니들 주사, 전신 주사, 카테터 주입, 바이오리스틱 인젝터(biolistic injector), 입자 가속기 (즉, "유전자 건(gene gun)"), 겔포움 스폰지 디폿(gelfoam sponge depot), 그 밖의 시판되는 디폿 물질, 삼투 펌프 (예를 들어, 알자 미니펌프(Alza minipump)), 경구 또는 좌제용 고형 (정제 또는 알약) 약제 제형 및 수술 동안 디켄팅(decanting) 또는 국부 적용을 포함한다. 예를 들어, 네이키드 칼슘 포스페이트 침전된 플라스미드를 래트 간 및 래트 비장내로 직접 주입하거나 단백질 코팅된 플라스미드를 문맥내로 직접 주입하는 것은 래트 간에서 외래 유전자의 유전자 발현을 일으킨다 (Kaneda et al., Science 243:375 (1989)).
바람직한 국소 투여 방법은 직접 주사에 의한 것이다. 바람직하게는, 전달 비히클과 복합체화된 본 발명의 알부민 융합 단백질은 직접 주사에 의해 동맥의 영역내로 또는 동맥의 영역내에서 국소적으로 투여된다. 동맥의 영역내에서 국소적으로 조성물을 투여한다는 것은 조성물을 동맥내에서 센티미터, 바람직하게는 밀리미터로 주사하는 것을 의미한다.
또 다른 국소 투여 방법은 본 발명의 폴리누클레오티드 작제물을 수술 창상내에 또는 이 주위에 접촉시키는 것이다. 예를 들어, 환자는 수술을 받을 수 있고, 폴리누클레오티드 작제물은 창상 내부의 조직의 표면상에 코팅되거나 작제물은 창상 내부의 조직의 영역내로 주입될 수 있다.
전신 투여에 유용한 치료 조성물은 본 발명의 표적화된 전달 비히클에 복합체화된 본 발명의 융합 단백질을 포함한다. 전신 투여용으로 사용하기에 적합한 전달 비히클은 특정 부위에 비히클을 표적화시키기 위해 리간드를 포함하는 리포솜을 포함한다. 특정 구체예에서, 전신 투여용으로 사용되는 적합한 전달 비히클은 특정 부위에 비히클을 표적화시키기 위해 본 발명의 알부민 융합 단백질을 포함하는 리포솜을 포함한다.
바람직한 전신 투여 방법은 정맥 주사, 에어로졸, 경구 및 경피 (국부) 전달을 포함한다. 정맥 주사는 당 분야의 표준 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 에어로졸 전달이 당 분야의 표준 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992; 본 문헌은 본 명세서에 참조로 포함되어 있음). 경구 전달은 본 발명의 폴리누클레오티드 작제물을 동물의 장내의 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 담체에 복합체화시킴으로써 이루어질 수 있다. 이러한 담체의 예로는 플라스틱 캡슐 또는 정제, 예를 들어 당 분야에 공지된 것들이 있다. 국부 전달은 본 발명의 폴리누클레오티드 작제물을 피부내로 전달될 수 있는 친지성 시약 (예를 들어, DMSO)과 혼합함으로써 이루어질 수 있다.
*전달하려는 물질의 유효량을 결정하는 것은 예를 들어 물질의 화학 구조 및 생물학적 활성, 동물의 연령 및 체중, 치료를 필요로 하는 정확한 질환 및 이의 중증도, 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 좌우될 수 있다. 치료의 빈도는 다수의 인자, 예를 들어 용량 당 투여되는 폴리누클레오티드 작제물의 양 뿐만 아니라 피검체의 건강 및 병력에 좌우된다. 정확한 양, 투여 횟수 및 투여 시점은 주치의 또는 수의사에 의해 결정된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 동물, 바람직하게는 포유류 및 조류에 투여될 수 있다. 바람직한 포유류는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 말 및 돼지를 포함하며, 인간이 특히 바람직하다.
생물학적 활성
알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 시험하기 위한 검정에서 사용될 수 있다. 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드가 특정 검정에서 활성을 나타내는 경우, 이러한 융합 단백질에 상응하는 치료 단백질이 생물학적 활성과 관련된 질병에 관여할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 융합 단백질은 관련 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 치료, 예방 또는 개선이 요망되는 환자에게 표 1의 "치료 단백질 X" 컬럼 (표 1의 "바람직한 적응증 Y" 컬럼에 기재된 질병 또는 장애와 동일한 행에 존재함)에 기재된 치료 단백질에 상응하는 치료 단백질 부분을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 질병 또는 장애를 치료, 예방 또는 개선하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하여, 표 1의 "바람직한 적응증 Y" 컬럼에 기재된 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 치료, 예방 또는 개선이 요망되는 환자에게 실시예에 나타나 있는 적응증과 관련있는 치료 단백질에 상응하는 치료 단백질 부분을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 질병 또는 장애를 치료, 예방 또는 개선하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하여, 표 1의 "바람직한 적응증: Y" 컬럼에서 특정 치료 단백질에 대해 기재된 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명에 의해 특히 고려되는 것은 SEQ ID NO:Y를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 경우 세포에 의해 생성되는 알부민 융합 단백질이다. 이러한 폴리누클레오티드가 세포로부터 엔코딩되는 단백질을 발현시키는데 사용되는 경우, 세포의 천연 분비 및 프로세싱 단계는 표 2의 컬럼 4 및/또는 11에 명시된 신호 서열이 결여된 단백질을 생성시킨다. 기재된 신호 서열의 특정 아미노산 서열은 본 명세서에 나타나 있거나 당 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 가장 바람직한 구체예는 세포에 의해 생성된 알부민 융합 단백질을 포함한다 (이는 표 2의 컬럼 4 및/또는 11에 나타나 있는 리더 서열이 결여되어 있음). 또한, 가장 바람직한 것은 표 2의 컬럼 4 및/또는 11에 기재된 특정 리더 서열없이 SEQ ID NO:Y를 포함하는 폴리펩티드이다. 약제 조성물을 포함하는 이러한 두 가지 바람직한 구체예를 포함하는 조성물이 또한 바람직하다. 이러한 알부민 융합 단백질은 표 1의 "바람직한 적응증: Y"에서 특정 치료 단백질에 대해 기재된 질병 또는 장애를 치료, 예방 또는 개선시키기 위해 특히 고려된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 내분비계의 질병 및 장애 (예를 들어, 하기 "내분비 장애" 섹션을 참조하라), 신경계의 질병 및 장애 (예를 들어, 하기 "신경학적 장애" 섹션을 참조하라), 면역계의 질병 및 장애 (예를 들어, 하기 "면역 활성" 섹션을 참조하라), 호흡계의 질병 및 장애 (예를 들어, 하기 "호흡 장애" 섹션을 참조하라), 심혈관계의 질병 및 장애 (예를 들어, 하기 "심혈관 장애" 섹션을 참조하라), 생식계의 질병 및 장애 (예를 들어, 하기 "생식계 장애" 섹션을 참조하라), 소화계의 질병 및 장애 (예를 들어, 하기 "위장 장애" 섹션을 참조하라), 세포 증식과 관련된 질병 및/또는 장애 (하기, "과증식 장애" 섹션을 참조하라), 및/또는 혈액과 관련된 질병 또는 장애 (예를 들어, 하기 "혈액 관련 장애" 섹션을 참조하라)와 관련된 질병 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료에서 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 본 발명의 융합 단백질의 치료 단백질 부분에 상응하는 유전자가 발현되는 조직(들)과 관련된 질병 및/또는 장애를 진단하고/하거나 예후하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질 및 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 프로호르몬(prohormone) 활성화, 신경전달물질 활성, 세포 신호링, 세포 증식, 세포 분화 및 세포 이동을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 활성과 관련된 질병 및/또는 장애의 진단, 검출 및/또는 치료에 유용하다.
더욱 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질 및 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 하기 계통과 관련된 질병 및/또는 장애의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료를 위해 유용할 수 있다.
면역 활성
본 발명의 알부민 융합 단백질 및 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 예를 들어, 면역 세포의 증식, 분화 또는 동원 (화학주성)을 활성화시키거나 억제함으로써 면역계의 질병, 장애 및/또는 질환을 치료, 예방, 진단 및/또는 예후하는데 유용할 수 있다. 면역 세포는 조혈로 일컬어지는 작용을 통해 분화하여, 다능성 줄기 세포로부터 골수 세포 (혈소판, 적혈구, 호중구 및 대식구) 및 림프 세포 (B 및 T 림프구)를 생성한다. 이러한 면역 질병, 장애 및/또는 질환의 병인은 유전적, 신체적(somatic), 예를 들어 암 및 일부 자기면역 질병, 후천적 (예를 들어, 화학요법 또는 독소에 의함), 또는 감염적일 수 있다. 더욱이, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 특정 면역계 질병 또는 장애의 마커 또는 검출물질로서 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 면역계의 질병 및 장애를 치료하고/하거나, 본 발명의 폴리펩티드가 발현되는 조직(들)과 관련된 세포에 의해 생성되는 면역 반응을 억제 또는 향상시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 선천성 및 후천성 면역결핍을 포함하는 면역결핍을 치료, 예방, 진단 및/또는 예후하는데 유용할 수 있다. 면역글로불린 수준 B 세포 기능 및/또는 B 세포 개수가 감소하는 B 세포 면역결핍의 예로는 X-연관된 무감마글로불린혈증 (브루톤병), X-연관된 영아 무감마글로불린혈증, 과잉 IgM을 동반하는 X-연관된 면역결핍, 과잉 IgM을 동반하는 X-연관되지 않은 면역결핍, X-연관된 림프증식 증후군 (XLP), 선천성 및 후천성 무감마글로불린혈증을 포함하는 무감마글로불린혈증, 성인 개시형 무감마글로불린혈증, 후기-개시형(late-onset) 무감마글로불린혈증, 이상감마글로불린혈증, 저감마글로불린혈증, 불특정형 저감마글로불린혈증, 열성 무감마글로불린혈증 (스위스 유형), 선택적 IgM 결핍, 선택적 IgA 결핍, 선택적 IgG 서브클래스 결핍, IgG 서브클래스 결핍 (IgA 결핍을 나타내거나 나타내지 않음), 증가된 IgM을 동반하는 Ig 결핍, 증가된 IgM을 동반하는 IgG 및 IgA 결핍, 정상 또는 상승된 Ig를 동반하는 항체 결핍, Ig 중쇄 결실, 카파 사슬 결핍, B 세포 림프증식 장애 (BLPD), 공통 가변성(common variable) 면역결핍 (CVID), 공통 가변성 면역결핍 (CVI) (후천성), 및 영아기의 일시적 저감마글로불린혈증이 있다.
특정 구체예에서, 모세혈관확장성 조화운동불능(ataxia-telangiectasia) 또는 조화운동불능과 관련된 질환이 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예후된다.
T 세포 및/또는 B 세포 기능 및/또는 개수가 감소하는 선천성 면역결핍의 예로는 비제한적으로 디죠지 이상(DiGeorge anomaly), 중증 복합 면역결핍 (SCID) (X-연관된 SCID, 보통염색체 열성 SCID, 아데노신 데아미나아제 결핍, 퓨린 누클레오시드 포스포릴라아제 (PNP) 결핍, 클래스 II MHC 결핍 (바르(Bare) 림프구 증후군), 위스코트-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군 및 모세혈관확장성 조화운동불능을 포함하지만, 이들에 제한되지 않음), 흉선 형성부전(thymic hypoplasia), 제 3 및 제 4 인두낭 증후군, 22q11.2 결실, 만성 점막피부 칸디다증, 자연 살상 세포 결핍 (NK), 특발성 CD4+ T-림프구감소증, T 세포 결함이 우세한 면역결핍 (불특정형) 및 세포 매개성 면역의 불특정형 면역결핍이 있다.
특정 구체예에서, 디죠지 이상 및 디죠지 이상과 관련된 질환은 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예후된다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는폴리누클레오티드를 사용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예후될 수 있는 다른 면역결핍으로는 비제한적으로 만성 육아종 질병, 체디악-히가시(Chediak-Higashi) 증후군, 골수세포형과산화효소 결핍, 백혈구 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 결핍, X-연관된 림프증식 증후군 (XLP), 백혈구 부착 결핍, 보체 성분 결핍 (Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 및/또는 C9 결핍을 포함함), 세망 발생장애(reticular dysgenesis), 흉선 림프조직무형성-무형성, 흉선종을 동반하는 면역결핍, 중증 선천성 백혈구감소증, 면역결핍을 동반하는 형성이상, 신생아 호중성백혈구감소증, 단지 난장이증(short limbed dwarfism) 및 Ig를 동반하는 네젤로프 증후군 합병성 면역결핍이 있다.
바람직한 구체예에서, 면역결핍 및/또는 상기 언급된 면역결핍과 관련된 질환은 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예후된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 면역결핍 개체들 사이에서 면역반응성을 증강시키기 위한 작용제로서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 B 세포 및/또는 T 세포 면역결핍 개체들 사이에서 면역반응성을 증강시키기 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 자기면역 장애를 치료, 예방, 진단 및/또는 예후하는데 유용할 수 있다. 다수의 자기면역 장애는 면역 세포가 자기(self)를 외래 물질로서 부적절하게 인식하는 데에서 비롯된다. 이러한 부적절한 인식은 면역 반응을 일으켜서 숙주 조직의 파괴를 초래한다. 따라서, 면역 반응, 특히 T 세포의 증식, 분화 또는 화학주성을 억제할 수 있는 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 투여는 자기면역 장애를 예방하는 데에 있어서 효과적인 요법일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 치료, 예방, 진단 및/또는 예후될 수 있는 자기면역 질병 또는 장애로는 비제한적으로 전신성 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 강직 척추염, 다발성 경화증, 자기면역 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자기면역 용혈성 빈혈, 용혈성 빈혈, 저혈소판증, 자기면역 저혈소판증 자색반, 자기면역 신생아 저혈소판증, 특발성 저혈소판증 자색반, 자색반 (예를 들어, 헨로치-스코엔레인(Henloch-Scoenlein) 자색반), 자기면역혈구감소증, 굿패스처(Goodpasture) 증후군, 보통 천포창, 중증 근무력증, 그레이브(Grave)병 (갑상선과다증) 및 인슐린 내성 당뇨병이 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하여 치료, 예방 및/또는 진단될 수 있는 자기면역 성분을 지니는 것으로 여겨지는 추가의 장애로는 비제한적으로 타입 II 콜라겐-유도된 관절염, 항인지질 증후군, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 심근염, 재발성 다발연골염, 류마티스성 심장병, 신경염, 포도막염 안염, 다중내분비병증(polyendocrinopathy), 레이터(Reiter) 병, 스티프-만(Stiff Man) 증후군, 자기면역 폐 염증, 자폐증, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 인슐린 의존성 당뇨병, 및 자기면역 염증성 안구 장애가 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료, 예방, 진단 및/또는 예견할 수 있는 자가면역 성분을 지니는 것으로 추정되는 부가적인 질환으로는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 항-콜라겐 항체에 의한 피부경화 (예를 들어, 핵소체 및 기타 핵 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 혼합 결합 조직병 (예를 들어, 추출가능한 핵 항원 (예를 들어, 리보누클레오단백질)에 대한 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 다발근육염 (예를 들어, 비-히스톤 ANA에 의해서 종종 특징되기도 함), 악성 빈혈 (예를 들어, 항-벽세포, 마이크로좀 및 내인 인자 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 특발성 에디슨 병 (예를 들어, 체액 및 세포 매개된 부신 세포독성에 의해서 종종 특징되기도 함), 불임증 (예를 들어, 항-정자 항체에 의해서 특징되기도 함), 사구체신염 (예를 들어, 사구체 기저막 항체 또는 면역 복합체에 의해서 종종 특징되기도 함), 유사 물집증 (예를 들어, 기저막에서의 IgG 및 보체에 의해서 종종 특징되기도 함), 쇼그렌 증후군 (예를 들어, 다발 조직 항체, 및/또는 특이적인 비-히스톤 ANA (SS-B)에 의해서 종종 특징되기도 함), 당뇨병 (예를 들어, 세포 매개된 및 체액성 섬세포 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 및 아드레날린 약물 내성 (천식 또는 낭종 섬유종에 대한 아드레날린 약물 내성을 포함함)(예를 들어, 베타-아드레날린 수용체 항체에 의해서 종종 특징되기도 함)이 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료, 예방, 진단 및/또는 예견될 수 있는 자가면역 성분을 지니는 것으로 추정되는 부가적인 질환으로는, 이들에 한정되는 것은 아니나, 만성 활성 간염 (예를 들어, 평활근 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 원발성 쓸개관 경화증 (예를 들어, 미토콘드리아 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 기타 내분비샘 이상 (예를 들어, 일부 경우에 특이적인 조직 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 백반증 (예를 들어, 멜라닌세포 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 혈관염 (예를 들어, 혈관 벽에서의 Ig 및 보체 및/또는 저혈청 보체에 의해서 종종 특징되기도 함), 후-MI (예를 들어, 심근 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 심장절개 증후군 (예를 들어, 심근 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 두드러기 (예를 들어, IgE에 대한 IgG 및 IgM 항체에 의해서 종종 특징되기도 함), 아토피성 피부염 (예를 들어, IgE에 대한 IgG 및 IgM에 의해서 종종 특징되기도 함), 천식 (예를 들어, IgE에 대한 IgG 및 IgM에 의해서 종종 특징되기도 함), 및 다수의 기타 염증성, 육아종, 퇴행성 및 위축성 질환이 있다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 언급된 질환 및 질병과 관련된 자가면역 질환 및 질병 및/또는 증상은, 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예견된다. 특정의 바람직한 일 구체예에서, 류마티스성 관절염이 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방 및/또는 진단된다.
또 다른 특정의 바람직한 구체예에서, 전신 홍반 루푸스가 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방 및/또는 진단된다. 또 다른 특정의 바람직한 구체예에서, 특발성 저혈소판증 자색반병이 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방 및/또는 진단된다.
또 다른 특정의 바람직한 구체예에서, IgA 신장병증이 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방 및/또는 진단된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 인용된 질환 및 질병과 관련된 자가면역 질환 및 질병 및/또는 증상은 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예견된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 면역억제제로서 사용된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 조혈 세포의 질환, 질병 및/또는 증상을 치료, 예방, 예견 및/또는 진단하는 데 유용할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는, 백혈병, 호중성백혈구 감소증, 빈혈 및 저혈소판증을 포함하나 이들에 한정되지 않는 특정 (또는 다수의) 유형의 조혈 세포의 감소와 관련된 그러한 질환, 질병 및/또는 증상을 치료 또는 예방하기 위해, 다기능성 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포의 분화 및 증식을 증가시키는 데 사용될 수 있었다. 대안적으로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는, 조직구증을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 (또는 다수의) 유형의 조혈 세포의 증가와 관련된 그러한 질환, 질병 및/또는 증상을 치료 또는 예방하기 위해, 다기능성 줄기 세포를 포함하는 조혈 세포의 분화 및 증식을 증가시키는 데 사용될 수 있었다.
천식 (특히 알레르기성 천식) 또는 기타 호흡 문제와 같은 알레르기성 반응 및 증상은 또한 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예견될 수도 있다. 또한, 이들 분자는 아나필락시스, 항원 분자에 대한 과민증 또는 세포 그룹 부적합증을 치료, 예방, 예견 및/또는 진단하는 데 사용될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 IgE-매개된 알레르기성 반응을 치료, 예방, 진단 및/또는 예견하는 데 사용될 수도 있다. 그러한 알레르기성 반응에는 이들에 한정되는 것은 아니나, 천식, 류마티스 및 습진이 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 시험관내 또는 생체내에서 IgE 농도를 조절하는 데 사용될 수도 있다.
추가로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 염증 질환을 진단, 예견, 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 염증 반응과 관련된 세포의 활성화, 증식 및/또는 분화를 억제할 수 있기 때문에, 이들 분자는 만성 및 급성 염증 질환을 예방 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 그러한 염증 질환으로는 이들에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 감염과 관련된 염증 (예를 들어, 패혈 쇼크, 패혈증, 또는 전신 염증 반응 증후군), 허혈성 재관류 손상, 내독소 치사, 보체 매개된 초급성 거부반응, 신장염, 사이토킨 또는 케모킨 유발된 폐 손상, 염증성 장 질환, 크론씨 병, 사이토킨 과다 생산 (예를 들어, TNF 또는 IL-1), 호흡 이상 (예를 들어, 천식 및 알레르기); 위장관 질환 (예를 들어, 염증성 장 질환); 암 (예를 들어, 위, 난소, 폐, 방광, 간 및 유방); CNS 질환 (예를 들어, 다발 경화증, 허혈성 뇌 손상 및/또는 중풍, 외상성 뇌 손상, 신경퇴행성 질환 (예를 들어, 파킨슨 병 및 알츠하이머 병); AIDS-관련된 치매; 및 프리온 병); 심혈관 질환 (예를 들어, 죽상 경화증, 심근염, 심혈관 질환, 및 심폐 두름 합병증); 뿐만 아니라 염증으로 특징되는 다수의 부가 질환, 증상 및 질병 (예를 들어, 간염, 류마티스성 관절염, 통풍, 외상, 췌장염, 사르코이드증, 치매, 허혈성-재관류 신장 손상, 갑상선기능 항진증, 전신 홍반 루푸스, 당뇨병 및 동종이식 거부반응)이 있다.
염증은 기본적인 방어 메커니즘이기 때문에, 염증 질환은 사실상 신체의 임의 조직에 대해 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는, 이들에 한정되지 않으나 부신염, 폐포염, 혈관쓸개염, 충수염, 귀두염, 눈꺼풀염, 기관지염, 윤활낭염, 심장염, 연조직염, 자궁경부염, 쓸개염, 성대염, 달팽이염, 결장염, 결막염, 방광염, 피부염, 곁주머니염, 뇌염, 심장뇌막염, 식도염, 귀인두관염, 섬유염, 모낭염, 위점막염, 위장염, 잇몸염, 설염, 간비장염, 각막염, 내이염, 후두염, 림프관염, 유방염, 중이염, 수막염, 자궁근염, 점액염, 심장근육염, 근육염, 고막염, 신장염, 신경염, 고환염, 뼈연골염, 귀염, 심장막염, 힘줄주위염, 복막염, 인두염, 정맥염, 회색질척수염, 전립샘염, 속질염, 망막염, 비염, 자궁관염, 공락맥락막염, 음낭염, 부비동염, 척추염, 지방조직염, 구내염, 윤활막염, 귀인두관염, 건염, 편도염, 요도염 및 질염이 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는, 장기 이식 거부반응 및 이식편-대-숙주병(graft versus host disease)을 진단, 예견, 예방 및/또는 치료하는 데 유용하다.면역 반응을 통한 이식된 조직의 숙주 면역 세포 파괴에 의해 장기 거부 반응이 일어난다. 마찬가지로, 면역 반응은 GVHD와 관련되어 있으나, 이 경우 외래 이식된 면역 세포가 숙주 조직을 파괴시킨다. 면역 반응을 억제, 특히 T 세포를 활성화, 증식, 분화 또는 케모탁싱(chemotaxing)시키는 본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 폴리누클레오티드, 및/또는 이의 효능제 또는 길항제는 장기 거부반응 또는 GVHD를 예방하는 데 있어 효과적인 치료제가 될 수 있다. 특정 구체예에서, 면역 반응을 억제, 특히 T 세포를 활성화, 증식, 분화 또는 케모탁싱시키는 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 실험적인 알레르기성 및 초급성 이종이식 거부반응을 예방하는 데 있어 효과적인 치료제가 될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 혈청병, 연쇄구균 감염후 사구체 신염, 결절다발 동맥염, 및 면역 복합체 유발된 혈관염을 포함하나 이들에 한정되지 않는 면역 복합 질환을 진단, 예견, 예방 및/또는 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 감염체를 치료, 검출 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 증가시킴으로써, 특히 B 및/또는 T 세포의 증식, 활성화 및/또는 분화를 증가시킴으로써, 감염성 질환이 치료, 검출 및/또는 예방될 수 있다. 면역 반응은 현존하는 면역 반응을 증가시키거나 새로운 면역 반응을 개시함으로써 증가될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 면역 반응을 필수적으로 유발시키지 않고, 감염체 (감염체 등이 존재하는 적용 부분을 지칭함)를 직접 억제시킬 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 항원에 대한 면역 반응성을 증강시키는 백신 보조제로서 사용된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 종양 특이적인 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 항-바이러스 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다. 보조제로서 본 발명의 조성물을 이용하여 증강될 수 있는 항-바이러스 면역 반응에는, 본원에 개시되거나 그렇지 않으면 당업계에 공지된 바이러스 및 바이러스 관련된 질환 또는 증상이 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 AIDS, 수막염, 뎅기, EBV 및 간염 (예를 들어, B형 간염)로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이러스, 질환 또는 증상에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HIV/AIDS, 호흡기 세포융합 바이러스, 뎅기, 로타바이러스, B형 일본 뇌염, A형 및 B형 독감, 파라인플루엔자, 홍역, 거대세포 바이러스, 광견병, 쥬닌(Junin), 치쿤군야(Chikungunya), 리프트 밸리 열(Rift Valley fever), 단순 헤르페스 및 황열로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이러스, 질환 또는 증상에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 항-세균 또는 항-진균 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다. 보조제로서 본 발명의 조성물을 이용하여 증강될 수 있는 항-세균 또는 항-진균 면역 반응에는, 본원에 기술되거나 그렇지 않으면 당업계에 공지된 세균 또는 진균, 및 세균 또는 진균과 관련된 질환 또는 증상이 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파상풍, 디프테리아, 보툴리눔 독소증 및 B형 수막염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세균 또는 진균, 질병 또는 증상에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 비브리오 콜레라균, 나병균, 장티푸스균, 파라티푸스균, 뇌수막염균, 폐렴 연쇄구균, B군 연쇄구균, 시겔라 종, 창자독소생성 대장균, 창자출혈 대장균 및 보렐리아균으로 이루어지는 군으로부터 선택된 세균 또는 진균, 질병 또는 증상에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 항-기생충 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다. 보조제로서 본 발명의 조성물을 사용하여 증강될 수 있는 항-기생충 면역 반응에는 본원에 기술되거나 그렇지 않으면 당업계에 공지된 기생충 및 기생충 관련된 질환 또는 증상이 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 기생충에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 열원충 (말라리아) 또는 리슈만 편모충에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 보조제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는, 예를 들어, 단핵 포식세포의 보충 및 활성화를 예방함으로써, 규소폐증, 사르코이드증, 및 특발성 폐 섬유종을 포함하는 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수도 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 본 발명의 폴리펩티드에 대해 면역 매개된 반응을 억제시키거나 증강시키기 위한 항체 생성용 항원으로서 사용된다.
일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 돼지, 초소형 돼지, 닭, 낙타, 염소, 말, 암소, 양, 개, 고양이, 사람을 제외한 영장류 및 사람, 사람이 가장 바람직함)에게 투여되어 하나 이상의 항체 (예를 들어, IgG, IgA, IgM 및 IgE)를 증가된 양으로 생성시키도록 면역 반응을 증강시켜, 그 결과 더욱 높은 친화도의 항체 생산 및 면역글로불린 급 전환 (예를 들어, IgG, IgA, IgM 및 IgE)을 유발시키고/거나 면역 반응을 증가시키게 된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 병원체에 대한 B 세포 반응성의 자극제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 T 세포의 활성화제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 면역억제 치료를 실시하기 전에 개체의 면역 상태를 증가시키는 제제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 보다 높은 친화도의 항체를 유발시키는 제제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 혈청 면역글로불린 농도를 증가시키는 제제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 면역약화된 개체의 회복을 촉진시키는 제조로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 노령화된 집단 및/또는 신생아에서 면역반응성을 증강시키기 위한 제제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 골수 이식 및/또는 기타 이식 (예를 들어, 동종 또는 이종 장기 이식) 전에, 동안에 또는 후에 면역체계 증강제로서 사용된다. 이식에 대해, 본 발명의 조성물은 이식 전에, 이식과 함께 및/또는 이식 후에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 이식 후에, T-세포 집단의 회복이 개시되기 전에 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 먼저, 이식 후, T 세포 집단의 회복이 개시된 후 및 B 세포 집단의 완전 회복 전에 투여된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 B 세포 기능이 후천적으로 손상된 개체 중에서의 면역반응성을 증강시키기 위한 제제로서 사용된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드를 투여함으로써 완화되거나 치료될 수 있는, B 세포의 후천적 기능 손상을 야기하는 증상에는 이들에 한정되는 것은 아니나 HIV 감염, AIDS, 골수 이식, 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)이 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 일시적 면역 결핍증을 지닌 개체 중에서의 면역반응성을 증강시키기 위한 제제로서 사용된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드를 투여함으로써 완화되거나 치료될 수 있는, 일시적 면역 결핍증을 야기하는 증상에는 이들에 한정되는 것은 아니나, 바이러스 (예를 들어, 인플루엔자) 감염으로부터의 회복, 영양실조와 관련된 증상, 감염성 단핵구증으로부터의 회복, 또는 스트레스와 관련된 증상, 홍역으로부터의 회복, 수혈로부터의 회복 및 수술로부터의 회복이 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 단핵구, 수지상 세포 및/또는 B 세포에 의한 항원 전달의 조절제로서 사용된다. 일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 시험관내 또는 생체내에서의 항원 전달을 증강시키거나 항원 전달을 길항시킨다. 또한, 관련된 구체예에서, 항원 전달의 이러한 증강 작용 또는 길항 작용은 항-종양 치료제로서 또는 면역 체계를 조절하는 데 있어 유용할 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 TH1 세포 반응에 반대되는 체액성 반응 (즉, TH2)의 진행에 대해 개체의 면역 체계를 유도하기 위한 제제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 종양의 증식을 유도하여 항-종양제에 대해 더욱 감수성을 띠게 하는 수단으로서 사용된다. 예를 들어, 다발 골수종은 서서히 분할하는 질병이며, 이에 따라 사실상 모든 항-종양 요법에 대해 무반응이다. 이러한 세포가 더욱 신속하게 증식되도록 강요되는 경우, 이들의 감수성 프로파일은 쉽게 변화될 것이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 AIDS, 만성 림프구 질환 및/또는 공통 가변성 면역결핍증과 같은 병리에서 B 세포 생산의 자극제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 수술, 외상 또는 유전적 결함 후의 림프 조직의 생성 및/또는 재생을 위한 치료제로서 사용된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 이식 전에 골수 샘플을 전처리하는 데 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 SCID 환자 중에서 확인된 것과 같은 면역-불완전/면역결핍을 유발시키는 유전병에 대한 유전자 기초 치료제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 리슈만 편모충과 같은 단핵구에 작용하는 기생충에 의한 질병에 대해 방어하도록 단핵구/대식세포를 활성화시키는 수단으로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 유발되는 분비된 사이토킨을 제어하는 수단으로서 사용된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 이들이 수의학 분야에 적용되는 경우에 본원에 기술된 하나 이상의 적용예로 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 외래 물질 또는 자신에 대한 다양한 측면의 면역 반응을 차단하는 수단으로서 사용된다. 요망될 수 있는 특정 일면의 면역 반응의 차단에는 루푸스 및 관절염과 같은 자가면역 질환, 및 피부 알레르기에 대한 면역반응성, 염증, 장 질환, 손상 및 병원체와 관련된 질환/질병이 포함된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오타이드는 특발성 혈소판감소 자색반병, 전신 홍반 루푸스 및 다발 경화증과 같은 자가면역 질환과 관련된 B 세포 증식 및 Ig 분비를 예방하기 위한 치료제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 폴리펩티드, 항체, 폴리누클레오티드 및/또는 효능제 또는 길항제 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 내피 세포에서의 B 및/또는 T 세포 이동의 억제제로서 사용된다. 이러한 활성은 조직 구조 또는 인지 반응을 파괴시키므로, 예를 들어, 면역 반응을 파괴시키고 패혈증을 차단시키는 데 유용하다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 의미 불명 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance: MGUS), 왈덴스트룀 병(Waldenstrom's disease), 관련된 특발 단클론성 감마병증 및 형질세포종과 같은 질병에서 확인되는 만성 고감마글로불린혈증에 대한 치료제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 예를 들어, 특정 자가면역 및 만성 염증 및 감염성 질환에서, 대식세포및 이들의 전구체, 호중구, 호염기구, B 림프구 및 일부 T 세포 서브셋, 예를 들어, 활성화되고 CD8 세포독성을 띠는 T 세포 및 천연 킬러 세포의 폴리펩티드 케모탁시스 및 활성화를 억제하는 데 사용될 수 있다. 자가면역 질환의 예로는 본원에 기술된 것과, 다발 경화증 및 인슐린 의존형 당뇨병이 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한, 예를 들어, 호산구 생산 및 이동을 예방함으로써 특발성 과-호산구 증후군을 치료하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 보체 매개된 세포 용해를 증강시키거나 억제시키는 데 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 항체 의존적인 세포의 세포독성을 증강시키거나 억제시키는 데 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는, 예를 들어, 동맥 벽에서 단핵구 침윤을 예방함으로써 죽상경화증을 치료하기 위해 사용될 수도 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 성인의 호흡곤란 증후군 (ARDS)를 치료하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 상처 및 조직 치유의 자극, 혈관형성의 자극, 및/또는 혈관 또는 림프관 질병 또는 질환의 치유를 자극하는 데 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 점막 표면의 재생을 자극하는 데 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 원발성 또는 후천적 면역결핍증, 결핍된 혈청 면역글로불린 생산, 재발되는 감염, 및/또는 면역 체계 기능이상에 의해 특징되는 질환을 진단, 예견, 치료 및/또는 예방하는 데 사용된다. 또한, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는, 관절, 뼈, 피부 및/또는 귀밑샘의 감염; 혈액 매개 감염 (예를 들어, 패혈증, 수막염, 감염성 관절염 및/또는 골수염); 자가면역 질환 (예를 들어, 본원에 기술된 것들); 염증 질환; 및 암; 및/또는 CVID, 기타 원발성 면역 결핍증, HIV 병, CLL, 재발성 기관지염, 부비동염, 중이염, 결막염, 폐렴, 간염, 수막염, 띠 헤르페스 (예를 들어, 중증 띠 헤르페스), 및/또는 폐포자충을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 이들 감염증, 질병, 질환 및 암과 관련된 임의의 질환 또는 질병 또는 증상;을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 예방, 진단, 예견 및/또는 치료될 수 있는 기타 질환 및 질병에는 HIV 감염, HTLV-BLV 감염, 림프구 감소증, 포식세포 살균 기능이상 빈혈증, 저혈소판증 및 혈색소뇨증을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 공통 가변성 면역결핍증("CVID"; 이것은 또한 "후천적 저감마글로불린 혈증"으로 공지되어 있음) 또는 이들 질환의 서브셋을 지닌 개체를 치료 및/또는 진단하는 데 사용된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 면역 세포 또는 면역 조직 관련된 암 또는 종양을 포함하는 암 또는 종양을 진단, 예견, 예방 및/또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 예방, 진단 또는 치료될 수 있는 암 또는 종양의 예로는 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 호지킨 병, 비호지킨 림프종, 급성 림프구 빈혈증 (ALL), 만성 림프구 백혈병, 형질세포종, 다발골수종, 버킷 림프종, EBV-형질전환 병, 및/또는 본원에서 "과증식 질환"으로 명명된 부분에 기술된 질환 및 질병을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 큰 B-세포 림프종의 세포 증식을 감소시키기 위한 치료제로서 사용된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 만성 골수성 백혈병과 관련된 B 세포 및 Ig의 병발을 감소시키는 수단으로서 사용된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 부분적이거나 전체적으로 비장절제된 개체와 같은 B 세포 면역결핍된 개체 중에서 면역반응성을 증강시키는 제제로서 사용된다.
혈액-관련된 질병
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 지혈 (출혈 억제) 또는 혈전 (혈액 덩어리의 용해) 활성을 조절하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지혈 또는 혈전 활성을 증가시킴으로써, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 혈액 응고 질환, 질병 및/또는 증상 (예를 들어, 무섬유소원혈증, 인자 결핍증, 혈우병), 혈소판 질환, 질병 및/또는 증상 (예를 들어, 저혈소판증), 또는 외상, 수술 또는 기타 요인에 의한 상처를 치료 또는 예방하는 데 사용할 수 있었다. 대안적으로, 지혈 또는 혈전 활성을 감소시킬 수 있는 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 혈액 응고를 억제하거나 혈액 덩어리를 용해시키는 데 사용될 수 있었다. 이들 분자들은 심장 마비 (경색증), 중풍 또는 흉터형성의 치료 또는 예방에 있어 중요할 수 있었다.
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 혈전증, 동맥혈전증, 정맥혈전증, 혈전색전증, 폐혈전색전증, 아테롬경화증, 심근경색증, 일과성허혈발작, 불완전형 협심증을 예방하고, 진단하고, 예측하고, 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 복재이식의 협착을 예방하고, 혈관성형술 과정을 수행하는 경우 말초단계적 혈전증의 위험을 감소시키고, 비류마티스성 세정을 포함하는 심방 세정에 걸린 환자에게서 뇌졸중의 위험을 감소시키고, 기계적 심장 판막 및/또는 판막 질환과 관련된 색전증의 위험을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 대한 다른 용도는 체외 장비(예를 들어, 혈관내 캐뉼라(canulas), 혈액투석 환자의 혈관진입분로, 혈액투석기, 및 심폐기)의 협착을 예방함을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴글레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 혈액 및/또는 본 발명의 폴리펩티드가 발현되는 조직과 관련된 혈액 형성 기관의 질병 및 질환을 예방하고, 진단하고, 예측하고, 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 조혈활성(혈액세포의 형성)을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 혈액세포, 예를 들어 적혈구, 림프구(B 또는 T 세포), 골수세포(예를 들어, 호염기구, 호산구, 호중구, 비만세포, 대식세포) 및 혈소판 모두 또는 서브세트(subset)의 양을 증가시키는데 사용될 수 있다. 혈액세포 또는 혈액세포의 서브세트의 양을 감소시키는 능력은 하기에 기술되는 빈혈 및 백혈구 감소증의 예방, 검출, 진단, 및/또는 치료에 유용할 것이다. 대안적으로는, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 혈액세포, 예를 들어 적혈구, 림프구(B 또는 T 세포), 골수세포(예를 들어, 호염기구, 호산구, 호중구, 비만세포, 대식세포) 및 혈소판 모두 또는 서브세트(subset)의 양을 감소시키는데 사용될 수 있다. 혈액세포 또는 혈액세포의 서브세트의 양을 감소시키는 능력은 백혈구 감소증, 예를 들어 호산구증가증의 예방, 검출, 진단 및/또는 치료에서 유용할 것이다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 혈액 질환(blood dyscrasia)을 예방하거나, 치료하거나 진단하는데 사용될 수 있다.
빈혈은 혈액 중 적혈구의 수 또는 헤모글로빈(산소를 운반하는 단백질)의 양이 정상 미만인 병태이다. 빈혈은 과다출혈, 감소된 적혈구 생산, 또는 증가된 적혈구 파괴(용혈현상)에 의해 야기될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 빈혈을 치료하고, 예방하고, 및/또는 진단하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의한 치료되거나, 예방되거나 진단되는 빈혈은 철결핍 빈혈, 저혈색소성 빈혈, 소적혈구 빈혈, 위황병, 유전성 철적모구성 빈혈, 특발성 면역성 철적모구성 빈혈, 적혈구 무형성, 거대 적아구성 빈혈(예를 들어, 악성 빈혈 (비타민 B12 결핍) 및 엽산 결핍 빈혈), 재생불량성 빈혈, 용혈성 빈혈(예를 들어, 자가면역 용혈성 빈혈, 미세맥관병성 용혈성 빈혈, 및 발작성 야간 혈색소뇨증)을 포함한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 전신성 홍반성 낭창, 암, 림프종, 만성 신장질환, 및 확장된 비장을 포함하나, 이에 제한되지 않는 질환과 관련된 빈혈을 치료하고, 예방하고, 및/또는 진단하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 메틸도파, 다프손, 및/또는 술파약물과 관련된 약물 치료로부터 발생하는 빈혈을 치료하고, 예방하고, 및/또는 진단하는데 유용하다. 추가적으로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 유전성 구상적혈구증, 유전성 타원형 적혈구증, 글루코즈-6-ㅍ스페이트 디하이드로게나제 결핍, 및 겸상적혈구빈혈을 포함하나, 이에 제한되지 않는 비정상적 적혈구 구조와 관련된 빈혈을 치료하고, 예방하고, 및/또는 진단하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 헤모글로빈 이상(abnormality)(예를 들어, 겸상적혈구빈혈, 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 S-C 질환, 및 헤모글로빈 E 질환)을 치료하고, 예방하고, 및/또는 진단하는데 유용할 것이다. 추가적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 알파-탈라세미아 및 베타-탈라세미아의 주형태 및 부형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 탈라세미아를 진단하고, 예측허고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 앤코딩 알부민 융합 단백질은 혈소판감소증(예를 들어, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 및 혈전성 혈소판감소성 자반병), 폰 빌리브란트 병, 유전성 혈소판 질환(예를 들어 체디아크-히가시 증후군 및 헤르만스키-푸들라크 증후군과 같은 기억풀 질환, 트롬복세인 A2 기능장애, 혈소판무력증, 베르나르-술리에 증후군), 용혈성-요독증 증후군, 혈우병 A 또는 인자 VII 결핍과 같은 혈우병, 및 크리스마스 질환 또는 인자 IX 결핍, 렌두 오슬러 웨버 병으로 불리우는 유전성 출혈성 말초혈관 확장증, 알레르기성 자반병(헤노흐-쇤라인 자반증) 및 파종성 혈관내 응고병증을 포함하나, 이제 제한되지 않는 출혈 질환을 진료하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
혈액응고시간에 대한 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질의 효과는 전혈 부분트롬보플라스틴 시간(PTT), 활성 부분트롬보플라스틴 시간(aPTT), 활성 혈액응고시간(ACT), 재석회화된 활성 혈액응고시간, 또는 이-화이트(Lee-White) 혈액응고시간을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 혈액응고시간을 이용하여 모니터링될 수 있다.
여러 질환 및 다양한 약물은 혈소판 기능장애를 야기시킬 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 신장 질환, 백혈병, 다발성 골수종, 간경변증, 및 전신 홍반성 낭창을 수반하는 혈소판 기능이상, 및 아스피린, 티클로피딘, 비스테로이드성 항염증약물(관절염, 통증, 염좌용으로 이용됨), 및 고용량의 페니실린으로의 치료를 포함하는 약물 치료법과 관련된 혈소판 기능장애와 같은 후천성 혈소판 기능장애를 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 증가되거나 감소된 수의 백혈구에 의해 특정되거나 이와 관련된 질병 및 질환을 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다. 백혈병은 백혈구 수가 정상 미만으로 감소되는 경우 발생한다. 백혈병은 호중구감소증 및 림프구감소증을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 정상치와 비교하여 백혈구 수의 증가는 백혈구증가증으로서 알려져 있다. 신체는 감염 동안 증가된 백혈구 수를 발생시킨다. 따라서, 백혈구감소증은 단순하게 감염을 반영한 정상 생리인자일 것이다. 대안적으로는, 백혈구감소증은 상해 또는 암과 같은 다른 질환의 척도일 수 있다. 백혈구감소증은 호산구증가증, 및 대식세포의 촉진을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 백혈구증가증을 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 백혈구증가증을 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
백혈구증가증은 모든 타입의 백혈구의 일반화된 감소를 나타내것나, 특정 타입의 백혈구의 특정 고갈일 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 호중구감소증으로 알려진 호중구 수의 감소를 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의해 진단되고, 예측되고, 예방되고, 및/또는 치료될 수 있는 호중구감소증은 유아성 유전의 무과립세포증, 가족성 호중구감소증, 주기적 호중구감소증, 다이어트 결핍(예를 들어, 비타민 B12 결핍 도는 엽산 결핍)으로부터 초래되거나 이와 관련된 호중구감소증, 약물 치료법(예를 들어, 페니실린 치료, 술폰아미드 치료, 항응고제 치료, 항경련제, 항갑상선 약물, 및 암 화학요법과 같은 항생물질 요법)으로부터 초래되거나 이와 관련된 호중구감소증, 및 일부 박테리아 또는 바이러스 감염, 알레르기성 질병, 자가면역 질환, 개개인이 확장된 비장을 갖는 병태(예를 들어, 펠티 증후군, 말라리아 및 유육종증), 및 일부 약물 치료 요법과 관련하여 발생할 수 있는 증가된 호중구 파괴로부터 초래되는 호중구감소증을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 스트레스, 약물치료(예를 들어, 코르티코스테로이드, 암 화학치료 및/또는 방사선 치료와 함께 약물 치료), AIDS 감염 및/또는 예를 들어 류미티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 만성 감염, 일부 바이러스 감염 및/또는 유전성 질환(예를 들어, 디죠지 증후군, 비스코트올드리치 증후군, 심한 결합된 면역결핍, 혈관확장성 운동실조증)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 림프구감소증(감소된 수의 B 및/또는 T 림프구)를 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 고셰병, 니만피크병, 레테르시베병 및 한트슐러크리스찬병을 포함하나, 이에 제한되지 않는 대식세포 수 및/또는 대식세포 기능과 관련한 지병 및 질환을 진단하고, 예측하고, 예방하고 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 특발성 과호산성 증후군, 호산성-근통증 증후군, 및 한트슐러크리스찬병을 포함하나, 이에 제한되지 않는 호산구 수 및/또는 호산구 기능과 관련한 질병 및 질환을 진단하고, 예측하고, 예방하고 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 급성 림프성 백혈병(ALL), 급성 골수성(골수세포성, 골수원성, 골수아구, 또는 골수단구성) 백혈병, 만성 림프성 백혈병(예를 들어, B 세포 백혈병, T 세포 백혈병, 세자리 증후군, 및 모발세포 백혈병), 만성 골수세포성(골수성, 골수원성, 또는 과립구성) 백혈병, 호치킨 림프종, 비호치킨 림프종, 버킷 림프종, 및 용상식육종을 포함하나, 이에 제한되지 않는 백혈병 및 림프종을 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 형질 세포 질환, 모노클론 감마글로불린장애, 결정되지 않은 유의성의 모노클론 감마글로불린장애, 다발성 골수종, 매크로글로불린혈증, 왈덴스트롬 매크로글로불린혈증, 한냉글로불린혈증, 및 레이노 현상을 포함하나, 이에 제한되지 않는 형질 세포의 질환 및 질병을 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 진성 다혈구증, 비교 적혈구증가증, 이차 적혈구증가증, 골수섬유증, 급성 골수섬유증, 특발성 골수섬유화증, 혈소판증가증(원발 및 이차 적혈구증가증 모두 포함) 및 만성 골수구백혈병을 포함하나, 이에 제한되지 않는 골수증식성 질환을 치료하고, 예방하고, 및/또는 진단하는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 외과수술 전 치료법으로서 혈구 생성을 증가시키는데 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 호중구, 호산구 및 대식세포의 이동, 식세포작용, 초과산화물 생산, 항체 의존 세포독성을 개선시키기 위한 제제로서 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 줄기세포 분리술 전에 줄기세포의 수를 증가시키기 위한 제제로서 사용될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 혈소판 분리술 전에 순환하는 줄기세포의 수를 증가시키기 위한 제제로서 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 시토카인 생성을 증가시키기 위한 제제로서 유용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 원발 조혈질환을 예방하고, 진단하고, 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다.
과다증식성 질환
특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클렝티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 과다증식성 질환을 치료하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 직접 또는 간접 상호작용을 통해 질환의 증식을 억제할 수 있다. 대안적으로는, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 과다증식성 질환을 억제할 수 있는 다른 세포를 증식시킬 수 있다.
예를 들어, 면역 반응을 증가시키고, 구체적으로 과다증식성 질환의 항원양을 증가시키므로써, 또는 T-세포를 증식시키거나, 분화시키거나 이동시키므로써, 과다증식성 질환이 치료될 수 있다. 이러한 면역 반응은 현존하는 면역 반응을 향상시키거나, 신규한 면역 반응을 개시시키므로써 증가될 수 있다. 대안적으로는, 면역 반응의 감소는 화학요법 제제와 같은 과다증식성 질환을 치료하는 방법일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의해 치료되거나 검출될 수 있는 과다증식성 질환의 예로는 대장, 복부, 뼈, 흉부, 소화기 계통, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 안구, 후두, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉곽, 및 비뇨생식기관에 위치하는 신생물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유사하게는, 다른 과다증식성 질환은 또한 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의해 치료되거나 검출될 수 있다. 이러한 과다증식성 질환의 예로는 상기 기관계에 위치한 신생물을 제외하고 급성 소아림프모구백혈병, 급성 림프모구백혈병, 급성 림프구백혈병, 급성 골수백혈병, 부신겉질암종, 성인(원발) 간세포성 암종, 성인(원발) 간암, 성인 급성 림프구백혈병, 성인 급성 골수백혈병, 성인 호치킨병, 성인 호치킨림프종, 성인 림프구백혈병, 성인 비호치킨림프종, 성인 원발 간암, 성인 연조직 육종, AIDS 관련 림프종, AIDS 관련 악성종양, 항문암, 성상세포종, 담관암, 방광암, 골수암, 뇌줄기 신경아교종, 뇌종양, 유방암, 신우 및 수뇨관의 암, 중추신경계 (원발) 림프종, 중추신경계 림프종, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종, 경부암, 유아 (원발) 간세포성 암, 유아 (원발) 간암, 유아 급성 림프모구백혈병, 유아 급성 골수성백혈병, 유아 뇌줄기 신경교종, 유아 소뇌 성상세포종, 유아 대뇌 성상세포종, 유아 두개외 생식세포 종양, 유아 호치킨 질환, 유아 호치킨 림프종, 유아 시상하부 및 시각경로 신경교종, 유아 림프모구백혈병, 유아 속질모세포종, 유아 비호치킨 림프종, 유아 송과체 및 천막위 원시신경외배엽종양, 유아 원발 간암, 유아 횡문근육종, 유아 연조직 육종, 유아 시각경로 및 시상하부 신경교종, 만성 림프구백혈병, 만성 골수백혈병, 대장암, 피부 T-세포 림프종, 내분비성 췌장 소도세포 암종, 자궁내막암, 상의세포종, 상피암, 식도암, 유잉 육종 및 관련된 종양, 외분비성 췌장암, 두개외 생식세포 종양, 고환외 배아세포종양, 간외담관암, 안구암, 여성 유방암, 고셰병, 담낭암, 위암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 종양, 배아세포 종양, 임신성 영양막 종양, 모발세포 백혈병, 후두암, 간세포성 암, 호치킨병, 호치킨 림프종, 감마글로블린증가증, 하인두암, 장암, 안구 흑색종, 소도세포 암종, 소도세포 췌장암, 카포시 육종, 신장암, 후두암, 입술 및 경구암, 간암, 폐암, 림프증식성 질병, 마크로글로블린혈증, 남성 유방암, 악성 중피종, 악성 흉선종, 속질모세포종, 흑색종, 중피종, 전이성 잠복원발 평편경부암, 전이성 원발 편평경부암, 전이성 평편경부암, 다발성 골수종, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 골수 이형성 증후군, 골수원성백혈병, 골수성백혈병, 골수증식성 질환, 비강 및 부비강암, 비인두암, 신경모세포종, 임신중 비호치킨 림프종, 비흑색종 피부암, 비소세포 폐암, 잠재원발 전이성 편평 목암, 입인두암, 골-/악성 섬유 육종, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뼈의 골육종/악성 섬유성 조직구종, 난소상피암, 난소배아세포 종양, 난소 낮은 악성 잠재적 종양, 췌장암, 파라단백혈증, 자색반병, 부갑상선암, 음경암, 크롬친화모세포종, 뇌하수체 종양, 형질세포 신생물/다발성 골수종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 간암, 전립선암, 직장암, 신장세포암, 신장 골반 및 요관암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 사르코이드 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 작은창자암, 연조직 육종, 평판 목암, 위암, 천막위 원시신경외배엽 및 송과체 종양, T-세포 림프종, 고환암, 가슴샘종, 갑상선암, 신장골반 및 요도관의 전이성 세포암, 전이성 신장골반 및 요도관암, 영양막 종양, 요도관 및 신장골반 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 시각경로 및 시상하부 신경아교종, 음문암, 왈덴스트롬 마크로글로불린혈증, 빌름스 종양, 및 임의의 기타 과다증식성 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 상술된 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는 전암성 병태를 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료하며, 이러한 종양 또는 악성 상태로의 진행을 예방하는데 사용된다. 이러한 용도는 신생물 또는 암으로의 전술한 진행으로 알려지거나 의심된느 병태, 구체적으로 증식증, 화생으로 구성된 비신생물 세포 성장, 또는 가장 구체적으로, 형성이상이 발생함에서 지시된다[비정상적 성장 병태의 리뷰; Robbins and Angell, 1976, Bsic Pathology, 2d Ed., W.B.Saunders Co., Philadelphia, pp.68-79].
증식증은 조절된 세포 증식의 형태로서, 구조 또는 기능의 현저한 개조없이, 조직 도는 기관에서 세포의 수의 증가를 수반한다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질로 진단되고, 예측되고, 예방되고 및/또는 치료될 수 있는 증식증 질환은 혈관여포양 종격동 임파선증식증, 호산구증가증을 동반한 혈관 림프관 과형성, 부정형 멜라닌 세포종증식증, 기저세포증식증, 양성 거대림프 임파선증식증, 시멘트질 증식증, 선천부신증식증, 선천피지증식증, 낭종증식증, 유방의 낭종증식증, 의치증식증, 담관증식증, 자궁내막증식증, 섬근육증식증, 국소상피 증식증, 잇몸증식증, 염증섬유 증식증, 염증유두모양 증식증, 혈관내유도모양 내피증식증, 전립선의 결절증식증, 결절재생증식증, 거짓상피종증식증, 노인피지증식증, 및 사마귀모양증식증을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
화생은 조절된 세포 성장의 형태로서, 한가지 타입의 성인 세포 또는 전부 분화된 세포는 다른 형태의 성인세포에 대해 치환한다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질로 진단되고, 예측되고, 예방되고 및/또는 치료될 수 있는 화생 질환은 원인불명골수화생, 아포크린화생, 비정형화생, 자동실질성 화생, 연결조직화생, 상피화생, 장화생, 화생성빈혈, 화생성 골화, 화생성 폴립, 골수화생, 원발성 골수화생, 이차 골수화생, 편형화생, 양막의 편평화생, 및 증상 골수화생을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
형성이상은 종종 암의 선구체이며 주로 상피에서 발견되는데, 개개 세포 균일성 및 세포의 건축 배향의 손실을 포함하는, 비신생물 세포 성장의 가장 무질서한 형태이다. 형성이상 세포는 종종 비정상적으로 거대하며, 진하게 핵을 손상시키며, 다형태로 존재한다. 형성이상은 장기간 조사 또는 염증이 존재하는 경우에 특징적으로 발생한다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질로 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료될 수 있는 형성이상 질환은 무한성 외배엽형성이상, 안면형성이상, 질식 흉부형성이상, 손가락동맥형성이상, 기관지폐형성이상, 대뇌형성이상, 경부형성이상, 연골외배엽성형성이상, 쇄골두개골형성이상, 선천성외배엽형성이상, 두개골간형성이상, 두개카르포타살형성이상, 두개중간뼈형성이상, 상아질형성이상, 골간형성이상, 외배엽형성이상, 사기질형성이상, 뇌-안구형성이상, 형성이상성 골단 반지증, 다발 골간 형성이상, 골간점형성이상, 상피형성이상, 안면디지토생식기관형성이상, 턱의 가족섬유형성이상, 가족백색주름형성이상, 섬유근형성이상, 뼈의 섬유형성이상, 개화성 뼈형성이상, 유전성 신장-망막형성이상, 발한외배엽형성이상, 땀저하외배엽형성이상, 림프구가슴생형성이상, 유방형성이상, 하악안면형성이상, 뼈몸통끝형성이상, 몬디니형성이상, 단일골형성이상, 점막상피형성이상, 다발성 골단형성이상, 안이척추형성이상, 안이지형성이상, 안이척추형성이상, 치원성형성이상, 눈근육하악형성이상, 치근단주위시멘트질형성이상, 다골섬유형성이상, 유사연골발육 척추사지골단형성이상, 망막형성이상, 코중격-안구형성이상, 척추사지골단형성이상, 및 심실방사형성이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질로 진단하고, 예측하고, 예방하고, 및/또는 치료될 수 있는 추가적인 사전-신생물 질환은 악성 이상증식질환(예를 들어, 악성 종양, 섬유낭병태, 조직 비대, 장폴립, 결장폴림 및 식도형성이상), 백혈병, 각화증, 보웬병, 파머스 스킨, 광선입술염, 및 광선각화증을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드가 발현되는 조직과 관련한 질환을 진단하고/거나 예측하는데 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같이 독소 또는 방사활성 동위원소에 결합된 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 본원에서 기술된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 암 및 신생물을 치료하는데 사용될 수 있다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본원에서 기술된 바와 같이 독소 또는 방사활성 동위원소에 결합된 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 급성 골수백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 세포사멸에 영행을 미칠 수 있으며, 그러므로 증가된 세포 생존 또는 세포사멸 억제와 관련된 다수의 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 및/또는 길항제에 의해 진단되고, 예측되고, 예방되고, 및/또는 치료될 수 있는 증가된 세포 생존 또는 세포사멸의 억제와 관련된 질환은 암(예를 들어, 소포림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 및 결장암, 심장 종양, 췌장암, 흑색종, 망막아세포종, 신경교아세포종, 폐암, 장암, 고환암, 위암, 신경모세포종, 점액종, 근종, 림프종, 내피종, 뼈세포종, 파골세포종, 뼈육종, 연골육종, 샘종, 유방암, 전립선암, 카포시육종, 및 난소암을 포함하는 호르몬-의존 종양); 자가면역질환, 예를 들어 다발성 경화증, 쉐그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 담낭 간경변증, 베체트씨병, 크론병, 다발근육염, 전신 홍반루푸스, 및 면역관련 사구체 신염 및 류미티스성 관절염) 및 바이러스 감염(예를 들어, 허프스 바이러스, 폭스 바이러스 및 아데노바이러스), 염증, 이식 대 숙주 질환, 급성 이식거부, 및 만성 이식거부를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질은 암, 구체적으로 상기 기술된 암의 성장, 진행 및/또는 전이를 억제하는데 사용된다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의해 진단되고, 예측되고, 예방되고 및/또는 치료될 수 있는 증가된 세포 생존과 관련된 추가 질환 또는 병태는 백혈병(급성 백혈병(예를 들어, 림프구 백혈병, 급성 골수세표 백혈병(골수모백혈병, 풋골수세포백혈병, 골수단핵구백혈병, 단핵구백혈병, 및 적백혈병을 포함), 및 만성 백혈병(예를 들어 만성 골수세포(과립백혈구)백혈병, 및 만성 림프구백혈병)), 진성적혈구증가증, 림프종(예를 들어, 호치킨병 및 비호치킨병), 다발성골수종, 왈덴스트롬 마크로글로불린 혈증, 중쇄 질환, 및 섬유육종, 점액육종, 지질육종, 연질육종, 골원성육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관상피육종, 육활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡모근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 평편세포 암종, 기저세포 암종, 샘암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두암종, 유듀샘암종, 낭샘암종, 속질암종, 기관지유래암종, 신장세포 암종, 간암, 담즙관 암종, 맥락암종, 고환종, 배아암종, 빌림스 암종, 경부암, 고환종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피 암종, 신경아교종, 별아교세포종, 속질모세포종, 뇌실막세포종, 솔방울샘종, 혈관모세포종, 소리신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함하나 이에 제한되지 않는 암 및 관련된 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의해 진단되고, 예측되고, 예방되고, 및/또는 치료될 수 있는 증가된 세포사멸과 관련된 질환은 AIDS; 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근육무긴장 외측경화증, 색소망막염, 소뇌퇴행 및 뇌종양 또는 종래 관련된 질환); 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 쉐그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 담즙 경화증, 베체트씨병, 크론병, 다발근육염, 전신홍반루푸스, 및 면역관련 사구체신염 및 류마티스성 관절염), 척수형성이상 증후군(예를 들어 무형성 빈혈), 이식 대 숙주 질환, 허혈손상(예를 들어, 심근 감염, 뇌졸중 및 재관류손상에 의해 야기되는 질환), 간손상(예를 들어, 간염관련 간손상, 허혈/재관류손상, 쓸개즙정체(담즙관 손상) 및 간암); 독소-유래 간질환(예를 들어 알코올에 의해 야기되는 질환), 감염 쇼크, 악액질 및 식욕부진을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의해 진단되고, 예측되고 및/또는 치료될 수 있는 과다증식성 질환 및 질병은 간, 복부, 가슴, 소화계, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 가슴샘, 감상샘), 안구, 머리 및 목, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 가슴, 및 요료관에 위치하는 신생물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유사하게는, 다른 과다증식성 질환은 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 엔코딩 알부민 융합 단백질에 의해 진단되고, 예측되고, 예방되고, 및/또는 치료될 수 있다. 이러한 과다증식성 질환의 예로는 신생물이외에 상술된 기관계에 위치하는 고감마글로불린혈증, 림프세포증식질환, 파라단백혈증, 자색반병, 사르코이드증, 세자리병, 왈덴스트롬 마크로글로불린 혈증, 고셰병, 조직구증, 및 임의의 다른 과다증식성 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 바람직한 구체예는, 본 발명에서 사용하고 있는 유전자 치료에 의해, 비정상인 세포의 분할을 억제하기 위한 본 발명의 알부민 융합 단백질을 코드화하고 있는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그들의 단백질 융합 또는 조각들을 사용한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질이 엔코딩된 폴리뉴클레오타이드인 비정상적 증식 세포로의 삽입에 의한 세포 증식 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 비정상적인 증식 세포 또는 세포로 하나 이상의 본 발명의 활성 유전자 카피들을 투여하는 단계를 포함하는 개인의 세포 증식성 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드를 엔코딩하는 DNA 시퀀스를 효과적으로 발현하는 재조합 표현 벡터를 포함하는 DNA 구조물이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA 구조물은 리트로 바이러스 또는 보다 바람직하게는 아데노바이러스(adenoviral) 벡터를 사용하여 처리되도록 하기 위해 세포로 삽입된다(여기서 참조로 되는, G J.Nabel, et.al., PNAS 1999 96: 324-326을 참조). 가장 바람직한 구체예에서, 바이러스의 벡터는 불완전하고, 비증식성 세포로 변형되지 않는, 증식성 세포이다. 또한, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 증식세포 단독, 또는 다른 뉴클레오티드와 조합되고 융합된 증식세포로 삽입되고, 다음에 외부 자극(즉, 마그네틱, 특정의 작은 분자, 화학제 또는 약 투여 등)을 통해 조정될 수 있고, 그 다음 엔코드된 단백질 제품의 표현을 유발하기 위해 상기 폴리뉴클레오티드의 상류 프로모터상에 작용한다. 본 발명의 유용한 치료적 효과와 같은 것은 상기 외부 자극에 근거하여 명백히 조정된다(즉 본 발명의 증가, 감소 또는 억제 발현).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 종양발생성 유전자 또는 항원의 발현을 억제하는데 유용할 수 있다. "종양발생성 유전자의 억제 발현"에 의해 유전자 전사의 억제, 상기 유전자 전사(프리-메시지 RNA)의 파괴, 접합의 억제, 메신저 RNA의 파괴, 단백질의 해독 후 변형의 금지, 단백질의 파괴 또는 단백질의 기본적 기능의 억제가 의도된다.
비정상적인 증식 세포로의 국소 투여에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 제한되지는 않지만, 트랜스 펙션, 전기 천공(electroporation), 셀의 현미 주사(microinjection), 또는 리포좀, 리포펙틴(lipofectin)과 같은 운반체에서, 또는 폴리뉴클레오티드 그대로를 포함하는 당업계에서 알려진 어떠한 방법에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 제한되는 것은 아니지만, 당업계에 알려져 있는 리트로 바이러스 벡터(Gilboa, J. Virology 44: 845(1982); Hocke, Nature 320:275 (1986); Wilson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 3014), 우두 바이러스 시스템(Chakrabarty et al., Mol Cell Biol. 5: 3403 (1985) 또는 다른 효율적인 DNA 전달 시스템(Yates et al., Nature 313: 812(1985))과 같은 알려진 유전자 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 이러한 참조문헌들은 단지 여기서 참조로서 예시된다. 비정상적 분열 및 여분의 분열하지 않은 세포를 특별히 전달하거나 전달 감염하기 위해, 당업계에서 잘 알려진 리트로 바이러스 또는 아데노바이러스(당업계에서 기재된 바와 같고 여기 어디선가 존재하는) 전달 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 호스트 DNA 복제가 통합하는 리트로 바이러스 DNA를 위해 필요하기 때문에, 리트로 바이러스는 그 라이프 사이클이 필요로 하는 리트로 바이러스 유전자의 부족으로 인해 스스로 복제할 수 없게 될 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 위한 리트로 바이러스 전달 시스템의 사용은 상기 유전자를 목표로 하고 비정상적 증식 세포를 구성하고 분열하지 않는 기준 세포를 면하게 한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 내부 기관의 세포 증식성 질환/병 부위, 체강 및 이와 유사한 것들로 상기 병 부위로 직접적으로 주사 주입하는 가이드로 사용되는 영상 장치의 사용에 의해 직접적으로 전달될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 외과 간섭의 시점에서 병 부위로 투여될 수도 있다.
