BR112014015706A2

BR112014015706A2 - método para o cultivo de uma estirpe mutante atenuada de salmonella typhi, estirpe mutante atenuada de salmonella typhi e salmonella typhi ty21a

Info

Publication number: BR112014015706A2
Application number: BR112014015706-5A
Authority: BR
Inventors: Heinz Lebenau; Holger Siede; Renate Janssen; Marco Springer
Original assignee: Vaximm Ag
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2020-10-27
Also published as: KR102015932B1; WO2013091898A1; US20140349274A1; CN104066834A; MX355134B; RU2014130045A; JP2015502162A; RU2631924C2; JP6251179B2; US9493738B2; SI2794849T1; CA2853656C; KR20140105028A; ZA201404501B; EP2794849B1; DK2794849T3; CA2853656A1; WO2013091898A8; PL2794849T3; IL233167A

Abstract

  MÉTODO PARA O CULTIV DE ESTIRPE MUTANTE ATENUADA DE SAMONELLA TYPHI, ESTIRPE MUTANTE ATENUADA DE WLLA TYPHI E SALMONELLA TYPHT TY21A A presente invenção se refere a um novo método para o crescimento de estirpe,q mutantes atenuadas de Salmonella tYphi desprovidas de a'tív.id'ade de galactose e.pimerase e que protege uma inolécula de DNA recombinante. O niétodo compreende a etapa' de. cultivo da referi-da estirpe ãe Salmon!e11a typhi sem a adiç.ão de glicose ao íneio durante a fermentação com uma quantidade de glicose que é esvâziâd.à àntes de atingir a fase estacionária. A invençâo se refere ain.da a èstirpes de Salmonella typhi mµtantes atenuadas que podem se'r obtidas pelo referidO métado e a uma estirpe mutante de Salmonella typlií atenüadã portado-ra de uma molécula de DNA recombinante que codífica uma proteína receptara de VEGF para uso como uma va'cina.

Description

1 / 63

MÉTODO PARA O CULTIVO DE UMA ESTIRPE MUTANTE ATENUADA DE SALMONELLA TYPHI, ESTIRPE MUTANTE ATENUADA DE SALMONELLA TYPHI E SALMONELLA TYPHI TY21A

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Esta invenção refere-se à um novo método para o crescimento de estirpes de Salmonella typhi mutantes atenuadas desprovidas de atividade de galactose epimerase e que porta uma molécula de DNA recombinante. O método compreende àa etapa de cultivar a referida estirpe de Salmonella typhi sem a adição de glicose ao meio durante a fermentação com uma quantidade de glicose que é esvaziada antes de atingir a fase estacionária. A invenção refere-se ainda a estirpes de Salmonella typhi mutantes atenuadas que podem ser obtidas pelo referido método e a uma estirpe de Salmonella typhi mutante atenuada portadora de uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína receptora de VEGFE para uso como uma vacina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Entre o número de diferentes abordagens para o desenvolvimento de vacinas, vacinas bacterianas vivas são uma das mais promissoras, já que elas imitam a rota de entrada de diversos agentes patogênicos e são capazes de provocar respostas imunitárias celulares e humorais eficazes, ao nível dos dois compartimentos, sistêmico e mucósico. Vacinas bacterianas vivas podem ser administradas por via oral ou por via masal, que oferecem as vantagens de simplicidade e segurança em comparação com a administração parentérica.

Custos de preparação de lotes são relativamente baixos e formulações de vacinas bacterianas vivas mostram alta estabilidade. A atenuação pode ser conseguida por eliminação de vários genes, incluindo virulência, regulação e genes metabólicos.

[0003] Vacinas bacterianas atenuadas não só podem ser usadas para induzir imunidade à sua estirpe patogênica correspondente, mas elas também podem ser modificadas para entregar um ou mais antígenos heterólogos.

[0004] Derivados “atenuados de Salmonella enterica são atraentes como veículos para a entrega de antígenos heterólogos ao sistema imunitário dos mamíferos, porque as estirpes de S. enterica podem potencialmente ser entregues “ através das rotas das mucosas da imunização e ter a capacidade de invadir os tecidos do hospedeiro e persistir, enquanto continua a produzir um antígeno heterólogo. Além disso, as estirpes de Salmonella provocam fortes respostas imunitárias an celulares e humorais, ao nível dos dois compartimentos, sistêmico e mucósico.

[0005] Várias estírpes de Salmonella typhimuríium atenuadas pelas mutações aro têm sido mostradas para ser veículos de distribuição seguros e eficazes para os antígenos heterólogos em modelos animais.

[0006] As abordagens de entrega de construções de DNA, que codificam antígenos heterólogos em proteínas receptoras de

VEGF em particular, por meio de estirpes de Salmonella typhimurium atenuadas vivas em células-alvo de rato, são descritas em WO 03/073995. Niethammer et al., (Nature Medicine 2002, 8(12), 1369) demonstraram que a estirpe SL7207 S&S, typhimurium aroA atenuada porta um vetor de expressão que codifica o receptor 2 (VEGFR-2 ou Flk-l) do fator de crescimento endotelial vascular do murino, o que é essencial para a angiogênese tumoral, é funcional como vacina contra o câncer.

[0007] Há, porém, apenas uma estirpe de Salmonella enterica serovar atenuada, chamada Salmonella enterica serovar typhi Ty21a (abreviação: S. typhi Ty2l1a), que foi aceita para uso em humanos,

[0008] Esta bem-tolerada vacina oral viva contra a febre tifóide foi derivada por mutagênese química isolado bacteriano de S. typhi Ty2 do tipo selvagem virulento e abriga uma mutação de perda de função no gene galE, bem como outras mutações menos definidas. Tem sido licenciada como vacina contra o tifo em muitos países depois de ter sido demonstrado ser eficaz e segura em ensaios de campo.

[0009] Há uma forte demanda para vetores de bactérias vivas atenuadas como veículos de entrega para antígenos heterólogos - especialmente antígenos de câncer - que são seguros para uso em seres humanos. O fornecimento de tal vetor de bactérias atenuado como vacina de DNA também pede o cultivo eficiente, de alto rendimento da estirpe bacteriana atenuada transformada com o referido DNA antígeno heterólogo. Transformação de estirpes de bactérias com construções de DNA recombinante muitas vezes resulta em diminuição do crescimento celular. Assim, muitas vezes é necessário melhorar oO processo preferível de cultivo em grande escala para obter elevados rendimentos de células viáveis e funcionalmente ativas.

OBJETOS DA INVENÇÃO

[0010] Um objeto da presente invenção consiste em melhorar os métodos da arte anterior para o crescimento de estirpes mutantes atenuadas de Salmonella typhi. Em particular, foi um objeto da presente invenção desenvolver um método de cultivo eficiente para a obtenção de elevados rendimentos de células de bactérias viáveis portadoras de uma molécula de DNA recombinante que codifica um antígeno heterólogo. Tal método e estirpes mutantes atenuadas de Salmonella typhi obtidos por tal método poderia servir para satisfazer a grande necessidade de estirpes de Salmonella atenuadas seguras como vacinas de DNA para utilização em seres humanos, Tal método seria Q > especialmente adequado para a produção comercial em larga escala de vacinas de DNA baseadas em estirpes de Salmonella atenuadas,.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Surpreendentemente, verificou-se que o rendimento das células de uma estirpe atenuada de Salmonella typhi sem atividade de galactose epimerase pode ser notavelmente aumentada se à quantidade de glicose no meio é reduzida à zero antes de atingir a fase estacionária. Os inventores mostraram que a adição de glicose ao meio durante a fermentação não resulta em maiores valores de massa celular/OD mais elevados. Pelo contrário, a omissão da adição de glicose durante o cultivo da estirpe de Salmonella atenuada rende densidades ópticas de cerca de 6 a 8 no início da fase estacionária do crescimento celular, em que à cultura idêntica a um nível de glicose de cerca de 1 a cerca de 4 g/l, de preferência de cerca de 2 a cerca de 3 g/l (por exemplo, conseguida por pulsamento sequencial do meio com glicose) resulta em densidades ópticas de apenas cerca de 3 a cerca de 5,5.

[0012] O método para o cultivo de uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi de acordo com a invenção proporciona ainda células de morfologia diferentes, em comparação com células cultivadas com glícose. Células Salmonella typhi cultivadas sem glicose são menores e mais curtas do que as células cultivadas com glicose. No entanto, estas células morfologicamente diferentes, como as células cultivadas num meio contendo glicose, são completamente a biologicamente ativas e não mostram qualquer tendência para a lise celular.

[0013] O aumento da produção de células obtidas por omissão da adição de glicose durante o cultivo, de acordo com o método da presente invenção, é observado independentemente do fato de a estirpe mutante atenuada selecionada de Salmonella typhi abrigar uma molécula de DNA recombinante que codifica um antígeno heterólogo (tal como pcDNA3.1-FIlIk1l ou um plasmídeo derivado do mesmo, como PpVAXIO.VR2-1) ou não (a estirpe atenuada vazia).

[0014] Assim, em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o cultivo de uma estírpe mutante atenuada de Salmonella typhi sem atividade de galactose epimerase e que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um cassete de expressão, que compreende a etapa de cultura da estirpe num meio tamponado compreendendo peptona no valor de cerca de pH neutro de partida na escala de fermentação, em que a quantidade de glicose no meio durante as fermentações é ajustada de tal modo que a quantidade de glicose é reduzida a zero antes de atingir a fase estacionária,

[0015] Numa forma de realização particular, nehuma glicose é adicionada ao meio durante a fermentação e a quantidade inicial de glicose é esgotada antes de atingir a fase estacionária,

[0016] Numa forma de realização particular, a referida estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi é Salmonella typhi Ty21la.

[0017] Numa forma de realização particular, O cassete de expressão é um cassete de expressão eucariótica. Em uma forma de realização particular, o cassete de expressão codifica uma proteína receptora de VEGF. Em uma forma de realização particular, a proteína receptora de VEGF é selecionada a partir do grupo que consiste em VEGFR-2 humana e um homólogo deste, que partilha pelo menos cerca de 80% de homologia com a mesma. Numa forma de realização preferida, o VEGFR-2 humana tem a sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1.

[0018] Numa forma de realização particular, o meio tamponado compreende peptona de origem não-animal. Numa forma de realização preferida, o referido meio tamponado é Tryptic Soy Broth (TSB) de origem não-animal.

[0019] Numa forma de realização particular, o volume do meio é de pelo menos cerca de 10 1, mais particularmente entre cerca de 10 1 à cerca de 10.000 1, mais particularmente entre cerca de 30 1 a cerca de 1.000 1, mais particularmente entre cerca de 100 1 à cerca de 500 1.

[0020] Numa forma de realização particular, à concentração de glicose de partida corresponde à de um meio mínimo de bactérias ou menos, particularmente a concentração de glicose de partida é de cerca de 0 g/1 até cerca de 4 g/1.

[90021] Numa forma de realização particular, o valor de pH de partida é de cerca de 5 a menos de cerca de 9, particularmente de cerca de 6 a cerca de 8, mais particularmente, de cerca de 6,5 a cerca de 7,5.

[0022] Numa forma de realização particular, o valor de pH é ajustado durante a referida cultura a um valor de pH de cerca de 6 a cerca de 8, especialmente para um valor de pH de cerca de 6,5 a cerca de 7,5.

[0023] Numa forma de realização particular, o progresso do crescimento é determinado por medição da densidade óptica (OD), particularmente através de um controle in situ da densidade óptica da cultura ou por recolhimento de amostras e medição da densidade óptica das amostras.

