JP2002540769A - プログラム細胞死の新規抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトアポトーシス調節タンパク質（アベン）及びアベンを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、一般に、アベンをコードする核酸配列を含む操作発現ベクター及び宿主細胞並びにアベンの産生法を提供する。本発明はまた、アベン発現に関連する疾患の予防及び処置におけるアベンに特異的に結合するアゴニスト、抗体、又はアンタゴニスト並びにそれらの使用法を提供する。さらに、本発明は、アベン発現に関連する疾患の処置用のアベンをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子の使用を提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチド又はそのフラグメントもしくは補足物及びアベンに特異的に結合する抗体を使用する診断アッセイを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９９年２月２６日に提出された米国仮出願番号６０／１２２，
１０４（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。

【０００２】 発明の分野 本発明は、プログラムされた細胞死の新規抑制剤、プロテインアベン（Ａｖｅ
ｎ）の核酸及びアミノ酸配列並びにアポトーシスの減少又は増加に関連する疾患
の診断、予防、及び治療におけるこれらの配列の使用に関する。

【０００３】 発明の背景 多細胞生物における正常な発達、成長、及び恒常性には、全身の組織中の細胞
の産生及び破壊の注意深いバランスが必要である。細胞分裂は、多数のチェック
ポイント及び調節機構を有する慎重に調整されたプロセスである。これらの機構
は、ＤＮＡ複製を調節し、及び不適切か又は過剰な増殖を防止するように設計さ
れている。それに対して、アポトーシスは、遺伝学的に制御されたプロセスであ
り、これにより、不必要であるか損傷を受けた細胞を、急性損傷及び壊死に関連
することが多い組織の破壊及び炎症反応を引き起こすことなく排除することがで
きる。

【０００４】 用語“アポトーシス”は、プログラムされた細胞死を受けた細胞を特徴づける
形態学的変化を説明するために最初に使用された。アポトーシス細胞は、膜脂質
含有量が変化し、核が極度に濃縮された縮んだ外観を有する。アポトーシス細胞
は、潜在的に損傷を受けた内容物を周囲組織に漏出させることや炎症反応を引き
起こすこともなく隣接細胞又はマクロファージによって迅速に食作用を受ける。

【０００５】 アポトーシスを調節する工程及び機構は、系統樹全体で極度に保存されており
、アポトーシスについての本発明者の現在の知識の多くは、線虫Ｃａｅｎｏｒｂ
ａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ及びショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ
ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの研究から誘導される。近年、アポトーシス調節にお
ける逸脱は、ヒト疾患の病原論において有意な因子と認識されている。例えば、
不適切な細胞の生存は、癌、自己免疫疾患、及び炎症疾患のような多くの疾患を
引き起こすか又は寄与することがある。これに対して、アポトーシスの増加は、
ＡＩＤＳ、神経変性障害、及び骨髄異形成症候群のような免疫不全疾患を引き起
こすことがある。

【０００６】 種々のリガンド及びそれらの細胞受容体、酵素、癌抑制遺伝子、ウイルス遺伝
子産物、薬理学的因子、及び無機イオンは、細胞のアポトーシス破壊の調節及び
実行における重要な正又は負の役割を有する。アポトーシス経路のいくつかの特
異的な成分が同定及び特徴づけられているが、関連するタンパク質間の多くの相
互作用が不確定であり、経路の主要な観点が未知のままである。細胞死及び既知
の遺伝子によるアポトーシスの調節能力に必要な遺伝子が同定されているにもか
かわらず、アポトーシスによる死における必須の生化学的現象は主として未知の
ままである。

【０００７】 正常な発達の間の異なる細胞型及び細胞種内のアポトーシス及び外部刺激に対
する反応として定義された形態学的及び生化学的パターンの一貫性は、細胞の死
滅率の共通の原因に一致する。この主張は、細胞死を担う内因性プログラムの概
念及びアポトーシスの正及び負のレギュレータである遺伝子産物によって支持さ
れている。最も研究されているアポトーシスの負のレギュレータは、Ｂｃｌ−２
プロトオンコジーン産物である。これは、広範な種々の細胞死モデルを妨害する
能力によって死の共有された哺乳類経路の最も強力な証拠を提供する。

【０００８】 Ｂｃｌ−２プロトオンコジーンは、多様な状況でのそのアポトーシス死の妨害
能力において細胞遺伝子の間でいくらか独特である。トランスジェニックモデル
におけるＢｃｌ−２の過剰発現は、正常な細胞死機構の回避による細胞の蓄積を
導く。異なった刺激、例えば照射、高熱、成長因子の除去、糖質コルチコイド、
及び多数のクラスの化学療法薬等によるアポトーシスの誘導は、Ｂｃｌ−２のイ
ンビトロモデルによって抑制される。これらの効果は、Ｂｃｌ−２の発現レベル
に比例する。さらに、Ｂｃｌ−２発現の内因性パターンは、インビトロでの細胞
生存の調節における役割の指標となる。Ｂｃｌ−２タンパク質は、おそらく、細
胞死に作用する中心的機構のアンタゴニストとして機能するようである。

【０００９】 Ｂｃｌ−２プロトオンコジーンによってコードされるタンパク質は、多数の造
血細胞系においてアポトーシスを抑制することができると報告されている。プロ
トオンコジーンＢｃｌ−２は、ヒト濾胞性リンパ腫の８０％以上に存在するｔ（
１４；１８）染色体転座における免疫グロブリン重鎖エンハンサに隣接するその
頻繁な転座の結果として分離されて特徴づけられた。これらの新形成は、通常こ
れらの細胞の代謝回転を引き起こすアポトーシスの妨害によると推定される成熟
静止Ｂ細胞の蓄積によって特徴づけられている。同様に、Ｅμエンハンサの調節
下でＢｃｌ−２を発現するトランスジェニックマウスは、濾胞性リンパ腫を発症
する。

【００１０】 Ｂｃｌ−２タンパク質は、２６ｋＤａの膜結合性細胞質タンパク質である。多
くの他のプロトオンコジーン産物と異なり、Ｂｃｌ−２タンパク質は、明らかに
、これらの細胞型の増殖を直接的に促進することよりもむしろＴ細胞及びＢ細胞
起源の造血細胞の生存を向上させることによって、少なくとも部分的に機能する
。細胞生存を向上させるＢｃｌ−２の能力は、いくつかの要因、例えばサイトカ
イン欠乏、照射暴露、糖質コルチコイド処理、及び抗ＣＤ−３抗体の投与によっ
て惹起されるアポトーシスを抑制する能力に関連する。Ｂｃｌ−２発現の上方制
御はまた、ＥＢＶ感染Ｂ細胞系のアポトーシスを抑制する。Ｂｃｌ−２の発現は
また、血清又は成長因子の欠如下で、正の細胞増殖調節プロトオンコジーン、ｃ
−ｍｙｃの発現から生じるアポトーシスを妨害することが認められている。