"세포 증식성 질환"은 기관의 어떤 하나 또는 어떤 조합, 텅 빈 구멍 또는 신체 일부에 영향을 미치는 모든 인간 또는 동물의 질병으로 의미되고, 그리고 그것은 유익하든지 해가 되든지 간에 세포, 세포의 군, 또는 조직의 단일 또는 다중의 국소 비정상적 증식을 특징으로 한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 어떤 양이라도 처리되는 세포의 증식에 생물학적 억제 효과를 나타내는 만큼 투여될 수 있다. 더구나, 같은 부위로 동시에 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 투여가 가능하다. "생물학적 억제"는 세포의 증식 또는 성장의 속도가 감소하는 만큼 부분 또는 전체 성장의 억제를 의미한다. 생물학적 억제 용량은 조직 배양에서 악성 또는 비정상적 증식 세포 성장, 동물 및 세포 배양에서의 종양 성장, 또는 당업계에서 일반적으로 알려진 어떤 다른 방법을 목표로 한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 효과를 평가하는 것에 의해 결정될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질이 엔코딩된 폴리뉴클레오티드는 단독으로, 융합 단백질, 또는 여기서 기재된 다른 폴리펩타이드들과 직접적 또는 간접적으로 조합되어, 증식성 세포 오티슈(ortissues)의 혈관 형성을 억제하는데 유용하게 된다. 가장 바람직한 구체예에서, 상기 항 혈관 형성 효과는, 예를 들어, 종양 관련 포식세포와 같은 조혈, 암 특유 세포의 억제를 통하여 간접적으로 달성될 수 있다(여기서 참조로 되는, Joseph IB, et al. J Natl Cancer Inst, 90(21):1648-53 (1998)을 참조).
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질이 엔코딩된 폴리뉴클레오티드는 세포사멸의 유도를 통해 증식 세포 또는 조직을 억제하는데 유용하게 될 수 있다. 이러한 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 사멸-도메인 수용체의 활성에 있어서, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체-1, CD95(Fas/APO-1), TNF-수용체-관련 세포사멸-매개 단백질(TRAMP) 및 TNF-관련 세포사멸-유도 리간드(TRAIL) 수용체-1 및 -2(여기서 참조로 되는, Schulze-Osthoff K, et.al., Eur J Biochem 254(3):439-59 (1998)을 참조)와 같은 증식 세포 또는 조직의 세포 사멸을 유도하도록 직접 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 이러한 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드는 세포사멸을 활성화하는 다른 단백질의 활성 또는 단독 또는 아포토닌(apoptonin), 갈락틴(galectins), 티오레독신, 항염증 단백질(여기서 참조로 되는, Mutat Res 400(1-2):447-55 (1998), Med Hypotheses.50(5):423-33 (1998), Chem Biol Interact. Apr 24 111-112:23-34 (1998), J Mol Med.76(6):402-12 (1998), Int J Tissue React;20(1):3-15 (1998)를 참조)과 같은 작은 분자 약물 또는 보조제와 조합된 단백질들의 발현의 자극을 통한 것과 같은 메커니즘을 통해 세포사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩한 폴리뉴클레오티드는 증식성 세포 또는 조직의 전이를 억제하는데 유용하다. 억제는 직접적으로 이러한 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 투여한 결과, 또는 예를 들어 알파 4 인테그린(integrins)(여기서 참조로 되는, Curr Top Microbiol Immunol 1998;231:125-41을 참조)과 같은 전이를 억제하는 단백질의 발현을 활성화하는 것과 같은 간접적인 방법을 통해 일어날 수 있다. 본 발명의 치료적 효과는 단독 또는 작은 분자 약물 또는 보조제와 조합하여 달성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 포함하는 조성물 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합되고, 결합하고, 또는 연합하는 폴리펩티드가 발현되는 세포를 목표로 하는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 소수성, 친수성, 이온성 및/또는 공유결합을 통해 다른 종류 폴리펩티드, 다른 종류 핵산, 독소 또는 약물의 전구체와 연합될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질은 직접적으로 만약 본 발명의 알부민 융합 단백질이 증식성 항원과 면역원에 반응하기 위해 "접종되거나", 또는 간접적으로, 언급된 항원과 면역원에 있어서 면역성의 응답(예를 들면, 케모카인)을 강화하는 것으로 알려진 단백질 발현의 활성화를 통해 증식세포 또는 조직의 면역원성 및/또는 항원성을 강화하는데 유용하다.
신장 질환
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩한 폴리뉴클레오티드는 신장 시스템의 질환을 치료하고, 억제하고, 진단하고 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물로 진단, 예방, 억제, 및/또는 치료될 수 있는 신장 질환은, 제한되는 것은 아니지만, 신부전, 신장염, 신장의 혈관 질환, 대사 및 선천성 신장질환, 신장의 요로질환, 자가면역병, 경화증 및 탈저, 전해질 불균형, 및 신장암을 포함한다.
본 발명의 조성물로 진단, 예방, 억제, 및/또는 치료될 수 있는 신장 질환은, 제한되는 것은 아니지만, 급성 신부전, 만성 신부전, 죽종성색전 신부전(atheroembolic renal failure), 말기 신장 질환, 신장의 염증 질환(예를 들면, 급성 사구체 신장염, 감염후 사구체신염, 급속진행성 사구체신염, 신증후군, 막증식성 사구체신염, 가족성 신증후군, 막증식성 사구체신염 I 및 II, 혈관간세포증식 사구체신염, 만성 사구체신염, 급성 세뇨관간질신염, 만성 세뇨관간질신염, 급성 연쇄구균감염후 사구체신염(PSGN), 신우신염, 루푸스 신장염, 만성 신장염, 간질 신장염(interstitial nephritis), 및 급성 연쇄구균감염후 사구체신염), 신장의 혈관 질환(예를 들면, 신장 경색 형성, 죽종성색전(atheroembolic) 신장 질환, 피질 탈저, 악성 신장경화증, 신장 정맥 혈전증, 신장 저관류(underperfusion), 신장 망막증, 신장 허혈-재관류(renal ischemia-reperfusion), 신장 동맥 색전증, 및 신동맥 협착), 및 신장 질환의 결과로 생기는 요로 질환(예를 들면, 신우신염, 수신증, 요석증(신장 담석증, 신석증), 역류성 신병증, 요로 감염, 요축적, 및 급성 또는 만성 한쪽 폐쇄성 요로병증)을 포함한다.
또한, 본 발명의 조성물은 대사 및 선천성 신장질환(예를 들면, 요독증, 신성 아밀로이드증, 신성 골이영양증, 신성 관형 아시도시스, 신 글루코스뇨, 신성 요붕증, 시스틴뇨, 팬코니 증후군, 신장 섬유 골화증(renal fibrocystic osteosis)(신성 구루병), 하아트눕병(Hartnup disease), 밴터 증후군(Banter's syndrome), 리들 증후군(Liddle's syndrome), 다낭신 병, 수질 낭성 신장, 수질성 해면신, 알포트 증후군(Alport's syndrome), 조갑 슬개골 증후군(nail-patella syndrome), 선천적인 신증후군, 크러쉬(CRUSH) 증후군, 마제형신, 당뇨병성 신증, 신성 요붕증, 진통제인성 신병증, 신장 결석, 및 막성 신증), 및 신장의 자가면역병(예를 들면, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 굿패스처 증후군, IgA 신병증, 및 1 gM 혈관간 세포증식성 사구체신염)을 진단, 예방, 억제, 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 신장의 괴사 질환(예를 들면, 사구체경화증, 당뇨병성 신증, 국소분절 사구체경화증(FSGS), 괴사 사구체신염, 및 신 유두 괴사), 신장암(예를 들면, 신종, 하이페메프로마(hypemephroma), 신모세포종, 신장 세포암, 변형 세포암, 신선암, 편평세포암, 및 윌름 종양(Wilm's tumor)), 및 전해질 불균형(예를 들면, 신석회증, 농뇨, 부종, 수신장염(hydronephritis), 단백뇨, 저나트륨혈증, 하이페마트레미아(hypematremia), 저칼륨혈증, 고칼륨혈증, 저칼슘혈증, 고칼슘 혈증, 저인산혈증, 및 과인산혈증)을 진단, 예방, 억제, 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 제한되는 것은 아니지만, 전달 사이트에서의 직접적인 바늘 주입, 정맥 주사, 국소 투여, 도관 주입, 바이오리스틱(biolistic) 주사기, 입자 액셀러레이터, 젤폼 스폰지 데포, 다른 시판되는 데포 물질, 삼투 펌프, 경구 또는 좌약식 고체 제형, 수술하는 동안 따르거나 국소 적용, 에어로졸 전달을 포함하여 당업계에서 알려진 어떤 방법이든지 사용하여 투여할 수 있다. 어떤 방법들은 당업계에서 알려져 있다. 본 발명의 조성물은 하기에서 더욱 자세하게 설명되는 것처럼 치료적인 양의 부분으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법들은 여기서 더욱 자세하게 기술된다.
심혈관 질환
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩한 폴리뉴클레오티드는 제한되는 것은 아니지만, 사지 허혈과 같은 말초 동맥 질환을 포함하는 심혈관 질환을 치료하고, 억제하고, 진단하고 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
심혈관 질환에는, 제한되는 것은 아니지만, 동맥-동맥 누공, 동정맥루, 뇌 동정맥 기형, 선천성 심장 결함, 폐동맥폐쇄, 및 신월도 증후군과 같은 심혈관 이상을 포함한다. 선천성 심장 결함은, 제한되는 것은 아니지만, 대동맥 축착, 삼방심, 심장동맥 혈관의 기형, 십자형 심장, 우심증, 동맥관개존, 에브스타인 기형, 아이젠멩거(Eisenmenger) 복합체, 좌심실 형성부전 증후군, 좌심증, 팔로사징후, 대혈관전위증, 양대 혈관 우실 기시증, 삼첨판 폐쇄, 동맥간 잔존, 및 대동맥 폐동맥 중격 결손, 심내막상 심실결손, 루템바커(Lutembacher's)의 증후군, 팔로삼징후(trilogy of fallot), 심실 심중격결손과 같은 심중격결손을 포함한다.
심혈관 질환은 또한, 제한되는 것은 아니지만, 부정맥, 카르시노이드 심장병, 높은 심장 출력, 낮은 심장 출력, 심낭 압전, 심내막염(박테리아를 포함하는), 심장 동맥류, 심장 정지, 충혈성 심부전, 울혈성 심근증, 발작성 호흡곤란, 심장의 부종, 심장 비대, 울혈성 심근증, 왼쪽 심실의 비대, 오른쪽 심실의 비대, 경색후 심장결손, 심실 중격결손, 심장 판막증, 심근 질환, 심근 허혈, 심낭의 유출, 심낭염(협착성과 결핵성을 포함하는), 심막기종, 심막절개후 증후군, 폐의 심장병, 류머티스성 심장병, 심실 기능 부전, 충혈, 심혈관의 임신 합병증, 신월도 증후군, 심혈관 매독, 및 심혈관 결핵과 같은 심장 질환을 포함한다.
부정맥은, 제한되는 것은 아니지만, 동부정맥, 심방세동, 심방 조동, 서맥, 기외수축, 아담스 스톡스 증후군, 다발-가지 블록, 동방차단, 긴 QT 증후군, 부수축, 론-가농-레빈(Lown-Ganong-Levine) 증후군, 마하임 타입(Mahaim-type) 전자극 증후군, 울프-파킨슨-화이트 증후군, 아픈 공동 증후군, 심박 급속증, 및 심실 연축을 포함한다. 심박 급속증은 발작성 빈맥, 상실성 빈맥증, 가속 자발성 심실 율동, 방실 결절 재입 심박 급속증, 이소성 심방성 빈맥, 이소성 경계 심박 급속증, 동방 결절 재입 심박 급속증, 공동 심박 급속증, 토사데 드 포인트(Torsades De Pointes), 및 심실 심박 급속증을 포함한다.
심장 판막증은, 제한되는 것은 아니지만, 대동맥판 기능저하, 대동맥판 협착, 심장 잡음, 대동맥판 일탈, 승모판 탈출증, 삼첨판 탈출증, 승모판 폐쇄부전증, 승모판 협착증, 폐동맥폐쇄, 폐동맥판 폐쇄부전, 폐동맥판 협착, 삼첨판 폐쇄, 삼첨판 기능저하, 및 삼첨판 협착증을 포함한다.
심근 질환은, 제한되는 것은 아니지만, 알코올성 심근병증, 울혈성 심근증, 비후형 심근병증, 대동맥 판막하부 협착, 폐의 판막하부 협착, 제한성 심근병증, 샤가스(Chagas) 심근병증, 심내막섬유 탄성증, 심근심내막 섬유증, 킴스(Keams) 증후군, 심근 재관류 손상, 및 심근염을 포함한다.
심근 허혈은, 제한되는 것은 아니지만, 협심증, 관상 동맥류, 관상 동맥 경화, 관상 혈전증, 관상 혈관 경축, 심근 경색, 및 심근 스터닝(stunning)과 같은 관상 질환을 포함한다.
심혈관 질환도, 동맥류, 혈관 이형성증, 혈관종증, 간균의 혈관종증, 히펠-린다우(Hippel-Lindau) 병, 클리펠-트레나우네이-웨버(Klippel-Trenaunay-Weber) 증후군, 스터지-웨버(Sturge-Weber) 증후군, 혈관 신경성 부종, 대동맥 병, 다카야스 동맥염, 대동맥염, 레리체(Leriche) 증후군, 두개강내동맥폐쇄성 질환, 동맥염, 내동맥염(enarteritis), 결절성 다발성 동맥염, 뇌혈관 장애, 당뇨병성 맥관장애, 당뇨병성 망막증, 혈전증, 홍색사지통증, 치질, 간정맥폐쇄성 질환, 고혈압, 저혈압, 허혈, 말초혈관질환, 정맥염, 폐정맥폐색성 질환, 레이노병, 크레스트 증후군, 망막정맥 폐색, 신월도 증후군, 상대정맥 증후군, 말초혈관확장증, 실조 말초혈관확장증, 유전성 출혈 혈관확장, 정계정맥류, 하지 정맥류, 정맥류성 궤양, 혈관염, 및 정맥 기능부전과 같은 혈관질환을 포함한다.
동맥류는, 제한되는 것은 아니지만, 박리 동맥류, 거짓 동맥류, 감염된 동맥류, 찢긴 동맥류, 대동맥 동맥류, 뇌 동맥류, 관상 동맥류, 심장 동맥류, 및 엉덩 동맥류를 포함한다.
두개강내동맥폐쇄성 질환은, 제한되는 것은 아니지만, 동맥 경화, 간헐성 파행, 경동맥 협착, 섬유근성 형성장애, 창자간막 혈관 폐색, 모야모야병, 신장의 동맥 장애, 망막의 동맥 폐색, 및 폐쇄성 혈전혈관염을 포함한다.
뇌혈관 장애는, 제한되는 것은 아니지만, 경동맥 질환, 뇌의 아밀로이드 혈관병증, 뇌의 동맥류, 대뇌 무산소증, 뇌동맥 경화, 뇌 동정맥 기형, 뇌의 동맥병, 뇌의 색전증 및 혈전증, 경동맥 혈전증, 공동 혈전증, 왈렌버그(Wallenberg) 증후군, 뇌출혈, 경막외혈종, 경막하혈종, 거미막밑 출혈, 뇌경색, 뇌허혈(일과성을 포함), 쇄골하동맥도류증후군, 뇌실 백질연화증(periventricular leukomalacia), 혈관성 두통, 군발 두통, 편두통, 및 척추골 뇌저동맥(기능)부전증을 포함한다.
색전증은, 제한되는 것은 아니지만, 공기 색전증, 양수 색전증, 콜레스테롤 색전증, 푸른 발가락 증후군, 지방 색전증, 폐색전증, 항문 혈전색전증(ano thromboembolism)을 포함한다. 혈전증은, 제한되는 것은 아니지만, 관상동맥 혈전증), 간정맥 혈전증, 망막정맥 폐색, 경동맥 혈전증, 공동 혈전증, 왈렌버그(Wallenberg) 증후군, 및 혈전성정맥염을 포함한다.
허혈성 질환은, 제한되는 것은 아니지만, 뇌허혈, 허혈성 대장염, 컴파트먼트(compartment) 증후군, 앞 컴파트먼트 증후군, 심근 허혈, 재관류 손상, 및 말초사지빈혈을 포함한다. 혈관염은, 제한되는 것은 아니지만, 대동맥염, 동맥염, 베체트 증후군, 척-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 피부점막림프절증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 과민증 혈관염, 쇼엘렌-헤녹(Schoenlein-Henoch) 자반병, 알레르기성 피부 혈관염, 및 베게너 육아종증을 포함한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩한 폴리뉴클레오티드는, 제한되는 것은 아니지만, 전달 사이트에서의 직접적인 바늘 주입, 정맥 주사, 국소 투여, 도관 주입, 바이오리스틱(biolistic) 주사기, 입자 액셀러레이터, 젤폼 스폰지 데포, 다른 시판되는 데포 물질, 삼투 펌프, 경구 또는 좌약식 고체 제형, 수술하는 동안 따르거나 국소 적용, 에어로졸 전달을 포함하여 당업계에서 알려진 어떤 방법이든지 사용하여 투여할 수 있다. 어떤 방법들은 당업계에서 알려져 있다. 본 발명의 조성물은 하기에서 더욱 자세하게 설명되는 것처럼 치료적인 양의 부분으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법들은 여기서 더욱 자세하게 기술된다.
호흡기 장애
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 호흡기 계통의 질병 및/또는 장애를 치료, 예방, 진단 및/또는 예후하기 위해 사용될 수 있다.
호흡기 계통의 질병 및 장애로는 비제한적으로 코 전정염, 비알레르기성 비염 (예를 들어, 급성 비염, 만성 비염, 위축 비염, 혈관운동 비염), 코 폴립(nasal polyp), 및 부비동염, 청소년 혈관섬유종, 코암 및 청소년 유두종, 성대 폴립, 결절 (가수 성대결절), 접촉성 궤양, 성대 마비, 후두낭종, 인두염 (바이러스 및 세균), 편도염, 편도 연조직염, 인두위턱 농양, 후두염, 후두낭종, 및 인후암 (예를 들어, 코인두암, 편도암, 후두암), 폐암 (예를 들어, 편평세포암, 소세포(small cell) (귀리 세포) 암종, 거대 세포(large cell) 암종, 및 선암종), 알레르기성 장애 (호산성 폐렴, 과민성 페렴 (예를 들어, 외인성 알레르기 페포염, 알레르기 간질 폐렴, 유기 먼지 진폐증, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 천식, 베게너(Wegener) 육아종증 (육아종 혈관염), 굿패스쳐(Goodpasture) 증후군), 폐렴 (예를 들어, 세균성 폐렴 (예를 들어, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) (폐렴구균성 폐렴), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (포도상구균성 폐렴), 그램-음성 세균성 폐렴 (예를 들어,클레브시엘라 종(Klebsiella spp .) 및 슈도마스 종(Pseudomas spp .)에 의해 유발됨), 미코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae) 폐렴, 헤모필루스 인플루엔자 폐렴, 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) (레지오넬라 질병), 및 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) (앵무새병)), 및 바이러스성 폐렴 (예를 들어, 인플루엔자, 수두 (varicella)가 있다.
호흡기 계통의 추가의 질병 및 장애는 비제한적으로 세기관지염, 소아마비 (회색질척수염), 크룹(croup), 호흡기 합포체 바이러스 감염, 볼거리, 감염 홍반 (제 5 병), 영아 장미진, 진행성 루벨라(rubella) 범뇌염, 풍진(german measles), 및 아급성 경화성 범뇌염), 진균성 폐렴 (예를 들어, 히스토플라스마증(Histoplasmosis), 콕시디오이데스진균증(Coccidioidomycosis), 분아균증(Blastomycosis), 면역계가 극심하게 억제된 사람에서의 진균 감염 (예를 들어, 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)에 의해 야기된 크립토콕쿠스증; 아스페르길루스 종(Aspergillus spp .)에 의해 야기되는 아스페르길루스증; 칸디다(Candida)에 의해 야기되는 칸디다증; 및 털곰팡이증)), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii) (뉴모시스티스 폐렴), 비정형 폐렴 (예를 들어, 미코플라스마 종(Mycoplasma spp.) 및 클라미디아 종(Chlamydia spp.)), 기회 감염 폐렴, 원내 폐렴, 화학적 폐렴, 및 흡인 폐렴, 흉막 장애 (예를 들어, 흉막염, 흉막 삼출, 기흉 (단순 자발성 기흉, 복합 자발성 기흉, 긴장성 기흉)), 기도 폐색 질병 (예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐질병 (COPD), 폐기종, 만성 및 급성 기관지염), 직업성 폐 질병 (예를 들어, 규소폐증, 탄진폐(black lung) (광부의 진폐증), 석면증, 베릴륨증, 직업성 천식, 면폐증, 및 양성 진폐증), 침윤성 폐 질병 (예를 들어, 폐섬유증 (예를 들어, 경화성 폐포염, 일반적인 간질 폐렴), 특발성 폐 섬유증, 박리성(desquamative) 간질 폐렴, 림프 간질 폐렴, 조직구증 X (예를 들어, 레터러-시웨(Letterer-Siwe) 질병, 핸드-슐러-크리스찬(Hand-Schuller-Christian ) 질병, 호산성 육아종), 특발성 폐 헤모시데린증, 사르코이드증 및 폐포 단백증), 급성 호흡 곤란 증후군 (또한, 성인성 호흡 곤란 증후군으로도 일컬어짐), 부종, 폐 색전증, 기관지염 (바이러스, 세균), 기관지확장증, 무기폐, 폐 농양 (예를 들어, 스태필로코커스 아우레우스 또는 레지오넬라 뉴모필라에 의해 야기됨), 및 낭 섬유증(cystic fibrosis)이 있다.
항-혈관형성 활성
혈관형성의 내인성 자극제와 억제제 사이의 자연적 균형은 억제성 영향이 우세한 것이다 (Rastinejad et al ., Cell 56:345-355 (1989)). 신생혈관형성이 창상 치유, 기관 재생, 배아 발생 및 여성 생식 작용과 같은 정상적인 생리학적 조건하에서 일어나는 드문 경우, 혈관형성은 엄격히 조절되며, 공간적 및 시간적으로 제약을 받는다. 고형 종양 성장을 특성화하는 것과 같은 병리학적 혈관형성의 조건하에서, 이러한 조절성 제어는 실패한다. 조절되지 않은 혈관형성은 병적인 것이 되어, 다수의 신생물성 및 비-신생물성 질병의 진행을 지속시킨다. 다수의 심각한 질병이 비정상적 신생혈관형성에 의해 지배되며, 이러한 질병으로는 고형 종양 성장 및 전이, 관절염, 일부 유형의 안구 장애 및 건선이 있다 [참조: Moses et al ., Biotech. 9:630-634 (1991); Folkman et al ., N. Engl . J. Med ., 333:1757-1763 (1995); Auerbach et al ., J. Microvasc . Res . 29:401-411 (1985); Folkman, Advances in Cancer Research, eds. Klein and Weinhouse, Academic Press, New York, pp. 175-203 (1985); Patz, Am . J. Opthalmol . 94:715-743 (1982); 및 Folkman et al ., Science 221:719-725 (1983)]. 다수의 병리학적 조건에서, 혈관형성 작용은 질병 상태에 기여한다. 예를 들어, 고형 종양의 성장이 혈관형성에 의존적임을 제시하는 상당한 데이터가 축적되어 있다 (Folkman and Klagsbrun, Science 235:442-447 (1987)).
본 발명은 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 투여함으로써 신생혈관형성과 관련된 질병 또는 장애의 치료를 제공한다. 본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드, 또는 효능제 또는 길항제에 의해 치료될 수 있는 악성 및 전이성 질환으로는 비제한적으로 악성종양, 고형 종양, 및 본 명세서에 기재된 암 및 기타 당 분야에 공지된 것들을 포함한다 (이러한 장애의 개관에 대해서는, 문헌 (Fishman et al ., Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1985))을 참조하라). 따라서, 본 발명은 혈관형성 관련 질병 및/또는 장애의 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 투여하는 것을 포함하여, 혈관형성 관련 질병 및/또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 암 또는 종양을 치료적으로 처리하기 위해 다양한 추가의 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료될 수 있는 암으로는 비제한적으로 전립선, 폐, 유방, 난소, 위, 췌장, 후두, 식도, 고환, 간, 귀밑샘, 담관, 결장, 직장, 자궁경부, 자궁, 자궁내막, 신장, 방광, 갑상선암을 포함하는 고형 종양; 원발성 종양 및 전이; 흑색종; 아교모세포종; 카포시 육종; 평활근육종; 비-소세포 폐암; 결장직장암; 진행된 악성종양; 및 혈액성 종양, 예를 들어 백혈병이 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 피부암, 두경부 종양, 유방 종양 및 카포시 육종과 같은 암을 치료하기 위해 국부적으로 전달될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 예를 들어 방광내 투여에 의해 표재형 방광암을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 주사 또는 카테터에 의해 종양내로 직접 전달되거나 종양 부위의 근처에 전달될 수 있다. 물론, 당업자에게 인식될 것이지만, 적절한 투여 방식은 치료하고자 하는 암에 따라 달라질 것이다. 다른 전달 방식이 본 명세서에 논의되어 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 암 이외에 혈관형성을 포함하는 그 밖의 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 이러한 장애로는 비제한적으로 양성 종양, 예를 들어 혈관종, 청각 신경종(acoustic neuroma), 신경섬유종, 트라코마, 및 화농 육아종; 죽상경화성 플라크; 안구 혈관형성 질병, 예를 들어 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증, 황반 변성, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 수정체뒤 섬유증식, 피부홍조, 망막모세포증, 눈의 포도막염(uveitis) 및 테리기아(Pterygia) (비정상적 혈관 성장); 류마티스 관절염; 건선; 지연된 창상 치유; 자궁내막증; 혈관신생; 육아; 비대 흉터 (켈로이드); 불유합 골절; 피부경화증; 트라코마; 혈관 유착; 심근 혈관형성; 관상 측부; 뇌 측부; 동정맥 기형; 허혈성 사지 혈관형성; 오스터-웨버(Oster-Webber) 증후군; 플라크 신생혈관형성; 모세혈관확장증; 혈우병환자 관절; 혈관섬유종; 섬유근육 형성이상; 창상 육아; 크론병; 및 죽상경화증이 있다.
예를 들어, 본 발명의 한 가지 양태에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 비대 흉터 또는 켈로이드에 투여하는 단계를 포함하여 비대 흉터 및 켈로이드를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 비대 흉터 또는 켈로이드 병변의 진행을 억제하기 위해 비대 흉터 또는 켈로이드내로 직접 주입된다. 이러한 요법은 비대 흉터 및 켈로이드 (예를 들어, 범(bum))을 발생시키는 것으로 알려져 있는 질환의 예방적 처리에서 특히 가치를 지니며, 바람직하게는 증식기가 진행되도록 하는 시간이 지난 후 (최초 손상 후 약 14일째)이지만 비대 흉터 또는 켈로이드 발생 전에 개시된다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 예를 들어 각막 신생혈관형성, 신생혈관 녹내장, 증식성 당뇨병성 망막병증, 수정체뒤 섬유증식 및 황반 변성을 포함하는 눈의 신생혈관 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료될 수 있는 신생혈관형성과 관련될 안구 장애로는 비제한적으로 신생혈관 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 망막모세포종, 수정체뒤 섬유증식, 포도막염, 미숙아 망막병증, 황반 변성, 각막 이식 신생혈관형성 뿐만 아니라 다른 눈 염증 질병, 안구 종양 및 맥락막 또는 홍채 신생혈관형성과 관련된 질병이 있다 [참조: Waltman et al ., Am . J. Ophthal . 85:704-710 (1978) 및 Gartner et al ., Surv . Ophthal . 22:291-312 (1978)]
따라서, 본 발명의 한 가지 양태에서, 혈관의 형성이 억제되도록 환자의 각막에 치료적 유효량의 화합물 (예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드)을 투여하는 단계를 포함하여, 각막 신생혈관형성 (각막 이식 신생혈관형성을 포함함)과 같은 눈의 신생혈관 질병을 치료하는 방법이 제공된다. 요약하면, 각막은 일반적으로 혈관이 없는 조직이다. 그러나, 특정한 병리학적 조건에서, 모세혈관이 가장자리의 각막주위 혈관 얼기로부터 각막내로 신장될 수 있다. 각막에 혈관형성이 되는 경우, 이는 또한 혼탁하게 되어, 환자의 시력을 저하시킨다. 각막이 완전히 혼탁해진 경우 시력 손실이 완전해질 수 있다. 예를 들어 각막 감염 (예를 들어, 트라코마, 단순 포진 각막염, 리슈만편모충증 및 회선사상충증), 면역학적 작용 (예를 들어, 이식 거부 및 스티븐스-존슨 증후군), 알칼리 화상, 외상, 염증 (임의의 원인에 의함), 독성 및 영양 결핍 상태를 포함하는 광범위하게 다양한 장애가 각막 신생혈관형성을 일으킬 수 있고, 이러한 장애는 콘택트렌즈 착용으로 인한 합병증으로서 일어날 수 있다.
본 발명의 특정 바람직한 구체예에서, 염수 내의 국소 투여용(안구 조제에서 통상적으로 사용되는 임의의 보존제 및 항미생물제와 함께 조합됨)으로 제조될 수 있고, 점안약 형태로 투여될 수 있다. 용액 및 현탁액은 이의 순수한 형태로 제조될 수 있고, 매일 수회로 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 기술된 바와 같이 제조된 항-혈관형성 조성물이 또한 각막에 직접적으로 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항-혈관형성 조성물은 각막에 결합하는 점막-점착 중합체와 함께 제조된다. 추가의 구체예에서, 항-혈관형성 인자 또는 항-혈관형성 조성물은 통상적인 스테로이드 요법에 대한 보조약으로 사용될 수 있다. 국소 요법이 또한 혈관형성 반응(예를들어, 화학적 범(bum))을 유도할 가능성이 높은 것으로 공지된 각막 병변에 예방적으로 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 아마 스테로이드와 조합되는 치료는 차후의 합병증을 예방하는데 직접적으로 도움을 줄 수 있을 것이다.
기타 구체예에서, 상기 기술된 화합물은 현미경 인도하에 안과의에 의해 각막 간질로 직접적으로 주사될 수 있다. 주사의 바람직한 부위는 개체 병변의 형태에 따라 다양할 것이나, 투여의 목표는 혈관구조(즉, 혈관 및 정상 각막 사이의 산재된 것)의 발달 전에 조성물을 배치시키는 것이다. 대부분의 경우, 이는 혈관 발달로부터 각막을 "보호"하기 위해 변연전 각막 주사를 포함할 것이다. 이 방법은 또한 각막 신생혈관증식을 예방적으로 방지하게 위해 각막 손상 후 단기간 사용될 수 있다. 이 상황에서, 물질은 각막 병변 및 이의 요망되지 않는 잠재적 대뇌 변연계 혈액 공급 사이에 산재된 변연전 각막에 주사될 수 있다. 이러한 방법은 또한 이식된 각막의 모세관 침입을 방지하기 위해 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 지효성 방출 형태에서, 주사는 1년에 2-3회만을 요한다. 스테로이드가 또한 주사 그 자체로부터 생성되는 염증을 감소시키기 위해 주사 용액으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 환자에게 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 치료적 유효량을 안구에 투여하여, 혈관의 생성이 억제되는 단계를 포함하는 신생혈관 녹내장을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 화합물은 신생혈관 녹내장의 조기 형태를 치료하기 위해 안구에 국소적으로 투여될 수 있다. 기타 구체예에서, 화합물은 전방각의 영역으로 주사에 의해 주입될 수 있다. 기타 구체예에서, 화합물은 또한 화합물이 방수로 지속적으로 방출되는 임의의 위치로 배치될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 환자에게 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 치료적 유효량을 안구에 투여하여 혈관의 생성이 억제되는 단계를 포함하는 증식성 당뇨망막병증을 치료하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 특정의 바람직한 구체예에서, 증식성 당뇨망막병증은 망막에서의 폴리누클레오티드, 폴리펩티드, 길항제 및/또는 효능제의 국소적 농도를 증가시키기 위해 방수 또는 유리체로 주사에 의해 치료될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 치료는 광응고를 요하는 심각한 질병의 취득 전에 개시되어야 한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 환자에게 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 치료적 유효량을 안구에 투여하여 혈관의 생성이 억제되는 단계를 포함하는 수정체후부섬유증식증을 치료하는 방법이 제공된다. 화합물은 유리체내 및/또는 안내 이식물을 통해 투여될 수 있다.
추가로, 본 발명의 융합 단백질 및/도는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료될 수 있는 장애는 혈관종, 관절염, 건선, 혈관섬유종, 죽상경화판, 지연 상처 치유, 과립화, 혈우병성 접합부, 비후성 반흔, 불유합 골절, 오셔-웨버 증후군(Osier-Weber syndrome), 화농육아종, 공피증, 트라코마, 및 관 유착을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료, 예방, 진단, 및/또는 예측될 수 있는 장애 및/또는 상태는 혈액 유래 종양, 예를들어 백혈병, 종양 전이, 카포시 육종, 양성 종양, 예를들어 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마, 및 화농육아종, 류마티스 관절염, 건선, 안구 혈관형성 질병, 예를들어 당뇨망막병증, 미숙아망막병증, 황반 변성, 각막 이식 거부, 신행혈관 녹내장, 수정체후섬유증식, 피부홍조, 망막모세포종, 및 포도막염, 지연 상처 치유, 자궁내막증, 혈관형성, 과립화, 비후성 반흔(켈로이드), 불유합 골절, 공피증, 트라코마, 관 유착, 심근 혈관형성, 심장동맥 측부, 대뇌 측부, 동정맥 기형, 허혈 사지 혈관형성, 오셔-웨버 증후군, 플라크 혈관신생, 모세혈관확장, 혈우병 접합부, 혈관섬유종 섬유근육 형성이상, 상처 과립화, 크론병, 죽상경화증, 배아 착상 조절 월경에 필요한 혈관형성을 방지에 의한 산아제한제, 병리학적 예후, 예를들어 묘소병(Rochele minalia quintosa), 궤양(Helicobacter pylori)으로서 혈관형성을 지니는 병, 바르토넬라증 및 세균성혈관종증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
산아 제한 방법의 한 양태에서, 배아 착상을 블로킹하기에 충분한 화합물의 양이 성교 및 수정이 발생하기 전 또는 후에 투여되어, 산아 제한의 효과적인 방법, 혹은 "모닝 애프터(morning after)" 방법을 제공한다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 월경을 조절하기 위해 사용되거나, 복막내 세척액 또는 자궁내막증의 치료에서의 복막 이식을 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 봉합 육아종을 예방하기 위해 외과술 봉합사로 혼합될 수 있다.
*본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 광범위한 외과적 처치에 사용될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 한 양태에서, 조성물(예를들어, 스프레이 또는 필름 형태)은 악성 조직으로부터 정상적인 주위 조직을 단리시키고/거나 주위 조직으로의 질병의 확산을 예방하기 위해, 종양의 제거 전에 그 부위를 코팅하거나 분무하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 기타 양태에서, 조성물(예를들어, 스프레이의 형태)은 종양을 코팅하거나 요망되는 장소의 혈관형성을 억제하기 위해 내시경 처치를 통해 전달될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 항-혈관형성 조성물로 코팅된 외과용망이 외과용망이 사용되어야 하는 임의의 과정에서 사용될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 한 구체예에서, 항-혈관형성 조성물이 적재된 외과용망은 구조를 지지하고, 항-혈관형성 인자의 양을 방출시키기 위해 복부암 절제술(예를들어, 결장 절제 후) 동안 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 절제 후 종양의 절제 가장자리에 투여함으로써, 이 부위에서의 암의 국소적 재발 및 새로운 혈관의 형성이 억제되는 것을 포함하는 종양 절제 부위를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 한 구체예에서, 항-혈관형성 화합물은 종양 절제 부위로 직접적으로 투여(예를들어, 종양의 절제 가장자리를 항-혈관형성 화합물로 도포하거나, 솔로 칠하거나 달리 코팅시킴으로써 적용됨)된다. 대안적으로, 항-혈관형성 화합물은 투여 전에 공지된 외과용 페이스트로 혼합될 수 있다. 본 발명의 특정의 바람직한 구체예에서, 항-혈관형성 화합물은 악성에 대한 간 절제술 후, 및 신경외과 수술 후에 적용된다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 유방 종양, 결장 종양, 뇌종양 및 간 종양을 포함하는 광범위한 종양의 절제 가장자리로 투여될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 한 구체예에서, 항-혈관형성 화합물은 절제 후 신경학적 종양 부위로 투여되어, 이 부위에서의 새로운 혈관의 형성을 억제할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 기타 항-혈관형성 인자와 함께 투여될 수 있다. 기타 항-혈관형성 인자의 대표적 예는 항-침습 인자, 레티노산 및 이의 유도체, 파클리탁셀, 수라민, 금속단백분해효소-1의 조직 억제제, 금속단백분해효소-2의 조직 억제제, 플라스미노겐 활성제 억제제-1, 플라스미노겐 활성제 억제제-2, 및 보다 가벼운 "d 그룹" 전이금속의 다양한 형태를 포함한다.
보다 가벼운 "d 그룹" 전이금속은, 예를들어 바나듐, 몰리브덴, 텅스텐, 티타늄, 니오븀, 및 탄탈륨 종을 포함한다. 이러한 전이금속종은 전이금속 착물을 형성할 수 있다. 상기 언급된 전이금속종의 적절한 착물은 옥소 전이금속 착물을 포함한다.
바나듐 착물의 대표적 예는 옥소 바나쥼 착물, 예를들어 바나데이트 및 바나딜 착물을 포함한다. 적절한 바나데이트 착물은 메타바나데이트 및 오르토바나데이트 착물, 예를들어 암모늄 메타바나데이트, 나트륨 메타바나데이트, 및 나트륨 오르토바나데이트를 포함한다. 적절한 바나딜 착물은, 예를들어 바나딜 아세틸아세토네이트 및 바나딜 설페이트 히드레이트를 포함하는 바나딜 설페이트, 예를들어 바나딜 설페이트 모노- 및 트리히드레이트를 포함한다.
텅스텐 및 몰리브덴 착물의 대표적 예는 또한 옥소 착물을 포함한다. 적절한 옥소 텅스텐 착물은 텅스테이트 및 텅스텐 옥시드 착물을 포함한다. 적절한 텅스테이트 착물은 암모늄 텅스테이트, 칼슘 텅스테이트, 나트륨 텅스테이트 디히드레이트, 및 텅스텐산을 포함한다. 적절한 텅스텐 옥시드는 텅스텐(IV) 옥시드 및 텅스텐(VI) 옥시드를 포함한다. 적절한 옥소 몰리브덴 착물은 몰리브데이트, 몰리브덴 옥시드, 및 몰리브데닐 착물을 포함한다. 적절한 몰리브데이트 착물은 암모늄 몰리브데이트 및 이의 수화물, 나트륨 몰리브데이트 및 이의 수화물, 및 칼륨 몰리브데이트 및 이의 수화물을 포함한다. 적절한 몰리브덴 옥시드는 몰리브덴(VI) 옥시드, 몰리브덴(VI) 옥시드, 및 몰리브덴산을 포함한다. 적절한 몰리브데닐 착물은, 예를들어 몰리브데닐 아세틸아세토네이트를 포함한다. 기타 적절한 텅스텐 및 몰리브덴 착물은, 예를들어 글리세롤, 타르타르산, 및 설탕으로부터 유래된 히드록소 유도체를 포함한다.
광범위한 기타 항-혈관형성 인자가 또한 본 발명의 상황에서 사용될 수 있다. 대표적 예는 혈소판 인자 4; 프로타민 설페이트; 황산화된 키틴 유도체(대게 껍질로부터 제조됨), (Murata et al., Cancer Res. 51:22-26, 1991); 황산화된 폴리사카라이드 펩티도글리칸 착물(SP- PG) (이 화합물의 기능은 스테로이드, 예를들어 에스트로겐, 및 타목시펜 시트레이트의 존재에 의해 향상될 수 있음); 스타우로스포린; 기질 대사의 조절제, 예를들어 프롤린 유사체, 시스히드록시프롤린, d,L-3,4-데히드로프롤린, 티아프롤린, 알파,알파-디피리딜, 아미노프로피오니트릴 푸마레이트; 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3H)-옥사졸론; 메토트렉세이트; 미톡산트론; 헤파린; 인터페론; 2 매크로글로불린-혈청; ChIMP-3(Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267:17321-17326, (1992)); 키모스타틴(Tomkinson et al., Biochem J. 286:475-480, (1992)); 시클로덱스트린 테트라데카설페이트; 에포네마이신; 캄프토테신; 퓨마길린(Ingber et al., Nature 348:555-557, 1990); 금 나트륨 티오말레이트("GST"; Matsubara and Ziff, J. Clin. Invest. 79:1440-1446, (1987)); 항콜라게나아제-혈청; 알파2-항플라스민(Holmes et al., J. Biol. Chem. 262(4):1659-1664, (1987)); 비산트렌(National Cancer Institute); 로벤자리트 디소듐 (N-(2)-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 디소듐 또는 "CCA"; Takeuchi et al., Agents Actions 36:312-316, (1992)); 탈리도미드; 혈관형억제 스테로이드; AGM-1470; 카르복시나미놀미다졸; 및 금속단백분해효소 억제제, 예를들어 BB94를 포함한다.
세포 수준에서의 질병
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방, 진단, 및/또는 예측될 수 있는 증가된 세포 생존 또는 아폽토시스의 억제와 관련된 질병은 암(예를들어, 소포림프종, p53 돌연변이를 지니는 암종, 및 결장암, 심장 종양, 췌장암, 흑색종, 망막모세포종, 교모세포종, 폐암, 장암, 고환암, 위암, 신경모세포종, 점액종, 근종, 림프종, 내피종, 골모세포종, 파골세포종, 골육종, 연골육종, 샘종, 유방암, 전림선암, 카포시 육종 및 난소암을 포함하나 이에 제한되지 않는 호르몬-의존성 종양); 자가면역 장애(예를들어, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 담즙성 간경변, 베체트병, 크론병, 다발근육염, 전신홍반루푸스 및 면역-관련 사구체신염 및 류마티스 관절염) 및 바이러스 감염(예를들어, 헤르페스 바이러스, 폭스 바이러스 및 아데노바이러스), 염증, 이식 대 숙주병, 급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 암, 특히 상기 기술된 암의 성장, 진행, 및/또는 전이를 억제하기 위해 사용된다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 치료되거나 검출될 수 있는 증가된 세포 생존과 관련된 추가의 질병 또는 질환은 악성 종양 및 관련 장애, 예를들어 백혈병(급성 백혈병(예를들어, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모구, 전골수구, 골수단핵구, 단핵구, 및 적백혈병을 포함함)을 포함함) 및 만성 백혈병(예를들어, 만성 골수성(과립구) 백혈병 및 만성 림프성 백혈병)), 진성적혈구증가증, 림프종(예를들어, 호지킨병 및 비-호지킨병), 다발골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 및 육종 및 암종, 예를들어 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 육종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포암종, 기저세포암종, 샘암종, 한선암종, 모지선암종, 유두암종, 유두상 선암종, 낭샘암종, 속질암종, 기관기원성 암종, 신세포암종, 간암, 담관암종, 융모막암종, 고환종, 배아암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피 암종, 신경아교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 및 망막모세포종을 포함하나 이에 제한되지 않는 고형 종양의 진행, 및 또는 전이를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료, 예방, 진단 및/또는 예측될 수 있는 증가된 아폽토시스와 관련된 질병은 AIDS; 신경변성 장애(예를들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 색소성 망막염, 소뇌 변셩 및 뇌종양 또는 이전에 관련된 질병); 자가면역 장애(예를들어, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 담즙성 간경변, 베체트병, 크론병, 다발성근염, 전신홍반루푸스 및 면역-관련 사구체신염 및 류마티스 관절염) 골수형성이상 증후군(예를들어, 재생불량빈혈), 이식 대 숙주병, 허혈 손상(예를들어, 심근경색, 뇌졸중 및 재관류 손상에 의해 야기된 것), 간 손상(예를들어, 간염 관련 간 손상, 허혈/재관류 손상, 담즙울체(담관 손상) 및 간암); 독소 유발 간 질병(예를들어, 알코올에 의한 것), 패혈 쇼크, 악액질 및 식욕부진을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상처 치유 및 상피세포 증식
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 치료 목적상, 예를들어 상처 치유의 목적상 상피세포 및 기본 각질세포 증식을 자극하고, 모낭 생성 및 피부 상처의 치유를 자극하기 위해 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하는 방법이 제공된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 외과적 상처, 절제 상처, 진피 및 표피의 손상을 포함하는 깊은 상처, 안구 조직 상처, 치아 조직 상처, 구강 상처, 당뇨병성 궤양, 피부 궤양, 욕창, 동맥성 궤양, 정맥 울혈 궤양, 열 또는 화학물질 노출로부터의 범(bum), 및 기타 비정상적 상처 치유 상태, 예를들어 요독증, 영양실조, 스테로이드의 전신적 치료와 관련된 비타민 결핍 및 합병증, 방사선 요법 및 항신생 약물 및 항대사물질을 포함하는 상처 치유를 자극시키기 위해 임상적으로 유용할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 피부 손실 이후의 피부 재형성을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 상처 바탕에 대한 피부 이식편의 부착을 증가시키고, 상처 바탕으로부터의 재-상피화를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 상처 바탕에 대한 부착을 증가시키기 위해 자가 이식, 인공피부, 동종 이식, 자가피부 이식, 자가표피 이식, 무혈관 이식, 블레어-브라운(Blair-Brown) 이식, 골 이식, 배태조직 이식, 피부 이식, 지연 이식, 식피, 표피 이식, 근막 이식, 전층피부 이식, 이종 이식, 이종 이식, 동종 이식, 증식성 이식, 표층 이식, 그물피부 이식, 점막 이식, 올리에르-티르쉬 이식, 그물막 이식, 첩부 이식, 경상 이식, 전층 이식, 부분층 식피술, 틱 스플릿(thick split) 이식과 같은 이식 유형에 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 피부 강도를 촉진시키고 노화된 피부의 외형을 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 간세포 증식, 및 폐, 유방, 췌장, 위, 소장, 및 대장의 상피세포에서의 변화를 일으킬 것으로 믿겨진다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 상피세포, 예를들어 피지세포, 모낭, 간세포, 과립허파꽈리세포, 뮤신 생성 술잔 세포, 및 기타 상피 세포 및 피부, 폐, 간, 및 위장관 내에 함유된 이들의 전구물질의 증식을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 내피세포, 각질세포, 및 기저 각질세포의 증식을 촉진할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 방사선, 화학요법 치료 또는 바이러스 감염으로부터 생성된 장 독성의 부작용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 소장 점막에 대한 세포보호 효과를 지닐 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 화학요법 및 바이러스 감염으로부터 생성된 점막염(구강 궤양)의 치유를 자극할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 범(bum)을 포함하는 전체 및 부분적 두께 피부 결함에서의 피부의 완전한 재생(즉, 모낭, 땀샘, 및 모지선의 재증식), 기타 피부 결함, 예를들어 건선의 치료에 추가로 이용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 수포성 표피박리증, 이들 병변의 재-상피화를 가속화시킴으로써 빈번하고, 개방되고, 고통스러운 수포를 발생시키는 근원적인 진피에 대한 표피의 부착 결함을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 위궤양 및 십이지장 궤양을 치료하고, 점막 내층의 형성 및 점액샘 및 십이지장 점막 내층의 재생을 보다 신속하게 치유하도록 원조하기 위해 사용될 수 있다. 염증성 창자병, 예를들어 크론병 및 궤양대장염은 각각 소장 또는 대장의 점막표면의 파괴를 일으키는 질병이다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 보다 신속한 치유를 원조하고 염증성 창자병의 진행을 방지하기 위한 점막표면의 재생을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용한 치료는 위장관을 통한 점액의 생성에 현저한 영향을 지니는 것으로 예상되고, 섭취되는 유해한 물질 또는 이후의 외과술로부터 창자 점막을 보호하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 발현하에서 관련된 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 다양한 병리학적 상태로 인한 폐에 대한 손상을 예방하고 치유하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 증식 및 분화를 자극하고, 급성 또는 만성 폐 손상을 예방하거나 치료하기 위해 꽈리 및 세기관지 상피의 복구를 촉진할 수 있다. 예를들어, 세기관지 상피 및 꽈리의 괴사를 야기하는 꽈리의 점진적 손실, 및 흡입 손상을 일으키는, 즉 연기 흡입 및 범(bum)으로부터 발생하는 폐기종은 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드, 효능제 또는 길항제를 이용하여 효과적으로 치료될 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 과립허파꽈리세포의 증식 및 분화를 자극할 수 있고, 이는 미성숙한 유아에서의 질병, 예를들어 유리질막병, 예를들어 유아 호흡곤란증후군 및 기관지허파 형성이상의 치료 또는 예방을 원조할 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 간세포의 증식 및 분화를 자극하여, 간 질병 및 병리, 예를들어 경화증에 의해 야기된 전격 간부전, 바이러스간염 및 독소 물질(예를들어, 아세트아미노펜, 사염화탄소 및 당 분야에 공지된 기타 간독소)에 의해 야기된 간 손상을 완화시키거나 치료하기 위해 사용될 수 있다.
게다가, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 당뇨병의 발병을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 새로이 진단된 타입Ⅰ 및 Ⅱ 당뇨병을 지닌 환자에서, 약간의 섬세포 기능이 잔류하는 경우, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 질병의 영구 소견을 완화하거나, 지연시키거나 예방하기 위해 섬세포 기능을 유지시키도록 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 섬세포 기능을 개선시키거나 촉진시키기 위해 섬세포 이식에서 보조제로 사용될 수 있다.
신경 활성 및 신경학적 질병
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 뇌 및/또는 신경계의 질병, 장애, 손상 또는 상처의 진단 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물(예를들어, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드)로 치료될 수 있는 신경계 장애는 신경계 손상, 및 축삭의 분리, 뉴런의 감소 또는 퇴행, 또는 말이집탈락을 일으키는 질병 또는 장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에 따라 환자(인간 및 비-인간 포유동물 환자를 포함함)에서 치료될 수 있는 신경계 병변은 (1) 뇌경색증 또는 허혈, 또는 척수 경색 또는 허열을 포함하는 신경 손상 또는 사멸을 일으키는, 신경계의 일부에서의 산소 결핍인 허혈성 병변; (2) 물리적 손상 또는 외과술 관련, 예를들어 신경계의 일부를 절단하는 병변, 또는 압박 손상에 의해 야기되는 병변을 포함하는 외상성 병변; (3) 신경계의 일부가 신경계 관련 악성종양 또는 비-신경계 조직으로부터 유래된 악성종양인 악성 조직에 의해 파괴되거나 손상되는 악성 병변; (4) 신경계의 일부가 농양 또는 감염의 결과, 예를들어 인간 면역결핍 바이러스, 대상 포진, 또는 단순포진 바이러스에 의한 감염 또는 라임병, 결핵, 또는 매독에 의한 감염의 결과로서 파괴되거나 손상되는 감염성 병변; (5) 신경계의 일부가 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤 무도병, 또는 근위축성 측삭 경화증(ALS)와 관련된 퇴행을 포함하나 이에 제한되지 않는 퇴행 과정의 결과로서 파괴되거나 손상되는 퇴행성 병변; (6) 신경계의 일부가 비타민 B12 결핍, 엽산 결핍, 베르니케병, 담배-알코올 약시, 마르키아파바-비냐미 병(뇌량의 원발성 퇴행), 및 알코올성 소뇌 퇴행을 포함하나 이에 제한되지 않는 물질대사의 영양장애 또는 장애에 의해 파괴되거나 손상되는, 영양 질병 또는 방애와 관련된 병변; (7) 당뇨병(당뇨병 신경병증, 벨안면신경마비), 전신홍반루푸스, 암종, 또는 사코이드증을 포함하나 이에 제한되지 않는 전신성 질병과 관련된 신경계 병변; (8) 알코올, 납, 또는 특정 신경독소를 포함하는 독성 물질에 의해 야기된 병변; 및 (9) 신경계의 일부가 다발성 경화증, 인간 면역결핍 바이러스 관련 척수병증, 횡단척수병증 또는 다양한 병인, 진행성 다발성 백질뇌병증, 및 뇌교 중심부 수초용해증을 포함하나 이에 제한되지 않는 말이집탈락병에 의해 파괴되거나 손상된 탈수초 병변과 같은 중추(척수, 뇌 포함)신경계 또는 말초신경계의 병변을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 저산소증의 손상 효과로부터 신경 세포를 보호하기 위해 사용된다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 뇌저산소증의 손상 효과로부터 신경 세포를 보호하기 위해 사용된다. 이 구체예에 따르면, 본 발명의 조성물은 뇌저산소증과 관련된 신경 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 이 구체예의 하나의 비제한적인 양태에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 대뇌 허혈과 관련된 신경 세포 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 이 구체예의 또 다른 비제한적인 양태에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 뇌경색증과 관련된 신경 세포 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 뇌졸중과 관련된 신경 세포 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 뇌졸중과 관련된 대뇌 신경 세포 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 심장부전과 관련된 신경 세포 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 심장부전과 관련된 대뇌 신경 세포 손상을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다.
신경계 장애를 치료하거나 예방하기에 유용한 본 발명의 조성물은 뉴런의 생존 또는 분화를 촉진하는 생물학적 활성에 대한 시험에 의해 선택될 수 있다. 예를들어, 하기의 효과중 하나를 유도하나 이에 제한되지 않는 본 발명의 조성물은 본 발명에서 유용할 수 있다: (1) 저산소증 또는 저산소 질환의 존재 또는 부재하에서의 배양물에서 뉴런의 생존 기간을 증가시키거나; (2) 배양물 또는 생체내에서 뉴런의 발아를 증가시키거나; (3) 배양물 또는 생체내에서 뉴런-관련 분자, 예를들어 운동 뉴런에 대한 콜린 아세틸트랜스퍼라아제 또는 아세틸콜린스테라아제의 생성을 증가시키거나; (4) 생체내 뉴런 기능장애의 증상을 감소시킴. 바람직하고 비제한적인 구체예에서, 뉴런의 증가된 생존은 본원에 기술되거나 당 분야에 달리 공지된, 예를들어 문헌[Zhang et al ., Proc Nall Acad Sci USA 97:3637-42 (2000) or in Arakawa et al ., J. Neurosci ., 10:3507-15 (1990)]에 기술된 방법을 이용하여 통상적으로 측정될 수 있고; 뉴런의 증가된 발아는 당 분야에 공지된, 예를들어 문헌[Pestronk et al ., Exp . Neurol ., 70:65-82 (1980), or Brown et al ., Ann . Rev . Neurosci., 4:17-42 (1981)]에 기술된 방법에 의해 검출될 수 있고; 뉴런-관련 분자의 증가된 생성은 당 분야에 공지된 기술을 이용하고 측정되는 분자에 따라 생물학적검정, 효소성 측정법, 항체 결합, 노던 블로팅 검정 등에 의해 측정될 수 있고; 운동 뉴런 기능장애는 운동 뉴런 장애의 물리적 표현, 예를들어 약함, 운동 뉴런 전도 속도, 또는 기능적 무력에 의해 측정될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 운동 뉴런 장애는 경색증, 감염, 독소에 대한 노출, 외상, 외과적 손상, 운동 뉴런 뿐만 아니라 신경계의 기타 성분에 영향을 줄 수 있는 퇴행 질병 또는 악성종양, 뿐만 아니라 영아진행성 척수성 근위축증, 진행연수마비, 원발성 측삭경화증, 영아형 근위축증 및 연소성 근위축, 유아의 진행연수마비(Fazio-Londe syndrome), 회색질척수염 및 소아마비후 증후군, 및 유전운동감각신경병증(Charcot-Marie-Tooth Disease)을 포함하나 이에 제한되지 않는 근위축성 측삭 경화증과 같은 선택적으로 뉴런에 영향을 주는 장애와 같은 장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 뉴런 생존; 시냅스 형성; 전도도; 뉴런 분화 등에서 중요한 역할을 할 것이다. 따라서, 본 발명의 조성물(본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함함)은 학습 및/또는 인지 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는, 이들의 역할과 관련된 질병 또는 장애를 진단하고/하거나 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 신경변성 질병 상태 및/또는 행동 장애의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 이러한 신경변성 질병 상태 및/또는 행동 장애는 급식, 수면양상, 균형 및 지각의 장애를 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 뚜렛 증후군, 정신분열병, 조증, 치매, 편집증, 강박장애, 공황장애, 학습장애, ALS, 정신병, 자폐증, 및 변경 행동(altered behavior)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 게다가, 본 발명의 조성물은 또한 배아 발달과 관련된 발달 장애, 또는 성-관련 장애의 치료, 예방 및/또는 검출에서 중요한 역할을 할 것이다.
추가로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 경동맥 질병(예를들어, 경동맥 혈전증, 경동맥 협착, 또는 모야모야병), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 뇌동맥류, 뇌무산소증, 뇌동맥경화증, 대뇌 동정맥 기형, 대뇌동맥병, 뇌색전증 및 혈전증(예를들어, 경동맥 혈전증, 정맥굴혈전증, 또는 왈렌버그 증후군), 뇌내출혈(예를들어, 경막외 또는 경막하 혈종, 또는 거미막하출혈), 뇌경색증, 대회허혈(예를들어, 일과성뇌허혈증, 쇄골하동맥도류증후군, 또는 척추골 뇌저동맥기능부전증), 혈관치매(예를들어, 다발경색), 백질연화증, 뇌실주위, 및 혈관성 두통(예를들어, 군발두통 또는 편두통)을 포함하나 이에 제한되지 않는 뇌혈관 장애와 관련된 질병, 손실, 장애, 또는 손상으로부터 신경 세포를 보호하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 다른 추가의 양태에 따르면, 치료 목적상, 예를들어 신경학적 세포 증식 및/또는 분화를 자극하기 위하여 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하는 방법이 제공된다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 신경학적 질병을 치료하고/하거나 검출하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 특정 신경계 질병 또는 장애의 표지 또는 검출자로 사용될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료되거나 검출될 수 있는 신경학적 질병의 예는 페닐케톤뇨증, 예를들어 모성 페닐케톤뇨증, 피루베이트 카르복실라아제 결핍, 피루베이트 데히드로게나아제 복합체 결핍, 베르니케 뇌병증, 뇌부종, 뇌 신생물, 예를들어 척막하 신생물, 뇌실 신생물, 예를들어 맥락막총 신생물, 시상하부 신생물, 천막위 신생물을 포함하는 소뇌 신생물, 카나반병, 소뇌병, 예를들어 척수소뇌변성, 예를들어 모세혈관확장성조화운동불능, 소뇌근육협동장애, 프리이드라이히 운동실조, 마카도-조셉병, 올리브다리소뇌위축을 포함하는 소뇌조화운동불능, 소뇌 신생물, 예를들어 천막하 신생물, 광범위뇌경화증, 예를들어 뇌염 축삭, 공세포백색질장애, 이염색백색질장애 및 아급성 경화성 범뇌염을 포함하는 대사성 뇌 질병과 같은 뇌 질병을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료되거나 검출될 수 있는 추가의 신경학적 질병은 뇌혈관 장애(예를들어, carotid artery diseases which include 경동맥 혈전증, 경동맥 협착 및 모야모야병), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 뇌동맥류, 뇌무산소증, 뇌동맥경화증, 대뇌 동정맥 기형, 대뇌동맥병, 뇌색전증 및 혈전증, 예를들어 경동맥 혈전증, 정맥동혈전증 및 왈렌버그 증후군, 뇌내출혈, 예를들어 경막외혈종, 경막하혈종 및 거미막하출혈, 뇌경색증, 대뇌허혈, 예를들어 일과성뇌허혈증, 쇄골하동맥도류증후군 및 척추골 뇌저동맥기능부전증, 혈관 치매, 예를들어 다발경색치매, 뇌실주위 백질연화증, 혈관성 두통, 예를들어 군발성두통 및 편두통을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료되거나 검출될 수 있는 추가의 신경학적 질병은 치매, 예를들어 AIDS 치매 복합체, 초로성 치매, 예를들어 알츠하이머병 및 크로이츠펠트-야콥 증후군, 노인 치매, 예를들어 알츠하이머병 및 진행성 상핵마비, 혈관 치매, 예를들어 다발경색치매, 뇌염 축삭, 바이러스성 뇌염, 예를들어 유행뇌염, 일본뇌염, 세인트루이스 뇌염, 진드기매개뇌염 및 서나일 열, 급성 파종성 뇌척수염, 수막뇌염, 예를들어 포도막수막뇌염 증후군, 뇌염후 파킨슨병 및 아급성경화범뇌염을 포함하는 뇌염, 뇌연화증, 예를들어 뇌실주위 백색연화증, 간질, 예를들어 영아연축, 결신발작을 포함하는 전신간질, MERRF 증후군, 긴장성-간대성 간질을 포함하는 간대성근경련간질, 부분간질, 예를들어 복합 부분간질, 전두엽간질 및 측두엽간질, 외상후간질, 간질지속증, 예를들어 지속부분간질, 및 할러포르텐-스파츠 증후군을 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 이용하여 치료되거나 검출될 수 있는 추가의 신경학적 질병은 수두증, 예를들어 댄디워커 증후군 및 정상압수두증, 시상하부병, 예를들어 시상하부 신생물, 뇌말라리아, 허탈발작을 포함하는 기면증, 연수성 회백척수염, 대뇌 가성종양, 레트 증후군, 라이 증후군, 시상병, 대뇌톡소포자충증, 두개내결핵종 및 젤베거증후군, 중추신경계 감염, 예를들어 AIDS 치매 복합체, 뇌농양, 경막하축농, 뇌척수염, 예를들어 말뇌척수염, 베네주엘라말뇌척수염, 괴사출혈뇌척수염, 비스나, 및 뇌말라리아를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료 또는 검출될 수 있는 추가의 신경학적 질병으로는 거미막염과 같은 수막염, 림프구 맥락수막염을 포함하는 바이러스 수막염과 같은 무균 수막염, 헤모필루스 메닌지티디스(Haemophilus Meningtitis), 리스테리아 메닌지티디스(Listeria Meningtitis), 워터하우스 프리데릭센 증후군과 같은 수막구균 메닌지티디스(Meningococcal Meningtitis), 폐렴구균 메닌지티디스(Pneumococcal Meningtitis) 및 수막 결핵을 포함하는 세균 수막염, 크립토코쿠스 메닌지티디스(Cryptococcal Meningtitis)와 같은 진균 수막염, 경막하 삼풀, 우베수막뇌염 증후군과 같은 수막뇌염, 횡단 척수염과 같은 척수염, 척수 매독과 같은 신경매독, 연수 회색질척수염 및 회색질척수염후 증후군을 포함하는 회색질척수염, 프리온 질병(예컨대 크로이츠펠트-야콥 증후군, 소 갯솜형 뇌병증, 저스트만-스트라우슬러 증후군, 쿠루병, 면양떨림병), 및 뇌 톡소포자충증이 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료 또는 검출될 수 있는 추가의 신경학적 질병으로는 소뇌천막밑 신생물과 같은 소뇌 신생물을 포함하는 뇌 신생물과 같은 중추신경계 신생물, 맥락 어기 신생물, 시상하부 신생물 및 천막위 신생물과 같은 뇌실 신생물, 수막 신생물, 경막외 신생물을 포함하는 척수 신생물, 카나반 질병과 같은 탈수초성 질환, 부신 백질 이영양증을 포함하는 광범위 뇌경화증, 축삭주위 뇌염, 구양세포 백질이영양증, 이염성의 백혈구 영양 실조와 같은 광범위 뇌경화증, 알레르기성 뇌척수염, 괴사 출혈성 뇌척수염, 진행성 다발성 백질뇌증, 다발성 경화증, 중심 다리뇌 마이엘린 용해, 횡단성 척수염, 시속 신경수염, 스크라피, 척추 만곡증, 만성 피로 증후군, 비스나, 고압 신경 증후군, 수막자극증, 선천성 근무긴장증과 같은 척수 질병, 근위축성 측색 경화증, 어드니그-호프만 병과 같은 척수 근육 소모증, 척수 압축, 경막외 신생물과 같은 척수 신생물, 척수 공동증, 척수 매독, 스티프-만 증후군, 앙겔만 증후군과 같은 정신 지연, 묘성 증후군, 드 란지 증후군, 아래의 증후군, 강글리오사이드증 G(M1)과 같은 강글리오사이드증, 샌드호프 병, 테이-삭스 병, 하아트눕병, 호모시스테인뇨증, 로렌스-문-비에들 증후군, 레쉬-니안, 메이플 시럽 소변 병, 푸코사이드 축적증과 같은 무코리피도시스, 신경세포 세로이드 지질갈색조증, 안뇌신 증후군, 모성 페닐케톤뇨증과 같은 페닐케톤뇨증, 프라더-윌리 증후군, 레트 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 결절 경화증, WAGR 증후군, 전전뇌증 같은 신경계 이상, 하이드란젠세팔리(hydrangencephaly)를 포함하는 무뇌증과 같은 신경관 결함, 아몰드-체어리 변형, 뇌류, 수막류, 수막척수류, 낭성이분척추 및 잠재이분척추와 같은 척수솔기닫힘장애가 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료 또는 검출될 수 있는 추가의 신경학적 질병으로는 카르콧-마리 병을 포함하는 유전성 운동 및 감각 신경병증, 유전성 시각 이상증, 레프섬 병, 유전성 연축성 대마비, 어드니그-호프만 병, 선천적인 무통 및 가족성 자율신경실조증과 같은 유전성 감각 및 자율신경 신경병증, 신경학적 소견(예컨대 저스트만 증후군을 포함하는 인식불능증, 역행 기억상실과 같은 기억상실, 행위상실증, 신경성 방광, 탈력 발작, 난청을 포함하는 청력 장애와 같은 의사소통 장애, 부분적인 청력 손실, 음량 동원 및 이명, 쓰기언어상실증, 명칭언어상실증, 브로카 언어상실증 및 어니크 언어상실증을 포함하는 언어상실증과 같은 언어 장애, 획득 난독증과 같은 난독증, 언어 발달 장애, 명칭언어상실증, 브로카 언어상실증 및 어니크 언어상실증을 포함하는 언어상실증과 같은 말하기 장애, 발음 장애, 말더듬증, 반향언어증, 무언증 및 말더듬을 포함하는 말하기 장애와 같은 의사소통 장애, 발성불능증 및 쉰소리와 같은 음성 장애, 대뇌제거 상태, 섬망, 속장화, 환각, 수막증, 앙겔멘 증후군과 같은 행동 장애, 운동 실조, 아테토시스, 무도병, 근긴장이상, 운동저하증, 근육 긴장저하, 간대성근경련증, 틱, 사경 및 떨림, 스티맨 증후군과 같은 근육 경축과 같은 과다근육긴장증, 근육 경직, 귀띠헤르페스를 포함하는 안면 마비와 같은 마비, 위마비, 반신불수, 복시 같은 안근마비, 두안 증후군, 호르너 증후군, 캘런스 증후군과 같은 만성 진행성 외안근마비, 연수 마비, 열대 연축성 대부전마비, 브라운-씨쿼드 증후군과 같은 대마비, 사지마비, 호흡 마비 및 성대 마비, 부전 마비, 환상 수족, 무미각증 및 미각 이상과 같은 미각 장애, 약시와 같은 시각 장애, 시각상실, 색각 결함, 복시, 반맹증, 암점 및 아정상 시각, 클레인-레빈 증후군을 포함하는 수면 과다와 같은 수면 장애, 불면증 및 몽유증, 개구장애와 같은 연축, 혼수와 같은 무의식, 지속 식물 상태 및 실신 및 현기증, 선천성 근무긴장증과 같은 신경근육 질병, 근위축성 측색 경화증, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 운동 뉴런 질환, 척수의 근육 소모증, 카르콧-마리 병과 어드니그-호프만 질병과 같은 근육 소모증, 회색질척수염후 증후군, 근위축증, 중증근무력증, 위축성 근긴장증, 선천성 근긴장증, 네말린 근증, 가족성 주기적인 마비, 다양한 파라밀로클로너스, 열대 연축성 대부전마비 및 스티프-만 증후군, 선단 동통과 같은 말초 신경계 병, 아밀로이드 신경장애, 아디 증후군과 같은 자율신경계 병, 바레-뢰오 증후군, 가족성 자율신경실조증, 호너 증후군, 반사성의 교감신경성 이영양증 및 샤이-드래거 증후군, 신경섬유종증 2를 포함하는 음향 신경종과 같은 음향 신경 병 등의 두개 신경 질병, 안면 신경통과 같은 안면 신경 질병, 멜커슨-로센탈 증후군, 약시를 포함하는 안구운동장애, 안구진탕, 동안신경 마비, 두안 증후군과 같은 안근마비, 호너 증후군, 캘런스 증후군을 포함하는 만성 진행성 외안근마비, 내사시 및 외사시와 같은 사시 동안신경, 눈돌림 신경 마비, 유전성 광학 위축을 포함하는 광학 위축과 같은 광학 신경 질병, 광학 디스크 결정강, 시각 신경척수염과 같은 광학 신경염, 유두부종, 삼차신경통, 성대 마비, 시각 신경척수염과 같은 말이집탈력 질병, 및 당뇨병 발과 같은 당뇨 신경병증이 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드로 치료 또는 검출될 수 있는 추가의 신경학적 질병으로는 수근터널 증후군, 족근관 증후군, 목의 늑골 증후군과 같은 아래가슴문 증후군, 척골 신경 압축 증후군, 작열통과 같은 신경통, 목-위팔 신경통, 안면 신경통 및 삼차신경통과 같은 신경 압축 증후군, 실험알레르기성 신경염, 시신경염, 다발성 신경염, 급성특발 다발성 신경염 및 다발성신경근염과 같은 신경근염 등의 신경염, 카르콧-마리 병과 같은 유전성 운동 및 감각 신경병증, 유전성 광학 위축, 레프섬 질병, 유전성 연축성 대마비 및 어드니그-호프만 병, 선천적인 무통 및 가족성 자율신경실조증을 포함하는 유전성 감각 및 자율신경 신경병증, POEMS 증후군, 좌골신경통, 미각성 발한 및 강직이 있다.
