Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN102119175A - 采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法 - Google Patents

采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102119175A
CN102119175A CN2009801150535A CN200980115053A CN102119175A CN 102119175 A CN102119175 A CN 102119175A CN 2009801150535 A CN2009801150535 A CN 2009801150535A CN 200980115053 A CN200980115053 A CN 200980115053A CN 102119175 A CN102119175 A CN 102119175A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cytokine
ifn
mab
ddd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801150535A
Other languages
English (en)
Inventor
张健行
大卫·M·哥德伯格
埃德蒙·A·罗斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IBC Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
IBC Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US12/396,965 external-priority patent/US7871622B2/en
Priority claimed from US12/396,605 external-priority patent/US7858070B2/en
Application filed by IBC Pharmaceuticals Inc filed Critical IBC Pharmaceuticals Inc
Publication of CN102119175A publication Critical patent/CN102119175A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

本发明涉及使用停靠与锁技术生成细胞因子-抗体复合物的方法和组合物。在优选实施方案中，该细胞因子-MAb DNL复合物包含一个附加在两个AD(锚定结构域)部分上的IgG抗体，和分别附加在一个DDD(停靠和二聚化结构域)部分上的四个细胞因子。该DDD部分形成结合于AD部分的二聚体，所得到DDD比AD的比例为2∶1。该细胞因子-MAb复合物表现出增强的药物动力学，相对于裸的细胞因子或聚乙二醇化的细胞因子有显著增长的血清半衰期。相对于单独的细胞因子、单独的抗体、未轭合的细胞因子加上抗体或者合并有不相关抗体的细胞因子-MAbDNL复合物，该细胞因子-MAb复合物也在体内与体外表现出显著增强的效力。尽管其他抗体和细胞因子已被用于生成DNL复合物，最优选地，该复合物包涵轭合于四个IFN-α2b部分的抗-CD20IgG抗体。

Description

采用停靠与锁(DNL)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法
相关申请
根据35U.S.C.119(e)的规定，本申请要求2008年4月10日提交的第61/043,932号、2008年10月13日提交的第61/104,916号、和2008年12月3日提交的第61/119,542号美国临时专利申请的优先权。本申请为2009年3月3日提交的第12/396,965号美国专利申请的部分继续申请，第12/396,965号美国专利申请为2006年3月28日提交的USSN第11/391,584号；2006年3月24日提交的USSN第11/389,358号；2006年6月29日提交的USSN第11/478,021号；2009年3月3日提交的USSN第12/396,605号，其为2006年12月5日提交的第11/633,729号专利申请的分案申请；2007年5月8日提交的第11/745,692号专利申请；以及2007年10月26日提交的USSN第11/925,408号的分案申请。根据35U.S.C.119(e)的规定，以上申请要求2005年4月6日提交的第60/668,603号美国临时专利申请；2005年10月20日提交的第60/728,292号美国临时专利申请，2005年12月16日提交的第60/751,196号美国临时专利申请，2006年3月14日提交的第60/782,332号美国临时专利申请，2006年5月15日提交的第60/800,342号美国临时专利申请；2006年11月6日提交的第60/864,530号美国临时专利申请的权益。每个优先权申请的全部内容均通过引用并入本文。
背景
发明领域
本发明涉及保留体外活性并表现出增强的体内效力的多聚细胞因子的设计和生成。通过将基于细胞因子的DDD部分与重组IgG进行位点特异性轭合，使用停靠与锁(dock-and-lock，DNL)方法生成锚定于人源化单克隆抗体(MAb)的四聚细胞因子，其中该抗体两条重链中的每条重链与一个AD部分融合，并且该DDD部分二聚体与每个AD部分结合。在优选的实施方案中，人源化抗-CD20MAb(hA20)与干扰素-α2b(IFNα2b)轭合生成包涵四个拷贝的IFNα2b的20-2b DNL构建物。该细胞因子-MAb构建物可用于治疗多种疾病状态，并且相对于单独的母体MAb、单独的细胞因子、未轭合的MAb与细胞因子的组合、以及轭合在对照MAb上的细胞因子，表现出针对靶标细胞比如肿瘤细胞更大的效力。
背景技术
据报道干扰素-α(IFNα)在动物癌症模型(Ferrantini等，1994，J Immunol153：4604-15)和人类癌症患者(Gutterman等，1980，Ann Intern Med93：399-406)中均具有抗肿瘤活性。IFNα可发挥多种直接的抗肿瘤效应，包括下调癌基因，上调肿瘤抑制子基因，通过增加肿瘤表面MHC I类蛋白的表达而增强免疫识别，加强凋亡，以及对化疗剂的增敏(Gutterman等，1994，PNAS USA 91：1198-205；Matarrese等，2002，Am J Pathol160：1507-20；Mecchia等，2000，Gene Ther 7：167-79；Sabaawy等，1999，Int J Oncol 14：1143-51；Takaoka等2003，Nature 424：516-23)。对于一些肿瘤，IFNα可通过活化STAT1而具有直接和有效的抗增殖效应(Grimley等，1998Blood 91：3017-27)。间接地，IFNα可抑制血管生成(Sidky和Borden，1987，Cancer Res 47：5155-61)以及刺激宿主免疫细胞，其可能对整体抗肿瘤反应至关重要但却已在很大程度上被低估(Belardelli等，1996，ImmunolToday 17：369-72)。IFNα通过对骨髓细胞(Raefsky等1985，J Immunol135：2507-12；Luft等1998，J Immunol 161：1947-53)、T细胞(Carrero等2006，J Exp Med 203：933-40；Pilling等，1999，Eur J Immuol 29：1041-50)、和B细胞(Le等2001，Immunity 14：461-70)的作用而对免疫反应具有多效性影响。作为先天性免疫系统的重要调节剂，IFNα诱导树突细胞的快速分化和活化(Belardelli等2004，Cancer Res 64：6827-30；Paquette等，1998，J Leukoc biol 64：358-67；Santini等，2000，J Exp med 191：1777-88)并增强细胞毒性、迁移、细胞因子生成以及NK细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Biron等，1999，Annu Rev Immunol 17：189-220；Brunda等1984，Cancer Res 44：597-601)。
将IFNα用作癌症疗法的期望主要因为其短暂的循环半衰期和系统毒性而受到阻碍。聚乙二醇化形式的IFNα2表现出增长的循环时间，从而增加其生物效力(Harris和Chess，2003，Nat Rev Drug Discov 2：214-21；Osborn等，2002，J Pharmacol Exp Ther 303：540-8)。将IFNα融合到单克隆体(MAb)上可提供与聚乙二醇化相似的益处，包括降低肾清除，增强可溶性和稳定性，和显著增加的循环半衰期。其即时的临床上的益处为需要更小给药频率和更少剂量，允许了延长的治疗浓度。使用肿瘤相关抗原(TAA)的MAb将IFNα靶向定位到肿瘤上可在限制其系统浓度的同时显著增加其肿瘤堆积和滞留，从而增加其治疗指数。IFNα的肿瘤浓度的增加可以增强其直接抗增殖、凋亡和抗血管生成的活性，并可初免和集中(primeand focus)自身免疫性反应。事实上，在小鼠的研究中使用同源鼠IFNα-分泌转基因肿瘤证实了由局部集中IFNα引起的增强的免疫反应(Ferrantini等，2007，Biochimie 89：884-93)。
CD20为使用MAb-IFNα作为B细胞淋巴瘤治疗的一种具有吸引力的候选TAA。结合使用利妥昔单抗(rituximab)的抗CD20免疫疗法为针对淋巴瘤的最成功的疗法之一，具有相对低的毒性(McLaughlin等，1998，J Clin Oncol 16：2825-33)。由于利妥昔单抗是嵌合抗体，在一些患者群体中可表现出免疫原性并在初始给药时需要相当长输注时间(Cheson等，2008，NEJM 359：613-26)，一种对CD20靶向的更好的候选物为人源化的MAb：veltuzumab(Stein等，2004，Clin Cancer Res 10：2868-78)。
现阶段处于临床评估的利妥昔单抗和IFNα联合疗法已显示出比只用利妥昔单抗更强的效力(Kimby等，2008，Leuk Lymphoma 49：102-12；Salles等，2008，Blood 112：4824-31)。所述研究已证实该联合疗法的一些益处和与IFNα相关的不足。除了每周输注利妥昔单抗，通常在几个月内每周三次给患者施用IFNα，患者将忍受为IFNα疗法相关的常见副作用的类似流感的症状，并因此限制其耐受剂量。抗CD20MAb-IFNα轭合物可以允许以较低剂量较不频繁地施用单独药剂，限制或消除副作用，并可导致更优越的效力。
本领域存在对表现出增强的体内效力、降低的毒性和更优的药物动力学性质的改良的抗体-细胞因子轭合物的需要。
发明概述
本发明公开了使用停靠与锁(DNL)方法(Chang等，2007，Clin CancerRes 13：5586s-91s)制备细胞因子和抗体轭合物的方法和组合物，其生成适于体内应用的稳定并确定的轭合物。在优选实施方案中，该DNL复合物包含四个拷贝的细胞因子，比如IFNα2b，其分别附加在二聚化和停靠结构域(DDD)部分上。该DDD部分自发地二聚化，并且每个DDD二聚体与一个锚定结构域(AD部分)结合。在更优选的实施方案中，AD部分附加于IgG抗体每条重链恒定区的C末端，得到四聚的细胞因子-IgG DNL复合物。
然而，本领域技术人员将会认识到，可在所要求保护的方法和组合物的范畴内构建和使用其他类型的具有不同结构和不同细胞因子对抗体或抗体片段比例的DNL复合物，比如2009年3月3日提交的第12/396,965号美国专利申请；2006年3月24日提交的第11/389,358号USSN；2006年3月28日提交的第11/391,584号USSN；2006年6月28日提交的第11/478,021号USSN；2009年3月3日提交的第12/396,605号USSN；2006年12月5日提交的第11/633,729号USSN；和2007年10月26日提交的第11/925,408号USSN中所公布的内容，其每个实施例部分均通过引用并入本文。方便起见，所感兴趣的DNL构建物在本文中一般称为细胞因子-MAb构建物。然而，本领域技术人员将会认识到，名称“MAb”用作通用术语来表明抗体或其抗原结合片段的存在。
本领域技术人员也将进一步认识到，任何已知抗体或其抗原结合片段可被合并入细胞因子-MAb DNL构建物。在优选的实施方案中，该复合物可用于癌症治疗，并且该抗体与肿瘤相关抗原(TAA)结合。本领域中已知多种肿瘤相关抗原，包括但不限于碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤维连接蛋白的ED-B、H因子、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、和癌基因产物。其他类型的靶标抗原可用于不同疾病状态的基于抗体的疗法，并且合并了靶向于任何所述替代抗原的抗体的细胞因子-MAb DNL构建物可用于所要求保护的方法和组合物中。
典型的可在细胞因子-MAb DNL构建物中使用的抗癌抗体包括但不限于hR1(抗IGF-1R，2009年1月20日提交的第61/145,896号美国临时专利申请)、hPAM4(抗MUC1，第7,282,567号美国专利)、hA20(抗CD20，第7,251,164号美国专利)、hA19(抗CD19，第7,109,304号美国专利)、hIMMU31(抗AFP，第7,300,655号美国专利)、hLL1(抗CD74，第7,312,318号美国专利)、hLL2(抗CD22，第7,074,403号美国专利)、hMu-9(抗CSAp，第7,387,773号美国专利)、hL243(抗HLA-DR，第11/368,296号美国专利申请)、hMN-14(抗CEA，第6,676,924号美国专利)、hMN-15(抗CEA，第10/672,278号美国专利申请)、hRS7(抗EGP-1，第7,238,785号美国专利)和hMN-3(抗CEA，第10/672,278号美国专利申请)，每个所引用的专利或申请的实施例部分均通过引用并入本文中。本领域技术人员将认识到，所述列表不具限制性，并且任何其他已知抗TAA抗体可被合并入细胞因子-MAb DNL构建物。
使用嵌合抗体为优选的，因为它们不像鼠抗体那样引起强烈的人类抗小鼠抗体(HAMA)反应。为了进一步减少引发HAMA反应的可能性，使用人源化抗体为更优选的。如下所讨论，通过使用相应的人类抗体框架和恒定区序列替换鼠框架和恒定区序列使鼠抗体人源化的技术是本领域熟知的，并已应用于大量鼠抗癌抗体。抗体人源化可能也涉及使用相应的母体鼠框架区序列残基取代一个或多个人类框架氨基酸残基。如下所讨论，生成人类抗体的技术也为本领域所熟知，并且所述抗体可被合并入所述细胞因子-MAb构建物。
典型的可被合并入细胞因子-MAb DNL构建物的细胞因子包括但不限于MIF(巨嗜细胞游走抑制因子)、HMGB-1(高迁移率族蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸细胞活化趋化因子、干扰素-α、-β、-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制瘤素M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、生长抑素、组织纤溶酶原激活物和LIF。
某些实施方案可能涉及结合至少一种治疗剂或至少一种诊断剂的细胞因子-MAb DNL构建物的治疗或诊断轭合物。并涵盖具有多个相同或不同类型的治疗剂的构建物。可选地，细胞因子-MAb DNL构建物可与至少一种治疗剂联合，该治疗剂在施用细胞因子-MAb构建物之前、同时、或之后施用。如以下具体讨论，本领域已知的任何治疗剂均可联合细胞因子-MAb DNL构建物使用，或附加于细胞因子-MAb DNL构建物上，所述治疗剂包括但不限于放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前药、酶类、寡核苷酸、siRNA、促凋亡剂、光敏治疗剂、细胞毒性剂、化疗剂、毒素、其他抗体或其抗原结合片段。
细胞因子-MAb复合物可用于多种疾病或医学疾患的治疗，所述疾病或医学疾患包括但不限于癌症、自身免疫性疾病、增生、败血症、糖尿病、炎性肠道疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、结节病、哮喘和奥西耶-韦伯综合症。
在特定的实施方案中，所公开的方法和组合物可用于治疗自身免疫性疾病，比如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、过敏性紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、艾迪生氏病、类风湿关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、舍格伦综合症、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病或纤维化肺泡炎。
典型的可用细胞因子-MAb DNL构建物治疗的癌症类型包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、胆癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肾母细胞瘤、尤文氏肉瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、肝癌、甲状腺髓样癌。
仍有其他实施方案涉及编码融合蛋白比如细胞因子-DDD融合蛋白或Fab-AD融合蛋白的DNA序列、包含该DNA序列的载体和宿主细胞、以及制备细胞因子-MAb DNL构建物的方法。
特别优选实施方案涉及20-2b，一种包含附加在人源化抗CD20抗体(hA20)上的四个IFNα2b部分的IFNα-MAb DNL构建物。通过体外增殖、活体外清除淋巴瘤细胞，和体内疗法研究，发现该20-2b构建物为一种优秀的抗单独母体抗体、抗单独IFNα细胞因子或非靶向IFNα-MAb的抗淋巴瘤剂。该20-2b构建物尤其可用于淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和相关疾患的治疗。
发明的详细说明
定义
除非上下文另外指明只意味单数形式，否则在本文中所用术语“一个(a，an)”和“该(the)”可指单数或复数形式。
在本文中所用术语“大约”意为值的加减百分之十(10％)。例如，“大约100”指介于90和110之间的任何数字。
抗体指全长(即天然产生或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)或具有免疫活性的免疫球蛋白分子的抗原结合部分，比如抗体片段。
抗体片段为抗体的一部分，比如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等。不论结构如何，抗体片段与被完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”也包括由可变区构成的分离片段，比如由重链和轻链的可变区构成的“Fv”片段，和其中轻链和重链可变区由肽连接子(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。在本文中所用术语“抗体片段”不包括没有抗原结合活性的抗体部分，比如Fc片段或单独的氨基酸残基。
