CN108392626B - Pedf及其衍生物在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用及其药物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了PEDF及其衍生物在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用及其药物筛选方法，包括，PEDF在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用；PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用；所述PEDF衍生多肽包括PEDF的44～77aa多肽片段；本发明还包括重构冠状动脉储备性侧支微循环药物的筛选方法。本发明重构冠状动脉储备性侧支微循环药物能够改善灌注功能、延长有效灌注时间、促进所述冠状动脉储备性侧支微循环血管内皮细胞连接稳定、阻止所述冠状动脉储备性侧支微循环血管渗漏、减轻所述冠状动脉储备性侧支微循环血管旁间质水肿、改善心脏功能。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种PEDF及其衍生物在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用及其药物筛选方法。
背景技术
当前急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)仍然是全球范围内致死、致残的主要疾病之一。AMI的主要治疗手段有药物、介入、手术、对症治疗及间充质干细胞抑制治疗等，其目的均为改善心肌的缺血缺氧，防止心律失常，维持较好的心脏灌注。尽管治疗方案很多，但所采用的常规治疗都存在不能很好地修复梗死的心肌等突出问题。治疗性血管新生能促进毛细血管的生长和侧支循环的建立，诱导血管新生的治疗被认为是恢复缺血区心肌氧气和营养供应、改善心功能和心室重构的有效方法。
众所周知，保护原有血管比等待新血管生长对缺血心肌的血液供应更及时有效且更少副作用。因此如何能够通过保护心脏中原有血管的方式更好地治疗急性心肌梗死是当前充满未知的技术难题，如何找到或制备一种能够通过保护心脏中原有血管的方式来治疗急性心肌梗死的药物是有待解决的难题。
发明内容
下文旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容旨在以简化形式阐明一些概念，更详细的内容将在后文予以呈现。
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明提供PEDF在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：PEDF在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用。
作为本发明所述PEDF在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述冠状动脉储备性侧支微循环，包括心脏在正常状态下无血流灌注的血管；所述冠状动脉储备性侧支微循环在心肌梗死后能够从无血流灌注状态转变为有血流灌注状态。
作为本发明所述PEDF在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述重构冠状动脉储备性侧支微循环药物能够改善灌注功能、延长有效灌注时间、促进所述冠状动脉储备性侧支微循环血管内皮细胞连接稳定、阻止所述冠状动脉储备性侧支微循环血管渗漏、减轻所述冠状动脉储备性侧支微循环血管旁间质水肿、改善心脏功能。
作为本发明所述PEDF在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述PEDF包括PEDF的盐。
作为本发明所述PEDF在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述盐包括所述PEDF或所述PEDF衍生多肽与有机酸、聚合酸或无机酸形成的盐，所述有机酸包括乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸或双羟萘酸；所述聚合酸包括鞣酸、羧甲基纤维素；所述无机酸包括氢卤酸、硫酸、磷酸。