내분비 질환
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 내분비 시스템의 장애 및/또는 질환과 관련된 호르몬 불균형 및/또는 질환 또는 질병을 치료, 예방, 진단 및/또는 예지하는데 사용될 수 있다.
내분비계 샘에서 분비되는 호르몬은 물리적 성장, 성 기능, 대사 및 다른 기능을 조절한다. 질병은 두 가지 방식으로 분류될 수 있다: 호르몬 생성에서의 장애, 및 호르몬에 반응하는 조직의 불능. 상기 호르몬 불균형 또는 내분비계 질환, 질병 또는 장애의 병인은 유전적이거나, 암 및 몇몇 자가면역 질환과 같이 신체적이거나, 후천적이거나 (예컨대, 화학치료, 상해 또는 독소에 의한) 감염성일 수 있다. 더욱이, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 내분비계 및/또는 호르몬 불균형과 관련된 특정 질병 또는 질환의 마커 또는 디텍터로서 이용될 수 있다.
내분비계 및/또는 호르몬 불균형 및/또는 질병은 임신 및 분만 합병증 (예컨대 조기 분만, 만기후 임신, 자연유산, 및 느리거나 정지된 분만)을 포함하나 이로 제한되지 않는 자궁 운동성 장애; 및 월경 주기의 질환 및/또는 질병 (예컨대, 생리통 및 자궁 내막증)을 포함한다.
내분비계 및/또는 호르몬 불균형 및/또는 질병은 췌장의 질환 및/또는 질병, 예컨대 당뇨병, 요붕증, 선천적인 췌장 무형성, 갈색세포종-도세포 종양 증후군; 부신의 질환 및/또는 질병, 예를 들어 애디슨병, 코르티코스테로이드 결핍, 남성화 질병, 다모, 쿠싱 증후군, 고알도스테론증, 갈색세포종; 뇌하수체의 질환 및/또는 질병, 예를 들어 뇌하수체 기능항진증, 뇌하수체 기능저하증, 뇌하수체성 소인증, 뇌하수체 선종, 범하수체기능저하증, 말단 비대증, 거인증; 갑상선 기능항진증, 갑상선 기능저하증, 플러머 병, 그레이브 병(독성 확산 갑상선종), 독성 결절갑상선종, 갑상선염(하시모토 갑상선염, 아급성 육아종성 갑상선염 및 무증상 림프구 갑상선염), 펜드레드 증후군, 점액부종, 크레틴병, 갑상선중독증, 갑상선의 호르몬 연결 결함, 흉선 형성 부전증, 갑상선의 허슬 세포 종양, 갑상선 암, 갑상선암종, 골수의 갑상선암종을 포함하나 이로 제한되지 않는 갑상선의 질환 및/또는 질병; 부갑상선의 질환 및/또는 질병, 예를 들어 부갑상선 기능항진증, 부갑상선 기능저하증; 시상하부의 질환 및/또는 질병이 있다.
또한, 내분비계 및/또는 호르몬 불균형 장애 및/또는 질병은 암을 포함하는 고환 또는 난소의 질환 및/또는 질병을 포함할 수 있다. 고환 또는 난소의 다른 질병 및/또는 질병으로는 예를 들어 난소암, 다낭 난소 증후군, 클린펠터 증후군, 고환소멸 증후군(양쪽 무고환증), 라이디그 세포의 선천적인 부재, 잠복 고환증, 누난 증후군, 근긴장성 이영양증, 고환의 모세관 혈관종(양성), 고환 및 신-고환의 신생물이 있다.
더욱이, 내분비계 및/또는 호르몬 불균형 장애 및/또는 질병은 예를 들어 다선성 부족 증후군, 갈색세포종, 신경모세포종, 다발성 내분비 신생물, 및 내분비 조직의 질환 및/또는 암과 같은 장애 및/또는 질병을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 본 발명의 알부민 단백질의 치료적 단백질 일부에 상응하는 치료적 단백질이 발현되는 조직(들)과 관련된 내분비 질환 및/또는 질병을 진단, 예지, 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
생식계 질병
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 생식계의 질환 및/또는 질병을 진단, 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 생식계 질환으로는 생식계 상처, 감염, 신생물 질환, 선천적인 결함, 및 불임, 임신, 산통 또는 분만 합병증 및 산후 어려움을 유발하는 질환 또는 질병이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
생식계 질환 및/또는 질병은 고환위축, 고환 여성화, 잠복고환증(한쪽 및 양쪽), 무고환증, 고환 전위, 부고환염과 고환염(통상적으로 예컨대 임질, 이하선염, 결핵 및 매독과 같은 감염으로부터 초래됨), 고환 꼬임, 결절 정관염, 생식세포종 (예를 들면, 정상피종, 배아 세포 암종, 기형암종, 융모막암종, 난황낭 종양 및 기형종), 간질의 종양 (예컨대, 레이디히 세포 종양), 수류, 혈종, 정계정맥류, 정액류, 서혜부 탈장 및 정자 생산의 장애 (예컨대, 섬모 기능부전 증후군, 무정자증, 아스테노정자증, 무정자증, 정자부족증 및 기형정자증)를 포함하는 고환의 질환 및/또는 장애를 포함한다.
생식계 질환은 또한 전립선의 질환을 포함하며, 예컨대 급성 비세균성 전립선염, 만성 비세균성 전립선염, 급성 세균성 전립선염, 만성 세균성 전립선염, 전립선근육긴장이상, 프로스타토시스, 육아조직성 전립선염, 연화판증, 양성 전립선 비대 또는 과형성, 및 선암종, 이행세포암종, 관암 및 편평세포암종을 포함하는 전립선 신생물 질병이 있다.
부가적으로, 본 발명의 조성물은 음경 및 요도의 질환 또는 질병의 진단, 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있으며, 이는 염증성 질환, 예컨대 귀두포피염, 폐색 건성 귀두염, 포경, 감돈포경, 매독, 단순 포진 바이러스, 임질, 비임균성 요도염, 클라미디아, 미코플라스마, 트리코모나스, HIV, AIDS, 레이터스 증후군, 첨규 콘딜로마, 편평 콘딜로마 및 진주 음경 구진; 요도의 이상, 예컨대 요도하열, 요도 상열 및 포경; 전암성 병변, 예컨대 큐이래트의 홍색형성증, 보웬 병, 보웬양상 파플로시스, 부스크-로웬스타인의 거대 콘딜로마 및 사마귀모양 암종; 음경 암, 예컨대 편평세포암종, 상피내암종, 사마귀모양 암종 및 파종된 음경 암종; 요도 신생물 질환, 예컨대 음경 요도 암종, 망울막 요도 암종 및 전립선 요도 암종; 및 발기 장애, 예컨대 지속발기증, 페이로니 병, 발기 기능 부전 및 발기불능을 포함한다.
더욱이, 정관의 질환 및/또는 질병으로는 혈관염 및 CBAVD(정관의 선천적인 양쪽 부재)가 있고; 추가로, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 포충병, 선천적인 염화물 설사 및 다낭신병을 포함하는 정낭의 질환 및/또는 질병을 진단, 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
남성 생식계의 다른 질환 및/또는 질병으로는 예를 들어 클린펠터 증후군, 영 증후군, 조루증, 당뇨병, 낭성 섬유증, 카르타게너 증후군, 고열, 다발성 경화증 및 여성유방증이 있다.
추가로, 본 발명의 폴리누클레오티드, 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 질 및 음문의 질환 및/또는 질병을 진단, 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있는데, 이는 세균성 질증, 칸디다균 질염, 단순 포진 바이러스, 연성하감, 서혜육아종, 성병성 림프육아종, 옴, 인간의 유두종 바이러스, 질의 외상, 음문 외상, 샘증, 클라미디아 질염, 임질, 트리코모나스 질염, 첨규 콘딜로마, 매독, 전염성 연속종, 위축성 질염, 파제트 병, 경화 태선, 편평 태선, 음문통증, 유독한 쇼크 증후군, 질경련, 음문질염, 음문전정염, 및 신생물 질환, 예컨대 편평세포 과형성, 명세포암, 기저세포암, 멜라노마, 바르톨린 샘의 암 및 음문 상피내 신생물을 포함한다.
자궁의 질환 및/또는 질병으로는 월경통, 후경 자궁, 자궁 내막증, 섬유증, 선근증, 무배란 출혈, 무월경, 쿠싱 증후군, 포상기태, 아셔만 증후군, 조기 폐경, 성조숙, 자궁의 폴립, 기능부전성 자궁출혈 (예를 들면, 비정상적인 호르몬의 신호에 의한), 및 신생물 질환, 예컨대 선암종, 평활근육종 및 육종이 있다. 추가로, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 선천적인 자궁 이상, 예컨대 자궁두뿔증, 사이막 자궁, 단순 단뿔 자궁, 비공동성 잔유 뿔을 지니는 단뿔 자궁, 무교통 공동성 잔유 뿔을 지니는 단뿔 자궁, 교통 공동성 뿔을 지니는 단뿔 자궁, 궁상 자궁, 자궁 디델퍼스, 및 T 형태의 자궁의 유용한 마커 또는 디덱터일 뿐만 아니라 이들을 진단, 치료 및/또는 예방하는데 유용할 수 있다.
난소 질환 및/또는 질병으로는 무배란, 다낭포 난소증후군(스테인-레벤탈 증후군), 난소낭, 난소 기능저하, 성선 자극 호르몬에 대한 난소의 무감응, 남성 호르몬의 난소 생산 과잉, 오른쪽 난소정맥증후군, 무월경, 히루티즘 및 난소암 (일차 및 이차 암 성장, 세르톨리-레이딕 종양, 난소의 자궁내막유사 암종, 난소의 유두상 장액성 선암, 난소의 점액성 선암 및 그리고 난소의 크로켄베르그 종양을 포함하나 이로 제한되지 않음)이 있다.
경부 질환 및/또는 질병으로는 자궁 경부염, 만성 자궁경관염, 점액농성의 자궁 경부염, 경부의 형성 이상, 경부의 폴립, 나보티안 낭포, 경부의 침식, 경부의 무능력 및 경부의 신생물(예를 들면, 자궁경부암, 편평상피화생, 편평세포암종, 아데노편평세포 신생물 및 원주형 세포 신생물을 포함함)이 있다.
추가로, 생식계의 질환 및/또는 질병으로는 조기 유산, 후기 유산, 자연 유산, 유도 유산, 치료 유산, 절박 유산, 계류 유산, 불완전 유산, 완전 유산, 습관 유산, 계류 유산 및 패혈 유산과 같은 유산 및 사산을 포함하는 임신의 질환 및/또는 질병; 자궁외 임신, 빈혈, Rh 부적합, 임신 동안 질 출혈, 임신당뇨병, 자궁내의 성장 지연, 양수과다, HELLP 증후군, 태반조기박리, 전치태반, 입덧, 자간전증, 자간증, 임신 헤르페스, 및 임신 두드러기가 있다. 추가로, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 심장병, 심장마비, 류머티스성의 심장병, 선천적인 심장병, 승모판탈출증, 높은 혈압, 빈혈, 신장병, 감염성 질병 (예를 들면, 풍진, 거대세포 바이러스, 톡소포자충증, 전염성 간염, 클라미디아, HIV, AIDS 및 생식기 헤르페스), 당뇨병, 그레이브 병, 갑상선염, 갑상선 기능저하증, 하시모토 갑상선염, 만성 활동성 간염, 간 경변, 원발성 담즙성 간경변, 천식, 전신성 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 중증 근무력증, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 충수염, 난소낭, 담낭 질병, 및 장폐쇄를 포함하는 임신에 수반될 수 있는 질병의 진단, 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
산통 및 분만과 관련된 합병증으로는 막 파열, 조기 산통, 만기후 임신, 과숙, 너무 천천히 진행하는 분만, 태아절박가사(예를 들면, 비정상적인 심박수(태아 또는 모체), 호흡 곤란 및 비정상적인 태위), 견갑 난산, 탯줄탈출, 양수 색전증 및 비정상인 자궁출혈이 있다.
추가로, 포스트전달 기간의 질환 및/또는 질병으로는 자궁내막염, 자궁 근층염, 자궁주위염, 복막염, 골반 혈전성정맥염, 폐의 색전증, 내독소혈증, 신우신염, 잠재 혈전성정맥염, 유선염, 방광염, 산후 출혈 및 역 자궁이 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 진단, 치료 및/또는 예방될 수 있는 여성 생식계의 다른 질환 및/또는 질병으로는 예를 들어 터너 증후군, 가성반음양, 월경 전 증후군, 골반의 염증성 병, 골반 울혈(맥관의 충혈), 냉감증, 불감증, 성교 불쾌증, 자궁관 파열 및 미텔슈미츠가 있다.
감염성 질병
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 감염성 작용제를 치료하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응, 특히 B 및/또는 T 세포의 증식 및 분화를 증가시킴에 의해 감염성 질병을 치료할 수 있다. 면역 반응은 존재하는 면역 반응을 향상시키거나 새로운 면역 반응을 개시함에 의해 증가될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 면역 반응을 반드시 유도하지 않으면서도 감염성 작용제를 직접 억제할 수 있다.
바이러스는 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 질병 또는 증후군을 야기할 수 있는 감염성 작용제의 한 예이다. 바이러스의 예는 하기 DNA 및 RNA 바이러스 패밀리를 포함하나 이로 제한되지 않는다: 아르보바이러스, 아데노비리데, 아레나비리데, 아르테리바이러스, 비마피리대, 부니아비리데, 칼리시비리데, 써코비리데, 코로나비리데, 뎅기, EBV, HIV, 플라비비리데, 헤파드나비리데 (간염), 헤르페스비리데 (예컨대 거대세포 바이러스, 단순포진, 헤르페스 조스터), 모노네가바이러스 (예를 들면, 파라믹소비리데, 모르빌리바이러스, 라브도비리데), 오르쏘믹소비리데 (예를 들면, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 파라인플루엔자), 파필로마 바이러스, 파포바비리데, 파르보비리데, 피코르나비리데, 폭스비리데 (예컨대 스몰폭스 또는 백시니아), 레오비리데 (예를 들면, 로타바이러스), 레트로비리데 (HTLV-I, HTLV-II, 렌티바이러스) 및 토가비리데 (예컨대 루비바이러스). 상기 패밀리에 속하는 바이러스는 관절염, 세기관지염, 호흡기 융합 바이러스, 뇌염, 눈 감염(예를 들면, 결막염, 각막염), 만성 피로 증후군, 간염(A, B, C, E, 만성 활성, 델타), 일본의 B 뇌염, 주닌(Junin), 치쿤군야, 금 계곡 열, 황열병, 수막염, 기회성 감염(예를 들면, AIDS), 폐렴, 버키트 림프종, 수두, 출혈성 열, 홍역, 이하선염, 파라인플루엔자, 광견병, 감기, 소아마비, 백혈병, 풍진, 성교 감염증, 피부병(예를 들면, 카포시, 사마귀) 및 바이러스혈증을 포함하나 이로 제한되지 않는 다양한 질병 또는 증후군을 야기할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 상기 증후군 또는 질병을 치료하거나 검출하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오디드는 수막염, 뎅기열, EBV 또는 간염(예를 들면, 간염 B)을 치료하는데 사용된다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 하나 이상의 시판되는 다른 간염 백신에 반응을 나타내지 않는 환자를 치료하는데 사용된다. 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 AIDS를 치료하는데 사용된다.
유사하게, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 치료되거나 검출될 수 있는 질병 또는 증후군을 야기할 수 있는 세균 및 진균 작용제로는 하기 그램-음성 및 그램-양성 세균, 세균 패밀리 및 진균이 있으나, 이로 제한되지 않는다: 방선균(예를 들면, 노르카르디아), 아시네토박터(Acinetobacter), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스퍼질러스(Aspergillus), 바실라세(예를 들면, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthrasis)), 박테로이드(예를 들면, 박테로이데스 프라질리스(Bacteroides fragilis)), 분아균증, 보르데텔라, 보렐리아(예를 들면, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)), 브루셀라, 칸디다, 캄필로박터, 클라미디아, 클로스트티듐(예를 들면, 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium butulinum), 클로스트리듐 디피실(Clostridium dificile), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)), 코시디오이드, 코리네박테리움(예를 들면, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diptheriae)), 크립토코커스, 더마토사이코시스, 대장균(예컨대, 창자독소생성 대장균 및 창자출혈 대장균), 엔테로박터(예를 들면 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)), 엔테로박테리아세(클레브시엘라, 살모넬라(예컨대, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)), 세라티아, 예르시니아, 시겔라), 에르시펠로트릭스, 해모필루스(예를 들면, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 타입 B), 헬리코박터, 레지오넬라(예를 들면, 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)), 렙토스피라, 리스테리아(예를 들면, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)), 미코플라스마, 미코박테리움(예를 들면, 미코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae) 및 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 비브리오(예를 들면, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)), 네이세리아세아(예를 들면, 네이세리아 고노르헤아(Neisseria gonorrhea), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)), 파스퇴렐라세아, 프로테우스, 슈도모나스(예를 들면, 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리케치아세아, 스피로케테스(예컨대, 트레모네마 종(Treponema spp.), 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 보렐리아 종(Borrelia spp.)), 시겔라 종(Shigella spp.), 스타필로코커스(예컨대, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), 메닌지오코커스, 폐렴구균 및 스트렙토코커스(예를 들면, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 및 그룹 A, B 및 C 스트렙토코커스) 및 우레아플라즈마. 상기 세균, 기생충 및 진균 패밀리는 하기를 포함하나 이로 제한되지 않는 질병 또는 증후군을 야기할 수 있다: 항생제-내성 감염, 균혈증, 심내막염, 패혈증, 눈 감염(예를 들면, 결막염), 포도막염, 결핵, 치은염, 세균성 설사, 기회성 감염(예를 들면, AIDS 관련 감염), 조갑주위염, 보철 관련 감염, 치아 우식증, 레이터 병, 호흡기 감염, 예컨대 백일해기침 또는 농흉, 패혈증, 라임병, 고양이 긁힘병, 이질, 파라티푸스, 식중독, 레지오넬라 병, 만성 및 급성 염증, 홍반, 효모 감염, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염(예를 들면, 수막염 타입 A 및 B), 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 브루셀라증, 소화성 궤양, 탄저병, 자연 유산, 기형아, 폐렴, 폐 감염, 귀 감염, 난청, 실명, 기면증, 권태감, 구토, 만성 설사, 크론병, 대장염, 질증, 불임, 골반 염증 질병, 칸디다증, 파라결핵증, 결핵, 루푸스, 보툴리누스 중독, 괴저, 파상풍, 농가진, 류머티즘 열, 스칼렛 열, 성교 감염증, 피부병(예를 들면, 봉소염, 피부병), 독혈증, 요로 감염, 상처 감염, 병원내 감염. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 임의의 상기 증후군 또는 질병을 치료 또는 검출하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 파상풍, 디프테리아, 보툴리눔독소증 및/또는 수막염 타입 B를 치료하는데 사용된다.
더욱이, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 의해 치료, 예방 및/또는 진단될 수 있는 질병 또는 증후군을 야기하는 기생충 작용제로는 하기 패밀리 또는 클래스가 있으나 이로 제한되지 않는다: 아메바병, 바베시아증, 콕시디아증, 크립토스포리듐증, 이핵아메바병, 교역, 외부기생충, 편모충증, 연충증, 레슈마니아증, 스키스티소마, 범안열원충증, 톡소포자충증, 트리파노소마증 및 트리코모나스 및 스포로조안(예를 들면, 플라스모듐 비락스(Plasmodium virax), 플라스모듐 팔시파륨(Plasmodium falciparium), 플라스모듐 말라리아(Plasmodim malariae) 및 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale)). 상기 기생충은 옴, 쓰쓰가무시병, 눈 감염, 장질환(예를 들면, 이질, 편모충증), 간 질환, 폐 병, 기회성 감염(예를 들면, AIDS 관련), 말라리아, 임신 합병증 및 톡소포자충증을 포함하나 이로 제한되지 않는 다양한 질환 또는 증후군을 야기할 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 임의의 상기 증후군 또는 질병을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 말라리아를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 사용된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 유효량의 본 발명의 알부민 융합 단백질을 환자에게 투여하거나, 환자로부터 세포를 제거하고, 본 발명의 폴리누클레오티드를 세포에 제공하고, 공학처리된 세포를 환자에게 반환시킴(생체외 요법)에 의해 적용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 감염성 질병에 대한 면역 반응을 일으키기 위한 백신에서 항원으로서 사용될 수 있다.
재생
*본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 조직의 재생을 유도하기 위해 세포를 분화, 증식 및 유인하는데 사용될 수 있다 (참조, Science 276:59-87(1997)). 조직의 재생은 선천적인 결함, 외상(상처, 화상, 절개 또는 궤양), 나이, 병(예를 들면 골다공증, 골관절염, 치주질환, 간 기능부전), 미용 성형 수술을 포함하는 수술, 섬유화, 재관류 손상 또는 전신의 사이토킨 손상에 의해 손상된 조직을 수복, 교체 또는 보호하는데 사용될 수 있었다.
본 발명을 이용하여 재생될 수 있었던 조직으로는 기관(예컨대, 췌장, 간, 창자, 신장, 피부, 내피), 근육(평활근, 골격근 또는 심근), 맥관(관 및 림프관 포함), 신경, 조혈 및 골격(뼈, 연골, 힘줄, 및 인대) 조직이 있다. 바람직하게는, 재생이 흉터없이 또는 흉터형성을 감소시키며 발생한다. 재생은 또한 혈관신생을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 치료하기 어려운 조직의 재생을 증가시킬 수 있다. 예를 들어 증가된 힘줄/인대 재생이 손상 후 회복 시간을 촉진할 것이다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 손상을 회피하기 위해 예방학적으로 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 특정 질병으로는 힘줄염, 손목굴 증후군 및 다른 힘줄 또는 인대 결함이 있다. 비치유성 상처의 조직 재생의 추가의 예로는 압력 궤양, 맥관 기능부족과 관련된 궤양, 수술 및 외상 상처가 있다.
유사하게, 신경 및 뇌 조직이 신경 세포를 증식 및 분화시키는 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하여 재생될 수 있다. 상기 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질병으로는 중추 및 말초 신경계 질환, 신경병증 또는 기계적 및 외상 질병(예컨대 척수 질병, 두부 외상, 뇌혈관 질환 및 뇌졸중)이 있다. 구체적으로, 말초 신경 상처와 관련된 질환, 말초신경병증(예를 들면, 화학 요법 또는 다른 의학 치료에서 초래됨)과, 국소 신경병증 및 중추 신경계 질환 (예컨대, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅톤 무도병, 근위축성 측색 경화증 및 샤이-드래거 증후군)은 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하여 완전히 치료될 수 있었다.
위장 질환
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 염증성 질환 및/또는 장애, 감염, 암(예를 들면, 장의 신생물(소장의 카르시노이드 종양, 소장의 비호지킨 림프종, 소장 림프종) 및 궤양, 예컨대 소화 궤양을 포함하는 위장 질환을 치료, 예방, 진단 및/또는 예지하는데 사용될 수 있다.
위장 질환으로는 연하곤란, 연하통, 식도의 염증, 소화성식도염, 위의 역류, 부점막 섬유화 및 협착, 말로리-바이스 병변, 평활근종, 지방종, 표피암, 생암종, 위 축적 장애, 위장관염, 위 위축, 위(gastric)/위(stomach) 암, 위의 폴립, 악성 빈혈과 같은 자가면역 질병, 유문협착증, 위염(세균, 바이러스, 호산구, 스트레스성, 만성 미란, 위축, 혈장 세포 및 메네트리아) 및 복막질환(예를 들면, 카일로페리오늄, 혈복강, 장간막낭, 장간막림프절염, 장간막의 맥관 폐색, 지방층염, 신생물, 복막염, 기복증, 횡경막하 농양)이 있다.
위장 질환은 또한 소장과 관련된 질환, 예컨대 흡수장애 증후군, 팽창, 민감성 장 증후군, 당류 불관용, 만성소화장애증, 십이지장 궤양, 십이지장염, 열대성 스푸루, 위플 병, 장림프관 확장증, 크론 병, 충수염, 회장 폐쇄, 멕켈 게실, 다발성 게실, 소장 및 대장의 완전 회전 실패, 림프종, 및 세균 및 기생충 질병(예컨대 여행자 설사, 장티푸스 및 파라티푸스, 콜레라, 회충(아스카리아시스 룸브리코이데스(Ascariasis lumbricoides)), 구충(안실로스토마 듀오데날(Ancylostoma duodenale)), 요충(엔테로비우스 베르미쿨라리스(Enterobius vermicularis)), 조충(타에니아 사기나타(Taenia saginata), 에치노코커스 그라눌로서스(Echinococcus granulosus), 디필로보트륨 종(Diphyllobothrium spp.) 및 타에니아 솔륨(T. solium))에 의한 감염을 포함한다.
간 질환 및/또는 질병은 간내 담즙 울체(알라질 증후군, 담즙성 간경변증), 지방간(알코올성 지방간, 레이 증후군), 간 정맥 혈전증, 간렌즈핵 퇴보, 간종, 간허파 증후군, 간신 증후군, 문맥 고혈압(식도 및 위 정맥류), 간 농양(아메바성 간 농양), 간경화(알코올성, 담즙성 및 실험성), 알코올성 간 질환(지방간, 간염, 경화증), 기생충(간 포낭충증, 간질증, 아메바성 간 농양), 황달(용혈성, 간세포성 및 담즙성), 담즙 정체, 문맥 고혈압, 간 비대, 복수, 간염(알코올성 간염, 동물성 간염, 만성 간염(자가면역, 간염 B, 간염 C, 간염 D, 약물 유도), 독성 간염, 바이러스 인간 간염(간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 D, 간염 E)), 윌슨병, 육아종성 간염, 이차 담즙성 간경변증, 간성 뇌증, 문맥 고혈압, 정맥류, 간성 뇌증, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성담관염, 간세포성 선종, 혈관종, 담즙 돌, 간 기능부전(간성 뇌증, 급성 간 기능부전) 및 간 신생물(혈관 근육 지방종, 석회성 간 전이, 포낭성 간 전이, 상피성 종양, 섬유표층 간암, 국소 결절성 과형성, 간 샘종, 간담즙성 낭선종, 간모세포종, 간 세포암, 간암, 간 암, 간 혈관내피종, 중간엽 과오종, 간의 중간엽 종양, 결절성 재생 과형성, 양성 간 종양(간장 포낭 [단순 포낭, 다낭포간 병, 간담즙성 낭선종, 총담관낭], 중간엽 종양 [중간엽 과오종, 유아의 혈관내피종, 혈관종, 간자반병, 지방종, 염증성 가종양, 미셀라너스], 상피 종양 [담관 상피 (담관 과오종, 담관 선종), 간세포(선종, 국소 결절성 과형성, 결절성 재생 과형성)], 악성 간 종양 [간세포성, 간모세포종, 간 세포암, 담관세포, 담관암종, 낭선암종, 혈관의 종양, 맥관육종, 카포시 육종, 혈관내피종, 기타 종양, 배아 육종, 섬유육종, 평활근육종, 횡문근 육종, 암육종, 테라토마, 유암종, 인편장 암, 일차 림프종], 간자반병, 적혈구간성 포르피린증, 간, 포르피린증(급성 간헐성 포르피린증, 만발성 피부포르피린증), 젤웨거 증후군)을 포함한다.
췌장 질환 및/또는 질병으로는 급성 췌장염, 만성 췌장염(급성 괴사 췌장염, 알코올성 췌장염), 신생물(췌장의 생암종, 낭선암종, 인슐리도마, 다발성 위궤양 및 글루카곤종양, 포낭성 신생물, 도세포 종양, 췌장모세포종), 및 기타 췌장 질환(예컨대, 낭성 섬유증, 포낭(췌장 가성낭포, 췌장 샛길, 기능부족))이 있다.
담낭 질환은 담석(담석증 및 총담관 결석증), 담낭절제후 증후군, 담낭 계실, 급성 담낭염, 만성 담낭염, 담관 종양 및 점액류를 포함한다.
대장의 질병 및/또는 질환으로는 항생제 관련 대장염, 게실염, 궤양성 대장염, 후천성 거대결장증, 농양, 진균 및 세균 감염, 항문직장 질병(예를 들면, 틈새, 치질), 결장 질환(대장염, 결장 신생물 [결장암, 샘종 결장 폴립(예컨대, 융모 샘종), 결장 암종, 결장직장 암], 결장 게실염, 결장 게실증, 거대결장증 [허쉬스프렁 병, 독성 거대결장증]; 구불창자 질병[직장결장염, 시그모인 신생물]), 변비, 크론병, 설사(영아 설사, 이질), 십이지장 질병(십이지장 신생물, 십이지장 폐쇄, 십이지장 궤양, 십이지장염), 장염(소장결장염), HIV 장병증, 회장 질환(회장 신생물, 회장염), 면역증식성 소장 질환, 선천적인 장 질병(궤양성 대장염, 크론병), 장 폐쇄, 기생충 질병(아니사키스증, 발란티듐증, 주머니배 감염, 크립토스포리듐증, 이핵아메바증, 아메바성 이질, 편모충증), 장루(직장루), 장의 신생물(맹장 신생물, 결장 종양, 십이지장 신생물, 회장 신생물, 장 폴립, 공장 신생물, 직장 신생물), 장의 폐쇄(구심성 고리 증후군, 십이지장 폐쇄, 매복 대변, 장의 유사 폐쇄 [맹장의 장축염전증], 중적), 장의 천공, 장의 폴립(결장 폴립, 가드너 증후군, 퓨츠-제거스 증후군), 공장 질병(공장 신생물), 흡수 장애 증후군(눈먼 고리 증후군, 소아만성소화장애증, 락토오스 불관용증, 작은창자 증후군, 열대성 스푸루, 위플 병), 장간막의 맥관 폐색, 장벽낭상기종, 단백질-손실 장병증(장 림프확대), 직장 질병(항문 병, 분실금, 치질, 직장염, 직장루, 직장탈, 직장류), 소화성 궤양(십이지장 궤양, 소화성식도염, 출혈, 천공, 위 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군), 위절제후 증후군(덤핑 증후군), 위 질병(예를 들면 무위산증, 위십이지장 역류(담즙 역류), 위 전정 맥관 확장증, 위루, 위날문 폐쇄, 위염(위축성 또는 비후성이다), 위 마비, 위 팽창, 위 게실, 위 신생물(위암, 위의 폴립, 위의 선암종, 증식성 위의 폴립), 위 파열, 위 궤양, 위염전), 결핵, 내장하수증, 구토(예컨대, 토혈, 임신 입덧, 수술후 욕지기 및 구토) 및 출혈성 결장염이 있다.
위장 시스템의 추가의 질병 및/또는 질환은 담도 질환(예컨대 위벽파열, 누공(예를 들면, 담도루공, 식도루, 위루, 장루, 췌루), 신생물(예를 들면 담도 신생물, 식도 신생물, 예컨대 식도의 샘암종, 식도 편평세포암종, 위장 신생물, 췌장 신생물, 예컨대 췌장의 선암종, 췌장의 점액 포낭성 신생물, 췌장 포낭성 신생물, 쓸개모세포종 및 복막 신생물), 식도 질병(예를 들면 수포성 병, 칸디다증, 글리코겐의 극세포증, 궤양화, 바렛 식도 정맥류, 폐쇄증, 포낭, 게실(예컨대, 젠커 게실), 누공(예를 들면, 기관식도루), 운동성 질병(예를 들면, CREST 증후군, 연하 장애, 아카라시아, 경련, 위 식도의 역류), 신생물, 천공(예를 들면, 뵈르하브 증후군, 말로리-바이스 증후군), 협착, 식도염, 횡경막의 탈장(예를 들면, 틈새 헤르니아), 위장 질병, 예컨대 위장관염(예를 들면, 급성 위장염, 노르워크 바이러스 감염), 출혈(예를 들면, 토혈, 흑색변, 소화성 궤양 출혈), 위 신생물(위의 암, 위의 폴립, 위의 선암종, 위암), 탈장(예를 들면, 선천적인 횡격막 탈장, 대퇴 탈장, 서혜부 탈장, 폐쇄공 탈장, 탯줄 탈장, 복부 탈장) 및 장 질환(예를 들면, 맹장 질환(충수염, 맹장의 신생물))을 포함한다.
화학주성
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 화학주성 활성을 지닐 수 있다. 화학주성 분자는 세포(예컨대, 단핵구, 섬유모세포, 호중구, T-세포, 비만 세포, 호산구, 상피 및/또는 내피 세포)를 신체의 특정 부위, 예컨대 염증, 감염 또는 과증식 부위로 유인하거나 이동시킨다. 이동된 세포는 이후 특정 외상 또는 비정상과 싸우고/거나 치료한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 특정 세포의 화학주성을 증가시킬 수 있다. 상기 화학주성 분자는 이후 신체내 특정 부위에 표적화된 세포의 수를 증가시킴에 의해 염증, 감염, 과증식 질병 또는 임의의 면역계 이상을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 화학주성 분자는 손상된 부위에 면역 세포를 유인하여 상처 및 조직에 대한 다른 외상을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화학주성 분자는 또한 상처를 치료하는데 사용될 수 있는 섬유모세포를 유인할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 화학주성 활성을 억제할 수 있는 것으로 고려된다. 상기 분자는 또한 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 화학주성의 억제제로서 사용될 수 있다.
결합 활성
본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질의 치료적 단백질 부분에 결합하는 분자 또는 융합 단백질의 치료적 단백질 부분이 결합되는 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 융합 단백질 및 분자의 결합은 융합 단백질 또는 결합된 분자의 활성을 활성화(효능제), 증가, 억제(길항제) 또는 감소시킬 수 있다. 그러한 분자의 예로는 항체, 올리고누클레오티드, 단백질(예컨대 수용체) 또는 소 분자가 있다.
바람직하게는, 분자는 본 발명의 융합 단백질의 치료적 단백질 부분의 천연 리간드, 예컨대 리간드의 단편, 천연 기질, 리간드, 구조적 또는 기능적 유사체와 밀접하게 관련이 있다. [참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)]. 유사하게, 분자는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분이 결합하는 천연 수용체, 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분에 의해 결합될 수 있는 적어도 수용체의 단편(예컨대, 활성 부위)과 밀접하게 관련될 수 있다. 어느 쪽이든, 분자는 공지된 기술을 사용하여 적절하게 고안될 수 있다.
상기 분자의 스크리닝은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현시키는 적합한 세포의 생성을 수반하는 것이 바람직하다. 바람직한 세포는 포유동물, 효모, 드로소필라 또는 대장균으로부터의 세포를 포함한다.
검정은 본 발명의 알부민 융합 단백질에 대한 후보 화합물의 결합을 단순히 시험해볼 수 있는데, 이 때 결합은 표지에 의해 검출되거나 표지된 경쟁자와의 경쟁을 포함하는 검정으로 검출된다. 추가로, 검정은 후보 화합물이 융합 단백질과의 결합에 의해 생성된 시그널을 초래하는지를 검사할 수 있다.
대안적으로, 검정은 무-세포 제조물, 고형 지지체에 고정된 융합 단백질/분자, 화학 라이브러리 또는 천연 생성물 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다. 검정은 또한 단순히 후보 화합물을 알부민 융합 단백질을 함유하는 용액과 혼합시키는 단계, 융합 단백질/분자 활성 또는 결합을 측정하는 단계, 및 표준과 융합 단백질/분자 활성 또는 결합을 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게는, ELISA 검정으로 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 이용하여 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)에서 융합 단백질의 레벨 또는 활성을 측정할 수 있다. 항체는 알부민 융합 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합하거나, 기질에 대해 알부민 융합 단백질을 경쟁시킴에 의해 융합 단백질의 레벨 또는 활성을 측정할 수 있다.
추가로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분이 결합하는 수용체는 당업자에게 공지된 수많은 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 분류 (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991))에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질의 치료적 단백질 부분이 FGF에 상응하는 경우, 알부민 융합 단백질에 반응성인 세포, 예를 들어 FGF 패밀리 단백질에 대한 다중 수용체를 함유하는 것으로 공지되어 있는 NIH3T3 세포, 및 SC-3 세포로부터 폴리아데닐화된 RNA가 제조되고 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리가 푸울로 나뉘어 COS 세포 또는 알부민 융합 단백질에 반응하지 않는 다른 세포를 트랜스펙션하는데 사용되는 발현 클로닝이 적용될 수 있다. 유리 슬라이드에서 성장된 트랜스펙션된 세포를 표지한 후 본 발명의 알부민 융합 단백질에 노출시킨다. 알부민 융합 단백질은 부위-특이적 단백질 키나아제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 봉입을 포함하는 다양한 방법에 의해 표지될 수 있다.
고정 및 인큐베이션 후, 슬라이드를 자동-방사선 분석한다. 양성 푸울을 동정하고, 서브-푸울을 제조하고 반복적인 서브-풀링 및 재스크리닝 과정을 이용하여 재트랜스펙션시켜 실제로 추정되는 수용체를 엔코딩하는 단일 클론을 수득한다.
수용체 동정에 관한 대안적인 접근법으로서, 표지된 알부민 융합 단백질을 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 성분에 대한 수용체 분자를 발현시키는 세포막 또는 추출 제조물과 광친화성 연결시킬 수 있고, 연결된 물질은 PAGE 분석에 의해 용해되어 X-레이 필름에 노출될 수 있다. 융합 단백질의 수용체를 함유하는 표지된 복합체는 절제, 펩티드 단편에 용해 및 단백질 마이크로시퀀싱될 수 있다. 마이크로시퀀싱으로 수득된 아미노산 서열은 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 일련의 퇴보 올리고누클레오티드 프로브를 고안하는데 사용되어 추정되는 수용체를 엔코딩하는 유전자를 동정할 것이다.
더욱이, 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(총괄하여 "DNA 셔플링"으로 언급함)의 기술은 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분 또는 알부민 성분의 활성을 조절하는데 적용되어 본 발명의 알부민 융합 단백질의 효능제 및 길항제를 효과적으로 생성할 수 있다. [참조, 일반적으로 U.S. Patent Nos. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, and 5,837,458, and Patten, P. A., et al ., Curr . Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, S. Trends Biotechnol . 16(2):76-82 (1998); Hansson, L. O., et al ., J. Mol . Biol . 287:265-76 (1999); and Lorenzo, M. M. and Blasco, R. Biotechniques 24(2):308-13 (1998); 상기 특허 및 공개문헌의 각각은 본원에 참조로서 포함됨]. 일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 변경, 및 그에 의해 엔코딩되는 알부민 융합 단백질이 DNA 셔플링에 의해 달성될 수 있다. DNA 셔플링은 동형, 또는 부위 특이적 재조합에 의해 둘 이상의 DNA 세그먼트를 요망되는 분자에 어셈블링하는 것을 포함한다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 및 그에 의해 엔코딩되는 알부민 융합 단백질이 재조합 이전에 에러-프론 PCR, 랜덤 누클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의해 랜덤 전이됨으로써 변경될 수 있다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등은 하나 이상의 동형 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 동형 분자는 패밀리 멤버이다. 추가로 바람직한 구체예에서, 동형 분자는 성장 인자, 예컨대 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), 형질전환 성장 인자 (TGF)-알파, 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), TGF-베타, 골 형태형성 단백질(BMP)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, 액티빈 A 및 B, 데카펜타플레직(dpp), 60A, OP-2, 오르살린, 성장 분화 인자(GDFs), 결절, MIS, 인히빈-알파, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타5, 및 아교세포-유래된 향신경 인자(GDNF)이다.
다른 바람직한 단편은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분 및/또는 알부민 성분의 생물학적으로 활성인 단편이다. 생물학적으로 활성인 단편은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분 및/또는 알부민 성분의 활성과 반드시 동일할 필요는 없으나 유사한 활성을 나타내는 것들이다. 단편의 생물학적 활성은 개선된 요망되는 활성, 또는 감소된 요망되지 않는 활성을 포함할 수 있다.
부가적으로, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 작용을 조절하는 것들을 동정하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 그러한 검정의 예는 섬유모세포가 정상적으로 증식하는 세포 배양 조건하에 포유동물 섬유모세포, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 스크리닝되는 화합물 및 3[H] 티미딘을 조합시키는 것을 포함한다. 대조군 검정은 스크리닝되는 화합물의 부재하에 수행될 수 있고, 이것을 화합물의 존재하에 이루어진 섬유세포 증식 정도와 비교하는데 3[H] 티미딘의 흡수를 측정함에 의해 각 경우에 화합물이 증식을 자극하는지를 결정한다. 섬유모세포 증식 정도는 3[H] 티미딘의 혼입을 측정하는 액체 섬광 크로마토그래피에 의해 측정된다. 효능제 및 길항제 화합물 둘 모두가 상기 공정에 의해 동정될 수 있다.
또 다른 방법에서, 본 발명의 융합 화합물의 치료적 단백질 성분에 대한 수용체를 발현시키는 포유동물 세포 또는 막 제조물을 화합물의 존재하에 본 발명의 표지된 융합 단백질과 함께 인큐베이션한다. 이후 이러한 상호작용을 증진시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다. 대안적으로, 스크리닝되는 화합물의 상호작용 이후 공지된 제2 메신져 시스템의 반응 및 수용체가 결정되며, 수용체에 결합하여 제2 메신져 반응을 유도하는 화합물의 능력을 측정하여 화합물이 잠재적인 융합 단백질인지를 결정한다. 이러한 제2 메신져 시스템은 cAMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노사이티드 가수분해를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
이러한 상기 검정은 모두 진단 또는 예후 마커로서 사용될 수 있다. 상기 검정을 이용하여 발견된 분자는 질병을 치료하거나, 융합 단백질/분자를 활성화시키거나 억제하여 환자에게서 특정 결과(예컨대, 혈관 성장)를 초래하는데 이용될 수 있다. 더욱이, 상기 검정은 적합하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 본 발명의 알부민 융합 단백질의 생성을 억제 또는 향상시킬 수 있는 작용제를 발견할 수 있다.
따라서, 본 발명은 (a) 후보 결합 화합물을 본 발명의 알부민 융합 단백질과 함께 인큐베이션시키는 단계; 및 (b) 결합이 발생하였는지를 측정하는 단계를 포함하여, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하는 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 (a) 후보 화합물을 본 발명의 알부민 융합 단백질과 함께 인큐베이션시키는 단계, (b) 생물학적 활성을 검정하는 단계, 및 (c) 융합 단백질의 생물학적 활성이 변경되었는지를 측정하는 단계를 포함하여, 효능제/길항제를 동정하는 방법을 포함한다.
표적 전달
또다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 성분에 대한 수용체를 발현시키는 표적 세포에 조성물을 전달하는 방법을 제공한다.
본원에서 논의된 대로, 본 발명의 융합 단백질은 소수성, 친수성, 이온성 및/또는 공유 상호작용을 통해 이종 폴리펩티드, 이종 핵산, 톡신 또는 전구약물에 결합될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 핵산과 결합된 본 발명의 융합 단백질(항체 포함)을 투여함에 의해 본 발명의 조성물을 세포에 특이적으로 전달하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 본 발명은 치료 단백질을 표적 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 또다른 실시예에서, 본 발명은 단일 가닥 핵산(예컨대, 안티센스 또는 리보자임) 또는 이중 가닥 핵산(예컨대, 세포의 게놈에 통합되거나 에피솜에 의해 복제될 수 있고 전사될 수 있는 DNA)을 표적 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질(예컨대, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 항체)을 톡신 또는 세포독성 전구약물과 함께 투여함에 의해 세포를 특이적으로 파괴(예컨대, 종양 세포의 파괴)하는 방법을 제공한다.
"톡신"이란 내인성 이펙터 시스템에 결합하여 활성화되는 화합물, 방사성동위원소, 홀로톡신, 개질된 톡신, 톡신의 촉매적 서브유닛, 또는 규정된 조건하에 세포 치사를 야기하는, 세포의 표면에 또는 표면상에 정상적으로 존재하지 않는 임의의 분자 또는 효소를 의미한다. 본 발명의 방법에 따라 이용될 수 있는 톡신으로는 당 분야에 공지된 방사성동위원소, 예를 들어 고유의 또는 유도된 내인성 세포독성 이펙터 시스템과 결합하는 항체(또는 이의 일부를 함유하는 보체 결합)와 같은 화합물, 티미딘 키나제, 엔도누클레아제, RNAse, 알파 톡신, 리신, 아브린, 슈도모나스(Pseudomonas) 엑소톡신 A, 디프테리아 톡신, 사포린, 모모르딘, 게로닌, 억새풀 항바이러스 단백질, 알파-사르신 및 콜레라 톡신이 있으나, 이로 제한되지 않는다. "세포독성 전구약물"이란 세포에 정상적으로 존재하는 효소에 의해 세포독성 화합물로 전환되는 비독성 화합물을 의미한다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 세포독성 전구약물에는 벤조산 머스타드 알킬화제의 글루타밀 유도체, 에토포사이드 또는 미토마이신 C의 인산염 유도체, 사이토신 아라비노사이드, 다우노루비신 및 독소루비신의 페녹시아세트아미드 유도체가 있으나, 이로 제한되지 않는다.
약물 스크리닝
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분에 상응하는 단백질의 활성을 개질시키는 분자를 스크리닝하기 위한 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 용도가 또한 고려된다. 상기 방법은 융합 단백질을 길항제 또는 효능제 활성을 지닐 것으로 의심되는 선택된 화합물(들)과 접촉시키고 결합 이후 융합 단백질의 활성을 검정하는 것을 포함할 것이다.
본 발명은 특히 다양한 약물 스크리닝 기술 중 어느 하나에서 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 결합 단편을 사용하여 치료적 화합물을 스크리닝하는데 유용하다. 상기 시험에 적용되는 알부민 융합 단백질은 고체 지지체에 고정되거나 용액 없이 세포 표면상에서 발현되거나 세포내에 정위된다. 약물 스크리닝의 한 방법은 알부민 융합 단백질을 발현시키는 재조합 핵산으로 안정하게 형질전환되는 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 사용하는 것이다. 경쟁적인 결합 검정에서 상기 세포를 배양하여 수득된 형질전환된 세포 또는 상청액에 대해 약물이 스크리닝된다. 예를 들어 시험되는 작용제 및 본 발명의 알부민 융합 단백질의 복합체의 제형화를 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 매개되는 활성에 영향을 주는 약물 또는 임의의 다른 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 작용제를 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키고 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 작용제 및 알부민 융합 단백질 또는 이의 단편과의 복합체의 존재를 검정하는 것을 포함한다. 상기 경쟁적인 결합 검정에서, 스크리닝을 위한 작용제는 통상적으로 표지된다. 인큐베이션 후, 유리 작용제를 결합된 형태로 존재하는 것으로부터 분리하며, 유리 표지 또는 복합되지 않은 표지의 양이 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하는 특정 작용제의 능력치이다.
약물 스크리닝에 대한 또다른 기술은 본 발명의 알부민 융합 단백질에 대해 적합한 결합 친화력을 지니는 화합물에 대한 높은 처리량의 스크리닝을 제공하며, 이것은 본원에 참조로서 포함되고 1984년 9월 13일 공개된 유럽 특허 출원 84/03564호에 매우 상세히 기술되어 있다. 간단히 언급하자면, 많은 수의 상이한 소형 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고체 기질상에서 합성한다. 펩티드 시험 화합물을 본 발명의 알부민 융합 단백질과 반응시키고 세척한다. 결합된 펩티드를 이후 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 검출한다. 정제된 알부민 융합 단백질은 상기 언급된 약물 스크리닝 기술에 사용되는 플레이트에 직접 코팅될 수 있다. 또한, 비중화 항체가 펩티드를 포획하여 고체 지지체상에 이것을 고정시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질과 결합할 수 있는 중화 항체가 알부민 융합 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 시험 화합물과 특이적으로 결합하는 경쟁적인 약물 스크리닝 검정의 사용에 대해 고찰한다. 이러한 방식으로, 항체는 하나 이상의 항원성 에피토프를 본 발명의 알부민 융합 단백질과 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하는데 사용된다.
결합 펩티드 및 기타 분자
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질과 결합하는 폴리펩티드 및 비폴리펩티드를 동정하는 방법, 및 그에 의해 동정된 결합 분자를 포함한다. 이러한 결합 분자는 예를 들어 본 발명의 알부민 융합 단백질의 효능제 및 길항제로서 유용하다. 상기 효능제 및 길항제는 본 발명에 따라 하기 상세하게 기술된 치료 구체예에 사용될 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 다수의 분자와 접촉하는 단계; 및 알부민 융합 단백질과 결합된 분자를 동정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 다수의 분자와 접촉시키는 단계는 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 알부민 융합 단백질을 고체 지지체상에 고정시키고 다수의 분자를 고정된 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 고려해 볼 수 있다. 이러한 절차는 친화력 매트릭스가 본 발명의 고정된 알부민 융합 단백질로 구성된 친화력 크로마토그래피 공정과 유사할 것이다. 알부민 융합 단백질에 대해 선택적인 친화력을 지니는 분자는 이후 친화력 선별에 의해 정제될 수 있다. 고체 지지체, 고체 지지체에 알부민 융합 단백질의 부착 공정, 용매 및 친화력 분리 또는 선별 조건의 특징은 매우 통상적인 것이며 당업자에게 널리 공지되어 있다.
대안적으로 다수의 폴리펩티드를 개별적인 폴리펩티드의 서브셋을 포함하는 실질적으로 분리된 분획으로 분리할 수 있다. 예를 들어, 다수의 폴리펩티드를 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피 또는 폴리펩티드의 선별을 위해 당업자에게 공지된 유사한 방법에 의해 분리할 수 있다. 개별적인 폴리펩티드는 또한 그 외부 표면상에 또는 그 부근에 발현되기 위해 (예컨대, 재조합 파지) 상기 방식으로 형질전환된 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다. 개별적인 분리물은 이후, 발현에 필요한 유도인자의 존재 또는 부재하에 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 "프로빙(probed)"될 수 있으며, 이는 임의의 선택적인 친화력 상호작용이 알부민 융합 단백질 및 개별적인 클론간에 발생하는지를 결정한다. 알부민 융합 단백질을 개별적인 폴리펩티드를 포함하는 각 분획과 접촉시키기 전에, 폴리펩티드는 먼저 부가적인 편의를 위해 고체 지지체로 옮겨질 수 있다. 상기 고체 지지체는 단순히 필터 막의 한 조각, 예컨대 니트로셀룰로오스 또는 나일론으로 제조된 것일 수 있다. 이러한 방식으로, 양성 클론이 발현 라이브러리의 형질전환된 숙주 세포의 수집물로부터 동정될 수 있고, 이것은 본 발명의 알부민 융합 단백질에 대해 선택적인 친화력을 지니는 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 구성물을 포함한다. 더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 대해 선택적인 친화력을 지니는 폴리펩티드의 아미노산 서열은 통상적인 방법에 의해 직접 결정될 수 있거나, 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA의 코딩 서열은 종종 보다 편리하게 결정될 수 있다. 일차 서열은 이후 상응하는 DNA 서열로부터 추론될 수 있다. 아미노산 서열이 폴리펩티드 자체로부터 결정되는 경우, 마이크로시퀀싱 기술을 이용할 수 있다. 시퀀싱 기술은 질량 분광학을 포함할 수 있다.
특정 경우에, 선택적인 친화력 상호작용의 존재를 결정하거나 검출하기 전에 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 다수의 폴리펩티드의 혼합물로부터 임의의 결합되지 않은 폴리펩티드를 세척하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 세척 단계는 특히 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 다수의 폴리펩티드가 고체 지지체상에 결합되는 경우에 바람직할 수 있다.
상기 방법에 따라 제공된 다수의 분자는 다양한 라이브러리, 예컨대 본 발명의 알부민 융합 단백질과 특이적으로 결합하는 분자에 대해 스크리닝될 수 있는 랜덤 또는 조합 펩티드 또는 비펩티드 라이브러리에 의해 제공될 수 있다. 사용될 수 있는 많은 라이브러리, 예컨대 화학적으로 합성된 라이브러리, 재조합(예컨대 파지 디스플레이 라이브러리) 및 시험관내 번역-기재 라이브러리가 당 분야에 공지되어 있다. 화학적으로 합성된 라이브러리의 예가 문헌[Fodor et al., Science 251:767-773 (1991); Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991); Lam et al., Nature 354:82-84 (1991); Medynski, Bio/Technology 12:709-710 (1994); Gallop et al., J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251 (1994); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426 (1994); Houghten et al., Biotechniques 13:412 (1992); Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618 (1994); Salmon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712 (1993); PCT Publication No. WO 93/20242; and Brenner and Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992)]에 기술되어 있다.
파지 디스플레이 라이브러리의 예가 문헌[Scott et al., Science 249:386-390 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990); Christian et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718 1992); Lenstra, J. Immunol. Meth. 152:149-157 (1992); Kay et al., Gene 128:59-65 (1993); and PCT Publication No. WO 94/18318 dated Aug. 18, 1994]에 기술되어 있다.
시험관내 번역-기재 라이브러리가 문헌[PCT Publication No. WO 91/05058 dated Apr. 18, 1991; and Mattheakis et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994)]에 기술되어 있으나 이로 제한되지 않는다.
비펩티드 라이브러리의 예로서, 벤조디아제핀 라이브러리(참조, 예컨대 Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712 (1994))가 사용될 수 있다. 펩토이드 라이브러리(Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992))가 또한 사용될 수 있다. 펩티드 중 아미드 작용기가 과메틸화되어 화학적으로 형질전환된 조합 라이브러리를 생성하는 사용될 수 있는 라이브러리의 또다른 예가 문헌[Ostresh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142 (1994)]에 기술되어 있다.
본 발명에서 유용한 비펩티드 라이브러리의 종류는 많다. 예를 들어 엑커(Ecker) 및 크루키(Crooke) [Bio/Technology 13:351-360 (1995)]는 다양한 라이브러리의 기초를 형성하는 화학 종 중에서도 벤조디아제핀, 하이단토인, 피페라진디온, 비페닐, 당류 유사체, 베타-메르캅토케톤, 아릴아세트산, 아실피페리딘, 벤조피란, 쿠반, 크산틴, 아민이미드 및 옥사졸론을 목록으로 제공한다.
비펩티드 라이브러리는 크게 두 유형으로 분류될 수 있다: 데코레이션된 단량체 및 올리고머. 데코레이션된 단량체 라이브러리는 다양한 작용기가 첨가된 비교적 단순한 골격 구조를 이용한다. 종종 골격은 공지된 유용한 약리 활성을 지니는 분자일 것이다. 예를 들어, 골격은 벤조디아제핀 구조일 수 있다.
비펩티드 올리고머 라이브러리는 단량체의 순서에 따라 신규한 형태를 생성하는 방식으로 함께 어셈블링되는 많은 수의 단량체를 이용한다. 단량체 유닛 중에서 사용되는 것은 카르바메이트, 피롤리논 및 모르폴리논이다. 측쇄가 알파 탄소가 아닌 알파 아미노기에 부착되는 펩토이드, 펩티드-유사 올리고머는 비펩티드 올리고머 라이브러리의 또다른 변형의 기초를 형성한다. 첫번째 비펩티드 올리고머 라이브러리는 단일 유형의 단량체를 사용하였으므로 반복적인 백본을 함유하였다. 최근의 라이브러리는 하나 이상의 단량체를 사용하여, 유연성이 부가된 라이브러리를 제공한다.
라이브러리를 스크리닝하는 것은 통상적으로 공지된 다양한 방법 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다. [예컨대, 펩티드 라이브러리의 스크리닝을 기술하고 있는 하기 참조문헌 참조: Parmley et al., Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218 (1989); Scott et at,. Science 249:386-390 (1990); Fowlkes et at., BioTechniques 13:422-427 (1992); Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397 (1992); Yu et at., Cell 76:933-945 (1994); Staudt et al., Science 241:577-580 (1988); Bock et at., Nature 355:564-566 (1992); Tuerk et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992 (1992); Ellington et al., Nature 355:850-852 (1992); U.S. Pat. No. 5,096,815, U.S. Pat. No. 5,223,409, and U.S. Pat. No. 5,198,346, all to Ladner et al.; Rebar et al., Science 263:671-673 (1993); and PCT Publication No. WO 94/18318].
특정 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 결합하는 분자를 동정하기 위한 스크리닝은 라이브러리 멤버를 고체상에 고정된 본 발명의 알부민 융합 단백질과 접촉시키고 알부민 융합 단백질과 결합된 라이브러리 멤버를 수집함에 의해 수행된다. "패닝(panning)" 기술로서 언급되는 상기 스크리닝 방법의 실시예가 문헌[Parmley et at., Gene 73:305-318 (1988); Fowlkes et at., BioTechniques 13:422-427 (1992); PCT Publication No. WO 94/18318; 및 본원에 인용된 참조문헌]에 예로서 기술되어 있다.
또다른 구체예에서, 효모에서 상호작용하는 단백질을 선별하기 위한 2-하이브리드 시스템이 (Fields et at., Nature 340:245-246 (1989); Chien et at., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991)) 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 분자를 동정하기 위해 사용될 수 있다.
결합 분자가 폴리펩티드일 때, 폴리펩티드는 랜덤 펩티드 라이브러리, 조합 펩티드 라이브러리 또는 바이어싱된 펩티드 라이브러리를 포함하는 임의의 펩티드 라이브러리로부터 편리하게 선택될 수 있다. "바이어싱된"이란 용어는 라이브러리를 생성하는 방법을 조작함에 의해 이 경우의 펩티드에서 분자의 생성된 수집물의 다양성을 좌우하는 하나 이상의 파라미터를 제한함을 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
따라서, 정확한 랜덤 펩티드 라이브러리는 펩티드의 소정의 위치에서 특정 아미노산을 발견할 확률이 모든 20개의 아미노산에 대해 동일한 펩티드의 수집물을 생성할 것이다. 그러나, 예를 들어 라이신이 모든 다섯번째 아미노산에 존재하거나 단지 아르기닌만을 포함하도록 고정된 데카펩티드 라이브러리의 4, 8 및 9 위치에 존재하도록 특정함에 의해 바이어스가 라이브러리에 도입될 수 있다. 명백하게, 많은 유형의 바이어스가 고려될 수 있고, 본 발명은 임의의 특정 바이어스에 제한되지 않는다. 더욱이, 본 발명은 파지 디스플레이된 펩티드 라이브러리 및 람다 파지 벡터와 함께 DNA 삽입을 포함하는 DNA 구성물과 같이, 특정 유형의 펩티드 라이브러리를 고찰한다.
상기 언급된 대로, 폴리펩티드인 결합 분자의 경우에, 폴리펩티드는 약 6개 내지 약 60개 미만의 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 6개 내지 약 10개의 아미노산 잔기, 및 가장 바람직하게는 약 6개 내지 약 22개의 아미노산 잔기를 지닐 수 있다. 또다른 구체예에서, 결합 폴리펩티드는 15-100개 아미노산, 또는 20-50개 아미노산을 지닌다.
선택된 결합 폴리펩티드는 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다.
