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KR20210005879A - 인터류킨-23 수용체에 특이적인 키메라 항원 수용체 - Google Patents

인터류킨-23 수용체에 특이적인 키메라 항원 수용체 Download PDF

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KR20210005879A
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KR
South Korea
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seq
cells
sequence
car
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KR1020207032065A
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토비아스 아벨
줄리 게트너-다덴느
프랑수아 메이어
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상가모 테라퓨틱스 프랑스
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Abstract

본 발명은 IL-23 수용체에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 이를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 CAR을 발현하는 T 세포 및 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

인터류킨-23 수용체에 특이적인 키메라 항원 수용체
본 발명은 면역요법 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인터류킨-23 수용체에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR), 상기 CAR을 발현하는 T 세포 및 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
IL-12 사이토카인 계열의 구성원인 인터류킨-23 (IL-23)은 두 개의 서브유닛, p19 및 p40으로 구성된다. IL-23에 대한 수용체 (IL-23R)는 IL-12Rβ1 하위단위와 착화된 IL-23Rα 서브유닛으로 구성되며, 이것은 IL-12 수용체의 공통 서브유닛이며 티로신 키나제 2 (Tyk2)와 상호작용한다. IL-23R은 야누스 키나제 2 (JAK2)와 구성적으로 연관되며 IL-23에 의한 이의 활성화시 STAT3 및 STAT4와 연관된다.
IL-23R은 주로 면역 세포, 특히 T 세포 (예를 들어, Th17 및 γδ T 세포), 대식세포, 수지상 세포 및 NK 세포 상에서 발현된다 (Duvallet et al., 2011). 최근, 활성화되지 않은 호중구가 기저량의 IL-23R을 발현하고 IL-23R 발현이 세포 활성화시 증가하는 것으로 나타났다 (Chen et al., 2016).
IL-23에 의한 IL-23R 활성화는 IL-23R 인산화 뿐만 아니라, 일단 인산화되면, 핵으로 전위되어 결과적으로 전사 인자 RORγt의 발현을 유도하는 STAT3 및 STAT4 형성 동종이량체의 동원을 유도한다. RORγt는 결국 면역 반응의 활성화에 관여하는 IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-6 및 IFN-γ와 같은 하류(downstream) 전염증성 사이토카인의 전사를 활성화시킨다 (Razawy et al., 2018, Sivanesan et al., 2016 and Duvallet et al., 2011). 특히, IL-23/IL-23R 신호전달 경로가 IL-17-분비 면역 세포, 특히 CD4+ Th17 세포 및 γδ T 세포의 증식 및 분화를 촉진하는데 중요한 것으로 기술되었다.
당업계에서, IL23R의 발현은 자가면역 질환 및 만성 염증의 출현 및 유지에 관여하는 병원성 염증 세포의 공통적인 특징으로 기술되었다. 표면에서의 IL23R의 발현은 IL23 노출에 의해 유도되며, 염증 수준에 따라 좌우된다. 인간 세포에서, RNA 수준에서의 IL23R의 발현이 잘 문서화되어 있지만, 세포 표면 상의 단백질의 존재에 대해 및 이에 따라 표적 제제에 대한 이의 이용가능성에 대해서는 거의 나타나 있지 않았다.
IL-23/IL-23R 신호전달 경로의 억제는 자가면역 및 염증성 질환 또는 장애에 대한 가능한 치료적 접근법으로서 조사되었다. 특히, IL-12p40 서브유닛에 대해 지시된 항체인 우스테키누맙 (Ustekinumab)이 크론병을 가진 비-반응성 환자 및 건선을 가진 환자에서 성공적인 결과를 갖는 것으로 시험되었다 (Fegan et al., 2016, Mease et al., 2015). 우스테키누맙은 미국에서 건선용 치료제로 승인되었다. 그러나, 사례 보고에서는 우스테키누맙으로 치료한 후 4명의 환자에서 건선성 관절염이 악화된 것으로 밝혀졌다 (Simon et al., 2016).
또한, 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 장기 치료를 위해서는, 내성의 유도가 필요하며, 이것은 사이토카인을 표적으로 할 경우 수득되지 않을 수 있다.
결과적으로, 선행 기술의 방법의 결점을 나타내지 않으면서 IL-23/IL-23R 신호전달 경로를 억제하여 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 여전히 필요하다.
본원의 출원인은 IL-23R에 대해 지시된 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 상기 IL-23R CAR을 발현하는 Treg 세포 집단을 제공한다. 상기 Treg 세포 집단은 특히 IL-23R 발현 세포와 관련된 질환 또는 장애, 특히 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 IL-23 수용체 (IL-23R)에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)에 관한 것이며, 여기서 상기 CAR은 다음을 포함한다:
(i) 세포외 결합 도메인 (여기서, 상기 결합 도메인은 상기 IL-23R에 결합한다),
(ii) 임의로 세포외 힌지 도메인(extracellular hinge domain),
(iii) 막관통 도메인(transmembrane domain),
(iv) 세포내 신호전달 도메인, 및
(v) 임의로 태그(tag) 및/또는 리더(leader) 서열.
하나의 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 상기 IL-23R에 대해 지시된 scFv 단편을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 상기 IL-23R에 대해 지시된 scFv 단편을 포함하며, 여기서 상기 scFv는
- 서열 번호 37의 서열 또는 서열 번호 37과 적어도 약 70% 동일성(identity)을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH),
- 서열 번호 38, 46 및 56을 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 및 상기 서열 번호 38, 46 또는 56과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL), 및
- 임의로 VH와 VL 사이의 링커를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 상기 IL-23R에 대해 지시된 scFv 단편을 포함하며, 여기서 scFv는 서열 번호 55의 서열 또는 서열 번호 55와 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 바람직하게는 서열 번호 13의 서열 또는 서열 번호 13과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 인간 CD8의 힌지 영역이다.
하나의 실시양태에서, 막관통 도메인은 바람직하게는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 21과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 인간 CD8α로부터 유래된 막관통 도메인이다.
하나의 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 바람직하게는 서열 번호 29의 서열 또는 서열 번호 29와 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 인간 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인 및 바람직하게는 서열 번호 26의 서열 또는 서열 번호 26과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 T 세포 일차 신호전달 인간 CD3 제타를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 다음을 포함한다:
(i) 바람직하게는 (G4S)3 링커 (서열 번호 3)에 의해 연결된 서열 번호 37의 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 38의 서열을 갖는 VL을 포함하는 항-IL-23R scFv,
(ii) CD8α로부터 유래된 힌지 도메인, 바람직하게는 서열 번호 13,
(iii) 인간 CD8α 막관통 도메인, 바람직하게는 서열 번호 21,
(iv) 인간 4-1BB 신호전달 도메인, 바람직하게는 서열 번호 29 및 인간 CD3 제타 도메인, 바람직하게는 서열 번호 26을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및
(v) 임의로 태그 및/또는 리더 서열.
본 발명은 추가로 상기한 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기한 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 IL-23 수용체에 특이적인 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 T 세포 집단에 관한 것이며, 여기서 상기 CAR은 다음을 포함한다:
(i) 세포외 결합 도메인 (여기서, 상기 결합 도메인은 상기 IL-23R에 결합한다),
(ii) 임의로 세포외 힌지 도메인,
(iii) 막관통 도메인,
(iv) 세포내 신호전달 도메인, 및
(v) 임의로 태그 및/또는 리더 서열.
하나의 실시양태에서, 상기 T 세포 집단은 조절 T 세포 집단이다.
하나의 실시양태에서, 상기 T 세포 집단은 CD4+CD25+Foxp3+ Treg, Tr1 세포, TGF-β 분비 Th3 세포, 조절 NKT 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 CD8+ T 세포, 및 이중 음성 조절 T 세포를 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 Treg 세포 집단이다.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 IL-23 수용체에 특이적인 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 적어도 하나의 T 세포 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 CAR은 다음을 포함한다:
(i) 세포외 결합 도메인 (여기서, 상기 결합 도메인은 상기 IL-23R에 결합한다),
(ii) 임의로 세포외 힌지 도메인,
(iii) 막관통 도메인,
(iv) 세포내 신호전달 도메인, 및
(v) 임의로 태그 및/또는 리더 서열.
하나의 실시양태에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이며 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 IL-23 수용체에 특이적인 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 T 세포 집단을 수득하기 위한 생체외 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 CAR은 다음을 포함하고:
(i) 세포외 결합 도메인 (여기서, 상기 결합 도메인은 상기 적어도 하나의 IL-23R에 결합한다),
(ii) 임의로 세포외 힌지 도메인,
(iii) 막관통 도메인,
(iv) 세포내 신호전달 도메인, 및
(v) 임의로 태그 및/또는 리더 서열,
여기서 상기 방법은 IL-23R-CAR을 암호화하는 핵산을 사용한 적어도 하나의 T 세포의 유전자 변형, 바람직하게는 형질도입 단계, 및 임의로 형질도입된 세포의 확장 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 IL-23 수용체에 특이적인 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 적어도 하나의 T 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, IL-23R 발현 세포-매개 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 CAR은 다음을 포함한다:
(i) 세포외 결합 도메인 (여기서, 상기 결합 도메인은 상기 적어도 하나의 IL-23R에 결합한다),
(ii) 임의로 세포외 힌지 도메인,
(iii) 막관통 도메인,
(iv) 세포내 신호전달 도메인, 및
(v) 임의로 태그 및/또는 리더 서열.
본 발명은 추가로 IL-23R 발현 세포-매개 질환 또는 장애를 치료하기 위한 또는 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 T 세포 집단 또는 본원에 기술된 바와 같은 조성물에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 상기 IL-23R 발현 세포-매개 질환 또는 장애는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애이다.
하나의 실시양태에서, 상기 IL-23R 발현 세포-매개 질환 또는 장애는 염증성 장 질환 (예를 들면, 크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)), 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 소아 특발성 관절염 (juvenile idiopathic arthritis), 쇼그렌 증후군 (sjoegren syndrome), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 1형 당뇨병 (Type 1 diabete), 자가면역성 갑상선 장애 (autoimmune thyroid disorder), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 중증 근무력증 (Myasthenia Gravis), 건선 (psoriasis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis) 또는 포도막염 (uveitis)을 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 상기 IL-23R 발현 세포-매개 질환은 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애, 바람직하게는 크론병 (Crohn's disease)이다.
정의
본 발명에서, 하기 용어들은 다음의 의미를 갖는다:
- 용어 "하나 (a 및 an)"는 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 지칭한다. 예를 들어, "요소 (an element)"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
- 용어 "약"은, 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하는데 적절하기 때문에, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 일부 경우 ±10%, 또는 일부 경우 ±5%, 또는 일부 경우 ±1%, 또는 일부 경우 ±0.1%의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
- 본원에서 사용된 용어 "활성화"는 검출 가능한 세포 반응을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포 (예를 들어, 조절 T 세포)의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 사이토카인 생성 또는 억제 활성과 같은 검출 가능한 이펙터 기능(들)과 연관될 수 있다. 용어 "활성화된" 조절 T 세포는 그중에서도 면역 반응을 억제할 수 있는 조절 T 세포를 지칭한다.
- 본원에서 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론 또는 단클론, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있으며, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 다중특이 항체 (예를 들어, 이중특이 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체와 같은 면역글로불린 분자의 다량체일 수 있다. 기본 4-사슬 항체 단위는 두 개의 동일한 경쇄 (L) 및 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종사량체 당단백질이다. 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 이들의 불변 도메인 (CL)의 아미노산 서열을 기반으로 카파 ([kappa]) 및 람다 ([lambda])라고 하는 두 가지 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 할당될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 다른 부류 또는 이소타입에 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 5가지 부류가 있다: 각각 알파 ([alpha]), 델타 ([delta]), 엡실론 ([epsilon]), 감마 ([gamma]) 및 뮤 ([mu])로 지정된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. [gamma] 및 [alpha] 부류는 CH 서열 및 기능의 상대적으로 작은 차이를 기준으로 하위부류로 더욱 나뉘며, 예를 들어 인간은 다음 하위부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2. 각 L 사슬은 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 반면 두 개의 H 사슬은 H 사슬 이소타입에 따라 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고 그 뒤에 [alpha] 및 [gamma] 사슬 각각에 대해 3개의 불변 도메인 (CH)을 갖고 [mu] 및 [epsilon] 이소타입에 대해 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고 그 뒤에 이의 다른 말단에 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 믿어진다. VH와 VL의 쌍은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. IgM 항체는 J 사슬이라고 하는 추가 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종사량체 단위로 구성되고, 따라서, 10개의 항원-결합 부위를 함유하는 반면 분비된 IgA 항체는 중합되어 J 사슬과 함께 기본 4-사슬 단위 중 2-5개를 포함하는 다가 어셈블리를 형성할 수 있다. IgG의 경우에, 4-사슬 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 항체의 상이한 부류의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6]을 참조한다.
- 본원에서 사용된 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단에 포함된 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이며 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 달리, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 특이성 외에도, 단클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 단클론 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 만들어질 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). "단클론 항체"는 또한 예를 들면 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본원에서 단클론 항체는 "키메라" 항체를 포함한다.
- 용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/불안정화, 공간 분포에 의해) 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 온전한 항체의 적어도 하나의 부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디설파이드-결합된 Fv (sdFv), VH 및 CHI 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 선형 항체, sdAb (VL 또는 VH)와 같은 단일 도메인 항체, 낙타과 VHH 도메인, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이 항체, 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv에 삽입될 수 있다 (예를 들어, 참조; Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 타입 III과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드에 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기술하는 미국 특허 제6,703,199호 참조). 항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편이라고 하는 두 개의 동일한 항원-결합 단편, 및 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영하는 명칭인 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH)과 하나의 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)과 함께 전체 L 사슬로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이며, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디설파이드 결합된 Fab 단편에 대략 상응하고 여전히 항원을 가교결합할 수 있는 단일 큰 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에 추가로 수 개의 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 보유하는 Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
- 항체의 "Fc" 단편은 디설파이드에 의해 함께 보유된 H 사슬 둘 다의 카복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이기도 한 Fc 영역의 서열에 의해 결정된다.
- "Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 단단한 비공유 결합의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 두 도메인의 접힘으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 사슬로부터 각각 3개 루프)가 생성된다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에서도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
- 용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어 합성 링커, 예를 들어 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고 단일 사슬 폴리펩티드로서 발현될 수 있으며, 여기서 scFv는 이들이 유래되는 온전한 항체의 특이성을 보유한다. 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 scFv는, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 대해 임의의 순서로 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있으며, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
- "온전한" 항체는 항원-결합 부위 뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. "천연 서열 (native sequence)" 폴리뉴클레오티드는 자연으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. "천연 서열" 폴리펩티드는 자연으로부터 (예를 들어, 임의의 종으로부터) 유래된 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 천연 서열 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다.
- 용어 "항체 중쇄"는 자연적으로 발생하는 형태에서 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭하며 이것이 통상적으로 항체가 속하는 부류를 결정한다.
- 용어 "항체 경쇄"는 자연적으로 발생하는 형태에서 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 (K) 및 람다 (λ) 경쇄는 두 가지 주요 항체 경쇄 이소타입을 지칭한다.
- 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 일으키는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산 및/또는 특정 면역적격 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 거의 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 숙련된 기술자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원"을 암호화한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업계의 숙련가는 항원이 반드시 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명이 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이러한 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 암호화하기 위해 다양한 조합으로 정렬된다는 것은 쉽게 명백하다. 또한, 숙련된 기술자는 항원이 반드시 "유전자"에 의해 암호화될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 합성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 다른 생물학적 성분을 가진 조직 샘플, 세포 또는 유체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
- 모노바디로도 알려진 용어 "애드넥틴 (adnectin)"은 당업계에 잘 알려져 있으며 항원에 대한 높은 친화성 및 특이성으로 결합하도록 설계된 단백질을 지칭한다. 이들은 집합적으로 "항체 모방체"라고 불리는 분자의 부류에 속한다.
- 세포-관통 알파바디 (Cell-Penetrating Alphabodies)로도 지칭될 수 있는, 본원에 사용된 용어 "알파바디"는 다양한 항원에 결합하도록 조작된 작은 10 kDa 단백질로 구성된 항체 모방체의 한 유형을 지칭한다. 알파바디는 세포내 단백질 표적에 도달하고 결합할 수 있다.
- 용어 "애피바디"는 당업계에 잘 알려져 있으며 스타필로코커스 단백질 A의 IgG 결합 도메인 중 하나로부터 유래된 58개 아미노산 잔기 단백질 도메인에 기초한 친화성 단백질을 지칭한다.
- 용어 "애필린"은 당업계에 잘 알려져 있으며 항원에 선택적으로 결합하도록 설계된 인공 단백질을 지칭한다. 이들은 항원에 대한 친화성 및 특이성에 있어서 항체와 유사하지만 항체 모방체의 일종으로 만드는 구조에 있어서는 그렇지 않다.
- 용어 "안티칼린"은 당업계에 잘 알려져 있으며 결합 특이성이 리포칼린으로부터 유도되는 항체 모방 기술을 지칭한다. 안티칼린은 또한 듀오칼린 (Duocalin)이라고 불리는 이중 표적 단백질로서 포맷될 수 있다.
- 본원에 사용된 용어 "아르마딜로 반복 단백질-기반 스캐폴드"는 아르마딜로 반복 단백질에 기반한 인공 펩티드 결합 스캐폴드에 상응하는 항체 모방체의 한 유형을 지칭한다. 아르마딜로 반복 단백질은 대략 42개 아미노산의 텐덤 아르마딜로 반복체로 구성된 아르마딜로 도메인을 특징으로 하며, 이것은 펩티드 또는 단백질과의 상호작용을 매개한다.
- 용어 "애트리머 (atrimer)"는 당업계에 잘 알려져 있으며 생물학적 활성을 위한 필요조건으로서 삼량체화하는 표적 단백질에 대한 결합 분자를 지칭한다. 이들은 다른 항체 모방체 스캐폴드에 비해 상대적으로 크다.
- 용어 "애비머 (avimer)"는 당업계에 잘 알려져 있으며 항체 모방 기술을 지칭한다.
- 용어 "DARPins" (설계된 안키린 반복 단백질)는 당업계에 잘 알려져 있으며 비-항체 폴리펩티드의 결합 능력을 이용하기 위해 개발된 항체 모방 DRP (설계된 반복 단백질) 기술을 지칭한다.
- 용어 "디아바디"는 V 도메인의 사슬내가 아닌 사슬간 쌍이 달성되어 2가 단편, 즉 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록 VH 및 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)를 갖는 scFv 단편을 작제함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이 디아바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 2개의 "교차" scFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는, 예를 들면, 제EP 0404097호; 제WO 93/11161호; 및 문헌 [Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 충분히 기술되어 있다.
- 용어 "에바신 (evasin)"은 당업계에 잘 알려져 있으며 케모카인-결합 단백질의 한 부류를 지칭한다.
- 용어 "피노머 (fynomer)"는 당업계에 잘 알려져 있으며 항체 모방체의 부류에 속하는 단백질을 지칭한다. 이들은 높은 열 안정성과 감소된 면역원성으로 인해 매력적인 결합 분자이다.
- 본원에 사용된 용어 "노틴 (knottin)" (억제제 시스틴 매듭으로도 지칭될 수 있음)은 3개의 디설파이드 브릿지를 함유하는 단백질 구조적 모티프를 포함하는 항체 모방체를 지칭한다.
- 용어 "도메인 쿠니츠 펩티드 (domain kunitz peptide)"는 항체 모방체의 한 유형을 지칭하며, 프로테아제의 기능을 억제하는 단백질의 활성 도메인을 기반으로 한다.
- 용어 "나노바디"는 당업계에 잘 알려져 있으며 자연 발생 중쇄 항체의 독특한 구조적 및 기능적 특성을 함유하는 항체-유래 치료 단백질을 지칭한다. 이러한 중쇄 항체는 단일 가변 도메인 (VHH)과 두 개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 함유한다.
- 용어 "유니바디 (unibody)"는 당업계에 잘 알려져 있으며 IgG4 항체의 힌지 영역이 없는 항체 단편을 지칭한다. 힌지 영역의 결실은 본질적으로 종래의 IgG4 항체의 절반 크기이고 IgG4 항체의 2가 결합 영역보다는 1가 결합 영역을 갖는 분자를 야기한다.
- 용어 "베르사바디 (versabody)"는 당업계에 잘 알려져 있으며 또 다른 항체 모방 기술을 지칭한다. 이들은 >15% 시스테인을 갖는 3-5 kDa의 작은 단백질이며, 높은 디설파이드 밀도 스캐폴드를 형성하여 전형적인 단백질이 갖는 소수성 코어를 대체한다.
- 용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)와 착화된 외래 항원을 표면에 표시하는 보조 세포 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포 등)와 같은 면역계 세포를 지칭한다. T-세포는 이들의 T-세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이러한 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 처리하여 이들을 T 세포에 제시한다.
- 용어 "동종이계 (allogeneic)"은 물질이 도입된 개체와 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 개체는 하나 이상의 유전자좌의 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종이계라고 한다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 유전적으로 충분히 달라서 항원적으로 상호작용할 수 있다.
- 용어 "자가조직 (autologous)"은 나중에 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
- 용어 "키메라 수용체 또는 키메라 항원 수용체 또는 CR 또는 CAR"은 면역 세포에 있을 때, 표적 리간드에 대한 특이성과 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는 하나의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 세트, 전형적으로 가장 간단한 실시양태에서 두 개의 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세트는 서로 인접한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 폴리펩티드의 세트를 포함하는 키메라 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재시 폴리펩티드를 서로 결합시킬 수 있는, 예를 들어 리간드 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 결합시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 키메라 수용체는 키메라 수용체 융합 단백질의 아미노-말단 (N-ter)에 임의의 리더 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 키메라 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하며, 여기서 리더 서열은 임의로 세포 처리 및 세포 막에의 키메라 수용체의 국재화 동안 리간드 결합 도메인으로부터 절단된다.
- 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 단백질의 생물학적 기능에 유의하게 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 표준 기술에 의해 단백질에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 펩티드 화학 분야의 숙련가가 폴리펩티드의 2차 구조 및 수치요법적 (hydropathic) 성질이 실질적으로 변하지 않을 것으로 예상하도록 아미노산 잔기가 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 따라서 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 다양한 전술한 특징을 고려한 예시적인 치환은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다. 아미노산 치환은 추가로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에 있어서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산은 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 또 다른 그룹은 다음을 포함한다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 또 다른 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 키메라 수용체 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 키메라 수용체는 본원에 기술된 기능적 분석을 사용하여 시험될 수 있다.
- 용어 "구성적" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 유전자 산물이 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건하에 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
- 용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여 증식과 같지만 이에 제한되지 않는 T 세포에 의한 공동자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 기여하는 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극 분자는 다음의 단백질 패밀리로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체.
- 본원에 사용된 용어 "로부터 유래된"은 제1 분자와 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이것은 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하며 제2 분자로부터 유래되는 제1 분자에 대한 프로세스 또는 소스 제한을 내포하거나 포함하지 않는다. 예를 들면, CD3 제타 분자로부터 유래되는 세포내 신호전달 도메인의 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 필요한 기능, 즉 적절한 조건하에서 신호를 생성하는 능력을 갖도록 하기에 충분한 CD3 제타 구조를 보유한다. 이것은 세포내 신호전달 도메인을 생산하는 특정 과정에 대한 제한을 내포하거나 포함하지 않으며, 예를 들어, 이것은 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위해 CD3 제타 서열로 시작하고 원치 않는 서열을 결실하거나 돌연변이를 도입하여 세포내 신호전달 도메인에 도달해야 한다는 것을 의미하지 않는다.
- 용어 "암호화"는 뉴클레오티드 (예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 및 이로부터 야기된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 작용하는 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 그 유전자에 해당하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 암호화한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 서열 목록에 통상적으로 제공되는 코딩 가닥과 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 산물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 퇴화된 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. "단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열"이라는 어구는 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
- 용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 그 내부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
- 용어 "조작된" 또는 "변형된"은 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포를 지칭한다.
- 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 그 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
- 용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
- 용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 함유됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하여 당업계에 공지된 모든 것들을 포함한다.
- 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자와 같은 2개의 핵산 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 분자 모두의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우; 예를 들어, 두 개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되면, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 두 서열 사이의 상동성은 일치하거나 상동성인 위치의 수의 직접적인 함수이며; 예를 들어, 두 서열에서 위치의 절반 (예를 들어, 길이가 10개의 서브유닛인 중합체에서 5개 위치)이 상동성이면, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90% (예를 들어, 10 중 9)가 일치하거나 상동성이면, 두 서열은 90% 상동성이다. 따라서, 용어 "상동성인" 또는 "동일한"은, 둘 이상의 폴리펩티드 또는 둘 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계에서 사용될 때, 둘 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기의 스트링 간의 일치 수에 의해 결정되는 바와 같이 폴리펩티드 또는 핵산 분자 사이의 서열 관련성의 정도를 지칭한다. "동일성"은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 처리된 간격 정렬 (있는 경우)을 갖는 둘 이상의 서열 중 더 작은 서열 간의 동일한 일치의 퍼센트를 측정한다. 관련 폴리펩티드의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법은 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New　York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]에 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 간에 가장 큰 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 기술되어 있다. 두 서열 간의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. ＼2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul et al., J. MoI. Biol. 215, 403-410 (1990))를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 및 기타 출처로부터 공개적으로 이용 가능하다 (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). 잘 알려진 스미스 워터만 (Smith Waterman) 알고리즘이 또한 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
- 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태라는 용어는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합 하위서열)을 지칭한다. 대부분의 경우, 인간화 항체 및 이의 항체 단편은 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체/항체 단편은 수용자 항체에서도 임포트된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 더욱 개선하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항체 단편은 실질적으로 모든 적어도 하나의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 FR 영역의 전부 또는 상당 부분은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]]을 참고한다.
- 본원에서 사용된 "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하는데 사용되는 주형을 포함한다.
- 용어 "유도성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재하는 경우에만 실질적으로 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
- 본원에 사용된 "5' 캡" (RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡이라고도 함)은 전사 시작 직후 진핵 전달자 RNA의 "전방" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 따라서 5' 캡은 첫 번째 전사된 뉴클레오티드에 연결된 말단 그룹으로 구성된다. 이의 존재는 리보솜에 의한 인식과 RNase로부터의 보호에 중요하다. 캡 부가는 전사와 결합되고, 각각이 서로에게 영향을 미치도록 공동-전사적으로 발생한다. 전사 시작 직후, 합성되는 mRNA의 5' 말단은 RNA 중합 효소와 연관된 캡-합성 복합체에 의해 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학 반응으로 진행된다. 캡핑 모이어티는 이의 안정성 또는 번역 효율과 같은 mRNA의 기능을 조절하도록 변형될 수 있다.
- 본 발명의 맥락에서, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 다음 약어가 사용된다. "A"는 아데닌을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아닌을 지칭하고, "T"는 티민을 지칭하고, "U"는 우라실을 지칭한다.
- 용어 "지침 자료"는 출판물, 기록물, 다이어그램, 또는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 지침 자료는, 예를 들면, 본 발명의 세포를 함유하는 용기에 부착되거나 본 발명의 세포를 함유하는 용기와 함께 운송될 수 있다. 대안적으로, 지침 자료는 수용자가 지침 자료를 협조적으로 사용할 의도로 용기와는 별도로 운송될 수 있다.
- 본원에 사용된 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 세포를 함유하는 키메라 수용체의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 키메라 수용체-T 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 세포용해 활성, 억제 활성, 조절 활성 및 사이토카인 분비를 포함한 헬퍼 활성을 포함할 수 있다.
- 용어 "단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"되지 않지만, 이의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 펩티드는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들면, 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다. 전형적으로, 단리된 핵산 또는 펩티드의 제제는 적어도 약 80% 순수한, 적어도 약 85% 순수한, 적어도 약 90% 순수한, 적어도 약 95% 순수한, 95% 이상 순수한, 약 96% 이상 순수한, 약 97% 이상 순수한, 약 98% 이상 순수한, 또는 약 99% 이상 순수한 핵산 또는 펩티드를 함유한다. "단리된 핵산"은 천연 서열을 자연적으로 수반하는 리보솜 및 중합 효소와 같은 단백질 또는 복합체 뿐만 아니라 다른 게놈 DNA 서열로부터 실질적으로 분리된 핵산이다. 이 용어는 자연 발생 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 복제된 DNA 단리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. "단리된 폴리펩티드"는 자연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드이다.