术语抗体融合蛋白可指重组生成的抗原结合分子，其中具有相同或不同特异性的一个或多个相同或不同的单链抗体或抗体片段段相互连接。融合蛋白的效价表明该融合蛋白对一个抗原或表位有多少结合臂或位点；即，单价、双价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价性意味着其可利用多种相互作用与抗原结合，从而增加其与抗原结合的亲和力。特异性表明抗体融合蛋白能够结合多少种抗原或表位；即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用所述定义时，天然抗体如IgG为双价，因为其有两个结合臂，但是为单特异性，因为其结合一种表位。单特异性、多价融合蛋白具有多于一个的表位结合位点但是只结合一种表位。融合蛋白可包涵单独抗体组成部分、不同抗体组成部分或相同抗体组成部分的多拷贝的多价或多特异性组合。融合蛋白可另外包涵抗体或抗体片段和治疗剂。适于所述融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选毒素包括核糖核酸酶(RNase)，优选地为重组RNase。然而，该术语不具限制性，并且多种蛋白或肽效应子可被结合入融合蛋白。在另一个非限制性的实例中，融合蛋白可包涵AD或DDD序列以生成如下所讨论的DNL构建物。
附图说明
图1所示为描绘表达细胞因子-DDD2(C)的基因结构(A和B)、以及IgG-AD2(D)DNL模块的卡通绘图。该模块被组合以形成由融合于IgG的四个细胞因子构成的DNL结构(E)。
图2所示为相比于聚乙二醇化或天然IFNα，在细胞因子-MAb DNL构建物中的体外IFNα活性。特异性活性(IU/pmol)如在实施例中所述测量。根据rhIFNα2b标准曲线推断每个测试物在已知浓度上的活性。培养物在浓度增加的20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)、v-mab+734-2b(□)、
Figure BPA00001250956700091
Figure BPA00001250956700092
(▲)或1R-2b存在下生长，并且使用MTS测量相对活细胞密度。将由未处理的细胞所得的信号百分比与摩尔浓度的对数作图。使用Prism软件生成剂量-响应曲线和EC50值。误差线，SD。
图2(A)所示为基于细胞的报道基因测定。
图2(B)所示为使用EMC病毒和A549细胞的病毒保护测定。
图2(C)所示为使用Daudi细胞的体外淋巴瘤增殖测定。
图2(D)所示为使用Jeko-1细胞的体外淋巴瘤增殖测定。
图3所示为在Swiss-Webster小鼠中的药物动力学分析结果。将20-2b、α2b-413、PEGINTRON或
Figure BPA00001250956700094
施用于小鼠，并使用ELISA在96小时期间分析血清样品中的IFNα2b浓度。所示为血清消除曲线。插入的表格中所总结为血清半衰期(T1/2)消除速率和平均存留时间(MRT)。
图4(A)为图解20-2b的ADCC效应物功能。将Daudi或Raji细胞与5μg/ml的20-2b、22-2b、v-mab、依帕珠单抗(e-mab)或h734在存在新鲜分离的PBMC的条件下一起培养4小时，然后对细胞溶解液进行量化。
图4(B)所示为20-2B的CDC效应物功能。将Daudi细胞在存在人类补体的条件下与系列稀释的20-2b(●)、734-2b(■)或v-mab(○)共同培养。将补体对照百分比(将测试样品中的活细胞数目与仅以补体处理的细胞相比较)与nM浓度的对数作图。误差线，SD。
图5所示为20-2b对全血中NHL细胞的增强的耗竭。将新鲜肝素化的人血与Daudi或者Ramos混合，并与浓度为0.01、0.1或1nM的20-2b(●)、v-mab(○)、734-2b(■)或v-mab+734-2b(□)一起培养两天。使用流式细胞术评估该处理对淋巴瘤和外周血液淋巴细胞的影响。误差线，SD。
图6(A)为图解表现在弥散性伯基特淋巴瘤(Daudi)异种移植模型中20-2b的治疗效力的存活曲线。在第0天对雌性C.B.17SCID小鼠静脉注射施用Daudi细胞。治疗包括腹部注射提供单剂量20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)、
Figure BPA00001250956700101
或生理盐水(×)。箭头表明治疗的天数。使用Prism软件分析生存曲线。在早期Daudi模型中，在第1天给予每10只为一组的小鼠0.7pmol(实线)或0.07pmol(虚线)的单剂量。
图6(B)所示为与图6(A)相似的研究，但在晚期Daudi模型中进行。在第7天给予每10只为一组的小鼠0.7pmol(实线)、7pmol(虚线)或70pmol(灰线)的单剂量。
图7(A)为显示在弥散性伯基特淋巴瘤(Raji和NAMALWA)异种移植模型中表现20-2b的治疗效力的存活曲线。在第0天对雌性C.B.17SCID小鼠静脉注射施用NHL细胞。治疗包括腹部注射给予剂量20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)或盐水(×)。箭头表明治疗的天数。使用Prism软件分析存活曲线。在晚期Raji模型中，在第5、7、9、12、14和16天，每10只为一组接受250pmol的剂量。
图7(B)所示为与图7(A)相似的研究，但在早期NAMALWA模型中进行。在第1、3、5、8、10和12天，每6只为一组接受250pmol剂量的20-2b或734-2b，或在第1、5、9、13、17、21和25天，接受3.5nmol剂量的v-mab。
图8所示为用EFO标准品、734-EPO或EPO-DDD2将TF1细胞处理72小时后用基于细胞的测定测量EPO活性的结果。使用Graph Pad Prism软件生成剂量响应曲线和EC50值。
停靠与锁(DNL)方法
DNL方法利用发生于cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调控(R)亚基与A激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间的特异性蛋白/蛋白相互作用(Baillie等，FEBS Letters.2005；579：3264，Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。PKA，通过第二信使cAMP与R亚基的结合在最被深入研究的信号传导通路之一中起到中心作用，于1968年首次从兔骨骼肌中被分离(Walsh等，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。该全酶的结构由被R亚基保持为非活性形式的两个催化亚基构成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。已发现PKA的同工酶有两种类型的R亚基(RI和RII)，每种类型有α和β亚型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。R亚基仅作为稳定的二聚体被分离，并且其二聚化结构域显示由前44个氨基末端残基构成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP与R亚基结合导致广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，所述激酶通过停靠在AKAP上对PKA进行区域化而定位于所选底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
自从第一个AKAP，微管相关蛋白-2，于1984年被表征(Lohmann等Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，已在范围从酵母菌到人类的物种中鉴定结构多样的多于50种的位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网的AKAP(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。AKAP中对PKA的AD为14-18残基的两亲螺旋(Carr等，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。不同的单独AKAP的AD的氨基酸序列非常不同，据报道RII二聚体的结合亲和性范围从2到90nM(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。有趣的是，AKAP仅结合于二聚的R亚基。对于人类RIIα，AD结合于由23个氨基末端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人类RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域均位于相同的N末端的44个氨基酸序列中(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等，EMBO J.2001；20：1651)，在本文中被称为DDD。
人类RIIα的DDD和AKAP的AD作为连接子模块
我们开发了使用人类RIIα的DDD和某种氨基酸序列的AD作为一对优秀的连接子模块，用来停靠任何两个实体(在此称为A和B)成为非共价复合物，并可通过在DDD和AD的关键性位点引入半胱氨酸残基以协助二硫键的形成来将其进一步锁定成为稳定束缚的结构的平台技术。“停靠与锁”方法的一般性的方法论如下。实体A由将DDD序列连接到A的前体而构成，由此获得第一个组成部分称之为a。由于该DDD序列将影响二聚体的自发形成，A将包括a2。实体B由将AD序列连接到B的前体而构成，由此获得第二个组成部分称之为b。a2中所含的DDD的二聚基序将产生用来与b中包含的AD序列结合的停靠位点，从而协助a2与b的预备缔合以形成包括a2b的二元的二聚复合物。该结合事件由于随后通过二硫键桥共价地固定两个实体的反应而变得不可逆，由于初始结合相互作用应使位于DDD和AD上的反应性硫基特异性地靠近连接位点，根据有效性局部浓度的原理，该反应将高效发生(Chimura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)。
在优选的实施方案中，细胞因子-MAb DNL构建物基于多种a2b结构，其中IgG免疫球蛋白分子在其C-末端上附加于两个拷贝的AD部分上。每个AD部分能够与两个DDD部分以二聚体的形式结合。通过将细胞因子附加于每个DDD部分上，将四个拷贝的细胞因子与每个IgG分子轭合。在更优选的实施方案中，DNL构建物中的四个细胞因子完全相同。
通过将DDD和AD附加在两种前体的功能性基团之外，所述的位点特异性连接也预期保留该两种前体的原始活性。该方法本质上为模块化的并有潜力可用于位点特异性和共价地连接广泛的物质。该DNL方法公开于以下：2005年10月20日提交的第60/728,292号美国临时专利申请；2005年12月16日提交的第60/751，196号美国临时专利申请；2006年3月14日提交的第60/782,332号美国临时专利申请；和2006年3月24日提交的第11/389,358号美国专利申请；2006年3月28日提交的第11/391,584号美国专利申请；2006年6月29日提交的第11/478,021号美国专利申请；2006年12月5日提交的第11/633,729号美国专利申请；2007年10月26日提交的第11/925,408号美国专利申请。
在优选的实施方案中，如以下实施例中所阐明，效应物部分为蛋白或肽，其可与DDD或AD单元连接以形成融合蛋白或肽。已知多种用于制备融合蛋白的方法，包括合成、杂交或/和扩增核酸以生成合成的编码所感兴趣的融合蛋白的双链核酸。所述双链核酸可插入表达载体中，通过标准分子生物学技术生成融合蛋白(参见Sambrook等，Molecular Cloning，Alaboratory manual(分子克隆实验室手册)，第2版，1989)。在所述优选的实施方案中，可将AD和/或DDD部分附加于效应物蛋白或肽的N末端或C末端。然而，本领域技术人员将会认识到，依据效应物部分的化学性质和效应物部分中涉及其生理活性的部分，在效应物部分上附加AD或DDD部分的位点可能不同。可使用本领域已知的技术位点特异性附加多种效应物部分，比如使用双价交联试剂和/或其他化学轭合技术。
细胞因子和其他免疫调节剂
在某些优选的实施方案中，效应物部分为免疫调节剂。免疫调节剂为一种当存在时，改变、抑制或刺激身体的免疫系统的剂。所用免疫调节剂可包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、血细胞生成因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和以上组合。特别有用的为淋巴毒素，比如肿瘤坏死因子(TNF)，血细胞生成因子，比如白细胞介素(IL)，集落刺激因子，比如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)，干扰素，比如干扰素-α、-β或-γ，和干细胞生长因子，比如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。
在更优选的实施方案中，效应物部分为细胞因子，比如淋巴因子、单核因子、生长因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素比如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素比如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成素(LH)；胎盘生长因子(PlGF)、肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子比如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)比如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子I和II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管他丁、血小板反应蛋白、内皮他丁、肿瘤坏死因子(TNF，如TNF-α)和LT。
蛋白或肽免疫调节剂比如细胞因子的氨基酸序列是本领域熟知的，并且可在本发明的实施中使用任何这样的已知序列。本领域技术人员明白细胞因子序列的公共信息的多种来源。例如，NCBI数据库包含大量细胞因子和免疫调节剂的蛋白和编码核酸序列，比如红细胞生成素(GenBank NM000799)、IL-1β(GenPept AAH08678)、GM-CSF(GenPept AAA52578)、TNF-α(GenPept CAA26669)、干扰素-α(GenPept AAA52716.1)、干扰素-α2b(GenPept AAP20099.1)和实质上以上所列任何肽或蛋白免疫调节剂。鉴定本质上任何所感兴趣蛋白或肽效应物部分的合适的氨基酸和/或核酸序列是本领域技术人员的例行事务。
抗体和抗体片段
在多种实施方案中，可将抗体或抗体的抗原结合片段附加在多聚的细胞因子上。抗体的抗原结合片段在本领域中是熟知的，比如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等，可使用任何这样的已知片段。在本文中，抗体的抗原结合片段指结合可被完整或母抗体识别的相同抗原的抗体的任何片段。已知制备实质上任何所感兴趣的抗体或片段的AD和/或DDD轭合物的技术(例如，第11/633,729号美国专利申请)。
可使用的未轭合于治疗剂的抗体或其片段被称为“裸”抗体或其片段。在替代实施方案中，可将抗体或片段轭合于一种或多种治疗和/或诊断剂上。在本领域已知大量所述治疗剂和诊断剂，如以下具体讨论，并且可使用任何这样的已知治疗剂或诊断剂。
本领域已知制备抗实质上任何靶标抗原的单克隆抗体的方法。参见例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，和Coligan等(编著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(免疫学最新实验方案)，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简要来说，可由以下获得单克隆抗体：向小鼠中注射包含抗原的组合物，除去脾脏以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择生成抗抗原的抗体的阳性克隆，培养所述生成抗抗原抗体的克隆，并将该抗体从杂交瘤培养物中分离出来。
可通过多种完善的技术将MAb从杂交瘤培养物中分离和纯化。该分离技术包括使用蛋白-A琼脂糖的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如，Coligan的第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3.页。并参见Baines等在METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(分子生物学方法)中，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.1992)的“PurificationofImmunoglobulin G(IgG)(免疫球蛋白G(IgG)的纯化)”。
在初始产生针对免疫原的抗体以后，可将抗体测序然后通过重组技术制备。本领域技术人员熟知鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合化。使用衍生于人源化的、嵌合或人类抗体的抗体组成部分排除了鼠恒定区的免疫原性带来的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体为一种重组蛋白，其中人类抗体的可变区可使用比如鼠抗体的可变区，包括鼠抗体的互补决定区(CDR)替代。当施用于受治疗者的时候，嵌合抗体表现出免疫原性降低和稳定性的增加。克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术已被公开于，例如，Orlandi等，Proc.Nat′l Acad.SciUSA 86：3833(1989)中。本领域技术人员已熟知构建嵌合抗体的技术。例如，Leung等在Hybridoma(杂交瘤)13：469(1994)中，通过将编码鼠LL2，一种抗CD22的单克隆抗体的Vκ和VH结构域的DNA序列与相应的人类κ和IgG1恒定区结构域组合而生成LL2嵌合体。
人源化抗体
生成人源化MAb的技术已在本领域熟知(参见，Jones等Nature 321：522(1986)，Riechmann等Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等Science239：1534(1988)，Carter等Proc.Nat′l Acad.Sci USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，和Singer等J.Immun.150：2844(1993))。可通过将鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链的鼠CDR转移到相应的人类抗体的可变结构域来将嵌合或鼠单克隆抗体人源化。嵌合单克隆抗体中的鼠框架区(FR)也被人类FR序列取代。由于简单的将鼠CDR转移到人类FR中常导致抗体亲和性的降低甚至丢失，可能需要额外的修饰以恢复鼠抗体的原始亲和性。这可通过将FR区中的一个或多个人类残基替换为其鼠相应部分而获得对其表位具有良好结合亲和性的抗体而达到。参见例如Tempest等，Biotechnology 9：266(1991)和Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)。通常，与鼠相应部分不同并且位于接近或接触一个或多个CDR氨基酸残基的人类FR氨基酸残基将成为替换的候选者。