【００１１】 脊椎動物内では、Ｂｃｌ−２は細胞死経路及び細胞死リプレッサとしての機能
について最も理解されている遺伝子である。Ｂｃｌ−２遺伝子産物と相互作用す
る及び／又は構造的に関連する他のタンパク質、例えば、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ及びＢｃ
ｌ−ｘ_Ｓのようなものもまた、同定されている。Ｂｃｌ−２関連タンパク質のフ
ァミリーには、線虫タンパク質ＣＥＤ−９及び２つのＤＮＡウイルスタンパク質
、エプスタイン・バー・ウイルスのＬＭＷ５−ＨＬ及びＢＨＲＦ−１が含まれる
。したがって、Ｂｃｌ−２様遺伝子のファミリーが存在し、この証拠はこれらの
遺伝子が細胞死制御に関与することを示す。

【００１２】 Ｂｃｌ−２関連タンパク質のファミリーは、排他的ではないが、主にＢｃｌ相
同性１及び２（ＢＨ１及びＢＨ２）と呼ばれる２つの保存領域内に集められる相
同性を有することが注目されている。これには、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ、Ｍｃｌ
−１及びＡ１、及びエプスタイン−バー・ウイルスのＢＨＲＦ−１及びアフリカ
ブタコレラウイルスのＬＭＷ５−ＨＬを包含するＤＮＡウイルスにおけるいくつ
かの読み取り枠が含まれる。

【００１３】 Ｂｃｌ−２はまた、Ｂａｘと呼ばれる２１ｋＤａのタンパク質パートナとイン
ビボで会合することが発見された。Ｂａｘは、Ｂｃｌ−２と広いアミノ酸相同性
を示し、インビボでＢａｘ自体とホモダイマを形成し、Ｂｃｌ−２とヘテロダイ
マを形成する。Ｂａｘは、６つのエクソンからコードされ、細胞質タンパク質の
２１ｋＤａのメンブレン（α）及び３つの形態（β、γ、及びω）と予想される
選択的ＲＮＡスプライシングの複合パターンを示す。Ｂｃｌ−２及びＢａｘは、
ヘテロ二量体化により細胞死／細胞生存を線引きするだけでなく調整もすること
ができる生化学的機能を有する。Ｂａｘが優勢で、Ｂａｘの実質的な割合がホモ
マルチマー（例えば、ホモ二量体）及び／又は遊離の（未結合）Ｂａｘモノマー
又は他の活性形態又は複合体として存在する場合、プログラム細胞死が加速され
、Ｂｃｌ−２の死抑制活性が対抗する。多くの細胞種において過剰である場合、
ＢａｘはＢｃｌ−２の細胞死を抑制する能力に対抗する。Ｂａｘが特に２つの極
度に保存されたドメイン内でＢｃｌ−２と広範な相同性を共有していることが見
出されるとは予期されなかった。これらのドメインはまた、ヒト、マウス、及び
ニワトリのＢｃｌ−２の最も極度に保存された領域である。これらのドメインは
また、エプスタイン−バーウイルス内の読み取り枠ＢＨＲＦ−１及びＭｃｌ−１
、ホルボールエステルでの誘導後の骨髄性白血病細胞系から最近単離された遺伝
子内に保存されている。

【００１４】 Ｂｃｌ−２ポリヌクレオチドプローブを用いた低い厳密性のハイブリッド形成
によってＢｃｌ−ｘ遺伝子が同定されており、これは選択的ＲＮＡスプライシン
グを介して２つのタンパク質、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ及びＢｃｌ−ｘ_Ｓをコードする。Ｂ
ｃｌ−ｘ_Ｌ ｃＤＮＡは、Ｂｃｌ−２のドメインと類似のドメインを有する２３
３個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。Ｂｃｌ−ｘ_Ｓ ｃＤＮＡは、Ｂｃ
ｌ−２と相同性の最も高い領域が欠失されている１７０個のアミノ酸のポリペプ
チドをコードする。適切な細胞死を調節する能力についてこれら２つのタンパク
質を比較した場合、Ｂｃｌ−ｘＬは細胞に成長因子の欠乏によって誘導されるア
ポトーシス細胞死への耐性を付与するが、Ｂｃｌ−ｘ_Ｓはアポトーシス細胞死に
対する耐性の誘導からのＢｃｌ−２の過剰発現を防止できることが見出された。
したがって、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌは、種々の細胞系においてアポトーシス細胞死の抑制
剤として作用することができるが、Ｂｃｌ−ｘ_Ｓは細胞死を抑制するＢｃｌ−２
の能力を抑制することができ、細胞をアポトーシス細胞死に対してより高い感受
性にすることができる。

【００１５】 多くの病態は、少なくとも部分的には、細胞増殖、分化及び／又はアポトーシ
スの異常な制御に由来する。例えば、新形成は、クローンから誘導された、正常
な細胞増殖調節シグナルに対する反応について減少した能力を有する細胞集団に
よって特徴付けられる。細胞の腫瘍形成形質転換は、細胞の代謝、生理学的性質
、及び形態学的性質をいくらか変化させる。腫瘍形成形質転換細胞の１つの特徴
的な変化は、細胞増殖制御遺伝子の適切な発現によって正常に課せられた細胞増
殖及び分化における制約に対する応答の喪失である。

【００１６】 多くの細胞種にとって悪性形質転換を引き起こす正確な分子経路及び第２の変
化は不明である。しかし、８０％を超えるヒト濾胞性Ｂ細胞リンパ腫及び２０％
のびまん性リンパ腫及び高レベルのＢｃｌ−２を発現するトランスジェニックマ
ウスに存在する腫瘍性濾胞性リンパ球増殖における免疫グロブリン重鎖遺伝子座
ｔ（１４；１８）に対するアポトーシス関連Ｂｃｌ−２遺伝子の特徴的転座は、
おそらくＢｃｌ−２遺伝子が異常なアポトーシス、細胞増殖、及び分化に起因す
る腫瘍性疾患及び他の病態の原因として関与することを示す。したがって、治療
又は予防に有利なようにアポトーシス、細胞増殖、分化を調整するために、Ｂｃ
ｌ−２関連タンパク質の活性を改変することができる薬剤を同定することが好ま
しい。さらに、かかる薬剤は、実験での適用におけるアポトーシス細胞増殖、及
び分化を制御するための、及び／又はインビトロ、エクスビボ治療、又はインビ
ボでの所定の造血幹細胞集団の増殖及び分化を制御するための市販の研究試薬と
して供することができる。