作为本发明的另一个方面，本发明提供PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用。
作为本发明所述PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述PEDF衍生多肽包括PEDF的44～77aa多肽片段。
作为本发明所述PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述冠状动脉储备性侧支微循环，包括心脏在正常状态下无血流灌注的血管；所述冠状动脉储备性侧支微循环在心肌梗死后能够从无血流灌注状态转变为有血流灌注状态。
作为本发明所述PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述重构冠状动脉储备性侧支微循环药物能够改善灌注功能、延长有效灌注时间、促进所述冠状动脉储备性侧支微循环血管内皮细胞连接稳定、阻止所述冠状动脉储备性侧支微循环血管渗漏、减轻所述冠状动脉储备性侧支微循环血管旁间质水肿、改善心脏功能。
作为本发明所述PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述PEDF衍生多肽包括PEDF衍生多肽的盐。
作为本发明所述PEDF衍生多肽在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用的一种优选方案，其中：所述盐包括所述PEDF或所述PEDF衍生多肽与有机酸、聚合酸或无机酸形成的盐，所述有机酸包括乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸或双羟萘酸；所述聚合酸包括鞣酸、羧甲基纤维素；所述无机酸包括氢卤酸、硫酸、磷酸。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种重构冠状动脉储备性侧支微循环药物的筛选方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种重构冠状动脉储备性侧支微循环药物的筛选方法，其中：将化学分子药物或生物分子药物装载于载体中，并注射于实验动物，筛选对于重构冠状动脉储备性侧支微循环有效的药物。
作为本发明所述重构冠状动脉储备性侧支微循环药物的筛选方法的一种优选方案，其中：所述重构冠状动脉储备性侧支微循环药物包括蛋白或其盐、多肽或其盐、核酸或其盐；所述载体包括脂质体、多聚阳离子载体、多聚阴离子载体、质粒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、靶向肽。
本发明的有益效果：本研究发现，正常大鼠心脏中潜伏着一种数量庞大的无血流灌注的血管，我们将其命名为冠状动脉储备性侧支微循环(coronary collateralmicrocirculation reserve，CCMR)。在急性心肌梗死发生后5分钟内梗死区的CCMR迅速由关闭状态转变为开放状态，为梗死区心肌供血。然而其存在时间非常短暂，大约在心梗后的4小时内再次关闭，也正因为此，这种血管才一直未被世人发现。大鼠心脏中的CCMR血管是不成熟的血管，内皮细胞之间的连接不稳定，血管渗透性大，通血后大量血管内蛋白、无机盐等渗透压物质将会漏出，随后水顺着渗透压梯度方向进入间质引起间质水肿，导致血管腔被间质挤压变小甚至完全闭合。此外，微血栓的形成也加速了CCMR血管的关闭。
针对急性心肌梗死后CCMR血管存在时间短暂的难题，本发明提供了一种可以促进CCMR血管内皮细胞连接稳定，从而促进未成熟的CCMR血管结构趋于稳定；增粗CCMR血管管径，提高供血功能，改善缺血心肌微循环灌注；抑制CCMR血管渗漏，抑制间质的水肿，从而减轻间质对包括CCMR血管在内的所有血管的压迫情况，延长心梗后CCMR血管有效开放时间，即能够重构CCMR的药物：色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)蛋白及其衍生多肽。
(1)本发明设计的PEDF源功能肽具有良好的功能优势，能够显著重构CCMR血管使其成熟稳定，在冠脉原有供血血管发生堵塞时，充当优秀的后备供血力量；对于心肌组织中原有的血管稳定，抗血管渗漏，改善急性心肌梗死预后等作用效果显著。
