ES2532910T3 - Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos - Google Patents

Abstract

Variante de un polipéptido original que comprende una región Fc de una IgG1 o IgG3 humana, cuya variante presenta una afinidad de unión mejor con respecto al C1q humano que el polipéptido original y comprende una sustitución de aminoácidos en la región Fc de IgG en la posición del aminoácido 326, 333 o 334, siendo la numeración de los aminoácidos de la región Fc de la IgG la del índice EU tal como se indica en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Description

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cadena pesada de la IgG. Más preferentemente, los fragmentos de anticuerpos conservan toda la región constante de una cadena pesada de IgG y comprenden una cadena ligera de IgG.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades inferiores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y están dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que normalmente comprenden distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo al obtenerse a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención se pueden preparar mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o se pueden realizar mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo., la patente US n. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" se pueden aislar asimismo a partir de genotecas de anticuerpos en fagos utilizando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria comprenden específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos a partir de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particulares, aunque el resto de la(s) cadena(s) se idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de los anticuerpos obtenidos a partir de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica pretendida (patente US n. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que comprenden una secuencia mínima obtenida a partir de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los aminoácidos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por aminoácidos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que presenta la especificidad, la afinidad y la capacidad pretendida. En algunos casos, los aminoácidos de la región de marco de Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los aminoácidos correspondientes no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender aminoácidos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Dichas modificaciones se realizan para ajustar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y normalmente dos, dominios variables, correspondiendo todas o sustancialmente todas las asas hipervariables a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá asimismo opcionalmente por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. BioL 2:593-596 (1992).

El término "región hipervariable", cuando se utiliza en la presente memoria se refiere a los aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión con el antígeno. La región hipervariable comprende aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest ["Secuencias de proteínas de interés en Inmunología"], 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos aminoácidos de un "asa hipervariable" (es decir, los aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los aminoácidos "marco" o "FR" son aquellos aminoácidos del dominio variable distintos a los aminoácidos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoadhesina" indica moléculas similares a los anticuerpos que combinan el "dominio de unión" de una proteína "adhesina" heteróloga (por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con un dominio constante de una inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la especificidad de unión pretendida que es distinta del reconocimiento de antígenos y el sitio de unión (sitio de combinación con el antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de la inmunoglobulina.

El "dominio de unión con el ligando", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier receptor de superficie celular natural o a cualquier región o derivado del mismo que conserva por lo menos una capacidad cualitativa de unión con el ligando de un receptor natural correspondiente. En una forma de realización específica, el

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de unión con un ribosoma se une operativamente a una secuencia codificante si está dispone de tal modo que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. El enlace se alcanza mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se utilizan adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

En la presente memoria, las expresiones "célula", "estirpe celular" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente y todos estos términos comprenden la descendencia. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" comprenden la célula primaria en cuestión y los cultivos obtenidos de la misma independientemente del número de transferencias. Se entiende asimismo que toda la descendencia puede no ser exactamente idéntica en lo que se refiere al contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Ello incluye la descendencia mutante que presenta la misma función o actividad biológica que la examinada en la célula originalmente transformada. Cuando se pretenda utilizar designaciones distintas, quedará claro a partir del contexto.

El término "complejo molecular", cuando se utiliza en la presente memoria, se refiere a la estructura relativamente estable que se forma cuando se unen entre sí (preferentemente de un modo no covalente) dos o más moléculas heterólogas (por ejemplo, polipéptidos). El complejo molecular preferido en la presente memoria es un complejo inmunitario.

"Complejo inmunitario" se refiere a la estructura relativamente estable que se forma cuando por lo menos una molécula diana y por lo menos un polipéptido que contiene la región Fc heteróloga se enlazan entre sí formando un complejo de mayor peso molecular. Los ejemplos de complejos inmunitarios son los agregados antígeno-anticuerpo y los agregados molécula diana-inmunoadhesina. El término "complejo inmunitario", tal como se utiliza en la presente memoria, excepto cuando se indique lo contrario, se refiere a un complejo ex vivo (es decir, distinto a la forma o entorno en que se puede encontrar en la naturaleza). Sin embargo, el complejo inmunitario se puede administrar, por ejemplo, a un mamífero para analizar la depuración del complejo inmunitario en el mamífero.

