CN112080525A

CN112080525A - 一种改良型嵌合抗原受体t细胞的制备

Info

Publication number: CN112080525A
Application number: CN201910517950.4A
Authority: CN
Inventors: 王恩秀; 张海; 汪晨
Original assignee: Nanjing Aide Institute Of Immunotherapy Co ltd
Current assignee: Nanjing Aide Institute Of Immunotherapy Co ltd
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2020-12-15

Abstract

本发明的课题在于，涉及一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备。其特征在于，提供在T细胞中既表达嵌合抗原受体(CAR)并且还表达IL‑15，所述CAR‑T细胞一方面既可以发挥CAR对肿瘤的特异靶向作用，并对肿瘤进行杀伤；另一方面，导入细胞的IL 15因子同样可促进CAR‑T细胞在体内外的存活，将有效的提高肿瘤免疫治疗中CAR‑T在体内的长期存活。

Description

一种改良型嵌合抗原受体T细胞的制备

技术领域

本发明涉及肿瘤疫治疗技术领域，具体涉及一种改良嵌合抗原受体T细胞的制备。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，利用配体结合结构域特性，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。

近年来，进行了各种CAR-T细胞的研究。例如，提出了：含有经修饰的自体人T细胞的医药组合物，所述自体人T细胞含有编码由CD19抗原结合区、跨细胞膜区、4-1BB共同刺激信号区、和CD3ζ信号区组成的CAR的核酸(公开号：US20130309258A1)；在各种CAR-T技术中，出现了多链CAR技术，例如含有编码DAP12、T2A、mesothelin抗原结合区和截短的或未截短的TREM1或TREM2核酸组成的CAR(公开号：CN108752482A)。

然而，迄今为止的技术中，下述问题尚未解决：CAR-T细胞在生物体内的存活效率较低，或者由CAR-T细胞诱导的内源性T细胞的活化、向肿瘤局部的蓄积不充分的问题；CAR-T细胞的活性被经由PD-L1/PD-1途径(其为癌细胞具有的肿瘤免疫逃逸机制)的免疫抑制信号及癌症微环境中分泌的TGF-β、IL-10等免疫抑制因子抑制的问题。因此，存在无法呈现充分的治疗效果的癌症种类、病例，需要制备更有效的CAR-T细胞、及用于制备所述CAR-T细胞的表达载体。

虽然研究中发现以Dap12为基础的多链CAR技术在实体瘤方面表现出了非常出色的抗肿瘤活性，但是寻找一些能促进CAR-T细胞存活的免疫功能调控因子，对进一步提升Dap12为基础的多链CAR技术在实体肿瘤免疫治疗中的作用具有重要的意义。

白细胞介素-15(IL-15)是与白细胞介素-2(IL-2)结构相似的细胞因子。像IL-2一样，IL-15与IL-2/IL-15受体β链(CD122)和普通γ链(γ-C，CD132)组成的复合物结合并进行信号传导。在被病毒感染后，单核吞噬细胞(和一些其他细胞)分泌IL-15。该细胞因子诱导天然杀伤细胞的细胞增殖，其主要作用是杀死病毒感染细胞的先天免疫系统细胞，此外，IL-15调节T淋巴细胞的活化和增殖，在不存在抗原的情况下维持记忆T细胞的生存信号由IL-15提供。在啮齿类淋巴细胞中，IL-15通过诱导凋亡途径抑制剂BCL2L1/BCL-x(L)来阻止细胞凋亡；在人类免疫系统中，IL-15通过诱导Bcl-2和/或Bcl-xL类似地抑制T-淋巴细胞的凋亡。

因此，考虑到回输的CAR-T细胞在生物体内的存活效率低，或者由于回输的CAR-T无法在体内长期存活，需要开发解决上述问题的技术。

发明内容

发明要解决的问题

在用于现有免疫疗法的CAR-T细胞中，未充分地增强内源性免疫活性细胞的免疫诱导效果、VAR-T的增殖能力、存活能力。因此，本发明在于提供在CAR-T细胞中表达IL-15且兼具增殖能力、存活能力，以及提供用于制备所述CAR-T细胞的IL-15表达载体。