(2)本发明设计的PEDF源功能肽具有极高的功能选择性，仅对结构不完整的CCMR血管发挥重构作用，对成熟的其它所以血管均没有影响。因此，对于改善急性心肌梗死预后的疗效更高，且副作用更低。
(3)本发明设计的PEDF源功能肽具有多重的保护作用，在急性心梗发生后，其对于新生内皮细胞(tip cell)具有促凋亡的抑制生长的作用，对于成熟的内皮细胞(phanlaxcell)具有保护稳定作用，从而减轻血管渗漏，抑制心肌水肿，维持较好的血液灌注。因此，对于缺血性心脏疾病的疗效更高。
(4)PEDF是人体内天然存在的多功能蛋白质，本发明发现了其在改善急性心肌梗死预后方面的作用，而制取针对性功能小肽段组合，相较于化学合成药物，应用生物安全性更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为在急性心肌梗死后随着血管闭塞时间的延长的CCMR血管灌注情况图。
图2为PEDF对CCMR血管形态的影响及灌注时间的影响示意图。
图3为能够替代PEDF的多肽的筛选结果示意图。
图4为PEDF及其衍生肽对CCMR血管内皮细胞连接稳定性的影响结果示意图。
图5为PEDF及其衍生肽对CCMR血管渗漏的影响结果示意图。
图6为PEDF及其衍生肽对CCMR血管旁间质水肿的影响结果示意图。
图7为PEDF及其衍生肽对心脏功能的影响结果示意图。
图8为预转染慢病毒大鼠急性心肌梗死预留结扎线动物模型的建立示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
根据一般约定书写本文提及的所有的肽序列，其中N端氨基酸在左边，而C端氨基酸在右边。在两个氨基酸残基之间的短线指示肽键。
本发明的化合物可以以药用盐的形式提供。优选的盐的实例是与药用有机酸以及聚合酸形成的那些和与无机酸形成的盐，所述有机酸如乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸或双羟萘酸，所述聚合酸如鞣酸或羧甲基纤维素，所述无机酸如氢卤酸(例如，盐酸、硫酸或磷酸等)。可以使用本领域技术人员已知的获得药用盐的任何方法。
为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：
Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；
Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；
Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝组氨酸；Ile＝I＝异亮氨酸；
Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝赖氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；
Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝丝氨酸；
Thr＝T＝苏氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y＝酪氨酸；
Val＝V＝缬氨酸；Cys＝C＝半胱氨酸。
实验材料与方法：
实验动物：
健康成年SD大鼠，雄性，体重(220±30)g；健康SD大鼠新生大鼠，雌雄不限，1-3日龄,体重5-7g，实验动物由徐州医科大学动物实验中心提供。本说明书所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度控制的饲养笼中，饲养温度约24℃至25℃，光暗循环为12：12小时。试验过程中提供饮水与标准实验室饲料供任食。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2010～0003，使用许可证号：SYXK(苏)2010～0011。
预转染慢病毒预留结扎线大鼠急性心肌梗死动物模型的建立：
手术前，将大鼠放在具有异氟烷持续填充的玻璃盒中诱导麻醉。然后将内径为0.2mm的软管通过口插入大鼠的气管，将插管的大鼠固定在无菌手术区域。将气管插管连接到呼吸机上，呼吸频率为250pbm，压力为4-6cmH2O，持续吸入2％异氟烷维持麻醉。用碘伏消毒。接三导联心电图(PowerLab，AD Instruments，Colorado Springs，CO，USA)，之后皮下注射丁丙诺啡(0.05mg/kg)以缓解疼痛。通过左侧第四肋间进行开胸手术。