[0024] Numa outra forma de realização particular, o progresso do crescimento é determinado por medição da densidade celular, particularmente ao microscópio ou por medição da resistência elétrica, ou por citometria de fluxo.

[0025] Numa outra forma de realização particular, o progresso do crescimento é determinado pela medição do valor das unidades formadoras de colônias (UFC) por recolhimento de amostras e de plaqueamento em placas de agar.

[0026] Numa forma de realização particular, as células são colhidas antes de atingir uma densidade óptica de cerca de 6, em particular com uma densídade óptica de cerca de 5 à cerca de 6.

[0027] Numa forma de realização particular, a estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi é Salmonella typhi Ty21a e à molécula de DNA recombinante compreende o gene de resistência à canamicina, 9 pMBl ori e um cassete de expressão eucariótica que codifica para o VEGFR-2 humana, sob o controle do promotor de CMV. Em uma forma de realização particular, o VEGFR-2 humana tem a sequência de ácido nucleico tal como encontrada na SEQ ID NO 2.

[0028] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi sem atividade de galactose epimerase e que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma cassete de expressão, obtida por um método para a cultura da estirpe, que compreende a etapa de cultivar a estirpe em um meio tamponado compreendendo peptona a pH de partida cerca de neutro à escala de fermentação, em que a quantidade de glicose no meio durante as fermentações é ajustada de tal modo que à quantidade de glicose é reduzida a zero antes de atingir a fase estacionária.

[0029] Numa forma de realização particular, nenhuma adição de glicose ao meio durante à fermentação e a quantidade : inicial de glicose é esgotada antes de atingir a fase Le) estacionária.

[0030] Numa forma de realização particular, o cassete de expressão é um cassete de expressão eucariótica que codifica para uma proteína receptora de VEGF. Em uma forma de realização particular, o cassete de expressão eucariótica codifica uma proteína receptora de VEGF selecionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 humana e um homólogo deste, que partilha pelo menos cerca de 80% de homologia com à mesma. Em

/ 63 uma forma de realização particular, o VEGFR-2 humana tem a sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1.

[0031] Numa forma de realização particular, a estirpe mutante atenuada é Salmonella typhi Ty21a e a molécula de DNA recombinante compreende o gene de resistência à canamicina, o PMB1 ori e uma cassete de expressão eucariótica que codifica para o VEGFR-2 humana sob o controle do promotor de CMV. Em uma forma de realização particular, o VEGFR-2 humana tem a sequência de ácido nucleico tal como encontrada na SEQ ID NO 2.

[0032] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi Ty2la, compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um cassete de expressão eucariótica que codifica para uma proteína receptora de VEGF para uso como uma vacina.

Q [0033] Em certos modos de realização, a proteína receptora de VEGF é selecionada entre o grupo consístindo de VEGFR-2 humana e um homólogo deste, que partilha pelo menos cerca de 80% de homologia com a mesma.

[0034] Numa forma de realização preferida, o VEGFR-2 humano tem a sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1.

11 / 63

[0035] O fato de que os rendimentos mais elevados de células de estirpes mutantes atenuadas de Salmonella typhi podem ser ebtidos pelo método de acordo com a invenção é de importância no que diz respeito à fabricação segura e econômica de uma vacina de DNA comercial à base de uma estirpe de Salmonella atenuada, tais como à estirpe de Salmonella typhi Ty21a aprovada. Salmonella typhi Ty2la transportando uma molécula de DNA recombinante que codifica um antígeno heterólogo, tal como o plasmídeo de expressão PpVAX10.VR2-1, pode, assim, ser s cultivada em rendimentos mais elevados, o que resulta em ' rendimentos mais elevados do que a vacina de DNA para utilização em seres humanos. Isso também está em conformidade com as fortes regras de segurança que devem ser aplicadas na fabricação e cultivo da Salmonella, mesmo em uma versão atenuada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0036] A presente invenção pode ser compreendida mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada da invenção e os exemplos nelas incluídas. 1) Salmonella typhi incluindo do tipo selvagem Salmonella typhi Ty2 e Salmonella typhi Ty21a atenuada

[0037] No âmbito do método da presente invenção qualquer estirpe atenuada de Salmonella typhi pode ser utilizada. A estírpe S. typhi Ty2la atenuada é o componente ativo de Typhoral L”, também conhecido como Vivotifº (fabricado por Berna Biotech Ltd., uma empresa Crucell, Suíça). É atualmente

12 / 63 a única vacina oral viva licenciada contra a febre tifóide. Esta vacina é licenciada em mais de 40 países. O número de Autorização de Comercialização de Typhoral Lº é PL 15747/0001 de 16 de Dezembro de 1996. Uma dose de vacina contém pelo menos 2x10º unidades formadoras de colônia de S. typhi Ty21a viáveis e pelo menos 5x10º células de S. typhi Ty2la não viáveis, A estirpe da vacina é cultivada em fermentadores sob condições controladas num meio contendo uma mistura de extrato de levedura, uma mistura de ácido de caseína, glicose e | galactose.

[0038] Uma das propriedades bioquímicas da estirpe de bactérias Salmonella typhi Ty2l1a, como utilizado de acordo com esta invenção, é a sua incapacidade para metabolizar a galactose. A estirpe bacteriana recombinante atenuada também não é capaz de reduzir o sulfato para sulfeto, que se diferencia a partir do tipo selvagem da estirpe de Salmonella typhi Ty2. Em relação às características de soro da estirpe de Salmonella typhi Ty2la, esta contém o antígeno-O9 que é um . polissacarídeo da membrana exterior das bactérias e que carece do antígeno-O05, que por sua vez é um componente característico da Salmonella typhi Ty2. Mais uma vez, essa característica sorológica suporta as razões para incluir o teste apropriado no painel de testes de identidade pela liberação do lote.

[0039] Numa forma de realização partícular, a estírpe mutante atenuada de Salmonella typhií cultivadas pelo método de acordo com a invenção é a Salmonella typhi Ty21a, transportando pelo menos uma cópia de um plasmídeo de DNA,

13 / 63 PpVAX10,VR2-1, que codifica um cassete de expressão eucariótica do Receptor 2 do Fator de Crescimento Endotelial Vascular humano (VEGFR-2). Esta estirpe mutante atenuada é designada VXMO1 e pode ser usada como uma vacina oral contra o câncer.

[0040] De acordo com a invenção, as funções da estirpe Salmonella typhi Ty2la atenvuadas como transportador bacteriano do DNA de plasmídeo que codifica o antígeno heterólogo de Receptor 2 do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR- . 2) na administração oral da vacina de DNA designado VXMO1.

[0041] A entrega de vacinas com base em tecnologia de DNA de Eplasmídeo resulta em um largo espectro de respostas imunes mucósicas e sistêmicas. Vetores replicantes vivos produzem seus próprios fatores imunomoduladores, como lipopolissacarídeos (LPS) in situ, que podem constituir uma vantagem sobre outras formas de administração, come a microencapsulação. Além disso, o uso da rota natural de entrada prova ser benéfica uma vez que grande número de ' bactérias, tais como Salmonella, saem a partir do lúmen intestinal através das células M das placas de Peyer e migram, eventualmente, para os gânglios linfáticos e o baço, permitindo, assim, a segmentação de vacinas para sítios indutívos do sistema imunológico. A estirpe vacinal de Salmonella typhi, Ty2la tem sido demonstrada até hoje para ter um excelente perfil de segurança. Ao sair do lúmen do intestino, através das células M, as bactérias são tomadas por células fagocíticas, tais como macrófagos e células dendríticas. Estas células são ativadas pelo patógeno e

14 / 63 começam a diferenciar-se, e, provavelmente, a migrar para os gânglios linfáticos e do baço. Devido às suas mutações atenuadas, bactérias da estirpe de S. typhi Ty21 não são capazes de persistir nas células fagocíticas, mas morrem neste ponto. Não há dados disponíveis até o momento quem indicam que a S. typhi Ty2la é capaz de entrar na corrente sanguínea sistémica. A estirpe vacinal Salmonella typhi Ty2la atenuada viva permite, assim, direcionamento específico do sistema imunológico enquanto exibe um excelente perfil de segurança.

[0042] Transportadores “bacterianos atenuados vivos que transportam DNA que codifica antígenos alvo podem ser utilizados como veículos para a administração oral destes antígenos, Vetores replicantes vivos produzem, in situ, os seus próprios fatores imunomoduladores, como o lipopolissacarídeo (LPS), o que constitui também uma vantagem sobre outras formas de administração da vacina, como microencapsulação,.

[0043] Imunização genética pode ser vantajosa em relação à vacinação convencional. O DNA alvo pode ser detectado por um período considerável de tempo atuando, assim, como um depósito de antígeno. Padrões de sequências em alguns plasmídeos, como ilhas GPC, são imuncestimulantes e que podem funcionar como adjuvantes fomentados pela imunoestimulação devido ao LPS e outros componentes bacterianos.

[0044] Conforme indícado acima, as bactérias Salmonella recombinantes são tomadas por células fagocíticas na saída do lúmen intestinal através das células M. Estas células fagocíticas são ativadas pelo patógeno e começam à se diferenciar, e, provavelmente, migram para os gânglios linfáticos e o baço. Durante este período, as bactérias morrem devido à sua mutação atenuada e liberam os vetores de expressão eucariotas baseados em plasmídeo, seguido de uma transferência de plasmídeos para o citoplasma, quer através de um sistema de transporte específico ou por vazamento endossomal. Finalmente, o vetor entra no núcleo, onde é ' transcrito, levando à expressão do antígeno no citoplasma da célula hospedeira. As células T citotóxicas, específicas contra o antígeno heterólogo, de preferência humano VEGFR-2, são induzidas pelas células que apresentam antígeno ativado (APCsS).

[0045] Numa concretização particular, à molécula de DNA recombinante transportada pela estirpe Salmonella typhi Ty21la, é um DNA de plasmídeo, pVAX10.VvR2-1 (7,58 kb), que contém um promotor imediato precoce de citomegalovírus humano eucariótico (CMV), para assegurar a eficiente transcrição da proteína VEGFR-2 na célula hospedeira e uma origem procariótica de replicação (ori), para assegurar a multiplicação no hospedeiro bacteriano. O vetor pcDNA3 encontra-se comercialmente disponível (Invítrogen) e foi modificado para satisfazer as exigências regulamentares, em que as sequências não sejam necessárias para a replicação em E. coli e para expressão das proteínas recombinantes em células de mamíferos foram removidas para limitar as sequências de DNA com possível homologia para o genoma humano

16 / 63 e para minimizar a possibilidade de integração cromossómica. Além disso, o gene de resistência à canamicina substitui o gene resistente à ampicilina. Para a estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi VXMOl produzida de acordo com o método desta invenção, a elevada cópia de origem de pUC do pvAX1-Flk- 1 de plasmídeo foi substituída pela baixa cópia de origem de replicação de pBR322 no pvAX10.VR2-1. A modificação do número de baizas cópias foi feita a fim de reduzir a carga metabólica e para fazer a construção mais estável. Detalhes do plasmídeo PpPVAX10.VR2-1 construto está apresentado na Figura 2.