기타 활성
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 혈전증, 동맥경화증 및 기타 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 기인한 허혈 조직의 재혈관신생을 자극하는 치료에 적용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 상기 논의된 혈관형성 및 사지 재생을 자극하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 섬유모세포 및 골격근 세포와 같은 상이한 기원의 다양한 세포에 대해 분열촉진성이어서 손상되거나 질병에 걸린 조직의 수복 또는 대체를 촉진시키기 때문에 상해, 화상, 수술후 조직 복원 및 궤양으로 인한 상처를 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 신경세포 성장을 자극하여 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 AIDS 관련 합병증과 같은 특정 신경세포 질병 또는 신경-퇴행성 질환에서 발생하는 신경세포 손상을 치료하고 예방하는데 시용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 연골세포 성장을 자극할 수 있어서, 뼈 및 치주 재생을 향상시키고 조직 이식 또는 뼈 이식을 돕는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 각질세포 성장을 자극하여 일광화상으로 인한 피부 노화를 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 탈모를 예방하는데 사용될 수 있다. 동일 범주에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 다른 사이토킨과 함께 사용되는 경우 조혈 세포 및 뼈 골수 세포의 성장 및 분화를 촉진하는데 적용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 이식 전에 기관을 유지하거나 일차 조직의 세포 배양을 지지하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 조기 배낭에서 분화하는 중배엽 기원의 조직을 유도하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 상기 언급된 조혈 리니지 이외에 배아 줄기 세포의 분화 또는 증식을 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 포유동물의 특징, 예컨대 신장, 체중, 헤어 컬러, 눈 컬러, 피부, 지방 조직의 비율, 색소 침착, 크기 및 형상(예컨대, 미용 수술)을 조절하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 이화작용, 동화작용, 프로세싱, 이용, 및 에너지의 저장에 영향을 미치는 포유동물의 대사를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 바이오리듬, 하루주기 리듬, 우울증(우울 장애 포함), 폭력 경향, 통증에 대한 내성, 생식능(바람직하게는 액티빈 또는 인히빈-유사 활성에 의한), 호르몬 또는 엔도크린 레벨, 식욕, 성욕, 기억, 스트레스 또는 다른 인지능에 영향을 미침에 의해 포유동물의 정신 상태 또는 물리적 상태를 변화시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 저장능, 지방 함량, 지질, 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 보조인자 또는 다른 영양 성분을 증가시키거나 감소시키기 위한 것과 같은 식품 첨가제 또는 방부제로서 사용될 수 있다.
상기 언급된 적용들은 광범한 종류의 숙주에서 사용된다. 상기 숙주로는 사람, 뮤린, 래빗, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 마이크로-피그, 닭, 염소, 소, 양, 개, 고양이, 비사람 영장류 및 사람이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 숙주는 마우스, 래빗, 염소, 기니아 피그, 닭, 래트, 햄스터, 돼지, 양, 개 또는 고양이이다. 바람직한 구체예에서, 숙주는 포유동물이다. 가장 바람직한 구체예에서, 숙주는 사람이다.
본 발명을 일반적으로 기술하였으며, 이는 제한하려는 의도가 아니라 설명을 위해 제공된 하기 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것이다.
추가의 설명 없이도, 당업자는 전술한 상세한 설명 및 하기 예시적인 실시예를 이용하여 본 발명에서 유추되는 개질을 수행하여 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 구체적으로 나타내는 것이며 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 고려되지 않는다.
[실시예]
실시예 1: pScNHSA 및 pScCHSA 의 생성
벡터 pScNHSA (ATCC 수탁번호: PTA-3279) 및 pScCHSA (ATCC 수탁번호: PTA-3276)는 pPPC0005 (ATCC 수탁번호: PTA-3278)의 유도체이며, 사람 혈청 알부민 "HSA"를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 번역 프레임에 근접하게 및 그 번역 프레임에 치료적 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 또는 이의 단편 또는 변이체가 삽입되는 클로닝 벡터로서 이용된다. pScCHSA는 치료적 단백질-HSA 융합체를 생성하는데 이용될 수 있는 반면, pScNHSA는 HSA-치료적 단백질 융합체를 생성하는데 이용될 수 있다.
pScCHSA 의 생성: 치료적 부분에 대한 알부민 잔기 C-말단과의 알부민 융합체
성숙 알부민 단백질을 엔코딩하는 DNA에 대한 치료적 단백질 N-말단을 엔코딩하는 클로닝 DNA를 촉진하는 벡터를 pPPC0005에서 키메라 HSA 시그널 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 변경시켜 Xho I 및 Cla I 제한 부위를 포함시킴에 의해 제조하였다.
먼저, pPPC0005 (ADH1 말단 서열의 3'쪽에 위치)에 고유한 Xho I 및 Cla I 부위는 pPPC0005를 Xho I 및 Cla I 로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제를 지니는 점착성 말단으로 메우고 블런트 말단을 재결찰시켜 pPPC0006을 생성함에 의해 제거되었다.
둘째로, Xho I 및 Cla I 제한 부위는 2 라운드의 PCR을 이용하여 pPPC0006 중 HAS의 시그널 펩티드(HSA 리더 및 메이팅 인자 알파 "MAF"로부터의 kex2 부위의 키메라)를 엔코딩하는 핵산 서열로 공학처리되었다. PCR의 첫번째 라운드에서, 서열번호 36 및 서열번호 37로 표시된 프라이머를 이용하여 증폭을 수행하였다. 서열이 서열번호 36인 프라이머는 HSA의 시그널 펩티드 서열의 일부, 메이팅 인자 알파 리더 서열로부터의 kex2 부위 및 HSA의 성숙 형태의 아미노-말단을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 네 개의 점 돌연변이가 서열에 도입되어 키메라 시그널 펩티드 및 HSA의 성숙 형태의 접합점에서 발견되는 Xho I 및 Cla I 부위를 생성한다. 상기 네 개의 돌연변이는 하기 도시된 서열에 밑줄로 표시된다. pPPC0005에서, 상기 네 위치의 누클레오티드는 5' 내지 3'으로 T, G, T 및 G이다.
5'-GCCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGATTTAAAGATTTGGG-3' (서열번호:36) 및 5'-AATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCTTTTCTCGAGGCTCCTGGAATAAGC-3' (서열번호:37). 이후 두번째 라운드의 PCR을 업스트림 플랭킹 프라이머 5'-TACAAACTTAAGAGTCCAATTAGC-3' (서열번호:38) 및 다운스트림 플랭킹 프라이머 5'-CACTTCTCTAGAGTGGTTTCATATGTCTT-3' (서열번호:39)를 이용하여 수행하였다. 그 다음, 생성된 PCR 생성물을 정젱하고 Aft II and Xba I로 절단하고 pPPC0006의 동일 부위에 결찰시켜 pScCHSA를 생성하였다. 생성된 플라스미드는 시그널 서열로 공학처리된 Xho I and Cla I 부위를 지닌다. Xho I 부위의 존재는 LDKR에서 LEKR로 시그널 서열의 말단에 단일 아미노산의 변화를 생성한다. D에서 E로의 변화는, 5' Sal I 부위 (이는 Xho I 부위에 적합함) 및 3' Cla I 부위를 지니는 알부민 융합 단백질의 치료적 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 서열이 pScCHSA의 Xho I 및 Cla I 부위에 결찰되는 경우 최종 알부민 융합 단백질 발현 플라스미드에 존재하지 않을 것이다. Xho I에 대한 Sal I의 결찰은 시그널 펩티드 서열의 최초 아미노산 서열을 복원한다. 알부민 융합 단백질의 치료적 부분을 엔코딩하는 DNA는 Kex2 부위(Kex2는 시그널 펩티드의 말단에서 이염기 아미노산 서열 KR 이후를 절단한다) 뒤 및 Cla I 부위 앞에 삽입될 수 있다.
pScNHSA 의 생성: 치료적 부분에 대한 알부민 잔기 N-말단과의 알부민 융합체
성숙 알부민 단백질을 엔코딩하는 DNA에 대한 치료적 단백질 부분 C-말단을 엔코딩하는 클로닝 DNA를 촉진하는 벡터를 3, 8-염기-쌍 제한 부위를 pScCHSA에 첨가함에 의해 제조하였다. Asc I, Fse I, 및 Pme I 제한 부위를 성숙 HSA 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열의 말단에서 Bsu36 I 및 Hind III 부위 사이에 첨가하였다. 이는 밑줄로 표시된 Asc I, Fse I, 및 Pme I 제한 부위를 함유하는 두 개의 상보적인 합성 프라이머를 사용하여 달성되었다 (서열번호:40 및 서열번호:41).
5'-AAGCTGCCTTAGGCTTATAATAAGGCGCGCCGGCCGGCCGTTTAAACTAAGCTTAATTCT-3' (서열번호:40) 및 5-AGAATTAAGCTTAGTTTAAACGGCCGGCCGGCGCGCCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3' (서열번호:41). 상기 프라이머는 어닐링되고 Bsu36 I 및 Hind III으로 절단되고 pScCHSA의 동일 부위에 결찰되어 pScNHSA를 생성하였다.
실시예 2: 효모 형질전환을 위한 일반적인 구성물 생성
벡터 pScNHSA 및 pScCHSA를 치료적 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 또는 이의 단편 또는 변이체가 성숙 사람 혈청 알부민 "HSA"를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 인접하게 삽입된 클로닝 벡터로서 이용할 수 있다. pScCHSA는 치료적 단백질-HSA 융합체를 생성하기 위해 사용되는 반면, pScNHSA는 HSA-치료적 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
HSA - 치료적 단백질 융합 생성물을 포함하는 알부민 융합 구성물의 생성
치료적 부분을 엔코딩하는 DNA (예컨대 서열번호:X에 도시되거나 당 분야에 공지된 서열)를 융합 구성물의 생성을 촉진시키는 (예컨대, 제한 부위의 첨가, 무봉합 융합체의 엔코딩, 링커 서열의 엔코딩 등에 의해) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 당업자는 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA의 5' 말단상에 HSA의 성숙 형태의 마지막 네 개의 아미노산을 엔코딩하는 (및 Bsu36I 부위를 함유하는) 폴리누클레오티드를 첨가시킨 5' 프라이머; 및 치료적 단백질 코딩 서열의 3' 말단상에 STOP 코돈 및 적합한 클로닝 부위를 첨가시킨 3' 프라이머를 고안할 수 있다. 예를 들어, 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA를 증폭시키기 위해 사용된 전향 프라이머는 서열 5'-aagctGCCTTAGGCTTA(N)15-3' (서열번호:42)를 지니며, 여기에서 밑줄로 표시된 서열은 Bsu36I 부위이고, 상부 누클레오티드는 성숙 HSA 단백질의 마지막 네 개의 아미노산(ALGL)을 엔코딩하며 및 (N)15는 관심있는 치료적 단백질을 엔코딩하는 처음 15개의 누클레오티드와 동일하다. 유사하게, 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA를 증폭시키기 위해 사용된 복귀 프라이머는 서열
Figure 112012047901064-pat00027
을 지니고, 여기에서 이탤릭체로 표시된 서열은 Pme I 부위이고, 이중 밑줄로 표시된 서열은 Fse I 부위이며, 단일 밑줄로 표시된 서열은 Asc I 부위이고, 박스로 표시된 누클레오티드는 두 개의 앞뒤 스톱 코돈의 역 보체이며, (N)15는 관심있는 치료적 단백질을 엔코딩하는 마지막 15개 누클레오티드의 역 보체이다. 일단 PCR 생성물이 증폭되면, Bsu36I 및 (Asc I, Fse I, 또는 Pme I) 중 하나로 절단되고 pScNHSA로 결찰된다.
HSA 키메라 리더 서열 중 Xho I 부위의 존재는 키메라 시그널 서열, 즉 HSA-kex2 시그널 서열의 말단에서 LDKR(서열번호:44)에서 LEKR(서열번호:45)로의 한 개의 아미노산 변경을 초래한다.
유전자- NSA 융합 생성물을 포함하는 알부민 융합 구성물의 생성
상기 기술된 방법과 유사하게, 하기 프라이머를 이용하여 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA를 PCR 증폭시킬 수 있다: 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA의 5' 말단상에 SalI 부위를 함유하고 HSA 리더 서열의 마지막 세 개의 아미노산, DKR을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 첨가시킨 5' 프라이머; 및 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA의 3' 말단상에 Cla I 부위를 함유하는 성숙 HSA의 처음 몇개의 아미노산을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 첨가시킨 3' 프라이머. 예를 들어, 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA를 증폭시키기 위해 사용된 전향 프라이머는 서열 5'-aggagcgtcGACAAAAGA(N)15-3' (서열번호:46)를 지니며, 여기에서 밑줄로 표시된 서열은 Sal I 부위이고, 상부 누클레오티드는 HSA 리더 서열의 마지막 세 개의 아미노산(DKR)을 엔코딩하며, (N)15는 관심있는 치료적 단백질을 엔코딩하는 처음 15개의 누클레오티드와 동일하다. 유사하게, 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA를 증폭시키기 위해 사용된 복귀 프라이머는 서열 5'-CTTTAAATCG A T GAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)15-3'(서열번호:47)을 지니고, 여기에서 이탤릭체로 표시된 서열은 Cla I 부위이고, 밑줄로 누클레오티드는 HSA의 성숙 형태의 처음 9개 아미노산을 엔코딩하는 DNA의 역 보체이며 (DAHKSEVAH, 서열번호:48), (N)15는 관심있는 치료적 단백질을 엔코딩하는 마지막 15개 누클레오티드의 역 보체이다. 일단 PCR 생성물이 증폭되면, Sal I 및 Cla I로 절단되고 Xho I and CIa I로 절단된 pScCHSA에 결찰될 수 있다. 상이한 시그널 또는 리더 서열이 요망될 수 있고, 예컨대 역전효소 "INV" (Swiss-Prot Accession P00724), 메이팅 인자 알파 "MAF" (Genbank Accession AAA18405), MPIF (Geneseq AAF82936), 피불린 B (Swiss-Prot Accession P23142), 클러스테린 (Swiss-Prot Accession P10909), 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 4 (Swiss-Prot Accession P22692), 및 HSA 리더 서열의 과돌연변이가 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 적합한 벡터로 서브클로닝될 수 있다.
효모(S. cerevisiae)에서 발현에 적합한 알부민 융합 구성물의 생성
pScNHSA 또는 pScCHSA로부터 생성된 N-말단 또는 C-말단 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 함유하는 Not I 단편을 LEU2 선택적인 마커를 지니는 pSAC35의 Not I 부위로 클로닝할 수 있다. 이후 생성된 벡터를 효모(S. cerevisiae) 발현 시스템의 형질전환에 사용한다.
실시예 3: 효모(S. cerevisiae)에서 일반적인 발현
효모 발현에 적합한 발현 벡터를 리튬 아세테이트 형질전환, 일렉트로포레이션, 또는 당분야에 공지된 다른 방법 및/또는 문헌[Sambrook, Fritsch, and Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2? quot ; edition", volumes 1-3, and in Ausubel et al. 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4]의 일부에 기술된 대로 효모(S. cerevisiae)로 형질전환시킬 수 있다. 발현 벡터를 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 균주 DXY1, D88, 또는 BXP10에 형질전환에 의해 도입하고, 개별적인 형질전환체를 예를 들어 3일 동안 30℃로 10 mL YEPD (1% w/v 효모 추출물, 2 % w/v, 펩톤, 2 % w/v, 덱스트로스) 중에서 성장시킬 수 있으며, 세포를 60시간 성장시킨 후에 정지기에서 수집할 수 있다. 세포를 3000g에서 10분 동안 정화시켜 상청액을 수집하였다.
pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42 and 참조 도 3)는 LEU2 선택적인 마커에 추가하여, 전체 효모 2㎛ 플라스미드를 포함하여 복제 기능, PRB1 프로모터 및 ADH1 말단 시그널을 제공한다.
* 실시예 4: 효모(S. cerevisiae)에서 알부민 융합체로부터 발현된 알부민 융 합 단백질의 일반적인 정제
바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료적 단백질의 성숙 형태의 N- 또는 C-말단 또는 이의 일부 (예컨대, 표 1에 나열된 치료적 단백질의 성숙 형태, 또는 표 2에 서열번호:Z로서 도시된 치료적 단백질의 성숙 형태)에 융합된 HSA의 성숙 형태를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 발현을 위해 사용된 숙주의 분비 경로에서 초기 융합 폴리펩티드를 유도하는 시그널 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 시그널 서열에 의해 엔코딩되는 시그널 펩티드를 제거하고, 성숙 알부민 융합 단백질이 배양 배지에 직접 분비된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 MAF, INV, Ig, 피불린 B, 클러스테린, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4, 키메라 HSA/MAF 리더 서열을 포함하나 이로 제한되지 않는 변이체 HSA 리더 서열, 또는 당 분야에 공지된 다른 이종 시그널 서열을 포함하나 이로 제한되지 않는 이종 시그널 서열(예컨대, 특정 치료적 단백질의 비-자생 시그널 서열)을 포함하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 것으로는 표 2에 나열된 시그널 서열 및/또는 명세서의 상기 "융합 단백질의 발현" 및/또는 "알부민 융합 단백질의 재조합 및 합성 제조의 부가적인 방법"에 기술된 시그널 서열이 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 추가로 포함한다. 단편 및/또는 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
상기 기술된 대로 효모에서 발현되는 알부민 융합 단백질을 하기와 같은 다이액스(Dyax) 펩티드 친화력 컬럼상에서 소규모로 정제할 수 있다. 알부민 융합 단백질을 발현시키는 효모로부터의 상청액을 3 mM 인산염 완충액 pH 6.2, 20 mM NaCl 및 0.01% Tween 20에 대하여 디아필트레이션시켜 부피를 감소시키고 안료를 제거한다. 이후 용액을 0.22 ㎛ 장치를 통해 여과한다. 여액을 다이액스 펩티드 친화력 컬럼상에 부하시켰다. 컬럼을 100 mM Tris/HCl, pH 8.2 완충액으로 용리시켰다. 단백질을 함유하는 피크 분획을 수집하고 5배로 농축시킨 후 SDS-PAGE 상에서 분석하였다.
대규모 정제를 위하여, 하기 방법을 이용할 수 있다. 2 L 과량의 상청액을 디아필트레이션하고 20 mM Tris/HCl pH 8.0 중에서 500 mL로 농축하였다. 농축된 단백질 용액을 미리-평형을 이룬 50 mL DEAE-세파로스 패스트 플로우 컬럼상에 부하시키고, 컬럼을 세척하고, 단백질을 20 mM Tris/HCl, pH 8.0 중 0 내지 0.4 M NaCl의 NaCl의 선형 구배로 용리시켰다. 단백질을 함유하는 상기 분획을 풀링하고, 0.5 M 인산나트륨(NaH2PO4)을 이용하여 pH 6.8로 조정하였다. 최종 농도의 0.9 M (NH4)2S04를 단백질 용액에 첨가하고, 전체 용액을 미리-평형을 이룬 50 mL Butyl650S 컬럼상에 부하시켰다. 단백질을 황산암모늄 (0.9 내지 0 M (NH4)2SO4)의 선형 구배로 용리시켰다. 알부민 융합체를 지니는 상기 분획을 다시 풀링하고, 10 mM Na2HP04/시트르산 완충액 pH 5.75에 대해 디아필트레이션시키고, 50 mL의 미리-평형을 이룬 SP-세파로스 패스트 플로우 컬럼상에 부하시켰다. 단백질을 0 내지 0.5 M의 NaCl 선형 구배로 용리시켰다. 관심있는 단백질을 함유하는 분획을 합치고, 완충액을 아미콘 컨센트레이터를 이용하여 10 mM Na2HPO/시트르산으로 변경시켰으며, 전도도는 < 2.5 mS/cm이었다. 상기 단백질 용액을 15 mL의 미리-평형을 이룬 Q-세파로스 고성능 컬럼상에 부하시키고, 컬럼을 세척하고, 단백질을 0 내지 0.15 M NaCl의 NaCl 선형 구배로 용리시켰다. 정제된 단백질은 이후 완충액 교환에 의해 특정 완충 조성물에 제형화될 수 있다.
실시예 5: 포유동물 세포 형질전환을 위한 일반적인 구성물 생성
포유동물 세포주에서 발현에 적합한 알부민 융합 구성물의 생성
포유동물 세포 배양 시스템에 사용되는 발현 벡터에서 알부민 융합 구성물이 생성될 수 있다. 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA는 당 분야에 공지된 표준 방법(예컨대, PCR 증폭, 제한 절단 및 결찰)에 의해 포유동물 발현 벡터에서 N-말단 또는 C-말단에서 HSA로 클로닝될 수 있다. 일단 발현 벡터가 구성되면, 포유동물 발현 시스템으로의 트랜스펙션이 진행될 수 있다. 적합한 벡터는 당 분야에 공지되어 있고, pC4 벡터, 및/또는 론자 바이올로직스, 인크.(Lonza Biologics, Inc., Portsmouth, NH)로부터 시판되는 벡터가 있으나 이로 제한되지 않는다.
사람 혈청 알부민을 엔코딩하는 DNA는 포유동물 배양 시스템에 적합한 pC4 벡터로 클로닝되어 플라스미드 pC4:HSA (ATCC 수탁 # PTA-3277)를 생성한다. 상기 벡터는 메토트렉세이트의 존재하에 선별이 가능한 유전자인 디하이드로폴레이트 리덕타제, "DHFR"를 지닌다.
pC4:HSA 벡터는 CHO 세포에서 알부민 융합 단백질의 발현에 적합하다. 발현을 위해서, 다른 포유동물 발현 배양 시스템에서는, 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함하거나 대안적으로 이로 구성된 단편을 대안적인 발현 벡터로 서브클로닝하는게 바람직할 수 있다. 예를 들어, 성숙 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함하거나 대안적으로 이로 구성된 단편은 본원에 기술된 포유동물 발현 벡터 중 어느 하나를 포함하나 이로 제한되지 않는 또다른 발현 벡터로 서브클로닝될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 알부민 융합 구성물을 엔코딩하는 DNA는 NS0 세포에서의 발현을 위해 당 분야에 공지된 절차에 따라 론자 바이올로직스, 인크.(Portsmouth, NH)에 의해 제공된 벡터로 서브클로닝된다.
HSA - 치료적 단백질 융합 생성물을 포함하는 알부민 융합 구성물의 생성
pC4:HSA (ATCC 수탁 # PTA-3277)를 이용하여, 치료적 단백질 부분이 성숙 알부민 서열에 대한 C 말단인 알부민 융합 구성물이 생성될 수 있다. 예를 들어, 벡터의 Bsu 36I 및 Asc I 제한 부위 사이에 치료적 단백질의 단편 또는 변이체를 엔코딩하는 DNA를 클로닝할 수 있다. Bsu 36I 및 Asc I로 클로닝되는 경우, 효모 벡터 시스템으로 클로닝될 때 사용된 동일한 프라이머 고안이 적용될 수 있다 (서열번호:42 및 43) (참조 실시예 2).
유전자- HSA 융합 생성물을 포함하는 알부민 융합 구성물의 생성
pC4:HSA (ATCC 수탁 # PTA-3277)을 이용하여, 치료적 단백질 부분이 N 말단에서 성숙 알부민 서열로 클로닝되는 알부민 융합 구성물이 생성될 수 있다. 예를 들어, pC4:HSA의 Bam HI (또는 Hind III) 및 CIa I 부위 사이에 고유의 시그널 서열을 지니는 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA를 클로닝할 수 있다. Bam HI 또는 Hind III 부위로 클로닝하는 경우, 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA의 번역 개시 코돈 앞에 코작 서열 (CCGCCACCATG, 서열번호:49)을 포함하는 것이 바람직하다. 치료적 단백질이 시그널 서열을 지니지 않는 경우, 치료적 단백질을 엔코딩하는 DNA는 pC4:HSA의 Xho I 및 Cla 1 부위 사이에서 클로닝될 수 있다. Xho I 부위를 이용하는 경우, 하기 5' (서열번호:50) 및 3' (서열번호:51)의 예시적인 PCR 프라이머가 사용될 수 있다:
5'-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)18-3' (서열번호: 50)
5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)18-3' (서열번호:51)
5' 프라이머(서열번호:50)에서, 밑줄로 표시된 서열은 Xho I 부위이고; Xho I 부위 및 Xho I 부위 이후의 DNA는 천연 사람 혈청 알부민의 리더 서열의 마지막 7개 아미노산을 코딩한다. 서열번호:50에서, "(N)18"은 관심있는 치료적 단백질을 엔코딩하는 처음 18개의 누클레오티드와 동일하다. 3' 프라이머(서열번호:51)에서, 밑줄로 표시된 서열은 Cla I 부위이고; Cla I 부위 및 그 이후의 DNA는 성숙 HSA 단백질(서열번호:1)의 처음 10개의 아미노산을 엔코딩하는 DNA의 역 보체이다. 서열번호:51에서, "(N)18"은 관심있는 치료적 단백질을 엔코딩하는 마지막 18개의 누클레오티드를 엔코딩하는 DNA의 역 보체이다. 상기 두 프라이머를 이용하여, 관심있는 치료적 단백질을 PCR 증폭시키고, PCR 생성물을 정제하고, 이것을 Xho I 및 CIa I 제한 효소로 절단하고, pC4:HSA 중 Xho I 및 Cla I 부위로 클로닝할 수 있다.
대안적인 리더 서열이 요망되는 경우, 자생 알부민 리더 서열을 당 분야에 공지된 표준 방법에 의해 키메라 알부민 리더, 즉 HSA-kex2 시그널 펩티드, 또는 대안적인 리더로 교체할 수 있다. (예를 들어, 당업자는 리딩 프레임을 유지하면서 알부민 리더 대신 대안적인 리더를 통상적으로 PCR 증폭시키고 PCR 생성물을 알부민 융합 구성물로 서브클로닝할 수 있다).
실시예 6: 포유동물 세포주에서의 일반적인 발현
포유동물 세포주에서 발현에 적합한 발현 벡터에서 생성된 알부민 융합 구성물은 인산칼슘 침전, 리포펙타민, 일렉트로포레이션, 또는 당 분야에 공지되고/거나 문헌[Sambrook, Fritsch, and Maniatis. 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition" and in Ausubel et al. 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School "Current Protocols in Molecular Biology", volumes 1-4]에 기술된 다른 트랜스펙션 방법에 의해 적합한 세포주로 트랜스펙션될 수 있다. 이후, 트랜스펙션된 세포를 존재 여부에 대해 또는 발현 벡터에서 선별적인 마커에 의해 결정된 선별제에 의해 선택한다.
pC4 발현 벡터 (ATCC 수탁번호 209646)는 플라스미드 pSV2-DHFR (ATCC 수탁번호 37146)의 유도체이다. pC4는 로우스 육종 바이러스의 강한 프로모터 긴 말단 반복단위 "LTR" (Cullen et al., March 1985, Molecular and Cellular Biology, 438-447) 및 시토메갈로바이러스의 단편 "CMV"-인핸서 (Boshart et al., 1985, Cell 41: 521-530)를 함유한다. 벡터는 또한 SV40 조기 프로모터의 조절하에 3' 인트론, 래트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 및 말단화 시그널, 및 마우스 DHFR 유전자를 함유한다. 중국 햄스터 난소 "CHO" 세포 또는 활성 DHFR 유전자가 결여된 다른 세포주가 트랜스펙션에 이용된다. 공지된 방법에 의한 pC4 중 알부민 융합 구성물의 CHO 세포로의 트랜스펙션은 CHO 세포에서 알부민 융합 단백질을 발현시킬 수 있을 것이고, 이후 리더 서열이 절단되고, 상청액으로 분비된다. 알부민 융합 단백질은 상청액으로부터 추가로 정제된다.
pEEl2.1 발현 벡터는 론자 바이올로직스, 인크.(Portsmouth, NH)에 의해 제공되며 pEE6의 유도체이다 (Stephens and Cockett, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 7110). 상기 벡터는 배지를 함유하는 선택적인 메티오닌 설폭스이민에서 트랜스펙션된 세포를 선별할 목적으로 프로모터, 인핸서 및 사람 시토메갈로바이러스의 메이저 이미디어트 어얼리(Major Immediate Early) 유전자의 완전한 5'-비번역된 영역, "hCMV-MIE" (국제 공개 # WO89/01036), 관심있는 서열의 업스트림, 및 글루타민 합성효소 유전자 (Murphy et al., 1991, Biochem J. 227: 277-279; Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10:169-175; US patent US 5,122,464)를 포함한다. 당 분야에 공지된 방법에 의한 pEE12.1 중 알부민 융합 단백질의 NSO 세포 (국제 공개 # WO86/05807)로의 트랜스펙션은 NS0 세포에서 알부민 융합 단백질을 발현시킬 수 있을 것이고, 이후 리더 서열이 절단되고 상청액으로 분비된다. 알부민 융합 단백질은 본원에 기술된 방법 또는 당 분야에 공지된 다른 방법에 의해 상청액으로부터 추가로 정제된다.
알부민 융합 단백질의 발현은 예를 들어 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯, 역상 HPLC 분석, 또는 당 분야에 공지된 다른 방법에 의해 분석될 수 있다.
알부민 융합 구성물로 트랜스펙션된 안정한 CHO 및 NS0 세포주가 당 분야에 공지된 방법(예컨대, 리포펙타민 트랜스펙션)에 의해 생성되고, 예를 들어 선택적인 마커로서 디하이드로폴레이트 리덕타제 'DHFR' 유전자를 지니는 벡터에 대해 또는 글루타민의 부재하에 성장 동안 100 nM 메토트렉세이트를 이용하여 선택된다. 발현 레벨은 예를 들어, 일차적으로 항-HSA 혈청을 일차 항체로서 이용하거나, 부차적으로 주어진 알부민 융합 단백질의 치료적 단백질 부분을 유도하는 항체를 함유하는 혈청을 일차 항체로서 이용하는 면역블롯팅에 의해 검사될 수 있다.
발현 레벨은 항-HSA 혈청을 일차 항체로서 이용하는 면역블롯 검출에 의해 검사된다. 특정 생산율은 포획 항체가 알부민 융합체의 치료적 단백질 부분에 대한 모노클로날 항체일 수 있고 검출 항체가 모노클로날 항-HSA-비오티닐화된 항체(또는 반대로도 가능함)일 수 있는 ELISA에 이어, 제조자의 프로토콜에 따른 홍당무 과산화효소/스트렙타비딘 결합 및 분석을 통해 결정된다.
실시예 7: 포유동물 세포에서 알부민 융합 단백질의 발현
본 발명의 알부민 융합 단백질은 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 통상적인 포유동물 발현 벡터는 프로모터 엘리먼트를 함유하고, 이는 mRNA의 전사 개시, 단백질 코딩 서열, 및 전사의 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 요구되는 시그널을 조절한다. 추가적인 엘리먼트로는 인핸서, 코작 서열 및 RNA 스플라이싱에 대한 공여체 및 수용체에 의해 플랭킹되는 개재 서열이 있다. 고도로 효과적인 전사가 SV40으로부터의 조기 및 만기 프로모터, 로타바이러스, 예컨대 RSV, HTLVI, HIVI로부터의 긴 말단 반복단위(LTR) 및 시토메갈로바이러스(CMV)의 조기 프로모터를 이용하여 달성된다. 그러나, 세포 엘리먼트가 또한 사용될 수 있다 (예컨대, 사람 액틴 프로모터).
본 발명을 실시하는데 사용되는 적합한 발현 벡터로는 예를 들어 벡터, 예컨대 pSVL 및 pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), pBC12M1(ATCC 67109), pCMVSport 2.0, 및 pCMVSport 3.0가 있다. 사용될 수 있는 포유동물 숙주 세포로는 사람 Hela, 293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, quail QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포가 있으나, 이로 제한되지 않는다.
대안적으로, 알부민 융합 단백질은 염색체에 통합된 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하는 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. DHFR, gpt, 네오마이신 또는 하이그로마이신과 같은 선택적인 마커를 이용한 공-트랜스펙션으로 트랜스펙션된 세포를 동정하고 분리할 수 있다.
융합 단백질을 엔코딩하는 트랜스펙션된 폴리누클레오티드는 또한 많은 양의 엔코딩된 융합 단백질을 발현하도록 증폭될 수 있다. DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타제) 마커는 관심있는 유전자의 수백 또는 심지어 수천 복사체를 지니는 세포주를 개발하는데 유용하다 (참조, e.g., Alt et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin et al., Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990); Page et al., Biotechnology 9:64-68 (1991)). 또다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 합성효소(SC)이다 (Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). 상기 마커를 이용하여, 포유동물 세포는 선택적인 배지에서 성장하며 가장 높은 내성을 지닌 세포가 선택된다. 상기 세포주는 염색체에 통합된 증폭된 유전자(들)를 함유한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 및 NSO 세포는 종종 단백질을 생성하기 위해 사용된다.
플라스미드 pSV2-dhfr (ATCC 수탁번호 37146), 발현 벡터 pC4 (ATCC 수탁번호 209646) 및 pC6 (ATCC 수탁번호 209647)의 유도체는 로우스 육종 바이러스의 강한 프로모터(LTR)(Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (March, 1985)) 및 CMV-인핸서 (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985))의 단편을 함유한다. 예컨대 제한 효소 절단 부위 BamHI, Xbal 및 Asp718을 지니는 다수의 클로닝 부위는 관심있는 유전자의 클로닝을 촉진시킨다. 벡터는 또한 SV49 조기 프로모터의 조절하에 3' 인트론, 래트 프리프로인슐린 유전자의 폴리아데닐화 및 종결 시그널, 및 마우스 DHFR 유전자를 함유한다.
구체적으로, 플라스미드 pC6는 예를 들어 적합한 제한 효소로 절단된 다음 당 분야에 공지된 공정에 의해 송아지 장 인산염을 이용하여 탈인산화되었다. 이후 벡터는 1% 아가로스 겔로부터 분리된다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 생성되고 상기 폴리누클레오티드는 당 분야에 공지된 PCR 기술을 이용하여 증폭된다. 천연 발생 시그널 서열이 본 발명의 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 경우, 벡터는 제2의 시그널 펩티드를 필요로 하지 않는다. 대안적으로, 천연 발생 시그널 서열이 사용되지 않는 경우, 벡터는 이종 시그널 서열을 포함하도록 개질될 수 있다 (참조, 예컨대, 국제 공개 WO 96/34891).
본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 증폭된 단편이 시판되는 키트 ("Geneclean," BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)를 이용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리된다. 이후 단편을 적합한 제한 효소로 절단하고 다시 1% 아가로스 겔 상에서 정제한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 증폭된 단편을 동일한 제한 효소로 절단하고 1% 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 분리된 단편 및 탈인산화된 벡터를 T4 DNA 리가아제로 절단하였다. 대장균(E. coli) HB 101 또는 XL-1 Blue 세포를 형질전환시키고 예를 들어 제한 효소 분석을 이용하여 플라스미드 pC6에 삽입된 단편을 함유하는 세균을 동정하였다.
활성 DHFR 유전자가 결여된 중국 햄스터 난소 세포를 트랜스펙션에 이용하였다. 5 ㎍의 발현 플라스미드 pC6 또는 pC4를 리포펙틴을 이용하여 0.5 ㎍의 플라스미드 pSVneo로 공트랜스펙션시켰다 (Feigner et al., supra). 플라스미드 pSV2-neo는 G418을 포함하는 항생제 그룹에 대해 내성을 부여하는 효소를 엔코딩하는 Tn5로부터의 neo 유전자를 현저하게 선택적인 마커로서 함유한다. 세포를 1 mg/ml의 G418이 보충된 알파 마이너스 MEM에 시딩하였다. 2일 후, 세포를 트립신화하고, 10, 25, 또는 50 ng/ml의 메토트렉세이트 및 1 mg/ml의 G418이 보충된 알파 마이너스 MEM에서 하이브리도마 클로닝 플레이트 (Greiner, Germany)에 시딩하였다. 약 10 내지 14일 후, 단일 클론을 트립신화한 다음 6-웰 페트리 디시 또는 10 ml 플라스크에 상이한 농도의 메토트렉세이트(50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM)를 이용하여 시딩하였다. 가장 높은 농도의 메토트렉세이트에서 성장한 클론을 보다 높은 농도의 메토트렉세이트 (1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 mM, 20 mM)를 함유하는 신규한 6-웰 플레이트로 옮겼다. 동일한 절차를 100 내지 200 μM의 농도에서 성장한 클론이 수득될 때까지 반복하였다. 요망되는 융합 단백질의 발현을 예를 들어 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 또는 역상 HPLC 분석에 의해 분석하였다.
실시예 8: 포유동물 세포주에서 알부민 융합 구성물로부터 발현되는 알부민 융합 단백질의 일반적인 정제
바람직한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 치료적 단백질 또는 부분의 성숙 형태의 N- 또는 C-말단에 융합된 HSA의 성숙 형태를 포함한다 (예컨대, 표 1에 기술된 치료적 단백질의 성숙 형태, 또는 서열번호:Z로서 표 2에 도시된 치료적 단백질의 성숙 형태). 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 발현에 이용된 숙주의 분비 경로에서 미성숙 융합 폴리펩티드를 유도하는 시그널 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 시그널 서열에 의해 엔코딩되는 시그널 펩티드를 제거하고, 성숙 알부민 융합 단백질을 배양 배지에 직접 분비시킨다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 MAF, INV, Ig, 피불린 B, 클러스테린, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4, 키메라 HSA/MAF 리더 서열을 포함하나 이로 제한되지 않는 변이체 HSA 리더 서열, 또는 당 분야에 공지된 다른 이종 시그널 서열을 포함하나 이로 제한되지 않는 이종 시그널 서열(예컨대, 특정 치료적 단백질의 비자생 시그널 서열)을 포함하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 것으로는 표 2에 나열된 시그널 서열 및/또는 명세서의 상기 "융합 단백질의 발현" 및/또는 "알부민 융합 단백질의 재조합 및 합성 제조의 부가적인 방법"에 기술된 시그널 서열이 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 추가로 포함한다. 단편 및/또는 변이체를 포함하는 상기 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
포유동물 세포주 상청액으로부터의 알부민 융합 단백질을 사용된 발현 시스템에 따라 상이한 프로토콜에 따라 정제한다.
CHO 및 293T 세포주로부터의 정제
CHO 세포 상청액 또는 일시적으로 트랜스펙션된 293T 세포 상청액으로부터의 알부민 융합 단백질의 정제는, 인산나트륨 완충액 및 인산염 구배 용리액을 이용한 음이온성 HQ 수지로의 초기 포획에 이어, 염 구배 용리액을 이용한 블루 세파로스 FF 컬럼 상에서의 친화력 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 블루 세파로스 FF는 주된 BSA/페투인 오염물을 제거한다. 포로스 PI 50 수지상에서 인산염 구배를 이용한 추가의 정제로 내독소 오염물을 제거 및 저하시킬 뿐만 아니라 알부민 융합 단백질을 농축시킬 수 있다.
NSO 세포주로부터의 정제
NSO 세포 상청액으로부터 알부민 융합 단백질의 정제는 Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그래피에 이어, 단계 용리액을 이용한 SP-세파로스 정제 및 단계 용리액을 이용한 페닐-650M 정제, 및 마지막으로 디아필트레이션을 포함할 수 있다.
정제된 단백질은 이후 완충액 교환에 의해 제형화될 수 있다.
실시예 9: 알부민 융합 단백질의 세균 발현
세균 시그널 서열을 포함하는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 DNA 서열의 5' 및 3' 말단에 상응하는 PCR 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭시켜 삽입 단편을 합성하였다. 삽입물을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 증폭시키는데 사용된 프라이머는 프라이머의 5' 말단에 BamHI 및 Xbal와 같은 제한 부위를 바람직하게 함유하여 증폭된 생성물을 발현 벡터로 클로닝한다. 예를 들어 BamHI 및 Xbal는 세균 발현 벡터 pQE-9 (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)상의 제한 효소 부위에 상응한다. 상기 플라스미드 벡터는 항생제 내성(Ampr), 복제의 세균 기원(ori), IPTG-조절가능한 프로모터/오퍼레이터(P/O), 리보좀 결합 부위(RBS), 6-히스티딘 태그(6-His), 및 제한 효소 클로닝 부위를 엔코딩한다.
pQE-9 vector를 BamHl 및 Xbal로 절단하고, 증폭된 단편을 세균 RBS에서 개시된 리딩 프레임을 보유하는 pQE-9 벡터에 결찰시킨다. 결찰 혼합물을 이후 플라스미드 pREP4의 다중 복사체를 함유하고, lac1 리프레서를 발현시키며 또는 카나마이신 내성(Kanr)을 부여하는 대장균 균주 M15/rep4 (Qiagen, Inc.)를 형질전환시키는데 이용한다. 형질전환체는 LB 플레이트상에서 성장하는 능력에 의해 동정되며 앰피실린/카나마이신 내성 콜로니가 선택된다. 플라스미드 DNA를 분리하고 제한 분석에 의해 확인한다.
요망되는 구성물을 함유하는 클론을 Amp (100 ug/ml) 및 Kan (25 ug/ml) 둘 모두가 보충된 LB 배지에서 액체 배양물로 밤새 (O/N) 성장시켰다. 1:100 내지 1:250의 대량 배양물을 접종하는데 O/N 배지를 이용하였다. 세포는 0.1 내지 0.6의 광학 밀도 600 (O.D.600)로 성장시켰다. IPTG (이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노시드)를 1 mM의 최종 농도로 첨가하였다. lac1 리프레서를 불활성화시키고 P/O를 정화시켜 증가된 유전자 발현을 유도함에 의해 IPTG를 유도하였다.
세포를 추가로 3 내지 4시간 동안 성장시켰다. 이후 원심분리(6000Xg에서 20분)에 의해 세포를 수집하였다. 세포 펠릿을 카오트로픽제 6 몰의 구아니딘 HCl 또는 바람직하게는 8 M 우레아에 0.14 M 2-메르캅토에탄올 보다 높은 농도로 3 내지 4시간 동안 4℃에서 교반시킴에 의해 용해시켰다 (참조, 예컨대 Burton et al., Eur. J. Biochem. 179:379-387 (1989)). 세포 데브리스를 원심분리에 의해 제거하고, 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 니켈-니트릴로-트리-아세트산 ("Ni-NTA") 친화력 수지 컬럼 (QIAGEN, Inc.에서 시판됨, supra)상에 부하시켰다. 높은 친화력으로 Ni-NTA에 결합된 6 x His 태그를 지니는 단백질을 단순 원스텝 공정으로 정제할 수 있다 (상세한 것은 하기 참조: The QlAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., supra).
간단하게, 상청액을 6 M 구아니딘-HCl, pH 8의 컬럼상에 부하시킨다. 컬럼을 먼저 10 부피의 6 M 구아니딘-HCl, pH 8로 세척한 다음 10 부피의 6 M 구아니딘-HCl, pH 6으로 세척하고, 마지막으로 폴리펩티드를 6 M 구아니딘-HCl, pH 5를 이용하여 용리시킨다.
정제된 단백질을 인산염-완충 염수(PBS) 또는 50 mM Na-아세테이트, pH 6 완충액 및 200 mM NaCl에 대해 투석시킴에 의해 원형재생시켰다. 대안적으로, 단백질을 Ni-NTA 컬럼상에 고정시켜서 성공적으로 재폴딩할 수 있다. 예시적인 조건은 하기와 같다: 프로테아제 억제제를 함유하는 500 mM NaCl, 20% 글리세롤, 20 mM Tris/HCI pH 7.4에서 선형 6M-1M 우레아 구배를 이용한 원형재생. 원형재생은 1.5시간 이상 동안 수행되어야 한다. 원형재생 이후, 단백질을 250 mM의 이미다졸을 첨가시켜 용리시켰다. PBS 또는 50 mM 나트륨 아세테이트 pH 6 완충액 및 200 mM NaCl에 대한 최종 투석 단계에 의해 이미다졸을 제거하였다. 정제된 단백질을 4℃로 저장하거나 -80℃에서 냉동시켰다.
상기 발현 벡터에 추가하여, 본 발명은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 엘리먼트 및 파지 오퍼레이터를 함유하는 소위 pHE4a (ATCC 수탁번호 209645, 1998년 2월 25일 수탁됨)를 발현 벡터로서 추가로 포함한다. 상기 벡터는 1) 선택적인 마커로서 네오마이신포스포트랜스퍼라제. 2) 복제의 대장균 기원, 3) T5 파지 프로모터 서열, 4) 두 lac 오퍼레이터 서열, 5) 샤인-델가노 서열, 및 6) 락토스 오페론 리프레서 유전자 (laclq)를 함유한다. 복제의 기원 (oriC)은 pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD)로부터 유래된다. 프로모터 및 오퍼레이터 서열은 합성에 의해 제조되었다.
DNA는 Ndel 및 Xbal, BamHl, Xhol, 또는 Asp718를 이용하여 벡터를 제한하고, 겔 상에서 제한된 생성물을 러닝시키고, 보다 큰 단편 (스터퍼 단편은 약 310개의 염기쌍이어야 한다)을 분리함에 의해 pHE4a에 삽입될 수 있다. DNA 삽입물은 Ndel (5' 프라이머) 및 Xbal, BamHl, Xhol, 또는 Asp718 (3' 프라이머)에 대한 제한 부위를 지니는 PCR 프라이머를 이용하여, 본원에 기술된 PCR 프로토콜 또는 당 분야에 공지된 다른 방법에 따라 생성된다. PCR 삽입물을 겔 정제하고 적합한 효소로 제한한다. 삽입물 및 벡터를 표준 프로토콜에 따라 결찰시킨다.
공학처리된 벡터는 세균 시스템에서 단백질을 발현하기 위한 상기 프로토콜에 쓰일 수 있다.
실시예 10: 수탁된 샘플로부터 선택된 cDNA 클론의 분리
본 발명의 다수의 알부민 융합 구성물이 표 3에 도시된 대로 ATCC에 수탁되어 있다. 알부민 융합 구성물은 하기 발현 벡터 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 효모(S. cerevisiae) 발현 벡터 pSAC35, 포유동물 발현 벡터 pC4, 또는 포유동물 발현 벡터 pEEI2.1.
pSAC35 (Sleep et a1 ., 1990, Biotechnology 8:42), pC4 (ATCC 수탁번호 209646; Cullen et al ., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (1985); Boshart et al ., Cell 41: 521-530 (1985)), 및 pEE12.1 (Lonza Biologics, Inc.; Stephens and Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110 (1989); 국제 공개 #WO89/01036; Murphy et a!., Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992); US patent US 5,122,464; International Publication #WO86/05807) 벡터는 세균 세포의 성장을 위한 앰피실린 내성 유전자를 포함한다. 상기 벡터 및/또는 이들을 포함하는 알부민 융합 구성물은 스트라타젠 XL-l 블루 (Stratagene Cloning Systems, Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037)와 같은 대장균 균주로 형질전환될 수 있는데, 이 때 100 ㎍/mL의 앰피실린을 함유하는 루리아-브로쓰 아가 플레이트 상에 도포하고 37℃에서 밤새 성장시키는 하나한(Hanahan)과 같은 당 분야에 공지되어 있는 기술을 이용한다.
임의의 주어진 알부민 융합 구성물에 대해 표 3에 인용된 ATCC 수탁번호가 부여된 샘플의 수탁된 재료는 각각 상이한 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 추가의 알부민 융합 구성물을 또한 함유할 수 있다. 따라서, 동일한 ATCC 수탁번호를 공유하는 수탁물은 적어도 표 3의 상응하는 열로 확인되는 알부민 융합 구성물을 함유한다.
표 3의 알부민 융합 구성물에 대해 인용된 플라스미드 DNA의 수탁된 샘플로부터 특정 알부민 융합 구성물을 분리하기 위해 두 가지 접근방법이 이용될 수 있다.
방법 1: 스크리닝
먼저, 알부민 융합 구성물을, 수탁된 플라스미드 DNA의 샘플을 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 스크리닝함에 의해 직접 분리할 수 있는데, 표 1의 개별적인 구성물 ID 번호에 대한 서열번호:X에 상응하는 폴리누클레오티드 프로브를 이용한다. 예를 들어, 30 내지 40개의 누클레오티드로 된 특정 폴리누클레오티드가 보고된 서열에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 DNA 합성기를 이용하여 합성될 수 있다. 올리고누클레오티드는 예를 들어 T4 폴리누클레오티드 키나아제를 이용하여 32P-y-ATP로 표지되고 통상적인 방법에 따라 정제될 수 있다 (예컨대, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). 주어진 ATCC 수탁물로부터의 알부민 융합 구성물이 벡터 공급업체에 의해 제공되는 것들 또는 상기 인용된 공개문헌 또는 특허와 관련하여 제공된 것들과 같은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 상기 언급된 적합한 숙주 (예컨대 XL-1 블루(Stratagene))로 형질전환된다. 형질전환체를 플레이트 당 약 150 형질전환체(콜로니)의 밀도로 1.5% 아가 플레이트 (적합한 선별제, 예컨대 앰피실린 함유)상에 플레이팅한다. 상기 플레이트를 세균 콜로니 스크리닝을 위해 통상적인 방법 (예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, pages 1.93 to 1.104), 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 따라 나일론 막을 이용하여 스크리닝한다.
방법 2: PCR
대안적으로, 주어진 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를, 예를 들어 주어진 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA에 수탁된 알부민 융합 구성물 5' 및 3'을 하이브리드화하는 17 내지 20개의 누클레오티드로 구성된 두 개의 프라이머를 이용하여, 서열번호:X의 수탁된 알부민 융합 구성물의 샘플로부터 증폭시킬 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응을 통상적인 조건하에 수행하며, 예를 들어 상기 조건은 0.5 ㎍의 상기 cDNA 주형을 지니는 25 ㎕의 반응 혼합물이다. 편리한 반응 혼합물은 1.5-5 mM MgCl2, 0.01% (w/v) 젤라틴, 각 20 μM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmol의 각 프라이머 및 0.25 유닛의 Taq 폴리머라제이다. 퍼킨-엘머 세투스 자동화 열 싸이클러(Perkin-Elmer Cetus automated thermal cycler)로 35주기의 PCR (94℃에서 1분 동안 변성; 55℃에서 1분 동안 어닐링; 72℃에서 1분 동안 신장)을 수행하였다. 증폭된 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고, 예측되는 분자량의 DNA 밴드를 절제하고 정제하였다. DNA 생성물의 서브클로닝 및 시퀀싱에 의해 PCR 생성물이 선택된 서열임을 입증하였다.
수탁된 클론에 존재하지 않을 유전자의 5' 또는 3' 비코딩 부분을 동정하기 위해 여러 가지 방법이 이용될 수 있다. 상기 방법은 필터 프로빙, 특정 프로브를 이용한 클론 부화, 및 당 분야에 공지된 5' 및 3' "RACE" 프로토콜과 유사하거나 동일한 프로토콜을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 5' RACE와 유사한 방법은 요망되는 전장 전사체에 없는 5' 말단을 생성하는데 이용될 수 있다 (Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res., 21(7):1683-1684 (1993)).
간단하게, 특정 RNA 올리고누클레오티드는 전장 유전자 RNA 전사체를 함유할 수 있는 RNA의 개체의 5' 말단에 결찰된다. 결찰된 RNA 올리고누클레오티드에 특이적인 프라이머 및 관심있는 유전자의 공지된 서열에 특이적인 프라이머를 함유하는 프라이머 셋은 요망되는 전장 유전자의 5' 부분을 PCR 증폭하는데 사용된다. 상기 증폭된 생성물은 이후 시퀀싱되고 전장 유전자를 생성하는데 사용될 수 있다.
폴리-A + RNA가 사용될 수 있으나, 상기 방법은 요망되는 출처로부터 분리된 총 RNA로 시작된다. 이후 퇴화되거나 손상된 RNA상에서 이후의 RNA 리가아제 단계를 방해할 수 있는 5' 인산염 그룹을 제거할 필요가 있는 경우 RNA 침전물을 포스파타제로 처리할 수 있다. 이후 포스파타제는 불활성화되고 RNA는 메신져 RNA의 5' 말단에 존재하는 캡 구조를 제거하기 위해 담배산 피로포스파타제로 처리된다. 상기 반응은 캡 절단된 RNA의 5' 말단에 5' 인산염 그룹을 남기며, 이것은 이후 T4 RNA 리가아제를 이용하여 RNA 올리고누클레오티드에 결찰될 수 있다.
이렇게 개질된 RNA 침전물은 유전자 특이적 올리고누클레오티드를 이용하는 제1 가닥 cDNA 합성을 위한 주형으로서 이용된다. 제1 가닥 합성 반응물은 결찰된 RNA 올리고누클레오티드에 특이적인 프라이머 및 관심있는 유전자의 공지된 서열에 특이적인 프라이머를 이용하는 요망되는 5' 말단의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 이용된다. 수득된 생성물을 시퀀싱하고 분석하여 5' 말단 서열이 요망되는 유전자를 소유함을 확인하였다.
실시예 11: 다중융합 융합체
알부민 (또는 이의 단편 또는 변이체)에 융합된 알부민 융합 단백질 (예컨대 치료적 단백질(또는 이의 단편 또는 변이체)을 함유)은 추가로 다른 단백질에 융합되어 "다중융합 단백질"을 생성할 수 있다. 다중융합 단백질은 다양한 적용을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, His-tag, HA-tag, 단백질 A, IgG 도메인 및 말토스 결합 단백질에 대한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 융합은 정제를 촉진시킨다(참조, 예컨대 EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 핵 국소화 시그널은 특정 아세포 국소화에 단백질을 표적화할 수 있는 반면, 공유 헤테로이량체 또는 호모이량체는 알부민 융합 단백질의 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 더욱이, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 부가적인 단백질 서열을 융합시켜 융합 단백질의 가용성 및/또는 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다. 상기 기술된 융합 단백질은 당 분야에 공지된 기술을 이용하거나 통상적으로 개질시키고/거나 폴리펩티드의 융합체를 IgG 분자로 표시한 하기 프로토콜을 개질시켜 제조될 수 있다.
간단하게, IgG 분자의 사람 Fc 부분을 하기 기술된 서열의 5' 및 3' 말단을 확대시킨 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킬 수 있다. 상기 프라이머는 발현 벡터, 바람직하게는 포유동물 또는 효모 발현 벡터로의 클로닝을 촉진하는 편리한 제한 효소 부위를 지닐 것이다.
예를 들어, pC4 (ATCC 수탁번호 209646)를 이용하는 경우, 사람 Fc 부분은 BamHI 클로닝 부위에 결찰될 수 있다. 3' BamHl 부위가 파괴됨을 주목한다. 다음으로, 사람 Fc 부분을 함유하는 벡터를 BamHI로 다시 제한하고, 벡터를 선형화시키고, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 (당 분야에 공지된 기술을 이용하여 생성 및 분리됨)를 상기 BamHI 부위에 결찰시킨다. 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 스톱 코돈 없이 클로닝되며, 융합 단백질을 함유하는 Fc가 생성되지 않음을 주목한다.
천연 발생 시그널 서열이 본 발명의 알부민 융합 단백질을 제조하는데 사용되는 경우, pC4는 제2의 시그널 펩티드를 필요로 하지 않는다. 대안적으로 천연 발생 시그널 서열이 사용되지 않으면 벡터는 이종 시그널 서열을 포함하도록 개질될 수 있다 (참조. 예컨대 국제 공개 WO 96/34891.)
사람 IgG Fc 영역:
Figure 112012047901064-pat00028
실시예 12: 알부민 융합 단백질로부터의 항체 생성
하이브리도마 기술
본 발명의 알부민 융합 단백질 및 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부(예컨대 융합 단백질의 치료적 단백질 부분 또는 알부민 단백질)에 결합하는 항체는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다 (참조, Current Protocols, Chapter 2.). 상기 방법의 한 예로서, 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부의 제조물을 제조하여 여기에 실질적으로 천연 오염물이 없도록 정제한다. 이후 상기 제조물을 동물에게 도입하여 보다 큰 특정 활성의 폴리클로날 항혈청을 생성한다.
본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부에 특이적인 모노클로날 항체를 하이브리도마 기술을 이용하여 제조한다 (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). 일반적으로, 동물(바람직하게는 마우스)을 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부로 면역시킨다. 상기 마우스의 비장세포를 추출하여 적합한 골수종 세포주와 융합시킨다. 임의의 적합한 골수종 세포주가 본 발명에 따라 적용될 수 있으나; ATCC로부터 이용가능한 모체 골수종 세포주(SP20)를 이용하는 것이 바람직하다. 융합 이후, 생성된 하이브리도마 세포를 HAT 배지에 선택적으로 유지시킨 다음 반즈 등 (Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981))이 기술한 대로 희석을 제한하여 클로닝한다. 상기 선택을 통해 수득된 하이브리도마 세포를 검정하여 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.
대안적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부와 결합할 수 있는 추가의 항체가 항-유전형 항체를 이용하는 2단계 공정으로 제조될 수 있다. 상기 방법은 항체가 그 자체로 항원이므로 제2 항체에 결합하는 항체를 수득할 수 있다는 사실을 이용한 것이다. 상기 방법에 따라, 단백질 특이적 항체를 동물, 바람직하게는 마우스를 면역시키는데 사용한다. 상기 동물의 비장세포를 히이브리도마 세포를 생성하는데 이용하며, 하이브리도마 세포를 스크리닝하여 본 발명의 알부민 융합 단백질 (또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부)에 결합할 수 있는 항체를 생성하는 클론을 동정한다 - 특정 항체가 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부에 의해 차단될 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 알부민 융합 단백질 (또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부)에 대한 항-유전형 항체를 포함한다 - 특정 항체가 본 발명의 추가의 융합 단백질 (또는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 일부)의 형성을 유도하기 위해 동물을 면역시키는데 사용된다 - 특정 항체.
사람에서 항체의 생체내 이용을 위해, 항체를 "사람화"시켰다. 이러한 항체는 상기 기술된 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 유래된 유전자 작제물을 사용하여 생성될 수 있다. 키메라 항체 및 사람화된 항체를 생성하는 방법은 당해분야에 공지되어 있으며, 본원에서 논의되어 있다. (문헌[Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et at., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et at., U.S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi et at., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et at., International Publication No. WO 8702671; Boulianne et at., Nature 312:643 (1984); Neuberger et at., Nature 314:268 (1985) 참조].
scFvs 라이브러리로부터의 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 일부에 대한 항체 단편의 분리. 사람 PBL로부터 단리된 자연적으로 발생하는 V-유전자를 도너가 노출되었거나 노출되지 않았던 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 일부에 대한 반응성을 갖는 항체 단편의 라이브러리로 작제시켰다 (본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. 특허 5,885,793 참조).
라이브러리의 획득. scFvs 라이브러리를 국제 공개 번호 WO92/01047에 기술된 바와 같이 사람 PBL의 RNA로부터 작제하였다. 항체 단편을 나타내는 파아지를 획득하기 위해, 파아지미드가 잠복된 약 109 E.coli에 1% 글루코오스 및 100㎍/ml의 앰피실린(2xTY-AMP-GLU)를 함유하는 50ml의 2xTY를 접종시키고, 진탕하면서 0.8의 O.D.로 성장시켰다. 5ml의 이러한 배양물에 50ml의 2xTY-AMP-GLU를 접종하고, 2x108 TU의 델타 유전자 3 헬퍼 (M13 델타 유전자 III, 국제공개 번호 WO 92/01047 참조)를 첨가하고, 배양물을 진탕하지 않고 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하고, 진탕하면서 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 10분 동안 4000r.p.m.으로 원심분리하고, 펠렛을 100㎍/ml 앰피실린 및 50ug/ml의 카나마이신을 함유하는 2리터의 2xTY에 재현탁시키고, 밤새 성장시켰다. 파아지를 국제공개번호 WO 92/01047에 기술된 바와 같이 제조하였다.
M13 델타 유전자 III을 하기와 같이 제조하였다: M13 델타 유전자 III 헬퍼 파아지는 유전자 III 단백질을 엔코딩하지 않으며, 따라서 항체 단편을 나타내는 파아지(미드)가 항원에 대한 더 큰 결합성을 갖는다. 감염성 M13 델타 유전자 III 입자는, 파아지 형성 동안 야생형 유전자 III 단백질을 공급하면서 pUC19 유도체가 잠복된 세포에서 헬퍼 파아지를 성장시킴으로써 제조하였다. 배양물을 1시간 동안 진탕하지 않고 37℃에서 인큐베이션시키고, 추가로 1시간 동안 37℃에서 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 세포를 스핀다운시키고 (IEC-Centra 8,400 r.p.m. 10분), 100㎍ 앰피실린/ml 및 25㎍ 카나마이신/ml (2xTY-AMP-KAN)을 함유하는 300ml 2xTY 브로스에 재현탁시키고, 37℃에서 진탕시키면서 밤새 성장시켰다. 파아지 입자를 두개의 PEG-침전 (Sambrook et al., 1990)에 의해 배양 배지로부터 정제하여 농축시키고, 2ml PBS중에 재현탁시키고, 0.45㎛ 필터 (Minisart NML; Satorius)를 통과시켜 약 1013 형질도입 유닛/ml 최종 농도를 제공하였다 (앰피실린 내성 클론).
라이브러리의 패닝. 면역튜브(Nunc)를 100㎍/ml 또는 10㎍/ml의 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 일부 4ml와 함께 PBS중에 밤새 코팅시켰다. 튜브를 2% Marvel-PBS로 2시간 동안 37℃하에 차단하고, PBS중에 3회 세척하였다. 약 1013 TU의 파아지를 튜브에 도포하고, 상하로 움직이는 턴테이블에서 텀블링시키면서 실온하에 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 1.5시간 동안 방치하였다. 튜브를 PBS 0.1% 트윈-20으로 10회 세척하고, PBS로 10회 세척하였다. 1ml의 100mM 트리에틸아민을 첨가하고, 상하로 움직이는 턴테이블에서 15분 동안 회전시킨 후, 용액을 즉시 0.5ml의 1.0M 트리스-HCl (pH7.4)로 중화시켜 파아지를 용리시켰다. 그 후, 30분 동안 37℃에서 박테리아와 용리된 파아지를 인큐베이션시킴으로써 파아지로 10ml의 미드-로그 E.coli TG1를 접종시켰다. 그 후, E.coli를 1% 글루코오스 및 100㎍/ml 앰피실린을 함유하는 TYE 플레이트상에 플레이팅시켰다. 그 후, 생성된 박테리아 라이브러리를 후속 선택용 파아지를 제조하기 위한 상기 기술된 바와 같은 델타 유전자 3 헬퍼 파아지로 획득하였다. 그 후, 이러한 공정을 총 4회의 친화 정제 동안 반복하면서, 3회 및 4회 정제 동안 튜브-세척을 20회의 PBS, 0.1% 트윈-20 및 20회의 PBS로 증가시켰다.
결합제 특성. 3회차 및 4회차 선택으로부터의 용리된 파아지로 E.coli HB 2151을 접종하고, 가용성 scFv를 검정을 위한 단일 클론으로부터 생성시켰다 (Marks, et al., 1991). 50mM 중탄산염 pH 9.6에서 10pg/ml의 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 이의 일부로 코팅한 미세적정 플레이트로 ELISA를 수행하였다. ELISA에서 클론 양성을 PCR 핑거프린팅 (예를 들어, 국제공개 WO92/01047 참조) 및 시퀀싱에 의해 추가로 특성 결정하였다. 이들 ELISA 양성 클론을 또한, 당해분야의 공지된 기법 예컨대, 예를 들어, 에피토프 맵핑, 결합 친화도, 수용체 시그널 변환, 항체/항원 결합의 차단력 또는 경쟁적 억제, 및 경쟁적인 작용성 또는 길항성에 의해 추가로 특성 결정할 수 있다.
실시예 13: [ 3 H]-2- 데옥시글루코오스 흡수 검정
지방, 골격근 및 간은 인슐린-민감성 조직이다. 인슐린은 이들 조직으로의 글루코오스 흡수/이송을 자극할 수 있다. 지방 및 골격근의 경우, 인슐린은 시그널 변환을 개시하며 이는 실질적으로 특정화된 세포내 구획으로부터 세포 표면으로 글루코오스 트랜스포터 4 분자 즉, GLUT4의 전위를 유도한다. 일단 세포 표면으로 이동하면, GLUT4는 글루코오스 흡수/이송을 가능하게 한다.