解决问题的手段

本申请的发明人以在利用CAR-T细胞的癌症免疫疗法中实现更优异的免疫诱导效果和抗肿瘤活性为目的，尝试CAR-T细胞改良。在这一过程之中，着眼于调控CAR-T细胞免疫功能的细胞因子，构建了表达调控CAR-T细胞免疫功能的因子的载体。将所述表达载体导入T细胞中时，发现可由此制备具有比现有CAR-T细胞更优异的免疫诱导效果、增殖能力以及存活能力，从而完成了本发明。

即，本发明以下(1)～(6)所公开。

(1)CAR表达载体，其含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其特征在于，所述编码所述免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素15的核酸。

(2)如上述(1)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码免疫功能促进因子的核酸为编码白细胞介素15的核酸。

(3)如上述(2)所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸与编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸由编码自切割肽(self-cleavage)的序列连接。

(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码下述单链抗体的多肽的核酸，所述单链抗体识别mesothelin。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码DAP12、T2A、mesothelin抗原结合区和截短的或未截短的TREM1或TREM2多肽的核酸。

(6)如上述5所述的CAR表达载体，其截短的TREM1氨基酸序列，命名为TREM1_cut，本发明所述的TREM1_cut为TREM1全长氨基酸序列C端40～90个氨基酸的多肽。

(7)CAR表达T细胞，其中导入了以下(a)或(b)所示的载体：

(a)上述(1)～(5)中任一项所述的CAR表达载体；

(b)含有编码CAR的核酸CAR表达载体、和含有编码CAR的核酸及编码IL-15的核酸的CAR表达载体；

发明的效果

若使用本发明表达IL-15的CAR-T细胞(7CAR-T)，能够兼具增殖能力、存活能力、肿瘤细胞损伤活性的CAR-T细胞、对于癌症微环境中的免疫抑制具有抵抗性的CAR-T细胞。通过利用上述CAR-T细胞实施针对癌症患者的免疫疗法，从而能够获得可期待强效的癌症治疗效果。

附图说明

图1是含有IL-15和CAR的慢病毒载体结构图。

图2是表达pro-CAR和15CAR的T细胞阳性率图。

图3是T细胞感染慢病毒后的增殖图。

图4是MSLN刺激下CAR-T细胞IFN-γ的分泌水平。

图5是MSLN刺激下CAR-T细胞IL-2的分泌水平。

图6是CAR-T细胞IL-15的分泌水平。

图7是CAR-T细胞对靶细胞的杀伤。

图8是表达IL-15的CAR-T细胞的存活率结果图。

图9是表达IL-15的CAR-T细胞的细胞数目结果图。

具体实施方式

作为将下文所述的本发明的表达载体导入T细胞中而制备的方法，没有特别限定，可列举通过病毒感染法、磷酸钙法、脂质体转染法、显微注射法、电穿孔法等已知方法导入的方法，可优选举出通过病毒感染法导入的方法。

本发明的载体中含有编码CAR分子的核酸、编码IL-15的核酸的表达载体中，任意核酸可配置于任意的上游或下游。具体地，相对于编码CAR分子的核酸而言，编码IL-15的核酸可配置于上游或配置于下游。编码CAR分子的核酸和编码IL-15的核酸可介由编码2A肽或IRES的序列连接。

所谓2A肽，是指来自病毒的自剪切型肽，其具有如下特征：在如序列号7所示的氨基酸序列中的G-P之间(自C末端起1个残基的位置)由内质网切断(Szymczak等，ExpertOpin.Biol.Ther.5(5)：627-638(2005))。因此，介由2A肽而并入其前后的核酸在细胞内相互独立地表达。

