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KR20180129919A - 사멸 수용체 작용제로써 췌장암 및 통증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

사멸 수용체 작용제로써 췌장암 및 통증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20180129919A
KR20180129919A KR1020187032301A KR20187032301A KR20180129919A KR 20180129919 A KR20180129919 A KR 20180129919A KR 1020187032301 A KR1020187032301 A KR 1020187032301A KR 20187032301 A KR20187032301 A KR 20187032301A KR 20180129919 A KR20180129919 A KR 20180129919A
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이슬기
마틴 지. 폼퍼
박오귀
마그달레나 스위어체프스카
판카즈 제이. 파스리차
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

췌장염을 치료하기 위한 사멸 수용체 5(DR5) 작용제 조성물 및 방법이 개발되었다. 상기 조성물은 종양 괴사 인자 관련 세포 자멸-유도 리간드(TRAIL), 이의 유사체 및 항-DR5 작용성 항체를 포함한다. 특정 실시예에서, TRAIL 유사체 및 항-사멸 수용체 5 작용성 항체는 췌장에 진통 및 질병 개질 효과를 갖는다.

Description

사멸 수용체 작용제로써 췌장암 및 통증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 4월 7일자로 출원된 미국 가출원 제62/319,454호의 우선권을 주장하며, 이는 본원에 참조로서 통합된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국방부(Department of Defense, DOD)가 수여하는 W81XWH-15-1-0301 및 W81XWH-15-1-0302와, 국립보건원(the National Institutes of Health, NIH)이 수여하는 R21AA 23855에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF)는 세포외 시스테인-풍부 도메인을 통해 종양 괴사 인자(TNFs)를 결합시키는 능력을 특징으로 하는 사이토 카인 수용체 군이다. 신경 성장 인자(NGF)를 제외하고 모든 TNF는 전형적인 TNF-α와 상동성이 있다. 그들의 활성 형태에서 대다수의 TNF 수용체는 원형질막에 삼 합체 복합체를 형성한다. 따라서, 일부는 가용성 형태(예컨대, TNFR1)로 분해될 수 있고 일부는 TMD가 완전히 결여될 수 있지만(예: DcR3), 대부분의 TNF 수용체는 막횡단 도메인(TMD)을 포함한다. 또한 대부분의 TNF 수용체는 하류 신호 전달을 위해 TRADD, TRAF, RIP 및 FADD와 같은 특정 어댑터 단백질을 필요로 한다. TNF 수용체는 주로 세포자멸 및 염증에 관여하지만, 증식, 생존 및 분화와 같은 다른 신호 전달 경로에도 참여할 수 있다. TNF 수용체는 포유 동물, 특히 백혈구의 다양한 조직에서 발현된다.
사멸 수용체(death receptor)라는 용어는 TNFR1, Fas 수용체, DR4 및 DR5와 같은 사멸 도메인(death domain)을 포함하는 TNF 수용체상 패밀리의 구성원을 지칭한다. 그들은 다른 기능을 하는 것으로 알려졌지만 세포자멸(apoptosis)의 역할을 위해 명명되었다.
용어 TNF 수용체는 수퍼 패밀리의 전형적인 구성원, 즉 TNF-α를 인식하는 TNFR1 및 TNFR2를 지칭하기 위해 종종 사용된다. 다음을 포함하는 27 슈퍼패밀리 구성원들이 있다: 종양 괴사 인자 수용체 1, 종양 괴사 인자 수용체 2, 림프 독소 베타 수용체, OX40, CD40, Fas 수용체, 디코이 수용체 3, CD27, CD30, 4-1BB, 사멸 수용체 4(DR4), 사멸 수용체 5(DR5), 디코이 수용체 1, 디코이 수용체 2, RANK, 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin), TEAK 수용체, TACI, BAFF 수용체, 헤르페스 바이러스 도입 매개자, 신경 성장 인자 수용체, B 세포 성숙 항원, 글루코코르티코이드 유도된 TNFR-관련, 트로이(TROY), 사멸 수용체 6, 사멸 수용체 3 및 엑토디스플라신 A2(Ectodysplasin A2) 수용체.
몇몇 조사에 따르면 급성 또는 만성 췌장염은 미국에서 "위장병의 부담(burden of gastrointestinal disease)"에 중요한 공헌자이다. 만성 췌장염(CP)은 알코올 남용의 심각한 결과이며 췌장의 구조와 기능이 점차적으로 돌이킬 수 없게 파괴된다는 특징이 있다. CP는 췌장 섬유증과 지속적인 복통을 동반한다. CP의 통증은 치료하기가 매우 어려웠다. 기초가 되는 생물학에 대한 이해 부족은 순수한 해부학적 근거와 일반적으로 고도의 침습성에 기반을 둔 다양한 경험적 접근법을 이끌어 냈다.
그러므로, 췌장염을 치료하는 치료 전략에 대한 실질적인 충족되지 않은 요구가 있다.
본 발명의 목적은 췌장염, 췌장 섬유증 및 췌장 통증을 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장염, 췌장 섬유증 및 췌장 통증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
췌장염 및 관련 장애, 예를 들어, 재조합 인간 TRAIL 유사체 또는 항-사멸 수용체 5(DR5) 작용성 항체와 함께 통증과 같은 연관된 장애를 치료하는 방법이 개발되었다. 재조합 TNF(종양 괴사 인자)-관련 세포 자멸-유발 리간드(TRAIL) 유사체 및 항-DR5 항체는 활성화된 췌장 성상 세포를 선택적으로 표적으로 하고 염증, 섬유 형성 및 통증을 감소시키고 그것을 필요로 하는 개인의 급성 및 만성 췌장염에서 췌장 기능을 개선시킨다.
췌장염 또는 췌장 통증을 치료하고 췌장 기능을 개선시키는 방법은 췌장염, 췌장 섬유증 또는 장애, 예컨대 췌장 통증을 앓고 있거나 또는 앓을 위험이 있는 환자에게 사멸 수용체 작용제의 유효량을 함유하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 적절한 사멸 수용체 작용제는 재조합 인간(rh) TRAIL, rhTRAIL 유사체, 공학적 TRAIL 유사체와 같은 TRAIL-R2(사멸 수용체 5) 작용제, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 중합체, 공중합체 및 분지형 유사체, 및 히알루론산과 같은 생체 고분자로 변형된 장시간 작용 TRAIL 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. TRAIL 융합 단백질, 작용성 항-TRAIL-R2 항체 및 TRAIL-R2에 결합하는 작용성 소형 분자 또는 펩타이드 분자를 포함하는 TRAIL-기반 장시간 작용 제제는 실시예 3에서 입증된 바와 같이 활성화된 췌장 성상 세포에서 선택적 세포자멸을 유도하는 주요 수용체이다.
바람직한 실시예에서, TRAIL은 rhTRAIL(즉, 재조합 인간 TRAIL), 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체, 예를 들어 281 아미노산 인간 TRAIL의 단편이다. 바람직한 실시예에서, 상기 단편은 전장 281 아미노산 인간 형태의 114 내지 281 또는 95 내지 281의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시예에서, 장시간 작용하는 rhTRAIL은 PEG화된 종양 괴사 인자(TNF)-관련 세포 자멸 유발 리간드(TRAIL) 단백질, PEG화된 TRAIL 유도체 또는 이들의 임의 조합이다. 바람직한 실시예에서, 항-사멸 수용체 항체는 항-사멸 수용체 5 작용성 항체이다. 예시적인 양태에서, 상기 사멸 수용체 작용제는 PEG화된 TRAIL 유사체 및 항-DR5 작용성 항체를 함유한다.
또한, 본원은 사멸 수용체 작용제 및 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기 또는 이의 유도체를 제공한다. 일부 경우, 사멸 수용체 작용제는 PEG화된 TRAIL 유사체 또는 이의 유도체를 포함한다.
일 측면에서, PEG 잔기(moiety) 또는 유도체는 선형 PEG, 분지형 PEG, 스타 PEG, 콤 PEG, 덴드리머 PEG, PEG 숙신이미딜프로피오네이트, PEG N-히드록시숙신이미드, PEG 프로피온알데히드, PEG 말레이미드, 선형 메톡시폴리(에틸렌 글리콜(mPEG), 분지형 mPEG, 스타(star) mPEG, 콤(comb) mPEG, 덴드리머 mPEG, mPEG 숙신이미딜프로피오네이트, mPEG N-히드록시숙신이미드, mPEG 프로피온알데히드 및 mPEG 말레이미드로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 경우, 분지된 PEG 잔기 또는 유도체는 모노머, 다이머 및/또는 삼량체 PEG 잔기 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 경우, PEG 잔기 또는 유도체는 삼량체 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드이다.
PEG 잔기는 크기 배제 크로마토그래피 또는 MALDI-TOF 질량 스펙트럼으로 측정시 적어도 1,000 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 경우, PEG 잔기는 평균 분자량이 약 1,000 내지 1,000,000 달톤, 평균 분자량이 약 10,000 내지 500,000 달톤, 평균 분자량이 약 1,000 내지 100,000 달톤, 가장 바람직하게는 5,000 내지 10,000 달톤인 PEG 잔기를 포함한다. 50,000 달톤. 다른 경우, PEG 잔기는 평균 분자량이 약 20,000 내지 250,000 달톤, 평균 분자량이 약 30,000 내지 100,000 달톤인 PEG 잔기 또는 평균 분자량이 약 40,000 내지 80,000 달톤인 PEG 잔기를 포함한다.
항-DR5를 함유하는 조성물은, HGS-TR2J/KMTR-2, LBY135, 드로지투맙(drozitumab), 코나투무맙(conatumumab), 티가투즈맙(tigatuzumab), TAS266, DS-8273/DS-8273a, APG880 또는 RG7386이 제공된다.
예시적인 질병 또는 장애는 급성 또는 만성 췌장염, 췌장염 관련 통증 및 췌장 섬유증뿐만 아니라 섬유증 관련 통증을 포함한다. 일부의 경우, 췌장 섬유증은 췌장의 종양 미세 환경에서의 표피 형성을 포함한다. 예시적인 실시예에서, 섬유증 장애는 섬유증-관련 통증이다. 몇몇 경우, 이 방법은 섬유증 관련 통증을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 환자를 확인하는 것을 추가로 포함한다. .
적절한 투여 방식은 정맥 내 및 피하, 흡입, 폐, 비강 및 가능하게는 안구 내 주입을 포함한다. 상기 조성물은 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 0.001 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg , 4mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg, 15mg/kg, 20mg/kg, 25mg/kg, 30mg/kg, 35mg/kg, 40mg/kg, 45mg/kg , 50mg/kg, 55mg/kg, 60mg/kg, 65mg/kg, 70mg/kg, 75mg/kg, 80mg/kg, 85mg/kg, 90mg/kg, 95mg/kg , 또는 100 mg/kg이다. 바람직하게는, 조성물을 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 투여량 또는 0.001 mg/kg 내지 20 mg/kg의 투여량으로 투여한다. 제제는 췌장 조직이 보호되고, 섬유 형성이 감소되고, 췌장 섬유 형성이 역전되고, 통증이 감소되고, 건강한 췌장 조직이 손상되지 않도록 효과적인 투여량 및 기간으로 투여된다. 한 측면에서, 섬유증 질환 또는 장애의 치료는 염증을 감소시키는 것을 포함한다.
도 1은 췌장염 모델에서, 사멸 수용체(DR) 작용제, 예컨대 TRAIL 유사체 또는 항-DR 작용제 항체의 역할을 나타내는 개략도이다. 사멸 수용체 작용제는 다른 조직에는 손상을 주지 않으면서, 췌장에서 활성화된 췌장 성상 세포(PSC)를 선택적으로 표적으로 한다. 활성화된 PSC는 췌장 섬유증 및 통증의 원조 중 하나이다. PSC 활성화 및/또는 활성화된 PSC를 선택적으로 차단함으로써, 사멸 수용체 작용제는 섬유화 및 통증을 감소시켜 췌장 조직의 복구를 유도한다.
도 2는 세포를 10, 100, 1,000 ng/mL의 TRAILPEG로 처리 하였을 때 일차 인간 섬 및 쥐의 선방 세포의 세포 생존율(%)을 나타내는 막대 그래프이다. 일차 인간 섬 및 췌장 선방(acinar) 세포를 포함한 정상 췌장 세포에 대한 독성은 발견되지 않았다. TRAILPEG(10, 100, 1,000 ng/mL)를 다양한 세포와 함께 24 시간 동안 배양하고 세포자멸을 MTT 분석에 의해 정량화하였다.
도 3a, 3b, 3c, 3d, 3e 및 3f는 배양 2 일, 4 일 및 7 일에 배양-활성화된 1 차 사람 PSC에 의한 지시된 유전자의 상대적인 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 배양-활성화된 일차 인간 PSCs는 Acta2(α-SMA, 활성화된 성상 세포 마커), 섬유 형성 마커 및 TRAIL 수용체(DR5/DR4)를 상향 조절하고, TRAIL-유도된 세포자멸에 매우 민감하게 된다. 정지(2 일) 및 활성화된 PSC(4 일 및 7 일)의 qPCR 분석. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 대 2일.
도 4는 배양물의 1 일, 2 일, 4 일 및 7 일에 배양-활성화된 일차 인간 PSC에서의 세포사 비율(%)을 나타내는 막대 그래프이다. * P <0.05
도 5는 표시된 농도의 마파투무맙(Mapatumumab)(항-DR4 작용성 항체, 0-103 ng/mL) 또는 코나투무맙(Conatumumab)(항-DR4 항체, 0-103 ng/mL)로 처리된 카스파제 3/7 DR5 작용성 항체, 0 내지 103 ng/mL). 코나투무맙만이 활성화된 PSC에서 아폽토시스를 유도한다. 이것은 DR5가 아니라 DR4가 활성화된 성상 세포에서 TRAIL 신호 전달에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. *** P <0.001 대 비 처리 PSC.
도 6a 및 6b는 정지된 PSC(2 일째) 및 활성화된 PSC(7 일째)의 세포막에서의 DR4 또는 DR5의 발현 프로파일을 나타내는 그래프로서, PE-태그된 사멸 수용체 항체를 사용하여 유동 세포 계측법으로 측정하였다. DR5는 DR4에 비해 활성화된 PSC의 세포 표면에서 우세하게 발현된다.
도 7a 내지 도 7e는 에탄올(EtOH)-활성화된 일차 인간 PSC가 Acta2(α-SMA, 활성화된 성상 세포 마커), 섬유 형성 마커 및 TRAIL 수용체(DR5/DR4)를 상향 조절하는 것을 나타내는 막대 그래프이다. 도 3은 EtOH(30 및 50 mM)에 의해 활성화된 PSC의 qPCR 분석을 나타낸다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 대 비-EtOH 활성화 PSCs.
