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KR20140105028A - 약독화 살모넬라 균주를 고수율로 생산하기 위한 방법 - Google Patents

약독화 살모넬라 균주를 고수율로 생산하기 위한 방법 Download PDF

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KR20140105028A
KR20140105028A KR1020147020387A KR20147020387A KR20140105028A KR 20140105028 A KR20140105028 A KR 20140105028A KR 1020147020387 A KR1020147020387 A KR 1020147020387A KR 20147020387 A KR20147020387 A KR 20147020387A KR 20140105028 A KR20140105028 A KR 20140105028A
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Abstract

본 발명은, 갈락토스 에피머라제(galactose epimerase) 활성이 결여되고 재조합 DNA 분자를 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 새로운 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스를 첨가하지 않고 안정기 도달 전에 고갈되는 초기 글루코스 양만으로 상기 Salmonella typhi 균주를 배양하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은, 상기 방법으로 수득할 수 있는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주, 및 백신으로 사용하기 위한, VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주에 관한 것이다.

Description

약독화 살모넬라 균주를 고수율로 생산하기 위한 방법 {METHOD FOR PRODUCING HIGH YIELD ATTENUATED SALMONELLA STRAINS}
본 발명은, 갈락토스 에피머라제(galactose epimerase) 활성이 결여되고 재조합 DNA 분자를 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 새로운 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스를 첨가하지 않고 안정기 도달 전에 고갈되는 초기 글루코스 양만으로 상기 Salmonella typhi 균주를 배양하는 단계를 포함한다. 또한 본 발명은, 상기 방법으로 수득할 수 있는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주, 및 백신으로 사용하기 위한, VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주에 관한 것이다.
백신 개발을 위한 여러 가지 다양한 접근법 중에서 생 박테리아 백신은 가장 유망한 방법 중 하나이며, 이는 생 박테리아 백신이 많은 병원체의 침입 경로를 모방하고, 조직 구획(compartment)과 점막 구획 수준에서 모두 효과적인 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있기 때문이다. 생 박테리아 백신은 경구 또는 경비로 투여될 수 있으며, 따라서 비경구 투여에 비해 간단하고 안전하다는 이점이 있다. 배치(batch) 제조 비용이 비교적 낮으며, 생 박테리아 백신 제제는 높은 안정성을 나타낸다. 약독화는, 독성 유전자, 조절 유전자 및 대사 유전자를 포함하는 다양한 유전자를 제거함으로써 이루어질 수 있다.
약독화 박테리아 백신은 그에 대응하는 병원체 균주에 대한 면역성을 유도하는 데 사용될뿐만 아니라, 하나 이상의 이종(heterologous) 항원을 수송하도록 변형될 수도 있다.
Salmonella enterica의 약독화된 유도체는, 포유류의 면역 시스템에 이종 항원을 수송하기 위한 수송수단(vehicle)으로서 주목받고 있는데, 이는, S. enterica 균주가, 점막성 면역 경로를 통해 수송되어 숙주의 조직에 침투하여 이종 항원을 계속적으로 생산하면서 숙주 조직에 존속할 수 있기 때문이다. 또한, Salmonella 균주는 조직 구획과 점막 구획 수준에서 모두 강한 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다.
aro 변이에 의해 약독화된 일부 Salmonella typhimurium 균주는 동물 모델에서 이종 항원을 수송하기 위한 안전하고 효과적인 수송수단으로 알려져 있다.
WO 03/073995에는, 생 약독화 Salmonella typhimurium 균주를 통해서 이종 항원, 특히 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 DNA 구조체(construct)를 쥐의 타겟 세포에 수송하는 방법이 기술되어 있다. Niethammer 등은, 쥐의 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR-2 또는 FLK-1)를 코딩하는 발현벡터를 함유하는 약독화 S. typhimurium aroA 균주 SL7207을 개시하였는데(Nature Medicine(2002, 8(12), 1369)), 여기서 혈관 내피 성장 인자 수용체 2는 종양 혈관신생(tumor angiogenesis)에 필수적이고 암 백신으로서 작용한다.
그러나, 인체에 사용하기에 적합한 것으로는, Salmonella enterica 혈청형 변이주 typhi Ty21a(S. typhi Ty21a)로 불리는 단 하나의 약독화 Salmonella enterica 혈청형 변이주만이 존재한다.
장티푸스(typhoid fever)에 대해 내성이 강한 생 경구 백신은, 야생형 독성 박테리아 분리물 S. typhi Ty의 화학적 돌연변이 유발(mutagenesis)에 의해 수득되었고, galE 유전자의 기능-상실(loss-of-function) 돌연변이 및 그 외 명확히 정의되지 않은 다른 돌연변이들을 함유한다. 상기 백신은 실지 시험(field trial)에서 효능과 안전성이 확인된 후에 많은 국가에서 장티푸스 백신으로서 허가되었다.
인체에 사용하기에 안전한, 이종 항원 -특히 암 항원- 의 수송수단으로서, 생 약독화 박테리아 벡터의 필요성이 존재한다. DNA 백신으로서 그러한 약독화 박테리아 벡터를 얻기 위해서는, 이종 항원 DNA로 형질전환된 약독화 박테리아 균주의 효율적인 고-수율 배양이 필요하다. 재조합 DNA 구조체로 박테리아 균주를 형질전환하면 종종 세포의 성장이 감소하는 결과가 나타난다. 따라서, 기능적으로 활성화된 살아있는 세포를 고수율로 수득하기 위한, 바람직하게는 대규모의, 배양 공정을 개선할 필요가 있다.
본 발명의 목적은, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 기존의 방법을 개선하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은, 이종 항원을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 함유하는 살아있는 박테리아 세포를 고수율로 수득하기 위한 효율적인 배양 방법을 개발하는 것이다. 상기 방법 및 상기 방법으로 수득한 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주는, 인체에 사용하기 위한 DNA 백신으로서 안전한 약독화 Salmonella 균주에 대한 절실한 필요성을 충족시킬 것이다. 상기 방법은, 약독화 Salmonella 균주에 기반한 DNA 백신의 상업적인 대규모 생산에 특히 적합할 것이다.
안정기에 도달하기 전에 배지 내의 글루코스 양이 0으로 감소되면, 갈락토스 에피머라제 활성이 결여된 약독화 Salmonella typhi 균주의 세포 수율이 현저하게 증가할 수 있다는 것을 발견한 것은 놀라웠다. 본 발명의 발명자들은 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스를 첨가하면 높은 세포량/높은 OD(Optical Density)값을 얻을 수 없다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 약독화 Salmonella 균주의 발효가 일어나는 동안 글루코스를 첨가하지 않으면, 세포 성장의 안정기가 시작되는 지점에서 약 6 내지 약 8의 OD값을 얻을 수 있으며, 반면, 약 1 내지 약 4 g/L, 바람직하게는 약 2 내지 약 3 g/L의 글루코스 농도(예를 들면, 배지에 순차적으로 일정하게 글루코스를 첨가함으로써 달성됨) 하에 동일하게 배양하면, 약 3 내지 약 5.5의 OD값을 얻게 된다.
또한, 본 발명에 따른 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 방법은, 글루코스의 존재 하에 배양된 세포와는 다른 형태(morphology)를 갖는 세포를 생산한다. 글루코스 없이 성장한 Salmonella typhi 세포는 글루코스의 존재 하에 배양된 세포보다 크기가 더 작고 길이가 더 짧다. 그러나, 형태학적으로 다른 이들 세포는, 글루코스-함유 배지에서 성장한 세포처럼 완전하게 생물학적으로 활성을 나타내고 세포 용해 경향을 전혀 나타내지 않는다.
본 발명의 방법에 따라 배양이 일어나는 동안 글루코스를 첨가하지 않으면, 선택된 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주가 이종 항원을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 함유하고 있는지(예를 들면, pcDNA3.1-FLK1, 또는 pVAX10.VR2-1 등의 이로부터 유래한 플라스미드) 그렇지 않은지(빈 약독화 균주)에 관계없이 세포 수율의 증가가 관찰된다.
따라서, 일 측면에서 본 발명은, 갈락토스 에피머라제 활성이 결여되고 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은, 발효 수준 규모(fermentation scale)에서 거의 중성인 초기 pH 값 하에 펩톤을 포함하는 완충 배지에서 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하고, 발효가 일어나는 동안 배지 내의 글루코스 양은, 안정기에 도달하기 전에 글루코스 양이 0으로 감소하도록, 조절된다.
일 실시예에서, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스가 전혀 첨가되지 않으며, 초기 글루코스 양은 안정기에 도달하기 전에 고갈된다.
일 실시예에서, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주는 Salmonella typhi Ty21a이다.
일 실시예에서, 발현 카세트는 진핵생물 발현 카세트이다. 일 실시예에서, 발현 카세트는 VEGF 수용체 단백질을 코딩한다. 일 실시예에서, VEGF 수용체 단백질은 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체(homolog)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 완충 배지는 비-동물성의 펩톤을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 완충 배지는 비-동물성의 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지이다.
일 실시예에서, 배지의 부피는, 약 10 L 이상, 특히 약 10 내지 약 10,000 L, 더욱 특히 약 30 내지 약 1,000 L, 가장 특히 약 100 내지 약 500 L이다.
일 실시예에서, 초기 글루코스 농도는 박테리아 최소 배지(bacterial minimal medium)의 농도에 대응하거나 그 이하이고, 특히 초기 글루코스 농도는 약 0 내지 약 4 g/L이다.
일 실시예에서, 초기 pH 값은, 약 5 이상 약 9 미만이고, 특히 약 6 내지 약 8이며, 더욱 특히 약 6.5 내지 약 7.5이다.
일 실시예에서, 성장 진행은 OD(optical density)를 측정함으로써 확인되며, 특히 배양물의 OD를 인-시튜(in-situ) 모니터링함으로써 또는 샘플을 추출하여 샘플의 OD를 측정함으로써 확인된다.
또 다른 실시예에서, 성장 진행은 세포 밀도를 측정함으로써 확인되며, 특히, 현미경으로 또는 전기 저항을 측정함으로써 또는 유동 세포 계측(flow cytometry)에 의해 확인된다.
또 다른 실시예에서, 성장 진행은 샘플을 추출하고 한천 플레이트(agar plate)에 플레이팅하여 CFU(colony forming unit) 값을 측정함으로써 확인된다.
일 실시예에서, OD가 약 6에 도달하기 전에, 특히 OD가 약 5 내지 약 6일 때, 세포를 채취한다.
일 실시예에서, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주는 Salmonella typhi Ty21a이고, 재조합 DNA 분자는 CMV 프로모터의 제어 하에 인간 VEGFR-2, 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 pMB1 ori를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함한다. 일 실시예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 갈락토스 에피머라제 활성이 결여되고 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주에 관한 것으로서, 상기 균주는, 발효 수준 규모에서 거의 중성인 초기 pH 값 하에 펩톤을 포함하는 완충 배지에서 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능하며, 상기 방법에서, 발효가 일어나는 동안 배지 내의 글루코스 양은, 안정기에 도달하기 전에 글루코스 양이 0으로 감소하도록 조절된다.
일 실시예에서, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스가 전혀 첨가되지 않으며, 초기 글루코스 양은 안정기에 도달하기 전에 고갈된다.
일 실시예에서, 발현 카세트는 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 진핵생물 발현 카세트이다. 일 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는, 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 VEGF 수용체 단백질을 코딩한다. 바람직한 실시예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주는 Salmonella typhi Ty21a이고, 재조합 DNA 분자는 CMV 프로모터의 제어 하에 인간 VEGFR-2, 카나마이신 저항성 유전자 및 pMB1 ori를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함한다. 일 실시예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 백신으로 사용하기 위한, VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi Ty21a 균주에 관한 것이다.
