JP2020511543A

JP2020511543A - 選択性ｔｎｆｒ１拮抗ペプチドｓｎ１０及び炎症性腸疾患におけるその使用

Info

Publication number: JP2020511543A
Application number: JP2020500944A
Authority: JP
Inventors: 一鳴陸; 海龍江; 瑩瑩卞; 潔王; 安李; 川張
Original assignee: Guilin Eight Plus One Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guilin Eight Plus One Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2020-04-16
Also published as: CN107056921B; EP3617224A4; WO2018171405A1; US20200277355A1; EP3617224A1; CN107056921A

Abstract

配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、ｍＰＥＧ２０００のカルボキシル基とＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のペプチド鎖のＮ端アスパラギン酸の遊離アミノ基との共有結合により選択的修飾を実現できる、マダラウミヘビのヘビ毒に由来する選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０が提供される。選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、炎症性腸疾患の治療に適用できる。【選択図】なし

Description

本発明は、生物医薬技術分野に関し、具体的には、マダラウミヘビ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｓｃｙａｎｏｃｉｎｃｔｕｓ）のヘビ毒に由来する選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及び炎症性腸疾患におけるその使用に関する。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、特発性、慢性、炎症性腸疾患であり、生涯にわたって再発する傾向があり、主にクローン病（ＣＤ）と潰瘍性結腸炎（ＵＣ）との２種類を含み、臨床症状が反復性慢性下痢、粘血便、腹痛、腹部腫瘤、腸閉塞、穿孔、体重減少などであり、悪性変化の恐れがある。ＩＢＤは、先進国、特に北アメリカ及びヨーロッパによく見られる疾患である。ヨーロッパ及び北アメリカにおいて、ＵＣの発生率は１０／１０^５−２０／１０^５、有病率は１００／１０^５−２００／１０^５に達し、ＣＤの発生率は５／１０^５−１０／１０^５、有病率は５０／１０^５−１００／１０^５に達している（文献：ＢｏｉｒｉｖａｎｔＭ，ＣｏｓｓｕＡ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＯｒａｌＤｉｓ．２０１２，１８（１）：１−１５．を参照）。近年、ＩＢＤの発生率は徐々に増加する傾向にあり、いくつかの病院症例の統計に基づいて、ＵＣ及びＣＤの有病率は、それぞれ少なくとも１１．６／１０^５及び１．４／１０^５である。現在、この疾患は、消化器系の一般的な疾患及び慢性下痢の主な原因となっており、患者は、ほとんど青壮年であり、社会の生産性と個人の生活の質に大きな影響を与え、大きな注目を集めているが、未だにこの疾患を治療するための方法や薬がない。

ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）は、多数の生物学的活性を有するサイトカインであり、免疫調節、炎症、感染性ショック、アポトーシス及び自己免疫などの生理的および病理学的過程に関与する。ＴＮＦ−α与慢性関節リウマチ、潰瘍性結腸炎、喘息、糖尿病などの多種の炎症性疾患および自己免疫疾患に関連している。研究によると、活動期潰瘍性結腸炎の患者において、ＴＮＦ−αの陽性発現は高くなり、炎症性媒体として結腸粘膜の病理学的損傷を媒介することができること、及びＴＮＦ−αの増加は病変の程度および病変の重症度に関連していることが明らかになった（文献：ＭｕｒｃｈＳＨ，ＢｒａｅｇｇｅｒＣＰ，Ｗａｌｋｅｒ−ＳｍｉｔｈＪＡ，ＭａｃＤｏｎａｌｄＴＴ．Ｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌｐｈａｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎｃｈｒｏｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｇｕｔ，１９９３，３４：１７０５−１７０９．を参照）。

