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WO2019240523A1 - 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포 - Google Patents

신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포 Download PDF

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WO2019240523A1
WO2019240523A1 PCT/KR2019/007180 KR2019007180W WO2019240523A1 WO 2019240523 A1 WO2019240523 A1 WO 2019240523A1 KR 2019007180 W KR2019007180 W KR 2019007180W WO 2019240523 A1 WO2019240523 A1 WO 2019240523A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chimeric antigen
cells
antigen receptor
domain
cd16v
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/007180
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
권수현
이은솔
김한솔
최은지
정미영
임호용
원성용
조성유
황유경
Original Assignee
주식회사 녹십자랩셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 녹십자랩셀 filed Critical 주식회사 녹십자랩셀
Publication of WO2019240523A1 publication Critical patent/WO2019240523A1/ko

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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/22—Intracellular domain
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides, chimeric antigen receptors comprising the same and immune cells expressing the same.
  • NK cells Human natural killer cells
  • T cells Human natural killer cells
  • chimeric antigen receptors in T cells to increase the recognition and activation of specific antigens of tumor cells, resulting in dramatic therapeutic effects and approved as autoimmune cell therapy.
  • NK cells can be applied not only to autologous but also to taga, and as a CAR-NK cell therapy that can overcome side effects such as GVHD and CRS (Cytokine release syndrome) of CAR-T, which have been transduced, A lot of researches are being used.
  • CAR-NK cell therapy that can overcome side effects such as GVHD and CRS (Cytokine release syndrome) of CAR-T, which have been transduced, A lot of researches are being used.
  • various intracellular signaling domains constituting the chimeric antigen receptor such as CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), DAP10, DAP12, or ICOS, can be used.
  • Application of auxiliary stimulation domains is possible.
  • 4-1BB (CD137) is a member of the Tumor necrosis factor receptor (TNFR) family that is expressed in T cells, B cells, natural killer cells, and dendritic cells, and acts as a co-stimulatory molecule in T cells to activate activation induced cell death (AICD). It is known to play an important role in the activation of T cells by preventing and increasing the cytotoxicity and secretion of type 1 cytokines (IL-2, IFNg, TNFa). In addition, the introduction of 4-1BB (CD137) as a co-stimulatory factor in CAR-T therapy increased the survival of T cells, prolonged survival in the body, and suppressed exhaustion, thereby inducing CD28 as a co-stimulatory factor. In vivo efficacy has been reported.
  • TNFR Tumor necrosis factor receptor
  • 4-1BB acts as an activation signal such as increased proliferation and IFNg secretion by binding CD137 and CD137 ligand in mouse killer cells, whereas IFNg secretion and cytotoxicity are decreased in human killer cells. The role is not clearly known.
  • An object of the present invention is to provide a novel peptide.
  • An object of the present invention is to provide a chimeric antigen receptor for enhancing the anticancer immune cell treatment efficiency using immune cells.
  • nucleic acid molecule according to the above 3, wherein the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 to 10.
  • a chimeric antigen receptor comprising all or part of the peptide of the above 1 as an intracellular signaling domain.
  • chimeric antigen receptor Further comprising, chimeric antigen receptor.
  • transmembrane domain comprises all or part of CD8 ⁇ , chimeric antigen receptor.
  • NK cell natural killer cell
  • a pharmaceutical composition for treating tumors comprising the immune cells of 14 above.
  • nucleic acid molecule encodes at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, 29, 35, and 37 or a variant thereof having at least 80% sequence identity, Nucleic Acid Molecules.
  • nucleic acid molecule of above 17 wherein the nucleic acid molecule comprises one or more nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 34, and 36 or variants thereof having 80% or more sequence identity, Nucleic Acid Molecules.
  • the chimeric antigen receptor according to the present invention is excellent in natural killer cell activation efficiency.
  • the chimeric antigen receptor according to the invention can be used with various cancer target antibodies depending on the type of cancer targeted.
  • the chimeric antigen receptor according to the invention can be applied to a variety of carcinomas by applying various antigen recognition sites.
  • Natural killer cells expressing the chimeric antigen receptor according to the present invention have excellent cytotoxicity against cancer cells.
  • Natural killer cells expressing the chimeric antigen receptor according to the present invention can be usefully used for the treatment of immune cells.
  • FIG. 1A illustrates a CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB (231-235) Z CAR, CD16V-BB (237-239) Z CAR or CD16V-BB (231-235, 237-239) Z according to an embodiment of the invention.
  • the expression level of each CAR in NK92MI cells transduced with CAR is shown.
  • FIG. 1B shows a CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB (231-235) Z CAR, CD16V-BB (237-239) Z CAR or CD16V-BB (231-235, 237-239) Z according to an embodiment of the invention. Evaluation of natural killer cell killing ability in combination with antibody to Ramos cells of NK92MI cells transduced with CAR.
  • Figure 2A shows the expression level of each CAR in NK92MI cells transduced with CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB (F245C) Z CAR or CD16V-BB (231-235, F245C) Z CAR according to an embodiment of the present invention. Indicates.
  • FIG. 2B shows antibody combination against Ramos cells in NK92MI cells transduced with CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB (F245C) Z CAR or CD16V-BB (231-235, F245C) Z CAR according to an embodiment of the present invention Shows the natural killer cell killing ability of the city.
  • Figure 3A shows the expression level of each CAR in NK92MI cells transduced with NKG2D-BBZ CAR, NKG2D-BB (F245C) Z CAR or NKG2D-BB (231-235, F245C) Z CAR according to an embodiment of the present invention. Indicates.
  • 3B shows natural killing of MCF cells in NK92MI cells transduced with NKG2D-BBZ CAR, NKG2D-BB (F245C) Z CAR or NKG2D-BB (231-235, F245C) Z CAR according to an embodiment of the present invention.
  • Cell killer evaluation is shown.
  • the present invention relates to novel peptides.
  • Peptides of the invention in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 (a) the substitution of residues 231-235 with TTGAA; (b) substitution of the residues 237-239 for AAA; And (c) a variant amino acid sequence for SEQ ID NO: 39 comprising one or more variations selected from the group consisting of substitution of residue 245 with C.
  • This sequence is a variant of the amino acid sequence corresponding to the intracellular signaling domain (901-1026nt, GenBank NM 001561.5, 4-1BB) derived from CD137.
  • TRAF2 binds to human 4-1BB and transmits an activation signal
  • TRAF3 is known to have a negative impact.
  • the present inventors devised the present invention by discovering that when the specific sequence of the intracellular signaling domain of human 4-1BB is substituted, the anticancer activity of the immune cell into which the chimeric antigen receptor is introduced is significantly increased.
  • the peptides of the present invention have one or more of three mutations in the wild type 4-1BB intracellular signaling domain, and BB (231-235) is a PVQTT sequence which is a TRAF binding region of the TNFR family CD30 and CD40. Is substituted with TTGAA, BB (237-239) is substituted with AAA of EED237-239 among two acidic residues (EED237-239, EEE248-250), BB (F245C) is CRFP of human 4-1BB It is substituted by CRCP sequence.
  • the peptide of the present invention may be one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 5.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule encoding the peptide.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is not limited as long as it can encode the peptide, and for example, may include a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6-10.
  • the present invention also relates to a chimeric antigen receptor comprising the peptide.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may comprise the peptide as an intracellular signaling domain.
  • the chimeric antigen receptor comprises a transmembrane domain connected to the intracellular signaling domain; A spacer domain linked to the transmembrane domain; And an extracellular domain linked to the spacer domain.
  • the chimeric antigen receptor may further include a signal sequence connected to a terminal which is not connected to the spacer domain of the extracellular domain.
  • each of the above domains may be directly connected to each other or may be connected by a linker.
  • the signal sequence may be such that the extracellular domain can be located outside the cell membrane of immune cells (eg, natural killer cells) when the chimeric antigen receptor is expressed.
  • the signal sequence may include all or a part of CD16 or CD8 ⁇ .
  • the extracellular domain is a domain for binding specifically to the antibody or specifically recognize the antigen, for example Fc receptor (Fc receptor), single-chain variable fragment (single-chain variable fragment) , An antigen-binding fragment of an antibody such as ScFv), a natural cytotoxicity receptor, NKG2D, 2B4 or DNAM-1.
  • Fc receptor Fc receptor
  • single-chain variable fragment single-chain variable fragment
  • An antigen-binding fragment of an antibody such as ScFv
  • NKG2D, 2B4 or DNAM-1 a natural cytotoxicity receptor
  • the chimeric antigen receptor according to one embodiment of the present invention can be used with various antibodies depending on the cell type of the cancer to be treated by including the Fc receptor as an extracellular domain.
  • the Fc receptor may be any one selected from the group consisting of CD16, CD32, CD64, CD23 and CD89.
  • the Fc receptor may comprise all or part of the CD16 V158 variant (CD16V).
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may include as an extracellular domain an antigen binding fragment of an antibody that directly recognizes the antigen as an extracellular domain without co-administration with the antibody.
  • the antigen-binding fragment may be a Fab fragment, F (ab ') fragment, F (ab') 2 fragment or Fv fragment.
  • the antibody may be any one of various kinds of antibodies capable of antigen-specific binding.
  • an antibody may be one light chain and one heavy chain combined, and two light chains and two heavy chains combined.
  • the first unit in which the first light chain and the first heavy chain are combined, and the second unit in which the second light chain and the second heavy chain are combined may be combined with each other.
  • the bond may be, but is not limited to, a disulfide bond.
  • the two units may be the same as or different from each other.
  • the first unit including the first light chain and the first heavy chain and the second unit including the second light chain and the second heavy chain may be the same as or different from each other.
  • an antibody prepared such that the first unit and the second unit can recognize two different antigens is commonly referred to in the art as a bispecific antibody.
  • the antibody may be a combination of three or more of the above units.
  • the antigen-binding fragment of the present invention may be derived from various types of antibodies as described above, but is not limited thereto.
  • the extracellular domain used in the present invention may be a natural cytotoxicity receptor.