일 실시예에서, VEGF 수용체 단백질은 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 방법에 의해서 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 높은 세포 수율을 달성할 수 있다는 점은, 승인된 Salmonella typhi Ty21a 균주와 같이 약독화된 Salmonella 균주를 기반으로 상업적인 DAN 백신을 생산함에 있어서 안전성 및 경제성의 측면에서 중요하다. 따라서, 이종 항원을 코딩하는 재조합 DNA 분자, 예를 들면 발현 플라스미드 pVAX10.VR2-1을 함유하는 Salmonella typhi Ty21a는, 고수율로 배양될 수 있고, 그에 따라 인간에 사용하기 위한 DNA 백신을 고수율로 수득할 수 있다. 이러한 방법은, 비록 그것이 약독화된 Salmonella라고 하더라도 Salmonella를 제조 및 배양할 때에는 반드시 준수해야 하는 엄격한 안전 규칙(strong safety rule)에도 부합한다.
도 1: 플라스미드 pVAX10.VR2-1에 클로닝된 cDNA에 의해 코딩되는 VEFGR-2의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2: pVAX10.VR2-1의 플라스미드 맵을 도시한 것이다.
도 3: Salmonella typhi Ty21a(pVAX10.VR2-1)의 제조 과정의 기술을 도시한 것이다.
도 4: S. typhi Ty21a 분리의 순서도를 도시한 것이다.
도 5: 카나마이신 첨가/미첨가에 따른 Salmonella typhi Ty21a의 전-배양물 1 및 전-배양물 2의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 6: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a(빈 것)의 배양물(전-배양 1)의 성장을 나타내는 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)를 측정함으로써 확인되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도 및 g/L 단위의 글루코스 농도를 나타낸다.
도 7: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a(빈 것)의 배양물(전-배양 1)의 성장을 나타내는 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)를 측정함으로써 확인되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도 및 pH값의 변화를 나타낸다.
도 8: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a(빈 것)의 배양물(전-배양 2)의 성장을 나타내는 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)로서 측정되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도 및 g/L 단위의 글루코스 농도를 나타낸다.
도 9: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a(빈 것)의 배양물(전-배양 2)의 성장을 나타내는 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)로서 측정되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도 및 pH 값의 변화를 나타낸다.
도 10: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a(빈 것)의 배양물(전-배양 3, 전-배양 1의 글루코스 처리된 접종원)의 성장을 나타내는 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)를 측정함으로써 확인되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도 및 g/L 단위의 글루코스 농도를 나타낸다.
도 11: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a(빈 것)의 배양물(전-배양 3, 전-배양 1의 글루코스 처리된 접종원)의 성장을 나타내는 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)를 측정함으로써 확인되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도 및 pH 값의 변화를 나타낸다.
도 12: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a의 야생형 균주(전-배양 1)와 인공적으로 변형된 암 백신 생산 균주(Salmonella typhi Ty21a: pVAX10.VR2-1, VXM01)의 성장을 비교하여 나타낸 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)로서 측정되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도를 나타낸다.
도 13: 글루코스의 규칙적인 첨가(최종 글루코스 농도는 2.5 g/L로 조정됨) 및 미첨가에 따른, Salmonella typhi Ty21a의 야생형 균주(전-배양 2)와 인공적으로 변형된 암 백신 생산 균주(Salmonella typhi Ty21a: pVAX10.VR2-1, VXM01)의 성장을 비교하여 나타낸 그래프이다. 세포 성장은 600nm에서의 OD(OD600)를 측정함으로써 확인되었다. 화살표는 글루코스의 첨가(규칙적인 첨가)를 나타낸다. X-축은 배양 시간을 시간(h)단위로 나타내고; Y-축은 OD 단위로 측정된 세포 밀도를 나타낸다.
이하 본 발명의 상세한 설명 및 그에 포함되어 있는 실시예를 참조함으로써 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있다.
1) 야생형 Salmonella typhi Ty2 및 약독화 Salmonella typhi Ty21a
본 방법에서는 임의의 약독화 Salmonella typhi 균주를 사용할 수 있다. 약독화된 S. typhi Ty21a 균주는, Vivotif®(스위스 소재 Crucell 회사 Berna Biotech Ltd.에서 제조함)로도 알려져 있는 활성 물질 Typhoral L®이다. 이것은 현재 유일하게 허가받은 장티푸스용 생 경구 백신이다. 이 백신은 40개 이상의 국가에서 허가되었다. Typhoral L®의 마케팅 허가 번호는 1996년 12월 16일자 PL 15747/0001이다. 백신의 1회 투여량은 2×109 CPU이상의 살아있는 typhi Ty21a 및 5×109 이상의 생존 불가능한 typhi Ty21a 세포를 함유한다. 백신 균주는 발효조 내에서 제어된 조건 하에 효모 추출물 다이제스트(digest), 카제인 산 다이제스트, 글루코스 및 갈락토스를 함유하는 배지에서 성장한다.
Salmonella typhi Ty21a 박테리아 균주가 가지는 생화학적 특성 중 하나는, 본 발명에 따라 사용될 때, 갈락토스 대사가 불가능하다는 것이다. 재조합된 약독화 박테리아 균주는 또한 황산염(sulfate)을 황화물(sulfide)로 환원하지 못하며, 이것이 야생형 Salmonella typhi Ty2 균주와의 차이점이다. Salmonella typhi Ty21a 균주의 혈청학적 특징을 살펴보면, 균주는, 박테리아의 외막 다당류인 O9-항원을 함유하는 반면 Salmonella typhi Ty2의 특징적인 요소인 O5-항원을 결여하고 있다. 또한, 이러한 혈청학적 특징은, 배치 방출에 대한 동일성 테스트의 패널에서 합리적인 테스트를 포함하고 있다는 근거가 된다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 성장하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주는, 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR-2)의 진핵생물 발현 카세트를 코딩하는 플라스미드 DNA인 pVAX10.VR2-1의 복제본을 하나 이상 함유하는 Salmonella typhi Ty21a이다. 이러한 약독화 변이체 균주는 VXM01로 표시되며, 경구 암 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 약독화 Salmonella typhi Ty21a 균주는, VXM01로 표시되는 DNA 백신의 경구 투여시, 이종 항원 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR-2)를 코딩하는 플라스미드 DNA의 박테리아성 캐리어로 작용한다.
플라스미드 DNA 기술에 기반한 백신의 수송은, 점막성 면역 반응 조직적 면역 반응 모두에서 광범위한 스펙트럼을 나타낸다. 살아있는 복제 백터는 지질다당류(LPS)와 같은 그들 고유의 면역 조절 요소를 인-시튜 생산하며, 이는 마이크로캡슐화(microencapsulation)와 같은 다른 투약 형태에 비해 유리하게 작용할 수 있다. 나아가, 자연적인 침입 경로를 사용하면 유리하다는 것이 입증되는데, 왜냐하면, Salmonella와 같은 많은 박테리아가 페이에르 판(Peyer's patch)의 M 세포를 통해서 소화관 내강(gut lumen)으로부터 빠져나가 최종적으로 림프절 및 비장 내로 이동하고, 그에 따라 백신을 면역 시스템의 유도 지점으로 타겟팅할 수 있기 때문이다. Salmonella typhi Ty21a 백신 균주는 오늘날까지 뛰어난 안정성 프로파일을 가지는 것으로 입증되어 있다. 박테리아는, M 세포를 통해 소화관 내강으로부터 방출되면, 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell)와 같은 식세포(phagocytic cell)에 의해 받아들여진다. 이들 식세포는 병원체에 의해 활성화되고 분화되기 시작하며, 대체로 림프절 및 비장 내로 이동한다. S. typhi Ty21a 균주 박테리아는, 약독화 변이 때문에, 이들 식세포 내에서 살아남을 수 없으며, 이 시점에서 죽게 된다. 현재까지는, S. typhi Ty21a가 조직적으로 혈류에 들어갈 수 있음을 나타내는 유효한 데이터가 존재하지 않는다. 따라서, 생 약독화 Salmonella typhi Ty21a 백신 균주는 뛰어난 안정성 프로파일을 나타내면서 면역 시스템의 특정 타겟팅을 가능하게 한다.
타겟 항원을 코딩하는 DNA를 수송하는 생 약독화 박테리아 캐리어는 이들 항원의 경구 투여를 위한 수송수단으로 사용될 수 있다. 생 복제 벡터는 지질다당류(LPS)와 같은 그들 고유의 면역 조절 요소를 인-시튜 생산하며, 이는 마이크로캡슐화와 같은 다른 투약 형태에 비해 유리하게 작용할 수 있다.
유전적 면역법은 종래의 백신보다 유리할 수 있다. 타겟 DNA는 상당한 기간에 걸쳐 검출될 수 있고, 따라서 항원의 저장소로 작용할 수 있다. 일부 플라스미드의 시퀀스 모티프, 예를 들면 GpC 섬(GpC island)은, 면역촉진성이고, LPS 및 다른 박테리아성 성분에 기인한 면역촉진에 의해 증진된 보조제(adjuvant)로 작용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 재조합 Salmonella 박테리아는, M 세포를 통해 소화관 내강으로부터 방출되면, 식세포에 의해 받아들여진다. 이들 식세포는 병원체에 의해 활성화되고 분화되기 시작하며, 대체로 림프절 및 비장 내로 이동한다. 이 기간 동안, 박테리아는 이들의 약독화 변이 때문에 죽게 되어 플라스미드-기반의 진핵생물 발현 벡터를 방출하고, 플라스미드는 특정 수송 시스템 또는 엔도솜 누출(endosomal leakage)에 의해 시토졸(cytosol)로 이송된다. 최종적으로, 벡터는 핵 내로 들어가고, 핵 내에서 전사되어 숙주 세포의 시토졸에 항원을 발현시킨다. 이종 항원에 대항하는 특정 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)는, 바람직하게는 인간 VEGFR-2이고, 활성화된 항원 표출 세포(antigen presenting cell, APC)에 의해 유도된다.
일 실시예에서, Salmonella typhi Ty21a 균주에 의해 수송된 재조합 DNA 분자는 플라스미드 DNA인 pVAX10.VR2-1(7.58 kb)이며, 숙주세포 내에서 VEGFR-2 단백질의 효율적인 전사를 보장하기 위한 진핵생물 인간 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV), 및 박테리아 숙주 내에서의 증식을 보장하기 위한 진행생물 복제 오리진(ori)을 함유한다. 벡터 pcDNA3은 상업적으로 이용가능하고(Invitrogen), 규제 사항에 따르기 위해 변형되었으며, 그에 따라 E. coli 내에서 복제하는 데 필요하지 않은 서열 또는 포유류 세포에서 재조합 단백질을 발현하는 데 필요하지 않은 서열은 제거되어, 인간 게놈(genome)에 상동성을 가질 수 있는 DNA 서열로 제한되었고, 염색체적인 통합의 가능성을 최소화하였다. 나아가, 카나마이신 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자로 치환된다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주 VXM01에 있어서, pVAX1-Flk-1 플라스미드의 고-복제 pUC 오리진이 pVAX10.VR2-1의 저-복제 오리진으로 대체되었다. 저-복제 변형은 대사 부담을 감소시키기 위해서 수행되었고, 플라스미드 구조물을 더욱 안정화시킨다. 플라스미드 pVAX10.VR2-1 구조물에 대한 상세한 설명은 도 2에 서술되어 있다.
2) 혈관 내피 성장 인자 수용체
혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, VEGF)(Kd 75-760 pM)는, 도관 시스템, 특히 혈관 및 림프관의, 복합 구성성분의 성장 및 분화를 조절하는 6개의 구조적으로 연관된 단백질(VEGF-A(VEGF로도 알려짐), -B, -C, -D, -E 및 PLGF(placental growth factor, PGF 또는 PIGF-2로도 알려짐)) 패밀리의 구성원이다. 혈관신생에서 VEGF의 역할은 이들 단백질과 VEGFR-2의 상호작용을 통해 매개되는 것으로 나타난다. 키나아제-삽입-도메인-함유 수용체(kinase-insert-domain-containing receptor, KDR)로도 알려진 VEGFR-2는, 1,356 아미노산 길이이고, 200-230 kDa의 분자량을 가지며, VEGF, VEGF-C 및 VEGF-D에 대한 고-친화성 수용체이다. 인간에서 티로신 키나아제 수용체 VEGFR-2에 대한 내피 cDNA의 스크리닝을 통해 확인된 서열은, 과거 발견된 쥐의 VEGFR-2(태아 간 키나아제 1(Flk-1)로도 알려짐)와 85%의 서열 동일성을 나타낸다. VEGFR-2는, 내피 세포, 초기 조혈 줄기세포 및 탯줄 스트로마(umbilical cord stroma)뿐만 아니라, 내피 전구체 및 조혈 전구체에서도 일반적으로 발현된다. 그러나, 성인 혈관계(vasculature)에서는 발현되지 않으며, VEGFR-2 mRNA는 하량 조절되는 것으로 나타난다.