人类抗体
使用组合方法或以人类免疫球蛋白位点转化的转基因动物生成完全人类抗体的方法在本领域已知(例如，Mancini等，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50)。完全人类抗体也可以由基因或染色体转染的方法，和嗜菌体展示技术构建，所述技术均在本领域已知。参见例如，McCafferty等Nature 348：552-553(1990)。该完全人类抗体预期展现比嵌合或人源化抗体更少的副作用，并在体内发挥本质上内源人类抗体的功能。在某些实施方案中，所要求保护的方法和步骤可能使用所述方法生成的人类抗体。
在另一种情况下，可使用噬菌体展示技术生成人类抗体(例如，Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。可从正常人或表现出特定疾病状态例如癌症的人生成人类抗体(Dantas-Barbosa等，2005)。从患病的个体构建人类抗体的好处是该循环抗体库可能倾向于抗疾病相关抗原的抗体。
在该方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了骨肉瘤患者的人类Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，总RNA由循环血液淋巴细胞获得(同上)。从μ、γ和κ链的抗体库克隆重组Fab并插入噬菌体展示文库中(同上)。将RNA转化为cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物产生Fab cDNA文库(Marks等1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。根据Andris-Widhopf等(2000，在Phage DisplayLaboratory Manual(噬菌体展示实验手册)中，Barbas等(编著)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY第9.1至9.22页)进行文库的构建。使用限制性核酸内切酶分解最终Fab片段并插入噬菌体基因组来生成噬菌体展示文库。在本领域已知所述文库可由标准噬菌体展示方法进行筛选(参见例如，Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
噬菌体展示可通过多种形式操作，综述参见Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。也可通过体外活化B细胞生成人类抗体。参见第5,567,610号和第5,229,275号美国专利，通过引用整体并入本文。本领域技术人员将认识到，所述技术为示例性的，并且可使用任何已知的制备和筛选人类抗体或抗体片段的方法。
在另一种可选情况下，可利用标准免疫实验方案使用已被遗传工程化生成人类抗体的转基因动物生成本质上抗任何免疫原性靶标的抗体。从转基因小鼠中获得人类抗体的方法在Green等Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg等Nature 368：856(1994)，和Taylor等Int.Immun.6：579(1994)中公开。所述系统的一个非限制性实例为Abgenix(Fremont，CA)的Xeno小
Figure BPA00001250956700171
(例如，Green等，1999，J.Immunol Methods 231：11-23)。在Xeno小
Figure BPA00001250956700172
和相似动物中，鼠抗体基因已被灭活并以功能性人类抗体基因替代，而其他鼠免疫系统保持完整。
使用含有人类IgH和Igκ位点的部分，包括大多数可变区序列以及辅助基因和调控序列的生殖细胞构造的YAC(酵母菌人造染色体)转化Xeno小
Figure BPA00001250956700173
人类可变区库可用于制备抗体生成B细胞，其可通过已知技术处理成为杂交瘤。通过靶标抗原免疫的Xeno小
Figure BPA00001250956700181
通过正常免疫反应生产人类抗体，其可被收获和/或通过以上所讨论标准技术制备。有多种品系的Xeno小
Figure BPA00001250956700182
可用，每一种都能够生产不同类的抗体。转基因生成的人类抗体已显示具有治疗潜力，同时保持正常人类抗体的药物动力学性质(Green等，1999)。本领域技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用Xeno小
Figure BPA00001250956700183
系统，而可使用已被遗传工程化以产生人类抗体的任何转基因动物。
抗体片段
可通过已知技术生成识别特异性表位的抗体片段。抗体片段为抗体的抗原结合部分，比如F(ab’)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab’)2片段可由胃蛋白酶消化抗体分子生成，而Fab’片段可通过还原F(ab’)2片段的二硫键而生成。另外，可构建Fab’表达文库以(Huse等，1989，Science，246：1274-1281)允许对具有所需特异性的单克隆Fab’片段的迅速和简易的鉴定。F(ab)2片段可由木瓜蛋白酶消化抗体而生成，而Fab片段可由还原二硫键获得。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合形成靶标结合位点。这两个结构域进一步通过肽连接子(L)共价连接。制备scFv分子和设计合适的肽连接子的方法在以下描述：第4,704,692号美国专利，第4,946,778号美国专利，R.Raag和M.Whitlow，“Single Chain Fvs(单链Fv)”FASEB第9卷：73-80(1995)，和R.E.Bird和B.W.Walker，“Single Chain Antibody Variable Regions(单链抗体可变区)”TIBTECH，第9卷：132-137(1991)。
生产单结构域抗体(DAB)的技术在本领域已知，例如在Cossins等(2006，Prot Express Purif51：253-259)中所公开的，通过引用并入本文。
可通过将全长抗体蛋白溶解性水解或在大肠杆菌或其他宿主中表达编码抗体片段的DNA来制备抗体片段。可通过常规方法使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体而获得抗体片段。这些方法已被描述在，例如Goldenberg的第4,036,945号和第4,331,647号美国专利，并在本文中引用。并且，参见Nisonoff等Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J 73：119(1959)，Edelman等在METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)第1卷，第422页(Academic Press 1967)中，和Coligan在第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页中所述。
已知抗体
可从多种已知渠道商业获得所用抗体。例如，由美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)可获得多种抗体分泌性杂交瘤细胞系。大量的抗各种疾病靶标，包括但不限于肿瘤相关抗原的抗体，已在ATCC中保藏和/或公开了可变区序列并可用于所要求保护的方法和组合物中。参见例如第7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,15；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572,856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040，6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953，5,525,338号美国专利。所述仅为典型例子，在本领域已知大量的其他抗体和其杂交瘤。本领域技术人员将认识到，可通过ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中简单搜索抗所感兴趣的所选疾病相关靶标的抗体而获得抗几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌性杂交瘤。使用本领域已知的常规技术，可将克隆抗体的抗原结合结构域扩增，剪切，连接进入表达载体，转染进入适应宿主细胞并用于生成蛋白。
氨基酸取代
在某些实施方案中，所公布的方法和组合物可能涉及生成和使用具有一个或多个取代的氨基酸残基的蛋白或肽。如上所讨论，在本领域已知制备抗本质上任何靶标抗原的单克隆抗体的方法。通常，所述技术导致生成抗靶标抗原的鼠抗体。如本领域所熟知，鼠单克隆抗体的抗原结合亲和性很大程度上由高变的互补决定区(CDR)序列决定。鼠抗体一般包括6段CDR序列，3段在抗体轻链上而3段在重链上。如上所详述，可由例如CDR嫁接等技术构建嵌合、人源化或人类形式的鼠抗体，其中将该鼠CDR序列插入例如人类抗体框架和恒定区序列，或将整个鼠可变区序列附加在人类抗体恒定区序列上。在替代实施方案中，可通过例如化学合成和装配编码抗体的整个轻链和重链可变区的寡核苷酸来构建抗体的可变区序列。
在多种实施方案中，可通过替换一个或多个氨基酸残基优化天然、嵌合、人源化或人类抗体的结构、物理和/或治疗特征。例如，本领域熟知可通过用相应的母体鼠抗体的FR氨基酸取代有限数量的人类框架区(FR)氨基酸来改进人源化抗体的功能性特征。当框架区氨基酸残基与CDR残基接近的时候尤其如此。
在其他情况下，可通过有限数量的氨基酸取代对抗体的治疗特性，比如对靶标抗原的结合亲和性，抗体从靶标抗原的解离率或脱离率，或者甚至抗体引发CDC(补体依赖性细胞毒性)或ADCC(抗体依赖性细胞毒性)的效果，进行优化。
在替代实施方案中，可进一步优化用于制备细胞因子-MAb DNL构建物的DDD和/或AD序列，例如增强其DDD-AD结合亲和性。DDD或AD序列中的潜在序列变异如以下实施例中所讨论。
本领域技术人员将会认识到，一般情况下，氨基酸取代通常涉及将一种氨基酸用另一种具有相对类似特性的氨基酸替换(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的特性和氨基酸取代对蛋白结构和功能的影响已被深入研究并在本领域已知。
例如，可考虑氨基酸疏水(hydropathic)指数(Kyte & Doolittle，1982，J.Mol.Biol，157：105-132)。氨基酸的相对疏水性特征促成所得蛋白的二级结构，其反过来界定该蛋白与其他分子的相互作用。基于其疏水性和电荷特征对每种氨基酸分配一个疏水指数(Kyte & Doolittle，1982)，具体为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在进行保守性取代的时候，优选使用疏水性指数在±2之间的氨基酸，更优选是在±1之间，更优选的为在±0.5之间。
氨基酸取代也可考虑到氨基酸残基的亲水性(例如，第4,554,101号美国专利)。氨基酸残基分配得到亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。首选使用类似亲水性的其他氨基酸进行替换。
其他的考虑包括氨基酸侧链的大小。例如，通常不优选将带有致密侧链的氨基酸，比如甘氨酸或丝氨酸，替换成带有庞大侧链的氨基酸，例如色氨酸或酪氨酸。各种氨基酸残基对蛋白二级结构的作用也是一种考虑。通过实证研究，不同氨基酸残基对蛋白结构域采取α-螺旋、β-平面或反转二级结构倾向性的作用已被确定并在本领域已知(参见例如，Chou &Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)。
基于所述考虑和深入的实证研究，已构建保守氨基酸取代表并在本领域已知。例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可选地：Ala(A)leu，ile，val；Arg(R)gln，asn，lys；Asn(N)his，asp，lys，arg，gln；Asp(D)asn，glu；Cys(C)ala，ser；Gln(Q)glu，asn；Glu(E)gln，asp；Gly(G)ala；His(H)asn，gln，lys，arg；Ile(I)val，met，ala，phe，leu；Leu(L)val，met，ala，phe，ile；Lys(K)gln，asn，arg；Met(M)phe，ile，leu；Phe(F)leu，val，ile，ala，tyr；Pro(P)ala；Ser(S)，thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe，tyr；Tyr(Y)trp，phe，thr，ser；Val(V)ile，leu，met，phe，ala。
其他关于氨基酸取代的考虑包括该残基是否位于蛋白内部或暴露于溶剂。对于内部残基，保守取代包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见例如，Rockefeller.edu的PROWL网站)。对于暴露于溶剂的残基，保守取代包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已构建各种基质以辅助选择氨基酸取代，比如PAM250评分基质、Dayhoff基质、Grantham基质、McLachlan基质、Doolittle基质、Henikoff基质、Miyata基质、Fitch基质、Jones基质、Rao基质、Levin基质和Risler基质(同上)。
在决定氨基酸取代的时候，人们也可考虑分子间或分子内键的存在，比如正电荷残基(例如His，Arg，Lys)和负电荷残基(例如Asp，Glu)之间离子键(盐桥)的形成，或相近的半胱氨酸残基之间的二硫键。
已知在编码蛋白序列里使用任何一种氨基酸取代任何另一种氨基酸的方法，并是本领域技术人员的常规实验事务，例如通过定向诱变技术或通过合成和装配编码氨基酸取代的寡核苷酸并剪接进入表达载体构建体。
治疗剂
在替代实施方案中，治疗剂比如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其他剂可被用作本文所讨论的多聚细胞因子的辅助疗法。所用药物可具有选自抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷化剂、抗代谢物剂、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促凋亡剂和其组合组成的组的药物特征。
典型所用药物包括5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉曲滨、camptothecans、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西紫杉醇、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉阿霉素(2P-DOX)、氰基吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌莫司汀、表鬼臼毒素(epidophyllotoxin)、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3’，5’-O-二油酰基-FUdR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、左旋天冬酰胺酶、来那度胺(lenolidamide)、亚叶酸钙、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide)(DTIC液态的形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替哌、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶芥、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。
所用毒素可包括蓖麻毒素、相思子毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNase)，例如豹蛙酶、DNA酶I，葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、和假单胞菌内毒素。
所用趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
在某些实施方案中，可使用抗血管生成剂比如血管他丁、baculostatin、血管能抑制素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PIGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞游走抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧基氨咪唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马马司他、戊聚糖多硫酸酯、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K的催乳素片段、利诺胺(罗喹美克)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木素、TNP-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、血管他丁、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
其他有用的治疗剂可包括寡核苷酸，特别是优选地针对癌基因和癌基因产物比如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。一种优选的治疗寡核苷酸形式为siRNA。
诊断剂
诊断剂优选地选自放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光活性剂组成的组。所述诊断剂已被熟知，并且可使用任何这样的已知诊断剂。非限制性的诊断剂的例子可包括放射性核素，比如110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、或其他γ-、β-、或正电子发射体。所用顺磁离子可包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可包括脂质体，比如充气脂质体。不透射线诊断剂可选自复合物、钡复合物、镓复合物和铊复合物。本领域已知多种荧光标记，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白(phycoerytherin)、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。可用的化学发光标记可包括鲁米诺、异氨基苯二酰肼、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
