KR20070011446A - 개의 냉- 및 멘톨-민감 수용체 1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규의 개 냉각- 및 멘톨-민감 수용체(개 CMR1(cCMR1)으로 지칭함)를 기술하는 핵산 및 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 분리된 핵산 또는 폴리펩티드 분자가 검출 시험과 검색 시험에 사용될 수 있다.

Description

개의 냉- 및 멘톨-민감 수용체 1{Canine cold- and menthol-sensitive receptor 1}

[관련 출원에 대한 참조]

본 출원은 2004. 4. 8자 출원된 미국출원 제 60/560,400호 및 2004. 10. 22자 출원된 미국출원 제 60/621,223호에 대해 우선권을 주장하며, 이들 전 내용은 본 발명에서 참고 자료에 속한다.

본 발명은 열수용체 이온 채널(ion channel) 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신규의 개의 냉- 및 멘톨-민감 수용체, CMR1의 분리된 핵산 분자와 폴리펩티드, 및 이들의 용도에 관한 것이다.

뉴우런 조직에서 열 및 냉 감각의 검출, 전달(transduction) 및 전파(transmission)에 관련된 생화학 메카니즘을 규명하는데 상당한 노력을 기울여 왔다. 열 자극은 감각 뉴우런, 이를테면 후근 신경절(DRG)과 삼차 신경절(TG)로부터 유래한 뉴우런 상에 위치한 특정 수용체를 활성화한다. 이들 자극이 유해 범위에 있을 때(즉, 매우 뜨겁거나 찰 때), 이들은 통각 수용기(통증-감각 뉴우런)라 지칭한 감각 뉴우런의 서브-모집단(sub-population) 상의 일정 세트의 열 수용체를 활성화한다. 활성화시, 열 수용체(예, 이온 채널)는 유해 자극을 감각 뉴우런에 따라 척수로 전달되는 전기 신호로 전달하며, 척수에서 뇌에 중계되고, 궁극적으로 통증의 인식을 유도한다. 따라서, 이들 열 수용체는 다양한 고통 증상의 치료를 위한 약물을 개발하는데 아주 유망한 목표를 나타낸다.

몇몇 온도-활성화 수용체는 열을 감지하는데 연관된 바 있다. TRPV1(VR1: 캅사이신- 및 열-활성화 채널)은 대부분의 포유류가 유해한 것으로 인식하는 온도인, 43℃ 근처에서 활성화된다. TRPV1에 대해 40% 이상의 아미노산 수준 동정치를 가진 다른 TRPV 채널이 또한 서머센서(thermosensor)로서 클로닝되고 특성화된 바 있다. 이들 채널은 TRPV3에 대해 39℃(따뜻함) 내지 TRPV2/VRL1에 대해 55℃(고역치 유해 열) 범위로, 다양한 열 역치(threshold)에서 활성화된다(참조: Story et al., Cell, 2003, 112: 819-829, 및 참고내용). 비교하여, TRPV4는 실온에서 구조적으로 개방되며 약 27℃보다 큰 온도에서 활성화된다(Gueler et al., J. Neurosci. 2002). 이들 온도-활성화 수용체는 비-선택적 양이온 채널의 일과성 수용체 포텐셜(TRP) 패밀리에 속하며, 문헌[C. elegans and D. melanogaster]에서 기계적 조절과 삼투압 조절에 연관되어 있다. TRP 채널은 TRPC(정규 또는 용량성 서브패밀리), TRPV(바닐로이드 서브패밀리), 및 TRPM(멜라노스타틴 서브패밀리)로 지정된 3개 서브패밀리로 분할되어 있다. 모두 막통과 영역 5 내지 6 사이에 제시된 기공 영역이 있는 6개의 추정 막통과 영역을 가진다. TRP 채널은 세포질 N- 및 C 말단이 있다고 생각된다(참조: Story et al., 상기, 및 참고내용).

더 최근에, TRP 패밀리의 단백질에 속하고 냉각 자극에 대한 반응을 조절하는 단백질이 발견된 바 있다. 쥐의 CMR1 단백질("냉각- 및 멘톨-민감 수용체"에 대해; McKemy, D.D. et al., Nature, 416: 52-58, 2002) 및 새앙쥐의 TRPM8 단백질("일과성 수용체 포텐셜 채널, 멜라노스타틴 서브패밀리, 타입 8"; Peier, A.M. et al., Cell 108: 705-715, 2002)은 비교적 저온에 노출시 활성화되는 흥분 이온 채널로서 작용하는 듯하다. TRPM8 활성화의 역가는 대략 약 23℃이다. 쥐의 CMR1과 새앙쥐의 TRPM8은 또한 냉감을 일으키는 화합물, 이를테면 멘톨과 이실린에 민감하다. 흥미롭게도, 쥐의 CMR1과 새앙쥐의 TRPM8은 이들의 아미노산 서열 전체 길이에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 공유한다.

열 수용체는 통증 치료를 위한 강력한 목표이므로, 추가 열 수용체를 확인할 필요가 있다. 또한 이들이 시험 화합물의 효과를 연구하는 모델 시스템으로서 사용될 수 있으므로, 서로 다른 종류의 열 수용체를 확인할 필요가 있다. 특히, 냉각 자극에 반응하는 열 수용체의 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 시험 화합물에 사용될 수 있는 시스템에 대한 필요가 있다. 이러한 화합물의 확인과 시험은 만성 통증과 관련한 다양한 질병의 치료를 가능하게 하거나 조직 냉각이 요망되는 다른 증상에 사용하게 할 수 있다.

[요약]

현재 본 발명에서 개의 CMR1(cCMR1)이라 명명된, 개의 단백질이 냉각 자극에 대한 반응을 조절하고 TRP 패밀리의 단백질에 속한다는 것을 알아냈다.

일예에서, 본 발명은 냉각 자극을 검출하고 형질도입하며 SEQ ID NO:2에 적어도 96% 서열 일치성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 코팅하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 아미노산 서열 SEQ ID NO:2을 가진 cCMR1 단백질을 코팅하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터(vector) 또는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 추가로 가혹한 하이브리드 형성 조건하에 본 발명의 핵산 분자에 선택적으로 하이브리드화하는 핵산 탐침, 및 이러한 탐침을 포함하는 키트를 제공한다.

다른 일예에서, 본 발명은 냉각 자극을 검출하고 형질도입하며 SEQ ID NO: 2에 적어도 96% 서열 일치성을 가질 수 있는 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2를 가진 cCMR1 단백질을 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 a) 본 발명의 폴리펩티드를 코팅할 수 있는 발현 벡터를 세포에 도입하고; b) 발현 벡터로부터 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체, 및 이러한 항체를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 특이하게 결합할 수 있는 제제와 접촉하는 단계를 포함하는, 본 발명의 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 시험 화합물을 cCMR 유전자의 발현을 조절하는 메카니즘을 포함하는 세포와 접촉하고; (b) 시험 화합물이 세포로부터 메카니즘에 의해 조절된 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하는, cCMR1 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 시험 화합물을 이온 채널과 접촉하고; (b) 시험 화합물이 이온 채널의 전도도(conductivity)를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하는, cCMR1 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일예는 (a) 이온 채널을 서브-비활성화 양의 칼슘을 함유한 완충액에서 배양하고; (b) 이온 채널을 활성화하며; (c) 이온 채널을 시험 화합물과 접촉시키고; (d) 완충액에서 칼슘 양을 증가시키며; (e) 칼슘의 세포 내 양을 측정하고, 이온 채널이 시험 화합물과 접촉되지 않은 대조군의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 포유류의 CMR1 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법을 포함한다.

추가로, 본 발명은 (a) 시험 화합물을 cCMR1 이온 채널과 접촉시키고; (b) 시험 화합물의 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하는, 통증을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 이 방법은 추가로 (a) 시험 화합물을 동물에 투여하고; (b) 시험 화합물이 동물의 통각 수용/통각 방위 반응을 변경하는 정도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 일예, 특징 및 장점은 본 발명의 상세한 설명 및 그의 바람직한 구체예 및 첨부한 특허청구범위를 비롯하여, 다음 상세 내용으로부터 명백할 것이다.

[상세한 설명]

본 발명에서 인용한 모든 문헌은 참고 자료에 속한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술에서 통상의 숙련자에게 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 사용된, "포함하는", "함유하는", "가진" 및 "비롯한"은 이들의 개방적이고, 비제한적인 의미로 사용된다.

다음은 본 명세서에서 사용된 때의 약호이다:

bp = 베이스 페어(base pair)

cDNA = 보충 DNA

CMR1 = 냉각- 및 멘톨-민감 수용체 1;

cCMR1 = 개의 냉각- 및 멘톨-민감 수용체 1;

DRG = 척수 신경절

ELISA = 효소 면역측정법

FLIPR = 형광 이미지화 플레이트 리더

kb = 킬로베이스; 1000 베이스 페어즈

nt = 뉴클레오티드

PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

PCR = 폴리머라제 사슬 반응

RT-PCR = 역전사 폴리머라제 사슬 반응

SDS = 소듐 도데실 설페이트

SSC = 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트

TG = 삼차 신경절

TRPM8 = 일과성 수용체 포텐셜 채널, 멜라노스타틴 서브패밀리, 타입 8

UTR = 번역 안 된 영역

폴리펩티드 또는 핵산의 "활성", "생물 활성", 또는 "작용 활성"은 표준 기술에 따라, 생체 내, 또는 시험관 내에서 측정된 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 나타낸 활성을 의미한다. 이러한 활성은 직접 활성, 이를테면 제 2 단백질과 관련된, 이온 채널 활성 또는 제 2 단백질 상의 효소 활성, 또는 간접 활성, 이를테면 다단계의, 일련의 패션으로 일어나는 상호 작용을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 추가 단백질 또는 다른 분자와 단백질의 상호 작용에 의해 매개된 세포 신호 활성일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "생물 샘플"은 세포 또는 조직 물질, 이를테면 세포 또는 대상(subject)으로부터 분리된 세포 또는 생물 유체를 함유하거나 구성된 샘플을 뜻한다. "대상"은 치료, 관찰 또는 실험 목적인 포유류, 이를테면 쥐, 새앙쥐, 원숭이, 또는 인간일 수 있다. 생물 샘플의 일예는 예를 들어, 가래, 혈액, 혈액 세포(예, 백혈구 세포), 양수, 플라즈마, 정액, 골수, 조직 또는 세침 생검 샘플, 오줌, 복수, 흉수, 및 세포 배양체를 포함한다. 생물 샘플은 또한 조직학 목적으로 취한 동결 절편과 같은 조직의 절편을 포함할 수 있다. 시험 생물 샘플은 분석, 검사, 또는 관찰의 목적인 생물 샘플이다. 대조 생물 샘플은 시험 생물 샘플에 대해 양성 또는 음성 대조군일 수 있다. 때로, 대조 생물 샘플은 시험 생물 샘플의 형태와 동일한 중요 조직, 세포 및/또는 생물 유체를 함유한다.

"세포"는 검출 방법의 민감도에 적합한 적어도 하나의 세포 또는 복수 세포를 뜻한다. 본 발명에 적합한 세포는 세균성이지만, 바람직하게는 진핵성이며, 가장 바람직하게는 포유류이다.

"클론"은 유사분열에 의한 단일 세포 또는 공통 조상으로부터 유래한 세포의 모집단이다. "세포주"는 세포의 클론 확장을 유발하고 많은 세대 동안 시험관 내에서 안정하게 성장할 수 있는 일차 세포이다.

"냉각- 및 멘톨-민감 수용체", "CMR1", "일과성 수용체 포텐셜 채널, 멜라노스타틴 서브패밀리, 타입 8", 또는 "TRPM8" 단백질은 각각 냉각 자극, 이를테면 냉각 온도 또는 멘톨과 이실린을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 냉각 감각을 일으키는 화합물을 감지하고 형질 도입할 수 있는 단백질을 뜻한다. "CMR1"은 흥분 이온 채널, CMR1 채널을 형성할 수 있으며, 이것은 저온 또는 냉각 감각을 일으키는 화합물에 의해 활성화될 수 있다. 활성화된 CMR1 채널은 채널을 통해 Ca⁺⁺ 이온의 유입을 제어하여, 막 감극을 초래한다. CMR1 단백질은 (1) SEQ ID NO: 2로 기술한 개의 CMR1(cCMR1) 단백질에 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지거나; (2) SEQ ID NO: 2로 기술한 cCMR1 단백질에 대해 대비하는, 항체, 예를 들어 다클론 또는 일클론 항체에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, CMR1은 SEQ ID NO: 2에 대해 약 85, 90, 또는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진다. CMR1의 일예는 cCMR1을 포함하며, 이것은 SEQ ID NO: 2로 기술한 cCMR1 단백질의 구조적 및 기능적 다형태를 포함한다. "다형태"는 모집단의 개체 중 특정 유전자 자리에서 유전자 변이체의 세트를 뜻한다. CMR1은 또한 인간, 쥐, 새앙쥐, 돼지, 개 및 원숭이를 비롯한 다른 동물에서 개의 CMR1의 상동 유전자(ortholog), 예를 들어 쥐의 CMR1(GenBank protein ID: NP_599198), 또는 새앙쥐 TRPM8(GenBank protein ID: NP_599013)의 구조적 및 기능적 다형태를 포함한다. CMR1 유전자는 일정한 뉴우런 조직, 이를테면 DRG 및 TG에서 자연적으로 발현된다.

"CMR1 활성화 온도"는 CMR1 채널이 기준선에 비해 그의 전도도가 적어도 10% 증가를 나타내는 온도이다. 본 기술의 숙련자는 실험적으로 CMR1 채널에 대한 활성화 온도를 측정할 수 있다. 일부 구체예에서, "CMR1 활성화 온도"는 CMR1 채널이 기준선에 비해 그의 전도도가 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 증가를 나타내는 온도이다. "CMR1 활성화 온도"는 전형적으로 약 6 내지 28℃이다. 일부 구체예에서, CMR1 활성화 온도는 약 15-28℃, 19-28℃, 23-28℃, 또는 19-24℃이다.

"CMR1 비활성화 온도"는 "CMR1 활성화 온도"에 대한 범위 외에 속하는 온도이다. CMR1 비활성화 온도의 일예는 37℃이다.

"유전자"는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 제조하는데 관련된 DNA, 및코딩 영역, 코딩 영역에 선행하고("5'UTR") 후행하는("3'UTR") 비코딩 영역을 비롯한, 이러한 단백질 종을 코딩하는 mRNA의 세그먼트이다. "유전자"는 또한 각각의 코딩 세그먼트("엑손") 사이에 끼어있는 비-코딩 서열("인트론")을 포함할 수 있다. "프로모터"(promoter)는 유전자의 전사를 시작하도록 RNA 폴리머라제의 결합에 연관되는 DNA의 조절 서열을 의미한다. 프로모터는 때로 유전자의 전사 개시 부위의 상류에 있다("5' 쪽으로"). "조절 서열"은 유전자의 발현을 조절할 수 있는 유전자의 일부를 뜻한다. "조절 서열"은 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 폴리아데닐화 시그널과 같은 발현 조절 요소, 리보좀 결합 부위(세균 발현을 위한), 및/또는, 오퍼레이터를 포함할 수 있다. "인핸서"는 거리- 및 배열-의존 패션으로 유전자의 발현을 조절할 수 있는 DNA의 조절 서열을 의미한다. "코딩 영역"은 아미노산을 코딩하는 유전자의 일부 및 세쌍-염기 코돈에 의해 대응하는 폴리펩티드의 번역을 위한 개시 및 정지 시그널을 의미한다.

"핵산 서열" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 단일- 또는 이중-가닥 형태에서 폴리머의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 잔기의 배열을 뜻한다. 핵산 서열은 염기 티미딘, 아데닌, 시토신, 구아닌, 및 우라실; 약호로 각각 T, A, C, G, 및 U의 천연 뉴클레오티드, 및/또는 합성 유사체로 구성될 수 있다.

"올리고뉴클레오티드"는 비교적 짧은 길이, 예를 들어 100 미만 길이의 잔기의 단일-가닥 DNA 또는 RNA 서열을 뜻한다. 많은 방법에 대해, 길이 약 16-25의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드가 유용하며, 그렇지만 약 25 이상의 뉴클레오티드의 더 긴 올리고뉴클레오티드가 때로 이용될 수 있다. 일부 올리고뉴클레오티드가 상보 핵산 가닥의 합성을 위한 "프라이머"(primer)로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 프라이머는 상보 핵산 서열을 하이브리드화하여 DNA 폴리머라제를 이용한 반응에서 상보 DNA 가닥의 합성을 촉진할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 핵산 검출의 일부 방법에서, 예를 들어 노던 블로팅(Northern blotting) 또는 현장 하이브리드화에서 하이브리드화에 유용하다.

"폴리펩티드 서열" 또는 "단백질 서열"은 폴리머에서 아미노산 잔기의 배열을 뜻한다. 폴리펩티드 서열은 희귀 아미노산 및 합성 아미노산 유사체에 더해, 표준 20개의 천연 아미노산으로 구성될 수 있다. 더 짧은 폴리펩티드가 일반적으로 펩티드로서 지칭된다.

"분리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 원에 존재한 다른 핵산 분자로부터 분리되는 분자이다. "분리된" 핵산 분자는 예를 들어 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 5' 및 3' 단부에 핵산 분자를 자연스럽게 측면에 위치하게 하는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나가 없는 핵산 분자일 수 있다. 분리된 핵산 분자는 제한 없이, 벡터, 자기 복제 플라즈미드, 바이러스(예, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 헤르페스 바이러스)로 일체화되거나, 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 일체화되는 핵산 분자뿐 아니라, 다른 서열과 독립하여 별도 핵산 분자(예, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)를 포함한다. 또한, 분리된 핵산 분자는 하이브리드 또는 융합 핵산 분자의 일부인 핵산 분자를 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 (i) 예를 들어, 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 시험관 내 증폭되거나; (ii) 예를 들어 화학 합성에 의해 합성되거나; (iii) 클로닝에 의해 재조합하여 생성되거나; (iv) 분해 및 전기영동 또는 크로마토그래피 분리에 의한 것처럼 정제되는 핵산 서열일 수 있다.