2) Receptor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular:

[0046] Fator de Crescimento Endotelial vascular VEGF (Kd 75- 760 pM) é um membro de uma família de seis proteínas estruturalmente relacionadas (VEGF-A [também conhecido como VEGF], —B, =-c, -D, -E e PLGF [fator de crescimento placentário, também conhecido como PGF ou PIGF-2]) que regula o crescimento e diferenciação de vários componentes do sistema vascular, em especial vasos sanguíneos e linfáticos. O papel do VEGF na angiogênese parece ser mediado através da interação dessa proteína com o VEGFR-2. VEGFR-2, também conhecida como receptor contendo o domínio de inserção de quinase (KDR), é um aminoácido de comprimento 1356, receptor de alta afinidade para com VEGF de peso molecular 200-230 kDa, assim como para o VEGF-C e VEGF-D. Identificados nos seres humanos através do rastreio de DNAC do endotélio para os receptores de tirosina- quinase, VEGFR-2 partilha de 85% de identidade de sequência com o VEGFR-2 do murino anteriormente descoberto, também

17 / 63 conhecido como quinase 1 (Flk-1) de fígado fetal. VEGFR-2 é normalmente expresso em precursores endoteliais e hematopoiéticos, assim como em células endoteliais, as células estaminais hematopoiéticas e nascentes do estroma do cordão umbilical. No entanto, na vasculatura quiescente no adulto, VEGFR-2 mRNA parece ser regulada para baixo.

[0047] o domínio extracelular do VEGFR-2 contém 18 potenciais sítios de glicosilação N-lígados, VEGFR-2 é inicialmente sintetizada como uma proteína de 150 kDa e rapidamente glicosilada a uma forma intermediária 200kDa, e, em seguida, ainda mais glicosilada a uma taxa mais lenta de uma proteina madura de 230 kDa que é expressa na superfície da célula.

[0048] A sequência de aminoácidos do VEGER-2 da sequência de DNAcC de codificação humana clonado no plasmídeo pVvVAX10.VR2-1 é apresentada na Figura 1. 3) Produção de Salmonella typhi Ty2l1a vazia e modificada

[0049] O processo de fabricação da estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi realizado de acordo com à invenção compreende a cultura da estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi em meio que compreende peptona como fonte de aminoácidos e peptídeos. Meios adequados para o método da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, meio TSB padrão, bem como meio TSB de origem não animal. Tanto TSB padrão quanto TSB de origem não animal compreendem 2,5 g/l1 de

18 / 63 glicose. Normalmente, a quantidade de glicose a partir de TSE, ou meio como-TSB é mais ou menos completamente consumido após 3 a 5 h de cultivo de uma estirpe de Salmonella typhi atenuada e deve ser substituída por glicose fresca a cada 3 a 5 horas, a fim de sustentar um nível de glicose mais ou menos constante no meio de cultura. A observação de que a omissão de adição de glicose durante a cultura de estirpes mutantes atenuadas de Salmonella typhi, opcionalmente, abrigando uma molécula de DNA recombinante que codifica um antígeno heterólogo, leva a um aumento do crescimento celular comparado com o cultivo com adição de glicose é muito surpreendente e sugere que as vias metabólicas específicas nas células bacterianas são desencadeadas pela ausência de glicose. O efeito descrito, também pode ser observado se TSB ou meio como-TSB não contém qualquer glicose no início do processo de cultivo. Portanto, o método de acordo com a invenção tem, para além de rendimentos mais elevados de células e, assim, rendimentos mais elevados da vacina de DNA final, ainda a vantagem de ser mais barata e mais simples ao tornar as etapas de alimentação de glicose durante a fermentação desnecessária,

[0050] O processo de fabricação da estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi Ty2la, como realizado de acordo com a invenção, é descrito exemplarmente na seguinte Tabela 1: (Salmonella Typhi Ty21a- pVAX10,.VR2-1) y 2 x 500 ml TSB + canamicina (500uL)

19 / 63 | (ODsoo > 0.3) | + | | (ODsoo 3 0.5) é o | | 100 L Volume de fermentação TSB 0,001% galactose | - 30ºC | - Fluxo de Ar 100L/min (1 vvm) | - Pressão não controlada | PH 7.0 controlada com NacCH ] - espuma controlada (Corning) | | - por 2 40% regulado por agitador | r- agito mínimo 200 rpm í nenhuma alimentação de glicose | rinantopa. e reimanidalitaseide | crescimento exponencial) - Arrefecimento a pelo menos25ºC antes da colet Filtração de fluxo cruzado - 10 concentração dobra - 10 vezes em tampão de troca de diafiltração com 15% de sacarose, 0,45% de ascorbato de solução de pH 7,2, seguido de posterior concentração a 1/20 vol. da coleta original - Armazenar entre 2 - 8ºC até encher 0 ferca de 24 horas

/ 63

[0051] Em mais detalhes: As culturas (meio TSB acrescido de pg/ml de canamicina) são inoculados cada um com diferentes amostras de estirpes de salmonelas (Ty2la vazio e Ty2la recombinante (pVAX10.VR2-1)). Na produção de amostras de células, o meio TSB é usado contendo 2,5 à 3,0 9/1 de glicose, de preferência 2,5 g/l. Em um meio de controle, glicose é omitida. Além disso, o meio contém canamicina, de preferência de 25 pg/ml. As culturas são íncubadas a 30ºC t+ 2ºC com agitação até uma densidade óptica ODsoom >0,1l seja alcançada, Mais detalhes são descritos na seção de Exemplos.

[0052] No processo de controle para as primeiras e segundas etapas de pré-cultura, no final dos tempos de incubação, incluí a análise do crescimento bacteriano medindo ODgoomm, PH e UFC/ml, assim como, se aplicável, a determinação da estabilidade do plasmídeo (PST) e exame bacteriano. Esta última análise baseia-se num exame de agar de sangue para a determinação de reações hemolíticas de microorganismos patogênicos exigentes. O valor UFC é avaliado antes e após a filtração de fluxo cruzado (CFF). Após a formulação do concentrado bacteriano final, CFU e índice de refração foram medidos na formulação com a concentração mais baixa de bactérias.

[0053] O método de acordo com a invenção, em que àa alimentação de glicose é omitida, é menos intensivo em trabalho e mais eficiente, o que resulta em rendimentos mais elevados de células.

21 / 63 4) Influência da alimentação da glicose durante a cultura de células

[0054] O crescimento das células de Salmonella typhi Ty21a vazias e modificadas foi testada em um meio TSB ou como-TSB através da cultura das células entre 0 e 30 horas a 25 a 35ºC, de preferência 30ºC e um pH entre 6,5 e 7,5, preferivelmente 7,0. O crescimento foi medido em OD ou em CFU/ml (unidades formadoras de colônias).

[0055] Os resultados destas experiências mostram que à adição de glicose não resulta em rendimentos com maiores valores de OD/massa célula da estirpe do tipo selvagem, apesar do consumo de glicose. Em contraste, os frascos sem adição de glicose atingiram valores elevados de OD (6 de pré-cultura 1, 8 para a pré-cultura 2). Aprox. 1 h após adição de glicose, OD permaneceu estático (ou mesmo diminuído ligeiramente) em comparação com o crescimento sem adição de glicose. Em impulsos repetidos, consumo de glicose diminuiu, nenhum efeito adicional/aditivo sobre o crescimento foi observado. Os valores de pH foram também monitorados durante a fermentação, e em algumas experiências ajustado ao valor de pH de partida, se variacoes pudessem ser observadas.

[0056] Sem adição de glicose, uma mudança de pH para alcalino foi observada após depleção de glicose, enquanto que com à valor de pH de pulso de glicose caiu (comparar à Figura 8 para a pré-cultura 1 e a Figura 9 para pré-cultura 2). Fenômenos foram observados em todas as pré-culturas utilizadas

22 / 63 indicando que não há influência do número de geração. Glicose pulsante foi feita 1 à 5 vezes (de preferência 1 a 3 vezes) em um tempo médio de cultivo no máximo de 30 h. Geralmente, após cerca de 5 a 15 horas, crescimento de células entrou na fase estacionária após à fase exponencial, dependendo das condições de partida da cultura de células. Se um pré-cultivo que cresceu com pulso de glicose foi inoculado em meio fresco, foram observadas as mesmas características de crescimento (valores superiores de OD/variação de pH para alcalino, sem | adição de glicose).

[0057] Ao omitir a ingestão de glicose na fase de crescimento ou mesmo no meio à partir do início, a mudança dos valores do pH para alcalino (de cerca de 7 a cerca de 8) pode ser observado, apesar de o sistema do meio ser tamponado. Pode ser favorável para ajustar o valor do pH durante o crescimento celular para o pH original de partida de cerca de 7.0.

[0058] Os resultados indicaram que as concentrações de glicose acima de um limite comparativamente baixo (aprox. 2,5 g/1) desencadea uma mudança reversível no metabolismo (glicose), Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, presume-se que uma substância, ainda não identificada, é então secretada no meio, o que inibe o crescimento ainda mais, mesmo se a glicose diminuir novamente abaixo do nível do gatilho. Após à inoculação em meio novo, esta substância é diluída para uma concentração abaixo da eficácia. Resultados — muito semelhantes podem ser obtidos se o meio de partida não contém qualquer glicose.

23 / 63

[0059] Interessantemente os mesmos resultados podem ser obtidos, não só com a Salmonella typhi Ty21a vazia, mas também com a estirpe modificada de Salmonella typhi Ty2la - PVAX10.VR2-1 (VXMO01), indicando que o efeito surpreendente não é influenciado pela construção bacteriana modificada artificialmente. No entanto, como pode ser visto a partir da Figura 12, o crescimento de células da bactéria modificada sem alimentação de glicose, é - como se esperava - mais lenta do que a da estirpe de tipo selvagem, mas pode, finalmente, obter os mesmos altos valores de densidade óptica (OD 7 a 8) em comparação com a estirpe de tipo selvagem, em que a estirpe de Salmonella modificada cultivada na presença de glicose por pulsação de glicose nunca recebe esses valores elevados de densidade óptica e para, como regra, a uma densidade celular de OD 3 ou menos.

[0060] Tanto a estirpe S. typhi Ty2la vazia como a modificada apresentam características de crescimento projetadas comparáveis em termos de crescimento com e sem adição de glicose.

[0061] Em suma, os resultados da invenção como descritos acima e a seguir mostram com ambas as estirpes, que à adição de glicose não resulta em valores superiores de OD/ rendimentos de massa de célula. Em contraste, os frascos sem adição de glicose atingiram valores de OD superiores. Sem adição de glicose, uma mudança de pH para alcalino é observada após depleção de glicose, enquanto que com pulso de glicose, o valor de pH cai. Um dos efeitos da mudança dependente de

24 / 63 concentração de glicose no metabolismo durante o cultivo de Salmonella typhi Ty2la consiste presumivelmente em excreção de uma substância inibidora para o meio de crescimento, que não é conhecida até agora.

[0062] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o cultivo de uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi sem atividade de galactose epimerase e que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um cassete de expressão, que compreende a etapa de cultivo da estirpe num meio tamponado compreendendo peptona em valor de pH de partida aproximadamente neutro na escala de fermentação, em que à quantidade de glicose no meio durante as fermentações é ajustada de tal modo que à quantidade de glicose é reduzida a zero antes de atingir à fase estacionária.

[0063] No contexto da presente invenção, os termos "compreende" ou "compreendendo" significam "incluindo, mas não limitado a". O termo destina-se a ser amplo para especificar a presença de quaisquer características indicadas, elementos, integrantes, etapas ou componentes, mas não impede a presença ou a adição de uma ou mais outras características, elementos, integrantes, etapas, componentes ou grupos destes. O termo “compreendendo“ inclui, portanto, os termos mais restritivos "consistindo de“ e “consistindo essencialmente em".