  • the natural killer receptors include, but are not limited to, NKp46, NKp30, NKp44, NKp80 and NKp65 receptors.
  • the transmembrane domain is located through the cell membrane, and any one can be located through the cell membrane without interfering with the function of the extracellular domain and the intracellular signaling domain. Any use is available.
  • the transmembrane domain may comprise all or part of CD8 ⁇ .
  • the extracellular domain and the transmembrane domain may be connected by a spacer domain.
  • the spacer domain can be a hinge domain.
  • the spacer domain may include all or part of the CD8 ⁇ .
  • the intracellular signaling domain is a part which is located inside the cell membrane of the natural killer cell, that is, cytoplasm, when the antibody bound to the extracellular domain of the present invention binds to the target antigen It may include a sequence capable of transmitting a signal for activating natural killer cells.
  • the chimeric antigen receptor may comprise one or more intracellular signaling domains.
  • the intracellular signaling domains may be connected in series with each other.
  • one end of the first intracellular signaling domain is connected to an end which is not connected to the spacer domain of the transmembrane domain, and the first intracellular signaling domain is connected.
  • One end of a second intracellular signaling domain is linked to a terminus that is not linked to the transmembrane domain of and a third to a terminus that is not linked to the first intracellular signaling domain of the second intracellular signaling domain.
  • One end of the intracellular signaling domain may be linked.
  • first, second and third intracellular signaling domains may be located in order in the cell membrane in the intracellular direction. Even if two, four or more intracellular signaling domains can be linked to one another in the same way. According to one embodiment of the invention, each of the above domains may be directly connected to each other or may be connected by a linker.
  • the chimeric antigen receptor may be one comprising two intracellular signaling domains.
  • it may include a first intracellular signaling domain connected to the transmembrane domain and a second intracellular signaling domain connected to a terminal not connected to the transmembrane domain of the first intracellular signaling domain.
  • the first intracellular signaling domain may include all or a part of any one selected from the group consisting of the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 5, the second intracellular signal
  • the delivery domain may be one that includes all or part of CD3-zeta.
  • the chimeric antigen receptor comprises one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, 29, 35 and 37 or variants thereof having 80% or more sequence identity. Can be.
  • the present invention further provides immune cells (eg, natural killer cells (NK cells)) expressing the chimeric antigen receptor according to the invention described above.
  • immune cells eg, natural killer cells (NK cells)
  • NK cells natural killer cells
  • the immune cells of the present invention may be toxic to tumor cells. Since the chimeric antigen receptor according to the present invention is determined which tumor cell is specifically toxic depending on which antibody the extracellular domain binds to, the immune cells expressing the chimeric antigen receptor according to the present invention are toxic. Tumor cells that can be expressed are not particularly limited. According to one embodiment, when the immune cells of the present invention (eg, natural killer cells) are used with rituximab, they may be toxic to malignant lymphoma cells.
  • the malignant lymphoma cells may be expressing CD20. Also for example, the malignant lymphoma may be B-cell lymphoma.
  • the present invention further provides that the number of immune cells (eg, natural killer cells) expressing chimeric antigen receptors according to the invention described above is comprised between two and 7.5 times the number of tumor cells (eg, malignant lymphoma cells) in the subject of treatment, It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a tumor or tumor metastasis.
  • immune cells eg, natural killer cells
  • tumor cells eg, malignant lymphoma cells
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises from 0.75 times the number of the immune cells (eg, natural killer cells) in one dose to the number of the tumor cells (eg, malignant lymphoma cells) in the treatment target. It may be included 10 times.
  • the number of immune cells (eg, natural killer cells) in a single dose may be comprised between 2 and 7.5 times the number of the tumor cells (eg, malignant lymphoma cells) in the treatment subject.
  • the present invention also provides a nucleic acid sequence encoding the chimeric antigen receptor according to the invention described above.
  • the nucleic acid sequence comprises at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 34 and 36 or variants thereof having at least 80% sequence identity. It may be.
  • the present invention also provides a vector comprising the nucleic acid sequence according to the present invention described above.
  • the present invention also provides a method for treating a tumor comprising administering the above-described immune cells to a subject.
  • the present invention also provides a method for preventing tumor metastasis, comprising administering the above-described immune cells to a subject.
  • the subject may be a mammal with a tumor, specifically, a human, but is not limited thereto.
  • Administration can be in an amount of 2 to 7.5 times the number of immune cells (eg, natural killer cells) expressing the chimeric antigen receptor according to the invention, of the number of tumor cells (eg, malignant lymphoma cells) in the treatment subject.
  • immune cells eg, natural killer cells
  • tumor cells eg, malignant lymphoma cells
  • the method of administration is not particularly limited and may be administered via conventional oral or parenteral routes.
  • the tumor is not particularly limited, and may be, for example, malignant lymphoma, leukemia, breast cancer, lung cancer, or the like, and more specifically, B-cell lymphoma.
  • Human B-family cell line Ramos, human erythroleukemic cell line K562, human breast cancer cell line MCF-7 and human natural killer cell line NK-92MI were supplied from ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Human embryonic kidney fibroblast 293T was used from KCTC.
  • K562 is maintained at RPMI-1640 with 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), and Ramos is RPMI-1640 with 10% FBS (fetal bovine serum; Gibco, Grand Island, NY, USA) (ATCC) (Manassas, VA).
  • MCF-7 was maintained in EMEM (ATCC) medium containing 10% FBS (Gibco).
  • NK92MI cells transduced with NK92MI were maintained in CellGro® (Cellgenix) serum-free medium containing 1% human plasma.
  • 293T cells were maintained in DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) containing 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA).
  • FCRG3A V158 variant CD16V
  • NKG2D extracellular domain Signal sequence of CD8 ⁇ , hinge and transmembrane domain of CD8 ⁇ ; Hinge and transmembrane domain, intracellular signaling domain of CD28;
  • Various mutants of 4-1BB and 4-1BB and intracellular signaling domains of CD3 ⁇ were artificially synthesized, respectively. They were assembled in various combinations using SOE-PCR (splicing by overlapping extension by PCR). PCR results were confirmed by direct sequencing.
  • PCR results were digested with Nhe1 and EcoRI and then inserted into the Nhe1 and EcoRI sites of the MSCV-EF1 ⁇ -GFP vector or EF1a-MCS vector, a third generation self-inactivating lentiviral expression vector. ligation).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CD16V-BBZ CAR (2nd generation) comprises the signal sequence domain of CD16 (34-84 nucleotides, GenBank Accession No. X52645); Extracellular domain of CD16V (FCRG3A V158) (85-651 nucleotides, G mutation of 559 nucleotides in GenBank Accession No.
  • X52645 Hinge and transmembrane domains derived from human CD8 ⁇ (1292-1507 nucleotides, GenBank NM 001768.6); Intracellular signaling domains derived from CD137 (901-1026 nucleotides, GenBank NM 001561.5); And a stop codon TGA linked to the intracellular signaling domain (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3) derived from CD3z. 84 nucleotides, GenBank Accession No. X52645); Extracellular domain of CD16V (FCRG3A V158) (85-651 nucleotides, G mutation of 559 nucleotides in GenBank Accession No.
  • X52645 Hinge and transmembrane domains derived from human CD8 ⁇ (1292-1507 nucleotides, GenBank NM 001768.6); Intracellular signaling domains derived from CD137 ( ⁇ F245C) (901-1026 nucleotides, mutations of 994-996 nucleotides in GenBank NM 001561.5, C mutations of amino acids 245); And the stop codon TGA and the intracellular signaling domain (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3) derived from CD3z.
  • the CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z CAR (2nd generation) contains the signal sequence domain (34-84 nucleotides, GenBank Accession No. X52645) of CD16; Extracellular domain of CD16V (FCRG3A V158) (85-651 nucleotides, G mutation of 559 nucleotides in GenBank Accession No.
  • CD16V-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) Z CAR (2nd generation) were found in the signal sequence domain of CD16 (34-84 nucleotides, GenBank Accession No. X52645); Extracellular domain of CD16V (FCRG3A V158) (85-651 nucleotides, G mutation of 559 nucleotides in GenBank Accession No.
  • X52645 Hinge and transmembrane domains derived from human CD8 ⁇ (1292-1507 nucleotides, GenBank NM 001768.6); Intracellular signaling domain from CD137 ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) (901-1026 nucleotide, 952-966, 994-996 nucleotides of GenBank NM 001561.5, TTGAA mutation of amino acids 231-235, 245 C mutation of amino acid 1); And the stop codon TGA and the intracellular signaling domain (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3) derived from CD3z.
  • the CD16V-BB ( ⁇ 237-239) Z CAR (2nd generation) contains the signal sequence domain (34-84 nucleotides, GenBank Accession No. X52645) of CD16; Extracellular domain of CD16V (FCRG3A V158) (85-651 nucleotides, G mutation of 559 nucleotides in GenBank Accession No.
  • CD16V-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ 237-239) Z CAR (2nd generation) are the signal sequence domains of CD16 (34-84 nucleotides, GenBank Accession No. X52645); Extracellular domain of CD16V (FCRG3A V158) (85-651 nucleotides, G mutation of 559 nucleotides in GenBank Accession No.
  • X52645 Hinge and transmembrane domains derived from human CD8 ⁇ (1292-1507 nucleotides, GenBank NM 001768.6); Intracellular signaling domain derived from CD137 ( ⁇ 231-235, ⁇ 237-239) (901-1026 nucleotide, 952-966, 970-978 nucleotides of GenBank NM 001561.5, TTGAA mutations of amino acids 231-235 , AAA mutation of amino acids 237-239); And the stop codon TGA and the intracellular signaling domain (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3) derived from CD3z.
  • NKG2D-BBZ CAR (2nd generation) comprises the signal sequence domain of CD8 ⁇ (890-952 nucleotides, GenBank NM 001768.6); Extracellular domain of NKG2D (788-1192 nucleotides, GenBank ID: AF461811.1); Hinge and transmembrane domains derived from human CD8 ⁇ (1292-1507 nucleotides, GenBank NM 001768.6); Intracellular signaling domains derived from CD137 (901-1026 nucleotides, GenBank NM 001561.5); And a stop codon TGA and an intracellular signaling domain derived from CD3 ⁇ (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3).