"분리되거나" "정제된" 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분은 세포 물질 또는 세포 또는 단백질이 유래하는 조직원으로부터 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 케미칼이 실질적으로 없다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이란 분리되거나 재조합하여 생성되는 세포의 세포 성분으로부터 단백질이 분리되는 단백질 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질은 이종 단백질(또한 본 발명에서 "오염 단백질"로서 지칭됨)이 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만(건조 중량에 의해)인 단백질 제제를 포함한다. 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분이 재조합하여 생성될 때, 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉 배양 배지가 단백질 제제 부피의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만을 나타낸다. 단백질이 화학적 합성에 의해 생성될 때, 바람직하게는 화학 전구체 또는 다른 케미칼이 실질적으로 없으며, 즉 단백질의 합성에 연관되는 화학 전구체 또는 다른 케미칼로부터 분리된다. 따라서 이러한 단백질 제제는 중요한 폴리펩티드 이외의 화학 전구체 또는 화합물이 약 30%, 20%, 10%, 5%(건조 중량에 의해) 미만이다. 분리된 생물학적 활성 폴리펩티드는 몇몇 다른 물리적 형태를 가질 수 있다. 분리된 폴리펩티드는 전신 신생(full-length nascent) 또는 미가공 폴리펩티드로서, 또는 부분 가공된 폴리펩티드로서 또는 가공된 폴리펩티드의 조합물로서 존재할 수 있다. 전신 신생 폴리펩티드는 전신 신생 폴리펩티드의 단편 형성을 초래하는 특이 단백질분해 절단 이벤트에 의해 번역 후로 수정될 수 있다. 단편, 또는 단편들의 물리적 연합체는 전신 폴리펩티드와 관련한 생물 활성을 가질 수 있으나; 각 단편들과 관련한 생물 활성의 정도는 달라질 수 있다. 분리되거나 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 예를 들어 화학적 합성 방법에 의해 합성된 폴리펩티드뿐 아니라, 분리된 핵산 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드, 및 생물학적 물질로부터 분리되고, 종래의 단백질 분석 또는 예비 과정을 이용하여, 본 발명에서 설명된 방법에 따라 사용되게 하는 정도로 정제된 폴리펩티드일 수 있다.

"재조합"이란 분자 생물학 기술을 이용하여 그의 천연 상태 외의 어떤 것으로 변형된, 핵산, 세포 또는 바이러스 입자에 의해 코드화된 단백질인, 핵산을 뜻한다. 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 본래(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있거나 달리 비정상적으로 발현되거나, 발현 중이거나, 또는 전혀 발현되지 않는 본래 유전자를 발현할 수 있다. 재조합 세포는 또한 유전자가 변형되고 인공 수단에 의해 세포로 재-도입되는 세포의 본래 형태에서 발견된 유전자를 함유할 수 있다. 용어는 또한 세포로부터 핵산을 제거하지 않고 변형된 내생(endogenous) 핵산을 함유하는 세포를 포함하며; 이러한 변형은 예를 들어 유전자 치환, 및 부위-특이 돌연변이에 의해 얻어진 것들을 포함한다.

"재조합 숙주 세포"는 재조합 DNA 서열로 도입된 세포이다. 재조합 DNA 서열은 예를 들어, 전기 천공, 칼슘 포스페이트 침전, 마이크로주사, 형질전환, 바이올리스틱(biolistics) 및 바이러스 감염을 비롯한, 적합한 방법을 이용하여 숙주 세포로 도입될 수 있다. 재조합 DNA는 세포의 게놈을 완성하는 염색체 DNA로 합체되거나(공유 결합) 되지 않을 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA는 에피솜 요소, 이를테면 플라즈미드 위에 유지될 수 있다. 별도로, 안정하게 형질전환되거나 핵산전달감염된 세포에 대해, 재조합 DNA는 염색체에 합체되어 염색체 복제를 통해 자세포에 의해 유전된다. 이러한 안정성은 외생 DNA를 함유한 자세포의 모집단으로 구성된 세포주 또는 클론을 확립하도록 안정하게 형질전환되거나 핵산전달감염된 세포의 능력에 의해 설명된다. 재조합 숙주 세포는 E. coli와 같은 박테리아, 효모와 같은 진균 세포, 인간, 소, 돼지, 원숭이 및 설치료의 세포주와 같은 포유류 세포, 및 Drosophila- 및 누에-유래 세포주와 같은 곤충 세포를 비롯한, 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. "재조합 숙주 세포"란 특정 대상 세포뿐 아니라, 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 뜻한다. 일정한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 계대로 발생될 수 있으므로, 이러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않고 본 발명에서 사용된 용어의 범위 내에 포함될 수 있다.

본 발명에서 사용된, "실시가능하게 연결된"은 2개의 핵산 서열 사이의 기능적 관계를 뜻한다. 예를 들어, 코딩 서열의 발현(예를 들어, 전사)을 조절하는 프로모터 서열은 이 코딩 서열에 실시가능하게 연결된다. 실시가능하게 연결된 핵산 서열은 많은 프로모터 서열의 전형으로서 접촉성(contiguous)이거나, 예를 들어 억제 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 경우, 비접촉성일 수 있다. 재조합 발현 벡터 내에서, "실시가능하게 연결된"은 예를 들어 시험관 내 전사/변역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입될 때 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현이 가능한 방식으로 중요한 코딩 서열이 조절 서열에 연결된다는 것을 의미하려는 것이다.

"벡터" 또는 "구성체"(construct)은 이종유래 핵산일 수 있거나 삽입되는 핵산 분자를 뜻한다. 일부 벡터는 벡터의 복제를 고려하거나 벡터 또는 구성체에 의해 코드화되는 단백질의 발현을 고려하는 숙주 세포로 도입될 수 있다. 벡터는 전형적으로 선택성 마커(marker), 예를 들어 내약물성을 고려한 단백질을 코딩하는 유전자, 복제 서열의 기원, 및 이종유래 서열의 삽입을 고려하는 복수 클로닝 부위를 가진다. 벡터는 전형적으로 플라즈마계이며 소문자 "p" 다음에 문자 및/또는 숫자의 조합에 의해 명명된다. 본 발명에서 개시된 출발 플라즈미드는 상용되어, 무제한적으로 공개적으로 이용가능하거나, 본 기술에서 공지된 과정의 응용에 의해 이용가능한 플라즈미드로부터 구성될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 많은 플라즈미드 및 기타 클로닝 및 발현 벡터는 잘 알려져 있으며 본 기술의 숙련자에게 쉽게 이용될 수 있다. 더구나, 숙련자는 본 발명에서 사용하는데 적합한 많은 수의 다른 플라즈미드를 구성할 수 있다. 본 발명에서, 다른 벡터뿐 아니라, 이러한 플라즈미드의 특성, 구성 및 용도는 본 문헌으로부터 숙련자에게 명백할 것이다.

"서열"은 모노머가 폴리머에서 일어나는 직선 순서, 예를 들어 폴리펩티드에서 아미노산의 순서 또는 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 순서를 의미한다.

본 기술에서 알려진, "서열 동일성 또는 유사성"은 서열을 비교함으로써 결정된, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 본 발명에서 사용된, "동일성"은 2개 이상의 핵산 서열 또는 2개 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 문맥에서, 서열이 최적으로 배열되고 분석될 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 퍼센트를 각각 뜻한다. 예를 들어 아미노산 서열 SEQ ID NO 2에 대한 문제 서열을 비교할 목적으로,문제 서열을 SEQ ID NO 2와 최적으로 배열하고 SEQ ID NO 2의 전체 길이(1104 아미노산)에 걸쳐 가장 좋은 국소 배열을 얻는다.

손으로 또는 서열 비교 알고리듬을 이용하여 분석할 수 있다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 기준 서열로 작용하며, 이 기준 서열과 문제의 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리듬을 이용할 때, 시험과 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면, 서브-서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리듬 프로그램 변수를 지정한다.

예를 들어 Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)의 상동성 배열 알고리듬을 이용하여 비교를 위한 서열의 최적 배열을 수행할 수 있다. Needleman & Wunsch 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 the Insitut Pasteur(France)의 Biological Software 웹사이트[http://bioweb.pasteur.fr/ seqanal/interfaces/needle.html.]를 통해 공개적으로 이용될 수 있다. NEEDLE 프로그램은 Needleman-Wunsch 글로벌 배열 알고리듬을 이용하여 2개 서열의 최적 배열(갭을 포함)을 이들의 전체 길이를 고려하여 찾아낸다. 동일성은 2개 서열 사이의 동일한 매치 퍼센트에 따라 길이의 갭을 비롯한, 기록된 배열 영역에 걸쳐 계산된다. 유사성 스코어도 제공되며 여기서 유사성은 길이의 갭을 비롯한, 기록된 벼열 영역에 걸쳐 2개 서열 사이의 매치 퍼센트로서 계산된다. 표준 비교법에서는 단백질 서열에 대해 EBLOSUM62 매트릭스를 이용하며 뉴클레오티드 서열에 대해 EDNAFULL 매트릭스를 이용한다. 갭 오픈 페널티(gap open penalty)는 갭이 생성될 때 없어진 점수이며; 갭 오픈 페널티를 이용한 디폴트 설정은 10.0이다. 갭 확장을 위해, 패널티를 갭에서 각 염기 또는 잔기에 대한 표준 갭 페널티에 추가하며; 디폴트 설정은 0.5이다.

하이브리드화도 2개 폴리뉴클레오티드가 서로 실질적으로 동일하다는 것을 나타내는 시험으로서 사용될 수 있다. 고도의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드는 엄격한 하이브리드화 조건하에 서로 하이브리드화할 것이다. "엄격한 하이브리드화 조건"은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)]에 기재된 바와 같이, 본 기술에서 알려진 의미를 가진다. 엄격한 하이브리드화 조건의 일예는 하이브리드화한 폴리뉴클레오티드가 상보성을 공유하는 길이에 따라, 약 45℃에서 6x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)에서 하이브리드화, 이어서 50℃에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다.

"정보제공 유전자"는 정보제공 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 뜻한다. 본 기술에서 알려진 바와 같이, 정보제공 유전자 생성물은 전형적으로 표준 방법에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 적합한 정보제공 유전자의 일예는 루시페라제를 코딩하는 유전자(lux), β-갈락토시다제(lacZ), 녹색형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), β-글루쿠로니다제, 네오마이신 포스포트란스퍼라제, 및 구아닌 크산틴 포스포리보실-트란스퍼라제 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

"CMR1 채널의 전도도를 증가시키는 화합물"은 CMR1 채널을 통해 이온의 통과를 증가시키는 화합물을 포함한다. 일 구체예에서, 이러한 화합물은 CMR1 채널에 결합하여 그의 전도도를 증가시키는 CMR 채널에 대한 작용제이다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 양성 알로스테릭 조절자이며, 이것은 작용제 결합-부위와 다른 알로스테릭 부위에서 CMR1 채널과 상호 작용하지만, 작용제에 채널의 반응을 강력하게 한다.

"CMR1 채널의 전도도를 감소시키는 화합물"은 CMR1 채널을 통해 이온의 통과를 감소시키는 화합물을 포함한다. 일 구체예에서, 이러한 화합물은 CMR1 채널에 결합하여 경쟁적 또는 비경쟁적 패션으로 작용제의 작용에 대항하거나, 감소시키거나 제한하는 CMR 채널에 대한 길항제이다. 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 음성 알로스테릭 조절자이며, 이것은 작용제 또는 길항제 결합-부위와 다른 알로스테릭 부위에서 CMR1 채널과 상호 작용하며, 작용제에 대한 채널의 반응을 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, 이러한 화합물은 CMR1 채널에 결합하고 다른 화합물, 이를테면 작용제의 부존재하에 채널의 전도도를 감소시키는 역작용제이다.

본 발명에서 사용된 "막 전위", "막통과 전위" 또는 막통과 전위차"는 각각 플라즈마 막, 세포의 외부, 제한적 리피드 이중층 막에 걸쳐 전기 전위차를 뜻한다. 거의 모든 동물 세포는 내부가 음성이며, 정지 전위가 -20 내지 -100 mV이다. 본 발명에서 사용된 "정지 전위"는 세포가 정지할 때 그의 주위에 대해 세포의 내부 전기 전위를 뜻한다.

본 발명에서 사용된 "탈분극"은 세포 막전위가 더 양성으로 되는, 예를 들어 -90 mV 내지 -50 mV인 경향을 뜻한다.

본 발명에서 사용된 "과다 분극"은 세포 막전위가 더 음성으로 되는, 예를 들어 -50 mV 내지 -90 mV인 경향을 뜻한다. 본 발명을 실시할 때, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA에서 많은 종래 기술이 사용된다. 이들 기술은 잘 알려져 있으며 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I, II, and III, F.M. Ausubel, ed. (1997); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)]에 설명되어 있다.

일예에서, 본 발명은 신규의 cCMR1(cCMR1) 핵산, 이들 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드, 재조합 cCMR1 물질, 및 이들 물질의 제조, 검출, 및 이용에 관련한 방법에 관한 것이다.

CMR1 명칭은 McKemy, D.D., et al.(Nature, 416: 52-58, 2002)에 의해 확립되었고 쥐의 DRG 및 TG 뉴우런에서 발현된 냉각- 및 멘톨-민감 수용체를 기술하는데 사용되었다. 인간 CMR1(또한 인간 TRPM8로서 알려짐)은 쥐 CMR1의 아미노산 서열과 92% 동일하며 이전에 전립선-특이 전사체로서 확인된 바 있고 또한 전립선, 흑색종, 직장암 및 유방암을 비롯한, 다양한 종양 조직에서 발현되는 것으로 발견된 바 있다(Tsavaler, L., et al. Cancer Res. 61: 3760-3769, 2002). 새앙쥐 CMR1(또한 새앙쥐 TRPM8로서 알려짐)은 새앙쥐 DRG cDNA 제제로부터 클로닝되었고 인간 CMR1 아미노산 서열과 93% 동일하다고 알려졌다(Peier, A.M. et al., Cell 108: 705-715, 2002).

본 발명에서, 개 cCMR1 유전자는 개 DRG 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되었다. cCMR1 오픈 리딩 프레임(ORF)와 대응하는 mRNA의 5' 및 3' 미번역 영역을 포함하여, cCMR1 cDNA를 서열화하였다. cCMR1 cDNA 서열은 SEQ ID NO: 1(표 1)로서 제시된다. SEQ ID NO: 1는 또한 표 1에 제시된, 1104 잔기 폴리펩티드(SEQ ID NO: 2)를 코드화하며, 이것은 인간, 새앙쥐, 및 쥐로부터 CMR1 단백질 서열로 배열된다(참조 표 2). 이 배열을 기준으로 하여, cCMR1 폴리펩티드는 인간 CMR1과 95.23%에서 가장 큰 아미노산 동일성을 공유한다.

본 발명에서, cCMR1 핵산은 또한 발현 벡터로 서브클로닝되며 cCMR1 단백질의 발현을 위해 숙주 세포로 형질전환되었다. 이러한 재조합 cCMR1 세포 시스템은 재조합 cCMR1 세포가 저온에서 배양되거나 멘톨 또는 이실린에 노출될 때 Ca⁺⁺ 이온의 유입을 허용한 기능적 cCMR1 단백질을 발현하는 것으로 알려졌다. 재조합 cCMR1 시스템은 cCMR1 기능 또는 발현을 조절하는 화합물을 검색하고 확인하는데 유용하다. CMR1 기능 또는 발현을 조절하는 화합물은 치료학적으로 유용할 수 있다. 이들 화합물은 예를 들어 cCMR1 단백질을 발현하는 재조합 시스템을 이용하여 확인된 다음 개 또는 다른 적합한 포유류에서 생체 내 시험하여 인간에 유용할 수 있는 투약 변수를 확립할 수 있다.

CMR1 단백질의 기능 또는 발현의 조절은 다양한 통증의 치료에 유리할 수 있다. CMR1 수용체가 냉각 및 냉각류 감각을 모방하는 화합물, 이를테면 멘톨과 이실린에 반응성이 있으므로, cCMR1 활성의 조절 역시 냉각 또는 멘톨 치료가 통증 완화 또는 다른 완화, 이를테면 울혈성 비염, 기침 또는 천식 기관지염의 경감 방법으로서 이용되는 치료적 응용예에 적절하다고 예상된다. 예를 들어, CMR1 단백질의 기능 또는 발현의 조절은 피부 염증 및 일광화상 및 레이저 화상을 비롯한, 피부 화상과 같은 피부 또는 점막 증상, 또는 인후염을 가진 환자에 유용할 수 있다. CMR1 활성의 조절도 냉각 이질통을 야기하는 냉각 과민증에 걸린 환자에 적절할 수 있다. CMR1 활성의 조절도 급성 통증, 예를 들어 치통(odontalgia) 및 삼차 분포 통증, 이를테면 삼차 신경통(ticdouleureux) 및 턱관절통(temperomandibular joint pain)에 적절할 수 있다.

추가로, 인간 CMR1이 종양 성장과 연관되는 마커로서 확인된 바 있으므로(Tsavaler, L., et al. Cancer Res. 61: 3760-3769, 2002), cCMR1도 개의 다양한 세포 증식 질환의 진단에 유용할 수 있다.

cCMR1 동족체를 클로닝하는 연구에서, PCR-계 전략이 이용되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 SEQ ID NO: 3(cmrl-23) 및 SEQ ID NO: 4(cmrl-26)로 제시된 서열에 따라 합성하였다. 이들 프라이머는 SEQ ID NO: 1의 위치 1761 내지 위치 2886로부터 cCMR1 서열의 일부를 성공적으로 증폭할 수 있다. 크기가 약 1.1 kb인 PCR 생성물을 정제한 다음 서열화(sequencing) 벡터로 서브클로닝하였다. 1.1 kb cCMR1 단편의 서열을 기준으로, 새로운 프라이머를 개발하고 RACE(cDNA 단부의 급속 증폭)-변형 개 DRG cDNA와 별도 PCR 반응에 사용하였다. 5' 및 3' 미변역 영역 모두를 포함한, cCMR1 cDNA의 완전한 서열을 얻었다(SEQ ID NO: 1). cCMR1의 오픈 리딩 프레임은 표 1에 제시된 바와 같이, 1104 잔기 폴리펩티드(SEQ ID NO: 2)를 코드화한다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 위치 69 내지 3380의 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열을 제공한다. SEQ ID NO 1의 위치 69 내지 3380은 오픈-리딩 프레임 서열(코딩 영역)이며, 이것은 SEQ ID NO: 2에 따른 CMR1 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 본 발명은 또한 cCMR1 오픈-리딩 프레임에서 상방, 예를 들어 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 69의 영역에 상응하는 분리된 핵산 서열과 cCMR1 오픈-리딩 프레임의 하방, 예를 들어 SSEQ ID NO: 1의 위치 3380 내지 3815의 영역에 상응하는 분리된 핵산 서열을 제공한다. 따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 위치 1 내지 69, 다른 구체예에서 SEQ ID NO: 1의 위치 3380 내지 3815의 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열을 제공한다.