VEGFR-2의 세포 외 도메인은 18개의 잠재적인 N-결합된 글리코실화(glycosylation) 부위를 함유한다. VEGFR-2는, 처음에 150 kDa의 단백질로 합성되고, 신속하게 글리코실화되어 200 kDa의 중간체 형태가 되며, 느린 속도로 더 글리코실화되어 230 kDa의 성숙한 단백질이 되어 세포 표면에 발현된다.
pVAX10.VR2-1 플라스미드에 클로닝 된 cDNA 서열을 코딩하는 인간 VEGFR-2의 아미노산 서열은 도 1에 도시하였다.
3) 빈 Salmonella typhi Ty21a 및 변형된 Salmonella typhi Ty21a 의 제조
본 발명에 따른 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 제조 방법은, 아미노산 및 펩티드의 원료로서 펩톤을 포함하는 배지에서 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 적합한 배지는, 비 제한적으로, 표준 TSB 배지 및 비-동물성의 TSB 배지를 포함한다. 일반적으로, TSB 또는 TSB-유사 배지 내 초기 글루코스 양은, 약독화된 Salmonella typhi 균주의 3-5 시간 배양 후에 거의 완전히 소모되며, 배양 배지 내에 거의 일정한 글루코스 수준을 유지하기 위해서 매 3-5시간마다 새로운 글루코스로 대체되어야만 한다. 선택적으로 이종 항원을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 동안 글루코스를 첨가하지 않으면 글루코스를 첨가하면서 배양한 경우에 비해서 세포 성장이 증가함을 발견한 것은 매우 놀랍고, 이러한 발견은 박테리아 세포 내 특정 대사 경로가 글루코스의 부재에 의해 촉발된다는 것을 시사한다. TSB 또는 TSB-유사 배지가 배양 과정의 초기에 글루코스를 전혀 함유하고 있지 않은 경우에도, 전술한 효과가 역시 관찰될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은, 높은 세포 수율 및 그에 따른 높은 최종 DNA 백신 수율을 얻을 수 있다는 것 외에도, 발효가 일어나는 동안 글루코스 공급 단계를 불필요하게 함으로써 더욱 경제적이고 더욱 단순하다는 이점이 있다.
본 발명에 따라 수행되는 약독화 변이체 Salmonella typhi Ty21a 균주의 전형적인 제조 공정은 하기 표 1에 기술하였다.
제조 공정
세포 I (Salmonella typhi Ty21a, 야생형) 또는
세포 II(Salmonella typhi Ty21a- pVAX10.VR2-1)
↓
2×500 ml TSB + 카나마이신 (500㎕)
(OD600 > 0.3)
↓
10×1000 ml TSB + 카나마이신 (75ml)
(OD600 ≥ 0.5)
100 L 발효 부피
TSB + 0.001% 갈락토스
- 30℃
- 기체유속 100L/min (1vvm)
- 압력은 제어되지 않음
- NaOH로 제어된 pH 7.0
- 제어된 포말 (Corning)
- 교반에 의해 조절된 pO2 ≥ 40%
- 최소 200rpm으로 교반함
- 글루코스 미공급
- 최종 OD600nm (지수 증식기의 끝)
- 채취 전 25℃ 이하로 냉각
교차 유동 여과(Cross flow filtration)
- 10배 농축
- 15% 수크로스, 0.45% 아스코르브산염 용액 pH 7.2로
정용여과(diafiltration)시 10배 완충액 교환,
뒤이어 본래 채취물의 1/20 부피로 추가적인 농축
- 약 24시간에 걸쳐 2-8℃에서 저장
보다 상세한 설명: 배양물(TSB 배지 + 25 ㎍/ml 카나마이신)을 salmonella 균주의 상이한 샘플(빈 Ty21a 및 재조합 Ty21a(pVAX10.VR2-1))로 각각 접종하였다. 세포 샘플의 제조시에, 글루코스를 2.5-3.0 g/L, 바람직하게는 2.5 g/L 함유하는 TSB 배지를 사용하였다. 하나의 제어 배지에서, 글루코스를 배제하였다. 나아가, 배지는 카나마이신을 바람직하게는 25 ㎍/ml 함유하였다. 배양물은 30±2℃에서 OD값이 OD600nm < 0.1에 도달할 때까지 교반하면서 배양하였다. 더욱 상세한 설명은 실시예에 기술되어 있다.
제1 및 제2 전-배양 단계에 대한 공정-내 제어는, 배양 시간의 종료시에, OD600nm, pH 및 CFU/ml의 측정에 의해서뿐만 아니라, 가능하다면, 플라스미드 안정성(PST)의 확인 및 박테리아 시험에 의해서, 박테리아의 성장을 분석하는 것을 포함한다. 후자의 분석은, 배양조건이 까다로운 병원성 미생물의 용혈 반응을 확인하기 위한 혈액 배지 분석(blood agar assay)에 기반한다. CFU 값은 교차 유동 여과(cross flow filtration, CFF)의 전후에 측정된다. 최종 박테리아 농도를 공식화할 때, 최저 박테리아 농도에서 CFU 및 굴절률이 측정된다.
글루코스 공급이 배제되는 본 발명에 따른 방법은, 덜 노동집약적이고 더욱 효율적이며, 높은 세포 수율을 가져온다.
4) 세포를 배양하는 동안 클루코스 공급이 미치는 영향
TSB 또는 TSB-유사 배지에서, 0 내지 30 시간 동안, 25 내지 35 ℃, 바람직하게는 30 ℃에서, pH 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 pH 7.0 하에 세포를 배양함으로써, 빈 Salmonella typhi Ty21a 또는 변형된 Salmonella typhi Ty21a의 세포 성장을 시험하였다. 세포 성장은 OD 또는 CFU/ml로 측정되었다.
이들 실험의 결과는, 글루코스의 소모에도 불구하고, 글루코스의 첨가가 야생형 균주의 높은 OD-값/세포량 수율을 가져오지 않음을 나타낸다. 대조적으로, 글루코스를 첨가하지 않은 플라스크에서는 높은 OD값에 도달하였다(전-배양 1에서는 6, 전-배양 2에서는 8). 글루코스를 첨가하지 않은 경우의 성장과 대조적으로, 글루코스를 첨가한 경우에는, 약 1시간 후에, OD가 그대로 유지(또는 오히려 약간 감소)되었다. 글루코스를 반복적으로 공급하면, 글루코스 소모가 감소되지만, 성장에 미치는 어떤 부가 효과/상가 효과도 관찰되지 않았다. 발효가 일어나는 동안 pH 값 역시 모니터링하였고, 변화가 관찰되면 일부 실험에서는 초기 pH값으로 조정하였다.
글루코스를 첨가하지 않은 경우, 글루코스의 고갈 후에 pH가 염기성으로 변화하는 것이 관찰되었고, 반면, 글루코스를 공급한 경우, pH 값이 떨어졌다(전-배양 1에 대하여 도 7 및 전-배양 2에 대하여 도 9를 비교하라). 모든 전-배양에서 세대 숫자에 어떤 영향도 미치지 않음을 나타내는 현상이 관찰되었다. 글루코스의 규칙적인 공급은, 최대 30시간의 평균 배양 시간 동안 1-5 회(바람직하게는 1-3 회) 이루어졌다. 세포 배양물의 초기 조건에 따라 다르지만, 일반적으로, 약 5-15시간 후에, 세포 성장은 지수 증식기를 지나 안정기에 접어들었다. 글루코스를 규칙적으로 공급한 전-배양물을 새로운 배지에 주입한 경우, 동일한 성장 특성(글루코스의 미첨가시, 높은 OD 값/염기성으로의 pH 변화)이 관찰되었다.
배지 시스템이 완충액이라고 하더라도, 성장기에 또는 처음부터 초기 배지에 글루코스의 공급을 배제함으로써, pH 값이 염기성(약 7 내지 약 8)으로 변화하는 것을 관찰할 수 있다. 세포가 성장하는 동안 본래의 초기 pH인 약 7.0으로 pH 값을 조정하는 것이 바람직할 수 있다.
결과는, 비교 하한(약 2.5 g/L)을 초과하는 클루코스 농도가 (글루코스) 대사에 가역 변화를 촉발함을 나타내었다. 어떤 이론에 의하여도 한계지어지기를 원하지 않으며, 글루코스 양이 다시 촉발 수준 이하로 감소하는 경우에도, 아직 확인되지 않은 물질이 배지 내로 분비되어 추가적인 성장을 저해하는 것으로 추정된다. 새로운 배지에 접종된 후에, 이 물질은 유효성을 나타내는 수준 미만의 농도로 희석된다. 초기 배지가 글루코스를 전혀 함유하고 있지 않은 경우에도 매우 유사한 결과가 관찰될 수 있다.
흥미롭게도, 동일한 결과가 빈 Salmonella typhi Ty21a에서뿐만 아니라 변형된 Salmonella typhi Ty21a - pVAX10.VR2-1(VXM01)에서도 관찰될 수 있으며, 이는 인공적으로 변형된 박테리아 구조체에 의해서도 이러한 놀라운 효과는 영향을 받지 않음을 나타낸다. 다만, 도 12에서 확인할 수 있듯이, 글루코스 공급을 배제한 경우 변형된 박테리아의 세포 성장은, -예상한 것처럼- 야생형 균주보다 느리지만, 최종적으로는 야생형 균주와 비교할 때 동일하게 높은 OD 값(OD 7-8)을 얻을 수 있고, 반면, 글루코스의 규칙적인 공급에 의해 글루코스의 존재 하에 배양된 변형된 Salmonella 균주는 이러한 높은 OD 값을 얻지 못하고, OD 3 이하의 세포 밀도에 그친다.
빈 S. typhi Ty21a 균주 및 변형된 S. typhi Ty21a 균주 모두, 글루코스 첨가 성장 및 글루코스 미첨가 성장에 있어서, 유사한 성장 특성을 나타낸다.
