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KR20170067773A - Car 발현 벡터 및 car 발현 t 세포 - Google Patents

Car 발현 벡터 및 car 발현 t 세포 Download PDF

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KR20170067773A
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유키미 사코다
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고쿠리츠다이가쿠호우진 야마구치 다이가쿠
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Abstract

T 세포에 있어서 키메라 항원 수용체(CAR)와 함께 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 발현하고, 면역 유도 효과나 항종양 활성이 높은 CAR 발현 T 세포나, 이러한 CAR 발현 T 세포를 제작하기 위한 CAR 발현 벡터를 제공하는 것을 과제로 한다.
키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산 및 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터로서, 상기 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 인터루킨 7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산인 CAR 발현 벡터나, 상기 CAR 발현 벡터를 도입한 CAR 발현 T 세포를 제작한다.

Description

CAR 발현 벡터 및 CAR 발현 T 세포{CAR EXPRESSION VECTOR AND CAR-EXPRESSING T CELLS}
본 발명은, CAR 발현 벡터나, CAR 발현 벡터를 도입한 CAR 발현 T 세포나, CAR 발현 T 세포를 함유하는 항암제에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor: 이하, 「CAR」라고도 한다.)는, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 단일사슬 항체와 T 세포의 활성화를 유도하는 신호 전달 영역을 융합시킨 인공적인 키메라 단백질이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 종양 반응성을 갖지 않는 통상적인 말초혈 T 세포(말초혈 T 림프구)에 CAR을 코딩하는 유전자를 도입함으로써, CAR을 발현 가능한 CAR 발현 T 세포(이하, 단순히 「CAR-T 세포」라고도 한다)를 대량으로 제작하는 것이 가능해진다. 이러한 CAR-T 세포는 종양 반응성을 가져, 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC)와의 상호작용에 의존하지 않고 암세포의 상해를 이끌어내는 것이 가능해진다.
CAR-T 세포의 투여에 의한 암 면역 요법, 보다 구체적으로는, 환자로부터 T 세포를 채취해, 이러한 T 세포에 CAR을 코딩하는 유전자를 도입하여 증폭하고, 다시 환자에게 이입하는 요법(비특허 문헌 1 참조)은, 현재 전 세계에서 임상시험이 진행하고 있어, 백혈병이나 림프종 등의 조혈기 악성 종양 등에 있어서 유효성을 나타내는 결과를 얻고 있다.
최근, 각종 CAR-T 세포의 연구가 진행되어 왔다. 예를 들어, CD19 항원 결합 영역, 세포막 관통 영역, 4-1BB 공자극 신호 영역, 및 CD3 ζ 신호 영역으로 이루어지는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 수식된 자기 사람 T 세포를 포함하는 의약 조성물(특허 문헌 1 참조)이나, 암세포에 결합하는 1개 또는 복수의 태그 부착 단백질의 배합물과 동시에 또는 따로따로 피험체에 투여되는, 상기 태그 부착 단백질에 결합하여, 암세포사를 유도하는 1개 또는 복수의 치료적으로 유효한 항 태그 키메라 항원 수용체(AT-CAR) 발현 T 세포 집단(특허 문헌 2 참조)이나, 사람 항체 139의 항원 결합 도메인, 세포 외 힌지 도메인, 세포막 관통 도메인, 및 세포 내 T 세포 신호 전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포(특허 문헌 3 참조)나, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포로서, 그 키메라 항원 수용체가 항원 결합 도메인, 세포막 관통 도메인, 공자극 신호 전달 영역, 및, SEQ ID NO：24의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포(특허 문헌 4 참조)나, 세포 표면 막 상에 CD19 특이적 키메라 수용체를 발현 및 보유하고, 그 키메라 수용체가 면역 세포의 이펙터 기능을 위한 세포 내 시그널링 도메인, 적어도 1개의 세포막 관통 도메인 및 적어도 1개의 세포 외 도메인으로 이루어지고, 세포 외 도메인이 CD19 특이적 수용체를 포함하는, 유전자 공학적으로 제작된 CD19 특이적 T 세포(특허 문헌 5 참조)나, 세포 내 도메인으로서 글루코코르티코이드 유도 종양 괴사 인자 수용체(GITR)의 세포 내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산이 도입된 키메라 항원 수용체 발현 세포(특허 문헌 6 참조)가 제안되고 있다.
그러나, CAR-T 세포의 생체 내에서의 생존 효율이 낮은, 혹은 CAR-T 세포에 의해 유도되는 내재성 T 세포의 활성화나 종양 국소에 대한 집적이 불충분하다는 문제나, 암세포가 갖는 종양 면역 회피 기구인 PD-L1/PD-1 경로를 통한 면역 억제 신호 및 암 미소 환경에서 분비되는 TGF-β나 IL-10 등의 면역 억제 인자에 의한 CAR-T 세포의 활성 저해라는 문제는 지금까지의 기술로는 해결되지 않고 있다. 그러므로, 충분한 치료 효과가 확인되지 않는 암 종류나 증례가 존재하고 있어, 더 효과적인 CAR-T 세포, 및 이러한 CAR-T 세포를 제작하기 위한 발현 벡터의 제작이 요구되고 있다.
(특허 문헌 1) 미국 특허출원공개명세서 제2014/0106449호 (특허 문헌 2) 일본 공표특허공보 제2014-504294호 (특허 문헌 3) 일본 공표특허공보 제2014-516510호 (특허 문헌 4) 일본 공표특허공보 제2014-507118호 (특허 문헌 5) 일본 특허공개공보 제2011-004749호 (특허 문헌 6) 국제 공개팜플렛 제2013/051718호
(비특허 문헌 1) 나카자와 히로시, The Shinshu medical journal　61(4)：197~203(2013)
종래의 CAR-T 세포에는, CAR의 신호 전달 영역에 CD28, 4-1BB, CD3ζ 등을 함유시킴으로써 T 세포의 활성화 능력을 높이는 노력이 이루어지고 있었지만, CAR-T 세포에 의한 내재성 T 세포의 면역 유도 효과나 종양 미소 환경에서의 면역 억제 기구에 대한 저항성에 대해서는 충분히 증강되어 있지 않고, 고형암에 대해서는 CAR-T 세포에 의한 치료 효과는 아직도 달성되어 있지 않다. 따라서, 본 발명의 과제는, T 세포에서 CAR과 함께 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 발현하여, 면역 유도 효과나 항종양 활성이 높은 CAR-T 세포나, 이러한 CAR-T 세포를 제작하기 위한 CAR 발현 벡터를 제공하는 것이다.
발명자들은, CAR-T 세포를 이용한 암 면역 요법에서, 보다 뛰어난 면역 유도 효과나 항종양 활성을 달성하는 것을 목적으로 하여, CAR-T 세포의 개량을 시도했다. 그 과정에서, T 세포의 면역 기능을 촉진하는 인자인 사이토카인, 케모카인, 신호 제어 단백질에 주목하여, CAR과 함께 상기 T 세포의 면역 기능을 촉진하는 인자를 발현하는 벡터를 구축했다. 이러한 발현 벡터를 T 세포에 도입한 결과, 종래의 CAR-T 세포보다 뛰어난 면역 유도 효과나 항종양 활성을 갖는 CAR-T 세포를 제작할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 아래에 개시되는 바와 같은 것이다.
(1) 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산 및 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터로서, 상기 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 인터루킨 7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
(2) 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 인터루킨 7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 CAR 발현 벡터.
(3) CAR을 코딩하는 핵산과 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 서열을 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (2)에 기재된 CAR 발현 벡터.
(4) 인터루킨 7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산이, 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 서열을 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (2) 또는 (3)에 기재된 CAR 발현 벡터.
(5) CAR을 코딩하는 핵산이, FITC 또는 CD20을 인식하는 단일사슬 항체의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 CAR 발현 벡터.
(6) CAR을 코딩하는 핵산이, CD8의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 CAR 발현 벡터.
(7) CAR을 코딩하는 핵산이, CD28의 세포 내 영역, 4-1BB의 세포 내 영역, 및 CD3ζ의 세포 내 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 CAR 발현 벡터.
(8) 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 벡터를 도입한 CAR 발현 T 세포.
(a) 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 CAR 발현 벡터
(b) CAR을 코딩하는 핵산 및 인터루킨 7을 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터와, CAR을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터
(9) 상기 (8)에 기재된 CAR 발현 T 세포와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 항암제.
본 발명의 CAR 발현 벡터를 이용하면, 생존 능력, 림프구 집적 능력, 종양 세포 상해 활성을 겸비하는 CAR-T 세포나, 암 미세 환경에서의 면역 억제에 저항성을 갖는 CAR-T 세포를 제작하는 것이 가능해진다. 이러한 CAR-T 세포를 이용하여 암환자에 대해 면역 요법을 수행하면, 강력한 암 치료 효과가 기대되고, 난치성·진행성 암에 대해서도 유효한 암 면역 요법이 가능해진다.
도 1은 CAR의 구조 및 CAR-T 세포에 의한 암 면역 요법의 기본 시스템을 나타내는 도면이다.
도 2는 CAR, 인터루킨 7(IL-7) 및 CCL19를 발현하는 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 CAR의 발현 레벨을 유동세포계수법(flow cytometry)으로 확인한 결과-1을 나타내는 도면이다. 왼쪽이 CAR 무 염색, 오른쪽이 CAR 염색이다.
도 4는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 CAR의 발현 레벨을 유동세포계수법으로 확인한 결과-2를 나타내는 도면이다.
도 5는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 CAR의 발현 레벨을 유동세포계수법으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 세포 상청액 중의 IL-7 및 CCL19의 농도에 대해, ELISA로 측정한 결과-1을 나타내는 도면이다.
도 7은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 세포 상청액 중의 IL-7 및 CCL19의 농도에 대해, ELISA로 측정한 결과-2를 나타내는 도면이다.
도 8은 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 세포 상청액 중의 IL-7 및 CCL19의 농도에 대해, ELISA로 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 자극하여, 3일간, 5일간, 7일간 배양했을 경우의 세포 수를 나타내는 도면이다.
도 10은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 자극하여, 3일간, 5일간, 7일간 배양했을 경우의 생존율을 나타내는 도면이다.
도 11은 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 자극하여, 5일간 배양했을 경우의 세포 수를 나타내는 도면이다.
도 12는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 T 세포 유주 시험의 결과-1을 나타내는 도면이다.
도 13은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 T 세포 유주 시험의 결과-2를 나타내는 도면이다.
도 14는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 수지상 세포 유주 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 T 세포 유주 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 T 세포의 증식 능력을 조사한 결과(자극 후 5 일째)를 나타내는 도면이다.
도 17은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 T 세포의 증식 능력을 조사한 결과(자극 후 3 일째, 7 일째)를 나타내는 도면이다.
도 18은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 CD127의 발현을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 CCR7의 발현을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 담암 마우스(tumour-bearing mouse)에 투여했을 경우의 종양 부피의 변화를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 21은 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 담암 마우스에 투여했을 경우의 마우스 생존율을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 22는 P815-hCD20을 피하 접종하고, 그 후 시클로포스파미드를 투여한 마우스에 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우의 마우스 생존율을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 23은 P815-hCD20을 피하 접종하고, 그 후 시클로포스파미드를 투여한 마우스에 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우의 마우스의 종양 부피를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 24는 도 23에서의 CPA＋7×19의 그래프의 세로축의 수치를 1/10으로 한 도면이다.
도 25는 P815-hCD20을 피하 접종한 마우스에 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우의 종양 조직을 H＆E 염색하여 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 26은 P815-hCD20을 피하 접종한 마우스에 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우의 종양 조직의 면역 조직 화학 분석에 의한 결과를 나타내는 도면이다.
도 27은 도 26에서의 형광 염색에 의해 표지된 포지티브 영역을 정량한 결과를 나타내는 도면이다.
도 28은 P815-hCD20을 피하 접종한 마우스에 항 사람 CD20　CAR-IL-7 발현 T 세포, 항 사람 CD20　CAR-CCL19 발현 T 세포, 또는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우의 종양 부피를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 29의 (a)는 CAR과 SHP1(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1)의 도미넌트 네거티브 변이체를 발현하는 벡터를 나타내는 도면이다. (b)는 CAR과 SHP2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2)의 도미넌트 네거티브 변이체를 발현하는 벡터를 나타내는 도면이다.
도 30의 (a)는 항 사람 CD20　CAR-SHP1DN 발현 T 세포에 의한 세포 상해 활성 시험의 결과를 나타내는 도면이다. (b)는 항 사람 CD20　CAR-SHP2DN 발현 T 세포에 의한 세포 상해 활성 시험의 결과를 나타내는 도면이다.
도 31은 P815-hCD20을 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 및 FITC 결합 리툭시맙 존재하에서 혼합하여 종양 세포 상해 활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 32는 P815-hCD20을 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포와 혼합하여 종양 세포 상해 활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 33은 P815-hCD20을 피하 접종한 마우스에 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여해 유동세포계수법으로 백혈구 표면의 표현형에 대해, CD4, CD8, CD44, CD62L를 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 34는 비장의 백혈구를 마이토마이신 C로 처리한 P815-hCD20과 함께 4일간 배양하여 자극하여, T 세포의 증식을 유동세포계수법으로 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명의 CAR 발현 벡터는, 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산 및 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터로서, 상기 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 인터루킨 7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산인 CAR 발현 벡터이면 특별히 제한되지 않고, 키메라 항원 수용체란, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 단일사슬 항체와 T 세포의 활성화를 유도하는 신호 전달 영역을, 세포막 관통 영역을 통해 융합시킨 인공적인 키메라 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서, CAR을 코딩하는 핵산으로서는, CAR을 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이면 특별히 제한되지 않고, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 단일사슬 항체, 세포막 관통 영역, 및 T 세포의 활성화를 유도하는 신호 전달 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 포함된다.