도 8a 및 8b는 TRAILPEG(1 ㎍/mL)를 갖는 EtOH(50 mM)-활성화된 PSC를 처리한 후 MTT 분석 및 카스파제 3/7 활성(세포 자멸사) 상대 비율로 정량화된 세포 생존률(%)을 나타내는 막대 그래프이다. 알코올 활성 PSC 만 TRAIL에 의한 세포자멸에 민감하다. ** P <0.01, *** P <0.001 대 비 EtOH 활성화 PSC.
도 9는 다양한 농도의 TRAILPEG, 코나투무맙(항-DR5 작용성 항체) 및 마파투무맙(항-DR4 작동 항체)로 EtOH(50mM)-활성화된 PSC를 처리한 후 정량화된 카스파제 3/7 활성(세포 자멸사 마커)를 보여주는 선 그래프이다. TRAILPEG와 코나투무맙만이 EtOH 활성화된 PSC에서 아폽토시스를 유도한다.
도 10a-10e는 생체 외(in vitro)에서 배근 신경절(DRG)로부터의 감각 뉴런의 흥분성에 대한 무 혈청 조건(PSC-CM)에서 활성화된 PSC로부터 얻은 조건화 배지 전체 셀 패치 클램프 기록으로 시연 도 10a는 PSC-CM 배양된 뉴런에서 증가된 자발적 및 유도된 활동 전위를 나타내는 대표적인 추적의 다이어그램이다. 이것은 rheobase(활동 전위를 이끌어 내기 위해 필요한 전류의 양)가 현저히 감소하는 것을 동반한다(도 10b 참조).
도 10c는 강화된 유발된 활동 전위를 도시한다. 도 10d는 증가된 활동 전위 진폭을 도시한다. 도 10e는 감소된 IA 전류(흥분성 유지에 중요한 과도 Kv 전류)를 도시한다.
도 11은 TRAILPEG 처리된 AP 쥐에서 감소된 수의 MPO +(호중구 마커) 세포를 나타내는 막대 그래프이다. TRAILPEG 처리는 염증 및 췌장에 침윤된 MPO + 세포 침윤의 수를 유의하게 감소시켰다. * P <0.05 vs; Cer-PBS(처리되지 않은 AP 쥐).
도 12는 만성 췌장염(CP) 쥐 모델에서 TRAILPEG를 시험하기 위한 연구 설계의 타임 라인을 나타내는 도면이다. 알코올로 유발된 CP의 모델은 SD 쥐에게 에탄올/리버 데칼리 액상식이 요법을 43 일 동안 섭취하고 세룰레인(cerulein)(20 μg/kg)을 5 주간 주사하여 만들어졌다. 하루 동안 총 칼로리의 0에서 36 %까지 에탄올을 식이에 보충하고 연구 종료까지 7 일에 시작하는 최종 에탄올 농도로 유지했다. 쥐를 14 일, 21 일, 28 일, 35 일 및 41 일에 셀레린(4 시간마다 i.p. 주사)으로 처리하였다. TRAILPEG(4mg/kg, i.v.) 또는 PBS(대조군)를 36 일째부터 7 일 동안 매일 처리하였다.
도 13a 및 13b는 Masson Trichrome(콜라겐 염색) 및 a-SMA(활성화된 PSCs 마커) 염색의 디지털 이미지로부터 정량화된 양성 영역/필드를 나타내는 막대 그래프이다.
도 14a 내지 14i는 세룰레인 및 에탄올/리버 데 칼리(Lieber DeCarli)식이-유도된 CP 쥐(EtOH-CP)에서 GAPDH에 비례하여 표시된 유전자 발현을 PBS 또는 TRAILPEG로 처리한 막대 그래프이다. 여러 섬유화 마커에 TRAILPEG의 효과가 표시된다. TRAILPEG는 세룰레인 및 에탄올/Lieber DeCarli식이 유도된 CP 쥐(EtOH-CP)의 mRNA(유전자) 수준에서 다중 섬유화 관련 분자를 하향 조절한다. a-SMA, 콜라겐 1, 콜라겐 3, PDGFr, TIMP1, TIMP3, 피브로넥틴, Pap 및 TGFβ를 포함하는 섬유화 관련 마커의 유전자 발현 수준은 TRAILPEG 처리 후 모두 감소되었다. Acta2는 alpha-SMA의 mRNA 이름이다. TIMP는 MMP의 억제제이다(MMP는 콜라겐의 분해를 담당한다). 피브로넥틴은 섬유증 마커이다. ## P <0.01, ### P <0.001 대 Pair Fed(대조군), * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 vs. EtOH-CP/PBS.
도 15는 PBS 또는 TRAILPEG로 처리한 대조군 및 CP 쥐(EtOH-CP)의 췌장 조직에서 히드록시프롤린 농도(μg/g)(콜라겐 마커)를 나타내는 막대 그래프이다. TRAILPEG는 세룰레인 및 에탄올/Lieber DeCarli식이 유도 CP 쥐(EtOH-CP)의 췌장에서 히드록시프롤린 수준을 비 처리 EtOH-CP와 비교하여 유의하게 감소시킨다. #P <0.05 대 Ctrl 그룹, *** P <0.001 대 EtOH-CP/PBS.
도 16은 PBS 또는 TRAILPEG로 처리한 건강한 및 CP 쥐(EtOH-CP)에서의 반응 대 VFF 강도의 수를 나타내는 라인 그래프이다. TRAILPEG는 췌장염과 관련된 통증을 감소시킨다. 통각에 대한 TRAILPEG의 효과는 VFF(Von Frey filament) 방법에 의한 복부의 기계적 민감도를 측정하여 만성 췌장염(CP) 쥐 모델에서 평가되었다. TRAILPEG는 CP 모델에서 강력한 항 침해 효과를 나타낸다.
I. 정의
"개선"은 질병의 발병 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 감소, 체포 또는 안정화시키는 것을 의미한다.
"대조군" 또는 "대조군"은 비교 표준을 의미한다. 본원에 사용된 "대조군과 비교하여 변화된"표본 또는 대상은 정상, 비 처리 또는 대조군 시료로부터의 표본과 통계적으로 상이한 수준을 갖는 것으로 이해된다. 대조군 샘플은 예를 들어, 배양된 세포, 하나 이상의 실험실 시험 동물 또는 하나 이상의 인간 대상을 포함한다. 대조 샘플을 선택하고 시험하는 방법은 당업자의 능력 내에 있다. 분석물은 세포 또는 유기체(예: 항체, 단백질) 또는 리포터 구조물(예: β-갈락토시다아제 또는 루시퍼라제)에 의해 생성된 물질에 의해 특징적으로 발현되거나 생성되는 자연 발생 물질일 수 있다. 탐지에 사용된 방법에 따라 변경 금액과 측정 값이 달라질 수 있다. 통계적 유의성의 결정은 당업자의 능력, 예를 들어 양성 결과를 구성하는 평균으로부터의 표준 편차의 수 내에 있다.
"검출"은 검출될 분석물의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "진단"은 병리학 또는 증상의 분류, 병리학의 심각성 결정(예: 등급 또는 단계), 병리학 진행의 모니터링, 병리학 결과의 예측 및/또는 회복의 전망 결정을 지칭한다.
제제 또는 제제 성분의 "유효량" 및 "치료학적 유효량"이란 용어는 원하는 효과를 제공하기에 충분한 양의 제제 또는 성분을 단독으로 또는 조합하여 의미한다. 예를 들어, "유효량"은 치료되지 않은 환자에 비해 질병 또는 장애의 증상 중 하나 이상을 개선 시키는데 필요한 화합물의 단독 또는 조합의 양을 의미한다. 질환의 치료학적 치료를 위한 유효량은 투여 방법, 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강 상태에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사는 적절한 양 및 용량 요법을 결정할 것이다. .
"변조"는 변경(증가 또는 감소)을 의미한다. 이러한 변경은 본원에 기술된 것과 같은 표준 기술 공지 방법에 의해 검출된다.
"생식기 질환 또는 장애"는 수복 또는 반응 과정에서 장기 또는 조직의 과도한 섬유 결합 조직이 점진적으로 형성되는 일반적인 용어이다. 섬유화는 일반적으로 염증이나 손상의 결과로 신체의 여러 조직에서 발생할 수 있다. 섬유증에 걸리기 쉬운 장기 또는 조직의 예로는 폐, 췌장, 심장, 간, 피부, 손가락, 관절, 뇌, 골수, 음경 및 장이 있다.
용어 "정상 양"은 질환 또는 장애로 진단되지 않는 것으로 알려진 개체의 정상적인 양의 복합체를 지칭한다. 분자의 양은 시험 샘플에서 측정될 수 있고 기준 한계, 식별 한계 또는 절단 점 및 비정상적인 값(예를 들어, 췌장염의 경우)을 정의하는 위험 정의 임계치와 같은 기술을 사용하여 "정상 대조군 수준"과 비교될 수 있다. "정상 대조 수준"은 전립선 암으로 고통받지 않는 것으로 알려진 피험자에서 전형적으로 발견되는 하나 이상의 단백질(또는 핵산) 또는 결합된 단백질 지수(또는 결합 핵산 지수)의 수준을 의미한다. 이러한 정상적인 조절 수준 및 차단점은 분자가 단독으로 사용되는지 아니면 다른 단백질을 조합하여 색인으로 사용되는지에 따라 달라질 수 있다. 대안으로, 정상 대조군 수준은 임상적으로 관련된 시간대에 걸쳐 질병 또는 장애로 전환되지 않은 이전에 시험된 피험자로부터의 단백질 패턴의 데이터베이스일 수 있다.
판정되는 레벨은 제어 레벨 또는 차단 레벨 또는 임계 레벨과 동일할 수 있거나 제어 레벨 또는 차단 레벨 또는 임계 레벨에 비해 증가 또는 감소될 수 있다. 일부 측면에서, 대조 대상은 동일한 종, 성별, 민족성, 연령 집단, 흡연 상태, 체질량 지수(BMI), 현재의 치료 요법 상태, 병력 또는 이들의 조합에 대한 대조군이지만, 대조군이 해당 질병으로 고생하지 않거나 질병의 위험이 없다는 진단을 받는 대상.
"약학 적으로 허용 가능한 담체"라는 문구는 당업계에 공지되어 있으며,이를 필요로 하는 개인에게 화합물을 투여하기에 적합한 약학 적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "TNF(종양 괴사 인자)-관련 세포 자멸-유발 리간드(TRAIL) 수용체 작용제"는 사멸 수용체(DR), TRAIL-R1(DR4) 및 TRAIL-R2 DR5). TRAIL 수용체 작용제 또는 TRA는 재조합 TRAIL, 재조합 TRAIL 변이체, TRAIL-R1 및/또는 TRAIL-R2뿐만 아니라 작용성 작은 분자 또는 펩타이드 분자에 결합하는 TRAIL 유도체 및 항-TRAIL 수용체 항체를 포함 하나 이에 한정되지 않는다 결합 TRAIL-R1 및/또는 TRAIL-R2. 일부 실시예에서, 항-TRAIL 수용체 항체는 TRAIL-R2(DR5)에 대한 항체를 포함한다.
일부 실시예에서, TRAIL 항체는 암 치료를 위해 처음에 개발된 DR5 항체, 코나투무맙(conatumuma), 티가투주맙(tigatuzumab), 렉사투무만(lexatumuman), HGS-TR2J/KMTR-2, LBY135, 드로지투맙(drozitumab), TAS266, DS-8273/DS-8273a , APG880, RG7386를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "PEG화(PEGylation)"는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 사슬을 약물, 치료 단백질 또는 소포와 같은 분자 및 거대 구조물에 공유 결합 또는 비공유 결합 또는 융합시키는 방법을 의미한다.
"예방하다", "예방하는", "예방" 및 "예방적 치료"라는 용어는 임상적으로 무증상 인 개인에게 특정 역효과에 걸릴 위험이 있거나, 장애 또는 질병을 치료할 수 있으며, 따라서 증상 및/또는 근본 원인의 예방에 관한 것이다.
약제 조성물은 신속하게 분열하는 세포, 예를 들어, 암 세포에서 세포주기를 정지시키는 데 사용하기 위한 키트 또는 약제 시스템으로 조립될 수 있다. 키트 또는 약제 시스템은 바이알, 튜브, 앰풀, 병, 주사기 또는 백과 같은 하나 이상의 용기 수단을 밀폐 상태로 갖는 상자, 카톤 또는 튜브와 같은 운반 수단을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 또는 약제학적 시스템은 또한 키트를 사용하기 위한 관련 지시 사항을 포함할 수 있다.
II. 조성물
유용한 조성물은 사멸 수용체(TRAIL 수용체) 작용제를 포함한다. 사멸 수용체 작용제의 예로는 정제된 TRAIL, 단리된 TRAIL, 재조합 TRAIL, 재조합 TRAIL 변이체, TRAIL-R1 및/또는 TRAIL-R2에 결합하는 TRAIL 유도체 및 항-TRAIL 수용체 항체뿐만 아니라 TRAIL에 결합하는 작용적 작은 분자 또는 펩티드 분자-R1 및/또는 TRAIL-R2. 일부 실시예에서, 항-TRAIL 수용체 항체는 TRAIL-R1(DR4) 및 TRAIL-R2(DR5)에 대한 항체를 포함한다.
A. 사멸 수용체 작용제
조성물은 PEG화된 TNF(종양 괴사 인자)-관련 세포 자멸-유발 리간드(예를 들어, TNF-α)와 같은 췌장염 및 섬유성 질환 및 췌장 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 섬유증 및 통증을 감소시키고 췌장 및 췌장염에서의 췌장 기능을 개선시키기 위해 TRAIL 유사체 및 항-DR5 작용성 항체를 포함한다. 이들 PEG화 단백질 계 약물 및 항-DR5 항체는 통증뿐만 아니라 췌장염 및 췌장 섬유증에서 질환-변형 효과를 갖는다. 그들은 안전하고, 매우 안정적이며, 유익하며, 반감기가 연장되었다.
1. 트레일
TNF(종양 괴사 인자) 관련 세포 자멸사 유도 리간드(TRAIL)는 세포자멸(apoptosis)이라는 세포자멸 과정을 유도하는 리간드로서 기능하는 단백질이다. TRAIL은 대부분의 정상 조직 세포에서 생산되고 분비되는 사이토 카인이다. 그것은 특정 종양 수용체에 결합함으로써 종양 세포에서 주로 세포자멸을 유발한다. TRAIL은 또한 CD253(분화 클러스터 253) 및 TNFSF10(종양 괴사 인자(리간드) 수퍼 패밀리, 구성원 10)으로 명명되었다.