【００１７】 形質転換された表現型及び新形成の根底にある分子機構をより一層明らかにし
たモデルの開発が進行しているにもかかわらず、従来の化学療法を超える癌治療
に適用可能な有意な治療法はほとんど得られていない。かかるＢｃｌ−２関連タ
ンパク質の調整剤は、新形成、リンパ球増殖状態、関節炎、炎症、自己免疫疾患
等の治療用に新規の化学療法薬を提供することができる。本発明は、これら及び
他の要求を満たす。

【００１８】 Ｂｃｌ−２細胞死経路の同定が有意である一方で、Ｂｃｌ−２経路の調節方法
は達成されていない。細胞死を抑制するＢｃｌ−２の効果を下方制御する能力及
び／又は細胞死を促進するＢａｘの活性を上方制御する能力は、癌治療において
、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の過形成の調節及び死エフェクタ分子の支持によ
る自己免疫における自己反応性クローンの排除において有利であろう。Ｂｃｌ−
２の効果の上方制御及び死抑制分子の支持は、ＡＩＤＳを包含する免疫不全疾患
、老化、神経変性疾患、虚血性細胞死、創傷治癒等の治療及び診断に有利であろ
う。

【００１９】 Ｂｃｌｘ_Ｌ相互作用因子（アベン）をコードするポリヌクレオチド、及びその
分子自体の発見により、プログラムされた細胞死及びアポトーシスの制御の調査
手段が得られる。アポトーシス制御タンパク質に関連する分子の発見は、癌、自
己免疫疾患、リンパ球増殖障害、アテローム性動脈硬化症、ＡＩＤＳ、免疫不全
疾患、虚血性損傷、神経変性疾患、骨粗鬆症、骨髄異形成症候群、毒素誘導疾患
、及びウイルス感染の検出、予防、及び治療に有用な新規の診断組成物又は治療
組成物の獲得によって本発明の技術の要求を満たす。

【００２０】 発明の要旨 本発明は、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌがアベン〔またＢｉｆ−１（Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ相互作用因
子１）として既知〕と呼ばれる５５ｋＤａのタンパクと相互作用するという発見
に関する。アベンがＢｃｌ−ｘ_ＬのようなＢｃｌ−２ファミリーのメンバー及び
Ａｐａｆ−１（ＣＥＤ−４の哺乳動物ホモログで、且つカスパーゼ−９活性化の
ファシリテータ）を包含するアポトーシスレギュレータのそれぞれと相互作用す
ることが意外にも発見された。アベンは、カスパーゼ−１誘導アポトーシスに対
するＢｃｌ−ｘ_Ｌの抗アポトーシス機能並びにＡｐａｆ−１及びカスパーゼ−９
により誘導されるアポトーシスからの細胞の保護を向上させる。アベンが動物モ
デルにおける神経アポトーシスの抑制剤として機能することが示された。

【００２１】 本発明は、図１に示したアミノ酸配列、及びその機能的等価物を包含する分離
されたアミノ酸化合物を提供する。このアミノ酸化合物は、図１に示す配列を有
するのが好ましい。図１に示すアベンのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ／Ａｒｇ豊富な
アミノ末端、推定されるαへリックス構造を有する中間の疎水性リピート、極度
に酸性のカルボキシル末端を有する。Ｂｃｌ−ｘ_Ｌとの相互作用を調整するアミ
ノ酸フラグメントの例には、図１のアミノ酸７１〜１０８及びアミノ酸７４〜１
０４が含まれる。アベンのカルボキシ末端は、アベンの転写活性化特性に必要で
ある。アベンのカルボキシル末端の、およそアミノ酸２８９〜３６２からの欠失
は、この転写活性化機能を消滅させる。

【００２２】 本発明はまた、現在得られるアミノ酸化合物又はその一部をコードする核酸配
列を包含する分離核酸化合物を提供する。ＤＮＡである核酸化合物が好ましい。
図２に示した配列を有するＤＮＡ化合物が最も好ましい。任意の得られた核酸配
列に相同であるか相補的である核酸配列及び任意の得られた核酸配列にハイブリ
ッド形成する配列もまた提供する。

【００２３】 本発明は、本発明にかかるアミノ酸化合物又は核酸化合物を過剰発現する発現
ベクター及び宿主細胞もまた提供する。本発明はまた、アベンに特異的に結合す
る抗体、及び実質的に精製されたアベンを含む薬学的組成物を提供する。さらに
、本発明は、アベンのアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。本発明は、本
発明にかかるアミノ酸又は核酸化合物を発現する安定に形質転換された細胞系、
又は本発明の抗体、アゴニストもしくはアンタゴニストも提供する。

【００２４】 本発明の他の利点及び特徴は、以下の詳細な説明、図面、及び本発明の好まし
い態様を例示した実施例から明らかとなる。

【００２５】 定義 以下の略語を本明細書中で使用する：ａａ、単独の又は複数のアミノ酸；Ａｂ
、単独の又は複数の抗体、ｂｐ、単独の又は複数の塩基対；ＣｏＩＰ又はＣｏ−
ＩＰ、同時免疫沈降；ＦＩＳＨ、蛍光インシトゥハイブリッド形成；ｋｂ、単独
の又は複数のキロベース又は１０００ｂｐ；ＬＢ、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ
培地、ｍＡｂ、モノクローナルＡｂ；ＯＲＦ、読み取り枠；ＰＣＲ、ポリメラー
ゼ連鎖反応；Ｔｎ、単独の又は複数のトランスポゾン；Ｙ２Ｈ、酵母ｔｗｏ−ｈ
ｙｂｒｉｄスクリーニング；：：、新規の結合（融合又は挿入）。

【００２６】 本明細書中で使用する用語“アゴニスト”は、アベン又はアベンのポリペプチ
ドに結合した場合、アベンの活性を調整してアベンを変化させる分子をいう。ア
ゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、又はアベン又はアベンのポリペプチドに
共有結合又は非共有結合で結合する任意の他の分子を包含することができる。