El término "molécula diana" se refiere a una molécula, normalmente un polipéptido, que puede unirse a una molécula heteróloga y que presenta uno o más sitios de unión para la molécula heteróloga. El término "sitio de unión" se refiere a una región de una molécula al que se puede enlazar otra molécula. La "primera molécula diana", en la presente memoria, comprende por lo menos dos sitios de unión distintos (por ejemplo, entre dos y cinco sitios de unión separados) para un analito (por ejemplo, un polipéptido que contiene región Fc) de tal modo que se pueden unir por lo menos dos moléculas de analito a la primera molécula diana. En la forma de realización preferida de la presente invención, los dos o más sitios de unión son idénticos (por ejemplo, presentan la misma secuencia de aminoácidos, siendo la molécula diana un polipéptido). En el ejemplo 1 que se describirá posteriormente, la primera molécula diana fue una IgE y presentaba dos sitios de unión separados en la región Fc de la misma a los que podía unirse el polipéptido que contiene la región Fc (un anticuerpo anti-IgE, E27). Otras primeras moléculas diana comprenden dímeros de monómeros sustancialmente idénticos (por ejemplo, neurotrofinas, IL8 y VEGF) o son polipéptidos que comprenden dos o más cadenas polipeptídicas sustancialmente idénticas (por ejemplo, anticuerpos

o inmunoadhesinas). La "segunda molécula diana" comprende por lo menos dos sitios de unión distintos (por ejemplo, entre dos y cinco sitios de unión separados) para la primera molécula diana de tal modo que se pueden unir por lo menos dos primeras moléculas diana a la segunda molécula diana. Preferentemente, los dos o más sitios de unión son idénticos (por ejemplo, presentan la misma secuencia de aminoácidos, siendo la molécula diana un polipéptido). En el ejemplo 2, la segunda molécula diana fue VEGF, que presenta un par de sitios de unión distintos a los que se podía enlazar el dominio variable del anticuerpo IgE. Se contemplan otras segundas moléculas diana, por ejemplo, otros dímeros de monómeros sustancialmente idénticos (por ejemplo, neurotrofinas o IL8) o polipéptidos que comprenden dos o más dominios sustancialmente idénticos (por ejemplo, anticuerpos o inmunoadhesinas).

Un "analito" es una sustancia que se va a analizar. El analito preferido es un polipéptido que contiene región Fc que se va a analizar con respecto a su capacidad para unirse a un receptor Fc.

Un "receptor" es un polipéptido que puede unirse a por lo menos un ligando. El receptor preferido es un receptor de superficie celular que presenta un dominio de unión con un ligando extracelular y, opcionalmente, otros dominios (por ejemplo, un dominio transmembrana, un dominio intracelular y/o un anclaje de membrana). El receptor a analizar en el ensayo descrito en la presente memoria puede ser un receptor intacto o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende el dominio de unión del receptor fusionada a uno o más polipéptidos heterólogos). Además, el receptor a analizar con respecto a sus propiedades de enlace puede estar presentes en una célula o aislado y opcionalmente recubierto en una placa de ensayo o en alguna otra fase sólida.

La frase "receptor de baja afinidad" se refiere a un receptor que presenta una afinidad de unión débil para un ligando de interés, por ejemplo, que presenta una constante de enlace de aproximadamente 50 nM o una afinidad inferior.

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En la IgG1 y la IgG3 humanas el aminoácido 327 es una alanina. A fin de generar una variante con una mejor unión del C1q, dicha alanina se puede sustituir con otro aminoácido tal como glicina. En la IgG2 y la IgG4, el aminoácido 327 es una glicina y este se puede sustituir por alanina (u otro aminoácido) para disminuir el enlace con el C1q.

Preferentemente, se combinan las sustituciones en dos, tres o todas las posiciones 326, 327, 333 o 334, opcionalmente con otras sustituciones de la región Fc, para generar un polipéptido con una mejor unión con el C1q humano y, preferentemente una mejor actividad CDC in vitro o in vivo.