按实验分组，采用心肌直接注射方法，以20μl微量加样器，在缺血边缘区2点，4点，8点和10点钟位置缓慢注射病毒稀释液共20μl(2×107TU)。注射后轻按压60s，以防液体漏出，还可以采用全身静脉注射、局部冠状动脉注射、舌下含服或注射、腹腔注射、鼻粘膜喷雾或注射、经肺雾化、直肠给药、肌肉注射和口服的方法进行给药。用6-0聚丙烯缝合线(Ethicon，Somerville，NJ)左冠状动脉(LDA)阻断部位预置结扎线a,b和松解线c，然后将PE-10管(5mm长，Becton Dickinson)固定到其末端。然后在呼气末胸腔内的空气排出后关闭胸膜腔。固定在缝合线末端的PE管仍然嵌在皮肤下面。术后肌注青霉素(100mg/kg)，预防感染。将动物置于回收笼中观察2小时，然后转移至饲养笼以进一步恢复。如果需要，动物皮下接受0.03mg/kg丁丙诺啡，然后在8-12小时后接受另一剂量。
待转染慢病毒载体携带目的基因充分表达后两周，在实验设计心肌缺血时间点，在非手术(不开胸)情况下，拉紧预置结扎线a,b，阻断冠状动脉左前降支，建立大鼠急性心肌梗死动物模型(图8)。图8A.正常心电图；图8B.拉紧a,b线后2小时心电图；图8C.放松a,b线，拉紧c线后30分钟心电图。
凝集素灌注实验：
在大鼠AMI模型建立后，将1ml浓度为200μg/ml的凝集素(SIGMA-ALDRICH，货号L2895)在30秒内注射到的大鼠股静脉中，经过全身循环中30秒后，立即收集心脏。
实验样本取材：
各组实验动物常规饲养，在实验设计时间点，用戊巴比妥钠过量麻醉动物，开胸，迅速取出心脏，置于预冷PBS溶液中。将心脏安装在恒流恒温恒压离体心脏灌流装置上(安徽正华生物仪器设备有限公司，型号ZH-LGF)，用PBS灌注冲洗冠脉系统内血液，然后将心脏用OCT包埋剂固定、备用。
免疫荧光与定量分析：
对于心脏组织染色，将冷冻的心肌组织水平切成6μm薄片并吸附在载玻片上。在4％多聚甲醛中固定15分钟，用Triton X-100(0.1％)透化并用含有5％牛血清的溶液封闭，然后应用一抗。按照实验需要样品分别与抗体抗CD31(Abcam公司，货号ab24590；1：200)；抗纤维蛋白原特异性因子1(FSP1)(Abcam公司，货号S100A4；1：200)；抗VE-cadherin(Abcam公司，货号ab33168；1：300)在4℃温育12小时。在PBS中洗涤三次，并在室温下二抗(LifeTechnologies公司，货号A21207；1：200)孵育1小时，PBS中洗涤三次。用DAPI(KeyGenBiotech公司，货号KGA215-10)染细胞核，PBS中洗涤三次。最后用50％甘油封片。使用Olympus荧光显微镜与3个不同的样品中的代表性区域随机选取十个视野(固定倍率：400×；每一样品10个视野)；并利用Olympus软件撷取影像。
超声心动图心脏功能测定：
大鼠AMI模型建立4小时后，2％异氟烷麻醉下行超声心动图(Philips IE33，a 10-MHz transducer,philips Medical Systems.Netherlands)检测心脏功能，根据左室缩短率(LVFS，left ventricular fractional shortening)和左室射血分数(LVEF，leftventricular ejection fraction)，评价各组大鼠心脏收缩功能。
统计学分析：
计量资料以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS 16.0统计软件进行数据统计分析。组间差异比较采用方差分析，两两比较采用q检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。
实施例1：
参见图1，建立急性心肌梗死模型，通过股静脉将凝集素-FITC注入大鼠体循环，凝集素-FITC将随着心脏的排出而到达各级血管，并与血管内皮细胞表面的糖蛋白结合。我们用这种方法实时地标记血流。分别在结扎冠脉后立即、5分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时取材。结果(图1C和1D)表明，结扎0min组在闭塞的下游区域几乎不可见有灌注的血管，而在结扎5分钟组，同一区域凝集素标记的血管密度比假手术组还要多，说明存在比原有血管数量还庞大的血管在此时有血流通过，我们将此现象命名为冠状动脉储备性侧支微循环(coronary collateral microcirculation reserve，CCMR)。随着血管闭塞时间的延长，有标记血管数量在1小时内开始下降，2小时内加速下降，4小时后趋于稳定，6小时后只有1/5灌注的血管被保存。在CD31/凝集素的免疫荧光中也发现了类似的结果(图1A和1B)。图1E为实验灌注效率。