SEQ ID NO: 1의 단편을 포함하는 분리된 핵산은 다양한 목적으로 유용하다. 예를 들어, 이들 서열은 CMR1 핵산의 검출을 위해 또는 CMR1 핵산에 wqj하는 서열의 검출을 위해 올리고뉴클레오티드 탐침으로서 사용될 수 있다. 이들은 CMR1 핵산의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머로서 사용될 수 있다. 이들은 또한 다른 폴리펩티드 서열, 예를 들어 하나 이상의 이종유래 서열로부터 하나 이상의 모티프(motif) 또는 도메인(domain)과 재조합된 cCMR1 서열의 하나 이상의 모티프 또는 도메인에 융합된 cCMR1 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 코딩하는 키메릭 핵산의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 이들은 cCMR1 유전자의 구조를 처리하는데 사용될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 유전 코드의 변성 때문에, 하나 이상의 코돈이 특정 아미노산을 코딩하는데 사용될 수 있으며, 따라서, cCMR1 아미노산 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 2)은 복수의 핵산 서열 중 어느 하나에 의해 코드화될 수 있다. 분리된 핵산은 서열에서 하나 이상의 코돈이 다른 서열의 코돈에 의해 치환되지만 동일한 아미노산 잔기를 코딩하는 서열을 포함하며 본 발명에서 "보존적 코돈 치환체"로 지칭된다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 보존적 코돈 치환체를 가진 SEQ ID NO: 2를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 기술의 숙련자는 하나 이상의 보존적 코돈 치환체를 가지며 본 발명에서 제공된 서열 정보를 기준으로 하여, SEQ ID NO: 2를 코딩하는 특정 핵산 서열을 결정할 수 있을 것이다. 보존적 코돈 치환체는 CMR1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에서 제조될 수 있으며, 예를 들어 코돈 TTT 및 TTC(총괄적으로 TTT/C로 지칭됨)는 Phe(페닐알라닌) 잔기를 코딩할 수 있으며; 다른 코돈 치환체는 다음과 같다:

TTA/G 및 CTT/C/A/G: Leu; ATT/C: Ile; ATG: Met; GTT/C/A/G: Val; TCT/C/A/G: Ser; CCT/C/A/G: Pro; ACT/C/A/G: Thr; GCT/C/A/G: Ala; TAT/C: Tyr; CAT/C: His; CAA/G: Gln; AAT/C: Asn; AAA/G: Lys; GAT/C: Asp; GAA/G Glu; TGT/C: Cys; CGT/C/A/G: Arg; AGT/C: Ser; AGA/G; Arg; GGT/C/A/G:Gly.

보존적 코돈 치환체는 cCMR1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 어느 위치에서도 제조될 수 있다.

본 발명에서 제시된 바와 같이, SEQ ID NO: 1의 위치 69 내지 3380은 1104 아미노산 잔기 폴리펩티드(SEQ ID NO: 2)를 코드화하며, 이것은 자연 발현된 개 CMR1의 예상된 서열이다. 표 2에 제시한 바와 같이, SEQ ID NO: 2는 인간, 새앙쥐 및 쥐 CMR1 단백질 서열로 배열되었다. 배열에 의해, cCMR1 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO: 2)는 인간 CMR1 단백질 서열과 아주 동일하며, 1104 잔기 중에서 1052를 공유한다(95.23% 동일성). cCMR1 단백질 서열은 새앙쥐 CMR1 폴리펩티드 서열(1042/1104: 94.38% 동일성) 및 쥐 CMR1 폴리펩티드 서열(1043/1104: 94.47% 동일성)과 더 낮은 정도의 동일성을 공유한다.

설명한 바와 같이, 표 2에 제시된, 개, 인간, 새앙쥐 및 쥐 CMR1 서열은 일반적으로 90% 이상의 아미노산 동일성을 공유한다. 그러나, 일정한 아미놋나 위치에서, 개 서열은 인간, 새앙쥐 또는 쥐 서열 중 하나 이상과 다르다. 개의 잔기가 하나 이상의 다른 종과 다른 아미노산 위치들은 잔기가 인간, 개, 새앙쥐 및 쥐의 서열에서 동일한 위치와 비교하여 더 가변적이다. 예를 들어, 서열 배열을 기준으로 하여, SEQ ID NO: 2의 위치 1, 2 및 3에서 아미노산 잔기는 인간, 새앙쥐 및 쥐 서열의 아미노산 잔기와 동일하다. 그러나, SEQ ID NO: 2의 위치 4 및 5에서 아미노산 잔기는 인간 서열에 관해 다르며, SEQ ID NO: 2의 위치 28에서 아미노산 잔기는 인간, 새앙쥐 및 쥐 서열에 관해 다르다. 개 서열과 인간, 새앙쥐 또는 쥐 CMR1 서열 중 어느 하나 사이에 적어도 하나의 차이가 있는 아미노산 위치를 본 발명에서 "CMR-패밀리 변이체 위치"로 지칭한다. CMR-패밀리 변이체 위치의 리스트를 표 3에 제공한다.

이러한 분석을 기준으로 하여, 하나 이상의 CMR-패밀리 변이체 아미노산의 치환체를 가진 cCMR1 폴리펩티드가 CMR1 생물학적 활성을 가질 것으로 예상된다. 즉, SEQ ID NO: 2는 동일 위치에서, 인간, 새앙쥐, 또는 쥐 서열에서 발견된 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산, 또는 대등한 아미노산에 의해 하나 이상의 CMR-패밀리 변이체 아미노산 위치에서 치환될 수 있다. cCMR1 아미노산을 치환하는 아미노산은 본 발명에서 "CMR-패밀리 변이체 아미노산"으로 지칭한다. "CMR-패밀리 변이체 아미노산"은 cCMR1 아미노산과 다르고 다른 포유류, 이를테면 인간, 새앙쥐 또는 쥐의 CMR1 서열에 존재한 아미노산인 아미노산으로 구성된다. 기원 cCMR1 아미노산 잔기를 치환하는데 사용될 수 있는, 적합한 CMR-패밀리 변이체 아미노산의 리스트도 표 3에서 찾을 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 글루탐산(E)의 치환에 적합한 위치 4에서 CMR-패밀리 변이체 아미노산은 아르기닌(R, 인간 CMR1에서 발생됨)이다.

일부 CMR-패밀리 변이체 아미노산 위치에서, 개, 인간, 새앙쥐 및 쥐 아미노산 잔기는 공통의 화학적 특성을 공유한다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 18 및 34에서 CMR-패밀리 변이체 아미노산은 수소성 아미노산 잔기, 예를 들어, 메티오닌(M) 또는 류신(L)을 포함할 수 있다. 다른 소수성 아미노산은 글리신, 발린, 이소류신 및 프롤린을 포함한다. 다른 아미노산 그룹은 "염기성 아미노산"을 포함하며,이들 아미노산은 히스티딘, 리신, 및 아르기닌을 포함하며; "산성 아미노산"을 포함하고, 이들 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하며; "방향족 아미노산"을 포함하고, 이들 아니모산은 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신을 포함하며; "소 아미노산"을 포함하고, 이들 아미노산은 글리신과 알라닌을 포함하며; "친핵성 아미노산"을 포함하고, 이들 아미노산은 세린, 트레오닌, 및 시스테인을 포함하고; "아미드 아미노산"을 포함하며, 이들 아미노산은 아스파라진과 글루타민을 포함한다.

따라서, 다른 일예에서, 본 발명은 CMR1-패밀리 변이체 아미노산을 포함하는 SEQ ID NO: 2에 따른 CMR1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구체예에서, cCMR1 폴리펩티드는 기원 cCMR1 아미노산 잔기의 4% 미만으로 CMR-패밀리 변이체 아미노산을 포함한다. 바람직하게는 cCMR1 폴리펩티드는 CMR-패밀리 변이체를 기원 cCMR1 아미노산 잔기의 약 2% 미만으로 포함하고, 가장 바람직하게는 기원 cCMR1 아미노산 잔기의 약 1% 미만이다.

본 발명은 또한 본 발명에서 설명한, 분리된 핵산 분자에 상보적인 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 분리된 핵산은 또한 추가의 아미노산 잔기를 가진 cCMR1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 추가의 아미노산은 아미노 말단, 카르복실 말단, cCMR1 서열 내 또는 조합된 이들 위치에 존재한다. 이들 형태의 추가 아미노산 서열을 가진 cCMR1 폴리펩티드는 "cCMR1 융합 단백질"로서 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 추가 아미노산 서열의 특성에 따라, 이들을 달리 "키메릭" 또는 "태그가 있는"(tagged) cCMR1 단밸, 등으로 지칭하는 것이 더 적합할 수 있다. 그럼에도, 본 발명에서 제공된 서열 정보를 가지고 추가 아미노산 서열을 가진 CMR1 폴리펩티드를 식별할 수 있을 것이다. 추가 아미노산 잔기는 예를 들어 1 내지 약 20개의 추가 아미노산 잔기로 짧거나, 예를 들어 약 20개 이상의 추가 아미노산 잔기로 더 길 수 있다. 추가 아미노산 잔기는 예를 들어 단백질(예, 항체) 또는 소 분자 결합을 위한 에피토프로서 작용; 세포 내 및 세포 외 트래피킹(trafficking)을 위한 태그로서 작용; 추가의 효소 활성 또는 다른 활성의 제공; 또는 검출가능한 시그널을 비롯한, 하나 이상의 기능 또는 목적을 수행할 수 있다.

예를 들어, 핵산 서열은 cCMR1 융합 단백질을 코딩할 수 있으며, 이 단백질은 유기 또는 무기 화합물과 결합(이를테면 이온, 공유, 배위, 수소 또는 반 데어 발스 결합 또는 이들의 조합)을 위한 좌표를 제공하는 추가 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 유용한 추가 아미노산 서열은 필요하다면, 예를 들어 Ni⁺-커플링된 잔기에의해 단백질 정제에 유용한 폴리-히스티딘 잔기, 검출 또는 정제를 위한 이뮤노-보체의 형성에 유용한 이뮤노글로블린(IgA, IgE, IgG, IgM) 또는 이들의 부분(CH1, CH2, CH3), 알부민, 헤마글루티딘(HA) 또는 myc 친화 에피토프 태그의 불변 영역(이들 부분에 대한 항체는 상업적으로 얻을 수 있음), 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 검출에 유용한 폴리펩티드, 베타-갈락토시다제(B-Gal), 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 및 알칼리 포스파타제(A)와 같은 효소, 단백질 트래피킹을 위한 시그널 서열 및 cCMR1 서열로부터 추가의 아미노산 서열을 분리하는데 유용한 프로테아제 분해 서열을 포함한다.

다른 일예에서, cCMR1, 이를테면 cCMR1 단백질 또는 핵산의 발현을 검출할 수 있는 진단 시험이 제공된다. cCMR1 단백질의 발현은 탐침에 의해 검출될 수 있으며, 탐침은 검출가능하게 표지되거나 후속적으로 표지될 수 있다. 전형적으로, 탐침은 상기에 기재한 바와 같이, 발현된 단백질을 인식하는 항체, 특히 일클론 항체이다. 따라서, 일 구체예에서, cCMR1 단백질의 발현을 검출할 수 있는 시험은 개의 조직 샘플을 cCMR1에 결합하는 하나 이상의 일클론 및/또는 다클론 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.

cCMR1 핵산과 단백질, CMR1에 대해 지정된 항체 및 이들 성분 중 어느 것을 함유한 생물학적 시스템은 검출성 시약으로 표지될 수 있거나, cCMR1에 대해 특이성이 있는 화합물을 검출성 시약으로 표지하여 cCMR1 엔티티를 검출하는데 사용할 수 있다. 검출성 시약은 스펙트럼, 생화학, 광화학, 생물전기학, 면역화학, 전기학, 광학 또는 화학적 기술에 의해 검출될 수 있는 화합물 및 조성물을 포함한다. 검출성 부분의 일예는 방사성 동위원소(예, ³²P, ³³P, ³⁵S), 화학발광 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자, 분광 마커, 이를테면 형광 마커 및 염료, 연결된 효소, 질량 분광 태그 및 자기 표지를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

항체를 이용하는 면역시험 방법은 도트 블로팅, 웨스턴 블로팅, 경쟁 및 비-경쟁 단백질 결합 시험, 효소-연결 면역흡착 시험(ELISA), 면역조직화학, 형광-활성화 세포 소팅(FACS), 이뮤노-PCR, 면역침전 및 기타 통상 사용된 rjtef을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

cCMR1 유전자에 상응하는 mRNA의 발현 수준은 통상 사용된 분자 생물학 방법, 예를 들어 노턴 블로팅, 현장 하이브리드화, 뉴클레아제 보호 시험, RT-PCR(실시간, 정량 PCR 포함), 고밀도 시험 및 다른 하이브리드화 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 따라서, 다른 구체예에서, 개의 조직에서 하나 또는 하나 이상의 cCMR1 유전자의 발현을 검출할 수 있는 시험이 제공되며, 이 시험은 개의 조직 샘플을 cCMR1 핵산으로 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 접촉하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 PCR/프라이머 확장 실험에 대해 길이 10 내지 20개의 뉴클레오티드이다. 약 40 내지 50개의 뉴클레오티드의 더 긴 올리고뉴클레오티드는 더 규칙적으로 현장 또는 블롯 하이브리드화에 이용된다. 심지어 50개 이상의 뉴클레오티드 서열이 또한 검출 실험에 사용될 수 있다. RNA는 예를 들어 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.(1996)]에 기재된 바와 같이 본 기술의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 의해 조직 샘플로부터 분리될 수 있다. cCMR1 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 검출하기 위한 바람직한 방법 하나는 RT-PCR에 의한 것이다. RT-PCR 기술의 세부내용은 잘 알려져 있으며 또한 본 발명에서 설명되어 있다.

개시된 유전자 하나 이상으로부터 얻어진 mRNA 전사체의 수준을 검출하기 위한 다른 바람직한 방법은 표지된 mRNA의 올리고뉴클레오티드 또는 조직의 정돈된 배열로 하이브리드화를 포함한다. 이러한 방법은 유전자 발현 프로파일 또는 패턴을 동시에 생성하도록 복수의 이들 유전자의 전사 수준을 측정하게 한다.

이 하이브리드화 방법에서 이용된 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 고체 지지체에 결합된다. 고체 지지체의 일예는 멤브레인, 필터, 슬라이드, 종이, 나일론, 웨이퍼, 섬유, 자기 또는 비자기 비드, 겔, 튜빙, 폴리머, 폴리비닐 클로라이드 접시, 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오티드가 직접적으로 또는 간접적으로, 공유결합으로 또는 비공유결합으로 결합될 수 있는 고체 표면이 모두 사용될 수 있다. 특히 바람직한 고체 기재는 고밀도 어레이(array) 또는 DNA 칩(chip)이다. 이들 고밀도 어레이는 어레이 위의 미리 선정된 위치에서 특정 올리고뉴클레오티드 탐침을 함유한다. 미리 선정된 위치는 각각 한 분자 이상의 탐침을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 기재 위의 규제된 위치에 있으므로, 하이브리드화 패턴과 세기(함께 독특한 발현 프로파일 또는 패턴을 얻음)는 특정 유전자의 발현 수준으로 해석될 수 있다.

올리고뉴클레오티드 탐침은 바람직하게는 상기에 확인된 중요한 유전자의 상보적 전사체만으로 특이 하이브리드화하는데 충분한 길이로 구성된다.

임의로, cCMR1 핵산 서열의 전부 또는 일부는 유사 서열의 존재를 측정하도록 다른 종으로부터 핵산 제제를 탐침 조사하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, cCMR1 핵산의 전부 또는 일부는 cCMR1 서열에 유사한 다른 종으로부터 cDNA 또는 게놈 핵산 서열을 확인하는데 탐침으로서 사용될 수 있다. 양성 클론이 cCMR1 탐침으로 하이브리드화하는 것들로서 확인될 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 제공된 cCMR1 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 전부 또는 일부는 다른 유용한 정보, 예를 들어 cCMR1 서열에 결합하는 cCMR1 서열 또는 분자에 상동성을 가진 단백질을 확인하는데 컴퓨터-보조 프로그램으로 사용될 수 있다. 예를 들어, cCMR1 서열 전부 또는 일부는 전자 데이터베이스의 멤버가 cCMR1 서열에 상동성을 가지고 있는지 측정하도록 다양한 전자 데이터베이스를 검색하는데 사용될 수 있다. 종-특이성이 있는 많은 유전 데이터베이스는 본 발명에서 제시된 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 일부를 이용하여 조사될 수 있다. 핵산과 단백질 서치 중 하나 또는 둘 다 수행될 수 있다.

다른 일예에서, cCMR1 폴리펩티드의 3차원 모델은 단백질 구조의 다양한 부분에 결합하는 분자를 확인하는데 측정되고 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 기재한 분리된 cCMR1 핵산을 이용하여, cCMR1 단백질은 세포 시스템에서 발현되고, 정제된 다음 단백질 구조에 관한 정보를 얻기 위해 결정화될 수 있다. 예를 들어, X-선 회절 또는 핵자기공명 스펙트로스코피를 수행하여 구조 정보를 얻을 수 있다. 아미노산 잔기와 이들의 측쇄의 위치는 3 차원 모델에서 좌표로서 표시될 수 있다. 그 후 이 정보를 컴퓨터 프로그램에 제공할 수 있다.

분자 모델화 프로그램은 소 분자가 cCMR1 폴리펩티드의 기능적 관련 부분, 예를 들어, 활성 부위에 맞을 수 있는지 측정하는데 사용될 수 있다. 분자 모델화에 대한 기본적인 정보는 예를 들어, 문헌[M. Schlecht, Molecular Modeling on the PC, 1998, John Wiley & Sons; Gans et al., Fundamental Principals of Molecular Modeling, 1996, Plenum Pub. Corp.; N. C. Cohen (editor), Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design, 1996, Academic Press; and W. B. Smith, Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling, 1996]에 제공되어 있다. 분자 모델화에 대한 상세한 wdj보를 제공하는 미국특허는 미국특허 제 6,093,573; 6,080,576; 5,612,894; 및 5,583,973 호를 포함한다.