【００２７】 本明細書中で使用する図２のポリヌクレオチドの“変化”は、ハイブリッド形
成アッセイを使用して検出することができる欠失、挿入、及び点変異を包含する
アベンをコードするポリヌクレオチドの配列の任意の変化を含む。アベンをコー
ドするゲノムＤＮＡ配列の変化（例えば、図２とハイブリッド形成することがで
きる制限フラグメント長の多形パターンの変化による）、選択された図２のフラ
グメントのゲノムＤＮＡのサンプルとのハイブリッド形成の無能力（例えば、対
立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの使用）、及びアベンをコードする
ポリヌクレオチド配列についての正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座とのハイ
ブリッド形成のような不適切又は予想外のハイブリッド形成（例えば、中期の染
色体の拡がりに対するＦＩＳＨの使用）の検出が本定義に含まれる。

【００２８】 本明細書中で使用する２０個の通常のアミノ酸及びその略語は、従来の使用に
従う。本明細書中で使用するアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を、以下の表
１に記載する。２０個の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ型アミノ酸）
、α，α−２置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の異例のアミ
ノ酸のような天然に存在しないアミノ酸もまた、本発明にかかるポリペプチド用
の適切な成分である。

【００２９】 異例のアミノ酸の例には、以下が含まれる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カ
ルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチル
リジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３
−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、及び
他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細
書中で使用するポリペプチドの表記法では、標準的な使用及び規定にしたがって
、左方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシ末端方向である。同様に
、特記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端であり
、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側は５’方向という。発生期のＲＮＡ転写物
の５’から３’の付加方向を転写方向といい；そのＲＮＡと同一の配列を有して
おり、そのＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域を
“上流配列”といい、そのＲＮＡと同一の配列を有し、コードＲＮＡ転写物の３
’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域を“下流配列”という。

【００３０】

【表１】

【００３１】 天然に発生するタンパク質分子のアミノ酸配列をいうために、“アミノ酸配列
”を本明細書中で言及するが、“アミノ酸配列”及び “ポリヌクレオチド”又
は“タンパク質” のような同様の用語は、このアミノ酸配列を引用したタンパ
ク質分子に関連する完全で、天然のアミノ酸配列に限定することを意味しない。

【００３２】 本明細書中で使用する“増幅”は、核酸配列のさらなるコピーをいい、一般に
、当該分野で周知のＰＣＲ技術を用いて行う。本明細書中で使用する用語“アン
タゴニスト”又は“抑制剤”は、アベン又はアベンのポリペプチドに結合した場
合、アベンの生物学的又は免疫学的活性を妨害又は調整する分子をいう。アンタ
ゴニスト及び抑制剤には、タンパク質、核酸、糖質、又はアベン又はアベンポリ
ペプチドに共有結合又は非共有結合で結合する任意の他の分子を含み得る。

【００３３】 本明細書中で使用する用語“抗体”は、エピトープの決定基に結合することが
できる無傷の分子及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖのようなそのフラグメ
ントをいう。アベンのポリペプチドに結合する抗体を、免疫化抗原として目的の
小さなペプチドを含む無傷のポリペプチド又はフラグメントを使用して調製する
ことができる。動物の免疫化に使用するポリペプチド又はペプチドは、ＲＮＡの
転写から誘導するか、又は化学合成することができ、所望ならば、キャリアタン
パク質に結合させることができる。ペプチドと化学結合する一般的に使用される
キャリアには、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、及び
サイログロブリンが含まれる。次いで、結合したペプチドを使用して、動物（例
えば、マウス、ラット、又はラビット）を免疫化する。

【００３４】 本明細書中で使用する用語“抗原決定基”は、特定の抗体と接触する分子の部
分（すなわち、エピトープ）をいう。タンパク質又はタンパク質のフラグメント
を使用して宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域は所与の領域又
はタンパク質の三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導することができ
る。これらの領域又は構造を、抗原決定基という。抗原決定基は、抗体への結合
に関して無傷の抗原（すなわち、免疫応答の惹起に使用された免疫原）と競合す
ることができる。

【００３５】 本明細書中で使用する用語“アンチセンス”は、特異的なＤＮＡ又はＲＮＡ配
列に相補的なヌクレオチド配列をいう。本明細書中で使用する用語“アンチセン
ス鎖”は、“センス”鎖に相補的な核酸鎖をいう。アンチセンス分子を、相補鎖
の合成を許容するウイルスプロモータに対して逆方向での目的の遺伝子の連結反
応による合成を包含する任意の方法によって産生することができる。一旦細胞に
導入されると、この転写された鎖は、その細胞によって産生された天然の鎖と組
み合わされて二重鎖を形成する。次いで、これらの二重鎖は、さらなる転写又は
翻訳のいずれかを妨害する。この様式で、変異表現型を作製することができる。

【００３６】 本明細書中で使用する用語“アベン”、また“Ｂｉｆ−１”とも呼ばれるもの
は、天然、合成、半合成、又は組換えのいずれかの任意の供給源由来の任意の種
、特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマを包含する哺乳動物、ショウジョウ
バエ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、酵母、好ましくはヒトから得られ、実質的に精製さ
れたアベンのアミノ酸配列をいう。用語“アベンのポリペプチド”は、アベンの
天然のタンパク質、フラグメント、アナログ、このようなタンパク質、フラグメ
ント、又はアナログのアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、
脂質付加、ユビキノン化、又はアシル化のような翻訳後修飾物、第２のポリペプ
チド配列（例えば、エピトープタグ、β−ｇａｌ、又は他の融合）に融合したこ
のようなタンパク質、フラグメント、又はアナログをいうために使用される総称
である。したがって、天然のアベン、アベンのフラグメント、及びアベンのアナ
ログ並びにアベン融合タンパク質は、アベンポリペプチド属の種である。

