KR101069906B1 - 비짜루국화 추출물을 함유하는 피부 상태개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비짜루국화 추출물을 함유하는 피부 상태개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비짜루국화를 에탄올로 추출하여 얻은 에탄올 추출물 또는 이로부터 얻은 용매 분획물을 유효성분으로 하는 피부 미백 또는 항염증 활성이 있는 피부 상태개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 비짜루국화 추출물 또는 이로부터 얻은 용매 분획물은 뛰어난 항산화 활성을 나타내며, 기존에 미백제로 알려진 melasolv보다 더욱 높은 멜라닌 저해 활성을 보이고, NO 생성을 억제하여 항염증 효과를 가지는 것으로 확인되었다.

비짜루국화, Aster subulatus Michx., 추출물, 용매분획, 항산화, 미백, 멜라닌, 항염증, 산화질소

Description

비짜루국화 추출물을 함유하는 피부 상태개선용 조성물{A composition for improving skin conditions comprising extract of Aster subulatus Michx.}

본 발명은 비짜루국화 추출물을 함유하는 피부 상태개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비짜루국화를 에탄올로 추출하여 얻은 에탄올 추출물 또는 이로부터 얻은 용매 분획물을 유효성분으로 하는 피부 미백 또는 항염증 활성이 있는 피부 상태개선용 조성물에 관한 것이다.

천연물 유래의 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 질병에 대한 치료 및 예방제 또는 건강보조제로서 식물자원이 널리 이용되고 있다. 천연 항산화제로는 α-토코페롤(α-tocopherol), 비타민 C, 카로티노이드류(carotenoids), 플라보노이드류(flavonoids) 등이 알려져 있는데, 이러한 항산화 효과가 있는 물질들은 동식물에 널리 분포되어 있으며, 특히 많은 연구가 이루어진 분야는 식물유래 물질이다. 식물 유래의 2차 대사산물들은 자유유리기(free radical)와 활성산소의 생성을 억제하거나 제거시켜서 산화에 의한 세포손상을 방지한다는 것이 생체 실험결과 밝혀졌다. 현재까지 보고된 대부분의 천연 항산화제는 식물에서 유래한 것으로서 주로 폴리페놀 화합물인 것으로 알려져 있으며, 특히 플라보노이드류는 지질의 산화, 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막는 역할을 함으로써 노화방지, 암 및 심장질환 등을 예방하거나 지연하는 효과가 있어서 오늘날 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에서 활용되고 있다. 또한 멜라닌(Melanin)은 자외선으로부터 생체를 보호하는 중요한 방어 수단으로서 동물, 식물, 및 미생물에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연 색소이다.

멜라닌은 자외선, 건조, 극한 온도 등에 대한 생존능력을 높여주고, 커피, 차, 담배 등의 품질을 향상시키나, 과도한 멜라닌 합성은 인체에 기미, 주근깨, 피부 반점을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다. 멜라닌 색소의 생합성은 티로시나제(tyrosinase) 효소를 비롯하여 여러 효소들에 의하여 조절되고 있으며, 그중 티로시나제는 티로신을 기질로 하여 L-도파퀴논(L-dopaquinone)으로 전이되는 초기 생합성과정 이후 디하이드록시인돌(dihydroxyindole)의 산화에 작용한다. 따라서 티로시나제 활성 억제제를 찾는 연구가 미백제의 개발에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 현재 알려져 있는 티로시나제 저해제로 하이드로퀴논(hydroquinone), 4-하이드록시아니솔(4-hydroxyanisole), 아스코르브산(ascorbic acid) 유도체, 코직산(kojic acid), 아젤라인산(azelaic acid), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 레티노이드류(retinoids), 알부틴(arbutin), 카테킨(catechin), 3,4,5-트리메톡시 신나메이트 티몰 에스테르(3,4,5-trimethoxy cinnamate thymol ester) 등이 있으나, 이들의 안전성과 경제성 등에 문제가 많아 사용에 있어서 어려움이 있다.