CAR에서의 단일사슬 항체로서는, 단일 클론 항체의 항원 결합 부위에 유래하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(scFv)으로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 사이에 링커 펩티드가 위치하는 올리고 또는 폴리펩티드를 들 수 있다.
상기 단일사슬 항체가 인식하는 암세포의 세포 표면 항원으로서는, 암세포 및 그 전구 세포에 특이적으로 발현하는 생체 분자, 세포의 암화에 의해 새롭게 발현이 확인되게 된 생체 분자, 혹은 암세포에서 정상세포에 비해 발현 레벨이 증가하고 있는 생체 분자일 수도 있고, CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFRvariant, ROR1, c-Met, HER2, CEA, 메소텔린, GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123　CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13 Ra2, BCMA, LewisY, IgG kappa　chain, Folate　receptor-alpha, PSCA, EpCAM을 들 수 있다.
T 세포 활성화 신호 전달 영역은, 상기 단일사슬 항체가 암세포의 세포 표면 항원을 인식했을 때에, 세포 내에 신호 전달하는 것이 가능한 영역으로, CD28, 4-1BB(CD137), GITR, CD27, OX40, HVEM, CD3ζ, Fc　Receptor-associated　γ chain의 세포 내 영역의 폴리펩티드에서 선택되는 적어도 1종 또는 2종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, CD28, 4-1BB, 및 CD3ζ의 3종의 세포 내 영역의 폴리펩티드를 포함하는 것이 보다 바람직하다.
각각의 세포 내 영역의 폴리펩티드는, 2~10 아미노산으로 이루어지는 올리고 펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있을 수도 있고, 이러한 링커 서열로서 글리신-세린 연속 서열을 들 수 있다.
본 발명에서의 세포막 관통 영역으로서는, CD8, T 세포 수용체의 α, β 사슬 CD28, CD3ε CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, GITR 유래의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 들 수 있고, 사람 CD8 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 바람직하게 들 수 있다. 이러한 세포막 관통 영역에 의해, CAR이 T 세포의 세포막에 고정된다.
상기 세포막 관통 영역에는, 임의의 올리고 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어지고, 길이가 1~100 아미노산, 바람직하게는 10~70 아미노산의 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 힌지 영역으로서는, 사람 CD8의 힌지 영역을 들 수 있다.
또한, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 단일사슬 항체와 세포막 관통 영역, 세포막 관통 영역과 T 세포 활성화 신호 전달 영역 사이에는, 임의의 올리고 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어지는 스페이서 영역을 설치할 수도 있다. 스페이서 영역의 길이로서는, 1~100 아미노산, 바람직하게는 10~50 아미노산을 들 수 있고, 이러한 스페이서 영역으로서 글리신-세린 연속 서열을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, T 세포의 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산으로서는, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산(이하, 「본건 핵산 1」이라고도 한다), SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산(이하, 「본건 핵산 2」라고도 한다), 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산(이하, 「본건 핵산 3」이라고도 한다)이면 특별히 제한되지 않고, 상기 본건 핵산 1~3의 각각의 핵산을 복수 포함하고 있을 수도 있고, 구체적으로는, 본건 핵산 1 및 본건 핵산 2, 본건 핵산 1 및 본건 핵산 3, 본건 핵산 2 및 본건 핵산 3, 본건 핵산 1및 본건 핵산 2및 본건 핵산 3을 포함하는 핵산일 수도 있다.
그리고, 본건 핵산 1에서의 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산으로서는, IL-7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하고 있을 수도 있고, IL-7을 코딩하는 핵산에 대해서 CCL19를 코딩하는 핵산이 상류에 배치되어 있을 수도, 하류에 배치되어 있을 수도 있다.
SHP1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산으로서는, SHP1에 대해서 우위로 작용하고, SHP1의 작용을 저해할 수 있는 SHP1의 변이체를 코딩하는 핵산이면 특별히 제한되지 않고, SHP1의 아미노산 서열에서 적어도 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지고, SHP1의 작용을 저해할 수 있는 변이체를 코딩하는 핵산을 들 수 있다. 또한, SHP2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산으로서는, SHP2에 대해 우위로 작용하고, SHP2의 작용을 저해할 수 있는 SHP2의 변이체를 코딩하는 핵산이면 특별히 제한되지 않고, SHP2의 아미노산 서열에서 적어도 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지고, SHP2의 작용을 저해할 수 있는 변이체를 코딩하는 핵산을 들 수 있다.
본 발명의 CAR 발현 벡터에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산과 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산의 사이나, 본건 핵산 1, 본건 핵산 2, 본건 핵산 3을 복수 포함하는 경우에서의 각 핵산의 사이나, 본건 핵산 1에서의 IL-7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산의 사이에는, 각각의 핵산을 발현할 수 있는 한, 임의의 핵산을 포함할 수도 있지만, 자기 절단형 펩티드(2A 펩티드), 또는 IRES(internal　ribozyme　entry　site)를 코딩하는 서열, 바람직하게는 2A 펩티드를 코딩하는 서열을 통해 연결되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 서열을 이용하여 연결함으로써, 각각의 핵산을 효율적으로 발현시키는 것이 가능해진다.
2A 펩티드란, 바이러스 유래의 자기 절단형 펩티드이며, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열 중의 G-P 사이(C 말단에서 1 잔기의 위치)가 소포체로 절단되는 특징을 갖는다(Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5(5):627-638(2005)). 그러므로, 2A 펩티드를 통해 그 전후에 삽입된 핵산은, 세포 내에서 서로 독립적으로 발현하게 된다.
상기 2A 펩티드로서는, 피코나 바이러스, 로타 바이러스, 곤충 바이러스, 애프도 바이러스 또는 트리파노소마 바이러스 유래의 2A 펩티드인 것이 바람직하고, 서열 번호 2로 표현되는 피코나 바이러스 유래의 2A 펩티드(F2A)인 것이 보다 바람직하다.
키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은, 암세포의 세포 표면 항원에 대한 단일사슬 항체, 세포막 관통 영역, 및 T 세포 활성화 신호 전달 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열을 바탕으로, 화학 합성하는 방법이나, PCR에 의해 증폭하는 방법 등의 공지된 기술에 의해 제작할 수 있다. 그리고, 아미노산을 코딩하기 위한 선택되는 코돈은, 목적의 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 최적화하기 위해 개편될 수도 있다.
암세포의 세포 표면 항원에 대한 단일사슬 항체, 세포막 관통 영역, 및 T 세포 활성화 신호 전달 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열의 정보는, 공지된 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있다.
예를 들어, T 세포 활성화 신호 전달 영역에서의 CD28, 4-1BB, 및 CD3ζ의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열의 정보는, NCBI 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있고, 사람 CD28에 대해서는, Genbank 번호：NM＿006139. 2(갱신일：2014년 5월 10일), 사람 4-1BB에 대해서는, Genbank 번호：NM＿001561. 5(갱신일：2014년 3월 16일), 사람 CD3ζ에 대해서는, Genbank 번호：NM＿000734. 3(갱신일：2014년 8월 12일)으로서 등록된 것을 예시할 수 있다.
또한, 사람 CD8의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열의 정보는, NCBI 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있고, Genbank 번호：NM＿001768. 6(갱신일：2014년 5월 10일)으로서 등록된 것을 예시할 수 있다.
또한, 단일사슬 항체의 폴리펩티드를 코딩하는 염기 서열의 정보에 대해서는, 표적으로 하는 세포 표면 항원을 인식하는 단일 클론 항체를 제작하고, 이러한 단일 클론 항체의 아미노산 서열을 에드만법 등의 공지된 방법으로 결정하고, 이러한 아미노산 서열을 바탕으로 입수할 수도 있다. 단일 클론 항체의 제작 방법으로서는, 혼성 세포를 이용하여 제작하는 방법이나, 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주를 형질 전환하여 제작하는 방법이나, 형질전환 동물을 원하는 항원으로 면역함으로써 제작하는 방법을 들 수 있다.
T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산인, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산은, 각각의 염기 서열을 바탕으로, 화학 합성하는 방법이나, PCR에 의해 증폭하는 방법 등의 공지된 기술에 의해 제작할 수 있다. 그리고, 아미노산을 코딩하기 위한 선택되는 코돈은, 목적의 숙주 세포에서의 핵산의 발현을 최적화하기 위해서 개편될 수도 있다.
IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산의 정보는, 공지된 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있다.
IL-7을 코딩하는 핵산으로서는, 본 발명의 CAR 발현 벡터를 도입하는 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 사람 IL-7의 아미노산 서열(서열 번호 3)을 코딩하는 핵산을 들 수 있고, IL-7에서의 세포 증식률의 항진 작용을 갖는 한, 서열 번호 3으로 표현되는 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 이용할 수도 있다.
CCL19를 코딩하는 핵산으로서는, 본 발명의 CAR 발현 벡터를 도입하는 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 사람 CCL19의 아미노산 서열(서열 번호 4)을 코딩하는 핵산을 들 수 있고, CCL19에서의 T 세포 유주 작용을 갖는 한, 서열 번호 4로 표현되는 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 이용할 수도 있다.
SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산으로서는, 본 발명의 CAR 발현 벡터를 도입하는 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 사람 SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체의 아미노산 서열(서열 번호 5)을 코딩하는 핵산을 들 수 있고, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체에서의 SHP-1의 작용을 저해할 수 있는 한, 서열 번호 5로 표현되는 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 이용할 수도 있다. 그리고, 서열 번호 5중, 453번째의 세린이 변이 부위이다.
SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산으로서는, 본 발명의 CAR 발현 벡터를 도입하는 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 사람 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체의 아미노산 서열(서열 번호 6)을 코딩하는 핵산을 들 수 있고, SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체에서의 SHP-2의 작용을 저해할 수 있는 한, 서열 번호 6으로 표현되는 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 이용할 수도 있다. 그리고, 서열 번호 6중, 459번째의 세린이 변이 부위이다.
본 발명의 CAR 발현 벡터로서는 직쇄형일 수도 환형일 수도 있고, 플라스미드 등의 비 바이러스 벡터일 수도, 바이러스 벡터일 수도, 가동성 유전인자에 의한 벡터일 수도 있다. 또한, 이러한 벡터에는, 프로모터나 터미네이터 등의 제어 서열이나, 약제 내성 유전자, 리포터 유전자 등 선택 마커 서열을 함유하고 있을 수도 있다. 프로모터 서열의 하류에 작동 가능하게 CAR을 코딩하는 핵산이나 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산을 배치함으로써, 각각의 핵산을 효율적으로 전사하는 것이 가능해진다. 또한, 마커 유전자를 함유시킴으로써, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산의 발현을 용이하게 확인하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명의 CAR 발현 벡터에는, 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하고 있을 수도 있고, 이러한 자살 유전자의 위치는 특별히 제한되지 않고, IL-7을 코딩하는 핵산, CCL19를 코딩하는 핵산, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산을 발현시키기 위한 프로모터의 하류에 2A 펩티드 또는 IRES를 코딩하는 서열을 통해 상기 각각의 핵산의 상류 또는 하류에 배치할 수도 있고, 다른 프로모터의 하류에 배치할 수도 있다. 본 발명의 CAR 발현 벡터에 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하게 함으로써, 암 치료 경과에 따라, 예를 들어 종양이 소실되었을 경우에 자살 유전자의 기능을 활성화하는 약제를 투여하여, 생체내의 CAR 발현 T 세포 수를 제어하는 것이 가능해진다.
자살 유전자로는, 아래의 문헌에 기재된 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘키나아제(HSV-TK)나 유도성 카스파제 9(inducible caspase 9) 등을 들 수 있고, 이러한 유전자의 기능을 활성화하는 약제로는, 전자에 대해서는 간시클로비르, 후자에 대해서는 2량체 유도 화합물(chemical induction of dimerization:CID)인 AP1903을 들 수 있다(Cooper LJ., et. al. Cytotherapy. 2006;8(2):105-17., Jensen M. C. et. al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep;16(9):1245-56., Jones BS. Front Pharmacol. 2014 Nov 27;5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8;8(2):230-49., Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25;6:174).
상기 바이러스 벡터로는, 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터를 들 수 있고, 레트로 바이러스 벡터를 바람직하게 들 수 있고, pMSGV 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))나 pMSCV 벡터(다카라 바이오사 제품)를 보다 바람직하게 들 수 있다. 레트로 바이러스 벡터를 이용하면, 도입 유전자는 호스트 세포의 게놈에 삽입되기 때문에, 장기간 안정적으로 발현하는 것이 가능해진다.