实施例2：
采用雄性成年SD大鼠建立预转染慢病毒预留结扎线急性心肌梗死动物模型(参见材料方法)，将动物开胸后在冠脉左前降支下预留结扎线并在左前降支灌注区域采用心肌直接注射、全身静脉注射、局部冠状动脉注射、舌下含服或注射、腹腔注射、鼻粘膜喷雾或注射、经肺雾化、直肠给药、肌肉注射或口服等方法，分别给予不同的对于心血管有影响的分别装载于脂质体、多聚阳离子载体、多聚阴离子载体、靶向肽、质粒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体或慢病毒载体等载体中的化学分子药物或生物分子药物。待两周后收紧结扎线并通过股静脉将凝集素-FITC注入大鼠体循环，分别在立即、5分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时后取材。随后在荧光显微镜下观察并摄取照片。观察不同的药物对于CCMR血管的影响，筛选对于重构CCMR有效的药物。所述重构CCMR药物包括蛋白或其盐、多肽或其盐、核酸或其盐。
实施例3：
采用雄性成年SD大鼠建立急性心肌梗死模型，将动物开胸后再冠脉左前降支下预留结扎线并在左前降支灌注区域采用心肌直接注射法注入PEDF载体慢病毒(手术方法参见材料方法预转染慢病毒大鼠急性心肌梗死动物模型的建立)。另外建立预转染空载体病毒组做阴性对照组。两周后收紧结扎线，分别在立即、5分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和6小时后取材。随后在荧光显微镜下观察并摄取照片。结果显示，经PEDF预转染两周的大鼠心脏在结扎后梗死区内开放的CCMR血管数目减少，然而血管的管径与单梗组相比显著增粗(图2A和2B)，并且这种粗大的灌流的CCMR血管的黏附连接相较于未处理的细密CCMR血管大大改善，这提示我们在PEDF干预后，CCMR血管的结构和数量发生了显著的变化。同时，我们还发现当过表达PEDF组模型进行到梗死后6小时，梗死区内仍旧发挥灌注功能的血管的数目仍然保持在一个可观的数量级(图2C)，这提示CCMR支持缺血心肌的能力有所改善。实验结果参见图2。
实施例4：
筛选对血管有影响的PEDF的衍生肽段，通过实验验证它们对于CCMR血管是否具有重构作用，从而找到最佳的能够替代PEDF的功能肽段。设计筛选过程分为两步：
第一步：通过整合既往关于PEDF的研究结果并进行分析归纳，筛选出全长PEDF中结合心脏中PEDF受体所对应的功能性多肽，筛选结果如下：
33mer序列(5-36aa)：
VLLLWTGALLGHGSSQNVPDSSQDSPAPDSTG
34mer序列(44-77aa)：
DPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSMSPTTN
44mer序列(78-121aa)：
VLLSPLSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT
43mer序列(131-173aa)：
APEKNFKSASRIVFERKLRVKSSFVAPLEKSYGTRPRILTGNP
第二步：分别验证四个肽段对于CCMR血管灌注能力与管径大小的影响效果。
同上述方法建立预转染慢病毒大鼠急性心肌梗死预留结扎线模型，使用的慢病毒载体分别携带33mer、34mer、44mer和43mer基因序列，待模型建立两周后收紧结扎线实现AMI模型，分别在各计划时间点取材，用荧光显微镜观察并摄取图像。结果显示，过表达34mer组的CCMR血管表现出变化与过表达PEDF组一致。与对照组相比，血管数目显著减少，血管形态由细而密转变为粗而少，进行到梗死后4小时，梗死区内具有灌注功能的血管的数目也仍然保持在一个可观的数量级(如图3)。然而，过表达33mer组、过表达44mer组和过表达43mer组中的CCMR血管数目及形态没有显著变化，进行到梗死后4小时，梗死区内具有灌注功能的血管数目与对照组没有显著差异(如图3)。