한편, 산화질소(nitric oxide) (NO)는 작고 비교적 불안정하며 독성이 있는 무기 저분자 라디칼로서 NO를 생성하는 효소(NOS: nitric oxide synthase)에는 constitutive NOS(c-NOS)와 inducible NOS(iNOS)가 보고되어 있다. cNOS에 의한 NO생성은 생체 내 항상성 조절에 중요한 역할을 하지만, iNOS는 cNOS와는 달리 리포다당류(lipopolysaccharide) (LPS), 인터페론-γ(interferon-γ) (IFN-γ), 인터루킨-1β(interleukin-1β) (IL-1β) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α) (TNF-α) 등의 자극에 의해 대식세포, 혈관평활근세포, 내피세포, 간세포와 심근세포 등에서 발현된다. 이들 조직에서 발현되는 iNOS는 장시간 동안 많은 양의 NO를 생성하게 되어 염증과 종양을 유발하며, 조직의 손상과 유전자 변이 및 신경 등의 손상을 초래한다. 따라서 최근에는 염증성 질환 등 다양한 질병을 예방 및 치료하기 위해 기능성 식품, 기능성 화장료 및 치료제 등 각 분야에서 인공물질이 아닌 천연물질을 이용한 연구가 활발히 진행되어지고 있다.

비짜루국화(Aster subulatus)는 귀화식물로서 국화과(Asteraceae)에 속하는 1년생 초본으로 제주도를 비롯하여 우리나라 전국에 자생하고 있다. 꽃은 8월 ~ 10월에 노란색을 약간 띤 백색으로 피며, 잎은 호생하고 줄기는 곧추서며, 원추형으로 가지를 친다. 현재 비짜루국화(Aster subulatus)에 대한 연구 결과 보고는 없으며, 국화과에 속하는 몇몇 종에서 기관지 천식 및 거담제, 진위제 등 약재로서의 유용성에 대한 보고가 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 제주도의 귀화식물인 비짜루국화(Aster subulatus)를 이용하여 에탄올 추출물 및 순차적 용매분획물을 얻어 항산화 활성을 조사하고, B16F10 mouse melanoma 세포 및 RAW 264.7 세포에 처리하여 멜라닌 생합성 억제활성을 통한 미백 및 기능성 화장료와 염증질환치료제의 유용자원으로서 활용가능성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 비짜루국화 추출물 또는 이의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 또는 항염증 활성이 있는 피부 상태개선용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 비짜루국화 추출물 또는 이의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 상태개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 피부상태 개선은 피부 미백 또는 항염증인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 비짜루국화 추출물은 물, 에탄올, 메탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 에탄올로 추출한 것을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.

본 발명의 일 실시예로서, 상기 비짜루국화 추출물은 비짜루국화 전초를 열풍건조하고 분쇄하여 얻은 분쇄물을 70 % 에탄올에 침적시키고 2 ~ 3 일 동안 실온에서 교반하여 침출하고 여과한 다음 감압농축하고, 동결건조함으로써 수득할 수 있다.

본 발명에서, 비짜루국화 추출물의 용매분획은 비짜루국화 추출물을 증류수 로 현탁한 후 비극성 용매부터 n-헥산(n-hexane)(n-Hex), 메틸렌클로라이드(methylene chloride)(CH₂Cl₂), 에틸아세테이트(ethyl acetate)(EtOAc), 및 n-부탄올(n-butanol)(n-BuOH)을 사용하여 분획함으로써 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로서, 비짜루국화 추출물의 용매분획은 비짜루국화 에탄올 추출물을 증류수에 현탁하고 분별 깔대기에서 비극성 용매부터 n-hexane(n-Hex), methylene chloride(CH₂Cl₂), ethyl acetate(EtOAc), n-butanol(n-BuOH)을 사용하여 분획한 뒤 여과, 감압 농축하여 각각의 용매별 분획물을 얻었다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물이다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 비짜루국화 추출물 또는 이의 용매분획물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에 센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지 방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구 또는 경피에 의해 투여할 수 있다. 그러나 바람직하기로는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하기로는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 경로로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 세포독성과 멜라닌 생성 저해 활성을 측정하기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포를 사용하였다. B16F10 mouse melanoma 세포는 미국 세포주 은행 (ATCC)으로부터 분양받았다. B16F10 세포를 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 1% Antibiotic-Antimycotic (Gibco), L-glutamine와 sodium bicarbonate 가 함유된 DMEM 배지(Gibco)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다.