ＴＮＦ−α関連疾患を治療するために現在使用されているいくつかのモノクローナル抗体医薬品は、症状を軽減するのに非常に有効である。しかし、このような抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体医薬品は、ＴＮＦ−αの生物学的機能を完全に遮断するため、生体の免疫自己安定機能及び免疫監視機能に影響を与え、多くの患者には、結核感染症、新しい自己免疫疾患、さらに腫瘍などの有毒な副作用をもたらす。ＴＮＦ−αは、ＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２の２種類の受容体に作用する。疾患の病因についての詳細な研究に伴い、より多くの研究は現在治療の標的をＴＮＦＲに変えている。一般的に言えば、抗炎症の観点から、ＴＮＦＲ１は主に炎症誘発性シグナルおよびアポトーシスシグナルを伝達するため、ＴＮＦＲ１伝達のシグナル伝達経路を選択的に遮断することによってＴＮＦ−αの生物学的機能を遮断することは、このような薬物の開発の焦点となっている。ＴＮＦＲ１を選択的に拮抗するＩＢＤ治療薬についての報告は未だにない。

中国特許ＣＮ１０３０３０６８７Ａには、ＳＮ１はＴＮＦ−α関連疾患を治療できることが開示されており、また、ＳＮ１は結腸炎を治療できることが開示されており、デキストラン硫酸ナトリウム誘発マウス結腸炎モデル（本発明の実施例５と同様）が挙げられている。しかし、ＳＮ１（２２ＡＡ）は、標的特異的ではなく、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２に結合することができ、そのうち、ＴＮＦＲ１との結合能が最も大きく、約３２μＭである。それに対し、ＳＮ１０（１０ＡＡ）は、標的特異的であり、選択性を有し、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ２に結合せず、ＴＮＦＲ１のみに結合し、ＴＮＦＲ１との結合能は約２．８μＭであり、ＴＮＦＲ１とＴＮＦ−αとの結合を競合的に阻害することができる。本発明は、それぞれデキストラン硫酸ナトリウム誘発マウス結腸炎モデル及びオキサゾロン誘発マウス結腸炎モデルにより、ＳＮ１０が炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性結腸炎）を治療する用途を有することを証明する。

本発明は、マダラウミヘビのヘビ毒に由来する選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及び炎症性腸疾患におけるその使用を提供することを目的とする。また、本発明のその他の目的は、ｍＰＥＧ２０００（モノメトキシポリエチレングリコール２０００）により修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、即ちＰＥＧ−ＳＮ１０の炎症性腸疾患における使用を提供することである。

本発明者らは、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１（２２ＡＡ）を切断してＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０（１０ＡＡ）を得、表面プラズモン共鳴技術（ＳＰＲ）によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０（１０ＡＡ）がＴＮＦＲ１に結合することができ、結合能が約Ｋ_Ｄ＝２．８μＭであり、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１とＴＮＦＲ１の結合能（Ｋ_Ｄ＝３２μＭ）よりも高いことが高いことを発見した（江海龍、中国人民解放軍第二軍医大学２０１５年修士論文「ウミヘビのヘビ毒の抗炎症活性ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１の構造最適化と抗炎症メカニズムの研究」）。動物モデルの結果により、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、一定の抗炎症活性を有することを示しているが、ＴＮＦＲ１を選択的に拮抗できるか否か、ＴＮＦＲ１とＴＮＦ−αの結合を競合的に阻害できるか否かが不明である。

本発明では、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０についてされに研究したところ、表面プラズモン共鳴技術（ＳＰＲ）、マイクロスケール熱泳動技術（ＭＳＴ）の結果により、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、標的特的であり、ＴＮＦＲ１に直接作用することができ、ＴＮＦＲ１との結合能が約２．８μＭであり、且つＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ２に結合せず、ＴＮＦＲ１のみに結合し、選択性を有し、ＴＮＦＲ１とＴＮＦ−αの相互作用を競合的に阻害することができ、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドであり、また、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、炎症性腸疾患動物モデル（デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス結腸炎モデル及びオキサゾロン（ＯＸＺ）誘発マウス結腸炎モデル）のいずれに対しても顕著な抗炎症活性を有することが示されており、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性結腸炎）の治療用途を有することが証明されている。