- 용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 (Retroviridae) 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하다; 이들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있어서, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다.
- 용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에 제공된 바와 같은 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하여 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 진료소에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 Oxford BioMedica로부터의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen으로부터의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용 가능하며 당업계의 숙련가에게 알려져 있을 것이다.
- 용어 "리간드"는 한 쌍의 리간드/수용체의 구성원을 지칭하며, 쌍의 다른 구성원에 결합한다.
- 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)과 같은 포스포디에스테르 결합에 의해 공유적으로 연결된 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립 유전자, 오르소로그, SNP, 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 함축적으로 포함한다. 특히, 퇴화 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
- 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "전사 제어"는 이종성 핵산 서열의 발현을 초래하는, 조절 서열과 이종성 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭한다. 예를 들면, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 제2 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있으며, 예를 들어, 두 개의 단백질 코딩 영역을 연결하는데 필요한 경우, 동일한 판독 프레임에 있다.
- 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 두 개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 예를 들면 당업계에서 일반적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄 및 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭하며, 이들 중에는 많은 유형이 있다. "폴리펩티드"는, 예를 들면, 특히 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
- 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제" 또는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 동물, 바람직하게는 인간에게 투여되는 경우 부작용, 알레르기 반응 또는 기타 원치않는 반응을 일으키지 않는 부형제를 지칭한다. 이것은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 기관 또는 EMA와 같은 규제 기관에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
- 용어 "폴리(A)"는 mRNA에 부착된 일련의 아데노신 모노포스페이트를 지칭한다. 일시적 발현을 위한 작제물의 하나의 실시양태에서, 폴리A는 50 내지 5000개 아데노신 모노포스페이트, 바람직하게는 64개 이상, 보다 바람직하게는 100개 이상, 가장 바람직하게는 300개 또는 400개 이상의 아데노신 모노포스페이트이다. 폴리(A) 서열은 국재화, 안정성 또는 번역 효율과 같은 mRNA 기능을 조절하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
- 용어 "폴리아데닐화"는 메신저 RNA 분자에 대한 폴리아데닐릴 모이어티 또는 이의 변형된 변이체의 공유 연결을 지칭한다. 진핵 생물에서, 대부분의 메신저 RNA (mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리 (A) 꼬리는 효소인 폴리아데닐레이트 중합 효소의 작용을 통해 프리-mRNA에 부가된 긴 서열의 아데닌 뉴클레오티드 (종종 수백 개)이다. 고등 진핵생물에서는, 폴리(A) 꼬리가 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체에 부가된다. 폴리(A) 꼬리 및 이에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는데 도움이 된다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, 핵으로부터의 mRNA의 엑스포트, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA가 RNA로 전사된 직후 핵에서 발생하지만, 추가로 또한 나중에 세포질에서 발생할 수도 있다. 전사가 종료된 후, mRNA 사슬은 RNA 중합 효소와 관련된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처에 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후, 아데노신 잔기가 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가된다.
- 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
- 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고 다른 경우에, 이 서열은 또한 유전자 산물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 기타 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들면, 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
- 용어 "재조합 단백질 또는 펩티드"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체), 예를 들면, 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현되는 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체)를 지칭한다. 용어는 또한 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체)를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고 DNA 분자가 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체), 또는 단백질 또는 펩티드를 지정하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체)을 발현하는 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, 항체)를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용 가능하고 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
- 용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 응답함으로써 이펙터로서 기능함으로써 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하기 위해 세포 내에 정보를 전송함으로써 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
- 용어 "신호 전달 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호를 전달하는 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 간의 생화학적 관계를 지칭한다.
- 용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플에 존재하는 결합 파트너를 인식하여 결합하지만 항체 또는 리간드가 샘플의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
- 용어 "자극"은 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 키메라 수용체)를 이의 동족 리간드와 결합시켜 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 또는 키메라 수용체의 신호전달 도메인을 통한 신호 전달과 같지만 이에 제한되지 않는 신호 전달 사건을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
- 용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대해 자극 방식으로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 하나의 측면에서, 신호는 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 T 세포 반응의 매개를 야기하는 1차 신호이다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 ("1차 신호전달 도메인"이라고도 함)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
- 용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체를 포함하는 것으로 의도된다 (예를 들어, 포유류, 인간). 하나의 실시양태에서, 대상체는 의료 관리를 받기를 기다리고 있거나 받고 있거나 의료 절차의 대상이었거나/대상이거나/대상일 것이거나, 예를 들면, 염증성 또는 자가면역 병태와 같은 표적 질환 또는 병태의 발병에 대해 모니터링되는 "환자", 즉 온혈 동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 대상체는 성인 (예를 들면, 18세 이상의 대상체)이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 어린이 (예를 들면, 18세 미만의 대상체)이다. 하나의 실시양태에서, 대상체는 남성이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 여성이다. 하나의 실시양태에서, 대상체는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애, 예를 들면, 자가항체-매개된 자가면역 질환에 영향을 받고, 바람직하게는 이러한 질환으로 진단된다. 하나의 실시양태에서, 대상체는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애, 예를 들면, 자가항체-매개된 자가면역 질환의 발병 위험이 있다. 위험 인자의 예는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 유전적 소인 또는 가족력을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
- 용어 "실질적으로 정제된 세포"는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연적으로 발생하는 상태에서 정상적으로 연관되는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 실질적으로 정제된 세포는 자연적으로 발생하는 상태에서 정상적으로 연관되는 다른 세포 유형을 적어도 약 75%, 80%, 또는 85%, 바람직하게는 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 함유하지 않는 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 적어도 약 75%, 80%, 또는 85% 균질한, 바람직하게는 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 균질한 세포의 집단을 지칭한다. 또 다른 경우에, 이 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 연관되는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 또 다른 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
- 용어 "치료적 유효량"은 특정 생물학적 결과를 달성하는데 효과적인 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 발현하는 세포의 양을 지칭한다. 따라서, 용어 "치료적 유효량"은 표적에 심각한 부정적 또는 유해한 부작용을 일으키지 않으면서 (1) 표적 질환 또는 병태의 발병을 지연 또는 예방하는 것; (2) 표적 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 진행, 심각화 또는 악화를 늦추거나 중지하는 것; (3) 표적 질환 또는 병태의 증상의 개선을 야기하는 것; (4) 표적 질환 또는 병태의 중증도 또는 발생률을 감소시키는 것; 또는 (5) 표적 질환 또는 병태를 치료하는 것을 목표로 하는 제제의 수준 또는 양을 의미한다. 치료적 유효량은 예방 또는 방지 작용을 위해서는 표적 질환 또는 병태의 발병 전에 투여될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 치료적 유효량은 치료적 작용을 위해서는 표적 질환 또는 병태의 개시 후에 투여될 수 있다.
- 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
- 용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 또한, 예를 들면, 폴리 리신 화합물, 리포솜 등과 같은 세포로의 핵산의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
- 본원에 사용된 "일시적"은 수 시간, 수 일 또는 수 주의 기간 동안의 비-통합된 이식유전자의 발현을 지칭하며, 여기서 발현 기간은 게놈에 통합되거나 숙주 세포에서 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 함유되는 경우 유전자의 발현 기간보다 작다.
- 본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 표적 질환 또는 병태, 예를 들어, 자가면역 병태의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선, 또는 표적 질환 또는 병태, 예를 들어, 자가면역 병태의 하나 이상의 증상 (바람직하게는, 하나 이상의 식별 가능한 증상)의 개선을 지칭하며, 여기서 상기 개선은 하나 이상의 요법 (예를 들어, 본 발명의 Treg 세포와 같은 하나 이상의 치료제)의 투여로부터 야기된다. 특정 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 표적 질환 또는 병태, 예를 들어, 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 적어도 하나의 측정 가능한 신체적 매개변수의 개선을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 신체적으로, 예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화에 의한, 생리학적으로, 예를 들어, 신체적 매개변수의 안정화에 의한, 또는 둘 다에 의한 표적 질환 또는 병태, 예를 들어, 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 진행의 억제를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 표적 질환 또는 병태, 예를 들어, 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선, 또는 표적 질환 또는 병태, 예를 들어, 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개선을 지칭한다. "치료하는" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하며; 여기서 목적은 표적 질환 또는 병태를 예방하거나 늦추는 것 (완화)이다. 치료를 필요로 하는 것은 이미 질병을 가진 것 뿐만 아니라 질병에 걸리기 쉬운 것 또는 질병을 예방해야 하는 것을 포함한다. 대상체는 본 발명에 따른 키메라 수용체를 포함하는 치료량의 세포 집단을 제공받은 후 대상체가 다음 중 하나 이상에서 관찰 가능하고/하거나 측정 가능한 개선을 보이는 경우 질환 또는 병태에 대해 성공적으로 "치료"된 것이다: 병원성 세포의 수 감소; 병원성인 전체 세포의 퍼센트 감소; 특정 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화; 이환율 및 사망률 감소 및/또는 삶의 질 문제 개선. 병태의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 매개변수는 의사에게 친숙한 일상적인 절차에 의해 쉽게 측정 가능하다.
- 용어 "Treg 세포"는, 예를 들면, 자가면역 또는 알레르기 반응과 같은 과도하거나 원치않는 염증 반응을 저해, 억제 또는 예방할 수 있는 세포를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포 집단은 억제 활성을 할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 억제 활성은 접촉 비의존적이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 억제 활성은 접촉 의존적이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포 집단은 이펙터 T 세포에 대해 억제 활성을 나타내며, 바람직하게는 상기 억제 작용은 TCR 발현 및/또는 활성화에 의존한다.
- 본원에 사용된 용어 폴리뉴클레오티드 "변이체"는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에서 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드와는 전형적으로 상이한 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 변이체는 자연 발생적일 수 있거나, 예를 들면, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키고 본원에 기술된 바와 같고/같거나 다수의 당업계에 잘 알려진 기술 중의 어느 것을 사용하여 암호화된 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 평가함으로써 합성적으로 생성될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드 변이체"는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에서 본원에 구체적으로 개시된 폴리펩티드와는 전형적으로 상이한 폴리펩티드이다. 이러한 변이체는 자연 발생적일 수 있거나, 예를 들면, 상기 폴리펩티드 서열 중 하나 이상을 변형시키고 본원에 기술된 바와 같고/같거나 다수의 당업계에 잘 알려진 기술 중의 어느 것을 사용하여 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 평가함으로써 합성적으로 생성될 수 있다. 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 구조에서 이루어질 수 있으며, 바람직한 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩티드를 암호화하는 기능성 분자를 여전히 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하여 본 발명의 폴리펩티드의 동등하거나 심지어 개선된 변이체 또는 일부를 생성하는 것이 바람직한 경우, 당업계의 숙련가는 전형적으로 코딩 DNA 서열의 하나 이상의 코돈을 변경할 것이다. 예를 들면, 특정 아미노산은 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 항원) 또는 세포에 결합하는 능력의 현저한 상실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 생물학적 기능 활성을 정의하는 것은 단백질의 결합 능력과 특성이기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환은 단백질 서열에서, 그리고 물론 이의 기본 DNA 코딩 서열에서 이루어질 수 있으며, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서 다양한 변화가 생물학적 유용성 또는 활성의 현저한 상실 없이 본 발명의 펩티드 서열, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열에서 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 다수의 경우에, 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 것이다. 변이체는 또한, 또는 대안적으로, 비-보존적 변경을 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 5개 이하의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 천연 서열과는 다르다. 변이체는 또한 (또는 대안적으로), 예를 들면, 폴리펩티드의 면역원성, 2차 구조 및 친수성 성질에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변형될 수 있다.
- 용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 GenBank Acc. No. BAG36664.1로서 제공되는 단백질, 또는 비인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기로서 정의되며, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전송하기에 충분한 제타 사슬의 세포질 도메인, 또는 이의 기능적 유도체로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 하나의 실시양태에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank Acc. No. BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 또는 이의 기능적 오르소로그인 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가 잔기를 포함한다.
상세한 설명
본 발명의 제1 목적은 적어도 하나의 IL-23 수용체 (IL-23R)에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)이며, 여기서 상기 CAR은 (i) 세포외 결합 도메인 (여기서, 상기 결합 도메인은 상기 IL-23R에 결합한다 (세포외 IL-23R 결합 도메인이라고도 할 수 있음)), (ii) 임의로 세포외 힌지 도메인, (iii) 임의로 막관통 도메인, (iv) 세포내 신호전달 도메인, 및 (v) 임의로 태그 및/또는 리더 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 세포 표면 상에 발현된 IL-23R을 인식하고 이에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 가용성 IL-23R (즉, 막 결합되지 않음)을 인식하고 이에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 인간 IL-23R을 인식하고 이에 결합한다. 인간 IL-23R은 11개의 엑손을 포함하는 2.8 kb 길이 mRNA에 의해 암호화된 단백질이다 (Genbank 수탁 번호: NM_144701).
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 변이체, 바람직하게는 인간 IL-23R의 변이체를 인식하고 이에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, IL-23R의 변이체 펩티드는 원래 펩티드에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 변형된 IL-23R 펩티드를 지칭한다.
인간 IL-23R의 스플라이스 변이체는 이전에 동정되었다 (Kan et al, 2008). 특히, IL-23R의 24가지 상이한 이소형이 기술되었다: 이소형_v1 (Genbank 수탁 번호 AM990313을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v2 (Genbank 수탁 번호 AM990314를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v3 (Genbank 수탁 번호 AM990315를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v4 (Genbank 수탁 번호 AM990316을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v5 (Genbank 수탁 번호 AM990317을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v6 (Genbank 수탁 번호 AM990318을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v7 (Genbank 수탁 번호 AM990319를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v8 (Genbank 수탁 번호 AM990320을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v9 (Genbank 수탁 번호 AM990321을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v10 (Genbank 수탁 번호 AM990322를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v11 (Genbank 수탁 번호 AM990323을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v12 (Genbank 수탁 번호 AM990324를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v13 (Genbank 수탁 번호 AM990325를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v14 (Genbank 수탁 번호 AM990326을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v15 (Genbank 수탁 번호 AM990327을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v16 (Genbank 수탁 번호 AM990328을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v17 (Genbank 수탁 번호 AM990329를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v18 (Genbank 수탁 번호 AM990330을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v19 (Genbank 수탁 번호 AM990331을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v20 (Genbank 수탁 번호 AM990332를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v21 (Genbank 수탁 번호 AM990333을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v22 (Genbank 수탁 번호 AM990334를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨), 이소형_v23 (Genbank 수탁 번호 AM990335를 갖는 mRNA에 의해 암호화됨) 및 이소형_v24 (Genbank 수탁 번호 AM990336을 갖는 mRNA에 의해 암호화됨).
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 이소형_v1, 이소형_v2, 이소형_v3, 이소형_v4, 이소형_v5, 이소형_v6, 이소형_v7, 이소형_v8, 이소형_v9, 이소형_v10, 이소형_v11, 이소형_v12, 이소형_v13, 이소형_v14, 이소형_v15, 이소형_v16, 이소형_v17, 이소형_v18, 이소형_v19, 이소형_v20, 이소형_v21, 이소형_v22, 이소형_v23 및 이소형_v24를 포함하는 그룹으로부터 선택된 인간 IL-23R의 스플라이스 변이체를 인식하고 이에 결합할 수 있다.
또한, 인간 IL-23R의 알파 서브유닛의 단일 뉴클레오티드 다형성은 이전에 기술되었다 (Kan et al., 2008 and Sivanesan et al. 2016).
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 알파 서브유닛에 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 IL-23R 변이체를 인식하고 이에 결합할 수 있으며, 여기서 상기 SNP는 R381Q, G149R, V362I 및 이들의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 뮤린 IL-23R을 인식하고 이에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 세포외 IL-23R 결합 도메인은 IL-23R에 대해 지시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 본 발명의 CAR의 부분은, 예를 들면, 단일 사슬 항체 (scFv), 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 인간화 항체 또는 이중특이 항체를 포함하여 항원 결합 도메인이 인접한 폴리펩티드 사슬의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 전체 항체, 단일 사슬 항체, 이량체 단일 사슬 항체, Fv, scFv, Fab, F(ab)'2, 탈푸코실화 항체, 이중특이 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 유니바디, 도메인 항체, 나노바디, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 세포외 IL-23R 결합 도메인은 항체 모방체이다. 항체 모방체의 예는 애피바디, 알파바디, 아르마딜로 반복 단백질 기반 스캐폴드, 노틴, 쿠니츠 도메인 펩티드, 애필린, 애피틴, 애드넥틴, 애트리머, 에바신, DARPin, 안티칼린, 애비머, 피노머, 베르사바디 또는 듀오칼린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포외 결합 도메인은, 예를 들면, scFv와 같은 항체 단편을 포함하거나 이들로 구성된다.
주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme)]에 기술된 것들 또는 이들의 조합을 포함하여 다수의 잘 알려진 체계 중 어느 것을 사용하여 결정될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR에 포함된 항체는 다중특이 항체 분자이며, 예를 들어, 이것은 다수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고 복수의 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 다중특이 항체 분자는 이중특이 항체 분자이다. 이중특이 항체는 2개 이하의 항원에 대한 특이성을 갖는다. 이중특이 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
하나의 실시양태에서, CAR은 서열 번호 37의 서열, 또는 서열 번호 37과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 갖는 중쇄 VH를 포함하는 scFv를 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, CAR은 서열 번호 38, 46 및 56 또는 상기 서열 번호 38, 46 및 56과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 그룹으로부터 선택된 경쇄 VL을 포함하는 scFv를 포함하거나 이들로 구성되고, 바람직하게는 서열 번호 38의 서열 또는 상기 서열 번호 38과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, scFv는 서열 번호 37 (또는 상기 서열 번호 37과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 중쇄 VH 및 서열 번호 38, 46, 56 및 상기 서열 번호 38, 46 및 56과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 그룹으로부터 선택된 경쇄 VL, 바람직하게는 서열 번호 38 (또는 상기 서열 번호 38과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, scFv는 서열 번호 37 (또는 상기 서열 번호 37과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 중쇄 VH 및 서열 번호 38 (또는 상기 서열 번호 38과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 경쇄 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, scFv는 서열 번호 37 (또는 상기 서열 번호 37과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 중쇄 VH 및 서열 번호 46 (또는 상기 서열 번호 46과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 경쇄 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, scFv는 서열 번호 37 (또는 상기 서열 번호 37과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 중쇄 VH 및 서열 번호 56 (또는 상기 서열 번호 56과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열)을 갖는 경쇄 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, scFv는 VH와 VL 사슬을 연결하는 링커를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 링커는 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 범위의 길이를 갖는 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드이다.
예를 들면, 글리신-세린 이중선은 특히 적합한 힌지 도메인 (GS 링커)을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 Gly/Ser 링커이다. Gly/Ser 링커의 예는 GS 링커, G2S 링커, G3S 링커, G4S 링커를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
G2S 링커의 비제한적인 예는 GGS이다.
G3S 링커는 (GGGS)n 또는 (서열 번호 1)n이라고도 하는 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1　이상의 양의 정수이다 (예를 들면, n=l, n=2, n=3. n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 또는 n=10). G3S 링커의 예는 GGGSGGGSGGGSGGGS (서열 번호 6)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
G4S 링커의 예는 GGGGS (서열 번호　5)에 상응하는 (Gly4 Ser); GGGGSGGGGS (서열 번호　4)에 상응하는 (Gly4 Ser)2; GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 3)에 상응하는 (Gly4Ser)3; 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호 2)에 상응하는 (Gly4 Ser)4를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 링커는 (G4S)3 링커 (서열 번호 3)이다.
하나의 실시양태에서, scFv는 서열 번호 55, 서열 번호　36 또는 서열 번호 57의 서열 또는 상기 서열 번호 55, 서열 번호 36 또는 서열 번호 57과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 실시양태에서, scFv는 서열 번호 55의 서열 또는 상기 서열 번호 55와 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 세포외 IL-23R 결합 도메인 및 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 이러한 실시양태에 따르면, 본 발명의 CAR은 IL-23R 및 적어도 하나의 다른 항원에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R, 및 별개의 항원 또는 리간드에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 상의 제1 에피토프 및 동일한 IL-23R 상의 별개의 에피토프에 결합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R, 및 별개의 IL-23R (예를 들면, IL-23R의 변이체)에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인은 특정 항원에 대해 지시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인은 항체 단편, 예를 들면, scFv를 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원에 결합할 수 있다.
용어 "일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원"은 다음 비제한적 목록의 식품 항원과 같이 인간에게 일반적인 식품에서 유래한 면역원성 펩티드를 지칭한다: 소 항원, 예를 들어 리포칼린, Ca-결합 S100, 알파-락트알부민, 락토글로불린, 예를 들어 베타-락토글로불린, 소 혈청 알부민, 카제인. 식품-항원은 또한 파브알부민과 같은 대서양 연어 항원; 오보뮤코이드, 난백알부민, Ag22, 콘알부민, 리소자임 또는 닭 혈청 알부민과 같은 닭 항원; 땅콩 항원; 트로포미오신과 같은 새우 항원; 응집소 또는 글리아딘과 같은 밀 항원; 샐러리 프로필린과 같은 샐러리 항원; 당근 프로필린과 같은 당근 항원; 타우마틴, 사과 지질 전달 단백질, 또는 사과 프로필린과 같은 사과 항원; 배 프로필린, 또는 이소플라본 리덕타제와 같은 배 항원; 엔도키티나제와 같은 아보카도 항원; 살구 지질 전달 단백질과 같은 살구 항원; 복숭아 지질 전달 단백질 또는 복숭아 프로필린과 같은 복숭아 항원; HPS, 대두 프로필린 또는 (SAM22) PR-I0 프로트와 같은 대두 항원; 이의 단편, 변이체 및 혼합물일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은, 예를 들면, 다발성 경화증-관련 항원, 관절-관련 항원, 눈-관련 항원, 인간 HSP 항원, 피부-관련 항원 또는 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원과 같은 자가항원에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 용어 "다발성 경화증-관련 항원"은 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 관련 당단백질 (MAG), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 희소돌기 아교세포 미엘린 올리고단백질 (OMGP), 미엘린 관련 희소돌기 아교세포 염기성 단백질 (MOBP), 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP/Claudinl 1), 열 충격 단백질, 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP), NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22 (PMP22), 2'3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제 (CNPase), 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다.
하나의 실시양태에서, 용어 "관절-관련 항원"은 시트룰린-치환된 사이클릭 및 선형 필라그린 펩티드, 타입 II 콜라겐 펩티드, 인간 연골 당단백질 39 (HCgp39) 펩티드, HSP, 이종 핵 리보핵단백질 (hnRNP) A2 펩티드, hnRNP B1, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 및 HSP90, BiP, 케라틴, 비멘틴, 피브리노겐, 타입 I, III, IV 및 V 콜라겐 펩티드, 아넥신 V, 글루코스 6 포스페이트 이소머라제 (GPI), 아세틸-칼파스타틴, 피루베이트 데하이드로게나제 (PDH), 알돌라제, 토포이소머라제 I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, 음이온성 카디오리핀 및 포스파티딜세린, 중성 하전된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린을 포함한 인지질 항원, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 피브릴린, 아그레칸, 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다. 관절-관련 항원의 또 다른 예는 시트룰린화 비멘틴, 시트룰린화 타입 II 콜라겐, 시트룰린화 피브리노겐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 용어 "눈-관련 항원"은 타입 II 콜라겐, 레티날 아레스틴, S-아레스틴, 광수용체간 레티노이드-결합 단백질 (IRBP1), 베타-크리스탈린 B1, 레티날 단백질, 맥락막 단백질 및 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다. 눈-관련 항원의 또 다른 예는 시트룰린화 비멘틴, 시트룰린화 타입 II 콜라겐, 시트룰린화 피브리노겐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 용어 "인간 HSP 항원"은 인간 HSP60, HSP70, HSP90, 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다.
하나의 실시양태에서, 항원은 염증성 신경계 병태-관련 항원, 바람직하게는 다발성 경화증-관련 항원이다. 염증성 신경계 병태-관련 항원, 바람직하게는 다발성 경화증-관련 항원의 예는 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 관련 당단백질 (MAG), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 희소돌기 아교세포 미엘린 올리고단백질 (OMGP), 미엘린 관련 희소돌기 아교세포 염기성 단백질 (MOBP), 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP/Claudinl 1), 열 충격 단백질, 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP), NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22 (PMP22), 2'3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제 (CNPase), 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 피부-관련 항원이다. 피부-관련 항원의 예는 각질 세포 항원, 진피 또는 표피에 존재하는 항원, 멜라닌 세포 항원 (예를 들면, 멜라닌 또는 티로시나제), 데스모글레인 (예를 들어, Dsg1/3이라고도 할 수 있는 데스모글레인 1 또는 3), BP180, BP230, 플렉틴, 인테그린 (예를 들어, 인테그린 α4β6), 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 타입 VII), 라미닌 (예를 들어, 라미닌 332 또는 라미닌 γ1), 플라킨 (예를 들어, 엔보플라킨, 페리플라킨, 또는 데스모플라킨), 케라틴 (예를 들어, KRT5, KRT8, KRT15, KRT17 및 KRT31), 케라틴 필라멘트-관련 단백질, 필라그린, 코르네오데스모신, 및 엘라스틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원이다. 이러한 항원의 예는 이식된 조직 또는 숙주에 특이적인 MHC, β2-마이크로글로불린, ABO 시스템으로부터의 항원, 레수스 시스템으로부터의 항원 (특히 C, c, E et e 및 D 시스템으로부터의 항원) 및 이소헤마글루티닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이식 거부 또는 GVHD에 관여할 수 있는 항원의 또 다른 예는 HLA-DR (특히 이식 후 처음 6개월 동안), HLA-B (특히 이식 후 처음 2년 동안), HLA-A, 작은 조직적합성 항원 (miHA, 예를 들어, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G), MHC 클래스 I에 상응하는 HLA (A, B, 및 C), MHC 클래스 II에 상응하는 HLA (DP, DM, DOA, DOB, DQ, 및 DR) 및 MHC 클래스 III에 상응하는 HLA (예를 들어, 보체 시스템의 성분)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 HLA-A2 세포 표면 단백질이다. 하나의 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 HLA-A2에 대해 지시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "HLA-A2"는 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌에서 HLA-A*02 대립 유전자 패밀리에 의해 암호화된 세포 표면 단백질을 포함하는 인간 백혈구 항원 (HLA) 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A2"에 의해 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 검사 또는 유전형 분석에 의해 HLA-A*02 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*02 항원 유형의 추가 명칭은 "HLA-A2", "HLA-A02" 및 "HLA-A*2"를 포함한다. HLA 시스템의 요인에 대해 WHO 위원회에 의해 2010년에 개발된 HLA 명명 시스템을 포함하여 이러한 대립 유전자 패밀리에 의해 암호화된 HLA 단백질을 동정하는 다른 명명 시스템이 개발되었다. 용어 "HLA-A2"는 "HLA-A*02:01", "HLA-A*02:02", "HLA-A*02:03", "HLA-A*02:04", "HLA-A*02:05", "HLA-A*02:06", "HLA-A*02:07", "HLA-A*02:08", "HLA-A*02:09", "HLA-A*02:10", 및 "HLA-A*02:11"로 시작하는 명칭을 포함하지만 이에 제한되지 않는 "HLA-A*02"로 시작하는 이러한 명명 시스템에 따른 명칭을 갖는 대립 유전자에 의해 암호화된 HLA 단백질을 지칭한다. 대립 유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. "HLA-A*02:"로 시작하는 대립 유전자 명칭 뒤에 2개 또는 3개의 추가 숫자는 완전한 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 용어 "HLA-A2"는 명칭 "HLA-A*02:01", "HLA-A*02:02", "HLA-A*02:03", "HLA-A*02:04", "HLA-A*02:05", "HLA-A*02:06", "HLA-A*02:07", "HLA-A*02:08", "HLA-A*02:09", "HLA-A*02:10", 및 "HLA-A*02:11"을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 이러한 명명 시스템에 따라 "HLA-A*02"로 시작하는 명칭으로 확인된 HLA 단백질을 지칭한다.