[ 3 H]-2- 데옥시글루코오스 흡수
지방 및 근육과 관련된 많은 세포주가 당뇨병 치료용으로 기술된 하나 이상의 치료학적 약물의 혼합물의 존재 또는 부재하의 글루코오스 흡수/이송 활성에 대한 시험에 사용될 수 있다. 특히, 3T3-L1 뮤린 섬유아세포 및 L6 뮤린 골격근 세포는 각각 3T3-L1 지방세포 및 근육대롱세포로 분화되어 [3H]-2-데옥시글루코오스 흡수 검정에 대한 적합한 생체내 모델로서 작용한다 (Urso et at., J Biol Chem, 274(43): 30864-73 (1999); Wang et at., J Mol Endocrinol, 19(3): 241-8 (199/); Haspel et al., J Membr Biol, 169 (1): 45-53 (1999); Tsakiridis et al., Endocrinology, 136(10): 4315-22 (1995)). 간단하게는, 2 x 105 세포/100㎕의 지방세포 또는 분화된 L6 세포를 분화후 배지중의 96-웰 조직-배양(Tissue-Culture) "TC" 처리된 즉, 50㎍/ml의 폴리-L-리신으로 코팅된 플레이트로 이동시키고, 밤새 37℃에서 5% CO2하에 인큐케이션시켰다. 세포를 먼저 혈청 비함유 글루코오스 저함유 DMEM 배지로 1회 세척한 후, 1nM 인슐린의 부재 또는 존재하에 37℃에서 16시간 동안 본 발명의 치료제 (예를 들어, SE ID NO:Y로 기술된 특이적 융합물 및 이의 단편 및 변이체)의 농도를 1nM, 10nM 및 100nM으로 증가시키면서, 100㎕/웰의 동일한 배지 및 100㎕/웰의 완충액 또는 당뇨병 치료용으로 기술된 치료학적 약물중 하나 이상의 혼합물로 절식시켰다. 플레이트를 100㎕/웰의 HEPES 완충된 염수로 3회 세척하였다. 인슐린을 10μM 라벨링된 [3H]-2-데옥시글루코오스(Amersham, #TRK672) 및 10μM 비라벨링된 2-데옥시글루코오스 (SIGMA, D-3179)의 존재하에 37℃에서 30분 동안 HEPES 완충된 염수중에 1nM으로 첨가하였다. 대조군으로서 인슐린의 부재하에서 동일한 조건으로 수행하였다. 최종 농도 10μM 사이토칼라신 B (SIGMA, C6762)를 별도의 웰에서 100㎕/웰로 첨가하여 비특이적 흡수를 측정하였다. 세포를 HEPES 완충된 염수로 3회 세척하였다. 라벨링된 즉, 10μM의 [3H]-2-데옥시글루코오스 및 비라벨링된 즉, 10μM의 2-데옥시글루코오스를 10분 동안 실온에서 첨가하였다. 세포를 차가운 인산염 완충된 염수 "PBS"로 3회 세척하였다. 세포를 150㎕/웰의 0.2N NaOH를 첨가하여 용해시키고, 실온에서 20분 동안 진탕시키면서 후속 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플을 섬광 바이알로 옮기고, 여기에 5mL의 섬광액을 첨가하였다. 바이알을 베타-섬관 계수계로 계수하였다. 이중 조건하의 흡수 즉, 인슐린의 존재 또는 부재하의 차이는 하기 식으로 측정하였다: [(분당 인슐린 수 "cpm" - 비특이적 cpm)/(비인슐린 cpm - 비특이적 cpm)]. 평균 반응은 지방세포 및 근관에 대한 대조군의 약 5배 및 3배 반응의 한도안에 있다.
세포의 분화
세포를 T-75 cm2 플라스크에 완전히 컨플루언시하게 하였다. 배지를 제거하고, 48시간 동안 25mL의 분화전 배지로 교체하였다. 세포를 5% CO2에서 37℃ 및 85% 습도하에 인큐베이션시켰다. 48시간 후, 분화전 배지를 제거하고, 48시간 동안 25mL의 분화 배지로 교체하였다. 세포를 다시 5% CO2에서 37℃ 및 85% 습도하에 인큐베이션시켰다. 48시간 후, 배지를 제거하고, 30mL 분화후 배지로 교체하였다. 분화후 배지를 14-20일 동안 유지시키거나, 완전한 분화가 달성될 때까지 유지시켰다. 배지를 2-3일마다 교체하였다. 사람 지방세포는 젠-바이오, 인크(Zen-Bio, INC (#SA 1096))로부터 구입할 수 있다.
실시예 14: 췌장 세포주로의 [ 3 H]- 티미딘 혼입의 실험관내 검정
GLP-1이 아이슬렛 듀오더널 홈박스-1(IDX-1) 및 인슐린 mRNA 수준의 증가 (Hui et al., 2001, Diabets, 50(4): 785-96)와 관련된 래트 췌장관 상피 세포주 ARIP의 분화를 시간 및 용량 의존적으로 유도하는 것이 최근 밝혀졌다. 이어서 IDX-1은 GLP-1 수용체의 mRNA 수준을 증가시킨다.
시험한 세포 유형
RIN -M 세포: 이들 세포는 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 컬렉션 (ATCC 세포주 제 CRL-2057호)로부터 입수가능하다. RIN-M 세포주는 방사선 유도된 이동가능한 래트 도세포 종양으로부터 유래된다. 이러한 세포주는 종양의 누드 마우스 이종이식으로부터 확립되었다. 세포는 아이슬렛 폴리펩티드 호르몬을 생성하고 분리하며, L-도파 데카르복실라아제 (아민 전구체 흡수 및 데카르복실화, 또는 APUD 활성을 갖는 세포에 대한 마커)를 생성한다.
ARIP 세포: 이들은 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 컬렉션 (ATCC 세포주 제 CRL-1674호)으로부터 입수가능한 상피 세포 형태의 췌장 외분비 세포이다. 또한 문헌[: Jessop, N.W. and Hay, R.1., "Characteristics of two rat pancreatic exocrine cell lines derived from transplantable tumors," In Vitro 16: 212, (1980); Cockell, M. et al., "Identification of a cell-specific DNA-binding activity that interacts with a transcriptional activator of genes expressed in the acinar pancreas," Mol. Cell. Biol. 9: 2464-2476, (1989); Roux, E., et al. "The cell-specific transcription factor PTFI contains two different subunits that interact with the DNA" Genes Dev. 3: 1613-1624, (1989); and, Hui, I-I., et al., "Glucagon-like peptide 1 induces differentiation of islet duodenal homeobox-l-positive pancreatic ductal cells into insulin-secreting cells," Diabetes 50: 785-796 (2001)] 참조.
세포 제조
RIN-M 세포주를 10% 소태 혈청 (HyClone, #SH30088.03)을 갖는 RPMI 1640 배지 (Hyclone, #SH300027.01)중에 성장시키고, 1:3 내지 1:6의 비로 6 내지 8일마다 계대배양하였다. 배지를 3 내지 4일 마다 교환하였다.
ARIP (ATCC #CRL-1674) 세포주를 1.5g/L 중탄산나트륨 및 10% 소태 혈청을 함유하도록 조절된 2mM L-글루타민을 갖는 함스(Ham's) F12K 배지(ATCC, #30-2004)에서 성장시켰다. ARIP 세포주를 주마다 2회 1:3 내지 1:6의 비로 계대 배양하였다. 배지를 3 내지 4일 마다 교환하였다.
검정 프로토콜
세포를 96-웰 플레이트에서 4000 세포/웰로 시딩하고, 48 내지 72시간 동안 50% 컨플루언시하게 배양하였다. 세포를 100㎕/웰에서 혈청 비함유 배지로 교체하였다. 48-72시간 인큐베이션 후, 혈청 및/또는 본 발명의 치료제 (예를 들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 이의 단편 및 변이체)를 웰에 첨가하였다. 추가로 36시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. [3H]-티미딘 (5-20 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia, #TRK120)을 1 마이크로퀴리스/5 마이크로리터로 희석시켰다. 36시간 인큐베이션 후, 웰당 5 마이크로리터를 추가로 24시간 동안 첨가하였다. 세포를 차가운 PBS로 1회 부드럽게 세척함으로써 반응을 종결시켰다. 그 후, 세포를 10% 빙냉 TCA 100 마이크로리터로 15분 동안 4℃에서 고정시켰다. PBS를 제거하고, 0.2N NaOH 200 마이크로리터를 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 용액을 섬광 바이알에 옮기고, 수용액과 혼화가능한 5mL의 섬광액을 첨가하고, 강하게 혼합하였다. 바이알을 베타 섬광 계수기에서 계수하였다. 음성 대조군으로서 완충액을 사용하였다. 양성 대조군으로서, 소태 혈청을 사용하였다.
실시예 15: 당뇨의 검정
당뇨 (즉, 소변중의 과량의 당)는 용이하게 검정될 수 있어 당뇨병의 질환 상태 지수를 제공한다. 일반적인 환자 샘플과 비교하여 환자 샘플중의 과도한 소변은 IDDM 및 NIDDM의 징후이다. IDDM 및 NIDDM을 갖는 이러한 환자의 치료 효과는 소변중의 과량의 글루코오스의 양의 감소에 의해 나타내어 진다. IDDM 및 NIDDM 모니터링에 대한 바람직한 구체예에서, 환자로부터의 소변 샘플은 당해분야에 공지된 기법을 이용하여 글루코오스 존재에 대해 검정된다. 사람의 당뇨는 100ml 당 100mg을 초과하는 비뇨 글루코오스 농도로 규정된다. 당뇨를 나타내는 이들 환자에서 과도한 당 수준은 혈액 샘플을 수득하고, 혈청 글루코오스를 검정함으로써 더욱 정확하게 측정될 수 있다.
실시예 16: B 세포 증식 및 분화의 자극 또는 억제의 검출 검정
작용성 사람 면역 반응의 유도는 B-계통 세포와 이들의 미세환경간의 해석가능한 동종의 시그널을 요한다. 시그널은 B-계통 세포가 이의 프로그래밍된 성장이 계속되게 하는 양성 자극, 또는 세포가 이의 현재의 성장 경로를 억제하도록 지시하는 음성 자극을 부여할 수 있다. 오늘날까지, 다양한 자극 및 억제 시그널이 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IL-14 및 IL-15를 유도하는 B 세포 반응에 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게는, 이러한 시그널은 이들 자체는 약한 이펙터이나, 다양한 보조-자극 단백질과 혼합되어 B 세포 군집중의 활성화, 증식, 분화, 귀소, 내성 및 치사를 유도할 수 있다.
B-세포 보조-자극 단백질 부류의 가장 우수하게 연구된 부류중 하나는 TNF-슈퍼패밀리이다. 이러한 패밀리로는, CD40, CD27 및 CD30과 이들 각각의 리간드 CD154, CD70 및 CD153이 다양한 면역 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 B-세포 군집 및 이들의 전구체의 증식 및 분화의 검출 및/또는 관찰을 가능하게 하는 검정은 증식 및 분화에 있어서 이들 B-세포 군집상에서 다양한 단백질이 가질 수 있는 효과를 측정하는 유용한 수단이다. 하기 리스트는 B-세포 군집 및 이들의 전구체의 분화, 증식 또는 억제를 검출하기 위해 고안된 두개의 검정이다.
시험관내 검정 - 본 발명의 알부민 융합 단백질 (치료학적 단백질의 단편 또는 변이체 및/또는 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체를 함유하는 융합 단백질을 포함)은 B-세포 군집 및 이들의 전구체에서 활성화, 증식, 분화 또는 억제 및/또는 치사를 유도할 수 있는 이들의 능력에 대해 평가될 수 있다. 0.1 내지 10,000ng/mL의 용량 범위를 정성적으로 초과하는 것으로 평가된 정제된 사람 편도선 B 세포에 대한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 활성은 표준 B-림프구 보조자극 검정으로 평가되며, 여기서 정제된 편도선 B 세포는 프라이밍제로서 고정된 항-사람 IgM 항체 또는 포르말린 고정된 스타필로코커스 아우레우스 코완 I (Staphylococcus aureus Cowan I)(SAC)의 존재하에 배양된다. 이차 시그널 예컨대, IL-2 및 IL-5는 SAC 및 IgM 가교와 상승 작용하여 삼중수소화-티미딘 혼입에 의해 측정되는 B 세포 증식을 유도한다. 신규한 상승 작용제가 이러한 검정을 이용하여 용이하게 확인될 수 있다. 이러한 검정은 CD3-양성 세포의 마그네틱 비드 (MACS) 고갈에 의해 사람 편도선 B 세포를 단리시키는 것을 포함한다. 생성된 세포 군집은 CD45R (B220)의 발현에 의해 평가할 경우 95% 초과의 B 세포이다.
다양하게 희석된 각각의 샘플을 96-웰 플레이트의 개개의 웰에 위치시키고, 여기에 총 150㎕ 부피 배양 배지 (10% FBS, 5 x 10-5 M 2ME, 100U/ml 페니실린, 10ug/ml 스트렙토마이신, 및 SAC의 10-5 희석물을 함유하는 RPMI 1640)중에 현탁된 105 B-세포를 첨가하였다. 증식 또는 억제는 3H-티미딘 (6.7 Ci/mM)으로의 20h 펄스에 의해 정량하고, 72h 후속 인자 첨가를 개시하였다. 양성 및 음성 대조군은 각각 IL2 및 배지이다.
생체내 검정 - BALB/c 마우스를 완충액 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질 (치료학적 단백질의 단편 또는 변이체 및/또는 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체를 함유하는 융합 단백질) 2mg/kg으로 매일 2회 접종(i.p.)시켰다. 마우스를 4일 연속해서 이렇게 처리하고, 그 후 이들을 희석시키고, 다양한 조직 및 혈청을 검정을 위해 모았다. 정상적인 비장 및 본 발명의 알부민 융합 단백질로 처리된 비장으로부터의 H & E 섹션의 비교는 비장 세포에 대한 융합 단백질의 활성 결과 예컨대, 주위림프구집의 분포 및/또는 레드 펄프(red pulp) 영역의 유핵 세포질의 현저한 증가를 확인시켜 주며, 이는 B-세포 군집의 분화 및 증식 활성을 나타낼 수 있다. B 세포 마커인 안티-CD45R(B220)을 사용한 면역조직화학적 연구는 비장 세포에 대한 생리적 변화 예컨대, 비장 파괴가 성립된 T-세포 영역을 침투하는 느슨하게 한정된 B-세포 구역내의 증가된 B-세포 표출로 인한 것인지의 여부를 측정하는데 사용된다.
알부민 융합 단백질로 처리된 마우스로부터의 비장의 세포 표현형 검색이 알부민 융합 단백질이 대조군 마우스에서 관찰된 것 보다 ThB+, CD45R(B220) 둔한 B 세포의 비를 현저하게 증가시키는 지의 여부를 나타내기 위해 사용된다.
마찬가지로, 생체내에서 증가된 성숙한 B-세포 표출의 예측된 결과는 혈청 Ig 역가의 상대적 증가이다. 따라서, 혈청 IgM 및 IgA 수준은 완충액 처리된 마우스와 융합 단백질 처리된 마우스간에 비교하였다.
실시예 17: T 세포 증식 검정
CD3-유도된 증식 검정은 PBMC에서 수행되며, 3H-티미딘의 흡수에 의해 측정된다. 본 검정은 하기와 같이 수행된다. 96-웰 플레이트를 밤새 4℃에서 CD3(HIT3a, Pharmingen)에 대한 100㎕/웰의 mAb 또는 이소타입-매칭된 대조군 mAb (B33.1)로 코팅한 후 (.05M 중탄산 완충액중의 1㎍/ml, pH 9.5), PBS로 3회 세척하였다. PBMC를 사람 말초혈로부터 F/H 구배 원심분리에 의해 분리하고, 다양한 농도의 본 발명의 알부민 융합 단백질 (치료학적 단백질의 단편 또는 변이체 및/또는 알부민 또는 알부민의 단편 또는 변이체를 함유하는 융합 단백질을 포함) (총 부피 200㎕)의 존재하에 10% FCS 및 P/S를 함유하는 RPMI에서 mAb 코팅된 플레이트의 웰에 4중으로 첨가하였다. 관련 단백질 완충액 및 배지 단독으로 사용한 것이 대조군이다. 48시간 동안 37℃에서 배양시킨 후, 플레이트를 2분 동안 1000rpm에서 회전시키고, 100㎕의 상청액을 제거하고, 증식에 대한 영향이 관찰되지 않았다면 IL-2 (또는 기타 사이토카인)의 측정을 위해 -20℃에서 저장하였다. 웰을 채취하고, 3H-티미딘을 혼입하여 증식을 측정하는데 이용하였다. 항-CD3 단독은 증식에 대한 양성 대조군이다. IL-2 (100U/ml)는 또한 증식을 증대시키는 대조군으로 사용하였다. T 세포의 증식을 유도하지 않는 대조군 항체는 본 발명의 융합 단백질의 효과에 대한 음성 대조군으로서 사용된다.
실시예 18: MHC 클래스 II 의 발현, 보조자극 및 부착 분자 및 모노사이트 및 모노사이트 유래된 사람 수지상 세포의 세포 분화에 대한 본 발명의 융합 단백질의 효과
수지상 세포는 말초 혈액에서 발견된 전구체 증식 확장에 의해 생성된다: 부착 PBMC 또는 세정된 모노사이트 분획을 GM-CSF (50ng/ml) 및 IL-4(20ng/ml)과 함께 7-10일 동안 배양된다. 이러한 수지상 세포는 비성숙 세포의 특징적 표현형을 갖는다 (CD1, CD80, CD86, CD40 및 HMC 클래스 II 항원의 발현). 활성화 인자 예컨대, TNF-α로의 처리는 표면 표현형의 신속한 변화를 초래한다 (MHC 클래스 I 및 II, 보조자극 및 부착 분자의 증가된 발현, FCγRII의 하향조절, CD83의 상향조절). 이들 변화는 증가된 항원 표출 능력 및 수지상 세포의 작용성 성숙과 관련있다.
표면 항원의 FACS 검정은 하기와 같이 수행하였다. 세포를 본 발명의 알부민 융합 단백질로 이의 농도를 증가시키면서 또는 LPS (양성 대조군)로 1-3일 처리하고, 1% BSA 및 0.02mM 나트륨 아지드를 함유하는 PBS로 세척한 후, 30분 동안 4℃에서 적합한 FITC- 또는 PE-라벨링된 모노클로날 항체의 1:20 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 추가적인 세척 후, 라벨링된 세포를 FACScan (Becton Dickinson)에 대한 유세포분류에 의해 검정하였다.
사이토카인의 생성에 대한 효과. 수지상 세포에 의해 생성된 사이토카인 특히, IL-12는 T-세포 의존성 면역 반응의 개시에 중요하다. IL-12는 Th1 헬퍼 T-세포 면역 반응의 발생에 영향을 끼치며, 세포독성 T 및 NK 세포 작용을 유도한다. ELISA는 하기와 같이 IL-12 방출을 측정하는데 사용된다. 수지상 세포 (106/ml)를 24시간 동안 본 발명의 알부민 융합 단백질의 농도를 증가시키면서 처리하였다. LPS(100ng/ml)를 양성 대조군으로서 세포 배양물에 첨가하였다. 세포 배양물로부터의 상청액을 모으고, 시중의 ELISA 키트 (예를 들어, R & D 시스템 (Minneapolis, MN))를 사용하여 IL-12 함유물에 대해 검정하였다. 키트와 제공된 표준 프로토콜을 이용하였다.
MHC 클래스 II , 보조자극 및 부착 분자의 발현에 대한 효과. 모노사이트상에 세포 표면 항원의 세개의 주요 패밀리가 확인될 수 있다: 부착 분자, 항원 제시와 관련된 분자 및 Fc 수용체. MHC 클래스 II 항원 및 기타 보조자극 분자 예컨대, B7 및 ICAM-1의 발현 조절은 모노사이트의 항원 표출 능력 및 T 세포 활성화 유도 능력에서의 변화를 초래할 수 있다. Fc 수용체의 증가된 발현은 개선된 모노사이트 세포독성 활성, 사이토카인 방출 및 식작용과 관련될 수 있다.
FACS 검정은 하기와 같이 표면 항원을 시험하는데 사용된다. 모노사이트를 본 발명의 알부민 융합 단백질로 이의 농도를 증가시키면서 또는 LPS (양성 대조군)으로 1 내지 5일 처리하고, 1% BSA 및 0.02mM 나트륨 아지드를 함유하는 PBS로 세척한 후, 30분 동안 4℃에서 적합한 FITC- 또는 PE-라벨링된 모노클로날 항체의 1:20 희석물과 인큐베이션시켰다. 추가적으로 세척한 후, 라벨링된 세포를 FACScan (Becton Dickinson)에 대한 유세포분류에 의해 검정하였다.
모노사이트 활성화 및/또는 증가된 생존. 모노사이트를 활성화 (또는 대안적으로 불활성화)시키고/거나 모노사이트 생존력을 증가 (또는 대안적으로 모노사이트 생존력을 감소)시키는 분자에 대한 검정법은 당해분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 분자가 모노사이트의 억제제 또는 활성화제로 작용하는지의 여부를 측정하는데 일정하게 적용될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질은 하기 기술된 세 검정법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이들 검정법 각각에 있어서, 말초혈 모노핵 세포 (PBMC)는 단일 도너 류코팩 (American Red Cross, Baltimore, MD)로부터 히스토파크 구배 (Histopaque gradient) (Sigma)를 통해 원심분리에 의해 정제된다. 모노사이트를 역류 원심분리 유출에 의해 PBMC로부터 분리하였다.
모노사이트 생존 검정. 사람 말초혈 모노사이트는 혈청 또는 기타 자극제의 부재하에 배양될 경우 점진적으로 생존력을 잃게된다. 이들의 치사는 내부적으로 조정된 과정 (아폽토시스)로부터 기인한다. 배양물로의 활성화 인자 예컨대, TNF-알파의 첨가는 현저하게 세포 생존율을 증대시키고, DNA 단편화를 방지한다. 요오드화프로피듐 (PI) 염색은 하기와 같이 아폽토시스를 측정하는데 사용된다. 모노사이트는 100ng/ml TNF-알파의 존재하에 (음성 대조군) 및 다양한 농도의 시험할 융합 단백질의 존재하에 혈청 비함유 배지 (양성 대조군)에서 프로필렌 튜브중에서 48시간 동안 배양하였다. 세포를 5㎍/ml의 최종 농도로 PI를 함유하는 PBS중에 2 x 106/ml로 현탁시키고, FACScan 검정 전에 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 본 실험적 범례에서 PI 흡수가 DNA 단편화와 관련있음이 입증되었다.
사이토카인 분비에 대한 효과. 모노사이트/마크로파아지의 중요한 작용은 자극 후 사이토카인 분비를 통한 면역 시스템의 기타 세포 군집화에 대한 조정 활동이다. 사이토카인 방출을 측정하기 위한 ELISA는 하기와 같이 수행하였다. 사람 모노사이트를 본 발명의 알부민 융합 단밸질과 이의 농도를 증가시키면서 5 x 105 세포/ml의 밀도로 인큐베이션시키고, 융합 단백질의 부재하에 동일한 조건하에 인큐베이션시켰다. IL-12 생성에 있어서, 세포를 융합 단백질의 존재하에 IFN (100U/ml)으로 밤새 프라이밍하였다. 그 후, LPS (10ng/ml)를 첨가하였다. 24시간 후, 컨디셔닝된 배지를 모으고, 사용때까지 냉동 저장하였다. 그 후, 시중에서 입수가능한 ELISA 키트 (예를 들어, R & D 시스템 (Minneapolis, MN))를 사용하고, 키트에 함께 제공된 표준 프로토콜에 따라 TNF-알파, IL-10, MCP-1 및 IL-8의 측정을 수행하였다.
산화 폭발. 정제된 모노사이트를 2-1 x 105 세포/웰로 96웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 본 발명의 알부민 융합 단밸질의 농도를 증가시키면서 총 부피 0.2ml의 배양 배지 (RPMI 1640 + 10% FCS, 글루타민 및 항체)의 웰에 첨가하였다. 3일 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 원심분리하고, 배지를 웰로부터 제거하였다. 마크로파아지 단일층에 웰당 0.2ml의 페놀 레드 용액 (140mM NaCl, 10mM 인산칼륨 완충액 pH 7.0, 5.5mM 덱스트로오스, 0.56mM 페놀 레드 및 19U/ml의 HRPO)을 자극제 (200nM PMA)와 함께 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 웰당 20㎕의 1N NaOH를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 흡수가 610nm에서 측정되었다. 마크로파아지에 의해 생성된 H2O2의 양을 측정하기 위해, 공지된 몰농도 H2O2 용액의 표준 곡선을 각각의 실험에 대해 수행하였다.
실시예 19: 혈관내피세포의 성장에 대한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 효 과
*1일째에, 사람 혈관내피세포 (HUVEC)를 4% 소태 혈청 (FBS), 16유닛/ml 헤파린 및 50유닛/ml 내피세포 성장 보충물 (ECGS, Biotehcnique, Inc.)을 함유하는 M199 배지에서 2-5x104 세포/35mm 디쉬 밀도로 시딩하였다. 2일째에, 배지를 10% FBS, 8유닛/ml 헤파린을 함유하는 M199로 교체하였다. 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 양성 대조군 예컨대, VEGF 및 염기성 FGF(bFGF)를 다양한 농도로 첨가하였다. 4일 및 6일 째에, 배지를 교체하였다. 8일째에, 컬터 카운터(Coulter Counter)로 세포 수를 측정하였다.
HUVEC 세포 수의 증가는 융합 단백질이 혈관내피세포를 증식시킬 수 있다는 것을 나타내는 반면, HUVEC 세포 수의 감소는 융합 단백질의 혈관내피세포를 방해한다는 것을 나타낸다.
실시예 20: 래트 각막 환부 회복 모델
본 동물 모델은 신혈관형성에 대한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 효과를 보여준다. 실험 프로토콜을 다음을 포함한다:
각막 중심으로부터 스트로마층으로 1-1.5mm 길이로 절개한다.
눈의 외부 가장자리에 면하는 절개부의 언저리 아래로 압설자를 삽입한다.
포켓을 만든다 (이의 기저부는 눈의 가장자리로부터 1-1.5mm에 있다).
포켓내에 50ng-5㎍의 알부민 융합 단백질을 함유하는 펠렛을 위치시킨다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 갖는 처리물은 20mg-500mg의 용량 범위 (5일 동안 매일 처리)로 각막 환부로 국부적으로 도포될 수 있다.
실시예 21: 당뇨병 마우스 및 글루코코르티코이드-손상된 환부 회복 모델
당뇨병 db +/ db + 마우스 모델
본 발명의 알부민 융합 단백질이 회복 과정을 가속화시킨다는 것을 입증하기 위해, 유전적으로 당뇨병을 갖는 환부 회복 마우스 모델을 사용하였다. db+/db+ 마우스에서 충분한 두께의 환부 회복 모델은 잘 특성화되고, 임상적으로 적절하고 재생가능한 손상된 환부 회복 모델이다. 당뇨병성 환부의 회복은 수축 보다는 육아 조직의 형성 및 재상피화에 의존적이다 (Gartner, M.H. et al., J.Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am.J.Pathol. 136:1235 (1990)).
당뇨병성 동물은 타입 II 당뇨병에서 관찰되는 많은 특징을 갖는다. 호모자이거스 (db+/db+) 마우스는 이들의 정상적인 호모자이거스 (db+/+m) 한배 새끼에 비해 비만이다. 변이성 당뇨병 (db+/db+) 마우스는 크로모좀 4 (db+)에 대한 단일 상염색체 열성 변이를 갖는다 (Coleman et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:283-293 (1982)). 동물은 대식성, 조갈증 및 다뇨증을 나타낸다. 변이성 당뇨병 마우스 (db+/db+)는 증가된 혈중 글루코오스, 증가되거나 정상의 인슐린 수준, 및 억제된 세포-매개된 면역성을 갖는다 (Mandel et al., J.Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin.Exp. Immunol. 51(1):1-7 (1983); Leither et al., Am.J. of Pathol. 114:46-55 (1985)). 말초신경장애, 심근 합병증, 및 비정상적인 미세혈관 병변, 기저막 두께 및 사구체 여과율이 이러한 동물에서 나타나는 것으로 기술되었다 (Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83(2):221-232 (1984); Robertson et al., diabetes 29(1):60-67 91980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40(4):460-473 (1979); coleman, D.L., Diabetes 31 (Suppl):1-6 (1982)). 이들 호모자이거스 당뇨병성 마우스는 고혈당증을 나타내며, 이는 사람 타입 II 당뇨병에 대한 인슐린 유사체에 대해 내성이다 (Mandel et al., J.Immunol. 120:1375-1377 (1978)).
이들 동물에서 관찰된 특징은 이러한 모델에서의 회복이 사람 당뇨병에서 관찰된 회복과 유사할 수 있음을 시사한다 (Greenhalgh, et al., Am.J. of Pathol. 136:1235-1246 (1990)).
유전적으로 당뇨병성인 암컷 C57BL/KsJ (db+/db+) 마우스 및 이의 비당뇨병성 (db+/+m) 헤테로자이거스 한배 새끼를 본 연구에 사용하였다 (Jackson Laboratories). 연구 시작시에 6주령 및 8주령된 동물을 구입하였다. 동물을 각각 수용시키고, 임의의 음식과 물을 공급하였다. 무균 기법을 이용하여 모든 조작을 수행하였다. 실험은 휴먼 게놈 사이언스, 인크.(Human Genome Sciences, Inc.), 인스티튜셔널 애니몰 케어 앤드 유스 코미테 앤드 더 가이드라인 퍼 더 케어 앤드 유스 오브 래버로터리 애니멀 (Institutional Animal Care and Use Comitte and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)의 룰 및 가이드라인에 따라 수행하였다.
상처 프로토콜은 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다 (Tsuboi, R. and Rifkin, D.B., J. Exp . Med . 172:245-251 (1990)). 간단하게는, 상처를 입히는 날에, 동물을 탈이온수에 용해시킨 아베르틴 (0.01mg/mL), 2,2,2-트리브로모에탄올 및 2-메틸-2-부탄올을 복강내 주입으로 마취하였다. 동물의 등 영역을 면도하고, 피부를 70% 에탄올 용액 및 요오드로 세척하였다. 상처를 내기 전에 수술 부위를 멸균 거즈로 건조시켰다. 그후, 키스 조직 펀치(Keyes tissue punch)를 사용하여 8mm 전체 두께의 상처를 생성시켰다. 상처를 낸 직후, 주위 피부를 조심스럽게 스트레칭시켜 환부가 확대되는 것을 배제시켰다. 실험 동안 환부 왼쪽 부분을 개방하였다. 상처난 날부터 연속 5일 동안 국부적으로 치료하였다. 치료 전에, 환부를 멸균 염수 및 거즈 스폰지로 조심스럽게 세척하였다.
환부를 시각적으로 검사하고, 수술일에 및 이틀 후에 일정한 간격을 두고 사진을 촬영하였다. 환부 밀봉부를 1-5일 및 8일째에 매일 측정하여 평가하였다. 눈금측정 제임스 캘리퍼스를 이용하여 환부를 수직 및 수평으로 측정하였다. 육아조직이 시각적으로 더이상 관찰되지 않고, 환부가 연속 상피에 의해 커버링되는 경우 상처가 아문 것으로 간주하였다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 비히클중으로 8일 동안 1일당 4mg 내지 500mg의 다양한 투여량으로 투여하였다. 비히클 대조군 그룹에는 50mL의 비히클 용액을 투여하였다.
8일째에 나트륨 펜토바르비탈 (300mg/kg)의 복강내 주입에 의해 동물을 안락시켰다. 그 후, 환부 및 주위 피부를 조직학 및 면역조직화학을 위해 채취하였다. 조직 표본을 추가 처리를 위해 생검 스폰지간의 조직 카세트의 10% 중성 완충된 포르말린에서 방치시켰다.
각각 10마리 동물 (당뇨병의 5마리 및 비당뇨병의 5마리 대조군)의 3 군을 평가하였다: 1) 비히클 위약 대조군, 2) 비처리된 군, 및 3) 처리된 군.
환부 밀봉을 수직 및 수평 축으로 영역을 평가하고, 환부의 총 면적을 수득함으로써 분석하였다. 그 후, 초기 환부 영역 (0일째)과 처리후 (8일째)의 환부 영역의 차이를 구하여 수축을 평가하였다. 1일째의 환부 영역은 64mm2이며, 이는 피부 펀치의 크기와 상응한다. 하기 공식을 이용하여 계산하였다:
a. [8일째의 개방 영역] - [1일째의 개방 영역] / [1일째의 개방 영역]
표본을 10% 완충된 포르말린중에서 고정시키고, 파라핀 함침된 블록을 환부 표면과 수직으로 절개하고 (5mm), 라이세트-정 마이크로톰(Reichert-Jung microtome)을 사용하여 컷팅하였다. 일정한 헤마톡실린-에오신 (H & E) 염색을 이등분된 환부의 단면에서 수행하였다. 환부의 조직학적 연구를 이용하여 치료된 피부의 회복 과정 및 형태학적 외형이 본 발명의 알부민 융합 단백질의 처리에 의해 변형되었는지의 여부를 평가하였다. 이러한 평가는 세포 축적, 염증 세포, 모세관, 섬유아세포, 재상피화 및 표피 성숙의 확인을 포함한다 (Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)). 블라인드 관찰자는 눈금측정 렌즈 마이크로미터를 사용하였다.
조직 절편을 또한 ABC 엘리트 검출 시스템을 사용하여 폴리클로날 래빗 항-사람 케라틴 항체로 면역조직화학적으로 염색하였다. 사람 피부를 양성 조직 대조군으로서 사용하고, 비면역 IgG를 음성 대조군으로서 사용하였다. 눈금측정 렌즈 마이크로미터를 사용하여 환부의 재상피화 범위를 평가함으로써 케라티노사이트 성장을 측정하였다.
피부 표본중의 증식 세포 핵 항원/시클린 (PCNA)는 ABC 엘리트 검출 시스템으로 항-PCNA 항체 (1:50)를 사용하여 입증되었다. 사람 콜론 암은 양성 조직 대조군으로서 작용하며, 사람 뇌 조직은 음성 조직 대조군으로서 작용한다. 각각의 표면은 일차 항체가 탈락되고, 비면역 마우스 IgG로 대체된 절편을 포함한다. 이들 절편의 순위는 0 내지 8 등급의 증식 범위에 기초하며, 더 낮은 등급은 약간의 증식을 반영하며, 더 높은 등급은 강렬한 증식을 반영한다.
실험 데이타는 독립표본 t-테스트를 이용하여 분석하였다. <0.05의 p 값은 현저한 것으로 간주된다.
스테로이드 손상 래트 모델
생체내 및 시험관내 스테로이드에 의한 환부 치유 억제는 다양하게 증명되어 있다 (Wahl, Glucocorticoids and Wound healing. In: Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahlet a!., J. Immunol . 115: 476-481 (1975); Werb et al ., J. Exp . Med . 147:1684-1694 (1978)). 글루코코르티코이드는 혈관신생을 억제하고, 혈관투과 ((Ebert et al ., An . Intern . Med . 37:701-705 (1952)), 섬유아세포 증식 및 콜라겐 합성 (Beck et a!., Growth Factors. 5: 295-304 (1991); Haynes et al ., J. Clin . Invest . 61: 703-797 (1978))을 억제하고, 모노사이트 순환의 일시적 감소를 유도하여 (Haynes et al., J. Clin . Invest . 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", In : Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989)) 상처 치유를 지연시킨다. 손상된 상처 치료에 대한 스테로이드의 전신 투여는 래트에서 잘 정립된 현상이다 (Beck et al ., Growth Factors . 5: 295-304 (1991); Haynes et al ., J. Clin . Invest . 61: 703-797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", In : Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302 (1989); Pierce et al ., Proc . Nat !. Acad . Sci . USA 86: 2229-2233 (1989)).
본 발명의 알부민 융합 단백질이 치유 과정을 가속화시킬 수 있음을 입증하기 위해, 메틸프레드니솔론의 전신 투여에 의해 치유가 억제되는 래트에서 완전 두께의 절제 피부 환부에 대한 상기 융합 단백질의 다양한 국소 도포의 효과를 평가하였다.
250-300g의 성숙한 수컷 스프라그 도레이 래트 (Charles River Laboratories)를 본 실시예에 사용하였다. 8주령된 동물을 구입하여, 연구 시작시에는 9주령이었다. 래트의 치유 반응은 상처 입힌 시점에 메틸프레드니솔론 (17mg/kg/래트 근내)의 전신 투여에 의해 상실된다. 동물을 개별적으로 수용시키고, 임의로 음식과 물을 제공하였다. 모든 조작은 무균 기법을 이용하여 수행하였다. 본 연구는 휴먼 게놈 사이언스, 인크., 인스티튜셔널 애니몰 케어 앤드 유스 코미테 앤드 더 가이드라인 퍼 더 케어 앤드 유스 오브 래버로터리 애니멀의 룰 및 가이드라인에 따라 수행하였다.
상처 프로토콜은 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다. 상처를 입히는 날에, 동물을 케타민 (50mg/kg) 및 자일라진 (5mg/kg)을 근내 주입하여 마취하였다. 동물의 등 영역을 면도하고, 피부를 70% 에탄올 용액 및 요오드 용액으로 세척하였다. 상처를 내기 전에 수술 부위를 멸균 거즈로 건조시켰다. 그후, 키스 조직 펀치를 사용하여 8mm 전체 두께의 상처를 생성시켰다. 실험 동안 환부 왼쪽 부분을 개방하였다. 상처낸 후 메틸프레드니솔론 투여한 날부터 연속 7일 동안 국부적으로 치료 물질을 도포하였다. 치료 전에, 환부를 멸균 염수 및 거즈 스폰지로 조심스럽게 세척하였다.
환부를 시각적으로 검사하고, 상처낸 날 및 치료 마지막날에 일정한 간격을 두고 사진 촬영을 하였다. 환부 밀봉부를 1-5일 및 8일째에 매일 측정하여 평가하였다. 눈금측정 제임스 캘리퍼를 이용하여 환부를 수직 및 수평으로 측정하였다. 육아조직이 시각적으로 더이상 관찰되지 않고, 환부가 연속 상피에 의해 커버링되는 경우 상처가 아문 것으로 간주하였다.
본 발명의 알부민 융합 단백질을 비히클중으로 8일 동안 1일당 4mg 내지 500mg의 다양한 투여량으로 투여하였다. 비히클 대조군 그룹에는 50mL의 비히클 용액을 투여하였다.
8일째에 나트륨 펜토바르비탈 (300mg/kg)의 복강내 주입에 의해 동물을 안락시켰다. 그 후, 환부 및 주위 피부를 조직연구를 위해 채취하였다. 조직 표본을 추가 처리를 위해 생검 스폰지간의 조직 카세트의 10% 중성 완충된 포르말린에서 방치시켰다.
각각 10마리 동물 (5마리는 메틸프레드니솔론으로 처리하고, 5마리는 글루코코르티코이드로 처리하지 않음)의 3 군을 평가하였다: 1) 비처리된 군, 2) 비처리된 군, 및 3) 처리된 군.
환부 밀봉을 수직 및 수평 축으로 영역을 평가하고, 환부의 총 면적을 수득함으로써 분석하였다. 그 후, 초기 환부 영역 (0일째)과 처리후 (8일째)의 환부 영역의 차이를 구하여 수축을 평가하였다. 1일째의 환부 영역은 64mm2이며, 이는 피부 펀치의 크기와 상응한다. 하기 공식을 이용하여 계산하였다:
b. [8일째의 개방 영역] - [1일째의 개방 영역] / [1일째의 개방 영역]
표본을 10% 완충된 포르말린중에서 고정시키고, 파라핀 함침된 블록을 환부 표면과 수직으로 절개하고 (5mm), 올림푸스 마이크로톰(Olympus microtome)을 사용하여 컷팅하였다. 일정한 헤마톡실린-에오신 (H & E) 염색을 이등분된 환부의 단면에서 수행하였다. 환부의 조직학적 연구를 이용하여 치료된 피부의 회복 과정 및 형태학적 외형이 본 발명의 알부민 융합 단백질의 처리에 의해 개선되었는지의 여부를 평가하였다. 블라인드 관찰자는 눈금측정 렌즈 마이크로미터를 사용하여 상처 갭의 간격을 측정하였다.
실험 데이타는 독립표본 t-테스트를 이용하여 분석하였다. <0.05의 p 값은 현저한 것으로 간주된다.
실시예 22: 림프부종 동물 모델
본 실험의 목적은 래트 뒷다리에서 신생 림프관 형성 및 림프 순환 시스템의 재성립에서 본 발명의 알부민 융합 단백질의 치료학적 효과를 시험하는데 적합하고 일정한 림프부종 모델을 생성시키는 것이다. 효과는 감염된 다리의 종창 부피, 림프 혈관의 양의 정량, 총 혈장 단백질 및 조직병리학에 의해 측정된다. 급성 림프부종은 7-10일 동안 관찰된다. 아마도 더욱 중요하게는, 부종의 만성 진행이 3-4주 까지 이어진다.
수술 전에, 혈액 샘플을 단백질 농도 분석을 위해 채취하였다. 약 ~350g의 수컷 래트에 펜토바르비톨을 투여하였다. 후속하여, 오른쪽 다리를 무릎에서 엉덩이까지 면도하였다. 면도한 영역을 70% EtOH로 적신 거즈로 닦아내었다. 혈청 총 단백질 시험을 위해 혈액을 채취하였다. 2개의 측정 레벨을 마킹한 후 (뒤꿈치 위로 0.5cm, 등과 발의 중간 지점) 발에 염료를 주입하기 전에 둘레 및 부피 측정을 수행하였다. 양 오른쪽 및 왼쪽 발 등에 0.05ml의 1% 에반스 블루(Evan's Blue)를 투여하였다. 이어서, 발에 염료를 투여한 후 둘레 및 부피 측정을 수행하였다.
랜드마크로서 뒤꿈치 관절을 이용하여, 다리 중간의 서혜부를 원주 모양으로 절개하여 페모랄 도관(femoral vessel)이 위치할 수 있게 하였다. 포셉(forcep) 및 지혈겸자를 사용하여 피부 플랩을 절개하고 분리하였다. 페모랄 도관을 위치시킨 후, 림프관은 상기 도관을 따라 아래에서 흐르도록 위치한다. 그 후, 이 영역에서 주요 림프관을 전기적으로 응고시키거나 봉합 결찰시켰다.
현미경을 이용하여, 다리 뒷쪽의 근육 (반건양근 및 전근 근처)을 절개하였다. 그 후, 오금림프절을 위치시켰다. 2개의 근접한 그리고, 2개의 원위의 림프관 및 원위 혈액 공급을 위한 오금림프절을 봉합에 의해 결찰시켰다. 그 후, 오금림프절 및 임의의 수반되는 지방 조직을 연결 조직을 절단함으로써 제거하였다.
이러한 과정으로부터 완만한 출혈을 조정하기 위해 주의를 기울였다. 림프를 폐쇄한 후, 피부 플랩을 액체 피부 (Vetbond) (AJ Buck)를 이용하여 봉합하였다. 분리된 피부 가장자리는 다리 주위에 ~0.5cm의 갭을 유지한채 안쪽 근육 조직으로 봉합시켰다. 또한, 필요에 따라 피부는 안쪽 근육과 봉합시켜 고정될 수 있다.
감염을 피하기 위해, 동물을 개별적으로 (깔짚이 아니라) 메쉬가 구비된 우리에 수용시켰다. 동물을 회수하여 최적의 부종 피크를 매일 체크하고, 이는 전형적으로 5-7일에 발생한다. 그 후, 플래토 부종 피크를 관찰하였다. 림프부종의 강도를 측정하기 위해, 작업 전에 매일 7일 동안 각각의 발에 2개의 지정된 위치에서 둘레 및 부피를 측정하였다. 림프부종에서의 혈장 단백질의 효과를 측정하고, 단백질 분석이 유용한 둘레측정 테스트인지의 여부를 연구하였다. 양 대조군 및 부종성 다리의 무게를 2 지점에서 평가하였다. 블라인드 방식으로 분석을 수행하였다.
둘레 측정: 다리 움직임을 방지하기 위해 간단한 가스 마취하에, 클로스 테이프로 다리 둘레를 측정하였다. 2명이 발목 뼈 및 발등에서 측정하고, 이 측정값을 평균내었다. 상기 측정값은 대조군 및 부종 다리 둘 모두로부터의 값이다.
부피 측정: 수술 당일에 동물을 펜토바르비탈로 마취시키고, 수술전에 시험하였다. 매일의 부피 측정을 위해, 동물을 간단하게 할로탄 마취시키고 (신속하게 고정화되고, 빠르게 회복됨), 양 다리를 면도하고, 다리에 방수 마커를 사용하여 똑같이 마킹하였다. 다리를 먼저 물에 담그고, 각각의 마킹된 수준까지 기구에 담그고, 벅스코 부종 소프트웨어 (Buxco edema software) (Chem/Victor)를 사용하여 측정하였다. 한 사람이 데이터를 기록하고, 다른 사람은 다리를 마킹된 영역까지 담그게 하였다.
혈액-혈장 단백질 측정: 혈액을 채취하고, 회전시키고, 혈청을 수술전에 분리한 후, 최종적으로 총 단백질 및 Ca2+ 비교를 수행하였다.
다리 무게 비교: 혈액을 채취한 후, 조직 수집을 위해 동물을 준비시켰다. 퀼리틴(quillitine)을 사용하여 다리를 절단한 후, 실험 다리 및 대조군 다리를 결찰부에서 절단하고 무게를 측정하였다. 경종 관절을 탈구시키고, 다리의 무게를 측정함으로써 이차 무게 측정을 수행하였다.
조직학적 준비: 무릎 (오금) 영역 아래에 위치한 횡근을 절개하고, 금속 몰드에 위치시키고, 프리즈겔(freezeGel)로 충전시키고, 냉 메틸부탄에 함침시키고, 분할될 때까지 -80EC에서 라벨링된 샘플 백에 위치시켰다. 분할되면, 림프관에 대한 형광 현미경으로 근육을 관찰하였다.
* 실시예 23: 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의한 TNF 알파-유도된 부착 분 자 발현의 억제
염증 및 혈관 신생 영역으로의 림프구의 집중은 림프구상의 세포 표면 부착 분자 (CAM)와 혈관 내피세포간의 특이적 수용체-리간드 상호작용을 포함한다. 정상 및 병리학적 세팅에서 부착 과정은 내피 세포 (EC)상의 세포간 부착 분자-1(ICAM-1) 및 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 및 내피 백혈구 부착 분자-1(E-셀렉틴) 발현을 포함하는 다중-단계가 따른다. 혈관 내피세포상의 이들 분자 및 기타 분자의 발현이, 백혈구가 국소적 맥관에 부착하여, 염증 반응의 전개 동안 국부 조직으로의 내출혈시키는 능력을 결정한다. 사이토카인 및 성장 인자의 국소적 집중화는 이들 CAM의 발현 조정에 관여한다.
종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 즉, 단백질 전염증성 사이토카인은 내피 세포상의 세개 모든 CAM의 자극제이며, 다양한 염증 반응에 관여하여 병리학적 결과를 초래한다.
TNF-α 유도된 CAM 발현을 매개하는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 잠재력이 시험될 수 있다. 고형상 흡수제로서 EC를 사용하는 변형된 ELISA 검정은 FGF 패밀리 단백질의 구성원으로 보조자극되는 경우 TNF-α 처리된 EC상에서 CAM 발현의 양을 측정하는데 사용된다.
실험을 수행하기 위해, 사람 혈관내피세포 (HUVEC) 배양물을 풀링된 코드 채취물로부터 수득하고, 5% CO2를 함유하는 37℃의 습식 인큐베이터에서 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 성장 배지 (EGM-2; Clonetics, San Diego, CA)에서 유지시켰다. HUVEC를 18-24시간 동안 또는 컨플루언시할때까지 37℃에서 EGM 배지중에서 1 x 104 세포/웰 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 그 후, 모노층을 100U/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 혈청 비함유 RPMI-1640 용액으로 3회 세척하고, 제공된 사이토카인 및/또는 성장 인자(들)로 24시간 동안 37℃에서 처리하였다. 인큐베이션 후, 세포를 CAM 발현을 위해 평가하였다.
사람 혈관내피세포 (HUVEC)를 표준 96 웰 플레이트에서 컨플루언시하게 성장시켰다. 성장 배지를 세포로부터 제거하고, 90㎕의 199 배지 (10% FBS)로 대체하였다. 시험 샘플 및 양성 또는 음성 대조군을 삼중 (10㎕ 부피)으로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 각각 5시간 (셀렉틴 및 인테그린 발현) 또는 24시간 (인테그린만 발현) 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 흡출시켜 배지를 제거하고, 100㎕의 0.1% 파라포름알데히드-PBS (Ca++ 및 Mg++ 함유)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 30분 동안 고정시켰다.
그 후, 웰로부터 고정물을 제거하고, 웰을 PBS(+Ca,Mg)+0.5% BSA로 1회 세척하고 배수시켰다. 웰이 건조되지 않게 하였다. 10㎕의 희석된 일차 항체를 시험 웰 및 대조군 웰에 첨가하였다. 안티-ICAM-1-바이오틴, 안티-VCAM-1-바이오틴 및 안티-E-셀렉틴-바이오틴을 10㎍/ml (0.1mg/ml 원핵 항체의 1:10 희석) 농도로 사용하였다. 세포를 습식 환경하에 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 웰을 PBS(+Ca,Mg)+0.5% BSA로 3회 세척하였다.
그 후, 20㎕의 희석된 엑스트라아비딘-알칼리성 포스포타아제 (ExtrAvidin-Alkaline Phosphotase) (1:5,000 희석)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS(+Ca,Mg)+0.5% BSA로 3회 세척하였다. p-니트로페놀 포스페이트 pNPP 1 타블렛을 5ml의 글리신 완충액 (pH 10.4)에 용해시켰다. 글리신 완충액중의 100㎕의 pNPP 기질을 각각의 시험 웰에 첨가하였다. 글리신 완충액중의 엑스트라아비딘-알칼리성 포스포타아제의 작업 희석물로부터 표준 웰이 삼중으로 제조하였다: 1:5,000 (100)>10-0.5>10-1>10-1.5. 5㎕의 각각의 희석액을 삼중 웰에 첨가하였으며, 각각의 웰중의 생성된 AP 함량은 5.50ng, 1.74ng, 0.55ng, 0.18ng이다. 그 후, 100㎕의 pNNP 시제를 각각의 표준 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 50㎕ 부피의 3M NaOH를 웰에 첨가하였다. 생성물을 405nm에서 플레이트 리더상에서 정량화하였다. 백그라운드 서브트랙션 옵션이 글리신 완충액으로만 충전된 블랭크에 사용된다. 템플레이트를 각각의 표준 웰에서 AP-컨쥬게이트의 농도를 나타내도록 셋팅하였다 [5.50ng; 1.74ng; 0.55ng; 0.18ng]. 생성물은 각각의 샘플에서 결합된 AP-컨쥬게이트의 양으로서 나타내었다.
실시예 24: GAS 리포터 작제물의 작제
세포의 분화 및 증식에 관련된 한 시그널 변환 경로는 잭스-STAT 경로 (Jaks-STATs pathway)로 불린다. 잭스-STAT 경로에서 활성화된 단백질은 많은 유전자의 프로모터에 위치하는 감마 활성화 부위 "GAS" 엘리먼트 또는 인터페론-민감 반응성 엘리먼트 ("ISRE")에 결합한다. 단백질의 이러한 엘리먼트로의 결합은 관련 유전자의 발현을 변형시킨다.
GAS 및 ISRE 엘리먼트는 시그널 트랜스듀서(Signal Transducer) 및 전사 활성화제(Activators of Transcription) 또는 "STAT"로 불리는 전사 인자 부류에 의해 인지된다. STAT 패밀리에서 6개의 구성원이 있다. Stat1 및 Stat3는 많은 세포 유형에 존재하며, Stat2 또한 그렇다 (IFN-알파에 대한 반응이 널리 확산되기 때문에). Stat4는 더욱 제한적이며, 많은 세포 유형에 존재하는 것은 아니나, IL-12로의 처리 후 T 헬퍼 클래스 I 세포에서 발견되었다. Stat5는 원래 유방 성장 인자로서 불리나, 골수계 세포를 포함한 다른 세포에서 더욱 높은 농도로 발견되었다. 이는 많은 사이토킨에 의해 조직 배양 세포에서 활성화될 수 있다.
STAT는 야뉴스 키나아제 ("Jaks") 패밀리로 공지된 키나아제 세트에 의한 티로신 포스포릴화시 활성화되어 세포질로부터 핵으로 전위된다. 잭스는 가용성 티로신 키나아제의 별개의 패밀리를 나타내며, Tyk2, Jak1, Jak2 및 Jak3를 포함한다. 이들 키나아제는 현저한 서열 유사성을 나타내며, 일반적으로 생성된 세포에서 촉매적으로 불활성이다.
잭스는 하기 표에 요약된 다양한 수용체에 의해 활성화된다 (Adapted from review by Schidler and Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:621-51 (1995)). 잭스를 활성화시킬 수 있는 사이토카인 수용체 패밀리는 두 그룹으로 나누어진다: (a) 클래스 1은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-l5, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF, CNTF 및 트롬보포이에틴에 대한 수용체를 포함하며; (b) 클래스 2는 IFN-α, IFN-g, 및 IL-10를 포함한다. 클래스 I 수용체는 보존되는 시스테인 모티프 (4개의 보존된 시스테인 및 하나의 트립토판으로 이루어진 세트) 및 WSXWS 모티프 (Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (SEQ ID NO:53)을 엔코딩하는 막 인접 영역)을 포함한다.
이와 같이, 수용체로의 리간드의 결합시 잭스는 활성화되며, 이어서 STAT를 활성화시키고, 이어서 전위되어 GAS 엘리먼트에 결합한다. 이러한 전체 과정은 잭스-STAT 시그널 변환 경로에 포함된다. 따라서, GAS 또는 ISRE 엘리먼트의 결합에 의해 반영된 잭스-STAT 경로의 활성화는 세포의 증식 및 분화에 관련된 단백질을 나타내는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 성장 인자 및 사이토카인은 잭스-STAT 경로를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다 (하기 표 5 참조). 이와 같이, 리포터 분자로 결합된 GAS 엘리먼트를 사용함으로써, 잭스-STAT 경로의 활성화제가 확인될 수 있다.
JAKs STATS GAS(엘리먼트) 또는 ISRE
리간드 tyk2 Jakl Jak2 Jak3
IFN 패밀리
IFN-α/B + + - - 1,2,3 ISRE
IFN-g + + - 1 GAS(IRF1>Lys6>IFP)
Il-10 + ? ? - 1,3
gp130 패밀리
IL-6(다면발현) + + + ? 1,3 GAS(IRF1>Lys6>IFP)
Il-11(다면발현) ? + ? ? 1,3
OnM(다면발현) ? + + ? 1,3
LIF(다면발현) ? + + ? 1,3
CNTF(다면발현) -/+ + + ? 1,3
G-CSF(다면발현) ? + ? ? 1,3
IL-12(다면발현) + - + + 1,3
g-C 패밀리
IL-2(림프구) - + - + 1,3,5 GAS
IL-4(림프/골수) - + - + 6 GAS(IRF1=IFP>>Ly6)(IgH)
IL-7(림프구) - + - + 5 GAS
IL-9(림프구) - + - + 5 GAS
IL-13(림프구) - + ? ? 6 GAS
IL-15 ? + ? + 5 GAS
gp140 패밀리
IL-3 (골수) - - + - 5 GAS(IRF1>IFP>>Ly6)
IL-5 (골수) - - + - 5 GAS
GM-CSF (골수) - - + - 5 GAS
성장 호르몬 패밀리
GH ? - + - 5
PRL ? +/- + - 1,3,5
EPO ? - + - 5 GAS(B-CAS>IRF1=IFP>>Ly6)
수용체 티로신 키나아제
EGF ? + + - 1,3 GAS(IRF1)
PDGF ? + + - 1,3
CSF-1 ? + + - 1,3 GAS(비 IRF1)
실시예 27-29에 기술된 생물학적 검정에 사용되는 프로모터 엘리먼트를 함유하는 합성 GAS를 작제하기 위해서, PCR 기본 방법을 이용하여 GAS-SV40 프로모터 서열을 생성시켰다. 5' 프라이머는 IRF1 프로모터에서 발견되는 GAS 결합 부위의 4개의 직렬의 복사체를 함유하며, 기타 GAS 또는 ISRE 엘리먼트가 대시 사용될 수 있지만 사이토카인 범위내에서 유입시 STAT에 결합하는 것으로 이전에 입증되었다 (Rothman et al., Immunity 1:457-468 (1994)). 5' 프라이머는 또한 SV40 초기 프로모터 서열에 상보적인 18bp 서열을 함유하며, XhoI 부위로 플랭킹된다. 5' 프라이머의 서열은 다음과 같다:
Figure 112012047901064-pat00029
다운스트림 프라이머는 SV40 프로모터에 상보적이며, Hind III 부위로 플랭킹된다:
Figure 112012047901064-pat00030
PCR 증폭은 클론테크(Clontech)로부터 수득된 B-gal:프로모터 플라스미드중에 존재하는 SV40 프로모터 주쇄를 사용하여 수행하였다. 생성된 PCR 단편은 XhoI/Hind III로 절단하고, BLSK2-로 서브클로닝하였다 (Stratagene). 전방향 및 역방향 프라이머로의 시퀀싱으로 삽입부가 다음 서열을 함유한다는 것을 확인하였다:
Figure 112012047901064-pat00031
이러한 GAS 프로모터 엘리먼트를 SV40 프로모터에 연결시키고, 다음에 GAS:SEAP2 리포터 작제물을 조작하였다. 여기서, 리포터 분자는 분비된 알칼리성 포스파타아제 또는 "SEAP"이다. 그러나, 분명하게는 모든 리포터 분자가 본 실시예 또는 기타 다른 실시예에서 SEAP 대신에 사용될 수 있다. SEAP 대신에 사용될 수 있는 널리 공지된 리포터 유전자로는 클로르암페닐콜 아세틸트랜스퍼라아제 (CAT), 루시퍼라아제, 알칼리성 포스파타아제, B-갈락토시다아제, 그린 형광 단백질 (GFP), 또는 항체에 의해 검출가능한 단백질을 포함한다.
상기 서열 확인된 합성 GAS-SV40 프로모터 엘리먼트를, SV40 프로모터를 증폭된 GAS-SV40 프로모터 엘리먼트로 효과적으로 대체시키면서 HindIII 및 XhoI를 사용하여 클론테크로부터 수득한 pSEAP-프로모터 벡터로 서브클로닝하여 GAS-SEAP 벡터를 생성시켰다. 그러나, 이러한 벡터는 네오마이신 내성 유전자를 함유하지 않으며, 따라서 포유동물 발현 시스템에 바람직하지 않다.
따라서, GAS-SEAP 리포터를 발현하는 포유동물의 안정한 세포주를 생성시키기 위해, GAS-SEAP 카세트를 SalI 및 NotI을 사용하여 GAS-SEAP 벡터로부터 회수하여, 네오마이신 내성 유전자 예컨대, pGFP-1(클론테크)를 함유하는 주쇄 벡터로 다중 클로닝 부위에서의 이들의 제한 부위를 이용하여 삽입하여, GAS-SEAP/Neo 벡터를 생성시켰다. 이들 벡터가 포유동물 세포로 트랜스펙션되면, 이들 벡터는 실시예 27-29에 기술된 바와 같이 GAS 결합을 위한 리포터 분자로서 사용될 수 있다.
기타 작제물을 상기 설명을 이용하여 GAS를 다른 프로모터 서열로 대체하여 제조할 수 있다. 예를 들어, EGR 및 NF-KB 프로모터 서열을 함유하는 리포터 분자의 작제물은 실시예 27-31에 기술되어 있다. 그러나, 많은 다른 프로모터는 이들 실시예에 기술된 프로토콜을 사용하여 치환될 수 있다. 예를 들어, SRE, IL-2, NFAT 또는 오스테오칼신(Osteocalcin) 프로모터는 단독으로 또는 혼합되어 (예를 들어, GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, Il-2/NFAT 또는 NF-KB/GAS) 치환될 수 있다. 유사하게는, 기타 세포주 예컨대, HELA (상피세포), HUVEC(내피세포), Reh(B-세포), Saso-2(골아세포), HUVAC(대동맥) 또는 심근세포가 리포터 작제물 활성을 시험하는데 사용될 수 있다.
실시예 25: SEAP 활성에 대한 검정
본원에 기재된 실시예에 기술된 검정을 위한 리포터 분자로서, SEAP 활성을 하기 일반적인 공정에 따라 트로픽스 포스포-라이트 키트(Tropix Phospho-light Kit) (Cat. BP-400)을 사용하여 검정하였다. 트로픽스 포스포-라이트 키트는 하기 사용된 희석, 검정 및 반응 완충액을 제공한다.
디스펜서에 2.5 x 희석 완충액을 준비하고, 15㎕의 2.5x 희석 완충액을 본 발명의 알부민 융합 단백질을 함유하는 35㎕ 용액을 함유하는 옵티플레이트(Optiplate)에 분배하였다. 플레이트를 플라스틱 밀봉제로 밀봉하고, 30분 동안 65℃에서 인큐베이션하였다. 옵티플레이트를 떼어놓아 균일하게 가열되게 하였다.
샘플을 15분 동안 냉각시켰다. 디스펜서를 비우고, 검정 완충액을 준비하였다. 50ml의 검정 완충액을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 디스펜서를 비우고, 반응 완충액 (하기 표 참조)을 준비시켰다. 50㎕의 반응 완충액을 첨가하고, 실온에서 20분동안 인큐베이션시켰다. 화학발광 시그널의 강도는 시간 의존적이기 때문에, 약 10분 동안 발광분석기상에서 5개의 플레이트를 해독하였으며, 따라서 5개의 플레이트를 각각의 시점에서 처리하여야 하며, 두번째는 10분 후에 개시하였다.
발광분석기에서 상대적 광을 해독하였다. H12를 블랭크로 하고, 결과를 프린팅하였다. 화학발광의 증가는 리포터 활성을 나타낸다.
플레이트 # Rxn 완충 희석액 ( ml ) CSPD ( ml ) 플레이트 # Rxn 완충 희석액( ml ) CSPD ( ml )
10 60 3 31 165 8.25
11 65 3.25 32 170 8.5
12 70 3.5 33 175 8.75
13 75 3.75 34 180 9
14 80 4 35 185 9.25
15 85 4.25 36 190 9.5
16 90 4.5 37 195 9.75
17 95 4.75 38 200 10
18 100 5 39 205 10.25
19 105 5.25 40 210 10.5
20 110 5.5 41 215 10.75
21 115 5.75 42 220 11
22 120 6 43 225 11.25
23 125 6.25 44 230 11.5
24 130 6.5 45 235 11.75
25 135 6.75 46 240 12
26 140 7 47 245 12.25
27 145 7.25 48 250 12.5
28 150 7.5 49 255 12.75
29 155 7.75 50 260 13
30 160 8
실시예 26: 뉴런 활성을 확인하기 위한 검정
세포가 분화 및 증식될 때, 유전자 군은 많은 다양한 시그널 변환 경로를 통해 활성화된다. 이들 유전자중 하나인 EGR1 (초기 성장 반응 유전자 1)은 활성화시 다양한 조직 및 세포 유형에서 유도된다. EGR1의 프로모터는 이러한 유도에 대해 반응가능하다. 리포터 분자에 연결된 EGR1 프로모터를 사용하여, 세포를 활성화시키는 본 발명의 융합 단백질의 능력을 평가할 수 있다.
특히, 하기 프로토콜은 PC12 세포주에서 신경 활성을 평가하는데 사용된다. PC12 세포 (래트 페노크로모사이토마 세포)는 많은 미토젠 예컨대, TPA (테트라데카노일 포르볼 아세테이트), NGF(신경 성장 인자) 및 EGF(표지 성장 인자)로의 활성화에 의해 증식되고/거나 분화하는 것으로 공지되어 있다. EGR1 유전자 발현은 이러한 처리 동안 활성화된다. 따라서, PC12 세포를 SEAP 리포터에 연결된 EGR 프로모터를 함유하는 작제물로 안정하게 트랜스펙션시키므로써, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의한 PC12 세포의 활성화를 평가할 수 있다.
EGR/SEAP 리포터 작제물은 하기 프로토콜에 의해 어셈블링될 수 있다. EGR-1 프로모터 서열 (-633에서 +1) (Sakamoto K et al., Oncogene 6:867-871 (1991))은 하기 프라이머를 사용하여 사람 유전자 DNA로부터 PCR 증폭될 수 있다:
제 1 프라이머:
Figure 112012047901064-pat00032
제 2 프라이머:
Figure 112012047901064-pat00033
실시예 24에서 생성된 GAS:SEAP/Neo 벡터를 사용하여, EGR1 증폭된 생성물을 이들 벡터에 삽입할 수 있다. 제한 효소 XhoI/HindIII를 사용하여 GAS:SEAP/Neo 벡터를 일렬화시키고, GAS/SV40 물질을 제거하였다. EGR1 증폭된 생성물을 이들 동일한 효소로 제한시켰다. 벡터와 EGR1 프로모터를 결찰시켰다.
세포 배양용 96-웰 플레이트를 준비하기 위해, 2ml의 코팅 용액 (30% 에탄올 (필터 멸균됨)중의 1:30 콜라겐 유형 I의 희석물 (Upstate Biotech Inc. Cat#08-115))을 하나의 10cm 플레이트에 첨가하거나, 96-웰 플레이트의 웰 당 50ml 첨가하고, 2시간 동안 공기 건조시켰다.
PC12 세포를 사전코팅된 10cm 조직 배양 접시에서 100유닛/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 10% 말 혈청 (JRH BIOSCIENCES, Cat. #12449-78P), 5% 열-불활성화된 소태 혈청 (FBS)를 함유하는 RPMI-1640 (Bio Whittaker)에서 일정하게 성장시켰다. 1 내지 4회의 스플릿으로 매 3일 내지 4일에 수행하였다. 플레이트로부터 15회 초과로 피펫팅 업-다운하여 스크랩핑하고 재현탁시키므로써 세포를 제거하였다.
EGR/SEAP/Neo 작제물을 당해분야에 공지된 기법을 이용하여 PC12에 트랜스펙션시켰다. EGR-SEAP/PC12 안정한 세포를 300㎍/ml G418에서 세포를 성장시켜 수득하였다. G418-비함유 배지를 매 한달 내지 두달에 걸친 일정한 성장 동안 사용하고, 세포를 2회 계대배양 동안 300㎍/ml G418로 재성장시켰다.