ＰＥＧ修飾ＰＥＧ−ＳＮ１０の製造に用いられる修飾剤ｍＰＥＧ２０００（モノメトキシポリエチレングリコール）は、平均分子量が２０００であり、構造式がＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは重合度を示す）である。前記ｍＰＥＧ２０００のカルボキシル基は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のペプチド鎖のＮ端にあるアスパラギン酸の遊離アミノ基に共有結合してアミド結合が形成されることにより、ＰＥＧ−ＳＮ１０修飾ペプチドが得られる。デキストラン硫酸ナトリウム及びオキサゾロン誘発マウス急性結腸炎モデルの抗炎症効果を研究することにより、ＰＥＧ−ＳＮ１０はマウス結腸組織における炎症性因子の発現を阻害し、局所の炎症性症状や徴候を効果的に緩和することができ、ＩＢＤに対して治療作用を有することが証明されている。

本発明の第１態様によれば、アミノ酸配列が配列番号２に示される選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０が提供される。

前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の合成方法は、固相合成法によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を合成することであり、ＨＰＬＣ及びＭＳにより分析した結果、前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の分子量は１２５０．２９ダルトン、等電点は４．３９である。

本発明の第２態様によれば、ヌクレオチド配列が配列番号１に示される選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のコーディング遺伝子が提供される。

本発明の第３態様によれば、炎症性腸疾患の治療薬の製造における前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の使用が提供される。

好ましくは、前記炎症性腸疾患の治療薬は、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又は選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である。

本発明の第４態様によれば、ｍＰＥＧ２０００（モノメトキシポリエチレングリコール２０００）により修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、即ちＰＥＧ−ＳＮ１０が提供される。前記ｍＰＥＧ２０００のカルボキシル基は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のペプチド鎖のＮ端にあるアスパラギン酸の遊離アミノ基に共有結合する。平均分子量が約２０００ダルトンのｍＰＥＧ（モノメトキシポリエチレングリコール）によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を修飾することにより、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の半減期及び安定性が向上する。前記ｍＰＥＧ２０００の構造式は、ＣＨ_３Ｏ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＯＯＨであり、前記ｎは重合度を示し、ｎ＝３５〜４５であり、その平均分子量は２０００ダルトンである。

本発明の第５態様によれば、炎症性腸疾患の治療薬の製造における前記ｍＰＥＧ２０００により修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＰＥＧ−ＳＮ１０の使用が提供される。

好ましくは、前記炎症性腸疾患の治療薬は、ＰＥＧ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又はＰＥＧ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である。

好ましくは、前記医薬組成物及び薬剤学的に許容される添加剤を用いて医薬製剤を製造する。前記的医薬製剤は、錠剤、顆粒剤、分散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、滴丸剤（ｄｒｉｐｐｉｎｇｐｉｌｌ）、注射剤、粉末注射剤又はエアロゾル剤などである。

好ましくは、前記炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性結腸炎（ＵＣ）を含む。

好ましくは、前記炎症性腸疾患の治療薬は、ＴＮＦＲ１を選択的に拮抗する。

本発明によれば、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の炎症性腸疾患の治療における使用、並びに炎症性腸疾患の有効な治療薬が提供される。

Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のＨＰＬＣ分析結果である。Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のＭＳ分析結果である。ＢＩＡｃｏｒｅ（ＳＰＲ技術）によるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析を示す。図３Ａは、ＳＮ１０とＴＮＦＲ１の相互作用を示し、結合解離定数ＫＤ値は約２．８μＭである。図３Ｂは、ＳＮ１０とＴＮＦ−αとが結合しないことを示す。図３Ｃは、ＴＮＦ−α−ＴＮＦＲ１結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦＲ１がチップ上にある）。図３Ｄは、ＴＮＦ−α−ＴＮＦＲ１結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦ−αがチップ上にある）。図３Ｅは、ＴＮＦ−α−ＴＮＦＲ２結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す。ＭＳＴ技術によるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析ことを示す。図４Ａは、ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との相互作用を示し、結合解離定数ＫＤ値が約２．８μＭである。図４Ｂは、ＳＮ１０とＴＮＦ−αとが結合しないことを示す。図４Ｃは、ＳＮ１０とＴＮＦＲ２とが結合しないことを示す。図４Ｄは、ＴＮＦＲ１−ＴＮＦ−α結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦＲ１蛍光マーカー）。図４Ｅは、ＴＮＦＲ１−ＴＮＦ−α結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦ−α蛍光マーカー）。図４Ｆは、ＴＮＦＲ２−ＴＮＦ−α結合に対するＳＮ１０の競合阻害作用を示す（ＴＮＦＲ２蛍光マーカー）。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの体重に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＤＳＳ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの疾患活動性指数に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＤＳＳ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの結腸長さに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＤＳＳ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの脾臓指数に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＤＳＳ誘発マウス急性結腸炎モデルおけるマウスの結腸組織中のミエロペルオキシダーゼの活性に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＤＳＳ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの血清中の炎症性因子の発現レベルに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。図１０Ａは、マウス血清中のＴＮＦ−αの発現状況を示す。図１０Ｂは、マウス血清中のＩＬ−６の発現状況を示す。図１０Ｃ、マウス血清中のＩＬ−１βの発現状況を示す。図１０Ｄは、マウス血清中のＩＦＮ−γの発現状況を示す。図１０Ｅは、マウス血清中のＩＬ−１０の発現状況を示す。組織切片をＨＥ染色した光学顕微鏡写真（２００倍）であり、ＤＳＳ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの結腸組織の病理学的損傷に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。組織切片の光学顕微鏡写真（１００倍）であり、ＤＳＳ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの結腸組織のＴＮＦ−α発現レベルに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。オキサゾロン（ＯＸＺ）誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの体重に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＯＸＺ誘発マウス急性結腸炎モデルの疾患活動性指数に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＯＸＺ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの結腸長さに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＯＸＺ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの脾臓指数に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＯＸＺ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの結腸組織中のミエロペルオキシダーゼ活性に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。ＯＸＺ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウス血清中の炎症性因子の発現レベルに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。図１８Ａは、マウス血清中のＴＮＦ−αの発現状況を示す。図１８Ｂは、マウス血清中のＩＬ−６の発現状況を示す。図１８Ｃは、マウス血清中のＩＬ−１βの発現状況を示す。図１８Ｄは、マウス血清中のＩＦＮ−γの発現状況を示す。図１８Ｅは、マウス血清中のＩＬ−１０の発現状況を示す。組織切片をＨＥ染色した光学顕微鏡写真（２００倍）であり、ＯＸＺ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの結腸組織の病理学的損傷に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。組織切片の光学顕微鏡写真（１００倍）であり、ＯＸＺ誘発マウス急性結腸炎モデルにおけるマウスの結腸組織のＴＮＦ−α発現レベルに対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の影響を示す。

以下、実施例により本発明の具体的な実施形態を詳しく説明する。

以下の実施例中の実験方法は、特に明記しない限り、通常の方法である。

実施例１で製造されるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を用いて実施例２−１０の実験を行う。以下の実施例で用いられるＰＥＧ−ＳＮ１０は、強耀生物科技有限公司によって合成されたものであり、ＨＰＬＣにより検出した純度は９８％以上である。

（実施例１）
選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の合成及び検出
ポリペプチド固相合成技術によりＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を合成し、ＨＰＬＣ（図１）及びＭＳ（図２）によりその純度及び分子量を分析した結果、純度＞９７％、分子量１２５０．２９ｇ／ｍｏｌであった。

（実施例２）
ＢＩＡｃｏｒｅによるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析
１、ベースラインレベルに達するまで、泳動用緩衝液を１０μｌ／ｍｉｎの流速でＣＭ−５センシングチップに設けられたチャンネルに通過させた。
２、機器推奨緩衝液によりチップの各チャンネルの表面反応基を活性化した。
３、ＥＰ緩衝液でＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２の凍結乾燥粉末を溶解し、チップの表面に包まれるように一定の濃度で試料を注入し、さらに、１ｍｏｌ／Ｌのエタノールアミンでチップをブロックした。なお、適切な再生条件を選択するために、動力学曲線を測定する前に再生条件をテストする必要がある。
４、ベースラインが安定した後、一連の濃度のポリペプチドを注入し、中間濃度のポリペプチドを１回注射し、各濃度の応答値を記録した。