[0064] No contexto da presente invenção, o termo "cerca de“ ou “aproximadamente” significa dentro de 20%, alternativamente

/ 63 dentro de 10%, incluindo 5% de um dado valor ou faixa. Em alternativa, especialmente nos sistemas biológicos, o termo "cerca de“ significa dentro de cerca de um log (isto é, uma ordem de magnitude), incluindo um fator de dois de um determinado valor.

[0065] No contexto da presente invenção, os termos “crescimento” e “cultura são utilizados como sinônimos e referem-se à propagação de microrganismos em meios condutores para o seu crescimento.

[0066] No contexto da presente invenção, o termo “fermentação” refere-se a cultura em larga escala de microorganismos, normalmente realizadas num fermentador, ou seja, um aparelho que mantêm as condições ótimas para o crescimento dos referidos microorganismos, para a produção com alto rendimento de um produto microbiano desejado, incluindo metabólitos e os próprios microorganismos.

[0067] No contexto da presente invenção, o termo “atenuado“ refere-se a uma estirpe bacteriana de virulência reduzida em comparação com a estirpe bacteriana parental não portadora da mutação atenuante. Estirpes de bactérias atenuadas têm preferência na perda de sua virulência, mas manteve Sua capacidade de induzir imunidade protetora, Bactéria atenuada pode ser encontrada naturalmente ou pode ser produzida em laboratório, por exemplo, por adaptação à um novo meio ou cultura celular ou pode ser produzida por tecnologia de DNA recombinante.

26 / 63

[10068] No contexto da presente invenção, o termo “estirpe mutante" refere-se à uma estirpe bacteriana portadora de uma mutação no seu genoma. Neste contexto, o termo “mutação“ refere-se a uma mudança de uma sequência de ácido nucleico, incluindo mutações pontuais, inserções, deleções, inversões e translocações,

[0069] No contexto da presente invenção, o termo “molécula de DNA recombinante" refere-se a uma construção de DNA modificada, de preferência composta de partes de DNA de diferentes origens. A molécula de DNA recombinante pode ser um ácido nucleico linear, ou, de preferência, um plasmídeo de DNA recombinante circular gerado através da introdução de um quadro de leitura aberta de interesse num vetor de expressão de plasmídeo. O quadro de leitura aberta é de preferência um antígeno heterólogo. O antígeno heterólogo é preferencialmente um antígeno do câncer. O antígeno do câncer é de preferência uma proteína receptora de VEGF. No contexto da presente invenção, o termo “antígeno heterólogo“" refere-se à um antígeno derivado de uma espécie diferente de Salmonella typhi.

[0070] No contexto da presente invenção, o termo “cassete de expressão" refere-se a uma unidade de ácido nucleico compreendendo pelo menos um gene sob o controle de sequências reguladoras que controlam a sua expressão. Os cassetes de expressão compreendidos na estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi podem preferencialmente mediar a transcrição do quadro de leitura aberta incluídos nas células-alvo. Os cassetes de expressão compreendem tipicamente um promotor, pelo menos, um quadro de leitura aberta e um sinal de terminação da transcrição.

[0071] No contexto da presente invenção, o termo “peptona“ refere-se a uma mistura de produtos de clivagem que compreende os aminoácidos e peptídeos produzidos por hidrólise dos materiais que contêm proteínas, por exemplo, ácido parcial ou hidrólise enzimática de misturas de proteínas nativas.

[0072] No contexto da presente invenção, o termo “valor de pH aproximadamente neutro“ refere-se a um valor de pH de cerca de 5 a cerca de 9, de preferência de cerca de 6 a cerca de 8, mais preferivelmente de cerca de 6,5 a cerca de 7,5, mais de preferência cerca de 7,0.

[90073] Os meios adequados para o método da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, meio TSB padrão, bem como meio TSB de origem não-animal. Meio TSB padrão conhecido na técnica é constituído por peptona pancreática da caseína, peptona farinha de soja, fosfato de hidrogênio di- potássio (tampão), cloreto de sódio e glicose (=dextrose) como fonte de energia numa concentração inicial de 2,5 g/l. Om exemplo de meio TSB adequado de origem não-animal é CASO Bouillon de orígem não animal, compreendendo peptona derivada de não-animais, hidrogenofosfato de di-potássio (tampão), cloreto de sódio e glicose em uma concentração a partir de 2,5 g/1l.

28 / 63

[0074] No contexto da presente invenção, o termo “fase estacionária“ refere-se a fase de crescimento bacteriano após à fase exponencial ou logarítmica, em que à densidade celular no meio de crescimento permanece aproximadamente constante. O termo “antes de atingir a fase estacionária", portanto, refere-se a qualquer ponto de tempo antes da fase estacionária e inclui a fase de retardamento (isto é, a primeira fase do crescimento bacteriano durante o qual as bactérias se adaptam às condições de crescimento) e a fase exponencial. Foi surpreendentemente descoberto que o cultivo de estirpes atenuadas de Salmonella typhi mutantes de acordo com o método da presente invenção prolonga a fase de crescimento exponencial. Quando o crescimento da estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi Ty2l1a, com uma quantidade de glicose que se esgota durante a fase de crescimento exponencial, sem adição de glicose durante o processo de fermentação, a fase estacionária é alcançada não mais cedo do que, após 9 horas de cultura, de preferência depois de 9 a 20 horas de cultura, mais preferivelmente, a partir de 9 a 15 horas após a cultura, mais preferencialmente a partir de 9 a 12 horas após a cultura,

[0075] Numa forma de realização particular, a não adição de glicose ao meio durante à fermentação e à quantidade inicial de glicose é esgotada antes de atingir a fase estacionária. É, contudo, também no âmbito do método da presente invenção o crescimento de uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi, para adicionar glicose, enquanto à quantidade de

29 / 63 glicose é reduzida à zero antes de atingir a fase estacionária.

[0076] No contexto da presente invenção, o termo “a glicose é esgotada” significa que a quantidade inicial de glicose no meio é consumida (isto é, retomado e metabolizada) pela bactéria.

[0077] Numa forma de realização particular, a estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi é Salmonella typhi Ty21a,

[0078] Numa forma de realização particular, o cassete de expressão é um cassete de expressão eucariótica., Demonstrou-se que a quantidade de antígeno heterólogo necessária para induzir uma resposta imunitária adequada pode ser tóxica para a bactéria e resultar em morte celular, sobre-atenuvuação Ou perda de expressão do antígeno heterólogo. Usando um cassete de expressão eucariótica que não é expresso no vetor bacteriano, mas apenas na célula alvo ultrapassa este problema de toxicidade.

[0079] No contexto da presente invenção, o termo “cassete de expressão eucariota" refere-se à um cassete de expressão que permite a expressão do quadro de leitura aberta em uma célula eucariótica. Um cassete de expressão eucariótica compreende — sequências regulatórias que são capazes de controlar a expressão de um quadro de leitura aberta de uma célula eucariótica, de preferência, um promotor e um sinal de poliadenilação. Os promotores e os sinais de poliadenilação

/ 63 incluídos nas moléculas de DNA recombinante constituídos pela estirpe de Salmonella typhi para a utilização como uma vacina da presente invenção são preferivelmente selecionados para serem funcionais nas células do indivíduo a ser imunizado. Exemplos de promotores úteis na estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi da presente invenção, especialmente na produção de uma vacina de DNA para os humanos, incluem, mas não estão limitados a, promotores de Vírus Símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de ratinho (MMTV), vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), tal como a Repetição Terminal Longa de HIV (LTR), vírus Moloney, citomegalovírus (CMV), tal como o promotor precoce imediato de CMV, vírus Epstein Barr (EBV), vírus do Sarcoma de Rouse (RSV), bem como promotores de genes humanos tais como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana e metalotioneína humana. Em uma forma de realização particular, o cassete de expressão eucariótica contém o promotor de CMV. No contexto da presente invenção, o termo “promotor de CMV“ refere-se ao promotor do citomegalovírus precoce imediato.

[0080] Os exemplos de sinais de poliadenilação apropriados, especialmente para à produção de uma vacina de DNA para os humanos, incluem, mas não estão limitados, local de poliadenilação BGH, sinais de poliadenilação SV40 e sinais de poliadenilação LTR. Em uma forma de realização particular, a cassete de expressão eucariótica incluída na molécula de DNA recombinante constituída pela estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi da presente invenção compreende & local de poliadenilação de BGH.

31 / 63

[0081] Além dos elementos reguladores necessários para a expressão de um gene heterólogo, tal como um antígeno heterólogo, como promotores e sinais de poliadenilação, outros elementos podem também ser incluídos na molécula de DNA recombinante. Tais elementos adicionais incluem intensificadores. O intensificador pode ser, por exemplo, o intensificador de actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina do músculo humano e intensificadores vírais tais como os de CMV, RSV e EBV.

[0082] As sequências reguladoras e os códons são geralmente dependentes da espécie, de modo que, a fim de maximizar a produção de proteína, as sequências de regulação e os códons são escolhidos de preferência para ser eficaz na espécie a ser imunizada. O perito na arte pode produzir moléculas de DNA recombinante que são funcionais em uma dada espécie.

[0083] Numa forma de realização particular, a cassete de expressão codifica uma proteína receptora de VEGF.

[0084] Proteínas receptoras VEGF são receptores de quinases-tirosina específicos de células endoteliais que podem ser vinculados pelo fator de crescimento endotelial vascular ligante (VEGF), que faz com que eles dimerizem e se tornem ativados através transfosforilação. Existem três sub-tipos principais de VEGFR, o VEGFR-l (ou FLTl), VEGFR-2 (KDR ou FIk1) e VEGFR-3 (ou FLT4). VEGFR-2 parece mediar a quase totalidade das respostas celulares conhecidas para o VEGF. Os receptores de VEGF ligados à membrana têm uma porção

32 / 63 extracelular consistindo de 7 domínios do tipo imunoglobulina, uma região transmembranar que abrange único e uma porção intracelular que contém um domínio de tirosina-quinase de divisão. Transcrições VEGFR dão também origem à variantes de junção alternativas que codificam as proteínas receptoras de VEGF solúveis. A família VEGF de fatores de crescimento compreende seis membros da família, o VEGF-A à E e PGF. Numa forma de realização preferida, oO cassete de expressão eucariótica codifica uma proteína receptora de VEGF selecionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 humana e um homólogo deste, que partilha pelo menos cerca de 80% de homologia com a mesma.

[0085] No contexto da presente invenção, o termo “homólogo” da VEGFR-2 humano refere-se a uma proteína receptora de VEGF, que difere na sequência de aminoácidos e/ou a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de VEGFR-2 humano. O homólogo de VEGFR 2 humano, pode ser de origem natural, por exemplo, um homólogo de VEGFR-2 de uma espécie diferente ou um homólogo de VEGFR-2 modificado. Sabe-se que à utilização de códons é diferente entre espécies. Assim, quando a expressão de uma proteína heteróloga numa célula-alvo, pode ser necessário ou pelo menos útil, adaptar-se a sequência de ácido nucleico para a utilização de códons da célula-alvo. Os métodos para a concepção e construção de homólogos de proteínas de receptor de VEGF são bem conhecidos de alguém com habilidade ordinária na técnica.