【００３７】 “Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー”又は“Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質”
又はその“Ｂｃｌ−２ファミリー”は、１以上のＢｃｌ−２相同ドメイン（ＢＨ
−１、ＢＨ−２、ＢＨ−３、又はＢＨ−４）を含み、細胞中での発現の際に細胞
死の抑制又は促進によるアポトーシス工程を調整又は制御するように作用するア
ポトーシス調整タンパク質を意味する。本明細書中で使用する用語“抗アポトー
シスタンパク質”は、典型的には細胞中での発現の際にプログラム細胞死（アポ
トーシス）の抑制に関連するＢｃｌ−２ファミリーメンバーをいう。抗アポトー
シスタンパク質の例は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、Ｂｃｌ−ｗ、Ａ１、Ａｆｌ
−１、Ｎｒｌ３、ＣＥＤ−９、Ｅｌｂ（１９ｋＤａ）、ＢＨＲＦ−１、及びＭｃ
ｌ−１である。本明細書中で使用する用語“プロアポトーシスタンパク質”は、
細胞中での発現の際に典型的にアポトーシスの誘導に関連するＢｃｌ−２ファミ
リーメンバーをいう。Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、及びＢｃｌ−
ｘ_Ｓは、プロアポトーシスタンパク質の例である。しかし、研究によって一定の
環境下でプロアポトーシスタンパク質がアポトーシスを抑制するように作用する
ことができて、抗アポトーシスタンパク質がアポトーシスを促進するように作用
することができることが示されたので、プロアポトーシスファミリーと抗アポト
ーシスファミリーとの間の線引きは人為的なものであり得ると理解すべきである
。したがって、プロ又は抗アポトーシスとしての特定のタンパク質の分類は、現
在の科学的理解に基づいたタンパク質活性についての一般化とみなすべきであり
、特定の細胞環境下には応用できない場合があり得る。

【００３８】 用語“Ｂｃｌ−２ポリペプチド”は、Ｂｃｌ−２、好ましくはヒト又はネズミ
Ｂｃｌ−２の天然のタンパク質、フラグメント、アナログ、又は融合物をいうた
めの総称として本明細書中で使用する。用語“Ｂｃｌ−ｘ_Ｌポリペプチド”は、
Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ，、好ましくはヒト又はネズミＢｃｌ−ｘ_Ｌの天然のタンパク質、
フラグメント、アナログ、又は融合物をいうための総称として本明細書中で使用
する。

【００３９】 本明細書中で使用する用語“生物学的に活性な”は、天然に生じる分子の構造
機能、制御機能、又は生化学的機能を有するタンパク質をいう。同様に、“免疫
学的に活性な”は、天然、組換え、又は合成のアベン又はその任意のオリゴペプ
チドが適切な動物又は細胞において特異的免疫応答を誘導し、特異的抗体に結合
する能力をいう。

【００４０】 本明細書中で使用する用語“相補的”又は“相補性”は、許容される塩及び温
度条件での塩基対合によるポリヌクレオチドの自然な結合性をいう。例えば、配
列“Ａ−Ｇ−Ｔ”は、相補配列“Ｔ−Ｃ−Ａ”に結合する。２つの一本鎖分子間
の相補性は、いくつかの核酸のみと結合する場合、“部分的”であり、一本鎖分
子が全て相補性を示す場合、完全であり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸
鎖間のハイブリッド形成の効率及び強度に対して有意な効果を有する。これは、
核酸鎖間の結合に依存する増幅反応では特に重要である。

【００４１】 本明細書中で使用する用語“ポリヌクレオチドの発現に相関する”は、ノーザ
ンブロット分析による図２と類似のリボ核酸の存在の検出がサンプル中のアベン
をコードするｍＲＮＡの存在の指標となることにより、タンパク質をコードする
ポリヌクレオチド由来の転写物の発現に相関することを示す。

【００４２】 本明細書中で使用する用語“欠失”は、１以上のアミノ酸又はヌクレオチド残
基がそれぞれ存在しないアミノ酸又はヌクレオチド配列の変化をいう。本明細書
中で使用する用語“誘導体”は、アベンをコードする核酸又はコードされたアベ
ンの化学修飾をいう。このような修飾の例は、アルキル基、アシル基、又はアミ
ノ基による水素の置換であろう。核酸誘導体は、天然分子の必須の生物学的特徴
を保持するポリペプチドをコードするであろう。

【００４３】 本明細書中で使用する用語“相同性”は、ヌクレオチド又はアミノ酸類似性の
程度をいう。部分的相同性又は完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る
。部分的に相補的な配列は、同一の配列が標的核酸にハイブリッド形成するのを
少なくとも部分的に阻害するものであり、これを、機能的な用語“実質的に相同
な”を用いていう。標的配列に対しての完全に相補的な配列のハイブリッド形成
の阻害を、低ストリンジェンシーな条件下でのハイブリッド形成アッセイ（サザ
ン又はノーザンブロット、溶液ハイブリッド形成等）を用いて試験することがで
きる。実質的に相同な配列又はプローブは、低ストリンジェンシーな条件下で標
的配列に対して完全に相同な配列又はプローブの結合（すなわち、ハイブリッド
形成）と競合するか阻害する。これは、低ストリンジェンシーな条件が非特異的
結合を起こすような条件であるとはいえず、低ストリンジェンシーな条件には２
つの配列の相互結合が特異的（すなわち、選択的）な相互作用であることを必要
とする。非特異的結合が存在しないことを、部分的な程度の相同（例えば、約３
０％以下の同一性）さえも欠く第２の標的配列の使用によって試験することがで
き、非特異的結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的標的配列とハイ
ブリッド形成しない。

【００４４】 当該分野で既知のように、多数の等価の条件を使用して、低いか又は高いスト
リンジェンシー条件のいずれかを含めることができる。配列の長さ及び性質（Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、標的（溶液中に存在するか固定化等されたＤＮＡ
、ＲＮＡ、及び塩基組成物）の性質、並びに塩及び他の成分（例えば、ホルムア
ミド、硫酸デキストラン、及び／又はポリエチレングリコールの有無）の濃度の
ような要因を考慮して、上記の条件と異なるが等価の低ストリンジェンシー又は
高ストリンジェンシーのいずれかの条件を得るためにハイブリッド形成溶液を変
化させることができる。

【００４５】 本明細書中で使用する用語“宿主細胞”には、以下が含まれるが、これらに限
定されない。

【００４６】

【表２】

【００４７】 本明細書中で使用する用語“ヒト化抗体”は、ヒト抗体により一層密接に類似
させるために非抗原結合領域中でアミノ酸が置換されているが、元の結合能力を
保持している抗体分子をいう。