분자 모델화 연구에 유용할 수 있는 프로그램은 예를 들어, GRID(Goodford, P. J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules" J. Med. Chem., 28, pp. 849-857, 1985)[Oxford University(Oxford, UK)로부터 이용 가능]; MCSS(Miranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure, Function and Genetics, 11, pp. 29-34, 1991)[Molecular Simulations(Burlington, Mass.)로부터 이용 가능]; AUTODOCK(Goodsell, D. S. and A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8, pp. 195-202, 1990)[Scripps Research Institute(La Jolla, Calif.)로부터 이용 가능]; 및 DOCK(Kuntz, I. D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions" J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288, 1982)[University of California(San Francisco, CA)로부터 이용 가능]를 포함한다.

cCMR1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 더해, 본 발명은 또한 cCMR1 폴리펩티드, cCMR1 폴리펩티드 변이체, cCMR1 폴리펩티드의 단편 및 추가의 아미노산을 가진 cCMR1 폴리펩티드를 포함한다. 핵산에 의해 코드화된 cCMR1 폴리펩티드의 일예는 본 발명에서 기재되어 있으며, 이들 일예도 cCMR1 폴리펩티드에 적용될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 CMR-패밀리 변이체 아미노산을 기원 cCMR1 아미노산 잔기의 4% 미만으로 가진 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게는 cCMR1 폴리펩티드는 CMR-패밀리 변이체를 기원 cCMR1 아미노산 잔기의 약 2% 미만으로 포함하며, 가장 바람직하게는 기원 cCMR1 아미노산 잔기의 약 1% 미만으로 포함한다.

본 발명에서 설명한 바와 같이, cCMR1 폴리펩티드는 또한 그의 아미노 말단, 그의 카르복실 말단 또는 양쪽 모두에 추가의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 추가 잔기는 예를 들어 면역검출, 정제, 세포 트래피킹, 효소 활성, 등을 비롯한, 다양한 목적을 위해 유용하다.

본 발명은 또한 cCMR1 폴리펩티드의 단편을 제공한다. cCMR1 폴리펩티드의 단편은 예를 들어 항체 생산을 비롯한, 많은 목적을 위해 유용할 수 있다. cCMR1 폴리펩티드 서열의 일부, 또는 전체 서열 자체는 항-CMR1 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

다른 일예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 내에서 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. 유용한 항체는 다클론 항체, 일클론 항체, 인간화 또는 키메릭 항체, 및 cCMR1 단백질의 일부에 결합할 수 있는 생물학적 기능성 항체 단편을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이전에 언급된 서열에 의해 코드화된 단백질에 특이한 항체는 몇몇 형태의 응용예에 이용성이 있다. 이들 항체는 예를 들어 cCMR1의 검출이 요구되는 시험을 위한 진단 키트에 사용될 수 있다. 이들은 또한 치료제, 예를 들어 항-cCMR1 항체 자체가 치료제이거나 항-cCMR1 항체가 치료제에 커플링되는 치료제의 제조에 사용될 수 있다. 항-cCMR1 항체는 통증을 치료하는데 사용될 수 있다고 예상된다. 이들 경우에 항-cCMR1 항체는 예를 들어 작용(예, 촉매) 또는 길항 활성을 제공하여, cCMR1의 활성을 조절할 수 있다.

본 발명은 또한 개-특이 일클론 항-CMR1 항체의 제조 방법을 제공한다. 이들 일클론 항체의 제조를 위해, 독특한 항-cCMR1 결정기를 제공하는 펩티드를 사용할 수 있다. 일클론 항체는 특이 항원(즉, 에피토프)에 지정되는 항체의 동질 클론 모집단이다. 항-cCMR1 일클론 항체를 제조하기 위해, cCMR1-특이 서열을 가진 펩티드 또는 "cCMR1 에피토프"가 사용된다. cCMR1 서열은 개, 새앙쥐 및 쥐 CMR1 서열에 대해 하나 이상의 위치에서 다른 서열이다. cCMR1 특이 서열을 측정하기위해, 본 발명에서 제공된 표 2를 참조할 수 있다.

일클론 항체(mAbs)는 배양체에서 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 위해 제공되는 기술에 의해 얻어질 수 있다. 이들은 예를 들어 하이브리도마 기술(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975); 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., Immunology Today, 4:72, 1983); 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985)을 포함한다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 또는 이들의 서브클래스를 비롯한 이뮤노글로블린 클래스로 구성될 수 있다. 본 발명의 mAb를 제조하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양될 수 있다.

CMR1 단백질에 대한 항체의 제조를 위해, 다양한 숙주 동물이 cCMR1 폴리펩티드, 또는 이들의 일부에 의한 주입으로 면역화될 수 있다. 전체 cCMR1 폴리펩티드가 사용되는 경우, 다른 종으로부터 다른 CMR1 단백질과 교차 반응하는 항-CMR 항체와 함께 cCMR1에 특이한 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체 제제는 항원, 이를테면 CMR1 폴리펩티드에 의해 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래한 항체 분자의 이종유래 모집단이다. 이 다클론 모집단에서, 항체는 CMR1 폴리펩티드의 서로 다른 부분과 교차 반응일 것이며, 일부 항체는 cCMR1과 특이적으로 반응하고 나머지는 다른 종의 CMR1 폴리펩티드와 교차 반응한다. 다클론 항체의 제조를 위해, 숙주 동물은 cCMR1 단백질, 또는 그의 부분에 의해 면역화되어, 전형적으로 반복적으로 동물에서 항체 역가(titer) 증가시키고 전형적으로 본 발명에서 설명한 애주번트(adjuvant)로 보충된다. 항-CMR1 항체의 제조를 위해 통상 사용된 숙주 동물은 토끼, 새앙쥐 및 쥐를 포함하나; 필요한 경우 다른 동물이 사용될 수 있다. 숙주 종에 다라, 면역학 반응을 증가시키는데 다양한 애주번트, 예를 들어 프로인트(완전 및 불완전) 애주번트 및 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔이 사용될 수 있다. 컨쥬게이트(conjugate, 예 KLH)도 면역화를 위해, 특히 더 짧은 cCMR1 펩티드가 면역화 및 항체 제조의 목적으로 사용되는 경우 포함될 수 있다.

cCMR1 폴리펩티드 또는 cCMR1 폴리펩티드 단편은 합성 또는 분자 생물학 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 더 작은 cCMR1 폴리펩티드 단편, 예를 들어 길이 30개의 아미노산이거나 더 짧은 펩티드 단편을 생성하는데 표준 합성 펩티드 기술이 사용될 수 있다. 펩티드 단편의 합성을 위한 기술이 잘 알려져 있으며 예를 들어 문헌[Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis , Part A., Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)]에 기재되어 있다.

재조합 기술은 예를 들어 cCMR1 핵산으로 형질전환된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포로부터 cCMR1의 일부, 변이체 및 융합체를 비롯한, cCMR1의 발현을 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기술과 생체 내 유전 재조합을 포함한다(참조예, the techniques described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3'd Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (2001); and Ausubel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Edition, John Wiley & Sons, Inc., NY (1999).

따라서, cCMR1은 (a) cCMR1 서열을 포함한 핵산을 제공하고, (b) 핵산을 숙주 세포로 삽입한 다음 (c) cCMR1 폴리펩티드의 발현을 고려하는 조건하에 숙주 세포를 유지함으로써 생성될 수 있다. 정제된 cCMR1 폴리펩티드가 필요한 경우, cCMR1 폴리펩티드를 분리하고, 필요한 경우 정제하는 단계도 수행될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 조절 서열에 실시가능하게 연결된 cCMR1 코딩 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 이종유래 핵산 구조체를 제공한다. 이들 이종유래 핵산 구조체는 숙주 세포에서 cCMR1 핵산의 발현에 적합한 재조합 발현 벡터를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 조절 서열을 포함하며, 이것은 cCMR1 핵산 서열에 실시가능하게 연결된, cCMR1 발현을 위해 사용된 숙주 세포의 형태를 기준으로 선택될 수 있다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소, 예를 들어, 폴리(A)+서열을 포함한다. 조절 서열은 원핵생물 세포, 예를 들어, 박테리아 세포, 이를테면 E. coli, 또는 진핵생물, 이를테면 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포(예를 들어, HEK, CHO 또는 COS 세포)에 특이성이 있을 수 있다. 조절 서열은 cCMR1 핵산 서열에 대해 시스 또는 트란스로 위치할 수 있다. 조절 서열은 전형적으로 다양한 성장 조건하에 다양한 숙주 세포에서 핵산의 발현을 작동하는 구성 발현 서열, 특정 숙주 세포 또는 조직에서 발현을 작동하는 조직-특이 조절 서열 및 이차 인자에 반응하여 발현을 작동하는 유도성 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터의 선택과 설계는 사용된 특정 숙주 세포 및 폴리펩티드 발현의 원하는 수준과 같은 인자에 좌우될 수 있다. 다른 발현 벡터 성분은 시그널 서열, 복제 기원, 하나 이상의 선택 유전자 및 전사 종료 서열 중 하난 이상을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 톡신, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결함을 보충하거나 (c) 복합체 배지로부터 이용할 수 없는 한계 영양물질을 공급하는 단백질을 코드화한다.

cCMR1 폴리펩티드의 발현에 사용된 이종유래 핵산 구조체는 또한 시험관 내에서 전사되고 변역될 수 있는 구조체, 예를 들어 T 프로모터 조절 서열을 가진 구조체를 포함할 수 있다.

cCMR1의 발현에 적합한 벡터는 본 기술에 알려져 있고 상업적으로 이용될 수 있다. 적합한 벡터는 예를 들어, pET-14b, pCDNAlAmp 및 pVL1392를 포함하며, 이것은 Novagen과 Invitrogen으로부터 얻을 수 있고 각각 E. coli, COS 세포 및 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포에서 발현에 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 cCMR1 핵산을 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 재조합 세포는 핵산 서열이 도입된 세포들을 포함한다. 전형적으로, 재조합 세포는 분자 생물학 기술을 이용하여 특정 핵산을 세포에 도입하여 생성된다. 그러나, 재조합 세포는 또한 원하는 핵산 서열의 발현을 촉진하는 다른 방식으로 조작된 세포를 포함한다. 예를 들어, 표적 핵산 서열에 인접한 영역을 변경하여 표적 핵산의 발현을 촉진할 수 있거나, 표적 핵산의 발현을 조절하도록 작용하는 유전자를 세포에 도입할 수 있다.

재조합 세포는 성장과 분할기 후 출발 모세포와 동일하지 않지만; 이들 세포는 재조합 세포로 지칭되며 본 발명에서 사용된 용어의 범위 내에 포함된다.

cCMR1 발현을 위한 수단을 계획하고 제공하는데 적합한 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포를 모두 포함한다. 적합한 원핵 숙주 세포의 일예는 유박테리아, 이를테면 그람-음성 또는 그람-음성 유기체, 예를 들어, Enterobacteriaceae 이를테면 Escherichia, 예를 들어, E. coli, Enterobacter, Salmonella, 예를 들어, Salmonella typhimurium, 그외 Bacilli 이를테면 B. subtilis, Pseudomonas, 및 Streptomyces이다.

진핵 세포, 이를테면 filamentous fungi 또는 효모가 cCMR1 발현 벡터를 ㅇ위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Saccharomyces cerevisiae(빵집 효모로 알려짐)은 통상 사용된 발현 시스템이며 다양한 프로모터와 선택성 마커 서열을 제시한다. 숙주 세포로서 유용한 다른 진균 또는 효모는 Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis , Pichia pastoris , Candida , Neurospora crassa 및 Aspergillus nidulans을 포함한다.

곤충 세포, 이를테면 Drosophila S2 및 Spodoptera Sf9 세포, 포유류 세포, 이를테면 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 원숭이 신장(COS) 세포, 개 신장(MDCK) 세포, 인간 자궁암(HeLa) 세포, 및 인간 배아 신장(HEK) 세포 및 그외에 식물 세포를 비롯한, 많은 고등 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다.

형질전환된 숙주 세포의 성장은 본 기술에 알려진 조건하에 일어날 수 있다. 일반적이로 이 조건은 숙주 세포와 사용된 벡터 형에 좌우될 것이다. 적합한 배양 조건, 이를테면 온도와 케미칼이 사용될 수 있으며 사용된 프로모터 형에 좌우될 것이다. 적합한 배지의 일예는 최소 필수 배지(MEM), RPMI-1640 및 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)을 포함한다.

발현 구조체를 비롯한, 핵산이 종래의 형질전환 또는 핵산전달감염 기술에 의해 원핵 또는 진핵 세포로 도입될 수 있다. 본 발명에서 사용된, "형질전환" 및 "핵산전달감염"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침전, DEAE-덱스트란-매개 핵산전달감염, 리포펙션(lipofection), 바이올리스틱(biolistics) 또는 전기 천공을 비롯한, 숙주 세포로 외래 핵산 분자(예, DNA)를 도입하기 위한 다양한 숙련 기술을 뜻하는 것이다. 숙주 세포를 형질전환하거나 핵산전달감염하는데 적합한 방법은 Sambrook, et al.(상기), 및 다른 실험 매뉴얼에서 발견될 수 있다.

포유류 세포는 선택성 마커를 가진 발현 구조체에 의해 그리고 관심 유전자에 의해 안정하게 핵산전달감염될 수 있다. 전형적으로 포유류 세포를 위한 선택성 마커는 항생제-내성 유전자, 예를 들어, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 화합물의 존재하에 형질전환된 세포를 성장시키는 유전자를 포함한다.

재조합 세포는 정제 목적으로 또는 cCMR1 폴리펩티드에 관련한 기능 연구를 위해 cCMR1 폴리펩티드의 제조에 유용할 수 있다. 예를 들어, 재조합 cCMR1 세포는 cCMR1 폴리펩티드의 활성을 변경하는 이들의 능력에 대해 여러 화합물을 시험하는데 사용될 수 있다. 재조합 cCMR1 세포는 또한 cCMR1 폴리펩티드의 다양한 특성을 변경하는 것, 예를 들어 cCMR1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하는 것이 어떻게 cCMR1 활성에 영향을 미치는 지를 시험하는데 사용될 수 있다.

cCMR1 핵산 서열을 가진 재조합 세포는 또한 비-인간 유전자삽입 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. 트랜스젠(transgene)은 유전자삽입 동물이 발생하는 세포의 게놈에 합체되며 성숙 동물의 게놈에 남아 있고, 이로서 유전자삽입 동물의 하나 이상의 세포형 또는 조직에서 코드화된 유전자 산물의 발현을 나타내는 외생 DNA이다. 예를 들어, cCMR1 핵산 서열을 함유한 핵산은 적합한 기술, 이를테면 마이크로주입을 이용하여, 수정 난모세포 또는 배아 줄기 세포와 같은 숙주 세포에 도입될 수 있다. 그 후 이들 cCMR1-함유 숙주 세포를 비-인간 유전자삽입 동물을 생성하는데 사용될 수 있다. 특히 유용한 동물은 cCMR1 유전자를 가진 유전자삽입 새앙쥐 또는 쥐를 포함하며, 이들은 또한 예를 들어 통증 모델과 같은 연구에 유용하게 만드는 물리적 또는 유전자 특성을 가질 수 있다.

cCMR1 유전자삽입 동물은 잠재적으로 유용한 화합물, 또는 cCMR1 기능 또는 발현을 조절하는 공지 화합물을 확인하거나, 검색하거나 시험하는데 사용될 수 있다. 이들 유전자삽입 동물은 또한 cCMR1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경함으로써 그의 기능을 연구하는데 사용될 수 있다.

배아 조작과 마이크로주입에 의해 유전자삽입 동물, 특히 새앙쥐와 같은 동물을 생산하는 방법은 종래 기술로 된 바 있으며, 예를 들어 미국특허 제 4,736,866, 및 4,870,009 호, 미국특허 제 4,873,191 호 및 문헌[Hogan, Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)]에 기재되어 있다. 상동 재조합 벡터와 상동 재조합 동물을 구성하는 방법은 추가로 문헌[Bradley (Current Opinion in Bio/Technology, 2:823-829, 1991)] 및 PCT 공보 WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968, 및 WO 93/04169에 기재되어 있다. 본 발명에서 기재한 비-인간 유전자삽입 동물의 클론도 문헌[Wilmut et al. (Nature, 385:810-813, 1997)] 및 PCT 공보 WO 97/07668 및 WO 97/07669에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

일부 경우에, 예를 들어 CMR1 조절자로 의심되는 화합물의 특이성을 시험하기 위해, 시스템에 존재한 CMR1의 양을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명에서 기재한 재조합 세포 또는 유전자삽입 동물은 그의 표면상에 발현되거나 존재한 CMR1의 양을 감소시키기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포는 세포에 존재한 cCMR1 RNA의 양을 감소시키고, 이에 의해 cCMR1 단백질 발현을 감소시키는 분자를 포함할 수 있다. 적합한 분자는 안티센스(antisense) 뉴클레오티드, 리보자임, 이중 가닥 RNA, 간섭 RNA(iRNA) 및 길항제 또는 작용제를 포함한다.

cCMR1 폴리펩티드의 정제를 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트 침전, 원심분리 또는 다른 공지 기술을 이용하여 조생성물의 정제를 수행할 수 있다. 예를 들어, 음이온 교환, 양이온 교환, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 겔 여과, 소수성 작용 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피, 예를 들어 cCMR1 단백질에 대한 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피를 비롯한, 적합한 크로마토그래피 기술에 의해 고도의 정제가 완성될 수 있다. 필요한 경우, 세포 내 합성, 분리 또는 정제 중에 단백질이 변성될 때 단백질의 활성 입체형태를 얻는데 cCMR1 단백질을 되접는 단계를 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적 샘플(시험 샘플)에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는 바람직하게는 적어도 하나의 컨테이너를 밀폐하는데 적합한 구획된 캐리어(carrier)를 포함한다. 캐리어는 표지 항원 또는 효소 기재 등과 같은 검출 수단을 함유할 수 있다. 예를 들어, 키트는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 검출할 수 있는 표지 화합물 또는 시약 및 샘플에서 폴리펩티드 또는 mRNA의 양을 측정하는 수단(예, 폴리펩티드를 결합하는 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA에 결합되는 올리고뉴클레오티드 탐침)을 포함할 수 있다. 키트는 또한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 양이 정상 수준 이상 또는 이하인 경우 폴리펩티드의 비정상 발현에 관련한 질병에 시험 대상이 걸려 있거나 발생 위험이 있는지 측정하기 위한 설명서를 포함한다.

항체-계 키트에 대해, 키트는 예를 들어 (1) SEQ ID NO: 2에 적어도 96% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는, 제 1 항체(예를 들어, 고체 지지체에 부착된 항체); 및, 임의로, (2) 제 1 항체 또는 제 1 항체가 결합하는 폴리펩티드(그러나 다른 에피토프에)에 결합하고, 검출성 시약에 접합하는 제 2 항체; 및 (3) 양성 대조군으로서 정제된 재조합 cCMR1 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 제 1 항체만이 cCMR1에 결합하며, 다른 종, 이를테면 인간, 쥐, 또는 새앙쥐로부터 CMR1에 결합하지 않는다.