자가항원의 또 다른 예는, 제한함이 없이, 아쿠아포린 수분 통로 (예를 들면, 아쿠아포린-4 수분 통로 (AQP4)), Hu, Ma2, 콜랩신 응답-매개자 단백질 5 (CRMP5), 및 암피피신, 전압-개폐 칼륨 통로 (VGKC),　N-메틸-d-아스파르테이트 수용체 (NMDAR), α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로프리온산 (AMPAR), 갑상선 퍼옥시다제, 티로글로불린, 항-N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NR1 서브유닛), Rh 혈액형 항원, I 항원, 데스모글레인 1 또는 3 (Dsg1/3), BP180, BP230, 아세틸콜린 니코틴성 시냅스후 수용체, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 혈소판 인테그린, GpIIb:IIIa, 콜라겐 (예를 들면, 콜라겐 알파-3(IV) 사슬), 류머티즘 인자, 칼파스타틴, 시트룰린화 단백질, 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG) 펩티드, 알파-베타-크리스탈린, DNA, 히스톤, 리보솜, RNP, 조직 트랜스글루타미나제 (TG2), 내인성 인자, 65-kDa 항원, 포스파티딜세린, 리보솜 인단백질, 항-호중구 세포질 항체, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, 항-SSB, 항핵 항체 (ANA), 항호중구 세포질 항체 (ANCA), Jo-1, 항미토콘드리아 항체, gp210, p62, sp100, 항인지질 항체, U1-70 kd snRNP, GQ1b 강글리오시드, GM1, 아시알로 GM1, GD1b, 항-평활근 항체 (ASMA), 항-간-신장 마이크로솜-1 항체 (ALKM-1), 항-간 시토졸 항체-1 (ALC-1), IgA 항근섬유막 항체, 호중구 과립 단백질, 스트렙토코커스 세포 벽 항원, 위 벽 세포의 내인성 인자, 인슐린 (IAA), 글루탐산 데카복실라제 (GAA 또는 GAD) 및 단백질 티로신 포스파타제 (예를 들면, IA2 또는 ICA512), PLA2R1 및 THSD7A1을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원은 암 항원이다.
본원에 사용된 용어 "암 항원"은 암세포에 의해 차별적으로 발현되어 암세포를 표적화하기 위해 이용될 수 있는 항원을 지칭한다. 암 항원은 명백하게 종양-특이 면역 반응을 잠재적으로 자극할 수 있는 항원이다. 이들 항원 중 일부는 반드시 발현되는 것은 아니지만 정상 세포에 의해 암호화된다. 이들 항원은 정상 세포에서 정상적으로 침묵하는 (즉, 발현되지 않는) 항원, 특정 분화 단계에서만 발현되는 항원 및 배아 및 태아 항원과 같이 일시적으로 발현되는 항원을 특징으로 할 수 있다. 다른 암 항원은 종양 유전자 (예를 들어, 활성화된 ras 종양 유전자), 억제 유전자 (예를 들어, 돌연변이 p53), 내부 결실 또는 염색체 전좌로 인한 융합 단백질과 같은 돌연변이 세포 유전자에 의해 암호화된다. 여전히 또 다른 암 항원은 RNA 및 DNA 종양 바이러스에 전달되는 것과 같은 바이러스 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 많은 종양 항원이 다중 고형 종양의 측면에서 정의되었다: 면역력에 의해 정의된 MAGE 1, 2, & 3; MART-l/Melan-A, gpl00, 암 배아 항원 (CEA), HER2, 뮤신 (즉, MUC-1), 전립선-특이 항원 (PSA), 및 전립선산 포스파타제 (PAP). 또한, B형 간염 (HBV), 엡스타인-바 (EBV) 및 인간 유두종 (HPV)에 의해 암호화된 일부와 같은 바이러스 단백질은 각각 간세포 암종, 림프종 및 자궁 경부암의 발병에 중요한 것으로 나타났다.
다른 암 항원은 707-AP (707 알라닌 프롤린), AFP (알파 (a)-태아단백질), ART-4 (T4 세포에 의해 인식되는 선암종 항원), BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이됨), BCMA (B 세포 성숙 항원), Bcr-abl (절단점군 영역-아벨손), CAIX (탄산 탈수 효소 IX), CD19 (분화 클러스터 19), CD20 (분화 클러스터 20), CD22 (분화 클러스터 22), CD30 (분화 클러스터 30), CD33 (분화 클러스터 33), CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8), CAMEL (흑색종 상의 CTL-인식된 항원), CAP-1 (암배아 항원 펩티드 - 1), CASP-8 (카스파제-8), CDC27m (돌연변이된 세포-분열 사이클 27), CDK4/m (돌연변이된 사이클린-의존적 키나제 4), CEA (암배아 항원), CT (암/고환 (항원)), Cyp-B (사이클로필린 B), DAM (분화 항원 흑색종), EGFR (표피 성장 인자 수용체), EGFRvlll (표피 성장 인자 수용체, 변이체 III), EGP-2 (상피 당단백질 2), EGP-40 (상피 당단백질 40), Erbb2, 3, 4 (적아구성 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체-2, -3, 4), ELF2M (돌연변이된 연장 인자 2), ETV6-AML1 (Ets 변이체 유전자 6/급성 골수성 백혈병 1 유전자 ETS), FBP (엽산 결합 단백질), fAchR (태아 아세틸콜린 수용체), G250 (당단백질 250), GAGE (G 항원), GD2 (디시알로강글리오시드 2), GD3 (디시알로강글리오시드 3), GnT-V (N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 V), Gp100 (당단백질 100kD), HAGE (헬리코스 항원), HER-2/neu (인간 표피 수용체-2/신경학적; EGFR2로도 알려짐), HLA-A (인간 백혈구 항원-A) HPV (인간 유두종 바이러스), HSP70-2M (열 충격 단백질 70 - 2 돌연변이됨), HST-2 (인간 인환 종양 - 2), hTERT 또는 hTRT (인간 텔로머라제 역전사 효소), iCE (장 카복실 에스테라제), IL-13R-a2 (인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2), KIAA0205, KDR (키나제 삽입 도메인 수용체), κ-경쇄, LAGE (L 항원), LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP-L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L푸코실트랜스퍼라제), LeY (루이스-Y 항체), L1 CAM (L1 세포 부착 분자), MAGE (흑색종 항원), MAGE-A1 (흑색종-관련 항원 1), 메소텔린, 뮤린 CMV 감염된 세포, MART-1/Melan-A (T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원-I/흑색종 항원 A), MC1 R (멜라노코르틴 1 수용체), 미오신/m (돌연변이된 미오신), MUC1 (뮤신 1), MUM-1 , -2, -3 (돌연변이된 흑색종 유비쿼터스 1, 2, 3), NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론), NKG2D (자연 살해 그룹 2, 멤버 D) 리간드, NY-BR-1 (뉴욕 유방 분화 항원 1), NY-ESO-1 (뉴욕 식도 편평 상피 세포 암종-1), 종양태아성 항원 (h5T4), P15 (단백질 15), p190 작은 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질), Pml/RARa (전골수성 백혈병/레티노산 수용체 a), PRAME (흑색종의 우선적으로 발현되는 항원), PSA (전립선-특이 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), PSMA (전립선-특이 막 항원), RAGE (신장 항원), RU1 또는 RU2 (신장 유비쿼터스 1 또는 2), SAGE (육종 항원), SART-1 또는 SART-3 (편평 항원 거부 종양 1 또는 3), SSX1 , -2, -3, 4 (활액 육종 X1 , -2, -3, -4), TAA (종양-관련 항원), TAG-72 (종양-관련 당단백질 72), TEL/AML1 (전좌 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1), TPI/m (돌연변이된 삼탄당인산염 이소머라제), TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, 또는 gp75), TRP-2 (티로시나제 관련 단백질 2), TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2), VEGF-R2 (혈관 내피 성장 인자 수용체 2), 또는 WT1 (빌름스 종양 유전자)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
자가항원의 또 다른 예는, 제한함이 없이, 아쿠아포린 수분 통로 (예를 들면, 아쿠아포린-4 수분 통로 (AQP4)), Hu, Ma2, 콜랩신 응답-매개자 단백질 5 (CRMP5), 및 암피피신, 전압-개폐 칼륨 통로 (VGKC),　N-메틸-d-아스파르테이트 수용체 (NMDAR), α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로프리온산 (AMPAR), 갑상선 퍼옥시다제, 티로글로불린, 항-N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NR1 서브유닛), Rh 혈액형 항원, I 항원, 데스모글레인 1 또는 3 (Dsg1/3), BP180, BP230, 아세틸콜린 니코틴성 시냅스후 수용체, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 혈소판 인테그린, GpIIb:IIIa, 콜라겐 (예를 들면, 콜라겐 알파-3(IV) 사슬), 류머티즘 인자, 칼파스타틴, 시트룰린화 단백질, 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG) 펩티드, 알파-베타-크리스탈린, DNA, 히스톤, 리보솜, RNP, 조직 트랜스글루타미나제 (TG2), 내인성 인자, 65-kDa 항원, 포스파티딜세린, 리보솜 인단백질, 항-호중구 세포질 항체, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, 항-SSB, 항핵 항체 (ANA), 항호중구 세포질 항체 (ANCA), Jo-1, 항미토콘드리아 항체, gp210, p62, sp100, 항인지질 항체, U1-70 kd snRNP, GQ1b 강글리오시드, GM1, 아시알로 GM1, GD1b, 항-평활근 항체 (ASMA), 항-간-신장 마이크로솜-1 항체 (ALKM-1), 항-간 시토졸 항체-1 (ALC-1), IgA 항근섬유막 항체, 호중구 과립 단백질, 스트렙토코커스 세포 벽 항원, 위 벽 세포의 내인성 인자, 인슐린 (IAA), 글루탐산 데카복실라제 (GAA 또는 GAD) 및 단백질 티로신 포스파타제 (예를 들면, IA2 또는 ICA512), PLA2R1 및 THSD7A1을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 감염된 세포와 연관된 항원에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "감염된 세포"는 이들의 품질, 특성 또는 상태에 불리하게 영향을 미치는 어떤 것으로 오염된 세포를 지칭한다.
하나의 실시양태에서, 항원은 바이러스 감염된 세포와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 박테리아 감염된 세포와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 진균 감염된 세포와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 기생충 감염된 세포와 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 흡입된 알레르겐, 섭취된 알레르겐 또는 접촉 알레르겐에 결합할 수 있다.
흡입된 알레르겐의 예는 무기문류아목 (Astigmata) (예를 들어, 시로 진드기 (저장 진드기, Aca s 13), 블로미아 트로피칼리스 (Blomia tropicalis) (진드기, Blo t), 데르마토파고이데스 파리나에 (Dermatophagoides farinae) (미국 집먼지 진드기, Der f), 데르마토파고이데스 미크로세라스 (Dermatophagoides microceras) (집먼지 진드기, Der m), 데르마토파고이데스 프테로니시누스 (Dermatophagoides pteronyssinus) (유럽 집먼지 진드기, Der p), 유로글리푸스 메이네이 (Euroglyphus maynei) (집먼지 진드기, Eur m), 글리시파구스 도메스티쿠스 (Glycyphagus domesticus) (저장 진드기, Gly d 2), 레피도글리푸스 디스트럭터 (Lepidoglyphus destructor) (저장 진드기, Lep d), 티로파구스 푸트레센티아에 (Tyrophagus putrescentiae) (저장 진드기, Tyr p)); 바퀴목 (Blattaria) (예를 들어, 블라텔라 게르마니카 (Blattella germanica) (독일 바퀴벌레, Bla g), 페리플라네타 아메리카나 (Periplaneta americana) (미국 바퀴벌레, Per a)); 딱정벌레목 (Coleoptera) (예를 들어, 하르모니아 악시리디스 (Harmonia axyridis) (아시아 무당벌레, Har a)), 파리목 (Diptera) (예를 들어, 에데스 에집티 (Aedes aegypti) (황열 모기, Aed a), 키로노무스 키엔시스 (Chironomus kiiensis) (깔따구, Chi k), 키로노무스 툼미 툼미 (Chironomus thummi thummi) (깔따구, Chi t), 포르시포마이아 타이와나 (Forcipomyia taiwana) (등에 모기, For t), 글로시나 모르시탄스 (Glossina morsitans) (사바나 체체 파리, Glo m), 헤미디프테라 (Hemidiptera): 트리아토마 프로트락타 (Triatoma protracta) (캘리포니아 키스 벌레, Tria p)), 막시목 (Hymenoptera) (예를 들어, 아피스 세라나 (Apis cerana) (동부 꿀벌, Api c), 아피스 도르사타 (Apis dorsata) (대형 꿀벌, Api d), 아피스 멜리페라 (Apis mellifera) (꿀벌, Api m), 봄부스 펜실바니쿠스 (Bombus pennsylvanicus) (호박벌, Bom p), 봄부스 테레스트리스 (Bombus terrestris) (호박벌, Bom t), 돌리코베스풀라 아레나리아 (Dolichovespula arenaria) (노랑 말벌, Dol a), 돌리코베스풀라 마쿨라타 (Dolichovespula maculata) (흰 얼굴 말벌, Dol m), 미르메시아 필로술라 (Myrmecia pilosula) (오스트레일리아 점프 개미, Myr p), 폴리스테스 아눌라리스 (Polistes annularis) (말벌, Pol a), 폴리스테스 도미눌루스 (Polistes dominulus) (지중해 종이 말벌, Pol d), 폴리스테스 엑스클라만스 (Polistes exclamans) (말벌, Pol e), 폴리스테스 푸스타투스 (Polistes fuscatus) (말벌, Pol f), 폴리스테스 갈리쿠스 (Polistes gallicus) (말벌, Pol g), 폴리스테스 메트리쿠스 (Polistes metricus) (말벌, Pol m), 폴리비아 파울리스타 (Polybia paulista) (말벌, Pol p), 폴리비아 스쿠텔라리스 (Polybia scutellaris) (말벌, Pol s), 솔레놉시스 게미나타 (Solenopsis geminata) (열대 불개미, Sol g), 솔레놉시스 인빅타 (Solenopsis invicta) (붉은 불개미, Sol i), 솔레놉시스 리치테리 (Solenopsis richteri) (검은 불개미, Sol r), 솔레놉시스 사에비시마 (Solenopsis saevissima) (브라질 불개미, Sol s), 베스파 크라브로 (Vespa crabro) (유럽 말벌, Vesp c), 베스파 만다리니아 (Vespa mandarinia) (대형 아시아 말벌, Vesp m), 베스풀라 피아보필로사 (Vespula fiavopilosa) (땅벌, Vesp f), 베스풀라 게르마니카 (Vespula germanica) (땅벌, Vesp g), 베스풀라 마쿨리프론스 (Vespula maculifrons) (땅벌, Vesp m), 베스풀라 펜실바니카 (Vespula pensylvanica) (땅벌, Vesp p), 베스풀라 스쿠아모사 (Vespula squamosa) (땅벌, Vesp s), 베스풀라 비두아 (Vespula vidua) (말벌, Vesp vi), 베스풀라 불가리스 (Vespula vulgaris) (땅벌, Vesp v)), 참진드기목 (Ixodida) (예를 들어, 아르가스 레플렉수스 (Argas reflexus) (비둘기 진드기, Arg r)), 나비목 (Lepidoptera) (예를 들어, 봄빅스 니오리 (Bombyx niori) (누에 나방, Bomb n), 플로디아 인터펀텔라 (Plodia interpunctella) (화랑곡 나방, Plo i), 타우메토포에아 피티오캄파 (Thaumetopoea pityocampa) (소나무 행렬모충 나방, Tha p)), 좀목 (Thysanura) (예를 들어, 레피스마 사카리나 (Lepisma saccharina) (좀벌레, Lep s)), 벼룩목 (Siphonaptera) (예를 들어, 크테노세팔리데스 펠리스 펠리스 (Ctenocephalides felis felis) (고양이 벼룩, Cte f)), 육식목 (Carnivora) (예를 들어, 카니스 파밀리아리스 (Canis familiaris) (개, Can f), 펠리스 도메스티쿠스 (Felis domesticus) (고양이, Fel d)); 토끼목 (Lagomorpha) (예를 들어, 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 (Oryctolagus cuniculus) (토끼, Ory c), 기제목 (Perissodactlyla): 에쿠우스 카발루스 (Equus caballus) (국내 말, Equ c)), 가자미목 (Pleuronectiformes) (예를 들어, 레피도르홈부스 휘피아고니스 (Lepidorhombus whiffiagonis) (작은 넙치, 가자미, 갈로, Lep w)), 쥐목 (Rodentia) (예를 들어, 카비아 포르셀루스 (Cavia porcellus) (기니 피그, Cav p), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) (마우스, Mus m), 라투스 노르베기우스 (Rattus norvegius) (쥐, Rat n)); 구과목 (Coniferales): 카마에시파리스 오브투사 (Chamaecyparis obtusa) (일본 사이프러스, Cha o), 쿠프레수스 아리조니카 (Cupressus arizonica) (사이프러스, Cup a), 크립토메리아 자포니카 (Cryptomeria japonica) (삼나무, Cry j), 쿠프레수스 셈페르비렌스 (Cupressus sempervirens) (일반 사이프러스, Cup s), 주니페루스 아쉐이 (Juniperus ashei) (산 삼나무, Jun a), 주니페루스 옥시세드루스 (Juniperus oxycedrus) (가시 향나무, Jun o), 주니페루스 사비노이데스 (Juniperus sabinoides) (산 삼나무, Jun s), 주니페루스 비르기니아나 (Juniperus virginiana) (동부 적삼목, Jun v)); 용담목 (Gentianales) (예를 들어, 카타란투스 로세우스 (Catharanthus roseus) (장밋빛 페리윙클, Cat r)); 벼목 (Poales) (예를 들어, 안톡산툼 오도라툼 (Anthoxanthum odoratum) (향기풀, Ant o 1), 시노돈 닥틸론 (Cynodon dactylon) (우산 잔디, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24), 닥틸리스 글로메라타 (Dactylis glomerata) (오리새, Dae g 1, Dae g 2, Dae g 3, Dae g 4, Dae g 5), 페스투카 프라텐시스 (Festuca pratensis) (왕포와풀, Fes p 4)), 홀쿠스 라나투스 (Holcus lanatus) (흰털새, Hol l 1, Hol l 5), 호르데움 불가레 (Hordeum vulgare) (보리, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21), 롤리움 페레네 (Lolium perenne) (독보리, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11), 오리자 사티바 (Oryza sativa) (벼, Ory s 1, Ory s 12), 파스팔룸 노타룸 (Paspalum notarum) (바이아 그래스 , Pas n 1), 팔라리스 아쿠아티카 (Phalaris aquatica) (카나리아풀, Pha a 1, Pha a 5), 플레움 프라텐세 (Phleum pratense) (티모시, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13), 포아 프라텐시스 (Poa pratensis) (캔터키 블루 그래스, Poa p 1, Poa p 5), 세칼레 세레알레 (Secale cereale) (호밀, Sec c 1, Sec c 20), 소르굼 할레펜세 (Sorghum halepense) (존슨 그래스, Sor h 1), 트리티쿰 아에스티붐 (Triticum aestivum) (밀, Tri a 12, Tri a 14, Tri a 185, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30), 제아 메이스 (Zea mays) (옥수수, Zea m 1 , Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25), 참나무목 (Fagales): 알누스 글루티노사 (Alnus glutinosa) (Alder, Aln g 1, Aln g 4), 베툴라 베르루코사 (Betula verrucosa) (자작나무, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4 , Bet v 5, Bet v 6, Bet v 7), 카르피누스 베툭스 (Carpinus betuhxs) (서어나무, Car b 1)); 꿀풀목 (Lamiales) (예를 들어, 플락시누스 엑셀시어르 (Fraxinus excelsior) (물푸레나무, Fra e l), 리구스트룸 불가레 (Ligustrum vulgare) (쥐똥나무, Lig v), 시린가 불가리스 (Syringa vulgaris) (라일락, Syr v)); 말피기목 (Malpighiales) (예를 들어, 헤베아 브라실리엔시스 (Hevea brasiliensis) (파라 고무 나무 (라텍스), Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13)); 산담팔수목 (Proteales) (예를 들어, 플라타누스 아세리폴리아 (Platanus acerifolia) (런던 버즘 나무, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3), 플라타누스 오리엔탈리스 (Platanus orientalis) (버즘 나무, Pla or 1, Pla or 2, Pla or 3))로부터의 알레르겐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
섭취된 알레르겐의 예는 자낭균류 (Fungi Ascomycota)으로부터의 알레르겐, 예를 들면, 갈반병균목 (Dothideales) (예를 들어, 알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata) (알터나리아 부후 진균, Alt a), 클라도스포리움 클라도스포리오이데스 (Cladosporium cladosporioides) (Cla c), 클라도스포리움 헤르바룸 (Cladosporium herbarum) (Cla h), 쿠르불라리아 루나타 (Curvularia lunata) (Cur l), - 유로티아목 (Eurotiales): 아스퍼길러스 플라부스 (Aspergillus flavus) (Asp fl), 아스퍼길러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus) (Asp f), 아스퍼길러스 니거 (Aspergillus niger) (Asp n), 아스퍼길러스 오리자에 (Aspergillus oryzae) (Asp o), 페니실리움 브레비콤팍툼 (Penicillium brevicompactum) (Pen b), 페니실리움 크리소게눔 (Penicillium chrysogenum) (Pen ch), 페니실리움 시트리눔 (Penicillium citrinum) (Pen c), 페니실리움 옥살리쿰 (Penicillium oxalicum) (Pen o)), 동충하초목 (Hypocreales) (예를 들어, 푸사리움 쿨모룸 (Fusarium culmorum) (Fus c)); 오니게니아목 (Onygenales) (예를 들어, 트리코피톤 루브룸 (Trichophyton rubrum) (Tri r), 트리코피톤 톤수란스 (Trichophyton tonsurans) (Tri t), 효모균목 (Saccharomycetales): 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) (효모, Cand a), 칸디다 보이디니이 (Candida boidinii) (효모, Cand b)); 투베르쿨라리아목 (Tuberculariales) (예를 들어, 에피코쿰 푸르푸라센스 (Epicoccum purpurascens) (Epi p)), 진균 담자균류 (Basidiomycota)로부터의 알레르겐, 예를 들면, 균심류 (Hymenomycetes) (예를 들어, 코프리누스 코마투스 (Coprinus comatus) (먹물 버섯, Cop c), 프실로시베 쿠벤시스 (Psilocybe cubensis) (매직 버섯, Psi c), 녹균강 (Urediniomycetes) (예를 들어, 로도토룰라 무실라기노사 (Rhodotorula mucilaginosa) (효모, Rho m)); 깜부기균강 (Ustilaginomycetes) (예를 들어, 말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur) (어루러기 감염인자, Mala f), 말라세지아 심포디알리스 (Malassezia sympodialis) (Mala s)); 항생제 (예를 들면, 페니실린, 세팔로스포린, 아미노시드, 퀴놀론, 매크롤리드, 테트라사이클린, 술파미드); 약제 (예를 들면, 아세틸살리실산, 백신, 모르핀 및 유도체); 비타민, 예를 들면, 비타민 K1; 및 식품 알레르겐 (예를 들면, 우유, 계란, 땅콩, 견과류 (호두, 캐슈 등), 생선, 조개류, 콩, 밀, 및 당근, 사과, 배, 아보카도, 살구, 복숭아로부터의 알레르겐)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
접촉 알레르겐의 예는 중금속 (예를 들면, 니켈, 크롬, 금), 라텍스, 합텐, 예를 들면, 할로탄, 하이드랄라진을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 난백알부민, MOG, 타입 II 콜라겐 단편, 이의 변이체 및 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된 항원에 결합할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 시트룰린화 비멘틴, 시트룰린화 타입 II 콜라겐, 시트룰린화 피브리노겐, 이의 변이체 및 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된 항원에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 난백알부민, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 MOG, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 타입 II 콜라겐, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 결합할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 다른 세포외 항원 결합 도메인 (바람직하게는 scFv)은 시트룰린화 비멘틴, 시트룰린화 타입 II 콜라겐, 시트룰린화 피브리노겐, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 결합할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 세포외 IL-23R 결합 도메인은 힌지 도메인에 의해 막관통 도메인에 연결된다.
하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 위에 기술된 바와 같이 바람직하게는 2 내지 10개의 아미노산 범위의 길이를 갖는 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 힌지 도메인의 또 다른 예는 본원에 참고로 포함된 제WO2012/138475호에 기술되어 있다.
하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 아미노산 서열 AGSSSSGGSTTGGSTT (서열 번호 7), 아미노산 서열 GTTAASGSSGGSSSGA (서열 번호 8), 아미노산 서열 SSATATAGTGSSTGST (서열 번호 9), 및 아미노산 서열 TSGSTGTAASSTSTST (서열 번호 10)을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (서열 번호 11)의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
또 다른 실시양태에서, 힌지 도메인은 KIRRDSS (서열 번호 12)에 상응하는 KIR2DS2 힌지이다.
하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 (서열 번호 13)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 13과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호 14의 핵산 서열 또는 서열 번호 14와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 CD8 힌지이다.
또 다른 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 (서열 번호 15)의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 15와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호 16의 핵산 서열 또는 서열 번호 16과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 IgG4 힌지이다.
또 다른 실시양태에서, 힌지 도메인은 IgD 힌지 (서열 번호 17)의 아미노산 서열 또는 서열 번호　17과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호 18의 핵산 서열 또는 서열 번호 18과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 IgD 힌지이다.
또 다른 실시양태에서, 힌지 영역은 CD28 힌지 (서열 번호 19)의 아미노산 서열 또는 서열 번호　19와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 실시양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호 20의 핵산 서열 또는 서열 번호 20과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 CD28 힌지이다.
본 발명의 키메라 수용체에 사용될 수 있는 막관통 도메인의 예는 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 도메인, 또는 CD28, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C의 막관통 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다
하나의 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인 (서열 번호 21)의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 21과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개이지만 20, 10 또는 5개 미만의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 21과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인 (서열 번호 22)의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 22와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
또 다른 실시양태에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인 (서열 번호 23)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 23과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 하나의 실시양태에서, 막관통 도메인은 서열 번호 24의 핵산 서열 또는 서열 번호 24와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 CD28 막관통 도메인이다.
하나의 실시양태에서, 막관통 도메인은 재조합체일 수 있으며, 이 경우 이것은 주로 발린 또는 류신과 같은 소수성 아미노산을 포함할 것이다.
하나의 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래되는 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 일차 신호전달 도메인 (또는 이로부터 유래된 서열) 및 임의로 T 세포 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 도메인(들) (또는 이로부터 유래된 서열(들))을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인으로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 도메인(들)을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 도메인(들)으로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 적어도 하나의 공동자극 도메인 및 일차 신호전달 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 적어도 두 개의 공동자극 도메인 및 일차 신호전달 신호전달 도메인을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, T 세포 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, 공통 FcR 감마 (FCER1G), FcR 베타 (Fc 엡실론 Rib), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, 및 DAP 12의 그룹에서 선택된 단백질의 신호전달 도메인 및 이들로부터 유래된 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, T 세포 일차 신호전달 도메인은 서열 번호 25, 26, 61 또는 62의 CD3-제타 도메인의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, CD3 제타 일차 신호전달 도메인은 서열 번호 25, 26, 61 또는 62의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개이지만 20개, 10개 또는 5개 미만의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
따라서, 하나의 실시양태에서, T 세포 일차 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 CD3-제타 도메인의 핵산 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
자극 방식으로 작용하는 T 세포 일차 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAMS)로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다.
본 발명에서 특히 유용한 ITAM 함유 T 세포 일차 세포내 신호전달 도메인의 예는 CD3 제타, 공통 FcR 감마 (FCER1G), Fc 감마 RIIa, FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD66b, CD79a, CD79b, DAP10, 및 DAP12의 것 (또는 이로부터 유래된 것)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, T 세포 일차 신호전달 도메인은 천연 ITAM 도메인에 비해 변경된 (예를 들어, 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어, 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 일차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 최적화된 및/또는 절두된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 일차 신호전달 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인과 조합된 T 세포 일차 신호전달 도메인 (예를 들면, CD3-제타 신호전달 도메인)을 포함한다.