【００４８】 本明細書中で使用する用語“ハイブリッド形成”は、核酸の鎖が塩基対合によ
って相補鎖と結合する任意の工程をいう。本明細書中で使用する用語“ハイブリ
ッド形成複合体”は、相補的なＧ塩基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基
との間の水素結合の形成によって２つの核酸配列間に形成される複合体をいう。
これらの水素結合は塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化することがで
きる。２つの相補的核酸配列は、逆平行配置で水素結合している。ハイブリッド
形成複合体を、溶液中（例えば、Ｃ_ｏｔ又はＲ_ｏｔ分析）又は溶液中に存在する
ある核酸配列と固体支持体（例えば、細胞がインシトゥハイブリッド形成用に固
定されているメンブラン、フィルター、チップ、ピン、又はガラススライド）上
に固定した別の核酸配列との間に形成させることができる。

【００４９】 本明細書中で使用する用語“挿入”又は“付加”は、天然に生じる分子と比較
して、１以上のアミノ酸又はヌクレオチド残基が加えられるアミノ酸又はヌクレ
オチド配列の変化をいう。

【００５０】 本明細書中で使用する用語“標識”又は“標識化”は、例えば、放射性標識ア
ミノ酸の組み込み又は標識アビジン（例えば、光学的方法又は熱量測定法によっ
て検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプトアビジン）
により検出可能なビオチン化部分のポリペプチドへの結合による検出可能なマー
カーの組み込みをいう。ポリペプチド及び糖タンパク質の種々の標識法が当該分
野で既知であり、これらを使用することができる。ポリペプチド用の標識の例に
は、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体（例えば、^３Ｈ、 ^１４ Ｃ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダ
ミン、ランタニド発光体）、酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチ
ン基、第２のレポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部
位、転写活性化ポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認
識される所定のポリペプチドエピトープ。いくつかの実施形態では、潜在的な立
体障害を減少させるために、標識を種々の長さのスペーサーアームに結合させる
。

【００５１】 本明細書中で使用する用語“模倣の”は、その構造がアベン又はその一部の構
造の知識から開発され、アベンとしてアポトーシスレギュレータ様分子の作用の
いくつか又はすべてを行うことができるような分子をいう。本明細書中で使用す
る用語“調整する”は、アベンの生物学的活性の変化又は変形をいう。調整によ
り、アベンのタンパク質活性の増加又は減少、結合特性の変化、又は生物学的、
機能的、又は免疫学的性質の他の任意の変化である。

【００５２】 本明細書中で使用する用語“核酸配列”は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチ
ド、又はポリヌクレオチド、及びそのフラグメント又は部分、並びに一本鎖又は
二本鎖であり、センス又はアンチセンス鎖を示し得るゲノム又は合成供給源のＤ
ＮＡ又はＲＮＡをいう。同様に、本明細書中で使用する用語“アミノ酸配列”は
、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びそのフラ
グメント又は部分、並びに天然に生じるか合成の分子をいう。

【００５３】 本明細書中で使用する用語“ペプチド核酸”は、リジンのようなアミノ酸残基
、及びアミノ基が付加されているオリゴマーを含む分子いう。これらの小分子は
、抗遺伝子剤とも呼ばれ、核酸の相補鎖への結合によって転写伸長を停止させる
。タンパク質（“所定のタンパク質の部分”として）に関して、本明細書中で使
用する用語「部分」は、そのタンパク質のフラグメントをいう。フラグメントは
、４個のアミノ酸残基〜全アミノ酸配列−１個のアミノ酸のサイズ範囲であり得
る。したがって、“図１のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む”タンパク質
は、全長ヒトアベン及びそのフラグメントを包含する。

【００５４】 本明細書中で使用する用語“試料”は、その最も広い意味で用いられる。アベ
ン又はそのフラグメントをコードする核酸が含有されていると考えられる生物学
的試料には、細胞、細胞から単離した染色体（染色体中期のスプレッド）、ゲノ
ムＤＮＡ（溶液中又はサザンブロット分析用のような固体支持体に結合されてい
る）、ＲＮＡ（溶液中又はノーザンブロット分析用のような固体支持体に結合さ
れている）、ｃＤＮＡ（溶液中又は固体支持体に結合されている）、細胞又は組
織由来の抽出物等を含み得る。

【００５５】 本明細書中で使用する用語“特異的結合”又は“特異的に結合する”は、抗体
とタンパク質又はペプチドとの相互作用に関連して、この相互作用がタンパク質
上の特定の構造（すなわち、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存すること
を意味する。言い換えれば、抗体は一般的なタンパク質よりもむしろ特異的なタ
ンパク質構造を認識するかそれに結合する。例えば、抗体がエピトープ“Ａ”に
特異的である場合、標識化した“Ａ”及び抗体を包含する反応物中のエピトープ
Ａを含むタンパク質（又はなし、非標識化Ａ）の存在は、抗体に結合した標識化
したＡの量を減少させる。

【００５６】 本明細書中で使用する用語“ストリンジェントな条件”は、約Ｔ_ｍ−５℃（プ
ローブの融解温度（Ｔｍ）より５℃低い）からＴ_ｍより約２０℃〜２５℃低い温
度範囲内で起こる“ストリンジェンシー”である。当業者に理解されるように、
同一であるか又は関連するポリヌクレオチド配列を同定するか又は検出するため
に、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを変化させることができる。

【００５７】 本明細書中で使用する用語“実質的に精製された”は、天然の環境から取り出
され、単離又は分離されて、天然に会合している他の成分を少なくとも６０％、
好ましくは７５％、及び最も好ましくは９０％含まない核酸又はアミノ酸配列を
いう。本明細書中で使用する用語“置換”は、１以上のアミノ酸又はヌクレオチ
ドの異なるアミノ酸又はヌクレオチドとの交換をいう。

【００５８】 本明細書中で使用する用語“形質転換”は、外因性ＤＮＡがレシピエント細胞
に侵入して細胞を変化させる工程を説明する。これは、当該分野で周知の種々の
方法を使用して天然又は人工的な条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真
核宿主細胞に外来核酸配列を挿入するための任意の既知の方法に依存することが
ある。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染
、エレクトロポレーション、リポフェクション、及び微粒子銃が含まれるが、こ
れらに限定されない。かかる“形質転換された”細胞には、挿入されたＤＮＡが
自律複製プラスミド又は宿主染色体の一部として複製することができる安定な形
質転換細胞が含まれる。形質転換細胞にはまた、限られた期間で挿入ＤＮＡ又は
ＲＮＡが一過性に発現する細胞も含まれる。