본 발명에서, 비짜루국화 추출물이 산화질소 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 사용하였다. RAW 264.7 세포는 murine macrophage cell line 으로 KCLB (Korean Cell Line Bank)로부터 분양받아 10% FBS와 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin이 포함된 DMEM 배지(Gibco)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다.

본 발명 비짜루국화 추출물을 함유하는 피부 상태개선용 조성물은 비짜루국화 추출물 또는 이의 용매분획물을 유효성분으로서 함유함으로써 뛰어난 항산화 활성을 나타내며, 기존에 미백제로 알려진 melasolv보다 더욱 높은 멜라닌 저해 활성을 보이고, NO 생성을 억제하여 항염증 효과를 가지는 피부 상태개선용 조성물을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가진다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 비짜루국화 추출물 제조

본 실시예에서 사용된 식물 시료인 비짜루국화 (Aster subulatus)는 (재)제주하이테크 산업진흥원 추출물은행에서 분양받아 사용하였다. 비짜루국화 전초 364.7 g을 흐르는 물에 세척 후 3일 동안 40℃ 열풍건조 하여 분쇄기로 분쇄하고, 이 분쇄물을 70 % 에탄올에 침적시키고 2 ~ 3 일 동안 실온에서 교반하여 침출하였다. 이 침출물을 여과기로 여과하고, 이 침출. 여과과정을 2 ~ 3 회 더 반복한 다음, 이 여과액을 감압농축하고, 동결건조하여 분말형태로 36.5 g의 에탄올 추출물을 수득하였다.

실시예 2: 비짜루국화 추출물 유래 용매분획

본 실시예에서 시료의 추출에 사용된 용매들은 Merk Co., Junsei Co., Hyman Co.사의 제품을 사용하였다. 분리과정에서 사용된 충진제로는 normal-phase silica gel column chromatography에는 Silica gel 60(0.040-0.063 mm, Merck Co.)이 사용되었고, reverse-phase silica gel column chromatography에는 Silica gel 100(RP-18, 230-400 mesh, Merck Co.)이 사용되었다.

비짜루 국화의 에탄올 추출물에 대한 용매분획은 다음과 같이 수행하였다.

먼저, 비짜루 국화의 에탄올 추출물(70% 에탄올 추출물) 36.5 g을 증류수에 현탁시킨후, 분별깔대기에서 비극성 용매부터 n-hexane(n-Hex)을 첨가하여 n-hexane 층과 수층으로 분획한 후 이를 2회 반복하여 n-hexane 층을 얻었다. 그 후 수층에 methylene chloride(CH₂Cl₂)를 첨가하여 methylene chloride 층과 수층으로 분획한 후 이를 3회 반복하여 methylene chloride 층을 얻었다. 그 다음 ethyl acetate(EtOAc)를 첨가하여 ethyl acetate 층과 수층으로 분획한 후 이를 3회 반복 하여 ethyl acetate 층을 얻었고 수층에 n-butanol(n-BuOH)을 첨가하여 n-butanol 층과 수층을 분획한 후 이를 3회 실시하여 n-butanol 층을 얻었다. 각각을 감압농축시켜 5개의 분획구를 획득할 수 있었다(도 1).

그 결과, 각각의 용매별 분획물 n-hexane 1.076 g, CH₂Cl₂ 1.1035 g, EtOAc 1.9034 g, n-BuOH 5.1037 g, H₂O 12.2046 g을 얻었다.

이후 실험에서는 분말로 된 헥산과 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 분획물은 100% 에탄올로 녹였고, 부탄올과 물 분획물은 100% 에탄올과 1×Phosphate Buffered Saline (PBS, pH 7.4)가 1:1로 혼합된 용매를 가하여 완전히 용해시킨 후 여과하여 사용하였다.