본 발명의 CAR 발현 T 세포로서는, (a) 상기 본 발명의 CAR 발현 벡터를 도입하여 얻어진 T 세포나, (b) CAR을 코딩하는 핵산 및 인터루킨 7을 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터(CAR-IL-7 발현 벡터)와 CAR을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터(CAR-CCL19 발현 벡터)가 적어도 2개의 벡터를 도입하여 얻어진 T 세포이면 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 CAR 발현 벡터나, CAR-IL-7 발현 벡터와 CAR-CCL19 발현 벡터를 T 세포에 도입하는 방법으로서는 특별히 제한되지 않지만, 바이러스 감염법, 칼슘 인산법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 일렉트로포레이션법 등의 공지된 방법에 의해 도입하는 방법을 들 수 있고, 바이러스 감염법을 바람직하게 들 수 있다. 그리고, 상기 CAR-IL-7 발현 벡터는, CAR을 코딩하는 핵산 및 인터루킨 7을 코딩하는 핵산을 함유하고 있으면 되고, 상기 CAR-CCL19 발현 벡터는, CAR을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하고 있으면 되고, 본 발명의 CAR 발현 벡터와 동일하게, 각각의 핵산을 발현할 수 있는 한, 2A 펩티드, IRES, 또는 자살 유전자를 코딩하는 핵산 등의 다른 핵산을 포함할 수도 있다.
바이러스 감염법으로서는, 본 발명의 CAR 발현 벡터와 패키징 플라스미드를 GP2-293 세포(다카라 바이오사 제품), Plat-GP 세포(코스모·바이오사 제품), PG13 세포(ATCC CRL-10686), PA317 세포(ATCC CRL-9078) 등의 패키징 세포에 트랜스펙션하여 재조합 바이러스를 제작하고, 이러한 재조합 바이러스를 T 세포에 감염시키는 방법을 들 수 있고, Retrovirus packaging Kit Eco(다카라 바이오사 제품) 등의 시판의 키트를 이용하여 수행할 수도 있다.
T 세포에 대한 본 발명의 CAR 발현 벡터의 도입의 확인은, 유동세포계수법, 노던블로팅, 서던블로팅, RT-PCR 등의 PCR, ELISA, 웨스턴 블로팅에 의해 CAR의 발현을 조사하는 것이나, 벡터에 삽입된 마커 유전자의 발현을 조사하는 것에 의해 확인할 수 있다.
T 세포로는, 사람 유래의 T 세포나, 개, 고양이, 돼지, 마우스 등의 비인간 포유동물 유래의 T 세포를 들 수 있다. 또한, T 세포는, 혈액, 골수액 등의 체액이나, 비장, 흉선, 림프절 등의 조직, 혹은 원발 종양, 전이성 종양, 암성 복수 등의 암 조직에 침윤하는 면역 세포로부터 단리, 정제하여 얻을 수 있다. 이러한 T 세포로서는, αβT 세포, γδT 세포, CD8＋T 세포, CD4＋T 세포, 종양 침윤 T 세포, 메모리 T 세포, 나이브 T 세포, NKT 세포를 들 수 있다.
본 발명의 CAR 발현 T 세포에서, 발현하는 단일사슬 항체는 세포 외에 위치하고, 이러한 단일사슬 항체를 구비함으로써, CAR 발현 T 세포는 암세포의 표면상에 발현되는 종양 관련 항원(TAA)을 인식하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명의 CAR 발현 T 세포에, 상기 본 발명의 CAR 발현 벡터와 함께, 자살 유전자를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터를 도입할 수도 있다.
본 발명의 항암제는, 본 발명의 CAR 발현 T 세포와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하고 있으면 특별히 제한되지 않고, 상기 첨가제로서는, 생리 식염수, 완충 생리 식염수, 세포 배양 배지, 덱스트로오스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합, 안정제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 방부제, 등장화제, 충진제, 및 윤활제를 들 수 있다.
본 발명의 항암제는, 당업자에게 기존의 방법을 이용하여, 암 치료를 필요로 하는 피험체에 투여할 수 있고, 투여 방법으로서는, 정맥내, 종양내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내, 활액낭내, 두엽내, 수강내, 및 지주막하(골수액)에 대한 주사를 들 수 있다.
투여하는 항암제에 포함되는 본 발명의 CAR 발현 T 세포의 양은, 암의 종류, 위치, 중증도, 치료를 받는 피험체의 연령, 체중 및 상태 등에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 바람직하게는, 1회의 투여에서 1×104~1×1010개, 바람직하게는 1×105~1×109개, 보다 바람직하게는 5×106~5×108개를 들 수 있다.
투여하는 항암제는, 1일 4회, 3회, 2회 또는 1회, 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 주 1회, 7일 간격, 8일 간격, 9일 간격, 주 2회, 월 1회 또는 월 2회 독립적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 항암제나, 후술하는 암 치료 방법에서의 암으로는, 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 소세포암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 자궁암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 기관암, 기관지암, 결장암, 소장암, 위암, 식도암, 담낭암, 정소암, 난소암 등의 암이나, 골조직, 연골 조직, 지방조직, 근조직, 혈관 조직 및 조혈조직의 암 외에, 연골육종, 유잉육종, 악성 혈관내피종, 악성 슈반종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간아종, 수아종, 신아종, 신경아종, 췌아종(췌장 모세포종), 흉막폐아종, 망막아종 등의 아종이나, 배세포 종양이나, 림프종이나, 백혈병을 들 수 있다.
본 발명의 항암제는, 다른 항암제와 병용하여 이용할 수 있다. 다른 항암제로서는, 시클로포스파미드, 벤다무스틴, 이오스파마이드, 다카바진 등의 알킬화 약, 펜토스타틴, 플루다라빈, 클라드리빈, 메소트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토푸린, 에노시타빈 등의 대사 길항약, 리툭시맙, 세툭시맙, 트라스투주맙 등의 분자 표적약, 이마티닙, 게페티닙, 엘로티닙, 아파티닙, 다사티닙, 수니티닙, 트라메티닙 등의 키나아제 저해제, 보르테조밉 등의 프로테아솜 저해제, 시클로스포린, 타크로리무스 등의 칼시뉴린 저해약, 이다루비신, 독소루비신 마이토마이신 C 등의 항암성 항생 물질, 이리노테칸, 에트포시드 등의 식물 알카로이드, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴 등의 플라티나 제제, 타목시펜, 비칼루타마이드 등의 호르몬 요법약, 인터페론, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 등의 면역 제어약을 들 수 있고, 알킬화약 또는 대사 길항약을 바람직하게 들 수 있고, 시클로포스파미드를 바람직하게 들 수 있다.
상기 「본 발명의 항암제와 다른 항암제와 병용하여 이용하는」 방법으로서는, 다른 항암제를 이용하여 처리하고, 그 후 본 발명의 항암제를 이용하는 방법이나, 본 발명의 항암제와 다른 항암제를 동시에 이용하는 방법이나, 본 발명의 항암제를 이용하여 처리하고, 그 후 다른 항암제를 이용하는 방법을 들 수 있고, 다른 항암제를 이용하여 처리하고, 그 후 본 발명의 항암제를 이용하는 방법을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 본 발명의 항암제와 다른 항암제와 병용할 경우에는, 암 치료 효과가 보다 향상되는 동시에, 각각의 항암제의 투여 횟수 또는 투여량을 줄임으로써, 각각의 항암제에 의한 부작용을 저감시키는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 항암제에 상기 다른 항암제를 포함할 수도 있다.
본 발명의 다른 양태 1로서, 1) 본 발명의 CAR 발현 T 세포를, 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법이나, 2) 항암제로서 사용하기 위한, 본 발명의 CAR 발현 T 세포나, 3) 본 발명의 CAR 발현 T 세포의, 항암제의 조제에서의 사용을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태 2로서, 본 발명의 CAR 발현 벡터를 구비하고 있는, CAR 발현 T 세포를 제작하기 위한 키트를 들 수 있고, 이러한 키트로는, 본 발명의 CAR 발현 벡터를 구비하고 있으면 특별히 제한되지 않고, CAR 발현 T 세포를 제작하기 위한 설명서나, 본 발명의 CAR 발현 벡터를 T 세포에 도입하기 위해서 이용하는 시약을 포함하고 있을 수도 있다.
실시예 1
［IL-7 및 CCL19를 발현하는 T 세포의 제작］
(T 세포의 면역 기능 촉진 인자의 선택)
T 세포의 기능을 제어할 수 있는 분자는 적어도 생체 내에 수백 종류나 존재한다. 발명자들은, CAR-T 세포에서의 추가적인 항종양 효과를 높이기 위한 제어 분자로서 지금까지의 식견이나 경험을 바탕으로, 방대한 조합 중에서 우선은 IL-7과 CCL19를 선택하는 한편, 각각 단독이 아니라 2개의 조합, 즉 IL-7과 CCL19의 조합을 선택하여, 이러한 T 세포의 면역 기능 촉진 인자와 CAR을 모두 발현하는 벡터를 제작했다.
그리고, 상기 IL-7은 T 세포의 생존에 필수적인 사이토카인으로, 골수, 흉선, 림프 기관·조직의 스트로마 세포 등의 비조혈 세포에 의해 산생된다. 한편, T 세포 자체의 산생 능력은 거의 확인되지 않는다.
또한, 상기 CCL19는 주로 림프절의 수지상 세포나 대식세포로부터 산생되고, 그 수용체인 CCR7을 통해 T 세포나 B 세포, 성숙한 수지상 세포의 유주를 야기하는 기능을 갖는다.
(IL-7 및 CCL19를 발현하는 항 FITC　CAR 발현 벡터의 제작)
항 FITC　scFv, 마우스 CD8 막 관통 영역, 마우스 CD28-4-1BB-CD3ζ 세포 내 신호 모티프로 이루어지는 항 FITC　CAR을 코딩하는 항 FITC　CAR　DNA 단편(서열 번호 7), 서열 번호 1로 표현되는 2A 펩티드(F2A)와 그 펩티드에 계속되는 제한 효소 사이트(MCS)를 코딩하는 F2A-MCS　DNA 단편(서열 번호 8), 마우스 IL-7(종결 코돈 없음)과 거기에 계속되는 F2A와 마우스 CCL19를 코딩하는 IL-7-F2A-CCL19　DNA 단편(서열 번호 9)을 인공 합성했다. 서열 번호 7에서, 1~819번째가 항 FITC　scFv, 829~1074번째가 마우스 CD8 막 관통 영역, 1075~1197번째가 마우스 CD28의 세포 내 영역, 1198~1332번째가 4-1BB의 세포 내 영역, 1333~1674번째가 CD3ζ의 세포 내 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 서열이다. 또한, 서열 번호 9에서, 1~462번째가 IL-7, 463~537번째가 F2A, 538~864번째가 CCL19를 코딩하는 서열이다.
CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 CAR 벡터를 제작하기 위해서, 상기 항 FITC　CAR　DNA 단편과 상기 F2A-MCS　DNA 단편을 연결하여 항 FITC　CAR-F2A-MCS 컨스트럭트를 제작했다. 그 다음, 제작한 컨스트럭트를 pMSGV 레트로 바이러스 발현 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))에 클로닝하여 항 FITC　CAR-F2A-MCS를 포함하는 pMSGV 벡터를 제작했다. 이러한 pMSGV 벡터의 MCS에, 상기 IL-7-F2A-CCL19　DNA 단편을, 제한 효소(NsiI 및 SalI) 처리 및 리게이션에 의해 삽입하여, 항 FITC　CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19를 포함하는 pMSGV 벡터(IL-7/CCL19 발현-항 FITC　CAR 벡터)를 얻었다. 얻어진 벡터의 배치도를 도 2에 나타낸다. 또한, 컨트롤로서 항 FITC　CAR　DNA 단편을 pMSGV 레트로 바이러스 발현 벡터에 클로닝하여, 항 FITC　CAR을 포함하는 pMSGV 벡터(컨트롤 항 FITC　CAR 벡터)를 제작했다.
(IL-7/CCL19 발현-항 FITC　CAR 벡터를 도입한 레트로 바이러스의 제작)
마우스 T 세포의 형질 도입을 위해, 레트로 바이러스를 제작했다. 리포펙타민 2000 또는 3000(라이프 테크놀로지사 제품)을 이용하여 상술한 IL-7/CCL19 발현-항 FITC　CAR 벡터 또는 컨트롤 항 FITC　CAR 벡터와 pCL-Eco 플라스미드(Imgenex사 제품)를 GP2-293 패키징 세포주(다카라 바이오사 제품)에 트랜스펙션함으로써, IL-7/CCL19 발현-항 FITC　CAR 벡터 또는 컨트롤 항 FITC　CAR 벡터를 도입한 레트로 바이러스를 제작했다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후에 상기 레트로 바이러스를 함유하는 상청액을 회수했다.
상기 GP2-293 세포의 배양액으로서는, 10% FCS, 100 U/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM을 이용했다. 또한, 후술하는 실시예에서 이용하는 T 세포의 배양액으로서는, 10% FCS, 100 U/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신, 50 mM의 2-메르캅토 에탄올, 2 mM의 L-글루타민을 첨가한 RPMI-1640을 이용했다.
(마우스 T 세포의 형질 도입)
마우스 T 세포의 형질 도입을 위해, 비장 및 림프절 유래의 3×106개의 정제된 마우스 T 세포를, 고층화된 항 CD3 단일 클론 항체(3μg/ml), 항 CD28 단일 클론 항체(1μg/ml), IL-2(100 IU/ml)로 48시간 활성화했다. 그 다음, 상술에서 제작한 IL-7/CCL19 발현-항 FITC　CAR 벡터 또는 컨트롤 항 FITC　CAR 벡터를 도입한 레트로 바이러스를 함유하는 상청액을, 25μg/ml의 레트로넥틴(등록상표：다카라 바이오사 제품)으로 코팅한 플레이트에서 활성화한 상술한 마우스 T 세포(1×106cells/ml)와 혼합하여, 1500 rpm으로 2시간 원심 후, IL-2(100 IU/ml)의 존재하에서 6시간 배양했다. 배양액으로부터 레트로 바이러스를 제거하기 위해, 마우스 T 세포를 회수하여, IL-2(100 IU/ml)를 함유하는 새로운 증식 배양액(RPMI)으로 옮기고, 또 42시간 배양하여, IL-7/CCL19 발현-항 FITC　CAR 벡터를 도입한 마우스 T 세포(항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포) 또는 컨트롤 항 FITC　CAR 벡터를 도입한 마우스 T 세포(항 FITC　CAR 발현 T 세포)를 얻었다.