实施例1、含有CAR基因的慢病毒构建

本实施例中以靶向人间皮素(mesothelin，MSLN)的单链抗体为统一的胞外识别抗原的结构，分别需要构建如下2个嵌合抗原受体(图1)：

DAP12-T2A-MSLN(scfv)-TREM1_cut(pro-CAR)

DAP12-T2A-MSLN(scfv)-TREM1_cut-F2A-IL-15(15CAR)

1、合成含有靶向人间皮素的嵌合抗原受体(CAR)的基因序列

人工分别合成编码pro-CAR和15CAR的DNA片段：包含自然杀伤激活受体(简称DAP12)、T2A、抗人间皮素的单链抗体scfv(简称MSLN(scfv))、截短的髓样细胞触发性受体(简称TREM1_cut)、F2A、IL-15的DNA片段，其结构如图1所示。其中DAP12的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，抗人间皮素的单链抗体(MSLN)scfv的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，TREM1_cut的核酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，F2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示，IL-15的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示

2、构建表达嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒载体

1)将含有合成CAR基因的pUC57-CAR质粒，用Nhe I和Xho I进行双酶切，凝胶回收试剂盒(全式金)回收CAR基因片段。

2)将慢病毒载体质粒pELNS用Nhe I和Xho I双酶切后，回收酶切后的产物，应用T4DNA连接酶(Takara)将载体片段和CAR基因进行连接。连接产物(pELNS-CAR)转入感受态细胞进行扩增，提取质粒进行酶切鉴定与测序鉴定。

3)用无内毒素质粒大提试剂盒(QIAGEN)提取pELNS-CAR质粒、2个包装质粒pRSV-rev和pGAG-Pol，包膜蛋白质粒pVSV-G，使用分光光度计测定质粒的浓度，OD260的光密度值应在0.1-1.0之间，OD260/OD280的光密度值应在1.8-2.0之间。

4)转染前一天，取2瓶T75培养的293T细胞，PBS洗一次后，加入胰酶消化细胞，细胞分散后，每瓶加入约5ml的DMEM完全培养基(10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，计数。

5)取3个T150细胞培瓶，每瓶接入2×10⁷个293T细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养约24h，此时细胞的汇合率约为80％-90％。

6)第二天，转染前30～60min，弃去原培养液，换上新配制的的DMEM培养液(10％FBS，1％HEPES，不含双抗)。

7)磷酸钙法转染试剂盒(碧云天)：在50ml离心管中加入4.5ml CaCl₂溶液，分别加入如下量的质粒：84ug pRSV-rev，84ug pGAG-Pol，33ug pVSVG，69ug pELNS-CAR，充分混匀；

8)向离心管中加入4.5ml BBS溶液，边加边混匀，室温孵育20min；

9)向每个T150培养瓶中液逐滴加入3ml质粒-转染混合液，边加边混匀。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。

10)6～8小时后弃去转染培养液，换新鲜DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱。

11)转染48h后，吸出含有病毒颗粒的培养液，用0.45μm的滤器过滤后，置于4℃保存。

12)在细胞培养皿中再加入20ml预热DMEM完全培养基，继续培养24h，收集上清用0.45μm滤器过滤，收集病毒上清。

3、CAR慢病毒载体的浓缩

1)将0.45μm滤器过滤后的病毒上清样品分装到离心管中；

2)盖上金属盖，将离心管连同金属盖一起配平，用1XPBS调整使重量偏差在0.02g范围内；

3)将配平的离心管对称放置于超速离心机中。设置离心转速50,000g，20℃离心2小时；

4)离心结束后，小心将离心管从转子中拿出，可以看到在离心管底有一小团沉淀，用Marker笔在外管壁上做标记，倒掉上清。将离心管倒扣在预先铺好的纸巾上，使残余液体流掉。可以用移液枪将挂在壁上的液滴吸走；