인간에서 TRAIL을 코딩하는 유전자는 3q26 염색체에 위치하는데, 이는 다른 TNF 패밀리와 유사하지 않는다. TRAIL 유전자의 게놈 구조는 약 20kb에 걸쳐 있으며, 222, 138, 42, 106 및 1245 개의 뉴클레오타이드와 약 8.2, 3.2, 2.3 및 2.3kb의 4 개의 인트론으로 이루어진 5 개의 엑손 세그먼트로 구성된다. TRAIL 유전자는 TATA 및 CAAT 상자가 없고 promoter 영역은 GATA, AP-1, C/EBP, SP-1, OCT-1, AP3, PEA3, CF-1 및 ISRE에 대한 추정 반응 요소를 포함한다.
TRAIL은 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리의 다른 구성원과 상동성을 보이다. 그것은 281 개의 아미노산으로 이루어져 있고 II형 막횡단 단백질(즉, 리더 서열 및 내부 막횡단 도메인 없음)의 특성을 갖는다. N 말단 세포질 도메인은 패밀리 구성원간에 보존되지 않지만, C 말단 세포 외 도메인은 보존되고 세포 표면으로부터 단백질 분해될 수 있다. TRAIL은 3 개의 수용체 분자를 결합하는 동종 삼량체를 형성한다.
TRAIL은 사멸 수용체 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2)에 결합한다. 세포자멸 과정은 카스파제-8에 의존적이다. Caspase-8은 procaspase-3,-6,-7을 포함한 downstream effector caspases를 활성화시켜 특정 키나제의 활성화를 유도한다. TRAIL은 또한 세포질 도메인(DcR1)을 포함하지 않거나 절단된 죽음 도메인(DcR2)을 포함하는 수용체 DcR1 및 DcR2에도 결합한다. DcR1은 TRAIL 중화 디코이 수용체로서 기능한다. DcR2의 세포질 도메인은 기능적이며 NFkappaB를 활성화시킨다. 따라서 DcR2를 발현하는 세포에서 TRAIL 결합은 NFkappaB를 활성화시켜 사망 신호 전달 경로를 길항하거나 염증을 촉진시키는 것으로 알려진 유전자의 전사를 유도한다. TRAIL은 TNFRSF10B와 상호 작용하는 것으로 나타났다.
TRAIL은 원주민 또는 유전자 조작(재조합) 형태로 얻을 수 있다. TRAIL은 삼량체 형성에 유리한 지퍼 아미노산 모티프 및/또는 그의 단리 및 정제를 용이하게하는 말단 그룹을 포함할 수 있다.
적절한 TRAIL 단백질은 길이가 281 아미노산의 아미노산 서열을 갖는 인간 형태의 TRAIL을 포함한다, SEQ ID NO: 1:
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG.
바람직한 실시예에서, TRAIL은 전장 인간 형태(1-281)의 아르기닌-114(Arg, R)부터 글리신-281(Gly, G)까지의 아미노산 서열을 가지며, 서열 번호 1의 아미노산 서열 번호 2를 가진다:
RERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG.
통상적으로, TRAIL은 N 말단 아미노산 잔기에서 에틸렌 글리콜(EG) 단위,보다 바람직하게는 2 이상의 EG 단위(즉, 폴리에틸렌 글리콜(PEG))로 변형된다. N-말단 아미노산 잔기는 리신, 시스테인, 세린, 티로신, 히스티딘, 페닐알라닌 또는 아르기닌을 포함 하나 이에 한정되지 않는다.
전형적으로, 임의의 TRAIL 유사체가 PEG화에 적합할 수 있다. 유사체는 3 개의 단량체 중 하나 이상이 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지며 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 갖는 삼량체 TRAIL을 포함한다. TRAIL 유사체는 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 생체 외에서 생성될 수 있다.
TRAIL은 N 말단에서 류신 또는 이소 루이 신 지퍼(ILZ)에 부착될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 지퍼 모티프는 이소 루이 닌 지퍼이다(Kim et al., BBRC, 321:930-935(2004)).
2. 사멸 수용체 작용 항체
일부 실시예에서, 사멸 수용체 작용성 항체는 DR5 항체 인 코나투무맙, tigatuzumab, lexatumuman, HGS-TR2J/KMTR-2, LBY135, drozitumab, TAS266, DS-8273/DS-8273a, APG880, RG7386, 단일 또는 이중 항원 또는 에피토프 특이성을 갖는 키메라 항체 및 하이브리드 단편을 비롯한 F(ab ') 2 등과 같은 단편을 포함할 수 있다. 이러한 항체 및 단편은 당업계에 공지된 기술로 제조될 수 있으며, 항체 생산 및 특이성 및 활성을 위한 항체 선별을 위한 일반적인 방법에 따라 특이성 및 활성에 대해 스크리닝될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York,(1988)).
많은 비인간 항체(예를 들어, 마우스, 쥐 또는 토끼로부터 유래된 것들)는 인간에서 자연적으로 항원성이고, 따라서 인간에게 투여될 때 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법에서의 인간 또는 인간화 항체의 사용은 인간에게 투여된 항체가 바람직하지 않은 면역 반응을 유발할 가능성을 줄이는 역할을 한다. 인간화 또는 키메라성 사멸 수용체 작용성 항체는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 모두가 비인간 면역 글로불린(즉, 공여자 항체) 및 모든 CDR 영역에 대응하는 적어도 하나의 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있다 또는 실질적으로 모든 프레임 워크 영역은 인간 면역 글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 바람직하게는, 사멸 수용체 작용제 항체는 또한 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역 글로불린의 부분을 포함한다. 사멸 수용체 작용제 항체의 불변 도메인은 항체의 제안된 기능, 특히 필요할 수 있는 이펙터 기능과 관련하여 선택될 수 있다. 일부 실시예에서, 사멸 수용체 작용제 항체의 불변 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인이다(또는 포함한다).
항체 단편은 항체의 결합 및 결합 특이성(및 항체 불변 영역의 특정 생물학적 기능을 요구하지 않음), 예를 들어 사멸 수용체에 특이적인 결합 단편을 포함한다. 다른 항체 영역은 표적 사멸 수용체에 대한 이중 특이적인 결합 및 결합 특이성이 유지될 것으로 기대하면서 임의의 중쇄 및 경쇄 또는 이들의 부분과 함께 또는 이들로부터 치환되거나, 변경되거나 또는 둘 모두로 치환, 변경될 수 있다. 항체 단편 및 펩타이드 형태의 경우, 사멸 수용체에 특이적인 결합 단편은 다수의 결합 단편 형태 중 임의의 것에 의해 구현될 수 있으며, 항체 결합 단편에 사용되는 임의의 다가 및 다중 특이적 방법을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 결합될 수 있다. 개시된 항체, 항체 단편 및 폴리펩타이드의 경우, 이러한 형태는 다가 항체 대신에(또는 부가하여) 이중 특이적일 것이다. VEGF 도메인, V-NAR 도메인, VH 도메인, VL 도메인, F(ab(ab ') 2), 항체-결합(Fab) ) 3, bis-scFv, diabody, triabody, tetrabody 및 minibody. 이들 형태 중 임의의 것을 독립적으로 사멸 수용체에 특이적인 결합 단편을 구현하는 데 사용할 수 있으며, 이어서 임의의 적합한 링커 또는 커플 링을 사용하여 결합되거나 결합될 수 있다. 또한, 사멸 수용체에 특이적인 결합 단편은 항체 단편의 다가 및/또는 다중 특이적 형태의 결합 단편 부분으로서 사용될 수 있다. 예로는 F(ab') 2, F(ab) 3, bis-scFv, diabody, triabody, tetrabody 및 minibody가 있다.
3. 사멸 수용체 작용제의 아날로그
사멸 수용체 작용제는 추가 잔기를 포함하도록 변형되어 유사체를 형성할 수 있다. 상기 잔기는 중합체 잔기, 폴리펩타이드, 다당류, 표지된 추적자 등일 수 있다. 상기 잔기는 상기 사멸 수용체 작용제에 비공유 또는 공유 결합될 수 있다.
일부 실시예에서, 잔기는 폴리알킬렌 옥사이드, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 산업 생산에서 의학에 이르기까지 다양한 용도로 사용되는 폴리 에테르 화합물이다. PEG의 구조는 다음과 같다.(괄호 안의 반복된 요소에주의하십시오.) H-(O-CH2-CH2) n-OH PEG는 분자량에 따라 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 또는 폴리 옥시 에틸렌(POE)으로도 알려져 있다. PEG, PEO 또는 POE는 에틸렌 옥사이드의 올리고머 또는 중합체를 나타낸다. 3 개의 이름은 화학적으로 동의어이지만 역사적으로 PEG는 생물 의학 분야에서 선호되는 반면, PEO는 고분자 화학 분야에서 더 널리 보급된다. 상이한 용도가 상이한 중합체 쇄 길이를 필요로 하기 때문에, PEG는 전형적으로 20,000 g/mol 이하의 분자량, 20,000 g/mol 이상의 분자량을 갖는 중합체에 대한 PEO 및 임의의 분자량의 중합체에 대한 POE와 함께 사용된다. PEG 및 PEO는 분자량에 따라 액체 또는 저 용융 고체이다. PEG는 에틸렌 옥사이드의 중합에 의해 제조되며 300 g/mol 내지 10,000,000 g/mol의 광범위한 분자량에 걸쳐 상업적으로 입수 가능하다. 상이한 분자량을 갖는 PEG 및 PEO가 상이한 용도에서의 용도를 찾고, 사슬 길이 효과로 인해 상이한 물리적 성질(예: 점도)을 가지지 만, 이들의 화학적 성질은 거의 동일하다. 중합 공정에 사용되는 개시제에 따라 다른 형태의 PEG도 사용할 수 있다. 가장 일반적인 개시제는 일 작용성 메틸 에테르 PEG 또는 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)(mPEG)이다. 저 분자량 PEG는 단 분산, 균일 또는 이산이라고 하는 보다 순수한 올리고머로도 제공된다. 매우 고순도 인 PEG는 최근에 결정질인 것으로 나타나 x-선 회절에 의한 결정 구조의 결정을 가능하게한다. 순수 올리고머의 정제 및 분리가 어렵 기 때문에, 이러한 유형의 품질에 대한 가격은 종종 다 분산 PEG의 가격의 10-1000 배이다.
PEG는 다른 기하학으로도 이용 가능한다. 분지된 PEG는 중심핵 그룹으로부터 나오는 3 개 내지 10 개의 PEG 사슬을 갖는다. 스타 PEG는 중심 코어 그룹으로부터 나오는 10 내지 100 개의 PEG 사슬을 갖는다. 콤 PEG는 일반적으로 폴리머 백본 상에 그라프트된 다중 PEG 사슬을 갖는다. PEG의 이름에 종종 포함되는 숫자는 평균 분자량을 나타낸다(예: n = 9 인 PEG는 약 400 달톤의 평균 분자량을 가지며 PEG 400으로 표시된다). 대부분의 PEG는 크기 분포는 다 분산 지수(Mw/Mn)로 지칭되는 그의 중량 평균 분자량(Mw) 및 수 평균 분자량(Mn)에 의해 통계적으로 특성화될 수 있다. MW 및 Mn은 질량 분광법으로 측정할 수 있다.
PEG화는 PEG 구조를 또 다른 큰 분자, 예를 들어 치료 단백질과 공유 결합시키는 작용으로 PEG화된 단백질이라고 한다. PEG화된 인터페론 알파-2a 또는 -2b는 일반적으로 C 형 간염 감염을 위한 주사 가능한 치료법이다. PEG는 물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 벤젠 및 디클로로메탄에 용해되며 디에틸에테르 및 헥산에는 용해되지 않는다. 그것은 비 이온 계면 활성제를 생산하기 위해 소수성 분자와 결합되어 있다. PEG에는 산화 에틸렌 및 1,4-디옥산과 같은 잠재적인 독성 불순물이 포함되어 있다. 에틸렌 글리콜과 에테르는 손상된 피부에 적용하면 신 독성이 있다.
폴리에틸렌 글리콜은 에틸렌 옥사이드와 물, 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 올리고머의 상호 작용에 의해 생성된다. 반응은 산성 또는 염기성 촉매에 의해 촉매된다. 에틸렌 글리콜 및 이의 올리고머는 물 대신에 출발 물질로서 바람직하며, 이는 낮은 다 분산도(좁은 분자량 분포)를 갖는 중합체의 생성을 허용하기 때문이다. 중합체 사슬의 길이는 반응물의 비율에 의존한다.
HOCH2CH2OH + n(CH2CH2O) → HO(CH2CH2O) n + 1H
촉매 유형에 따라, 중합 메커니즘은 양이온성 또는 음이온성일 수 있다. 에틸렌 옥사이드의 중합은 발열 과정이다.
PEG화(또한 종종 PEG화)는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 사슬의 분자 및 거대 구조(예: 약물, 치료용 단백질 또는 소포)에 공유 결합 및 비공유 결합 또는 융합하는 과정이며, PEG화 페 길화). PEG화는 PEG의 반응성 유도체를 표적 분자와 함께 배양함으로써 일상적으로 달성된다. 약물 또는 치료용 단백질에 PEG를 공유 결합 시키면 숙주의 면역계(면역 원성 및 항원성 감소)로부터 약물을 "차폐"시킬 수 있고, 신장을 감소시킴으로써 순환 시간을 연장시키는 약물의 유체 역학적 크기(용액 내 크기)를 증가시킬 수 있다 재고 정리. PEG화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 대한 수용성을 제공할 수 있다.
PEG화는 중합체 PEG의 가닥을 분자, 가장 일반적으로 펩타이드, 단백질 및 항체 단편에 부착시키는 과정으로, 많은 치료법의 안전성 및 효율을 향상시킬 수 있다. 그것은 입체 구조, 정전기 결합, 소수성 등의 변화를 포함하는 물리 화학적 성질의 변화를 일으킨다. 이러한 물리적 및 화학적 변화는 치료제의 전신 보유력을 증가시킨다. 또한, 이는 세포 수용체에 대한 치료 잔기의 결합 친화력에 영향을 줄 수 있으며, 흡수 및 분포 패턴을 변경할 수 있다.
PEG는 접합에 특히 매력적인 중합체이다. 제약 응용 분야와 관련된 PEG 잔기의 구체적인 특성은 수용성, 용액에서의 높은 이동성, 독성 및 낮은 면역 원성 부족, 신체로부터의 즉각적인 제거 및 신체의 분포 변화이다.