【００５９】 本明細書中で使用するアベンの“変異型”は、１以上のアミノ酸によって変化
したアミノ酸配列をいう。変異型は、置換されたアミノ酸が類似の構造上又は化
学的性質、例えば、ロイシンとイソロイシンとの置換を有する“保存的”変化を
有し得る。稀に、変異型は“非保存的”変化、例えば、グリシンとトリプトファ
ンとの置換を有し得る。類似の少数の変形形態には、アミノ酸欠失もしくは挿入
又はその両方も含み得る。生物学的又は免疫学的活性を無効にすることなくアミ
ノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることができる決定ガイダンスを、当該分
野で周知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ^ＴＭソフトウェア
（ＭＦＲ、ＬＯＣＡＴＩＯＮ）を用いて見出すことができる。好ましいアベンの
変異型は、アベンのアミノ酸配列（図１）に少なくとも８０％、より好ましくは
９０％類似のアミノ酸配列を有するものである。最も好ましいアベン変異型は、
図１に少なくとも９５％類似のアミノ酸配列を有するものである。

【００６０】 好ましい実施形態の詳細な説明 図面及び以下の実施例と共に、参考として、本発明の原理の説明に役立つ、本
発明の好ましい実施形態を詳細に記載する。これらの実施形態は、当業者が本発
明を実施することができるのに十分に詳細に記載してあり、他の実施形態を使用
することができ、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、構造上、生物学的
、及び化学的に変化させることができることが理解される。

【００６１】 本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形“ａ”、“ａｎ”
、及び“ｔｈｅ”には、文中で明らかに区別しない限り、複数形を包含すること
に留意しなければならない。したがって、例えば、“宿主細胞”という記載には
、このような宿主細胞の複数形を含み、“抗体”という記載は、当業者に既知の
１以上の抗体及びその等価物等をいう。

【００６２】 他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語及び科学用語は、
本発明が属する技術の当業者に共通に理解される意味と同一である。本明細書中
に記載のものと類似又は等価な任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験で
使用することができるが、本明細書中に好ましい方法、デバイス、及び材料を記
載する。本明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用され
る。本明細書では、本発明に先行発明によるこのような開示を速やかに実現させ
る権利を与えない承認として解釈されるものではない。

【００６３】 本発明は、単離、精製、及び／又は組換え形態の新規のヒトアポトーシス調節
タンパク質のアベン、及びアベン、アベンのポリペプチド、アベンをコードする
核酸の使用、及び癌、自己免疫疾患、リンパ球増殖障害、アテローム性動脈硬化
症、ＡＩＤＳ、免疫不全疾患、虚血性損傷、神経変性疾患、骨粗鬆症、骨髄異形
成症候群、毒素誘導疾患、ウイルス感染、及びアポトーシスに関連する他の疾患
の診断、予防、又は治療用のこれらの組成物の使用に関する。アベンは、Ｂｃｌ
−ｘ_Ｌを包含する抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリメンバー及びＡｐａｆ−１
と相互作用することが本発明者によって認められ、これを単離し、特徴づけ、本
発明者らが命名した。

【００６４】 本発明にかかるヒトアベンをコードする核酸を、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌと相互作用する
タンパク質について酵母のツーハイブリッドスクリーニングによって最初に同定
した。６つの異なるクローンを単離し、そのうちの１つをＢｃｌ−ｘ_Ｌ相互作用
因子１（アベン）と命名し、そのアミノ酸配列を図１に示した。図面を参照する
と、アベンのアミノ酸配列は図１に示される。認められるように、アベンは３６
２個のアミノ酸を含み、Ｇｌｙ／Ａｒｇ豊富なアミノ末端及び極度に酸性のカル
ボキシ末端を有する。アベンの推定サイズは約４０ｋＤａであったが、トランス
フェクション及びインビトロ転写及び翻訳から産生されたアベンは見かけの分子
量５５ｋＤａに一貫して移動するので、アベンが翻訳後に修飾され得ることが示
唆される。一方、移動度の変化は、折りたたみ及び配列の影響によるものであり
、翻訳後修飾によるものではない。アベンのアミノ酸配列は、以前に既知のタン
パク質に対して既知の相同性を示さない。

【００６５】 本発明にかかるアベンをコードするＤＮＡ配列は、１５６６個の塩基対を含み
、これを図２に示す。両鎖を、左側に５’末端、右側に３’末端として示す。開
始コドン（ＡＴＧ）（ｂｐ５３〜５５）及び終止コドン（ＴＡＡ）（ｂｐ１１３
９〜４１）に下線を引く。開始コドンの数ダース塩基対上流及び終止コドンの下
流も示す。アベンのＤＮＡ配列は以前に既知の配列に有意な相同性を示さない。

【００６６】 遺伝子コードの縮重の結果として、アベンをコードする多数のヌクレオチド配
列は、いくつかが何らかの既知で天然に生じる遺伝子のヌクレオチド配列に最少
の相補性を示し、産生させることができることが当業者に認識される。したがっ
て、本発明は、可能なコドン選択に基づく選択によって作製することができるヌ
クレオチド配列のそれぞれ及び全ての可能な変形形態を包含する。これらの組み
合わせを、天然に生じるアベンのヌクレオチド配列に適用されるような標準的な
三文字暗号によって作製し、全てのこのような変形形態は特別に開示されると考
えるべきである。

【００６７】 アベン及びその変異型をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択されたス
トリンジェンシーな条件下で天然に生じるアベンのヌクレオチド配列とハイブリ
ッド形成することができることが好ましいにもかかわらず、実質的に異なるコド
ンを使用するアベン又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を産生するの
に有利であり得る。宿主によって特定のコドンが使用される頻度に従って、特定
の原核又は真核宿主でペプチドの発現が起こる率が増加するようにコドンを選択
することができる。コードされるアミノ酸配列が変化することなくアベン及びそ
の誘導体をコードするヌクレオチド配列が実質的に変化する他の理由には、天然
に生じる配列から産生された転写物よりもより一層長い半減期のような、望まし
い性質を有するＲＮＡ転写物の産生が含まれる。

【００６８】 本発明はまた、アベン及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はその一部の
専ら合成化学による産生を包含する。産生後、合成配列を本出願の提出時に当該
分野で周知の試薬を用いて多くの任意の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿
入することができる。さらに、合成化学を用いて、アベン又はその一部をコード
する配列に変異を導入することができる。