올리고뉴클레오티드-계 키트에 대해, 키트는 예를 들어 (1) 엄격한 조건하에 SEQ ID NO: 1에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드, 예, 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드, 또는 (2) SEQ ID NO: 2에 적어도 96% 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 증폭하는데 유용한 한 쌍의 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 또한 예를 들어 완충제, 방부제, 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 검출가능한 시약을 검출하는데 필요한 성분을 포함할 수 있다(예, 효소 또는 기질). 키트는 또한 시험 샘플과 비교하여 시험할 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플들을 함유할 수 있다. 키트의 각 성분은 통상 개별 컨테이너 내에 밀봉되며 바람직하게는 다양한 컨테이너 모두 단일 패키지 내에 포함된다.

CMR1은 서늘한 온도 내지 찬 온도에서 활성화되고 신경 조직에서 발현되므로, 이 유전자는 통증, 염증 및 피부 질환, 예를 들어 일광화상 및 다른 민감 상태에 연관된 질환을 치료하는데 유용한 약물의 확인을 위한 치료 목적으로서 역할을 수행할 수 있다. 따라서, 다른 일반적인 일예에서, 본 발명은 치료 화합물, 예를 들어 통증을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하고, 냉각 온도 및 피부에 냉감을 제공하는 화합물에 대한 반응을 조절하는 방법에서, cCMR1 핵산 및 단백질의 용도에 관한 것이다. 이들 형태의 화합물은 cCMR1 폴리펩티드 또는 cCMR1 핵산을 포함하는 시스템을 이용하여 확인될 수 있다. 화합물을 또한 동물 모델 시스템, 예를 들어, 쥐, 새앙쥐 또는 개의 모델 시스템에서 생체 내로 직접 시험할 수 있다. 특히 유용한 시스템은 통증의 동물 모델을 포함한다. 이들 방법은 cCMR1 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시키는 다양한 화합물의 능력, cCMR1 채널의 전도도 또는 동물의 통각 작용에 대해 평가하는 것을 포함한다.

화합물 확인 방법은 종래의 실험실 포맷을 이용하여 또는 높은 처리량에 적합한 시험에서 수행될 수 있다. "높은 처리량"이란 복수의 샘플을 동시에 및/또는 연속으로 검색을 용이하게 하는 시험 설계를 의미하며, 로보트 조작에 대한 역량을 포함할 수 있다. 높은 처리량 시험의 다른 바람직한 특징은 원하는 분석을 완성하도록 시약 사용량을 감소시키거나, 조작수를 최소화하는데 최적인 시험 설계이다. 시험 포맷의 일예는 96-웰 또는 384-웰 플레이트, 공중부양 소적(levitating droplet), 및 액체 취급 실험에 사용된 "랩온어칩"(lab on a chip) 마이크로채널 칩을 포함한다. 플라스틱 몰드 및 액체 취급 장치의 소형화가 진행됨에 따라, 또는 개선된 시험 장치가 설계됨에 따라, 더 큰 수의 샘플이 본 발명의 설계를 이용하여 처리될 수 있다는 사실은 본 기술의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

후보 화합물은 유기 또는 무기 소 화합물, 천연 또는 합성 분자, 이를테면 항체, 단백질 또는 그의 단편, 안티센스 뉴클레오티드, 간섭 RNA(iRNA) 및 리보자임을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 많은 화학 부류를 포함한다. 바람직하게는, 이들은 유기 소 화합물, 즉 분자량이 50 이상 약 2500 미만인 화합물들이다. 후보 화합물은 폴리펩티드와 구조 상호 작용에 필요한 작용성 화학 그룹을 포함하며, 전형적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실 그룹을 포함하고, 바람직하게는 적어도 2개의 작용성 화학 그룹을 포함하며 더 바람직하게는 적어도 3개의 작용성 화학 그룹을 포함한다. 후보 화합물은 하나 이상의 상기 그룹으로 치환된 사이클릭 탄소 또는 헤테로사이클릭 구조 및/또는 방향족 또는 폴리아로마틱 구조를 포함할 수 있다. 후보 화합물은 또한 펩티드, 당류, 지방산, 스테롤, 이소프레노이드, 퓨린, 피리미딘, 이들의 유도체 또는 구조 유사체, 또는 이들의 조합물 등과 같은 생체 분자일 수 있다. 화합물이 핵산인 경우, 화합물은 전형적으로 DNA 또는 RNA 분자이다. 그렇지만 부자연스런 결합 또는 서브유닛을 가진 변형된 핵산이 또한 예상된다.

후보 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함한 광범위한 원료로부터 얻어진다. 예를 들어, 무작위 올리고뉴클레오티드, 합성 유기 결합 라이브러리, 랜덤 펩티드의 파지 디스플레이 라이브러리, 등의 발현을 비롯한, 많은 수단이 광범위한 유기 화합물 및 생체 분자의 임의 및 규제된 합성에 이용될 수 있다. 후보 화합물은 또한 생물학적 라이브러리; 공간 어드레스성 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법; "완-비드 완-컴파운드"(one-bead one-compound) 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 이용한 합성 라이브러리 방법(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)를 비롯한, 본 기술에서 알려진 결합 라이브러리 방법에서 많은 수단을 이용하여 얻을 수 있다. 별도로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물의 형태로 천연 화합물의 라이브러리가 이용될 수 있거나 쉽게 생산된다. 추가로, 천연 및 합성 생산된 라이브러리 및 화합물은 종래의 화학적, 물리적, 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 개질될 수 있다.

또한, 공지의 약제를 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화, 등과 같은 규제되거나 임의의 화학적 변형 처리하여 약제의 구조 유사체를 제조할 수 있다. 후보 화합물은 자유롭게 선택될 수 있거나 결합하고/하거나 CMR1 활성의 기능을 조절하는 현존 화합물을 기재로 할 수 있다. 따라서, 후보 약제의 원료는 화합물의 구조가 분자의 하나 이상의 위치에서 변하여 다소 많거나 적은 부분 또는 서로 다른 화학적 부분을 함유하는 CMR1 채널 전도도를 증가시키거나 감소시키는 공지 화합물 하나 이상을 기재로 한 하나 이상의 라이브러리 분자이다. 유사체 활성제/억제제의 라이브러리를 생성하는데 분자에 가한 구조 변화는 규제되거나, 임의이거나, 규제되고 임의의 치환 및/또는 첨가 모두의 조합법일 수 있다. 결합 라이브러리의 제조에서 본 기술의 통상 숙련자는 현존 화합물을 기재로 하여 이러한 라이브러리를 쉽게 제조할 수 있다.

다양한 다른 시약이 또한 혼합물에 포함될 수 있다. 이들은 최적 단백질-단백질 및/또는 단백질-핵산 결합을 용이하게 하는데 사용될 수 있는 염, 완충제,중성 단백질(예, 알부민), 세제, 등과 같은 시약을 포함한다. 이러한 시약은 또한 반응 성분의 비-특이 또는 배경 상호 작용을 감소시킬 수 있다. 뉴클레아제 억제제, 항미생물제, 등과 같은 시험의 효능을 개선하는 다른 시약이 또한 사용될 수 있다.

분자 라이브러리의 합성 방법의 일예는 본 기술에서, 예를 들어 문헌[Zuckermann et al. (1994). J Med . Chem. 37:2678. Libraries of compounds can be presented in solution (e.g., Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), or on beads (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacteria (U.S. Patent No. 5,223,409), spores (Patent NO. 5,571,698), plasmids (Cull et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:1865-1869) or phage (see e.g., Scott and Smith (1990) Science 249:3 86-390)]에서 발견될 수 있다.

일예에서, 본 발명은 cCMR1 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 시험 화합물을 cCMR 유전자의 발현을 조절하기 위한 메카니즘을 포함한 세포와 접촉하고; (b) 시험 화합물이 세포로부터 이 메카니즘에 의해 조절된 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함한다. cCMR 유전자의 발현을 조절하기 위한 메카니즘은 전사 또는 번역의 수준에서 유전자 작용의 조절에 핵, 세포질, 또는 세포 내 인자가 영향을 끼치는 메카니즘을 포함한다. 예를 들어, 메카니즘은 유전자 활성화 또는 유전자 억제를 포함한다. cCMR 유전자의 발현을 조절하기 위한 메카니즘을 포함하는 세포는 cCMR을 내생적으로 발현하는 자연 숙주 세포, 이를테면 개 DRG 세포일 수 있다. 세포는 또한 cCMR 유전자를 위한 조절 서열을 가진 재조합 DNA 서열을 함유한 재조합 세포일 수 있으며, 조절 서열은 유전자, 바람직하게는 리포터 유전자에 실시가능하게 연결되어 있다.

CMR1의 조절 서열에 의해 조절된 유전자의 발현에 대한 화합물의 효과는 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 효과는 세포로부터 유전자의 mRNA 또는 단백질의 양에 의해, 또는 세포로부터 유전자 산물의 활성에 의해 측정될 수 있다. 리포터 유전자가 사용될 때, 효과는 세포로부터 리포터 유전자 산물의 수준으로서 측정될 수 있다. 예를 들어, CMR1 조절 서열이 GFP 유전자에 실시가능하게 연결될 때, 유전자 발현에 대한 화합물의 효과는 형광계를 이용하여 세포루버ㅌ 녹색 형광의 방출에 대한 화합물의 효과로서 측정될 수 있다.

내생 cCMR1 세포가 사용될 때, 유전자 발현에 대한 화합물의 효과는 하기 설명된 방법을 이용하여 세포 내에서 cCMR1 mRNA 또는 단백질의 양에 의해 측정될 수 있다(즉, Northern Blot, RT-PCR, SDS-PAGE, Western Blot, immunohisto- or immunocytochemistry, radioreceptor ligand binding, etc). 별도로, cCMR1 채널의 전도도가 cCMR1 단백질의 발현에 대한 화합물의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 설명한 세포-기재 방법은 cCMR1 유전자의 하나 이상의 조절 서열에 결합함으로써 cCMR1 발현을 직접 조절하는 화합물을 확인할 뿐 아니라, 활성이 cCMR1 발현 또는 단백질 안정성에 영향을 끼치는 다른 세포 성분에 결합함으로써 간접적으로 cCMR1 발현을 조절하는 화합물을 확인한다. 예를 들어, cCMR1 유전자에 대한 전사 활성화제 또는 억제제의 활성을 조절하는 화합물은 본 발명에서 설명한 방법을 이용하여 확인될 수 있다. cCMR1 단백질을 생체 내에서 분해하는 프로테아제의 활성을 조절하는 화합물이 또한 확인될 수 있다.

본 발명은 또한 cCMR1 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 시험 화합물을 이온 채널과 접촉시키고; (b) 시험 화합물이 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, cCMR1 이온 채널은 숙주 세포의 표면상에서 발현된다. 세포는 cCMR1을 내생적으로 발현하는 cCMR1을 위한 자연 숙주 세포, 예를 들어 개 DRG 또는 TG 세포일 수 있다. 세포는 또한 cCMR1을 위한 재조합 숙주 세포, 예를 들어 cCMR1을 재조합으로 발현하는 CHO 또는 COS 세포일 수 있다.

일부 다른 구체예에서, cCMR1 이온 채널은 분리된 막 제제와 연관되어 있다. 막 제제는 자연 숙주 세포의 표면상에 cCMR1을 발현하는 자연 숙주 세포로부터, 또는 재조합 숙주 세포의 표면상에 cCMR1을 발현하는 재조합 숙주 세포로부터 분리될 수 있다. 또한 생물학적 막, 이를테면 cCMR1 채널을 포함한 조직 막, 플라즈마 막, 세포막, 또는 내부 세포기관 막으로부터 제조될 수 있다. 방법들은 생물학적 막 제제의 분리 및 제조를 위해 본 기술의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 조직 또는 세포의 기계적 또는 효소 파괴, 다른 성분들로부터 막을 분리하는 원심분리, 막 단편 또는 소낭을 적합한 완충액에 재분산시키는 단계를 포함할 수 있다. 별도로, 막-함유 제제는 또한 인공 막으로부터 유래할 수 있다. 정제된 cCMR1 단백질은 리피드 이중층으로 재구성되어 인공 막 소낭을 형성할 수 있다(참조 Chen et al., 1996, J. Gen . Physiol. 108:237-250). 이러한 형태의 막 소낭은 괌심 채널에 매우 특이할 수 있으며, 다른 채널에 의한 오염 문제를 방지한다. 인공 막 소낭을 제조하는 방법은 본 기술의 숙련자에게 알려져 있다.

일부 구체예에서, cCMR1을 포함하는 막 소낭은 독창적인 시험과 벙법에 대해 더 용이한 포맷을 제공할 수 있다. 왜냐하면 세포 용해 및/또는 전단은 시험 중 관심이 그리 많지 않기 때문이다. 그러나, 다른 구체예에서, cCMR1을 발현하는 세포는 예를 들어 세포막 제제 과정이 관심 채널을 파괴하거나 비활성화할 때 바람직하다.

시험 화합물은 cCMR1 채널의 이온 전도도를 증가시키거나 감소시키는 능력에 대해 평가할 수 있다. 예를 들어, 세포 탈분극의 자극 또는 세포 내 칼슘 이온 수준의 증가에 의해, CMR1 채널 전도도를 측정하는 방법이 본 기술의 숙련자에게 알려져 있다. 세포 내 칼슘의 수준은 칼슘 이온-민감 형광 지시기, 이를테면 칼슘 이온-민감 형광 염료를 이용하여 평가될 수 있다. 적합한 칼슘 이온-민감 형광 염료는 예를 들어, quin-2(참조예, Tsien et al., J Cell BioL, 94:325, 1982), fura-2(참조예, Grynkiewicz et al., J BioL Chem., 260:3440, 1985), fluo-3(참조예, Kao et al., J BioL - 43 Chem., 264:8179, 1989) 및 rhod-2(참조예, Tsien et al., J Biol. Chem., Abstract 89a, 1987)를 포함한다. 적합한 칼슘 이온-민감 형광 염료는 예를 들어 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 상업적으로 이용될 수 있다. 세포 형광은 또한 형광계 또는 형광 램프와 검출기를 갖춘 흐름 세포 측정기를 이용하여 검측될 수 있다.

cCMR1 양이온 채널은 2가 양이온, 예를 들어, Ca⁺⁺ 뿐 아니라, 1가 양이온, 예를 들어 Na⁺ 또는 K⁺ 를 이동하는 기능이 있다. 따라서, 1가 양이온의 이동 변화를 측정하기 위한 시험은 cCMR1 채널의 전도도를 측정하도록 수행될 수 있다. Na⁺- 및 K⁺-민감 염료는 본 기술에 알려져 있으며 예를 들어 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 상업적으로 이용될 수 있다.

cCMR1 채널의 전도도는 또한 패치-클램프(patch-clamp)와 같은 전기생리학 기술에 의해 측정될 수 있다. 패치-클램프 기술은 세포, 세포막, 및 분리된 조직에서 전기 활성을 연구하기 위해 일과적으로 사용된다. 이것은 마이크로피펫과 플라즈마 막 사이에 전기적으로 치밀한, 고-내성 밀봉을 형성하는 것을 포함한다. 그 후 플라즈마 막 내의 개별 이온 채널을 통해 흐르는 전류를 측정할 수 있다. 기술 상 다른 변형법은 플라즈마 막의 서로 다른 표면을 배딩(bathing) 매질에 노출시킨다. 4개의 가장 보편적인 변형법은 온-셀 패치(on-cell patch), 인사이드-아웃 패치(inside-out patch), 아웃사이드-아웃 패치(outside-out patch), 및 홀-셀 클램프(whole-cell clamp)를 포함한다.

패치-클램프 방법은 막을 통과하는 전압을 조절하고 전류를 측정하는 전압 클램프에 의해 통상 사용된다. 전압 클램프 공정 중에, 마이크로전극을 셀에 삽입하고 미리 정한 몇몇 수준으로 세포막 전위를 유지하도록 전극을 통해 전류를 주입한다. 패치-클램프 방법은 또한 전류-클램프 방법과 함께 사용될 수 있으며, 전류는 조절되고 전압은 측정된다.

cCMR1 채널 전도도를 감소시키는 화합물을 확인하는 시험은 바람직하게는 특정 이온 채널이 활성화되는 조건하에 수행된다. 예를 들어, 이러한 시험은 CMR1이 활성화되는 온도에서 수행될 수 있다. 홀-셀 패치 클램프 레코딩으로부터 연구는 cCMR1이 약 17℃에서 또는 그 이하의 냉각 온도에서 활성화된다는 것을 나타냈다(하기 실시예 7). 별도로, 이러한 시험은 cCMR1을 활성화하는 화합물, 이를테면 냉각 화합물 멘톨 또는 이실린, 또는 얼얼한 화합물 겨자씨 유의 존재하에 수행될 수 있다. 또한, 이러한 시험은 cCMR1 채널이 탈분극화될 때의 조건에서, 이를테면 탈분극화 전위에서 채널을 클램핑하여 수행될 수 있다.

반대로, cCMR1 채널 전도도를 증가시키는 화합물을 확인하려 할 때, 시험 조건은 바람직하게는 cCMR1 채널이 활성이 아니거나 달리 차단되는 조건으로 조정된다. 예를 들어, 이러한 시험은 CMR1 비-활성화 온도에서 수행될 수 있다. 실온에서 아직 활성인 쥐 CMR1과 다르게, cCMR1은 실온에서 비활성화 된다(하기 실시예 7). 별도로, 이러한 시험은 cCMR1 채널의 전도도를 감소시키는 화합물의 존재하에 수행될 수 있다. 또한, 이러한 시험은 cCMR1 채널을 탈감작시키는데 충분한 세포외 Ca^{2 +} 의 존재하에 수행될 수 있다. 본 기술의 통상 숙련자는 일과적인 실험에 의해 cCMR1 채널을 탈감작시키는데 충분한 세포외 Ca^{2 +} 의 적절한 농도를 측정할 수 있다. 또한, 이러한 시험은 cCMR1 채널이 과다 분극화 될 때의 조건에서, 이를테면 과다 분극된 전위에서 채널을 클램핑하여 수행될 수 있다.

cCMR1 조정자의 확인을 위한 시험은 수동으로 또는 자동화 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 자동화 시스템은 높은 처리량 검색이 수행되는 경우 바람직하다. 예를 들어, 자동화 시스템의 한 형태는 복수-웰 배양 플레이트, 예를 들어 96-웰 또는 1536-웰 배양 플레이트를 이용하며, 여기서 각 웰은 cCMR1 단백질을 코딩하는 핵산을 가진 재조합 세포를 함유한다. 플레이트를 각 웰에서 세포의 칼슘 플럭스 및/또는 막전위를 측정할 수 있는 형광계, 예를 들어 FlexStation^TM(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)에 적재한다. 칼슘 이온-민감 형광 지시기 염료 또는 시험 화합물을 함유한 용액을 자동으로 각 웰에 첨가할 수 있다. 형광계에서 온도는 수행되는 시험의 형태에 따라 조절될 수 있으며, 예를 들어 온도는 CMR1 작용제로 의심되는 시험 화합물에 대해, CMR-활성화 온도 이상의 온도, 예를 들어 28℃ 이상으로 조절될 수 있다. 유사하게, 온도는 CMR1 길항제로 의심되는 시험 화합물에 대해 CMR-활성화 온도로, 예를 들어, 28℃에서 또는 그 이하로 조절될 수 있다.