(IL-7 및 CCL19를 발현하는 항 CD20　CAR 발현 벡터의 제작)
상기에서의 IL-7/CCL19 발현-항 FITC　CAR 벡터의 제작에서, 서열 번호 7로 표현되는 서열에 포함되는 항 FITC　scFv영역의 서열을, 리툭시맙의 서열을 바탕으로 라이프 테크놀로지사가 합성한 항 사람 CD20　scFv(서열 번호 10)의 서열로 치환된 것 외에는 동일한 방법으로, 항 사람 CD20　CAR-F2A-IL-7-F2A-CCL19를 포함하는 pMSGV 벡터(IL-7/CCL19 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터)를 제작했다. 동일하게, 상기에서의 컨트롤 항 FITC　CAR 벡터의 제작에서, 서열 번호 7로 표현하는 서열에 포함되는 항 FITC　scFv영역의 서열을, 상기 항 사람 CD20　scFv(서열 번호 10)의 서열로 치환된 것 외에는 동일한 방법으로, 항 사람 CD20　CAR을 포함하는 pMSGV 벡터(컨트롤 항 사람 CD20　CAR 벡터)를 제작했다. 이러한 IL-7/CCL19 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터 또는 컨트롤 항 사람 CD20　CAR 벡터를, 상기와 같은 방법으로 마우스 T 세포에 도입하여, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 제작했다.
실시예 2
［유동세포계수법에 의한 CAR 발현 측정］
(유동세포계수법 해석)
모델 항원으로서의 FITC를 인식하는 CAR의 발현 레벨은 2색 유동세포계수법 해석에 의해 수행했다. 제작된 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 FITC 덱스트란과 알로피코시아닌(APC) 결합 항 CD8 단일 클론 항체(53-6. 7 Affymetrix사 제품)의 존재하에서 배양했다. 유동세포계수법은 EC800(소니사 제품)을 이용하고, 데이터 해석은 FlowJo　software(Tree　Star사 제품)를 이용했다.
또한, 사람 CD20을 인식하는 CAR의 발현 레벨도 2색 유동세포계수법 해석에 의해 수행했다. 제작한 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 비오틴 표지된 프로테인 L 및 APC 결합 스트렙타아비딘을 이용해 해석했다.
(결과)
결과를 도 3~5에 나타낸다. 도 3중, 왼쪽은 CAR무염색(FITC 결한 덱스트란 무첨가)의 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포, 오른쪽은 CAR 염색(FITC 결합 덱스트란 첨가)의 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 결과이며, 도 4중, 「transduction　(-)」는 형질 도입 없음의 T 세포, 「Cont.」는 항 FITC　CAR 발현 T 세포, 「7×19」는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포이며, 도 5중, 「transduction　(-)」는 형질 도입 없음의 T 세포, 「Cont.」는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, 「7×19」는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 결과이다. 또한, 도면 중의 수치는 각각의 파퓰레이션(population)의 퍼센티지를 나타낸다. 도 3~5에 나타낸 바와 같이 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포나 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 있어서, CAR의 발현이 확인되었다.
실시예 3
［IL-7, CCL19의 분비］
(항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 배양 상청액 중의 IL-7, CCL19 농도의 측정-1)
제작한 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 1μg/ml의 고층화된 FITC 결합 트라스트주맙으로 자극하여 3일간 배양하고, 상청액을 회수하여 IL-7 및 CCL19의 농도를 시판의 ELISA 키트(R＆D　systems사 제품)를 이용하여 측정했다. 결과를 도 6에 나타낸다.
(결과)
도 6에 나타낸 바와 같이, 배양 상청액 중에 IL-7에 대해서는 300 pg/ml 이상, CCL19에 대해서는 75 pg/ml 이상 검출되었다. 따라서, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 IL-7 및 CCL19를 발현하는 한편 발현한 IL-7 및 CCL19가 세포 외로 분비되는 것이 확인되었다. 그리고, 컨트롤의 항 FITC　CAR 발현 T 세포에서는, IL-7, CCL19 모두가 검출 한계 이하(Not　detected)였다.
(항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 배양 상청액 중의 IL-7, CCL19 농도의 측정-2)
고층화된 FITC 결합 트라스트주맙 또는 항 CD3 단일 클론 항체에 의한 자극 유무에서의 3, 5, 7일간 배양 후의 IL-7 및 CCL-19의 농도를, ELISA 키트를 이용하여 측정했다. 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7중, 백색 컬럼이 자극 없음, 회색 컬럼이 FITC 결합 트라스트주맙에 의한 자극 있음, 흑색 컬럼이 항 CD3 단일 클론 항체에 의한 자극을 나타낸다. 또한, 「Cont.」는 항 FITC　CAR 발현 T 세포, 「7×19」는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 나타낸다.
(결과)
도 7에서 명백하듯이, 3일간 뿐 아니라 5일간, 7일간 배양해도 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서는 IL-7 및 CCL-19가 세포 외로 분비되는 것이 명백해졌다.
(항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서의 배양 상청액 중의 IL-7, CCL19 농도의 측정)
또한, 제작한 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포에 대해, 동일하게 마이토마이신 C로 처리한 P815 비만세포종, 사람 CD20을 발현하도록 유전자 재조합을 수행한 P815 비만세포종(P815-hCD20), 또는 고층화된 항 CD3 단일 클론 항체에 의한 자극 유무에서의 3일간 또는 5일간 배양 후의 IL-7 및 CCL-19의 농도를, ELISA 키트를 이용하여 측정했다. 결과를 도 8에 나타낸다. 도 8중, 백색 컬럼이 자극 없음, 사선 컬럼이 마이토마이신 C로 처리한 P815에 의한 자극 있음, 흑색 컬럼이 P815-hCD20에 의한 자극 있음, 회색 컬럼이 고층화된 항 CD3 단일 클론 항체에 의한 자극이 있음을 나타낸다. 또한, 「Cont.」는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, 「7×19」는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 나타낸다.
(결과)
도 8에서 명백하듯이, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 대해서도 IL-7및 CCL-19가 세포 외로 분비되는 것이 명백해졌다.
실시예 4
［CAR 발현 T 세포의 세포 수, 생존율］
(항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 세포 수, 생존율)
항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의해 산생되는 IL-7이나 CCL19가 생물적인 기능을 발휘하여, 면역 유도 효과를 나타내는지 아닌지에 대해 검토했다. 제작한 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 1μg/ml의 고층화된 FITC 결합 트라스트주맙으로 자극하여 3일간, 5일간, 7일간 배양해, 세포와 상청액을 회수했다. 세포 수와 생존율은 트리판 블루 염색에 의해 해석했다. 결과를 도 9, 10에 나타낸다. 도 9, 10중, 흑색 컬럼은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포, 백색 컬럼은 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 나타내고, 가로축은 배양 날짜를 나타낸다. 또한, 통계학적 유의차는 Student＇s t-test로 검토했다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, †p<0.001).
(결과)
도 9, 10에 나타낸 바와 같이, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 세포 증식, 생존율이 모두 항진되어 있고, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의해 산생되는 IL-7이나 CCL19가 생물적인 기능을 발휘하고 있는 것이 명백해졌다.
(항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 세포 수)
항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포(4×105개) 함유 샘플을, 쥐 IgG2a 이소 타입 컨트롤, 항 CD127 단일 클론 중화 항체, 또는 항 CCR7 단일 클론 중화 항체의 존재하에서 마이토마이신 C와 함께 P815-hCD20으로 자극했다. 5일간 배양하고, 트리판 블루에 의해 생 세포의 절대 수를 조사했다. 그리고, CD127은 IL-7의 수용체이며, CCR7은 CCL19의 수용체이다. 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11중, 「Iso. Cntrl.」는 쥐 IgG2a 이소 타입 컨트롤, 「anti-CD127」은 항 CD127 단일 클론 중화 항체, 「anti-CCR7」은 항 CCR7 단일 클론 중화 항체, 의 각각 항체의 존재하에서 P815-hCD20으로 자극했을 경우이다. 도 11중, 흑색 컬럼은 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포, 백색 컬럼은 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 나타낸다. 또한, 각 데이터는 3개의 웰의 평균±표준 편차로 나타내고,*: P < 0.05, †: P < 0.001을 나타낸다.
(결과)
도 11에 나타낸 바와 같이, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서도 세포 수가 증가하고 있고, 세포 증식률이 항진되는 것, 및 anti-CD127에 의해 세포 증식이 억제되고 있는 것으로부터, 세포 증식률의 항진은 IL-7의 수용체인 CD127를 통해 작용하고 있는 것이 명백해졌다.
실시예 5
［T 세포 유주 시험］
(항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 T 세포 유주 시험)
트랜스 웰을 이용한 세포 유주 시험에 의해, CCL19의 유주 야기 효과를 검토했다. 응답 측 T 세포의 유주성은 96 웰의 트랜스 웰(등록상표) 챔버(Cornig　Costar사 제품)를 이용하여, 구멍 지름 5 μm의 폴리카보네이트 필터를 통해 유주시킴으로써 측정했다. 구체적으로는, 챔버의 하층에서 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 1μg/ml의 고층화 FITC 결합 트라스트주맙으로 3일간 자극했다. 응답 측 T 세포는, MACS(등록상표) (Miltenyi　Biotec사 제품)의 네거티브 선택에 의해, 비장이나 림프절로부터 조제했다. 응답 측 T 세포는 CytoTell　blue(AAT　Bioquest사 제품)로 라벨링하고, 상층에서 3시간 배양했다. 챔버의 상층에서 하층으로의 유주는 유동세포계수법으로 조사했다. 결과를 도 12에 나타낸다. 도 12중, 흑색 컬럼은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포, 백색 컬럼은 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 나타내고, 세로축은 하층의 챔버에 유주한 응답 측 T 세포의 절대 수를 나타낸다(아래의 도 13, 14에서도 동일). 또한, 통계학적 유의차는 Student＇s t-test로 검토했다(*p<0.05).
(결과)
도 12에 나타낸 바와 같이, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는, 항 FITC　CAR 발현 T 세포와 비교하여 보다 많은 T 세포를 하층에 유주시켰다. CAR 발현 T 세포 등의 림프구 이입 요법에서는, 투여한 T 세포에 의한 암세포 상해는 물론 중요하지만, 그에 더해, 암환자에게 원래 존재하는 내재성 T 세포(=숙주 측 면역 세포)를 활성화하여, 암세포를 공격하는 세포로서 동원하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 항종양 활성을 갖는 림프구를 단순히 외부로부터 이입할 뿐 아니라, 어떠한 수법으로, 이입된 T 세포와 내재성 T 세포의 능동적인 상호작용을 야기하여, 내재성 T 세포를 암 국소에 집적하도록 시키는 것이 면역 치료 효과를 높이는 점에서 바람직하다. 도 12의 결과로부터, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는, 내인성 T 세포를 집적시키는 능력을 가지므로, 이입된 T 세포와 내재성 T 세포의 능동적인 상호작용을 유도하는 것이 가능하다는 것이 명백해졌다.
(항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 T 세포 또는 수지상 세포의 유주 시험)
트랜스 웰의 하층 챔버중에서, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 함유하는 샘플(5×105개)을 고층화된 FITC 결합 트라스트주맙 또는 항 CD3 단일 클론 항체에 의해 자극했다. 3일째에 CytoTell　Blue로 염색한 4×105개의 T 세포를 상층에 두고, 3시간 또는 5시간 인큐베이팅했다. 같이 각각의 샘플을 고층화된 FITC 결합 트라스트주맙으로 자극하여, 3일째에 CytoTell　Blue로 염색한 4×105개의 수지상 세포를 상층에 두고, 3시간 인큐베이팅했다. 상층에서 하층으로 유주된 각각의 응답 측 세포를 유동세포계수법으로 분석했다. 결과를 도 13, 14에 나타낸다. 도 13, 14중, 흑색 컬럼은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포, 백색 컬럼은 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 나타낸다. 그리고, 도 13, 14 및 후술하는 도 15에서, 각 데이터는 3개의 웰의 평균±표준 편차로 나타내고, *:P < 0.05, **: P < 0.01, †:P < 0.001, ††: P < 0.00001, ‡:p<5×10-5를 나타낸다.
(결과)
도 13, 14의 결과로부터, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는, 내인성 T 세포 및 수지상 세포를 집적시키는 능력이 높은 것이 명백해졌다.