5)向每个离心管中加入400μl的Opti-MEM，用200μl移液器吹打使沉淀溶解，尽量减少泡沫的产生；将病毒分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存；实施例2：滴度测定

1)取24孔板接种293T细胞。每孔细胞为5×10⁴个，所加培养基体积为500ul,不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；

2)准备3个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)接种细胞24小时后，取两个孔的细胞进行计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N；

3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖DMEM+10％FBS),终体积为500ul；

4)感染24小时后，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO2继续培养48小时；

5)72小时后，用胰酶消化后，用500ul PBS重悬细胞，并离心(1500rpm，5min)；

6)弃上清，100ul PBS重悬细胞，并向加入2ul F(ab)2抗体(CAR检测抗体)，4℃放置30min；

7)加入500ul PBS，并离心(1500rpm，5min)；

8)加入500ul PBS，流式细胞仪测定表达CAR的阳性率(如图2所示)。取阳性率在1-20％的病毒稀释倍数，计算病毒滴度。

表1不同稀释倍数CAR阳性细胞比例

按如下公式计算滴度：浓缩后病毒滴度为＝{(测定的阳性细胞百分比×感染细胞时的细胞总数)/接种病毒体积}×稀释倍数。

测定的pro-CAR慢病毒滴度为：4.5×10⁸TU/ml。

15CAR慢病毒滴度为：4.2×10⁸TU/ml。

实施例3、病毒感染T细胞

1、T细胞的分离活化及病毒感染

(1)人外周血单核细胞的分离

用含有抗凝剂的采血管采集外周血约10ml，室温(18-25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于5000r/min条件下离心10min，按体积比1:1加到淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)上，梯度离心，3000r/min，离心30min，离心后，离心管由上之下分层：第一层为血浆层；第二层为淋巴细胞白膜层；第三层为透明分离液层；第四层红细胞层。吸取淋巴细胞白膜层，并用PBS洗涤2次，两次离心以1500r/min，离心10min，PBS重悬细胞，加入5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基培养人外周血单核细胞。

(2)慢病毒感染T淋巴细胞

用含5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，IL-2购自R&D Systems，KBM581购自Corning，第0天加入CD3/CD28Dynabeads(购自invitrogen)活化T细胞，前3天进行慢病毒感染，加入MOI＝3的慢病毒载体，未感染的T淋巴细胞作为空白对照，48h后将培养基更换为含有5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基，继续培养7-9天。

2、T细胞中CAR阳性率的检测

将培养至第7天的已感染病毒的T细胞，1200r/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞，用含有体积分数1％FBS的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×10⁶个/ml，加入生物素标记羊抗鼠F(ab)2(Jackson ImmunoResearch公司)，4℃孵育30min，PBS洗一次，再加入Streptavidin-PE(BD Biosciences公司)，4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测，结果显示经过7天的培养，CAR-T细胞CAR的阳性率：pro-CAR慢病毒感染组阳性率78.3％，15CAR病毒感染组阳性率74.5％(图2)

实施例4、病毒感染CAR-T细胞对细胞增殖的影响

各组慢病毒感染完T细胞后，将T细胞用含体积分数5％自体血浆+300IU/ml重组人IL-2+KBM581完全培养基，每1-2天计数一次。然后观察T淋巴细胞生长情况，结果如图3所示。结果表明细胞在感染表达CAR的病毒后，依然能够形成典型的增殖克隆团，通过对细胞进行计数，绘制细胞增殖曲线可见感染pro-CAR CAR-T细胞与15CAR CAR-T增殖相似，比未感染病毒的T细胞(图3中NTD)增殖能力稍弱。

实施例5、检测慢病毒感染CAR-T的细胞因子分泌(IL-2，IL-15，IFN-γ)

(1)细胞因子检测采用Elisa的方法，使用R&D公司试剂盒进行。

(2)标准品的稀释：准备1ml离心管7支，按1～7依次编号，1号离心管加入标准品稀释液(1000-x)μL，其余各管加入500μL标准品稀释液；然后取原浓度标准品xμL加入到1号离心管中，充分混匀，在1号离心管中取500μL加入2号离心管中，充分混匀；依次操作。