CMR1 채널이 활성화되고 양이온(이를테면 Ca⁺⁺ 이온)의 유입을 허용한 후, Ca⁺⁺ 이온의 세포 내 축적은 음성 피드백(feedback)과 CMR1 채널의 비활성화를 촉진한다. CMR1은 세포 내 Ca⁺⁺ 수준이 예를 들어 세포 밖으로 펌핑되거나 세포 내 소기관으로 취한 Ca⁺⁺ 에 의해 감소된 후 재활성화된다.

CMR1 채널이 시원한 온도 내지 냉각 온도에 반응하여 Ca⁺⁺ 이온의 유입을 허용할 수 있지만, 이것은 약간 새는 이온 채널로 된다. 일부 CMR1 채널은 심지어 비-활성화 온도에서, 예를 들어 28℃ 이상에서 Ca⁺⁺ 이온의 유입을 허용할 것이다. 종래의 시험 시스템에서, mM 범위의 세포 외 Ca⁺⁺ 농도는 전형적으로 사용되며, 이것은 심지어 비-활성화 온도에서 칼슘의 세포 내축적을 유발할 수 있으며, CMR1의 음성 피드백 비활성화를 야기한다.

따라서, 본 발명의 다른 일예는 포유류 CMR1 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법이며, 이것은 (a) 칼슘의 서브-비활성화 양을 함유한 완충액에서 이온 채널을 배양하고; (b) 이온 채널을 활성화하며; (c) 이온 채널을 시험 화합물과 접촉시키고; (d) 완충액에 칼슘의 양을 증가시키며; (e) 칼슘의 세포 내 양을 측정하고, 이 양을 이온 채널이 시험 화합물과 접촉되지 않는 대조군의 양과 비교하는 단계를 포함한다. "칼슘의 서브-비활성화 양"은 CMR1 채널의 음성 피드백과 비활성화를 촉진하는 정도로 Ca⁺⁺ 이온의 세포 내 축적을 야기하지 않는 세포 외 Ca⁺⁺ 의 양이다. 본 기술의 숙련자는 특정 CMR1 채널에 대한 "칼슘의 브-비활성화 양"을 실험적으로 측정할 수 있다. 일부 구체예에서, "칼슘의 서브-비활성화 양"은 완충액에서 본질적으로 제로 칼슘이다. 다른 구체예에서, "칼슘의 서브-비활성화 양"은 완충액에서 칼슘 μM 범위이다. 본 발명의 방법은 본 발명에서 설명한 단계 (a) 내지 (e)를 포함하는 방법을 포함하며, 여기서 단계 (c)는 단계 (b)에 선행한다.

화합물이 CMR1 활성 또는 발현을 조절하기 위한 바람직한 기준에 일치한다는 것을 확인한 후, 화합물을 생존 동물에 투여할 수 있다. 이것은 투여 요법을 확립하는데 중요한 독성과 다른 약리학적 변수를 확립하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, cCMR1 폴리펩티드를 함유하는 생체 밖 시스템을 이용하여 화합물을 확인한 후, 화합물을 개에 투여하여 개에서 화합물의 다양한 약리학적 양상을 실험할 수 있다. 본 발명에서 설명한 cCMR1 시스템은 인간의 투여 요법을 확인하고 확립하는데 특히 유용하다. 왜냐하면, 개, 특히 큰 품종은 쥐 또는 새앙쥐에 비해 체중이 인간에 가깝고 따라서 인간 투여량을 평가하기 위한 더 적합한 동물 모델을 제공한다.

화합물을 또한 동물에 투여하여 통각 공정을 변경하는 화합물의 능력을 평가할 수 있다. 통증의 다양한 동물 모델로 예를 들어 신경 손상의 척수 신경 연결(SNL) 모델이 존재하며, 이것은 Kim과 Chung에 의해 발생된 쥐의 신경병 통증 모델이다(Pain, 50: 355-363, 1992).

통증의 다른 적합한 동물 모델은 본 발명의 교시 내용과 관련하여 이용될 수 있다. 신경병 통증의 통상 연구된 설치류 모델은 만성 수축 손상(CCI) 또는 Bennett 모델; 신경종 또는 액소토미(axotomy) 모델; 및 부분 좌골 절단 또는 Seltzer 모델(Shir et al., Neurosci . Lett ., 115:62-67, 1990)을 포함한다. 신경병 통증 모델의 일예는 몇몇 외상 신경 손상 제제((Bennett et al ., Pain 33: 87-107, 1988; Decosterd et al ., Pain 87: 149-58, 2000; Kim et al ., Pain 50: 355-363, 1992; Shir et al ., Neurosci Lett 115: 62-7, 1990), 신경염증 모델(Chacur et al ., Pain 94: 231-44, 2001; Milligan et al ., Brain Res 861: 105-16, 2000), 당뇨 신경병(Calcutt et al ., Br J Pharmacol 122: 1478-82, 1997), 바이러스-유발 신경병(Fleetwood-Walker et al ., J Gen Virol 80: 2433-6, 1999), 빈크리스틴 신경병(Aley e t al ., Neuroscience 73: 259-65, 1996; Nozaki-Taguchi et al ., Pain 93: 69-76, 2001), 및 패클리탁셀 신경병(Cavaletti et al ., Exp Neurol 133: 64-72, 1995), 그외에 급성 통각 시험 모델과 염증 모델(Brennan, T.J. et al. Pain 64:493, 1996; D'Amour, F.E. and Smith, D.L. J Pharmacol 72: 74-79, 1941; Eddy, N.B. et al. J Pharmacol Exp Ther 98:121, 1950; Haffner, F. Dtsch Med Wochenschr 55:731, 1929; Hargreaves, K.et al. Pain 32: 77-88, 1988; Hunskaar, S. et al. J Neurosci Meth 14:69, 1985; Randall, L.O. and Selitto, J.J. Arch . Int . Pharmacodyn 111: 409-419, 1957; Siegmund, E. et al. Proc Soc Exp Bio Med 95:729, 1957)을 포함한다.

따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 통증을 치료하는데 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 시험 화합물을 cCMR1 이온 채널과 접촉시키고; (b) 시험 화합물이 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 방법은 추가로 (a) 시험 화합물을 동물에 투여하고; (b) 시험 화합물이 동물의 통각 수용/통각 방위 반응을 변경하는 정도를 측정하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 통증의 동물 모델은 설치류, 예를 들어 쥐 또는 새앙쥐를 포함하며; 다른 일예에서 통증의 동물 모델은 개를 포함하고, 예를 들어 피부 당김 시험한다(Kamerling et al. Pharmacol . Biochem . Behav. 17:733-740, 1982; also, see Burns JC et al. Perspect Biol Med . Autumn; 35(1): 68-73, 1991).

치료 효능과 독성은 예를 들어 ED₅₀(모집단의 50%에서 치료 효과 있는 투여량) 및 LD₅₀(모집단의 50%가 치사하는 투여량)을 계산하여 세포 배양체 또는 실험 동물에서 표준 약제 과정에 의해 측정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 인덱스이며, 이것은 비율, LD₅₀/ED₅₀ 으로 표시될 수 있다. 재조합 CMR1 및동물 연구, 이를테면 개 연구를 이용한 세포 배양 시험은 인간 사용을 위한 투여량 범위를 배합하는데 사용된다. 이러한 조성물에 함유된 투여량은 바람직하게는 ED₅₀ 을 독성이 거의 없거나 전혀 없게 포함하는 순환 농도의 범위를 생성한다. 투여량은 이 범위 내에서 사용된 제형, 환자의 민감도 및 투여 경로에 따라 달라진다. 정확한 투여량은 치료를 요하는 대상에 관련한 인자에 비추어, 투여량을 투여하는 사람에 의해 측정될 것이다. 투여량과 투여는 충분한 수준의 활성제를 제공하거나 원하는 효과, 예를 들어 유효 통증 완화를 유지하도록 조정된다. 고려할 수 있는 요인은 통증의 심각도와 대상의 종합적인 건강 상태, 연령, 체중 및 성별, 식이법, 투여의 시간과 빈도, 약물 배합, 반응 민감도 및 치료법에 대한 내성/반응을 비롯한, 다른 요인을 포함한다.

CMR1 활성을 조절하는 것으로서 확인된 화합물을 함유한 약제 조성물을 경구, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 골수내, 경막내, 경막외, 뇌실내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 설하, 흡입, 안내, 이내 또는 직장 수단을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 많은 경로에 의해 투여할 수 있다.

활성 성분에 더해, 이들 약제 조성물은 약제로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 가공을 용이하게 하거나 활성 화합물의 흡수 또는 분배를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한, 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제제화 및 투여를 위한 기술에 대한 추가 상세 내용은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co., Easton, PA]에서 발견될 수 있다.

경구 투여를 위한 약제 조성물은 경구 투여에 적합한 투여량으로 본 기술에서 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 배합될 수 있다. 이러한 담체는 환자에 의한 주입을 위해, 정제, 환제, 드러지, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 약제 조성물을 배합할 수 있게 한다.

표 1

표 2

표 3
위치	cCMR1 잔기	변이체	위치	cCMR1 잔기	변이체
4	E	R	353	V	Hydrophobic (e.g., A, M)
5	G	A	374	T	I
12	N	S	387	S	C
16	G	D	388	S	P
18	L	Hydrophobic (e.g., M)	403	I	Hydrophobic (e.g., V)
19	D	G	406	N	S
28	T	A, V	419	N	S
34	V	Hydrophobic (e.g., L)	443	N	S
38	E	D	444	E	D
58	T	I	449	N	(Amine-containing, E.g. H)
59	K	Basic (e.g., R)	454	G	E
64	T	M	485	R	(Amine-containing, E.g. Q)
66	N	S	490	N	(Amine-containing, E.g. H)
67	V	Hydrophobic (e.g., I)	491	D	E
78	I	Hydrophobic (e.g., M)	499	N	T
85	S	Q	534	G	S
86	N	S	536	R	W
118	I	Hydrophobic (e.g., L)	541	S	N
126	A	S	542	S	G
128	T	I	544	D	E
204	N	S	545	D	E
227	L	Hydrophobic (e.g., I)	546	I	Hydrophobic (e.g., M, L)
229	N	S	548	V	Hydrophobic (e.g., I)
232	A	D	553	V	Hydrophobic (e.g., A)
235	Y	H	555	P	Hydrophobic (e.g., L)
237	S	L	556	I	T
241	I	L	564	H	L
246	K	T, M	585	R	(Basic, e.g., K)
290	I	S	635	S	N
310	R	(Basic, e.g., K)	709	F	L
320	I	Hydrophobic (e.g.,V)	715	R	(Basic, e.g., K)
322	S	N	717	I	Hydrophobic (e.g., V)
348	V	Hydrophobic (e.g., A)	723	I	Hydrophobic (e.g., L)
739	A	S
766	S	(Nucleophillic, e.g., T or P)
770	V	Hydrophobic (e.g., I)
773	A	S
788	M	Hydrophobic (e.g., V)
819	P	S
823	T	(Nucleophillic, e.g., S)
894	H	(Amine-containing, eg., Q)
921	G	S
927	A	S
932	T	(Nucleophillic, e.g., S)
946	H	Y
985	T	I
1007	N	S
1016	V	Hydrophobic (e.g., I)
1030	G	K
1034	R	(Basic, e.g., K)
1037	H	(Amine-containing, eg., N)
1038	A	M, T
1040	P	S
1041	S	N
1042	A	Hydrophobic (e.g., V)
1046	R	(Basic, e.g., K)
1070	E	K
1074	T	N
1075	S	A
1076	Q	E
1087	T	(Nucleophillic, e.g., S)
1089	I	Hydrophobic (e.g., L)
1094	G	S
1102	K	(Basic, e.g., N)

표 4

SEQ ID NO	설명	서열
SEQ ID NO 3	업스트림 프라이머 (cmr1-23)	ttcatctgggccattcttcag
SEQ ID NO 4	다운스트림 프라이머 (cmr1-26)	cacagtggcttggactcatt
SEQ ID NO 5	3' RACE-PCR을 위한 포워드 프라이머 (dcmr1-3)	gcccatcgacaagcacaagaagatc
SEQ ID NO 6	5' RACE-PCR을 위한 리버스 프라이머 (dcmr1-1)	gatcttcttgtgcttgtcgatgggc
SEQ ID NO 7	유니버셜 프라이머	ccatcctaatacgactcactatagggc
SEQ ID NO 8	포워드 프라이머 (dcmr1-7)	aagcttcatatgtccttcgagggggccaggctcagcatgaggaa
SEQ ID NO 9	리버스 프라이머 (dcmr1-8)	ctcgagctatttgattttattagcgatctctttcagaaggccc

도 1은 개의 CMR1 발현 벡터에 의해 안정하게 핵산전달감염된(transfected) 재조합 세포 상에 세포-기준 칼슘 유입 시험 결과를 도시한다. 세포는 10 μM의 이실린(채운 원); 또는 100 μM의 (-)-멘톨(개방 원)에 대한 반응에서 칼슘-매개 형광 증가를 나타냈다. 200 초 시점에 화합물을 세포에 넣었다. 세포에 완충액만 첨가할 때 칼슘 유입이 관찰되지 않았다(개방 삼각형).

도 2는 실질적으로 칼슘이 없는 로딩(loading) 완충액을 사용한 세포-기준 칼슘 유입 시험 결과를 도시한다. 쥐의 CMR1 발현 벡터에 의해 안정하게 핵산전달감염된 재조합 세포(채운 원)는 4 mM Ca^{2 +} 의 첨가시 칼슘-매개 형광 증가를 나타냈 다. 형질전환되지 않은 세포(개방 원)는 4 mM Ca^{2 +} 첨가시 Ca^{2 +} 유입이 거의 없었다. Ca^{2 +} 는 10 초에 세포에 첨가하였다.

도 3은 매운 화합물인, 겨자씨 오일에 의해 cCMR1이 활성화되는 것을 도시한다. cCMR1에 의해 안정하게 핵산전달감염된 재조합 세포는 1 mM 겨자씨 오일(대시선) 또는 양성 대조군으로서 100 nM 이실린(실선)의 첨가시 칼슘-매개 형광 증가를 나타냈다. 완충액 단독은 음성 대조군(점선)으로 사용하였다.

도 4는 cCMR1이 외견상 강하게 좋아지며 양이온에 선택적이지 않다는 것을 도시한다. 실선은 100 μM 멘톨의 존재하에 수행된 cCMR1의 전세포 패치 클램프 기록(whole-cell patch clamp recording)을 나타내며, 반면에 대시선은 완충액 대조군을 나타낸다.

도 5는 cCMR1의 온도 민감성을 도시한다. 세포를 통과하는 전류는 cCMR1-발현 세포를 살포한 용액의 온도가 낮춰짐에 따라 상당히 증가되며, 이것은 약 17℃의 활성화 역치를 나타낸다.

도 6은 세포외 Ca^{2 +} 가 cCMR1 채널을 탈감작시키는 것을 도시한다. 가장 낮은 흔적은 100 μM 멘톨의 존재 및 세포외 Ca^{2 +} 의 부존재하에 cCMR1의 전세포 패치 클램프 기록을 나타내며, 반면에 표시 명확성을 위해 Ca^{2 +}-프리 흔적으로 정상화된, 가장 위쪽의, 흑색 흔적은 1.8 mM 세포외 Ca^{2 +} 의 존재하에 100 μM 멘톨에 의해 활 성화된 전류를 나타낸다.

도 7은 세포외 Ca^{2 +} 에 의해 cCMR1 채널의 전류 크기의 억제에 대한 농도 의존성을 도시한다. 채널은 -80 mV에서 전압-클램프되었고 1 mM 멘톨에 의해 활성화되었다. 대시선은 1.6 mM의 IC₅₀ 값으로서 데이터에 가장 적합한 것을 나타내는 논리 함수이다.

도 8은 세포외 Ca^{2 +} 에 의해 cCMR1 채널의 전류 크기의 억제에 대한 전압 의존성을 도시한다. 채널은 1 mM 멘톨에 의해 활성화되었다.

실시예 1

개 DRG 뉴우런으로부터 CMR1의 클로닝

A. 폴리(A⁺)RNA의 분리

cCMR1의 클로닝에서 제 1 단계로서, Oligotex^TM 스핀 컬럼(Qiagen Inc., CA)을 이용하여 개 DRG [(Custom made by Analytical Biological Service Inc . DE)]로부터 총 RNA 100 ㎍으로부터 폴리(A⁺)RNA를 분리하였다. 간단히, 150 ㎕의 RNase-없는 물, 250 ㎕의 완충 OBB [20mM Tris, pH7.5, 1M NaCl, 2 mM EDTA 및 0.2% SDS] 및 15 ㎕의 올리고텍스 비드 현탁액을 100 ㎕의 총 RNA 용액(1 ㎍/㎕)에 첨가하였다. 그 후 RNA/올리고텍스 비드 혼합물을 70℃에서 3 분간 가열하여 RNA의 이차 구조를 파괴하고 실온에서 10 분간 배양하였다. 폴리(A⁺)RNA/올리고텍스 입자 복합체를 원심분리하고 400 ㎕의 완충 OW2 [10mM Tris, pH7.5, 150 mM NaCl, 및 1 mM EDTA]로 2회 세척한 다음 용출 단계를 위해 스핀 컬럼에 옮겼다. 200 ㎕의 미리 가열한(70 ℃) 완충 OEB[5 mM Tris, pH 7.5]를 이용하여 올리고텍스 비드로부터 폴리(A⁺)RNA를 용출하였다. 끝으로, 개 DRG 폴리(A⁺)RNA를 20 ㎍의 글리코겐과 150 mM 소듐아세테이트 존재하에 에탄올에 의해 침전시키고 10 ㎕의 RNase 없는 물에 재현탁시켰다.