T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), MHC 클래스 I 분자, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS (CD278), 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, ARHR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55), CD19, CD19a, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2ra, IL6Ra, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, IL-13RA1/RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), IL-21R, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a/CD18, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, CTLA-4 (CD152), CD95, TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), TGFbR1/2/3, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, 공통 감마 사슬, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, NKp44, NKp30, NKp46, 또는 NKG2D, 및 이들의 임의의 조합의 그룹에서 선택된 단백질의 신호전달 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 키메라 수용체는 4-1BB, ICOS, CD27, OX40, CD28, CTLA4 및 PD-1을 포함하는 그룹으로부터 선택된 T 세포 공동자극 분자의 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, T 세포 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB 세포내 도메인 (서열 번호 29)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 29와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 29의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개이지만 20개, 10개 또는 5개 미만의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, T 세포 공동자극 신호전달 도메인은 CD27 세포내 도메인 (서열 번호 30)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 30과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 30의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개이지만 20개, 10개 또는 5개 미만의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, T 세포 공동자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 도메인 (서열 번호 31)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 31의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개이지만 20개, 10개 또는 5개 미만의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 키메라 수용체는 바람직하게는 CD28의 세포내 도메인, CD27의 세포내 도메인 및 4-1BB의 세포내 도메인으로부터 선택되는 T 세포 공동자극 분자의 적어도 두 개의 세포내 도메인의 조합을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 키메라 수용체는 4-1BB 세포내 도메인 (서열 번호 29)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 29와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 CD27 세포내 도메인 (서열 번호 30)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 30과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키메라 수용체는 4-1BB 세포내 도메인 (서열 번호 29)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 29와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 CD28 세포내 도메인 (서열 번호 31)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키메라 수용체는 CD27 세포내 도메인 (서열 번호 30)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 30과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 CD28 세포내 도메인 (서열 번호 31)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 키메라 수용체는 4-1BB 세포내 도메인 (서열 번호 29)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 29와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 CD27 세포내 도메인 (서열 번호 30)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 30과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 CD28 세포내 도메인 (서열 번호 31)의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 하나의 실시양태에서, T 세포 공동자극 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 4-1BB 세포내 도메인 (서열 번호 32)의 핵산 서열 또는 서열 번호 32와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열, 및/또는 CD27 세포내 도메인 (서열 번호 33)의 핵산 서열 또는 서열 번호 33과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열, 및/또는 CD28 세포내 도메인 (서열 번호 34)의 핵산 서열 또는 서열 번호 34와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 다음을 포함하고:
- 서열 번호 29의 4-1BB 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 서열 번호 29와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 번호 30의 CD27 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 서열 번호 30과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 서열 번호 31의 CD28 세포내 도메인의 아미노산 서열 또는 서열 번호 31과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
- 서열 번호 25, 26, 61 또는 62의 CD3-제타 세포내 도메인의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
여기서 세포내 도메인에 포함된 서열은 동일한 프레임에서 및 단일 폴리펩티드 사슬로서 발현된다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열은 다음을 포함한다:
- 서열 번호 32의 4-1BB 세포내 도메인의 핵산 서열 또는 서열 번호 32와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열, 및/또는 서열 번호 33의 CD27 세포내 도메인의 핵산 서열 또는 서열 번호 33과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열, 및/또는 서열 번호 34의 CD28 세포내 도메인의 핵산 서열 또는 서열 번호 34와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열; 및
- 서열 번호 27 또는 서열 번호 28의 CD3-제타 세포내 도메인의 핵산 서열, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 무작위로 또는 지정된 순서로 서로 연결될 수 있는 적어도 두 개의 상이한 도메인 (예를 들어, 일차 신호전달 도메인 및 T 세포 공동자극 분자의 적어도 하나의 세포내 도메인)을 포함한다.
임의로, 예를 들면, 2 내지 10개 아미노산 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 별개의 신호전달 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 글리신-세린 이중선 (GS)이 적합한 링커로서 사용된다. 하나의 실시양태에서, 단일 아미노산, 예를 들어, 알라닌 (A), 글리신 (G)이 적합한 링커로서 사용된다. 링커의 또 다른 예가 본원에 기술되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 두 개 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 두 개 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어, 상기한 바와 같은 링커 분자에 의해 분리된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62) 및 CD28의 공동자극 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62) 및 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62) 및 CD27의 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 특이 세포외 결합 도메인으로부터 N-말단에 위치한 리더 서열을 추가로 포함한다. 리더 서열의 비제한적인 예는 서열 번호 39의 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있는 CD8의 리더 서열이다.
하나의 실시양태에서, CAR은 태그, 예를 들면, 품질 관리, 농축, 생체내 추적 등을 위한 태그를 추가로 포함한다. 상기 태그는 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 국재화될 수 있다. 본 발명의 CAR에서 사용될 수 있는 태그의 예는 숙련가에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 제한함이 없이, 본 발명에서 사용되는 태그는 혈구 응집소 태그, 폴리 아르기닌 태그, 폴리 히스티딘 태그, Myc 태그, Strep 태그, S-태그, HAT 태그, 3x 플래그 태그, 칼모듈린-결합 펩티드 태그, SBP 태그, 키틴 결합 도메인 태그, GST 태그, 말토스-결합 단백질 태그, 형광 단백질 태그, T7 태그, V5 태그 및 Xpress 태그를 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 태그일 수 있다. 태그의 또 다른 예는, 제한함이 없이, NWSHPQFEK (서열 번호 59) 또는 SAWSHPQFEK (서열 번호　60)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 P2A (서열 번호 44) 및 GFP (서열 번호 45) 서열을 추가로 포함한다.
제1 실시양태에 따르면, 본 발명의 CAR은 세포외 IL-23R 결합 도메인, 임의로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　21); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호　25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
제2 실시양태에 따르면, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인, 임의로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, T 세포 공동자극 분자의 단일 세포내 도메인 및 T 세포 일차 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　15); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　15); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　17); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　17); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　19); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　19); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
제3 실시양태에 따르면, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인, 임의로 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, T 세포 공동자극 분자의 두 개의 세포내 도메인 및 T 세포 일차 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD8의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 13); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　15); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　15); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgG4의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 15); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; 바람직하게는 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 IgD의 힌지 도메인; CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; IgD의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 17); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　19); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호　21); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD8의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 21); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 30); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호　19); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); 4-1BB의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 29); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 IL-23R 결합 도메인; CD28의 힌지 도메인 (바람직하게는 서열 번호 19); CD28의 막관통 도메인 (바람직하게는 서열 번호 23); CD27의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호　30); CD28의 세포내 도메인 (바람직하게는 서열 번호 31); 및 CD3-제타 일차 신호전달 도메인 (바람직하게는 서열 번호 25, 26, 61 또는 62)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 (i) IL-23R 결합 도메인, (ii) 인간 CD28의 힌지 영역, (iii) 인간 CD28의 막관통 도메인, (iv) 인간 CD28의 세포내 도메인 및 (v) 인간 CD3ζ 사슬의 세포내 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 인간 CD28의 힌지 영역, 인간 CD28의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3ζ 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 서열 번호 35 또는 63의 아미노산 서열 또는 서열 번호　35 또는 63과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열에 상응한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 서열 번호 35 또는 63의 아미노산 서열 또는 서열 번호 35 또는 63과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열 또는 아미노산 서열에 연결된 IL-23R 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 (i) IL-23R 결합 도메인, (ii) 인간 CD8의 힌지 영역, (iii) 인간 CD8의 막관통 도메인, (iv) 인간 4-1BB의 세포내 도메인 및 (v) 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 인간 CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 4-1BB의 세포내 도메인 및 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 서열 번호 49, 50, 70 또는 71의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 49, 50, 70 또는 71과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 임의의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 (i) IL-23R 결합 도메인, (ii) 인간 CD8의 힌지 영역, (iii) 인간 CD8의 막관통 도메인, (iv) 인간 CD28의 세포내 도메인 및 (v) 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 인간 CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 서열 번호 51 또는 72의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 51 또는 72와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 임의의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 항-IL-23R scFv (예를 들어, 서열 번호 55, 36 또는 57, 바람직하게는 서열 번호 55의 서열을 포함하거나 이들로 구성됨), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 4-1BB의 세포내 도메인 및 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 CAR은 서열 번호 41, 43, 65 또는 67 또는 서열 번호 41, 43, 65 또는 67과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 CD8의 리더 서열, 항-IL-23R scFv (예를 들어, 서열 번호 55, 36 또는 57, 바람직하게는 서열 번호 55의 서열을 포함하거나 이들로 구성됨), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 4-1BB의 세포내 도메인 및 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 CAR은 서열 번호 40, 42, 64 또는 66 또는 서열 번호 40, 42, 64 또는 66과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 항-IL-23R scFv (예를 들어, 서열 번호 55, 36 또는 57, 바람직하게는 서열 번호 55의 서열을 포함하거나 이들로 구성됨), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 CAR은 서열 번호 48, 53, 69 또는 74 또는 서열 번호 48, 53, 69 또는 74와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 CD8의 리더 서열, 항-IL-23R scFv (예를 들어, 서열 번호 55, 36 또는 57, 바람직하게는 서열 번호 55의 서열을 포함하거나 이들로 구성됨), CD8의 힌지 영역, 인간 CD8의 막관통 도메인, 인간 CD28의 세포내 도메인 및 인간 CD3ζ의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 CAR은 서열 번호 47, 52, 68 또는 73 또는 서열 번호 47, 52, 68 또는 73과 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 서열 번호 39를 갖는 CD8 리더 서열, (G4S)3 링커 (서열 번호 3)에 의해 연결된 서열 번호 37의 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 38을 갖는 VL을 포함하는 항-인간 IL-23R scFv, 서열 번호 13의 서열을 갖는 CD8α로부터 유래된 힌지 도메인, 서열 번호 21을 갖는 인간 CD8α 막관통 도메인, 및 서열 번호 29를 갖는 인간 4-1BB 신호전달 도메인 및 서열 번호 26을 갖는 인간 CD3 제타 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 (G4S)3 링커 (서열 번호 3)에 의해 연결된 서열 번호 37의 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 38을 갖는 VL을 포함하는 항-인간 IL-23R scFv, 서열 번호 13의 서열을 갖는 CD8α로부터 유래된 힌지 도메인, 서열 번호 21을 갖는 인간 CD8α 막관통 도메인, 및 서열 번호 29를 갖는 인간 4-1BB 신호전달 도메인 및 서열 번호 26을 갖는 인간 CD3 제타 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 서열 번호 54의 서열 또는 서열 번호 54와 적어도 약 95%, 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
본 발명은 추가로, 세포 표면 상에 상기한 바와 같은 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포, 바람직하게는 단리된 T 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 세포 표면 상에 상기한 바와 같은 CAR을 발현하도록 조작된 세포를 포함하는 단리된 및/또는 실질적으로 정제된 T 세포 집단에 관한 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 CAR에 의해 인식되는 IL-23R을 표면에 발현하는 세포를 억제한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 CAR에 의해 인식되는 IL-23R을 표면에 발현하는 세포에 대해 세포독성이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 집단은 조절 T 세포 (Treg), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 및 NK T 세포를 포함하거나 이들로 구성된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 Treg 세포이다.
하나의 실시양태에서, T 세포는 조절 면역 세포, 예를 들면, 세포 요법에서 사용하기에 적합한 임의의 조절 면역 세포이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 집단의 Treg 세포는 모두 본원에 정의된 바와 같은 키메라 수용체 (CAR)를 발현하고 따라서 CAR-단일특이적으로 정의될 수 있다 (즉, 모든 Treg 세포는 이들이 발현하는 CAR과 동일한 항원 (IL-23R)을 인식한다). 하나의 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이다 (즉, 모든 Treg 세포가 이들의 TCR과 동일한 항원을 인식한다). 또 다른 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-다중특이적이다 (즉, Treg 세포는 이들의 TCR과는 다른 항원을 인식할 수 있다).
하나의 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은 항원, 항원의 단편, 항원의 변이체 또는 이들의 혼합물을 인식한다.
하나의 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은 일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원에 특이적이다.
또 다른 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은, 예를 들면, 다발성 경화증-관련 항원, 관절-관련 항원, 눈-관련 항원, 인간 HSP 항원, 피부-관련 항원 또는 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원과 같은 자가항원에 특이적이다. 자가항원, 특히 다발성 경화증-관련 항원, 관절-관련 항원, 눈-관련 항원, 인간 HSP 항원, 피부-관련 항원 또는 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원의 예는 본원에 제공되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은 흡입된 알레르겐, 섭취된 알레르겐 또는 접촉 알레르겐에 특이적이다.
하나의 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은 난백알부민, MOG, 타입 II 콜라겐 단편, 이의 변이체 및 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된 항원에 특이적이다.
하나의 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은 난백알부민, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적이다.
또 다른 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은 MOG, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적이다.
또 다른 실시양태에서, Treg 세포 집단은 TCR-단일특이적이고, TCR은 타입 II 콜라겐, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR을 발현하는 Treg 세포는 CAR에 의해 인식되는 IL-23R을 발현하는 세포를 억제한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은, Treg 세포에 의해 발현될 때, Treg 세포가 이에 대해 특이적이거나 이에 의해 활성화되는 항원과는 달리, 세포 표면에서 IL-23R을 발현하는 세포에 결합하고 IL-23R에 의해 활성화되는 능력을 Treg 세포에 부여한다.
따라서 본 발명의 Treg 세포 집단은 재지시된 Treg 세포 집단으로 정의될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "재지시된 (redirected)"은 Treg 세포가 이에 대해 특이적이거나 이에 의해 활성화될 리간드와는 상이한 리간드에 결합하고 이에 의해 활성화될 수 있는 능력을 Treg 세포에 부여하는 본원에 기술된 바와 같은 키메라 수용체를 보유하는 Treg 세포를 지칭한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포는 세포독성이 아니다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포는 세포독성이다.
IL-23R을 발현하는 세포의 예는 Th17, αβ T 세포, 호중구, 감마 델타 T 세포, NK, NKT, 수지상 세포 및 대식세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포는 CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg, Tr1 세포, TGF-β 분비 Th3 세포, 조절 NK T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 CD8+ T 세포, 및 이중 음성 조절 T 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 조절 세포는 CD4+ 조절 T 세포 (Treg)이다. 하나의 실시양태에서, Treg는 흉선 유래 Treg 또는 적응 또는 유도 Treg이다. 하나의 실시양태에서, Treg는 CD4+FOXP3+ 조절 T 세포 또는 CD4+FOXP3- 조절 T 세포 (Tr1 세포), 바람직하게는 CD4+FOXP3+ 조절 T 세포이다.
하나의 실시양태에서, 조절 세포는 CD8+ 조절 T 세포 (Treg)이다. 하나의 실시양태에서, CD8+ 조절 T 세포는 CD8+CD28- 조절 T 세포, CD8+CD103+ 조절 T 세포, CD8+FoxP3+ 조절 T 세포, CD8+CD122+ 조절 T 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 조절 세포는 INFγ+IL10+IL34+ CD8+CD45RClow 조절 T 세포이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 Treg 세포이다.
하나의 실시양태에서, Treg는, 예를 들면, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 또는 iPSC)를 제한함이 없이 포함하는 유도-줄기 세포와 같은 줄기 세포로부터 유래된다.
본원에 사용된 용어 "유도된 다능성 줄기 세포", "iPS" 또는 "iPSC"는 탈분화 또는 재프로그래밍에 의해 비-다능성 세포, 특히 성인 체세포로부터 유래된 인공 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 특히, iPSC는, 예를 들면, 전사 인자 Oct4 (Pou5f1), Sox2, cMyc 및 Klf4와 같은 특정 세트의 다능성-관련 유전자를 세포에 도입함으로써 수득될 수 있다. 배아 줄기 세포와 유사한 형태, 자기-재생 특성 및 다능성 외에도, iPSC는 또한 배아 줄기 세포와 매우 가까운 히스톤 메틸화 및 유전자 발현의 전체 프로필로 후성적 재프로그래밍을 나타낸다. IPSC는 특히, 예를 들면, Nanog, Sox2, Oct4 및 Ssea3 / 4 단백질과 같은 다능성 마커를 발현한다.
하나의 실시양태에서, 조절 세포는 다음의 표현형을 갖는다: CD4+CD25+, 예를 들면, CD4+CD25+CD127-, 예를 들면, CD4+CD25+CD127-CD45RA+. 바람직하게는, 조절 면역 세포는 다음의 표현형을 갖는다: FoxP3+CD4+CD25+, 예를 들면, FoxP3+CD4+CD25+CD127-, 예를 들면, FoxP3+CD4+CD25+CD127-CD45RA+.
하나의 실시양태에서, 조절 세포는 다음 표현형 중의 적어도 하나를 제시한다: CD4+CD25+, FoxP3+, CD127lo /-, CTLA-4+, CD39+, Helios+, CD62L+/hi, VLA4+, LFA1+, CD49bint, ITGb7int, PSGL-1+, ICOS+, GITR+, PD-1int, Perflo /-, CCR7+. 하나의 실시양태에서, 면역 조절 세포는 그랜자임 A 및/또는 그랜자임 B를 발현하지 않는다.
하나의 실시양태에서, 분자의 발현 수준의 결정은 유세포 분석, 면역형광 또는 이미지 분석, 예를 들면, 고 함량 분석에 의해 수행된다. 바람직하게는, 분자의 발현 수준의 결정은 유세포 분석에 의해 수행된다. 하나의 실시양태에서, 유세포 분석을 수행하기 전에, 세포를 고정하고 투과시켜 세포내 단백질을 검출할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 세포 집단에서 분자의 발현 수준의 결정은 분자를 발현하는 세포 집단의 세포 (즉, 분자에 대해 "+" 세포)의 백분율을 결정하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 분자를 발현하는 세포의 상기 백분율은 FACS에 의해 측정된다.
용어 "발현하는 (또는 +)" 및 "발현하지 않는 (또는 -)"은 당업계에 잘 알려져 있으며, "+"에 상응하는 세포 마커의 발현 수준은 높거나 중간이고 "+/- "라고도 하며 "-"에 상응하는 세포 마커의 발현 수준은 null이라는 점에서 관심있는 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다.
용어 "낮은 (low)" 또는 "lo" 또는 "lo/-"는 당업계에 잘 알려져 있으며, 세포 마커의 발현 수준이 전체적으로 분석되는 세포 집단에서 해당 세포 마커의 발현 수준에 비해 낮다는 점에서 관심있는 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다. 보다 특히, 용어 "lo"는 하나 이상의 다른 별개의 세포 집단보다 낮은 수준에서 세포 마커를 발현하는 별개의 세포 집단을 지칭한다.
용어 "높은 (high)" 또는 "hi" 또는 "밝은 (bright)"은 당업계에 잘 알려져 있으며, 세포 마커의 발현 수준이 전체적으로 분석되는 세포 집단에서 해당 세포 마커의 발현 수준에 비해 높다는 점에서 관심있는 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다.
일반적으로, 염색 강도의 상위 2, 3, 4 또는 5%에 있는 세포는 "hi"로 지정되며, 집단의 상위 절반에 속하는 세포는 "+"로 분류된다. 형광 강도가 50% 미만으로 떨어지는 세포는 "lo" 세포로 지정되고 5% 미만은 "-" 세포로 지정된다.
관심있는 세포 마커의 발현 수준은 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색된 세포 집단으로부터의 세포의 형광 강도 중간값 (MFI)을 비관련 특이성을 갖지만 동일한 이소타입, 동일한 형광 프로브를 가지며 동일한 종 (이소타입 대조군이라고 함)에서 유래한 형광 표지된 항체로 염색된 동일한 세포 집단으로부터의 세포의 형광 강도 (FI)와 비교함으로써 결정된다. 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색되고 이소타입 대조군으로 염색된 세포와 동등한 MFI 또는 더 낮은 MFI를 보이는 집단으로부터의 세포는 이 마커를 발현하지 않으며 (-) 또는 음성으로 지정된다. 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색되고 이소타입 대조군으로 염색된 세포보다 우수한 MFI 값을 보이는 집단으로부터의 세포는 이 마커를 발현하고 (+) 또는 양성으로 지정된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포 집단의 세포는 본 발명의 CAR에 의해 인식되는 IL-23R과는 다른 리간드에 결합하는 본 발명의 CAR 및 다른 수용체 (이하 "제2 수용체"라고 함)를 이들의 세포 표면에서 발현한다. 본 발명에 따르면, 이러한 다른 수용체는 위에 기술된 바와 같이 세포외 리간드 결합 도메인, 임의로 힌지, 임의로 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 제2 수용체는 내인성 (예를 들면, 내인성 TCR)이다. 또 다른 실시양태에서, 제2 수용체는 외인성이며, 이의 발현은 본 발명의 Treg 세포 집단의 세포에서 이를 코딩하는 핵산의 형질전환 또는 형질도입에 의해 유도된다. 상기 외인성 수용체는 외인성 TCR 또는 CAR일 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포는 두 개의 CAR을 발현하며, 여기서 제1 CAR은 IL-23R을 인식하고, 제2 CAR은 별개의 리간드를 인식한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포는 두 개의 CAR을 발현하며, 여기서 제1 CAR은 IL-23R 상의 제1 에피토프를 인식하고, 제2 CAR은 동일한 IL-23R 상의 별개의 에피토프를 인식한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포는 두 개의 CAR을 발현하며, 여기서 제1 CAR은 IL-23R을 인식하고, 제2 CAR은 별개의 IL-23R (예를 들면, IL-23R의 변이체)을 인식한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR 및 제2 수용체 (바람직하게는 제2 CAR) 중의 적어도 하나는 유도성이며, 즉 세포 표면 상에서의 이의 발현은 유도될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR 및 제2 수용체 (바람직하게는 제2 CAR) 중 하나의 발현은 다른 수용체의 활성화에 의해 유도된다. 제1 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 발현은 제2 수용체의 활성화에 의해 유도된다. 제2 실시양태에서, 제2 수용체의 발현은 본 발명의 CAR의 활성화에 의해 유도된다. 유도성 CAR은, 예를 들면, Roybal 등 (Cell, 2006)에 의해서와 같이 당업계에 이전에 기술되었다.
하나의 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은 항원, 항원의 단편, 항원의 변이체 또는 이들의 혼합물에 특이적이다.
하나의 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은 일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원에 특이적이다.
용어 "일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원"은 다음 비제한적인 목록의 식품 항원과 같이 인간에게 일반적인 식품에서 유래한 면역원성 펩티드를 지칭한다: 소 항원, 예를 들어 리포칼린, Ca-결합 S100, 알파-락트알부민, 락토글로불린, 예를 들어 베타-락토글로불린, 소 혈청 알부민, 카제인. 식품-항원은 또한 파브알부민과 같은 대서양 연어 항원; 오보뮤코이드, 난백알부민, Ag22, 콘알부민, 리소자임 또는 닭 혈청 알부민과 같은 닭 항원; 땅콩 항원; 트로포미오신과 같은 새우 항원; 응집소 또는 글리아딘과 같은 밀 항원; 샐러리 프로필린과 같은 샐러리 항원; 당근 프로필린과 같은 당근 항원; 타우마틴, 사과 지질 전달 단백질, 또는 사과 프로필린과 같은 사과 항원; 배 프로필린, 또는 이소플라본 리덕타제와 같은 배 항원; 엔도키티나제와 같은 아보카도 항원; 살구 지질 전달 단백질과 같은 살구 항원; 복숭아 지질 전달 단백질 또는 복숭아 프로필린과 같은 복숭아 항원; HPS, 대두 프로필린 또는 (SAM22) PR-I0 프로트와 같은 대두 항원; 이의 단편, 변이체 및 혼합물일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은, 예를 들면, 다발성 경화증-관련 항원, 관절-관련 항원, 눈-관련 항원, 인간 HSP 항원, 피부-관련 항원 또는 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원과 같은 자가항원에 특이적이다.
다발성 경화증-관련 항원의 예는 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 관련 당단백질 (MAG), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 희소돌기 아교세포 미엘린 올리고단백질 (OMGP), 미엘린 관련 희소돌기 아교세포 염기성 단백질 (MOBP), 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP/Claudinl 1), 열 충격 단백질, 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP), NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22 (PMP22), 2'3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제 (CNPase), 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
관절-관련 항원의 예는 시트룰린-치환된 사이클릭 및 선형 필라그린 펩티드, 타입 II 콜라겐 펩티드, 인간 연골 당단백질 39 (HCgp39) 펩티드, HSP, 이종 핵 리보핵단백질 (hnRNP) A2 펩티드, hnRNP B1, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 및 HSP90, BiP, 케라틴, 비멘틴, 피브리노겐, 타입 I, III, IV 및 V 콜라겐 펩티드, 아넥신 V, 글루코스 6 포스페이트 이소머라제 (GPI), 아세틸-칼파스타틴, 피루베이트 데하이드로게나제 (PDH), 알돌라제, 토포이소머라제 I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, 음이온성 카디오리핀 및 포스파티딜세린, 중성 하전된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린을 포함한 인지질 항원, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 피브릴린, 아그레칸, 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 관절 관련 항원의 또 다른 예는 시트룰린화 비멘틴, 시트룰린화 타입 II 콜라겐, 시트룰린화 피브리노겐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
눈-관련 항원의 예는 타입 II 콜라겐, 레티날 아레스틴, S-아레스틴, 광수용체간 레티노이드-결합 단백질 (IRBP1), 베타-크리스탈린 B1, 레티날 단백질, 맥락막 단백질 및 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
인간 HSP 항원의 예는 인간 HSP60, HSP70, HSP90, 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 염증성 신경계 병태-관련 항원, 바람직하게는 다발성 경화증-관련 항원이다. 염증성 신경계 병태-관련 항원, 바람직하게는 다발성 경화증-관련 항원의 예는 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 관련 당단백질 (MAG), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 희소돌기 아교세포 미엘린 올리고단백질 (OMGP), 미엘린 관련 희소돌기 아교세포 염기성 단백질 (MOBP), 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP/Claudinl 1), 열 충격 단백질, 희소돌기 아교세포 특이 단백질 (OSP), NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22 (PMP22), 2'3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제 (CNPase), 이의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 피부-관련 항원이다. 피부-관련 항원의 예는 각질 세포 항원, 진피 또는 표피에 존재하는 항원, 멜라닌 세포 항원 (예를 들면, 멜라닌 또는 티로시나제), 데스모글레인 (예를 들어, Dsg1/3이라고도 할 수 있는 데스모글레인 1 또는 3), BP180, BP230, 플렉틴, 인테그린 (예를 들어, 인테그린 α4β6), 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 타입 VII), 라미닌 (예를 들어, 라미닌 332 또는 라미닌 γ1), 플라킨 (예를 들어, 엔보플라킨, 페리플라킨, 또는 데스모플라킨), 케라틴 (예를 들어, KRT5, KRT8, KRT15, KRT17 및 KRT31), 케라틴 필라멘트-관련 단백질, 필라그린, 코르네오데스모신, 및 엘라스틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원이다. 이러한 항원의 예는 이식된 조직 또는 숙주에 특이적인 MHC, β2-마이크로글로불린, ABO 시스템으로부터의 항원, 레수스 시스템으로부터의 항원 (특히 C, c, E et e 및 D 시스템으로부터의 항원) 및 이소헤마글루티닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이식 거부 또는 GVHD에 관여할 수 있는 항원의 또 다른 예는 HLA-DR (특히 이식 후 처음 6개월 동안), HLA-B (특히 이식 후 처음 2년 동안), HLA-A, 작은 조직적합성 항원 (miHA, 예를 들어, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G), MHC 클래스 I에 상응하는 HLA (A, B, 및 C), MHC 클래스 II에 상응하는 HLA (DP, DM, DOA, DOB, DQ, 및 DR) 및 MHC 클래스 III에 상응하는 HLA (예를 들어, 보체 시스템의 성분)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 HLA-A2 세포 표면 단백질이다. 하나의 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 HLA-A2에 대해 지시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "HLA-A2"는 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌에서 HLA-A*02 대립 유전자 패밀리에 의해 암호화된 세포 표면 단백질을 포함하는 인간 백혈구 항원 (HLA) 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A2"에 의해 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 검사 또는 유전형 분석에 의해 HLA-A*02 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*02 항원 유형의 추가 명칭은 "HLA-A2", "HLA-A02" 및 "HLA-A*2"를 포함한다. HLA 시스템의 요인에 대해 WHO 위원회에 의해 2010년에 개발된 HLA 명명 시스템을 포함하여 이러한 대립 유전자 패밀리에 의해 암호화된 HLA 단백질을 동정하는 다른 명명 시스템이 개발되었다. 용어 "HLA-A2"는 "HLA-A*02:01", "HLA-A*02:02", "HLA-A*02:03", "HLA-A*02:04", "HLA-A*02:05", "HLA-A*02:06", "HLA-A*02:07", "HLA-A*02:08", "HLA-A*02:09", "HLA-A*02:10", 및 "HLA-A*02:11"로 시작하는 명칭을 포함하지만 이에 제한되지 않는 "HLA-A*02"로 시작하는 이러한 명명 시스템에 따른 명칭을 갖는 대립 유전자에 의해 암호화된 HLA 단백질을 지칭한다. 대립 유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. "HLA-A*02:"로 시작하는 대립 유전자 명칭 뒤에 2개 또는 3개의 추가 숫자는 완전한 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 용어 "HLA-A2"는 명칭 "HLA-A*02:01", "HLA-A*02:02", "HLA-A*02:03", "HLA-A*02:04", "HLA-A*02:05", "HLA-A*02:06", "HLA-A*02:07", "HLA-A*02:08", "HLA-A*02:09", "HLA-A*02:10", 및 "HLA-A*02:11"을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 이러한 명명 시스템에 따라 "HLA-A*02"로 시작하는 명칭으로 확인된 HLA 단백질을 지칭한다.