  • NKG2D-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) Z CAR (2nd generation) were found in the signal sequence domain (890-952 nucleotide, GenBank NM 001768.6) of CD8 ⁇ ; Extracellular domain of NKG2D (788-1192 nucleotides, GenBank ID: AF461811.1); Hinge and transmembrane domains derived from human CD8 ⁇ (1292-1507 nucleotides, GenBank NM 001768.6); Intracellular signaling domain from CD137 ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) (901-1026 nucleotide, 952-966, 994-996 nucleotides of GenBank NM 001561.5, TTGAA mutation of amino acids 231-235, 245 C mutation of amino acid 1); And the stop codon TGA and the intracellular signaling domain (299-634 nucleotides, GenBank NM000734.3) derived from CD3z.
  • Table 3 shows a sequence listing of chimeric antigen receptors (CARs) according to an embodiment of the present invention and the domains used for the preparation thereof.
  • CARs chimeric antigen receptors
  • CD16 amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 11 12 CD16 amino acid Amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 11 13 CD16V nucleotide Codon optimized sequence of the G mutation of 559 nucleotides in the signal sequence and extracellular domain of CD16V (85-651nt, GenBank Accession No.
  • CD16V amino acid Amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 13 15 CD8 ⁇ nucleotide Codon optimized sequence of hinge and transmembrane domain (1292-1507nt, GenBank NM 001768.6) derived from human CD8 ⁇ 16 CD8 ⁇ amino acid Amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 15 17 CD3z nucleotide Codon-Optimized Sequences of the Intracellular Signaling Domain from CD3z (299-634 nt, GenBank NM000734.3) 18 CD3z amino acid Amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 17 19 CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z nucleotide Codon Optimized Nucleotide Sequences of CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z CAR 20 CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z amino acid Amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 19 21 CD16V-BB ( ⁇ 237-239) Z nucleotide Codon Optimize
  • PCDH1-MSCV-CD16-construct-EF1-copGFP vectors were applied to 293T cells cultured in DMEM medium containing 10% FBS.
  • -copGFP control vector for mok infection virus production using empty vector
  • EF1a-NKG2D-construct vector or EF1a-GFP control vector for moq infection viral production using empty vector
  • HIV-based pPACKH1 lentiviral package kit (System Biosciences) were co-transfected using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
  • CD16V-4-1BB mutant construct expression vectors or control plasmids in a 75T flask with about 80% 293T cells concentrated; And pPACKH1 lentiviral packaging plasmids were transfected and replaced with DMEM medium containing 10% FBS and Sodium butyrate (Sigma Aldrich, USA) 6 hours later. 48 hours after transfection, the conditioned medium containing the lentiviral was removed and filtered using a 0.45 ⁇ m filter unit (Milliopore, Billerica, MA, USA) to remove cell debris. The supernatant containing lentiviral was concentrated about 50-fold by centrifugation at 3000 rpm for 40 minutes at 4 ° C using Amicon Filter (Millipore). The concentrated virus was stored at -80 ° C.
  • NK92MI cells in logarithmic phase are adjusted to 1 x 10 6 cells / ml using Cellgro (Cellgenix) containing 1% human plasma.
  • 50 MOI of lentiviral supernatant and 8 ⁇ g / ml polybrene were added to the cells and centrifuged at 1800 g for 90 minutes at 32 ° C. After centrifugation, the cells are placed in a humidified incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours. Cells are then washed twice with RPMI-1640 medium containing 10% FBS and placed in RPMI-1640 medium containing 10% FBS until used in the experiment. Control cells were transduced using the vector only.
  • Receptor expression detection including CD16V or NKG2D-4-1BB mutant construct
  • NK92MI cells transduced with each CD16V-4-1BB mutant chimeric antibody receptor, control vector-transduced NK92MI (NK92MI-mock), or NK-92MI blasts were washed twice with FACS buffer, followed by 7- Staining was performed using AAD (Beckman coulter), anti-CD3, anti-CD56 and anti-CD16 (BD Biosciences) mAbs. Expression ratio and mean fluorescence intensity (MFI) of the stained cells were measured using BD LSRFortessa.
  • NK92MI cells transduced with NKG2D-4-1BB mutant chimeric antibody receptor were washed twice with FACS buffer, followed by 7-AAD (Beckman coulter), anti-CD3, anti-CD56 and anti-NKG2D (R & D systems) mAbs. Were stained using. Expression ratio and mean fluorescence intensity (MFI) of the stained cells were measured using BD LSRFortessa.
  • NK92MI cells were first gated for singlets and then gated for 7AAD- and CD3-CD56 +. Transformation efficiency of the CD16V-4-1BB mutant construct and the control vector was determined by flow cytometry analysis of GFP and CD16 expressing cells among CD3-CD56 + cells. Transformation efficiency of the NKG2D-4-1BB mutant construct and the control vector was determined by flow cytometry analysis of NKG2D expressing cells among CD3-CD56 + cells.
  • Target cells were diluted in RPMI-1640 medium containing 10% FBS at 1 ⁇ 10 6 cells / mL and at 37 ° C. using 30 ⁇ M Calcein acetoxymethyl ester (Calcein-AM; Molecular probes). Labeled for 1 hour. After washing twice with RPMI-1640 medium containing 10% FBS, labeled target cells were placed in 96-well plates at 1 ⁇ 10 4 cells / well. Each CD16V-4-1BB mutant CAR-transduced NK92MI cell, control vector-transduced NK92MI (NK92MI-mock), or NK-92MI parental cells were harvested and washed and then subjected to various effector- (E / T) effects.
  • E / T effector-
  • the V158 variant of CD16 can have a good therapeutic effect in combination with antibodies and immune cells expressing CD16V as Fc receptors having high affinity with the Fc portion of the antibody.
  • TNF receptor-associated factor TNF receptor-associated factor
  • TNFR Tumor necrosis factor receptor
  • the amino acid sequence PVQTT 235 was replaced with TTGAA mouse 229-233 to prepare a CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z chimeric antigen receptor containing CD137 ( ⁇ 231-235) as an intracellular signaling domain.
  • CD137 ⁇ 237-239) is included as an intracellular signaling domain by replacing AED 237-239 amino acid sequence EED, which is a site where TRAF (TNF receptor-associated factor) 1, 2, and 3 binds to 4-1BB.
  • CD16V-BB ( ⁇ 237-239) Z chimeric antigen receptor was constructed, and CD16V-BB ( ⁇ 231-235, which replaced both amino acid sequences 231-235 and amino acids 237-239 in the 4-1BB intracellular domain ⁇ 237-239) Z chimeric antibody receptor was constructed.
  • chimeric antibody receptors CD16V-BBZ, CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z, CD16V-BB ( ⁇ 237-239) Z, CD16V-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ 237-239) Z
  • the lentiviral vector containing the MSCV promoter was expressed in NK92MI cells using 50 multiples of infection (MOI).
  • MOI multiples of infection
  • Expression of chimeric antibody receptors in transduced NK92MI cells was confirmed by detecting human CD16 using monoclonal mouse anti-human CD16 antibodies. As a result of flow cytometry, it was confirmed that the chimeric antibody receptors were transduced at an efficiency of 90% or more in NK92MI cells (FIG. 1A).
  • CD16V chimeric antibody receptors CD16V-BBZ, CD16V-BB
  • CD16V-BB CD16V-BB
  • CD16V-BB ⁇ 231-235, ⁇ 237-239)
  • Cytotoxicity against positive lymphoma cell cells was assessed through a Calcein-AM release assay.
  • FIG. 1B 10: 1, 5: 1, and 2.5: 1 represent ratios of the number of transfected NK92MI cells, which are effector cells, and the number of Ramos cells, which are target cells. Since NK92MI cells do not express CD16, the presence of anti-CD20 antibody rituximab does not increase the death of Ramos cells.
  • a control group (Mock) transfected with a GFP-expressing vector and NK92MI cells expressing a chimeric antibody receptor containing a 4-1BB or 4-1BB mutation are Ramos cells. Almost no cell killing ability was observed.
  • the previously produced 4-1BB is a chimeric antibody receptor (CD16V-BBZ) included as an intracellular signaling domain and a chimeric antibody receptor (CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z and CD16V-BB containing a 4-1BB mutation)
  • NK92MI cells expressing ( ⁇ 237-239) Z, CD16V-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ 237-239) Z are 10: 1, 5: 1, 2.5: 1 effector cells in the presence of rituximab. : Higher cell death in cells expressing CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z chimeric antibody receptor, including 4-1BB ( ⁇ 231-235) mutation, showing killing ability against Ramos cells at target cell ratio Ability revealed.
  • LCK one of the tyrosine kinases that plays an important role in signaling within immune cells, differing in sequence between humans and mice in the intracellular domain of 4-1BB (Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, p56lck) is located in the position of the CXCP motif to bind amino acid F 245 is replaced by C 4-1BB ( ⁇ F245C) CD16V-BB ( ⁇ containing the intracellular signaling domain ( ⁇ ) F245C) Z chimeric antigen receptor was constructed.
  • the CD16V-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) Z chimeric antibody receptor was prepared by adding the ⁇ F245C mutation to CD16V-BB ( ⁇ 231-235) Z, which had improved cell death ability.
  • CD16V-BBZ, CD16V-BB ( ⁇ F245C) Z, CD16V-BB ( ⁇ 231-235), and ⁇ F245C) Z chimeric antibody receptors were transformed into NK92MI cells via lentiviruses and at high levels. It was confirmed that the expression (Fig. 2A).
  • the NKG2D chimeric antibody receptor thus produced was expressed in NK92MI cells via lentivirus. Expression of chimeric antibody receptors in transduced NK92MI cells was confirmed by detecting human NKG2D using monoclonal mouse anti-human NKG2D antibodies. As a result of flow cytometry, it was confirmed that the chimeric antibody receptors were transfected with high efficiency over 90% in NK92MI cells (FIG. 3A).