TRAIL 유도체의 생물학적 활성은 선택적 PEG화를 통해 증가될 수 있다. 의약품의 치료 효과는 또한 PEG화 과정을 통해 증가될 수 있다. PEG화의 적용은 분자량, 대사 부위의 방어 및 면역 원성 부위의 억제를 증가시켜 생체 내 반감기 및 안정성을 증가시키고 면역 원성을 감소시킨다. 또한, 펩타이드 및 PEG와 결합한 단백질의 신장 배설은 PEG에 의한 펩타이드 및 단백질의 분자량의 증가로 인해 감소되며, 따라서 PEG화는 약동학 및 약력 모두에서 효과를 증가시키는 이점을 갖는다.
바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도체는 선형 또는 분지형이거나, TRAIL 및/또는 다른 PEG 분자에 대한 링커가 없거나 또는 이들과 함께 또는 이량체 또는 삼량체의 형태일 수 있다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 숙신이미딜프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 또는 이들 유도체의 다중 분지형을 포함한다. 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 선형 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드, 분지형 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 또는 삼량체성 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드이며, 보다 바람직하게 삼량체성 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드이다.
TRAIL 유도체를 폴리에틸렌 글리콜로 PEG화하거나 그 유도체를 제조한 후, 질량 분석기, 액체 크로마토그래피, X선 회절 분석, 편광계 및 계산된 값의 비교를 통해 유사체의 분자 구조를 확인할 수 있다 PEG화된 TRAIL을 구성하는 대표 원소의 측정 값.
4. 부형제
TRAIL, 항체 또는 유도체는 투여를 위해 제제화될 수 있다. 전형적으로는 주사, 흡입, 폐 투여 또는 안내 투여를 위해 멸균 수, 완충액 또는 굿맨 앤 길만(Goodman and Gilman 's)에 기재된 것과 같은 다른 부형제로 투여하기 위해 용해될 수 있는 동결 건조 또는 분무 건조 분말의 형태로 존재할 것이다.
폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체로 PEG화된 TRAIL 유도체는 임의로 완충제, 현탁제, 정균제 또는 점도 변형된 액체 또는 현탁액으로서 제조된 다음 앰플 또는 바이알 단위 투여 형태로 포장될 수 있다. 상기 조성물은 여과, 조사 또는 에틸렌 옥사이드와 같은 기체에 의해 멸균된다.
III. 조성물의 제조방법
A. TRAIL 및 PEG화된 TRAIL을 만드는 방법
PEG화의 첫 번째 단계는 한쪽 또는 양쪽 말단에서 PEG 폴리머의 기능화이다. 동일한 반응성 잔기를 갖는 각각의 말단에서 활성화되는 PEG는 "호모 이기능성"으로 알려져 있고, 존재하는 작용기가 다른 경우, PEG 유도체는 "헤테로이 작용성" 또는 "이성질 관능성"으로 지칭된다. PEG 중합체는 원하는 분자에 PEG를 부착시키도록 제조된다.
단백질 접합을 위한 전반적인 PEG화 공정은 용액 상 배치 공정과 온-칼럼 유-배치 공정의 두 가지 유형으로 크게 분류될 수 있다. 간단하고 일반적으로 채택된 배치 공정은 바람직하게는 4 내지 6 ℃의 온도에서 적당한 완충 용액 중에 함께 시약을 혼합한 다음, 물리 화학적 성질에 기초한 적합한 기술을 사용하여 원하는 생성물을 분리 및 정제하는 것을 포함한다, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온교환 크로마토그래피(IEX), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 멤브레인 또는 수성 2상 시스템을 포함한다.
PEG 유도체에 대한 적합한 작용기의 선택은 PEG에 커플 링될 분자상의 이용 가능한 반응성 기의 유형에 기초한다. 단백질의 경우, 전형적인 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다. N-말단 아미노기 및 C-말단 카르복실산은 또한 알데히드 작용성 중합체와의 접합에 의해 부위 특이적 부위로서 사용될 수 있다. 1 세대 PEG 유도체를 형성하기 위해 사용되는 기술은 일반적으로 PEG 중합체를 히드록실기, 일반적으로 무수물, 산 클로라이드, 클로로포메이트 및 카보네이트와 반응성인 기와 반응시킨다. 2 세대 PEG화 화학에서는 알데하이드, 에스테르, 아미드 등과 같은 보다 효율적인 작용기가 접합에 이용 가능하게 되었다.
이 헤테로 이작용성 PEG는 친수성, 유연성 및 생체 적합성 스페이서가 필요한 두 개체를 연결하는 데 매우 유용하다. 헤테로 이작용성 PEG에 대한 바람직한 말단기는 말레이미드, 비닐술폰, 피리딜디술피드, 아민, 카르복실산 및 NHS 에스테르이다. 중합체의 형태가 분지화된 제3세대 PEG화제, 점도가 감소하고 장기 축적이 없는 Y 형 또는 콤 모양이 이용 가능하다. PEG화된 화합물의 제거 시간에 예측할 수 없는 것은 독성학적으로 알려진 결과가 없는 봉입체로 이끄는 간에서 큰 분자량의 화합물의 축적으로 이어질 수 있다. 또한, 사슬 길이의 변경은 생체 내 예상치 못한 클리어런스 시간을 초래할 수 있다.
B. 사멸 수용체 작용제를 만드는 방법
항체 및 항체 단편은 폴리펩타이드의 생산에 유용한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 시험관내 합성, 재조합 DNA 생산 등에 의해 제조될 수 있다. 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 항-DR5 작용성 항체는 재조합 면역 글로불린 발현 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간화 항체를 포함하는 면역 글로불린 분자의 재조합 생산은 미국 특허 제 4,816,397 호(보스(Boss) 등), 미국 특허 제 6,331,415 호 및 제 4,816,567 호(양자 모두 카빌리(Cabilly) 등), 영국 특허 제 2,188,638 호(윈터(Winter), 및 영국 특허 GB 2,209,757에 기술되어 있다. 또한, 인간화 면역 글로불린을 포함하는 면역 글로불린의 재조합 발현을 위한 기술이 Goeddel 등, Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press(1991), Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman(1992)에서 찾을 수 있다. 재조합 항체의 생성, 디자인 및 발현에 관한 추가 정보는 Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego(1993)에서 찾을 수 있다.
항체는 또한 동물을 합성 또는 정제된 단량체성, 호 메오 릭성 또는 이종성 DR5로 면역화하여 제조할 수 있다. 면역 혈청을 펩타이드 친화성 칼럼에 적용하여 고도의 특이 면역 반응을 일으킨다.
본원에 기재된 인간 항체 및 인간화 항체는 임의의 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체 생산 기술의 예는 보어너(Boerner) 등의 문헌 [J. Immunol., 147(1), 86-95(1991)]에 기재된 기술을 포함한다. 본원에 기재된 인간 항체(및 그의 단편)는 또한 파지 디스플레이 라이브러리(예를 들어, Marks 등, J. Mol. Biol., 222, 581-597(1991) 참조)를 사용하여 생산될 수 있다. 본원에 기재된 인간 항체는 또한 형질 전환 동물로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 면역에 반응하여 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질 전환된 돌연변이 쥐가 기재되어 있다(Jakobovits 등, PNAS, 90, 2551-255(1993) 및 Jakobovits et al. , Nature, 362, 255-258(1993)).
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 설치류 상보성 결정 영역(CDR) 또는 인간 항체의 상응하는 서열에 대한 CDR 서열을 대체함으로써 생성될 수 있다. 상세한 절차는 문헌 [Jones et al., Nature, 321, 522-525(1986)]; Riechmann 등, Nature, 332, 323-327(1988); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536(1988)]에 기재되어 있다.
인간화된 항체를 생성 시키는데 사용될 수 있는 방법은 또한 미국 특허 제 4,816,567 호; 미국 특허 제 5,565,332 호; 미국 특허 제 5,721,367 호; 미국 특허 제 5,837,243 호; 미국 특허 제 5,939,598 호; 미국 특허 제 6,130,364 호; 및 미국 특허 제 6,180,377 호에 기재되어 있다.
IV. 사용 방법
사멸 수용체 작용제는 췌장염, 췌장 섬유증, 췌장 통증 또는 이들의 임의의 조합을 치료하는 데 사용될 수 있다. 사멸 수용체 작용제는 췌장 섬유증을 감소, 정지 또는 역전시키고 췌장 통증을 감소 또는 중지시키는 염증 과정의 초기 단계에서 췌장 염증을 감소, 정지 또는 역전 시키는데 유용하다.
폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도체로 PEG화된 TRAIL 유도체를 함유하는 약학 조성물의 인체 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질병 수준에 따라 달라질 수 있고, 바람직하게는 0.01 내지 200 ㎎/㎏/day의 용량으로 의사 또는 약사의 결정 후에 투여될 수 있다.
예시된 것에 기술된 바와 같이, 일차 인간 PSC에서 TRAILPEG의 효과가 조사되었다. 특히 세룰레인에 의한 급성 췌장염(AP)과 에탄올/세룰레인/리버-데칼리(Lieber-Decarli)(LD)식이 유도성 만성 췌장염(CP)을 포함한 다양한 췌장염 모델에서 TRAILPEG를 정맥 내로 투여한 항 섬유소제 및 항 통증 효능을 시험하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, TRAIL 신호 전달은 틈새 수용체를 직접 감작시키고 췌장 통각 과민을 유도할 수 있는 TGFβ 조절뿐만 아니라 췌장 섬유 형성에 중요한 역할을 한다. TRAILPEG는 급성 및 만성 단계 모두에서 췌장염의 진행을 개선했다. 놀랍게도, TRAILPEG 치료는 CP 쥐 모델에서 통증을 유의하게 감소시켰다.
아래에서 자세히 설명 하듯이 TRAILPEG는 PS의 활성화를 선택적으로 차단하고 CP의 생성자인 활성화된 PSC를 제거하여 CP의 역전을 초래한다. 또한, TGFβ의 상향 조절에 의한 통각 수용체를 민감하게 하는 PSC를 표적으로 함으로써, TRAILPEG는 전신 독성없이 CP-관련 심한 통증을 감소시킨다.
췌장 섬유 형성 및 통증에서의 TRAIL 신호 전달의 역할을 조사하여 클리닉에서 췌장염 치료를 위한 사멸 수용체 작용제(예: TRAILPEG 및 항-DR5 항체)를 이용할 수 있는 가능성을 결정하였다. 췌장염 치료 및 새로운 TRAIL 기반 요법에 대한 TRAIL 신호의 새로운 방향이 제안되었다.
A. 치료 조건
췌장염은 췌장의 염증이다. 췌장은 소화 효소를 생성하는 위의 큰 기관이다. 급성 췌장염과 만성 췌장염의 두 가지 주요 유형이 있다. 췌장염의 징후와 증상에는 상복부 통증, 오심 및 구토가 포함된다. 통증은 종종 등 뒤쪽으로 들어가며 보통 심하다. 급성 췌장염에서 열이 발생할 수 있으며 증상은 일반적으로 며칠 안에 해결된다. 만성 췌장염에서 체중 감소, 지방간 및 설사가 발생할 수 있다. 합병증에는 감염, 출혈, 당뇨병 또는 다른 기관의 문제가 포함될 수 있다.
급성 췌장염의 가장 흔한 원인은 담석과 중 알코올 사용이다. 다른 원인으로는 직접적인 외상, 특정 약물, 유행성 이하선염과 같은 감염 및 다른 사람들 사이의 종양이 있다. 급성 췌장염의 결과로 만성 췌장염이 발생할 수 있다. 그것은 일반적으로 다년간의 과도한 알코올 사용으로 인한 것이다. 다른 원인으로는 높은 수준의 혈중 지방, 고혈압 칼슘, 일부 약제 및 낭성 섬유증과 같은 특정 유전 질환이 있다. 흡연은 급성 및 만성 췌장염의 위험을 증가시킨다. 급성 췌장염의 진단은 아밀라아제 또는 리파아제의 혈액을 3 배로 증가시키는 것에 기반한다. 만성 췌장염에서 이러한 검사는 정상적일 수 있다. 초음파 및 CT 스캔과 같은 의료 이미징 또한 유용할 수 있다.
1. 급성 췌장염
급성 췌장염은 보통 정맥 내 수액, 진통제, 때로는 항생제로 치료한다. 일반적으로 음식 섭취는 허용되지 않으며 관은 위장에 놓일 수 있다. 차단된 경우 췌관을 열려면 내시경 역행성 담췌관 조영술(ERCP)로 알려진 절차를 수행해야 한다. 담석이 있는 사람들은 담낭을 제거하기도한다. 만성 췌장염에서, 위의 것 이외에, 비위 관을 통한 일시적인 공급이 적절한 영양을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 장기식이 요법과 췌장 효소 대체가 필요할 수 있으며 때로는 수술을 통해 췌장 부분을 제거한다.
급성 췌장염은 일년에 약 10 만명당 약 30 명이 발생한다. 만성 췌장염의 새로운 사례는 매년 10 만명당 8 명에서 발생하며 현재 미국 내 10 만명당 50 명에 영향을 미친다. 전 세계적으로 2013 년에 췌장염으로 인해 1990 년 83,000 명의 사망자가 발생하여 123,000 명이 사망했다. 여성보다 남성에서 더 흔하다. 종종 만성 췌장염은 30 세에서 40 세 사이에 시작되는 반면 어린이에서는 드물다. 급성 췌장염은 1882 년에 부검으로 처음 설명되었으며, 만성 췌장염은 1946 년에 처음 설명되었다.
췌장염의 가장 흔한 증상은 가벼운 상복부 또는 좌상 상부 통증으로 통증이 뒤쪽으로, 메스꺼움과 구토가 식중으로 악화되는 것이다. 신체 검사는 내 출혈의 정도와 정도에 따라 다르다. 혈압은 통증에 의해 상승되거나 탈수 또는 출혈에 의해 감소될 수 있다. 심장 및 호흡 수는 종종 상승한다. 복부는 일반적으로 부드럽지만 통증 자체보다는 덜하다. 복부 질환에서 흔히 있는 것처럼 장의 소리는 반사 장 대 마비에서 감소될 수 있다. 발열이나 황달이 나타날 수 있다. 만성 췌장염은 당뇨병이나 췌장암으로 이어질 수 있다. 소화를 방해하는 췌장 효소가 부족하여 설명할 수 없는 체중 감소가 발생할 수 있다.
췌장염의 80 %는 알코올이나 담석으로 인한 것이다. 담석은 급성 췌장염의 가장 흔한 단일 원인이다. 알콜은 만성 췌장염의 가장 흔한 단일 원인이다.