자가항원의 또 다른 예는, 제한함이 없이, 아쿠아포린 수분 통로 (예를 들면, 아쿠아포린-4 수분 통로 (AQP4)), Hu, Ma2, 콜랩신 응답-매개자 단백질 5 (CRMP5), 및 암피피신, 전압-개폐 칼륨 통로 (VGKC),　N-메틸-d-아스파르테이트 수용체 (NMDAR), α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로프리온산 (AMPAR), 갑상선 퍼옥시다제, 티로글로불린, 항-N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NR1 서브유닛), Rh 혈액형 항원, I 항원, 데스모글레인 1 또는 3 (Dsg1/3), BP180, BP230, 아세틸콜린 니코틴성 시냅스후 수용체, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 혈소판 인테그린, GpIIb:IIIa, 콜라겐 (예를 들면, 콜라겐 알파-3(IV) 사슬), 류머티즘 인자, 칼파스타틴, 시트룰린화 단백질, 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백질 (MOG) 펩티드, 알파-베타-크리스탈린, DNA, 히스톤, 리보솜, RNP, 조직 트랜스글루타미나제 (TG2), 내인성 인자, 65-kDa 항원, 포스파티딜세린, 리보솜 인단백질, 항-호중구 세포질 항체, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, 항-SSB, 항핵 항체 (ANA), 항호중구 세포질 항체 (ANCA), Jo-1, 항미토콘드리아 항체, gp210, p62, sp100, 항인지질 항체, U1-70 kd snRNP, GQ1b 강글리오시드, GM1, 아시알로 GM1, GD1b, 항-평활근 항체 (ASMA), 항-간-신장 마이크로솜-1 항체 (ALKM-1), 항-간 시토졸 항체-1 (ALC-1), IgA 항근섬유막 항체, 호중구 과립 단백질, 스트렙토코커스 세포 벽 항원, 위 벽 세포의 내인성 인자, 인슐린 (IAA), 글루탐산 데카복실라제 (GAA 또는 GAD) 및 단백질 티로신 포스파타제 (예를 들면, IA2 또는 ICA512), PLA2R1 및 THSD7A1을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 항원은 암 항원이다.
본원에 사용된 용어 "암 항원"은 암세포에 의해 차별적으로 발현되어 암세포를 표적화하기 위해 이용될 수 있는 항원을 지칭한다. 암 항원은 명백하게 종양-특이 면역 반응을 잠재적으로 자극할 수 있는 항원이다. 이들 항원 중 일부는 반드시 발현되는 것은 아니지만 정상 세포에 의해 암호화된다. 이들 항원은 정상 세포에서 정상적으로 침묵하는 (즉, 발현되지 않는) 항원, 특정 분화 단계에서만 발현되는 항원 및 배아 및 태아 항원과 같이 일시적으로 발현되는 항원을 특징으로 할 수 있다. 다른 암 항원은 종양 유전자 (예를 들어, 활성화된 ras 종양 유전자), 억제 유전자 (예를 들어, 돌연변이 p53), 내부 결실 또는 염색체 전좌로 인한 융합 단백질과 같은 돌연변이 세포 유전자에 의해 암호화된다. 여전히 또 다른 암 항원은 RNA 및 DNA 종양 바이러스에 전달되는 것과 같은 바이러스 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 많은 종양 항원이 다중 고형 종양의 측면에서 정의되었다: 면역력에 의해 정의된 MAGE 1, 2, & 3; MART-l/Melan-A, gpl00, 암 배아 항원 (CEA), HER2, 뮤신 (즉, MUC-1), 전립선-특이 항원 (PSA), 및 전립선산 포스파타제 (PAP). 또한, B형 간염 (HBV), 엡스타인-바 (EBV) 및 인간 유두종 (HPV)에 의해 암호화된 일부와 같은 바이러스 단백질은 각각 간세포 암종, 림프종 및 자궁 경부암의 발병에 중요한 것으로 나타났다.
다른 암 항원은 707-AP (707 알라닌 프롤린), AFP (알파 (a)-태아단백질), ART-4 (T4 세포에 의해 인식되는 선암종 항원), BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이됨), BCMA (B 세포 성숙 항원), Bcr-abl (절단점군 영역-아벨손), CAIX (탄산 탈수 효소 IX), CD19 (분화 클러스터 19), CD20 (분화 클러스터 20), CD22 (분화 클러스터 22), CD30 (분화 클러스터 30), CD33 (분화 클러스터 33), CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8), CAMEL (흑색종 상의 CTL-인식된 항원), CAP-1 (암배아 항원 펩티드 - 1), CASP-8 (카스파제-8), CDC27m (돌연변이된 세포-분열 사이클 27), CDK4/m (돌연변이된 사이클린-의존적 키나제 4), CEA (암배아 항원), CT (암/고환 (항원)), Cyp-B (사이클로필린 B), DAM (분화 항원 흑색종), EGFR (표피 성장 인자 수용체), EGFRvlll (표피 성장 인자 수용체, 변이체 III), EGP-2 (상피 당단백질 2), EGP-40 (상피 당단백질 40), Erbb2, 3, 4 (적아구성 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체-2, -3, 4), ELF2M (돌연변이된 연장 인자 2), ETV6-AML1 (Ets 변이체 유전자 6/급성 골수성 백혈병 1 유전자 ETS), FBP (엽산 결합 단백질), fAchR (태아 아세틸콜린 수용체), G250 (당단백질 250), GAGE (G 항원), GD2 (디시알로강글리오시드 2), GD3 (디시알로강글리오시드 3), GnT-V (N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 V), Gp100 (당단백질 100kD), HAGE (헬리코스 항원), HER-2/neu (인간 표피 수용체-2/신경학적; EGFR2로도 알려짐), HLA-A (인간 백혈구 항원-A) HPV (인간 유두종 바이러스), HSP70-2M (열 충격 단백질 70 - 2 돌연변이됨), HST-2 (인간 인환 종양 - 2), hTERT 또는 hTRT (인간 텔로머라제 역전사 효소), iCE (장 카복실 에스테라제), IL-13R-a2 (인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2), KIAA0205, KDR (키나제 삽입 도메인 수용체), κ-경쇄, LAGE (L 항원), LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP-L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L푸코실트랜스퍼라제), LeY (루이스-Y 항체), L1 CAM (L1 세포 부착 분자), MAGE (흑색종 항원), MAGE-A1 (흑색종-관련 항원 1), 메소텔린, 뮤린 CMV 감염된 세포, MART-1/Melan-A (T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원-I/흑색종 항원 A), MC1 R (멜라노코르틴 1 수용체), 미오신/m (돌연변이된 미오신), MUC1 (뮤신 1), MUM-1 , -2, -3 (돌연변이된 흑색종 유비쿼터스 1, 2, 3), NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론), NKG2D (자연 살해 그룹 2, 멤버 D) 리간드, NY-BR-1 (뉴욕 유방 분화 항원 1), NY-ESO-1 (뉴욕 식도 편평 상피 세포 암종-1), 종양태아성 항원 (h5T4), P15 (단백질 15), p190 작은 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질), Pml/RARa (전골수성 백혈병/레티노산 수용체 a), PRAME (흑색종의 우선적으로 발현되는 항원), PSA (전립선-특이 항원), PSCA (전립선 줄기 세포 항원), PSMA (전립선-특이 막 항원), RAGE (신장 항원), RU1 또는 RU2 (신장 유비쿼터스 1 또는 2), SAGE (육종 항원), SART-1 또는 SART-3 (편평 항원 거부 종양 1 또는 3), SSX1 , -2, -3, 4 (활액 육종 X1 , -2, -3, -4), TAA (종양-관련 항원), TAG-72 (종양-관련 당단백질 72), TEL/AML1 (전좌 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1), TPI/m (돌연변이된 삼탄당인산염 이소머라제), TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, 또는 gp75), TRP-2 (티로시나제 관련 단백질 2), TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2), VEGF-R2 (혈관 내피 성장 인자 수용체 2), 또는 WT1 (빌름스 종양 유전자)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 항원은 감염된 세포와 연관된다.
본원에 사용된 용어 "감염된 세포"는 이들의 품질, 특성 또는 상태에 불리하게 영향을 미치는 어떤 것으로 오염된 세포를 지칭한다.
하나의 실시양태에서, 항원은 바이러스 감염된 세포와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 박테리아 감염된 세포와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 진균 감염된 세포와 연관된다. 또 다른 실시양태에서, 항원은 기생충 감염된 세포와 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은 흡입된 알레르겐, 섭취된 알레르겐 또는 접촉 알레르겐에 특이적이다.
하나의 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은 난백알부민, MOG, 타입 II 콜라겐 단편, 이들의 변이체 및 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된 항원에 특이적이다.
하나의 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은 난백알부민, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적이다.
또 다른 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은 MOG, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적이다.
또 다른 실시양태에서, 제2 수용체, 바람직하게는 제2 CAR은 타입 II 콜라겐, 이의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 수용체는 별개의 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 제1 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 T 세포 일차 신호전달 도메인 (예를 들면, CD3 제타)을 포함하고, 제2 수용체는 공동자극 신호전달 도메인 (예를 들면, 4-1BB, CD28의 공동자극 신호전달 도메인 또는 4-1BB와 CD28의 공동자극 신호전달 도메인의 조합)을 포함한다. 제2 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 공동자극 신호전달 도메인 (예를 들면, 4-1BB, CD28의 공동자극 신호전달 도메인 또는 4-1BB와 CD28의 공동자극 신호전달 도메인의 조합)을 포함하고, 제2 수용체는 T 세포 일차 신호전달 도메인 (예를 들면, CD3 제타)을 포함한다.
그 결과, 이러한 실시양태에 따르면, 본 발명의 Treg 세포 집단의 완전 활성화는 IL-23R에 대한 본 발명의 CAR의 결합, 및 이것이 지시되는 리간드에 대한 제2 수용체의 결합 둘 다를 필요로 한다.
하나의 실시양태에서, 제2 수용체에 의해 인식되는 리간드는 질병에 걸린 조직이나 기관에서, 또는 자가면역 반응 부위에서 발현되거나 존재한다. 그 결과, IL-23R을 발현하는 세포에 대한 억제 활성은 상기 리간드가 Treg 세포 집단의 세포에 존재하고 제2 수용체에 의해 인식될 때 질병에 걸린 조직 또는 기관에서 또는 자가면역 반응 부위에서만 유도될 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 키메라 수용체는 키메라 수용체에 의해 인식되는 IL-23R과는 별개의 리간드를 인식하는 세포외 리간드 결합 도메인을 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 리간드 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 키메라 수용체는 IL-23R 결합 도메인을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인 및 상기 IL-23R과는 별개의 리간드를 인식하는 또 다른 리간드 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 리간드 결합 도메인은 IL-23R 및 별개의 리간드 둘 다를 인식하는 이작용성 항체이다.
하나의 실시양태에서, Treg 세포 집단은 나이브 T 세포의 시험관내 분화에 의해 수득된다.
본 발명은 또한 위에서 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이며, 여기서 상기 핵산 서열은 (i) 세포외 IL-23R 결합 도메인의 핵산 서열, (ii) 임의로 세포외 힌지 도메인의 핵산 서열, (iii) 임의로 막관통 도메인의 핵산 서열, (iv) 세포내 신호전달 도메인의 하나 이상의 핵산 서열(들) 및 (v) 임의로 태그 및 또는 리더 서열의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 위에서 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 예는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]에, 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 통상의 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 제WO01/96584호; 제WO01/29058호; 및 제US6,326,193호).
다수의 바이러스 기반 시스템이 포유류 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들면, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자를 벡터에 삽입하고 당업계에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 그후 재조합 바이러스를 단리하고 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달할 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 하나의 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가적인 전사 활성 요소, 예를 들어, 프로모터 및 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절할 수 있다. 전형적으로, 핵심 촉진 (core promote)과 관련하여, 이들은 시작 부위의 상류 30-110 bp 영역에 위치하지만, 최근에 다수의 프로모터가 시작 부위의 하류에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났으며 인핸서 요소는 일반적으로 시작 부위의 상류 500-2000bp에 위치한다. 프로모터 요소들 사이의 간격은 자주 유연하므로, 요소들이 서로 반전되거나 서로에 대해 상대적으로 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화하기 위해 협력적으로 또는 비의존적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 한 가지 예는 전초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 연장 성장 인자 - la (EF-la)이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터이다. 그러나, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터 뿐만 아니라 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같은 이에 제한되지 않는 인간 유전자 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 제한되어서는 안된다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현이 요구될 때에는 이것이 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 발현이 요구되지 않을 때에는 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 2개 이상의 유전자의 효율적이고 조정된 발현을 가능하게 하는 양방향 프로모터가 또한 본 발명에서 관심을 가질 수 있다. 양방향 프로모터의 예는 i) 시토메갈로바이러스 (CMV) 또는 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 게놈으로부터 유래된 제1 최소 프로모터 서열 및 ii) 동물 유전자로부터 유래된 완전 효율적인 프로모터 서열을 포함하는 양방향 프로모터를 개시하는 본원에 참고로 포함된 제US2006200869호에 루이지 날디니 (Luigi Naldini)에 의해 기술된 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
CAR 폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위해, T 세포에 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터의 발현 세포의 동정 및 선택을 용이하게 할 수 있는 CD34 또는 리포터 유전자 또는 둘 다와 같은 선택 가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 또 다른 측면에서, 선택 가능한 마커는 별도의 DNA 조각 상에 운반될 수 있으며 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커와 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열이 측면에 위치할 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는, 예를 들면, neo 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 자살 유전자 기술이 사용될 수 있다. 다른 자살 유전자 기술은 작용 메커니즘에 따라 당업계에 기술되어 있다 (Jones et al. Frontiers in Pharmacology, 2014 (5): 254). 무독성 약물을 독성 약물로 전환하는 유전자-지시된 효소 전구약물 요법 (GDEPT)의 예는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK) 및 시토신 데아미나제 (CD)를 포함한다. 또 다른 예는, 예를 들면, 유도성 Fas (iFas) 또는 유도성 카스파제 9 (iCasp9) 시스템과 같은 아폽토시스 성분에 연결된 약물 결합 도메인으로 구성된 키메라 단백질이다. 또 다른 예는 항-c-myc 항체의 투여에 의해 결실을 유도하도록 조작된 세포의 표면에서 c-myc의 과발현을 유도하는 것과 같이 치료 항체에 의해 매개되는 시스템을 포함한다. EGFR의 사용은 c-myc 시스템과 비교하여 유사한 시스템으로 기술된다. 하나의 실시양태에서, 사용되는 자살 유전자 기술은 제WO2013153391호 또는 제WO2016120216호 (본원에 참고로 포함됨)에 설명된 기술이다. 제WO2013153391호는 마커 모이어티 (예를 들면, CD34의 최소 에피토프) 및 자살 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 기술하며, 여기서 자살 모이어티는 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포가, 예를 들면, 리툭시맙과 같은 용해 항체를 사용하여 선택적으로 사멸될 수 있도록 CD20으로부터의 에피토프를 기반으로 하는 최소 에피토프를 포함한다. 보다 특히, 상기 펩티드는 화학식 St-R1-S1-Q-S2-R2를 가질 수 있으며, 여기서 St는 폴리펩티드가 표적 세포의 표면에서 발현될 때 R 및 Q 에피토프가 세포 표면으로부터 돌출되도록 하는 줄기 서열이고; R1 및 R2는 리툭시맙-결합 에피토프이고; S1 및 S2는 동일하거나 상이할 수 있는 임의의 스페이서 서열이고; Q는 QBEND-10-결합 에피토프이다. 이러한 펩티드의 예는 서열 번호 76: CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPW이다. 제WO2016120216호는 세포 분류 및 세포 고갈을 허용하도록 변형된 세포외 결합 도메인 (scFv)을 포함하는 CAR을 기술하며, 여기서 상기 변형은 scFv 내에 하나 이상의 선택된 에피토프를 삽입하는 것으로 구성되며, 상기 에피토프는 하나 이상의 특정 항체(들)에 의해 인식되는 특이성을 갖는다. 특히, 상기 선택된 에피토프는 상기 CAR을 발현하는 세포가, 예를 들면, 리툭시맙과 같은 용해 항체를 사용하여 선택적으로 사멸될 수 있도록 CD20으로부터의 에피토프일 수 있다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 동정하고 조절 서열의 기능을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않으며, 이의 발현이 일부 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어, 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 후 적절한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 참조; Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 보이는 최소 5' 측면 영역을 갖는 작제물이 프로모터로 동정된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어 프로모터-유도된 전사를 조절하는 능력에 대해 제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유전자를 세포에 도입하고 발현하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어, 포유 동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New　York)]을 참조한다. 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
관심있는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터가 포유동물, 예를 들어, 인간 세포에 유전자를 삽입하는데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 또 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 미국 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템과 같은 콜로이드 분산 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제형의 사용은 핵산을 숙주 세포 (시험관내 , 생체외 또는 생체내)로 도입하기 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 결합될 수 있다. 지질과 결합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되고, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되고, 리포솜에 포획되고, 리포솜과 착화되고, 지질을 함유하는 용액에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 조합되고, 지질 중의 현탁액으로서 함유되고, 미셀을 함유하거나 미셀로 착화되고, 또는 달리 지질과 결합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 중의 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들면, 이들은 미셀과 같은 이중층 구조 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액에 산재되어, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들면, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 용적 (fatty droplet) 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드와 같은 이들의 유도체를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO로부터 입수할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, NY)로부터 입수할 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring로부터 입수할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발하기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일층 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조의 형성 전에 자기-재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 용액에서 정상적인 소포 구조와는 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들면, 지질은 미셀 구조를 취하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석은, 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석; 예를 들어, 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범위내에 속하는 제제를 확인하기 위해 본원에 기재된 분석에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 분석을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포는 RNA의 도입을 통해 변형된다. 하나의 실시양태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 한 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머와 RNA 중합 효소를 사용하여 PCR에 의해 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들면, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 기타 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 바람직한 주형은 본 발명의 CAR이다.
하나의 실시양태에서, PCR에 사용될 DNA는 개방형 해독틀을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈에서 자연적으로 발생하는 DNA 서열로부터 유래할 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA는 관심있는 전장 유전자 또는 유전자의 일부이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, PCR에 사용될 DNA는 인간 유전자이다. 또 다른 실시양태에서, PCR에 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. DNA는 대안적으로, 자연 발생 유기체에서는 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 암호화하는 개방형 해독틀을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 일부를 함유하는 것이다. 함께 결찰되는 DNA의 일부는 단일 유기체로부터 또는 하나 이상의 유기체로부터 유래할 수 있다.
PCR은 형질감염에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하는데 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR의 주형으로 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에 사용된 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열의 염기의 대부분 또는 전부가 상보적이거나 하나 이상의 염기가 상보적이지 않거나 일치하지 않는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR에 사용되는 어닐링 조건하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링하거나 혼성화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하여 세포에서 정상적으로 전사되는 유전자의 일부 (개방형 해독틀)를 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정 관심 도메인을 암호화하는 유전자의 일부를 증폭하도록 설계될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하여 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭하도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당업계에 잘 알려진 합성 방법에 의해 생성된다.
"정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 가닥에 대하여 증폭될 DNA 서열에 대한 위치 5'를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 하류에 있는 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 가닥에 대하여 증폭될 DNA 서열의 3' 위치를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 중합 효소가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 시약 및 중합 효소는 다수의 공급원으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 가진 화학 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 5' UTR은 0개 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 코딩 영역에 추가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 다른 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머를 설계함을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 당업계의 통상의 숙련가는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역 효율을 달성하는데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형할 수 있다. 5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대한 자연 발생적 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머에 삽입함으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변경하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 3' UTR 서열에서 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 잘 알려진 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 전술한 바와 같이 PCR에 의해 부가될 때, 컨센서스 Kozak 서열은 5' UTR 서열을 부가함으로써 재설계될 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역을 가능하게 하는 것이 필요한 것으로 보이지는 않는다. 다수의 mRNA에 대한 Kozak 서열에 대한 요구사항은 당업계에 알려져 있다. 또 다른 실시양태에서, 5' UTR은 이의 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 3' 또는 5' UTR에서 사용될 수 있다.
유전자 클로닝에 대한 필요성 없이 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해서는, 전사의 프로모터를 전사될 서열의 상류에 있는 DNA 주형에 부착해야 한다. RNA 중합 효소의 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 부가되는 경우, RNA 중합 효소 프로모터는 전사시키고자 하는 개방형 해독틀의 상류에 있는 PCR 산물에 삽입되게 된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 T7 중합 효소 프로모터이다. 또 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 중합 효소 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려져 있다.
하나의 실시양태에서, mRNA는 세포에서 mRNA의 리보솜 결합, 번역 개시 및 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 꼬리에 캡을 모두 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어, 플라스미드 DNA에서, RNA 중합 효소는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카테머 산물 (concatemeric product)을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는, 전사 후에 폴리아데닐화되더라도 진핵 형질감염에 효과적이지 않은 정상적인 크기의 mRNA를 야기한다.
선형 DNA 주형에서, 파지 T7 RNA 중합 효소는 전사체의 3' 말단을 주형의 마지막 염기 너머까지 확장할 수 있다 (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003).
폴리A/T 스트레치를 DNA 주형에 통합하는 종래의 방법은 분자 콜로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있으며, 이것이 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 기타 이상으로 크게 오염되는 이유이다. 이것은 클로닝 과정을 힘들고 시간 소모적일 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 그래서 클로닝없이 폴리A/T 3' 스트레치를 갖는 DNA 주형을 작제할 수 있는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 단편은 100T 꼬리 (크기는 50-5000 T일 수 있음)와 같은 폴리T 꼬리를 함유하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 동안 생성될 수 있거나, DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하고 이들의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관 관계가 있다. 하나의 실시양태에서, 폴리(A) 꼬리는 100개 내지 5000개 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 대장균 폴리A 중합 효소 (E-PAP)와 같은 폴리(A) 중합 효소를 사용하여 시험관내 전사 후에 추가로 확장될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100개 뉴클레오티드에서 300 내지 400개 뉴클레오티드로 늘리면 RNA의 번역 효율이 약 2배 증가한다. 또한, 3' 말단에 다른 화학 그룹을 부착하면 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 앱타머 및 기타 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들면, ATP 유사체는 폴리(A) 중합 효소를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 삽입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 더욱 증가시킬 수 있다.
RNA의 5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당업계에 공지되고 본원에 기술된 기술을 사용하여 제공된다 (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-비의존적 리보솜 결합을 개시하고 번역 개시를 촉진하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제 및 계면활성제와 같은 세포 투과성과 생존력을 촉진하는 인자를 함유할 수 있는 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 다수의 상이한 방법들 중의 어느 것, 예를 들어, 전기천공 (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 유전자 펄서 II (BioRad, Denver, Colo.), 멀티포레이터 (Eppendort, Hamburg Germany), 리포펙션을 사용한 양이온성 리포솜 매개된 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개된 형질감염, 또는 "유전자 총"과 같은 유전자총법 입자 전달 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상업적으로 이용 가능한 방법을 사용하여 표적 세포에 도입될 수 있다 (예를 들면, 참조; Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).
하나의 실시양태에서, CAR 서열은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 세포에 전달된다. CAR-발현 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 형질도입된 세포를 운반체로 사용하거나 캡슐화된, 결합된 또는 네이키드 벡터의 무세포 국소 또는 전신 전달을 사용하여 상이한 유형의 진핵 세포 뿐만 아니라 조직 및 전체 유기체에 전달될 수 있다. 사용되는 방법은 안정된 발현이 필요하거나 충분한 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CAR 서열은 시험관내 전사된 mRNA를 사용하여 세포에 전달된다. 시험관내 전사된 mRNA CAR은 형질감염된 세포를 운반체로 사용하거나 캡슐화된, 결합된 또는 네이키드 mRNA의 무세포 국소 또는 전신 전달을 사용하여 상이한 유형의 진핵 세포 뿐만 아니라 조직 및 전체 유기체에 전달될 수 있다. 사용되는 방법은 일시적인 발현이 필요하거나 충분한 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 원하는 CAR은 트랜스포존에 의해 세포에서 발현될 수 있다.
본 발명의 Treg 세포의 확장 및 유전자 변형 이전에, T 세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 당업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, T 세포는 Ficoll™ 분리와 같은 숙련가에게 알려진 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집 산물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 하나의 실시양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다.
하나의 실시양태에서, 백혈구 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여, 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 세포를 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척한다. 대안적인 실시양태에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 2가 양이온이 전부는 아니더라도 많이 부족할 수 있다. 세척 후, 세포를, 예를 들면, Ca2 +-비함유, Mg2 +-비함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액을 갖거나 갖지 않는 다른 염수 용액과 같은 다양한 생체적합성 완충액에 재현탁할 수 있다. 대안적으로, 백혈구 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, T 세포는, 예를 들면, PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 세정에 의해, 적혈구를 용해하고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시양태에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 시간 동안 항-CD3/항-CD28 (즉, 3x28)-접합된 비드, 예를 들어 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 배양함으로써 단리된다. 하나의 실시양태에서, 기간은 약 30분이다. 추가의 실시양태에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상 및 그 사이의 모든 정수 값에 이른다. 추가의 실시양태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 배양 시간은 24시간이다. 더 긴 배양 시간은 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서 T 세포를 단리하는데 사용될 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하는 시간을 단순히 단축하거나 연장함으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써 (본원에서 추가로 기술된 바와 같이), T 세포의 하위집단이 배양 개시시 또는 과정 동안 다른 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 또한, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시시 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선택될 수 있다. 숙련된 기술자는 다중 라운드의 선택이 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
또 다른 실시양태에서, 선택 절차를 수행하고 "선택되지 않은" 세포를 활성화 및 확장 과정에서 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은 " 세포는 또한 추가 라운드의 선택에 적용될 수 있다. 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성으로 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지시된 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역-부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들면, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 기타 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의한 원하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도를 변경할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드와 세포가 함께 혼합되는 용적을 상당히 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시양태에서, 20억 개 세포/ml의 농도가 사용된다. 하나의 실시양태에서, 10억 개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1억 개 이상의 세포/ml가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)을 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있으며 수득하는 것이 바람직할 것이다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후 동결될 수 있다. 이론에 결부시키고자 함이 없이, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구를 제거하고 세포 집단에서 단핵구를 어느 정도 제거함으로써 보다 균일한 산물을 제공한다. 혈장과 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 다수의 동결 용액 및 매개변수가 당업계에 알려져 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는, 예를 들면, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 기타 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함하며, 그후 세포를 분당 1°의 속도로 -80℃로 동결하고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에서 저장한다. 제어 동결의 또 다른 방법이 사용될 수 있을 뿐만 아니라 -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 비제어된 동결이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 저온보존된 세포를 본원에 기술된 바와 같이 해동 및 세척하고, 활성화 전에 실온에서 1시간 동안 휴지되도록 한다.
또한 본 발명의 맥락에서, 본원에 기술된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있는 시기 이전의 기간에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 백혈구 성분채집술 산물을 수집하는 것이 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 어느 시점에서든 수집될 수 있으며, T 세포와 같은 원하는 세포는 본원에 기술된 것과 같은 T 세포 요법으로부터 혜택을 받는 임의의 수의 질환 또는 병태에 대해 T 세포 요법에서 나중에 사용하기 위해 단리되고 동결될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 백혈구 성분채집술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 특정 실시양태에서, 혈액 샘플 또는 백혈구 성분채집술은 질환을 발병할 위험이 있지만 아직 질환을 발병하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되며, 관심 세포는 나중에 사용하기 위해 단리 및 동결된다. 특정 실시양태에서, T 세포는 확장되고, 동결되며, 나중에 사용될 수 있다.