  • NK92MI cells expressing chimeric antibody receptors have increased cancer cell killing capacity
  • NK92MI cells transfected with GFP-only vectors and NKG2D chimeric antibody receptors (NKG2D-BBZ, NKG2D-) containing 4-1BB or mutation Cytotoxicity against breast cancer cell line MCF-7 expressing NKG2D ligand of NK92MI expressing BB ( ⁇ 231-235) Z, NKG2D-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) Z) was analyzed through Calcein-AM release assay. Evaluated.
  • FIG. 3B The degree of lysis of cancer cells after co-culture with NK92MI cells transfected with NKG2D chimeric antibody receptor containing 4-1BB mutation and MCF-7 breast cancer cells stained with Calcein-AM was evaluated by measuring the amount of Calcein-AM released.
  • Fig. 3B 5: 1, 2.5: 1 and 1: 1 represent the ratio of the number of transfected NK92MI cells, which are effector cells, and the number of MCF-7 cells, which are target cells.
  • NKG2D-BBZ, NKG2D-BB ( ⁇ 231-235) Z, NKG2D-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) Z chimeric antibody receptors all showed cell killing ability against MCF-7 cells in a 2-hour in vitro cytotoxicity assay. Seemed.
  • the chimeric antibody receptor NKG2D-BB ( ⁇ 231-235) Z and NKG2D-BB ( ⁇ 231-235, ⁇ F245C) Z containing the 4-1BB ( ⁇ F245C) mutations were found to further increase cell death ability ( 3B).

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Abstract

본 발명은 신규한 펩티드 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것으로서, 신규한 펩티드의 전체 또는 일부를 포함하는 세포내 신호전달 도메인 (intracellular signaling domain)을 포함함으로써 면역세포의 항암 활성 증대 효과가 우수한 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR) 및 이를 발현하는 면역세포에 관한 것이다.

Description

신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포
본 발명은 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역세포에 관한 것이다.
인간 자연 살해 세포 (Natural killer cells, NK cells)는 선천성 면역을 담당하며 바이러스에 감염된 세포나 종양세포를 제거할 수 있어, 안전하고 효과적인 면역세포 치료제로써의 가능성을 가지고 있다. 최근에는 NK 세포가 T 세포에서 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor)를 발현시켜 종양세포가 가진 특정 항원의 인식을 높이고 활성화시켜 극적인 치료 효과를 보여 자가 면역세포치료제로써 승인 받았다.
T 세포와는 다르게 NK 세포는 자가뿐만 아니라 타가로도 적용 가능하며, 이를 유전자 형질 도입된 CAR-T가 가진 GVHD나 CRS (Cytokine release syndrome)와 같은 부작용을 극복할 수 있는 CAR-NK 세포치료제로 활용하는 연구들도 많이 진행 되고 있다.
이러한 키메라 항원 수용체가 도입된 면역세포의 효능을 향상시키기 위해, 키메라 항원 수용체를 구성하는 세포내 신호전달 도메인으로서 CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), DAP10, DAP12 또는 ICOS 등의 다양한 보조 자극 도메인들의 적용이 가능하다.
4-1BB(CD137)는 TNFR (Tumor necrosis factor receptor) family 중 하나로 T 세포와 B 세포, 자연살해세포, 수지상 세포 등에서 발현되며 T 세포에서 co-stimulatory molecule로 작용하여 activation induced cell death (AICD)를 방지하고 세포독성 및 type 1 싸이토카인 (IL-2, IFNg, TNFa)의 분비를 증가시킴으로써 T 세포의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 더불어 CAR-T therapy에 보조자극 인자로 4-1BB (CD137)를 도입했을 때 T 세포의 survival이 증가하여 체내 생존기간이 오래 지속되고 exhaustion이 억제되어 CD28이 보조자극 인자로 도입된 CAR-T에 비해 in vivo efficacy가 증대된다는 보고가 있다.
하지만 4-1BB는 마우스 자연살해 세포에서는 CD137과 CD137 ligand의 결합에 의해 proliferation과 IFNg의 분비가 증가하는 등 활성화 신호로 작용하는 반면, 인간 자연살해 세포에서는 IFNg 분비 및 cytotoxicity가 감소한다는 보고가 있어 그 역할이 명확하게 알려져 있지 않다.
본 발명은 신규한 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 면역세포를 이용한 항암 면역세포 치료 효율을 증대시키기 위한 키메라 항원 수용체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 서열번호 39의 아미노산 서열에서, (a) 231-235번 잔기의 TTGAA로의 치환; (b) 237-239번 잔기의 AAA로의 치환; 및 (c) 245번 잔기의 C로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 서열번호 39에 대한 변이 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
2. 위 1에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
3. 위 1 또는 2의 펩티드를 코딩하는 핵산분자.
4. 위 3에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 6 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
5. 위 1의 펩티드의 전체 또는 일부를 세포내 신호전달 도메인 (intracellular signaling domain)으로 포함하는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor).
6. 위 5에 있어서, 상기 펩티드의 전체 또는 일부를 제1 세포내 신호전달 도메인으로 포함하고, CD3-zeta의 전체 또는 일부를 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하며, 상기 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 세포막에서 세포내 방향으로 순서대로 위치하는, 키메라 항원 수용체.
7. 위 5에 있어서,
상기 세포내 신호전달 도메인에 연결된 막관통 도메인 (transmembrane domain);
상기 막관통 도메인에 연결된 스페이서 도메인 (spacer domain); 및
상기 스페이서 도메인에 연결된 세포외 도메인 (extracellular domain)
을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
8. 위 7에 있어서, 상기 세포외 도메인에 연결된 신호 서열 (signal sequence)을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
9. 위 8에 있어서, 상기 신호 서열은 CD16 또는 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
10. 위 7에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
11. 위 7에 있어서, 상기 스페이서 도메인은 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
12. 위 7에 있어서, 상기 세포외 도메인은 CD16V 또는 NKG2D의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
13. 위 5 내지 12 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포.
14. 위 13에 있어서, 상기 면역세포는 자연 살해 세포 (NK cell)인, 면역세포.
15. 위 14의 면역세포를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물.
16. 위 5 내지 12 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자.
17. 위 16에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 35 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 코딩하는, 핵산 분자.
18. 위 17에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 34 및 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 핵산 분자.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 자연 살해 세포 활성화 효율이 우수하다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 표적이 되는 암 종류에 따라 다양한 암 표적 항체들과 같이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 다양한 항원 인식부위를 적용함으로써 다양한 암종에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 자연 살해 세포는 암 세포에 대한 세포독성이 우수하다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 자연 살해 세포는 면역세포 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1A는 본 발명의 실시예에 따른 CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB(231-235)Z CAR, CD16V-BB(237-239)Z CAR 또는 CD16V-BB(231-235, 237-239)Z CAR로 형질도입된 NK92MI 세포에서의 각각의 CAR의 발현량을 나타낸다.
도 1B는 본 발명의 실시예에 따른 CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB(231-235)Z CAR, CD16V-BB(237-239)Z CAR 또는 CD16V-BB(231-235, 237-239)Z CAR로 형질도입된 NK92MI 세포의 Ramos 세포에 대한 항체병용시의 자연살해세포 살해능 평가를 나타낸다.
도 2A는 본 발명의 실시예에 따른 CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB(F245C)Z CAR 또는 CD16V-BB(231-235, F245C)Z CAR로 형질도입된 NK92MI 세포에서의 각각의 CAR의 발현량을 나타낸다.
도 2B는 본 발명의 실시예에 따른 CD16V-BBZ CAR, CD16V-BB(F245C)Z CAR 또는 CD16V-BB(231-235, F245C)Z CAR로 형질도입된 NK92MI 세포에서의 Ramos 세포에 대한 항체병용시의 자연살해세포 살해능 평가를 나타낸다.
도 3A는 본 발명의 실시예에 따른 NKG2D-BBZ CAR, NKG2D-BB(F245C)Z CAR 또는 NKG2D-BB(231-235, F245C)Z CAR로 형질도입된 NK92MI 세포에서의 각각의 CAR의 발현량을 나타낸다.
도 3B는 본 발명의 실시예에 따른 NKG2D-BBZ CAR, NKG2D-BB(F245C)Z CAR 또는 NKG2D-BB(231-235, F245C)Z CAR로 형질도입된 NK92MI 세포에서의 MCF 세포에 대한 자연살해세포 살해능 평가를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 신규한 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드는 서열번호 39의 아미노산 서열에서, (a) 231-235번 잔기의 TTGAA로의 치환; (b) 237-239번 잔기의 AAA로의 치환; 및 (c) 245번 잔기의 C로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 서열번호 39에 대한 변이 아미노산 서열을 포함한다.
상기 서열은 CD137 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026nt, GenBank NM 001561.5, 4-1BB)에 대응하는 아미노산 서열의 변이체이다.
4-1BB는 내재적 kinase activity가 없기 때문에 associated molecule인 TNF receptor-associated factor (TRAF) 1-3과 상호작용에 의해 신호전달이 유도된다. TRAF2가 인간 4-1BB에 binding하여 활성화 신호를 전달하는 반면 TRAF3은 negative impact를 준다고 알려져 있다.
본 발명자들은 인간 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인의 특정 서열을 치환하는 경우, 이를 포함한 키메라 항원 수용체가 도입된 면역 세포의 항암 활성이 현저히 증대되는 것을 발견한 것에 착안하여 본 발명을 고안하였다.
구체적으로, 본 발명의 펩티드들은 wild type 4-1BB 세포내 신호전달 도메인에서 3개의 돌연변이 중 1개 이상을 갖는 것으로, BB(231-235)는 TNFR family인 CD30, CD40의 TRAF binding region인 PVQTT 서열을 TTGAA로 치환한 것, BB(237-239)는 2개의 acidic residue 중 (EED237-239, EEE248-250) EED237-239를 AAA로 치환한 것, BB(F245C)는 human 4-1BB의 CRFP를 CRCP 서열로 치환한 것이다.