B. 이중가닥 cDNA의 합성

4 ㎕(1 ㎍)의 개 DRG 폴리(A ⁺ ) RNA 및 1 ㎕의 cDNA 합성 프라이머[52-mer oligo 서열 5'-TTCTAGAATTCAGCGGCGC(T)₃₀N_-1N-3' N_-1=G, A 또는 C; 및 N=G, A, C 또는 T(Clontech, CA SEQ ID NO:10)]을 혼합하고, 70^oC에서 2 분간 배양한 다음 얼음 상에서 2분간 냉각하였다. 1 mM dNTP 혼합물과 제 1 가닥 합성 완충액(50 mM Tris, pH 8.5, 8 mM MgCl₂, 30 mM KCl and 1 mM DTT) 10 ㎕의 존재하에 20 유니트의 AMV 역전사효소를 이용하여 42^oC에서 1 시간 제 1 가닥 cDNA 합성(역전사)을 수행하였다. 24 유니트의 E. coli DNA 폴리머라제 I, 5 유니트의 E. coli DNA 리가제, 1 유니트의 E. coli RNase H, 0.25 mM의 dNTP 혼합물(각각 0.25 mM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 및 제 2 가닥 완충액(100 mM KCl, 10 mM ammonium sulfate, 5 mM MgCl₂, 0.15 mM b-NAD, 20 mM Tris pH 7.5, and 50 mM/ml bovine serum albumin) 80 ㎕로 구성된 효소 칵테일을 첨가하여 제 2 가단 cDNA 합성을 수행하였다. 반응을 처음에 16℃에서 90 분간 수행하고 이이서 20 유니트의 T4 DNA 폴리머라제를 동일 온도에서 45 분간 연속 배양하면서 첨가하였다. 10 mM EDTA와 8 ㎍의 글리코겐을 첨가하여 반응을 종료하였다. 페놀과 클로로포름 추출을 수행하고, 이어서 에탄올 침전하였다. 그 후 이중가닥 cDNA를 200 ㎕의 TE 완충액에 현탁시키고 -20℃에서 저장하였다.

C. 개 CMR1의 근접 카르복실 말단의 PCR 증폭

cmr1-23(5'-ttcatctgggccattcttcag-3'(SEQ ID NO: 3)(SEQ ID NO 1의 뉴클레오티드 1761-1781로 하이브리드됨) 및 cmr1-26(5'-cacagtggcttggactcatt-3'(SEQ ID NO: 4)(SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 2868-2886으로 하이브리드됨)로 지정된 2개 프라이머를 이용하여 cCMR1 서열의 일부를 성공적으로 증폭하였다. PCR 반응을 최종 부피 50 ㎕로 수행하였고, 이것은 5 ㎕의 개 DRG 이중가닥 cDNA, 5 ㎕의 10 x 반응 완충액(Advantage2 DNA 폴리머라제로서 제공), 200 μM dNTPs, 200 nM 포워드 프라이머 cmr1-23, 200 nM 리버스 프라이머 cmr1-26 및 1 ㎕의 50X Advantage^TM-HF2 DNA 폴리머라제 혼합물(Clontech, CA)을 함유하였다. 94℃에서 1 분간 최초 변성 단계, 이어서 30 사이클의 (a) 94℃에서 30 초간 변성, (b) 55℃에서 30 초간 어닐링 및 (c) 72℃에서 60 초간 확장에 의해 PCR을 수행하였다.

아가로즈 겔 전기영동을 수행하여, PCR 생성물이 약 1.1 kb임을 밝혔다. PCR 후 1.1 kb PCR 단편을 정제하여 벤더의 프로토콜에 따라 pPCR 스크립트(Stratagene)로 서브클로닝하였다. 2개의 독립적인 클론을 골라 DNA 서열 분석하였다.

서열 결과는 PCR 증폭 단편이 각각 새앙쥐, 쥐 및 인간 CMR1의 근접 카르복실 말단에 83%, 84%, 및 87% 동일하였다.

D. cCMR1 서열의 5' 및 3' 말단의 RACE-PCR

cCMR1 유전자의 완전한 5' 및 3' cDNA 서열을 얻기 위해, RACE-PCR 기술을 수행하였다. 처음에, 제조업자의 설명서에 따라, 5'- 및 3'-RACE-Ready cDNA를 별도로 SMART^TM RACE DNA 증폭 키트(BD Clontech, CA)로 합성하였다. 0.5 ml 튜브 하나에서, 5' RACE를 위한 cDNA를 제조하기 위해, A.에서 얻어진 3 ㎕의 개 DRG 폴리(A⁺)RNA를 1 ㎕의 5'-CDS 프라이머 및 1 ml의 SMART II A 올리고와 혼합하였다. 3' RACE를 위한 cDNA를 제조하기 위해, 3 ㎕의 개 DRG 폴리(A⁺)RNA를 다른 0.5 ml 튜브에서 1 ㎕ 3'-CDS 프라이머 및 1 ㎕ RNase 없는 물과 혼합한 다음 70℃에서 2 분간 배양하고 얼음 상에서 2 분간 냉각하였다. 다음에, 2 ㎕의 5X 제 1 가닥 완충액, 1 ml 20 mM DTT, 1 ㎕의 10 mM dNTP 믹스 및 1 ㎕ PowerScript 역전사효소를 각 튜브에 넣고 42℃에서 90 분간 합성을 수행하였다. 200 ㎕의 TE 완충액을 첨가하고 샘플을 72℃에서 7 분간 가열하여 반응을 정지시켰다. 반응 생성물을 -20℃에 저장하였다.

RACE-PCR을 위해, cCMR1 cDNA의 5' 부분에 인접한 1.1 kb cDNA를 기준으로 2 개 프라이머를 합성하였다. 3' RACE-PCR을 위한 포워드 프라이머를 dcmrl-3으로 명명하고 다음 서열: 5'-GCCCATCGACAAG CACAAGAAGATC-3'(SEQ ID NO: 5)을 가지고 있으며(SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 2213-2237(상보 가닥)로 하이브리드됨); 5'-RACE-PCR을 위한 리버스 프라이머를 dcmrl-1로 명명하고 다음 서열: 5'-gatcttcttgtgcttgtcgatgggc-3'(SEQ ID NO: 6)를 가지고 있다(SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 2213-2237로 하이브리드됨). 5' 및 3'-RACE PCR을 모두 최종 부피 50 ㎕로 수행하고 이것은 5 ㎕의 cDNA 템플레이트(5' 또는 3'-RACE-Ready cDNA, 상기에 설명됨), 5 ㎕의 10X 반응 완충액, 200 μM dNTPs, 200 nM Universal Primer Mix (UPM)(Clontech), SEQ ID NO: 7(5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3'), 200 nM cCMR1 특이 프라이머(dcmr1-1, 5'-RACE PCR를 위함 또는 dcmr1-3, 3'-RACE PCR을 위함) 및 1 ㎕의 50X Advantage^TM-HF2 DNA 폴리머라제 혼합물(Clontech)를 함유하였다. RACE-PCR에 대한 서멀 사이클러 변수는 a) 94℃에서 2 분간 최초 변성; b) 5 사이클: 94℃ 30초, 72℃ 3 분; c) 5 사이클: 94℃ 30 초, 70℃ 30 초, 72℃ 3 분; 및 d) 25 사이클: 94℃ 5초, 68℃ 30초, 72℃ 3 분이었다. 반응 후에, RACE-PCR 생성물을 정제하고, 폴리싱한 다음 pPCR 스크립트로 직접 서브클로닝하였다. 5'-RACE 또는 3'-RACE로부터 4개의 독립 클론을 골라 DNA 서열 분석하였다.

E. 완전 길이 cCMR1 cDNA의 서열:

완전 길이의 개 CMR1 cDNA의 서열을 RACE-PCR에 의해 얻어진 5' 및 3' 말단의 서열을 기준으로 PCR 프라이머를 합성하여 확인하였다. 완전 길이의 cCMR1 cDNA를 포워드 프라이머 dcmrl-7[서열: 5'-AAGCTTCAT ATG TCC TTC GAG GGG GCC AGG CTC AGC ATG AGG AA-3(SEQ ID NO: 8)] 및 리버스 프라이머 dcmrl-8[서열: 5'-CTCGAG CTA TTT GAT TTT ATT AGC GAT CTC TTT CAG AAG GCCC-3'(SEQ ID NO: 9)]이 있는 고적합도 DNA 폴리머라제에 의해 B.에서 제조된 개 DRG 이중가닥 cDNA로부터 증폭하였다. PCR을 최종 부피 50 ㎕로 수행하였고, 이것은 5 ㎕의 상기 개 DRG ㅇ이중가닥 cDNAs, 5 ㎕의 10 x 반응 완충액, 200 mM dNTP, 200 nM 포워드 프라이머 dcmr1-7, 200 nM 리버스 프라이머 dcmr1-8, 및 1 ㎕의 50 x Advantage^TM-HF2 DNA ㅍ폴리머라제 혼합물(Clontech , CA)을 함유하였다. PCR 반응 변수는 1 사이클: 94℃에서 2 분 최초 변성; 35 사이클: a) 94℃에서 30초 변성, b) 70℃에서 5 분간 어닐링 및 확장이었다. PCR 후에, 3.4 kb PCR 단편을 정제하여 C.에서와 같이 동일 클로닝 프로토콜에 따라 pPCR 스크립트로 서브클로닝하였다. 4개의 독립 클론을 골라 DNA 서열 분석하였다. 추가 서브클로닝과 연구를 위해 클론 NQC562를 사용하였다. 서열 결과는 cCMR1 cDNA(SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 69-3380)의 핵산 서열이 새앙쥐(수탁번호: AY095352), 쥐(수탁번호: AY072788) 및 인간(수탁번호: NM_024080) CMR1의 cDNA 서열과 각각 86.2%, 86.6%, 및 90.9% 동일하였다.

F. 서열 분석

5'- 및 3'-RACE-PCR은 5' 미번역 영역의 68개 뉴클레오티드 서열의 측정을 고려하였고; 3'-RACE-PCR은 37-mer 폴리(A⁺)테일을 포함한 3' 미번역 영역의 431 bp의 측정을 고려하였다. 인프레임 정지 코돈은 확인되지 않았다.

예상된 cCMR1 오픈 리딩 프레임은 분자량 계산치가 127.6 kDa인 1104 아미노산(SEQ ID NO: 2)의 폴리펩티드를 코드화한다고 예상되는 3315 bp 서열로 구성된다(참조 표 1). 일차 서열의 Kyte-Doolitle 친수성 분석(제시 안됨)으로 카르복실 말단 근처에 밀집한 8개의 추정 소수성 영역의 존재를 예상한다. 잔기 1070부터 말단까지 바로 카르복실 말단에 위치한 코일드-코일 영역의 높은 가능성(채널의 올리고머화로 해석될 수 있음)이 확인되었다. 또한, GCG SeqWeb에 의한 일차 서열 분석으로 cCMR1이 잔기 15, 256, 317, 812, 934, 1050 및 1072에 각각 위치한 복수의 N-글리코실화 부위를 포함하였음이 밝혀졌다. cCMR1은 또한 잔기 92에 하나의 추정 PKA(단백질 키나제 A) 포스포릴화 부위, 잔기 30, 228 및 288에 3개의 티로신 포스포릴화부위, 및 17 PKC(단백질 키나제 C) 포스포릴화 부위를 함유한다.

Accelrys의 Seqweb 버전 2로부터 Gap 프로그래을 이용하여, 각각 95.1%, 94.1%, 및 93.9% 동일성이 밝혀진 인간(GenBank Acc. No.: NP_076985), 쥐(GenBank Acc. No.: NP_599198), 및 새앙쥐(GenBank Acc. No.: AAM23261) 서열과 함께 아미노산 서열을 배열하였다. Gap 프로그램은 Needleman 및 Wunsch의 알고리듬을 사용하여(J Mol. Biol., 48:443 (1970)) 2개의 완전 서열의 배열을 알아냈다. 매치 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화한다.

실시예 2

CMR1의 재조합 발현

A. 포유류 발현 벡터로 cCMR1의 클로닝

포유류 세포주에서 cCMR1의 발현을 위해, cCMR1의 완전 길이 cDNA를 3 방식 연결을 수행하여 pcDNA3.1로 서브클로닝하였다. 처음에, 완전 길이 cCMR1 클론 NQC562를 HindIII와 NcoI로 절단하여 0.8 kb 5' 단편을 얻었다. 다음에, 독립 제한 반응에서, NQC562를 NcoI와 SalI로 절단하여 2.5 kb 3' 단편을 얻었다. 0.8 kb5' 및 2.5 kb 3' cCMR1 단편을 정제하여 HindIII 및 SalI로 미리 절단한 pcDNA3.1과 연결하여, 벡터 pcDNA3.1-cCMR1을 생성하였다.

시험관 내 번역 분석을 위해, 완전 길이 cCMR1 cDNA를 pAGA4 벡터로 서브클로닝하였다(pGEM3로부터 변형, Promega, Sanford 1991 and Qin, et al 1997). 간단히, 0.8 kb N-말단 단편을 NdeI와 NcoI에 의한 NQC562의 절단에 의해 얻고 2.5 kb C-말단 단편을 NcoI와 XhoI에 의한 NQC562의 절단에 의해 얻었다. 2개의 정제된 단편을 NdeI와 SalI에 의해 미리 절단한 벡터 pAGA4와 함께 연결하여, 구조체 cCMR1/pAGA4를 생성하였다. 최종 구조체 모두를 DNA 서열에 의해 확인하였다.

B. cCMR1의 시험관 내 번역

벤더 제안 프로토콜에 따라, 개 CMR1의 시험관 내 번역을 TnT^TM T7 Quick Coupled Transcription/Translation System(Promega)에 의해 수행하였다. 간단히, 1 ㎕의 0.1 ㎍/㎕ cCMR1/pAGA4를 9 ㎕의 TNT Quick Master Mix에 0.2 ㎕의 [³⁵S]-메티오닌(1000 Ci/mmol 10 mCi/ml에서)과 함께 첨가하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 90 분간 배양하였다. 동일 부피의 2XSDS/PAGE 로딩 완충액을 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 샘플에 4-20% 기울기 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 전기영동 후에, 겔을 Commassie Blue R250으로 착색하여, 건조시키고 X-선 필름에 노출시켰다. 상응하는 핵산 서열로부터 아미노산 서열의 정확한 번역에 의해 예상된 바와 같이 시험관 내 번영 cCMR1은 분자량이 대략 135 kDa로 이동하였다.

시험관 내 번역 cCMR1 단백질을 또한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 5 ㎕의 시험관 내 번역 cCMR1 단백질에 4-20% 기울기 SDS-PAGE로 처리하여다. 그 후 겔 상 단백질을 니트로셀룰로스에 옮겼다. 그 후 블롯을 TTBS(0.5% Tween 20, 100 mM Tris-HCl, 및 0.9% NaCl at pH = 7.5) 내 5% 건조 밀크에 의해 실온에서 1 시간 차단한 다음 항-cCMR1 다클론 항체(1:500)에 의해 4℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 블롯을 100 ml TTBS로 3 회 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제(Pierce)와 결합한 염소 항-토끼 IgG 항체와 함께 실온에서 1 시간 배양하였다. 블롯을 100 ml TTBS로 3 회 세척하고 제조업자의 설명서에 따라 ECL-Plus 발광제(Amersham-Pharmacial Biotech)에 의해 시각화하였다.

제조업자의 프로토콜에 따라, GeneJammer^TM kit (Stratagene , CA)를 이용하여, pcDNA3.1-cCMR1 구조체를 HEK293(인간 배아 신장 세포(ATCC CRL-1573)으로 핵산전달감염시켰다. 안정한 세포 클론을 G418의 존재하 성장에 의해 선택하였다. 단일 G418 레지스턴트 클론을 분리하고 정제하였다. cCMR1 cDNA를 함유한 클론을 칼슘 유입 시험을 이용하여 분석하였다.

실시예 3

cCMR1의 칼슘 유입 기능 시험

세포의 모집단 내에서 cCMR2 채널의 특성을 연구하기 위해 FLIPR 시험을 수행하였다.

재조합 세포에서 발현된 cCMR1의 기능성을 나타내기 위해, CMR1/HEK293의 안정하게 핵산전달감염된 세포를 384-웰 플레이트에 농도 6.7 x 10⁵ 세포/웰로 파종하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 세포를 완충액과 칼슘 염료(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 최종 부피 40 ㎕로 채우고 실온에서 30 분간 배양하였다. FLIPR에 의해 형광 세기를 멘톨 또는 이실린의 첨가 전 및 후에 측정하였고, 이들은 각각 농도 100 μM 또는 10 μM로 첨가하였다. 결과를 도 1에 도시한다.

실시예 4

Ca⁺⁺ 로딩 농도가 감소된 CMR1 기능 시험

CMR1은 작용제, 이를테면 멘톨 또는 이실린, 및 또한 보통의 냉각 온도(15 내지 25℃)에 대한 반응에 열린다. 따라서, 실온(22-24℃)에서, CMR1은 활성일 수 있으며 Ca²⁺ 유입을 유발한다. 그러나, Ca^{2 +} 유입은 또한 Ca^{2 +}-의존 비활성화를 유발하며, CMR1의 음성 피드백 조절을 초래한다. 이 경우에, CMR1은 실온에 의한 활성 화 후 비활성화될 것이며 온도가 약 25℃ 이상으로 증가될 때까지 재활성화되지 않을 것이다. 따라서, 정상 시험 조건(실온 및 2 mM Ca^{2 +} 를 함유한 완충액의 존재하)하에, 일정한 종, 이를테면 쥐 CMR1으로부터 CMR1은 어떠한 작용제에 대해 반응성이 없다. CMR1이 실온에서 길항제를 검색하는데 사용되는 시스템을 제조하기 위해, Ca^{2 +} 유입 시험은 염료 로딩 완충액으로부터 Ca^{2 +} 를 제거한 다음 4 mM Ca^{2 +}에 의한 CMR1-함유 시스템을 면역성 시험하여 계발되었다. 이 조건 하에, CMR1이활성이지만(실온에서), 칼슘이 채널을 통해 세포에 들어가지 않을 것이며 비활성화가 일어나지 않을 것이다. 이들 시험 조건하에 CMR1은 구성적으로 활성이며 Ca^{2 +} 가 세포 외 용액에 첨가되지마자 Ca^{2 +} 유입을 허용하게 한다.