바람직한 CAR을 발현하기 위한 Treg 세포의 유전자 변형 전이든 또는 후이든 간에, T 세포는 일반적으로, 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 미국 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 제20060121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 Treg 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 Treg 세포의 세포 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장된다. 특히, Treg 세포는 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온 운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동자극을 위해, 보조 분자를 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들면, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (Diaclone, Besancon, France). 당업계에 일반적으로 알려진 다른 확장 방법이 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(l-2):53-63, 1999).
특정 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포에 대한 일차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 각 신호를 제공하는 제제는 용액 상태일 수 있거나 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 제제는 동일한 표면에 (즉, "시스" 형성으로) 또는 별도의 표면에 (즉, "트랜스" 형성으로) 결합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 결합되고 다른 제제는 용액 상태일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 공동자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 상태이거나 표면에 결합된다. 특정 실시양태에서, 두 제제 모두는 용액 상태일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있으며, 그후 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 제제에 결합할 다른 결합제와 같은 표면에 가교-결합될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포의 활성화 및 확장에 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대해서는, 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 미국 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
하나의 실시양태에서, 두 제제는 동일한 비드 (즉, "시스") 또는 별도의 비드 (즉, "트랜스")에서 비드 상에 고정된다. 예를 들자면, 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며; 두 제제 모두는 등가의 분자 양으로 동일한 비드에 공동-고정된다. 하나의 실시양태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각 항체의 1:1 비율이 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율은 1:1의 비율을 사용하여 관찰된 확장에 비해 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 특정 실시양태에서 1:1 비율을 사용하여 관찰된 확장에 비해 약 1배 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 하나의 실시양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉 CD3:CD28의 비율은 1 미만이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 비드에 결합된 항-CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1보다 크다. 하나의 특정 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:75 CD3:CD28 비율이 사용된다. 추가의 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:50 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:30 CD3:CD28 비율이 사용된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:10 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 1:3 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 비드에 결합된 항체의 3:1 CD3:CD28 비율이 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비율이 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 당업계의 통상의 숙련가들이 쉽게 인지할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들면, 작은 크기의 비드는 수 개의 세포 만을 결합할 수 있는 반면 보다 큰 비드는 많은 세포를 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 대 입자의 비율은 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값에 이르며 추가의 실시양태에서 비율은 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하며, 또한 T　세포를 자극하는데 사용될 수 있다. T 세포 자극을 야기하는 T 세포에 대한 항-CD3- 및 항-CD28-결합된 입자의 비율은 위에서 주지된 바와 같이 변할 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고 하나의 바람직한 비율은 T 세포 당 적어도 1:1 입자이다. 하나의 실시양태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비율이 사용된다. 하나의 특정 실시양태에서, 바람직한 입자:세포 비율은 1:5이다. 추가의 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 일자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 첫째 날에는 1:1 내지 10:1이고 추가 입자가 매일 또는 격일로 이후 최대 10일 동안 (부가 당일 세포 수에 기반하여) 1:1 내지 1:10의 최종 비율로 세포에 부가된다. 하나의 특정 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 첫째 날에는 1:1이고 자극 3일째 및 5일째에 1:5로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 첫째 날에는 1:1의 최종 비율로, 자극 3일째와 5일째에는 1:5로 부가된다. 또 다른 실시양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 첫째 날에는 2:1이고 자극 3일째 및 5일째에 1:10으로 조정된다. 또 다른 실시양태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 첫째 날에는 1:1의 최종 비율로, 자극 3일째와 5일째에는 1:10으로 부가된다. 당업계의 숙련가는 다양한 다른 비율이 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있음을 인지할 것이다. 특히, 비율은 입자 크기 및 세포 크기와 유형에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, Treg 세포를 제제-코팅된 비드와 조합하고, 비드 및 세포를 후속적으로 분리한 다음 세포를 배양한다. 대안적인 실시양태에서, 배양 전, 제제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고 함께 배양한다. 추가의 실시양태에서, 비드와 세포를 먼저 자기력과 같은 힘의 적용에 의해 농축시켜, 세포 표면 마커의 결찰을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들자면, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드 (3x28 비드)가 본 발명의 Treg 세포와 접촉하도록 함으로써 결찰될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포 (예를 들면, 104 내지 109개 T 세포) 및 비드 (예를 들면, 1:1 비율의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충액, 바람직하게는 (칼슘 및 마그네슘와 같은 2가 양이온이 없는) PBS에서 조합한다. 다시, 당업계의 통상의 숙련가들은 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 인지할 수 있다. 예를 들면, 표적 세포는 샘플에서 매우 드물고 샘플의 0.01% 만을 포함하거나 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수는 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정의 실시양태에서, 세포와 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자와 세포가 함께 혼합되는 용적을 상당히 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시양태에서, 약 20억 개 세포/ml의 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 1억 개 이상의 세포/ml가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시양태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있으며 특정 실시양태에서 수득하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 혼합물은 수 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 동안 또는 그 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양된다. 또 다른 실시양태에서, 비드 및 T 세포는 2-3일 동안 함께 배양된다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 주기의 자극이 또한 필요할 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청 (예를 들어, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업계의 숙련가에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하여 증식 및 생존력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지 (예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 기타 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 및 환원제, 예를 들어, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산 나트륨 및 비타민이 첨가되고 무혈청이거나 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함되며, 대상체에게 주입하고자 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는데 필요한 조건, 예를 들면, 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 다른 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 전형적인 혈액 또는 성분채집술로 수득된 말초 혈액 단핵 세포 산물은 세포독성 또는 억제 T 세포 집단 (Tc, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (Th, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함에 의한 T 세포의 생체외 확장은 약 8-9일 이전에는 주로 Th 세포로 구성되는 T 세포의 집단을 생성하는 반면 약 8-9일 후에는 T 세포의 집단이 점점 더 많은 Tc 세포의 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 주로 Th 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, Tc 세포의 항원-특이 하위세트가 단리된 경우, 이러한 하위세트를 더 크게 확장하는 것이 유리할 수 있다. 또한, CD4 및 CD8 마커 외에도, 다른 표현형 마커가 상당히 다르지만, 대부분 세포 확장 과정 동안 재현 가능하게 다르다. 따라서, 이러한 재현성은 활성화된 T 세포 산물을 특정 목적에 맞게 조정할 수 있는 능력을 가능하게 한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, T 세포는 예를 들면 본원에 참고로 포함된 제WO2007110785호에 기술된 바와 같이 조절 T 세포를 수득하기 위해 라파마이신의 존재하에서 배양될 수 있다. 조절 T 세포를 생성하는 또 다른 방법이 본원에 참고로 포함된 미국 제2016024470호에 기술되어 있으며, 여기서 T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)/CD3 활성화제, 예를 들어 TCR/CD3 항체, TCR 공동-자극제 활성화제, 예를 들면, CD28, CD137 (4-1 BB), GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40, CD40 또는 CD137 항체 및 라파마이신과 함께 배양된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, CAR의 발현에 의해 유전자 변형된 T 세포는 또한 ROR-C, Foxp3, Foxo1, T-bet 또는 Gata 3, c-Maf, AhR과 같은 적어도 하나의 세포내 인자의 발현에 의해 유전자 변형될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 면역 세포는 Foxp3를 발현한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 면역 세포는 Foxo1을 발현한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 Treg 세포는 동종 Treg 세포일 수 있다. 예를 들면, 동종 Treg 세포는 기능적 인간 백혈구 항원 (HLA), 예를 들어, HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II의 발현이 없는 T 세포, 및/또는 내인성 HLA의 발현이 없는 T 세포일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 Treg 세포는 이의 표면에 기능적 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 Treg 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 클래스 1 (특히 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C) 및/또는 HLA 클래스 II 또는 비-고전적인 HLA 분자가 하향조절되도록 조작될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, Treg 세포는 기능적 TCR 및 기능적 HLA, 예를 들어 HLA 클래스 I (특히 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C) 및/또는 HLA 클래스 II가 부족할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 Treg 세포는 이의 표면에 내인성 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다.
기능적 TCR 및/또는 HLA의 발현이 없는 변형된 Treg 세포는 TCR 또는 HLA 중의 하나 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, Treg 세포는 siRNA, shRNA, 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열 (CRISPR) 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제 (mn, 호밍 엔도뉴클레아제로도 알려짐), 또는 megaTAL (TAL 이펙터와 mn 절단 도메인을 조합함)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산은 Treg의 게놈의 특정 유전자좌, 예를 들면, 결실될 유전자의 유전자좌에 삽입된다. 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산은 HLA 유전자좌 내에 삽입되어, HLA 발현을 억제한다.
하나의 실시양태에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 T 세포에서 TCR 및/또는 HLA를 암호화하는 핵산을 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다. T 세포에서 siRNA 및 shRNA의 발현은, 예를 들어, 렌티바이러스 발현 시스템과 같은 임의의 통상적인 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. TCR의 성분의 발현을 하향조절하는 예시적인 shRNA는, 예를 들어, 미국 제2012/0321667호에 기술되어 있다. HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 유전자의 발현을 하향조절하는 예시적인 siRNA 및 shRNA는, 예를 들어, 미국 제2007/0036773호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하기 위한 CRISPR"은 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열의 세트, 또는 이러한 반복서열 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas"는 CRISPR-관련 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 침묵시키거나 돌연변이시키는데 사용될 수 있는 CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
자연적으로 발생하는 CRISPR/Cas 시스템은 서열분석된 진정세균 게놈의 대략 40%와 서열분석된 고세균의 90%에서 발견된다. 문헌 [Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8:172] 참조. 이 시스템은 플라스미드 및 파지와 같은 외래 유전 요소에 대한 내성을 부여하고 후천성 면역의 한 형태를 제공하는 일종의 원핵 면역계이다. 문헌 [Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845] 참조. CRISPR/Cas 시스템은 마우스 또는 영장류와 같은 진핵생물의 유전자 편집 (특정 유전자 침묵, 강화 또는 변경)에 사용하기 위해 변형되었다. 문헌 [Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8] 참조. 이것은 특별히 설계된 CRISPR 및 하나 이상의 적절한 Cas를 함유하는 플라스미드를 진핵 세포에 도입함으로써 달성된다. CRISPR 유전자좌라고도 하는 CRISPR 서열은 교호적 반복체 및 스페이서를 포함한다. 자연 발생 CRISPR에서, 스페이서는 통상적으로 플라스미드 또는 파지 서열과 같은 박테리아에 외래성인 서열을 포함하며; TCR 및/또는 HLA CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서는 TCR 또는 HLA 유전자 서열로부터 유래된다. CRISPR 유전자좌로부터의 RNA는 구성적으로 발현되고 Cas 단백질에 의해 작은 RNA로 처리된다. 이들은 반복 서열이 측면에 있는 스페이서를 포함한다. RNA는 다른 Cas 단백질을 안내하여 RNA 또는 DNA 수준에서 외인성 유전 요소를 침묵시킨다. 문헌 [Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7] 참조. 따라서 스페이서는 siRNA와 유사하게 RNA 분자의 주형으로서 작용한다. 문헌 [Pennisi (2013) Science 341: 833-836] 참조. 따라서 CRISPR/Cas 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집 (염기쌍 부가 또는 결실)하거나 조기 중단을 도입하여 TCR 및/또는 HLA의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 대안적으로 RNA 간섭처럼 사용될 수 있어, 가역적인 방식으로 HLA 유전자를 끌 수 있다. 포유류 세포에서, 예를 들면, RNA는 Cas 단백질을 TCR 및/또는 HLA 프로모터로 안내하여, RNA 중합 효소를 입체적으로 차단할 수 있다.
예를 들어, 미국 제20140068797호, 및 문헌 [Cong (2013) Science 339: 819-823]에 기술된 당업계에 공지된 기술을 사용하여 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템이 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576], 미국 제8,871,445호; 제8,865,406호; 제8,795,965호; 제8,771,945호; 및 제8,697,359호에 기술된, TCR 및/또는 HLA를 억제하는 당업계에 공지된 또 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템이 또한 생성될 수 있다.
"TALEN" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 TALEN" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하기 위한 TALEN"는 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제를 지칭한다. TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생산된다. 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)는 TCR 및/또는 HLA 유전자의 일부를 포함하여 임의의 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, TCR 및/또는 HLA 서열을 포함하는 임의의 원하는 DNA 서열에 특이적인 제한 효소가 생산될 수 있다. 그후 이들은 세포에 도입될 수 있으며, 여기서 이들은 게놈 편집에 사용될 수 있다. 문헌 [Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; and Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501] 참조.
TALE은 크산토모나스 (Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 12번째와 13번째 아미노산을 제외한 반복되고 고도로 보존된 33-34 아미노산 서열을 함유한다. 이들 두 위치는 매우 가변적이며, 특정 뉴클레오티드 인식과 강력한 상관관계를 보여준다. 따라서 이들은 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. TALEN을 생산하기 위해, TALE 단백질은 야생형 또는 돌연변이된 Fokl 엔도뉴클레아제인 뉴클레아제 (N)에 융합된다. Fokl에 대한 몇 가지 돌연변이가 TALEN에서 사용하기 위해 만들어졌다; 이들은, 예를 들면, 절단 특이성 또는 활성을 개선한다. 문헌 [Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; and Guo et al. (2010) /. Mol. Biol. 200: 96] 참조. Fokl 도메인은 이량체로서 기능하여, 적절한 방향과 간격으로 표적 게놈의 부위에 대해 고유한 DNA 결합 도메인을 가진 두 개의 작제물을 필요로 한다. TALE DNA 결합 도메인과 Fokl 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수와 두 개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수는 둘 다 높은 수준의 활성을 달성하기 위한 중요한 매개변수인 것으로 보인다. 문헌 [Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8] 참조. HLA TALEN은 이중-가닥 파단 (DSB)을 생성하기 위해 세포 내부에서 사용될 수 있다. 수선 메커니즘이 비상동 말단 접합을 통해 파단을 부적절하게 수선하는 경우 파단 부위에 돌연변이가 도입될 수 있다. 예를 들면, 부적절한 수선은 해독틀 이동 돌연변이를 도입할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA가 TALEN과 함께 세포에 도입될 수 있다; 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이 과정은 TCR 및/또는 HLA 유전자의 결함을 수정하거나 이러한 결함을 wt TCR 및/또는 HLA 유전자에 도입하여 HLA의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. TCR 및/또는 HLA의 서열에 특이적인 TALEN은 모듈 성분을 사용하는 다양한 방식을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 작제될 수 있다. 문헌 [Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: el9509] 참조.
"ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 ZFN" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하기 위한 ZFN"은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 아연 핑거 뉴클레아제를 지칭한다. TALEN과 마찬가지로, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 Fokl 뉴클레아제 도메인 (또는 이의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 문헌 [Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; and Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160] 참조. 아연 핑거는 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 아연 핑거는, 예를 들면, Cys2His2 (서열 번호 75)를 포함할 수 있으며, 대략 3-bp 서열을 인식할 수 있다. 알려진 특이성의 다양한 아연 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 다중-핑거 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유류 세포를 포함하여 특정 서열을 인식하는 아연 핑거 (및 이들의 조합)를 생성하기 위해 다양한 선택 및 모듈식 조립 기술이 이용 가능하다.
TALEN과 마찬가지로, ZFN은 DNA를 절단하기 위해 이량체화해야 한다. 따라서, 비-회문 DNA 부위를 표적화하기 위해서는 한 쌍의 ZFN이 필요하다. 두 개의 개별 ZFN은 DNA의 반대 가닥을 적절한 간격을 두고 있는 이들의 뉴클레아제와 결합시켜야 한다. 문헌 [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5] 참조. 또한 TALEN과 마찬가지로, ZFN은 DNA에서 이중-가닥 파단을 생성할 수 있으며, 이것은 부적절하게 수선될 경우 해독틀-이동 돌연변이를 생성하여 세포에서 TCR 및/또는 HLA의 발현 및 양을 감소시킬 수 있다. ZFN은 또한 TCR 및/또는 HLA 유전자에서 돌연변이를 일으키기 위해 상동성 재조합과 함께 사용될 수 있다. TCR 및/또는 HLA의 서열에 특이적인 ZFN은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Quo et al. (2010) /. Mol. Biol. 400: 96; US2011/0158957]; 및 미국 제2012/0060230호를 참조한다.
"메가뉴클레아제" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 메가뉴클레아제" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하기 위한 메가뉴클레아제"는 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하는데 사용될 수 있는 큰 (> 14개 염기쌍) 인식 부위를 가진 단량체성 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 메가뉴클레아제 (mn)는 박테리아 호밍 엔도뉴클레아제로부터 유래되고 고유한 표적 부위를 위해 조작된 선천적 뉴클레아제 활성을 갖는 단량체성 단백질이다. 호밍 엔도뉴클레아제는 이들의 숙주 게놈의 개별 유전자좌에서 이중 가닥 파단을 생성하여 부위-특이 유전자 전환 이벤트를 유도할 수 있는 DNA-절단 효소이다. (Stoddard, Structure. 2011 Jan 12;19(1):7-15). 작은 크기에도 불구하고, 호밍 엔도뉴클레아제는 긴 DNA 서열 (일반적으로 20 내지 30개의 염기쌍)을 인식한다. 호밍 엔도뉴클레아제는 매우 널리 퍼져 있으며 미생물 뿐만 아니라 파지 및 바이러스에서도 발견된다. LAGLIDADG 및 His-Cys 박스 효소 (이러한 효소 중 가장 서열-특이적임)는 DNA 표적 부위의 주요 홈에 도킹하는 역평행 β-시트에 의존한다 (Flick et al., 1998; Jurica et al., 1998). 거기에서 이들은 다수의 연속 염기쌍에 걸쳐 불균일하게 분포된 서열-특이 및 비특이 접촉의 무리를 확립한다 (Chevalier et al., 2003; Scalley-Kim et al., 2007).
LAGLIDADG 호밍 엔도뉴클레아제 (LHE) 패밀리는 유전자 표적화 분야에 사용되는 조작된 효소의 주요 공급원이다. LHE 패밀리는 주로 고세균 내에서 및 조류와 진균의 엽록체 및 미토콘드리아 게놈에서 암호화된다 (Chevalier et al., 2005; Dalgaard et al., 1997; Sethuraman et al., 2009). 단백질 사슬 당 하나의 보존된 LAGLIDADG 모티프 (서열 번호 58)를 보유하는 메가뉴클레아제는 회문 및 거의 회문 DNA 표적 서열을 절단하는 동종이량체 단백질을 형성하는 반면, 단백질 사슬 당 두 개의 이러한 모티프를 함유하는 것은 완전히 비대칭인 DNA 서열을 표적화할 수 있는 더 큰 유사-대칭 단량체를 형성한다.
메가뉴클레아제는 TCR 및/또는 HLA를 표적화하도록 조작될 수 있으며, 따라서 DNA에서 이중-가닥 파단을 생성할 수 있고, 이것이 부적절하게 수선될 경우 해독틀-이동 돌연변이를 생성하여 세포에서 TCR 및/또는 HLA의 발현 및 양을 감소시킬 수 있다.
"MegaTAL" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 megaTAL" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하기 위한 megaTAL"은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제를 지칭한다. MegaTAL은 LAGLIDADG 호밍 엔도뉴클레아제 패밀리로부터 유래된 메가뉴클레아제의 N-말단에 최소 TAL (전사 활성화제-유사) 이펙터 도메인의 융합을 통해 수득된 하이브리드 단량체 뉴클레아제이다 (Nucleic Acids Res. 2014 Feb;42(4):2591-601; Takeuchi et al, Methods Mol Biol. 2015;1239:105-32. doi: 10.1007/978-1-4939-1862-1_6). 따라서 MegaTAL은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인에 의해 제공되는 추가의 친화성과 특이성을 갖는 부위-특이 메가뉴클레아제 절단 헤드로 구성된다.
MegaTAL은 TCR 및/또는 HLA를 표적화하도록 조작될 수 있으며, 따라서 DNA에서 이중-가닥 파단을 생성할 수 있고, 이것이 부적절하게 수선될 경우 해독틀-이동 돌연변이를 생성하여 세포에서 TCR 및/또는 HLA의 발현 및 양을 감소시킬 수 있다.
특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 일부 실시양태에서, 치료 T 세포는 T 세포에서의 단축된 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 갖는다; 따라서, 텔로머라제 유전자로의 형질감염은 T 세포의 텔로미어를 연장시키고 환자에서 T 세포의 지속성을 개선시킬 수 있다. 문헌 [Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117: 1466-1476 (2007)]을 참조한다. 따라서, 실시양태에서, 유전자 변형된 Treg 세포는 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어, 텔로머라제의 촉매적 서브유닛, 예를 들어, TERT, 예를 들어, hTERT를 이소성으로 발현한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 세포를 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어, 텔로머라제의 촉매적 서브유닛, 예를 들어, TERT, 예를 들어, hTERT를 암호화하는 핵산과 접촉시킴을 포함하여, CR-발현 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 세포는 CR을 암호화하는 작제물과 접촉하기 전, 접촉과 동시에 또는 접촉한 후에 핵산과 접촉할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 Treg 세포를 수득하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 적어도 하나의 Treg 세포를 상기 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입하는 단계, 및 임의로 형질도입된 세포를 확장하는 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 방법은 생체외 방법이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포를 수득하는 방법은 다음을 포함한다:
- (예를 들어, 백혈구 성분채집술에 의해 회수된) PBMC 집단으로부터의 Treg 세포의 단리 단계,
- 상기 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 서열이 Treg 세포 내에서 도입되거나 전달되는 유전자 변형 단계,
- 임의로 확장 단계,
- 임의로 세척 단계 및
- 임의로 동결 단계.
하나의 실시양태에서, 유전자 변형 단계(들)는 유전자 파괴 단계, 유전자 교정 단계 또는 유전자 부가 단계에 상응하고, 바람직하게는 유전자 부가 단계에 상응한다. 하나의 실시양태에서, 유전자 변형 단계(들)는 형질감염, 형질도입 또는 유전자 편집을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된 방법에 의해 수행된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 유전자 편집 방법의 예는 조작된 뉴클레아제에 기반한 방법, 재조합 아데노-관련 바이러스 (또는 AAV)에 기반한 방법, 트랜스포손에 기반한 방법 (예를 들어, 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템), 상동성 재조합에 기반한 방법, 부위-특이 재조합 효소를 사용한 조건부 표적화 (예를 들어, Cre-LoxP 및 Flp-FRT 시스템), 및 MAGE (Multiplex Automated Genomic Engineering)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
조작된 뉴클레아제의 비제한적인 예는 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복서열 (CRISPR) 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제 (mn, 호밍 엔도뉴클레아제로도 알려짐), 또는 megaTAL (TAL 이펙터와 mn 절단 도메인을 조합함)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포를 수득하는 방법은 다음을 포함한다:
- (예를 들어, 백혈구 성분채집술에 의해 회수된) PBMC 집단으로부터의 Treg 세포의 단리 단계,
- 상기 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 사용한 형질도입 또는 형질감염 단계,
- 임의로 확장 단계,
- 임의로 세척 단계 및
- 임의로 동결 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성된 조성물이다.
하나의 실시양태에서, 상기 조성물은 위에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 IL-23R에 특이적인 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 적어도 하나의 Treg 세포 집단을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성되며, 여기서 상기 CAR은 (i) 위에 기술된 바와 같은 IL-23R에 특이적인 세포외 결합 도메인, (ii) 임의로 위에 기술된 바와 같은 세포외 힌지 도메인, (iii) 임의로 위에 기술된 바와 같은 막관통 도메인, (iv) 위에 기술된 바와 같은 세포내 신호전달 도메인, 및 (v) 임의로 위에 기술된 바와 같은 태그 및/또는 리더 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 조성물은 동결 및 해동되었다.
본 발명의 또 다른 목적은 위에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 Treg 세포 집단 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성된 약제학적 조성물이다.
본 발명의 또 다른 목적은 위에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 Treg 세포 집단을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성된 약제이다.
하나의 실시양태에서, 약제학적 조성물 또는 약제는 본 발명의 적어도 하나의 단리된 및/또는 실질적으로 정제된 Treg 세포 집단을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 약제학적 조성물 또는 약제는 위에 기술된 바와 같은 Treg 세포 집단의 조합 (즉, 본 발명의 적어도 2개의 별개의 Treg 세포 집단)을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물 또는 약제는 적어도 하나의 다른 Treg 세포 집단을 추가로 포함하며, 여기서 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 항원, 항원의 단편, 항원의 변이체 또는 이들의 혼합물에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
하나의 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는, 예를 들면, 다발성 경화증-관련 항원, 관절-관련 항원, 눈-관련 항원, 인간 HSP 항원, 피부-관련 항원 또는 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원과 같은 자가항원에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 흡입된 알레르겐, 섭취된 알레르겐 또는 접촉 알레르겐에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
하나의 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 난백알부민, MOG, 타입 II 콜라겐, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된 항원에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
하나의 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 난백알부민, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 MOG, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 타입 II 콜라겐, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 시트룰린화 비멘틴, 시트룰린화 타입 II 콜라겐 또는 시트룰린화 피브리노겐, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 다른 면역 세포 집단의 세포는 HLA-A2, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물에 특이적인 CAR을 세포 표면에 발현한다.
하나의 실시양태에서, 상기 다른 Treg 세포 집단의 세포는 CAR을 세포 표면에 발현하며, 여기서 상기 CAR의 세포외-결합 도메인은, 예를 들면, 자가항원 또는 이의 단편 또는 변이체와 같은 단백질 또는 이의 단편 또는 변이체이다.
본원에 사용된 용어 "로 본질적으로 구성된"은, 약제학적 조성물 또는 약제와 관련하여, 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단이 상기 약제학적 조성물 또는 약제 내에서 유일한 치료제 또는 생물학적 활성을 갖는 제제임을 의미한다.
이러한 조성물 및 약제는 중성 완충 염수, 인산염 완충 염수 등과 같은 완충액; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신과 같은 폴리펩티드 또는 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다.
조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식 (implantation) 또는 이식 (transplantation)을 포함하여 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내 (i.v.) 주사 또는 복강내 투여될 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포 집단은 i.v. 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 조성물은 하나의 실시양태에서 정맥내 투여용으로 제형화된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 Treg 세포 집단은 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애의 부위에 직접 주사될 수 있다.
본 발명은 또한 IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 CAR을 발현하는 Treg 세포, 이러한 세포의 집단, 본원에 기술된 바와 같은 조성물, 약제학적 조성물 또는 약제에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 목적은 IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애를 이를 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법이며, 여기서 상기 방법은 위에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 Treg 세포 또는 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여함을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 방법은 세포 요법 방법이다.
하나의 실시양태에서, 대상체에는 자가 세포가 투여된다 (또는 투여될 예정이다). 즉, 하나의 실시양태에서, 세포 요법은 자가 요법이다.
하나의 실시양태에서, 세포 요법은 이종 요법이다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에는 동종 세포가 투여된다 (또는 투여될 예정이다). 즉, 하나의 실시양태에서, 세포 요법은 동종 요법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애를 이를 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법이며, 여기서 상기 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 CAR 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 포함하는 벡터를 투여함을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 유전자 요법 방법이다.
하나의 실시양태에서, IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애는 전염증성 세포 매개된 질환 또는 장애, Th17-매개된 질환 또는 장애 또는 γδ T-매개된 질환 또는 장애이다.
하나의 실시양태에서, IL-23R-발현 세포-매개된 질환은 자가면역 질환 또는 장애 및/또는 염증성 질환 또는 장애이다.
IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애의 예는 크론병 (Crohn's disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis) (UC), 수포성 유천포창 (bullous pemphigoid), 루푸스 (전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus) (SLE), 루푸스 신염 (lupus nephritis) (LN), 원판상 루푸스 (discoid lupus), 심홍반성 루푸스 (lupus erythematosus profundus), 동창 홍반성 루푸스 (Chilbrain lupus erythematosus), 비대성 홍반 루푸스 (tumidus lupus erythematosus), 중증 전신 홍반성 루푸스 (severe systemic lupus erythematosus), 급성 피부 루푸스 (acute cutaneous lupus), 만성 피부 루푸스 (chronic cutaneous lupus) 포함), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 관절염 (예를 들면, 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 반응성 관절염 (reactive arthritis) (라이터 증후군 (Reiter syndrome)), 소아 특발성 관절염 (juvenile idiopathic arthritis), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis) 및 건선성 관절염 (psoriatic arthritis)), 시신경 척수염 (neuromyelitis optica) (NMO), 자가면역 변연성 뇌염 (autoimmune limbic encephalitis) (LE), 하시모토 병 (Hashimoto's disease), N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NMDAR) 뇌염, 자가면역 용혈성 빈혈 (autoimmune hemolytic anemia), 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris), 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 그레이브스 병 (Graves' disease), 특발성 혈소판 감소성 자반병 (idiopathic thrombocytopenic purpura), 굿파스처 증후군 (Goodpasture's syndrome), 셀리악 병 (celiac disease), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 백반증 (vitiligo), 경피증 (scleroderma), 건선 (psoriasis), 쇼그렌 증후군 (sjoegren's syndrome), 베게너 육아종증 (Wegener granulomatosis), 다발 근염 (polymyositis), 피부 근염 (dermatomyositis), 원발성 쓸개관 간경변 (primary biliary cirrhosis), 항인지질 증후군 (antiphospholipid syndrome), 혼합 결합 조직 질환 (mixed connective tissue disease), 밀러 피셔 증후군 (Miller Fisher syndrome), 길랭-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 급성 운동 축삭 신경병증 (acute motor axonal neuropathy), 자가면역 간염 (autoimmune hepatitis), 포진성 피부염 (dermatitis herpetiformis), 척-스트라우스 병 (Churg-Strauss disease), 현미경적 다발 혈관염 (microscopic polyangiitis), IgA 신장병증 (IgA nephropathy), ANCA 및 기타 ANCA 관련 질환에 의해 유발된 혈관염 (vasculitis), 급성 류마티스 열 (acute rheumatic fever), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 1형 당뇨병 (Type 1 diabetes) (T1D), 막성 신장병증 (membranous nephropathy), 만성 염증성 탈수 초성 다발신경병증 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (thrombotic thrombocytopenic purpura), 단클론성 감마글로불린병증의 과다점도 (hyperviscosity in monoclonal gammopathies), 용혈성 요독 증후군 (hemolytic uremic syndrome) (비정형, 인자 H에 대한 항체로 인함), 윌슨 병 (Wilson disease), 전격성 람베르트-이튼 근무력 증후군 (fulminant, Lambert-Eaton myasthenic syndrome), 임신중 RBC 동종면역 (RBC alloimmunization in pregnancy), 버섯 중독 (mushroom poisoning), 급성 파종성 뇌척수염 (acute disseminated encephalomyelitis), 용혈성 요독 증후군 (hemolytic uremic syndrome) (비정형, 보체 인자 돌연변이로 인함), 자가면역 용혈성 빈혈 (autoimmune hemolytic anemia) (생명을 위협하는 저온 응집병), 골수종 캐스트 신장병증 (myeloma cast nephropathy), 수혈후 자반병 (post-transfusion purpura), 자가면역 용혈성 빈혈 (autoimmune hemolytic anemia) (온열 자가면역 용혈성 빈혈 (warm hemolytic anemia)), 고중성지방혈증 췌장염 (hypertriglyceridemic pancreatitis), 갑상선 독성발작 (thyroid storm), 강직 인간 증후군 (stiff person syndrome), 용혈성 요독 증후군 (Hemolytic uremic syndrome) (전형적인 설사-관련), 면역성 혈소판 감소증 (immune thrombocytopenia), ABO 비-호환성 고형 장기 이식 (ABO-incompatible solid organ transplantation) (SOT), 한랭 글로불린혈증 (cryoglobulinemia), 헤파린-유도된 혈소판 감소증 (heparin-induced thrombocytopenia), 갑상선 독성발작 (thyroid storm), 만성 염증성 탈수초성 다발신경근병증 (chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy), 국소 분절 사구체 경화증 (focal segmental glomerulosclerosis) 및 전격성 간부전 (fulminant hepatic failure)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 상기 IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애는 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease) (예를 들면, 크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)), 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 소아 특발성 관절염 (juvenile idiopathic arthritis), 쇼그렌 증후군 (sjoegren's syndrome), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 1형 당뇨병 (Type 1 diabetes), 자가면역 갑상선 장애 (autoimmune thyroid disorder), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 중증 근무력증 (Myasthenia Gravis), 건선 (psoriasis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis) 또는 포도막염 (uveitis)으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에서, IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애는 크론병 (Crohn's disease)이다.
용어 "염증성 장애" 또는 "염증성 질환"은 상호 교환적으로 사용되며 본원에 사용된 바와 같이 염증과 관련된 임의의 이상을 지칭한다.
하나의 실시양태에서, 염증성 병태는 암과 관련된 염증성 질환 또는 장애를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 염증성 병태는 자가면역 질환과 관련된 염증성 질환 또는 장애를 포함한다.
염증성 질환 또는 장애의 예는 관절염 (arthritis), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 골관절염 (osteoarthritis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 소아 특발성 관절염 (juvenile idiopathic arthritis), 소아 류마티스 관절염 (juvenile rheumatoid arthritis), 요도염성 관절염 (arthritis uratica), 통풍 (gout), 만성 다발성 관절염 (chronic polyarthritis), 관절주위염 (periarthritis) 상완골수염 (humeroscapularis), 경추 관절염 (cervical arthritis), 요추 관절염 (lumbosacral arthritis), 장병성 관절염 (enteropathic arthritis) 및 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 천식 (asthma), 피부염 (dermatitis), 건선 (psoriasis), 경피증 (scleroderma), 다발 근염 (polymyositis), 피부 근염 (dermatomyositis), 소아 피부 근염 (juvenila dermatomyositis), 원발성 쓸개관 간경변 (primary biliary cirrhosis), 섬유증 (fibrosis), 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis), 폐 섬유증 (pulmonary fibrosis), 간경변 (cirrhosis), 심내막심근 섬유증 (endomyocardial fibrosis), 종격동 섬유증 (dediastinal fibrosis), 골수섬유증 (myelofibrosis), 후복막 섬유증 (retroperitoneal fibrosis), 신성 섬유증 (nephrogenic fibrosis), 켈로이드 (Keloids), 경피증 (scleroderma), 관절섬유증 (arthrofibrosis), 이식후 후기 및 만성 고형 장기 거부 (post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 루푸스 신염 (lupus nephritis), 천포창 (pemphigus), 심상성 천포창 (Pemphigus vulgaris), 수포창 피부염 (Pemphigus herpetiformis), 증식성 천포창 (Pemphigus vegetans), IgA 천포창 (IgA pemphigus), 홍반성 천포창 (Pemphigus erythematosus), 수포성 유천포창 (bullous pemphigoid), 임신 유천포창 (Pemphigoid gestationis), 점막 피부병 (Mucous membrane dermatosis), 결절성 유천포창 (Pemphigoid nodularis), 선상 IgA 수포성 피부병 (Linear IgA bullous dermatosis), 수포성 편평 태선 (Bullous lichen planus), 후천성 표피 수포증 (Epidermolysis bullosa acquisita), 자가면역 당뇨병 (autoimmune diabetes), 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy), 당뇨병성 신장병증 (diabetic nephropathy), 당뇨병성 혈관병증 (diabetic vasculopathy), 안구 염증 (ocular inflammation), 포도막염 (uveitis), 비염 (rhinitis), 허혈-재관류 손상 (ischemia-reperfusion injury), 혈관성형후 재협착 (post-angioplasty restenosis), 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease) (COPD), 사구체신염 (glomerulonephritis), 그레이브스 병 (Graves disease), 위장 알레르기 (gastrointestinal allergies), 결막염 (conjunctivitis), 죽상 동맥경화증 (atherosclerosis), 관상 동맥 질환 (coronary artery disease), 협심증 (angina), 소동맥 질환 (small artery disease), 급성 파종성 뇌척수염 (acute disseminated encephalomyelitis), 특발성 혈소판 감소성 자반병 (idiopathic thrombocytopenic purpura), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 항인지질 증후군 (antiphospholipid syndrome), 쇼그렌 증후군 (Sjoegren's syndrome), 자가면역 용혈성 빈혈 (autoimmune hemolytic anemia), 대장염 (colitis), 크론병 (Crohn's Disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 염증성 장 질환 (Inflammatory Bowel Disease) (IBD), 색전증 (embolism), 폐 색전증 (pulmonary embolism), 동맥 색전증 (arterial embolism), 정맥 색전증 (venous embolism), 알레르기성 염증 (allergic inflammation), 심혈관 질환 (cardiovascular disease), 이식-관련 질환 (graft-related diseases), 이식편 대 숙주 질환 (graft versus host disease) (GVHD), 이식편 이식 거부, 만성 거부, 및 조직 또는 세포 동종이식 또는 이종이식과 관련된 장애, 자가면역 질환 (autoimmune diseases), 외상후 변성 (degeneration after trauma), 뇌졸중 (stroke), 이식 거부 (transplant rejection), 알레르기 상태 (allergic conditions) 및 과민증 (hypersensitivity), 예를 들어, 알레르기성 비염 (allergic rhinitis), 알레르기성 습진 (allergic eczema) 등, 피부 질환, 피부 염증성 질환 (dermal inflammatory disorder), 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
피부 질환의 예는 여드름 (acne); 광선 각화증 (actinic keratosis); 아토피성 피부염 (atopic dermatitis); 접촉성 피부염 (contact dermatitis); 욕창 궤양 (decubitus ulcer) (욕창); 습진 (eczema); 홍피증 (erythroderma); 혈관종 (hemangioma), 예를 들면, 유년기 혈관종 (hemangioma of childhood); 비후 흉터 (hypertrophic scarring); 편평 태선 (lichen planus); 태선모양 질환 (lichenoid disorder); 림프관신생 (lymphangiogenesis); 건선 (psoriasis); 화농성 육아종 (pyogenic granulomas); 전염성 연속종 (molluscum contagious); 신경 섬유종증 (neurofibromatosis); 주사비 (rosacea); 열성 이영양성 수포성 표피박리증 (recessive dystrophic epidermolysis bullosa); 흉터 (켈로이드); 경피증 (scleroderma); 지루성 각화증 (seborrheic keratosis); 피부암, 예를 들어 혈관 육종 (angiosarcoma), 기저 세포 암종 (basal cell carcinoma), 혈관 내피종 (hemangioendothelioma), 카포시 육종 (Karposi's sarcoma), 악성 흑색종 (malignant melanoma), 흑색종 (melanoma), 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma); 피부 궤양 (skin ulcers); 자가이식 (autotransplantation) 및 동종이식 (allotransplantation과 같은 피부 이식 후 피부 손상; 스티븐-존슨 증후군 (Steven-Johnson syndromes) 및 독성 표피 괴사용해 (toxic epidermal necrolysis); 스터지-웨버 증후군 (Sturge-Weber syndrome); 결절성 경화증 (tuberous sclerosis); 정맥 궤양 (venous ulcers); 심상성 사마귀 (verruca vulgaris); 무사마귀 (warts), 예를 들면, 바이러스 성 무사마귀 (viral warts); 상처 (wounds); 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
피부 염증성 장애의 예는 건선 (psoriasis), 방울 건선 (guttate psoriasis), 부위바뀜 건선 (inverse psoriasis), 농포성 건선 (pustular psoriasis), 홍피증 건선 (erythroderma psoriasis), 급성 열성 호중구 피부병 (acute febrile neutrophilic dermatosis), 습진 (eczema), 건조 습진 (asteatotic eczema), 땀흘림이상 습진 (dyshidrotic eczema), 소포성 손발바닥 습진 (vesicular palmoplanar eczema), 심상성 여드름 (acne vulgaris), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 접촉성 피부염 (contact dermatitis), 알레르기성 접촉 피부염 (allergic contact dermatitis), 피부근염 (dermatomyositis), 박리성 피부염 (exfoliative dermatitis), 손 습진 (hand eczema), 한포증 (pompholyx), 주사비 (rosacea), 유육종증에 의해 유발된 주사비 (rosacea caused by sarcoidosis), 경피증에 의해 유발된 주사비 (rosacea caused by scleroderma), 스위트 증후군에 의해 유발된 주사비 (rosacea caused by Sweet's syndrome), 전신 홍반성 루푸스에 의해 유발된 주사비 (rosacea caused by systemic lupus erythematosus), 두드러기에 의해 유발된 주사비 (rosacea caused by urticaria), 대상포진-관련 통증에 의해 유발된 주사비 (rosacea caused by zoster-associated pain), 스위트 질환 (Sweet's disease), 호중구 한선염 (neutrophilic hidradenitis), 무균성 농포증 (sterile pustulosis), 약물 발진 (drug eruption), 지루성 피부염 (seborrheic dermatitis), 장미색 비강진 (pityriasis rosea), 피부 기구치병 (cutaneous kikuchi disease), 임신성 소양성 팽진구진반 (pruritic urticarial papules and plaques of pregnancy), 스티븐-존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome) 및 독성 표피 괴사용해 (toxic epidermal necrolysis), 문신 반응 (attoo reations), 웰스 증후군 (Wells syndrome) (호산구성 봉와직염 (eosinophilic cellulitis)), 반응성 관절염 (reactive arthritis) (라이터 증후군 (Reiter's syndrome)), 장-관련 피부병-관절염 증후군 (bowel-associated dermatosis-arthritis syndrome), 류마티스 호중구 피부병 (rheumatoid neutrophilic dermatosis), 호중구 외분비 한선염 (neutrophilic eccrine hidradenitis), 등쪽 손의 호중구성 피부병 (neutrophilic dermatosis of the dorsal hands), 형질세포성 국한성 귀두염 (balanitis circumscripta plasmacellularis), 귀두 포피염 (balanoposthitis), 배체트병 (Behcet's disease), 원심성 환상 홍반 (erythema annulare centrifugum), 지속 이색 홍반 (erythema dyschromicum perstans), 다형 홍반 (erythema multiforme), 환상 육아종 (granuloma annulare), 수부 피부염 (hand dermatitis), 광택 태선 (lichen nitidus), 편평 태선 (lichen planus), 경화성 위축성 태선 (lichen sclerosus et atrophicus), 만성 단순 태선 (lichen simplex chronicus), 극상 태선 (lichen spinulosus), 화폐상 피부염 (nummular dermatitis), 괴저성 농피증 (pyoderma gangrenosum), 사르코이드증 (sarcoidosis), 각질하 농포성 피부염 (subcorneal pustular dermatosis), 두드러기 (urticaria), 및 일과성 극세포해리성 피부병 (transient acantholytic dermatosis)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 자가면역 질환 또는 장애를 이를 필요로 하는 대상체에서 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 CAR 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 포함하는 벡터를 투여함을 포함한다.
자가면역 질환의 예는 루푸스 (예를 들어, 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 루푸스 신염 (lupus nephritis)), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 원발성 점액수종 (primary myxedema), 그레이브스 병 (Graves' disease), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 자가면역 위축성 위염 (autoimmune atrophic gastritis), 애디슨 병 (Addison's disease), 당뇨병 (예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병 (insulin dependent diabetes mellitus), 1형 당뇨병 (type I diabetes mellitus), 2형 당뇨병 (type II diabetes mellitus)), 굿파스처 증후군 (good pasture's syndrome), 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 천포창 (pemphigus), 크론 병 (Crohn's disease), 교감성 안염 (sympathetic ophthalmia), 자가면역 포도막염 (autoimmune uveitis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역 용혈성 빈혈 (autoimmune hemolytic anemia), 특발성 혈소판 감소증 (idiopathic thrombocytopenia), 원발성 쓸개관 간경변 (primary biliary cirrhosis), 만성 활동성 간염 (chronic action hepatitis), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 쇼그렌 증후군 (sjoegren's syndrome), 류마티스 질환 (rheumatic diseases) (예를 들어, 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis)), 다발근염 (polymyositis), 경피증 (scleroderma), 건선 (psoriasis), 및 혼합 결합 조직 질환 (mixed connective tissue disease)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 알레르기 질환 또는 장애를 이를 필요로 하는 대상체에서 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 CAR 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 포함하는 벡터를 투여함을 포함한다.
알레르기 질환의 예는 흡입된 알레르겐, 섭취된 알레르겐 또는 접촉 알레르겐에 대한 알레르기 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 알레르기 질환의 또 다른 예는 알레르기성 천식 (allergic asthma), 과민성 폐 질환 (hypersensitivity lung diseases), 식품 알레르기 (food allergy), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 알레르기성 비염 (allergic rhinitis), 알레르기성 비결막염 (allergic rhinoconjunctivitis), 만성 두드러기 (chronic urticaria), 지연형 과민성 장애 (delayed-type hypersensitivity disorders) 및 전신 아나필락시스 (systematic anaphylaxis)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 암을 이를 필요로 하는 대상체에서 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서 상기 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 CAR 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 또는 본원에 기술된 바와 같은 CAR을 포함하는 벡터를 투여함을 포함한다.
본원에 사용된 "암"은 표면 항원 또는 암 마커와 관련된 임의의 암일 수 있다.
암의 예는 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia) (ALL), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia) (AML), 선낭 암종 (adenoid cystic carcinoma), 부신피질 암종 (adrenocortical, carcinoma), AIDS-관련 암, 항문암 (anal cancer), 충수암 (appendix cancer), 성상세포종 (astrocytomas), 비정형 기형양/횡문근양 종양 (atypical teratoid/rhabdoid tumor), 중추 신경계, B-세포 백혈병, 림프종 또는 기타 B 세포 악성 종양, 기저 세포 암종 (basal cell carcinoma), 담관암 (bile duct cancer), 방광암 (bladder cancer), 골암 (bone cancer), 골육종 (osteosarcoma) 및 악성 섬유성 조직구종 (malignant fibrous histiocytoma), 뇌간 교종 (brain stem glioma), 뇌 종양 (brain tumors), 유방암 (breast cancer), 기관지 종양 (bronchial tumors), 버킷 림프종 (burkitt lymphoma), 유암 종양 (carcinoid tumor), 중추 신경계 암 (central nervous system cancers), 자궁 경부암 (cervical cancer), 척색종 (chordoma), 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia) (CLL), 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia) (CML), 만성 골수증식성 장애 (chronic myeloproliferative disorders), 결장암 (colon cancer), 결장 직장암 (colorectal cancer), 두개인두종 (craniopharyngioma), 피부 t-세포 림프종 (cutaneous t-cell lymphoma), 배아성 종양 (embryonal tumors), 중추 신경계, 자궁 내막암 (endometrial cancer), 뇌실막모세포종 (ependymoblastoma), 뇌실막종 (ependymoma), 식도암 (esophageal cancer), 감각신경모세포종 (esthesioneuroblastoma), 유잉 육종 계열의 종양 (ewing sarcoma family of tumors) 두개외 생식 세포 종양 (extracranial germ cell tumor), 성선외 생식 세포 종양 (extragonadal germ cell tumor) 간외 담관암 (extrahepatic bile duct cancer), 안암 (eye cancer) 뼈의 섬유 조직구종 (fibrous histiocytoma of bone), 악성, 및 골육종 (osteosarcoma), 담낭암 (gallbladder cancer), 위암, 위장 카르시노이드 종양 (gastrointestinal carcinoid tumor), 위장 간질 종양 (gastrointestinal stromal tumors) (GIST), 연조직 육종 (soft tissue sarcoma), 생식 세포 종양 (germ cell tumor), 임신 영양막 종양 (gestational trophoblastic tumor), 신경교종 (glioma), 모발상 세포 백혈병 (hairy cell leukemia), 두경부암 (head and neck cancer), 심장암 (heart cancer), 간세포 (간) 암 (hepatocellular (liver) cancer), 조직구증 (histiocytosis), 호지킨 림프종 (hodgkin lymphoma), 하인두암 (hypopharyngeal cancer), 안내 흑색종 (intraocular melanoma), 섬세포 종양 (islet cell tumors) (내분비 췌장), 카포시 육종 (kaposi sarcoma), 신장암 (kidney cancer), 랑게르한스 세포 조직구증 (langerhans cell histiocytosis), 후두암 (laryngeal cancer), 백혈병 (leukemia), 입술 및 구강 암 (lip and oral cavity cancer), 간암 (liver cancer) (원발성), 소엽성 상피내 암종 (lobular carcinoma in situ) (LCIS), 폐암 (lung cancer), 림프종 (lymphoma), 마크로글로불린혈증 (macroglobulinemia), 남성 유방암 (male breast cancer), 뼈의 악성 섬유 조직구종 및 골육종 (malignant fibrous histiocytoma of bone and osteosarcoma), 수모세포종 (medulloblastoma), 수질피종 (medulloepithelioma), 흑색종 (melanoma), 머켈 세포 암종 (merkel cell carcinoma), 중피종 (mesothelioma), NUT 유전자를 포함하는 잠재성 원발성 정중선 암종을 동반한 전이성 편평 경부암 (metastatic squamous neck cancer with occult primary midline tract carcinoma involving NUT gene), 구강암 (mouth cancer), 다발성 내분비 신생물 증후군 (multiple endocrine neoplasia syndromes), 다발성 골수종 (multiple myeloma)/형질 세포 신생물 (plasma cell neoplasm), 균상식육종 (mycosis fungoides), 골수이형성 증후군 (myelodysplastic syndromes), 골수이형성/ 골수증식 신생물 (myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms), 골수성 백혈병, 만성 (CML), 골수성 백혈병, 급성 (AML), 골수종 (myeloma), 다발성, 골수 증식성 장애 (multiple, myeloproliferative disorders), 비강 및 부비동 암 (nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암 (nasopharyngeal cancer), 신경모세포종 (neuroblastoma), 비-호지킨 림프종 (non-hodgkin lymphoma), 비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer), 구강암 (oral cancer), 구강암 (oral cavity cancer), 구강인두암 (oropharyngeal cancer), 뼈의 골육종 및 악성 섬유 조직구종 (osteosarcoma and malignant fibrous histiocytoma of bone), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 유두종증 (papillomatosis), 부신경절종 (paraganglioma), 부비동 및 비강 암 (paranasal sinus and nasal cavity cancer), 부갑상선암 (parathyroid cancer), 음경암 (penile cancer), 인두암 (pharyngeal cancer), 크롬 친화성 세포종 (pheochromocytoma), 중간 분화의 송과체 실질 종양 (pineal parenchymal tumors of intermediate differentiation), 송과체모세포종 (pineoblastoma) 및 천막위 원시 신경외배엽 종양 (supratentorial primitive neuroectodermal tumors), 뇌하수체 종양 (pituitary tumor), 형질 세포 신생물/다발성 골수종 (plasma cell neoplasm/multiple myeloma), 흉막 폐 모세포종 (pleuropulmonary blastoma), 임신 및 유방암 (pregnancy and breast cancer), 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종 (primary central nervous system (CNS) lymphoma), 전립선암 (prostate cancer), 직장암 (rectal cancer), 신장 세포 (신장) 암 (renal cell (kidney) cancer), 신우뇨관, 이행 세포 암 (renal pelvis and ureter, transitional cell cancer), 망막모세포종 (retinoblastoma), 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma), 침샘 암 (salivary gland cancer), 육종 (sarcoma), 세자리 증후군 (sezary syndrome), 소세포 폐암 (small cell lung cancer), 소장암 (small intestine cancer), 연조직 육종 (soft tissue sarcoma), 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma), 편평 경부암 (squamous neck cancer), 위암, 천막위 원시 신경외배엽 종양 (supratentorial primitive neuroectodermal tumors), t-세포 림프종, 피부, 고환암 (testicular cancer), 인후암 (throat cancer), 흉선종 (thymoma) 및 흉선 암종 (thymic carcinoma), 갑상선암 (thyroid cancer), 신우뇨관의 이행 세포 암 (transitional cell cancer of the renal pelvis and ureter), 영양막 종양 (trophoblastic tumor), 요관 및 신우 암 (ureter and renal pelvis cancer), 요도암 (urethral cancer), 자궁암 (uterine cancer), 자궁 육종 (uterine sarcoma), 질암 (vaginal cancer), 외음부 암 (vulvar cancer), 발텐스트롬 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom macroglobulinemia), 윌름스 종양 (Wilms Tumor)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 암은 B 세포 악성 종양이다. B 세포 악성 종양의 예는 비-호지킨 림프종 (Non-Hodgkin's Lymphomas) (NHL), 미만성 거대 B 세포 림프종 (Diffuse Large B Cell Lymphoma) (DLBCL), 소 림프구성 림프종 (lymphocytic lymphoma) (SLL/CLL), 맨틀 세포 림프종 (Mantle cell lymphoma) (MCL), 여포성 림프종 (Follicular lymphoma) (FL), 변연부 림프종 (Marginal zone lymphoma) (MZL), 결절외 (MALT 림프종), 결절 (단핵구 B-세포 림프종), 비장, 미만성 거대 세포 림프종 (Diffuse large cell lymphoma), B 세포 만성 림프구성 백혈병/림프종 (B cell chronic lymphocytic leukemia/lymphoma), 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma) 및 림프모구성 림프종 (Lymphoblastic lymphoma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간)는 본 발명의 Treg 세포 집단의 초기 투여 및 1회 이상의 후속 투여를 받으며, 여기서 1회 이상의 후속 투여는 15일 미만으로, 예를 들어, 이전 투여 후 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일에 투여된다.
하나의 실시양태에서, 치료적 유효량의 Treg 세포가 대상체에게 투여되거나 투여될 것이다.
하나의 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 면역 세포 집단의 Treg 세포의 양은 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개 세포이다.
하나의 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단의 Treg 세포의 양은 약 102 내지 약 109, 약 103 내지 약 108, 약 104 내지 약 107, 또는 약 105 내지 약 106개 세포에 이른다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단의 Treg 세포의 양은 약 106 내지 약 109, 약 106 내지 107, 약 106 내지 108, 약 107 내지 109, 약 107 내지 108, 약 108 내지 109개 세포에 이른다. 또 다른 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단의 Treg 세포의 양은 약 106, 약 107, 약 108, 또는 약 109개이다.
하나의 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단의 Treg 세포의 양은 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109개 세포/체중 kg이다.
하나의 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단의 Treg 세포의 양은 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여 약 104 내지 109개 세포/체중 kg 또는 105 내지 108개 세포/체중 kg에 이른다.
하나의 실시양태에서, 대상체는 매주 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단을 1회 이상 투여받으며, 예를 들어, 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단의 2, 3 또는 4회 투여가 대상체에게 매주 투여된다.
하나의 실시양태에서, 적어도 하나의 Treg 세포 집단은 활성제와 병용하여 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 하나의 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 Treg 세포 집단은 활성제의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다.
본 발명의 또 다른 목적은 IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이다.
제조 물품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 시린지, 파우치 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 자가면역 및/또는 염증성 질환 또는 장애와 같은 IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 Treg 세포 집단이다.
표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용됨을 나타낼 수 있다.
제조 물품, 표지 또는 포장 삽입물은 본 발명의 Treg 세포 집단을 환자에게 투여하기 위한 지침 자료를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 제조 물품은 약제학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단을 포함하는 키트이다. "키트"란 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단을 포함하는 임의의 제품 (예를 들어, 패키지 또는 용기)으로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 홍보, 배포 또는 판매될 수 있다. 더욱이, 임의의 또는 모든 키트 시약은 밀봉된 용기와 같이 외부 환경으로부터 이들을 보호하는 용기 내에 제공될 수 있다.
키트는 또한 키트 및 이의 사용방법을 설명하는 포장 삽입물을 함유할 수 있다. 다양한 목적에 유용한 (예를 들어, IL-23R-발현 세포-매개된 질환 또는 장애를 치료하기 위한) 키트가 또한 제공된다. 본 발명의 Treg 세포 집단을 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 제조 물품과 마찬가지로, 키트는 용기, 및 용기 상에 또는 용기와 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 용기는 본 발명의 적어도 하나의 Treg 세포 집단을 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제 및 완충제를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명 뿐만 아니라 의도된 사용에 대한 지침을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 항-IL-23R 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물 (예를 들면, 서열 번호 54의 서열을 갖는 CAR)의 개략도를 나타낸다. 항-IL23R CAR은 인간 CD8 리더 서열 (CD8), 인간 IL23R에 대해 지시된 scFv (αIL23R), CD8 힌지 (CD8 링커), 인간 CD8 알파로부터 유래된 막관통 도메인 (CD8 TM), 인간 4-1BB의 활성화 도메인 (4-IBB) 및 CD3 제타 (CD3Z)를 포함한다. CAR 작제물은 P2A-GFP 코딩 서열을 갖는 프레임에 있다.