33 / 63

[0086] Um VEGFR-2 homólogo pode conter uma ou mais mutações que compreende uma adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos. De acordo com os ensinamentos da presente invenção, os referidos aminoácidos deletados, adicionados e/ou substituídos podem ser aminoácidos consecutivos ou podem ser intercalados ao longo do comprimento da sequência de aminoácidos do VEGFR-2 homólogo funcional. De acordo com os ensinamentos da presente invenção, pode ser adicionado qualquer número de aminoácidos, elimínados e/ou substítutos, desde que a VEGFR-2 homóloga e humana partilhem pelo menos cerca de 80% de homologia. Em forma de realização particular, o homólogo da VEGFR-2 humana tem uma homologia de sequência de pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou mais particularmente de pelo menos cerca de 95% e uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70% e mais particularmente de pelo menos cerca de 75%. Os métodos e algoritmos para determinar a identidade e/ou homologia da sequência, incluindo a comparação de homólogos possuindo deleções, adições e/ou substituições relativamente a uma sequência parental, são bem conhecidos do perito na arte. Ao nível do DNA, as sequências de ácidos nucleicos que codificam oe homólogo de VEGFR-2 humana podem diferir de uma extensão maior, devido à degenerescência do código genético.

[0087] Em ainda outra forma de realização preferida, O cassete de expressão eucariótica codifica VEGFR-2 humana da sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1.

34 / 63

[0088] Em certas formas de realização, o meio tamponado compreende peptona de origem não-animal. Numa forma de realização preferida, o meio é tamponado Tryptic Soy Broth (TSB) de origem não-animal.

[0089] No contexto da presente invenção, “peptona de origem não-animal” refere-se a uma mistura de produtos de clivagem produzida por ácido parcial ou hidrólise enzimática da proteína nativa, que não é de origem animal. De preferência, a proteína nativa é de origem vegetal. Peptona de origem não- animal compreende apenas os componentes que não são diretamente derivados de animais eucarióticos,.

[00990] Em certas formas de realização, o volume do meio é de pelo menos cerca de 10 1.

[0091] Em certas formas de realização, o volume do meio é de pelo menos cerca de 10 litros ou 30 litros ou 50 1 ou 100 1 até um máximo de cerca de 10.000 1, ou 1,000 1 ou 800 1 ou 500 1.

[0092] Em formas de realização particulares, o volume do meio é de cerca de 100 1 a cerca de 500 1, mais particularmente de cerca de 100 1, a cerca de 150 1, cerca de 200 litros, cerca de 250 litros, cerca de 300 litros, cerca de 400 1 ou cerca de 500 1.

/ 63

[0093] Em certas formas de realização, a concentração de glicose de partida corresponde à de um meio mínimo de bactérias ou menos.

[0094] Em certas formas de realização, à concentração de glicose de partida é de cerca de O 9/1 até cerca de 4 g/1.

[0095] Em formas de realização particulares, a concentração de glicose de partida é de cerca de O 9g/l, cerca de 0,5 g/l, cerca de 1 g/l, cerca de 1,5 g/l, cerca de 2 g/l, cerca de 2,5 g/1, de cerca de 3 g/l, cerca de 3,5 g/l1 ou cerca de 4 g/L,

[0096] Em certas formas de realização, o valor de pH de partida é de pelo menos cerca de 5, cerca de 6 ou cerca de 6,5 até um máximo de menos de cerca de 9, cerca de 8 ou cerca de 7,5.

[0097] Em formas de realização particulares, o valor de pH de partida é de cerca de 6,5 a cerca de 7,5, mais particularmente cerca de 7,0.

[0098] Numa forma de realização particular, o valor de pH é ajustado durante a cultura à um valor de pH de cerca de 6 a cerca de 8, em particular a partir de cerca de 6,5 a cerca de 775»

[0099] Numa forma de realização particular, o valor de pH é ajustado a partir de pelo menos cerca de 6 ou 6,5 até um máximo de cerca de 8 ou cerca de 7,5 durante à fermentação.

36 / 63

[00100] Numa forma de realização particular, O valor de pH é ajustado a partir de cerca de 6,5 a cerca de 7,5 durante a fermentação, mais particularmente, para cerca de 7,0.

[00101] Numa forma de realização particular, o progresso do crescimento é determinado por medição da densidade óptica (OD).

[00102] No contexto da presente invenção, o termo “densidade óptica" ou “turbidez" de um material refere-se à proporção logarítmica da radiação que incide sobre o referido material para a radiação transmitida através do referido material para um dado comprimento de onda. A densidade óptica é preferencialmente medida utilizando um espectrofotômetro. De preferência, a densidade óptica pode ser utilizada como uma medida da concentração de células de bactérias, de preferência, em uma suspensão. Como a luz visível passa através de uma suspensão de células, a luz é difundida. Maior dispersão indica o número de células maiores. Tipicamente, a densidade óptica a um comprimento de onda de 600 nm (ODswo) é medida. A densidade óptica à um comprimento de onda particular de uma cultura de bactérias em função do tempo de cultura dá uma curva de crescimento que pode ser utilizada para delinear as várias fases de crescimento bacteriano e para determinar o tempo de duplicação da cultura bacteriana. A curva de crescimento é característica para um determinado tipo de bactérias cultivadas sob determinadas condições, em um dado meio de cultura. Medição da densidade óptica da suspensão celular pode, assim, ser utilizada para monitorar a etapa de

37 / 63 crescimento bacteriano. Medição da densidade óptica pode ser utilizada para determinar o ponto final do processo de cultura, isto é, a fase de crescimento de bactérias, em que as células estão para ser coletadas, normalmente a fase mid-log de crescimento,

[00103] Numa forma de realização preferida, o progresso do crescimento é determinado pela monitorização in situ da densidade óptica da cultura ou por recolha de amostras e medindo a densídade óptica das amostras. Monitoramento in situ da densidade óptica de uma cultura bacteriana usando dispositivos on-line ou in situ permite o monitoramento constante, contínua, não-invasivo de crescimento celular, minimizando o risco de contaminação e eliminando a necessidade de extração de trabalho intensivo pesado de amostras.

[00104] Foi surpreendentemente descoberto que o cultivo de estirpes mutantes atenuadas de Salmonella typhi de acordo com o processo da presente invenção origina valores de densidade óptica de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, no início da fase estacionária. Em comparação, a cultura da mesma estirpe de um processo de fermentação semelhante, mas em que a glicose é adicionada durante a fermentação para manter um nível de glicose aproximadamente estável de cerca de 1 q/1 até cerca de 4 g/1 rendimentos em valores de densidade óptica de cerca de 3 a cerca de 5,5. Assim, verificou-se surpreendentemente que o crescimento de uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi, sem adição de glicose ao meio durante a fermentação e com uma quantidade de glicose a partir do meio que é esgotado

38 / 63 antes de atingir os rendimentos em fase estacionária num aumento da densidade óptica no início da fase estacionária em relação a um processo de fermentação com a adição de glicose.

[00105] Numa outra forma de realização, o progresso do crescimento é determinado por medição da densidade celular.

[00106] Numa forma de realização preferida, a densidade de células é determinada microscopicamente ou por medição da resistência elétrica ou por citometria de fluxo, A densidade celular pode ser determinada microscopicamente contando-se as células manualmente usando uma câmara de contagem ou hemocitômetro. Medição da densidade da célula com base na resistência elétrica é de preferência realizada utilizando um contador Coulter. Medição da densidade celular por citometria de fluxo é conseguida deixando as células passar um feixe de laser num fluxo estreito, que os atinge um por um, Um detector de luz capta a luz que é refletida das células.

[00107] Foi surpreendentemente descoberto que o cultivo de estirpes mutantes atenuadas de Salmonella typhi de acordo com o processo da presente invenção origina valores de densidade de células de cerca de 5 x 10" a cerca de B x 10%, no início da fase estacionária. Em comparação, a cultura da mesma estirpe de um processo de fermentação semelhante, mas em que a glicose é adicionada durante a fermentação para manter um nível de glicose aproximadamente estável de rendimentos de cerca de 1 g/l1 à cerca de 4 g/l nos valores de densidade de células de cerca de 5 x 107 1 x 10%. Assim, verificou-se

39 / 63 surpreendentemente que o crescimento de uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi, sem adição de glicose ao meio durante a fermentação e com uma quantidade de glicose a partir do meio que é esgotado antes de atingir os rendimentos em fase estacionária num aumento a densidade de células no início da fase estacionária em relação a um processo de fermentação com a adição de glicose.

[00108] A densidade óptica da suspensão de células inferior a cerca de 0,4 é diretamente proporcional à sua densidade de células. Assim, a curva de calibração pode ser criada através da representação gráfica da densidade óptica em relação à densidade celular. Tal curva de calibração pode ser usada para estimar a densidade de células de uma suspensão de células pela medição da densidade óptica.

[00109] Numa outra forma de realização, oO progresso do crescimento é determinado pela medição das unidades formadoras de colônias (CFU) por valor da coletada de amostras e de plaqueamento em placas de agar. Por este método, apenas as células viáveis são contadas como as únicas células viáveis capazes de formar colônias em uma placa de agar.

[00110] Foi surpreendentemente descoberto que o crescimento das estirpes mutante atenuadas de Salmonella typhi de acordo com o método da presente invenção produz valores de UFC de cerca de 6 x 10º à cerca de 8 x 10º no início da fase estacionária. Em comparação, a cultura da mesma estirpe de um processo de fermentação semelhante, mas em que a glicose é

40 / 63 adicionada durante a fermentação para manter um nível de glicose de aproximadamente estável de cerca de 1 g/1 até cerca de 4 g/1 rendimentos em valores de UFC de cerca de 2 x 10º à x 10º, Assim, verificou-se surpreendentemente que o crescimento de uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi, sem adição de glicose ao meio durante a fermentação e com uma quantidade de glicose a partir do meio que é esgotado antes de atingir a fase estacionária, não só os rendimentos em um aumento da densidade de células no início da fase estacionária, mas também num aumento do número de células viáveis em comparação com um processo de fermentação com a adição de glicose.

[00111] Numa forma de realização particular, as células são coletadas antes de atingir uma densidade óptica de cerca de 6.

[00112] Numa forma de realização preferida, as células são coletadas a uma densidade óptica de cerca de 5 a cerca de 6.

[00113] Numa forma de realização particular, a estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi é Salmonella typhi Ty21a, e a molécula de DNA recombinante compreende o gene de resistência à canamicina, o pDMBl ori e uma cassete de expressão eucariótica que codifica para o VEGFR-2 humana, sob o controle do promotor de CMV.

[00114] Numa forma de realização preferida, à VEGFR-2 humana tem a sequência de ácido nucleico tal como encontrada na SEQ ID NO 2,

41 / 63

[00115] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi sem atividade de galactose epimerase e que compreende pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma cassete de expressão, que é obtida através de um método para o crescimento da estirpe, compreendendo a etapa de cultivo da estirpe num meio tamponado compreendendo peptona à um valor de partida de pH aproximadamente neutro na escala de fermentação, em que à quantidade de glicose no meio durante as fermentações é ajustada de tal modo que a quantidade de glícose é reduzida a zero antes de atingir o fase estacionária.

[00116] Numa forma de realização particular, a não adição de glicose ao meio durante a fermentação e a quantidade inicial de glicose é esgotada antes de atingir a fase estacionária.

[00117] Numa forma de realização particular, o cassete de expressão é um cassete de expressão eucariótica.

[00118] Numa forma de realização particular, a cassete de expressão codifica uma proteína receptora de VEGF.

[00119] Numa forma de realização preferida, a cassete de expressão eucariótica codifica uma proteína receptora de VEGF selecionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 humana e um homólogo deste, que partilha pelo menos cerca de 80% de homologia com à mesma.

42 / 63

[00120] Em àáinda outra forma de realização preferida, a cassete de expressão eucariótica codifica VEGFR-2 humana da sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1.