En una forma de realización, se altera únicamente una de las ocho posiciones identificadas anteriormente a fin de generar la variante polipeptídica. Preferentemente se altera únicamente un aminoácido 270, 329 o 322 si este es el caso. Alternativamente, se modifican dos o más de las posiciones identificadas anteriormente. Si se van a combinar sustituciones, generalmente sustituciones que mejoran la unión con el C1q humano (por ejemplo, se combinan las posiciones de los aminoácidos 326, 327, 333 y 334) o aquellas que disminuyen el enlace con el C1q humano (por ejemplo, las posiciones de los aminoácidos 270, 322, 329 y 331). En esta última forma de realización, se pueden sustituir las cuatro posiciones (es decir, 270, 322, 329 y 331). Se puede generar una variante en la que el aminoácido natural de la posición 329 de la región constante de la cadena pesada humana se sustituye con otro aminoácido, opcionalmente junto con una sustitución del aminoácido de la posición 331 y/o sustitución del aminoácido de la posición 322. De lo contrario, el aminoácido natural de la posición 331 y el aminoácido natural de la posición 322 de la región Fc de la IgG humana se pueden sustituir con otro aminoácido. Se puede combinar asimismo una sustitución de un aminoácido en la posición 270 con una o más sustituciones adicionales en las posiciones 322, 329 y/o 331.

El ADN que codifica la secuencia de aminoácidos variante del polipéptido inicial se prepara mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos comprenden, pero sin limitarse a los mismos, la preparación por mutagénesis dirigida al sitio (o en la que intervienen oligonucleótidos), mutagénesis por PCR y mutagénesis de casete de un DNA preparado anteriormente que codifica el polipéptido.

La mutagénesis dirigida es un procedimiento preferido para preparar variantes de sustitución. Dicho método es muy conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985) y Kunkel et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:488 (1987)). En pocas palabras, al realizar la mutagénesis dirigida al sitio de ADN, el ADN inicial se ve alterado por la primera hibridación de un oligonucleótido que codifica la mutación pretendida con una sola cadena de dicho ADN inicial. Tras la hibridación, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena, utilizando el oligonucleótido hibridado como cebador y utilizando la cadena única del ADN inicial como molde. De este modo, se incorpora el oligonucleótido que codifica la mutación pretendida en el ADN bicatenario resultante.

La mutagénesis por PCR también es apta para realizar variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido inicial. Véanse Higuchi, in PCR Protocols, p. 177-183 (Academic Press, 1990) y Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989). En pocas palabras, cuando se utilizan cantidades pequeñas de ADN molde como material inicial en una PCR, se pueden utilizar cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente de un ADN molde para generar unas cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia molde únicamente en las posiciones en las que los cebadores difieren del molde.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis de casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al., Gene 34:315-323 (1985). El material inicial es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN del polipéptido inicial a mutar. Se identifican uno o más codones del ADN inicial a mutar. Debe existir un único sitio de endonucleasa de restricción en cada lado del uno o más sitios de mutación identificados. Si no existen dichos sitios de restricción, pueden generarse utilizando el procedimiento de mutagénesis en la que intervienen oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlos en las posiciones adecuadas del ADN del polipéptido inicial. Se corta el ADN del plásmido en dichos sitios para linealizarlo. Se sintetizó un oligonucleótido bicatenario que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene una o más mutaciones pretendidas utilizando procedimientos estándar, en los que las dos cadenas del oligonucleótido se sintetizaron por separado y a continuación se hibridaron juntas utilizando técnicas estándar. Se conoce dicho oligonucleótido bicatenario como casete. Dicho casete está diseñado para presentar unos extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de tal modo que pueda ligarse directamente al plásmido. Dicho plásmido contiene ahora la secuencia de ADN mutada.

Alternativamente, o adicionalmente, se puede determinar la secuencia de aminoácidos pretendida que codifica una variante polipeptídica y se puede generar sintéticamente una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha variante de la secuencia de aminoácidos.

Se pueden someter la(s) variante(s) polipeptídica(s) preparada(s) de este modo a modificaciones adicionales, a menudo dependiendo del uso previsto del polipéptido. Dichas modificaciones pueden implicar la alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, la fusión a polipéptido(s) heterólogo(s) y/o modificaciones covalentes.

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interviene el complemento. A continuación se pueden añadir 50 μl de azul de alamar (Accumed International) a cada pocillo e incubar durante la noche a 37 °C. Se determina la absorbancia utilizando un fluorómetro de 96 pocillos con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados se pueden expresar en unidades de fluorescencia relativa (RFU). Las concentraciones de las muestras se pueden calcular a partir de una curva normal y se indica el porcentaje de la actividad en comparación con el polipéptido no variante para la variante polipeptídica de interés.