在观察到CCMR形态结构学特征的改变之后，我们决定以各项指标如黏附连接等作为PEDF与其衍生肽段干预CCMR血管重构的可能靶点并逐一验证。此外，梗死后六小时受PEDF与其衍生肽段干预的CCMR血管存在数量显著多于对照组，提示CCMR支持缺血心肌的能力有所改善。
实施例5：
同上述方法建立PEDF与其衍生肽的预转染慢病毒大鼠急性心肌梗死预留结扎线模型，转染两周后收紧结扎线实现AMI模型，在梗死后4小时取材，制备冰冻切片后进行免疫荧光染色标记VE-cadherin(参见材料方法)，用荧光显微镜观察并摄取图像。结果显示，单梗组与空载体组中，VE-cadherin大量从膜上转位至胞浆内，此外，Lectin标记显著减少，说明具有灌注功能的血管显著减少。综上提示梗死区内的CCMR血管可能由于其结构不完整和内皮细胞间连接破坏导致血管关闭。与单梗组和空载体组相比，PEDF组与34mer组的VE-cadherin呈良好的线性，并且Lectin标记的血管显著增多(如图4)。因此，PEDF能够通过改善CCMR血管的内皮细胞之间的连接，促进血管成熟。
实施例6：
同上述方法建立PEDF与其衍生肽的预转染慢病毒大鼠急性心肌梗死预留结扎线模型，转染两周后收紧结扎线实现AMI模型，在梗死后4小时取材，制备冰冻切片后进行免疫荧光染色标记纤维蛋白原(参见材料方法)，用荧光显微镜观察并摄取图像。结果显示，单梗组与空载体组中，血管周围大量的纤维蛋白原被标记出，说明血管通透性高，发生了显著渗漏，从而只存在血管内的纤维蛋白原漏在血管外。与单梗组和空载体组相比，PEDF组和34mer组的血管周围被标记的纤维蛋白原显著减少，此外血管形态粗大，这些均提示PEDF及其衍生肽能够重构CCMR血管并抑制血管渗漏，改善CCMR血管的灌注功能(图5A和5B)。
实施例7：
同上述方法建立PEDF与其衍生肽的预转染慢病毒大鼠急性心肌梗死预留结扎线模型，转染两周后收紧结扎线实现AMI模型，在梗死后4小时取材，制备冰冻切片后进行HE染色，用显微镜观察并摄取图像。结果显示，单梗组和空载体组的间质发生了显著的水肿，间质间距离显著变宽，心肌组织呈细条样，这可能是由于水肿的间质体积增大挤压心肌组织导致的。与单梗组相比，PEDF组和34mer组的间质水肿显著减轻，心肌组织依然保持良好的形态(如图6C和6D)。此外我们的前期研究显示，急性心肌梗死发生后心肌组织中的间质将会发生水肿，且随着时间的延长间质水肿程度持续增大(如图6A和6B)。以上结果均提示被PEDF及其衍生肽重构后的CCMR血管有助于抑制急性心肌梗死后间质的水肿。
实施例8：
同上述方法建立PEDF与其衍生肽的预转染慢病毒大鼠急性心肌梗死预留结扎线模型，转染两周后收紧结扎线实现AMI模型，在梗死后4小时在动物麻醉状态下，彩色多普勒检测(Philips IE33,a 10-MHz transducer；Philips Medical Systems.Netherlands)动物心脏功能，根据FS(左室缩短分数)和EF(左室射血分数)的值，评价各组动物心脏收缩功能。结果显示，转染PEDF及其衍生肽34mer的心梗大鼠，相比于对照组，左室缩短分数和左室射血分数明显提高，心室收缩功能提高(图7)。
本研究发现了正常大鼠心脏中潜伏着一种数量庞大的无血流灌注的血管，我们将其命名为冠状动脉储备性侧支微循环(coronary collateral microcirculationreserve，CCMR)。在急性心肌梗死发生后5分钟内梗死区的CCMR迅速由关闭状态转变为开放状态，为梗死区心肌供血。然而其存在时间非常短暂，大约在心梗后的4小时内再次关闭，也正因为此，这种血管才一直未被世人发现。大鼠心脏中的CCMR血管是不成熟的血管，内皮细胞之间的连接不稳定，血管渗透性大，通血后大量血管内蛋白、无机盐等渗透压物质将会漏出，随后水顺着渗透压梯度方向进入间质引起间质水肿，导致血管腔被间质挤压变小甚至完全闭合。此外，微血栓的形成也加速了CCMR血管的关闭。
针对急性心肌梗死后CCMR血管存在时间短暂的难题，本发明提供了可以增粗CCMR血管管径、提高供血功能、改善缺血心肌微循环灌注、并且促进血管内皮细胞连接稳定，促进未成熟的CCMR血管结构趋于稳定、抑制CCMR血管渗漏、抑制间质的水肿、减轻间质对包括CCMR血管在内的所有血管的压迫情况、延长心梗后CCMR血管有效开放时间的药物，即能够重构CCMR的药物，本发明筛选出的上述药物之一为色素上皮细胞衍生因子(pigmentepithelium derived factor,PEDF)蛋白及其衍生多肽。