[00121] Numa forma de realização particular, a estirpe mutante atenuada é Salmonella typhi Ty2l1a e a molécula de DNA recombinante compreende o gene de resistência à canamicina, o PMB1l ori e uma cassete de expressão eucariótica que codifica para o VEGFR-2 humana sob o controle do promotor de CMV.

[00122] Numa forma de realização preferida, a VEGFR-2 humana tem a sequência de ácido nucleico tal como encontrada na SEQ ID NO 2.

[00123] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi Ty21la, compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma cassete de expressão eucariótica que codifica para uma proteína receptora de VEGF para uso como uma vacina.

[00124] No contexto da presente invenção, o termo “vacina*“ refere-se a um agente que é capaz de induzir uma resposta imune num sujeito por administração. A vacina pode, de preferência, prevenir, melhorar ou tratar uma doença, Preferencialmente, tal vacina compreende uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi, de preferência S. typhi TyZ2Z1la. De preferência, a vacina compreende ainda pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um cassete

43 / 63 de expressão, preferivelmente que codifica um antígeno heterólogo. Tal vacina compreendendo um vetor, por exemplo, uma estirpe bácteriana atenuada, como um veículo de entrega de um DNA que codifica um antígeno heterólogo é denominada vacina de DNA.

[00125] Numa forma de realização particular, o cassete de expressão eucariótica codifica uma proteína receptora de VEGF selecionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 humana e um homólogo deste, que partilha pelo menos cerca de 80% de homologia com a mesma.

[00126] Numa forma de realização preferida, o cassete de expressão eucariótica codifica VEGFR-2 humana da sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ITD NO 1.

[00127] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se à um método para aumentar o crescimento de células de uma estirpe de vacina mutante atenuada de Salmonella sem atividade de galactose epimerase, por cultura da estirpe num meio tamponado compreendendo essencialmente digestões enzimáticas de caseína e soja e uma quantidade de glicose a partir de não mais de 2,5 a 3,0 g/l1 a um valor de pH de partida de 6,5 a 7,5, em que a cultura é realizada por omissão de qualquer glicose adicional de alimentação para o caldo de fermentação até a fase estacionária de crescimento celular, por conseguinte, não sustentando o nível original de glicose no caldo, o referido aumento do crescimento das células, o que é apenas alcançado totalmente a depleção de glicose durante a fermentação, é

44 / 63 medido pela densidade óptica (OD) e tem um valor de 7,5 a 8,0, em fase estacionária, finalmente obtida (preferivelmente obtido após 18 - 20 horas), em comparação com OD 5,0 a 5,5 em um respectivo processo de fermentação sob as mesmas condições, no entanto, em que a glicose é alimentada durante à fermentação para manter um nível de glicose permanente no caldo de fermentação de 2,0 a 3,0 q/1.

[00128] Numa forma de realização particular, o crescimento celular máxima é obtido após 20 h de cultura.

[00129] Numa forma de realização particular, uma densidade de células de 5 x 10" a 8 x 10º &é conseguido por omissão de qualquer alimentação de glicose durante a fermentação, em comparação com 5 x 10 a 1 x 10, quando a adição de glicose durante o cultivo.

[00130] Numa forma de realização particular, uma unidade de formação de colônias (UFC) valor de 6 x 10º a 8 x 10º por ml é obtida após fermentação omitindo qualquer alimentação de glicose durante a fermentação, em comparação com 2% 10º a 5x 10º após a alimentação da glicose durante a fermentação.

[00131] Numa forma de realização particular, o valor de pH é ajustado para 7,0 durante a fermentação. Omitindo à ingestão de glicose na fase de crescimento ou mesmo no meio à partir do início, a mudança dos valores do pH para alcalino (a partir de cerca de 7 até cerca de 8) pode ser observado, apesar de o sistema de meio ser tamponado. Pode ser favorável para ajustar

45 / 63 o valor do pH durante o crescimento celular para o pH original de partida de ca. 7.0.

[00132] Numa forma de realização particular da invenção, o meio é Tryptic Soy Broth (TSB) ou um meio que fornece os mesmos ou similares nutrientes,

[00133] Numa outra forma de realização preferida de acordo com a invenção, à estirpe de vacina de Salmonella mutante atenuada é Salmonella typhi Ty21a.

[00134] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produção de uma estirpe mutante atenuada de vacina contra o câncer de Salmonella typhi Ty2la, em que a estirpe transporta várias cópias de um plasmídeo de DNA, que codifica um cassete de expressão eucariótica de receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGFR-2 ou Flk-l1), o método compreendendo um método para aumentar o crescimento de células de uma estirpe mutante atenuada de vacina de Salmonella da presente invenção.

[00135] Numa forma de realização particular, o referido DNA de plasmídeo é um plasmídeo de 7580 pb de DNA que compreende o DNAc de VEGFR-2, que está sob o controle do promotor de CMV, o gene de resistência à canamicina e o pMBi ori e que é designado como pvVAX10. VR2-1.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURAS E TABELAS

46 / 63 Figura 1: Sequência de aminoácidos de VEGFR-2 codificado por CDNA. clonado no plasmídeo pVAX10,.VR2-1 Figura 2: Mapa do plasmídeo de pVAX10.VR2-1 Figura 3: Descrição do processo de fabricação da Salmonella typhi TyZ2a (pVAX10,.VR2-1) Figura 4: Fluxograma do isolamento de S. typhi Ty21a Figura 5: Crescimento de pré-cultura 1 e 2 de Salmonella typhi Ty21a com/sem canamicina Figura 6: Crescimento de culturas (pré-cultura 1) de Salmonella typhi Ty21a (vazias) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração final de glicose de 2,5 g/l) e sem pulsação de glicose.

O crescimento celular foi determinado por medição da densidade óptica a 600 nm (OD600). As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de cultivo em horas (h); eixo y representa a densidade celular medido em unidades de OD e glicose (glc) concentração em g/1. Figura 7: Crescimento de culturas (pré-cultura 1) de Salmonella typhi Ty2la (vazias) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração final de glicose de 2,5 9g/l) e sem pulsação de glicose.

O crescimento celular foi determinado por medição da densidade óptica a 600 nm (OD600), As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de

47 / 63 cultivo em horas (h); eixo dos y representa a densidade celular medida em unidades de OD e mudança de valor do pH.

Figura 8: Crescimento de culturas (pré-cultura 2) de Salmonella typhi Ty2la (vazias) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração final de glicose de 2,5 9g/l1) e sem pulsação de glicose.

O crescimento celular foií medido como densidade óptica a 600 nm (OD600). As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de cultivo em : horas (h); eixo dos y representa a densidade celular medida em unidades de OD e glicose (glc) a concentração em gqg/1,. Figura 9: Crescimento de culturas (pré-cultura 2) de Salmonella typhi Ty2l1a (vazias) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração final de glicose de 2,5 g/l1) e sem pulsação de glicose.

O crescimento celular foi medido como densidade óptica à 600 nm (OD600). As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de cultivo em horas (h); eixo dos y representa a densidade celular medida em unidades de OD e mudança de valor do pH.

Figura 10: Crescimento de culturas (pré-cultura 3, glicose preparada inóculos de pré-cultura 1) de Salmonella typhi Ty21la (vazias) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração fínal de glicose de 2,5 g/1) e sem pulsação de glicose.

O crescimento celular foi determinado por medição da densidade óptica a 600 nm (OD600). As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de cultivo em horas (h);

48 / 63 eixo dos y representa a densidade celular medido em unidades de OD e glicose (glc) a concentração em qg/l1 Figura 11: Crescimento de culturas (pré-cultura 3, glicose preparada inóculos de pré-cultura 1) de Salmonella typhi Ty21a (vazias) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração final de glicose de 2,5 g/l) e sem pulsação de glicose.

O crescimento celular foi determinado por medição da densidade óptica a 600 nm (OD600). As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de cultivo em horas (h); eixo dos y representa a densidade celular medida em unidades de OD e mudança valor do pH.

Figura 12: Crescimento da estirpe de tipo selvagem (pré- cultura 1) de Salmonella typhi Ty2la, em comparação com estirpe de produção da vacína do câncer modificada (Salmonella typhi Ty2la: PpVAXIO.VR2-1, VXMO1l) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração final de glicose de 2,5 qg/1) e sem pulsação de glicose.

O crescimento celular foi medido como densidade óptica a 600 nm (OD600). As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de cultivo em horas (h); eixo dos y representa a densidade celular medido em unidades de DO.

Figura 13: Crescimento da estirpe de tipo selvagem (pré- cultura 2) de Salmonella typhi Ty2la em comparação com estirpe de produção da vacina do câncer modificada (Salmonella typhi TyZla: PVAXIO,VR2-1, VXMO1) com glicose pulsante (ajustado para uma concentração final de glicose de 2,5 9/1) e sem

49 / 63 pulsação de glicose. O crescimento celular foi determinado por medição da densidade óptica a 600 nm (OD600). As setas indicam a adição de glicose (pulsante). Eixo X representa o tempo de cultivo em horas (h); eixo dos y representa a densidade celular medido em unidades de DO. Tabela 1: Procêésso de fabricação Tabela 2: Processo de fabricação Tabela 3: Resultados das medições OD600 durante o processo de fermentação Tabela 4: Concentração de glicose durante o processo de fermentação Tabela 5: Mudança de valor de pH durante o processo de fermentação

EXEMPLOS Exemplo 1: Isolamento de estirpe Salmonella typhi Ty2l1a para a preparação da Research Seed Lot (RSL)

[100136] A prímeira etapa na preparação do LSR consistia no isolamento da estirpe atenuada de Salmonella typhi Ty2la de cápsulas Typhoral L” seguida pela transformação das bactérias atenuadas com o DNA de plasmídeo (pVAXL0.VR2-1).

50 / 63

[00137] As cápsulas de Typhoral 1º disponíveis comercialmente, contendo uma estirpe atenuada de Salmonella enterica serovar typhi Ty2la, foram usadas para preparar oO material de S. typhi para ser utilizada nos estudos recombinantes indicados abaixo. O processo consistiu em inocular um meio de cultura líquido, com uma parte do conteúdo das cápsulas e plaqueamento da cultura líquida sobre um meio de agar com o fim de isolar colônias individuais de bactérias.

As colônias únicas foram isoladas e cultivadas em meio de cultura líquido. Duas culturas, nomeadamente VAX.Ty21-1 e VAX.Ty21-2 foram formuladas com glicerol, alíquotas (1 mL) e armazenadas a -75ºC t+ 5ºC de uso pendente. Identidade de cada uma das duas culturas foi ainda confirmada.

Exemplo 2: Construção do plasmídeo :

[00138] O princípio da síntese do plasmídeo baseia-se em cadeia dupla na síntese de genes in vitro, com as seguintes etapas: - A sequência inteira do plasmídeo pVAX10-VR2.1 de 7.58kB foi subdividido (por meio de análise de software) em 5 seções de -1,5 kb. Cada seção foi subdividida em oligonucleotídeos de 40 a 50 pb, cada tendo regiões de sobreposição entre os oliígonucleotídeos dos dois cordões —- Os oligoónucleotídeos sintetizados in vitro foram então fosforilados por incubação com polínucleotiídeo quinase T4 —- Após o processo de aquecimento de oligonucleotiídeos sobrepostos, sob condições apropriadas, à enzima DNA lígase Tag ligada aos oligonucleotídeos alinhados.