일부 약물은 일반적으로 췌장염과 관련이 있으며, 대부분 프레드니솔론 (prednisolone)과 같은 부신 피질 호르몬뿐만 아니라 HIV 약물인 디다노신 (didanosine)과 펜타미딘 (pentamidine), 이뇨제, 항 경련제 발프로산 (valproic acid), 화학요법제 L-아스파라기나아제(L-asparaginase)와 아자치오프린 (azathioprine), 증가된 혈액 트리글리세라이드에 의한 에스트로겐 및(metformin), 빌다글립틴(vildagliptin) 및 시타글립틴(sitagliptin)과 같은 항 고혈당제가 있다. 췌장염의 증가된 사건과 관련이 있는 상태를 치료하는 데 사용되는 약물은 부수적으로 췌장염과 관련될 수도 있다. 예로는 이상 지질혈증 치료제 인 스타틴(statins)과 당뇨병 치료시 글립틴(gliptin)이 있다. 식품 의약품 안전청의 메드워치 감시 시스템(MedWatch Surveillance System) 및 발표된 보고서 비정형(비정형) 보고서에 따르면 클로자핀(clozapine), 리스페리돈(risperidone) 및 오란자핀(olanzapine)과 같은 비정형 항 정신병 제 역시 췌장염의 원인이 될 수 있다.
다른 일반적인 원인에는 외상, 유행성 이하선염, 자가 면역 질환, 고혈압 칼슘, 저체온증 및 내시경 역행성 담췌관 조영술(ERCP)이 있다. 췌장 분열은 일부 재발성 질환의 근본 원인이 될 수 있는 췌장의 공통적인 선천성 기형이다. 2 형 당뇨병은 2.8 배 높은 위험도와 관련이 있다.
덜 흔한 원인으로는 췌장암, 췌관 결석, 혈관염(췌장의 작은 혈관 염증), 콕 사키 바이러스 감염 및 포르피린증(특히 급성 간헐적인 포르피린증 및 적혈구 조혈 항원증)이 있다.
췌장 내에서 트립시노겐(trypsinogen)이 활성화되어 자가 분해 (autodigestion)를 일으키는 상속된 형태가 있다. 관련 유전자에는 트립시노겐을 코드하는 트립신 1(Trypsin 1), 트립신 억제제 또는 낭포성 섬유증 막통과 컨덕턴스 조절기를 암호화하는 SPINK1이 포함될 수 있다.
췌장염의 일반적인 원인은 알코올/에탄올, 담석, 스테로이드, 외상자가 면역 췌장염, 유행성 이하선염, 고지질혈증, 저체온증, 부갑상선 항진증, 전갈, 전립선 역행 담관 췌장 조영술 및 약물(전형적으로 아자티오프린 및 발프로산)을 포함한다.
유행성이하선염(Mumps), 콕사키 바이러스(Coxsackie virus), B형 간염, 거대세포 바이러스(Cytomegalovirus), 단순성포진 바이러스(Herpes simplex virus), 수두-대상포진 바이러스(Varicella-zoster virus) 등 여러 감염병이 췌장염의 원인으로 알려져 있다.
췌장염의 감별 진단에는 담낭염, 콜레 도석 결석증, 천공된 소화성 궤양, 창자 경색, 소장 폐쇄, 간염 및 장간막 허혈이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 진단은 상복부의 특징적인 급성 발병 또는 뒤쪽으로 방사될 수 있는 막연한 복통(위의 징후 및 증상 참조), 혈청 아밀라아제 또는 리파아제 수치가 정상 상한치의 3배 초과이며, 이미징 연구 특성 변화. CT, MRI, 복부 초음파 또는 내시경 초음파를 진단에 사용할 수 있다. 아밀라아제와 리파아제는 췌장에서 생산되는 2 가지 효소이다. 리파아제의 상승은 일반적으로 췌장염의 더 나은 특이성을 가지며 더 긴 반감기를 갖는 췌장염의 더 좋은 지표로 간주된다. 이미징의 경우, 복부 초음파는 편리하고 단순하며 비 침습적이며 저렴하다. 그것은 담즙 돌에서 췌장염에 대해 다른 감각 양상보다 민감하고 구체적이다. 그러나 환자의 25-35 %에서 췌장의 시야 및 대장 가스에 의해 방해 받아 평가하기가 어렵다. 조영 증강 CT 스캔은 대개 췌장 괴사 및 추가 췌장액을 평가하고 질병의 심각성을 예측하기 위해 통증이 발생한 후 48 시간 이상 수행된다. 조기에 CT를 스캔하면 안심할 수 있다. ERCP 또는 내시경 초음파는 또한 췌장염의 담즙 원인이 의심되는 경우 사용할 수 있다.
췌장염의 치료는 지지적이며 심각도에 달려 있다. 모르핀은 일반적으로 통증 조절에 적합하다. 모르핀이 오디(Oddi)의 괄약근을 수축시킬지도 모른다는 주장이 있지만 이것은 논란의 여지가 있다. 모르핀이 증상을 악화 시키거나 췌장염이나 담낭염을 일으킬 수 있다는 임상 시험은 없다. 급성 췌장염에 대한 치료는 합병증을 일으키지 않는 경증의 상태인지 또는 심각한 합병증을 유발할 수 있는 심각한 형태의 것인지 여부에 따라 다르다. 경미한 급성 췌장염의 치료는 일반 병원 병동의 입원으로 성공적으로 수행된다. 전통적으로 사람들은 염증이 해결될 때까지는 식사를 할 수 없었지만, 최근의 증거에 따르면 조기 사료 섭취는 안전하고 결과를 개선할 수 있다고 한다. 췌장염은 폐 손상을 일으킬 수 있고 정상적인 폐 기능에 영향을 줄 수 있기 때문에 코를 통해 연결된 호흡 튜브를 통해 때때로 산소가 전달된다. 그런 다음 튜브가 며칠 후에 제거될 수 있다. 급성 췌장염이 발생하는 동안 탈수가 발생할 수 있으므로 체액이 정맥 내로 제공된다. 급성 췌장염의 경증 또는 중등도의 경우와 관련된 통증은 심각할 수 있으며, 이는 마약성 진통제가 필요할 수 있음을 의미한다.
심한 췌장염은 장기 부전, 괴사, 감염 괴사, 가성 낭종 및 농양과 관련이 있다. 중증 급성 췌장염으로 진단되면 사람들은 높은 의존성 단위 또는 집중 치료 단위에 입원해야 한다. 그것은 췌장을 복구하려고 체액과 영양분을 전환 시키므로 신체 내부의 체액 수준이 현저히 떨어질 수 있다. 체액 수준의 저하는 체내의 혈액량 감소를 가져올 수 있으며, 이는 저혈량 충격으로 알려져 있다. 저혈당성 쇼크는 생존에 필요한 산소가 풍부한 혈액의 몸을 매우 빠르게 굶어 죽을 수 있기 때문에 생명을 위협할 수 있다. 혈량 저하의 충격으로 가는 것을 피하기 위하여는, 액체는 정맥으로 양수될 것이다. 산소는 코에 부착된 튜브를 통해 공급되며 환기 장치는 호흡 보조 용으로 사용될 수 있다. 수유 튜브는 적절한 진통과 결합된 영양소를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
가벼운 급성 췌장염의 경우와 마찬가지로 근본 원인 담석 치료, 약물 중단, 술 중단 등이 필요하다. 담석이 원인인 경우 ERCP 절차 또는 담낭 제거가 권장된다. 담낭은 동일한 입원 기간이나 췌장염 2 주 이내에 제거해야 재발성 췌장염의 위험을 줄일 수 있다. 췌장염의 원인이 알코올 인 경우 알코올 섭취 중단 및 알코올 의존 치료로 췌장염을 개선할 수 있다. 근본 원인이 알코올 섭취와 관련이 없다고 하더라도, 의사는 회복 과정 중에 췌장에 더 많은 손상을 줄 수 있으므로 적어도 6 개월은 복용하지 않는 것이 좋다. 구강 섭취, 특히 지방은 일반적으로 초기에 제한되지만 48 시간 이내에 조기 섭취가 임상 결과를 향상시키는 것으로 나타났다. 액체와 전해질은 정맥으로 대체된다. 영양 공급은 처음 72-96 시간의 치료가 개선되지 않으면 분비된 췌장 효소에 가장 영향을 받는 소화관 부분을 능가하도록 튜브 먹이를 통해 시작된다.
조기 합병증에는 쇼크, 감염, 전신성 염증 반응 증후군, 저칼슘 칼슘, 고혈당 및 탈수증이 포함된다. 혈액 손실, 탈수 및 복강 내로의 누출(복수)은 신부전을 유발할 수 있다. 호흡기 합병증은 종종 심하다. 흉막 삼출은 보통 존재한다. 통증으로부터의 얕은 호흡은 폐 붕괴로 이어질 수 있다. 췌장 효소는 폐를 공격하여 염증을 일으킬 수 있다. 심한 염증은 복강 내 고혈압 및 복부 구획 증후군으로 이어질 수 있으며 신장 및 호흡 기능을 더욱 악화시키고 압력을 완화하기 위해 개방 복부를 관리해야 할 수도 있다.
후기 합병증으로는 재발성 췌장염과 흉터로 인한 췌장 유사 분열물(췌장 유사 분열물)의 발생이 있다. 이것들은 통증을 유발하고, 감염되고, 파열되고 출혈을 일으키거나, 담관을 막고 황달을 일으키거나, 복부 주위로 옮길 수 있다. 급성 괴사성 췌장염은 괴사, 액화 및 감염으로 인한 고름집 인 췌장 농양을 유발할 수 있다. 이것은 약 3 %의 경우 또는 췌장에서 2 개 이상의 가성 낭 및 가스가 관련된 경우의 거의 60 %에서 발생한다.
2. 만성 췌장염
만성 췌장염은 장기의 정상적인 구조와 기능을 변화시키는 췌장의 오래 지속되는 염증이다. 이전에 손상된 췌장에서 급성 염증의 에피소드로 나타나거나 지속적인 통증이나 흡수 장애로 인한 만성 손상으로 나타날 수 있다. 이것은 급성 췌장염의 가역적인 변화와는 다른 췌장에 돌이킬 수 없는 손상을 특징으로 하는 질병 과정이다. 만성 췌장염의 발생 빈도는 10 만명 당 5 ~ 12 명이며, 유병률은 100,000 명당 50 명이다. 여성보다 남성에서 더 흔하다.
만성 췌장염과 일치하는 증상은 대개 음식에 지방이 흡수되지 않아 지속되는 복통이나 지방 줄기가 있다. 상당량의 체중 감소는 흡수 장애로 인해 종종 발생하며 상태가 진행됨에 따라 건강 문제가 계속될 수 있다. 환자는 또한 음식 섭취와 관련된 통증, 특히 지방과 단백질의 높은 비율을 함유한 식사에 대해 불평할 수 있다.
만성 췌장염의 원인 중에는 알코올,자가 면역 질환, 관내 장 폐쇄, 특발성 췌장염, 종양, 허혈 및 석회석이 있다. 최근 연구에 따르면 흡연은 만성 췌장염을 유발할 수 있는 고위험 인자일 수 있지만 병인학적 요인, 유전적 소인 및 질병 진행 속도와의 관계는 더 명확히 해야 한다. 소그룹의 환자에서 만성 췌장염이 유전적인 것으로 밝혀졌다. 낭포성 섬유증을 앓고 있는 거의 모든 환자는 대개 출생시부터 만성 췌장염을 앓게 된다. 낭포성 섬유증 유전자 돌연변이는 또한 만성 췌장염 환자에서 확인되었지만 낭포성 섬유증의 다른 증상은 없었다. 양성 또는 악성 과정으로 인해 췌장 관이 막히면 만성 췌장염이 발생할 수 있다.
유전적 관점에서 본 만성 췌장염의 기전은 어린 시절부터 심한 상복부 통증의 조기 발병을 시사한다. 이것은 상 염색체 우성 질환이며, 만성 췌장염 질환은 양성 트립신 유전자 PRSS1과 돌연변이 R122H에서 확인된다. R122H는 유전적인 만성 췌장염의 가장 흔한 돌연변이로, 트립시노겐 (trypsinogen) 단백질의 아미노산 위치 122에서 아르기닌을 히스티딘으로 대체한다. 당연히 알코올, 영양실조 및 흡연과 같은 다른 메커니즘이 있다. 각 메커니즘은 췌장 자체에 영향을 미친다.
만성 췌장염의 진단은 췌장의 구조와 기능에 대한 검사를 기반으로 한다. 만성 췌장염의 경우에는 혈청 아밀라아제와 리파아제가 적당히 증가할 수 있으며, 아밀라아제와 리파아제는 급성기에 거의 항상 상승한다. 세균성 자극 검사는 만성 췌장염의 진단을 위한 최상의 검사로 간주된다. 만성 췌장염의 진단에는 혈청 트립신, 전산화 단층 촬영, 초음파 및 생검이 있다. 만성 췌장염이 유전적 요인에 의해 유발될 때, ESR, IgG4, 류마티스 인자, ANA 및 항-평활근 항체의 상승이 검출될 수 있다.
만성 췌장염 치료를 위한 다양한 치료 옵션은 의료 조치, 치료 내시경 및 수술이다. 치료는 가능한 경우 근본 원인으로 유도되고 통증과 흡수 장애를 완화한다. 인슐린 의존성 진성 당뇨병이 발생할 수 있으며 장기 인슐린 요법이 필요할 수 있다. 복통은 매우 심각할 수 있으며 고용량의 진통제를 필요로 하며 때로는 아편 제제를 포함한다. 알코올 중단 및식이 요법(저지방식이 요법)은 통증을 관리하고 석회화 과정을 지연시키는 데 중요하다. 산화 방지제가 도움이 될 수 있지만 이점이 의미가 있는지는 불분명하다. 췌장 효소 대체는 종종 만성 췌장염과 관련된 흡수 장애 및 지방 국체 치료에 효과적이다. CP의 치료는 췌장 효소 용액을 식사와 함께 투여하는 것으로 구성된다. 일부 환자는 효소 대체로 통증 감소가 있으며 비교적 안전하기 때문에 만성 췌장염 환자에게 효소를 대체하는 것은 대부분의 환자에게 치료의 허용 단계이다. 특발성 췌장염이 있는 대형 덕트 및 관상 동맥 질환이 없는 환자에서 치료가 성공할 가능성이 더 높다. 만성 췌장염 치료를 위한 수술은 절제술과 배수술의 두 가지 영역으로 나누어진다. 수술을 선택하는 이유는 가성 낭종, 누공, 복수 또는 고정된 장애가 있는 경우이다.