요약하면, 전술한 그리고 후술할 본 발명의 결과는, 양 균주에 있어서, 글루코스의 첨가가 높은 OD 값/세포량 수율을 가져오지 않는다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 글루코스를 첨가하지 않은 플라스크에서는 높은 OD 값에 도달하였다. 글루코스를 첨가하지 않은 경우, 글루코스의 고갈 후에 pH가 염기성으로 변화하는 것이 관찰되지만, 반면, 글루코스를 공급한 경우에는 pH 값이 떨어진다. Salmonella typhi Ty21a의 배양시 대사에 있어서 글루코스 농도 의존적 변화의 한 가지 효과는, 추측건대, 성장 배지 내로 아직까지 알려지지 않은 저해 물질을 분비함에 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 갈락토스 에피머라제 활성이 결여되고 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은, 발효 수준 규모에서 거의 중성인 초기 pH 값 하에 펩톤을 포함하는 완충 배지에서 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하고, 발효가 일어나는 동안 배지 내의 글루코스 양은, 안정기에 도달하기 전에 글루코스 양이 0으로 감소하도록, 조절된다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 "포함하며, 단 그에 제한되지는 않는"을 의미한다. 이 용어는 개방형(open-ended)이고, 임의의 언급된 특징, 요소, 정수, 단계 또는 구성성분의 존재를 구체화하기 위한 것으로 의도되며, 하나 이상의 다른 특징, 요소, 정수, 단계, 구성성분 또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하려는 것이 아니다. 따라서, 용어 "포함하는"은 더욱 제한적인 용어 "구성되는" 및 "필수적으로 구성되는"을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "약" 또는 "대략"은, 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 대안적으로 10% 이내를 의미하며, 5% 이내를 포함한다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에 있어서, 용어 "약"은 주어진 값의 약 1 로그 이내(즉, 자릿수)를 의미하며, 2배 이내를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "성장" 및 "배양"은 동의어로 사용되며, 미생물의 성장이 일어나는 배지 내에서의 그들의 증식을 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "발효"는 미생물의 대규모 배양을 의미하며, 발효는 전형적으로는 발효조, 즉, 대사 산물 및 미생물 그 자체를 포함하는, 원하는 미생물 생성물을 고-수율로 생산하기 위해서, 미생물의 성장을 위한 최적의 조건을 유지하는 장치 내에서 수행된다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "약독화"는, 약독화 변이를 내재하지 않는 부모 박테리아 균주에 비해서 독성이 감소된 박테리아 균주를 의미한다. 약독화 박테리아 균주는 바람직하게는 그들의 독성을 잃지만, 방어 면역을 유도하는 그들의 능력은 여전히 보유한다. 약독화 박테리아는, 자연에서 발견될 수도 있고, 또는, 예를 들면, 새로운 배지나 세포 배양물에 적응함으로써 또는 재조합 DNA 기술에 의해, 실험실에서 생산될 수도 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "변이체 균주"는 게놈 내에 변이를 함유하는 박테리아 균주를 의미한다. 이 문맥에서, 용어 "변이"는, 점 돌연변이(point mutation), 삽입, 결손, 전좌(translocation) 및 역위(inversion)를 포함하는, 핵산 서열의 변화를 의미한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "재조합 DNA 분자"는 변형된 DNA 구조체를 의미하며, 바람직하게는 다양한 기원을 갖는 DNA 조각들로 구성된다. 재조합 DNA 분자는 선형 핵산일 수 있고, 또는 바람직하게는, 원하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 발현 벡터 플라스미드에 도입한 원형 재조합 DNA 플라스미드일 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 이종 항원이다. 이종 항원은 바람직하게는 암 항원이다. 암 항원은 바람직하게는 VEGF 수용체 단백질이다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "이종 항원"은 Salmonella typhi 이외의 종에서 유래한 항원을 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "발현 카세트"는, 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열의 제어 하에 있는 유전자를 하나 이상 포함하는 핵산 단위를 의미한다. 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주에 포함된 발현 카세트는, 바람직하게는, 포함된 오픈 리딩 프레임의 타겟 세포에서의 전사를 매개할 수 있다. 발현 카세트는 전형적으로, 프로모터, 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 및 전사 종료 신호를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "펩톤"은, 단백질-함유 물질의 가수분해, 예를 들면, 생 단백질 혼합물의 부분 산성 가수분해 또는 효소적 가수분해에 의해 생성된, 아미노산 및 펩티드를 포함하는 절단 생성물의 혼합물을 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "거의 중성인 pH 값"은 약 5 내지 약 9의 pH 값을 의미하며, 바람직하게는 약 6 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5, 가장 바람직하게는 약 7.0의 pH 값을 의미한다.
본 발명의 방법에 적합한 배지는, 비 제한적으로, 표준 TSB 배지 및 비-동물성의 TSB 배지를 포함한다. 당업계에 알려진 표준 TSB 배지는, 췌장 카제인 펩톤, 콩 분말 펩톤, 인산수소이칼륨(완충액), 염화나트륨, 및 에너지원으로서 초기 농도 2.5 g/L의 글루코스(=덱스트로스)를 포함한다. 비-동물성의 TSB 배지로 적합한 예는, 비-동물성의 CASO Bouillon으로서, 비-동물성의 펩톤, 인산수소이칼륨(완충액), 염화나트륨, 및 초기 농도 2.5 g/L의 글루코스를 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "안정기"는, 지수 증식기 또는 대수 증식기 후에, 성장 배지 내 세포 밀도가 거의 일정하게 유지되는, 박테리아의 성장 단계를 의미한다. 따라서, 용어 "안정기에 도달하기 전에"는 안정기 이전의 임의의 시점을 의미하며, 적응기(즉, 박테리아 성장의 제1 단계로서, 박테리아가 성장 조건에 적응하는 단계) 및 지수 증식기를 포함한다. 본 발명의 방법에 따른 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양에서 지수 증식기가 연장되는 것을 발견한 것은 놀라웠다. 발효가 일어나는 동안 글루코스를 첨가하지 않고 대수 증식기 동안에 고갈되는 초기 글루코스 양만으로 약독화 변이체 Salmonella typhi Ty21a 균주를 배양하면, 배양시간이 9시간이 지나기 전에는 안정기에 도달하지 않고, 바람직하게는 9 내지 20 시간의 배양 후에, 더욱 바람직하게는 9 내지 15시간의 배양 후에, 가장 바람직하게는 9 내지 12시간의 배양 후에 안정기에 도달한다.
발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스가 전혀 첨가되지 않으며, 초기 글루코스 양은 안정기에 도달하기 전에 고갈된다. 그러나, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하기 위한 방법으로서, 글루코스 양이 안정기에 도달하기 전에 0으로 감소하는 한, 글루코스를 첨가하는 방법 역시 본 발명의 대상이다.
본 발명의 문백에서, 용어 "글루코스의 고갈"은 배지 내 초기 글루코스 양이 박테리아에 의해 소모되는 것(즉, 받아들여지고 대사됨)을 의미한다.
일 실시예에서, Salmonella typhi의 약독화 변이체 균주는 Salmonella typhi 21a이다.
일 실시예에서, 발현 카세트는 진핵생물 발현 카세트이다. 충분한 면역 반응을 유도하는 데 필요한 만큼의 이종 항원은 박테리아에 유독성일 수 있으며, 세포사, 과-약독화 또는 이종 항원 발현의 상실을 초래할 수 있음이 알려져 있다. 박테리아 벡터에서는 발현되지 않고 오직 타겟 세포에서만 발현되는 진핵생물 발현 카세트를 사용함으로써 이러한 독성 문제를 극복할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "진핵생물 발현 카세트"는 진핵 세포에서 오픈 리딩 프레임의 발현을 허용하는 발현 카세트를 의미한다. 진핵생물 발현 카세트는, 진핵 세포에서 오픈 리딩 프레임의 발현을 조절할 수 있는 조절 서열, 바람직하게는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 본 발명에서 백신으로 사용하기 위한 Salmonella typhi 균주에 포함된 재조합 DNA분자에 포함되어 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는, 바람직하게는 면역될 대상의 세포 내에서 작용할 수 있도록 선택된다. 본 발명의 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주에 유용한 프로모터의 예는, 특히 인간용 DNA 백신의 생산에 있어서, 비 제한적으로, Simian Virus 40(SV40) 유래 프로모터, Mouse Mammary Tumor Virus(MMTV) 프로모터, Human Immunodeficiency Virus(HIV) 프로모터, 예를 들면 HIV Long Terminal Repeat(LTR) 프로모터, Moloney virus 프로모터, Cytomegalovirus(CMV) 프로모터, 예를 들면 CMV immediate early 프로모터, Epstein Barr Virus(EBV) 프로모터, Rouse Sarcoma Virus(RSV) 프로모터 및 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자에서 유래한 프로모터 등이 있다. 일 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는 CMV 프로모터를 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "CMV 프로모터"는 급-초기 시토메갈로바이러스 프로모터를 의미한다.
적합한 폴리아데닐화 신호의 예는, 특히 인간용 DNA 백신의 생산에 있어서, 비 제한적으로, BGH 폴리아데닐화 부위, SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명의 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주에 포함된 재조합 DNA 분자에 포함되어 있는 진핵생물 발현 카세트는 BGH 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
예를 들면 프로모터 및 폴리아데닐화 부위와 같이, 이종 항원 등의 이종 유전자의 발현에 필요한 조절 요소에 더하여, 다른 요소들도 재조합 DNA 분자에 포함될 수 있다. 이러한 추가적인 요소는 인핸서(enhancer)를 포함한다. 인핸서는, 예를 들면, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근 크레아틴의 인핸서 및 CMV, RSV 및 EBV에서 유래한 바이러스성 인핸서일 수 있다.
조절 서열 및 코돈은 일반적으로 종에 따라 다르고, 따라서 단백질 생산을 최대화하기 위해, 조절 서열 및 코돈은, 바람직하게는, 당해 종이 면역되는 데 효과적이도록 선택된다. 당업자는 주어진 대상 종에서 작용하는 재조합 DNA를 생산할 수 있다.
일 실시예에서, 발현 카세트는 VEGF 수용체 단백질을 코딩한다.
VEGF 수용체 단백질은 내피 세포-특이적 수용체-티로신 키나아제로서, 리간드 혈관 내피 성장 인자(ligand vascular endothelial growth factor, VEGF)에 의해 결합될 수 있고, 리간드 혈관 내피 성장 인자는 인산기전이(transphosphorylation)를 통해 VEGF 수용체 단백질을 이량화(dimerize)하여 활성화되도록 한다. VEGFR의 세 가지 주요 서브타입인, VEGFR-1(또는 FLT1), VEGFR-2(또는 KDR, FLK1) 및 VEGFR-3(또는 FLT4)가 존재한다. 막-결합성(membrane-bound) VEGF 수용체는, 7개의 면역글로불린-형 도메인, 단일 막횡단 스패닝 구역(transmembrane spanning region) 및 갈라진 티로신-키나아제 도메인을 포함하는 세포내 부분으로 구성된 세포외 단백질을 갖는다. VEGFR 전사체는, 수용성 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는, 대안적인 스플라이스 이형체(alternative splice variant) 역시 생산한다. 성장인자 중 VEGF 패밀리는 6 종류의 패밀리 구성원, 즉, VEGF-A 내지 VEGF-E 및 PGF를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는, 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된 VEGF 수용체 단백질을 코딩한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 인간 VEGFR-2의 "상동체"는 아미노산 서열 및/또는 인간 VEGFR-2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 상이한 VEGF 수용체 단백질을 의미한다. 인간 VEGFR-2의 상동체는, 예를 들면, 다른 종의 VEGFR-2 상동체와 같이, 자연에서 기원한 것일 수도 있고, 또는 인공적으로 변형된 VEGFR-2 상동체일 수도 있다. 코돈의 사용은 종 간에 서로 다르다는 것이 알려져 있다. 따라서, 타겟 세포에 이형 단백질을 발현시킬 때, 핵산 서열을 타겟 세포의 코돈 사용에 맞추기 위해서, 코돈이 필요할 수 있고, 또는 적어도 유용하다. VEGF 수용체 단백질의 상동체를 설계 및 제작하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
VEGFR-2 상동체는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결손 및/또는 치환을 포함하는 변이를 하나 이상 함유한다. 본 발명의 내용에 따르면, 결손, 삽입 및/또는 치환된 아미노산은, 작용하는 VEGFR-2 상동체의 아미노산 서열의 길이 전체에 걸쳐 산재되어 있을 수도 있고, 또는 연속된 아미노산일 수도 있다. 본 발명의 내용에 따르면, 상동체와 인간 VEGFR-2가 80% 이상의 상동성을 가지는 이상, 임의의 개수의 아미노산이 삽입, 결손, 및/또는 치환될 수 있다. 일 실시예에서, 인간 VEGFR-2의 상동체는, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 가장 특히 95% 이상의 의 서열 상동성을 가지며, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상 및 가장 특히 75% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 결손, 삽입 및/또는 치환을 가지는 상동체를 모 서열(parental sequence)에 대하여 비교하는 것을 포함하는, 서열 동일성 및/또는 상동성을 측정하기 위한 방법 및 알고리즘은, 당업자에게 잘 알려져 있다. DNA 수준에서, 인간 VEGFR-2의 상동체를 코딩하는 핵산 서열은, 유전자 코드의 퇴화 때문에, 상당 부분 다를 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는 서열번호 1의 인간 VEGFR-2를 코딩한다.
일 실시예에서, 완충 배지는 비-동물성의 펩톤을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 완충 배지는 비-동물성의 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지이다.
본 발명의 문맥에서, "비-동물성의 펩톤"은 동물에서 기원하지 않은 자연 단백질의 부분 산성 가수분해 또는 효소적 가수분해에 의해 생성된 절단 생성물의 혼합물을 의미한다. 비-동물성의 펩톤은 오직 진핵 동물로부터 직접 유래하지 않은 구성성분만을 포함한다.
일 실시예에서, 배지의 부피는 약 10 L 이상이다.