Otro ejemplo adicional de variante "no activa el complemento". Por ejemplo, 0,6μg/ml de la variante polipeptídica presentan aproximadamente entre el 0 y el 10 % de actividad de CDC en este ensayo en comparación con 0,6 μg/ml de un anticuerpo de control que presenta una región Fc de la IgG1 no mutada. Preferentemente, no parece que la variante presente actividad alguna de CDC en el ensayo de la CDC anterior.

La presente invención se refiere asimismo a una variante polipeptídica con una mejor CDC en comparación con un polipéptido original, por ejemplo, presentando entre aproximadamente dos veces y aproximadamente 100 veces una mejor actividad de CDC in vitro o in vivo (por ejemplo, en los valores de CI50 para cada molécula que se compara).

Preferentemente, la variante polipeptídica conserva sustancialmente la capacidad de unirse al antígeno en comparación con el polipéptido no variante, es decir, la capacidad de unión no es inferior a aproximadamente 20 veces, por ejemplo, no es inferior a aproximadamente 5 veces la del polipéptido no variante. Se puede determinar la capacidad de unión de la variante polipeptídica utilizando técnicas tales como, por ejemplo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o la precipitación radioinmunológica (RIA).

Se puede analizar asimismo la capacidad de la variante polipeptídica para unirse con un FcR. Cuando el FcR es un receptor de Fc de alta afinidad, tal como FcγRI o FcRn, se puede medir la unión mediante la valoración de la variante polipeptídica monomérica y determinando la variante polipeptídica unida utilizando un anticuerpo que se une específicamente a la variante polipeptídica en un formato de ELISA estándar (véase el ejemplo 2 posteriormente). En el apartado siguiente se describe más detalladamente otro ensayo de unión con el FcR de baja afinidad.

Preferentemente, la variante conserva la capacidad de unirse a uno o más FcR, por ejemplo, la capacidad de la variante polipeptídica para unirse a FcγRI, FcγRII, FcγRIII y/o FcRn es no se reduce más de aproximadamente 20 veces, preferentemente no es más de aproximadamente 10 veces inferior y más preferentemente no más de aproximadamente dos veces inferior en comparación con el polipéptido inicial tal como se determina en los ensayos de FcγRl o FcRn del ejemplo 2 o los ensayos de FcγRII o FcγRIII descritos en el apartado siguiente.

A.Ensayo de unión con el receptor y complejo inmunitario

En la presente memoria se describe el desarrollo de un ensayo de unión con el receptor que resulta particularmente útil para determinar la unión de un analito de interés con un receptor en el que la afinidad del analito hacia el receptor es relativamente baja, por ejemplo, de escala micromolar, tal como es el caso de FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa y FcγRIIIb. El procedimiento implica la formación de un complejo molecular que presenta una mejor afinidad hacia el receptor de interés en comparación con el analito que no forma complejo. El complejo molecular preferido es un complejo inmunitario que comprende: (a) un polipéptido que contiene la región Fc (tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina); (B) una primera molécula diana que comprende por lo menos dos sitios de unión para el polipéptido que contiene la región Fc; y (c) una segunda molécula diana que comprende por lo menos dos sitios de unión para la primera molécula objetivo.

En el ejemplo 1 que se describirá posteriormente, el polipéptido que contiene la región Fc es un anticuerpo anti-IgE, tal como el anticuerpo E27 (figuras 4A a 4B). El E27, cuando se mezcla con la IgE humana con una proporción molar de 1:1, forma un hexámero estable que consiste en tres moléculas de E27 y tres moléculas de IgE. En el ejemplo 1 que se describirá posteriormente, la "primera molécula diana" es una forma quimérica de la IgE en la que la parte Fab de un anticuerpo anti-VEGF se fusiona con la parte Fc de la IgE humana y la "segunda molécula diana" es el antígeno al que se fija la parte Fab (es decir, VEGF). Cada molécula de IgE se une con dos moléculas de VEGF.. La VEGF se une asimismo con dos moléculas de IgE por molécula de VEGF. Cuando se añadió VEGF humano recombinante con una proporción molar de 2:1 con respecto a los hexámeros IgE:E27, los hexámeros se enlazaron en complejos de un peso molecular superior mediante la interacción IgE:VEGF (figura 5). La región Fc del anticuerpo anti-IgE del complejo inmunitario resultante se une con el FcR con una afinidad superior que cualquier hexámero anti-IgE o anti-IgE:IgE sin formar complejo.