51 / 63 - Após a conclusão da etapa de ligação, PCR foi realizada utilizando os iniciadores aquecidos em posições exteriores, para aumentar o rendimento dos fragmentos de plasmídeo ligado (-1,5 kb) - A eletroforese em gel de agarose preparativa foi realizada para isolar os produtos de PCR - Os produtos de PCR isolados foram clonados em vetores TOPO (Invitrogen KH4575-40) e transformados em células de E. coli TOP10 para propagação - Após o isolamento do plasmídeo TOPO, uma restrição e sequência de verificação foi realizada - Os fragmentos alinhados isolados foram montados através de sobreposição de PCR. Este processo foi seguido de montagem linear do plasmídeo pvVAX10.VR2-1 - Após digestão de restrição com Xhol (local de restrição único presente no plasmídeo pVAXLO.VR2-1, ver Figura

2.1.5.1.2.2-1) e de ligação covalente através de T4 ligase, E. coli foi transformada com o plasmídeo circular para propagação - Após verificação final da sequência de plasmídeo, o plasmídeo PpVAX10.VR2-1 foi transformado na estirpe bacteriana de S. typhi Ty21a.

[00139] O plasmídeo pVAXL0O.VR2-1 foi então sintetizado com sucesso (sem desvio da sequência referência). Este plasmídeo foi depois utilizado para transformar as bactérias S. typhi Ty21a isoladas da estirpe (Vax.Ty21-1 e Vax.Ty21-2).

52 / 63 Exemplo 3: Processos de fabricação

[00140] A Tabela 2 a seguir resume cs processos de fabricação com/sen "alimentação de glicose durante a fermentação. Etapa de Processo variante A: com | Processo variante A: sem CÉLULAS (com/sem plasmídeo CÉLULAS (com/sem plasmideo ÉVAKI10,VR2-=1) PVAXIL1O.VR2-1) ; d Pré-culturas 350 ml TSB + canamícina (l1mL) 2 x 500 ml TSB + cenamicina Sala limpa + 1S00pL) classe D e A Y em D 5 x 550 mL TSB + canamicina tODeon > 0.3) 150mL) 10 x 1000 vd TSB + canamicidna LODsos > 0.5) [7 5mL) (ODem > 0.5) 30L Volume de fermentação 100 L Volume de fermentação TSB + 0,001%t galactose TSB + 0,001% galactose - 30º - 30º - Fluxo de Ar 2 l/min (0.07 |- Fluxo de Ar 100L/min (1 vvm) Tum) - EFressão não controlada - Pressão 1 bar - pl 7.0 controlada com NaOH Fermentação - EH 7.0 controlada com NaOH - espuma controlada (Corning) - po2 2 408 regulado porj- pOZ 2 40º regulado por Sala limpa agitador aqgitador classe D - alimentação de glicose X 5|/- agito mínimo 200 rpm = & q/1 - nenhuma alimentação de = —ODwwm Fical - 2.7 (alvo 6 - glicose 10) - Obi Final (final da fase - Arrefecimento a 15ºC antes de crescimento exponencial) da coleta - Arrefecimento à pelo menos 25ºC antes da coleta Coleta/ Filtração de fluxo cruzado Filtração de fluxo cruzado concentração/ —- Concentração 10 dobra - Concentração 10 dobra 1avagem - Troca de tampão 10 dobra em|- Troca de tampão 10 dobra em diafiltração com solução de|diafiltração com 15% sacarose, Sala 1impa sacarose 15%, seguido por uma |0.495% solução de ascorbato de classe D maior concentração de 1/15 /pfl 7,2, seguído por úma maior vol. da coleta original. concentração a 1/20 vol. da

53 / 63 - Formulação por adição de|colheita originais | ácido ascórbico para uma | Armazenamento à 2 a 8º C até o / concentração final de 0,45% enchimento 24 horas Armazenamento a 2 a 8º C até o enchimento 24 horas Enchimento. manual de 150 | Enchimento manual de 150 | frascos de 5 diluições frascos de 5 diluições - Ajuste de UFC - Ajuste de UFC - Suspensão 300mL — enchimento | - Suspensão 300ml — enchimento de 150 frascos de 150 frascos - Diltição de 30 ml dej- DilWição de 30 ml de Diluição/ suspênsão de 270 mL de solução | suspensão de 270 mb de solução enchimento de = de formulação, de enchimento |de Formulação, de enchimento de rascos de 150 2 R fráscos de vidro 150 2 R frascos de vidro - Quatro dilvições e |- Quatro diluições e enchimento Sala limpa enchimento de 150 frascos de|de 150 frascos de até 1:10.000 cláâsse À em B até 1:10,000 - Fechamento de frascos com — Fechamento de frascos com|tampa de borracha e tampas de tampa de borracha e tampas de | alumínio alumínio - Armazenamento em $ —70ºC - Armazenamento em -75ºC + 10ºC

[00141] O processo de crescimento de bactérias foi realizado em TSB 2x350 ml de meio contendo mais de 25 upa/ml de canamicina. Dois frascos de 2 L-Erlenmeyer com chicanas foram inoculados cada um com uma alíquota (1 ml) de Salmonella typhi Ty2la e Ty2la (pVAXKIO.VR2-l1), As culturas foram incubadas a 30ºC + 2ºC com agitação (140 rpm) até uma densidade óptica DOsoonm> 0.1 ser atingida. A coleta bacteriana (50 ml) com a primeira qultura foi usada para inocular uma segunda cultura (pré-cultura 2), 6x550 ml de meio TSB com canamicina (25 upg/ml) contido em 3frascos l-Fernbach com chicanas. As culturas foram incubadas a 30ºC * 2ºC com agitação (180 rpm) até uma densidade óptica a 600 nm da cultura bacteriana atingir um valor de 20,3, Após a conclusão do período de

54 / 63 incubação, a cultura principal (meio TSB com 0,001% de galactose) preparada num fermentador de aço inoxidável com um volume controlado de trabalho de 27 L foi inoculada com a pré- cultura 2 (agrupados 5 frascos de cultura bacteriana) e incubou-se a 30ºC com as seguintes definições: Fluxo de Ar a 2 l/min, à pressão de 1 bar, pH 7,0, pOr, 2 40%.

[00142] Metade das amostras de cultura foi alimentada com glicose, numa quantídade que forneceu uma concentração final de 2,0 g/l a 3,0 g/l no meio de cultura de partida. Alimentação de glicose foi realizada após 3 à 5 h após o início da fermentação e foi repetida várias vezes a cada 3 a 5 horas.

[00143] A outra metade das amostras de cultura foi tratada de forma idêntica, mas sem qualquer alimentação de glicose durante a cultura de células de Salmonella. Como controle, um meio de cultura foi testado que não continha qualquer glicose a partir do primeiro momento (meio TSB sem glicose).

[00144] A cultura bacteriana foi concentrada por filtração de fluxo cruzado (CFF)/diafiltração contra uma solução de sacarose a 15%. Cinco diluições do concentrado bacteriano final foram realizadas. O produto bacteriano final foi então colocado em alíquotas (1 ml) em frascos de 2R, os frascos fechados, rotulados, tapados e armazenados a -75ºC + 5ºC,

[00145] Controles durante o processo para às primeira e segunda etapas de pré-cultura, no final dos tempos de

55 / 63 incubação, incluem a análise do crescimento bacteriano medindo ODsoonas PH e UFC/ml, assim como a determinação da estabilidade do plasmídeo (PST) e exame bacteriano. A segunda análise foi baseada num ensaio de agar de sangue para a determinação de reações hemolíticas de microorganismos patogênicos exigentes. O valor UFC foi avaliado antes e depois do CFF. Após a formulação do concentrado bacteriano final, CFU e índice de refração foram medidos na formulação com a concentração mais baixa de bactérias, Exemplo 4: Crescimento de Salmonella typhi Ty21a (pVAX10,VR2- 1) com e sem canamicina

[00146] A produção da vacina de câncer bacteriano vivo baseia-se na fermentação de uma Salmonella enterica serovar typhi estirpe Ty2la (compreendendo o plasmídeo pVAX10.vVR2-1). Após orescimento à suspensão de células tem de ser concentrada por filtração de fluxo cruzado e lavada por diafiltração. Cinco diluições diferentes de suspensão de células lavadas devem ser preenchidas em 2 R frascos vidro.

[00147] Os objetivos destes frascos testes de crescimento foram: - verificação de taxa de crescimento para pré-cultura 1 e 2 para o planejamento de tempo do ciclo de produção —- investigar a influência da alimentação de glicose para alcançar alta concentração de células (valores ODsoo)

56 / 63

[00148] Os experimentos foram realizados a partir dos bancos de células mestras de Salmonella enterica typhi TY2la e Salmonella enterica typhi TY21a (PVAX10,.VR2-1) (=estirpe VMX01). O inóculo para fermentação foi preparado por uma préê- cultura de duas etapas (VK): 1 pré-cultura foi inoculada diretamente a partir do MCB; pré-cultura 2 foi inoculada por um maior volume de testes de pré-cultura 1. Testes de crescimento foram realizados para avaliar curso de tempo para o cultivo de pré-cultura em dois frascos de Erlenmeyer (l pré- cultura 1) e frascos 3 1 Fernbach Corning (pré-cultura 2). Pré-cultura foi feita com e sem canamicina para obter informações sobre o crescimento/fase exponencial de crescimento em ambas as condições.

[00149] Crescimento destes cinco frascos é comparado na Figura 5: : - VKla: 500 ml de meio TSB em 3 1 frasco Corning + 0,5 ml de MCB, 30ºC, 120 rpm - VKlb: 500 ml de meio TSB em 3 1 frasco Corning + 0,5 ml de MCB, 30ºC, 120 rpm —- VK2; 1000 ml de meio TSB em 3 1 frasco Corning + 75 ml VKib (OD 1,6), 30ºC, 120 rem - VKla k: 500 ml de meio TSB + 25 mg/l de sulfato de canamicina em 2 1 frasco Corning + 0,5 ml de MCB, 30ºC, 120 rpm - VKlb k: 500 ml de meio TSB + 25 ma/l de sulfato de canamicina, em 3 1 frasco Corning + 0,5 ml de MCB, 30ºC, 120 rpm

57 / 63 - VK2a k: 1000 ml de meio TSB + 25 sulfato de mg/l de canamicina, em 3 1 frasco Corning + 75 ml VKla k (OD 1,8), 30ºC, 120 rpm - VK2b k: 1000 ml de meio TSB + 25 sulfato de mg/l de canamicina, em 3 1 frasco Corning + 75 ml VKla k (OD 1,8), 30ºC, 120 rpm

[00150] Os resultados na Figura 5 mostram que não existem diferenças significativas entre o crescimento com e sem — canamicina, bem como no crescimento em 2 1 ou 3 ll frasco Corning respectivamente. O tempo de cultivo para a pré-cultura 1 a 30ºC deve estar entre cerca de 15 a 23 horas (ODsww - l à 4) pré-cultura 2 para inocular com células em fase exponencial. ODsoww mínimo para pré-cultura 2 (> 0,5) foi alcançado após 2 a 3 horas; fase exponencial de crescimento é caracterizada por valores de ODxowoW entre 0,5 e 3,0. Exemplo 5; Crescimento de Salmonella typhi Ty2la (vazia) com e sem alimentação de glicose

[00151] Testes de crescimento de três pré-culturas (1, 2, 3) foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 2 1 e duas etapas de cultura como foi feito com à estirpe de produção,

[00152] Pré-cultura 1 é inoculada diretamente à partir de RCB; pré-cultura 2 é inoculada por um maior volume de pré- cultura 1. Devido à ausência de resistência do plasmídeo que codifica à canamicina, antibiótico seletivo foi omitido no meio de cultura. Para avaliar a influência da etapa de pré- cultura (número de geração), adições repetidas glicose foram

58 / 63 realizadas em pré-cultura 1, bem como na pré-cultura 2, tanto em comparação com culturas "não pulsadas". Além disso, a glicose pulsada pré-cultura 1 foi utilizada como inóculo para pré-cultura 2 para acompanhar a reversibilidade da concentração glicose mediada impacto metabólico. Pré-cultura 3 representa uma pré-cultura cultivada com alimentação de glicose (pulsação) inoculadas em meio TSB fresco (com ou sem glicose).