(항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 T 세포 유주 시험)
트랜스 웰의 하층 챔버중에서, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포(1×105개) 함유 샘플을, 마이토마이신 C로 처리한 P815-hCD20과 공배양했다. 3일째에 CytoTell　Blue로 염색한 4×105개의 T 세포를 상층에 두고, 쥐 IgG2a 이소 타입 컨트롤, 항 CD127 단일 클론 항체, 또는 항 CCR7 단일 클론 항체의 존재하에서 3시간 인큐베이팅했다. 상층에서 하층으로 유주된 각각의 응답 측 T 세포를 유동세포계수법으로 분석했다. 결과를 도 15에 나타낸다. 도 15중, 「Iso. Cntrl.」는 쥐 IgG2a 이소 타입 컨트롤, 「anti-CD127」은 항 CD127 단일 클론 중화 항체, 「anti-CCR7」은 항 CCR7 단일 클론 중화 항체의 존재하에서 P815-hCD20으로 자극했을 경우이다. 도 15중, 흑색 컬럼은 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포, 백색 컬럼은 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 나타낸다.
(결과)
도 15의 결과로부터, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서도 내인성 T 세포를 집적시키는 능력이 높은 것, 및 anti-CCR7에 의해 내인성 T 세포의 집적이 억제되고 있으므로, 내인성 T 세포의 집적은 CCL19의 수용체인 CCR7을 통해 작용하고 있는 것이 명백해졌다.
또한, 도 9~15의 결과로부터 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포나 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는, IL-7에 의해 효과적으로 증식하고, 생존율도 높은 한편 CCL19에 의해 T 세포나 수지상 세포가 암국소에 집적된다고 하는, 면역 유도에 빠질 수 없는 중요한 효과를 구비하고 있어, 뛰어난 면역 유도 효과를 갖는 것이 명백해졌다. 즉, CAR 발현 T 세포에서, 「IL-7」과 「CCL19」의 2개의 제어 분자를 발현시킴으로써, 이러한 T 세포의 증식 능력, 생존율, 면역 유도 효과를 향상시키는 것이 가능하다는 것이 명백해졌다.
실시예 6
［T 세포의 증식 능력］
항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 및 컨트롤로서 항 FITC　CAR 발현 T 세포를 함유하는 샘플(5×105개)을 CytoTell　Blue(AAT　Bioquest사 제품)로 염색하고, 고정화한 FITC 결합 트라스트주맙에 의해 자극 후에 유동세포계수법으로 분석했다. 자극 개시 후 5일째의 결과를 도 16에, 3일째, 7일째의 결과를 도 17에 나타낸다. 도 16중, 막대그래프의 수치는 세포 분열 수를 나타내고, 도 16, 17중, 원 그래프의 수치는 백혈구 파퓰레이션에서의 각각의 게이팅(gating)한 프랙션(fraction)(0, 1, 2, 3, 4＞의 세포 분열수)의 비율을 나타낸다.
(결과)
도 16, 17의 결과로부터, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 항 FITC　CAR 발현 T 세포와 비교하여 증식 능력이 증대하고 있는 것이 명백해졌다.
실시예 7
［T 세포, 수지상 세포, 및 CAR 발현 T 세포에서의 CD127 또는 CCR7의 발현］
비자극의 비장 T 세포(나이브 T 세포：naive T cells), 비장 T 세포를 항 CD3 단일 클론 항체, 항 CD28 단일 클론 항체 및 IL-2와 함께 2일간 배양하여 자극한 것(activated T cells), 비자극 비장 중의 수지상 세포(dendritic cells), 및 실시예 1의 「마우스 T 세포의 형질 도입」과 동일한 방법으로 활성화하여 제작한 항 FITC　CAR 발현 T 세포(Cont.)와 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포(7×19)를 유동세포계수법으로 해석하여, CD127 또는 CDR7의 발현을 조사했다. 또한 T 세포는 CD3＋CD19-의 파퓰레이션, 항 FITC　CAR 발현 T 세포, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 FITC 결합 덱스트란 비즈에 대해 포지티브(positive)한 파퓰레이션, 수지상 세포는 CD11c＋의 파퓰레이션으로 했다. CD127 발현을 조사한 결과를 도 18에, CCR7 발현을 조사한 결과를 도 19에 나타낸다. 도면 중, 수치는 양성의 %, 「Cont.」는 항 FITC　CAR 발현 T 세포, 「7×19」는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 나타낸다.
(결과)
도 18에 나타낸 바와 같이, CD127의 발현은, 활성화 T 세포에서는 나이브 T 세포와 비교하여 분명하게 저하되었지만, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서는, 활성화 T 세포보다 많고, 추가로 나이브 T 세포 이상으로 회복하고 있는 것이 명백해졌다. 또한, 도 19에 나타낸 바와 같이, CCR7의 발현은 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 있어서 활성화에 의해 발현이 저하되지만, 나이브 T 세포와 비교하여 대략 67%의 발현을 유지하고 있는 것이 명백해졌다. 종래에, T 세포가 활성화되면 CD127 또는 CCR7의 발현은 대략 1/2~1/3까지 저하되는 것이 알려졌었다. 그러므로, IL-7이나 CCL19를 발현하는 CAR 발현 T 세포를 제작해도, CAR 발현 T 세포가 활성화되는 것에 의해 IL-7 및 CCL19의 작용이 저하된다고 생각된다. 따라서, CAR 발현 T 세포에 IL-7 및 CCL19를 발현시킴으로써, CAR 발현 T 세포에 의한 면역 유도 효과나 항종양 활성을 높이는 것은 통상적으로 기대하기 어렵다고 생각된다. 본 시험에서도, 비장 T 세포를 활성화 후 2일째는, CD127 또는 CCR7의 발현은 일단 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 그런데, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에서는, 4일째에 CD127 또는 CCR7의 발현이 회복되는 것이 명백해졌다. 이 때문에, CAR 발현 T 세포에 IL-7 및 CCL19를 발현시키는 것은 면역 유도 효과나 항종양 활성의 증강에 유용하다는 것이 나타났다.
실시예 8
［마우스 종양 모델에서의 치료 효과］
(마우스에 대한 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 투여)
담암 마우스(DBA/2 마우스)에, 사람 CD20을 발현하도록 유전자 재조합을 실시한 P815 비만세포종(P815-hCD20) 5×105개를 피하에 접종했다. 3일 후, 3×106개의 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 상기 마우스에 대해 정맥 내에 투여했다. 컨트롤로서는, 상기 P815 비만세포종를 접종 후 미처리(CAR 발현 T 세포 투여하지 않음)의 비치료군을 설정했다. 마우스의 종양 부피나 생존율을 1주간 2회 측정했다. 종양 부피 분석에서, 표준 편차는 각각의 실험 그룹에서 산출했다. 3개의 그룹의 통계적 유의차는, 종양 부피 분석에서는 Student's t-tests, 생존율의 조사에서는 log-rank test에 의해 검토했다(*P<0.05, **P<0.01).
마우스의 종양 부피 변화의 결과를 도 20에, 마우스 생존율의 결과를 도 21에 나타낸다. 도 20, 21중, ○는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 투여했을 경우, ●는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우, ◇는 비치료군으로서 CAR 발현 T 세포를 투여하지 않은 경우를 나타낸다. 또한, 도 20의 가로축은 세포를 마우스 정맥 내에 투여 후의 경과일수, 세로축은 종양 부피(mm3)를 나타내고, 도 21의 가로축은 세포를 마우스 정맥 내에 투여 후의 경과 주, 세로축은 생존율(%)을 나타낸다.
(결과)
도 20, 21에 나타낸 바와 같이, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우에는, 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 투여했을 경우나 CAR 발현 T 세포 투여하지 않음의 경우와 비교하여 종양 부피의 감소 효과나, 생존율의 향상(생존 기간의 연장 효과)이 확인되었다. 따라서, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 뛰어난 항종양 활성을 갖는 것이 명백해졌다.
(마우스에 대한 항암제 및 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포의 접종)
마우스에 5×105개의 P815-hCD20을 피하 접종했다. 접종 후 10일째에 항암제인 시클로포스파미드(CPA, 100 mg/kg)를 복강 내에 투여하고, 14일째에 1×106개의 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 정맥 내에 투여했다. 마우스의 생존율의 결과를 도 22에, 종양의 부피의 결과를 도 23, 24에 나타낸다. 도 22~24중, 가로축은 P815-hCD20을 피하 접종 후의 날짜(마우스에 P815-hCD20을 피하 접종한 날을 0일로 했다), 세로축은 생존율(도 22), 종양 부피(종양의 긴 축×(종양의 짧은 축) 2/2(mm3)) (도 23, 24)이고, 「no　treatment」는 무처리, 「CPA」는 CPA만, 「CPA＋Cont.」는 CPA 투여 후에 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 투여, 「CPA＋7×19」는 CPA 투여 후에 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여한 그룹이며, †는 마우스의 죽음을 나타낸다. 그리고, 도 24는 도 23에서의 CPA＋7×19의 그래프의 세로축의 수치를 1/10로 한 도면이다.
(결과)
도 22에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포와 항암제를 병용함으로써, 생존율이 매우 높아지는 것이 명백해졌다. 또한, 도 23, 24에 나타낸 바와 같이 본 발명의 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포와 항암제를 병용함으로써, 종양이 완전히 소실되는 것이 명백해졌다. 그리고, 도 24에 나타낸 바와 같이, P815-hCD20을 피하 접종 후 10일째에 종양 부피가 최대가 되어 있고, 이때의 짧은 직경은 4. 86 mm~7. 25 mm, 긴 직경은 5. 92 mm~8. 39 mm이며, 종양 부피로 하면, 69. 91 mm3~220. 50 mm3, 평균은 140. 02 mm3였다. 상기 결과로부터도, 일단 증식된 종양이, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포에 의한 치료에 의해 소실된 것이 나타났다. 그리고, 다른 항암제와 병용하는 경우에는, 상기 방법과 같이, 우선은 다른 항암제에 의해 림프구 세포 수를 저감시키고, 그 후에 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여하는 것이, 보다 본 발명의 CAR 발현 T 세포에 의한 항종양 활성을 높이는데 바람직하다. 이러한 방법에 의해 CAR 발현 T 세포의 생체내 항상성을 증강시킬 수 있다.
실시예 9
［종양 조직으로의 침투 효과］
마우스에 5×105개의 P815-hCD20을 피하 접종했다. 접종 후 3일째에, 1×106개의 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여하고, 접종 후 21일째에 종양 조직을 절단했다. 각각의 조직을 2개로 나누었다. 하나는 헤마톡실린·에오진(H＆E) 염색을 수행하고, 다른 쪽은 면역 조직 화학 분석에 이용했다. 면역 조직 화학 분석에서, 1차 항체로서 항 CD4 및 항 CD8의 단일 클론 항체의 조합, 또는, 항 CD3 및 항 DEC205의 단일 클론 항체의 조합으로 수행했다. 또한, 2차 항체로서 Alexa　Fluor(상표 등록) 488 결합 항쥐(anti-rat) IgG2a(녹색) 및 Alexa　Fluor(상표 등록) 647 결합 항쥐 IgG2b(적색)를 이용했다. 세포핵은 DAPI(청색)로 염색했다. H＆E 염색 샘플 및 면역 표지된 단편의 현미경 관찰은 ×100 또는×200의 배율로 수행했다. 그리고, CD4 및 CD8은 T 세포의 마커, DEC205는 수지상 세포의 마커이다. H＆E 염색의 결과를 도 25에, 면역 조직 화학 분석의 결과를 도 26(a), (b)에 나타낸다. 또한, 도 26(a), (b)의 데이터에 대해 각각의 형광 염색(CD4 염색(빨강), CD8 염색(초록), CD3 염색(빨강), DEC205 염색(초록), CD3 및 DEC205의 공존(노랑))에 의해 표지된 포지티브 영역을 Hybrid　Cell　Count　program(KEYENCE사 제품)을 이용해 정량 한 결과를 각각 도 27(a), (b)에 나타낸다. 도 25~27중, 「no　treatment」또는 「no　treat.」는 무처리, 「Cont.」는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, 7×19는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포로 처리한 그룹이다.
(결과)
도 25의 결과로부터, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포로 처리했을 경우에는, 네크로시스(괴사)가 진행되고(화살표로 나타낸 영역), 핵이 소실된 영역이 관찰되었다. 또한, 도 26(a), 27(a)의 결과로부터, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포로 처리하는 것에 의해, 암의 조직 내에 T 세포가 침투되어 있는 것, 및 도 26(b), 27(b)의 결과로부터, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포로 처리하는 것에 의해, 암의 조직 내에 T 세포와 함께 수지상 세포가 침투되어 있는 것이 명백해졌다.
실시예 10
［IL-7과 CCL19의 조합에 의한 종양 치료 효과］
DBA/2 마우스에 5×105개의 P815-hCD20을 피하 접종했다. 접종 후 3일째에, 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, 면역 기능 촉진 인자로서 IL-7만을 발현하는 (CCL19를 발현하지 않는다) 항 사람 CD20　CAR-IL-7 발현 T 세포, 면역 기능 촉진 인자로서 CCL19 만을 발현하는 (IL-7을 발현하지 않는다.) 항 사람 CD20　CAR-CCL19 발현 T 세포, 또는 IL-7 및 CCL19를 발현하는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 1×106개 정맥 내에 투여했다. 컨트롤로서, IL-7 및 CCL19를 발현하지 않는 CAR 발현 T 세포 투여하지 않음의 마우스 군을 마련했다. 투여 후 10일째에 종양의 긴 축 짧은 축을 측정하여, 종양의 부피(mm3)를 상기와 같은 방법으로 산출했다. 결과를 도 28에 나타낸다. 도 28 중, 「No　treat」는 CAR 발현 T 세포를 투여하지 않음, 「Control　CAR」은 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, 「IL-7　CAR」은 항 사람 CD20　CAR-IL-7 발현 T 세포, 「CCL19　CAR」은 항 사람 CD20　CAR-CCL19 발현 T 세포, 「IL-7/CCL19　CAR」은 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우를 나타낸다.