Se contemplan otras formas de complejos moleculares para utilizar en el ensayo del receptor. Los ejemplos que comprenden únicamente una combinación polipéptido que contiene una región Fc : primera molécula diana comprenden una combinación inmunoadhesina : ligando tal como el receptor VEGF (KDR) -immunoadhesina : VEGF y un anticuerpo biespecífico (BsAb) de longitud completa : primera molécula diana. Un ejemplo adicional de combinación polipéptido que contiene una región Fc : primera molécula diana : segunda molécula diana comprende

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Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembrana (por ejemplo, un receptor) o ligando tal como un factor de crecimiento. Los ejemplos de antígenos comprenden moléculas tales como la renina; una hormona del crecimiento, comprendiendo la hormona del crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina; el factor de liberación de la hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea; la tirotropina; lipoproteínas; la α-lantitripsina; la cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; la proinsulina; la folítropina; calcitonina; la lutotropina; el glucagón; factores de coagulación tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular y el factor von Willebrands; factores anticoagulantes como la Proteína C; factor natriurético atrial; un tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como la uroquinasa o activador del plasminógeno de la orina o de tipo tisular humano (t-PA); la bombesina; trombina; el factor del crecimiento hematopoyético; los factores α y β de la necrosis tumoral; la encefalinasa; RANTES (regulado en la activación de los linfocitos T expresados y secretados normalmente); la proteína inflamatoria de los macrófagos humanos (MIP-1-α); una seroalbúmina tal como la seroalbúmina humana; la sustancia inhibidora de Müller; la cadena A de la relaxina; la cadena B de la relaxina; la prorrelaxina; el péptido asociado a la gonadotropina murina; una proteína microbiana, tal como la β-lactamasa; la DNasa; la IgE; un antígeno asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA), tales como el CTLA-4; la inhibina; la activina; el factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; la proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurótrofo tal como el factor neurótrofo procedente del hueso (BDNF), la neurotrofina-3, -4, -5, -6 o (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como el NGF-β; el factor de crecimiento procedente de los trombocitos (PDGF); un factor de crecimiento de los fibroblastos tal como aFGF y bFGF; el factor de crecimiento epidérmico (EGF); un factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-α y TGF-β, comprendiendo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 o TGF-β5; el factor de crecimiento insulinoide I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I, proteínas de unión del factor de crecimiento insulinoide (IGF-I de cerebro); proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19 y CD20; la eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como el interferón α, β y γ; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (ILS), por ejemplo, IL-1 a IL10; la superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de superficie de membrana; factor de aceleración de la descomposición; un antígeno vírico tal como, por ejemplo, una parte de la cubierta del SIDA; proteínas de transporte; receptores de asentamiento; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como los receptores HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente.

Las dianas moleculares preferidas para los anticuerpos según la presente invención comprenden proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34; miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor de EGF, los receptores HER2, HER3 o HER4, moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y la integrina αv/β3 que comprenden las subunidades α o β de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antígenos de grupos sanguíneos; el receptor flk2/FLT3; el receptor de la obesidad (OB); el receptor mpl; CTLA-4; la proteína C, etc.

Se pueden utilizar antígenos o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas solubles, como inmunógenos para generar anticuerpos. En el caso de las moléculas transmembrana, tales como receptores, se pueden utilizar fragmentos de las mismas (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como inmunógeno. Alternativamente, se pueden utilizar las células que expresan la molécula transmembrana como inmunógeno. Dichas células se pueden obtener de una fuente natural (por ejemplo, estirpes de células cancerosas)

o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos resultarán evidentes para los expertos en la materia.

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Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se obtienen preferentemente en animales mediante una pluralidad e inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno correspondiente y un aditivo. Puede resultar útil conjugar el antígeno correspondiente con una proteína que sea inmunógena en la especie a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina o el inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación mediante aminoácidos cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante aminoácidos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R'N=C=NR, en la que R y R' son grupos alquilo distintos.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunógenos o derivados combinando, por ejemplo, 100 μg o 5 μg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de aditivo completo de Freund e inyectando la disolución por vía intradérmica en una pluralidad de sitios. Al cabo de un mes se administra a los animales una vacuna de recuerdo con entre 1/5 y 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en aditivo completo de Freund mediante inyección subcutánea en una pluralidad de sitios. Entre 7 y 14 días más tarde se procede a la sangría de los animales y se analiza el suero para con respecto al valor de anticuerpos. Se administran vacunas de recuerdo a los animales hasta que se estabiliza el valor. Preferentemente, se estimula el animal con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína distinta y/o con un