図３に示すように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、ＴＮＦＲ１と直接作用することができ、ＴＮＦＲ１との結合能が約２．８μＭであり、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦ−αが結合せず、ＴＮＦＲ１とＴＮＦ−αとの相互作用を競合的に阻害することができる。

（実施例３）
ＭＳＴによるＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦＲ１との結合能の分析
１、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２との相互作用
１：１の希釈比率で一連のグラジエント濃度のＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を調製し、蛍光マーカーＴＮＦ−α／ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２２００ｎＭとＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０とを等体積で均一に混合した後、暗所で３０分間インキュベートし、次いで、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、相対蛍光値の時間軌跡及び熱泳動（Ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の用量反応曲線を観察し、ソフトウェアＮＴＡｆｆｉｎｉｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｖ２．０．２によりシミュレートして親和性Ｋ_Ｄ値を計算し、特異的結合の傾向があるか否かを判断した。

２、ＴＮＦ−αとのＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２との結合に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の競合阻害作用
１：１の希釈比率で一連のグラジエント濃度のＴＮＦ−αを調製し、蛍光マーカーＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２（２００ｎＭ）とＴＮＦ−αとを等体積で均一に混合した後、暗所で３０分間インキュベートし、次いで、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、ソフトウェアによりシミュレートして陽性対照ＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２及びＴＮＦ−αのＫ_Ｄ値を求め、４００ｎＭのＴＮＦＲ１と４００μＭのＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を等体積で混合した後、さらに一連の濃度のＴＮＦ−αと等体積で混合し、３０分間インキュベートした後、毛細管で適量のサンプルを取って検出し、ソフトウェアによりシミュレートしてＫ_Ｄ値を求めた。Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０添加前後のＴＮＦ−α飽和濃度、応答値振幅及び親和性定数Ｋ_Ｄ値の変化を比較した。

３、ＴＮＦ−αとＴＮＦＲ１／ＴＮＦＲ２との結合に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の競合阻害作用（方法は前記２と同じ）
図４に示すように、ＭＳＴ実験の結果から分かるように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０は、標的特異的であり、ＴＮＦＲ１と直接相互作用することができ、ＴＮＦＲ１との結合能が約２．８μＭであり、ＴＮＦ−α、ＴＮＦＲ２に結合せず、ＴＮＦＲ１のみに結合し、選択性を有し、ＴＮＦＲ１とＴＮＦ−αとの相互作用を競合的に阻害することができる。

（実施例４）
ＳＤラット体内のＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の血漿半減期の検出。
Ｇｅｎｚｙｍｅ社から購入したＥＬＩＳＡキットを用いて、製品説明書に従って測定した。ヘパリンで処理した５０μＬ毛細管により後眼窩から血清サンプルを採取し、処理後の１ｍｉｎ、２ｍｉｎ、３ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈに血液サンプルを収集した。２時間静置した後、サンプルを遠心分離し、得られた上澄みを検出のために−２０℃で貯蔵した。

表１に示すように、ＰＥＧで修飾したＰＥＧ−ＳＮ１０の血漿半減期は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の血漿半減期よりも長くなった。