(3)取已包被酶标板，分别加入：不同浓度的标准品100μL，每个浓度3个平行孔；加入待测样品100μL，每个样品3个平行孔；100μL标准品稀释液(空白对照)。

(4)室温放置孵育2h

(5)弃去液体，甩干，每孔加200μL洗涤液，静止30s后弃去，如此重复3次。

(6)每孔加入100μL检测抗体

(7)孵育：同操作(5)

(8)洗涤：同操作(6)

(9)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素

(10)避光室温放置孵育20min

(11)洗涤：同操作(6)

(12)每孔加入显色液100μL，轻轻震荡混匀，避光室温放置孵育20min

(13)每孔加入终止液50μL，终止反应

(14)以空白孔校零，酶标仪450nm波长测定各孔的吸光值(OD值)，测定应在加入终止液后15min内进行。

将靶细胞与CAR-T或NTD(T细胞)共培养，检测CAR-T或NTD受抗原刺激分泌IL-2、IL-15和IFN-γ水平；靶细胞选择OVCAR3(MSLN阳性)，293T(MSLN阴性)。pro-CAR CAR-T和15CAR CAR-T在受到MSLN抗原刺激时分泌IFN-γ，NTD细胞则几乎不分泌(图4)；然而pro-CAR CAR-T和15CAR CAR-T在受到MSLN抗原刺激时分泌及其微量的IL-2(图5)；同时，只有15CAR CAR-T分泌IL-15，pro-CAR CAR-T和NTD并不分泌IL-15，如图6所示。

实施例6、病毒感染CAR-T细胞体外杀伤效果评估

(1)第一天，分别将1X10⁴靶细胞OVCAR3细胞(MSLN阳性)和293T(MSLN阴性)接种于E-Plate中。

(2)第二天，按照效靶比为0:1、1:1、5:1、10:1，分别加入相应数量的CAR-T细胞，通过RTCA系统实时监控CAR-T对靶细胞的杀伤作用。

按下列公式计算CAR-T对靶细胞的杀死率：

检测结果如图7所示。pro-CAR和15CAR T细胞对OVCAR3有相同的杀伤效果，pro-CAR和15CAR对293T没有杀伤效果。杀伤结果表明，IL-15的加入，并不会影响CAR-T细胞的杀伤能力。

实施例7、IL-15表达T细胞的细胞数及存活率

对于表达IL-15的CAR-T细胞产生的IL-15是否发挥生物功能进行了研究。将制备的15CAR T细胞(4×10⁵个)、pro-CAR T细胞(4×10⁵个)以及未转染病毒的T细胞(non-transduced T cell，NTD，对照)培养5天。为了排除Dynabeads对IL-15的表达产生的影响，在不存在由Dynabeads引起的刺激下进行上述培养。接下来，利用流式细胞仪测定细胞的活率和细胞数，结果如图8所示；粒度仪测定细胞数，如图9所示。

与NTD细胞和pro-CAR CAR-T细胞相比，15CAR CAR-T细胞数约高达其1.5倍，存活率约高达其3倍。因此可明确，通过使用将本发明的表达载体导入T细胞而获得表达IL-15的CAR-T细胞，从而IL-15发挥生物功能并显示免疫诱导效果。

本发明的7CAR T细胞由于兼具增殖能力、存活能力及杀伤能力，因此可用于免疫疗法的领域中。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权力要求书所限定的范围。