免疫轭合物
在某些实施方案中，可将细胞因子-MAb DNL构建物的抗体组成部分轭合于一种或多种治疗剂或诊断剂上。该治疗剂不需相同而可为不同，例如，药物和放射性同位素。例如，可将131I整合入抗体或融合蛋白的酪氨酸上，可将药物附加在赖氨酸残基的ε氨基基团上。也可将治疗剂和诊断剂附加到例如还原的SH基团和/或碳水化合物侧链上。本领域已知多种制备治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价轭合物的方法，并可使用任何这样的已知方法。
可通过形成二硫键将治疗剂或诊断剂附加在还原抗体组成部分的铰链区。可选地，可使用双异官能交联剂，比如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)附加所述剂。Yu等Int.J.Cancer 56：244(1994)。本领内已熟知所述轭合的一般技术。参见例如，Wong，CHEMISTRY OFPROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(蛋白轭合和交联的化学反应)(CRC Press 1991)；Upeslacis等MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS(单克隆抗体：原理和应用)中的“Modification ofAntidodies by Chemical Methods(修饰抗体的化学方法)”，Birch等(编著)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING ANDCLINICALAPPLICATION(单克隆抗体：制备、工程化和临床应用)中的“Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies(合成肽衍生的抗体的制备和表征)”，Ritter等(编著)，第60-84页(CambridgeUniversity Press 1995)。可选地，治疗剂或诊断剂可通过抗体Fc区中的碳水化合物部分轭合。该碳水化合物基团可用于增加结合于硫基的相同剂的负荷，或者该碳水化合物部分可用于结合不同治疗剂或诊断剂。
本领域技术人员已熟知通过抗体的碳水化合物部分将肽轭合于抗体组成部分的方法。参见例如，Shih等Int.J.Cancer 41：832(1988)；Shih等Int.J.Cancer 46：1101(1990)；和Shih等第5,057,313号美国专利，均通过引用整体并入本文。一般方法包括将带有一个氧化的碳水化合物部分的抗体组成部分与带有至少一个自由胺官能的载体聚合物进行反应。该反应得到初始希夫碱(亚胺)连接键，其可通过还原为仲胺而被稳定化以形成最终轭合物。
如果用作免疫轭合物的抗体组成部分的抗体为抗体片段，该抗体可能缺少Fc区。然而，有可能在全长抗体或抗体片段的轻链可变区引入碳水化合物部分。参见例如，Leung等J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等第5,443,953号美国专利(1995)，Leung等第6,254,868美国专利号，通过引用整体并入本文。该工程化的碳水化合物部分用于附加治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，抗体、抗体片段或融合蛋白上可附加螯合剂以用来螯合治疗剂或诊断剂，比如放射性核素。典型螯合剂包括但不限于DTPA(比如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。本领域已熟知轭合和使用螯合剂向蛋白上附加金属或其他配体的方法(参见例如，第12/112,289号美国专利申请，通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，放射性金属或顺磁离子可通过与带有可能附加用于结合离子的多重螯合基的长尾部的试剂反应而附加在蛋白或肽上。所述尾部可为聚合物比如聚赖氨酸、多糖，或具有悬垂部分的其他衍生或可衍生链，该悬垂基团可结合螯合基团比如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于本目的的类似基团。
螯合物可直接连接到抗体或肽上，例如在第4,824,659号美国专利中所公开的，通过引用整体并入本文。特别有用的金属螯合组合包括2-苄基-DTPA和其单甲基和环己基类似物，可与一般能量范围60至4,000keV的诊断同位素一起用于放射性成像，所述同位素比如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br。当与非放射性金属例如镁、铁和钆复合时，相同的螯合物可用于MRI。大环螯合物比如NOTA、DOTA和TETA可与多种金属和射电金属一起使用，更特别地分别与镓、铱和铜的放射性核素一起使用。可通过为所感兴趣的金属定制环的大小使所述金属-螯合物复合物非常稳定。涵盖其他的环型螯合物比如大环聚醚，其特别稳定地结合核素，比如RAIT中的223Ra。
最近，已公开在PET扫描技术中使用18F标记的方法，例如通过将F-18与金属或其他原子例如铝进行反应。18F-Al轭合物可与直接附加在抗体上或用于在预靶向方法中标记可靶向的构建体的螯合基团比如DOTA、NOTA或NETA复合。所述F-18标记技术公开在2008年4月30日提交的第12/112,289号美国专利申请，通过引用整体并入本文。
治疗方法
各种实施方案涉及在患者例如哺乳动物，包括人类、家养或陪伴宠物，比如狗和猫中治疗癌症的方法，包括向受治疗者施用治疗有效量的细胞因子-MAb DNL构建物。在优选的实施方案中，细胞因子-MAb DNL构建物为20-2b构建物，如以下实施例中具体讨论。
可由同时或随后施用治疗有效量的结合于靶标细胞表面上另一种抗原或与之反应的另一种抗体而对细胞因子-MAb DNL构建物的施用进行补充。优选的另外MAb包括至少一种选自与以下反应的MAb组成的组的人源化、嵌合或人类MAb：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、腱生蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、癌基因产物或其组合。本领域技术人员已知多种可用抗体，比如抗CD19抗体、抗CD20抗体、和抗CD22抗体。参见例如，Ghetie等Cancer Res.48：2610(1988)；Hekman等Cancer Immunol.Immunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353(1996)，第5,798,554；6,187,287；6,306,393；6,676,924；7,109,304；7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；7,282,567；7,300,655；7,312,318号美国专利；和第20080131363；20080089838；20070172920；20060193865；20060210475；20080138333；和20080146784号美国专利申请公布，均通过引用并入本文。
可通过同时或随后施用至少一种治疗剂进一步补充细胞因子-MAbDNL构建物疗法。例如“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司丁)为用于治疗非霍奇金淋巴瘤的方案。Patti等Eur.J.Haematol.51：18(1993)。本领域技术人员熟知其他合适的联合化疗方案。参见例如，Freedman等，在CANCER MEDICINE(癌症药物)第2卷，第3版中的“Non-Hodgkin′s Lymphomas(非霍奇金淋巴瘤)”，Holland等(编著)，第2028-2068页(Lea&Febiger 1993)。作为说明，第一代治疗中间级非霍奇金淋巴瘤(NHL)的化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和强的松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)。有用的第二代化疗方案为m-BACOD(甲氨蝶呤、博莱霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸钙)，而合适的第三代方案为MACOP-B(甲氨蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博莱霉素和亚叶酸钙)。其他有用的药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。
可根据已知方法来配制细胞因子-MAb DNL构建物以制备药学上有用的组合物，据此将细胞因子-MAb DNL构建物与药学上合适的赋形剂混合于混合物中。无菌磷酸盐缓冲盐水为药学上合适的赋形剂的实例。本领域已知其他合适的赋形剂。参见例如，Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(药物剂量形式和药物递送系统)，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编著)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，和其修订版。
可将细胞因子-MAb DNL构建物配制用于静脉给药，通过例如推注注射或连续输液。优选地，将细胞因子-MAb DNL构建物经少于约4小时的期间输液，更优选地，经少于约3小时的期间。例如，初始的25-50mg可在30分钟内输液，优选地甚至15分钟，而余下的部分经随后2-3小时输液。注射制剂可以剂量单位形式呈现，例如，在安瓿瓶或多剂量容器中，并有添加防腐剂。组合物可为油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液形式，并且可以包含配制剂，比如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可为粉末形式，在使用前与合适载体例如无菌的无热原水重构。
可使用其他制药方法控制细胞因子-MAb DNL构建物作用的持续时间。可通过使用聚合物来复合或吸附细胞因子-MAb DNL构建物来配制释放控制制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-醋酸乙烯)基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood等Bio/Technology 10：1446(1992)。所述基质的释放率决定于细胞因子-MAbDNL构建物的分子量、基质中细胞因子-MAb DNL构建物的量、和分散粒子的大小。Saltzman等，Biophys.J.55：163(1989)；Sherwood等，同上。其他固体剂量形式在Ansel等PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSAND DRUG DELIVERY SYSTEMS(药物剂量形式和药物递送系统)，第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编著)，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，(雷明顿药物科学)，第18版(MackPublishing Company 1990)及其修订版中描述。
细胞因子-MAb DNL构建物也可对哺乳动物进行皮下给药或者甚至其他非肠道途径给药。而且，可通过连续输液或单剂量或多剂量推注给药。优选地，细胞因子-MAb DNL构建物经少于约4小时的期间输液，更优选地，经少于约3小时的期间。
更普遍的情况下，施用于人类的细胞因子-MAb DNL构建物的剂量将根据比如患者年龄、体重、身高、性别、一般性病情和先前病史等因素变化。可期望给予接受者剂量范围在从约1mg/kg到25mg/kg的单次静脉输注的细胞因子-MAb DNL构建物，尽管如果情况需要施用剂量可更低或更高。例如，对于体重70kg的患者应给予1-20mg/kg剂量，对身高1.7m的患者为70-1,400mg或41-824mg/m2。如果需要，可重复该剂量，例如，一周一次持续4-10周，一周一次持续8周，或一周一次持续4周。也可以根据维持疗法的需要以更小的频率给药，比如每两周一次持续几个月，或每个月或每个季度一次持续几个月。
可选地，细胞因子-MAb DNL构建物可每2周或3周以单剂量给药，重复总共至少3个剂量。或者，可每周施用该构建物两次并持续4-6周。如果剂量降低到大约200-300mg/m2(对于身高1.7m的患者每剂量为340mg，或者对于体重70kg的患者剂量为4.9mg/kg)，可每周一次或甚至两次持续4到10周给药。可选地，给药时间表可缩短，即每2周或3周一次持续2-3个月。然而，已经确定即使更高的剂量，比如20mg/kg每周一次或2-3周一次，仍可以重复的给药循环通过慢静脉输注给药。根据对剂量和时间表的合适调整，给药时间表可任选地以其他间隔重复，并可通过各种非肠道途径给药。
在优选的实施方案中，细胞因子-MAb DNL构建物可用于癌症治疗。癌症的例子包括但不限于，癌、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤。所述癌症更具体的例子如以下所记录，包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤、肾母细胞瘤、星形细胞瘤、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)，包括胃肠癌、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、分化型甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，细胞还没有转移到患者身体内除了最初的恶性肿瘤或肿瘤位置以外其他位置的恶性肿瘤或肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，来源于转移瘤、恶性细胞或肿瘤细胞转移到与最初的肿瘤位置不同的继发性位置的恶性细胞或肿瘤)。有利于本发明治疗方法的癌症包含表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
其他癌症或恶性肿瘤的例子包括但不限于：儿童急性成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓细胞性白血病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓细胞性白血病、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路的神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童髓母细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺肿瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、高雪氏病、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、高丙球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性疾病、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移隐匿性原发性鳞状细胞颈癌、转移性原发性鳞状细胞颈癌、转移性鳞状细胞颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓增生异常综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性鳞状细胞颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、低恶性度卵巢肿瘤、胰腺癌、异常蛋白血症、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液癌、结节病肉瘤、塞扎里综合症、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、肾盂和输尿管移行癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、肾母细胞瘤，和位于上述器官系统内除瘤形成外的任何其他过度增生疾病。
本文中描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶化前的疾患并阻止进展成为肿瘤或恶性瘤状态，包括但不限于以上所列的病症。所述用途在已知或疑为继续进展为肿瘤或癌症的疾患中有所指示，特别是在非肿瘤细胞生长包括发生增生、化生或特别是发育不良的时候(所述异常生长状况的综述参见Robbins和Angell，Basic Pathology(基础病理学)，第二版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页(1976))。
发育不良常为癌症的前兆，并且主要在上皮中发现。其为非肿瘤细胞生长中最无序的一种形式，包括失去个体细胞的一致性和失去细胞的结构方向。发育不良典型地发生在存在慢性刺激或炎症的部位。可治疗的发育不良病症包括但不限于，无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育不良、心房指发育不良、支气管肺发育不良、脑发育异常、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不全、先天性外胚层发育不良、颅骨骨干发育不良(craniodiaphysialdysplasia)、颅腕跖骨发育不良、颅骨干骺端发育不全(craniometaphysialdysplasia)、牙质发育不良、骨干发育异常(diaphysial dysplasia)、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面-指(趾)-生殖器发育不良(faciodigitogenital dysplasia)、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱襞性发育异常、纤维肌肉发育不良、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾性视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良(lymphopenicthymic dysplasia)、乳腺结构不良、下颌面骨发育不良、干骨后端发育不良、蒙迪尼发育不良、单骨纤维性骨发育不良、粘膜上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不良、齿源性发育不良、眼下颚(opthalmomandibulomelic)发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨性纤维异常增生症、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育不良、视隔发育不良、脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphysial dysplasia)和脑室径向发育不良(ventriculoradial dysplasia)。