구체적인 예시를 들자면, 본 발명의 펩티드는 서열번호 1 내지 5 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.
본 발명의 핵산분자는 상기 펩티드를 코딩할 수 있는 것이라면 그 서열은 제한되지 않으며, 구체적인 예를 들자면 서열번호 6 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)에 관한 것이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 상기 펩티드를 세포내 신호전달 도메인 (intracellular signaling domain)으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 키메라 항원 수용체는 상기 세포내 신호전달 도메인에 연결된 막관통 도메인 (transmembrane domain); 상기 막관통 도메인에 연결된 스페이서 도메인 (spacer domain); 및 상기 스페이서 도메인에 연결된 세포외 도메인 (extracellular domain)을 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 키메라 항원 수용체는 상기 세포외 도메인의 상기 스페이서 도메인과 연결되지 않은 말단에 연결된 신호 서열 (signal sequence)을 더 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 위의 각각의 도메인들은 서로 직접 연결될 수도 있고 링커에 의해 연결될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신호 서열은 키메라 항원 수용체가 발현될 때 세포외 도메인이 면역세포 (예컨대, 자연 살해 세포)의 세포막 바깥에 위치할 수 있도록 하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 신호 서열은 CD16 또는 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포외 도메인은 항체와 특이적인 결합을 하거나 항원을 특이적으로 인식하기 위한 도메인이며, 예컨대 Fc 수용체 (Fc receptor), 단일사슬항체절편 (single-chain variable fragment, ScFv)과 같은 항체의 항원결합 단편, 자연살해 수용체 (Natural cytotoxicity receptor), NKG2D, 2B4 또는 DNAM-1일 수 있다. 따라서, 본 발명의 용어 "세포외 도메인 (extracellular domain)"은 "항원 인식 부위", "항원 결합 단편" 또는 "항체 결합 부위"와 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키메라 항원 수용체는, 세포외 도메인으로서 Fc 수용체를 포함함으로써, 치료하고자 하는 암의 세포 종류에 따라 다양한 항체와 사용할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 Fc 수용체는 CD16, CD32, CD64, CD23 및 CD89로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 Fc 수용체는 CD16 V158 변이체 (CD16V)의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항체와의 병용투여 없이 세포외 도메인으로서 직접 항원을 인식하는 항체의 항원결합 단편을 세포외 도메인으로서 포함할 수도 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 항원결합 단편은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체는 항원 특이적으로 결합할 수 있는 다양한 종류의 항체 중 어느 하나일 수 있다. 예컨대, 항체는 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄가 결합된 것일 수 있으며, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄가 결합된 것일 수 있다. 예컨대, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄가 결합된 경우, 제1경쇄 및 제1중쇄가 결합된 제1단위체와 제2경쇄 및 제2중쇄가 결합된 제2단위체가 서로 결합된 것일 수 있다. 여기서 결합은 이황화결합 (disulfide bond)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에 따르면, 2개의 단위체는 서로 동일한 것일 수도 있고 서로 다른 것일 수도 있다. 예컨대, 제1경쇄 및 제1중쇄를 포함하는 제1단위체와 제2경쇄 및 제2중쇄를 포함하는 제2단위체는 서로 동일할 수도 있고 서로 다를 수도 있다. 이와 같이 제1단위체와 제2단위체가 서로 다른 두 개의 항원을 인식할 수 있도록 제조된 항체는 당업계에서 통상 이중항체 (bispecific antibody)로 명명된다. 또한 예컨대, 항체는 위의 단위체가 3개 이상 결합된 것일 수 있다. 본 발명의 항원결합 단편은 위에 기술한 바와 같은 다양한 형태의 항체로부터 유래한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 세포외 도메인은 자연살해 수용체 (Natural cytotoxicity receptor)일 수 있다. 구체적인 구현예에 따르면, 상기 자연살해 수용체는 NKp46, NKp30, NKp44, NKp80 및 NKp65 수용체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 막관통 도메인은 세포막을 관통하여 위치하는 것이며, 상기 세포외 도메인 및 상기 세포내 신호전달 도메인의 기능을 방해하지 않고 세포막을 관통하여 위치할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 사용 가능하다. 예컨대 상기 막관통 도메인은 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포외 도메인과 상기 막관통 도메인은 스페이서 도메인으로 연결될 수 있다. 예컨대, 스페이서 도메인은 힌지 도메인일 수 있다. 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 스페이서 도메인은 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 자연 살해 세포의 세포막 안쪽, 즉 세포질에 위치하게 되는 부분으로서, 본 발명의 세포외 도메인에 결합된 항체가 타겟 항원에 결합하였을 때, 자연 살해 세포를 활성화 시키는 신호를 전달할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 키메라 항원 수용체는 1개 또는 그 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 2개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 경우에는 세포내 신호전달 도메인들이 서로 직렬로 연결될 수 있다. 예컨대, 3개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 경우에는 상기 막관통 도메인의 상기 스페이서 도메인과 연결되지 않은 말단에 제1 세포내 신호전달 도메인의 한 말단이 연결되고, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인의 상기 막관통 도메인에 연결되지 않은 말단에 제2 세포내 신호전달 도메인의 한 말단이 연결되고, 상기 제 2 세포내 신호전달 도메인의 상기 제 1 세포내 신호전달 도메인에 연결되지 않은 말단에 제 3 세포내 신호전달 도메인의 한 말단이 연결된 것일 수 있다. 즉, 상기 제1, 제2 및 제3 세포내 신호전달 도메인은 세포막에서 세포내 방향으로 순서대로 위치한 것일 수 있다. 세포내 신호전달 도메인이 2개, 4개 또는 그 이상인 경우에도 위와 같은 방법으로 서로 연결될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 위의 각각의 도메인들은 서로 직접 연결될 수도 있고 링커에 의해 연결될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 키메라 항원 수용체는 2개의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 막관통 도메인에 연결된 제1 세포내 신호전달 도메인 및 상기 제1 세포내 신호전달 도메인의 상기 막관통 도메인과 연결되지 않은 말단에 연결된 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 제1 세포내 신호전달 도메인은 전술한 서열번호 1 내지 5의 펩티드로 군에서 선택되는 어느 하나의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 CD3-zeta의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 따르면, 키메라 항원 수용체는 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 35 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 앞서 기술한 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포 (예컨대, 자연 살해 세포 (NK cell))를 제공한다.
본 발명의 면역세포는 종양세포에 대해 독성을 나타내는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인이 어떤 항체와 결합하는지에 따라서 어떤 종양세포에 대해 특이적으로 독성을 나타내는지가 정해지는 것이므로, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포가 독성을 나타낼 수 있는 종양 세포는 특별히 한정되어 있지 않다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 면역세포 (예컨대, 자연 살해 세포)가 리툭시맙(rituximab)과 함께 사용되는 경우에는, 악성 림프종 (lymphoma) 세포에 대해 독성을 나타낼 수 있다. 예컨대, 상기 악성 림프종 세포는 CD20를 발현하는 것일 수 있다. 또한 예컨대, 상기 악성 림프종은 B세포 림프종 (B-cell lymphoma)일 수 있다.
또한 본 발명은 위에 기술한 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포 (예컨대, 자연 살해 세포)의 수가 치료 대상 내의 종양 세포 (예컨대, 악성 림프종 세포) 수의 2배 내지 7.5배로 포함된, 종양 또는 종양 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물은 1회 투여량 내에 상기 면역세포 (예컨대, 자연 살해 세포)의 수가 치료 대상 내의 상기 종양세포 (예컨대, 악성 림프종 세포) 수의 0.75배 내지 10배로 포함된 것일 수 있다. 예컨대, 1회 투여량 내에 상기 면역세포 (예컨대, 자연 살해 세포)의 수가 치료 대상 내의 상기 종양세포 (예컨대, 악성 림프종 세포) 수의 2배 내지 7.5배로 포함된 것일 수 있다.
또한 본 발명은 위에 기술한 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 핵산 서열은 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 34 및 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 위에 기술한 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 위에 기술한 면역세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양의 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 위에 기술한 면역세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양 전이의 예방방법을 제공한다.
대상체는 종양을 가진 포유류일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
투여는 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포 (예컨대, 자연 살해 세포)의 수가 치료 대상 내의 종양 세포 (예컨대, 악성 림프종 세포) 수의 2배 내지 7.5배의 양으로 될 수 있다.
투여 방법은 특별히 제한되지 않고 통상의 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다.
종양은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 악성 림프종, 백혈병, 유방암, 폐암 등일 수 있고, 보다 구체적으로는 B세포 림프종 (B-cell lymphoma)일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 방법 및 시약
세포주
인간 B-계열 세포주 Ramos, 인간 적백혈 (erythroleukemic) 세포주 K562, 인간 유방암 세포주 MCF-7 및 인간 자연살해 세포주 NK-92MI는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 공급받아 사용하였다. 인간 배아 신장 섬유아세포 293T는 KCTC로부터 공급받아 사용하였다.
K562는 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 유지되며, Ramos는 10% FBS (fetal bovine serum; Gibco, Grand Island, NY, USA)를 포함하는 RPMI-1640 (ATCC) (Manassas, VA)에서 유지(maintain)되었다. MCF-7는 10% FBS (Gibco)를 포함하는 EMEM (ATCC) 배지에서 유지 되었다. NK92MI 와 형질도입된 NK92MI 세포는 1% 인간 혈장을 포함하는 CellGro®(Cellgenix) 무혈청 배지에서 유지되었다. 293T 세포는 10% FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA)를 포함하는 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 유지되었다.