일 실시예에서, 배지의 부피는, 약 10 L, 또는 30 L, 또는 50 L, 또는 100 L 이상이고, 약 10,000 L, 또는 1,000 L, 또는 800 L 또는 500 L 이하이다.
일 실시예에서, 배지의 부피는, 약 100 L 내지 약 500 L, 더욱 특히 약 100 L, 약 150 L, 약 200 L, 약 250 L, 약 300 L, 약 400 L 또는 약 500 L이다.
일 실시예에서, 초기 글루코스 농도는 박테리아 최소 배지의 농도에 대응하거나 그 이하이다.
일 실시예에서, 초기 글루코스 농도는 약 0 내지 약 4 g/L이다.
일 실시예에서, 초기 글루코스 농도는, 약 0 g/L, 약 0.5 g/L, 약 1 g/L, 약 1.5 g/L, 약 2 g/L, 약 2.5 g/L, 약 3 g/L, 약 3.5 g/L 또는 약 4 g/L이다.
일 실시예에서, 초기 pH 값은, 약 5, 약 6 또는 약 6.5 이상이고, 약 9, 약 8 또는 약 7.5 미만이다.
일 실시예에서, 초기 pH 값은, 약 6.5 내지 약 7.5이고, 더욱 특히 약 7.0이다.
일 실시예에서, pH 값은, 발효가 일어나는 동안, 약 6 내지 약 8, 특히 약 6.5 내지 약 7.5의 pH 값으로 조정된다.
일 실시예에서, pH 값은, 발효가 일어나는 동안, 약 6 또는 약 6.5 이상, 약 8 또는 약 7.5 이하로 조정된다.
일 실시예에서, pH 값은, 발효가 일어나는 동안, 약 6.5 내지 약 7.5, 더욱 특히 약 7.0으로 조정된다.
일 실시예에서, 성장 진행은 OD(optical density)를 측정함으로써 확인된다.
본 발명의 문맥에서, 용어 물질의 "OD" 또는 "탁도"는, 소정의 파장에서 물질을 투과한 광선에 대한 물질에 흡수되어 감소된 광선의 대수비(logarithmic ratio)를 의미한다. OD는 바람직하게는 분광 광도계(spectrophotometer)를 사용하여 측정한다. 바람직하게는, OD는, 현탁액 중의 세포, 바람직하게는 박테리아의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 가시광선이 세포 현탁액을 통과할 때, 광선이 분산된다. 분산이 더 많이 될수록 세포의 수가 더 많음을 나타낸다. 전형적으로는, 600 nm 파장에서의 OD(OD600)를 측정한다. 배양 시간에 대하여 박테리아 배양물의 특정 파장에서의 OD를 플롯팅(plotting)하면 성장 곡선이 나타나며, 이 성장 곡선은, 박테리아 성장의 여러 단계를 설명하는 데 사용될 수 있고, 또한 박테리아 배양의 증배 시간(doubling time)을 측정하는 데 사용될 수 있다. 성장 곡선은, 특정한 배양 배지에서 특정한 조건 하에 배양되는 박테리아의 특정 타입에 따라 고유한 특징을 나타낸다. 따라서 세포 현탁액의 OD를 측정함으로써 박테리아 성장의 단계를 모니터링할 수 있다. OD 측정은, 세포가 채취되어야 하는 시기인, 배양 진행의 종점, 즉, 박테리아 성장 단계의 종점을 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이 시점은 전형적으로는 중간-대수 증식기이다.
바람직한 실시예에서, 성장 진행은 배양물의 OD를 인-시튜 모니터링함으로써 또는 샘플을 추출하여 샘플의 OD를 측정함으로써 확인된다. 온라인 또는 인-시튜 장치를 이용한 박테리아 배양물의 OD의 인-시튜 모니터링에 의하면, 세포 성장을 변함없이 지속적이고 비침습적으로 모니터링할 수 있고, 오염의 위험을 최소화할 수 있으며, 번거롭고 노동집약적인 샘플의 추출을 필요로 하지 않는다.
본 발명의 방법에 따라 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하면, 안정기가 시작될 때 약 6.0 내지 약 8.0의 OD 값을 달성함을 발견한 것은 놀라웠다. 대조적으로, 발효가 일어나는 동안 약 1 g/L 내지 약 4 g/L의 거의 안정적인 글루코스 수준을 유지하도록 글루코스를 첨가하는 것을 제외하고, 유사한 발효 과정에서 동일한 균주를 배양하면, 약 3 내지 약 5.5의 OD 값을 달성한다. 따라서, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스를 첨가하지 않고 안정기 도달 전에 고갈되는 초기 글루코스 양만으로 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하면, 안정기가 시작될 때, 글루코스를 첨가하는 발효 방법에 비해서 증가된 OD 값을 달성함을 발견한 것은 놀라웠다.
또 다른 실시예에서, 성장 진행은 세포 밀도를 측정함으로서 확인된다.
바람직한 실시예에서, 세포 밀도는, 현미경으로 또는 전기 저항을 측정함으로써 또는 유동 세포 계측에 의해 확인된다. 세포 밀도는, 계수판(counting chamber) 또는 혈구계산기(hemocytometer)를 이용하여, 현미경을 통해 직접 세포를 계수함으로써 확인할 수 있다. 전기 저항에 기반한 세포 밀도의 측정은, 바람직하게는 쿨터 계수기(Coulter counter)를 이용하여 수행된다. 유동 세포 계측에 의한 세포 밀도의 측정은, 세포에 가느다란 줄기의 레이저 광선이 통과하도록 하여, 레이저 광선이 세포들과 차례차례 부딪치도록 함으로써 달성된다. 광 검출기가 세포에서 반사된 광선을 검출한다.
본 발명의 방법에 따라 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하면, 안정기가 시작될 때 약 5×1014 내지 약 8×1014의 세포 밀도 값을 달성함을 발견한 것은 놀라웠다. 대조적으로, 발효가 일어나는 동안 약 1 g/L 내지 약 4 g/L의 거의 안정적인 글루코스 수준을 유지하도록 글루코스를 첨가하는 것을 제외하고, 유사한 발효 과정에서 동일한 균주를 배양하면, 약 5×1013 내지 약 1×1014의 세포 밀도 값을 달성한다. 따라서, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스를 첨가하지 않고 안정기 도달 전에 고갈되는 초기 글루코스 양만으로 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하면, 안정기가 시작될 때, 글루코스를 첨가하는 발효 방법에 비해서 증가된 세포밀도 값을 달성함을 발견한 것은 놀라웠다.
세포 현탁액의 OD 값이 약 0.4 미만인 경우에는 세포 밀도와 정비례한다. 따라서, 보정 곡선(calibration curve)은 세포 밀도에 대한 OD를 플롯팅함으로써 얻을 수 있다. 이러한 보정 곡선은 세포 현탁액의 OD를 측정함으로써 세포 현탁액의 세포밀도를 측정하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 성장 진행은 샘플을 추출하고 한천 플레이트에 플레이팅하여 CFU(colony forming unit) 값을 측정함으로써 확인된다. 이 방법에 의해서는 오직 살아있는 세포만이 계수되는데, 이는 오직 살아있는 세포만이 한천 플레이트에 콜로니를 형성할 수 있기 때문이다.
본 발명의 방법에 따라 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하면, 안정기가 시작될 때 약 6×109 내지 약 8×109의 CFU 값을 달성함을 발견한 것은 놀라웠다. 대조적으로, 발효가 일어나는 동안 약 1 g/L 내지 약 4 g/L의 거의 안정적인 글루코스 수준을 유지하도록 글루코스를 첨가하는 것을 제외하고, 유사한 발효 과정에서 동일한 균주를 배양하면, 약 2×109 내지 약 5×109의 CFU 값을 달성한다. 따라서, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스를 첨가하지 않고 안정기 도달 전에 고갈되는 초기 글루코스 양만으로 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하면, 안정기가 시작될 때, 글루코스를 첨가하는 발효 방법에 비해서 증가된 세포밀도 값을 달성하는 것뿐만 아니라 살아있는 세포의 수도 증가됨을 발견한 것은 놀라웠다.
일 실시예에서, OD가 약 6에 도달하기 전에 세포를 채취한다.
일 실시예에서, OD가 약 5 내지 약 6일 때 세포를 채취한다.
일 실시예에서, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주는 Salmonella typhi Ty21a이고, 재조합 DNA 분자는 CMV 프로모터의 제어 하에 인간 VEGFR-2, 카나마이신 저항성 유전자 및 pMB1 ori를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 갈락토스 에피머라제 활성이 결여되고 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주에 관한 것으로서, 상기 균주는, 발효 수준 규모에서 거의 중성인 초기 pH 값 하에 펩톤을 포함하는 완충 배지에서 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능하며, 상기 방법에서, 발효가 일어나는 동안 배지 내의 글루코스 양은, 안정기에 도달하기 전에 글루코스 양이 0으로 감소하도록 조절된다.
일 실시예에서, 발효가 일어나는 동안 배지에 글루코스가 전혀 첨가되지 않으며, 초기 글루코스 양은 안정기에 도달하기 전에 고갈된다.
일 실시예에서, 발현 카세트는 진핵생물 발현 카세트이다.
일 실시예에서, 발현 카세트는 VEGF 수용체 단백질을 코딩한다.
바람직한 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는, 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 VEGF 수용체 단백질을 코딩한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 VEGFR-2를 코딩한다.
일 실시예에서, 약독화된 변이체 균주는 Salmonella typhi Ty21a이고, 재조합 DNA 분자는 CMV 프로모터의 제어 하에 인간 VEGFR-2, 카나마이신 저항성 유전자 및 pMB1 ori를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함한다.
일 실시예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 백신으로 사용하기 위한, VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi Ty21a 균주에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "백신"은 대상에 접종하면 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 의미한다. 백신은 바람직하게는 질병을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 백신은, Salmonella typhi의 약독화된 변이체 균주, 바람직하게는 S. typhi Ty21a를 포함한다. 바람직하게는, 백신은 바람직하게는 이종 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 더 포함한다. 벡터를 포함하는 이러한 백신, 예를 들면, 이종 항원을 코딩하는 DNA의 수송수단으로서 약독화 박테리아 균주를, DNA 백신이라고 지칭한다.
일 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는, 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 VEGF 수용체 단백질을 코딩한다.
바람직한 실시예에서, 진핵생물 발현 카세트는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 VEGFR-2를 코딩한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 갈락토스 에피머라제 활성이 결여된 약독화 변이체 Salmonella 백신 균주의 세포 성장을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 6.5-7.5의 초기 pH 값 하에, 카제인과 콩 분말의 효소적 다이제스트 및 2.5-3.0 g/L 이하의 초기 글루코스 양을 필수적으로 포함하는 완충 배지에서 균주를 배양하는 단계를 포함하며, 배양은, 세포 성장의 안정기에 도달할 때까지 발효 브로스(fermentation broth)에 글루코스를 전혀 첨가하지 않음으로써 수행된다. 이러한 세포 성장의 증가는, 발효가 일어나는 동안 글루코스의 완전한 고갈에 의해서만 달성되고, 최종적으로 도달할 수 있는 안정기(바람직하게는 18-20 시간 후에 도달함)에 7.5-8.0의 값을 나타내는 OD에 의해 확인되며, 이는, 발효가 일어나는 동안 발효 브로스 내에 2.0-3.0 g/L의 변함없는 글루코스 수준을 유지하도록 글루코스를 공급하는 것 외에는 동일한 조건 하에서 수행된 발효 과정에서 OD가 5.0 내지 5.5로 나타나는 것과 대조된다.
일 실시예에서, 최대 세포 성장은 20시간의 배양 후에 달성된다.
일 실시예에서, 발효가 일어나는 동안 글루코스를 첨가하지 않음으로써 5×1014 - 8×1014의 세포 밀도가 달성되고, 대조적으로, 배양시 글루코스를 첨가하면 5×1013 - 1×1014의 세포 밀도가 달성된다.
일 실시예에서, 발효가 일어나는 동안 글루코스를 첨가하지 않음으로써 발효 후에 ml 당 6×109 내지 8×109의 CFU 값이 달성되고, 대조적으로, 배양시 글루코스를 첨가한 후에는 2×109 내지 5×109의 CFU 값이 달성된다.