（実施例５）
デキストラン硫酸ナトリウム誘発マウス急性結腸炎に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の作用
６−８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを１０匹／群でランダムに８群に分けた。正常群（ｎｏｒｍａｌ）に処理をしなかった。モデル群（ｍｏｄｅｌ）について、マウスの飲水に２．５％（ｗ／ｖ）のＤＳＳ（市販、ＭＰ社から購入、ＭＷ：３６，０００−５０，０００）を加え、結腸炎を誘発するためにモデルを７日間構築した。残りの群について、モデルを構築すると同時に、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０ペプチド及びＰＥＧ−ＳＮ１０ペプチド（４００μｇ／ｋｇ／ｄ）を腹腔内注射した（陰性対照群：ランダムペプチド群（４００μｇ／ｋｇ／ｄ））；陽性対照群：スルファサラジン（ＳＡＳＰ、４００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）及びインフリキシマブ（ＩＦＸ、５ｍｇ／ｋｇ／ｄ））。各群マウスの体重変化を毎日記録した（図５）。Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、結腸炎による体重減少を効果的に抑制できることが分かった。表２に従って疾患活動性指数（ＤＡＩ）の採点を行い、結果を図６に示す。Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、結腸炎マウスの下痢、便血症状を効果的に抑制することができる。モデル構築の７日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、マウスの完全な結腸及び脾臓を取り出したところ、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０はマウスの結腸長さを顕著に改善できることを発見した（図７）。脾臓重量を測定し、脾臓指数を計算したところ、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、結腸炎による脾臓変化を効果的に抑制できることを発見した（図８）。マウス結腸組織のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を検出したところ、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、マウス病変結腸組織中のＭＰＯの活性を顕著に低下できることを発見した（図９）；マウス血液を採取した後、２時間静置２し、上澄みを取って炎症性因子の検出を行なったところ、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、治療群のマウス血清中の炎症誘発因子ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γの含有量を顕著に低減させ、炎症抑制因子ＩＬ−１０の含有量が顕著に高くなることを発見した（図１０）。結腸末端組織を取り、１０％ホルマリンで固定し、組織切片をＨＥ染色した後、結腸変化を観察したところ、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、ＤＳＳによる結腸病変を顕著に抑制できることを発見した（図１１）。マウス結腸の組織切片中のＴＮＦ−α発現量を観察したところ、同様にＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０はマウス結腸組織の炎症程度を減軽できることを発見した（図１２）。

上記結果から明らかであるように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、ＤＳＳ誘発結腸炎動物モデルを効果的に治療することができる。

（実施例６）
オキサゾロン誘発マウス急性結腸炎に対するＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０の作用
オキサゾロン誘発マウス結腸炎動物モデルの構築
６−８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを１０匹／群でランダムに８群に分けた。１日目に、マウスの背中皮膚（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）を剃毛し、正常群について皮膚に０．１５ｍＬのアセトン／オリーブオイル溶液（アセトン／オリーブオイルの体積比は４：１）を塗り、モデル群、ＳＮ１０群の陰性対照薬群及び陽性対照薬群について皮膚に０．１５ｍＬの３％（ｗ／ｖ）オキサゾロン（アセトン／オリーブオイル溶液に溶解）を塗り、皮膚前感作を行なった。８日目に、４％の抱水クロラールを腹腔内注射することでマウスを麻酔した後、３．５Ｆのカテーテルをゆっくりと肛門からマウス結腸内に約４ｃｍ挿入し、正常群に０．１ｍＬの５０％エタノールを注入し、他の群に０．１ｍＬの１％（ｗ／ｖ）オキサゾロン（５０％のエタノールに溶解）を注入した後、カテーテルをゆっくり引き抜き、薬液が腸管腔内に十分に残るように、マウスを垂直で頭が下に向く姿勢に６０秒保持した。浣腸後、正常群及びモデル群のマウスに０．１ｍＬの生理食塩水を腹腔内注射し、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０群、ＰＥＧ−ＳＮ１０群及びランダムペプチド群にそれぞれ０．１ｍＬのＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０及びランダムペプチド（生理食塩水に溶解）を腹腔内注射し、容量はいずれも４００ｕｇ／ｋｇ／ｄであり、陽性薬群についてそれぞれ０．１ｍＬスルファサラジン（強制経口）及びインフリキシマブ（生理食塩水に溶解）（腹腔内注射）を投与し、容量は、それぞれ４００ｍｇ／ｋｇ／ｄ及び５ｍｇ／ｋｇ／ｄであり、両方とも３日間連続投与した。

浣腸後、マウスの体重変化、大便の性状及び便血状況を毎日観察し、記録した。マウスの体重変化を図１３に示す。結果は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０は、結腸炎マウスの体重減少を効果的に低減することができる。表２に従って疾患活動性指数（ＤＡＩ）の採点を行なった結果（図１４）、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０、ＰＥＧ−ＳＮ１０は、結腸炎マウスの下痢及び便血の症状を効果的に緩和することができる。