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origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente secuencia señal

La variante polipeptídica de la presente invención se puede producir por recombinación no solo directamente sino asimismo como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que presenta un sitio de escisión específico en el extremo aminoterminal de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferentemente una que la célula hospedador reconoce y procesa (es decir, la escinde mediante una peptidasa señal). En el caso de las células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal variante del polipéptido natural, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp o una secuencia guía de la enterotoxina termoestable II. En el caso de la secreción en levaduras, la secuencia señal natural se puede sustituir, por ejemplo, mediante la secuencia guía de la invertasa de la levadura, la secuencia guía del factor α (entre ellas las secuencias guía de factor α de Saccharomyces y Kluyveromyces) o la secuencia guía de la fosfatasa ácida, la secuencia guía de la glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, se dispone de las secuencias señal de los mamíferos así como las secuencias guía de secretores víricos, por ejemplo, la señal gD del herpes simple

El ADN para dicha región precursora se liga en marco de lectura al ADN que codifica la variante polipeptídica.

(ii) Origen del componente de replicación

Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación dicha secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico de la hospedadora y comprende los orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Resultan muy conocidas dichas secuencias para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apto para la mayoría de bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2μ es apto para levaduras y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, no se necesita el origen del componente de replicación para los vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 normalmente se puede utilizar únicamente porque contiene el promotor inicial).

(iii) Componente del gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, denominado asimismo marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) proporcionan resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener la multiplicación de una célula hospedadora. Aquellas células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que proporciona resistencia al fármaco y, por lo tanto, sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables aptos para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico variante del polipéptido, tales como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferentemente genes de metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula hospedadora apta cuando se emplea la DHFR natural es la estirpe celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de la DHFR.

Alternativamente, se pueden seleccionar células hospedadoras (en particular hospedadoras naturales que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican la variante polipeptídica, la proteína DHFR natural y otro marcador seleccionable tal como la aminoglicósido-3'-fosfotransferasa (APH) con respecto a una multiplicación celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase la patente US n. 4.965.199.

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Un gen de selección apto para utilizar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de la levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de multiplicarse en triptófano, por ejemplo, la ATCC n. 44.076 o la PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula hospedadora de la levadura proporciona de este modo un entorno efectivo para detectar la transformación por multiplicación sin triptófano. De un modo similar, las cepas de levadura que carecen de Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos que presentan el gen Leu2.

Además, se pueden utilizar los vectores procedentes del plásmido circular 1,6 de μm pKD1 en la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se describió de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Se han descrito asimismo vectores de expresión multicopia estables para la secreción de seroalbúmina humana recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que el organismo hospedador reconoce y se une funcionalmente al ácido nucleico de la variante polipeptídica. Los promotores aptos para utilizar con hospedadores procariotas comprenden el promotor phoA, los sistemas del promotor de la β-lactamasa y la lactosa, la fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp), y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, son aptos otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos contendrán asimismo una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) unida funcionalmente al ADN que codifica la variante polipeptídica.

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas presentan una región rica en AT ubicada aproximadamente entre 25 y 30 bases cadena arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra entre 70 y 80 bases cadena arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas existe una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se introducen de un modo adecuado en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras aptas para utilizar con hospedadores de levadura comprenden los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de multiplicación, son las regiones promotoras de alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas catalíticas asociadas al metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores aptos para utilizar en la expresión de levaduras se describen asimismo en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levaduras se utilizan asimismo ventajosamente con promotores de levaduras.

Se controla la transcripción de la variante polipeptídica a partir de vectores en células hospedadoras de mamífero, por ejemplo, mediante promotores procedentes de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el virus de los simios 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de la inmunoglobulina, de promotores del choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.

Los promotores iniciales y finales del virus SV40 se obtienen ventajosamente como fragmento de restricción del SV40 que contiene asimismo el origen vírico de la replicación del SV40. El promotor inicial inmediato del citomegalovirus humano se obtiene ventajosamente como fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar el ADN en huéspedes de mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la patente US n. 4.419.446. Una modificación de dicho sistema se describe en la patente de US n. 4.601.978. Véase asimismo Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del interferón β humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, se puede utilizar como promotor la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

(v) Componente del elemento potenciador

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