일 실시예에서, pH 값은, 발효가 일어나는 동안, 7.0으로 조정된다. 배지 시스템이 완충액이라고 하더라도, 성장기에 또는 처음부터 초기 배지에 글루코스의 공급을 배제함으로써, pH 값이 염기성(약 7 내지 약 8)으로 변화하는 것을 관찰할 수 있다. 세포가 성장하는 동안 본래의 초기 pH인 약 7.0으로 pH 값을 조정하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 배지는, TSB(Tryptic Soy Broth) 배지 또는 이와 동일하거나 유사한 영양분을 공급하는 배지이다.
본 발명에 따른 더욱 바람직한 실시예에서, Salmonella의 약독화된 변이체 균주는 Salmonella typhi Ty21a이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 약독화 변이체 Salmonella typhi Ty21a 암 백신 균주의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 균주는, 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR-2 또는 FLK-1)의 진핵생물 발현 카세트를 코딩하는 플라스미드 DNA의 복제본을 다수 함유하며, 상기 방법은, 본 발명의 약독화 변이체 Salmonella 백신 균주의 세포 성장을 증가시키는 방법을 포함한다.
일 실시예에서, 플라스미드 DNA는, 7,580 bp 플라스미드 DNA로서, CMV 프로모터의 제어 하에 있는 VEGFR-2의 cDNA, 카나마이신 저항 유전자 및 pMB1 ori를 포함하며, pVAX10.VR2-1로 표시된다.
실시예
실시예 1: RSL ( Research Seed Lot )의 제조를 위한 Salmonella typhi Ty21a 균주의 분리
RSL의 제조를 위한 제1 단계는, Typhoral L® 캡슐로부터 약독화 Salmonella typhi Ty21a 균주를 분리한 후, 플라스미드 DNA(pVAX10.VR2-1)로 형질전환시키는 것으로 구성되었다.
후술하는 재조합 연구에 사용할 S. typhi 스톡(stock)을 제조하기 위해서, 약독화 Salmonella enterica 혈청형 변이주 typhi Ty21a를 포함하는, 상업적으로 이용가능한 Typhoral L® 캡슐을 사용하였다. 공정은, 액체 배양 배지에 캡슐 내용물의 일부를 접종한 후, 단일 박테리아 콜로니를 분리하기 위해 액체 배양물을 한천 배지에 플레이팅하는 것으로 구성되었다. 단일 콜로니를 분리하여 액체 배양 배지에서 배양하였다. 두 개의 배양물, 즉, VAX.Ty21-1 및 VAX.Ty21-2를, 글리세롤로 제형화하였고, 나누어 담아서(1mL), 사용할 때까지 -75±5℃에서 저장하였다. 두 개의 배양물 각각의 고유성을 추가로 확인하였다.
실시예 2: 플라스미드 제작
플라스미드 합성의 원리는, 이하의 단계에 따른, 이중 가닥 체외(in vitro) 유전자 합성에 기반한다:
- 7.58kB의 전체 pVAX10-VR2.1 플라스미드 서열을 ~1.5kB의 다섯 섹션으로 세분하였다(소프트웨어 분석을 통해). 각 섹션을, 양 가닥 모두 올리고뉴클레오티드 간에 겹치는 부위를 각각 갖는, 40-50bp의 올리고뉴클레오티드로 세분하였다.
- 체외 합성된 올리고뉴클레오티드를 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 인산화하였다.
- 적합한 조건 하에서 겹치는 올리고뉴클레오티드의 어닐링(annealing) 과정을 거친 후에, Taq DNA 리가아제 효소로 정렬된 올리고뉴클레오티드를 연결하였다.
- 연결(ligation) 단계가 완료되면, 연결된 플라스미드 조각(~1.5kB)의 수율을 증가시키기 위해서, 밖을 향하는 위치(outward position)가 어닐링된 프라이머를 이용해서 PCR을 수행하였다.
- PCR 산물을 분리하기 위해서 예비적인 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 수행하였다.
- 분리된 PCR 산물을 TOPO 벡터(Invitrogen K#4575-40)에 클로닝하였고, 증식을 위해 TOP10 E.coli 세포 내에 도입하여 형질전환하였다.
- TOPO 플라스미드를 분리한 후에, 제한 및 서열 확인을 수행하였다.
- 정렬된 조각을 분리한 후에 overlap PCR을 통해서 조립하였다. 이 공정 후에, pVAX10.VR2-1 플라스미드를 선형으로 조립하였다.
- Xhol 제한 다이제스트(pVAX10.VR2-1 플라스미드에 단일 제한 부위가 존재함, 도 2.1.S.1.2.2-1 참조) 및 T4 리가아제를 통한 공유결합 후에, 증식을 위해서 E.coli를 원형 플라스미드로 형질전환하였다.
- 최종적인 플라스미드 서열을 확인한 후에, pVAX10.VR2-1 플라스미드를 S. typhi Ty21a 박테리아 균주에 도입하여 형질전환하였다.
이에 따라 플라스미드 pVAX10.VR2-1를 성공적으로 합성하였다(참조 서열에 대하여 편차가 전혀 나타나지 않음). 이 플라스미드는, 나아가, S. typhi Ty21a 박테리아 균주 분리체(Vax.Ty21-1 및 Vax.Ty21-2)를 형질전환하는 데 사용되었다.
실시예 3: 제조 공정
이하의 표 2는 발효가 일어나는 동안 글루코스의 공급/미공급에 따른 제조 공정을 요약한 것이다.
제조 공정
생산 단계 처리 이형체 A: 글루코스 공급 처리 이형체 A: 글루코스 미공급


전-배양
무균실 등급 D 및 D 중 A		 세포(pVAX10.VR2-1 유/무)
↓
350mL TSB + 카나마이신(1mL)

↓
5×550mL TSB + 카나마이신(50mL)
(OD600≥0.5)		 세포(pVAX10.VR2-1 유/무)
↓
2×500mL TSB + 카나마이신(500㎕)
(OD600>0.3)
↓
10×1000mL TSB + 카나마이신(75mL)
(OD600≥0.5)





발효
무균실 등급 D		 30L 발효 부피
TSB + 0.001% 갈락토스
- 30℃
- 기체유속 2L/min (0.07vvm)
- 압력 1bar
- NaOH로 제어된 pH 7.0
- 교반에 의해 조절된 pO2 ≥ 40%
- 글루코스 공급 ∑5-8g/L
- 최종 OD600nm ~2.7(목표 6-10)
- 채취 전 15℃ 이하로 냉각		 100 L 발효 부피
TSB + 0.001% 갈락토스
- 30℃
- 기체유속 100L/min (1vvm)
- 압력은 제어되지 않음
- NaOH로 제어된 pH 7.0
- 제어된 포말 (Corning)
- 교반에 의해 조절된 pO2 ≥ 40%
- 최소 200rpm으로 교반함
- 글루코스 미공급
- 최종 OD600nm (지수 증식기의 끝)
- 채취 전 25℃ 이하로 냉각



채취/농축/
세척
무균실 등급 D		 교차 유동 여과
- 10배 농축
- 15% 수크로스 용액으로 정용여과시 10배 완충액 교환, 뒤이어 본래 채취물의 1/15 부피로 추가적인 농축
- 약 24시간에 걸쳐 2-8℃에서 저장		 교차 유동 여과
- 10배 농축
- 15% 수크로스, 0.45% 아스코르브산염 용액 pH 7.2로 정용여과시 10배 완충액 교환, 뒤이어 본래 채취물의 1/20 부피로 추가적인 농축
- 약 24시간에 걸쳐 2-8℃에서 저장




희석/바이알( vial ) 을 채움
무균실 등급 B중 A		 5회 희석으로 150 바이알을 직접 채움
- CFU 조정
- 300mL 현탁액→150 바이알을 채움
- 30mL 현탁액을 270mL 제제 용액으로 희석, 150 2R 유리 바이알을 채움
- 1:10,000이 될 때까지 4회 희석 및 150 바이알을 채움
-고무 마개 및 알루미늄 캡으로 바이알을 밀봉
- -75±10℃에서 저장		 5회 희석으로 150 바이알을 직접 채움
- CFU 조정
- 300mL 현탁액→150 바이알을 채움
- 30mL 현탁액을 270mL 제제 용액으로 희석, 150 2R 유리 바이알을 채움
- 1:10,000이 될 때까지 4회 희석 및 150 바이알을 채움
-고무 마개 및 알루미늄 캡으로 바이알을 밀봉
- ≤-70℃에서 저장
박테리아의 성장 과정은, 25 ㎍/ml의 카나마이신을 더 함유하는 2×350 mL TSB 배지에서 수행되었다. 격벽(baffle)을 가진 2-L-에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 두 개에 각각 Salmonella typhi Ty21a 및 Ty21a (pVAX10.VR2-1) 표본(1mL)을 접종하였다. 배양물은 30±2 ℃에서 교반하면서(140 rpm) OD가 OD600nm>0.1에 도달할 때까지 배양하였다. 제1 배양물에서의 박테리아 채취물(50 mL)은 제2 배양물(전-배양 2)을 접종하는 데 사용하였고, 카나마이신(25 ㎍/ml)을 함유하는 TSB 배지 6×550 mL를 3-L-페른바흐 플라스크(Fernbach flask)에 담았다. 배양물은 30±2 ℃에서 교반하면서(180 rpm) 박테리아 배양물의 600nm에서의 OD가 ≥0.3의 값에 도달할 때까지 배양하였다. 배양 시간이 완료되면, 작업 부피가 27L인 제어된 스테인리스-스틸 발효조 내에서 제조된 주 배양물(0.001% 갈락토스를 함유하는 TBS 배지)을, 전-배양 2의 배양물에 접종하였고(박테리아 배양물의 5개의 플라스크에 나누어짐), 이하의 조건으로 30℃에서 배양하였다: 기체유속 2 L/min, 압력 1 bar, pH 7.0, pO2≥40%.
배양물 샘플의 절반에는, 초기 배양 배지 내 최종 글루코스 농도가 2.0 내지 3.0 g/L가 되도록 글루코스를 공급하였다. 글루코스 공급은 발효가 시작된 지 3-5 시간 후에 수행되었고, 매 3-5 시간마다 수 회 반복되었다.
±℃배양물 샘플의 다른 절반도 동일하게 처리하였으나, Salmonella 세포의 배양이 일어나는 동안 글루코스를 전혀 공급하지 않았다. 대조군으로서, 최초부터 글루코스를 전혀 함유하지 않은 배양 배지(글루코스가 배제된 TSB 배지)를 시험하였다.
박테리아 배양물을 15% 수크로스 용액으로 교차 유동 여과(cross-flow filtration, CFF)/디아필트레이션(diafiltration)함으로써 농축하였다. 최종 박테리아 농축물을 5회 희석하였다. 그리고 나서, 최종 박테리아 생성물을 2R 바이알에 나누어 담았고(1 mL), 바이알을 밀봉하여 라벨을 붙이고 마개를 덮은 뒤 -75±5 ℃에서 보관하였다.
제1 및 제2 전-배양 단계의 공정-중 제어는, 배양 시간이 완료되었을 때 OD600, pH 및 CFU/mL의 측정을 통해 박테리아의 성장을 분석하는 것뿐만 아니라 플라스미드 안정성(plasmid stability, PST)의 확인 및 박테리아 분석(bacterial examination)도 포함하였다. 후자의 분석은, 까다로운 병원성 미생물의 용혈 반응을 확인하기 위한 혈액 한천 시험(blood agar assay)에 기반하였다.
CFU 값은 교차 유동 여과의 전후에 측정하였다. 최종 박테리아 농축물을 제제화하여, 가장 낮은 박테리아 농도를 갖는 제제의 CFU 및 굴절률을 측정하였다.
실시예 4: 카나마이신 유무에 따른 Salmonella typhi TY21a ( pVAX10 . VR2 -1)의 성장
생 박테리아 암 백신의 생산은 Salmonella enterica 혈청형 변이주 typhi Ty21a(플라스미드 pVAX10.VR2-1를 포함함)의 발효에 기반한다. 성장 후에, 세포 현탁액을 교차 유동 여과에 의해 농축하였고 디아필트레이션에 의해 세척하였다. 세척된 세포 현탁액의 5 가지 상이한 희석액을 2R 유리 바이알에 채웠다.