플라스미드
FCRG3A V158 변이 (CD16V)의 신호 서열 (signal sequence) 및 세포외 도메인 (extracellular domain); NKG2D 세포외 도메인 (extracellular domain); CD8α의 신호 서열, CD8α의 힌지 (hinge) 및 막관통 도메인 (transmembrane domain); CD28의 힌지 (hinge) 및 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인; 4-1BB와 4-1BB의 다양한 mutants 및 CD3ζ (CD3z)의 세포내 신호전달 도메인 (intracellular signaling domain)은 각각 인공적으로 합성되었다. 이들은 SOE-PCR (splicing by overlapping extension by PCR)을 이용하여 다양한 조합으로 조립 (assemble)되었다. PCR 결과물은 직접 서열분석 (direct sequencing)으로 확인되었다. PCR 결과물은 Nhe1 및 EcoRI으로 절단된 후 3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 발현 벡터 (third generation self-inactivating lentiviral expression vector)인 MSCV-EF1α-GFP 벡터 또는 EF1a-MCS 벡터의 Nhe1 및 EcoRI 사이트에 삽입 (ligation) 되었다.
본 발명의 실시예에 따른 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR)를 표 1에 정리하였다. 본 발명의 실시예에 따른 모든 CAR의 도메인들은 서로 직렬로 (in tandem) 연결된 것이며, 또한 in frame으로 연결된 것이다.
CAR 종류 (세대) 약칭 신호 서열 세포외도메인 힌지 막관통 도메인 신호-1 신호-2 신호-3
2nd CD16V-BBZ CD16 CD16V CD8α CD8α 4-1BB CD3ζ -
2nd CD16V-BB(△F245C)Z CD16 CD16V CD8α CD8α 4-1BB(△F245C) CD3ζ -
2nd CD16V-BB(△231-235)Z CD16 CD16V CD8α CD8α 4-1BB(△231-235) CD3ζ -
2nd CD16V-BB(△231-235, △F245C)Z CD16 CD16V CD8α CD8α 4-1BB(△231-235, △F245C) CD3ζ -
2nd CD16V-BB(△237-239)Z CD16 CD16V CD8α CD8α 4-1BB(△237-239) CD3ζ -
2nd CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z CD16 CD16V CD8α CD8α 4-1BB(△231-235, △237-239) CD3ζ -
CD16V-BBZ CAR (2세대)는 CD16의 신호서열 도메인 (34-84 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645); CD16V (FCRG3A V158)의 세포외 도메인 (85-651 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645 중 559번 뉴클레오타이드의 G 돌연변이); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.CD16V-BB(△F245C)Z CAR (2세대)는 CD16의 신호서열 도메인 (34-84 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645); CD16V (FCRG3A V158)의 세포외 도메인 (85-651 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645 중 559번 뉴클레오타이드의 G 돌연변이); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 (△F245C) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5 중 994-996번 뉴클레오타이드의 돌연변이, 245번 아미노산의 C 돌연변이); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.
CD16V-BB(△231-235)Z CAR (2세대)는 CD16의 신호서열 도메인 (34-84 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645); CD16V (FCRG3A V158)의 세포외 도메인 (85-651 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645 중 559번 뉴클레오타이드의 G 돌연변이); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 (△231-235) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5 중 952-966번 뉴클레오타이드의 돌연변이, 231-235번 아미노산의 TTGAA 돌연변이); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.
CD16V-BB(△231-235, △F245C)Z CAR (2세대)는 CD16의 신호서열 도메인 (34-84 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645); CD16V (FCRG3A V158)의 세포외 도메인 (85-651 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645 중 559번 뉴클레오타이드의 G 돌연변이); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 (△231-235, △F245C) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5 중 952-966번, 994-996번 뉴클레오타이드의 돌연변이, 231-235번 아미노산의 TTGAA 돌연변이, 245번 아미노산의 C 돌연변이); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.
CD16V-BB(△237-239)Z CAR (2세대)는 CD16의 신호서열 도메인 (34-84 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645); CD16V (FCRG3A V158)의 세포외 도메인 (85-651 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645 중 559번 뉴클레오타이드의 G 돌연변이); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 (△237-239) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5 중 970-978번 뉴클레오타이드의 돌연변이, 237-239번 아미노산의 AAA 돌연변이); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.
CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z CAR (2세대)는 CD16의 신호서열 도메인 (34-84 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645); CD16V (FCRG3A V158)의 세포외 도메인 (85-651 뉴클레오타이드, GenBank Accession No. X52645 중 559번 뉴클레오타이드의 G 돌연변이); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 (△231-235, △237-239) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5 중 952-966번, 970-978번 뉴클레오타이드의 돌연변이, 231-235번 아미노산의 TTGAA 돌연변이, 237-239번 아미노산의 AAA 돌연변이); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.
CAR 종류 (세대) 약칭 신호 서열 세포외도메인 힌지 막관통 도메인 신호-1 신호-2 신호-3
2nd NKG2D-BBZ CD8α NKG2D CD8α CD8α 4-1BB CD3ζ -
2nd NKG2D-BB(△F245C)Z CD8α NKG2D CD8α CD8α 4-1BB(△F245C) CD3ζ -
2nd NKG2D-BB(△231-235, △F245C)Z CD8α NKG2D CD8α CD8α 4-1BB(△231-235, △F245C) CD3ζ -
NKG2D-BBZ CAR (2세대)는 CD8α의 신호서열 도메인 (890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); NKG2D의 세포외 도메인 (788-1192 뉴클레오타이드, GenBank ID: AF461811.1); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5); 및 CD3ζ 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.NKG2D-BB(△F245C)Z CAR (2세대)는 CD8α의 신호서열 도메인 (890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); NKG2D의 세포외 도메인 (788-1192 뉴클레오타이드, GenBank ID: AF461811.1); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 (△F245C) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5 중 994-996번 뉴클레오타이드의 돌연변이, 245번 아미노산의 C 돌연변이); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다
NKG2D-BB(△231-235, △F245C)Z CAR (2세대)는 CD8α의 신호서열 도메인 (890-952 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); NKG2D의 세포외 도메인 (788-1192 뉴클레오타이드, GenBank ID: AF461811.1); 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507 뉴클레오타이드, GenBank NM 001768.6); CD137 (△231-235, △F245C) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026 뉴클레오타이드, GenBank NM 001561.5 중 952-966번, 994-996번 뉴클레오타이드의 돌연변이, 231-235번 아미노산의 TTGAA 돌연변이, 245번 아미노산의 C 돌연변이); 및 CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 뉴클레오타이드, GenBank NM000734.3)과 stop codon TGA가 연결된 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR) 및 그의 제조에 사용된 도메인들의 서열목록을 표 3에 정리하였다.
서열번호 서열이름 서열에 대한 설명
1 4-1BB (△231-235 mutant) amino acid 4-1BB (CD137) 유래의 세포내 신호전달 도메인(GenBank NM 001561.5)의 △231-235 mutant 아미노산 서열
2 4-1BB (△237-239 mutant) amino acid 4-1BB (CD137) 유래의 세포내 신호전달 도메인(GenBank NM 001561.5)의 △237-239 mutant 아미노산 서열
3 4-1BB (△231-235, △237-239 mutant) amino acid 4-1BB (CD137) 유래의 세포내 신호전달 도메인(GenBank NM 001561.5)의 △231-235, △237-239 mutant 아미노산 서열
4 4-1BB (△F245C_mutant) amino acid 4-1BB (CD137) 유래의 세포내 신호전달 도메인(GenBank NM 001561.5)의 △F245C mutant 아미노산 서열
5 4-1BB (△231-235, △F245C mutant) amino acid 4-1BB (CD137) 유래의 세포내 신호전달 도메인(GenBank NM 001561.5)의 △231-235, △F245C mutant 아미노산 서열
6 4-1BB (△231-235 mutant) nucleotide 서열번호 1에 대응하는 뉴클레오타이드 서열
7 4-1BB (△237-239 mutant) nucleotide 서열번호 2에 대응하는 뉴클레오타이드 서열
8 4-1BB (△231-235, △237-239 mutant) nucleotide 서열번호 3에 대응하는 뉴클레오타이드 서열
9 4-1BB (△F245C_mutant) nucleotide 서열번호 4에 대응하는 뉴클레오타이드 서열
10 4-1BB (231-235, △F245C mutant) nucleotide 서열번호 5에 대응하는 뉴클레오타이드 서열
11 CD16 nucleotide CD16의 신호서열 및 세포외 도메인 (34-84 nt, GenBank Accession No. X52645)
12 CD16 amino acid 서열번호11에 대응하는 아미노산 서열
13 CD16V nucleotide CD16V의 신호서열 및 세포외 도메인(85-651nt, GenBank Accession No. X52645) 중 559번 뉴클레오타이드의 G 돌연변이의 코돈 최적화된 서열
14 CD16V amino acid 서열번호 13에 대응하는 아미노산 서열
15 CD8α nucleotide 인간 CD8α 유래의 힌지 및 막관통 도메인 (1292-1507nt, GenBank NM 001768.6)의 코돈 최적화된 서열
16 CD8α amino acid 서열번호 15에 대응하는 아미노산 서열
17 CD3z nucleotide CD3z 유래의 세포내 신호전달 도메인 (299-634 nt, GenBank NM000734.3)의 코돈 최적화된 서열
18 CD3z amino acid 서열번호 17에 대응하는 아미노산 서열
19 CD16V-BB(△231-235)Z nucleotide CD16V-BB(△231-235)Z CAR의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
20 CD16V-BB(△231-235)Z amino acid 서열번호 19에 대응하는 아미노산 서열
21 CD16V-BB(△237-239)Z nucleotide CD16V-BB(△237-239)Z의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
22 CD16V-BB(△237-239)Z amino acid 서열번호 21에 대응하는 아미노산 서열
23 CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z nucleotide CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
24 CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z amino acid 서열번호 23에 대응하는 아미노산 서열
25 CD16V-BB(△F245C)Z nucleotide CD16V-BB(△F245C)Z의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
26 CD16V-BB(△F245C)Z amino acid 서열번호 25에 대응하는 아미노산 서열
27 CD16V-BB(△231-235, △F245C)Z nucleotide CD16V-BB(△231-235, △F245C)Z의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
28 CD16V-BB(△231-235, △F245C)Z amino acid 서열번호 27에 대응하는 아미노산 서열
29 CD8α nucleotide 인간 CD8α 유래의 신호 서열 (1-63nt, GenBank NM 001768.6)
30 CD8α amino acid 서열번호 29에 대응하는 아미노산 서열
31 NKG2D nucleotide 인간 NKG2D 유래의 세포외 도메인 (788-1192nt, GenBank ID: AF461811.1)
32 NKG2D amino acid 서열번호 31에 대응하는 아미노산 서열
33 NKG2D-BB(△F245C)Z nucleotide NKG2D-BB(△F245C)Z의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
34 NKG2D-BB(△F245C)Z amino acid 서열번호 33에 대응하는 아미노산 서열
35 NKG2D-BB(231-235, △F245C)Z nucleotide NKG2D-BB(231-235, △F245C)Z의 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
36 NKG2D-BB(231-235, △F245C)Z amino acid 서열번호 35에 대응하는 아미노산 서열
37 4-1BB (CD137) nucleotide 4-1BB (CD137) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026nt, GenBank NM 001561.5)의 코돈 최적화된 서열
38 4-1BB (CD137) amino acid 서열번호 37에 대응하는 아미노산 서열
39 4-1BB (CD137) nucleotide 4-1BB (CD137) 유래의 세포내 신호전달 도메인 (901-1026nt, GenBank NM 001561.5)의 자연서열
바이러스 생산 및 유전자 전달
VSVG-유사형(pseudotyped) 렌티바이러스를 제조하기 위하여, 10% FBS가 들어있는 DMEM 배지에서 배양된 293T 세포에 다양한 타입의 PCDH1-MSCV-CD16-construct-EF1-copGFP 벡터, 또는 PCDH1-MSCV-EF1-copGFP 대조군 벡터 (공벡터를 이용한 모크 감염바이러스 제작용)와 EF1a-NKG2D-construct 벡터 또는 EF1a-GFP 대조군 벡터 (공벡터를 이용한 모크 감염바이러스 제작용); 및 HIV-기반 pPACKH1 렌티바이러스 패키지 킷 (System Biosciences)이 리포펙타민 2000 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 공-형질감염 되었다. 75T 플라스크에 80% 정도 293T 세포가 밀집한 상태에서 다양한 타입의 CD16V-4-1BB 돌연변이 컨스트럭트 발현벡터들 또는 대조군 플라스미드; 및 pPACKH1 렌티바이러스 패키징 플라스미드들을 형질감염 시키고 6시간 후 10% FBS와 Sodium butyrate (Sigma Aldrich, USA) 가 포함된 DMEM 배지로 교체되었다. 형질 감염 후 48 시간 뒤에 렌티바이러스가 들어있는 conditioned medium 을 걷어 세포 조각 (cell debris) 들을 제거하기 위해 0.45 μm 필터 유닛 (Milliopore, Billerica, MA, USA) 을 사용하여 필터링 하였다. 렌티바이러스를 포함하는 상층액 (viral supernatant) 은 Amicon Filter (Millipore) 를 사용하여 4℃에서 3000 rpm 으로 40 분간 원심분리 함으로써 약 50배 농축되었다. 농축된 바이러스는 -80℃에서 보관되었다.