浣腸後の３日目に、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させた直後、開腹して結腸及び脾臓を取り出し、結腸の長さを測定した。図１５に示すように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、マウス結腸の長さを顕著に改善することができる。脾臓の重量を計量し、脾臓指数＝１０×脾臓重量（ｇ）／体重（ｇ）を計算した。図１６に示すように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、マウスの脾臓指数を顕著に低下させることができる。

病変結腸組織の一部を切り取って重量を計量し、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）測定キット（南京建成生物工程研究所）を用いてマウス結腸組織中のＭＰＯ活性を検出した。ＭＰＯは、好中球の機能的マーカーおよび活性化マーカーであり、炎症反応を調節する多くの過程に関与する。しかし、ＭＰＯ活性が高すぎると、反応を触媒することで過剰の酸化剤が生成し、局所的な酸化ストレスと酸化的組織損傷を引き起こす。図１７に示すように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、炎症結腸組織中のＭＰＯ活性の増加を効果的に抑制することができる。

図１８に示すように、マウス血清を取り、炎症性因子を検出したところ、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、治療群のマウス血清中の炎症誘発因子を干渉することにより、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γの含有量が顕著に低下した一方、炎症抑制因子ＩＬ−１０が顕著に増加した。

生理食塩水でマウス結腸を洗浄し、末端結腸組織を取り、１０％ホルマリン中に浸漬して固定し、組織切片を作製し、ＨＥ染色を行なった。図１９に示すように、モデル群の結腸組織には、広範囲な炎症細胞浸潤が観察され、杯細胞が減少し、腺体密度が低下するが、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、マウス結腸組織の病理学的変化を顕著に減軽することができる。

図２０に示すように、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０群及びＰＥＧ−ＳＮ１０群のマウス結腸組織切片中のＴＮＦ−αの発現量は顕著に減少し、この結果は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０がマウス結腸組織の炎症の程度を減軽できることを示している。

以上の結果は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０及びＰＥＧ−ＳＮ１０は、オキサゾロン誘発マウス結腸炎動物モデルを効果的に治療できることを示している。

以上本発明の好適な実施例を具体的に説明したが、本発明は、これらの実施例に限定されない。当業者は、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で、多種の同等の変形又は置換を行うことができ、これらの同等の変形又は置換は、全て本発明の特許請求の範囲に含まれる。

Claims

炎症性腸疾患の治療薬の製造における選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の使用であって、
前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のコーディング遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のアミノ酸配列は、配列番号２に示される、使用。
前記選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０の分子量は１２５０．２９ダルトンである、請求項１に記載の使用。
前記炎症性腸疾患は、クローン病及び潰瘍性結腸炎を含み、
前記炎症性腸疾患の治療薬は、ＴＮＦＲ１を選択的に拮抗する、請求項１に記載の使用。
前記炎症性腸疾患の治療薬は、選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又は選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＨｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である、請求項１に記載の使用。
ｍＰＥＧ２０００によって修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＰＥＧ−ＳＮ１０であって、
前記ｍＰＥＧ２０００のカルボキシル基は、Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のペプチド鎖のＮ端にあるアスパラギン酸の遊離アミノ基に共有結合し、
前記Ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｎ−ＳＮ１０のアミノ酸配列は、配列番号２に示される、ｍＰＥＧ２０００によって修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＰＥＧ−ＳＮ１０。
前記ｍＰＥＧ２０００の平均分子量は２０００ダルトンである、請求項５に記載のｍＰＥＧ２０００によって修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＰＥＧ−ＳＮ１０。
炎症性腸疾患の治療薬の製造における、請求項５又は６に記載のｍＰＥＧ２０００によって修飾された選択性ＴＮＦＲ１拮抗ペプチドＰＥＧ−ＳＮ１０の使用。
前記炎症性腸疾患の治療薬は、ＰＥＧ−ＳＮ１０を唯一の活性成分とするか、又はＰＥＧ−ＳＮ１０を含む医薬組成物である、請求項７に記載の使用。
前記医薬組成物及び薬剤学的に許容される添加剤を用いて医薬製剤を製造する、請求項４又は８に記載の使用。
前記医薬製剤は、錠剤、顆粒剤、分散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、滴丸剤、注射剤、粉末注射剤又はエアロゾル剤である、請求項９に記載の使用。