신경 활성을 검정하기 위해, 약 70 내지 80% 컨플루언트하게 된 세포를 갖는 10cm 플레이트를 오래된 배지를 제거함으로써 스크리닝하였다. 세포를 PBS (포스페이트 완충된 염수)로 1회 세척하였다. 그 후, 세포를 저혈청 배지 (1% 말 혈청 및 0.5% FBS와 항생제를 함유하는 RPMI-1640)중에서 밤새 절식시켰다.
다음날 아침, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 플레이트로부터 세포를 스크랩핑하고, 2ml의 저혈청 배지중의 세포 웰에 현탁시켰다. 세포 수를 계수하고, 더 많은 혈청 배지를 첨가하여 최종 세포 밀도가 5x105 세포/ml가 되게 하였다.
200㎕의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다 (1x105 세포/웰 당량). 일련의 상이한 농도의 본 발명의 알부민 융합 단백질을 37℃에서 48 내지 72시간 동안 첨가하였다. 양성 대조군으로서, EGR을 통해 PC12 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 성장 인자 예컨대, 50ng/㎕의 신경 성장 인자 (NGF)가 사용될 수 있다. 양성 대조군 웰에서는 SEAP의 50배가 넘는 유입이 전형적으로 관찰되었다. SEAP 검정은 당해분야에 공지된 기법 및/또는 실시예 25에 기술된 비와 같이 일정하게 수행될 수 있다.
실시예 27: T-세포 활성에 대한 검정
인자를 확인하고, 본 발명의 알부민 융합 단백질이 T-세포를 증식 및/또는 분화시키는지의 여부를 측정하는 하기 프로토콜을 사용하여 T-세포 활성을 평가하였다. 실시예 24에서 생성된 GAS/SEAP/Neo 작제물을 이용하여 T-세포 활성을 평가하였다. 이와 같이, SEAP 활성을 증가시키는 인자는 잭스-STATS 시그널 변환 경로를 활성화시키는 능력을 나타낸다. 본 검정에 사용된 T-세포는 주르캣(Jurkat) T-세포 (ATCC 수탁 번호. TIB-152)이며, Molt-3 세포 (ATCC 수탁 번호. CRL-1552) 및 Molt-4 세포 (ATCC 수탁 번호. CRL-1582)가 또한 사용될 수 있다.
주르캣 T-세포는 림프아구 CD4+ Th1 헬퍼 세포이다. 안정한 세포주를 생성시키기 위해, 약 2 백만 주르캣 세포를 DMRIE-C (라이프 테크놀로지)를 이용하여 GAS-SEAP/neo 벡터로 트랜스펙션시켰다(하기 기술된 트랜스펙션 공정). 트렌스펙션된 세포를 웰 당 약 20,000의 밀도로 시딩하고, 1mg/ml 젠티신에 내성인 트렌스펙턴트를 선택하였다. 내성 콜로니를 확장시키고, 인터페론 감마의 농도 증가에 대한 이들의 반응성을 시험하였다. 선택된 클론의 용량 반응을 입증하였다.
특히, 하기 프로토콜은 200㎕의 세포를 함유하는 75웰에 대해 충분한 세포를 생성시킬 것이다. 이와 같이, 다중 96 웰 플레이트에 대해 충분한 세포를 생성시키기 위해 스케일을 크게 하거나 여러번 수행한다. 주르캣 세포는 10% 혈청과 1% Pen-Strep를 갖는 RPMI에서 유지된다. 2.5mL의 OPTI-MEM (라이프 테크놀로지)와 10㎍의 플라스미드 DNA를 T25 플라스크에서 혼합하였다. 50㎕의 DMRIE-C를 함유하는 2.5ml의 OPTI-MEM을 첨가하고 15-45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 기간 동안, 세포 농도를 측정하고, 원하는 수의 세포 (트랜스펙션당 107)를 회전 침전시키고, 이를 107 세포/ml의 최종 농도로 OPTI-MEM에 재현탁시켰다. 그 후, OPTI-MEM중에 1ml의 1 x 107 세포를 T25 플라스크에 첨가하고, 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 10ml의 RPMI + 15% 혈청을 첨가하였다.
주르캣:GAS-SEAP 안정적인 리포터 라인을 RPMI + 10% 혈청, 1mg/ml 젠티신 및 1% Pen-Strep중에 유지시켰다. 이들 세포를 다양한 농도의 본 발명의 하나 이상의 융합 단백질로 처리하였다.
융합 단백질로의 처리일에, 세포를 세척하고, ml 당 500,000 세포의 밀도로 신선한 RPMI+10% 혈청에 재현탁시켰다. 요구되는 정확한 수의 세포는 융합 단백질의 수에 의존적이며, 상이한 농도의 융합 단백질의 수를 스크리닝하였다. 하나의 96 웰 플레이트에 있어서, 약 1억개의 세포 (10 플레이트에 있어서, 10억개 세포)가 요망된다.
*융합 단백질로 처리된 주르캣 세포를 함유하는 웰 디쉬를 48시간 동안 인큐베이터에 위치시켰다 (주목: 이 시간은 48-72시간으로 변동가능하다). 각 웰로부터 35㎕ 샘플을 12 채널 피펫을 사용하여 불투명 96 웰 플레이트로 이동시켰다. 불투명 플레이트를 커버링하고 (셀로펜 커버를 사용), 실시예 25에 따라 SEAP 검정을 수행할 때 까지 -20℃에서 저장하였다. 나머지 처리된 세포를 함유하는 플레이트를 4℃에 위치시키고, 필요에 따라 특정 웰에서 검정을 반복하기 위한 재료의 공급원으로서 사용하게 하였다.
*양성 대조군으로서, 주르캣 T 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 100유닛/ml 인터페론 감마를 사용할 수 있다. 30배에 걸친 유입이 양성 대조군 웰에서 전형적으로 관찰된다.
상기 프로토콜은 일시적으로 트렌스펙션된 세포 또는 안정하게 트렌스펙션된 세포의 생성에 사용될 수 있으며, 이는 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 28: T-세포 활성에 대한 검정
NF-KB (핵 인자 KB)는 염증 사이토카인 IL-1 및 TNF, CD30 및 CD40, 림포톡신-알파 및 림포톡신-베타를 포함하는 다양한 제제에 의해, LPS 또는 트롬빈에 노출시킴으로써, 및 특정한 바이러스 유전자 생성물의 발현에 의해 활성화되는 전사 인자이다. 전사 인자로서, NF-KB는 포유동물 세포 활성화, 아폽토시스의 조절 (NF-KB는 아폽토시스로부터 세포를 방어하는 것으로 여겨짐), B 및 T-세포 발달, 항-바이러스 및 항-미생물 반응, 및 다중 스트레스 반응과 관련된 유전자의 발현을 조절한다.
비자극 조건하에서, NF-KB는 I-KB (억제제 KB)를 갖는 세포질에서 보유된다. 그러나, 자극시, I-KB는 포스포릴화되고, 분해되어 NF-KB가 핵으로 왕복 이동하게 하여, 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. NF-KB에 의해 활성화된 표적 유전자는 IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 및 클래스 1 MHC를 포함한다.
이의 중심적 역할 및 자극의 범위에 대한 반응 능력으로 인해, NF-KB 프로모터 엘리먼트를 사용한 리포터 작제물은 융합 단백질을 스크리닝하는데 사용된다. NF-KB의 활성화제 또는 억제제는 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용할 것이다. 예를 들어, NF-KB의 억제제는 NF-KB의 급성 또는 만성 활성화와 관련된 질환 예컨대, 류마티스 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다.
NF-KB 프로모터 엘리먼트를 함유하는 벡터를 작제하기 위해, PCR 기본 방법을 사용하였다. 업스트림 프라이머는 NF-KB 결합 부위 (GGGGACTTTCCC) (SEQ ID NO:59)의 4개의 일렬의 복사체 즉, SV40 초기 프로모터 서열의 5' 말단부에 상보적인 18bp 서열을 함유하며, 이는 XhoI 부위로 플랭클링된다:
Figure 112012047901064-pat00034
다운스트림 프라이머는 SV40 프로모터의 3' 말단부에 상보적이며, Hind III 부위로 플랭클링된다:
Figure 112012047901064-pat00035
PCR 증폭은 클론테크로부터 수득한 pB-gal:프로모터 플라스미드에 존재하는 SV40 프로모터 주쇄를 사용하여 수행하였다. 생성된 PCR 단편을 XhoI 및 Hind III로 분해하여 BLSK2-로 서브클로닝하였다 (스트라타진:Stratagene). T7 및 T3 프라이머로 시퀀싱하여 삽입물이 하기 서열을 함유하는지를 확인하였다:
Figure 112012047901064-pat00036
다음으로, pSEAP2-프로모터 플라스미드 (클로테크)에 존재하는 SV40 최소 프로모터 엘리먼트를 XhoI 및 HindIII를 사용하여 상기 NF-KB/SV40 단편으로 대체시켰다. 그러나, 이러한 벡터를 네오마이신 내성 유전자를 함유하지 않으며, 따라서 포유동물 발현 시스템에는 바람직하지 않다.
안정한 포유동물 세포주를 생성시키기 위해, NF-KB/SV40/SEAP 카세트를 제한 효소 SalI 및 NotI를 사용하여 상기 NF-KB/SEAP 벡터로부터 회수하고, 네오마이신 내성을 갖는 벡터에 삽입하였다. 특히, NF-KB/SV40/SEAP 카세트를, pGFP-1을 SalI 및 NotI로 제한한 후 GFP 유전자를 대체하여 pGFP-1 (클론테크)로 삽입하였다.
하나의 NF-KB/SV40/SEAP/Neo 벡터를 생성시키고, 안정한 주르캐트 T-세포를 생성시키고, 실시예 25에 기술된 프로토콜에 따라 유지시켰다. 유사하게는, 이러한 안정한 주르캐트 T-세포를 갖는 융합 단백질을 검정하기 위한 방법이 또한 실시예 25에 기술되어 있다. 양성 대조군으로서, 외생성 TNF 알파 (0.1, 1, 10ng)을 웰 H9, H10, 및 H11에 첨가하면, 5 내지 10배의 활성화가 전형적으로 관찰된다.
실시예 29: 골수 활성을 확인하기 위한 검정
융합 단백질이 골수 세포를 증식하고/거나 분화시키는 지의 여부를 측정함으로써, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 골수 활성을 평가하기 위해 하기 프로토콜을 사용하였다. 골수 세포 활성은 실시예 24에서 생성된 GAS/SEAP/Neo 작제물을 사용하여 평가하였다. 이와 같이, SEAP 활성을 증가시키는 인자는 잭스-STATS 시그널 변환 경로를 활성화시키는 능력을 나타낸다. 본 검정에 사용된 골수 세포는 U937 즉, 프리-모노사이트 세포주를 사용하였으며, TF-1, HL60 또는 KG1이 사용될 수 있다.
U937 세포를 실시예 24에서 생성된 GAS/SEAP/Neo 작제물로 일시적으로 트랜스펙션시키기 위해, DEAE-Dextran 방법 (Kharbanda et al., 1994, Cell Growth & Differentiation, 5:259-265)를 사용하였다. 먼저, 2x107 U937 세포를 채취하고, PBS로 세척하였다. U937 세포를 100유닛/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신으로 보충한 10% 열-불활성화된 소태 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 일반적으로 성장시켰다.
다음으로, 0.5mg/ml DEAE-덱스트란, 8㎍의 GAS-SEAP2 플라스미드 DNA, 140mM NaCl, 5mM KCl, 375 uM Na2HPO4·7H2O, 1mM MgCl2 및 675uM CaCl2를 함유하는 1ml의 20mM 트리스-HCl (pH7.4) 완충액에 현탁시켰다. 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다.
10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지로 세포를 세척하고, 10ml 완전배지에 재현탁시키고, 37℃에서 36시간 동안 인큐베이션하였다.
상기 세포를 400ug/ml G418중에서 성장시킴으로써 GAS-SEAP/U937 안정한 세포를 수득하였다. 일정한 성장 동안 그러나, 매 한달 내지 두달 동안에 G418-비함유 배지를 사용하였으며, 세포를 2회 계대배양을 위해 400ug/ml G418중에 재성장시켰다.
이들 세포를 1x108 세포(이는 10개의 96-웰 플레이트 검정에 충분함)를 채취함으로써 시험하고, PBS로 세척하였다. 세포를 상기 기술된 성장 배지 200ml중에 최종 밀도 5x105 세포/ml로 현탁시켰다. 96-웰 플레이트중에 웰당 200ul 세포를 플레이팅시켰다 (또는 1x105 세포/웰).
상이한 농도의 융합 단백질을 첨가하였다. 37℃에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군으로서, U937 세포를 활성화시키는 것으로 공지된 100유닛/ml 인터페론 감마를 사용할 수 있다. 30배에 걸친 유입이 양성 대조군 웰에서 전형적으로 관찰된다. SEAP 검정은 실시예 25에 기술된 프로토콜 및/또는 당해분야에 공지된 방법에 따라 상청액을 검정한다.
실시예 30: 소분자 농도 및 막 투과성 변화를 확인하기 위한 검정
수용체로의 리간드 결합은 소분자 예컨대, 칼슘, 칼륨, 나트륨 및 pH의 세포내 수준을 변화시키고, 막 전위를 변화시키는 것으로 공지되어 있다. 이러한 변화는 특정 세포의 수용체에 결합하는 융합 단백질을 확인하는 검정으로 측정될 수 있다. 하기 프로토콜은 칼슘에 대한 검정을 기술하고 있지만, 본 프로토콜은 칼륨, 나트륨, pH, 막 전위, 또는 형광 프로브에 의해 검출가능한 기타 소분자에서의 변화를 검출하도록 용이하게 변형될 수 있다.
하기 검정은 소분자에 결합하는 형광 분자 (Molecular Probes)에서의 변화를 측정하기 위한 플루오메트릭 이미징 플레이트 리더 (Fluorometric Imaging Plate Reader ("FLIPR"))를 사용한다. 분명하게는, 소분자를 검출하는 형광 분자가 칼슘 혈광 분자 즉, 본원에서 사용된 플루오-4(Molecular Probes, Inc.; 카달로그 넘버. F-14202) 대신에 사용될 수 있다.
부착 세포에 있어서, 세포를 투명한 바닥을 갖는 코-스타 블랙 96-웰 플레이트에 10,000-20,000 세포/웰로 시딩하였다. 플레이트를 CO2 인큐베이터중에 20분 동안 인큐베이션하였다. 부착 세포를 바이오텍 워셔(Biotek washer)중에 200ul의 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)로 2회 세척하고 최종 세척 후 100ul의 완충액을 제거하였다.
1mg/ml 플루오-4 스톡 용액을 10% 플루로닉산(pluronic acid) DMSO중에서 제조하였다. 세포를 플루오-4로 로딩시키기 위해, 50ul의 12ug/ml의 플루오-4를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 60분 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 바이오텍 워셔중에서 HBSS로 4회 세척하여 100ul의 완충액을 제거하였다.
비부착 세포에 있어서, 세포를 배양 배지로부터 회전 침전시켰다. 세포를 50ml 원뿔형 튜브에서 HBSS로 2-5x106 세포/ml로 재현탁시켰다. 10% 플루로닉산 DMSO중의 4ul의 1mg/ml 플루오-4 용액을 각 ml의 세포 현탁액에 첨가하였다. 그 후, 튜브를 30-60분 동안 37℃ 물에 위치시켰다. 세포를 HBSS로 2회 세척하고, 1x106 세포/ml에 재현탁시키고, 마이크로플레이트에 100ul/웰로 분산시켰다. 플레이트를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 후, 플레이트를 덴레이 셀 워시(Denley Cell Wash)중에서 200ul로 1회 세척하고, 흡기 단계에 의해 100ul 최종 부피가 되게 하였다.
비세포 기재 검정에 있어서, 각각의 웰은 형과 분자 예컨대, 플루오-4를 함유한다. 본 발명의 융합 단백질을 웰에 첨가하고, 형광 변화를 관찰하였다.
세포내 칼슘의 형광성을 측정하기 위해, 하기 변수에 대해서 FLIPR을 세팅하였다: (1) 시스템 게인은 300-800mW이다; (2) 노출 시간은 0.4초이다; (3) 카메라 F/정지는 F/2이다; (4) 여기는 488nm이다; (5) 방출은 530nm이다; (6) 샘플 첨가량은 50ul이다. 530nm로의 방출 증가는 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 유도된 분자에 의한 세포외 시그널링 현상을 나타내며, 이는 세포내 Ca++ 농도를 증가시킨다.
실시예 31: 티로신 키나아제 활성을 확인하기 위한 검정
단백질 티로신 키나아제 (PTK)는 다양한 그룹의 트랜스멤브레인 및 세포질 키나아제를 나타낸다. 수용체 단백질 티로신 키나아제 (RPTK) 그룹에는 PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF를 포함하는 세포분열 및 대사 성장 인자에 대한 수용체 및 인슐린 수용체 서브패밀리가 속한다. 또한, 상응하는 리간드는 공지되어 있지 않은 RPTK의 큰 패밀리가 있다. RPTK에 대한 리간드는 주로 분비된 소단백질을 포함하나, 또한 멤브레인-결합된 세포외 매트릭스 단백질을 포함한다.
리간드에 의한 RPTK의 활성화는 리간드-매개된 수용체 이량체화를 수반하며, 이는 수용체 서브유닛의 트랜스포스포릴화 및 세포질 티로신 키나아제의 활성화를 유도한다. 세포질 티로신 키나아제는 src-패밀리 (예를 들어, src, yes, lck, lyn, fyn)의 수용체 결합된 티로신 키나아제 및 비수용체 결합된 사이토졸릭 단백질 티로신 키나아제 예컨대, 잭 패밀리를 포함하며, 이의 구성원은 수용체의 사이토카인 슈퍼패밀리 (예를 들어, 인터루킨, 인터페론, GM-CSF 및 렙틴)에 의해 개시된 시그널 변환을 매개한다.
티로신 키나아제 활성을 자극할 수 있는 넓은 범위의 공지된 인자로 인해, 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 본 발명의 융합 단백질에 의해 유도된 단백질이 티로신 키나아제 시그널 변환 경로를 활성화시킬 수 있는지의 여부를 확인하는 것이 관심을 끈다. 따라서, 하기 프로토콜은 티로신 키나아제 시그널 변환 경로를 활성화시킬 수 있는 이러한 분자를 확인하기 위해 고안하였다.
표적 세포 (예를 들어, 일차 케라티노사이트)를 Nalge Nunc (Naperville, IL)로부터 구입한 96 웰 로프로디 사일런트 스크린 플레이트 (Loprodyne Silent Screen Plates)에서 웰 당 약 25,000 세포 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 100% 에탄올로 30분 동안 2회 멸균시키고, 물로 린싱하고, 밤새 건조시켰다. 일부 플레이트를 100 mL의 시그마 케미칼스(St. Louis, MO)로부터 구입가능한 세포 배양 등급 타입 I 콜라겐 (50mg/ml), 겔라틴 (2%) 또는 폴리리신 (50mg/ml) 또는 벡톤 디킨슨 (Bedford, MA)로부터 구입한 10% 마트리겔 또는 우혈청으로 2시간 동안 코팅시키고, PBS로 린싱하고, 4℃에서 저장하였다. 이러한 플레이트상에서의 세포 성장을, 성장 배지중에 5,000 세포/웰을 시딩하고, 48시간 후 제조업자 알라마르 바이오사이언스, 인크.(Alamar Biosciences, Inc.(Sacramento, CA))에 의해 기술된 바와 같은 알라마르블루(alamarBlue)를 사용하여 세포 수의 간접적인 정량화에 의해 검정하였다. 벡톤 디킨슨으로부터의 팔콘 플레이트 커버 #3071을 사용하여 로프로딘 사일런트 스크린 플레이트로 커버링하였다. 팔콘 마이크로테스트 III 세포 배양 플레이트는 일부 증식 실험에 사용될 수 있다.
추출물을 제조하기 위해, A431 세포를 로프로딘 플레이트의 나일론 멤브레인상에 시딩하고 (20,000/200ml/웰), 완전 배지중에서 밤새 배양하였다. 세포를 24시간 동안 혈청 비함유 염기성 배지중에서 인큐베이션시켜 작업 중단시켰다. EGF (60ng/ml) 또는 본 발명의 상이한 농도의 알부민 융합 단백질로 5-20분 처리한 후, 배지를 제거하고, 100ml의 추출 완충액 (20mM HEPES pH7.5, 0.15M NaCl, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 2mM Na3VO4, 2mM Na4P207 및 뵈링거 만하임(Indianapolis, IN)으로부터 수득한 프로테아제 억제제 (# 1836170)의 칵테일)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 4℃에서 회전 쉐이커상에서 쉐이킹시켰다. 그 후, 플레이트를 진공 트랜스퍼 메인폴드에 위치시키고, 하우스 진공을 이용하여 각 웰의 0.45mm 멤브레인 바닥을 통해 여과하였다. 추출물을 진공 메인폴드의 바닥의 96-웰 캐취/검정 플레이트에서 수집하고, 즉시 얼음위에 위치시켰다. 원심분리에 의해 정화된 추출물을 수득하기 위해, 5분 동안 세정제 가용해시킨 후, 각 웰의 내용물을 제거하고, 16,000 x g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다.
티로신 키나아제 활성 수준에 대해 여과된 추출물을 시험하였다. 티로신 키나아제 활성을 검출하는 많은 방법이 공지되어 있으나, 본원에서는 하나의 방법만 기술하였다.
일반적으로, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 티로신 키나아제 활성은 특이적 기질 (바이오티닐화된 펩티드)상에서 티로신 잔기를 포스포릴화시킬 수 있는 이의 능력을 측정함으로써 평가된다. 이러한 목적을 위해 사용될 수 있는 바이오티닐화된 펩티드는 PSK1(세포 분할 키나아제 cdc2-p34의 아미노산 6-20에 상응) 및 PSK2(가스트린의 아미노산 1-17에 상응)을 포함한다. 이 두 펩티드는 티로신 키나아제에 대한 기질이며, 뵈링거 만하임으로부터 입수가능하다.
티로신 키나아제 반응은 순차적으로 하기 성분을 첨가함으로써 준비하였다. 먼저, 10ul의 5uM 바이오티닐화된 펩티드를 첨가하고, 10ul ATP/Mg2 + (5mM ATP/50mM MgCl2), 이어서 10ul의 5x 검정 완충액 (40mM 이미다졸 히드로클로라이드, pH7.3, 40mM 베타-글리세로포스페이트, 1mM EGTA, 100mM MgCl2, 5mM MnCl2, 0.5mg/ml BSA), 그 후 5ul의 나트륨 바나데이트 (1mM) 이어서 5ul의 물을 첨가하1였다. 성분을 완만하게 혼합하고, 반응 혼합물을 30℃에서 2분 동안 사전인큐베이션하였다. 10ul의 대조군 효소 또는 여과된 상청액을 첨가하여 반응을 개시시켰다.
그 후, 티로신 키나아제 검정 반응을 10ul의 120mm EDTA를 첨가하고, 반응물을 엄음상에 위치시킴으로써 종료시켰다.
반응 혼합물의 50ul 분취물을 미세적정 플레이트 (MTP) 모듈에 이동시키고, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시킴으로써 티로신 키나아제 활성을 측정하였다. 이는 96 웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅시켜 바이오티닐화된 펩티드와 결합시킨다. MTP 모듈을 300ul/웰의 PBS로 4회 세척하였다. 이어서, 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제 (항-P-Tyr-POD(0.5u/ml))에 컨쥬게이션된 75ul의 항-포스포티로신 항체를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 상기와 같이 세척하였다.
이어서, 100ul의 퍼옥시다아제 기질 용액 (뵈링거 만하임)을 첨가하고, 실온에서 5분 이상 동안 인큐베이션하였다 (30분 이하). ELISA 리더를 사용하여 샘플을 405nm에서 샘플의 흡광도를 측정하였다. 결합된 퍼옥시다아제 활성 수준을 ELISA 리더로 정량화시키고, 이는 티로신 키나아제 활성의 수준을 반형한다.
실시예 32: 포스포릴화 활성을 확인하는 검정
실시예 31에 기술된 단백질 티오신 키나아제 활성의 검정에 대한 가능한 대체법 및/또는 보완법으로서, 주요 세포내 시그널 변환 매개체의 활성화 (포스포릴화)를 검출하는 검정법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 하기 기술된 바와 같이, 한 특정 검정법은 Erk-1 및 Erk-2 키나아제의 티로신 포스포릴화를 검출할 수 있다. 그러나, 기타 분자 예컨대, Raf, JNK, p38 MAP, Map 키나아제 키나아제 (MEK), MEK 키나아제, Src, 근육 특이적 키나아제 (MuSK), IRAK, Tec 및 야누스 및 기타 다른 포스포세린, 포스포티로신 또는 포스포트레오닌 분자의 포스포릴화가 이들 분자를 Erk-1 또는 Erk-2로 치환함으로써 하기 검정법으로 검출될 수 있다.
특히, 96-웰 ELISA 플레이트의 웰을 0.1ml의 단백질 G (1ug/ml)로 2시간 동안 실온(RT)에서 코팅시킴으로써 검정 플레이트를 제조하였다. 그 후, 플레이트를 PBS로 린싱하고, 1시간 동안 실온에서 3% BSA/PBS로 차단하였다. 그 후, 단백질 G 플레이트를 Erk-1 및 Erk-2에 대한 2개의 통상의 모노클로날 항체 (100ng/웰)로 처리하였다 (실온에서 1시간)(Santa Cruz Biotechnology). (기타 분자를 검출하기 위해, 상기 기술된 분자를 검출하는 모노클로날 항체를 치환함으로써 이러한 단계가 용이하게 변형될 수 있다.) PBS로 3-5회 린싱한 후, 플레이트를 사용때까지 4℃에서 저장하였다.
A431 세포를 96-웰 로프로딘 필터플레이트에서 20,000/웰로 시딩하고, 밤새 성장 배지에서 배양시켰다. 그 후, 세포를 염기성 배지 (DMEM)중에서 48시간 동안 절식시키고, EGF(6ng/웰) 또는 본 발명의 융합 단백질의 농도를 변화시키면서 5-20분 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 용해시키고, 추출물을 검정 플레이트로 직접 여과시켰다.
추출물을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후, 웰을 다시 린싱하였다. 양성 대조군으로서, MAP 키나아제의 통상의 제조물 (10ng/웰)을 A431 추출물 대신에 사용하였다. 그 후, 플레이트를 Erk-1 및 Erk-2의 포스포릴화된 에피토프를 특이적으로 인지하는 통상의 폴리클로날 (래빗) 항체 (1ug/ml)로 처리하였다 (실온에서 1시간). 그 후, 항체를 표준 공정에 따라 바이오티닐화시켰다. 그 후, 결합된 폴리클로날 항체를 유로피움-스트렙타비딘 및 유로피움 형광 증진제와 왈락 DELFIA 장치 (Wallac DELFIA instrument)에서 연속 인큐베이션에 의해 정량화하였다 (시간에 따라 소멸되는 형광성). 백그라운드 위의 증가된 형과 시그널은 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 유도된 분자에 의한 포스포릴화를 나타낸다.
실시예 33: 포스포릴화 검정
본 발멸의 알부민 융합 단백질의 포스포릴화 활성을 검정하기 위해, U.S. 특허 5,958,405 (본원에 참고문헌으로 인용됨)에 기술된 바와 같은 포스포릴화 검정법을 이용하였다. 간단하게는, 감마-라벨링된 32P-ATP를 사용한 단백질 기질의 포스포릴화 및 감마 방사성 동위원소 카운터를 이용한 혼입된 방사능의 정량화에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 단백질 기질, 32P-ATP, 및 키나아제 완충액과 인큐베이션하였다. 그 후, 기질로 혼입된 32P를 전기영동에 의해 유리 32P-ATP로부터 분리하고, 혼입된 32P를 계수하고, 음성 대조군과 비교하였다. 음성 대조군을 초과하는 반사능 계수는 융합 단백질의 포스포릴화 활성을 나타낸다.
실시예 34: 폴리펩티드 리간드의 존재하에 본 발명의 알부민 융합 단백질의 포스포릴화 활성 (활성화)의 검출
당해분야에 공지된 방법 또는 본원에 기술된 방법을 이용하여 본 발명의 알부민 융합 단백질의 포스포릴화 활성을 측정할 수 있다. 포스포릴화 활성을 측정하는 바람직한 방법은 US 5,817,471 (본원에 참고문헌으로 인용됨)에 기술된 바와 같은 티로신 포스포릴화 검정법을 이용하는 것이다.
실시예 35: 골수 CD34 + 세포 증식을 자극하기 위한 검정법
본 검정법은 조혈 성장 인자의 존재하에 사람 CD34+의 증식력에 기초하며, CD34+세포의 증식을 자극하는 본 발명의 융합 단백질의 능력을 평가한다.
대부분의 성숙한 전구체가 단지 단일 시그널에만 반응할 것이라는 것은 이미 입증되었다. 더욱 미숙한 전구체가 2개 이상의 반응할 시그널이 요구된다. 따라서, 다양한 선구 세포의 조혈 활성에 대한 본 발명의 융합 단백질의 효과를 시험하기 위해, 본 검정물은 조혈 성장 인자의 존재 또는 부재하에 본 발명의 제공된 융합 단백질을 함유한다. 분리된 세포를 시험 샘플과 함께 줄기세포 인자(SCF)의 존재하에 5일 동안 배양시켰다. SCF 단독은 단지 "생존" 인자로서 이러한 조건에서 작용하는 골수 (BM) 증식에 대한 매우 제한된 효과를 가진다. 그러나, 이들 세포 (예를 들어, IL-3)에 대한 자극 효과를 나타내는 인자와 혼합될 경우, SCF는 상승 효과를 유도할 것이다. 따라서, 시험된 융합 단백질이 조혈 선구체에 대한 자극 효과를 갖는다면, 이러한 활성은 용이하게 활성될 수 있다. 정상의 BM 세포가 낮은 수준의 사이클링 세포를 갖기 때문에, 제공된 융합 단백질의 억제 효과는 관찰되지 않을 수 있다. 따라서, 선구체에 대한 억제 효과의 검정은 바람직하게는, 먼저 세포를 SCF+IL+3로 실험관내 자극시킨 후, 이러한 유도된 증식의 억제에 대해 평가되는 화합물과 접촉시키므로써 시험된다.
간단하게는, CD34+ 세포를 당업계에 공지된 방법을 분리하였다. 세포를 해동시키고, 배지 (1% L-글루타민(500ml)를 갖는 QBSF 60 혈청 비함유 배지, Quality Biological, Inc., Gaithersburg, MD Cat# 160-204-101)에 재현탁시켰다. 200 x g에서 수차례의 완만한 원심분리 단계 후, 세포를 한시간 동안 방치하였다. 세포 수를 2.5 x 105 세포/ml로 조절하였다. 이 시간 동안, 100㎕의 멸균수를 96-웰 플레이트의 가장자리 웰에 첨가하였다. 본 검정에서 본 발명의 알부민 융합 단백질로 시험될 수 있는 사이토카인은 50ng/ml의 단독의 rhSCF (R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat# 255-SC)이며, 30ng/ml의 rhSCF와 rhIL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat# 203-ML)의 혼합물이다. 1시간 후, 10㎕의 제조된 사이토카인, 다양한 농도의 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 20㎕의 희석된 세포를 이미 웰에 존재하는 배지에 첨가하여 최종의 총 부피가 100㎕가 되게 하였다. 그 후, 플레이트를 37℃/5% CO2 인큐베이터를 오일 동안 배치하였다.
검정 18시간 전에 채취하고, 0.5μCi/웰의 [3H] 티미딘을 10㎕ 부피로 각 웰에 첨가하여 증식율을 측정하였다. 각 96-웰 플레이트로부터 세포를 톰텍 하비스터(Tomtec Harvester) 96을 사용하여 필터매트로 채취하여 종결시켰다. 채취 후, 필터매트를 건조시키고, 트리밍시키고, 하나의 옴니필터 (OmniFilter) 플레이트 및 하나의 옴니필터 트레이(OmniFilter Tray)로 이루어진 옴니필터 어셈블리로 배치시켰다. 60㎕ 마이크로신트를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 탑실-A 프레스-온 실링 필름(TopSeal-A press-on sealing film)으로 밀봉시켰다. 바 코드 15 스티커를 계수를 위해 제 1 플레이트에 부쳤다. 그 후, 밀봉된 플레이트를 로딩시키고, 반사능 수준을 패카드 탑 카운트 (Packard Top Count)로 측정하고, 프린팅된 데이타를 검정을 위해 수집하였다. 반사능 수준은 세포 증식의 양을 반영한다.
본 실시예에 기술된 연구는 골수 CD34+ 세포 증식을 자극하기 위해 제공된 융합 단백질의 활성을 시험한다. 당업자는 본 발명의 융합 단백질 및 폴리누클레오티드 (예를 들어, 유전자 치료) 및 이의 작용제 및 길항제의 활성을 시험하기 위한 예시적 연구를 용이하게 변형시킬 수 있다. 골수 CD34+ 세포의 증식을 자극하는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 능력은, 융합 단백질에 상응하는 알부민 융합 단백질 및/또는 폴리누클레오티드는 면역 시스템 및 혈구생성에 영향을 끼치는 질환의 진단 및 치료에 유용하다. 대표적인 용도는 상기 섹션 "면역 활성" 및 "감염성 질환"에 기술되어 있으며, 본원의 다른 부분에서 기술되어 있다.
실시예 36: 세포외 매트릭스 증진된 세포 반응( EMECR )의 검정
세포외 매트릭스 증진된 세포 반응 (EMECR)의 목적은 세포외 매트릭스 (ECM) 유도된 시그널 하에 조혈 줄기 세포에 대한 본 발명의 융합 단백질의 능력을 평가하는 것이다.
세포는 주위 미세환경으로부터 수용된 시그널에 있어서 조절 인자에 대한 반응한다. 예를 들어, 섬유아세포, 및 내피 및 상피 줄기 세포는 ECM으로부터의 시그널의 부재하에서는 복제를 실패한다. 조혈 줄기 세포는 골수에서 자가-소생할 수 있으나, 실험관내 현탁 배양물에서는 그렇지 못하다. 실험관내에서 자가-소생할 수 있는 줄기 세포의 능력은 스트로마 세포 및 ECM 단백질 피브로넥틴(fn)과의 이들의 상호작용에 의존적이다. fn으로의 세포 부착은 α5.β1 및 α4.β1 인테그린 수용체에 의해 매개되며, 이는 사람 및 마우스 조혈 줄기 세포에 의해 발현된다. ECM 환경으로 조정되며, 줄기 세포 자가-소생 자극에 반응하는 인자(들)은 확인되지 않았다. 이러한 인자의 발현은 유전자 치료 및 골수 이식 적용에 있어서 매우 유익할 것이다.
간단하게는, 폴리스티렌의 비조직 배양 처리된 96-웰 플레이트를 0.2㎍/cm2의 코팅 농도로 fn 절편으로 코팅시켰다. 마우스 골수를 0.2ml의 혈청 비함유 배지에 플레이팅 시켰다 (1,000세포/웰). IL-3(5ng/ml) + SCF (50ng/ml)의 존재하에 배양된 세포는 양성 대조군으로서 작용할 것이며, 이러한 조건하에 줄기 세포의 자가-소생은 거의 발생하지 않을 것이나, 줄기 세포의 현저한 분화가 예상된다. 본 발명의 알부민 융합 단백질을 SCF (5.0ng/ml)의 존재 및 부재하에 적합한 음성 대조군과 시험하였으며, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 함유하는 투여된 조성물의 용적은 총 검정물 용적중의 10%이다. 그 후, 플레이팅된 세포를 저산소 환경(5% CO2, 7% O2, 및 88% N2) 조직 배양 인큐베이터에서 7일 동안 인큐베이션함으로써 성장하도록 하였다. 이후, 웰 내의 증식 세포의 수는 세포 DNA로의 티미딘 혼입을 측정함으로써 정량화하였다. 검정에서 양성 히트의 확인은 세포의 표현형 특징을 요구할 것이며, 이는 배양 시스템의 스케일을 크게하거나 세포 표면 항원 및 FACScan에 대한 적합한 항체 시제를 사용함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 특정 융합 단백질이 조혈 선구체의 자극제인 것으로 밝혀진다면, 융합 단백질 및 융합 단백질에 상응하는 폴리누클레오티드는 예를 들어, 면역계 및 혈구생성에 영향을 끼치는 질환의 진단 및 치료에 유용할 수 있다. 대표적인 용도는 상기 "면역 활성" 및 "감염성 질환"에 기술되어 있으며, 본원의 기타 부분에 기술되어 있다. 또한, 융합 단백질은 다양한 혈통의 줄기 세포 및 해당 선구체의 팽창에 유용할 수 있으며, 다양한 세포 유형의 분화 및/또는 증식에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 조혈 세포의 증식 및 분화를 억제하는데 사용될 수 있으며, 따라서 화학치료 동안 화학치료제로부터의 골수 줄기 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다. 이러한 항증식 효과는 더 높은 용량의 화학 치료제의 투여를 가능하게 할 수 있으며, 따라서 더욱 효과적인 화학치료 처리법이 된다.
게다가, 본 발명의 융합 단백질 및 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 스트로마 세포가 조혈 계통의 세포 생성에 중요하기 때문에, 조혈 관련 질환 예컨대, 빈혈증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 혈소판감소증 또는 백혈병의 치료 및 진단에 유용할 수 있다. 이의 사용은 골수 세포 생체외 배양, 골수 이식, 골수 재구성, 신생물의 방사선치료 또는 화학치료를 포함한다.
실시예 37: 사람 피부 섬유아세포 및 대동맥 연근세포 증식
본 발명의 알부민 융합 단백질을 정상의 사람 피부 섬유아세포 (NHDF) 및 사람 대동맥 연근세포 (AoSMC)의 배양물에 첨가하고, 두개의 보조 검정을 각각의 샘플로 수행하였다. 첫번째 검정은 정상적인 사람 피부 섬유아세포 (NHDF) 또는 대동맥 연근세포 (AoSMC)의 증식에 대한 융합 단백질의 영향을 시험하는 것이다. 섬유아세포 또는 연근세포의 비정상적인 성장은 섬유증 및 레테노시스를 포함한 여러 병리학적 과정의 일부이다. 두번째 검정은 NHDF 및 SMC 둘 모두에 의한 IL6 생성을 시험하는 것이다. IL6 생성은 기능 활성화의 표시체이다. 활성화된 세포는 많은 사이토카인 및 기타 인자의 생성을 증가시킬 것이며, 이는 사전염증 또는 면역조절 과정을 초래할 수 있다. 검정은 보조자극 또는 억제 활성을 체크하기 위해 보조-TNFa 자극의 존재하에 및 부재하에 수행하였다.
간단하게는, 1일째에 96-웰 블랙 플레이트를 100㎕ 배양 배지에서 1000 세포/웰 (NHDF) 또는 2000 세포/웰 (AoSMC)로 세팅하였다. NHDF 배양 배지는 하기를 함유한다: 클로네틱스(Clonetics) FB 기초 배지, 1mg/ml hFGF, 5mg/ml 인슐린, 50mg/ml 젠타마이신, 2% FBS를 함유한다. 반면, AoSMC 배양물 배지는 클로네틱스 SM 기초 배지, 0.5㎍/ml hEGF, 5mg/ml 인슐린, 1㎍/ml hFGF, 50mg/ml 젠타마이신, 50㎍/ml 암포테리신 B, 5% FBS. 37℃에서 4-5시간 이상 동안 인큐베이션시킨 후, 배양물 배지를 흡기시키고, 성장 억류 배지로 교체하였다. NHDF에 대한 성장 억류 배지는 섬유아세포 기초 배지, 50mg/ml 젠타마이신, 2% FBS를 함유하는 반면, AoSMA에 대한 성장 억류 배지는 SM 기초 배지, 50mg/ml 젠타마이신, 50㎍/ml 암포테리신 B, 0.4% FBS를 함유한다. 2일 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
2일 째에, 본 발명의 알부민 융합 다백질의 일련의 희석물 및 주형을 배지 조절제 및 공지된 단백질 조절제를 항상 포함하도록 설계하였다. 자극 및 억제 실험에 있어서, 단백질을 성장 억류 배지로 희석시켰다. 억제 실험에 있어서, TNFa를 2ng/ml (NHDF) 또는 5ng/ml (AoSMC)의 최종 농축물에 첨가하였다. 대조군 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질을 함유하는 1/3 vol 배지를 첨가하고, 5일 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다.
각 웰로부터 60㎕를 또 다른 라벨링된 96-웰 플레이트로 이동시키고, 플레이트-밀봉제로 커버링하고, 6일 동안 4℃에서 저장하였다 (IL6 ELISA에 있어서). 세포 배양 플레이트중의 나머지 100㎕에, 배양물 부피 (10㎕)의 10%에 상응하는 양으로 알라마르 블루(Alamer Blue)를 무균 첨가하였다. 다시 플레이트를 3 내지 4시간 동안 인큐베이터에 위치시켰다. 그 후, 사이토플루오르(CytoFluor)를 사용하여 530nm의 여기 및 590nm의 방출을 갖는 형광물을 측정하였다. 이는 성장 자극/억제 데이타를 생성시킨다.
5일째에, 96 웰 플레이트를 PBS pH7.4중에 희석된 50-100ul/웰의 항-사람 IL6 모노클로날 항체로 코팅시키고 IL6 ELISA를 수행하고, 실온에서 ON을 배양하였다.
6일째에, 플레이트를 페이퍼 타올상에 싱크시키고 블롯팅하여 비웠다. 4% BSA를 갖는 PBS를 함유하는 검정 완충액을 제조하였다. PBS중의 200㎕/웰의 피어스 슈퍼 블록 차단 완충액으로 플레이트를 차단한 후, 세척 완충액 (PBS, 0.05% 트윈-20)으로 세척하였다. 플레이트를 페이퍼 타월로 블롯팅하였다. 그 후, 50㎕/웰의 희석된 항-사람 IL-6 모노클로날, 바이오틴-라벨링된 항체 0.50mg/ml를 첨가하였다. 배지 (30, 10, 3, 1, 0.3, 0ng/ml)중의 IL-6 스톡을 희석시켰다. 샘플을 이중으로 플레이트의 상층 열에 첨가하였다. 플레이트를 커버링하고, 2시간 동안 쉐이커에서 인큐베이션하였다.
플레이트를 세척 완충액으로 세척하고, 페이퍼 타월로 블롯팅하였다. 검정 완충액중에 EU-라벨링된 스트렙티비딘을 1:1000으로 희석하고, 100㎕/웰을 첨가하였다. 플레이트를 커버링하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척 완충액으로 세척하고, 페이퍼 타월로 블롯팅하였다.
100㎕/웰의 증진 용액을 첨가하였다. 5분 동안 쉐이킹하였다. 왈락 DELFIA 형관분석기상에서 플레이트를 살폈다. 각 검정에서 삼중 샘플로부터의 값을 표로 만들고 평균화시켰다.
이러한 검정에서의 양성의 결과는 AoSMC 세포 증식을 시사하며, 알부민 융합 단백질이 피부 섬유아세포 증식 및/또는 연근 세포 증식에 관련있음을 시사한다. 양성의 결과는 또한, 본 융합 단백질 및 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 많은 잠재적 용도를 암시한다. 예를 들어, 본 명세서에 걸쳐 상세하게 설명된 바와 같은 염증 및 면역 반응, 환부 치료, 및 혈관신생. 특히, 융합 단백질은 환부 치료 및 피부 재생에 사용될 수 있으며, 또한 혈관 및 림프관의 혈관발생의 증진에 사용될 수 있다. 혈관 성장은 예를 들어, 심혈관 질환의 치료에 이용될 수 있다. 추가적으로, 본 검정에서 길항 활성을 나타내는 융합 단백질은 항-혈관제 (예를 들어, 항-혈관신생)로서 작용함으로써 혈관신생과 관련된 질환, 질병 및/또는 상태를 치료하는데 유용할 수 있다. 이러한 질환, 질병 및/또는 상태는 당해분야에 공지되어 있고/거나 본원에 기술되어 있으며, 예컨대, 종양, 고형종양, 양성 종양, 예를 들어, 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마스 및 화농성 육아종; 동맥경화 플라그; 안구혈관신생 질환 예를 들어, 당뇨병성 신경종, 미숙아 망막증, 황반부 변성, 각막이식거부, 관신생 녹내장, 후수정제 섬유증식, 홍채조홍, 망막모세포종, 눈의 포도막염 및 프테리지아 (비정상 혈관 성장); 류마티스 관절염; 건선; 지연된 상처 치료; 자궁내막증; 혈관발생; 육아종화(granulation); 비대성 반흔 (켈로이드); 골절 불유합; 경피증; 트라코마; 혈관 유착; 심근 혈관신생; 관동맥측부; 대뇌측부; 동정맥기형; 허혈성 지체 혈관신생; 오슬러-웨버 신드롬; 플라그 신혈관형성; 텔란지엑타시아(telangiectasia); 혈우병성 접합; 혈관섬유종; 섬유근이형증; 환부 육아종화; 크론병 및 죽상동맥경화가 있다. 게다가, 본 검정에서 길항제로서 작용하는 알부민 융합 단백질은 당해분야에 공지되고/거나 본원에 기술된 항-고증식성 질환 및/또는 항-염증을 치료하는데 유용할 수 있다.
실시예 38: 내피세포상에서 세포 유착 분자 ( CAM ) 발현
염증 및 혈관신생 영역에 대한 림프구의 보충은 림프구상의 세포 표면 유착 분자 (CAM) 및 혈관 내피세포간의 특이적 수용체-리간드 상호작용과 관련있다. 정상 및 병리학적 셋팅에서 유착 과정은 세포간 유착 분자-1(ICAM-1), 혈관 세포 유착 분자-1(VACM-1), 및 내피 세포(EC)상의 내피성 백혈구 유착 분자-1(E-셀렉틴) 발현을 포함하는 일련의 다중 단계를 따른다. 이들 분자 및 혈관 내피세포상의 기타 분자의 발현은 백혈구가 국소 맥관에 부착하고, 염증 반응의 전개 동안 국소 조직으로 일출시킬 수 있는 유효성을 측정한다. 사이토카인 및 성장 인자의 국소적 농도는 이들 CAM의 발현 조절에 관계한다.
간단하게는, 내피세포 (예를 들어, 사람 제대정맥 내피세포 (HUVEC))를 표준 96 웰 플레이트에 컨플루언시하게 성장시키고, 성장 배지를 세포로부터 제거하고, 100㎕의 199 배지 (10% 소태 혈청 (FBS))로 대체하였다. 시험용 샘플 (본 발명의 알부민 융합 단백질 함유) 및 양성 또는 음성 대조군을 플레이트에 삼중 (10㎕ 부피)으로 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 5시간 (셀렉틴 및 인테그린 발현) 또는 24시간 (인테그린 발현) 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 흡기시켜 배지를 제거하고, 100㎕의 0.1% 파라포름알데히드-PBS (Ca++ 및 Mg++)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 30분 동안 고정시켰다. 웰로부터 고정물을 제거하고, 웰을 PBX(+Ca,Mg) + 0.5% BAS로 1X 세척하고, 탈수시켰다. 10㎕의 희석된 일차 항체를 시험 및 대조군 웰에 첨가하였다. 항-ICAM-1-바이오틴, 항-VCAM-1-바이오틴 및 항-E-셀렉틴-바이오틴을 10㎍/ml의 농도로 사용하였다 (0.1mg/ml 스톡 항체의 1:10 희석물). 세포를 사람화 환경에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 웰을 PBS(+Ca,Mg) + 0.5% BAS로 3회 세척하였다. 20㎕의 희석된 엑스트라아비딘-알칼리성 포스파타아제 (1:5,000 희석물, 본원에서는 작업 희석물로서 언급)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS(+Ca,Mg) + 0.5% BAS로 3회 세척하였다. 5ml의 글리신 완충액 (pH 10.4)당 p-니트로페놀 포스페이트 pNPP 1 정제를 용해시켰다 (pH 10.4). 글리신 완충액중의 100㎕ pNPP를 각 시험 웰에 첨가하였다. 글리신 완충액중의 엑스트라아비딘-알칼리성 포스포타아제의 작업 희석물로부터 표준 웰을 삼중으로 제조하였다: 1:5,000 (100)>10-0.5>10-1>10-1.5. 5㎕의 각 희석물을 삼중웰에 첨가하고, 각 웰 내의 생성된 AP 함량은 5.50 ng, 1.74 ng, 0.55 ng, 0.18 ng이었다. 이후, 100㎕의 pNNP 시약을 각 표준 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 50㎕ 부피의 3M NaOH를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 글리신 완충액으로만 충전된 블랭크 웰에 대한 백그라운드 서브트랙션 옵션(the background subtraction option)을 이용하여 405nm에서 플레이트 리더상에서 살폈다. 또한, 주형을 각 표준 웰에서 AP-컨쥬게이트의 농축물을 나타내도록 준비시켰다 [5.50ng; 1.74ng; 0.55ng; 0.18ng]. 결과는 각 샘플에서 결합된 AP-컨쥬게이트의 양으로서 나타내었다.
실시예 39: 알라마르 블루 내피세포 증식 검정
본 검정법은 소 림프관 내피세포 (LEC), 소 대동맥 내피 세포 (BAEC) 또는 사람 미세혈관 자궁근 세포 (UTMEC)의 bFGF-유도된 증식의 단백질 매개된 억제를 정량적으로 측정하는데 이용될 수 있다. 이러한 검정법은 대사 활성의 검출을 기초로하여 형광광도분석 성장 지시제와 통합된다. 표준 알마마르 블루 증식 검정은 내피세포 자극의 공급원으로서 첨가된 10ng/ml의 bFGF와 EGM-2MV중에 준비하였다. 이러한 검정은 성장 배지 및 세포 농도를 약간만 변형시켜 다양한 내피세포로 이용될 수 있다. 시험할 단백질 배취의 희석물을 적합하게 희석시켰다. bFGF를 함유하지 않는 혈청-비함유 배지 (GIBCO SFM)를 비자극된 대조군으로서 사용하고, 안지오스타틴 또는 TSP-1은 공지된 억제 대조군으로서 포함된다.
간단하게는, LEC, BAEC 또는 UTMEC를 96 웰 플레이트에서 5000 내지 2000 세포/웰의 밀도로 성장 배지중에 시딩하고, 밤새 37℃에 위치시켰다. 세포를 밤새 인큐베이션시킨 후, 성장 배지를 제거하고, GIBCO EC-SFM으로 대체하였다. 세포를 삼중 웰로 본 발명의 알부민 융합 단백질의 적합한 희석물 또는 대조군 단백질 샘플 (SFM중에 제조됨)로 처리하고, 추가의 bFGF로 10ng/ml 농도가 되게 하였다. 세포를 일단 샘플로 처리하면, 플레이트(들)를 다시 3일 동안 37℃ 인큐베이터에 위치시켰다. 3일 후, 10ml의 스톡 알라마르 블루 (Biosource Cat# DAL 1100)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트(들)을 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 위치시켰다. 그 후, 플레이트를 사이토플루오르 형광 리더기를 사용하여 530nm의 여기 및 590nm의 방출에서 살폈다. 직접적인 결과는 상대적 형광 유닛에 기록하였다.
알라마르 블루는 세포 성장으로부터 유래된 성장 배지의 화학 환원에 반응하여 색을 형광시키고 변화시키는 산화-환원 지시제이다. 세포가 배양물중에서 성장함에 따라, 내재적 대사 활성은 인접한 주위 환경의 화학 반응을 초래한다. 성장과 관련된 환원은 지시제를 산화된 (비형광 블루) 형태로부터 환원된 (형광 레드) 형태로 변화시킨다 (즉, 자극된 증식은 더 강한 시그널을 생성시키고, 억제된 증식은 더욱 약한 시그널을 생성시키고, 전체 시그널은 세포의 전체 수 및 이들의 대사 활성에 비례한다.) 활성의 배경 수준은 절식 배지 단독으로 관찰하였다. 이를 양성 대조군 샘플 (성장 배지중의 bFGF) 및 단백질 희석물로부터 관찰된 결과와 비교하였다.
실시예 40: 혼합된 림프구 반응의 억제 검출
본 검정은 본 발명의 융합 단백질에 의해 혼합된 림프구 반응 (MLR)의 억제를 검출하고 평가하는데 사용될 수 있다. MLR의 억제는 세포 증식 및 생존력에 대한 직접적 효과, 상호작용 세포에 대한 보조자극 분자의 조절, 림프구와 보조 세포간의 부착 조절, 또는 보조 세포에 의한 사이토카인 생성의 조절로 인한 것일 수 있다. 본 검정에 사용된 말초혈 단핵 단편이 T, B 및 천연 킬럼 림프구 및 단핵구 및 수지상 세포를 포함하기 때문에 다중 세포는 MLR을 억제하는 알부민 융합 단백질에 의해 표적화될 수 있다.
MLR을 억제하는 것으로 밝혀진 본 발명의 알부민 융합 단백질은 림프구 및 모노사이트 활성화 또는 증식과 관련된 질환에 적용될 수 있다. 이들 질환으로는 천식, 관절염, 당뇨병, 염증 피부 질환, 건선, 습진, 전신성 홍반성 루프스, 다발성 경화증, 사구체신염, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 동맥경화증, 간경병, 이식편대 숙주병, 숙주대 이식편병, 간염, 백혈병 및 림프종을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
간단하게는, 사람 공여체로부터의 PBMC를 림프구 분리 배지 (LSM?, 밀도 1.0770g/ml, Oragnon Teknika Corporation, West Chester, PA)를 사용한 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 두 공여체로부터의 PBMC를 10% FCS 및 2mM 글루타민이 보충된 RPMI-1640 (Life Technologies, Grand Island, NY)중에 2x106 세포/ml로 조절하였다. 제 3 공여체로부터의 PBMC를 2 x 105 세포/ml로 조절하였다. 각 도너로부터의 PBMC의 50 마이크로리터를 96-웰 둥근 바닥 미세적정 플레이트의 웰에 첨가하였다. 융합 단백질 시험 물질 (50㎕)의 희석물을 미세적정 웰에 삼중으로 첨가하였다. (대상 단백질의) 시험 샘플을 1:4의 최종 희석으로 첨가하고; rhuIL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN, 카달로그 넘버 202-IL)를 최종 농도 1㎍/ml로 첨가하고; 항-CD4 mAb (R&D Systems, 클론 34930.11, 카달로그 넘버 MAB379)를 최종 농도 10㎍/ml로 첨가하였다. 세포를 7-8일 동안 37℃에서 5% CO2로 배양시키고, 1μC의 [3H] 티미딘을 마지막 16시간 배양 동안 웰에 첨가하였다. 세포를 채취하고, 패카드 탑카운드(Packard TopCount)를 사용하여 티미딘 혼입을 측정하였다. 데이타는 삼중 측정치의 평균 및 표준 편차로서 나타내었다.
대상 융합 단백질의 샘플을 별도의 실험으로 스크리닝하고, 림프구의 증식을 억제하는 음성 대조군 처리군인 항-CD4 mAb, 및 림프구의 증식을 증진시키는 양성 대조군 처리군인 IL-2(재조합 물질 또는 상청액으로서)와 비교하였다.
실시예 41: 프로테아제 활성의 검정
하기 검정법은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 프로테아제 활성을 평가하는데 사용될 수 있다.
젤라틴 및 카세인 자이모그래프를 실질적으로 문헌 [Heusen et al., Anal . Biochem., 102:196-202 (1980); Wilson et al., Journal of Urology , 149:653-658 (1993)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 샘플을 1% 겔라틴 오르카세인을 함유하는 10% 폴리아크릴아미드/0.1% SDS 겔상에서 수행하고, 2.5% 트리톤중에 실온에서 1시간 동안 함침시키고, 0.1M 글리신 (pH 8.3)중에 37℃에서 5 내지 16시간 동안 함침시켰다. 아미도 블랙으로 염색 후, 단백질 분애 영역이 다시 블루-블랙 배경에 대해 다시 투명한 영역으로서 나타났다. 트립신(Sigma T8642)을 양성 대조군으로서 사용하였다.
프로테아제 활성은 n-a-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르 (BAEE)(Sigma B-4500)의 절단을 모니터링함으로써 측정하였다. 반응은 pH 7.5로 세팅하였다 (25mM NaPO4, 1mM EDTA 및 1mM BAEE). 샘플을 첨가하고, 260nm 흡광도 변화를 시간 구동 모드로 벡맨(Beckman) DU-6 스펙트로포토미터로 모니터링하였다. 트립신을 양성 대조군으로서 사용하였다.
280nm 흡광도로서 측정된 헤모글로빈 또는 카세인으로부터의 산-가용성 펩티드의 방출 또는 폴린 방법(Folin method)을 측색계적으로 이용한 것을 기초로하는 추가적임 검정을 문헌 [Bergmeyer, et al., Methods of Enzymatic Analysis , 5 (1984)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 기타 검정법은 색원체 기질의 가용화를 포함한다 (Ward, Applied Science , 251-317 (1983).
실시예 42: 세린 프로테아제 기질 특이성의 확인
본원에 기술되거나 당해분야에 공지된 방법을 이용하여 세린 프로테아제 활성을 갖는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 기질 특이성을 측정하였다. 기질 특이성을 측정하는 바람직한 방법은 GB 2 324 529 (본원에 참고문헌으로 인용됨)에 기술된 바와 같이 위치 스캐닝 합성 혼합 라이브러리의 사용을 특징으로 한다.
실시예 43: 리간드 결합 검정
하기 검정법은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 리간드 결합 활성을 평가하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질에 대해 정제된 리간드는 결합 연구에 있어서 고특이적 활성 (50-2000 Ci/mmol)에 대해 방사선라벨링된다. 그 후, 방사선라벨링 과정이 융합 단백질에 대한 리간드의 활성을 감소시키지 않는 것으로 결론내려져다. 완충액, 이온, pH 및 기타 조절제 예컨대, 누클레오타이드에 대한 검정 조건이, 막과 전체 세포 폴리펩티드 공급원에 있어서 작업가능한 시그널 대 잡음비를 성립하도록 최적화된다. 이들 검정에 있어서, 특이적 폴리펩티드 결합은 총 관련 방사능 빼기 과량의 라벨링가능한 경쟁 리간드의 존재하에 측정된 방사능으로서 규정된다. 가능한 경우, 하나 초과의 경쟁 리간드가 잔류 미특이적 결합을 규정하는데 사용된다.
실시예 44: 개구리 난모세포에서 기능 검정
본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 선형화된 플라스미드 주형으로부터의 캡핑된 RNA 전사물을 표준 공정에 따라 RNA 중합효소로 실험관내에서 합성시켰다. 실험관내에서, 전사물을 0.2mg/ml의 최종 농도로 물중에 현탁시켰다. 성숙한 암컷 두꺼비로부터 난소엽을 제거하고, 스테이지 V 데폴리큘레이팅된(Stage V defolliculated) 난모세포를 수득하고, RNA 전사물 (10ng/난모세포)을 미세주입 장치를 이용하여 50nl 거환으로 주입하였다. 두개의 전극 전압 클램프를 사용하여 반응 융합 단백질 및 폴리펩티드 작용제 노출시 개개의 개구리 난모세포로부터 전류를 측정하였다. 실온에서 Ca2+ 유리 배르스 배지(Barth's medium)에서 기록을 수행하였다. 개구리계는 리간드를 활성화시키는데 있어서 공지된 리간드 및 조직/세포 추출물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
실시예 45: 마이크로피지오메트릭 검정
매우 다양한 이차 메신저 시스템의 활성화는 세포로부터의 소량의 산 분출을 초래한다. 세포내 시그널링 과정에 에너지를 공급하는데 요구되는 증가된 대사 활성의 결과로서 대부분이 산이 형성된다. 세포를 둘러싸는 배지에서 pH 변화는 매우 작으나, CYTOSENSOR 마이크로피지오미터에 의해 검출가능하다 (Molecular Devices Ltd., Menlo Park, Calif.). 따라서, CYTOSENSOR는 에너지 사용 세포내 시그널링 경로에 결합되는 이차 메신저를 활성화시키는 본 발명의 알부민 융합 단백질의 능력을 검출할 수 있다.
실시예 46: 추출물/세포 상청액 스크리닝
많은 수의 포유동물 수용체가 존재하며, 이들 수용체에 대한 비 동종 활성화 리간드 (작용제)가 여전히 남아있다. 따라서, 이들 수용체에 대한 활성 리간드는 오늘날까지 확인된 리간드 뱅크내에 포함되지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 본 발명의 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분 및/또는 치료학적 단백질 부분에 대한 천연 리간드를 확인하기 위해 조직 추출물에 대해 작용적으로 스크리닝할 수 있다 (칼슘, cAMP, 마이크로피지오미터, 난모세포 전기생리 등, 작용 스트린 이용). 양성 작용 반응을 유도하는 추출물은 활성화 리간드를 분리하고 확인할 때까지 순차적으로 하류단편화될 수 있다.
실시예 47: ATP -결합 검정
하기 검정은 본 발명의 융합 단백질의 ATP-결합 활성을 평가하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 알부민 융합 단백질의 ATP-결합활성은 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. 특허 5,858,719에 기술된 ATP-결합 검정을 이용하여 검출될 수 있다. 간단하게는, 본 발명의 알부민 융합 단백질에 대한 ATP-결합을 경쟁 검정법으로 8-아지도-ATP로의 광친화성 라벨링을 통해 측정하였다. 1mg/ml의 ABC 이송 단백질을 함유하는 반응 혼합물을 다양한 농도의 ATP, 또는 가수분해불가능한 ATP 유사체 아데닐-5'-이미도디포스페이트와 10분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 8-아지도-ATP (Sigma Chem. Corp., St.Louis, MO.)와 8-아지도-ATP (32P-ATP)의 혼합물 (5mCi/μmol, ICN, Irvine CA)을 100μM의 최종 농도로 첨가하고, 0.5ml의 분취액을 얼음위의 자기 스폿 플레이트의 웰에 위치시켰다. 플레이트를 플레이트로부터 2.5cm 간격을 두고 254nm UV 램프로 1분 간격을 두고 두번 조사하고, 간격 사이에 1분 냉각시켰다. 최종 농도 2mM가 되도록 디티오트레이톨을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 배양물을 SDS-PAGE 전기영동시키고, 건조시키고, 자기방사시켰다. 본 발명의 알부민 융합 단백질에 상응하는 단백질 밴드가 여기되며, 방사능을 정량시켰다. ATP 또는 아데닐-5'-이미도디포스페이트를 증가시키면서 방사능을 감소시키면 융합 단백질에 대한 ATP 친화도의 측정치를 제공한다.
실시예 48: 본 발명의 알부민 융합 단백질과 상호작용하는 시그널 변환 단백 질의 동정
본 발명의 알부민 융합 단백질은 시그널 변환 경로 단백질 또는 수용체 단백질의 동정, 특징화 및 정제에 대한 연구 도구로서 작용할 수 있다. 간단하게는, 본 발명의 라벨링된 융합 단백질은 상호작용하는 분자를 정제하기 위한 시약으로서 유용하다. 친화도 정제의 한 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 크로마토그래피 칼럼에 공유적으로 결합시켰다. 추상의 표적 세포 예컨대, 암종 조직으로부터 유래된 세포-유리 추출물을 칼럼을 통과시키면, 적합한 친화도를 갖는 분자는 알부민 융합 단백질에 결합하였다. 단백질 착물을 칼럼으로부터 회수하고, 분해하고, 회수된 분자를 N-말단 단백질 시퀀싱하였다. 본 아미노산 서열을 사용하여 캡쳐링된 분자를 동정하거나, 적합한 cDNA 라이브러리로부터 관련 유전자를 클로닝하기 위한 변질된 올리고누클레오티드 프로브를 고안하는데 사용된다.
실시예 49: IL -6 생검정
본 발명의 알부민 융합 단백질의 증식 효과를 시험하는 다양한 검정법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 검정으로는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Marz et al . ( Prot . Natl . Acad . Sci ., U.S.A., 95:3251-56 (1998)]에 기술되어 있다. 37℃에서 68시간 후, 생존한 세포의 수를 테트라졸륨 염 티아졸릴 블루 (MTT)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. B9 세포를 SDS로 분해하고, 광학 밀도를 570nm에서 측정하였다. IL-6을 함유하는 대조군은 양성 대조군이며, 사이토카인을 함유하지 않는 대조군은 음성 대조군이다. 간단하게는, IL-6 의존성 B9 뮤린 세포를 IL-6 유리 배지로 3회 세척하고, 50㎕로 웰당 5,000 세포 농도로 플레이팅시키고, 50㎕의 본 발명의 융합 단백질을 첨가하고, 사용하였다. 음성 대조군과 관계있는 시험 샘플(들) (본 발명의 알부민 융합 단백질을 함유)에서 증진된 증식은 융합 단백질에 의해 매개된 증식 효과를 지시한다.
실시예 50: 닭 배아 뉴런 생존에 대한 유지.