3. 췌장 섬유증
섬유증은 복구 또는 반응 과정에서 장기 또는 조직에 과도한 섬유 결합 조직이 형성되는 것이다. 이것은 반응성, 양성 또는 병적 상태일 수 있다. 부상에 대한 응답으로 이것은 흉터라고하며, 섬유화가 단일 세포주에서 발생하는 경우 이것을 섬유종이라고 한다. 생리학적으로 섬유증은 결합 조직을 침착시키는 작용을 하며, 이로 인해 장기 또는 조직의 구조와 기능이 무의미해질 수 있다. 섬유화는 섬유 조직의 과도한 침착의 병리학적 상태뿐만 아니라 치료에 결합 조직 침착 과정을 기술하는 데 사용될 수 있다.
섬유화는 콜라겐과 글리코 사 미노 글리 칸을 포함한 결합 조직을 자극하는 자극된 세포를 포함한다는 점에서 흉터의 과정과 유사하다. 간질이라고 불리는 표면 사이의 손상된 조직뿐만 아니라 대 식세포라고 불리는 면역 세포는 TGFβ를 분비한다. 주변 조직의 염증이나 순환하는 매개체가 증가된 일반화된 염증 상태를 비롯한 여러 가지 이유가 있다. TGF는 섬유 아세포의 증식과 활성화를 자극하여 결합 조직을 침착시킨다. 섬유화는 일반적으로 췌장(만성 췌장염), 간경화(간경변), 폐(폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 특발성 폐 섬유증), 심방(심방성 섬유증), 염증 또는 손상의 결과로 인체 내의 많은 조직에서 발생할 수 있다.(무릎, 어깨, 다른 관절), 크론 병(창자), 듀플렉스의 계약(손, 손가락), 켈로이드(피부), 종격동 섬유증(연조직(골수), 페이로 니 병(페니스), 신장성 전신 섬유증(피부), 진행성 다발성 섬유증(폐); 복강경 섬유화(후 복막 연조직), 경피증/전신 경화증(피부, 폐) 및 몇 가지 형태의 점액낭염(견관절)의 합병증으로 인해 발생한다.
4. 췌장염이나 췌장 통증 치료 방법
A. PSC 타겟팅
병리학적으로, CP는 중요한 섬유화에 의해인지된다. 췌장 섬유 형성은 주로 췌장 별 모양 세포(PSCs)에 의해 조율된다(Erkan, M., et al., Gut, 2012. 61(2):172-178;(Omary, M.B., et al., J Clin Invest, 2007. 117(1):50-59; Pinzani, M., Gut, 2006. 55(1):12-14). 췌장 손상 또는 질병 동안, 정지 상태의 PSCs(qPSCs)는 활성화되어 증식성, 섬유성 및 수축성 근섬유 아세포로 변형된다(문헌 [Proceedings, Vol. 콜라겐 침착을 촉진하고 섬유화 조직을 유도하는 것으로 알려져 있다. 활성 PSCs(aPSCs)는 췌장을 대상으로 하는 항 섬유화 치료의 주요 목표이다(Omary, M.B., et al., J Clin Invest, 2007. 117(1):50-59; Apte, M.V., et al., J Gastroenterol Hepatol, 2006. 21 Suppl 3:S97-S101). 따라서, aPSCs의 박멸은 섬유 형성 및 그 합병증, 통증을 예방, 중단 및/또는 역전시키는 논리적인 전략이다. aPSC에서 qPSC 활성화를 차단하고 qPSCs가 아닌 aPSCs의 선택적으로 아폽토시스를 유도할 수 있는 분자적 표적 화제는 CP에서 강력한 항 섬유화 효과를 제공할 것이다. 췌장 fibrogenesis의 발신자가 고갈이다. 반대로 췌장 섬유증은 CP 진행을 정지/역전 시키므로 결과적으로 CP 관련 통증이 감소하고 췌장 기능이 개선된다(도 1).
b. 통증을 치료하기 위해 사멸 수용체 작용제로 PSC-TGFβ 축을 표적으로 한다.
급성 통증에서 만성 통증으로의 전환은 적극적인 조사의 영역이다(Reichling, D.B. and Levine, J.D., Trends Neurosci, 2009. 32(12) : 611-618). 조직 염증은 말초 감작을 초래하는 사건의 계단을 일으키는데, 즉 몸이 등 지근(DRG)에 수납되어 있고 척수의 2 차 뉴런과 함께 시냅스 중심이 끝나는 원심성 뉴런(nociceptors)의 반응성이 향상된다. 그러나, 조직 섬유화가 두드러지는 염증의 후행 인자에 대해서는 거의 알려져 있지 않는다. 본원에 기술된 바와 같이, TGFβ에 의한 DRG 뉴런의 처리는 흥분성의 변화를 유도하고 만성 췌장염에서 통각 자극성의 특징 인 특정 전압 의존성 칼륨 전류(IA)를 억제하였다(Zhu, Y., et al., Mol Pain, 2012 8:65). TGFβ 자체는 통각 수용체를 민감하게하고, 췌장 통각 과민을 유도하며, CP에 동반되는 향상된 행동 반응에 기여할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, PSC는 활성화 과정 동안 TGFβ를 상향 조절하고 DRG 뉴런의 흥분성에 영향을 미친다. 통각에 대한 TRAIL 및 TGFβ의 역할에 대한 새로운 지식은 또한 염증 및 만성 통증에 의해 특징 지워지는 다른 증상에 영향을 미친다. 실제로 "급성 통증 상태에서 만성 통증 상태로의 전환은 연구를 개선하는 가장 중요한 도전일 수 있다(Reichling, DB and Levine, JD, Trends Neurosci, 2009. 32(12) : 611-618).
C. 치료 대상
전형적으로, 치료될 피험자는 췌장염, 췌장 섬유증 및/또는 췌장 통증을 앓고 있거나 또는 겪을 위험이 있는 대상을 포함한다.
일부 실시예에서, 치료될 피험자는 또한 2 형 당뇨병, 간 섬유증, 간(liver fibrosis), 간(liver fibrosis), 간(liver fibrosis), 간 피부 섬유증, 췌장암, 전이된 암, 제 1 형 당뇨병 및 류마티스성 관절염을 포함하는 자가 면역 상태를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
다른 실시예에서, 치료될 피험자는 2 형 당뇨병, 간 섬유증, 고지혈증 및 고지혈증, 간경화, 간암, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 췌장암, 전이암, 제 1 형 당뇨병 및 류마티스성 관절염을 포함한 자가 면역 상태와 같은 추가적인 만성 또는 급성 증상을 앓지 않는 췌장염, 췌장 섬유증 및/또는 췌장 통증을 앓고 있거나 이를 앓을 위험이 있는 환자를 포함한다.
D. DR5 작용제의 유효량
상기 조성물은 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 0.001 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg 또는 100 ㎎/㎏이다. 예를 들어, 조성물은 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 투여량 또는 0.001 mg/kg 내지 20 mg/kg의 투여량으로 투여된다.
일부 측면에서, 췌장 조직은 보호되고 섬유 형성은 감소되며 췌장 섬유 형성은 역전되고 통증은 감소되며 건강한 췌장 조직은 손상되지 않는다. 한 양태에서, 섬유증 질환 또는 장애를 치료하는 것은 통증을 감소시키는 것을 포함한다. 통증은 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 % 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, 99.9 % 및 100 %
한 측면에서, 섬유증 질환 또는 장애의 치료는 췌장 섬유증을 감소시키는 것을 포함한다. 췌장 섬유증은 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, 99.9 % 및 100 %로 환자에 감소된다.
한 측면에서, 섬유증 질환 또는 장애의 치료는 췌장 염증을 감소시키는 것을 포함한다. 췌장염은 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 % , 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, 99.9 % 및 100 %로 감소된다.
1. 복합 요법을 위한 투여량과 치료 요법
치료 방법은 전형적으로는 질병 또는 그 증상의 치료, 또는 포유 동물, 특히 인간에게 췌장염 또는 그의 증상을 치료하기 위한 또는 생리학적 변화를 일으키는 프로-아폽토시스 제의 유효량을 투여하는 것을 포함하여 원하는 생리학적 변화를 달성하는 방법을 포함한다.
사멸 수용체 작용제의 유효량은 환자에게 한 번 또는 여러 번 단일 투여로 투여될 수 있다. 투여는 1 일 1 회, 1 일 2 회, 매일 3 회, 1 주일, 2 회, 2 주, 2 주 또는 1 회일 수 있다.
사멸 수용체 작용제의 유효량은 단일 단위 투여량(예를 들어, 투여 단위로서), 또는 유한 시간 간격에 걸쳐 투여되는 치료용량 이하로 투여될 수 있다. 이러한 단위 투여량은 3 일 이하, 5 일 이하, 7 일 이하 또는 10 일 이하, 15 일 이하 또는 20 일, 또는 최대 25 일과 같은 유한한 시간 동안 매일 투여될 수 있다.
일부 실시예에서, 단위 투여량은 주 요법으로서 투여된다. 다른 실시예에서, 단위 투약은 복합 요법에서 제 2 약제와 함께 투여된다.
a. 복합 요법
일부 실시예에서, 상기 사멸 수용체 작용제는 추가의 활성제와 조합된다. 사멸 수용체 작용제 및 추가의 활성제는 동일한 조성물의 일부와 같이 함께 투여될 수 있거나, 또는 동시에 또는 상이한 시간에 개별적으로 및 독립적으로 투여될 수 있다(즉, 리간드 또는 작용제의 투여 및 제 2 활성제는 서로 유한한 기간으로 분리됨). 따라서, 용어 "조합" 또는 "조합된"은 리간드 또는 작용제 및 제 2 활성제의 동시, 동시 또는 순차 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 조합은 동시에(예를 들어, 혼합물로서), 개별적으로 동시에(예를 들어, 동일한 대상 내로 별도의 정맥 주사 라인을 통해 투여될 수 있고, 하나의 약제는 경구 투여되고, 다른 약제는 주입 또는 주사 등에 의해 투여될 수 있다) 또는 순차적으로(예를 들어, 한 에이전트가 먼저 주어지며 두 번째 에이전트가 먼저 주어진다).
일부 실시예에서, 제 2 활성 작용제와 조합하여 사멸 수용체 작용제를 투여하면, 프로-세포 자멸제 및 제 2 활성제를 단독으로 또는 독립적으로 투여하는 경우보다 더 큰 결과를 얻는다(즉, 조합에 의해 달성된 결과는 개별 구성 요소만으로 얻은 결과를 보완하는 것보다 더 더 많다). 일부 실시예에서, 조합하여 사용되는 하나 또는 두 가지 약제의 유효량은 개별적으로 투여될 때 각 약제의 유효량보다 낮다. 일부 실시예에서, 복합 요법에서 사용되는 경우 한 가지 또는 두 가지 약제의 양은 단독으로 사용되는 경우에는 치료 이하이다.
복합 요법의 치료 요법은 하나 이상의 리간드 또는 작용제의 투여를 포함할 수 있다. 복합 요법의 치료 요법은 제 2 활성제의 1 회 또는 다수 회 투여를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 친-세포자멸제는 제 2 활성제의 제 1 투여 전에 투여된다. 다른 실시예에서, 리간드 또는 작용제는 제 2 활성제의 제 1 투여 후에 투여된다.
리간드 또는 작용제는 제 2 활성제 투여 전 또는 투여 후 적어도 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 또는 30 시간 또는 며칠 동안 투여될 수 있다.
약제의 용량 요법 또는 사이클은 완전히 또는 부분적으로 중첩될 수 있거나 순차적일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 프로-아폽토시스 제제의 이러한 모든 투여(들)는 제 2 활성제의 투여 전 또는 후에 일어난다. 다르게는, 프로-아폽토시스 제제의 1 회 이상의 투여량을 제 2의 치료제의 투여로 일시적으로 엇갈리게 하여 균일한 또는 불균일한 치료 코스를 형성시켜 하나 이상의 프로-아폽토시스 제제를 투여하고, 제 2 활성제의 1 이상의 투여량에 이어 1 회 이상의 투여량의 사멸 수용체 작용제; 또는 제 2 활성제의 1 회 이상의 투여가 뒤 따르고,이어서 프로-세포사 제의 1 회 이상의 투여가 뒤 따르고,이어서 제 2 활성제의 1 회 이상의 투여가 수행되고; 치료법을 연구하는 임상의 또는 임상가가 선택하거나 원하는 모든 스케줄에 따라 결정할 수 있다.
V. 키트
의료 키트도 공개된다. 상기 의료 키트는 예를 들어 프로-아폽토시스 제, 바람직하게는 작용제 TRAIL 수용체에 대한 리간드 또는 아고 니스트의 투여량을 단독으로 또는 제 2 치료제와 조합하여 포함할 수 있다. 제 2 치료제와 병용할 때, 활성제는 단독으로(예: 동결 건조) 또는 약학 조성물(예: 혼화제)으로 공급될 수 있다. 활성제는 단위 투여량 또는 투여 전에 희석되어야하는 투여량일 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 약학 적으로 허용 가능한 담체의 공급물을 포함한다. 키트는 또한 활성제 또는 조성물, 예를 들어 주사기의 투여 용 장치를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 기재된 용도로 화합물을 투여하기 위한 인쇄된 지침을 포함할 수 있다.
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예를 참조로 추가로 이해될 것이다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원 및 도면의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
실시예
일반적인 방법
생체 내에서 TRAILPEG의 효능을 시험하기 위해, 생물학적 샘플을 다음과 같이 분석하였다.
혈액 화학 및 간장 지질 수준 :
혈청 아밀라아제, 리피다아제, ALT, AST, ALP, 나트륨, 콜레스테롤, 중성 지방, 포도당, 알부민, 단백질 및 요소 질소 수준은 IDEXX 분석기를 사용하여 결정된다.
조직학 및 IHC :
고정된 췌장 샘플을 H & E, Sirius Red, α-SMA로 염색하고 Mayer의 헤 마톡 실린으로 대조 염색하였다. 면역 형광 검사(IF) 이중 염색은 α-SMA, 활성 카스파제-3에 대한 적절한 항체를 사용하여 수행하였고, 핵을 DAPI로 염색하였다. 췌장 조직에 대한 TUNEL 분석을 수행하여 세포사멸 시그널링 캐스케이드로부터 DNA 손상을 측정하였다.
실시간 PCR :
DR5, α-SMA, Pdgf-r, Col1a1, Col1a2, Col1a3, Tgf-b1, Tgf-br2, Tgf-br3, Bmp7, Timp1에 대한 적절한 프라이머를 사용하여 RT-PCR(ABI7500)/3, Mmp2/3/7/9/13뿐만 아니라 Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, FLIP 및 cIAP를 포함한다.
웨스턴 블롯팅 :
DR5, α-SMA, 콜라겐, Timp, Tgfβ, Mmps, 카스파제-8/-9/-3, 절단된 PARP-1, 절단된 PARP-1 및 키나아제를 포함하는 주요 마커에 대한 췌장 균질물로부터의 단백질 추출물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, FLIP, FADD 및 t-Bid를 포함한다.