其他可治疗的前肿瘤病症包括但不限于，良性增生失调病症(例如，良性肿瘤、纤维囊肿病症、组织肥大、肠息肉或腺瘤、和食管发育不良)、白斑、角化症、博温氏病、农民皮肤病、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明方法用于抑制癌症生长、进展和/或转移，尤其是以上所列癌症。
其他过度增生疾病、病症和/或疾患包括但不限于，恶性肿瘤和相关病症的进展和/或转移，例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞、和红白血病))和(慢性白血病，例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、和实体肿瘤，包括但不限于，肉瘤及癌如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底肾细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、寡突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
药盒
各种实施方案可涉及包含适合于治疗或诊断患者患病组织的组成部分的药盒。典型药盒可容纳至少一种或多种如本文所描述的细胞因子-MAb构建物。如果含有给药组成部分的组合物未被配制为通过消化道递送药物，比如通过口服，药盒中可包括能够通过一些其他途径递送该药盒组成部分的装置。一种类型的装置，比如为非肠道递送的应用，为用于将组合物注射进入患者身体的注射器。也可使用吸入装置。在某些实施方案中，可以带有无菌液体制剂或冻干制剂的预充式注射器或自动注射笔的形式提供治疗剂。
药盒的各组成部分可包装在一起或分别包装在两个或多个容器中。在某些实施方案中，容器可为装有适于重构的组合物的无菌冻干制剂的管形瓶。药盒还可包括一种或多种适于重构和/或稀释其他试剂的缓冲液。其他可用的容器包括但不限于，囊、盘、盒子、管等。药盒各组成部分可在容器内包装并保持无菌。另外一个可包括的组成部分为人们使用药盒的说明书。
表达载体
仍有其他实施方案可涉及包含编码细胞因子-MAb构建物、或其组分融合蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包括附加在不同肽或蛋白上的抗体或细胞因子，比如在以下实施例中详细讨论的用于形成DNL构建物的AD肽和DDD肽。
各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可包含编码可向其附加嵌合、人源化或人类可变区序列的轻链和重链恒定区和人类免疫球蛋白铰链区的序列。载体可另外包含在所选宿主细胞中表达编码蛋白的启动子、增强子和信号或前导序列。尤其有用的载体为pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区和铰链区可源于人类EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中同种异型位点上的至少一种氨基酸任选地换为见于不同IgG1同种异型中的氨基酸，并且其中基于EU编号系统的EU重链氨基酸253任选地替换为丙氨酸。参见Edelman等Proc.Natl.Acad.Sci USA 63：78-85(1969)。在其他实施方案中，IgG1序列可转换成IgG4序列。
本领域技术人员将会认识到，遗传工程化表达构建体和插入宿主细胞中以表达工程化蛋白的方法在本领域是熟知的并为常规实验事务。表达克隆抗体或片段的宿主细胞和方法已描述在，例如，在2005年7月25日提交的第11/187,863号美国专利申请，2005年10月20日提交的第11/253,666号美国专利申请，2006年7月14日提交的第11/487,215号美国专利申请中，均通过引用整体并入本文。
实施例
提供以下实施例用于阐明但是不限制本发明的权利要求。
一般方法
细胞系。在补加了2mM L-谷氨酰胺和100单位/mL的青霉素-链霉素的杂交瘤无血清培养基(H-SFM)中培养Sp/ESF细胞，一种增强的Sp2/0-Ag14(ATCC，Manassas，VA)变种。将Daudi、Ramos、Raji、NAMALWA和Jeko-1(ATCC)人类淋巴瘤在包含10％FBS和补加了1mM丙酮酸钠、10mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES和100单位/mL的青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。
MAb-IFNα构建物。通过组合在SD/ESF中分别表达的两个DNL模块CH3-AD2-IgG-v-mab和IFNα2b-DDD2由DNL生成20-2b。另外的DNL-生成的具有如同20-2b(人源化IgG1+4IFNα2b)相似设计但是具有不同靶标MAb的MAb-IFNα构建物在多个实验中用作对照：22-2b具有CH3-AD2-IgG-e-mab(依帕珠单抗)作为其AD2模块，其针对CD22并与淋巴瘤结合；734-2b具有CH3-AD2-IgG-h734作为其AD2模块，其针对半抗原In-DTPA并且不与任何动物蛋白或组织结合；以及R1-2b使用CH3-AD2-IgG-hR1，其与人类胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)结合。
分析方法。根据生产商建议的方案使用商业人类IFNα2ELISA试剂盒测量IFNα构建物的蛋白浓度(PBL Interferon Source，Piscataway，NJ)并通过使用具有Bio-Sil SEC 250柱的Beckman System Gold型号116(Bio-Rad，Hercules，CA)，以及使用0.04M PBS，pH 6.8，1mM EDTA作为流动相的尺寸排阻HPLC确认。使用4-20％梯度Tris-甘氨酸凝胶(Cambrex Bio Science，Rockland，ME)进行还原和非还原SDS-PAGE分析。所有比色(ELISA和MTS)、发光(报道基因)和荧光(CDC和ADCC)测定均使用EnVision 2100多标记读板仪(PerkinElmer，Waltham，MA)进行定量。
IFNα活性测量。根据生产商建议的方案(PBL Interferon Source)使用iLite人类干扰素Alpha基于细胞的检测试剂盒来确定IFNα2b的特异性活性。在1％BSA-PBS中将
Figure BPA00001250956700361
20-2b，和另外七种MAb-IFNα构建物稀释至10、2.5和0.625ng/mL。将
Figure BPA00001250956700362
稀释至1、0.25和0.0625ng/mL。每次稀释均通过与所提供细胞过夜培养一式三样进行检测。根据所提供的标准品生成的标准曲线而推断得出特异性活性。通过独立分析实验室(PBL Interferon Source)在A549细胞中使用脑心肌炎(EMC)病毒进行体外病毒攻击测定来确定抗病毒活性。
体外增殖。96孔平板中将Daudi或Jeko-1以5,000细胞/孔铺板，并在增加浓度的所指剂存在下于37℃培养四天(Daudi)或五天(Jeko-1)。使用CellTiter 96细胞增殖测定法(Promega，Madison，WI)确定活细胞密度。
从全血中活体外耗竭Daudi和Ramos淋巴瘤细胞。使用流式细胞术活体外评估20-2b对NHL细胞以及来自健康志愿者的全人血中外周血淋巴细胞的作用，并与v-mab、734-2b或v-mab和734-2b的组合比较。将Daudi或Ramos(5×104细胞)与肝素化全血(150μl)混合并与0.01、0.1或1nM的测试MAb在37℃和5％CO2的条件下一起培养2天。使用FITC标记的抗CD3、抗CD19、或鼠IgG1同种型对照(BD Biosciences，San Jose，CA)对细胞进行染色。溶解红细胞后，使用带有Cell Quest软件的FACSCalibur(BD Biosciences)对细胞进行分析。Daudi和Ramos细胞均为CD19+并位于单核细胞门。正常B和T细胞分别为CD 19+和CD3+细胞，位于淋巴细胞门。使用Student t检验评估统计显著性(p＜0.05)。在小鼠中的体内效力。研究使用雌性C.B.17纯合的重症联合免疫缺陷(SCID)的体重大约20g的小鼠(Taconic，Germantown，NY)。每只小鼠在第0天静脉注射接种1.5×107Daudi、2.5×106Raji或5×106NAMALWA细胞。治疗剂量均以皮下注射的方式给药。生理盐水用作对照治疗。每天监视动物，当其发展后肢麻痹或其他濒死情况的时候将其人道的处死。另外，如果失去多于20％的初始体重时，将小鼠处死。使用Prism(v4.03)软件包(GraphPadSoftware，Inc.)的Kaplan-Meier绘图(对数秩分析)分析存活曲线。在分析中对通过临界Z检验确定的一些离群值进行终检。
实施例1.CH3-AD2-IgG表达载体
pdHL2哺乳动物表达载体已被用于表达重组IgG(Qu等，Methods2005，36：84-95)。生成一种质粒穿梭载体来辅助将任何IgG-pdHL2载体转变为CH3-AD2-IgG-pdHL2载体。使用PdHL2载体作为模板并使用以下寡核苷酸引物通过PCR扩增Fc(CH2和CH3结构域)基因：
Fc BglII左
AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG(SEQ ID NO：1)
Fc Bam-EcoRI右
GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG(SEQ ID NO：2).
将扩增引物克隆于pGemT PCR克隆载体(Promega)中。使用Xba I和Bam HI将Fc插入片段由pGemT中剪切并且与通过使用Xba I和Bam HI消化h679-Fab-AD2-pdHL2(Rossi等，Proc Natl Acad Sci USA 2006，103：6841-6)制备的AD2-pdHL2载体连接以生成穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。为了将IgG-pdHL2表达载体转化为CH3-AD2-IgG-pdHL2表达载体，将861bp的BsrG I/Nde I限制片段从前者剪切下来并使用剪切自Fc-AD2-pdHL2载体的952bp的BsrG I/Nde I限制片段取代。以下为部分已生成并用于生产重组人源化IgG-AD2模块的CH3-AD2-IgG-pdHL2表达载体的部分列表：
CH3-AD2-IgG-hA20(抗CD20)
CH3-AD2-IgG-hLL2(抗CD22)
CH3-AD2-IgG-hL243(抗HLA-DR)
CH3-AD2-IgG-hLL 1(抗CD74)
CH3-AD2-IgG-hR1(抗IGF-1R)
CH3-AD2-IgG-h734(抗铟-DTPA)。
实施例2.CH3-AD2-IgG的生产
转染和选择稳定的C H3 -AD2-IgG分泌细胞系
所有的细胞系均在杂交瘤SFM(Invitrogen，Carlsbad CA)中生长。通过使用Sal I限制性内切酶消化并通过电穿孔(450伏，25μF)转染进入Sp2/0-Ag14(2.8×106细胞)将CH3-AD2-IgG-pdHL2载体(30μg)线性化。该pdHL2载体包含二氢叶酸还原酶的基因，允许使用氨甲喋呤(MTX)进行克隆选择和基因扩增。
转染之后，将细胞在96孔平板上铺板并在含有0.2μM MTX的培养基中选择转基因克隆。通过使用特异性抗独特型MAb涂层的96孔微量反应平板的夹心ELISA筛选各克隆的CH3-AD2-IgG生产率。将推定克隆的条件性培养基转移到微量平板孔中，并使用辣根过氧化物酶共轭的山羊抗人类IgG F(ab’)2(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA)检测融合蛋白。将给出最高信号的孔扩增并最终用于生产。
生产和纯化C H3 -AD2-IgG模块
为了生产融合蛋白，以2×105细胞/ml浓度在滚瓶培养中播种细胞并在37℃和5％CO2的条件下在滚瓶培养器中培养直至细胞存活率降低到低于25％(～10天)。使用离心、过滤和超滤浓缩到50倍的方法将培养肉汤澄清。为了纯化CH3-AD2-IgG模块，将浓缩的上清液上样到蛋白-A(MAb选择性)亲和柱上。使用PBS将该柱洗至基线并且使用0.1M甘油酸，pH2.5将该融合蛋白洗脱。
实施例3.基于干扰素(IFN)-α2b的DDD-模块的产生
用于在哺乳动物细胞中表达的IFN-α2b-DDD2-pdHL2的构建
使用PCR扩增IFN-α2b的cDNA序列得到包含以下特性的序列，其中XbaI和BamHI为限制性位点，信号肽为IFN-α2b天然信号肽，并且6His为六组氨酸标签：XbaI-信号肽-IFNα2b-6His-BamHI(6His于SEQID NO：28中公开)。所得分泌蛋白由在其C末端融合序列如下的多肽的IFN-α2b构成：
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTR
LREARA  (SEQ ID NO：3).
使用全长人类IFNα2b cDNA克隆(Invitrogen Ultimate ORF人类克隆产品编号#HORF01Clone ID IOH35221)为模板以及以下所列寡核苷酸为引物进行PCR扩增：
IFNA2XbaI左
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG(SEQ ID NO：4)
IFNA2BamHI右
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC(SEQ IDNO：5)
将PCR扩增引物克隆于pGemT载体中。如下制备用于连接IFN-α2b的DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体。使用Xba I和Bam HI将CH1-DDD2-Fab-hMN-14-pdHL2(Rossi等Proc Natl Acad Sci USA 2006，103：6841-6)载体消化，去除所有Fab基因序列但是保留DDD2编码序列。使用Xba I和Bam HI将IFN-α2b扩增引物从pGemT上剪切并连接到DDD2-pd HL2载体上以生成IFN-α2b-DDD2-pdHL2表达载体。
IFN-α2b-DDD2在哺乳动物细胞中表达
使用SalI将IFN-α2b-DDD2-pdHL2消化而线性化，并使用电穿孔稳定转染到Sp/ESF骨髓瘤细胞中(参见第11/877,728号美国专利申请，其实施例部分通过引用整体并入本文)。使用ELISA发现两个具有可检测水平的IFN-α2b的克隆。这两个克隆之一，命名为95，可在不显著降低生产率的情况下适应在无血清培养基中生长。随后将该克隆经五周使用从0.1到0.8μM增加浓度的MTX扩增。在此阶段，通过限制稀释将其亚克隆并将最高产的亚克隆(95-5)扩增。使用商业rIFN-α2b(Chemicon IF007，批号06008039084)为标准，生长在摇瓶中的95-5的估计产率为2.5mg/L。
从滚瓶中生长的分批培养物中纯化IFN-α2b-DDD2
将克隆95-5扩增到34个装有总共20L无血清杂交瘤SFM和0.8μMMTX的滚瓶中并使之到达末期培养。将培养肉汤处理并以如下所述使用固定化金属亲和色谱法(IMAC)将IFN-α2b-DDD2纯化。使用离心将上清液澄清，0.2μM过滤，渗滤到1×结合缓冲液(10mM咪唑，0.5M NaCl，50mM NaH2PO4，pH 7.5)中，浓缩为310mL，加入Tween 20达到最终浓度0.1％，并上样到30-mL Ni-NTA柱上。样品上样后，使用500mL 1×结合缓冲液中0.02％的Tween 20洗柱，然后使用290mL的30mM咪唑，0.02％Tween 20，0.5M NaCl，50mM NaH2PO4，pH 7.5洗柱。使用110mL的250mM咪唑，0.02％Tween 20，150M NaCl，50mM NaH2PO4，pH 7.5将产物洗脱。纯化得到大约6mg IFNα2b-DDD2。
在大肠杆菌中产生IFN-α2b-DDD2
也可将IFN-α2b-DDD2以可溶蛋白形式通过微生物发酵在大肠杆菌中表达。使用IFN-α2b-DDD2-pdHL2DNA为模板将编码序列通过PCR扩增。使用Nde I和Xho I限制性位点将该扩增引物克隆到pET26b大肠杆菌表达载体中。通过在18℃使用100μM IPTG对LB摇瓶进行12个小时诱导将蛋白在BL21pLysS宿主细胞中细胞内地表达。如上所述通过IMAC将可溶性IFN-α2b-DDD2从细胞溶解产物中纯化。
实施例4.生成包含连接在CH3-AD2-IgG上的四个IFN-α2b-DDD2部分的DNL轭合物
如下制备包含连接在CH3-AD2-IgG(图1)上的四个IFN-α2b-DDD2部分的DNL复合物。简要地，将所选CH3-AD2-IgG与大约两摩尔当量的IFN-α2b-DDD2组合，并在加入1mM EDTA和2mM还原型谷胱甘肽(GSH)后，将该混合物在温和的条件下在室温过夜还原。加入氧化型谷胱甘肽至2mM并将该混合物再置于室温12-24小时。通过蛋白A亲和柱纯化该DNL轭合物。制备四种所述DNL轭合物命名为20-2b、22-2b、hR1-2b和243-2b，每一种包含四个拷贝的分别定位于CH3-AD2-IgG-hA20(具有CD20特异性)、CH3-AD2-IgG-hLL2(具有CD22特异性)、CH3-AD2-IgG-hR1(具有IGF-1R特异性)和CH3-AD2-IgG-hL243(具有HLA-DR特异性)上的IFN-α2b。使用SE-HPLC对哺乳动物(m)或大肠杆菌(e)生成的IFN-α2b-DDD2制备的20-2b分析表明，每种20-2b显示出滞留时间与包含IgG和4个IFN-α2b基团的共价复合物一致的一个主峰(未显示)。在其他三种IFN-IgG轭合物中观察到相似的SE-HPLC谱。
实施例5.IFN-IgG轭合物的体外活性。
使用基于细胞的报道基因、病毒保护和淋巴瘤增殖测定法将20-2b的体外IFNα生物活性与商业聚乙二醇化IFNα2剂
Figure BPA00001250956700411
和
Figure BPA00001250956700412
进行比较。使用基于细胞的试剂盒确定特异性活性，其使用带有融合于干扰素刺激反应元件的报道基因的转基因人类前单核细胞系(图2A-2D)。20-2b(5300IU/pmol)的特异性活性大于
Figure BPA00001250956700413
(170IU/pmol)和
Figure BPA00001250956700414
(3400IU/pmol)(图2A)。以相似于20-2b的方法生产的734-2b、1R-2b和五种其他MAb-IFNα构建物(数据未显示)，均表现出相似的特异性活性(4000-8000IU/pmol)，表明生成该结构的DNL方法的一致性(图2A)。具有四个IFNα2b基团有助于增强MAb-IFNα的效力。当对IFNα等效物归一后，该特异性活性/IFNα比
Figure BPA00001250956700415
高大约10倍，并仅比
Figure BPA00001250956700416
低大约两倍。
在体外病毒保护检测中比较MAb-IFNα、和
Figure BPA00001250956700418
表明，MAb-IFNα保留类似
Figure BPA00001250956700419