교감 뉴런 세포의 생존능이 본 발명의 알부민 융합 단백질에 의해 유지되는 지를 시험하기 위해, 세날디 등의 닭 배아 뉴런 생존 검정을 사용할 수 있다(참조: Prot. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 96:11458-63 (1998), 본원에 참조로서 통합됨). 간략하게, 운동 및 교감 뉴런이 닭 배아로부터 분리되고 L15 배지(10% FCS, 글루코오스, 소듐 셀레니트, 프로게스테론, 콘알부민, 퓨트레신, 및 인슐린 함유; 라이프 테크놀로지스, 로크빌, MD) 및 둘베코의 변형된 이글스 배지(10% FCS, 글루타민, 페니실린, 및 25mM 헤페스 완충액(pH 7.2) 함유; 라이프 테크놀로지스, 로크빌, MD)에 각각 재현탁시키고, 사이토카인이 결핍된 음성 대조군 뿐만 아니라 여러 농도의 본 발명의 정제된 융합 단백질의 존재하에 5% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 3일 후에, 뉴런 생존능을 세포 형태의 평가 및 모스맨(참조: Mosmann, T., J. Immunol. Methods , 65:55-63 (1983))의 비색 검정을 사용하여 측정하였다. 사이토카인이 결핍된 대조군에 비하여 증강된 뉴런 세포 생존능은 알부민 융합 단백질이 뉴런 세포의 생존능을 증강시키는 능력을 나타낸다.
실시예 51: 포스파타아제 활성의 검정.
하기 검정은 본 발명의 알부민 융합 단백질의 세린/트레오닌 포스파타아제(PTP아제) 활성을 형가하기 위하여 사용될 수 있다.
세린/트레오닌 포스파타아제(PTP아제) 활성을 검정하기 위하여, 당업자에 널리 공지된 검정법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 세린/트레오닌 포스파타아제(PTP아제) 활성은 뉴 잉글랜드 바이오랩, 인크.사의 PSP아제 검정 키트를 사용하여 측정될 수 있고, PSP아제의 기질인 마이엘린 염기성 단백질(Myelin basic protein, MyBP)은 [32P]ATP의 존재하에 cAMP-의존성 단백질 키나아제로 세린 및 트레오닌 잔기상에서 인산화된다. 단백질 세린/트레오닌 포스파타아제 활성은 그 후에 32P-표지된 MyBP로부터 무기 인산염의 방출을 측정함에 의해 결정된다.
실시예 52: 세린/트레오닌 포스파타아제의 다른 단백질과의 상호작용
세린/트레오닌 포스파타아제 활성을 가지는 본 발명의 융합 단백질(즉, 실시예 51에서 결정된 것)은 예를 들어 추가의 상호작용 단백질 또는 수용체 단백질 또는 다른 시그날 트랜스덕션 경로 단백질의 확인, 특성 규명 및 정제를 위한 연구 수단으로서 유용하다. 간단하게, 본 발명의 표지된 융합 단백질은 이와 상호작용하는 분자의 정제를 위한 시약으로서 유용하다. 친화성 정제의 일 구체예에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 크로마토그래피 칼럼에 공유결합에 의해 커플링되어 있다. 추정되는 표적 세포, 예를 들어 뉴런 또는 간 세포로부터 유래된 세포-비함유 추출물은 칼럼을 통과하고 적절한 친화도를 가지는 분자는 융합 단백질에 결합한다. 융합 단백질-복합체가 칼럼으로부터 회수되고, 분리(dissociation)되어, 회수된 분자는 N-말단 단백질 시퀀싱을 거친다. 이러한 아미노산 서열은 그 후에 포획된 분자를 확인하거나 적절한 cDNA 라이브러리로부터 적합한 유전자를 클로닝하기 위한 축퇴성 올리고누클레오티드 프로브를 설계하기 위하여 사용된다.
실시예 53: 헤파라나아제 활성의 검정
본 발명의 알부민 융합 단백질의 헤파라나아제 활성을 검정하기 위하여 사용될 수 있는 많은 검정법이 공지되어 있다. 일례에서, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 헤페라나아제 활성은 블로다브스키 등의 의한 문헌 (Vlodavsky et al., Nat. Med., 5:793-802 (1999))에 기재된 바와 같이 검정된다. 간단하게, 세포 용해물, 컨디셔닝된 배지, 온전한 세포(35mm 디쉬 당 1 x 106 세포), 세포 배양 상청액, 또는 정제된 융합 단백질을 35S-표지된 ECM 또는 가용성 ECM 유래 피크 I 프로테오글리칸과 함께, pH 6.2-6.6, 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션 배지는 원심분리되고 상청액은 세파로오스 CL-6B 칼럼(0.9×30cm) 상에서 겔 여과에 의해 분석한다. 분획을 PBS로 용출하고 이들의 방사선활성을 측정한다. 헤파란 설페이트 측쇄의 분해(degradation) 단편은 세파로오스 6B로부터 0.5 < Kav < 0.8(피크 II)로 용출된다. 각 실험은 적어도 3회 수행된다. 블로다브스키 등에 의해 기술된 "피크 II"에 해당하는 분해 단편은 헤파린 설페이트를 절단하는데 있어 본 발명의 알부민 융합 단백질의 활성을 나타낸다.
실시예 54: 생분자의 고정화
본 실험은, 상기 기술된 다양한 작용 검정에서 본 발명의 융합 단백질의 연구를 위해 개조될 수 있는 비숙주 세포 지질 이중층 구조물에서 본 발명의 알부민 융합 단백질의 안정화 방법을 제공한다(참조: e.g., Bieri et al., Nature Biotech 17:1105-1108 (1999), 전체 내용이 본원에 참조로 통합됨). 간략하게, 바이오티닐화에 대한 탄수화물-특이적 화학이 본 발명의 알부민 융합 단백질에 바이오틴 태그를 가두어 고정화시 일정한 정위(orientation)을 가능하게 하기 위하여 사용된다. 세척된 막 중의 50mM의 본 발명의 알부민 융합 단백질 용액은 실온에서 한 시간 동안 20 mM NaI04 및 1.5 mg/ml (4mM) BACH 또는 2 mg/ml (7.5mM) 바이오틴-하이드라지드와 함께 인큐베이션된다(반응 부피, 150㎕). 다음에, 샘플을 5 시간 동안 먼저 4℃에서 투석하고(피어스 슬라이데알리저 카세트(Pierce Slidealizer Cassett), 10kDa 컷오프; 피어스 케미칼 코.(Pierce Chemical Co.,) 락포드 IL), 1 시간 마다 완충액을 교환하고, 최종적으로 500㎖ 완충액 R에 대해 12시간 동안 투석하였다(15 M NaCl, 1 mM MgCl2, 10 mM 인산 나트륨, pH7). 큐벳에 첨가하기 바로 직전에, 시료를 완충액 ROG50 (50 mM 옥틸글루코시드가 보강된 완충액 R) 중에 1:5로 희석한다.
실시예 55: 메탈로프로테나아제 활성에 대한 검정
메탈로프로테나아제는 촉매 매카니즘으로써 Zn2+와 같은 금속 이온을 사용하는 펩티드 가수분해효소이다. 본 발명의 알부민 융합 단백질의 메탈로프로타나아제 활성은 당업계에 공지된 방법에 따라 검정될 수 있다. 하기 예시되는 방법이 제공된다:
알파-2- 마크로글로불린의 단백질분해
프로테아제 활성을 확인하기 위하여, 본 발명의 정제된 융합 단백질을 1X 검정 완충액(50 mM HEPES, pH 7.5, 0.2 M NaCl, 10 mM CaCl2, 25 μM ZnCl2 및 0.05% Brij-35) 중에서 기질 알파-2-마크로글로불린(0.2유닛/㎖; 뵈링거 맨하임, 독일)과 혼합하고, 1 내지 5일 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 트립신이 양성 대조군으로서 사용되었다. 음성 대조군은 검정 완충액 중에 알파-2-마크로글로불린만을 함유한다. 시료를 수집하고 5분 동안 5% 2-머캡토에탄올을 함유하는 SDS-PAGE 시료 완충액 중에서 가열하고, 8% SDS-폴리아크릴아미이드 겔상에 로딩하였다. 전기영동 후에, 단백질을 은 염색에 의해 가시화하였다. 단백질 분해는 음성 대조군과 비교하여 낮은 분자량 배드의 출현으로 명백했다.
메탈로프로테나아제의 억제제에 의한 알파-2- 마크로글로불린의 억제
공지된 메탈로프로테나아제 억제제(금속 킬레이트(EDTA, EGTA, 및 HgCl2), 펩티드 메탈로프로테나아제 억제제(TIMP-1 및 TIMP-2), 및 상업용 소분자 MMP 억제제)가 또한 본 발명의 알부민 융합 단백질의 단백질분해 활성의 특징규명을 위하여 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 세개의 합성 MMP 억제제는 MMP 억제제 I[MMP-1 및 MMP-8에 대한 IC50 = 1.0 μM; MMP-9에 대한 IC50 = 30 μM; MMP-3에 대한 IC50= 150 μM]; MMP-3 (스트로멜리신-1) 억제제 I [MMP-3에 대한 IC50 = 5μM], 및 MMP-3 억제제 II [MMP-3에 대한 Ki= 130 nM]; 칼바이오켐을 통해 입수가능한 억제제, 각각 카탈로그 번호 444250, 444218, 및 444225)이다. 간략하게, 상이한 농도의 소분자 MMP 억제제를 22.9㎕의 1×HEPES 완충액(50mM HEPES, pH 7.5, 0.2M NaCl, 10mM CaCl2, 25μM ZnCl2, 및 0.05% Brij-35) 중에서 본 발명의 정제된 융합 단백질(50㎍/㎖)과 혼합하고, 2 시간 동안 실온(24℃)에서 인큐베이션하고, 그 후에 7.1㎕의 기질 알파-2-마크로글로불린(0.2유닛/㎖)을 첨가하고 20 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 반응을 4×시료 완충액을 첨가하여 중단시키고 즉시 5분 동안 끓였다. SDS-PAGE 후에, 단백질 밴드를 은 염색에 의해 가시화하였다.
합성 형광발생 펩티드 기질 절단 검정
증명된 메탈로프로테나아제 활성과의 본 발명의 융합 단백질에 대한 기질 특이성을 합성 형광발생 펩티드 기질(BACHEM 바이오사이언스 인크.사로부터 구입)을 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 결정하였다. 시험 기질은 M-1985, M-2225, M-2105, M-2110, 및 M-2255을 포함한다. 처음 네개는 MMP 기질이고 마지막 것은 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 전환 효소(TACE)의 기질이다. 이들 기질은 바람직하게는 1:1 디메틸 설폭시드(DMSO) 및 물 중에서 제조되었다. 저장 용액(stock solution)은 50-500μM이었다. 형광발생 검정을 항온 수욕이 장착된 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) LS 50B 발광 스펙트로미터를 사용하여 수행하였다. 조사 λ는 328nm이고 발산 λ는 393nm였다. 간략하게, 검정을 176㎕ 1×HEPES 완충액(0.2 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Brij-35 및 50 mM HEPES, pH 7.5)을 4㎕의 기질 용액(50μM)으로 15분 동안 25℃에서 인큐베이션하고, 그 후에 20㎕의 본 발명이 정제된 융합 단백질을 검정 큐벳에 첨가함에 의해 수행하였다. 기질의 최종 농도는 1μM이었다. 초기 가수분해율을 30분 동안 모니터링하였다.
실시예 56: NOD 마우스에서의 당뇨병 발생
암컷 NOD(비비만성 당뇨) 마우스는, 질병이 수컷 NOD 마우스에서보다 암컷 NOD 마우스에서 더 두드러짐에도 불구하고, 인간에서 발견되는 것과 유사한 과정으로 IDDM을 보인다는 것을 특징으로 한다. 이후에는 다르게 기술하지 않는한, 용어 "NOD 마우스"는 암컷 NOD 마우스를 언급한다. NOD 마우스는 만성 자가면역 질환에 의해 유발되는 베타 세포의 점진적인 파괴를 가진다. 따라서, NOD 마우스는 유글리세미아(euglycemia) 또는 정상 혈당 수준으로 삶을 시작한다. 그러나, 약 15 내지 16주령까지 NOD 마우스는 이들의 췌장 베타 세포의 대부분의 파괴와 대응하여 췌장이 충분한 인슐린을 생성할 수 없다는 것을 나타내는 고혈당증이 되기 시작한다. 따라서, 질병의 원인과 진행이 인간 IDDM 환자와 유사한다.
면역화 방법의 효능에 대한 생체내 검정은 암컷 NOD/LtJ 마우스(바 하버, 메인에 위치한 잭슨 래버러토리사로부터 구입가능함)에서 평가될 수 있다. 문헌에서, 80%의 암컷 마우스는 24주령까지 당뇨병이 발병되고, 인슐린염이 6 내지 8주령 사이에 시작되다고 보고되었다. NOD 마우스는 동종번식하며 다양한 면역조절 전략에 큰 반응성을 보인다. 성체 NOD 마우스(6 내지 8주령)은 20 내지 25g의 평균 질량을 가진다.
이러한 마우스들은 처리되지 않거나(대조군), 본 발명의 치료제(즉, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 이들의 단편 및 변이체) 단독으로 또는 상기 기술된 다른 치료 화합물과 조합하여 치료될 수 있다. 당뇨병의 진행에 대한 이러한 다양한 치료 효과는 하기와 같이 측정될 수 있다:
14주령에서, 암컷 NOD 마우스는 내당능에 따른 표현형을 가질 수 있다. 내당능은 복강내 내당능 시험(IPGTT)으로 측정될 수 있다. 간략하게, 혈액을 글루코오스의 복강내 주사(1g/kg 체중량) 후 0분 및 60분에 안와주변 망(paraorbital plexus)으로부터 채취한다. 정상적인 내성은 0분에 144㎎% 미만의 혈장 글루코오스 또는 60분에 160㎎% 미만의 혈장 글루코오스로서 정의된다. 혈중 글루코오스 수준은 글루코미터 엘리트 장치로 결정된다.
이러한 표현형 분석에 기초하여, 동물을 상이한 실험 군에 할당할 수 있다. 특히, 보다 상승된 혈중 글루코오스 수준을 가지는 동물을 내당능 손상 군에 할당될 수 있다. 마우스에게 임의로 사료를 공급하고 산성수(pH 2.3)를 공급할 수 있다.
당 내성 및 불내성 마우스는 대조군, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 알부민 융합 단백질/치료 화합물 조합 그룹으로 추가로 나누어질 수 있다. 대조군에서 마우스에게 주당 6회로 매일 비히클이 주사될 수 있다. 알부민 융합 그룹의 마우스에는 주당 6회로 매일 비히클 중의 본 발명의 치료제(즉, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 이의 단편 및 변이체)가 주사될 수 있다. 알부민 융합 단백질/치료 화합물 조합 그룹의 마우스는 알부민 융합 단백질 및 상기 기술한 바와 같은 치료 화합물의 조합 둘 모두를 투여받았다.
NOD 마우스의 뇨중 글루코오스의 수준은 랩스틱스(Labstix)(바이에르 디아그노스틱스, 햄프셔, 잉글랜드)를 사용하여 격주로 결정할 수 있다. 중량 및 용액 섭취 또한 격주 기준으로 결정될 수 있다. 당뇨병의 발생은 2회의 연속적인 측정시 당뇨 발생 후에 명백해진다. 10주 치료 후에, 추가의 IPGTT를 수행할 수 있고 동물은 그 다음날 살생될 수 있다.
10주 동안의 치료 동안, 당 내성 그룹 및 당 불내성 그룹 둘 모두의 대조 동물은 각각 60% 및 86%의 비율로 당뇨병을 발병하였다(미국 특허 제5,866,546호, 그로스 등). 이와 같이, 높은 비율의 당뇨병이 간섭이 없었다면 처음에 당 내성인 NOD 마우스에서 조차 발생할 수 있다.
그 결과는 치료 전 및 후에 NOD 마우스에서 혈중 글루코오스 수준의 측정으로 확인될 수 있다. 혈중 글루코오수 수준은 기재된 모든 그룹의 당 내성 및 불내성 마우스 둘 모두에서 상기 기술된 바와 같이 측정된다.
대안적인 구체예에서, 본 발명의 치료제(즉, 서열 번호: Y로서 개지된 특이적 융합체, 및 이의 단편 및 변이체)는 스펙트로미터 분석을 사용하여 정량될 수 있고, 적절한 단백질 양이 용량 당 50 .mu.l. 인산염 완충 염수(PBS)로 주사 전에 현탁될 수 있다. 일주일 간격으로 2회의 주사가 각 마우스의 등 피부 아래의 경피로 투여될 수 있다. 모니터링을 면역화 전에 별도 2회에 수행할 수 있고, 치료 동안 및 그 후 계속 매주 수행할 수 있다. 소변을 매주 당에 대해 시험하고(Keto-Diastix.RTM.; Miles Inc., Kankakee, Ill.) 당뇨 마우스를 혈청 당에 대해 체크할 수 있다(ExacTech.RTM., MediSense, Inc., Waltham, Mass.). 공복시 혈당증이 2.5g/L 보다 큰 경우에 당뇨병이 진단된다.
실시예 57: NOD 마우스의 조직학적 검사
NOD 마우스로부터의 조직 시료의 조직학적 검사는 본 발명의 조성물 및/또는 본발명의 조성물과 다른 당뇨병 치료제의 조합물의 췌장에서 베타 세포의 상대 농도를 증가시키는 능력을 증명할 수 있다.
실시예 56으로부터의 마우스를 치료 기간이 끝난 후에 살생시킬 수 있고 조직 시료를 췌장으로부터 취할 수 있다 시료를 0.9% 염수 중의 10% 포르말린 중에 고정하고 왁스에 함침시킬 수 있다. 5개의 연속된 5 .mu.m 절편 두 세트를 150 .mu.m의 절단 간격으로 면역표지를 위해 절단할 수 있다. 절편을 인슐린(기니아 피그 항-인슐린 항혈청 희석율 1:1000, ICN 테임즈(Thames) U.K.) 및 글루카곤 (토끼 항-췌장 글루카곤 항혈청 희석율 1:2000)에 대해 면역표지하고 페록시다아제 컨쥬게이션된 항기니아 피그(다코, 하이위컴, U.K.) 또는 페록시다아제 컨쥬게이션된 항-토끼 항혈청(희석율 1:50, 다코)로 검출하였다.
본 발명의 조성물은 당 내성 및 당 불내성 동물에서 당뇨병의 임상적 발현에 대한 것처럼 베타 세포의 가시적 질량에 대한 강한 효과를 가지거나 가지지 않을 수 있다.
실시예 58: NIDDM 의 생체내 마우스 모델
잭슨 래버러토리사(바 하버, ME)로부터의 수컷 C57BL/6J 마우스는 3주령에 얻을 수 있고 통상적인 음식 또는 지방(35.5% wt/wt; Bioserv.Frenchtown, NJ) 또는 프룩토오스 (60% wt/wt; Harlan Teklad, Madison, WI) 중에 농축된 식이를 먹일 수 있다. 정규 음식은 4.5% wt/wt 지방, 23% wt/wt 단백질, 31.9% wt/wt 전분, 3.7% wt/wt 프룩토오스, 및 5.3% wt/wt 섬유로 구성된다. 고지방(라드(lard)) 식이는 35.5% wt/wt 지방, 20% wt/wt 단백질, 36.4% wt/wt 전분, 0.0% wt/wt 프룩토오스, 및 0.1% wt/wt 섬유로 구성된다. 고 프룩토오스 식이는 5% wt/wt 지방, 20% wt/wt 단백질, 0.0% wt/wt 전분, 60% wt/wt 프룩토오스, 및 9.4% wt/wt 섬유로 구성된다. 마우스를 12시간 광(오전 6시에서 오후 6시)/암 사이클로 22°+/-3℃ 온도 및 50% +/-20% 습도 조절실에서 케이지 당 5마리 이하로 수용할 수 있다(Luo et al., 1998, Metabolism 47(6): 663-8, "Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetes mellitus"; Larsen et al., Diabetes 50(11): 2530-9 (2001), "Systemic administration of the long-acting GLP-1 derivative NN2211 induces lasting and reversible weight loss in both normal and obese rats").
3주 동안 각 식이에 대해 노출한 후에, 마우스에 100 mg/kg 체중량의 스트렙토조토신, "STZ"(시그마, 세인트루이스, MO) 또는 비히클(0.05 mol/L 시트르산, pH 4.5)으로 복강내 주사하고 다음 4주 동안 동일한 식이를 먹였다. 비공복 상태 하에서, 혈액을 꼬리의 말단을 잘라내어 STZ 후 1주, 2주, 및 4주에 수득한다. 시료를 사용하여 비공복시 혈장 글루코오스 및 인슐린 농도를 측정하는게 사용된다. 체중량 및 음식 섭취를 매주 기록한다.
글루코오스 제거를 자극하는 인슐린의 능력에 대한 고지방 식이의 효과를 직접 결정하기 위하여, 실험을 상기 기술된 7주 기간이 끝나고 STZ로 주사된 지방-식이된 마우스, 비히클이 주사된 지방-식이된 마우스, 및 지방 식이된 마우스의 세 그룹에서 시작할 수 있다. 제 1 시리즈의 실험에서, 마우스를 메톡시플루란(피트맨-무어(Pitman-Moor), Mundelein, IL) 흡입으로 마취시킨다. 보통 인슐린(시그마)을 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 마우스에 주사할 수 있고([IV] 0.1 U/kg 체중량), 혈액을 상이한 꼬리 정맥으로부터 주사 후 3분, 6분, 9분, 12분, 및 15분에 수집할 수 있다. 혈장 글루코오스 농도를 이러한 시료에 대해 결정할 수 있고, 혈장으로부터 글루코오스 소실의 반감기(t1/2)가 윈논린(WinNonlin)(사이언티픽 컨설팅, Apex, NC), 약동학/약력학 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다.
제 2 시리즈의 실험에서, 마우스를 복강내 소듐 펜토바비탈(시그마)로 마취할 수 있다. 복강을 열고, 주요 복강 정맥을 노출시키고 24-게이지 IV 카테터(존슨-존슨 메디칼, 알링턴, TX)를 꽂는다. 카테터를 복강내 정맥에 인접한 근 조직에 고정하고 시린지 연결부의 바닥에서 절단하고, 미리 충전된 PE50 플라스틱 튜브에 훅으로 채우고, 이 튜브는 다시 주입 용액을 가진 시린지에 연결된다. 복강은 다음에 봉합 폐쇄된다. 이러한 방법으로, 몸체의 낮은 부분으로부터 혈액의 역류의 차단물이 없을 것이다 마우스를 10㎕/분의 주입 부피로 글루코오스(24.1㎎/㎏/분) 및 인슐린(10mU/㎏/분)를 연속적으로 주입할 수 있다. 안와후방의 혈액 시료(각각 70㎕)를 혈장 글루코오스 및 인슐린 농도의 측정을 위해 주입 시작 후 90분, 105분, 120분 및 135분에 취할 수 있다. 이러한 4개의 시료의 평균을 각 동물에 대한 정상 상태(steady-state) 혈장 글루코오스(SSPG) 및 인슐린(SSPI) 농도를 산출하기 위해 사용한다.
최종적으로, 단독의, 또는 진성 당뇨병의 치료를 위해 나열된 치료제 중 하나 이상과 조합된 본 출원의 치료적 조성물, 알부민 융합 단백질의 혈장 글루코오스를 감소시킬 수 있는 능력을 평가하기 위한 실험을 STZ-주입된 "NIDDM" 마우스 모델의 하기 두 그룹에서 수행할 수 있다: (1) 지방-식이된 C57BL/6J, 및 (2) 프룩토오스-식이된 C57BL/6J. 이러한 연구를 위하여 마우스의 혈장 글루코오스 농도는 255 내지 555 ㎎/dL의 범위일 수 있다. 마우스를 비히클, 본 발명의 알부민 융합 치료제 단독 또는 진성 당뇨병의 치료를 위해 나열된 치료제 중 하나 이상과 조합된 본 발명의 알부민 융합 치료제를 이용한 치료에 무작위로 할당한다. 총 3회 용량이 투여될 수 있다. 꼬리 정맥 혈액 시료는 제 1 투여 전 및 최종 투여 후 3시간째의 혈장 글루코오스 농도의 측정을 위해 채취할 수 있다.
혈장 글루코오스 농도는 시그마사의 글루코오스 다이어그노시틱 키트(Sigma No. 315), 효소 발색 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 혈장 인슐린 수준은 린코 리서치(#RI-13K; 세인트 찰스, MO)사의 래트 인슐린 RIA 키트를 사용하여 결정할 수 있다.
실시예 59: 인슐린 작용에의 관련성을 확립하는 시험관내 H4Ile - SEAP 리포터 검정
다양한 H411e 리포터
H411e / rMEP - SEAP: 래트로부터 분리된 말산 효소 프로모터(rMEP)는 인슐린 경로에 있는 PPAR-감마 요소를 함유한다. 이 리포터 구성물은 안정되게 간 H4Ile 세포주로 트랜스펙션된다.
H4IIe / SREBP - SEAP: 스테롤 조절성 요소 결합 단백질((SREBP-1c)은 많은 인슐린-반응성 유전자, 예를 들어 지방산 합성효소(FAS)에 작용하며 섬유아세포, 지방세포, 및 간세포에서 지방산 대사에서 키 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자이다. 지방세포 결정 및 분화 인자 I(ADD-I)으로도 알려진 SREBP-1c은 지방 세포에서 유전자 발현에 대한 인슐린 효과의 1차 매개체로서 간주된다. 이의 활성은 인슐린, 스테롤, 및 글루코오스의 수준에 의해 조절된다. 이 리포터 구조물은 안정되게 H4Ile 세포주로 트랜스펙션된다.
H4IIe / FAS - SEAP: 지방산 합성효소 리포터 구성물은 최소의 SREBP-반응성 FAS 프로모터를 함유한다. 이 리포터 구조물은 안정되게 간 H4Ile 세포주로 트랜스펙션된다.
H411e / PEPCK - SEAP: 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PEPCK) 프로모터는 PEPCK 유전자 전사 조절 PEPCK 활성의 호르몬 조절의 제 1 위치이다. PEPCK는 간 글루코오스신생합성(gluconeogenesis)에서 개입 및 속도-제한 단계를 촉매하고 따라서 혈당 수준을 정상 범위 내로 유지하기 위하여 조심스럽게 조절되어야 한다. 이 리포터 구성물은 안정되게 간 H4Ile 세포주로 트랜스펙션된다.
이러한 리포터 구성물은 또한 3T3-L1 섬유아세포 및 L6 근아세포로 안정되게 트랜스펙션될 수 있다. 이러한 안정한 세포주는 다음에 앞서 실시예 13에서 기술된 바와 같은 3T3-L1 지방세포 및 L6 근관(myotube)으로 분화된다. 분화된 세포주는 다음에 하기 기술되는 SEAP 검정에서 사용될 수 있다.
증식 및 검정 배지
증식 배지는 10% 우태아 혈청(FBS), 10% 송아지 혈청, 1% NEAA, 1×페니실린/스트렙토마이신 및 0.75㎎/㎖ G418(H4IIe/rFAS-SEAP 및 H4Ite/SREBP-SEAP의 경우) 또는 0.50 mg/mL G418 (H4IIe/rMEP-SEAP의 경우)을 포함한다. H411e/PEPCK-SEAP의 경우에, 증식 배지는 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 15mM HEPES 완충 염수, 및 0.50 mg/㎖ G418로 구성된다.
검정 배지는 H4IIe/rFAS-SEAP, H4IIe/SREBP-SEAP, H41Ie/rMEP-SEAP 리포터의 경우에 저함량 글루코오스 DMEM 배지(라이프 테크놀로지), 1% NEAA, 1×페니실린/스트렙토마이신으로 구성된다. H4IIe/PEPCK-SEAP 리포터에 대한 검정 배지는 0.1% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 15mM HEPES 완충 염수로 구성된다.
방법
96-웰 플레이트에 대수 성장 단계의 세포가 부착될 때까지 100㎕/웰의 증식 배지에서 75,000 세포/웰로 시딩한다. 증식 배지를 검정 배지(200㎕/웰)로 교환하여 세포를 48시간 동안 기아상태로 한다. (H4IIe/PEPCK-SEAP 세포의 경우, 0.5μM 덱사메타손을 함유하는 검정 배지를 100㎕/웰로 첨가하고 약 20 시간 동안 인큐베이션한다). 검정 배지를 그 후에 신선한 검정 배지 100㎕/웰로 교환하고, 본 발명의 치료제(즉, 본 발명의 알부민 융합 단백질 및 이들의 단편 및 변이체)를 발현하는 트랜스펙션된 세포주로부터 수득된 세포 상청액의 50㎕ 분취량을 웰에 첨가한다. 빈(empty) 벡터가 트랜스펙션된 세포주로부터의 상청액을 음성 대조군으로 사용한다. 웰에 10nM 및/또는 100nM가 첨가된 것을 양성 대조군으로 사용한다. 48시간 인큐베이션 후에, 컨디셔닝된 배지를 회수하고 SEAP 활성을 측정한다(포스파-라이트(Phospha-Light) 시스템 프로토콜, 트로픽스 #BP2500). 간략하게, 시료를 희석 완충액 중에 1:4로 희석하고 30분 동안 65℃에서 인큐베이션하여 SEAP의 내인성 비태반성 형태를 불활성화한다. 희석된 시료의 50㎕ 분취량을 비태반성 SEAP 동질효소(isoenzyme)에 대하여 활성인 억제제의 혼합물을 함유하는 50㎕의 SEAP 검정 완충액과 혼합하고 추가 5분 동안 인큐베이션한다. 에머랄드 발광 증강제 중에 1:20으로 희석된 CSPD 화학발광 기질의 50㎕ 분취량을 혼합물에 첨가하고 15 내지 20분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 다이넥스(Dynex) 플레이트 발광분석기에서 판독한다.
실시예 60: 형질전환 동물
본 발명의 알부민 융합 단백질은 또한 형질전환 동물에서 발현될 수 있다. 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 돼지, 마이크로-피그, 염소, 양, 젖소, 및 비인간 영장류, 즉, 개코원숭이, 원숭이 및 침팬치를 비제한적으로 포함하는 임의의 종의 동물이 형질전환 동물을 생성하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 기술 또는 당업계에 공지된 기술은 유전자 치료 프로토콜의 일부로서 인간에서 본 발명의 융합 단백질을 발현하는데 사용된다.
당업계에 공지된 임의의 기술이 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 동물에 도입하여 형질전환 동물의 설립 주(founder line)을 생성한다. 이러한 기술은 전핵 미세주입(pronuclear microinjection)(Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-698 (1994); Carver et al., Biotechnology (NY) 11:1263-1270 (1993); Wright et al., Biotechnology (NY) 9:830-834 (1991); 및 Hoppe et al., U.S. Pat. No. 4,873,191 (1989)); 생식세포주, 배반포 또는 배아 세포주로의 레트로바이러스 매개 유전자 이전(Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 (1985)); 배아 줄기 세포에서의 유전자 표적화(Thompson et al., Cell 56:313-321 (1989)); 세포 또는 배아의 일렉트로포레이션(Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983)); 유전자 총을 사용하는 본 발명의 폴리누클레오티드의 도입(참조: e.g., Ulmer et al., Science 259:1745 (1993)); 배아 조혈모세포로 핵산 구조물을 도입하고 이 세포를 다시 배반포로 전이시키는 방법; 및 정자-매개 유전자 전이법 (Lavitrano et al., Cell 57:717-723 (1989) 등을 비제한적으로 포함한다(상기 문헌은 전체가 본원에 참조로 통합됨). 이러한 기술의 검토를 위해, 문헌[Gordon, "Transgenic Animals," Intl. Rev. Cytol. 115:171-229 (1989)]을 참조할 것이고, 이는 전체가 본원에 참조로 통합된다.
당업계에 공지된 임의의 기술은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 함유하는 형질전환 클론을 생성하는데 사용될 수 있고, 예를 들어 휴면 상태(quiescence)로 유도된 배양된 배아, 태아 또는 성체 세포로부터 핵의 핵이 제거된 난모세포로의 핵 전이가 있다(Campell et al., Nature 380:64-66 (1996); Wilmut et al., Nature 385:810-813 (1997)).
본 발명은 모든 세포에 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 가지는 형질전환 동물 뿐만 아니라 모든 또는 일부 세포에 이러한 폴리누클레오티드를 가진 동물, 즉 모자이크 동물 또는 키메라를 제공한다. 형질전환유전자(transgene)은 또한 하기, 예를 들어 라스코 등의 교시내용((Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 (1992))에 의해 특정 세포 타입으로 선택적으로 도입되고 활성화될 수 있다. 이러한 세포 타입 특이적 활성화를 위해 필요한 조절 서열은 관심대상의 특정 세포 타입에 따라 다를 것이고, 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명의 융합 단백질이 돈 발명의 융합 단백질의 치료 단백질 부분 또는 알부민 부분에 대응하는 내인성 유전자의 염색체 영역으로 인테그레이션되는 것이 바람직한 경우에, 유전자 표적화가 바람직하다. 간략하게, 이러한 기술이 활용되는 경우에, 내인성 유전자에 상동적인 일부 누클레오티드 서열을 함유하는 벡터는 염색체 서열과의 상동성 재조합을 통해 인테그레이션되어 내인성 유전자의 누클레오티드 서열의 기능을 파괴할 목적으로 설계된다. 형질전환유전자는 또한 특정 세포 타입에 선택적을 도입되어, 내인성 유전자가 하기, 예를 들어 구 등의 교시 내용(Gu et al., Science 265:103-106 (1994))에 의해 그 세포 타입에서만 내인성 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 이러한 세포 타입에 특이적인 불활성화에 필요한 조절 서열은 관심대상인 특정 세포 타입에 따라 다를 것이고, 당업자에 명확할 것이다.
일단 형질전환 동물이 생성되는 경우에, 재조합 유전자의 발현을 표준 기술을 사용하여 검정할 수 있다. 초기 스크리닝은 서던 블랏 분석 또는 PCR 기술에 의해 수행되어 동물 조직을 분석하고 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 인테그레이션이 일어났음을 증명할 수 있다. 형질전환 동물의 조직에서 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 mRNA 발현 수준은 또한 동물로부터 수득된 조직 시료의 노던 블랏 분석, 인 시튜 하이브리드화 분석, 및 역전사효소-PCR(rt-PCR)를 비제한적으로 포함하는 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 융합 단백질-발현 조직의 시료는 또한 용합 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 면역세포화학적으로 또는 면역조직화학적으로 평가될 수 있다.
*일단 수립 동물이 생성되면, 이들은 특정 동물의 콜로니를 생성하기 위하여 교배, 동종교배, 이종교배 또는 잡종교배될 수 있다. 이러한 교배 전략의 예로는 별도의 주(line)을 확립하기 위하여 하나 이상의 인테그레이션 위치를 가지는 수립 동물의 이종교배; 각 형질전환유전자의 추가 발현의 효과 때문에 보다 높은 수준으로 형질전환유전자를 발현하는 화합물 형질전환체를 생성하기 위한 별도 주의 동종교배; DNA 분석에 의해 동물의 스크리닝을 위한 필요를 제거하고 발현을 감소시키기 위하여, 소정의 인테그레이션 위치에 대한 동질접합체 동물을 생성하는 이종접합체 형질전환동물의 교배; 및 관심대상 실험 모델에 적합한 뚜렷한 배경상에 형질전환유전자(즉, 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드)를 위치시키기 위한 교배를 비제한적으로 포함한다. 본 발명의 형질전환동물은 본 발명의 융합 단백질 및 치료 단백질 및/또는 본 발명의 융합 단백질의 알부민 성분의 생물학적 기능을 연구하고, 비정상 발현과 관련된 질환 및/또는 질병을 연구하고, 이러한 질환 및/또는 질병을 개선하는데 효과적인 화합물을 스크리닝하는데 유용한 동물 모델 시스템을 비제한적으로 포함하는 용도를 가진다.
실시예 61: 유전자 치료법을 사용하는 치료 방법- 생체외
유전자 치료법의 한 방법은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 발현하는 섬유아세포를 환자에 이식한다. 일반적으로, 섬유아세포는 피부 생검에 의해 피검체로부터 수득된다. 얻어진 조직은 조직-배양 배지에 놓여지고 작은 조각으로 분리된다. 작은 덩어리의 조직은 조직 배양 플라스크의 젖은 표면에 놓여지고, 대략 10개 조각이 각 플라스크에 놓여진다. 플라스크를 거꾸로 놓고, 꼭 닫고, 밤새 실온에 둔다. 실온에서 24시간 후에, 플라스크를 거꾸로 하고 조직 덩어리는 플라스크 바닥에 고정된 채로 있고 신선한 배지(10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신 함유 햄(Ham)의 F12 배지)를 첨가한다. 다음에, 플라스크를 약 1 주일 동안 37℃로 인큐베이션한다.
이번에는, 신선한 배지를 첨가하고 후속하여 수일마다 변경한다. 배양액에서 추가 2주 후에, 단일층의 섬유아세포가 나타난다. 단일층은 트립신처리되고 보다 큰 플라스크로 규모가 조정된다.
몰로니(Moloney) 설치류 사르코마 바이러스의 긴 말단 반복부에 의해 플랭킹(flanking)된 pMV-7(Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988))를 EcoRI 및 HindIII로 소화하고 후속하여 송아지 장내 포스파타아제로 처리한다. 선형 백터를 아가로스 겔 상에 분별시키고 유리 비드를 사용하여 정제한다.
본 발명의 알부민 용합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 필요하다면 5' 및 3' 말단 서열에 대응하고 임의로 적절한 제한 위치 및 개시/정지 코돈을 가지는 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 바람직하게는, 5' 프라이머는 EcoRI 위치를 함유하고, 3' 프라이머는 HindIII 위치를 포함한다. 동일한 양의 콜로니 설치류 사르코마 바이러스 선형 백본(backbone) 및 증폭된 EcoRI 및 HindIII 단편을 T4 DNA 리가아제의 존재하에 함께 첨가한다. 생성된 혼합물을 두개의 단편의 라이게이션을 위해 적절한 조건하에서 유지한다. 다음에, 라이게이션 혼합물을 박테리아 HB101를 형질전환하는데 사용되고, 그 후에 벡터가 적절하게 삽입된 대상 유전자를 가지는 지를 확인하기 위하여 카나마이신을 함유하는 아가 상에 플레이팅한다.
양친화성 pA317 또는 GP+am12 팩키징 세포를 조직 배양물 중에 증식시켜 10% 송아지 혈청(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 두벨코의 개질된 이글스 배지(DEME)에서 밀도가 컨플루언스(confluence)를 이루도록 한다. 유전자를 함유하는 MSV 벡터는 다음에 배지에 첨가되고 팩키징 세포는 벡터로 형질도입된다. 팩키징 세포는 이제 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생성한다(펙키징 세포는 이제 생성자 세포라 칭한다).
신선한 배지를 형질도입된 생성자 세포에 첨가하고, 후속하여 배지를 컨플루언스를 형성한 생성자 세포의 10cm 플레이트로부터 수집한다. 감염성 바이러스 입자를 함유한 사용된 배지를 밀리포어 필터를 통해 여과하여 떼어진 생성자 세포를 제거하고 이 배지를 다음에 섬유아세포를 감염시키기 위해 사용한다. 배지를 섬유아세포의 서브-컨플루언스를 형성한 플레이트로부터 제거하고 신속히 생성자 세포로부터의 배지와 교환한다. 이 배지는 제거되고 신선한 배지로 교환된다. 바이러스 역가가 높은 경우에, 실질적으로 모든 섬유아세포는 감염될 것이고 선별이 필요하지 않다. 역가가 낮은 경우에, neo 또는 his와 같은 선별 마커를 가진 레트로바이러스 벡터를 사용할 필요가 있다. 섬유아세포가 효율적으로 감염되면, 섬유아세포를 분석하여 알부민 융합 단백질이 생성되는지를 결정한다.
다음에 조작된 섬유아세포를 단독으로 또는 사이토덱스 2 마이크로케리어 비드상에서 컨플루언스를 이루도록 증식시킨 후에 숙주에 이식한다.
실시예 62: 유전자 치료법을 사용하는 치료 방법- 생체내
본 발명의 또 다른 측면은 장애, 질병, 및 질환을 치료하기 위하여 생체내 유전자 치료 방법을 사용하는 것이다. 유전자 치료 방법은 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 네이키드(naked) 핵산(DNA, RNA, 및 안티센스 DNA 또는 RNA) 서열의 도입에 관한 것이다. 본 발명의 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 표적 조직에 의한 폴리펩티드 발현을 위하여 필요한 프로모터 또는 임의의 다른 유전 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다(즉, 결합될 수 있다). 이러한 유전자 치료 및 전달 기술 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[W090/11092, WO98/11779; U.S. Patent NO. 5693622, 5705151, 5580859; Tabata et al., Cardiovasc. Res. 35(3):470-479 (1997); Chao et al., Pharmacol. Res. 35(6):517-522 (1997); Wolff, Neuromuscul. Disord. 7(5):314-318 (1997); Schwartz et al., Gene Ther. 3(5):405-411 (1996); Tsurumi et al., Circulation 94(12):3281-3290 (1996)](본원에 참조로 통합됨)을 참조할 수 있다.
폴리누클레오티드 구조물은 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간, 장 등)의 세포간 공간으로의 주사와 같은 동물의 세포에 주사가능한 물질을 전달하는 임의의 방법에 의해 전달될 수 있다. 폴리누클레오티드 구조물을 약제학적으로 허용되는 액체 또는 수성 담체로 전달될 수 있다.
용어 "네이키드" 폴리쿠늘레오티드, DNA 또는 RNA는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제형, 리포펙틴 또는 침전제 등을 포함하여 세포로 들어가는 것을 돕거나, 증강시키거나 용이하게 하는데 작용하는 임의의 전달 비히클로부터 자유로운 서열을 의미한다. 그러나, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 리포좀 제형(예를 들어 문헌[Feigner P.L. et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:126-139 and Abdallah B. et al. (1995) Biol. Cell 85(1):1-7]에 교시된 바와 같은 것들)으로 전달되고 상기 리포좀 제형은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
유전자 치료 방법에 사용되는 폴리누클레오티드 벡터 구조물은 바람직하게는 숙주 게놈에 인테그레이션되지 않고 복제를 허용하는 서열을 함유하지 않는 구조물이다. 당업계에 공지된 임의의 강한 프로모터는 DNA의 발현을 추진시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 유전자 치료 방법과 달리, 표적 세포에 네이키드 핵산 서열을 도입하는 하나의 주요한 이점은 세포에서 폴리누클레오티드 합성의 일시적인 특성이다. 연구에 따르면 비복제 DNA 서열은 세포에 도입되어 6개월 이하의 기간동안 요망되는 폴리펩티드의 생성을 제공할 수 있다.
폴리누클레오티드 구조물은 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 쓸개, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 분비기관(gland), 및 연결 조직을 포함하는 동물 내의 조직의 세포간 공간으로 전달될 수 있다. 조직의 세포간 공간은 세포간 액체, 기간 조직의 망상 섬유 중의 뮤코다당류, 혈관 또는 소실 벽의 탄성 섬유, 섬유 조직의 콜라겐 섬유, 또는 연결조직 인쉬팅(ensheathing) 근육 세포 내 또는 뼈의 소와 중의 그러한 동일한 매트릭스를 포함한다. 근육 조직의 세포간 공간으로의 전달은 하기 논의되는 이유로 바람직하다. 이들은 이러한 세포를 포함하는 조직으로 주사에 의해 편리하게 전달될 수 있다. 이들은 바람직하게는, 전달 및 발현이 비분화되거나 완전히 분화되지 않은 세포, 예를 들어 혈액 또는 피부 섬유아세포의 줄기 세포에서 달성될 수 있을지라도, 분화되는 지속적이고 분열되지 않는 세포로 전달되고 발현된다. 생체내 근육 세포는 특히 폴리누클레오티드를 흡수하고 발현하는 능력을 가진다.
네이키드 폴리누클레오티드 주사를 위하여, DNA 또는 RNA의 효과적인 투여량은 약 0.5g/kg 체중량 내지 약 50mg/kg 체중량의 범위내일 것이다. 바람직하게는, 용량을 약 0.005㎎/kg 내지 약 20㎎/kg 일 것이고, 보다 바람직하게는 약 0.05㎎/kg 내지 약 5㎎/kg일 것이다. 물론, 당업자로서 유용한 용량이 조직 주사 위치에 따라 다양할 수 있을 것이라는 것을 인정할 것이다. 적절하고 효과적인 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 치료되는 질환 및 투여 경로에 따라 다를 수 있다. 바람직한 투여 경로는 조직의 세포간 공간으로 주사의 비경구 투여에 의한다. 그러나, 다른 비경구 경로는 또한 예를 들어 특히 폐 또는 기관지 조직, 목, 또는 코의 점막으로의 전달을 위한 에어로졸 제형의 흡입이 사용될 수 있다. 또한, 네이키드 폴리누클레오티드 구성물이 방법에 사용된 카테터에 의해 혈관형성술 동안 동맥에 전달될 수 있다.
생체내 근육에서 주사된 폴리누클레오티드의 용량 반응 효과는 다음과 같이 결정된다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 생성을 위한 적절한 주형 DNA는 표준 재조합 DNA 방법에 따라 제조된다. 환형이거나 선형일 수 있는 주형 DNA는 네이키드 DNA로서 또는 리포솜과 복합체를 이루어 사용된다. 다음에, 사두근(quadriceps muscle)에 다양한 양의 주형 DNA를 주사한다.
5 내지 6주령의 수컷 및 암컷 Balb/C 마우스를 0.3㎖의 2.5% 애버틴(Avertin)으로 복강내 주사하여 마취한다. 전방 넓적 다리상에 1.5cm 절개하여 사두군이 직접 보이도록 한다. 주형 DNA를, 근육의 원위 삽입 영역으로부터 무릎으로 약 0.5cm 및 약 0.2cm 깊이로, 1분에 걸쳐 27 게이지 바늘을 통해 1cc 시린지로 0.1㎖ 담체중에서 주사한다. 이후 위치 측정을 위해 봉합실을 주사 부위에 놓고, 피부를 스테인리스 스틸 클립으로 닫는다.
적절한 인큐베이션 시간(예를 들어 7일) 후에, 근육 추출물을 전체 사두근을 절개함에 의해 제조한다. 개개 사두근의 15um 다섯번째 절단면 마다 단백질 발현을 위해 조직화학적으로 염색한다. 융합 단백질 발현을 위한 시간 과정을 상이한 마우스로부터 사두근이 상이한 시간에 수집되는 것을 제외하고 유사한 방법으로 수행한다. 주사 후 근육 내에 DNA의 지속을 주사된 마우스 및 대조 미우스로부터의 총 세포성 DNA 및 HIRT 상청액을 제조한 후에 서던 블랏 분석에 의해 결정할 수 있다. 마우스에서 상기 실험의 결과는 네이키드 DNA를 사용하여 인간 및 다른 동물에서 적절한 용량 및 다른 치료 파라미터를 추정하는데 사용할 수 있다.
실시예 63: 본 발명의 융합 단백질의 생물학적 효과
성상세포 및 신경세포 검정
본 발명의 알부민 융합 단백질을 생존능, 신경돌기 성장, 또는 피질 신경 세포의 표현형 분화를 증진시키기 위한 활성 및 신경아교원섬유산성단백질 면역양성 세포, 성상세포의 증식 유도에 대해 시험할 수 있다. 생검을 위한 피질 세포의 선택은 피질 구조의 FGF-1 및 FGF-2의 우세한 발현 및 이미 보고된 FGF-2 치료로부터 기인한 피질 신경 생존의 증강에 기초한다. 티미딘 혼입 검정은 이러한 세포상에 본 발명의 활성의 알부민 융합 단백질을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
더욱이, 시험관에서 피질 또는 해마 뉴런에 대한 FGF-2(염기성 FGF)의 생물학적 효과를 기술하는 종래 보고서는 뉴런 생존 및 신경돌기 성장 둘 모두를 증가시킨다는 것을 증명한바 있다(Walicke et al., "Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension." Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:3012-3016. (1986), 본원에 전체가 참조로 통합됨). 그러나, PC-12 세포에 대해 행해진 실험 보고서는 이러한 두 반응이 반드시 같은 의미를 가지지 않고 FGF가 시험된 것뿐만 아니라 어느 수용체가 표적 세포에 발현되는지에 따라 다르다는 것을 제안한다. 1차 피질 신경세포 배양 파라다임을 사용하여, 본 발명의 알부민 융합 단백질의 신경돌기 생장을 유도하는 능력은 예를 들어 티미딘 혼입 검정을 사용하여 FGF-2로 달성된 반응과 비교될 수 있다.
섬유아세포 및 내피세포 검정
인간 폐 섬유아세포는 클로네틱스(Clonetics)(샌디에고, CA)로부터 수득되고 클로네틱스의 증식 배지중에 유지된다. 진피 미세혈관 내피 세포는 셀 어플리케이션(Cell Application)(샌디에고, CA)로부터 수득된다. 증식 검정을 위해서, 인간 폐 섬유아세포 및 진피 미세혈관 내피 세포가 증식 배지에서 1일 동안 96-웰 플레이트 중에 5,000 세포/웰로 배양될 수 있다. 다음에 세포를 0.1% BSA 기초 배지에서 1일 동안 인큐베이션한다. 배지를 신선한 0.1% BSA 배지로 교환한 후에, 세포를 3일 동안 본 발명의 시험 융합 단백질과 인큐베이션한다. 알라마 블루(Alamar Blue)(알라마 바이오사이언스, 새크라멘토, CA)를 10%의 최종 농도로 각 웰에 첨가한다. 세포를 4 시간 동안 인큐베이션한다. 세포 생존능을 CytoFluor 형광 판독기로 판독하여 측정한다. PGE2 검정의 경우에, 인간 폐 섬유아세포는 1일 동안 96-웰 플레이트 증에서 5,000 세포/웰로 배양한다. 배지를 0.1% BSA 기초 배지로 교환한 후에, 세포를 24 시간 동안 IL-1α와 함께 또는 이것 없이 본 발명의 융합 단백질 또는 FGF-2와 인큐베이션한다. 상청액을 수집하고 EIA 키트(케이맨(Cayman), 앤 하버, MI)에 의해 PGE2에 대해 검정한다. IL-6 검정의 경우에, 인간 폐 섬유아세포는 1일 동안 96-웰 플레이트 중에서 5,000세포/웰로 배양한다. 배지를 0.1% BSA 기초 배지로 교환한 후에, 세포를 FGF-2와 함께, 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질 및/또는 IL-1α와 함께 또는 이들 없이 24 시간 동안 인큐베이션한다. 상청액을 수집하고 ELISA 키트에 의해 IL-6(엔도겐(Endogen), 캠브리지, MA)에 대해 검정한다.
인간 폐 섬유아세포를 섬유아세포의 증식에 대한 효과를 평가하기 위하여 알라마 블루를 첨가하기 전에 기초 배지에서 3일 동안 FGF-2 또는 본 발명의 알부민 융합 단백질과 배양한다. FGF-2는 본 발명의 융합 단백질과 자극을 비교하기 위해 사용될 수 있는 10-2500ng/㎖의 자극을 보여야 한다.
[3H] 티미딘 혼입에 기초한 세포 증식
하기 [3H]티미딘 혼입 검정은 치료제 단백질, 예를 들어 성장 인자 단백질의 섬유아세포, 상피 세포 또는 미성숙 근육 세포와 같은 세포의 증식에 대한 효과를 측정하기 위하여 사용될 수 있다.
서브-컨플루언스를 이룬 배양물을 무혈청 배지에서 18시간 동안 배양함에 의해 G1 상에 정지시킨다. 다음에 치료제 단백질은 24시간 동안 첨가하고, 마지막 4시간 동안 배양물을 0.33μM의 최종 농도로 [3H]티미딘(25Ci/mmol, 애머샴, 알링턴 하이츠, IL)으로 표지한다. 혼입된 [3H]티미딘을 24 시간 동안 빙냉된 10% 트리클로로아세트산으로 침전시킨다. 후속하여, 세포를 빙냉된 10% 트리클로로아세트산 및 다음에 빙냉된 물로 순차적으로 세정한다. 0.5M NaOH 중에서 용해한 후에, 용해물 및 PBS 세정액(500㎖)을 풀링하고 방사선활성의 양을 측정한다.
파킨슨 모델
파킨슨 병에서 운동 기능의 손실은 흑색선조의 도파민성 투사 뉴런의 변성으로 부터 기인한 선조체 도파민의 결핍으로 인한 것이다. 광범위하게 특성이 규명된 파킨슨 병의 동물 모델은 1-메틸-4-페닐 1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)의 전신성 투여와 관련된다. CNS에서, MPTP는 아스트로사이트에 의해 흡수되며 모노아민 옥시다아제 B에 의해 1-메틸-4-페닐 피리딘(MPP+)로 대사되고 방출된다. 후속하여, MPP+는 도파민에 대한 고친화성 재흡수 트랜스포터에 의해 도파민작용성 뉴런에 활발히 축적된다. MPP+는 다음에 전기화학 구배에 의해 미토콘드리아에 농축되고 선택적으로 니코티다미드 아데닌 디포스페이트:유비퀴논 옥시도리덕셔나아제(복합체 I)을 선택적으로 억제하여 전자 이송을 방해하여 결국에는 산소 라디칼을 생성한다.
FGF-2(염기성 FGF)가 흑질 도파민작용성 뉴런에 대한 영양 활성을 가진다는 것을 조직 배양 파라다임에서 증명하였다(Ferrari et al., Dev. Biol. 1989). 최근에, 운식커(Unsicker) 박사 그룹은 선조체에서 겔 포움 임플란트에 FGF-2를 투여하는 것은 MPTP 노출과 관련된 독성으로부터 흑질 도파민작용성 뉴런을 거의 완벽하게 보호한다는 것을 증명하였다(Otto and Unsicker, J. Neuroscience, 1990).
FGF-2를 이용한 데이터에 기초하여, 본 발명의 알부민 융합 단백질은 이것이 시험관내에서 도파민작용성 뉴런 생존을 증강시키는데 있어 FGF-2의 작용과 유사한 작용을 가지는 지를 결정하기 위하여 평가될 수 있고, 또한 MPTP 치료와 관련된 손상으로부터 선조체에서 도파민작용성 뉴런의 보호를 위해 생체내 시험될 수 있다. 본 발명의 알부민 융합 단백질의 잠재적 효과는 먼저 도파민작용성 뉴런 세포 파라다임에서 시험관내 실험된다. 배양물을 임태일로부터 잉태 14일의 위스타 래트 배아로부터 중뇌 바닥판을 절개하여 제조한다. 조직을 트립신으로 분리하고 폴리오르티닌-라미닌 코팅된 유리 커버슬립상에 200,000세포/cm2의 밀도로 시딩한다. 세포를 둘베코의 개질된 이글스 배지 및 호르몬선 첨가물(N1)을 함유하는 F12 배지에 유지한다. 배양물을 시험관내에서 8일 후에 파라포름알데하이드로 고정하고 티로신 하이드록실라아제, 도파민작용성 뉴런에 대한 특이적 마커, 면역조직화학 염색에 대해 처리한다. 분리된 세포 배양물을 배야 래트로부터 제조한다. 배양 배지는 3일마다 교환하고 인자는 또한 그때에 첨가된다.
도파민작용성 뉴런이 잉태 14일에 동물로부터 분리되기 때문에, 도파민작용성 전구체 세포가 증식하는 단계를 지난 발생시에, 티로신 하이드록실라아제 면역양성 뉴런 개수의 증가는 시험관내에서 생존하는 도파민작용성 뉴런의 수의 증가를 나타낼 것이다. 따라서, 본 발명의 치료 단백질이 도파민작용성 뉴런의 생존을 연장시키는 역활을 한다면, 융합 단백질이 파킨슨 병에 관여될 것이라는 것을 제시할 것이다.
실시예 64: 췌장 베타 세포 이식 조합 치료
이식은 자가면역 질환, 특히 표적 자가 조직이 심하게 손상된 경우에 일반적인 치료 형태이다. 비제한적인 일례로서, 췌장 이식 및 아일릿(islet) 세포 이식은 IDDM에 대한 일반적인 치료 옵션이다(참조, e.g., Stewart et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 86 (3): 984-988 (2001); Brunicardi, Transplant. Proc. 28: 2138-40 (1996); Kendall & Robertson, Diabetes Metab. 22: 157-163 (1996); Hamano et al., Kobe J. Med. Sci. 42: 93-104 (1996); Larsen & Stratta, Diabetes Metab. 22: 139-146 (1996); and Kinkhabwala, et al., Am. J. Surg. 171: 516-520 (1996)). 이식 방법으로서, 자가면역 질환 환자를 위한 이식 치료법은 이식된 조직의 숙주 거부의 위험을 최소화하는 치료법을 포함한다. 그러나, 자가면역 질병은 본래 자기 조직에 손상을 입히는 미리 존재하는 숙주 자가변역 반응이 이식된 조직에 동일한 손상 효과를 보일 것이라는 추가의 독립적인 위험을 수반한다. 이와 같이, 본 발명은 자가면역 질병의 이식 치료법을 거친 개체에서 면역조절제/면역억제제와 조합하여 본 발명의 알부민 융합 단백질을 사용하여 자가면역 췌장 질병의 치료를 위한 방법 및 조성물을 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 기술된 알부민 융합 기재 조성물 및 제형은 본래 자기 조직에 대하여 초기에 유발된 숙주 개체의 자가면역 반응으로부터 생성된 이식된 기관, 조직 또는 세포에 대한 손상을 예방하고 치료하기 위하여 투여된다. 투여는 매 일주일 간격으로 2 내지 4회 용량으로 이식 전 및 후에 수행될 수 있다.
AI-401, CDP-571(항-TNF 모노클론성 항체), CG-1088, 디아미드(Diamyd)(당뇨병 백신), ICM3(항-ICM-3 모노클론성 항체), 리노미드(로퀴니멕스), NBI-6024(변경된 펩티드 리간드), TM-27, VX-740(HMR-3480), 카스파아제 8 프로테아제 억제제, 탈리도미드, hOKT3gammal(Ala-ala)(항-CD3-모노클론성 항체), 경구 인터페론-알파, 경구 락토바실러스, 및 LymphoStat-BTM를 비제한적으로 포함하는 면역조절제/면역억제제가 아일릿 세포 또는 췌장 이식에서 본 발명의 알부민 융합 치료제와 함께 사용될 수 있다.
실시예 65: VH 및 VL 도메인의 확인 및 클로닝
특정 항체를 발현하는 세포주로부터 VH 및 VL 도메인을 확인하고 클로닝하는 한가지 방법은 항체 발현 세포주로부터 만들어진 cDNA 상에 VH 및 VL 특이적 프라이머로 PCR을 수행하는 것이다. 간략하게, RNA는 세포주로부터 분리되고 EBV 세포주에 의해 발현되는 항체의 VH 및 VL 도메인을 증폭시키기 위해 설계된 RT-PCR에 대한 주형으로서 사용된다. 세포를 TRIzol? 시약(라이프 테크놀로지, 락빌, MD)중에서 용해하고, 1/5 부피의 클로로포름으로 추출한다. 클로로포름의 첨가 후에, 용액이 10분 동안 실온에서 인큐베이션되도록 하고, 테이블탑 원심분리기에서 4℃로 15분간 14,000rpm으로 원심분리한다. 상청액을 수집하고 RNA를 동일한 부피의 이소프로판올을 사용하여 침전시킨다. 침전된 RNA를 테이블탑 원심분리기에서 4℃로 15분간 14,000rpm으로 원심분리하여 펠릿을 형성한다. 원심분리 후에, 상청액을 제거하고 75% 에탄올로 세척한다. 세척 후에, RNA를 4℃에서 5분간 800rpm으로 다시 원심분리한다. 상청액을 제거하고 펠릿을 공기 건조되도록 한다. RNA를 DEPC 물에 용해시키고 10분 동안 60℃로 가열한다. RNA의 양은 광학 밀도 측정을 사용하여 결정할 수 있다.
cDNA를 역전사효소 및 램덤 헥사머 프라이머를 사용하여 1.5-2.5 마이크로그램의 RNA로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. cDNA는 다음에 VH 및 VL 도메인의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용된다. VH 및 VL 유전자를 증폭하기 위하여 사용되는 프라이머는 표 7에 도시된다. 통상적으로 PCR 반응은 단일의 5' 프라이머 및 단일의 3' 프라이머를 사용한다. 때때로, 사용가능한 RNA 주형의 양이 제한적인 경우 또는 보다 큰 효율을 위해 5' 및/또는 3' 프라이머의 그룹이 사용될 수 있다. 예를 들어, 때때로, 모든 5개의 VH-5' 프라이머 및 모든 JH3'프라이머는 하나의 PCR 반응에서 사용된다. PCR 반응은 1X PCR 완충액, 2mM의 각 dNTP, 0.7 유닛의 고성능 택 폴리머라아제(High Fidelity Taq polymerase), 5' 프라이머 혼합물, 3' 프라이머 혼합물 및 7.5 마이크로리터 cDNA를 함유하는 50 마이크로리터 부피로 수행된다. VH 및 VL 둘 모두의 5' 및 3' 프라이머 혼합물은 각각 개개 프라이머 각각의 22 pmole 및 28 pmole을 함께 풀링함에 의해 만들어진다. PCR 조건은 하기와 같다: 5분간 96℃; 다음 1분 동안 94℃, 1분 동안 50℃, 및 1분 동안 72℃의 사이클 25회; 다음 10분 동안 72℃의 연장 사이클. 반응이 완결된 후에 시료 튜브를 4℃에 저장한다.
[표 7]
VH 및 VL 도메인을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 서열
Figure 112012047901064-pat00037

Figure 112012047901064-pat00038

PCR 시료는 다음에 1.3% 아가로오스 겔 상에서 전기영동된다. 예상 크기(VH 도메인의 경우 ∼506 염기쌍의 DNA 밴드, 및 VL 도메인의 경우 344 염기쌍)을 겔로부터 잘라내어 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 정제할 수 있다. 정제된 PCR 생성물은 PCR 클로닝 벡터(인비트로겐사의 TA 벡터, Carlsbad, CA)로 라이게이션될 수 있다. 개개의 클로닝된 PCR 생성물을 대장균의 트랜스펙션 및 청색/백색 선별 후에 분리할 수 있다. 다음에, 클로닝된 PCR 생성물은 당업계에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 시퀀싱할 수 있다.
VH 도메인 및 VL 도메인을 함유하는 PCR 밴드는 또한 전장 Ig 발현 벡터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. VH 및 VL 도메인은 중쇄(즉, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4) 또는 경쇄(인간 카파 또는 인간 람다) 불변 영역의 누클레오티드 서열을 함유하는 벡터로 클로닝되어 완전한 중쇄 또는 경쇄 분자는 적절한 숙주 세포로 트랜스펙션되는 경우에 이들 벡터들로부터 발현될 수 있다. 또한, 클로닝된 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 하나의 세포주에서 (하나 또는 두개의 벡터로부터) 발현되는 경우에, 이들은 세포 배양 베지로 분비되는 완전한 작용성 항체 분자로 회합될 수 있다. VH 및 VL 항체 도메인을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하여 완전한 항체 분자를 엔코딩하는 발현 벡터를 생성하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
실시예 66: HA -사이토카인 또는 HA -성장 인자 융합 단백질(예를 들어 NGF , BDNFa , BDNFb 및 BDNFc)의 제조
NGF와 같은 관심 대상인 사이토카인 또는 성장 인자에 대한 cDNA는 모두 표준 방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 중복 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 포함하여 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. 이러한 단백질 모두에 대한 누클레오티드 서열은 공지되어 있고 입수가능하다. cDNA는 5' 및 3' 말단에서 제한효소 위치를 생성하도록 재단하여 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. NGF(또는 다른 사이토카인) cDNA을 pPP00005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고, 이로부터 완전한 발현 카세트를 절단하고 플라스미드 pSAC35에 삽입하여 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다음에 효모로부터 분비되는 알부민 융합 단백질을 수지하고 배지로부터 정제하고 이의 생물학적 활성에 대해 시험한다. 포유동물 세포주에서 발현을 위하여, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트를 절단하고 포유동물 세포주의 프랜스펙션에 적합한 플라스미드에 삽입한다.
실시예 67: HA - IFN 융합 단백질(예를 들어, IFN α)의 제조
IFNα와 같은 관심대상인 인터페론에 대한 cDNA는 모두 표준 방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 일련의 중복되는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 비제한적으로 포함하는 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. IFNα와 같은 인터페론의 누클레오티드 서열은, 예를 들어 미국 특허 제5,326,859호 및 제4,588,585호, EP 제32134호 뿐만 아니라 진뱅크와 같은 공용 데이터베이스에 공지되어 있고 입수가능하다. cDNA를 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단하여 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하는데 사용될 수 있다. 이것은 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 HA 서열의 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. IFNα(또는 다른 인터페론) cDNA는 pPP00005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA , 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝하여 이로부터 완전한 발현 카세트를 절단하고 플라스미드 pSAC35에 삽입하여 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 효모로부터 분비되는 알부민 융합 단백질은 그 후에 수집되고 배지로부터 정제되어 이의 생물학적 활성에 대해 시험될 수 있다. 포유동물 세포주에서 발현의 경우에, 사용된 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열, 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 이러한 발현 카세트는 다음에 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션에 적합한 플라스미드로 삽입된다.