이러한 플라스크 성장 실험의 목표는 다음과 같다:
- 생산 시행의 타임테이블을 계획하기 위해서 전-배양 1 및 2의 성장률을 확인하는 것
- 높은 세포 농도(OD600 값) 달성하는 데 글루코스 공급이 미치는 영향을 조사하는 것
Salmonella enterica typhi Ty21a 및 Salmonella enterica typhi Ty21a(pVAX10.VR2-1)(=균주 VMX01)의 마스터 세포 은행(master cell bank)에서 시작하여 실험을 수행하였다. 2 단계의 전-발효(VK)를 통해 발효할 접종물을 제조하였다: 전-발효 1의 발효물은 MCB로부터 직접 접종하였고; 전-발효 2의 발효물은 전-발효 1에서 유래한 대량의 발효물로 접종하였다. 2L 에를렌마이어 플라스크(전-배양 1) 및 3L 페른바흐 코닝 플라스크(전-배양 2) 내 성장 시험에서, 전-배양물을 배양하는 데 드는 시간 경과를 측정하기 위해서 성장 시험을 수행하였다. 카나마이신 유무에 따른 성장기/지수 증식기에 대한 정보를 얻기 위해서 카나마이신의 존재 및 배제 하에 전-배양을 수행하였다.
이들 다섯 개 플라스크의 성장은 도 5에 비교하여 도시하였다:
- VK1a: 3L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 0.5 mL MCB, 30℃, 120 rpm
- VK1b: 3L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 0.5 mL MCB, 30℃, 120 rpm
- VK2: 3L 코닝 플라스크 내 1,000 mL TSB 배지 + 75 mL VK1b(OD 1.6), 30℃, 120 rpm
- VK1a k: 2L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 25 mg/L 황산 카나마이신 + 0.5 mL MCB, 30℃, 120 rpm
- VK1b k: 3L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 25 mg/L 황산 카나마이신 + 0.5 mL MCB, 30℃, 120 rpm
- VK2a k: 3L 코닝 플라스크 내 1,000 mL TSB 배지 + 25 mg/L 황산 카나마이신 + 75 mL VK1a k(OD 1.8), 30℃, 120 rpm
- VK2b k: 3L 코닝 플라스크 내 1,000 mL TSB 배지 + 25 mg/L 황산 카나마이신 + 75 mL VK1a k(OD 1.8), 30℃, 120 rpm
도 5의 결과는, 2L 코닝 플라스크 또는 3L 코닝 플라스크 내에서의 성장뿐만 아니라, 카나마이신의 존재 및 배제 하의 성장 간에도 각각 유의한 차이가 존재하지 않음을 나타낸다. 전-배양 2의 배양물을 지수 증식기에 있는 세포로 접종하기 위해서, 30 ℃에서 전-배양 1의 배양 시간은 약 15 내지 23 시간(OD600 ~1-4)이어야 한다. 전-배양 2에 대한 최소 OD600(>0.5)는 2-3 시간 후에 달성되었고; 지수 증식기는 0.5 내지 3.0의 OD600 값으로 특징지어졌다.
실시예 5: 글루코스 공급 유무에 따른 Salmonella typhi TY21a (빈 것)의 성장
2L 에를렌마이어 플라스크에서 세 가지 전-배양물(1, 2, 3)의 성장을 수행하였고, 생성 균주로 2 단계 배양을 수행하였다.
전-배양 1의 배양물은 RCB로부터 직접 접종하였고; 전-배양 2의 배양물은 전-배양 1에서 유래한 대량의 배양물로 접종하였다. 카나마이신 저항성을 코딩하는 플라스미드가 존재하지 않기 때문에, 배지 내에 선택성 항생물질은 생략하였다. 전-배양 단계가 미치는 영향(세대 수)을 측정하기 위해서, 전-배양물 1 및 전-배양물 2에 반복적으로 글루코스를 공급하였고, 양자를 "미공급" 배양물과 비교하였다. 나아가, 대사 효과에 의해 조절되는 글루코스 농도의 가역성을 확인하기 위해서, 글루코스가 공급된 전-배양물 1을 전-배양물 2를 접종하는 데 사용하였다. 전-배양물 3은, 글루코스의 공급(규칙적인 공급) 하에 성장한 전-배양물 1을 새로운 TSB 배지(글루코스 첨가 또는 미첨가)에 접종한 것을 나타낸다.
도 6 내지 11에서 사용된 샘플은 다음과 같다:
- VK1a: 2L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 0.5 mL RCB, 30℃, 120 rpm
- VK1b: 2L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 0.5 mL RCB, 30℃, 120 rpm + 글루코스 첨가
- VK2a: 2L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 38 mL VK1a(OD 5.4), 30℃, 120 rpm
- VK2b: 2L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 38 mL VK1a(OD 5.4), 30℃, 120 rpm + 글루코스 첨가
- VK3a: 2L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 38 mL VK1b(OD 5.1; 최초 글루코스 첨가로부터 5시간 후), 30℃, 120 rpm
- VK3b: 2L 코닝 플라스크 내 500 mL TSB 배지 + 38 mL VK1b(OD 5.1; 최초 글루코스 첨가로부터 5시간 후), 30℃, 120 rpm + 글루코스 첨가
이들 실험의 결과는, 글루코스의 소모에도 불구하고, 글루코스를 첨가하는 것이 야생형 균주의 더 높은 OD 값/세포량 수율을 초래하지 않음을 나타낸다. 대조적으로, 글루코스를 첨가하지 않은 플라스크에서는 더 높은 OD 값(전-배양 1에서는 6, 전-배양 2에서는 8)이 달성되었다. 글루코스를 첨가하지 않은 배양과 대조적으로, 글루코스를 첨가한 배양에서는, 글루코스의 첨가 후 약 1 시간이 지나도 OD가 일정하게 유지(또는 오히려 다소 감소)되었다. 글루코스를 반복적으로 공급하면, 글루코스 소모가 감소되지만, 성장에 미치는 어떤 부가 효과/상가 효과도 관찰되지 않았다.
글루코스를 첨가하지 않은 경우에는 글루코스가 고갈된 후 pH가 염기성으로 변화하는 것이 관찰되었으나, 글루코스를 규칙적으로 공급한 경우에는 pH 값이 떨어졌다(전-배양 1에 대하여 도 7 및 전-배양 2에 대하여 도 9를 비교하라). 모든 전-배양(VK1, VK2)에서 세대 숫자에 어떤 영향도 미치지 않음을 나타내는 현상이 관찰되었다.
글루코스의 공급 하에 성장한 전-배양물을 새로운 배지(1:14 희석; VK3; 도 10, 도 11)에 접종한 경우에도, 동일한 성장 특성(높은 OD 값/글루코스 미첨가시 염기성으로의 pH 변화)이 관찰되었다.
결과는, 비교 하한(약 2.5 g/L)을 초과하는 클루코스 농도가 (글루코스) 대사에 가역 변화를 촉발함을 나타내었다. 추정하건대, 글루코스 양이 다시 촉발 수준 이하로 감소하는 경우에도, 어떤 물질이 배지 내로 분비되어 추가적인 성장을 저해하는 것으로 생각된다. 새로운 배지(VK3)에 접종된 후에, 이 물질은 유효성을 나타내는 수준 미만의 농도로 희석된다.
실시예 6: 글루코스 공급 유무에 따른, 인공적으로 변형된 암 백신 생산 균주 Salmonella typhi Ty21a ( pVAX10 . VR2 -1)(= VXM01 )의 성장
암 백신 생산 균주 VXM01에 대하여 실시예 5에서와 동일한 실험을 수행하였다. 실시예 5와의 유일한 차이점은 균주가 플라스미드 pVAX10.VR2-1로 형질전환되었다는 것이다. 이들 실험은, 글루코스 대사에 대한 생산 균주 S. typhi Ty21a:pVAX10-VR2.1(p)의 성장 특성이 플라스미드에 의해 영향을 받지 않고, 빈 균주의 성장 특성과 동일하다는 가정을 뒷받침하기 위해서 수행되었다. 양 균주의 성장 및 글루코스 공급은 도 11 및 도 12에 비교되어 있다.
결과는, 양 균주(빈 S. typhi Ty21a 균주 및 인공적으로 변형된 S. typhi Ty21a 균주)의 성장 특성이 유사함을 나타내었다. 플라스미드의 영향을 나타내는 징조는 관찰되지 않았다. 나아가, 글루코스의 공급 없이 자란 세포는 글루코스의 존재 하에 배양된 세포에 비해 다양한 형태를 나타내었고, 이들은, 글루코스의 존재 하에 성장한 세포와 비교할 때, 세포 용해의 증가 및 플라스미드 안정성(인공적으로 변형된 세포의 경우)의 감소를 나타내지 않았다.