[00153] As designações de amostra como utilizadas nas Figuras 6 a 11 são como se segue: - VKla: 500 ml de meio TSB em 2 1 frasco Corning + 0,5 ml de RCB, 30ºC, 120 rpm - VKlib: 500 ml de meio TSB em 2 1 frasco Corning + 0,5 ml de RCB, 30ºC, 120 rpm + adição de Glicose —- VK2a: 500 ml de meio TSB em 2 1 frasco Corning + 38 ml VKla (OD 5,4), 30ºC, 120 rpm —- VK2b: 500 ml de meio TSB em 2 1 frasco Corning + 38 ml VKla (OD 5,4), 30ºC, 120 rpm + adição de Glicose - VK3a: 500 ml de meio TSB em 2 1 frascos Corning + 38 ml VKlb (OD 5,1, 5 horas após a adição primeira glicose) 30ºC, 120 rpm - VK3b: 500 ml de meio TSB em 2 L Corning balão + 38 ml VKlb (OD 5,1, 5 horas após a adição prímeira glicose) 30ºC, 120 rpm + adição de Glicose.

[00154] Os resultados destas experiências mostram que a adição de glicose não resulta em valores superiores de OD/rendimentos de massa célula da estirpe do tipo selvagem,

59 / 63 apesar do consumo de glicose. Em contraste, os frascos sem adição de glicose atingiram valores elevados de OD (6 de pré- cultura 1, 8 para a pré-cultura 2). Aprox. 1 h após à adição glicose, OD permaneceu estático (ou mesmo diminuído ligeiramente) em comparação com o crescimento sem adição glicose. Em impulsos repetidos, consumo glicose diminuiu, nenhum efeito adicional/aditivo sobre o crescimento foi observado.

[00155] Sem adição glicose uma mudança de pH para alcalino foi observada após depleção de glicose, enquanto o valor do pH no pulso de glicose caiu (comparar com a Figura 8 para a pré- cultura 1 e a Figura 9 para pré-cultura 2). Fenômenos foram observados em ambas as pré-culturas (VKl, VK2), indicando que não há influência do número de geração.

[00156] Quando uma pré-cultura cultivada com pulso de glicose foi inoculada em meio fresco (diluição 1:14; VK3; Figura 10, Figura 11), as mesmas características de crescimento (deslocamento valores mais elevados de OD/pH a alcalino, sem adíção glicose) foram observados.

[00157] Os resultados indicaram que as concentrações de glicose acima de um limite comparativamente baixo (aprox. 2,5 g/l1) desencadeiam uma mudança reversível no metabolismo (glicose). Presumivelmente, uma substância é então secretada no meio que inibe O crescimento, mesmo se glicose diminui "novamente abaixo do nível do gatilho. Após a

60 / 63 inoculação em meio novo (VK3), esta substância é diluída para uma concentração abaixo de eficácia. Exemplo 6: Crescimento da estirpe de vacina do câncer de Salmonella typhi Ty21a (pVAXIO.VR2-1) (= VXMO01) de produção modificada com e sem alimentação de glicose.

[00158] A mesma abordagem experimental que a descrita no Exemplo 5 foi realizada com a estirpe VXMOl de produção da vacina contra o câncer. A única diferença com o exemplo 5 é que a estirpe foi transformada com o plasmídeo pVAX10.VR2-1. Estas investigações foram realízadas para suportar a hipótese de que as características de crescimento da estirpe de produção de S. typhi Ty2la:pVAXI0O VR2.1(p) em relação ao metabolismo da glicose não é influenciada pelo plasmídeo, mas uma característica da estirpe vazia. Crescimento e pulsos de glícose de ambas as estirpes são comparadas na Figura 11 e Fígura 12.

[00159] Os resultados mostram que as características de crescimento de ambas as estirpes (S. typhi Ty2la vazia e estirpe de produção modificada) são comparáveis, Nenhuma indicação para a influência do plasmídeo foi observada. Além disso, embora as células cultivadas sem glicose mostrem uma morfologia diferente em comparação com as células cultivadas na presença de glicose, elas não mostram qualquer aumento da lise celular e não diminui a estabilidade do plasmídeo (no caso das células manipuladas), em comparação com as células cultivadas com glicose,

NNE RR RR RO ROO RO RO A a gg a gg A as a a aa Lao a a [a Po mo DP pe Ra as aa a a

NNE RR RC O RO RO O ao a a

NNE RN O O O O O ao sa a Lago sa a ag [| aa ao a ao a aero CI Paso e aa

62 / 63 Tabela 4: Concentração de glicose durante o processo de fermentação | IM) | vRlak | vRIDk| vR2a x [VR | | o | 24 | 24 | 2,5 | 2,6 | La a) ao og ao ag a : sv a so 3,9 | o |

A MO RO

A Bo aa

ENE RC O aa ao 2 ago a Ta a E | 1670 | oa aa 17,0 a ao ga Paso a aaa aro

ER 230 a agro as) ao aro aaa a sao

63 / 63 Tabela 5: Mudança de valor de pH durante o processo de fermentação Lo 6&e | 6 | 65 | ES | a A ea a A nv va Ra ao DS | 65

NET RR A CS gv va 62 | ss 5,91 |

NNE RR RS RS

NTE RR RS RS a ça sa | a A a

NES RR RS RO

NNE RR RS RS a

NET RN RO O Paso sz 160 se anos [180 [sa a a 9/0 sa

FA AAA Pao asa aa [asso e a a a | g,28 |

RNREZIRSR R O ata a ag Bag

RENT RR RO O sao sa

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para o cultivo de uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi sem atividade de galactose epimerase e caracterizada por compreender pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um cassete de expressão, compreendendo a etapa de cultivo da estirpe em um meio tamponado compreendendo peptona no valor de pH de partida aproximadamente neutro na escala de fermentação, em que a quantidade de glicose no meio durante à fermentação é ajustada de tal modo que a quantidade de glicose é reduzida a zero antes de atíngir a fase estacionária.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por nenhuma glicose ser adicionada ao meio durante a fermentação e à quantidade de partida de glicose ser esgotada antes de atingir à fase estacionária.

“

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por a referida estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi ser Salmonella typhi Ty21la.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado por a cassete de expressão ser um cassete de expressão eucariótica, de preferência codificadora de uma proteína receptora de VEGF, de preferência uma proteina receptora de VEGF selecionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 humano e um homólogo deste, que divide pelo menos cerca de 80% de homologia com os mesmos, particularmente em que o VEGFR-2 humano tem a sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 4, caracterizado por o meio tamponado compreender peptona de origem não-animal, de preferência em que o referido meio tamponado é Tryptic Soy Broth (TSB) de origem não- animal.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 5, caracterizado por o volume dos meios ser de pelo menos cerca de 10 L, de preferência de cerca de 10 L à cerca de

10.000 L, mais preferivelmente de cerca de 30 L à cerca de

1.000 L, mais preferencialmente desde cerca de 100 L a cerca de 500 L.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 6, caracterizado por a concentração de glicose de partida corresponder ao mínimo meio bacteriano ou menos, de preferência em que a concentração de glicose de partida é de cerca de 0 9/1 até cerca de 4 qg/l1.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 7, caracterizado por o valor de pH de partida ser de cerca de 5 à menos de cerca de 9, de preferência de cerca de 6 a cerca de 8, mais preferivelmente de cerca de 6,5 a cerca de 7,5.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | e 8, caracterizado por o valor de pH ser ajustado durante a referida cultura à um valor de cerca de pH 6 a cerca de 8, de preferência para um valor de pH de cerca de 6,5 à cerca ae 7,5.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 9, caracterizado por o progresso do crescimento Ser determinado por: (i) medição da densidade óptica (OD), de ' preferência por (ia) monitoramento in situ da densidade óptica da cultura ou pela (ib), recolhimento de amostras e medição da densidade óptica das amostras, ou por (ii) medição da densidade celular, de preferência (iia) microscopicamente ou (iibj) por medição da resistência elétrica ou (iic) por citometria de fluxo, ou por (iii) medição do valor de unidades formadoras de colônias (UFC) por recolhimento de amostras e de plaqueamento em placas de ágar.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 10, caracterizado por as células serem colhidas antes de atingir uma densidade óptica de cerca de 6, de preferência a uma densidade óptica de cerca de 5 à cerca de 6.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 11, caracterizado por a estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi ser Salmonella typhi Ty2la e à molécula de DNA recombinante compreender o gene de resistência à canamicina, o pPpMBl ori e uma cassete de expressão eucariótica que codifica para o VEGFR-2 humano, sob o controle do promotor de CMV, particularmente em que o humano de VEGFR-2 tem a sequência de ácido nucleico tal como encontrada na SEQ ID NO 2.

13. Uma estirpe mutante atenuada de Salmonella typhi deficiente ná atividade de galactose epimerase e compreendendo pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante caracterizada por compreender um cassete de expressão obtenível por um método para o crescimento da estírpe, compreendendo a etapa de cultivar a estirpe em um meio tamponado compreendendo peptona em pH inicial aproximadamente neutro em escala de fermentação, em que à quantidade de glicose no meio durante à fermentação é ajustada de tal modo que a quantidade de glicose é reduzida a zero antes de atingir à fase estacionária, preferivelmente em que não há à adição de ' glicose ao meio durante a fermentação e a quantidade inicial de glicose é esgotada antes atingir a fase estacionária.

14. Estirpe mutante atenuada de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o cassete de expressão ser um cassete de expressão eucariótica que codifica para uma proteina receptora de VEGF, de preferência uma proteína receptora de VEGF selecionada entre o grupo consistindo de VEGFR-2 humano e um homólogo deste, que divide pelo menos cerca de 80% de homologia com os mesmos, particularmente em que o s/5 VEGFR-2 humano tem a sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1.

15. Estirpe mutante atenuada de acordo com à reivindicação 14, caracterizada por a estirpe mutante átenuada ser Salmonella typhi Ty2la e a molécula de DNA recombinante compreender o gene de resistência à canamicina, o pMB1l ori e um cassete de expressão eucariótica que codifica para o VEGFR-2 humano sob o controle do promotor CMV, particularmente em que o VEGFR-2 humano tem a sequência de ácido nucleico tal como encontrada na SEQ ID NO 2.

16. Uma estirpe mutante atenuada de Saimonella typhi Ty2la, caracterizada por compreender pelo menos uma cópia de uma molécula de DNA recombinante compreendendo um cassete de expressão eucariótica que codifica para uma proteína receptora de VEGF, de preferência uma proteína receptora de VEGF selecionada entre o grupo consistindo de VEGEFR-2 humano e um homólogo da mesma que divide pelo menos cerca de 80% de homologia com os mesmos, particularmente em que o VEGFR-2 humano tem a sequência de aminoácidos tal como encontrada na SEQ ID NO 1 para uso como uma vacina.