바이얼로부터 최대 단백질 회수
본 발명의 알부민 융합 단백질은 이들이 낮은 농도로 포장되는 경우에 조차 높은 정도의 안정성을 가진다. 또한, 낮은 단백질 농도에도 불구하고, 우수한 융합-단백질 회수는 수용액이 바이얼 벽에 결합되는 것을 최소하하기 위하여 첨가된 다른 단백질을 포함하지 않는 경우조차 관찰된다. 바이얼-저장된 HA-IFN 용액의 회수를 저장 요액과 비교한다. 6 또는 30㎍/㎖ HA-IFN 용액을 바이얼에 넣고 4℃에서 저장한다. 48시간 또는 72시간 후에, 10ng의 시료에 원래 대응하는 부피를 제거하고 IFN 샌드위치 ELISA에서 측정한다. 추정 값을 높은 농도의 저장 용액의 값과 비교한다. 도시된 바와 같이 본질적으로 이러한 바이얼에서 시료의 손실은 없고, 이는 알부민과 같은 외인성 물질이 바이얼 벽에서의 시료 손실을 막을 필요가 없다는 것을 나타낸다.
HA -α- IFN 융합체의 생체내 안정성 및 생체이용율
HA-α-IFN 융합 분자의 생체내 안정성 및 생체이용율을 결정하기 위하여, (효모로부터의) 정제된 융합 분자를 원숭이에게 투여한다. HA-α-IFN 융합체로부터 제형화된 약제 조성물은 연장된 혈청 반감기 및 생체이용율을 설명할 수 있다. 이에 따라, 약제 조성물은 천연 알파-인터페론 분자와 비교하여 보다 낮은 용량의 알파-인터페론 활성을 함유하도록 제형화될 수 있다.
HA-α-IFN 융합체를 함유하는 약제 조성물은 α-IFN의 투여에 의해 조절될 수 있는 질병 또는 질병 상태를 가진 환자의 질병을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 질병은 모상 세포 백혈병, 카포시 육종, 성기 및 항문 사마귀, 만성 B형 간염, 만성 비-A형, 비-B형 간염, 특히, C형 간염, D형 간염, 만성 골수성 백혈병, 항문 세포 암종, 방광 암종, 난소 및 자궁경부 암종, 피부 암종, 재발성 호흡기 유두종증, 비호지킨 및 피부 T-세포 림프종, 흑색종, 다발성 골수종, AIDS, 다발성 경화증, 교모세포종 등을 비제한적으로 포함한다(문헌(Interferon Alpha, In: AHFS Drug Information, 1997) 참조).
이에 따라, 본 발명은 HA-α-IFN 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 함유하고 인간 투여를 위하여 적절한 용량으로 제형화된 약제 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 HA-α-IFN 융합 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 함유하는 약제 조성물을 투여하기 위한 단계를 적어도 포함하는 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.
이작용성 HA -α- IFN 융합체
*HA-α-IFN 발현 벡터는 이작용성 HA-α-IFN 융합 단백질의 발현을 위한 삽입체를 포함하도록 개질될 수 있다. 예를 들어, 관심대상인 제 2 단백질에 대한 cDNA는 이중 정지 코돈이 제거되거나 코딩 서열의 다운스트림으로 쉬프트된 후에 "rHA-IFN"의 프레임 다운스트림에 삽입될 수 있다.
이작용성 HA-α-IFN 융합 단백질의 한 버젼에서, B-림프구 자극 단백질(진뱅크 기탁 번호 제4455139호) 또는 폴리펩티드에 대한 항체 또는 단편은 융합 분자의 HA 분자의 한 말단에 융합될 수 있다. 이러한 이작용성 단백질은 융합체의 α-IFN 성분에 의해 생성된 면역 반응을 조절하기 위해 유용하다.
실시예 68: HA -호르몬 융합 단백질의 제조
관심대상이 호르몬에 대한 cDNA는 모두 표준 방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 중복되는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 비제한적으로 포함하는 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. 이러한 단백질 모두에 대한 누클레오티드 서열은 예를 들어 진뱅크와 같은 공용 데이터베이스에 공지되어 있고 입수가능하다. cDNA는 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단되어, 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대해 cDNA를 함유하는 백터로 cDNA를 클로닝하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. 호르몬 cDNA는 pPPC0005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고 이로부터 완전한 발현 카세트가 절단되고 플라스미드 pSAC35에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다음에 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질이 수집되고 배지로부터 정제되고 이의 생물학적 활성에 대해 시험된다. 포유동물 세포주에서 발현을 위해, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트는 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션을 위해 적합한 플라스미드에 삽입된다.
실시예 69: HA -가용성 수용체 또는 HA -결합 단백질 융합 단백질의 제조
관심대상인 가용성 수용체 또는 결합 단백질에 대한 cDNA는 모두 표준방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 일련의 중복되는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 비제한적으로 포함하는 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. 이러한 단백질 모두에 대한 누클레오티드 서열은 예를 들어 진뱅크에 공지되어 있고 입수가능하다. cDNA는 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단되어 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하도록 사용될 수 있다. 이는 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수있다. 수용체 cDNA를 pPPC0005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고 이로부터 완전한 발현 카세트가 절단되고 플라스미드 pSAC35에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다음에 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질이 수집되고 배지로부터 정제되고 이의 생물학적 활성에 대해 시험된다. 포유동물 세포주에서 발현을 위해, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트는 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션을 위해 적합한 플라스미드에 삽입된다.
실시예 70: HA -성장인자의 제조
관심대상인 성장인자에 대한 cDNA는 모두 표준방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 일련의 중복되는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 비제한적으로 포함하는 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다(진뱅크 수탁번호 NP_000609). cDNA는 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단되어 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하도록 사용될 수 있다. 이는 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. 성장인자 cDNA를 pPPC0005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고 이로부터 완전한 발현 카세트가 절단되고 플라스미드 pSAC35에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다음에 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질이 수집되고 배지로부터 정제되고 이의 생물학적 활성에 대해 시험된다. 포유동물 세포주에서 발현을 위해, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트는 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션을 위해 적합한 플라스미드에 삽입된다.
실시예 71: HA -단일 사슬 항체 융합 단백질의 제조
단일 사슬 항체는 파지 라이브러리로부터의 선별, 항체의 cDNA를 클로닝하고 프라이머로서 프랭킹 불변 영역을 사용하여 가변 영역을 클로닝함에 의하거나 특이적 항체의 가변 영역에 대응하는 올리고누클레오티드를 합성함에 의한 특이적 항체의 가변 영역의 클로닝을 비제한적으로 포함하는 수개의 방법에 의해 생성된다. cDNA는 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단되어 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하도록 사용될 수 있다. 이는 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. 세포 cDNA를 pPP00005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고 이로부터 완전한 발현 카세트가 절단되고 플라스미드 pSAC35에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다.
본 발명의 융합 분자에서, VH 및 VL은 하기 수단 또는 이들의 조합에 의해 연결될 수 있다: VH 의 C-말단 및 VL의 N-말단 사이의 펩티드 링커; VH 및 VL이 분비시에 절단되어 떨어지고 그 후에 자가-회합하도록 하는 VH 과 VL 사이의 Kex2p 프로테아제 절단 위치; 및 VH 및 VL이 이들을 함께 연결시킬 수 있는 이들 사이의 이황화결합을 형성할 수 있도록 위치된 시스틴 잔기. 대안적인 옵션은 VH를 HA 또는 HA 도메인 단편의 N-말단에 위치시키고 VL을 HA 또는 HA 도메인 단편의 C-말단에 위치시키는 것일 것이다.
다음에 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질이 수집되고 배지로부터 정제되고 이의 생물학적 활성에 대해 시험된다. 포유동물 세포주에서 발현을 위해, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트는 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션을 위해 적합한 플라스미드에 삽입된다.
실시예 72: HA -세포 부착 분자 융합 단백질의 제조
관심대상인 세포 부착 분자에 대한 cDNA는 모두 표준방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 일련의 중복되는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 비제한적으로 포함하는 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. 공지된 세포 부착 분자에 대한 누클레오티드 서열은 예를 들어 진뱅크에 공지되어 있고 입수가능하다. cDNA는 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단되어 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하도록 사용될 수 있다. 이는 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. 세포 부착 분자 cDNA를 pPPC0005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고 이로부터 완전한 발현 카세트가 절단되고 플라스미드 pSAC35에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다음에 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질이 수집되고 배지로부터 정제되고 이의 생물학적 활성에 대해 시험된다. 포유동물 세포주에서 발현을 위해, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트는 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션을 위해 적합한 플라스미드에 삽입된다.
실시예 73: HA 융합 단백질(예를 들어 HA -항바이러스, HA -항생제, HA -효소 억제제 및 HA-항알레르기성 단백질)로서 억제 인자 및 펩티드의 제조
관심대상인 단백질에 대한 cDNA는 모두 표준방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 일련의 중복되는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 비제한적으로 포함하는 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. cDNA는 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단되어 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하도록 사용될 수 있다. 이는 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. 펩티드 cDNA를 pPPC0005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고 이로부터 완전한 발현 카세트가 절단되고 플라스미드 pSAC35에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다음에 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질이 수집되고 배지로부터 정제되고 이의 생물학적 활성에 대해 시험된다. 포유동물 세포주에서 발현을 위해, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트는 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션을 위해 적합한 플라스미드에 삽입된다.
실시예 74: 표적화된 HA 융합 단백질의 제조
관심대상인 단백질에 대한 cDNA는 cDNA 라이브러리로부터 분리되거나 표준 분자 생물학 방법을 사용하는 수개의 중복되는 올리고누클레오티드를 사용하여 합성적으로 제조될 수 있다. 적절한 누클레오티드는 cDNA에서 조작되어 편리한 제한효소 위치를 형성하고 또한 단백질 cDNA를 알부민 cDNA에 부착 가능하게 할 수 있다. 또한 단일 쇄 항체 또는 펩티드, 세포내부에서 단백질을 인도할 수 있는 핵 국재화 신호와 같은 표적 단백질 또는 펩티드 cDNA가 알부민의 다른 말단에 융합될 수 있다. 관심대상인 단백질 및 표적화 펩티드가 pPPC0005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터에 클로닝되어 알부민 cDNA와 융합될 수 있다. 이러한 방식으로, 알부민의 N 및 C-말단이 다른 단백질에 융합된다. 융합된 cDNA는 다음에 pPPC005로부터 절단되어 pSAC35와 같은 플라스미드에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 상기 방법 모두 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질을 수집하고 배지로부터 정제하여 이의 생물학적 활성 및 이의 표적화 활성을 적절한 생화학 및 생물학적 시험을 사용하여 시험한다.
실시예 75: HA -효소 융합체의 제조
관심대상인 효소에 대한 cDNA는 모두 표준방법을 사용하는 cDNA 라이브러리, RT-PCR, 및 일련의 중복되는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR을 비제한적으로 포함하는 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. cDNA는 제한효소 위치를 생성하도록 5' 및 3' 말단에서 재단되어 올리고누클레오티드 링커가 HA에 대한 cDNA를 함유하는 벡터로 cDNA를 클로닝하도록 사용될 수 있다. 이는 스페이서 서열을 사용하거나 사용하지 않고 N 또는 C-말단에 있을 수 있다. 효소 cDNA를 pPPC0005 (도 2), pScCHSA, pScNHSA, 또는 pC4:HSA와 같은 벡터로 클로닝되고 이로부터 완전한 발현 카세트가 절단되고 플라스미드 pSAC35에 삽입되어 효모에서 알부민 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 다음에 효모로부터 분비된 알부민 융합 단백질이 수집되고 배지로부터 정제되고 이의 생물학적 활성에 대해 시험된다. 포유동물 세포주에서 발현을 위해, 사용되는 발현 카세트가 포유동물 프로모터, 리더 서열 및 터미네이터를 사용하는 것을 제외하고 유사한 방법을 개조한다(실시예 1 참조). 다음에 이러한 발현 카세트는 절단되고 포유동물 세포주의 트랜스펙션을 위해 적합한 플라스미드에 삽입된다.
실시예 76: 작제물 ID 2053, IFNb - HSA , 생성
작제물 ID2053, pEE12.1:IFNb.HSA는 NS0 발현 벡터 pEE12.1에서 HSA의 성숙 형태의 아미노 말단에 융합된 천연 IFNb 리더 서열을 포함하는 전장 IFNb 단백질을 가지는 IFNb 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함한다.
IFNb cDNA 의 클로닝
IFNb를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 하기 기술된 프라이머 IFNb-1 및 IFNb-2를 사용하여 PCR 증폭되고 Bam HI/Cla I으로 절단되고 Bam HI/Cla I 잘단부 pC4:HSA로 연결되어 작제물 2011을 생성한다. 작제물 ID #2011로부터의 Eco RI/Eco RI 단편은 pEE12.1의 Eco RI 영역으로 서브클로닝되어 리더 서열 및 IFNb의 성숙형태를 포함하고 성숙 HSA 단백질이 뒤따르는 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 작제물 ID #2053을 생성한다.
전장 IFNb, IFNb-1, 및 IFNb-2를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 PCR 증폭에 적합한 두개의 올리고누클레오티드가 합성되었다.
Figure 112012047901064-pat00039
IFNb-1 프라이머는 Bam HI 클로닝 위치(밑줄로 표시), EcoRI 클로닝 위치, 및 코작 서열(이탤릭체로 표시)를 혼입하고 IFNb의 전장 형태의 처음 27개 아미노산을 엔코딩하는 80개 누클레오티드가 뒤따른다. IFNb-2에서, Cla I 위치(밑줄로 표시) 및 이를 뒤따르는 DNA는 성숙 HSA 단백질(서열번호: 1)의 처음 10개 아미노산을 엔코딩하는 DNA의 반대 짝이고 마지막 18개 누클레오티드는 IFNb의 마지막 6개 아미노산 잔기를 엔코딩하는 DNA의 반대 짝이다(실시예 2 참조). PCR 증폭체를 이러한 프라이머를 사용하여 생성하고, 정제하고 Bam HI 및 Cla I 제한 효소로 소화하고, pC4:HSA 벡터의 Bam HI 및 Cla I 위치로 클로닝하였다. 서열이 확인된 후에, IFNb 알부민 융합 단백질 발현 카세트를 함유하는 Eco RI 단편을 Eco RI 소화된 pEE12.1로 서브클로닝하였다.
추가로, 아미노산 시퀀싱에 의해 발현된 알부민 융합 단백질의 N-말단의 분석은 예상 IFNb 서열의 존재를 확인할 수 있다(하기 참조).
본 발명의 IFNb 알부민 융합 단백질은 바람직하게는 IFNb의 성숙 형태의 N 또는 C-말단, 즉, Met-22 내지 Asn-187에 융합된 HSA의 성숙 형태, 즉 Asp-25 내지 Leu-609의 성숙 형태를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 IFNb 알부민 융합 단백질은 발현을 위해 사용된 숙주의 분비 경로에서 초기의 융합 폴리펩티드를 인도하는 시그날 서열을 추가로 포함한다. 추가의 바람직한 구체예에서, 시그날 서열에 의해 엔코딩되는 시그날 펩티드는 제거되고, 성숙 IFNb 알부민 융합 단백질은 배양 배지에 직접 분비된다. 본 발명의 IFNb 알부민 융합 단백질은 비제한적으로 MAF, INV, Ig, 피불린 B, 클러스테린, 인슐린 유사 성장 인자 단백질 4, 비제한적으로 키메라 HSA/MAF 리더 서열을 포함하는 변이체 HSA 리더 서열, 또는 당업계에 공지된 다른 이종성 신호 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 IFNb 알부민 융합 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 추가로 포함한다. 단편 및/또는 변이체를 포함하는 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 또한 본 발명에 포함된다.
작제물 ID 2053의 발현 및 정제
설치류 골수종 NS0 세포주에서 발현
작제물 ID #2053, pEE12.1:IFNb-HSA는 당업계에 공지된 NS0 세포로 일렉트로포레이션되었다(실시예 6 참조).
NS0 세포 상청액의 정제
NS0 세포 상청액으로부터 IFNb-HSA의 정제는 20mM Tris-HCl 중의 0 내지 1M NaCl 구배를 사용하여 pH7.4에서 Q-세파로오스 음이온 교환 크로마토그래피, 후속하여 5 내지 40mM 소듐 시트레이트 구배로 pH 6.5에서 Poros PI 50 음이온 교환 크로마토그래피, 및 10mM 시트레이트, pH 6.5, 및 140mM NaCl, 최종 완충액 조성으로 6DV에 대해 투석하는 것을 포함할 수 있다. N-말단 시퀀싱은 IFNb의 성숙 형태의 아미노 말단이 서열 MSYNLL을 생성하여야 한다. 단백질은 대략 88.5kDa의 MW를 가진다.
보다 큰 스케일 정제를, 즉 50L의 NSO 세포 상청액을 ~8 내지 10L로 농축할 수 있다. 농축된 시료를 다음에 50mM NaOAc, pH 6.0, 및 150mM NaCl로 구성된 단계 용출을 사용하는 pH 7.5에서 Q-세파로오스 음이온 교환 칼럼(10×19cm, 1.5L)를 통과할 수 있다. 용출된 시료는 다음에 실온에서 60분 동안 0.75% 트리톤-X 100으로 바이러스가 불활성화될 수 있다. SDR-역상 크로마토그래피(10cm×10cm, 0.8L)는 다음에 50mM NaOAc 및 150mM NaCl로 pH6.0에서 적용하거나, 대안적으로 시료를 50 mM NaOAc, pH 6.0, 및 150 mM NaCl의 단계 용출을 사용하여 pH4.8에서 SP-세파로오스 칼럼에 대해 퉁과할 수 있다. DV50 여과가 임의의 바이러스 함량을 제거하기 위하여 후속하여 사용될 것이다. 350 mM (NH4)2SO4 및 50 mM NaOAc로 구성되거나 대안적으로 50mM NaOAc pH 6.0으로 구성된 단계 용출을 사용하여 pH 6.0에서의 페닐-650M 크로마토그래피(20cm×12cm, 3.8L)가 후속할 수 있다. 6-8DV에 대한 투석이 10 mM Na2HPO4 + 58 mM 수크로오스 + 120 mM NaCl, pH 7.2 또는 10 mM 시트레이트, pH 6.5, 및 140 mM NaCl 또는 25 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl, pH 7.2의 요망되는 최종 제형 완충액으로 완충액 교환을 가능하게 할 것이다.
IFNb 의 활성은 시험관내 ISRE - SEAP 검정을 사용하여 검정될 수 있다.
모든 타입 I 인터페론 단백질은 인터페론 "IFN"의 활성화시에 축적되는 일정한 수용체 복합체 및 유사한 Jak/STAT 시그날링 경로를 통해 신호하고, 반응성 유전자는 인터페론 서열 반응성 요소, "ISRE"를 통해 신호한다. 타입 I IFN 활성에 대한 편리한 검정은 다운스트림 리포터 유전자에 융하된 ISRE 요소의 여러 복사체를 함유하는 프로모터-리포터 기재 검정 시스템이다. 안정한 HEK293 세포주가 생성되고 타입 I IFN에 극도록 감수성이고 농도의 5 로그에 대하여 선형을 보이는 ISRE-SEAP 리포터 유전자의 안정하게 인테그레이션 된 복사체를 함유한다.
IFNb - HSA NSO 안정한 클론의 스크리닝 방법
작제물 2053은 실시예 6에 기술된 NSO 세포로 일렉트로포레이션된다. 작제물ID#2053으로 트랜스펙션된 NSO 세포를 ISRE-SEAP 검정에서 컨디셔닝된 증식 배지를 시험함에 의해 활성에 대해 스크리닝하였다. ISRE-SEAP/293F 리포터 세포를 96-웰, 폴리-D-라이신 코팅된 플레이트에서 치료 하루 전에 3×104 세포/웰로 플레이팅하였다. 리포터 세포를 작제물 ID 2053 또는 대조군으로서 rhIFNb에 의해 엔코딩된 IFNb 알부민 융합 단백질의 컨디셔닝된 상청액 또는 정제 제조물의 다양한 희석율(비제한적으로 1:500 내지 1:5000)로 처리하였다. 리포터 세포를 다음에 SEAP 리포터 유전자 화학형광 검정(로슈 카타로그 # 1779842)에서 사용하기 위하여 40㎕를 제거하기 전에 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 재조합 인간 인터페론 베타, "rhIFNb"(바이오젠)을 양성 대조군으로 사용하였다.
결과
NSO 발현된 IFNb-HSA의 정제 제조물은 1.8×10-10 g/㎖의 EC50을 가지는 rhIFNb(바이오젠) 보다 큰 9.3×10-9 g/㎖의 EC50을 가졌다(도 4 참조)
인터페론에 의한 OAS 의 생체내 유도
방법
OAS 효소, 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타아제는 항바이러스 감염에 반응하여 인터페론에 의해 전사 수준에서 활성화된다. 인터페론 작제물의 효과는 치료된 원숭이로부터의 혈액 시료를 수득하고 이러한 시료를 두개의 OAS mRNA, p41 및 p69의 전사 불활성화에 대하여 분석함에 의해 측정될 수 있다. 전체 혈액 0.5㎖ 부피는 4마리의 동물로부터 각 동물마다 7개의 상이한 시점, 0일째, 1일째, 2일째, 4일째, 8일째, 10일째, 및 14일째에서 수득하였다. 다양한 그룹은 비히클 대조군, 1일째에 30㎍/kg 및/또는 300㎍/kg IFN 알부민 융합 단백질의 정맥내 및/또는 경피성 주사, 및 1, 3, 및 5일째에 양성 대조군으로서 40㎍/kg의 인터페론 알파(쉐링-플라우)의 경피성 주사를 포함할 수 있다. p41 및 p69 mRNA 전사체의 수준은 p41-OAS 및 p69-OAS에 대해 특이적인 프로브를 사용하여 실시간 정량 PCR(택맨)에 의해 결정될 수 있다. OAS mRNA 수준을 18S 리보좀 RNA 내인성 대조군에 의해 정량될 수 있다.
작제물 ID 2053에 의해 엔코딩되는 인터페론 베타 알부민 융합체에 의한 OAS 의 생체내 유도
방법
작제물 2053에 의해 엔코딩되는 HSA-IFNb 융합 단백질의 활성은 "인터페론에 의한 OAS의 생체내 유도"라는 제목을 가진 하부 단락하에 이미 기술된 바와 같이 생체내 OAS 검정에서 검정될 수 있다.
실시예 77: IFNb 알부민 융합 단백질에 대한 적응증
IFN 베타 알부민 융합 단백질(작제물 2053에 의해 엔코딩된 것을 비제한적으로 포함)은 다발성 경화증을 치료, 예방, 개선 및/또는 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 적응증은 비제한적으로 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 및 다른 코로나바이러스 감염증; 에볼라 바이러스 및 마버그(MArburg) 바이러스를 비제한적으로 포함하는 필로바이러스; 피첸드 바이러스, 라사 바이럿, 주닌 바이러스, 마추포 바이러스, 구아나리토 바이러스를 비제한적으로 포함하는 아레나바이러스; 및 림프구 코리오베닌지티디스 바이러스(LCMV); 푼타 토로 바이러스, 크리민-콩고 출혈성 열 바이러스, 모래파리 열 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 라 크로세 바이러스, 및 한타바이러스를 비제한적으로 포함하는 버니야 바이러스; 황열, 반지 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 틱-본 뇌염, 옴스크 출혈 열, 및 키야사나 산림 질병 바이러스를 비제한적으로 포함하는 플라비바이러스; 베네주엘라, 동부, 및 서부 마 뇌염 바이러스, 로스 리버 바이러스 및 루벨라 바이러스를 비제한적으로 포함하는 토가바이러스; 백시니아, 우두, 천연두, 및 두창을 비제한적으로 포함하는 오르토폭스 바이러스; 헤르푸스 바이러스; 플루A/B; 호흡기 합포체 바이러스(RSV); 파라플루; 홍역;리노바이러스; 아데노바이러스; 및 기관(U.S. Centers for Disease Control and Prevention as high-priority disease agents)(i.e., Category A, B, and C agents; see, e.g., Moran, Emerg. Med. Clin. North. Am. 2002; 20(2):311-30 and Darling et al., Emerg. Med. Clin. North Am. 2002;20(2):273-309)에 의해 확인돤 다른 바이러스 제제를 포함하는 바이러스 감염증을 비제한적으로 포함한다.
실시예 78: 작제물 ID 2249, IFNa2 - HSA , 생성
작제물 ID 2249, pSAC35:IFNa2.HSA는 효모 S. 세레비지애(S. cerevisiae ) 발현 벡터 pSAC35에서 HSA의 성숙 형태의 아미노 발단에 융합된, IFNa2 단백질의 성숙 형태가 후속하는 HSA 키메라 리더 서열을 가지는 IFNa2 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함한다.
IFNa2 cDNA 의 클로닝
IFNa2를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 하기 기술된 바와 같은 IFNa2-1 및 IFNa2-2 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭제는 Sal I/Cla I으로 절단하고, Xho I/Cla I 절단된 pScCHSA로 연결하였다. 작제물 ID #2249는 HSA의 키메라 리더 서열, IFNa2의 성숙 형태, 후속하는 성숙 HSA 단백질을 함유하는 알부민 융합 단백질을 엔코딩하다.
IFNa2, IFNa2-1, 및 IFNa2-2의 성숙 형태를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 PCR증혹에 적합한 두개의 올리고누클레오티드가 합성되었다:
Figure 112012047901064-pat00040
IFNa2-1 프라이머는 Sal I 클로닝 위치(밑줄로 표시), 키메라 HSA 리더 서열의 마지막 세개 아미노산 잔기, 뿐만 아니라 IFNa2의 성숙 형태의 처음 7개 아미노산 잔기를 엔코딩하는 22개 누클레오티드(굵은 글씨체로 표시)를 혼입한다. IFNa2-2에서, Cla I 위치(밑줄로 표시) 및 이를 후속하는 DNA는 성숙 HSA 단백질의 처음 10개 아미노산을 엔코딩하는 DNA의 반대 짝이고, 마지막 22개 누클레오티드(굵은 글씨체로 표시)는 IFNa2의 마지막 7개 아미노산 잔기를 엔코딩하는 DNA의 반대 짝이다(실시예 2 참조). IFNa2-HSA의 PCR 증폭체가 이러한 프라이머를 사용하여 생성되고, 정제되고, SalI 및 Cla I 제한효소로 소화되고 pScCHSA 벡터의 Xho I 및 Cla I 위치로 클로닝된다. 서열이 확인된 후에, 이 IFNa2 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 발현 카세트는 Not I 소화된 pSAC35로 서브클로닝된다.
또한, 아미노산 시퀀싱에 의해 발현된 알부민 융합 단백질의 N-말단은 예상 IFNa2 서열의 존재를 확인할 수 있다(하기 참조).
상이한 리더 서열을 사용하는 다른 IFNa2 알부민 융합 단백질은 당업계에 공지된 방법에 의해 제작되었다(실시예 2 참조). 다양한 리더 서열의 예에는 인버타아제(invertase) "INV"(작제물 2343 및 2410) 및 메이팅 알파 인자 "MAF"(작제물 2366)을 비제한적으로 포함한다. 이러한 IFNa2 알부민 융합 단백질을 앞서 기술한 바와 같이 pC4(작제물 2382) 및 pEE12.1과 같은 포유동물 발현 벡터로 서브클로닝될 수 있다(실시예 5 참조). HAS에 C-말단 융합된 치료제 부분을 가지는 IFNa2 알부민 융합 단백질이 제작될 수 있다(작제물 2381).
본 발명의 IFNa2 알부민 융합 단백질은 바람직하게는 IFNa2의 N 또는 C 말단(즉, Cys-1 내지 Glu-165)에 융합된 HSA의 성숙 형태, 즉 Asp-25 내지 Leu-609를 바람직하게는 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 IFNa2 알부민 융합 단백질은 추가로 발현을 위해 사용된 숙주의 분비 경로에서 초기의 융합 폴리펩티드를 유도하는 신호 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 바람직한 구체에에서, 신호 서열에 의해 엔코딩되는 신호 펩티드가 제거되고, 성숙한 IFNa2 알부민 융합 단백질이 배지내로 직접 분비된다. 본 발명의 IFNa2 알부민 융합 단백질은 MAF, INV, Ig, 피불린(Fibulin) B, 클러스테린(Clusterin), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 이종성 신호 서열, 키메라 HSA/MAF 리더 서열을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 변이체 HSA 리더 서열, 또는 당 분야에 공지되어 있는 기타 이종성 신호 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 IFNa2 알부민 융합 단백질은 천연 IFNa2를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 IFNa2 알부민 융합 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 추가로 포함한다. 단편 및/또는 변이체를 포함하는 이들 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드가 또한 본 발명에 포함된다.
작제물 ID 2249의 발현 및 정제
효모 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae)에서의 발현
작제물 2249를 효소 사카로마이세스 세레비시애 균주 BXP10 내로 형질전환시키는 것은 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행하였다 (실시예 3 참조). 세포는 72시간 증식 후에 정지기에서 수집할 수 있다. 세포를 3000g에서 10분간 정화시킴으로써 상층액을 수집한다. 발현 수준은 항-HSA 혈청 (Kent Laboratories)을 사용하는 면역블롯 검출에 의해 또는 1차 항체로서 조사한다. 근사 분자량이 88.5 kDa인 IFNa2 알부민 융합 단백질이 수득될 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레비시애 세포 상층액으로부터의 정제
효모 사카로마이세스 세레비시애 세포 중의 작제물 ID #2249로부터 발현된 IFNa2 융합 단백질을 함유하는 세포 상층액은 디액스(Dyax) 펩티드 친화성 컬럼으로 소규모로 정제하거나 (실시예 4 참조), 투석여과, DEAE-세파로오스 패스트 플로우(DEAE-Sepharose Fast Flow) 컬럼을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피, 부틸 650S 컬럼을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), SP-세파로오스 패스트 플로우 컬럼을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피 또는 블루-세파로오스(Blue-Sepharose) 크로마토그래피, 및 Q-세파로오스 고성능 컬럼 크로마토그래피를 사용하는 고성능 크로마토그래피의 5 단계에 의해 대규모로 정제할 수 있다 (실시예 4 참조). IFNa2 알부민 융합 단백질은 100 내지 250 mM NaCl을 사용하여 DEAE-세파로오스 패스트 플로우 컬럼으로부터 용리되고, 150 내지 250 mM NaCl을 사용하여 SP-세파로오스 패스트 플로우 컬럼으로부터 용리되고, Q-세파로오스 고성능 컬럼으로부터 5 내지 7.5 mS/cm으로 용리될 수 있다. N-말단 시퀀싱은 IFNa2의 성숙한 형태에 상응하는 서열 CDLPQ (SEQ ID NO:98)를 산출할 수 있다.
IFNa2 의 활성은 시험관내 ISRE - SEAP 검정을 이용하여 검정될 수 있다.
방법
작제물 ID # 2249에 의해 엔코딩되는 IFNa2 알부민 융합 단백질은 앞서 실시예 76에 기재된 바와 같이 ISRE-SEAP 검정에서 활성에 대해 시험할 수 있다. 요약하면, 컨디셔닝된 효모 상층액을 ISRE-SEAP/293F 리포터 세포주상에서 ISRE 신호 전달을 유도할 수 있는 능력에 대해 1:1000의 희석율로 시험하였다. ISRE-SEAP/293F 리포터 세포를 처리 1일 전에 96-웰 폴리-D-라이신 코팅된 플레이트에서 3 x 104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 그 후, 리포터 세포를 SEAP 리포터 유전자 화학발광 검정 (Roche catalog # 1779842)에서 사용하기 위해 40㎕를 분리하기 전에 18 또는 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 재조합 인간 인터페론 베타인 "rhIFNb" (Biogen)를 양성 대조군으로서 사용하였다.
결과
IFNa2-HSA의 정제된 제제는 10-1 내지 101 ng/ml의 농도 (도 5 참조) 또는 10-10 내지 10-8 ng/ml의 농도에 걸쳐 ISRE-SEAP 검정에서 비교적 선형 증가를 나타내었다.
작제물 ID 2249에 의해 엔코딩되는 인터페론 알파 융합체에 의한 OAS 의 생체 내 유도
방법
OAS 효소인 2'-5'- 올리고아데닐레이트 신테타아제(OligoAdenylate Synthetase)는 항바이러스 감염에 반응하여 인터페론에 의해 전사 수준에서 활성화된다. 인터페론 작제물의 효과는 처리된 원숭이로부터 혈액 샘플을 수득하고, 이들 샘플을 p41 및 p69라는 두 개의 OAS mRNA의 전사 활성화에 대해 분석함으로써 측정될 수 있다. 0.5ml 부피의 전혈을 동물 당 0일째, 1일째, 2일째, 4일째, 8일째, 10일째 및 14일째의 7개의 상이한 시점에서 그룹 당 4마리의 동물로부터 수득하였다. 다양한 그룹은 비히클 대조군, 1일째의 30 ㎍/kg의 HSA-IFN의 정맥 주사, 1일째의 30 ㎍/kg의 HSA-IFN의 피하 주사, 1일째의 300 ㎍/kg의 HSA-IFN의 피하 주사, 및 1일, 3일 및 5일째의 양성 대조군으로서 40 ㎍/kg의 인터페론 알파 (Schering-Plough)의 피하 주사를 포함한다. p41 및 p69 mRNA 전사체의 수준은 p41-OAS 및 p69-OAS에 대해 특이적인 프로브를 사용하여 실시간 정량 PCR (Taqman)에 의해 측정하였다. OAS mRNA 수준을 18S 리보솜 RNA 내인성 대조군과 비교하여 정량하였다. 작제물 2249에 의해 엔코딩되는 알부민 융합체는 유사한 실험을 받을 수 있다.
결과
p41 및 p69 OAS 둘 모두에 대한 mRNA 전사체 수준의 현저한 증가가 IFNa 처리된 원숭이와 대조적으로 HSA-인터페론 처리된 원숭이에서 관찰되었다 (p41 데이터에 대해서는 도 7을 참조하라). 효과는 거의 10일간 지속되었다.
실시예 79: IFNa2 알부민 융합 단백질에 대한 적응증.
INF 알파 알부민 융합 단백질 (작제물 2249, 2343, 2410, 2366, 2382, 및 2381에 의해 엔코딩되는 것들을 포함하지만 이들에 제한되지 않음)은 다발성 경화증을 치료, 예방, 개선 및/또는 검출하는데 사용될 수 있다. 다른 적응증으로는 비제한적으로 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 및 다른 코로나바이러스 감염을 포함하는 바이러스 감염을 포함한다: 비제한적으로 에볼라(Ebola) 바이러스 및 마르부르그(Marburg) 바이러스를 포함하는 필로바이러스(filovirus); 비제한적으로 피첸데(Pichende) 바이러스, 라사(Lassa) 바이러스, 쥬닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스를 포함하는 아레나바이러스(Arenavirus); 및 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCWV); 비제한적으로 푼타 토로(Punta toro) 바이러스, 크리민-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 바이러스, 샌드플라이 열(sandfly fever) 바이러스, 리프트 밸리 열(Rift Valley fever) 바이러스, 라 크로세(La Crosse) 바이러스, 및 한타바이러스(hantavirus)를 포함하는 분야바이러스(Bunyavirus); 비제한적으로 황열, 반지(Banzi) 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기 매개 뇌염, 옴스크(Omsk) 출혈열, 및 키아사누르 포레스트 디지즈(Kyasanur Forest Disease) 바이러스를 포함하는 플래비바이러스(Flavivirus); 비제한적으로 베네주엘란(Venezuelan), 이스턴(eastern), 및 웨스턴(western) 말 뇌염 바이러스, 로스 리버(Ross River) 바이러스, 및 루벨라(Rubella) 바이러스를 포함하는 토가바이러스(Togavirus); 비제한적으로 백시니아(Vaccinia), 카우폭스(Cowpox), 스몰폭스(Smallpox), 및 멍키폭스(Monkeypox)를 포함하는 오르토폭스(Orthopox) 바이러스; 포진 바이러스; FluA/B; 호흡기 합포성 바이러스 (RSV); 파라플루(paraflu); 홍역; 리노바이러스; 아데노바이러스; 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스; 바이러스 출혈열; 라브도바이러스(Rhabdovirus); 비제한적으로 니파(Nipah) 바이러스 및 헨드라(Hendra) 바이러스를 포함하는 파라믹소바이러스; 및 우선순위가 높은 병인 물질로서 유.에스. 센터스 포 디지즈 컨트롤 앤드 프리벤션(U.S. Centers for Disease Control and Prevention)에 의해 확인된 다른 바이러스 물질 (즉, 카테고리 A, B, 및 C 물질; 참조: Moran, Emerg. Med. Clin. North. Am. 2002; 20(2):311-30 및 Darling et al., Emerg. Med. Clin. North Am. 2002;20(2):273-309)을 포함한다.
바람직하게는, IFNa-알부민 융합 단백질 또는 IFN 하이브리드 융합 단백질은 치료를 받은 적이 없는 환자 뿐만 아니라 치료 경험이 있는 성인 및 소아 환자에서 HIV-1 감염, HCV, 또는 HIV-1 및 HCV 동시감염을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 CCR5 길항제와 함께 투여되며, 추가로 리바비린, IL-2, IL-12, 펜타푸시드 단독 또는 항-HIV 약물 요법, 예를 들어 HAART와의 병용 중 하나 이상과 함께 투여된다.
실시예 80: 작제물 ID # 3691인 BNP - HSA 생성
작제물 ID # 3691인 pC4:SPCON.BNP1-32/HSA는 포유류 발현 벡터 pC4에서 컨센서스 리더 서열, 세크레콘(secrecon)에 이어 HSA의 성숙한 형태의 아미노-말단에 융합된 프로세싱된 활성 BNP 펩티드 (아미노산 1-32)를 지니는 BNP 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함한다.
작제물 3691을 위한 BNP cDNA 의 클로닝
BNP를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 Bam HI/Cla I로 절단된 하기 기술된 프라이머 BNP-1 및 BNP-2를 사용하여 PCR 증폭시키고, Bam HI/Cla I 절단된 pC4:HSA내로 연결시켜서, 작제물 ID # 3691을 생성시켰다. 작제물 ID # 3691은 컨센서스 리더 서열 (SEQ ID No:111) 및 BNP의 프로세싱된 활성 형태에 이어 성숙한 HSA 단백질을 함유하는 알부민 융합 단백질을 엔코딩한다 (표 2의 작제물 3691에 해서는 SEQ ID No:321를 참조하라).
프로세싱된 활성 형태의 BNP, BNP-1 및 BNP-2를 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 PCR 증폭을 위해 적합한 두 개의 올리누클레오티드를 합성하였다:
Figure 112012047901064-pat00041
BNP-1은 Bam HI 클로닝 부위 (밑줄그어져 있음), 컨센서스 리더 서열 (SEQ ID No:111)을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 (이탤릭체로 되어 있음), 및 BNP의 최초 7개 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 (진한 글씨체로 되어 있음)를 포함한다. BNP-2에서, 밑줄그어진 서열은 Cla I 부위이고, 그 다음에 오는 폴리누클레오티드는 BNP의 최종 6개 아미노산 (진한 글씨체로 되어 있음) 및 성숙한 HSA 단백질의 최초 10개의 아미노산을 엔코딩하는 DNA의 역상보체를 함유한다. 이러한 두 개의 프라이머를 사용하여 BNP 단백질을 PCR 증폭시켰다. 어닐링 및 신장 온도 및 시간은 각각의 특정 프라이머 쌍 및 주형에 대해 경험적으로 측정되어야 한다.
PCR 생성물을 정제 (예를 들어, 위저드 PCR 프렙스 DNA 퓨리피케이션 시스템 (Wizard PCR Preps DNA Purification System) (Promega Corp)을 사용함)한 후, Bam HI 및 Cla I로 분해하였다. Bam HI-Cla I 단편을 겔 전기영동에 의해 추가로 정제한 후, 생성물을 Bam HI/ Cla I로 분해시킨 pC4:HSA내로 클로닝하여, 작제물 ID # 3691을 생성시켰다. 발현 작제물의 서열을 확인하였다.
작제물 ID 3691의 발현 및 정제.
293F 세포에서의 발현
작제물 ID # 3691인 pC4:SPCON.BNP1-32/HSA를 당 분야에 공지된 방법에 의해 293F 세포내로 트랜스펙션시켰다 (실시예 6 참조).
293F 세포 상층액으로부터의 정제
2 리터의 상층액을 트랜스펙션 후 3일째에 수집하였다. 재조합 단백질을 5ml 블루 세파로오스 CL-6B 컬럼 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)에 의해 포획하고, 2M NaCl에 의해 용리시켰다. 물질을 하이프렙(Hiprep) 16/10 페닐 FF (high sub) 컬럼에 결합시키고, 20mM MES(pH 6.7)에 의해 용리시켰다. BNP-HSA를 pH 6.8에서 인산 나트륨 완충액 구배 (200ml 중의 0 내지 20 mS/cm)에서 수산화인회석 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 최종 생성물을 하이프렙(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼 (Amersham Biosciences)에 의해 PBS(pH 7.2)내로 교환시켰다.
BNP - HSA 의 활성은 시험관내 NPR -A/ cGMP 검정을 사용하여 검정될 수 있다.
나트륨이뇨 펩티드 수용체-A (NPR-A)는 BNP에 대한 신호링 수용체이고, 그 자체로 BNP의 생물학적 효과의 대부분을 담당한다. BNP 생체활성은 활성화시에 GTP를 cGMP로 전환시키는 NPR-A 구아닐릴 사이클라아제 도메인에 의해 매개된다. BNP 활성에 대한 편리한 검정은 NPR-A를 안정하게 과발현시키는 293F 세포주의 BNP 자극을 측정하는 것이다. BNP에 노출된 후 세포에서의 cGMP 생성은 cGMP ELISA에 의해 측정될 수 있다.
NPR -A 293F 안정성 클론을 스크리닝하는 방법.
인간 NPR-A의 오픈 리딩 프레임을 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen)내로 구성화시켰다. 293F 세포를 플라스미드 DNA를 사용하여 리포펙타민 방법에 의해 안정하게 트랙스펙션시키고, 0.8 ㎍/ml의 G418에 의해 선택하였다. 293F/NPR-A 안정성 클론을 재조합 BNP에 대한 최상의 반응에 대해 스크리닝하였다.
cGMP 활성화의 측정.
BNP에 의한 cGMP 활성화를 293F/NPR-A 세포에서 수행하고, 캐치포인트(Catchpoint) 사이클릭-GMP 형광 검정 키트 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)에 의해 측정하였다. 요약하면, 96-웰 플레이트에서 배양된 50,000개 세포/웰의 293F/NPR-A 세포를 80㎕의 사전자극 완충액 (10mM 글루코오스 (pH 7.4), 15nM 중탄산 나트륨, 및 0.75mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴이 함유된 크렙스-링거 중탄산염 완충액(Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer))내로 세척하였다. 40㎕의 사전자극 완충액 중의 BNP-HSA 또는 재조합 BNP를 37℃에서 10분간 세포에 첨가하였다. 세포를 40㎕의 용해 완충액으로 10분간 용해시키며 진탕시켰다. 용해물 중의 cGMP의 양을 제조업자의 지시에 따라 정량하였다.
결과
BNP-HSA 및 재조합 BNP의 투여량-반응 관계를 측정하였다 (도 8 참조). 작제물 ID # 3691 및 재조합 BNP의 최대 활성은 유사하였고 (각각, 1.63±0.016 대 1.80±0.016pm), EC50 값은 각각 28.4±1.2 및 0.46±1.1nM 이었다.
BNP - HSA 는 생체내에서 혈압을 감소시킨다.
방법
BNP는 직접적 혈관확장에 의해서 뿐만 아니라 레닌/안지오텐신/엔도텔린/알도스테론 시스템의 억제에 의해 혈압을 감소시킨다. 동맥 혈압을 감소시키는 BNP-HSA의 능력을 타코닉(Taconic) (Germantown, NY, USA)으로부터 구입한 3개월령 수컷 자발성 고혈압 래트에서 시험하였다. 자발성 고혈압 래트는 3개월령 후에 고혈압이 발병하는 유전적으로 고혈압성이다. BNP-HSA 또는 재조합 BNP를 래트 당 0.3cc PBS에서 재구성하였다. 약물을 꼬리 정맥 주사를 통해 전달하였다. 수축기 및 확장기 혈압을 XBP-1000 시스템 (Kent Scientific, Torrington, CT, USA)을 사용하여 커프-테일(cuff-tail) 방법에 의해 기록하였다. 각각의 혈압 데이터 지점에 대해, 4 내지 5회의 연속 판독값을 취하고, 평균을 내었다. 평균 동맥압 (MAP)을 1/3 수축기 압력 + 2/3 확장기 압력으로서 계산하였다. 투여량-반응 측정을 위해, 혈압을 0.5, 2, 6 및 18nmol/kg의 용량으로 pC4:SPCON.BNP1-32/HSA를 투여한 후 20시간째에 측정하였다.
결과
자발성 고혈압 래트의 전형적인 수축기 압력은 투여 전에 180 내지 200mmHg 였다. 꼬리 정맥 주사를 통해 전달된 6nmol/kg의 BNP-HSA의 단일 볼루스(bolus)는 수축기 및 확장기 압력 둘 모두를 낮추었고, 이는 30mmHg를 초과하는 평균 동맥압 (MAP) 감소를 초래하였다. 낮추어진 혈압은 불변하였고, 1일간 지속된 후, 수 일에 걸쳐 점차 기선으로 복귀하였다 (도 9 참조). 대조적으로, 순간적 소거로 인해, 재조합 BNP의 단일 6nmol/kg 볼루스는 약 ~15mmHg의 매우 일시적인 MAP 감소만을 생성시켰다.
또한, BNP-HSA의 볼루스의 주입 후 20시간째의 투여량-반응을 4마리의 자발성 고혈압 래트에서 측정하였다. 0.5nmol/kg BNP-HSA는 평균 7mmHg MAP 감소를 나타내었고, 6 nmol/kg BNP-HSA는 평균 30mmHg MAP 감소를 나타내었으며, 18nmol/kg의 고용량의 BNP-HSA는 혈압을 6nmol/kg 보다 단지 약간 높게 감소시켰다.
BNP - HSA 에 의한 혈장 cGMP 의 생체내 유도.
방법
BNP에 의한 세포내 cGMP 활성화는 세포로부터 순환계로 이를 방출시킨다. 혈장 cGMP 수준은 BNP-유도된 심혈관 및 신장 생리학과 상호관련된다. 혈장 cGMP는 생체내 BNP 작용에 대한 바이오마커로서 사용되어 왔다. 생체내에서의 BNP-HSA에 의한 혈장 cGMP의 유도를 시험하기 위해, 11주령 또는 12주령된 수컷 C57/BL6 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 6nmol/kg 용량으로 재조합 BNP 또는 BNP-HSA의 단일 볼루스를 투여하였다. 혈장을 재조합 BNP 투여 그룹에 대해서는 5분, 10분, 20분, 40분 및 80분 시점에서, 및 BNP-HSA 그룹에 대해서는 추가의 640분, 1440분, 2880분 및 5760분째에 꼬리 채혈로부터 준비하였다. 비히클 대조군으로서 PBS로 처리된 마우스로부터의 혈장 샘플을 시점 0으로서 수집하였다. cGMP 수준을 제조업자의 지시에 따라 캐치포인트 사이클릭-GMP 형광 검정 키트에 의해 측정하였다.
결과
6nmol/kg의 재조합 BNP 또는 BNP-HSA의 단일 정맥 볼루스 후에, 기선에 대한 피크 혈장 cGMP 수준은 각각 3.9배 또는 5.6배 증가하였다 (도 10 참조). 또한, 재조합 BNP 처리 후의 단상(one-phase) 지수 붕괴 반감기는 16분 (10 내지 42분, 95%CI)이었고, BNP-HSA 투여 후의 cGMP의 단상 지수 붕괴 반감기는 1538분 (1017 내지 3153분, 95%CI) 이었다.
작제물 ID 3691에 의해 엔코딩되는 BNP 알부민 융합체의 생체내 약력학적 분 석.
방법
11주령 내지 12주령된 수컷 C57/BL6 마우스 (입수처: Ace Animals, Boyertown, PA, USA)는 실험시에 중량이 25.1 ±0.12g이었다. 모든 동물에게 10ml/kg 체중의 부피로 투여하였다. 투여전 동물에게 PBS를 주입하였다. 재조합 BNP를 꼬리에서 정맥내 주입하거나 견갑골 중간 영역에 피하 주입하였다.
약력학적 분석을 하기 그룹에 대해 수행하였다:
그룹 약물 투여량(mg/kg) 경로 N/시간 시간(hour)
1 BNP-HSA 2.19 피하 3 0.5, 2, 6, 16, 24, 32, 48, 72, 96
2 BNP-HSA 2.19 정맥 3 0.083, 2, 6, 16, 24, 32, 48, 72, 96
3 비히클 0 피하 3 투여전
4 비히클 0 정맥 3 투여전
혈액을 하대정맥으로부터 채취하고, EDTA 코팅된 마이크로테이너(microtainer)에 넣고, 얼음상에서 저장하였다. 샘플을 실온에서 14,000rpm (16,000xg)에서 10분간 미세원심분리기에서 원심분리하였다. 혈장을 클러스터 튜브(cluster tube)내로 옮기고, -80℃에서 저장하였다.
혈장 샘플 중의 BNP-HSA 농도를 BNP EIA 키트 (Phoenix Pharmaceutical, Belmont, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 시험 샘플과 동일한 플레이트상에서 동시에 생성시켰다. 검출 한계는 재조합 BNP에 대해 0.11ng/ml 이었다. 검정은 재조합 BNP를 검출하고, 마우스 BNP에 대해 교차반응하지 않는다.
분석은 비구획(noncompartmental) 방법에 의해 수행하였다 (WinNonlin; version 4.1; Pharsight Corp.,Mountain View, CA, USA). 각각의 시간에서의 평균 혈장 농도를 분석에서 사용하였다. 리니어 업/로그 다운(linear up/log down) 사다리꼴 방법을 사용하여 AUCO-t을 계산하였다. 무한대 AUG0 -∞로의 외삽은 최종 관찰된 농도를 종말 소거율 상수로 나눔으로써 수행하였다. 데이터는 이러한 분석을 위해 균일하게 가중되었다.
결과
투여전 샘플에서 검출된 혈장 중의 BNP-HSA의 평균 기선 농도는 약 0.081 내지 0.095 ㎍/ml이었다. 단일 정맥 주사 또는 피하 주사 후, BNP-HSA는 11.2시간 (정맥 전달) 또는 19.3시간 (피하 전달)의 종말 소거 반감기를 지녔고, 마우스에서 재조합 BNP의 반감기는 3.1분이었다. BNP-HSA의 비구획 분석은 BNP-HSA가 하기 특징을 지닌다는 것을 밝혀내었다:
단위 정맥 피하
t max h NA 16
C max ㎍/ml NA 11.2
t 1 /2,종말 h 11.2 19.3
AUC 0 -∞ (h·㎍/ml)(mg/kg) 658.9 227.9
V ss ml/kg 37 NA
V z 또는 V z /F ml/kg 53.5 268
CL 또는 CL /F ml/h/kg 3.3 9.6
MRT h 11.2 19.8
생체이용률 % 34.6
Cmax, 약물의 피크 혈장 농도; tmax, 최대 혈장 농도의 시간; AUC0 -∞, 시간 0 내지 무한대의 혈장 약물 농도-시간 곡선 아래의 면적; t1 /2,종말, 종말 제거기 반감기; CL, 정맥 투여 후 소거; CL/F, 피하 투여 후 겉보기 소거; Vss, 정맥 투여 후 정상-상태에서의 분포 부피; Vz: 정맥 투여 후 말기 동안 분포 부피; Vz/F, 피하 투여 후 말기 동안 분포 부피; NA, 적용불가
정맥 프로파일의 말기에서의 5개 지점 및 피하 프로파일의 말기에서의 4개 지점을 종말 반감기 계산을 위해 선택하였다. 이러한 말기 동안 생성된 AUC는 각각의 정맥 및 피하 프로파일에 대해 전체 AUC의 약 10% 였다. 이는 최종 3개 지점이 종말 반감기 계산을 위해 선택된 경우 정맥 및 피하 프로파일에 대해 각각 전체 AUC의 단지 2% 및 4%인 것과 비교된다.
실시예 81: 작제물 ID # 3618인 BNP (2X)- HSA 생성
작제물 ID # 3618인 pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA는 포유류 발현 벡터 pC4에서 컨센서스 리더 서열, 세크레톤에 이어 HSA의 성숙한 형태의 아미노-말단에 직렬로 융합된 두 개의 프로세싱된 활성 BNP 펩티드 (아미노산 1-32)를 지니는 BNP 알부민 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함한다.
작제물 3618을 위한 BNP cDNA 의 클로닝
복제 BNP 부분을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 먼저 하기 기재된 4개의 프라이머 BNP-1, BNP-2, BNP-3 및 BNP-4를 사용하여 BNP의 프로세싱된 활성 형태 (아미노산 1-32)로부터 PCR 증폭시켜서, 두 개의 단편 A 및 B를 생성시켰다. 증폭 후, 두 개의 정제된 단편 (A 및 B)를 등몰량으로 혼합하고, PCR 주형으로서 사용하고, 이를 하기 기재된 프라이머 BNP-5 및 BNP-6를 사용하여 증폭시켰다. 그 후, BNP(2X) 인서트를 BamHI and ClaI로 분해하고, BamHI 및 ClaI로 미리 분해시킨 pC4HSA 벡터내로 연결시켜서, 작제물 3618을 생성시켰다. 작제물 ID # 3618은 컨센서스 리더 서열, 세크레콘 (SEQ ID No:111) 및 BNP의 프로세싱된 활성 형태의 두 개의 탠덤(tandem) 복사체에 이어 성숙한 HSA 단백질을 함유하는 알부민 융합 단백질을 엔코딩한다 (표 2의 작제물 3618에 대해서는 SEQ ID No:483을 참조하라).
먼저 BNP 단백질의 두 개의 단편을 엔코딩하는 폴리누클레오티드의 PCR 증폭을 위해 적합한 4개의 올리고누클레오티드를 합성하였다:
Figure 112012047901064-pat00042
BNP-1/BNP-2 및 BNP-3/BNP-4의 프라이머 세트를 사용하여, 두 개의 BNP 단백질 단편 (각각 A 및 B)을 PCR 증폭시켰다. 어닐링 및 신장 온도 및 시간은 각각의 특정 프라이머 쌍 및 주형에 대해 경험적으로 측정되어야 한다. 단편 A 및 B를 정제하고 (예를 들어, 위저드 PCR 프렙스 DNA 퓨리피케이션 시스템 (Wizard PCR Preps DNA Purification System) (Promega Corp)을 사용함), 등몰량으로 혼합하고, PCR 증폭을 위해 적합한 두 개의 추가의 올리고누클레오티드인 BNP-5 및 BNP-6을 사용하는 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다:
Figure 112012047901064-pat00043
BNP-5는 Bam HI 클로닝 부위 (밑줄그어져 있음), 컨센서스 서열 (SEQ ID No:111)을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 (이탤릭체로 되어 있음), 및 BNP의 최초 7개 아미노산 서열을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 (진한 글씨체로 되어 있음)를 포함한다. BNP-6에서, 밑줄그어진 서열은 Cla I 부위이고, 그 다음에 오는 폴리누클레오티드는 BNP의 최종 6개 아미노산 (진한 글씨체로 되어 있음) 및 성숙한 HSA 단백질의 최초 10개의 아미노산을 엔코딩하는 DNA의 역상보체를 함유한다. 이러한 두 개의 프라이머를 사용하여 컨센서스 리더 서열 및 활성 BNP 펩티드의 두 개의 탠덤 복사체를 PCR 증폭시켰다. 어닐링 및 신장 온도 및 시간은 각각의 특정 프라이머 쌍 및 주형에 대해 경험적으로 측정되어야 한다.
PCR 생성물을 정제 (예를 들어, 위저드 PCR 프렙스 DNA 퓨리피케이션 시스템 (Wizard PCR Preps DNA Purification System) (Promega Corp)을 사용함)한 후, Bam HI 및 Cla I로 분해하였다. Bam HI-Cla I 단편을 겔 전기영동에 의해 추가로 정제한 후, 생성물을 Bam HI / Cla I로 분해시킨 pC4:HSA내로 클로닝하여, 작제물 ID # 3618을 생성시켰다. 발현 작제물의 서열을 확인하였다.
작제물 ID # 3618의 발현 및 정제.
293F 세포에서의 발현.
작제물 ID # 3618인 pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA를 당 분야에 공지된 방법에 의해 293F 세포내로 트랜스펙션시켰다 (실시예 6 참조).
293F 세포 상층액으로부터의 정제.
작제물 ID # 3618에 의해 엔코딩되는 pC4:SPCON.BNP1-32(2x)/HSA를 실시예 80의 "203F 세포 상층액으로부터의 정제"라는 제목의 서브섹션에 기재된 바와 같이 정제하였다.
BNP (2X)- HSA 의 활성은 시험관내 NPR -A/ cGMP 검정을 사용하여 검정될 수 있다.
작제물 ID # 3618에 의해 엔코딩되는 BNP(2X)-HSA의 활성은 실시예 80의 "BNP-HSA의 활성은 시험관내 NPR-A/cGMP 검정을 사용하여 검정될 수 있다" 및 "NPR-A 203F 안정성 클론을 스크리닝하는 방법"이라는 제목의 서브섹션에 기재된 바와 같이 NPR-A/cGMP 검정을 사용하여 시험관내에서 검정될 수 있다.
결과
BNP(2X)-HSA 및 재조합 BNP의 투여량-반응 관계를 측정하였다 (도 8 참조). 작제물 ID # 3618에 의해 엔코딩된 BNP(2X)-HSA 및 재조합 BNP의 최대 활성은 유사하였고 (각각, 1.68±0.021 대 1.80±0.016pm), EC50 값은 각각 9.8±1.1 및 0.46±1.1nM 이었다.
본 출원에 인용된 각각의 문헌 (특허, 특허 출원, 특허 공개공보, 논문, 초록, 실험실 매뉴얼, 서적 또는 기타 발표물)의 전체 내용 뿐만 아니라 본 출원에 언급된 젠뱅크(GenBank), 젠세크(GeneSeq) 또는 CAS 레지스트리(Registry)와 같은 데이터베이스에 특이적인 식별번호를 통해 이용가능한 정보는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
또한, 다음 각각의 미국 출원의 명세서 및 서열 목록의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다: 2005년 2월 4일에 출원된 미국 출원 제 60/542,274호; 2004년 3월 5일에 출원된 미국 출원 제 60/549,901호, 2004년 3월 29일에 출원된 미국 출원 제 60/556,906호; 및 2004년 12월 17일에 출원된 미국 출원 제 60/636,603호.
기탁된 생물학적 물질에 대한 표시
(PCT Rule 13bis)
A. 하기 제공된 표시는 상세한 설명의 제 50면에 있는 표 3에 언급된 기탁된 생물학적 물질에 관한 것이다.
B. 기탁의 식별표시: 추가의 기탁은 또 다른 시트에서 확인 된다:
기탁기관 명칭: 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션
기탁기관 주소: 미국 20110-2209 버지니아
마나사스 유니버시티 불러바드 10801
Figure 112012047901064-pat00044
캐나다
본 출원인은 본 출원을 기초로 하여 캐나다 특허를 받거나, 본 출원이 거절되거나, 포기되어 더 이상 재생되지 않거나, 취하될 때까지 특허청장은 본 출원에 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플을 특허청장이 정하는 독립 전문가에게 제공하는 것만을 허가할 것을 요청하는 바이며, 이에 따라 본 출원인은 국제 출원의 공개를 위한 기술적 준비의 완료 전에 국제 사무국에 서면으로 통지해야 합니다.
노르웨이
본 출원인은 본 출원이 공중의 검사에 공개되거나 (노르웨이 특허청에 의해), 공개적 검사없이 노르웨이 특허청에 의해 최종 결정될 때까지 샘플의 제공이 당업자에게만 이루어질 것을 요청하는 바입니다. 이러한 요청은 본 출원이 노르웨이 특허법의 22절 및 33(3)절하에 공중에게 이용가능해지는 시점 이전에 본 출원인에 의해 노르웨이 특허청에 제출될 것입니다. 이러한 요청이 본 출원인에 의해 제출된 경우, 샘플의 제공을 위한 제 3자에 의해 이루어지는 임의의 요청은 사용하고자 하는 전문가를 나타낼 것입니다. 이러한 전문가는 노르웨이 특허청에 의해 작성된 인정된 전문가 목록에 등재된 임의의 사람 또는 개별적 경우에 본 출원인에 의해 승인된 임의의 사람일 수 있습니다.
호주
본 출원인은 미생물의 샘플의 제공은 특허결정 전, 또는 본 출원의 소멸, 거절 또는 취하 전에 본 발명에 이해관계가 없는 당업자에게만 이루어질 것을 통지하는 바입니다 (호주 특허 법규의 규칙 3.25(3)).
핀란드
본 출원인은 본 출원이 공중의 검사에 공개되거나 (특허 및 법규의 국가 위원회에 의해), 공중의 검사에 공개됨이 없이 특허 및 등록의 국가 위원회에 의해 최종 결정될 때까지 샘플의 제공은 당업자에게만 이루어질 것을 요청하는 바입니다.
영국
본 출원인은 미생물의 샘플의 제공이 전문가에게만 이용가능할 것을 요청하는 바입니다. 이러한 요청은 출원의 국제 공개를 위한 기술적 준비의 완료 전에 국제 사무국에 제출되어야 합니다.
덴마크
본 출원인은 본 출원이 공중의 검사에 공개되거나 (덴마크 특허청에 의해), 공중의 검사에 공개됨이 없이 덴마크 특허청에 의해 최종 결정될 때까지 샘플의 제공이 당업자에게만 이루어져야 할 것을 요청하는 바입니다. 이러한 요청은 본 출원이 덴마크 특허법의 22절 및 33(3)절하에 공중에게 이용가능해지는 시점 이전에 본 출원인에 의해 덴마크 특허청에 제출될 것입니다. 이러한 요청이 본 출원인에 의해 제출된 경우, 샘플의 제공을 위한 제 3자에 의해 이루어지는 임의의 요청은 사용하고자 하는 전문가를 나타낼 것입니다. 이러한 전문가는 덴마크 특허청에 의해 작성된 인정된 전문가 목록에 등재된 임의의 사람 또는 개별적 경우에 본 출원인에 의해 승인된 임의의 사람일 수 있습니다.
스웨덴
본 출원인은 본 출원이 공중의 검사에 공개되거나 (스웨덴 특허청에 의해), 공중의 검사에 공개됨이 없이 스웨덴 특허청에 의해 최종 결정될 때까지 샘플의 제공이 당업자에게만 이루어질 것을 요청하는 바입니다. 이러한 요청은 우선일로부터 16개월이 경과하기 전에 본 출원인에 의해 국제 사무국에 제출될 것입니다 (바람직하게는 PCT 출원인 가이드의 I권 부록 Z에 복사되어 있는 PCT/RO/134 양식으로). 이러한 요청이 본 출원인에 의해 제출된 경우, 샘플의 제공을 위한 제 3자에 의해 이루어지는 임의의 요청은 사용하고자 하는 전문가를 나타낼 것입니다. 이러한 전문가는 스웨덴 특허청에 의해 작성된 인정된 전문가 목록에 등재된 임의의 사람 또는 개별적 경우에 본 출원인에 의해 승인된 임의의 사람일 수 있습니다.
네덜란드
본 출원인은 네델란드 특허결정일 또는 출원의 거절, 취하 또는 소멸일까지 미생물은 특허 규칙의 31F(1)에 제공된 바와 같이 단지 전문가에 대한 샘플의 지급에 의해 이용가능할 것을 요청하는 바입니다. 이러한 요청은 본 출원이 네덜란드 왕국의 특허법의 22C절 또는 25절하에 공중에 이용가능해지는 일자 (두 가지 일자 중 빠른 때) 전에 본 출원인에 의해 네덜란드 특허청에 제출되어야 합니다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. (a) SEQ ID NO: 319, 및 (b) SEQ ID NO: 322로 이루어지는 군으로부터 선택되는 융합 단백질 아미노산 염기서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 GLP-1-알부민 융합 단백질 발현 작제물을 함유하는 숙주 세포로부터 발현된 알부민 융합 단백질.
  2. 알부민 융합 단백질로, 여기서 상기 알부민 융합 단백질은,
    알부민 융합 작제물로서 CID 3610을 함유하는 숙주 세포로부터 발현되는 알부민 융합 단백질.
  3. CID 3610을 포함하는 숙주 세포로부터 생성된 알부민 융합 단백질로, 여기서 상기 알부민 융합 단백질은 SEQ ID NO: 319의 아미노산 25 내지 669를 포함하는 알부민 융합 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항의 알부민 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 당뇨병 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 및 장애 중 하나 이상의 치료를 위한 조성물.
  5. SEQ ID NO: 319의 아미노산 염기서열을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서,
    여기서 상기 숙주 세포는 효모 세포 또는 포유동물 세포인 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    여기서 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 숙주 세포.
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