그리고, 항 사람 CD20　CAR-IL-7 발현 T 세포는 항 사람 CD20　CAR-F2A-IL-7을 포함하는 pMSGV 벡터(IL-7 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터)를 제작하고, 실시예 1의 「마우스 T 세포의 형질 도입」과 동일한 방법으로 마우스 T 세포에 도입함으로써 얻었다. 동일하게, 항 사람 CD20　CAR-CCL19 발현 T 세포는 항 사람 CD20　CAR-F2A-CCL19를 포함하는 pMSGV 벡터(CCL19 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터)를 제작하고, 실시예 1의 「마우스 T 세포의 형질 도입」과 동일한 방법으로 마우스 T 세포에 도입함으로써 얻었다. 각각의 벡터의 제작은, 실시예 1의 「IL-7 및 CCL19를 발현하는 항 FITC　CAR 발현 벡터의 제작」이나 「IL-7 및 CCL19를 발현하는 항 CD20CAR 발현 벡터의 제작」방법에 준해 수행했다. IL-7을 코딩하는 서열은, 서열 번호 9에서의 1~462번째와 그에 계속되는 종지 코돈 서열, CCL19를 코딩하는 서열은 서열 번호 9에서의 538~864번째의 서열을 이용했다. 결과를 도 28에 나타낸다.
(결과)
도 28에 나타낸 바와 같이, 항 사람 CD20　CAR-IL-7 발현 T 세포나 항 사람 CD20　CAR-CCL19 발현 T 세포를 투여했을 경우에는, Conotrol의 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 투여했을 경우와 거의 동등 또는 약간 낮은 종양 증식 억제 효과 밖에 없었지만, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여하면 종양이 거의 소실되었다. 따라서, IL-7, CCL19 각각 단독으로는 거의 종양 증식 억제 효과가 없음에도 IL-7로 CCL19를 조합함으로써, 지극히 높은 종양 증식 억제 효과를 얻을 수 있는 것이 명백해졌다.
실시예 11
［51Cr방출 어세이에 의한 종양 세포 상해 활성-1］
(T 세포의 면역 기능 촉진 인자의 선택)
암 조직의 미소 환경에서는, 면역 세포에 억제성 신호가 전달되어 항종양 면역 반응이 저해됨으로써, 면역 요법의 효과가 감소, 약화된다. 면역 세포에 대한 억제 신호는, SHP-1이나 SHP-2에 의해 전달된다. 따라서, 암에 대한 T 세포 요법에서, T 세포 자체에 SHP-1이나 SHP-2의 작용을 저해하는 도미넌트 네거티브 변이체를 산생시킴으로써, 항종양 효과를 증강하는 것이 가능해진다. 따라서, SHP-1이나 SHP-2의 작용을 저해하는 도미넌트 네거티브 변이체와 CAR을 함께 발현하는 벡터를 제작하고, 종양 세포 상해 활성을 조사했다.
(SHP1 또는 SHP2의 도미넌트 네거티브 변이체를 발현하는 CAR 발현 벡터의 제작)
453 위치에서의 촉매 시스테인 잔기의 세린으로의 변이(C453S)를 함유하는 마우스 SHP1의 도미넌트 네거티브 변이체(SHP1DN)를 코딩하는 DNA 단편은, PCR에 의한 부위 특이적 변이 도입법에 의해 제작하고, 459 위치에서의 촉매 시스테인 잔기의 세린으로의 변이(C459S)를 함유하는 마우스 SHP2의 도미넌트 네거티브 변이체(SHP2DN)를 코딩하는 DNA 단편은, 라이프 테크놀로지사가 합성한 것을 이용했다. 마우스 SHP1DN을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 11로, 마우스 SHP2DN을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 12로 나타낸다. 서열 번호 11중, 1357~1359번째, 및 서열 번호 12중, 1375~1377번째의 3 염기가 변이 부위이다. SHP1DN 또는 SHP2DN을 코딩하는 DNA 단편을, 실시예 2의 IL-7/CCL19 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터 제작 과정에서의 항 사람 CD20　scFv　CAR-F2A-MCS를 포함하는 pMSGV 벡터의 MCS에 삽입하여, 각각 SHP1DN 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터, SHP2DN 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터를 얻었다. 얻어진 벡터의 배치도를 도 29에 나타낸다.
(마우스 T 세포의 형질 도입)
상기 SHP1DN 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터, SHP2DN 발현-항 사람 CD20　CAR 벡터를 실시예 1과 동일한 방법으로 마우스 T 세포에 도입하고, 각각 항 사람 CD20　CAR-SHP1DN 발현 T 세포, 항 사람 CD20　CAR-SHP2DN 발현 T 세포를 얻었다. 컨트롤로서는, 실시예 1로 제작한 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 이용했다.
(51Cr방출 어세이에 의한 종양 세포 상해 활성)
종양에 대한 CAR 발현 T 세포의 세포 상해 활성은, 표준적인 4시간 51Cr방출 어세이에 의해 측정했다. 사람 CD20을 발현하는 P815(P815-hCD20)을 타겟 종양 세포로써 이용했다. 상기 종양 세포를 채취해, 100 μCi　Na2 51CrO4 존재 하, 37℃에서 1시간 배양한 후에 3회 세정했다. 그 후, 이펙터 T 세포로서 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, 항 사람 CD20　CAR-SHP1DN 발현 T 세포, 또는 항 사람 CD20　CAR-SHP2DN 발현 T 세포와 공배양했다. 이펙터/타겟비는, 0. 6, 1. 25, 2. 5, 5, 10이 되도록 했다. 타겟 세포의 최대 방출과 자연 방출은, 상기 세포를 10% Triton-X(시그마 알드리치사 제품) 함유 배양액 또는 배양액만으로 배양하는 것에 의해 측정했다. 상청액의 51Cr방출은 TopCount 신틸레이션 카운터(PerkinElmer사 제품)로 측정했다. 특이적 상해의 비율은, 식：특이적 상해(%)=［(시험 방출-자연 방출)/(최대 방출-자연 방출)］×100으로 산출했다. 결과를 도 30에 나타낸다. 도 30(a)에 있어서, ○는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, ●는 항 사람 CD20　CAR-SHP1DN 발현 T 세포이며, 도 30(b)에 있어서, ○는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, ●는 항 사람 CD20　CAR-SHP2DN 발현 T 세포이다. 또한, 가로축은 이펙터(T 세포)와 타겟(종양 세포)의 비를 E/T　ratio로 나타내고, 세로축은 특이적 상해(%)를 나타낸다. 통계학적 유의차는 Student＇s t-test로 검토했다(*p<0.05).
도 30에 나타낸 바와 같이, 항 사람 CD20　CAR-SHP1DN 발현 T 세포나 항 사람 CD20　CAR-SHP2DN 발현 T 세포는, 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포와 비교하여 큰 의미를 갖는 종양 세포 상해 활성을 갖는 것이 명백해졌다.
실시예 12
［51Cr방출 어세이에 의한 종양 세포 상해 활성-2］
P815-hCD20(1×104개/웰)을 라벨이 없는(Ab, 희게 표시) 또는 FITC 결합(FITC-Ab, 검게 표시) 리툭시맙 존재하에서, 이펙터/타겟(E/T) 비율이 0. 15625, 0. 3125, 0. 625, 2. 5, 5, 10이 되도록 항 FITC　CAR 발현 T 세포(Cont, 동그라미) 또는 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포(7×19, 사각)와 함께 혼합하고, 상술과 같은 방법으로 상청액의 51Cr방출을 측정하여, 상해 활성의 비율을 산출했다. 결과를 도 31에 나타낸다. 도 31 중, FITC 결합 리툭시맙 존재하에서, 항 FITC　CAR 발현 T 세포와 함께 혼합했을 경우를 “●”, 라벨이 없는 리툭시맙 존재하에서, 항 FITC　CAR 발현 T 세포와 함께 혼합했을 경우를 “○”, FITC 결합 리툭시맙 존재하에서, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포와 함께 혼합했을 경우를 “■”, 라벨이 없는 리툭시맙 존재하에서, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포와 함께 혼합했을 경우를 “□”로 나타낸다.
또한, 815-hCD20(1×104개/웰)을 이펙터/타겟(E/T) 비율이 0. 3125, 0. 625, 2. 5, 5, 10, 20이 되도록 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포 또는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포와 함께 혼합하고, 상기와 같은 방법으로 상청액의 51Cr방출을 측정해, 상해 활성의 비율을 산출했다. 결과를 도 32에 나타낸다. 도 32 중, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포와 함께 혼합했을 경우를 “●”, 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포와 함께 혼합했을 경우를 “○”로 나타낸다.
(결과)
도 31, 32에 나타낸 바와 같이, 항 FITC　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 1 세포 당 종양 세포 상해 활성이 항 FITC　CAR 발현 T 세포와 동등하게 유지하고 있고, 동일하게 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 1 세포 당 종양 세포 상해 활성이 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포와 동등 레벨을 유지하고 있는 것이 명백해졌다.
실시예 13
［생체 내에서의 CAR 발현 T 세포의 생존과 메모리 T 세포로의 분화］
(유동세포계수법 해석)
DBA/2 마우스에 5×105개의 P815-hCD20을 피하 접종했다. 접종 후 10일째에 항암제인 시클로포스파미드(CPA, 100 mg/kg)를 복강 내에 투여하고, 14일째에 1×106개의 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포 또는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포를 정맥 내에 투여했다. CAR 발현 T 세포 투여 후 21일째에 비장 또는 종양 소속 림프절(겨드랑 밑, 상완, 서혜)로부터 백혈구를 단리했다. 유동세포계수법으로 백혈구 표면의 표현형에 대해, CD4, CD8, CD44, CD62L를 해석한 결과를 도 33에 나타낸다. 또한, 비장의 백혈구를 마이토마이신 C로 처리한 P815-hCD20과 함께 4일간 배양하여 자극하여, T 세포의 증식을 유동세포계수법으로 조사한 결과를 도 34에 나타낸다. CAR의 발현은 비오틴 표지된 프로테인 L 및 APC 결합 스트렙타아비딘을 이용하여 확인했다. 도 33중의 숫자는 CD4＋T 세포, CD8＋T 세포 각각의 게이트 영역(CD62L＋CD44-는 나이브 T 세포, CD62L＋CD44＋는 센트럴 메모리 T 세포, CD62L-CD44＋는 이펙터 메모리 T 세포)의 비율을 나타내고, 도 34 중의 숫자는 프로테인 L 양성 T 세포의 비율을 나타낸다. 또한, 도 33, 34에서, 「Cont.」는 항 사람 CD20　CAR 발현 T 세포, 「7×19」는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 나타낸다.
(결과)
도 33, 34에 나타낸 바와 같이, 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포를 투여한 마우스에서는, 비장 및 림프절에서 메모리 T 세포가 증가하고 있는 것, 또 마우스 내에 생존하는 항 사람 CD20　CAR-IL-7/CCL19 발현 T 세포는 사람 CD20을 발현하는 종양 세포와 공배양하면 강하게 증식하는 것이 명백해졌다. 도 21, 22의 생존율의 결과와 합치면, 본 발명의 CAR 발현 T 세포는, 투여된 생체 내에 있어서 효율적으로 생존하고, 메모리 T 세포가 됨으로써 암세포를 소멸시켜 생존율을 높이는 능력도 갖고 있다고 생각되어, 암의 재발 예방에도 유효하다는 것이 나타났다.
본 발명의 CAR 발현 벡터를 이용하면, 생존 능력 및 림프구 집적 능력을 겸비하는 CAR-T 세포나, 암 미세 환경에서의 면역 억제에 저항성을 갖는 CAR-T 세포를 제작하는 것이 가능해지므로, 암면역 요법의 분야에 있어서 이용 가능하다.