도 2는 CAR의 Treg 형질도입 효능 및 막 발현을 보여주는 유세포 분석의 점 도표의 조합이다. 두 개의 Treg 클론으로 수득된 결과가 도시된다 (대표적인 결과). 형질도입 효능은 유세포 분석에서 GFP 발현에 의해 평가하였다. CAR의 막 발현은 유세포 분석에서 단백질-L 염색에 의해 평가하였다. 두 개의 Treg 클론 (클론 1: A-B; 클론 2: C-D)으로 수득된 결과가 도시된다 (대표적인 결과). (A, C) GFP-형질도입된 Treg (MOCK), (B, D): 본 발명의 IL-23R CAR로 형질도입된 Treg.
도 3은 IL-23R CAR 매개된 Treg 활성화를 보여주는 히스토그램이다. Treg 세포 활성화는 형질도입되지 않은 Treg (MOCK) 또는 IL-23R-CAR 형질도입된 Treg (IL-23R-CAR)를 코팅된 재조합 인간 IL-23R (rhuIL-23R) (5μg/ml) 또는 CD3/CD28 코팅된 비드로 (1:1 비드-대-세포 비율로) 활성화한지 24시간 후 유세포 분석에 의한 CD69 발현에 의해 평가하였다. 결과는 2명의 다른 공여자의 평균 ± SEM로 표현하였다.
도 4는 본 발명의 항-뮤린 IL-23R 키메라 항원 수용체 (CAR) 작제물의 개략도이다. 항-IL23R CAR은 인간 CD8 리더 서열 (CD8), 인간/뮤린 IL23R에 대해 지시된 교차 반응성 scFv (αIL23R), 뮤린 CD28로부터 유래된 힌지 및 막관통 도메인 (mCD28 링커 & mCD28 TM), 뮤린 CD28의 활성화 도메인 (mCD28) 및 뮤린 CD3 제타 (mCD3Z)를 포함한다.
도 5는 뮤린 Treg 형질도입 효능을 보여주는 유세포 분석의 점 도표의 조합이다. 형질도입 효능은 유세포 분석에서 NGFR 염색에 의해 평가하였다.
도 6은 IL-23R CAR 매개된 뮤린 Treg (mTreg) 활성화를 보여주는 히스토그램이다. mTreg 세포 활성화는 형질도입되지 않은 mTreg (Poly Treg) 또는 IL-23R-CAR 형질도입된 mTreg (IL-23R-CAR mTreg)를 CD3/CD28 코팅된 비드 또는 플레이트-코팅된 재조합 뮤린 IL-23R (mIL23R 플레이트-코팅된 1μg/ml) 또는 인간 또는 뮤린 IL-23R로 코팅된 비드로 활성화한지 24시간 후 유세포 분석에 의한 CD69 발현에 의해 평가하였다.
도 7은 IL-23R CAR mTreg가 시험관내에서 효율적인 CAR-매개된 억제 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 그래프이다. 형질도입되지 않은 Treg (A) 또는 mIL-23R 코팅된 비드 (비율 1:1 또는 2:1), CD3/CD28 코팅된 비드로 이들의 CAR을 통해 자극된 또는 자극되지 않은 (NS) IL-23R-CAR Treg (B)에 의해 매개되는 접촉 의존적 억제는 유세포 분석에서 기존 T 세포 (Tconv)의 증식을 측정함으로써 평가하였다.
도 8은 (A) 생체내 실험 설계의 개략도 및 (B) 상이한 그룹의 마우스의 이미퀴모드-유도된 피부 염증 모델의 PASI 점수를 보여주는 그래프의 조합이다: 비처리 (염수), 항-IL-23으로 i.p. 처리, poly-mTreg (8x106) 또는 IL-23R-CAR mTreg (8x106)로 i.v. 처리.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예 1: 항- IL23R CAR 인간 Treg
재료 및 방법
세포 및 시약
HEK293T 세포 (LentiX, Ozyme, France)는 10% 태아 소 혈청 (FBS)이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다.
FoxP3 Treg 단리
CD4+CD25+CD127low Treg 세포는 StemCell로부터의 EasySep™ 인간 CD4+CD127lowCD25+ 조절 T 세포 단리 키트를 사용하여 연막 (buffy coats)으로부터 새로 단리하였다. 단리 후 순도는 FoxP3 염색에 의해 평가하였다. 단리된 Treg 세포를 24-웰 플레이트 (Costar)에서 웰당 5 X 105개 세포로 X-VIVO 15 배지 (Lonza)에 플레이팅하고 항-CD3/항-CD28 코팅된 마이크로비드 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 1:1 비드-대-세포 비율에서 활성화하였다. Treg 세포에 활성화와 동시에 라파마이신 (100 ng/ml)을 제공하였다. 2일, 5일, 7일 및 9일차에 IL-2를 첨가하였다 (1000 단위/ml, Miltenyi).
CAR 작제물
항-IL23R CAR 작제물은 인간 CD8 리더 서열 (aa1-22) (예를 들어, 서열 번호 39의 서열을 가짐), 인간 IL23R에 대해 지시된 scFv (예를 들어, 서열 번호 55의 서열을 가짐), CD8 힌지 (예를 들어, 서열 번호 13의 서열을 가짐) 및 인간 CD8 알파로부터 유래된 막관통 도메인 (aa138-206) (예를 들어, 서열 번호 21의 서열을 가짐), 인간 4-1BB의 활성화 도메인 (aa214-255) (예를 들어, 서열 번호 29의 서열을 가짐) 및 CD3 제타 (aa52-164) (예를 들어, 서열 번호 26의 서열을 가짐)를 포함한다. CAR 작제물은 P2A-GFP 코딩 서열을 갖는 프레임에 있다.
벡터 및 적정
CAR 작제물은 고전적인 4-플라스미드 렌티바이러스 시스템을 사용하여 생산하였다. 간단히 말해서, HEK293T 세포를 3세대 렌티바이러스 전달 벡터 (pTX266), HIV-1 gagpol을 발현하는 플라스미드 (pMDLgpRRE), HIV-1 rev를 발현하는 플라스미드 (pRSV.Rev) 및 수포성 구내염 바이러스의 외피 당단백질인 VSV-G를 발현하는 플라스미드 (pMD2.G)로 형질감염시켰다. 형질감염한지 1일 후, 바이러스 상청액을 수확하고, 원심분리에 의해 농축하고, 분취하고 장기 저장을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 밀리리터당 형질도입 단위 수 (TU/ml)로 표현되는 감염 역가 (infectious titer)는 바이러스 상층액의 연속 희석물로 Jurkat T 세포를 형질도입한 후 수득하였으며 형질도입 효율은 유세포 분석을 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현을 모니터링함으로써 3일 후 평가하였다.
렌티바이러스 형질도입
Treg는 CD8의 서열 리더에 이은 scFv 항-IL-23R로 구성된 키메라 수용체로 이들을 활성화한지 2일 후에 형질도입하였다. 이러한 세포외 도메인은 인간 CD8의 힌지 및 막관통 영역을 통해 신호 서열에 연결된다. 신호 서열은 4-1BB의 세포내 도메인에 이어 세포내 인간 CD3ζ 사슬로 구성된다. 간단히 말해서 형질도입은 각 웰에 ml 당 0.5x107 형질도입 단위 (TU)를 부하함으로써 수행하였다. 37℃에서 6시간 후, 바이러스 입자를 세척에 의해 제거하였다. 그후, 플레이트를 5% CO2로 37℃에서 배양하였다. 형질도입 효율 (GFP 발현에 의해 평가됨) 및 세포 표면에서의 키메라 수용체 수준 (단백질-L 염색에 의해 평가됨)은 형질도입한지 5일 후에 확인하였다.
단백질-L 염색
세포 표면 CAR 발현의 정량화는 CAR을 APC-접합 단백질 L로 표지함으로써 수행하였으며 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. 간단히 말해서, 세척 후, 세포를 0.2 ml의 빙냉 세척 완충액 (PBS 4% BSA)에 재현탁하고 5 μg의 단백질 L과 함께 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 빙냉 세척 완충액 0.2 ml로 3회 세척한 다음 세척 완충액 0.2 ml에서 APC-접합된 스트렙타비딘 1 μl와 함께 (암흑에서) 배양하였다. 면역형광 염색은 MacsQuantify 소프트웨어 (Miltenyi)를 사용하여 MACQUANT (Miltenyi)에서 분석하였다.
결과
인간 Treg 세포를 CD4+CD127lowCD25+ 프로필을 기반으로 한 Stem Cell로부터의 키트를 사용하여 분류하고 바이러스 형질도입 전 2일 동안 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드 및 IL-2로 예비-자극하였다. Treg를 항-IL-23R의 단일 사슬 가변 단편 (scFv)으로 구성된 키메라 항원 수용체 (IL-23R-CAR)로 형질도입하고 인간 CD8의 힌지 및 막관통 영역을 통해 신호 서열에, 인간 4-1BB의 세포내 부분에 연결하였으며, 이것이 결국 세포내 인간 CD3ζ 사슬에 융합되었다 (도 1 참조).
바이러스 상청액을 250μl Xvivo 배지에서 5x105 자극된 Treg에 첨가하였다. 2일마다 IL-2를 첨가하여 세포를 7일 동안 배양하였다. FoxP3 양성 세포에서 GFP 발현에 의해 평가된 형질도입 효율은 약 80%의 GFP+를 보이며 이들 모두는 세포 표면에서 CAR을 발현하였다 (도 2).
그후 본 발명자들은 IL-23R CAR을 통해 활성화되는 형질도입된 Treg의 능력을 조사하였다. Treg를 플레이트-코팅된 재조합 인간 IL-23R 또는 비드-코팅된 IL-23R로 자극하였다. 자극한지 24시간 후, 활성화의 상태를 유세포 분석에서 CD69 발현을 통해 분석하였다.
플레이트 또는 비드 코팅된 재조합 인간 IL-23R의 존재하에서의 CD69 상향조절은 IL-23R CAR 형질도입된 Treg가 CAR 유발을 통해 활성화될 수 있음을 입증한다 (도 3).
실시예 2: 항- IL23R CAR 뮤린 Treg
재료 및 방법
FoxP3 Treg 단리
CD4+CD25+ 뮤린 Treg 세포는 life technologies로부터의 조절 T 세포 단리 키트를 사용하여 C57Bl6 마우스의 비장으로부터 새로 단리하였다. 단리 후 순도는 FoxP3 염색에 의해 평가하였다. 단리된 Treg 세포를 24-웰 플레이트에서 웰당 5 X 105개 세포로 RPMI 10% SVF에 플레이팅하고 항-CD3/항-CD28-코팅된 마이크로비드 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 2:1 비드-대-세포 비율에서 활성화하였다. Treg 세포에 활성화와 동시에 및 4일차에 라파마이신 (50 ng/ml)을 제공하였다. 마지막으로, 0일, 2일, 4일차에, IL-2를 첨가하였다 (1000 단위/ml).
CAR 작제물
당해 실험에서 사용되는 항-뮤린 IL23R CAR 작제물 (예를 들어, 서열 번호 77의 핵산 서열 및 서열 번호 78의 아미노산 서열을 가짐)은 인간 CD8 리더 서열 (CD8), 인간/뮤린 IL23R에 대해 지시된 교차 반응성 scFv (αIL23R), 뮤린 CD28로부터 유래된 힌지 및 막관통 도메인 (mCD28 링커 & mCD28 TM), 뮤린 CD28의 활성화 도메인 (mCD28) 및 뮤린 CD3 제타 (mCD3Z)를 포함한다.
벡터 및 적정
CAR 작제물은 고전적인 4-플라스미드 렌티바이러스 시스템을 사용하여 생산하였다. 간단히 말해서, HEK293T 세포를 3세대 렌티바이러스 전달 벡터, HIV-1 gagpol을 발현하는 플라스미드 (pMDLgpRRE), HIV-1 rev를 발현하는 플라스미드 (pRSV.Rev) 및 동종지향성 뮤린 백혈병 바이러스의 외피 당단백질인 Eco-MLV를 발현하는 플라스미드 (pCMV-Eco)로 형질감염시켰다. 형질감염한지 1일 후, 바이러스 상청액을 수확하고, 원심분리에 의해 농축하고, 분취하고 장기 저장을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 밀리리터당 형질도입 단위 수 (TU/ml)로 표현되는 감염 역가는 바이러스 상층액의 연속 희석물로 Jurkat T 세포를 형질도입한 후 수득하였으며 형질도입 효율은 유세포 분석을 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현을 모니터링함으로써 3일 후 평가하였다.
렌티바이러스 형질도입
Treg는 CD8의 리더 서열에 이은 scFv 항-IL-23R로 구성된 키메라 수용체로 이들을 활성화한지 2일 후에 형질도입하였다. 이러한 세포외 도메인은 인간 CD8의 힌지 및 막관통 영역을 통해 신호 서열에 연결된다. 신호 서열은 4-1BB의 세포내 도메인에 이어 세포내 인간 CD3ζ 사슬로 구성된다. 간단히 말해서 형질도입은 각 웰에 0.5x107 TU/ml를 부하함으로써 수행하였다. 37℃에서 6시간 후, 바이러스 입자를 세척에 의해 제거하였다. 그후, 플레이트를 5% CO2로 37℃에서 배양하였다. 형질도입 효율 (GFP 발현에 의해 평가됨) 및 세포 표면에서의 키메라 수용체 수준 (단백질-L 염색에 의해 평가됨)은 형질도입한지 5일 후에 확인하였다.
CAR- Treg의 활성화 분석
활성화 분석은 배양한지 7일에 수행하였다. 간단히 말해서, 0.05 x 106 Treg를 96 U 바닥 플레이트 단독에서 또는 항CD28/항CD3 코팅된 비드의 존재하에 (2:1 Treg 대 비드 비율에서), 또는 플레이트-코팅된 뮤린 IL-23R (1μg/ml)의 존재하에, 또는 200 μl 최종 용적에서 비드 코팅된 인간 및 뮤린 IL-23R의 용량 증가의 존재하에 시딩하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 후, 세포를 CD4 및 CD69에 대해 염색한 다음 유세포 분석을 사용하여 분석하였다.
T 세포 증식의 억제 분석
억제 분석은 배양한지 7일에 수행하였다. OTII 마우스로부터의 비장세포 (OVA 특이 TCR에 대한 Tg)를 난백알부민 (100μg/ml), 형질도입되지 않은 Treg (Poly Treg), 또는 뮤린 IL-23R 코팅된 비드 또는 항-CD3/CD28 비드를 갖거나 갖지 않는 IL-23RmCAR Treg의 존재하에 4일 동안 공동배양하였다. 4일차에, 세포를 수확하고, 비장세포로부터의 CD4의 증식을 염료 450 희석의 결정을 통해 유세포 분석에 의해 평가하였다. Tconv 증식의 억제 퍼센트는 다음과 같이 계산하였다:
Figure pct00001
이미퀴모드 -유도된 건선 -유사 피부 염증
8 내지 10주령의 마우스 (C57BL/6)에게는 연속 7일 동안 면도된 등에 일일 국소 용량의 62.5 mg의 시판 IMQ 크림 (5%) (Aldara; 3M Pharmaceuticals)을 제공하고, 대조군 마우스는 대조군 비히클 크림 (Vaseline Lanette cream; Fagron)으로 유사하게 처리하였다. 2일차에, 항-IL-23 (100ug)을 복강내 주사하고 마우스 당 8x106 Treg (Poly 또는 aIL-23R-CAR)를 정맥내 주사하였다. 모든 마우스는 7일차에 희생시켰다. 등 피부의 염증의 중증도를 점수매기기 위해, 임상 건선 면적 및 중증도 (PASI)를 기반으로 하여 객관적인 점수 시스템을 개발하였다. 발적, 스케일링 및 비후는 0 내지 4의 등급으로 독립적으로 점수를 매겼다: 0, 없음; 1, 약간; 2, 보통; 3, 현저함; 4, 매우 현저함. 발적의 수준은 붉은 얼룩 (red taint)을 갖는 채점표를 사용하여 점수를 매겼다. 누적 점수 (발적 + 스케일링 + 비후)가 염증의 중증도의 척도로서 작용하였다 (등급 0-12). 모든 실험은 동물 실험에 관한 프랑스 법령에 따라 동물 윤리위원회의 승인을 받았다.
결과
단리 후, 뮤린 Treg (mTreg) 세포를 바이러스 형질도입 전 2일 동안 항CD3/항-CD28 코팅된 비드 및 IL-2로 예비-자극하였다. mTreg를 교차-반응성 hu/ms 항-IL-23R의 단일 사슬 가변 단편 (scFv)으로 구성된 키메라 항원 수용체 (IL-23R-mCAR)로 형질도입하고, 뮤린 CD8의 힌지 및 막관통 영역을 통해 신호 서열에 연결하여 뮤린 CD28의 세포내 부분에 연결하고, 이것이 결국 세포내 뮤린 CD3ζ 사슬에 융합되었다 (도 4).
바이러스 상청액을 250μl Xvivo 배지에서 5x105 자극된 Tregs에 첨가하였다. 2일마다 IL-2를 첨가하여 세포를 7일 동안 배양하였다. 형질도입 효율 및 세포 표면에서의 CAR 발현은 NGFR 염색에 의해 평가하였으며, 형질도입된 세포의 약 70%가 세포 표면에서 CAR을 발현함을 보여 주었다 (도 5).
그후, IL-23R CAR을 통해 활성화되는 형질도입된 mTreg의 능력을 조사하였다. mTreg를 플레이트-코팅된 재조합 뮤린 IL-23R 또는 비드-코팅된 인간 및 뮤린 IL-23R로 자극하였다. 자극한지 24시간 후, 활성화 상태를 유세포 분석에서 CD69 발현을 통해 분석하였다. 플레이트 또는 비드 코팅된 재조합 인간/뮤린 IL-23R의 존재하에서의 CD69 상향조절은 IL-23R CAR 형질도입된 mTreg가 CAR 유발을 통해 활성화될 수 있음을 입증한다 (도 6).
마지막으로, 중요한 특징은 IL-23R-CAR로 형질도입된 FoxP3+Treg 세포가 CAR 유발을 통해 억제 접촉 의존 기능을 유지한다는 것이다 (도 7a 및 b).
마지막으로, 도 8a 및 b에 도시된 바와 같이, IL-23R CAR Treg를 IL-23/IL-23R 축에 의해 유도되는 것으로 설명된 모델인 이미퀴모드-유도된 피부 염증 모델에서 생체내 이들의 활성에 대해 시험하였다. 항-IL-23 항체 (백색 사각형)는 IL-23의 차단이 임상 점수의 감소를 유도함을 확인하였다. 흥미롭게도, IL-23R-CAR mTreg (백색 원)는 또한 i.v. 주입한지 2일 후 임상 점수의 감소를 유도할 수 있는 반면 다클론 Treg (백색 삼각형)는 임상 과정에 영향을 미치지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> TXCELL ABEL Tobias GERTNER-DARDENNE Julie MEYER Fran챌ois <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR SPECIFIC FOR INTERLEUKIN-23 RECEPTOR <130> IPA201293-FR <150> US 62/657,233 <151> 2018-04-13 <160> 78 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 1 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 6 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 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gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300 tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360 gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690 <210> 17 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgD hinge <400> 17 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe 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Asn Met Thr Pro Arg 355 360 365 Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg 370 375 380 Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 385 390 395 400 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 405 410 415 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 420 425 430 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro 435 440 445 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 450 455 460 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 465 470 475 480 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 485 490 495 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 500 505 <210> 74 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn 85 90 95 Pro Asp Ile Tyr Asn Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 130 135 140 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Ser Asn 145 150 155 160 Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 165 170 175 Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn 180 185 190 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 195 200 205 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu Tyr Phe Lys Phe Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe 245 250 255 Glu Lys Met His Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 260 265 270 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 275 280 285 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 290 295 300 Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 305 310 315 320 Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 325 330 335 Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 340 345 350 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 355 360 365 Arg Ser Thr Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 370 375 380 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 385 390 395 400 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 405 410 415 Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 420 425 430 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 435 440 445 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 450 455 460 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 465 470 475 480 Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cys2His2 <400> 75 Cys Cys His His 1 <210> 76 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide comprising a marker moiety and a suicide moiety <400> 76 Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro 20 25 30 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 65 70 75 80 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 85 90 95 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 100 105 110 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val 115 120 125 Cys Lys Cys Pro Arg Pro Trp 130 135 <210> 77 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR <400> 77 atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttcttca tgccgccaga 60 ccatctgagg tgcagctagt tgaatctggt ggaggcctgg ttcagcctgg tggctctctg 120 agactgtctt gtgccgccag cggcatcgac ttcaacagca actactacat gtgctgggtc 180 cgacaggccc ccggcaaagg acttgaatgg attggctgca tctacgtggg cagccatgtg 240 aacacctact acgcaaactg ggccaagggc agattcacca tcagccggga caacagcaag 300 aacaccgtgt acctgcagat gaacagcctg agagcagaag atactgccgt gtactactgt 360 gccacatctg gcagcagcgt gctgtacttc aagttctggg gccagggcac cctggtcaca 420 gtttcttcag gaggtggagg ctctggcggt ggaggaagtg gtgggggagg ctctgacatc 480 cagatgacac agagccccag cagcctgtct gcctctgtgg gagacagagt gaccatcact 540 tgccaggcca gcgagaacat ctacagcttc ctggcctggt accagcagaa gccaggcaag 600 gcccctaagc tgctgatcta cagcgcctct aaactagctg ccggggtgcc aagcagattt 660 tctggctctg gcagcggcac cgacttcacc ctgaccatat caagcctgca gcctgaggac 720 ttcgccacct actactgcca gcagaccaac aggtacagca accccgacat ctacaacgtg 780 tttggacagg gcaccaagct gacagtgctt ggaatgcata tcgagttcat gtaccctcca 840 ccttacctgg acaacgagag aagcaacggc accatcatcc acatcaaaga gaagcacctc 900 tgtcacaccc agagcagccc caagctgttt tgggctcttg tggtggtggc tggcgtgctg 960 ttttgttacg gcctgctggt cacagtggcc ctgtgtgtga tttggaccac gcgtaacagc 1020 agaagaaaca gaggcggaca gagcgactac atgaacatga cccctagacg gcctggcctg 1080 acaagaaagc cctaccagcc ttacgctccc gccagagatt tcgccgccta cagacctaga 1140 gccaagttca gcagatccgc cgaaacagcc gccaacttgc aagatcctaa ccagctgtac 1200 aacgagctga acctggggag aagagaagag tacgacgtgc tggaaaagaa gagggccaga 1260 gatccagaga tgggcggcaa gcagcagaga agaagaaacc ctcaagaggg cgtgtacaac 1320 gctctgcaaa aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaactaa gggcgaacgc 1380 agaagaggca agggccacga tggactgtac cagggcctga gcacagccac caaggacaca 1440 tacgatgccc tgcacatgca gacactggcc cctagatag 1479 <210> 78 <211> 492 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR <400> 78 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45 Ile Asp Phe Asn Ser Asn Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Tyr Val Gly Ser His Val 65 70 75 80 Asn Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 100 105 110 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Leu 115 120 125 Tyr Phe Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 165 170 175 Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe Leu Ala 180 185 190 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser 195 200 205 Ala Ser Lys Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 210 215 220 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 225 230 235 240 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Arg Tyr Ser Asn Pro Asp 245 250 255 Ile Tyr Asn Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Met 260 265 270 His Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg Ser 275 280 285 Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr Gln 290 295 300 Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val Leu 305 310 315 320 Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp Thr 325 330 335 Thr Arg Asn Ser Arg Arg Asn Arg Gly Gly Gln Ser Asp Tyr Met Asn 340 345 350 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr 355 360 365 Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro Arg Ala Lys Phe Ser 370 375 380 Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr 385 390 395 400 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys 405 410 415 Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg 420 425 430 Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 435 440 445 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 450 455 460 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 465 470 475 480 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr Leu Ala Pro Arg 485 490

Claims (15)

  1. 적어도 하나의 IL-23 수용체 (IL-23R)에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)로서,
    (i) 세포외 결합 도메인 (여기서, 상기 결합 도메인은 상기 IL-23R에 결합한다),
    (ii) 임의로 세포외 힌지 도메인(extracellular hinge domain),
    (iii) 막관통 도메인(transmembrane domain),
    (iv) 세포내 신호전달 도메인, 및
    (v) 임의로 태그(tag) 및/또는 리더(leader) 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  2. 제1항에 있어서, 세포외 결합 도메인이 상기 IL-23R에 대해 지시된 scFv 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포외 결합 도메인이 상기 IL-23R에 대해 지시된 scFv 단편을 포함하고, 여기서 상기 scFv가
    서열 번호 37의 서열 또는 서열 번호 37과 적어도 약 70% 동일성(identity)을 갖는 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH),
    서열 번호 38, 46 및 56으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 및 서열 번호 38, 46 또는 56과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 및
    임의로 VH와 VL 사이의 링커를 포함하고,
    바람직하게는 상기 scFv가 서열 번호 55의 서열 또는 서열 번호 55와 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR).
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 바람직하게는 서열 번호 13의 서열 또는 서열 번호 13과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 인간 CD8의 힌지 영역인 키메라 항원 수용체(CAR).
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 바람직하게는 서열 번호 21의 서열 또는 서열 번호 21과 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 인간 CD8α로부터 유래된 막관통 도메인인 키메라 항원 수용체(CAR).
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 바람직하게는 서열 번호 29의 서열 또는 서열 번호 29와 적어도 약 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 인간 4-1BB의 공동자극 신호전달 도메인 및 바람직하게는 서열 번호 26의 서열 또는 서열 번호 26과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 T 세포 일차 신호전달 인간 CD3 제타를 포함하는 CAR.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (i) 바람직하게는 (G4S)3 링커 (서열 번호 3)에 의해 연결된, 서열 번호 37의 서열을 갖는 VH 및 서열 번호 38의 서열을 갖는 VL을 포함하는 항-IL-23R scFv,
    (ii) CD8α로부터 유래된 힌지 도메인, 바람직하게는 서열 번호 13,
    (iii) 인간 CD8α 막관통 도메인, 바람직하게는 서열 번호 21,
    (iv) 인간 4-1BB 신호전달 도메인, 바람직하게는 서열 번호 29 및 인간 CD3 제타 도메인, 바람직하게는 서열 번호 26을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및
    (v) 임의로 태그 및/또는 리더 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 CAR을 암호화하는 핵산 서열.
  9. 제8항에 따르는 핵산 서열을 포함하는 벡터(vector).
  10. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 T 세포 집단.
  11. 제10항에 있어서, 상기 T 세포 집단이 조절 T 세포 집단이고, 바람직하게는 상기 조절 T 세포 집단이 CD4+CD25+Foxp3+ Treg, Tr1 세포, TGF-β 분비 Th3 세포, 조절 NKT 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 CD8+ T 세포, 및 이중 음성 조절 T 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 T 세포 집단.
  12. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 적어도 하나의 T 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물이 바람직하게는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물인 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 CAR을 세포 표면 상에 발현하도록 조작된 T 세포 집단을 수득하기 위한 생체외 방법으로서, 상기 생체외 방법이 IL-23R-CAR을 암호화하는 핵산으로의 적어도 하나의 T 세포의 유전자 변형, 바람직하게는 형질도입 단계, 및 임의로 형질도입된 세포의 확장 단계를 포함하는 방법.
  14. IL-23R 발현 세포-매개된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IL-23R 발현 세포-매개된 질환 또는 장애 (여기서, 상기 IL-23R 발현 세포-매개된 질환 또는 장애는 바람직하게는 자가면역 및/또는 염증성 질환 및/또는 장애이다)를 치료하는데 사용하기 위한, 제10항 또는 제11항에 따르는 T 세포 집단, 또는 제12항에 따르는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 자가면역 및/또는 염증성 질환 및/또는 장애가 염증성 장 질환 (inflammatory bowel diseases) (예를 들면, 크론병 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)), 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 소아 특발성 관절염 (juvenile idiopathic arthritis), 쇼그렌 증후군 (Sjoegren syndrome), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 1형 당뇨병 (Type 1 diabete), 자가면역성 갑상선 장애 (autoimmune thyroid disorder), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 중증 근무력증 (Myasthenia Gravis), 건선 (psoriasis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis) 및 포도막염 (uveitis)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 자가면역 및/또는 염증성 질환 및/또는 장애가 크론병 (Crohn's disease)인 T 세포 집단 또는 조성물.
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