본 발명 비짜루국화 유래 추출물 및 각 분획물의 수율을 조사한 결과 하기 표 1과 같았다.

본 발명 비짜루국화 유래 추출물 및 각 분획물의 수율

Ext. solvent	Yield (%)
70% EtOH Ext.	10
n-hexane Fr.	0.3
CH2Cl2 Fr.	0.3
EtOAc Fr.	0.5
n-butanol Fr.	1.4
H2O Fr.	3.3

실험예 1: DPPH 자유유리기 소거 활성, Xanthine oxidase 억제 활성 및 superoxide 소거 활성 측정을 통한 항산화 활성 평가

전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blosis 방법에 의한 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 자유유리기 소거법에 따라 측정하였다. 즉, 에탄올에 녹인 여러 농도의 시료를 96well plate에 100 ㎕씩 분주 하고 0.4 mM DPPH 용액을 동량 첨가하여 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로는 butylated hydroxy anisole (BHA)를 사용하였다. DPPH 자유유리기 소거활성은 하기 수학식 1로부터 산출하였고 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표시하였다.

DPPH 자유유리기 소거활성(%) = (A_control - A_sample)/A_control × 100

A_sample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도

A_control = 시료대신 에탄올을 첨가한 반응액의 흡광도

한편, Xanthine oxidase에 의한 uric acid 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 대조군으로 allopurinol(Sigma)을 사용하였다. superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법으로 560 nm에서 측정하였다. 반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.5 mM xanthine와 1 mM EDTA를 200 mM phosphate buffer (pH 7.5) 100 μl에서 준비하였고 50 mU/ml xanthine oxidase를 첨가하여 uric acid의 생성을 유도하였다. Superoxide 소거활성은 위 반응액에 0.5 mM NBT를 첨가 하여 반응시켰다. Xanthine oxidase 억제 및 superoxide 소거 활성은 각각 생성된 uric acid와 superoxide의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC₅₀)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복 실험 후 평균값을 구하였다.

비짜루국화의 에탄올 추출물과 순차적 분획물의 항산화 활성에 대한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

비짜루국화의 에탄올 추출물과 순차적 분획물의 항산화 활성

Treatment	IC50 (㎍/㎖)1)
	DPPH radical scavenging activity	Xanthine oxidase inhibitory activity	Superoxide radical scavenging activity
EtOH extract	104.05 ± 11.77	657.76 ± 88.08	14.20 ± 1.29
EtOAc fraction	17.66 ± 1.47	84.63 ± 1.23	2.54 ± 1.26
CH2Cl2 fraction	135.83 ± 3.47	>1000	159.61 ± 8.34
n-Hex fraction	907.27 ± 23.19	>1000	526.10 ± 42.01
n-BuOH fraction	61.03 ± 0.89	485.42 ± 5.91	29.98 ± 12.20
Water fraction	483.13 ± 82.19	>1000	135.58 ± 2.84
Quercetin	N/A	N/A	N/A
BHA2 )	5.95 ± 0.49	N/A	N/A
Allopurinol	N/A	12.26 ± 2.80	2.11 ± 0.91
[주] 1) IC50 값: 3회 반복실험으로 다른 농도를 이용한 회귀직선으로부터 계산됨 2) BHA: 부틸히드록시아니졸(Butylated hydroxyl anisole) 3) N/A : Not assay

상기 표 2를 통해 확인할 수 있듯이, DPPH의 자유유리기 소거 활성은 에탄올 추출물과 순차적 분획물 모두에서 처리농도에 따라 농도 의존적으로 증가하였다. 순차적 분획물 중 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 DPPH의 자유유리기 소거 활성의 대조군인 BHA 보다 약간 떨어지는 활성을 보였으나 다른 분획물보다는 현저히 좋은 활성을 갖고 있으며, 이때의 IC₅₀ 값은 각각 17.66, 61.03 ㎍/㎖로 나타났다.