<110> YAMAGUCHI UNIVERSITY <120> CAR EXPRESSION VECTOR AND CAR-EXPRESSING T CELLS <130> 17IC17022 <150> JP 2014-208200 <151> 2014-10-09 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A peptide cleavage region <220> <221> PEPTIDE <222> (2) <223> Val or Ile <220> <221> PEPTIDE <222> (4) <223> any amino acid <400> 1 Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2Apeptide(F2A) <400> 2 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 3 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IL-7 <400> 3 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 85 90 95 Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 115 120 125 Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu 130 135 140 Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 165 170 175 His <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CCL19 <400> 4 Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 20 25 30 Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 50 55 60 Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu 65 70 75 80 Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 85 90 95 Ser Ser <210> 5 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human SHP1DN <400> 5 Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr 1 5 10 15 Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser 20 25 30 Arg Lys Asn Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln 35 40 45 Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu 85 90 95 Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His 100 105 110 Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly 115 120 125 Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp 130 135 140 Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser 145 150 155 160 Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr 165 170 175 Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu 180 185 190 His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr 195 200 205 Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr Ala Thr Arg Val Asn Ala Ala Asp Ile Glu 210 215 220 Asn Arg Val Leu Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Ser Glu Asp Thr Ala 225 230 235 240 Lys Ala Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val 245 250 255 Lys Asn Leu His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly 260 265 270 Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile 275 280 285 Leu Gln Gly Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala 290 295 300 Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Tyr Ile Ala Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp 325 330 335 Gln Met Ala Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg 340 345 350 Glu Val Glu Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val 355 360 365 Gly Met Gln Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu 370 375 380 His Asp Thr Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu 385 390 395 400 Asp Asn Gly Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser 405 410 415 Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe 420 425 430 Leu Asp Gln Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro 435 440 445 Ile Ile Val His Ser Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile 450 455 460 Val Ile Asp Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ile Asp Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser 485 490 495 Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile 500 505 510 Ala Gln Phe Ile Glu Thr Thr Lys Lys Lys Leu Glu Val Leu Gln Ser 515 520 525 Gln Lys Gly Gln Glu Ser Glu Tyr Gly Asn Ile Thr Tyr Pro Pro Ala 530 535 540 Met Lys Asn Ala His Ala Lys Ala Ser Arg Thr Ser Ser Lys His Lys 545 550 555 560 Glu Asp Val Tyr Glu Asn Leu His Thr Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys 565 570 575 Val Lys Lys Gln Arg Ser Ala Asp Lys Glu Lys Ser Lys Gly Ser Leu 580 585 590 Lys Arg Lys 595 <210> 6 <211> 593 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human SHP2DN <400> 6 Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala 1 5 10 15 Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn 35 40 45 Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp 50 55 60 Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr 65 70 75 80 Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile 85 90 95 Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp 100 105 110 Phe His Gly His Leu Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu 115 120 125 Lys Gly Lys His Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro 130 135 140 Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser 145 150 155 160 Asn Asp Gly Lys Ser Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln Glu 165 170 175 Leu Lys Tyr Asp Val Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr Asp 180 185 190 Leu Val Glu His Tyr Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly Thr 195 200 205 Val Leu Gln Leu Lys Gln Pro Leu Asn Thr Thr Arg Ile Asn Ala Ala 210 215 220 Glu Ile Glu Ser Arg Val Arg Glu Leu Ser Lys Leu Ala Glu Thr Thr 225 230 235 240 Asp Lys Val Lys Gln Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Thr Leu Gln Gln 245 250 255 Gln Glu Cys Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Lys Glu Gly Gln Arg Gln Glu 260 265 270 Asn Lys Asn Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Thr 275 280 285 Arg Val Val Leu His Asp Gly Asp Pro Asn Glu Pro Val Ser Asp Tyr 290 295 300 Ile Asn Ala Asn Ile Ile Met Pro Glu Phe Glu Thr Lys Cys Asn Asn 305 310 315 320 Ser Lys Pro Lys Lys Ser Tyr Ile Ala Thr Gln Gly Cys Leu Gln Asn 325 330 335 Thr Val Asn Asp Phe Trp Arg Met Val Phe Gln Glu Asn Ser Arg Val 340 345 350 Ile Val Met Thr Thr Lys Glu Val Glu Arg Gly Lys Ser Lys Cys Val 355 360 365 Lys Tyr Trp Pro Asp Glu Tyr Ala Leu Lys Glu Tyr Gly Val Met Arg 370 375 380 Val Arg Asn Val Lys Glu Ser Ala Ala His Asp Tyr Thr Leu Arg Glu 385 390 395 400 Leu Lys Leu Ser Lys Val Gly Gln Gly Asn Thr Glu Arg Thr Val Trp 405 410 415 Gln Tyr His Phe Arg Thr Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Asp Pro 420 425 430 Gly Gly Val Leu Asp Phe Leu Glu Glu Val His His Lys Gln Glu Ser 435 440 445 Ile Met Asp Ala Gly Pro Val Val Val His Ser Ser Ala Gly Ile Gly 450 455 460 Arg Thr Gly Thr Phe Ile Val Ile Asp Ile Leu Ile Asp Ile Ile Arg 465 470 475 480 Glu Lys Gly Val Asp Cys Asp Ile Asp Val Pro Lys Thr Ile Gln Met 485 490 495 Val Arg Ser Gln Arg Ser Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Arg 500 505 510 Phe Ile Tyr Met Ala Val Gln His Tyr Ile Glu Thr Leu Gln Arg Arg 515 520 525 Ile Glu Glu Glu Gln Lys Ser Lys Arg Lys Gly His Glu Tyr Thr Asn 530 535 540 Ile Lys Tyr Ser Leu Ala Asp Gln Thr Ser Gly Asp Gln Ser Pro Leu 545 550 555 560 Pro Pro Cys Thr Pro Thr Pro Pro Cys Ala Glu Met Arg Glu Asp Ser 565 570 575 Ala Arg Val Tyr Glu Asn Val Gly Leu Met Gln Gln Gln Lys Ser Phe 580 585 590 Arg <210> 7 <211> 1674 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-FITC CAR <400> 7 atggagttgc ctgttaggtt gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gtcgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acgttggtac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaaggtc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaagtagtg ctgatgatgc taagaaggat 420 gctgctaaga aggatgatgc taagaaggat gatgctaaga aggatggtga ggtgaagctg 480 gatgagactg gaggaggctt ggtgcaacct gggaggccca tgaaactctc ctgtgttgcc 540 tctggattca cttttagtga ctactggatg aactgggtcc gccagtctcc agagaaagga 600 ctggagtggg tagcacaaat tagaaacaaa ccttataatt atgaaacata ttattcagat 660 tctgtgaaag gcagattcac catctcaaga gatgattcca aaagtagtgt ctacctgcaa 720 atgaacaact taagagttga agacatgggt atctattact gtacgggttc ttactatggt 780 atggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctccg cggccgcagt cgtgccagtc 840 cttcagaaag tgaactctac tactaccaag ccagtgctgc gaactccctc acctgtgcac 900 cctaccggga catctcagcc ccagagacca gaagattgtc ggccccgtgg ctcagtgaag 960 gggaccggat tggacttcgc ctgtgatatt tacatctggg cacccttggc cggaatctgc 1020 gtggcccctc tgctgtcctt gatcatcact ctcatctgct accacaggag ccgaaatagt 1080 agaaggaaca gactccttca aagtgactac atgaacatga ctccccggag gcctgggctc 1140 actcgaaagc cttaccagcc ctacgcccct gccagagact ttgcagcgta ccgccccaaa 1200 tggatcagga aaaaattccc ccacatattc aagcaaccat ttaagaagac cactggagca 1260 gctcaagagg aagatgcttg tagctgccga tgtccacagg aagaagaagg aggaggagga 1320 ggctatgagc tgagagcaaa attcagcagg agtgcagaga ctgctgccaa cctgcaggac 1380 cccaaccagc tctacaatga gctcaatcta gggcgaagag aggaatatga cgtcttggag 1440 aagaagcggg ctcgggatcc agagatggga ggcaaacagc agaggaggag gaacccccag 1500 gaaggcgtat acaatgcact gcagaaagac aagatggcag aagcctacag tgagatcggc 1560 acaaaaggcg agaggcggag aggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagcact 1620 gccaccaagg acacctatga tgccctgcat atgcagaccc tggcccctcg ctaa 1674 <210> 8 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A-MCS <400> 8 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tccaaccctg gaccatgcat aaaaagctta aaccagttaa ctggaaaacg cgtaaagtcg 120 acaaaggcca aaaaggccaa cgtacg 146 <210> 9 <211> 864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouseIL-7-F2A-mouseCCL19 <400> 9 atgttccatg tttcttttag atatatcttt ggaattcctc cactgatcct tgttctgctg 60 cctgtcacat catctgagtg ccacattaaa gacaaagaag gtaaagcata tgagagtgta 120 ctgatgatca gcatcgatga attggacaaa atgacaggaa ctgatagtaa ttgcccgaat 180 aatgaaccaa acttttttag aaaacatgta tgtgatgata caaaggaagc tgcttttcta 240 aatcgtgctg ctcgcaagtt gaagcaattt cttaaaatga atatcagtga agaattcaat 300 gtccacttac taacagtatc acaaggcaca caaacactgg tgaactgcac aagtaaggaa 360 gaaaaaaacg taaaggaaca gaaaaagaat gacgcatgtt tcctaaagag actactgaga 420 gaaataaaaa cttgttggaa taaaattttg aagggcagta taggaagcgg agtgaaacag 480 actttgaatt ttgaccttct caagttggcg ggagacgtgg agtccaaccc tggacctatg 540 gccccccgtg tgaccccact cctggccttc agcctgctgg ttctctggac cttcccagcc 600 ccaactctgg ggggtgctaa tgatgcggaa gactgctgcc tgtctgtgac ccagcgcccc 660 atccctggga acatcgtgaa agccttccgc taccttctta atgaagatgg ctgcagggtg 720 cctgctgttg tgttcaccac actaaggggc tatcagctct gtgcacctcc agaccagccc 780 tgggtggatc gcatcatccg aagactgaag aagtcttctg ccaagaacaa aggcaacagc 840 accagaagga gccctgtgtc ttga 864 <210> 10 <211> 783 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-humanCD20 scFv <400> 10 atggactgga cctggcggat cctgttcctg gtggctgctg ctacaggcgc ccacagccag 60 atcgtgctgt ctcagtctcc cgccatcctg tctgctagcc ctggcgagaa agtgaccatg 120 acctgcagag ccagcagcag cgtgtcctac atccactggt tccagcagaa gcccggcagc 180 agccccaagc cttggatcta cgccacaagc aacctggcct ctggcgtgcc agtgcggttt 240 agcggctctg gctctggcac cagctacagc ctgaccatca gcagagtgga agccgaggac 300 gccgccacct actactgtca gcagtggacc agcaaccccc ccacattcgg cggaggcacc 360 aagctggaaa tcaagggcgg aggcggatct ggcggcggag gatctggggg aggcggctct 420 caggtgcagc tgcagcagcc tggcgctgag ctcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaagatg 480 agctgcaagg ccagcggcta caccttcaca agctacaaca tgcactgggt caagcagacc 540 cctggcagag gcctggaatg gatcggcgct atctaccccg gcaacggcga cacctcctac 600 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag cacagcctac 660 atgcagctgt cctccctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagatctacc 720 tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggcgctg gcaccaccgt gaccgtgtct 780 gct 783 <210> 11 <211> 1788 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse SHP1DN <400> 11 atggtgaggt ggtttcaccg ggacctcagc gggcctgatg cagagaccct gctgaagggc 60 cggggagtcc ctgggagctt cctggctcgg cccagccgca agaaccaggg tgacttctcc 120 ctctcagtca gggtggatga tcaggtgact catattcgga tccagaactc aggggacttc 180 tatgacctgt acggagggga gaagtttgcg acgctgacag agctggtcga gtattacacg 240 cagcagcagg gcatcctgca ggaccgagat ggcaccatca tccaccttaa gtacccactg 300 aactgctcgg accccaccag tgagaggtgg taccacggcc acatatctgg agggcaggcg 360 gagtcactgc tgcaggccaa gggcgagccc tggacatttc ttgtgcgtga gagtctcagc 420 caacctggtg attttgtgct ctctgtgctc aatgaccagc ccaaggctgg cccaggttcc 480 ccgctcaggg tcactcatat caaggttatg tgtgagggtg gacgctatac tgtgggtggc 540 tcagagacgt ttgacagcct cacagacctg gtggagcact tcaagaagac agggattgag 600 gaggcctcgg gtgcctttgt ctacctgcgg cagccttact acgctactcg ggtaaacgca 660 gctgacattg agaatcgggt cttggaactg aacaagaagc aggagtcgga ggacacagcc 720 aaggctggct tctgggagga gtttgagagt ctacaaaagc aggaggtaaa gaatctacac 780 caacgtctgg aagggcagcg gccagagaac aagagcaaga accgctacaa gaacattctt 840 ccctttgacc acagccgagt gatcctgcag ggacgtgaca gtaacatccc aggctctgac 900 tacatcaatg ccaactacgt gaagaaccag ctgctaggtc cagatgagaa ctctaagacc 960 tacatcgcca gccagggctg tctggatgcc acagtcaatg acttctggca gatggcttgg 1020 caggagaaca ctcgtgtcat cgtcatgact accagagagg tggagaaagg ccggaacaaa 1080 tgtgtcccat actggcccga ggtgggcact cagcgtgtct atggtctcta ctctgtgacc 1140 aacagtaggg agcatgacac agcagaatac aaactgcgaa cattacagat ctccccacta 1200 gacaatgggg acctggttcg ggagatatgg cactaccagt acctgagctg gcctgaccat 1260 ggggttccca gtgagcctgg gggtgtcctc agctttctgg atcagatcaa ccagcgacag 1320 gaaagtttgc ctcatgcagg gcccatcatt gtgcattcca gcgctggcat cggccgcacg 1380 ggcaccatca tcgtcattga tatgcttatg gaaagcatct ccaccaaggg gctagactgt 1440 gacattgata tccagaagac catccagatg gtacgagcac agcgctccgg catggtgcag 1500 accgaggccc agtacaagtt tatttacgtg gccattgccc agttcatcga aacgaccaag 1560 aagaaactgg agatcataca atcccagaag ggccaggagt cggagtatgg gaatatcacg 1620 taccctcccg ctgtgaggag tgcccacgcc aaagcctcgc gtacttcctc caagcacaag 1680 gaggaggtgt acgaaaacgt gcatagcaag agcaagaagg aagagaaagt aaagaagcag 1740 cggtcggcag acaaggagaa gaacaaaggt tctctcaaga ggaagtga 1788 <210> 12 <211> 1782 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse SHP2DN <400> 12 atgacatcgc ggagatggtt tcaccccaac atcactggtg tggaggcaga gaatctcctg 60 ctgaccagag gagtcgatgg cagtttttta gcaaggccca gtaagagtaa ccctggagac 120 ttcactctgt ctgttagaag aaatggagct gttacccaca tcaagattca gaacactggg 180 gactactatg acctctatgg tggggagaag tttgccactt tggctgaact ggttcagtat 240 tacatggaac accatgggca gctgaaagag aagaatggag atgttatcga gctcaagtac 300 ccgctgaact gtgcagaccc tacctctgaa aggtggttcc atggtcactt gtctggaaaa 360 gaagcagaga agctgctgac ggagaagggc aagcatggca gcttcctcgt tcgagagagc 420 cagagccacc ccggagactt cgttctctcc gtgcgcactg gtgacgacaa aggggagagc 480 aacgacggca agtccaaagt gacccacgtc atgatccgct gtcaggagct gaaatacgac 540 gttggtgggg gagagcgctt tgactctctg acagacctgg tggagcatta caagaagaac 600 cccatggtgg agacgctggg cacagtcctg cagctcaagc agcccctcaa cacaactcgt 660 atcaatgctg ctgaaattga aagccgggtt cgagagttaa gcaagctggc tgagaccaca 720 gataaagtca agcagggctt ttgggaagag tttgagacgc tccagcaaca ggaatgcaaa 780 cttctctata gccgaaaaga aggacagaga caagaaaata aaaacaaaaa cagatacaaa 840 aacatcctgc cctttgatca taccagggtc gttctgcatg atggggatcc caatgagcct 900 gtttctgatt acattaatgc aaacatcatc atgcctgagt ttgagaccaa gtgcaacaat 960 tccaaaccca aaaagagtta cattgccact caaggctgcc tgcagaacac ggtgaatgac 1020 ttctggcgga tggtgttcca ggagaactct cgagtcattg tcatgaccac aaaggaagtg 1080 gagagaggga agagcaaatg tgtcaagtac tggcctgatg agtatgcgct caaagaatac 1140 ggggtcatgc gtgttaggaa cgtcaaagaa agtgccgccc atgactacac tttacgagag 1200 ctcaaactct ctaaggtcgg acaaggaaac acagagagaa ccgtctggca gtaccacttt 1260 cggacctggc cagaccatgg cgtgcctagt gaccctggag gtgtgctgga cttcctggag 1320 gaggtccacc acaagcagga gagcatcgtg gatgcaggcc ctgtcgtggt tcactccagc 1380 gctgggattg gccggacagg aaccttcatt gtgattgaca tccttattga catcattcga 1440 gagaaaggtg tggactgtga catcgacgtt cctaaaacca ttcagatggt gcggtcccag 1500 aggtcgggga tggtccagac agaagcacag taccggttta tctacatggc tgtccagcac 1560 tacatagaga cgctgcagcg ccggatcgag gaggagcaga aaagcaaaag aaaaggacat 1620 gaatatacca atattaagta ttccttggtg gaccagacaa gtggtgatca gagtcccctg 1680 ccaccctgca ccccaacgcc accctgtgca gaaatgaggg aggacagcgc ccgagtctat 1740 gagaacgtgg gcctcatgca gcagcagagg agtttcagat ga 1782

Claims (9)

  1. 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 핵산 및 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터로서,
    상기 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 인터루킨 7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산, SHP-1에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산, 또는 SHP-2에 대한 도미넌트 네거티브 변이체를 코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 인터루킨 7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
  3. 제 2항에 있어서,
    CAR을 코딩하는 핵산과 T 세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산이, 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 서열을 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    인터루킨 7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산이, 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 서열을 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR을 코딩하는 핵산이, FITC 또는 CD20을 인식하는 단일사슬 항체의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR을 코딩하는 핵산이, CD8의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    CAR을 코딩하는 핵산이, CD28의 세포 내 영역, 4-1BB의 세포 내 영역, 및 CD3ζ의 세포 내 영역의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 CAR 발현 벡터.