的特异性活性的IFNα2b抗病毒活性并比
Figure BPA000012509567004110
活性高10倍(图2B)。
IFNα2b可在一些肿瘤细胞系中具有直接的抗增殖或细胞毒性作用。使用体外增殖检测法以对IFNα高度敏感的伯基特淋巴瘤细胞系(Daudi)进行20-2b活性的测量(图2C)。每个IFNα2剂在体外以高效力(EC50＝4-10pM)有效地抑制(＞90％)Daudi。然而，20-2b(EC50＝0.25pM)比非靶向MAb-IFNα构建物大约30倍的更加强效。在相当高的浓度下(EC50＞10nM)，20-2b的母体抗CD20MAb在多种淋巴瘤细胞中具有体外抗增殖活性，包括在Daudi中(Rossi等，2008，Cancer Res 68：8384-92)。Jeko-1细胞也被用于检测20-2b的体外活性，其为具有对IFNα和抗CD20较低敏感性的套细胞淋巴瘤细胞系(图2D)。Jeko-1对于母体抗CD20MAb仅为中度敏感，在EC50接近1nM时具有10％的最大抑制(Imax)。如以734-2b所示，Jeko-1(Imax＝43％；EC50＝23pM)比Daudi(Imax＝90％；EC50＝7.5pM)对IFNα2b较不响应。相比较于734-2b，20-2b在更大的程度上抑制Jeko-1(Imax＝65％)并表现出双相性剂量响应曲线(图2D)。在＜10pM，观察到归于IFNα2b活性的低浓度响应，其于Imax＝43％稳定，与734-2b相似。在100pM以上可明显观察到高浓度响应，其中Imax达到65％。20-2b的低浓度IFNα2b响应(EC50＝0.97pM)比734-2b有效25倍，与使用Daudi结果相类似。
对母体抗CD20抗体和734-2b(v-mab+734-2b)组合进行检测用来阐明20-2b效力的增加是否归因于CD20和IFNα信号转导的相加/协同效应。v-mab+734-2b的剂量响应曲线大部分与单独的734-2b相似，除了当＞1nM时，前者而非后者的抑制加强。这些结果表明MAb的靶向性造成20-2b较低的EC50，而其较高的Imax显然归因于IFNα2b和CD-20信号转导的相加活性。CD20信号转导的效果只在20-2b的高浓度响应(EC50＝0.85nM)中明显，其与对v-mab(EC50＝1.5nM)的响应平行。v-mab+734-2b的双相剂量响应曲线不明显，因为这两个响应重叠。然而，在＞1nM的浓度下有明显的相加效果。20-2b的Imax(65％)比IFNα2b(Imax＝43％)和v-mab(Imax＝10％)相加的响应高，表明IFNα2b和v-mab作用之间可能的协同作用。
ADCC活性
IFNα可通过活化NK细胞和巨噬细胞增强ADCC活性，其为抗CD20免疫疗法的基本作用机理(MOA)。我们使用两种NHL细胞系并使用外周血单核细胞(PBMC)作为效应物细胞来比较20-2b和v-mab的ADCC。使用来自多个捐赠者的PBMC的重复检测一致地表明20-2b具有比v-mab增强的ADCC，如在Daudi和Raji细胞中所示(图4A)。该效果也表现在22-2b(一种包含抗CD22MAb依帕珠单抗的MAb-IFNα)，其表现出中度ADCC(Carnahan等2007，Mol Immunol 44：1331-41)。
CDC活性
CDC被认为是I型抗CD20MAb(包括v-mab和利妥昔单抗)的重要MOA。然而在以托西莫单抗为代表的II型MAb中缺乏这种功能(Cardarelli等，2002，Cancer Immunol Immunother 51：15-24)，尽管其仍然具有抗淋巴瘤活性。与v-mab不同的是，20-2b在体外未表现出CDC活性(图4B)。所述结果与其他基于CH3-AD2-IgG-v-mab模块的DNL结构一致，其可能通过位阻影响，使其中补体结合受到明显损害(Rossi等，2008)。
实施例6.20-2b的药物动力学(PK)分析
使用雄性Swiss-Webster小鼠对20-2b的药物动力学(PK)性质进行评估并与
Figure BPA00001250956700431
PEG-INTRON和α2b-413(使用DNL制备的聚乙二醇化IFN，参见第11/925,408号美国专利申请)进行比较。使用ELISA根据生产商的说明书在各时间确定IFN-α在血清样品中的浓度。简要地说，根据试剂盒中提供的人类IFN-α标准品将血清样品适当的稀释。结合于微量滴定板上的抗体捕获干扰素。然后使用二级抗体显示结合的干扰素，在加入四甲基联苯胺(TMB)后，通过共轭在辣根过氧化物酶(HRP)的抗二级抗体量化干扰素。在450nm读板。图3所示为PK分析的结果，其显示20-2b相对于其他剂显著较慢的消除和较长的血清滞留期。在注射剂量为210pmol的情况下，计算所得的药物动力学血清半衰期为8.0hr(20-2b)、5.7hr(α2b-413)、4.7hr
Figure BPA00001250956700432
和2.6hr(PEG-INTRON)。消除速率(1/h)为0.087(20-2b)、0.121(α2b-413)、0.149
Figure BPA00001250956700433
和0.265(PEG-INTRON)。计算所得MRT0.08→∞(hr)为22.2(20-2b)、12.5(α2b-413)、10.7
Figure BPA00001250956700434
和6.0(PEG-INTRON)。由于药物动力学参数更多的决定于该复合物的性质而非个体抗体或细胞因子，预期细胞因子-DNL复合物的PK特性可通用于其他细胞因子部分和抗体部分而不限于以上所讨论的特定20-2b构建物。
实施例7.20-2b的体内活性
血清稳定性.
20-2b在37℃在人类血清(≥10天)或全血(≥6天)中稳定(未显示)。使用双特异性ELISA检测法确定20-2b复合物的浓度。在检测的时段中，在全血或血清中血清20-2b水平几乎没有可检测的变化。
20-2b抗源于全人血的淋巴瘤细胞的活体外效力
我们比较了20-2b、v-mab、734-2b或v-mab+734-2b在活体外条件下从全血中排除淋巴瘤或正常B细胞的能力(图5)。裸的抗CD20MAb的治疗效力被认为通过三种作用机制(MOA)实现-信号转导诱导的凋亡或生长停滞、ADCC和CDC(Glennie等，2007，MolImmunol 44：3823-37)。在本项检测中，v-mab可采用所有三种MOA，然而，根据体外研究结果，20-2b可潜在的利用信号转导并加强ADCC，而非CDC。在该短期模型中，20-2b和734-2b的IFNα2b基团可直接作用于肿瘤细胞，增加v-mab的ADCC活性，并可能具有一些免疫刺激效应。然而，在持续两天的活体外检测中，没有实现可能在体内发生的IFNα-介导的全谱先天性和获得性免疫系统的活化。
在0.01nM，20-2b(60.5％)比v-mab(22.8％)、734-2b(38.6％)或v-mab+734-2b(41.7％)耗竭显著更多的Daudi细胞(图5)。在0.1nM，20-2b和v-mab+734-2b耗竭相似程度的Daudi(88.9％)，比v-mab(82.4％)或734-2b(40.7％)多(图5)。在1nM，除了734-2b(55.7％)，各剂耗竭＞95％的Daudi(图5)。每个所指差异均为统计显著的(P＜0.01)。
对IFNα2b和v-mab，Ramos不如Daudi敏感。734-2b的效果仅为中等，在每个浓度上造成耗竭＜20％的Ramos(图5)。在0.01和0.1nM，20-2b比v-mab+734-2b耗竭更多Ramos，其转而比v-mab排除更多细胞(图5)。在1nM，除了734-2b以外所有的处理都得到相似的Ramos耗竭(75％)(图5)。每个所指差异均为统计显著的(P＜0.02)。
如734-2b所示，在本检测中单独IFNα2b不能耗竭正常B细胞。在这些低浓度下，20-2b、v-mab和v-mab+734-2b均表现相似的耗竭B细胞的剂量响应，比对Daudi或Ramos的耗竭显著减少。所有处理均不导致显著的T细胞耗竭(数据未显示)。
20-2b在SCID小鼠中的体内效力
小鼠模型的一个限制为鼠细胞对人类IFNα2b的低敏感度。20-2b可在人类中实现的整体治疗益处可包括增强先天性和获得性免疫。在了解这些限制性之后，我们研究了20-2b在SCID小鼠中抗弥散性伯基特淋巴瘤模型的体内抗淋巴瘤效力。我们起初测试了高敏感的早期Daudi模型(图6A)。接种后一天，各组接受单个低剂量的20-2b、v-mab或734-2b。将在0.7pmol(170ng)单剂量下的v-mab或734-2b与盐水相比较，v-mab导致存活明显增加(P＜0.0001)，但不相关MAb-IFNα对照734-2b并未表现存活的增加(图6A)。所述增加为中等，中值存活时间(MST)从盐水的27天增加到v-mab的34天。然而，单剂量0.7pmol(170ng)的20-2b比盐水对照和v-mab组将MST增加了多于100天(P＜0.0001)(图6A)。该项研究在19周以后停止，并在此时对在0.7pmol 20-2b处理组的7个长期生存者(LTS)进行尸体剖检，并未发现可见的疾病迹象(治愈)(图6A)。值得注意的是，即使最低浓度0.07pmol(17ng)的20-2b都多于加倍的延长了MST(图6A)。
接下来，我们检测20-2b在更具挑战性的晚期Daudi模型中的效力，其中允许小鼠在处理前形成本质上更大的肿瘤负担(图6B)。肿瘤接种后七天，向各组施用单个低剂量(0.7、7.0或70pmol)的20-2b、v-mab、734-2b或
Figure BPA00001250956700451
盐水对照小鼠的MST为21天(图6B)。
Figure BPA00001250956700452
或734-2b均具有增强的Pk(相较于重组IFNα2b)但是不靶向于肿瘤，其最高剂量(70pmol)加倍了MST(42天；P＜0.0001)(图6B)。使用20-2b在低100倍的低剂量(0.7pmol)处理产生与最高剂量(70pmol)的
Figure BPA00001250956700453
或734-2b相似的结果(38.5天)(图6B)。使用20-2b在10倍低剂量(7pmol)处理得到比使用70pmol的
Figure BPA00001250956700454
或734-2b显著增加的存活(80.5天，20％LTS)(P＜0.0012)(图6B)。在所检测的最高剂量(70pmol)，20-2b将MST增加至＞105天并有100％LTS(图6B)。在早期肿瘤模型中我们已经证明v-mab在相对低的剂量下(3.5pmol)可增加带有Daudi的小鼠的存活，而较高剂量则导致LTS。然而，在该晚期肿瘤模型中，单剂量为70pmol的v-mab对于存活仅具有显著但是中等的效应(MST＝24天，P＝0.0001)(图6B)。
我们随后在更具挑战性的模型中检测20-2b，该模型对于IFNα直接抑制比Daudi更不敏感，并对于v-mab免疫疗法更不响应。Raji比Daudi对于IFNα2b直接作用的敏感度小～1000倍。然而，Raji具有和Daudi相似的CD20抗原密度(Stein等2006，Blood 108：2736-44)并对v-mab响应，尽管比Daudi的响应小很多(Goldenberg等，2009，Blood 113，1062-70)。在肿瘤接种五天后开始治疗，在晚期Raji模型中研究20-2b的效力(图7A)。各组经两周接受共6次注射给药(每次250pmol)。相对于盐水，734-2b没有增加存活(MST＝16天)，这与Raji对IFNα不敏感性相一致(图7A)。相对于盐水，v-mab显著增加存活(MST＝26天，P＜0.0001)(图7A)。20-2b比其它所有处理更有效(MST＝33天，P＜0.0001)(图7A)。
最后，我们研究了20-2b对NAMALWA的效力(图7B)，NAMALWA为一种对IFNα2b直接作用具有低敏感性，相对于Daudi或Raji的CD20抗原密度低～25倍，并且被认为对抗CD20免疫疗法有抗性的人类淋巴瘤(Stein等，2006)。向各组施用共6个剂量(每个剂量250pmol)的20-2b或734-2b。向另一组施用共7个剂量(每个剂量3.5nmol)的v-mab。盐水处理的组具有17天的MST(图7B)。734-2b处理的组具有显著但是非常中度的生存的增加(MST＝20天，P＝0.0012)(图7B)。20-2b(MST＝34天)比734-2b(P＝0.0004)和v-mab(MST＝24天，P＝0.0026)更有效，且v-mab所给剂量比20-2b高14倍(图7B)。
结论
所得结果明确表明将IFNα靶向于抗CD20MAb上使得该免疫细胞因子比任一种剂单独使用或联合使用更强效和有效。MAb将IFNα靶向到肿瘤上使得可以更低频率的时间表给药单独剂，减低或消除IFN疗法相关的副作用，并得到深刻增强的效力。另外，靶向的IFNα可诱发急性肿瘤定向免疫反应，并可能通过对先天性和获得性免疫的多效性刺激而唤起免疫记忆(Belardelli等2002，Cytokine Growth Factor Rev 12：119-34)。通过化学轭合生成MAb-IFNα的其他组揭示了所述构建物的一些潜在临床益处(Pelham等，1983，Cancer Immunol Immunother 15：210-16；Ozzello等，1998，Breast Cancer Res Treat 48：135-47)。包含鼠IFNα和抗HER2/neu MAb的重组MAb-IFNα在具有免疫活性的小鼠中表现出对转基因(HER2/neu)鼠B细胞淋巴瘤的强效抑制，并可根据免疫记忆诱发保护性获得性免疫反应(Huang等，2007，J Immunol 179：6881-88)。
我们预期20-2b疗法将刺激包括NK、T4、T8和树突状细胞的若干免疫细胞的局部募集和活化，导致加强的细胞毒性和ADCC，并可潜在的诱发肿瘤定向免疫记忆。然而，对于人类IFNα2b，鼠细胞的敏感度相对人类细胞极大的减少(～4logs)(Kramer等，1983，J Interferon Res 3：425-35；Week等，1981，J Gen Virol 57：233-37)。因此，在以上所述体内研究中，在鼠模型内，即使有，也是非常少的20-2b的抗淋巴瘤活性可归因于IFNα2b对鼠免疫反应的活化。反而，死亡主要是由于IFNα2b对淋巴瘤细胞的直接作用。
我们已经显示20-2b可增强ADCC，这可能为抗CD20免疫疗法的最重要的MOA。然而，由于人类IFNα2b仅为鼠宿主免疫效应细胞的非常弱刺激剂，可能不会像在人类中那样实现IFNα增强的ADCC。即使具有所述局限性，体内实验结果仍表明20-2b可为高效的抗淋巴瘤剂，在IFNα敏感性Daudi模型中表现出比v-mab或非靶向性MAb-IFNα多100倍的效力。即使在对IFNα直接作用相对不敏感(Raji/NAMALWA)或对抗CD20免疫疗法具有抗性(NAMALWA)的淋巴瘤模型中，20-2b仍表现出比v-mab或非靶向性MAb-IFNα更高的效力。
融合到v-mab上的IFNα2b通过延长循环时间和允许肿瘤靶向而增强其体内效力。在Daudi模型中展示出Pk的治疗显著性，其中较慢清除的优于比较快清除的
Figure BPA00001250956700472
尽管后者具有更高的特异性活性(数据未显示)。20-2b比
Figure BPA00001250956700473
或734-2b都有可观的更大效力，表明通过抗CD20MAb靶向淋巴瘤对于其更优效力和效能起到决定性作用。出乎意料的是，靶向的作用在体外测定中也很显著。在体外增殖实验中，仅允许通过信号转导对淋巴瘤进行抑制，相对于非靶向的MAb-IFNα，不论在单独或联合v-mab的情况下，20-2b均在相对低25倍的浓度下表现出活性。活体外条件允许涉及到所有的三种抗CD20MOA。即使没有CDC活性，不论在单独或联合的情况下，20-2b都比IFNα或v-mab更有效的从血液中耗竭淋巴瘤，表明了靶向的重要性。而在体外/活体外研究中MAb靶向的影响多少有些出乎意料，因为MAb、效应物、和靶标细胞在整个实验中全部受限。我们预期在人类患者的体内实验中，20-2b将具有实质上更大的影响。
20-2b的IFN α2b和v-mab组成部分很显然可以相加或协同作用，以促成其增强的效力。体外增殖测定表明有至少一种相加作用，其通过在活体外研究中得到联合v-mab和734-2b优于单独使用任何一种剂的结果证实。这可在活体外通过增加作为20-2b的一部分的v-mab的ADCC活性或者与734-2b联合时实现，然而在体外增殖测定中ADCC仍然不具功能性，表明存在其他机制。结合v-mab的CD20引起的信号传导可增强IFNα信号，导致增强的效力。另外，与v-mab(其为一种缓慢内化的MAb)结合可阻止I型IFN受体的内化/下调，导致更长时间和有效的IFNα-诱导的信号。
实施例8.基于红细胞生成素(EPO)的DDD模块的生成
构建在哺乳动物细胞中表达的EPO-DDD2-pdHL2
使用PCR扩增EPO的cDNA序列得到包含以下性质的序列，其中XbaI和Bam HI为限制性位点，信号肽为天然人类EPO，并且6His为六组氨酸标签：XbaI-信号肽-EPO-6His-BamHI(6His公开于SEQ IDNO：28)。所得分泌蛋白由在其C末端融合如下多肽的EPO构成：
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：3)
使用全长人类EPO cDNA克隆作为模板并使用以下寡核苷酸作为引物进行PCR扩增：
EPOXba I左
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGGGGTGCACGAATGTCC(SEQ ID NO：6)
EPO BamHI右
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTCTGTCCCCTGTCCTGCAG(SEQ IDNO：7)
将PCR扩增引物克隆到pGemT载体上。通过使用XbaI和Bam HI限制性内切酶消化而制备用于与EPO连接的DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体。通过使用XbaI和Bam HI将EPO扩增引物从pGemT上剪切并连接进入DDD2-pdHL2载体以生成表达载体EPO-DDD2-pdHL2。
EPO-DDD2在哺乳动物细胞中的表达
通过SalI酶消化使EPO-pdHL2线性化，并将其通过电穿孔方法稳定转染进入Sp/ESF骨髓瘤细胞。使用含有0.15μM MTX的培养基对克隆进行选择。通过使用Nunc Immobilizer镍-螯合物平板的ELISA检测法捕获His-标签的融合蛋白并以抗EPO抗体检测，克隆#41、49和37分别表现出生成～0.5mg/L的EPO。由IMAC从9.6升无血清滚瓶培养物中纯化出大约2.5mg的EPO-DDD2。
实施例9.制备734-EPO，一种包含连接在CH3-AD2-IgG-h734上的四个EPO-DDD2部分的DNL轭合物
根据以上制备20-2b的方法制备734-EPO。对使用蛋白A-纯化过的734-EPO的SE-HPLC分析显示一个主峰和一个较高分子大小的肩峰(未显示)。主峰的滞留时间与包含IgG和4个EPO基团的共价复合物一致。肩峰有可能归因于IgG-EPO轭合物的非共价二聚体。使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析以及抗EPO免疫印迹分析显示，在非还原条件下该产物具有＞260kDa的分子量(未显示)，与推断的分子量～310kDa相一致。在还原条件下，代表734-EPO三种组分多肽(EPO-DDD2、重链-AD2和轻链)的带明显可见并表现为相似的量(未显示)。未检测到非产物污染。