렌티바이러스 감염을 위해 대수증식기에 있는 NK92MI 세포는 1% 인간 혈장을 포함하는 Cellgro (Cellgenix) 를 사용하여 1 x 10 6 cells/ml 로 맞춘다. 세포에 렌티바이러스 상층액 50 MOI와 8 μg/ml 폴리브렌 (polybrene) 을 넣고 32℃에서 1800 g에서 90 분간 원심분리한다. 원심분리가 끝나면 세포들을 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건의 가습 인큐베이터에 넣어 둔다. 그 후에 세포들을 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지로 두 차례 세척하고 실험에 사용되기 전까지 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지에 둔다. 대조군 세포들은 벡터만을 사용하여 형질 도입되었다.
CD16V 또는 NKG2D-4-1BB 돌연변이 컨스트럭트를 포함하는 수용체 발현 검출
각각의 CD16V-4-1BB 돌연변이 키메라 항체 수용체가 형질도입된 NK92MI 세포, 대조군 벡터-형질도입된 NK92MI (NK92MI-mock), 또는 NK-92MI 모세포는 FACS 완충액을 사용하여 두 차례 세척한 후, 7-AAD (Beckman coulter), 항-CD3, 항-CD56 및 항-CD16 (BD Biosciences) mAbs를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포들의 발현비율 및 평균 형광강도(mean fluorescence intensity, MFI)는 BD LSRFortessa를 사용하여 측정되었다.
NKG2D-4-1BB 돌연변이 키메라 항체 수용체가 형질도입된 NK92MI 세포는 FACS 완충액을 사용하여 두 차례 세척 후, 7-AAD (Beckman coulter), 항-CD3, 항-CD56 및 항-NKG2D (R&D systems) mAbs를 사용하여 염색하였다. 염색된 세포들의 발현비율 및 평균 형광강도(mean fluorescence intensity, MFI)는 BD LSRFortessa를 사용하여 측정되었다.
NK92MI 세포들은 우선 싱글렛 (singlet)에 대하여 게이트 (gate) 되었고, 그 후에 7AAD- 및 CD3-CD56+에 대하여 게이트 되었다. CD16V-4-1BB 돌연변이 컨스트럭트와 대조군 벡터의 형질전환 효율은 CD3-CD56+ 세포들 중 GFP 및 CD16을 발현하는 세포들을 유세포 분석하여 측정되었다. NKG2D-4-1BB 돌연변이 컨스트럭트와 대조군 벡터의 형질전환 효율은 CD3-CD56+ 세포들 중 NKG2D를 발현하는 세포들을 유세포 분석함으로써 측정되었다.
칼세인 방출 세포독성 에세이
타겟 세포들은 1 x 10 6 cell/mL로 10% FBS가 들어있는 RPMI-1640 배지에 희석하고 30 μM 칼세인아세톡시메틸에스터 (Calcein acetoxymethyl ester, Calcein-AM; Molecular probes)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 표지 (label) 되었다. 10% FBS가 들어있는 RPMI-1640 배지로 두 차례 세척 후, 표지된 타겟 세포들은 96-well 플레이트에 1 x 10 4 cells/well 로 넣었다. 각각의 CD16V-4-1BB 돌연변이 CAR-형질도입된 NK92MI 세포, 대조군 벡터-형질도입된 NK92MI (NK92MI-mock), 또는 NK-92MI 모세포는 수확 (harvest)되어 세척 된 후 다양한 E/T (effector-to-target) 비율로 넣고 리툭시맙 (rituximab)을 포함하거나 포함하지 않는 조건으로 첨가되었다. 대조군으로서는 리툭시맙과 무관한 항-인간 항체 (Sigma aldrich)가 사용되었다. 2시간 후에, 플레이트들을 4℃에서 2000rpm으로 3분간 원심분리 되었으며, 100 μL의 상층액을 수집하여 형광 마이크로 플레이트 리더 (Victor3, PerkinElmer)로 여기파장 485nm 및 발광파장 535nm에서 칼세인 방출을 측정하였다. 구체적인 칼세인 방출량은 다음의 식으로 계산되었다: percent specific lysis = (test release - spontaneous release) x 100/ (maximal release - spontaneous release). Spontaneous release는 칼세인이 염색된 타겟세포만 들어있는 상층액을 사용하였고 maximal lysis에는 1% Triton X-100을 넣어 사용하였다.
2. 결과
(1) 다양한 4-1BB 돌연변이를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 NK92MI 세포의 CD20-양성 림포마 세포에 대한 세포독성 평가
- 다양한 4-1BB 돌연변이가 공동자극모티브로 CD16V와 연결된 키메라 항원 수용체의 형질 도입 및 발현
CD16의 V158 변이체는 항체의 Fc 부분과 높은 친화도를 갖는 Fc 수용체로 CD16V를 발현하는 면역세포와 항체 병용으로 좋은 치료 효과를 낼 수 있다. 이러한 CD16V와 CD8α 힌지 및 막관통 도메인, 공동자극분자인 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인 및 T세포 자극 분자인 CD3z를 결합시켰다.
우리는 인간과 마우스 4-1BB의 세포내 도메인 중 서열이 다르며, CD30, 40과 같은 TNFR (Tumor necrosis factor receptor)에서 TRAF (TNF receptor-associated factor) 1, 2, 3이 결합하는 부위인 231-235번 아미노산 서열 PVQTT을 마우스 229-233번 TTGAA로 대체하여 CD137 (△231-235)가 세포내 신호전달 도메인으로 포함된 CD16V-BB(△231-235)Z 키메라 항원 수용체를 제작하였다. 또한 4-1BB에서 TRAF (TNF receptor-associated factor) 1, 2, 3이 결합하는 부위인 237-239번 아미노산 서열 EED를 AAA로 대체하여 CD137 (△237-239)가 세포내 신호전달 도메인으로 포함된 CD16V-BB(△237-239)Z 키메라 항원 수용체를 제작하였고, 4-1BB 세포내 도메인에 231-235번 아미노산 서열과 237-239번 아미노산 서열 모두 대체된 CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z 키메라 항체 수용체를 제작하였다.
이렇게 제작된 키메라 항체 수용체들 (CD16V-BBZ, CD16V-BB(△231-235)Z, CD16V-BB(△237-239)Z, CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z)은 MSCV 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 50 감염배수 (MOI, Multiple of infection)를 사용하여 NK92MI 세포에 발현 되었다. 형질 도입된 NK92MI 세포에서 키메라 항체 수용체들의 발현은 단클론 마우스 항-인간 CD16 항체를 사용하여 인간 CD16을 검출함으로써 확인 되었다. 유세포 분석을 이용한 결과 NK92MI 세포에서 키메라 항체 수용체들은 90% 이상의 효율로 형질 도입됨을 확인 하였다(도 1A).