序列表

<110> 南京艾德免疫治疗研究院有限公司

<120> 一种改良型嵌合抗原受体T细胞的制备

<130> 2019

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atggggggac ttgaaccctg cagcaggttc ctgctcctgc ctctcctgct ggctgtaagt 60

ggtctccgtc ctgtccaggt ccaggcccag agcgattgca gttgctctac ggtgagcccg 120

ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 180

gtgtacttcc tgggccggct ggtccctcgg gggcgagggg ctgcggaggc agcgacccgg 240

aaacagcgta tcactgagac cgagtcgcct tatcaggagc tccagggtca gaggtcggat 300

gtctacagcg acctcaacac acagaggccg tattacaaa 339

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Val Gln Ala Gln Ser Asp

20 25 30

Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

35 40 45

Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

50 55 60

Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly

85 90 95

Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr

100 105 110

Lys

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ggagagggca gaggaagtct tctaacatgc ggtgacgtgg aggagaatcc cggccct 57

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac 180

aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 300

tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360

ggaggcggtt caggcggcgg tggctctagc ggtggtggat cggacatcga gctcactcag 420

tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 480

tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 540

atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 600

ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattac 660

tgccagcagt ggagtaagca ccctctcacg tacggtgctg ggacaaagtt ggaaatcaaa 720

<210> 6

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

130 135 140

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

145 150 155 160

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

210 215 220

Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 7

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

cctcctacca ccactaaggc cttgtgccca ctctatacca gccccagaac tgtgacccaa 60

gctccaccca agtcaactgc cgatgtctcc actcctgact ctgaaatcaa ccttacaaat 120

gtgacagata tcatcagggt tccggtgttc aacattgtca ttctcctggc tggtggattc 180

ctgagtaaga gcctggtctt ctctgtcctg tttgctgtca cgctgaggtc atttgtaccc 240

<210> 8

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Pro Pro Thr Thr Thr Lys Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg

1 5 10 15

Thr Val Thr Gln Ala Pro Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro

20 25 30

Asp Ser Glu Ile Asn Leu Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro

35 40 45

Val Phe Asn Ile Val Ile Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser

50 55 60

Leu Val Phe Ser Val Leu Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro

65 70 75 80

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct 60

ggacct 66

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 11

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60

ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120

gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt 180

gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac 240

cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt 300

gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac 360

agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag 420

gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac 480

acttcttga 489

<210> 12

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr

1 5 10 15

Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His

20 25 30

Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala

35 40 45

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

50 55 60

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

65 70 75 80

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

100 105 110

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

115 120 125

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

130 135 140

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

145 150 155 160

Thr Ser

Claims

1.CAR表达载体，其含有编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸及编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸，其特征在于，所述编码所述免疫功能促进因子的核酸为：编码白细胞介素15的核酸。

2.如权利要求1所述的CAR表达载体，其特征在于，所述编码CAR的核酸与所述编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸介由编码自切割肽的序列连接。

3.如权利要求1～2中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码下述单链抗体多肽的核酸，所述单链抗体识别mesothelin。

4.如权利要求1～3中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，1.一种嵌合抗原受体，其特征在于包括：抗原结合结构域和信号传导结构域，其中信号传导结构域包括第一传导结构域和第二传导结构域，第一传导结构域和第二传导结构域之间串联抗原结合结构域；所述的第一传导结构域为TREM1氨基酸序列或氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述第二传导结构域为DAP12；第二传导结构域通过T2A与抗原结合结构域串联。

5.如权利要求1～4中任一项所述的CAR表达载体，其特征在于，编码CAR的核酸含有编码DAP12、TREM1截短或未截短的核酸。

6.CAR表达T细胞，其中导入了以下(a)或(b)所示的载体：(a)权利要求1～5中任一项所述的CAR表达载体；(b)含有编码CAR的核酸及编码白细胞介素15的核酸的CAR表达载体。

7.T细胞，其表达CAR、白细胞介素15。

8.如权利要求7所述的T细胞，其特征在于，含有编码CAR的核酸、编码白细胞介素15的核酸。

9.表达CAR、白细胞介素15的T细胞的制造方法，其特征在于，使用载体将编码CAR的核酸、编码白细胞介素15的核酸导入T细胞。