使用重组人类EPO(Calbiochem)作为阳性对照，检测EPO-DDD2和734-EPO刺激EPO反应性TF1细胞(ATCC)生长的能力。将TF1细胞在补充20％FBS但没有补充GM-CSF的RPMI 1640培养基中，以1×104细胞/孔的浓度在96孔板中培养。使用商业试剂盒(人类红细胞生成素ELISA试剂盒，Stem Cell Research，产品号#01630)确定EPO构建物的浓度(单位/ml)。在存在浓度范围为900u/ml到0.001U/ml的rhEPO、EPO-DDD2或734-EPO的条件下将细胞培养72小时。使用MTS测定比较活细胞密度，使用20μl MTS试剂/孔，在使用96孔板读板器测量OD490之前，培养6小时。使用Graph Pad Prism软件生成剂量响应曲线和EC50值(图8)。EPO-DDD2和734-EPO均表现出大概为rhEPO的10％的体外生物活性。
实施例10.基于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的DDD模块的产生
构建在哺乳动物细胞中表达的G-CSF-DDD2-pdHL2
使用PCR扩增G-CSF的cDNA序列，得到包含以下性质的序列，其中信号肽为人类G-CSF天然的信号肽，并且6His为六组氨酸标签：Xba I-信号肽-G-CSF-6His-Bam HI(6His公开于SEQ ID NO：28)。所得分泌蛋白由在其C末端融合SEQ ID NO：3组成的多肽的G-CSF构成。
使用全长人类G-CSF cDNA克隆(Invitrogen IMAGE人类产品编号#97002RG克隆ID 5759022)作为模板并使用以下寡核苷酸作为引物进行PCR扩增：
G-CSFXbaI左
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCTGGACCTGCCACCCAG(SEQ ID NO：8)
G-CSF BamHI-右
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG(SEQID NO：9).
将PCR扩增引物克隆到pGemT载体上。通过使用XbaI和Bam HI限制性内切酶消化而制备用于与G-CSF连接的DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体。通过使用XbaI和Bam HI将G-CSF扩增引物从pGemT上剪切并连接进入DDD2-pdHL2载体以生成表达载体G-CSF-DDD2-pdHL2。
G-CSF-DDD2在哺乳动物细胞中的表达
通过Sal I酶消化使得G-CSF-pdHL2线性化，并将其通过电穿孔方法稳定转染进入Sp/ESF骨髓瘤细胞。使用含有0.15μMMTX的培养基对克隆进行选择。通过夹心ELISA检测，克隆#4表现出生成～0.15mg/L的G-CSF-DDD2。
从生长在滚瓶中的分批培养物中纯化G-CSF-DDD2
将克隆#4扩大到含0.4μM MTX，总量为20L杂交瘤SFM的34个滚瓶中并使之到达末期培养。使用离心，过滤(0.2μM)，渗滤到1×结合缓冲液(10mM咪唑，0.5M NaCl，50mM NaH2PO4，pH 7.5)中将上清液澄清并浓缩。使用IMAC纯化浓缩液。
在大肠杆菌中构建和表达G-CSF-DDD2
将G-CSF-DDD2以可溶性蛋白的形式通过微生物发酵在大肠杆菌中表达。使用G-CSF-DDD2-pdHL2DNA为模板将编码序列通过PCR扩增。使用Nde I和Xho I限制性位点将该扩增引物克隆到pET26b大肠杆菌表达载体中。通过在18℃使用100μM IPTG对LB摇瓶进行12个小时诱导，将蛋白在BL21pLysS宿主细胞中细胞内地表达。使用IMAC将可溶性G-CSF-DDD2从细胞溶解产物中纯化。
在大肠杆菌中构建和表达N-DDD2-G-CSF(C17S)
通过将DDD2序列与肽间隔子融合在G-CSF(C17S)的N末端上而生成另一种G-CSF-DDD2模块，其通过使用丝氨酸取代在第17位上的不配对的半胱氨酸残基而与野生型不同。在大肠杆菌中表达N-DDD2-G-CSF(C17S)并使用IMAC纯化。
实施例11.制备hR1-17S，一种包含连接在CH3-AD2-IgG-hR1上的四个N-DDD2-G-CSF(C17S)部分的DNL轭合物
通过在氧化还原条件下将CH3-AD2-IgG-hR1与过量N-DDD2-G-CSF(C 17S)联合而生成hR1-17S，并随后使用蛋白A亲和色谱法纯化。对蛋白A纯化过的hR1-17S的SE-HPLC分析显示出一个主峰和一个较高分子大小的肩峰(未显示)。主峰的滞留时间与包含IgG和4个G-CSF基团的共价复合物一致。肩峰有可能归因于IgG-G-CSF轭合物的非共价二聚体。使用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析和抗G-CSF免疫印迹分析显示，在非还原条件下该产物的分子量与推断的分子量～260kDa相一致。在还原条件下，检测到代表hR1-17S三种组分的多肽(N-DDD2-G-CSF(C17S)、重链-AD2和轻链)的带(未显示)。
实施例12.序列变体
在某些优选的实施方案中，将AD和DDD序列整合到包含AD2和DDD2的氨基酸序列的细胞因子-MAb DNL复合物中，如下所示。
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：10)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：11)
然而，在替代实施方案中，可使用序列变体AD和/或DDD部分构建细胞因子-MAb DNL复合物。AD和DDD结构域的结构功能关系已成为研究对象。(参见例如，Burns-Hamuro等，2005，Protein Sci14：2982-92；Carr等，2001，J Biol Chem 276：17332-38；Alto等，2003，Proc Natl Acad Sci USA100：4445-50；Hundsrucker等，2006，Biochem J 396：297-306；Stokka等，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等，2006，Mol Cell 24：383-95；Kinderman等，2006，Mol Cell 24：397-408，每篇文章的内容均通过引用整体并入本文。)
例如，Kinderman等(2006)研究了AD-DDD结合相互作用的晶体结构并得出结论：人类DDD序列包含若干在二聚体形成或AKAP结合中重要的保守氨基酸残基，在SEQ ID NO：12中以下划线标出(参见Kinderman等，2006中的图1，通过引用并入本文。)本领域技术人员将会认识到，在设计DDD序列的序列变体的时候，人们将期望避免改变任何下划线标出的残基，而对二聚化和AKAP结合不甚关键的残基可进行保守氨基酸取代。
来自蛋白激酶A的人类DDD序列
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：12)
Alto等(2003)对各种AKAP蛋白的AD序列进行了生物信息学分析，以设计一种称作AKAP-IS的对DDD的结合常数为0.4nM的RII选择性AD序列(SEQ ID NO：17)。该AKAP-IS序列被设计为AKAP结合PKA的肽拮抗剂。在AKAP-IS序列中，取代将会倾向于降低其与DDD的结合的残基在SEQ ID NO：13中由下划线标出。
AKAP-IS序列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：13)
相似的，Gold(2006)使用晶体学和肽筛选开发了SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO：14)，对PKA的RII同种型显示出相对其RI同种型高出五个数量级的选择性。下划线标出的残基表明相对于AKAP-IS序列，增加与RIIα的DDD部分结合的氨基酸取代的位点。在此序列中，N末端的Q残基编号为残基第4号并且C末端的A残基编号为残基第20号。可通过进行取代来影响对RIIα的亲和性的残基为残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等，2006)。在某些替代实施方案中，考虑到可将AKAP-IS AD部分序列用SuperAKAP-IS序列取代以制备细胞因子-MAb DNL构建物。其他可用于取代AKAP-IS AD序列的替代序列如SEQ ID NO：15-17中所示。相对于AKAP-IS序列的取代由下划线标出。可预期的是，如同在SEQID NO：11中所示的AKAP-IS序列一样，该AD部分可能也包括另外的N末端半胱氨酸残基和甘氨酸残基和C末端的甘氨酸残基和半胱氨酸残基，如SEQ ID NO：11中所示。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：14)
替代AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：15)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：16)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：17)
Stokka等(2006)也开发出与AKAP竞争结合PKA的肽竞争者，如SEQ ID NO：18-20所示。这些肽拮抗剂命名为Ht31(SEQ ID NO：18)、RIAD(SEQ ID NO：19)和PV-38(SEQ ID NO：20)。Ht-31肽显示了对PKA的RII同种型的较大亲和性，而RIAD和PV-38显示出对RI的较高亲和性。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：18)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：19)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：20)
Hundsrucker等(2006)也开发出对PKA的RII型的DDD结合常数低至0.4nM的与AKAP竞争结合PKA的其他肽竞争者。各种AKAP肽拮抗剂的序列在Hundsrucker等(通过引用并入本文)的表1中提供。在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基以参考AKAP IS序列(SEQ IDNO：13)用下划线标记如下。这些残基与Alto等(2003)的观察一致，具有另外的C末端丙氨酸残基(参见Hundsrucker等(2006)的图4，通过引用并入本文。)对RII DDD序列具有特别高的亲和性的肽拮抗剂的序列如SEQ ID NO：21-23中所示。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：13)
AKAP7δ-wt-pep
PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：21)
AKAP7δ-L304T-pep
PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：22)
AKAP7δ-L308D-pep
PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：23)
Carr等(2001)研究了人类和非人类蛋白的不同AKAP结合DDD序列的序列同源性程度，并鉴定出在不同DDD部分之间，在DDD序列中显示为最高度保守的残基。这些残基参考SEQ ID NO：12的人类PKA RIIαDDD序列以下划线标示如下。特别保守的残基更进一步用斜体标出。这些残基与Kinderman等(2006)所提出的对于结合AKAP蛋白有重要作用的残基有所重叠，但是不完全相同。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：12)
本领域技术人员将会认识到，一般情况下来源于不同蛋白的DDD和AD序列中高度保守的氨基酸残基为当进行氨基酸取代时优选保持恒定的氨基酸残基，而对并非如此高度保守的残基则可更容易的进行变化以生成本文中所述的AD和/或DDD序列的变体。
除了DDD和/或AD部分的序列变体，在某些实施方案中，优选可以向抗体部分或将抗体与AD序列连接的连接肽序列中引入序列变化。在一个说明性实例中，以上所述的20-2b重链的C末端残基可由天然赖氨酸残基变化所得。该野生型重链C末端序列，和三种可能的融合蛋白序列变体如SEQ ID NO：24-27中所示。
WT
QKSLSLSPGK(SEQ ID NO：24)
(L)
QKSLSLSPGLGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：25)
(A)
QKSLSLSPGAGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：26)
(-)
QKSLSLSPGGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：27)
使用亮氨酸取代重链恒定区序列中野生型C末端赖氨酸残基以生成命名为hA20(L)的序列变体。如以上实施例中所述，将亮氨酸取代序列整合入hA20(L)-2b DNL构建物以形成20-2b构建物。注射不同DNL构建物后的第1、2、3和4天取出小鼠血清样品以比较变体的药物动力学特性。已确定在每个时间点，20(L)-2b构建物注射的小鼠血清中的干扰素的血清浓度比20-2b构建物注射的小鼠高两倍。然而，比较20(L)-2b和20-2b构建物注射小鼠的hA20IgG血清浓度显示在本质上无差别。由此可得出结论：使用亮氨酸取代野生型赖氨酸导致从抗体IgG部分上蛋白水解性裂解AD部分的减少，该蛋白水解导致IFN从复合物上丢失，随之而来的是相对于结合于DNL构建物的IFN，非轭合的IFN有更高的血清清除率。本领域技术人员将会认识到，在DNL构建物中的抗体部分或连接子部分的所述及其他氨基酸取代可用于增强所得DNL构建物的治疗特性和/或药物动力学特性。
本文公布和要求保护的所有组合物和方法可依照本文所公布内容生成和使用而无需不必要的实验。尽管组合物和方法已经以优选实施方案的方式进行描述，对于本领域技术人员明显的是，可对本文所述的组合物和方法或对方法中的步骤或步骤顺序加以变化而不背离本发明的概念、主旨和范畴。更具体的，可使用某些化学上和生理上相关的剂替换本文所述的剂而达到相同或相似结果。所有对本领域技术人员来说明显的这样的相似替换和修改视为在以所附权利要求书所界定的本发明主旨、范畴和概念之内。
Figure IPA00001250956200011
Figure IPA00001250956200021
Figure IPA00001250956200031
Figure IPA00001250956200041
Figure IPA00001250956200051
Figure IPA00001250956200061
Figure IPA00001250956200071
Figure IPA00001250956200081
Figure IPA00001250956200091
Figure IPA00001250956200101
Figure IPA00001250956200111
Figure IPA00001250956200121

Claims (31)

1.一种细胞因子-抗体DNL(停靠与锁)复合物，包含：
a)附加在DDD(二聚化和停靠结构域)部分的细胞因子部分，其中所述DDD部分具有来自于蛋白激酶A的二聚化和停靠结构域的肽序列；和
b)附加在AD(锚定结构域)部分的抗体部分，其中所述AD部分具有来自于AKPA(A-激酶锚定蛋白)的锚定结构域的肽序列；
其中所述DDD部分形成结合于一个所述AD部分的二聚体以形成所述复合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，其进一步包含在所述DDD部分和所述AD部分之间的二硫键。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中所述DDD部分包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的复合物，其中所述AD部分包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的复合物，其中所述抗体部分选自IgG抗体和抗体的抗原结合片段组成的组。
7.根据权利要求6所述的复合物，其中所述抗体部分为IgG抗体，并且所述IgG抗体的每条重链的C-末端附加于一个所述AD部分上。
8.根据权利要求6所述的复合物，其中每个所述AD部分与两个所述DDD部分结合，并且所述复合物包含四个所述细胞因子部分。
9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述细胞因子部分选自干扰素(IFN)-α2b、G-CSF和红细胞生成素组成的组。
10.根据权利要求7所述的复合物，其中所述IgG重链与所述AD部分形成第一融合蛋白，并且所述细胞因子部分与所述DDD部分形成第二融合蛋白。
11.根据权利要求1所述的复合物，其中相对于单独的所述细胞因子和聚乙二醇化形式的所述细胞因子，所述细胞因子-抗体DNL复合物表现出更长的血清半衰期。
12.根据权利要求1所述的复合物，其中相对于单独的所述细胞因子部分、单独的所述抗体部分、未轭合的所述细胞因子部分与未轭合的所述抗体部分的组合、以及聚乙二醇化形式的所述细胞因子部分，所述细胞因子-抗体DNL复合物表现出针对淋巴瘤细胞更强的体内效力。
13.根据权利要求1所述的复合物，其中所述抗体部分为hA20IgG抗体，并且所述细胞因子部分为人类IFNα2b。
14.一种治疗选自癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病组成的组的疾病的方法，包括：
a)获取根据权利要求1的细胞因子-抗体DNL复合物；并
b)向患有所述疾病的受治疗者施用所述复合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病为癌症，并且所述抗体部分与肿瘤相关抗原(TAA)结合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述TAA选自以下组成的组：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤维连接蛋白的ED-B、H因子、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MU C4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、和癌基因产物。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体部分选自以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗MUC1)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗CD74)、hMN-14(抗CEA)、hMN-15(抗CEA)、hRS7(抗EGP-1)和hMN-3(抗CEA)。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述DDD部分包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，并且所述AD部分包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述复合物包含IgG抗体，并且所述IgG抗体的每条重链的C-末端附加于一个所述AD部分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中每个所述AD部分与两个所述DDD部分结合，并且所述复合物包含四个所述细胞因子部分。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞因子部分选自干扰素(IFN)-α2b、G-CSF和红细胞生成素组成的组。