4-1BB 돌연변이들이 포함된 CD16V 키메라 항체 수용체를 발현하는 NK92MI 세포의 리툭시맙항체 병용에 따른 CD20-양성 림포마 세포에 대한 세포 사멸 능력 평가
키메라 항체 수용체가 발현하는 NK92MI 세포가 암세포 사멸 능력이 증가하는지를 확인하기 위해, GFP만 발현하는 벡터가 형질 도입된 NK92MI 세포와 4-1BB 돌연변이들이 포함된 CD16V 키메라 항체 수용체 (CD16V-BBZ, CD16V-BB(△231-235)Z, CD16V-BB(△237-239)Z, CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z)를 발현하는 NK92MI 세포의 리툭시맙 항체 병용에 따른 CD20-양성 림포마 세포 세포 (Ramos 세포)에 대한 세포독성을 Calcein-AM 방출 에세이를 통해 평가 하였다.
형질도입된 NK92MI 세포와 Calcein-AM으로 염색된 CD20-양성 림포마 세포주 Ramos 및 항체를 공배양 후 암세포의 용해(lysis) 정도를 Calcein-AM 방출양을 측정하여 평가였다(도 1B). 도 1B에서 10:1, 5:1 및 2.5:1은 작용세포 (effector cell)인 형질 도입된 NK92MI 세포 수와 타겟세포 (target cell)인 Ramos 세포 수의 비를 나타낸다. NK92MI 세포에서는 CD16을 발현하지 않기 때문에 항-CD20 항체인 리툭시맙이 존재하더라도 Ramos 세포의 사멸이 증가하지 않는 것으로 알려져 있다.
도 1B에 나타낸 바와 같이 리툭시맙이 존재하지 않을 때는 GFP 를 발현하는 벡터가 형질 도입된 대조군 (Mock)과 4-1BB 또는 4-1BB 돌연변이가 포함된 키메라 항체 수용체를 발현하는 NK92MI 세포들은 Ramos 세포에 대한 세포 살해능이 거의 나타나지 않았다. 기존에 제작했던 4-1BB가 세포내 신호전달 도메인으로 포함되는 키메라 항체 수용체 (CD16V-BBZ)와 4-1BB 돌연변이가 포함된 키메라 항체 수용체 (CD16V-BB(△231-235)Z, CD16V-BB(△237-239)Z, CD16V-BB(△231-235, △237-239)Z)가 발현하는 NK92MI 세포는 리툭시맙의 존재 하에서는 10:1, 5:1, 2.5:1의 작용세포: 타겟세포 비율에서 Ramos 세포에 대해 살해능을 보였으며 그중 4-1BB(△231-235) 돌연변이를 포함하는 CD16V-BB(△231-235)Z 키메라 항체 수용체를 발현하는 세포에서 더 높은 세포 사멸 능력이 나타냈다.
- 4-1BB(△F245C) 돌연변이를 포함하는 CD16V 키메라 항체 수용체의 효능 평가
4-1BB 돌연변이를 포함하는 키메라 수용체의 세포독성을 증가시키기 위해, 4-1BB의 세포내 도메인 중 인간과 마우스 사이 서열에 차이를 보이며 면역세포 내 신호전달에 중요한 역할을 하는 tyrosine kinase 중 하나인 LCK (Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, p56lck)가 결합하는 CXCP 모티프가 위치하는 자리로 245번 아미노산 F를 C로 대체하여 4-1BB(△F245C)가 세포내 신호전달 도메인으로 포함된 CD16V-BB(△F245C)Z 키메라 항원 수용체를 제작하였다. 또한 세포 사멸 능력이 향상 되었던 CD16V-BB(△231-235)Z에 △F245C 돌연변이를 추가하여 CD16V-BB(△231-235, △F245C)Z 키메라 항체 수용체를 제작하였다.
세포독성을 비교하기 위해 CD16V-BBZ, CD16V-BB(△F245C)Z, CD16V-BB(△231-235), △F245C)Z 키메라 항체 수용체를 NK92MI 세포에 렌티바이러스를 통해 형질전환 시켰으며 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다 (도2A).
도2B에서 나타낸 바와 같이 리툭시맙이 존재하지 않을 때에는 Ramos 세포에 대해 낮은 세포 살해능을 보이지만 리툭시맙이 존재할 때는 CD16V-BBZ, CD16V-BB(△F245C)Z, CD16V-BB(△231-235), △F245C)Z 키메라 항체 수용체 모두 Ramos 세포에 대한 세포 살해능을 보였고 4-1BB (△F245C) 돌연변이가 포함된 키메라 항체 수용체 모두 높은 세포 살해능을 보였다.
(2) 4-1BB (△F245C)를 포함하는 NKG2D 키메라 항체 수용체를 발현하는 NK92MI 세포의 인간 유방암 세포에 대한 세포독성 평가
- 4-1BB(△F245C) 돌연변이가 공동자극모티브로 NKG2D와 연결된 키메라 항원 수용체의 형질 도입 및 발현
인간 NKG2D 세포외 도메인과 CD8α 힌지 및 막관통 도메인, 공동자극분자인 4-1BB 세포내 신호전달 도메인 및 T세포 자극 분자인 CD3z를 결합시켰다.
우리는 NKG2D 키메라 항체 수용체의 세포독성을 증가시키기 위해, 공동자극모티브인 4-1BB의 245번 아미노산 F를 C로 대체한 4-1BB 돌연변이(△F245C)를 세포내 신호전달 도메인으로 포함하는 NKG2D-BB(△F245C)Z 키메라 항원 수용체를 제작하였다. 그리고 CD16V 키메라 항체수용체에서 세포 사멸 능력이 향상 되었던 4-1BB 31-235번 아미노산 서열 PVQTT을 마우스 229-233번 TTGAA로 대체한 돌연변이와 245번 아미노산 F를 C로 대체된 4-1BB 돌연변이(△231-235, △F245C)가 포함된 NKG2D-BB(△231-235, △F245C)Z 키메라 항체 수용체를 제작하였다(표2).
이렇게 제작된 NKG2D 키메라 항체 수용체는 렌티바이러스를 통해 NK92MI 세포에 발현 되었다. 형질 도입된 NK92MI 세포에서 키메라 항체 수용체들의 발현은 단클론 마우스 항-인간 NKG2D 항체를 사용하여 인간 NKG2D를 검출함으로써 확인 되었다. 유세포 분석을 이용한 결과 NK92MI 세포에서 키메라 항체 수용체들은 90% 이상 높은 효율로 형질 도입 됨을 확인 하였다(도 3A).
- 4-1BB(△F245C) 돌연변이를 포함하는 NKG2D 키메라 항체 수용체의 세포사멸 증가 효과
키메라 항체 수용체가 발현하는 NK92MI 세포가 암세포 사멸 능력이 증가하는지를 확인하기 위해, GFP만 발현하는 벡터가 형질 도입된 NK92MI 세포와 4-1BB 또는 돌연변이가 포함된 NKG2D 키메라 항체 수용체 (NKG2D-BBZ, NKG2D-BB(△231-235)Z, NKG2D-BB(△231-235, △F245C)Z)를 발현하는 NK92MI의 NKG2D 리간드를 발현하는 유방암 세포주 MCF-7 에 대한 세포독성을 Calcein-AM 방출 에세이를 통해 평가 하였다.
4-1BB 돌연변이를 포함하는 NKG2D 키메라 항체 수용체가 형질도입된 NK92MI 세포와 Calcein-AM으로 염색된 MCF-7 유방암 세포와 공배양 후 암세포의 용해(lysis) 정도를 Calcein-AM 방출양을 측정하여 평가였다(도 3B). 도 3B에서 5:1, 2.5:1 및 1:1은 작용세포 (effector cell)인 형질 도입된 NK92MI 세포 수와 타겟세포 (target cell)인 MCF-7 세포 수의 비를 나타낸다. 2시간 인비트로 세포 독성 분석에서 NKG2D-BBZ, NKG2D-BB(△231-235)Z, NKG2D-BB(△231-235, △F245C)Z 키메라 항체 수용체 모두 MCF-7 세포에 대한 세포 살해능을 보였다. 특히 4-1BB (△F245C) 돌연변이가 포함된 키메라 항체 수용체 NKG2D-BB(△231-235)Z, NKG2D-BB(△231-235, △F245C)Z 에서 세포 사멸능력이 더 증가됨을 확인하였다 (도 3B).

Claims (18)

  1. 서열번호 39의 아미노산 서열에서, (a) 231-235번 잔기의 TTGAA로의 치환; (b) 237-239번 잔기의 AAA로의 치환; 및 (c) 245번 잔기의 C로의 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 서열번호 39에 대한 변이 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 청구항 1 또는 2의 펩티드를 코딩하는 핵산분자.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 6 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  5. 청구항 1의 펩티드의 전체 또는 일부를 세포내 신호전달 도메인 (intracellular signaling domain)으로 포함하는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor).
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 펩티드의 전체 또는 일부를 제1 세포내 신호전달 도메인으로 포함하고, CD3-zeta의 전체 또는 일부를 포함하는 제2 세포내 신호전달 도메인을 더 포함하며, 상기 제1 및 제2 세포내 신호전달 도메인은 세포막에서 세포내 방향으로 순서대로 위치하는, 키메라 항원 수용체.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 세포내 신호전달 도메인에 연결된 막관통 도메인 (transmembrane domain);
    상기 막관통 도메인에 연결된 스페이서 도메인 (spacer domain); 및
    상기 스페이서 도메인에 연결된 세포외 도메인 (extracellular domain)
    을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 세포외 도메인에 연결된 신호 서열 (signal sequence)을 더 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 신호 서열은 CD16 또는 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 스페이서 도메인은 CD8α의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 세포외 도메인은 CD16V 또는 NKG2D의 전체 또는 일부를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체.
  13. 청구항 5 내지 12 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 면역세포는 자연 살해 세포 (NK cell)인, 면역세포.
  15. 청구항 14의 면역세포를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물.
  16. 청구항 5 내지 12 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 21, 23, 25, 27, 29, 35 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 코딩하는, 핵산 분자.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 20, 22, 24, 26, 28, 34 및 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열 또는 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 핵산 분자.
PCT/KR2019/007180 2018-06-14 2019-06-14 신규 펩티드, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 면역 세포 WO2019240523A1 (ko)

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