또한, 상기 표 2를 통해 알 수 있는 바와 같이 비짜루국화 에탄올 추출물 및 순차적 분획물 모두 농도 의존적으로 xanthine oxidase 억제활성을 보였으며, 에틸아세테이트 분획물이 분획물중 IC₅₀ 값이 84.63 ㎍/㎖으로 높은 억제활성을 보였다. 특히 비짜루국화 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트와 부탄올 분획물의 superoxide radical 소거활성 IC₅₀ 값이 각각 14.20 ㎍/㎖과 2.54 ㎍/㎖, 29.98 ㎍/㎖로 나타나 대조군 allopurinol(IC₅₀=6.80 ㎍/㎖)에 비교하여 전혀 뒤떨어지지 않는 높은 억제활성을 보였다. 이와 같은 효과는 이미 보고된 바와 같이 지질의 산화, 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막는 역할을 함으로써 노화방지, 암 및 심장질환 등을 예방하거나 지연하는 효과로 오늘날 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에서 이들 효과를 활용하고 있다. 따라서, 이러한 항산화 효과를 기초로 판단했을 때 비짜루국화는 생체 내에서 일어나는 많은 산화적인 스트레스 및 손상의 예방에 매우 유용한 자원식물임을 알 수 있었다.

실험예 2: MTT assay 를 이용한 세포독성 측정

세포독성 측정을 위하여, 먼저 B16F10 세포를 24 well plate에 well당 2×10⁴개의 세포를 접종하고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양한 후 시료를 각각의 well에 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 그리고 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 72시간 배양하였다. 여기에 2 ㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT 용액 200 ㎕를 첨가하고 동일한 배양 조건으로 4시간을 배양하여 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 각 well당 DMSO 200 ㎕를 가하여 ELISA reader (μQuant, USA)로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

비짜루국화 (Aster subulatus) 에탄올 추출물 및 순차적 분획물이 B16F10 세포주의 세포 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 그리고 100 ㎍/㎖까지 다양한 농도로 3일 동안 처리하고 배양한 후에 MTT 방법으로 세포의 생존률을 관찰하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 대조군의 세포 생존률을 100%로 하였을 때, 비짜루국화 에탄올 추출물 및 각각의 순차적 분획물 농도들 중 12.5, 25, 50 ㎍/㎖ 농도에서는 거의 85 ~ 103%로 대조군에 비해 약간 감소하거나 증가하였으며, 100㎍/㎖ 농도에서 에틸아세테이트 분획물만 28%로 억제되는 경향을 보였다. 이처럼 대조군에 비해 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖의 농도들은 약간의 차이가 있으나 유의할만한 변화를 나타내지 않았으며 100㎍/㎖이상에서 에틸아세테이트 분획물에서만 세포독성이 나타남으로서 세포독성이 낮아야하는 미백제로서의 기준에 에틸아세테이트 분획물의 100㎍/㎖을 제외한 100 ㎍/㎖이하의 비짜루국화 에탄올 추출물 및 순차적 분획물이 부합하는 것으로 사료되어진다.

실험예 3: 멜라닌 생성 저해 활성 측정

24 well plate에 well당 2×10⁴개의 B16F10 세포를 접종하고 24시간동안 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양한 후 시료를 각각의 well에 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 그리고 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 3일간 시료 처리 후 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 각 well당 500 ㎕의 1N NaOH를 가하고 56℃에서 30분 용해한 후 ELISA reader (μQuant, USA)로 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실험예 2의 실험결과, 에틸아세테이트 분획물을 제외하고는 모두 100 ㎍/㎖ 이하에서 세포독성이 없는 것으로 관찰되었으므로 비짜루국화 에탄올 추출물 및 순차적 분획물을 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖까지 다양한 농도로 3일 동안 처리한 후, 멜라닌생성 저해 활성을 측정하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 대조군으로서 미백제로 알려진 합성물질인 melasolv 처리시 56%의 멜라닌 생성 억제활성을 보였으며, 각각 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 농도까지 처리시 비짜루국화 에탄올 추출물은 4%, 17%, 35% 48% 저해 활성을 보였다. 또한 각각의 순차적 분획물들 중 에틸아세테이트 분획물을 제외한 100 ㎍/㎖ 농도에서 77%, 69%, 57%, 37%로 대조군 보다 높은 멜라닌 저해 활성을 보였으며, 천연식물에서의 미백제로서 매우 탁월한 결과를 보여주었다. 따라서 이러한 결과로 보면 멜라닌 생성을 줄이면서 세포독성은 낮아야 하는 미백제로서의 기준에 비짜루국화 에탄올 추출물 및 순차적 분획물이 부합하는 것으로 사료되어진다.