발효가 진행되는 동안 OD600의 측정 결과
배양시간
[h]		 OD600 결과
VK1a VK1b VK2 VK1a k VK1b k VK2a k VK2b k
0 0.001 0.003 0.1 0.0 0.0 0.2 0.2
1 0.3 0.3 0.3
2.0 0.5 0.7 0.6
3.0 0.003 1.0 1.2 1.2
4.0 1.6 1.7 1.6
5.0 0.005 2.4 2.5 2.6
6.0 3.4 3.1 3.1
7.0 3.8 3.7 3.7
7.5 0.010 3.7 4.5
8.0 4.5
9.0 0.026
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0 1.6 1.8 2.1
16.0 2.2 2.6 2.8
17.0 2.8 2.8 3
18.0 3.2 3.1
19.0 3.7 3.0
20.0
21.0 5.1 4.2 3
22.0
23.0 6.1 5.3 3.1
24.0 5.9 7.3 3.8 8
25.0 6.3
26.0 6.9
27.0 7.3
28.0 7.6
30.0 7.5
39.0 7.0 7.6 3.2
발효가 진행되는 동안의 글루코스 농도
배양시간
[h]		 글루코스 농도 [g/L]
VK1a k VK1b k VK2a k VK2b k
0 2.4 2.4 2.5 2.6
1 2.5
2.0 2.4
3.0 2.3
4.0 1.7
5.0 4.8 1.0
6.0 3.9 0.1
7.0 3.1
7.5
8.0 2.2
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0 1.4 1.1
16.0 0.4 0.1
17.0 3.8
18.0 3.2
19.0 2.5
20.0
21.0 1.6
22.0
23.0 0.8
24.0 0
25.0
26.0
27.0
28.0
30.0
39.0 0.0
발효가 진행되는 동안 pH 값의 변화
배양시간
[h]		 pH 값
VK1a k VK1b k VK2a k VK2b k
0 6.8 6.8 6.5 6.5
1 6.4 6.4
2.0 6.4 6.4
3.0 6.5 6.5
4.0 6.0 6.0
5.0 6.2 6.2
6.0 5.8 5.91
7.0
7.5
8.0 5.4 5.9
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
14.0
15.0 5.7 5.6
16.0 5.6 5.6
17.0 5.7 5.4
18.0 5.8 4.4
19.0 5.7 5.3
20.0
21.0 6.1 5.2
22.0
23.0 6.6 5.1
24.0 5.7 8.28
25.0
26.0
27.0
28.0
30.0
39.0 8.0 5.1
SEQUENCE LISTING <110> VAXIMM AG Lubenau, Heinz Siede, Holger Janssen, Renate Springer, Marco <120> Method for producing high yield attenuated Salmonella strains <130> 109312P855PC <140> PCT/EP2012/xxxxxx <141> 2012-12-21 <150> EP 11400061.5 <151> 2011-12-22 <150> EP 12004995.2 <151> 2012-07-05 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1356 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro 20 25 30 Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr 35 40 45 Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60 Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser 65 70 75 80 Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn 85 90 95 Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser 100 105 110 Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser 115 120 125 Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys 130 135 140 Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser 145 150 155 160 Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg 165 170 175 Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile 180 185 190 Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser 195 200 205 Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr 210 215 220 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 225 230 235 240 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 245 250 255 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 260 265 270 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 275 280 285 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 290 295 300 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met 325 330 335 Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala 340 345 350 Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly 355 360 365 Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr 370 375 380 Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu 385 390 395 400 Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val 405 410 415 Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val 420 425 430 Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr 435 440 445 Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu 450 455 460 Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr 465 470 475 480 Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys 485 490 495 Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys 500 505 510 Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr 515 520 525 Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser 530 535 540 Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln 545 550 555 560 Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser 565 570 575 Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro 580 585 590 Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr 595 600 605 Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile 610 615 620 Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr 625 630 635 640 Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val 645 650 655 Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn 660 665 670 Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys 675 680 685 Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn 690 695 700 Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg 705 710 715 720 Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr 725 730 735 Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe 740 745 750 Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu 755 760 765 Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile 770 775 780 Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly 785 790 795 800 Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His 805 810 815 Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp 820 825 830 Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val 835 840 845 Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr 850 855 860 Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg 865 870 875 880 Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu 885 890 895 Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu 900 905 910 Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu 915 920 925 Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg 930 935 940 Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys 945 950 955 960 Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly 965 970 975 Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro 980 985 990 Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr 995 1000 1005 Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys 1010 1015 1020 Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu 1025 1030 1035 Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile 1040 1045 1050 Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro 1055 1060 1065 Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr 1070 1075 1080 Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 1085 1090 1095 Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu 1100 1105 1110 Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro 1115 1120 1125 Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp 1130 1135 1140 His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu 1145 1150 1155 His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys 1160 1165 1170 Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu 1175 1180 1185 Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu 1190 1195 1200 Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215 Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro 1220 1225 1230 Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu 1235 1240 1245 Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val 1250 1255 1260 Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu 1265 1270 1275 Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser 1280 1285 1290 Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly 1295 1300 1305 Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu 1310 1315 1320 Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser 1325 1330 1335 Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser 1340 1345 1350 Pro Pro Val 1355 <210> 2 <211> 4071 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc 60 tctgtgggtt tgcctagtgt ttctcttgat ctgcccaggc tcagcataca aaaagacata 120 cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac 180 tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc 240 gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc 300 tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat 360 tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag 420 aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 480 ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 540 agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 600 gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg 660 tataggattt atgatgtggt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa 720 aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg 780 gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag 840 tctgggagtg agatgaagaa atttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt 900 gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa gaacagcaca 960 tttgtcaggg tccatgaaaa accttttgtt gcttttggaa gtggcatgga atctctggtg 1020 gaagccacgg tgggggagcg tgtcagaatc cctgcgaagt accttggtta cccaccccca 1080 gaaataaaat ggtataaaaa tggaataccc cttgagtcca atcacacaat taaagcgggg 1140 catgtactga cgattatgga agtgagtgaa agagacacag gaaattacac tgtcatcctt 1200 accaatccca tttcaaagga gaagcagagc catgtggtct ctctggttgt gtatgtccca 1260 ccccagattg gtgagaaatc tctaatctct cctgtggatt cctaccagta cggcaccact 1320 caaacgctga catgtacggt ctatgccatt cctcccccgc atcacatcca ctggtattgg 1380 cagttggagg aagagtgcgc caacgagccc agccaagctg tctcagtgac aaacccatac 1440 ccttgtgaag aatggagaag tgtggaggac ttccagggag gaaataaaat tgaagttaat 1500 aaaaatcaat ttgctctaat tgaaggaaaa aacaaaactg taagtaccct tgttatccaa 1560 gcggcaaatg tgtcagcttt gtacaaatgt gaagcggtca acaaagtcgg gagaggagag 1620 agggtgatct ccttccacgt gaccaggggt cctgaaatta ctttgcaacc tgacatgcag 1680 cccactgagc aggagagcgt gtctttgtgg tgcactgcag acagatctac gtttgagaac 1740 ctcacatggt acaagcttgg cccacagcct ctgccaatcc atgtgggaga gttgcccaca 1800 cctgtttgca agaacttgga tactctttgg aaattgaatg ccaccatgtt ctctaatagc 1860 acaaatgaca ttttgatcat ggagcttaag aatgcatcct tgcaggacca aggagactat 1920 gtctgccttg ctcaagacag gaagaccaag aaaagacatt gcgtggtcag gcagctcaca 1980 gtcctagagc gtgtggcacc cacgatcaca ggaaacctgg agaatcagac gacaagtatt 2040 ggggaaagca tcgaagtctc atgcacggca tctgggaatc cccctccaca gatcatgtgg 2100 tttaaagata atgagaccct tgtagaagac tcaggcattg tattgaagga tgggaaccgg 2160 aacctcacta tccgcagagt gaggaaggag gacgaaggcc tctacacctg ccaggcatgc 2220 agtgttcttg gctgtgcaaa agtggaggca tttttcataa tagaaggtgc ccaggaaaag 2280 acgaacttgg aaatcattat tctagtaggc acggcggtga ttgccatgtt cttctggcta 2340 cttcttgtca tcatcctacg gaccgttaag cgggccaatg gaggggaact gaagacaggc 2400 tacttgtcca tcgtcatgga tccagatgaa ctcccattgg atgaacattg tgaacgactg 2460 ccttatgatg ccagcaaatg ggaattcccc agagaccggc tgaagctagg taagcctctt 2520 ggccgtggtg cctttggcca agtgattgaa gcagatgcct ttggaattga caagacagca 2580 acttgcagga cagtagcagt caaaatgttg aaagaaggag caacacacag tgagcatcga 2640 gctctcatgt ctgaactcaa gatcctcatt catattggtc accatctcaa tgtggtcaac 2700 cttctaggtg cctgtaccaa gccaggaggg ccactcatgg tgattgtgga attctgcaaa 2760 tttggaaacc tgtccactta cctgaggagc aagagaaatg aatttgtccc ctacaagacc 2820 aaaggggcac gattccgtca agggaaagac tacgttggag caatccctgt ggatctgaaa 2880 cggcgcttgg acagcatcac cagtagccag agctcagcca gctctggatt tgtggaggag 2940 aagtccctca gtgatgtaga agaagaggaa gctcctgaag atctgtataa ggacttcctg 3000 accttggagc atctcatctg ttacagcttc caagtggcta agggcatgga gttcttggca 3060 tcgcgaaagt gtatccacag ggacctggcg gcacgaaata tcctcttatc ggagaagaac 3120 gtggttaaaa tctgtgactt tggcttggcc cgggatattt ataaagatcc agattatgtc 3180 agaaaaggag atgctcgcct ccctttgaaa tggatggccc cagaaacaat ttttgacaga 3240 gtgtacacaa tccagagtga cgtctggtct tttggtgttt tgctgtggga aatattttcc 3300 ttaggtgctt ctccatatcc tggggtaaag attgatgaag aattttgtag gcgattgaaa 3360 gaaggaacta gaatgagggc ccctgattat actacaccag aaatgtacca gaccatgctg 3420 gactgctggc acggggagcc cagtcagaga cccacgtttt cagagttggt ggaacatttg 3480 ggaaatctct tgcaagctaa tgctcagcag gatggcaaag actacattgt tcttccgata 3540 tcagagactt tgagcatgga agaggattct ggactctctc tgcctacctc acctgtttcc 3600 tgtatggagg aggaggaagt atgtgacccc aaattccatt atgacaacac agcaggaatc 3660 agtcagtatc tgcagaacag taagcgaaag agccggcctg tgagtgtaaa aacatttgaa 3720 gatatcccgt tagaagaacc agaagtaaaa gtaatcccag atgacaacca gacggacagt 3780 ggtatggttc ttgcctcaga agagctgaaa actttggaag acagaaccaa attatctcca 3840 tcttttggtg gaatggtgcc cagcaaaagc agggagtctg tggcatctga aggctcaaac 3900 cagacaagcg gctaccagtc cggatatcac tccgatgaca cagacaccac cgtgtactcc 3960 agtgaggaag cagaactttt aaagctgata gagattggag tgcaaaccgg tagcacagcc 4020 cagattctcc agcctgactc ggggaccaca ctgagctctc ctcctgttta a 4071

Claims (16)

  1. 갈락토스 에피머라제(galactose epimerase) 활성이 결여되고 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주를 배양하는 방법으로서, 발효 수준 규모(fermentation scale)에서 거의 중성인 초기 pH 값 하에 펩톤을 포함하는 완충 배지에서 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하고, 발효가 일어나는 동안 상기 배지 내의 글루코스 양은, 안정기에 도달하기 전에 글루코스 양이 0으로 감소하도록 조절되는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발효가 일어나는 동안 상기 배지에 글루코스가 전혀 첨가되지 않고, 초기 글루코스 양은 상기 안정기에 도달하기 전에 고갈되는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주가 Salmonella typhi Ty21a인 것을 특징으로하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 카세트가, 진핵생물 발현 카세트이고, 바람직하게는 VEGF 수용체 단백질을 코딩하며, 바람직하게는 VEGF 수용체 단백질은 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체(homolog)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 인간 VEGFR-2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충 배지가 비-동물성의 펩톤을 포함하고, 바람직하게는 상기 완충 배지가 비-동물성의 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지인 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지의 부피가, 약 10 L 이상, 바람직하게는 약 10 내지 약 10,000 L, 더욱 바람직하게는 약 30 내지 약 1,000 L, 가장 바람직하게는 약 100 내지 약 500 L인 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    초기 글루코스 농도가 박테리아 최소 배지(bacterial minimal medium)의 농도에 대응하거나 그 이하이고, 바람직하게는 초기 글루코스 농도가 약 0 내지 약 4 g/L인 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 초기 pH 값이, 약 5 이상 약 9 미만이고, 바람직하게는 약 6 내지 약 8이며, 더욱 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5인 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 pH 값이, 발효가 일어나는 동안, 약 6 내지 약 8, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH 값으로 조정되는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    성장 진행이, (i) OD(optical density)를 측정함으로써, 바람직하게는 (ia) 배양물의 OD를 인-시튜(in-situ) 모니터링함으로써 또는 (ib) 샘플을 추출하여 샘플의 OD를 측정함으로써, 또는 (ii) 세포 밀도를 측정함으로써, 바람직하게는 (iia) 현미경으로 또는 (iib) 전기 저항을 측정함으로써 또는 (iic) 유동 세포 계측(flow cytometry)에 의해, 또는 (iii) 샘플을 추출하고 한천 플레이트(agar plate)에 플레이팅하여 CFU(colony forming unit) 값을 측정함으로써, 결정되는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    OD가 약 6에 도달하기 전에, 바람직하게는 OD가 약 5 내지 약 6일 때, 상기 세포를 채취하는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주가 Salmonella typhi Ty21a이고, 상기 재조합 DNA 분자가 CMV 프로모터의 제어 하에 인간 VEGFR-2, 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 pMB1 ori를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하며, 바람직하게는 인간 VEGFR-2는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주의 배양 방법.
  13. 갈락토스 에피머라제 활성이 결여되고 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주로서, 상기 균주는, 발효 수준 규모에서 거의 중성인 초기 pH 값 하에 펩톤을 포함하는 완충 배지에서 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능하며, 상기 방법에서, 발효가 일어나는 동안 상기 배지 내의 글루코스 양은, 안정기에 도달하기 전에 글루코스 양이 0으로 감소하도록 조절되고, 바람직하게는 상기 발효가 일어나는 동안 상기 배지에 글루코스가 전혀 첨가되지 않으며, 초기 글루코스 양은 안정기에 도달하기 전에 고갈되는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 발현 카세트가 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 진핵생물 발현 카세트이고, 바람직하게는 VEGF 수용체 단백질은 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되며, 특히 인간 VEGFR-2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주가 Salmonella typhi Ty21a이고, 상기 재조합 DNA 분자가 CMV 프로모터의 제어 하에 인간 VEGFR-2, 카나마이신 저항성 유전자 및 pMB1 ori를 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하며, 바람직하게는 인간 VEGFR-2는 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi 균주.
  16. 백신으로 사용하기 위한, VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 진핵생물 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 복제본을 하나 이상 함유하는 약독화 변이체 Salmonella typhi Ty21a 균주로서, 바람직하게는 VEGF 수용체 단백질은 인간 VEGFR-2 및 이와 80% 이상의 상동성을 가지는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 인간 VEGFR-2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 약독화 변이체 Salmonella typhi Ty21a 균주.
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