  8. 아래의 (a) 또는 (b)에 나타내는 벡터를 도입한 CAR 발현 T 세포.
    (a) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 CAR 발현 벡터
    (b) CAR을 코딩하는 핵산 및 인터루킨 7을 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터와, CAR을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하는 CAR 발현 벡터
  9. 제 8항에 따른 CAR 발현 T 세포와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 항암제.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019240523A1 (ko) * 2018-06-14 2019-12-19 주식회사 녹십자랩셀 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포
WO2021162521A1 (ko) * 2020-02-14 2021-08-19 (주)이뮤노텍바이오팜코리아 외부에서 도입된 세포 신호 조절 인자를 과발현하는 면역 세포 및 이들의 용도

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016056228A1 (ja) * 2014-10-09 2016-04-14 国立大学法人山口大学 Ｃａｒ発現ベクター及びｃａｒ発現ｔ細胞
GB201509413D0 (en) * 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
EP3416686A1 (en) 2016-02-16 2018-12-26 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Immunotherapy compositions and methods
CA3017442A1 (en) * 2016-03-17 2017-09-21 Yamaguchi University Immunocompetent cell and expression vector expressing regulatory factors of immune function
CA3048312A1 (en) * 2017-01-01 2018-07-05 Chi-Yu Gregory Lee Rp215 chimeric antigen receptor construct and methods of making and using same
EP3569709A4 (en) * 2017-01-10 2020-08-19 Yamaguchi University ANTI-GPC3 ANTIBODIES
CN110461881B (zh) * 2017-03-27 2023-06-23 诺伊尓免疫生物科技株式会社 嵌合抗原受体
CN108484777B (zh) * 2017-03-31 2022-07-12 李吉祐 人源化rp215单克隆抗体的嵌合抗原受体构建体及核酸分子与应用
WO2019073973A1 (ja) * 2017-10-10 2019-04-18 国立大学法人山口大学 メモリー機能を有するｔ細胞又はｂ細胞の増強剤、悪性腫瘍再発抑制剤、及びｔ細胞又はｂ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤
MX2020006666A (es) * 2017-12-24 2020-08-31 Noile Immune Biotech Inc Celula inmunocompetente que expresa una molecula de superficie celular que reconoce especificamente la mesotelina humana, il-7 y ccl19.
KR20200104360A (ko) * 2017-12-27 2020-09-03 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 핵산-함유 지질 나노-입자 및 그의 용도
CN108659133A (zh) * 2018-04-26 2018-10-16 上海怡豪生物科技有限公司 肺癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108641000A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 肝癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN108641001A (zh) * 2018-04-26 2018-10-12 上海怡豪生物科技有限公司 结肠癌的双靶点car-t治疗载体及其构建方法和应用
AU2019271819A1 (en) * 2018-05-15 2021-01-14 Crage Medical Co., Limited Genetically engineered cell and application thereof
CN108866004A (zh) * 2018-06-26 2018-11-23 奥妙生物技术（广州）有限公司 Shp-1敲除的t细胞及其构建方法
EP3825404A4 (en) * 2018-07-17 2022-04-13 Noile-Immune Biotech, Inc. CAR CONTAINING ANTI-GPC3 SINGLE STRAND ANTIBODY
CN109055430A (zh) * 2018-08-14 2018-12-21 杭州荣泽生物科技有限公司 一种共表达il18和ccl19蛋白及靶向muc1基因car-t细胞的制备方法
US20210309712A1 (en) * 2018-08-31 2021-10-07 Noile-Immune Biotech, Inc. Car-expressing t cells and car expression vector
KR20240046644A (ko) * 2018-09-05 2024-04-09 액트테라퓨틱스 주식회사 고형암을 위한 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t 세포
CN112771167A (zh) * 2018-09-20 2021-05-07 科济生物医药（上海）有限公司 表达有趋化因子的细胞及用途
CN113286874A (zh) * 2018-10-12 2021-08-20 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(CARs)组合物及使用方法
CN109504660B (zh) * 2018-11-02 2021-08-06 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
EP3883955A1 (en) * 2018-11-19 2021-09-29 Board of Regents, The University of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
CN113543792A (zh) * 2019-03-08 2021-10-22 奥托路斯有限公司 包含工程化嵌合抗原受体和car调节剂的组合物和方法
CN112080526A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 表达il-7和car的表达载体及免疫细胞
CN112080525A (zh) * 2019-06-14 2020-12-15 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种改良型嵌合抗原受体t细胞的制备
JP2021016371A (ja) * 2019-07-23 2021-02-15 株式会社東芝 Ｃａｒ−ｔ細胞の製造方法、核酸導入キャリア及びキット
AU2020373899A1 (en) 2019-10-28 2022-06-09 Noile-Immune Biotech Inc. Drug for treating cancer, combination drug, drug composition, immune responsive cell, nucleic acid delivery vehicle, and product
CN110922490B (zh) * 2019-12-05 2023-03-03 浙江启新生物技术有限公司 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用
CN113528483B (zh) * 2020-04-22 2024-08-16 复星凯特生物科技有限公司 Shp2特异性失活突变蛋白及其在car-t治疗中应用
GB202006820D0 (en) * 2020-05-07 2020-06-24 Autolus Ltd Cell
JPWO2021256522A1 (ko) 2020-06-17 2021-12-23
KR102297396B1 (ko) 2020-07-29 2021-09-06 (주)티카로스 면역시냅스를 안정화시키는 키메라 항원 수용체(car) t 세포
EP4261225A1 (en) 2020-12-10 2023-10-18 Eutilex Co., Ltd. Anti-pd-1 antibody and uses thereof
CN114717203B (zh) * 2020-12-22 2023-06-27 广东东阳光药业有限公司 一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途
KR20220099103A (ko) 2021-01-05 2022-07-12 (주)에임드바이오 항-fgfr3 항체 및 이의 용도
CN112961248B (zh) * 2021-02-22 2022-03-18 广州百暨基因科技有限公司 共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用
WO2022245098A1 (ko) 2021-05-18 2022-11-24 주식회사 바이오솔루션 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법
JP2024528029A (ja) 2021-07-29 2024-07-26 武田薬品工業株式会社 メソテリンを特異的に標的とする操作された免疫細胞及びその使用
CN113913385A (zh) * 2021-09-01 2022-01-11 苏州璞惠卓越生物科技有限公司 一种抑制蛋白阻断型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其用途
CN113921082B (zh) * 2021-10-27 2023-04-07 云舟生物科技(广州)股份有限公司 基因搜索权重调整方法、计算机存储介质及电子设备
EP4429676A2 (en) * 2021-11-08 2024-09-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cells expressing glucose transporter 5 (gluts) and compositions and methods including the same
WO2023223292A1 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of producing engineered immune cells
US12006353B2 (en) 2022-07-25 2024-06-11 Long Chen Application of SCFV protein, car gene expression vector, CAR-T cell and application thereof
CN115505601B (zh) * 2022-10-17 2024-05-28 深圳市先康达生命科学有限公司 一种两级SynNotch逻辑调控结构及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110268766A1 (en) * 2008-10-08 2011-11-03 Intrexon Corporation Engineered Cells Expressing Multiple Immunomodulators And Uses Thereof
US20140255363A1 (en) * 2011-09-16 2014-09-11 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5857318A (ja) * 1981-10-01 1983-04-05 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 癌細胞障害性リンパ球の製造法
WO2002077029A2 (en) 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
KR20050118057A (ko) * 2004-04-24 2005-12-15 김상희 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로함유하는 항암제 및 건강식품
TWI436775B (zh) * 2007-08-24 2014-05-11 Oncotherapy Science Inc 以抗原胜肽合併化療藥劑治療胰臟癌
SI3214091T1 (sl) 2010-12-09 2019-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Uporaba himernih antigen receptor-modificiranih T celic za zdravljenje raka
JP5897035B2 (ja) * 2010-12-14 2016-03-30 ユニバーシティ オブ メリーランド，ボルチモア 汎用の抗タグキメラ抗原受容体発現ｔ細胞及びがんを治療する方法
TR201815488T4 (tr) 2011-04-08 2018-11-21 Health Anti-epidermal büyüme faktör reseptörü varyant III kimerik antijen reseptörleri ve kanser tedavisi için kullanımı.
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
EP2765193B1 (en) 2011-10-07 2017-08-09 Mie University Chimeric antigen receptor
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
US9783591B2 (en) * 2012-02-22 2017-10-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of the CD2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
CN102625373A (zh) 2012-02-22 2012-08-01 中兴通讯股份有限公司 一种智能载波管理方法及装置
WO2016056228A1 (ja) * 2014-10-09 2016-04-14 国立大学法人山口大学 Ｃａｒ発現ベクター及びｃａｒ発現ｔ細胞

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110268766A1 (en) * 2008-10-08 2011-11-03 Intrexon Corporation Engineered Cells Expressing Multiple Immunomodulators And Uses Thereof
US20140255363A1 (en) * 2011-09-16 2014-09-11 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Immunol Immunother Vol. 63:185-193(Published online: 5 November 2013) *
Journal of Thoracic Oncology vol.2(8):S615 (2007. 08.) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019240523A1 (ko) * 2018-06-14 2019-12-19 주식회사 녹십자랩셀 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포
WO2021162521A1 (ko) * 2020-02-14 2021-08-19 (주)이뮤노텍바이오팜코리아 외부에서 도입된 세포 신호 조절 인자를 과발현하는 면역 세포 및 이들의 용도

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Publication number Publication date
DK3205720T3 (da) 2019-10-07
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SG11201702391RA (en) 2017-04-27
CA2962375C (en) 2020-07-14
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JP7527049B2 (ja) 2024-08-02
IL251504B (en) 2020-03-31
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KR101890638B1 (ko) 2018-08-22
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