쥐 CMR1에 의해 핵산전달감염된 인간 배아 신장 세포(HEK293)를 384-웰 플레이트에 파종하였다(6.7 x 10⁵ 세포/웰). 다음 날, 세포 배지를 제거하고 세포를 완전 Hank 완충액으로 린스하였다. 그 후 세포를 완충액과 칼슘 염료(Mol. Dev.)에 의해 최종 부피 40 ㎕로 채우고 실온에서 30 분간 배양하였다. 그 후 플레이트를 길항제 활성에 대해 시험한 화합물을 최종 농도 4.2 μM로 시간 제로에서 첨가한 FLIPR 장치에 옮겼다. 칼슘을 최종 농도 4 mM으로 약 10 초에 첨가하고, 형광 세기를 FLIPR에 의해 측정하였다. 대표적인 결과를 도 2에 제시하며, 여기서 시험 화합물은 시간 제로에 첨가되지 않았다.

실시예 5

CMR1 채널의 탈민감제 또는 비활성화제에 대한 스크리닝 시험

일반적으로, 활성화 자극(예, 작용제)에 대한 이온 채널의 장기 노출시 또는 직접 탈민감화 또는 비활성화 자극에 대한 반응에서, 채널은 활성화 자극에 대한 반응에서 일정치 않게 덜 활성화일 수 있는 교대 형태를 추정할 수 있다. 이들 덜 활성화 또는 비활성화 가능한 형태는 기능적으로 탈민감화되거나 비활성화된다고 언급될 수 있으며, 이들 상태를 나타내는 화합물을 각각 탈민감제 또는 비활성화제로 언급할 수 있다. 이러한 형태는 이들 소위 탈민감제 또는 비활성화제에 의해 또는 존재하에 유도되거나 안정화될 수 있으며, 오픈 채널시 또는 닫힌 채널시 탈민감제 또는 비활성화제의 우선 작용에 의해 일어날 수 있다. 또한, 이러한 형태는 가변적 시간 경로 및 조건에 걸쳐, 가역적일 수 있거나, 초기 채널의 신규 합성 중, 비가역적일 수 있다. 가역적이거나 비가역적인, 탈민감제 또는 비활성화제로서 확인되는 화합물은 통증을 비롯한, 일정한 증상의 치료에 유용할 수 있으며, 여기서 감소된 CMR1 활성이 치료성이 있을 것이다.

따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 CMR1 활성의 가역적 및 비가역적 탈민감제 또는 비활성화제를 확인하는 방법을 제공한다. 제 1 방법은 닫힌 상태로부터 탈민감화되거나 비활성화된 상태에서 채널을 유도하고/하거나 안정화하는 화합물을 확인하도록 설계되며 (a) cCMR1 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 세포를 접촉하고, (b) 재조합 세포를 활성화를 위한 역가 이상의 온도(전형적으로 약 28℃ 이상)에서 시간을 변화시키는 동안 시험 화합물과 접촉시키며, (c) 시험 화합물을 대규모로 세척한 다음 (d) 바뀌는 시점에서, 시험 화합물이 CMR1-활성화 자극에 후속 노출에 반응하여 CMR1 활성을 감소시키는 정도를 측정하는 단계를 포함한다. 제 2 방법은 오픈 상태로부터 탈민감화 또는 비활성화 상태에서 채널을 유도하고/하거나 안정화하는 화합물을 확인하도록 설계되어 있으며 (a) cCMR1 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 세포를 제공하고, (b) 활성화를 위한 역가 이상의 온도(전형적으로 약 28℃ 이상)에서 재조합 세포를 CMR1 작용제와 접촉시키며, (c) 재조합 세포를 바뀌는 시점에서 시험 화합물과 접촉시키고, (d) 시험 화합물과 작용제를 대규모로 세척한 다음 (e) 바뀌는 시점에서, 시험 화합물이 CMR1-활성화 자극에 후속 노출에 반응하여 CMR1 활성을 감소시키는 정도를 측정하는 단계 또는 (a) cCMR1 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 세포를 제공하고, (b) 활성화를 위한 역가 이상의 온도(전형적으로 약 28℃ 이상)에서 재조합 세포를 배양하며, (c) 재조합 세포를 바뀌는 시점에서 시험 화합물과 접촉시키고, (d) 시험 화합물을 대규모로 세척한 다음 (e) 바뀌는 시점에서, 시험 화합물이 CMR1-활성화 자극에 후속 노출에 반응하여 CMR1 활성을 감소시키는 정도를 측정하는 단계를 포함한 다.

실시예 6

겨자씨 유에 의한 cCMR1의 활성화

겨자씨 유는 피부에 적용시 통증과 염증을 유발하는 천연 산물이다. 최근, TRP 패밀리의 신규 멤버인, TRPA1이 겨자씨 유의 얼얼한 작용에 대한 세포 및 분자 표적 중 하나로서 제안된 바 있다(Jordt, et al. 2004, Nature, 427: 260-265). 겨자씨유가 또한 cCMR1을 활성화한다는 사실을 알아냈다.

cCMR1으로 안정하게 핵산전달감염된 HEK293 세포를 384 웰 플레이트에 농도 6.7 x 10⁵ 세포/웰로 파종하고 37℃/CO₂ 에서 밤새 배양하였다. 다음 날 세포를 칼슘 염료로 채우고 실온에서 30 분간 배양하였다. 칼슘-매개 형광 세기를 화합물을 세포에 투여하기 전 및 후에 FLIPR에 의해 측정하였다. 도 3에 도시한 바와 같이, cCMR1은 100 nM 이실린(실선)과 같은 냉각 화합물에 민감할 뿐 아니라, 1 mM 겨자씨 유(대시선), 얼얼한 화합물에 의해 활성화된다.

실시예 7

전-세포 패치 클램프 연구

단일 세포에 발현된 cCMR1 채널의 특성을 연구하기 위해 패치 클램프 실험을 수행하였다.

개 cCMR12에 의해 안정하게 핵산전달감염된 HEK293을 10% 소태아 혈청, 100 유니트/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 1 mg/ml G418로 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 에서 유지하였다.

달리 지시되지 않는 한, 기록을 위해 사용된 표준 세포 외 용액은 (mM로) NaCl, 132; EGTA, 1; KCl, 5.4; MgCl₂, 0.8; HEPES, 10; 글루코스, 10을 함유하였고, pH=7.4이었다. 세포 외 용액이 Ca^{2 +} 를 함유한 실험에서, 사용된 세포 외 용액은 사용된 Ca^{2 +} 농도에 따라, 다음 중 하나 이었다: (1) NaCl, 132; CaCl₂, 0.1 또는 1.8; KCl, 5.4; MgCl₂, 0.8; HEPES, 10; 글루코스, 10; pH=7.4; (2) NaCl, 116; CaCl₂, 10; KCl, 5.4; MgCl₂, 0.8; HEPES, 10; 글루코스, 10; pH=7.4. 기록 피펫을 채우는데 사용된 세포 내 용액은 (mM로): CsCl, 145; EGTA, 5; HEPES, 10; 글루코스, 5; pH=7.4 함유하였다.

종래의 전-세포 패치 클램프 기술을 이용하여, 단일 세포 기록에 적합한 밀도에서 글래스 오버슬립 위로 세포를 이식하고 1-2일 후 기록을 수행하였다. 패치 클램프 증폭기에 의해 전류를 증폭하고 2 kHz에서 필터링하였다(Axopatch 200B, Axon Instruments). 멘톨(100 μM) 또는 이실린(1 μM)을 중력-공급 살포 시스템에 의해 0.5 ml/분으로 세포에 적용하였다. 작용제 자극에 관련한 기록을 22℃에 서 수행하였다.

온도가 변하는 실험에서, 양극 온도 조절기(Model CL-100, Warner Instruments)에 의해 조절된 이중 인-라인 히터/쿨러(Model SC-20, Warner Instruments, Hamden, CT)에서 관류액을 가열하고/냉각하여 온도 램프를 생성하였다. 기록 세포의 근처 온도를 검측 온도계(Model TH-8, Physitemp, Clifton, NJ)에 연결된 주문품 소형 서모-마이크로프로브에 의해 측정하였고, Digidata 1322A와 pClamp 9.0(Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여, 전류가 전-세포 패치 클램프 모드로 동시에 측정될 때, 분취하였다. 이들 연구에 2개 전압 프로토콜을 사용하였다. 첫 번째는 10 kHz의 분취 속도에서 -100 mV 내지 +60 mV로 600 ms 전압 램프를 포함하였다. 이 전압 펄스를 5 초마다 1회 반복하였다. 세포를 전압 펄스 사이에 -100 mV에 방치하였다. 제 2 프로토콜에서, 세포를 -80 mV에 방치하고 이 방치 전위에서 전류를 연속적으로 샘플링하였다(100 Hz에서).

도 4는 cCMR1이 외견상 강하게 수정되고 있으며 양이온에 선택적이지 않다는 것을 예시한다. 상기에 설명한 전압 램프 프로토콜을 이용하여 cCMR1의 전-세포 패치 클램프 기록을 수행하였다. 냉각제, 100 μM 멘톨의 적용시, 과분극되고 탈분극된 양쪽 막전위에서 대조군(대시선)에 비해 전-세포 전류 크기(실선)의 증가가 컸다. 이러한 증가는 과분극 전위에서보다 탈분극 전위에서 훨씬 심하였다. 따라서, 채널은 외견상 강하게 수정되고 있다. 추가로, 멘톨-활성화 전류는 0 mV에 가까운 반전 전위를 가지며, 채널의 비교적 비선택적(적어도 이들 시험에서 사용된 양이온에 대해) 특성을 나타냈다. 또한 정성적으로 유사한 결과가 다른 냉각제, 이실린에 대해 얻어졌다.

cCMR1의 온도 민감성을 도 5에 도시한다. cCMR1-발현 세포를 살포하는 용액의 온도를 낮춤에 따라, +60 mV에서 세포를 통과하는 전류는 ~ 17℃의 활성화 역가로서 상당히 증가되었다. cCMR1 채널은 실온에서 오픈이 아니나, 약 17℃ 이하의 냉각 온도에 의해 활성화되었다.

도 6에서는 세포 외 Ca^{2 +} 가 cCMR1 채널을 탈민감화하는 것을 제시한다. 100 μM에서 멘톨은 세포 외 Ca^{2 +}의 부존재하 탈민감화 하지 않는 전류를 활성화하였다(-80 mV; 회색 흔적). 비교하여, 다른 동일한 기록 조건하 1.8 mM 세포 외 Ca^{2 +} 의 존재하에 다른 것은 동일한 기록 조건하에 탈민감화가 쉽게 일어났다(흑색 흔적; 디스플레이의 명확화를 위해 Ca^{2 +}-없는 흔적으로 정상화함).

세포 외 Ca^{2 +} 는 채널이 멘톨에 의해, 예를 들어 1 mM에서 활성화될 때 cCMR1의 전류 크기를 감소시켰다. 세포 외 Ca^{2 +} 에 의한 이러한 명백한 억제는 농도 의존적이었다(도 7). 세포 외 Ca^{2 +} 의 농도가 더 높을수록, 전류 크기의 억제는 더 강하다. 도 7에서 대시선은 데이터에 가장 최적을 나타내는 논리 함수이다. 1.6 mM 세포 외 Ca^{2 +} 의 IC₅₀ 값은 가장 잘 맞는 분석에서 유래하였다. 또한, 세포 외 Ca^{2 +} 에 의한 명백한 억제는 전압-의존적이었다(도 8). 세포 외 Ca^{2 +}(10 mM)는 과분 극 전위에서 전류 크기를 강하게 억제하였다. 탈분극이 더 큰 전위에서 억제가 줄었다.

Claims (49)

1. 냉각 자극을 검출하고 변환할 수 있으며 SEQ ID NO: 2에 적어도 96% 서열 동일성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 적어도 98% 서열 동일성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
3. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
4. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 69 내지 3380을 포함하는 분리된 핵산 분자.
5. 제 1 항의 분리된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
6. 제 1 항의 분리된 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
7. 냉각 자극을 검출하고 변환할 수 있으며 SEQ ID NO: 2에 적어도 96% 서열 동 일성이 있는 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
8. 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 적어도 98% 서열 동일성이 있는 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
9. 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO: 2를 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
10. (a) 제 7 항의 폴리펩티디를 코딩할 수 있는 발현 벡터를 세포에 도입한 다음,

    (b) 발현 벡터로부터 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 제 7 항의 폴리펩티드를 발현하는 방법.
11. 엄격한 하이브리드화(hybridization) 조건하에 제 1 항의 핵산 분자로 선택적으로 하이브리드화하는 핵산 탐침(probe).
12. 제 7 항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체.
13. 제 11 항의 핵산 탐침을 포함하는 키트.
14. 제 12 항의 항체를 포함하는 키트.
15. 핵산 분자를 제 11 항의 핵산 탐침과 접촉하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 핵산 분자를 검출하는 방법.
16. 폴리펩티드를 제 12 항의 항체와 접촉하는 단계를 포함하는, 제 7 항의 폴리펩티드를 검출하는 방법.
17. (a) cCMR1 유전자의 발현을 조절하기 위한 메카니즘(mechanism)을 포함하는 세포와 시험 화합물을 접촉한 다음;

    (b) 시험 화합물이 세포로부터 상기 메카니즘에 의해 조절된 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하는, cCMR1 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 발현이 메카니즘에 의해 조절되는 유전자가 리포터(reporter) 유전자인 방법.
19. 제 17 항에 있어서, 발현이 메카니즘에 의해 조절되는 유전자가 cCMR1 유전자인 방법.
20. (a) 시험 화합물을 cCMR1 이온 채널과 접촉한 다음;

    (b) 시험 화합물이 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하는, cCMR1 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법.
21. 제 20 항에 있어서, cCMR1 이온 채널이 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는 방법.
22. 제 20 항에 있어서, cCMR1 이온 채널이 숙주 세포와 관련되어 있는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 숙주 세포가 cCMR1 이온 채널을 위한 재조합 숙주 세포인 방법.
24. 제 22 항에 있어서, 숙주 세포가 cCMR1 이온 채널을 위한 내생 숙주 세포인 방법.
25. 제 20 항에 있어서, cCMR1이 분리된 막 제제(membrane preparation)와 관련되어 있는 방법.
26. 제 20 항에 있어서, 단계 (b)가 세포 내 칼슘 수준의 양을 측정하는 것을 포함하는 방법.
27. 제 20 항에 있어서, 시험 화합물을 이온 채널과 접촉하는 단계 전에 이온 채널의 전도도를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 이온 채널의 전도도를 증가시키는 단계가 채널의 전도도를 증가시킬 수 있는 화합물이 함유된 완충액에서 이온 채널을 배양하는 것을 포함하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 채널의 전도도를 증가시킬 수 있는 화합물이 멘톨, 이실린, 및 겨자씨 오일로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법.
30. 제 27 항에 있어서, 이온 채널의 전도도를 증가시키는 단계가 cCMR1 채널 활성화 온도에서 이온 채널을 배양하는 것을 포함하는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, cCMR1 채널 활성화 온도가 4-17℃인 방법.
32. 제 27 항에 있어서, 이온 채널의 전도도를 증가시키는 단계가 이온 채널을 탈분극화하는 것을 포함하는 방법.
33. 제 20 항에 있어서, 시험 화합물을 이온 채널과 접촉하는 단계 전에 이온 채 널의 전도도를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서, 이온 채널의 전도도를 감소시키는 단계가 채널의 전도도를 감소시킬 수 있는 화합물이 함유된 완충액에서 이온 채널을 배양하는 것을 포함하는 방법.
35. 제 33 항에 있어서, 이온 채널의 전도도를 감소시키는 단계가 cCMR1 채널 비활성화 온도에서 이온 채널을 배양하는 것을 포함하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, cCMR1 채널 비활성화 온도가 실온인 방법.
37. 제 33 항에 있어서, 이온 채널의 전도도를 감소시키는 단계가 세포 외 Ca^{2 +} 가 함유된 완충액에서 채널의 전도도를 감소시키는데 충분한 농도로 이온 채널을 배양하는 것을 포함하는 방법.
38. 제 33 항에 있어서, 이온 채널의 전도도를 감소시키는 단계가 이온 채널을 과분극화하는 것을 포함하는 방법.
39. (a) 칼슘의 서브-비활성화 양이 함유된 완충액에서 이온 채널을 배양하고;

    (b) 이온 채널을 활성화하며;

    (c) 이온 채널을 시험 화합물과 접촉하고;

    (d) 완충액에서 칼슘의 양을 증가시킨 다음;

    (e) 시험 화합물이 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하는, 포유류 CMR1 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는 화합물을 확인하는 방법.
40. 제 39 항에 있어서, 이온 채널을 활성화하는 단계가 채널의 전도도를 증가시키는 화합물이 함유된 완충액에서 이온 채널을 배양하는 것을 포함하는 방법.
41. 제 39 항에 있어서, 이온 채널을 활성화하는 단계가 포유류 CMR1 채널-활성화 온도에서 이온 채널을 배양하는 것을 포함하는 방법.
42. 제 39 항에 있어서, 이온 채널을 활성화하는 단계가 이온 채널을 탈분극화하는 것을 포함하는 방법.
43. 제 39 항에 있어서, 포유류 CMR1 단백질이 인간, 쥐, 새앙쥐, 또는 개로부터 유래된 것인 방법.
44. 제 39 항에 있어서, 시험 화합물이 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소 시키는지를 측정하는 단계가 칼슘의 세포 내 양을 측정하는 것을 포함하는 방법.
45. 제 44 항에 있어서, 칼슘의 세포 내 양이 FLIPR 시험을 이용하여 측정되는 방법.
46. 제 39 항에 있어서, 시험 화합물이 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계가 이온 채널에 의해 전도된 전류를 측정하는 것을 포함하는 방법.
47. 제 46 항에 있어서, 이온 채널에 의해 전도된 전류가 패치-클램프(patch-clamp) 기술을 이용하여 측정되는 방법.
48. (a) 시험 화합물을 cCMR1으로 구성된 이온 채널과 접촉한 다음;

    (b) 시험 화합물이 이온 채널의 전도도를 증가시키거나 감소시키는지를 측정하는 단계를 포함하는, 통증 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
49. 제 48 항에 있어서,

    (a) 시험 화합물을 동물에 투여한 다음;

    (b) 시험 화합물이 동물의 통각 수용/통각 방위(nociceptive/nocifensive) 반응을 변경하는 정도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

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