VFF 테스트 및 전기 자극을 이용한 통증 행동:
TRAILPEG 처리 후, 각각의 EtOH/세룰레인/LD식이 유도 CP 군으로부터 4 마리의 쥐를 VFF 시험 및 전기 자극 연구에 사용하였다.
데이터 및 통계 분석:
항 섬유화 치료를 위한 그룹당 6-10 마리의 동물들과 5 % 유의 수준 및 90 % 힘에 대한 치료군과 대조군의 평균값 간의 차이를 관찰하기 위해서는 항염 치료를 위한 그룹당 4 마리의 동물이 필요했다. 조직 슬라이드는 샘플에 대한 사전 지식없이 병리학 자들에 의해 분석되었다. 얼룩 강도와 정도는 0-4 사이의 허용된 채점 시스템에 따라 등급이 매겨졌다. 면역조직화학(IHC) 영상을 NIH Image J로 분석하였다. TRAILPEG 처리가 있거나 없는 대조군과 위/아래 조절 수용체, 바이오 마커 및 그룹 간의 비교는 양측 피셔의 정확한 시험(Fisher 's exact test), one way ANOVA 또는 chi-square 테스트. 모든 데이터 세트는 여러 치료 그룹 간의 다중 비교에 의해 분석되었다. 모든 분석은 프리즘 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 수행된다. 0.05 미만의 P 값은 모든 분석에서 통계적으로 유의하다고 간주된다.
실시예 1. 췌장 세포에 대한 TRAIL PEG 효과.
PEG화는 단백질 약물의 반감기(t1/2)와 매우 효율적인 상업 전략(Harris et al., Nat Rev Drug Discov, 2(3) : 214-221(2003))을 연장하는 황금 표준이다. 10 개 이상의 PEG화된 생물학적 제제는 FDA 승인을 받았으며 PEG화 단백질은 일반적으로 면역원성이 낮다고 여겨진다(Alconcel et al., Polymer Chemistry, 2(7) : 1442-1448(2011)). TRAIL의 극히 짧은 t1/2(설치류에서 5 분 미만 및 인간에서 30 분 미만)(Kelley 등, J Pharmacol Exp Ther, 299(1) : 31-38(2001), Ashkenazi 등, J Clin Oncol, 26(21) : 3621-3630(2008))은 TRAIL 기능을 연구하고 특히 생체 내에서 약물 효능을 입증하는 것을 어렵게 만든다. PEG화된 TRAIL은 5-kDa PEG 분자(TRAILPEG)와 함께 N 말단에서 삼량체 형성을 돕는 각 단량체의 말단에 이소류신-지퍼 아미노산 모티프(isoleucine-zipper amino acid motifs, iLZ)를 포함하는 삼량체 TRAIL을 안정화시킴으로써 생산되었다(WO 2007/145457). TRAILPEG는 둘라민(Dulanermin)(Genentech),(Lemke, J., et al., Cell Death Differ, 2014. 21(9) : 1350-1364)와 같은 재조합 TRAIL과 비교하여 쥐 및 원숭이의 안정성 및 순환 반감기를 상당히 향상시켰다. 클리닉에서 조사되었고 좋은 안전성 프로파일을 보였으나 효능은 낮았다.
재료 및 방법
췌장 독성의 가능성을 조사하기 위해 TRIALPEG를 췌장 선방 세포(AR42J, ATCC CRL-1492)(ATCC) 및 일차 인간 섬(췌장)(Celprogen, Torrance, CA)에서 시험하였다. 100 U/ml 페니실린/스트렙토 마이신(Life Technology)을 첨가한 RPMI 1640 배지(Corning cellgro, Manassas, VA, USA)에 AR42J 세포(ATCC). 랑게르한스(Langerhans)의 세포 배양을 완료한 인간 췌장 섬(# 35002-04, Celprogen, Torrance, CA)을 혈청(Celprogen # M35002-04S) 및 랑게르한스 세포 외 배양 배지(# E35002-04, Celprogen) ). 세포를 5 % CO2의 가습 분위기 하에서 37 ℃에서 배양하였다. 간단히 말해, 2 ㅧ 104 세포를 96-웰 플레이트에서 24 시간 동안 배양한 다음 TRAILPEG(0, 101, 102, 103 ng/mL)로 3 시간 동안 처리하고 세포 생존력을 세포자멸 MTT 분석으로 분석하였다. 배양 후, MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 4 시간 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT)를 사용하여 430 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
결과
도 2에 도시된 바와 같이, TRAILPEG는 선방 세포(AR42J) 및 일차 인간 섬에 어떠한 독성도 나타내지 않았다.
실시예 2 : 배양-활성화된 췌장 성상 세포는 TRIAL-유도된 세포자멸에 민감하게 된다.
결과는 일차 인간 PSC가 배양-활성화되었을 때 PSC가 근섬유 아세포 유사 세포로 변형되고 다른 섬유화 마커뿐만 아니라 DR4 및 DR5를 상향 조절하고 상향 조절된 DR5/DR4를 통해 TRAILPEG에 대해 매우 민감해진다는 것을 보여준다.
비활성 PSCs(qPSCs)가 아닌 활성화된 일차 인간 PSCs(aPSCs)는 DR을 증가시키고 TRAIL 매개 아폽토시스(apoptosis)에 민감해진다.
재료 및 방법
일차 인간 PSC에서 TRAIL-유도된 세포자멸이 시험되었다. 인간 PSCs(ScienceCell 연구실)는 제조사의 지침에 따라 FBS 2 %, 별 모양 세포 성장 보충제 1 % 및 페니실린/스트렙토 마이신 용액 1 %가 보충된 SteCM 배지(ScienceCell)에서 재배되었다. 2 ㅧ 105 개의 PSC를 폴리-L-라이신으로 코팅된 6-웰 플레이트에서 배양하고 2 일(정지) 및 7 일(활성화) 배양하고 분석을 위해 수확하였다. 다른 세포와는 달리 간장 성상 세포(HSC) 및 췌장 성상 세포(PSC)를 포함한 성상 세포는 활성화될 수 있고 연속된 세대의 배양(예: 5 일 이상 배양)으로 활성화된 성상 세포로 분화될 수 있다. DR5 및 DR4, α-SMA, 콜라겐 및 TGFβ뿐만 아니라 PDGFR 및 TGFβ의 표현을 정지 및 활성화된 세포 상태에서 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 7 일 동안 배양하면 활성화가 유도된다.
결과
활성화는 PSC의 형태학적 변화를 유도하고 섬유화 마커를 현저히 상향 조절하였으며, 중요하게는 DR4 및 DR5(도 3a-3f). 세포를 TRAILPEG(1 μg/mL)로 3 시간 동안 정지 상태 또는 활성화 상태에서 처리했을 때 TRAIL 유도된 세포자멸은 aPSC에서는 명확하게 관찰되었지만 qPSC에서는 관찰되지 않았고 MTT 분석으로 측정된 세포자멸 특징 및 정량화된 세포자멸로 입증되었다(도 4).
TRAIL 신호 분자, 섬유증 마커 및 아폽토시스 마커의 모니터링 조정.
TRAIL 신호 분자, 섬유증 마커 및 세포 자멸사 마커의 조절은 활성화 동안 일차 인간 PSC에서 모니터링되었다. 안전은 일차 인간 섬 및 췌장 선방 세포에서 확인되었다.
재료 및 방법
대표적인 TRAIL 신호 및 섬유증 관련 분자를 일차 인간 PSC(ScienceCell)의 단백질 및 mRNA 수준에서 스크리닝하였다. PSC는 SteCM 배지에서 2, 4, 7 일 동안 배양-활성화시키고 수확하였다. TRAIL 신호 분자 DR5, DR4 및 FLIP 및 섬유증 마커 α-SMA, Pdgf-r, 콜라겐 유형-1/2/3, Mmps, Timps, Collagens 및 TGFβ의 발현 및 카포 세스를 포함하는 세포 자멸사 및 항-세포 자멸사 표지자 PARP-1, BCL-2, BCL-XL, FLPI 및 cIAP를 절단한 후, qPCR 및 웨스턴 블랏팅에 의해 분석하였다. PSC 형태의 변화는 현미경으로 관찰되었다. 일단 TRAIL 신호 분자의 발현 양상이 확인되면 PSC 활성화 동안 TRAIL 유도된 세포자멸의 효과를 조사하였다. 분자 연구를 위해 대기 및 배양 활성 PSC(2 일에서 7 일까지)를 1 μg/mL의 TRAILPEG로 처리했다. 활성화된 PSC는 TRAILPEG(1 ㎍/mL)의 유무에 상관없이 3 시간 처리하고 qPCR로 분석하였다.
결과
활성화된 PSC는 BCL-2, BCL-XL, X-IAP와 같은 여러 개의 항-세포자멸 단백질을 상향 조절하였으나 상향 조절된 PARP-1, Cl Casep-8 및 CLP-1에 의해 입증된 TRAIL 유도성 세포자멸에 민감하였다. Cl 캐스프-3. 대부분의 원발성 암세포의 경우, 이러한 상향 조절된 항-세포 자멸 단백질은 TRAIL-유도된 세포자멸을 강력하게 억제하여 TRAIL 저항성을 유발한다. 또한 활성화된 PSC는 독소루비신(doxorubicin)(DOX, 100nM), 시스프라틴(cisplatin)(CIS, 10mM) 또는 과산화수소(H2O2, 10mM)와 같은 항암제를 포함한 일반적인 독성 제제와 함께 항온 처리할 때 죽이는 것이 어렵다는 것도 보여주었다. 활성화된 PSC를 TRAILPEG(1 ㎍/mL)로 3 시간 동안 배양하고, 독성 인자를 48 시간 동안 배양한 경우, TRAILPEG 처리된 세포가 CL PARP-1, Cl Casp-8, Cl Casp-3 및 Cl Casp-9를 상향 조절함에 따라 TRAILPEG 만이 강력한 세포자멸을 유도하였다.
배양-활성화된 일차 인간 PSCs는 상향 조절된 절단된(cl) PARP-1, Cl Casp-8에 의해 입증된 바와 같이, 다수의 항-세포 자멸 단백질(BCL-XL, BCL-2, X-IAP)을 증가 시키지만 TRAIL-유도된 세포자멸에 민감하게 유지된다(카스파제-8), 및 C1 카스파-3(카스파제-3).
실시예 3: 항-DR5 항체가 아닌 항-DR5 항체는 활성화된 췌장 성상 세포에서 선택적 세포자멸을 유도한다.
TRAIL은 인지 수용체인 DR4 및 DR5에 결합함으로써 세포자멸을 유도한다. TRAIL 수용체가 활성화된 PSC에서 아폽토시스를 유도하는 데 필요한지 여부를 조사하기 위해, 카스파제 3/7 활성(아폽토시스 마커)이 활성화된 PSC를 인간 항-DR4 작용성 항체(마파투무맙) 또는 항-DR5 작용성 항체(코나투무맙) 중 어느 것으로 처리하여 측정되었다. DR4 또는 DR5 특이적 항체 처리를 위해, 96 웰 플레이트(코닝) 및 MAPC(Human anti-DR4 항체, Creative Biolabs)의 순차적 농도(0, 101, 102, 103 ng/mL)에서 7 일 동안 PSC를 활성화시켰다. 단백질 G(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA # 21193)를 함유한 코나투무맙(인간 항-DR5 항체, Creative Biolabs)을 첨가하고 3 시간 동안 배양하고 세포가 카스파제 활성을 시험하였다. 카스파제 3/7 활성을 카스파제 3/7 검정 키트(Promega)에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 각 샘플의 발광은 1 분 래그 시간 및 0.5 초/웰 판독 시간(n = 4)의 매개 변수를 갖는 플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments Inc)에서 측정되었다.
활성화된 PSC의 세포 막에서 DR4 및 DR5 발현 프로파일을 조사하기 위해, 인간 일차 PSC를 2 일 및 7 일 동안 배양-활성화시키고, 세포를 수확하고, 차가운 PBS로 2 회 세척하고, 항-인간 CD261(DR4 )-PE 또는 안티-인간 CD262(DR5)-PE(eBioscience, San Diego, CA). 마우스 IgG1 K 이소 타입 컨트롤 PE(eBioscience)를 아이소 타입 컨트롤로 사용했다. TRAIL 수용체의 세포 표면 발현을 유동 세포 계측법(Accuri C6, BD Biosciences, San Jose, CA)으로 분석하였다. FlowJo 소프트웨어(FlowJo LLC, Ashland, OR)를 사용하여 조직학 및 평균 형광 강도(MFI) 데이터를 분석하였다.
결과
도 5에서 볼 수 있듯이 활성화된 PSC를 코나투무맙(DR5 항체, 103 ng/mL)로 처리하면 카스파제-3/7 활성이 10.79 ± 1.42 배 증가한다. 대조적으로, 마파투무맙(103 ng/mL)은 카스파제-3/7 활성을 증가시키지 않았다(1.27 ± 0.03 배). 다음으로 PSC의 세포막에서 DR4 및 DR5의 발현을 정지(2 일) 및 활성화된 PSC(7 일)에서 피코에리트린(PE)으로 표지된 DR4 또는 DR5 특이적 항체를 사용하여 유동 세포 계측법 분석에 의해 조사하였다. 예기치 않게, 평균 형광 강도(MFI)의 큰 변화는 DR4 항체의 경우와 비교하여 DR5 항체 처리된 활성화된 PSC에서만 관찰되었다(도 6a 및 6b). 이 결과는 DR5가 활성화된 PSC의 세포 표면에서 우세하게 발현된다는 것을 보여 주었다. 종합하여 볼 때, 활성화된 PSC에서 TRAIL-유도된 세포자멸은 우세하게 DR5에 의해 매개되고, DR4에 의해 매개되지는 않는다.
실시예 4 : 알코올-활성화 췌장 성상 세포가 TRAIL-유도 및 항-DR5 항체-유도된 세포 자멸에 민감하게 된다.
만성 췌장염의 주요 원인은(모든 경우의 약 70 %에서) 알코올 남용이다. 정지 상태의 PSC는 알코올, 에탄올(EtOH)에 의해 활성화될 때 TRAIL 수용체 DR4 및 DR5를 유의하게 증가시키고 TRAIL 유도성 세포자멸에 민감하게 나타난다.