22.根据权利要求15所述的方法，其中相对于单独的所述细胞因子部分、单独的所述抗体部分、未轭合的所述细胞因子部分与未轭合的所述抗体部分的组合、以及聚乙二醇化形式的所述细胞因子部分，所述细胞因子-抗体DNL复合物表现出针对淋巴瘤细胞更强的体内效力。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体部分为hA20IgG抗体，并且所述细胞因子部分为人类IFNα2b。
24.一种递送细胞因子的方法，包括：
a)获取根据权利要求1的细胞因子-抗体DNL复合物；并且
b)向受治疗者施用所述复合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病为癌症，并且所述抗体部分与肿瘤相关抗原(TAA)结合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述TAA选自以下组成的组：碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤维连接蛋白的ED-B、H因子、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、和癌基因产物。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体部分选自以下组成的组：hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗MUC1)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗CD74)、hMN-14(抗CEA)、hMN-15(抗CEA)、hRS7(抗EGP-1)和hMN-3(抗CEA)。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述DDD部分包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列，并且所述AD部分包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述复合物包含IgG抗体，并且所述IgG抗体的每条重链的C-末端附加于一个所述AD部分。
30.根据权利要求29所述的方法，其中每个所述AD部分与两个所述DDD部分结合，并且所述复合物包含四个所述细胞因子部分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞因子部分选自干扰素(IFN)-α2b、G-CSF和红细胞生成素组成的组。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体部分为hA20IgG抗体，并且所述细胞因子部分为人类IFNα2b。
CN2009801150535A 2008-04-10 2009-04-06 采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法 Pending CN102119175A (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4393208P 2008-04-10 2008-04-10
US61/043,932 2008-04-10
US10491608P 2008-10-13 2008-10-13
US61/104,916 2008-10-13
US11954208P 2008-12-03 2008-12-03
US61/119,542 2008-12-03
US12/396,965 US7871622B2 (en) 2005-04-06 2009-03-03 Stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
US12/396,605 2009-03-03
US12/396,965 2009-03-03
US12/396,605 US7858070B2 (en) 2005-10-19 2009-03-03 Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
PCT/US2009/039619 WO2009126558A1 (en) 2008-04-10 2009-04-06 Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (dnl) technology

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102119175A true CN102119175A (zh) 2011-07-06

Family

ID=43033575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801150535A Pending CN102119175A (zh) 2008-04-10 2009-04-06 采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP2271364B1 (zh)
JP (1) JP5699362B2 (zh)
CN (1) CN102119175A (zh)
AU (1) AU2009233925B2 (zh)
BR (1) BRPI0911427A2 (zh)
CA (1) CA2720748C (zh)
WO (1) WO2009126558A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104363919A (zh) * 2012-06-01 2015-02-18 Ibc药品公司 具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物
CN108495865A (zh) * 2015-12-23 2018-09-04 美天旎生物技术有限公司 具有细胞因子受体激活或阻断结构域的嵌合抗原受体

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8491914B2 (en) 2004-02-13 2013-07-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) complexes for delivery of interference RNA
US8652484B2 (en) 2004-02-13 2014-02-18 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
US8481041B2 (en) 2005-04-06 2013-07-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Dock-and-lock (DNL) constructs for human immunodeficiency virus (HIV) therapy
US8475794B2 (en) 2005-04-06 2013-07-02 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-CD74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, Autoimmune disease and other diseases
EP2496256A4 (en) * 2009-11-05 2013-07-17 Ct Molecular Med & Immunology IMMUNOCONJUGATES COMPRISING PEPTIDES FROM POXVIRUS AND ANTIBODIES DIRECTED AGAINST ANTIGEN-PRESENTING CELLS FOR SUBUNIT-BASED POXVIRUS VACCINES
WO2011072124A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-16 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
CN102665758A (zh) * 2009-12-09 2012-09-12 Ibc药品公司 用于递送干扰rna的对接锁定(dnl)复合物
CA2808211C (en) * 2010-08-17 2018-08-28 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with anti-cd74 antibodies provides enhanced toxicity to malignancies, autoimmune disease and other diseases
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
KR20140014064A (ko) * 2010-09-03 2014-02-05 스템 센트알엑스 인코포레이티드 신규한 조절 인자 및 사용 방법
EP2689787A1 (en) 2010-09-03 2014-01-29 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
JP5843170B2 (ja) * 2010-09-30 2016-01-13 国立研究開発法人理化学研究所 グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤
CN103328001B (zh) * 2010-11-03 2017-02-15 Ibc药品公司 用于人免疫缺陷病毒(hiv)疗法的对接和锁定(dnl)构建体
SG10201604160WA (en) 2011-02-10 2016-07-28 Roche Glycart Ag Mutant Interleukin-2 Polypeptides
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2012171541A1 (en) * 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins
US11299528B2 (en) 2014-03-11 2022-04-12 D&D Pharmatech Inc. Long acting TRAIL receptor agonists for treatment of autoimmune diseases
KR102508649B1 (ko) 2015-12-17 2023-03-13 더 존스 홉킨스 유니버시티 사멸 수용체 작용제로 전신성 경화증 완화
EA201892260A1 (ru) 2016-04-07 2019-03-29 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Композиции и способы для лечения панкреатита и боли с применением агонистов рецептора смерти
US11767353B2 (en) 2020-06-05 2023-09-26 Theraly Fibrosis, Inc. Trail compositions with reduced immunogenicity

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001097844A1 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
US20070086942A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US20070140966A1 (en) * 2005-10-19 2007-06-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
KR100827757B1 (ko) * 1999-08-09 2008-05-07 메르크 파텐트 게엠베하 복수의 시토킨-항체 복합체
JP4498746B2 (ja) * 2002-02-14 2010-07-07 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 抗ｃｄ２０抗体およびその融合タンパク質ならびに使用法
WO2003093296A2 (en) * 2002-05-03 2003-11-13 Sequenom, Inc. Kinase anchor protein muteins, peptides thereof, and related methods
EP1937851A4 (en) * 2005-10-19 2010-08-25 Ibc Pharmaceuticals Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING BIOACTIVE GROUPS OF INCREASED COMPLEXITY AND THEIR USE
SG153825A1 (en) * 2005-12-16 2009-07-29 Ibc Pharmaceuticals Inc Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
KR20090064453A (ko) * 2006-09-14 2009-06-18 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001097844A1 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
US20070086942A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US20070140966A1 (en) * 2005-10-19 2007-06-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIEN-HSING CHANG ET AL: "The Dock and Lock Method: A Novel Platform Technology for Building Multivalent, Multifunctional Structures of Defined Composition with Retained Bioactivity", 《CLIN. CANCER RES. 》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104363919A (zh) * 2012-06-01 2015-02-18 Ibc药品公司 具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物
CN108495865A (zh) * 2015-12-23 2018-09-04 美天旎生物技术有限公司 具有细胞因子受体激活或阻断结构域的嵌合抗原受体
CN108495865B (zh) * 2015-12-23 2022-08-02 美天施生物科技有限两合公司 具有细胞因子受体激活或阻断结构域的嵌合抗原受体
US11512139B2 (en) 2015-12-23 2022-11-29 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Chimeric antigen receptor with cytokine receptor activating or blocking domain

Also Published As

Publication number Publication date
CA2720748C (en) 2017-10-24
BRPI0911427A2 (pt) 2015-11-17
AU2009233925B2 (en) 2014-03-13
AU2009233925A1 (en) 2009-10-15
JP5699362B2 (ja) 2015-04-08
EP2271364B1 (en) 2016-08-10
EP2271364A4 (en) 2012-07-11
CA2720748A1 (en) 2009-10-15
EP2271364A1 (en) 2011-01-12
WO2009126558A1 (en) 2009-10-15
JP2011517684A (ja) 2011-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102119175A (zh) 采用停靠与锁(dnl)技术制备具有增强的药物动力学的四聚细胞因子的模块方法
US9498542B2 (en) Tetrameric cytokines with improved biological activity
US9617531B2 (en) Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock
US8003111B2 (en) Dimeric alpha interferon pegylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US8158129B2 (en) Dimeric alpha interferon PEGylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
JP5999217B2 (ja) 二重特異性免疫サイトカインドック−アンド−ロック（ｄｎｌ）複合体及びその治療的使用
CN104159600B (zh) 用抗体靶向干扰素‑λ来有效增强抗肿瘤和抗病毒活性
US9416197B2 (en) Bispecific antibodies that neutralize both TNF-α and IL-6: novel therapeutic agent for autoimmune disease
US20110020273A1 (en) Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
US9931413B2 (en) Tetrameric cytokines with improved biological activity
US20170166651A1 (en) Modular Method to Prepare Tetrameric Cytokines with Improved Pharmacokinetics by the Dock-and-Lock (DNL) Technology
CN105566498A (zh) 双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20110706