(1)本发明设计的PEDF源功能肽具有良好的功能优势，能够显著重构CCMR血管使其成熟稳定，在冠脉原有供血血管发生堵塞时，充当优秀的后备供血力量；对于心肌组织中原有的血管稳定，抗血管渗漏，改善急性心肌梗死预后等作用效果显著。
(2)本发明设计的PEDF源功能肽具有极高的功能选择性，仅对结构不完整的CCMR血管发挥重构作用，对成熟的血管均没有影响。因此，对于改善急性心肌梗死预后的疗效更高，且副作用更低。
(3)本发明设计的PEDF源功能肽具有多重的保护作用，在急性心梗发生后，其对于新生内皮细胞(tip cell)具有促凋亡的抑制生长的作用，对于成熟的内皮细胞(phanlaxcell)具有保护稳定作用，从而减轻血管渗漏，抑制心肌水肿，维持较好的血液灌注。因此，对于缺血性心脏疾病的疗效更高。
(4)PEDF是人体内天然存在的多功能蛋白质，本发明发现了其在改善急性心肌梗死预后方面的作用，而制取针对性功能小肽段组合，相较于化学合成药物，应用生物安全性更高。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 董红燕
<120> PEDF及其衍生物在制备重构冠状动脉储备性侧支微循环药物中的应用及其药物筛选方法
<141> 2021-06-24
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Val Leu Leu Leu Trp Thr Gly Ala Leu Leu Gly His Gly Ser Ser Gln
1 5 10 15
Asn Val Pro Asp Ser Ser Gln Asp Ser Pro Ala Pro Asp Ser Thr Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Met Ser Pro Thr
20 25 30
Thr Asn
<210> 3
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Val Leu Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr
20 25 30
Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr
35 40
<210> 4
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Ala Pro Glu Lys Asn Phe Lys Ser Ala Ser Arg Ile Val Phe Glu Arg
1 5 10 15
Lys Leu Arg Val Lys Ser Ser Phe Val Ala Pro Leu Glu Lys Ser Tyr
20 25 30
Gly Thr Arg Pro Arg Ile Leu Thr Gly Asn Pro
35 40
Claims (3)
1.PEDF衍生多肽在制备促进大鼠冠状动脉储备性侧支微循环血管内皮细胞连接稳定、阻止大鼠冠状动脉储备性侧支微循环血管渗漏的药物中的应用，其特征在于：所述PEDF衍生多肽为PEDF的44～77aa多肽片段，其氨基酸序列为DPFFKVPVNKLAAAVSNFGYDLYRVRSSMSPTTN；所述冠状动脉储备性侧支微循环血管为大鼠心脏中不成熟的血管，为心脏在正常状态下无血流灌注的血管，其内皮细胞之间的连接不稳定，血管渗透性大，所述冠状动脉储备性侧支微循环血管在急性心肌梗死后能够从无血流灌注状态转变为有血流灌注状态。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PEDF衍生多肽包括PEDF衍生多肽的盐。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述盐选自所述PEDF衍生多肽与有机酸、聚合酸或无机酸形成的盐；所述有机酸选自乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸或双羟萘酸；所述聚合酸选自鞣酸、羧甲基纤维素；所述无机酸选自氢卤酸、硫酸、磷酸。
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