재료 및 방법
PSC 활성화에 대한 알코올의 효과를 조사하기 위해, 폴리-L-라이신으로 코팅된 6-웰 플레이트에서 2 ㅧ 105 사람 주 PSC를 배양하고 24 시간 동안 배양하고 에탄올(EtOH)(0, 30, 50mM) 48 h. 알코올 자극 후, 실시간 qPCR 분석 및 웨스턴 블랏팅을 위해 세포를 수확했다. DR4, DR5 및 a-SMA(Acta2)와 같은 섬유 형성 인자(collagens)를 포함한 TRAIL 신호 전달 분자의 발현을 분석한다. 알콜-활성화된 PSCs에서 TRAIL-유도된 세포자멸을 조사하기 위해, 96-웰 플레이트에서 2 ㅧ 104 세포를 밤새 배양한 다음 50 mM EtOH로 48 시간 동안 활성화시켰다. TRAIL, TRAILPEG, 마파투무맙(인간 항-DR4 항체) 또는 코나투무맙(인간 항-DR5 항체)의 다양한 농도(0, 101, 102, 103 ng/mL)로 EtOH-활성화 PSC를 처리하고 3 시간 동안 배양하였다. 아폽토시스는 MTT 세포자멸 법 및 카스파제 3/7 분석법으로 측정하였다.
결과
도 7a-7e에 도시된 바와 같이, 48 시간 동안 EtOH(50 mM)로 처리된 정지 PSC는 α-SMA(Acta2, 3.7.5 ± 0.29 배), 콜라겐(Col1α2, 4.0 ± 0.43)의 mRNA 수준을 연속적으로 상향 조절하였다 PDGF 수용체(Pdgf-r, 1.9 ± 0.25 배)뿐만 아니라 TRAIL 수용체(DR4; 2.1 ± 0.12, DR5, 1.8 ± 0.09 배)의 비 활성화된 PSC와 비교하였다. 또한, EtOH(50 mM)에 의해 활성화된 PSC는 비 활성화된 PSC에 비해 TRAILPEG(59.95 ± 6.37 % 세포자멸) 및 카스파제 3/7 활성(apoptosis marker, 10.45 ± 1.60 배)(도 8a 및 8b).
알콜 활성 PSC가 문화에 알코올이 여전히 존재하는 동안 TRAILPEG, contumumab(콘투무맙)(항-DR5 작용 항체) 및 맙투무맙(maptumumab)(항-DR4 작용 항체)의 다른 농도로 처리했을 때, TRAILPEG와 콘투무맙(contumumab)만이 농도 의존적으로 강한 세포자멸을 유도했다.
실시예 3에 기술된 바와 같이, 맙투무맙, 항-DR4 항체는 알코올-활성화된 PSC에서 어떠한 독성도 유도하지 않았다. 이 연구는 항-DR5 항진제 만이 활성화된 췌장 성상 세포에서 세포자멸을 유도함을 입증한다. 인간 TRAIL 및 TRIALPEG는 DR4 및 DR5에 모두 결합하지만, 항체는 DR4 또는 DR5에만 결합한다. 이러한 결과는 인간 TRAIL 유사체 및 항-DR5 작용성 항체가 췌장에서 상향 조절된 DR5를 표적으로 함으로써 췌장 섬유증, 통증 및 췌장염 치료에 유용함을 확인한다.
실시예 5 : PSC-통각 수용기-TGFβ 축에 대한 TRAIL 신호 전달의 항 침해 활성.
활성화된 PSC가 TGFβ를 상향 조절하는 것으로 나타났다(도 3b). 따라서, 활성화된 PSC는 TGFβ에 대한 지배적인 세포 공급원이 될 수 있으며 통증의 통각 과민성 증식에 중요한 역할을 할 수 있다.
재료 및 방법
체외에서 DRG(후부 신경절)의 감각 뉴런의 흥분성에 대한 활성화된 PSC의 영향을 분리 배양된 DRG를 배양-활성화된 PSC(7 일)로부터 얻은 배양 배지와 무균 배지(PSC-CM ). 이 흥분성은 Axopatch 200B 앰프로 전체 세포 패치-클램프 전기 생리학적 기록으로 액세스하고 Digidata 1200으로 디지털화했다.
결과
도 10a-10e에서 입증된 바와 같이, PSC-CM은 DRG로부터 유의하고 유사한 반응을 일으켰으며, 이는 PSC 활성화가 통각 수용기 민감화에서 결정적인 역할을 한다는 것을 나타낸다. TRAILPEG-치료는 만성 췌장염 모델에서 입증된 것과 같은 통증을 역전시켰다(도 16,보기 6). 따라서, 활성화된 PSC는 TRAILPEG에 의해 차단된 TGFβ의 생성 및 촉진된 통각 과민을 통해 통각 수용체를 감작시켰다.
실시예 6 : 항 섬유화 및 항 통증 CP 치료를 위한 TRAIL PEG 의 활용.
사멸 수용체가 항 섬유화 및 항진증 치료 및 진단을 위한 중요한 표적임을 확인하기 위해, 강력한 항 섬유화 항 진통제로서 TRAILPEG의 효능을 조사하였다. TRAILPEG는 급성(도 11)과 만성 췌장염(도 13a-15) 모두에서 강력한 항 섬유화 효과를 나타냈다. 그 항 통증 효능은 쥐 CP 모델에서 증명되었다(도 16). 이 연구는 전신 투여된 TRAILPEG가 동물 모델에서 급성 췌장염(AP)과 만성 췌장염(CP) 모두를 완화시키고 CP 모델에서 신체적으로 통용되는 통각 과민을 감소시키는 것으로 나타났다.
재료 및 방법
급성 췌장염(AP)은 쥐(220-240 g)에서 20 μg/kg 세룰레인을 매 시간 복강 내 주사하여 4 회 유도하고, 세룰레인의 마지막 주사 2 시간 후 PBS 또는 TRAILPEG(iv, 4 mg/kg, 단회 투여)로 치료했다. 2 개의 대조군을 셀레린없이 PBS 또는 TRAILPEG로 처리하였다. TRAILPEG 처리 후 24 시간 째에 AP 쥐를 희생시켰다.
실험용 알코올 유발성 만성 췌장염(CP) 모델을 쥐에서 유도하였다(Bertola, A., et al., Nat Protoc, 2013.8(3) : 627-637, Deng, X. J Pathol, 2005, 166(1) : 93-106). 도 12에 도시된 바와 같이, 4룹의 쥐(n = 8, 각 그룹)는 7 일 동안 0 내지 36 %의 점차적으로 증가된 EtOH 농도를 갖는 리버-데칼리(Lieber-Decarli(LD)) 액체 식이를 공급 받고, 이어서 6 주 동안 36 % EtOH를 공급하였다. 쥐를 14 일, 21 일, 28 일, 35 일 및 41 일에 세룰레인(4 시간마다 ip 주사)으로 처리하였다. TRAILPEG(4 mg/kg, iv) 또는 PBS(대조군)를 36 일부터 매일 7 일 동안 주사했다. 사료 중 알코올이 없는 대조군을 PBS 또는 TRAILPEG로 정맥 내 투여하였다.
본 프레인 필라멘트(VON Frey Filament(VFF)) 방법은 설치류의 통증 메커니즘 연구에 중요한 도구이다(Zhu et al., Mol Pain, 8:65(2012)). 43 일째 처리 후, 통풍 작용을 연구하기 위해 VFF 시험을 사용하였다. VFF 연구 후, 동물을 희생시키고 췌장 표본을 채취하여 IHC, qPCR 및 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 췌장 조직에서 히드록시프롤린(콜라겐 마커) 수준을 히드록시프롤린 분석 키트(Sigma)로 분석했다.
결과
H & E로 염색된 호중구(MPO)에 대해 면역 염색된 췌장 조직 사진은 PBS로 처리한 AP 군(Cer-PBS)과 비교했을 때, TRAILPEG(Cer-TRAIL)의 항 염증 효능을 입증했다. 정맥 내 TRAILPEG(Cer-TRAIL)은 세룰레인 유도된 AP 쥐(Cer-PBS)에서 급성 췌장염(AP)을 예방한다. 정량화된 결과는 도 11에 나와 있다.
CP 모델에서 췌장 섬유 형성은 콜라겐 및 α-SMA(활성화된 PSC 마커)(도 13a 및 13b) 및 다중 섬유 형성 마커(도 14a-14i)의 높은 발현에 의해 입증되었다. TRAILPEG 처리는 콜라겐 (Col1a2, Col3a1), TIMPs(메탈로프로테이나아제의 조직 억제제), 파이브로넥틴(fibronectin), Pap(췌장염 관련 단백질) 및 TGFβ를 포함한 다른 섬유화 및 췌장 마커뿐만 아니라 콜라겐 침착, α-SMA 및 PDGFRβ의 발현을 감소시켰다 도 14a-14i). 히드록시프롤린 수준은 CP 모델에서 매우 증가했다. TRAILPEG 처리는 췌장에서 히드록시프롤린 함량을 유의하게 감소시켰다(도 15). 분리된 카스파제-8은 TRAILPEG로 처리한 CP에서만 유의하게 상향 조절되었으며, 이는 활성화된 PSC의 박멸이 TRAIL 매개 세포자멸로 인한 것임을 나타낸다. 중요한 것은 췌장 조직의 이중 면역 주사(aPSCs-a-SMA 염색, 세포 자멸사-TUNEL 염색 및 핵-DAPI 염색)를 통해 α-SMA + aPSC에서 세포자멸(TUNEL 염색)이 특이적으로 발생했다는 것을 확인할 수 있었다. 예를 들어, TRAILPEG 처리는 무 처리 CP 쥐에 비해 간 손상의 유용한 제조사 인 ALT 수준을 상당히 정상화시켰다.
CP는 심하고 지속적인 복통을 동반한다. 놀랍게도, TRAILPEG는 CP 모델에서 항 침해 효과를 나타냈다. TRAILPEG는 에탄올/셀레 룰린/LD식이 유도 CP 쥐에서 신체적으로 통각 과민 통을 감소시켰다. TRAILPEG(4 mg/kg, i.v.) 처리 동물(n = 4)은 VFF 시험(도 16)에 의해 측정된 바와 같이 체세포성 통각 과민의 현저한 감소를 입증하였다. NGF(신경 성장 인자) 또는 TGFβ에 의한 DRG 뉴런의 치료는 흥분성의 변화를 유도하고 CP에서의 침해성 흥분성의 특징인 특정 전압 의존성 칼륨 전류(IA)를 억제한다는 것이 밝혀졌다(Zhu 등 예비 시험에서는 PSC가 활성화 과정에서 TGFβ를 상향 조절하고 aPSC에서 얻은 조건부 배양액(CM)이 혈청에 영향을 미친다는 사실이 확인되었다(Zhu et al., Mol Pain, 8:65(2012)). 활성화된 PSCs는 TGFβ를 상향 조절하고(도 3b) aPSC에서 얻은 조건화된 배양액(CM)은 DRG 뉴런의 흥분성에 영향을 미친다(도 10). 따라서 활성화된 PSC는 중요한 세포 유형이다. PSC 활성화가 통각 과민 증에 중요한 역할을 하기 때문에 이 기술은 PSC 활성화를 선택적으로 차단하거나 통증을 완화하여 통증을 완화시키는 새로운 방법을 의미한다. TGFβ 및 NGF(신경 성장 인자)에 대한 주요 세포 원천 중 하나인 활성화된 PSC를 사멸 수용체 작용제를 이용하여 활성화시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> The Johns Hopkins University Lee, Seulki Pomper, Martin G Park, Okyi Swierczewska, Magdalena Pasricha, Pankaj J <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PANCREATITIS AND PAIN WITH DEATH RECEPTOR AGONISTS <130> JHU C 13835 <150> 62/319,454 <151> 2016-04-07 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 2 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg 1 5 10 15 Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala 20 25 30 Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser 35 40 45 Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu 50 55 60 Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu 65 70 75 80 Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile 85 90 95 Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala 100 105 110 Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile 115 120 125 Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val 130 135 140 Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe 145 150 155 160 Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 165

Claims (21)

  1. 췌장염 또는 췌장 통증을 앓고 있거나 또는 췌장염 또는 췌장 통증을 앓고 있는 대상에게 사멸 수용체 작용제를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 췌장염 또는 췌장 통증 장애의 치료 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 사멸 수용체 작용제는 재조합 인간 종양 괴사 인자(TNF)-관련 세포자멸 유도 리간드(TRAIL) 단백질, TRAIL 유사체, PEG화된 TRAIL, 사멸 수용체(DR5) 작용제 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 작용제를 포함하는 것인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 사멸 수용체 작용제는 렉사투무맙(Lexatumumab), 티가투주맙(Tigatuzumab), 코나투무맙(Conatumumab), 드로지투맙(Drozitumab), HGSTR2J/KMTRS 및 LBY-135로 이루어진 군으로부터 선택된 DR5 작용제를 포함하는 것인 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 사멸 수용체 작용제가 TAS266 및 scTRAIL-RBD로 이루어진 군으로부터 선택된 다가 DR 작용제를 포함하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 항체가 전장 항체, 결합 작용을 보유하는 그의 기능적 단편, 인간화 항체, 이작용성 또는 키메라 항체 또는 이들의 조합인 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 작용제가 TRAIL 또는 폴리알킬렌 옥사이드로 변형된 TRAIL인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 폴리알킬렌 옥사이드가 5,000 내지 50,000 달톤의 분자량을 갖는 선형, 분지형, 이량체 또는 삼량체 폴리에틸렌 글리콜 인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    췌장염 또는 췌장 통증 장애가 췌장염 및 췌장 섬유증 관련 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 췌장염은 급성 췌장염 및 만성 췌장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    췌장 섬유증 관련 통증이 췌장염 관련 통증인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이 섬유증 관련 통증을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 환자를 확인하는 것을 더 포함하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    췌장염이 만성 췌장염인 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 주사, 비강 내, 폐, 또는 안내 내로 투여되는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    췌장 조직이 보호되고, 섬유 형성이 감소되고, 췌장 섬유 형성이 역전되고 및/또는 통증이 감소되고, 건강한 췌장 조직이 손상되지 않는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    췌장염 또는 췌장 통증을 치료하는 것은 통증을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    췌장염 또는 췌장 통증을 치료하는 단계는 췌장 섬유증을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    췌장염 또는 췌장 통증을 치료하는 단계는 췌장 염증을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유효량의 조성물을 필요로 하는 개인에게 1 일 1 회, 1 일 2 회, 1 일 3 회, 1 주 1 회, 2 회, 2 주 또는 1 회 1 회 투여하는 방법.
  19. 췌장염 또는 췌장 통증 치료용 유효량의 사멸 수용체 작용제를 포함하는 약학 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    제 2 치료학적, 예방적 또는 진단적 제제를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 단독으로 또는 제 2 치료제와 조합하여 사멸 수용체 작용제를 포함하는 조성물의 투약 단위를 포함하는 키트.
KR1020187032301A 2016-04-07 2017-04-07 사멸 수용체 작용제로써 췌장암 및 통증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 KR102508650B1 (ko)

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