실험예 4: Nitric oxide ( NO ) 측정

RAW 264.7세포에서 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 생성된 NO의 양은 Griess reagent로 측정하였다. 48 well plate에 2×10⁵cell/㎖의 RAW 264.7 세포를 접종하고 24시간 전 배양 하였다. 그 후 배지를 제거하고, 시료가 함유된 배지를 처리하고 1시간 후 LPS (1 ㎍/㎖) 처리하였다. 전 배양과 동일 조건에서 24시간 동안 배양하여 100 ㎕의 배양액을 96 well plate에 넣고 동량의 Griess reagent [1% (W/V) sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylethylen diamine in 2.5% (V/V) H₃PO₄]를 첨가하고 10분간 실온에서 배양한 후 ELISA reader (μQuant, USA)를 이용하여 540 nm에서 정량하였다.

항산화 기능을 가지고 있는 녹차의 폴리페놀 (polyphenol) 성분, 상황추출물 (curcumin), 로즈마리 (rosemary: Rosmarinus officinalis Linn)등이 염증반응을 억제하는 항염증제로 사용되고, 이들 항염증제는 염증반응을 일으키는 활성산소를 소거시키기도 한다. 따라서 항산화 활성이 좋은 비짜루국화 에탄올 추출물 및 순차적 분획물에 대하여 항염증 효과를 탐색하기 위하여 LPS로 자극한 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성 억제 활성을 분석하여 IC₅₀을 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 메틸렌클로라이드 분획물과 헥산 분획물의 NO 생성 억제율에 대한 IC₅₀ 값이 각각 21.23 ㎍/㎖, 51.68 ㎍/㎖로 가장 높은 억제활성을 나타났다. 이러한 결과를 통해 비짜루국화의 유효성분 추출을 통한 항염증용 조성물을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.

RAW 264.7세포에서 비짜루국화의 에탄올 추출물 및 이의 분획물이 LPS-유도 NO 생성에 미치는 영향

Aster subulatus	IC50 2 ) (μg/ml)
EtOH extract	>100
EtOAc fraction	>100
CH2Cl2 fraction	21.23 ± 3.42
n-Hex fraction	51.68 ± 11.68
n-BuOH fraction	>100
Water fraction	>100

이상 상기 실시예 및 실험예를 통해 설명한 바와 같이, 본 발명 비짜루국화 추출물을 함유하는 피부 상태개선용 조성물은 비짜루국화 추출물 또는 이의 용매분획물을 유효성분으로서 함유함으로써 뛰어난 항산화 활성을 나타내며, 기존에 미백제로 알려진 melasolv보다 더욱 높은 멜라닌 저해 활성을 보이고, NO 생성을 억제하여 항염증 효과를 가지는 피부 상태개선용 조성물을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가지므로 화장품산업 및 제약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 비짜루국화로부터 에탄올 추출물 및 이의 용매분획물을 얻는 과정을 간략히 나타낸 흐름도이다.

도 2는 B16F10 세포에서 비짜루국화 에탄올 추출물과 이의 용매분획물이 나타내는 세포 생존률을 나타내는 그래프이다. 이때 데이터는 3회 측정 후 얻은 평균±SD 값이다.

도 3은 B16F10 세포에서 비짜루국화 에탄올 추출물과 이의 용매분획물이 나타내는 멜라닌 생성 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 이때 데이터는 3회 측정 후 얻은 평균±SD 값이다.

Claims (6)

1. 비짜루국화 추출물 또는 이의 용매분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 비짜루국화 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 용매분획물은 헥산 분획물, 메틸렌클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물, 또는 이의 조합임을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
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