【００６９】 特許請求の範囲に記載のヌクレオチド配列、特に、図２に示した配列と種々の
ストリンジェンシーな条件下でハイブリッド形成することができるポリヌクレオ
チド配列もまた、本発明に含まれる。ハイブリッド形成条件は、核酸結合複合体
又はプローブの融解温度（Ｔ_ｍ）に基づき、これを定義されたストリンジェンシ
ーで使用することができる。

【００７０】 本発明に含まれるアベンをコードする核酸配列の変化には、同一又は機能的に
等価のアベンをコードするポリヌクレオチドが得られる欠失、挿入、又は異なる
ヌクレオチドの置換が含まれる。コードタンパク質はまた、サイレントに変化し
、機能的に等価なアベンが得られるアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を含ん
でも良い。アベンの生物学的活性が保持される限り、アミノ酸残基の極性、電荷
、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性に基づいて計画的なアミノ酸置
換を行うことができる。例えば、負電荷のアミノ酸にはアスパラギン酸及びグル
タミン酸を含んでよく、正電荷のアミノ酸にはリジン及びアルギニンを含んでよ
く、及び類似の親水性値を有する無電荷の極性の頭部基を備えたアミノ酸にはロ
イシン、イソロイシン、及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及び
グルタミン、セリン及びトレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含んでよ
い。

【００７１】 アベンをコードする遺伝子の対立遺伝子もまた本発明の範囲内である。本明細
書中で使用する用語“対立遺伝子”又は“対立遺伝子配列”は、核酸配列中の少
なくとも１つの変異に起因し得る遺伝子の変更形態である。対立遺伝子によって
、ｍＲＮＡ又はポリペプチドの構造又は機能が変化し得るか又は変化し得ずにｍ
ＲＮＡ又はポリペプチドが変化し得る。何らかの所定の遺伝子は、対立遺伝子形
態を含まないか、１つ含むか、多数含んでも良い。対立遺伝子が生じる共通の変
異による変化は、一般に、ヌクレオチドの天然の欠失、付加、又は置換に基づく
。これらの各変化の型は、所定の配列中に１回又は複数回単独又は他の型と組み
合わせて起こり得る。

【００７２】 当該分野でよく知られており一般的に利用されているＤＮＡ配列決定法を使用
して、本発明の任意の実施形態を実施することができる。この方法は、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ^ＴＭ（米国オハイオ
州クリーブランド所在のＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）、Ｔａｑポリメ
ラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（イリノイ
州シカゴ所在のＡｍｅｒｓｈａｍ社）、又はＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）のような組換えポリメラーゼとプル
ーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせ（メリーランド州ガイサー
ブルク所在のＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社）のような酵素を使用することができる。好
ましくは、この工程を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（ネ
バダ州レノ所在のＨａｍｉｌｔｏｎ社）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ
ｙｃｌｅｒ ＰＴＣ２００（マサチューセッツ州ウォータタウン所在のＭＪ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ社）、及びＡＢＩ ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ社）のような機械で自動化する。

【００７３】 アベンをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列の使用及びプロモー
タ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当該分野で既知の種々
の方法を使用して伸長することができる。例えば、制限部位ＰＣＲは既知の遺伝
子座に隣接する未知の配列を検索するための普遍プライマを使用する。この方法
では、最初にリンカープライマ及び既知の領域に特異的なプライマの存在下でゲ
ノムＤＮＡを増幅させる。次に、増幅した配列を、第１の領域内の同一のリンカ
ープライマ及び別の特異的プライマを用いた第２ラウンドのＰＣＲに供する。各
ラウンドのＰＣＲ産物を適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写して、逆転写酵
素を用いて配列決定する。

【００７４】 逆ＰＣＲを使用して、既知の領域に基づく分岐プライマの使用によって配列を
増幅又は伸長させることもできる。この方法は、遺伝子の既知の領域中で適切な
フラグメントを作製するためにいくつかの制限酵素を使用し、その後分子内連結
反応によって環状化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。捕獲ＰＣＲとして既知の別
の方法は、ヒト及び酵母の人工染色体ＤＮＡ中の既知の配列に隣接するＤＮＡフ
ラグメントのＰＣＲ増幅が含まれる。この方法では、ＰＣＲを行う前に多数の制
限酵素消化及び連結反応を使用して、操作した二本鎖配列をＤＮＡ分子の未知の
部分に置くこともできる。さらに、ＰＣＲ、ネスト化プライマ、及びゲノムＤＮ
Ａ中に入るためのＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲ^ＴＭライブラリ（カリフォルニ
ア州パロアルト所在のＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用することができる。この工程
により、ライブラリのスクリーニングの必要がなく、イントロン／エクソン接合
点の発見に有用である。

【００７５】 全長ｃＤＮＡをスクリーニングする場合、より大きなｃＤＮＡを含むようにサ
イズ選択したライブラリを使用することが好ましい。遺伝子の５’領域を包含す
るより多くの配列を含む点で、ランダムプライミングライブラリも好ましい。ラ
ンダムプライミングライブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが全長ｃＤ
ＮＡを産生しない条件で特に好ましい。ゲノムライブラリは、５’及び３’非転
写調節領域への配列の伸長に有用であり得る。

【００７６】 一般的に利用可能なキャピラリ電気泳動システムを使用して、サイズを分析す
るか、配列決定又はＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を確認することができる。特
に、キャピラリ配列決定は、電気泳動分離用の流出可能なポリマー、レーザで活
性化される４つの異なる蛍光染料（各ヌクレオチドあたり１つ）、及び電荷結合
素子カメラによる放射した波長の検出を使用することができる。出力／光強度を
、適切なソフトウェア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ^ＴＭ及びＳＥＱＵＥＮＣＥ
ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ^ＴＭ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して電気信号
に変化させ、サンプルの負荷からコンピュータ分析及び電子データの表示までの
全工程をコンピュータで制御することができる。キャピラリ電気泳動は、特定の
試料に少量存在し得るＤＮＡの小片の配列決定に特に好ましい。

【００７７】 本発明の別の実施形態では、アベン又はその融合タンパク質もしくは機能的等
価物をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを組換えＤＮＡ分
子に使用して、適切な宿主細胞中のアベンの発現に指向させることができる。遺
伝コードの固有の縮重により、実質的に同一であるか機能的に等価なアミノ酸配
列をコードする他のＤＮＡ配列を産生させることができ、これらの配列を使用し
てアベンをクローン化及び発現させることができる。

【００７８】 当業者に理解されるように、それは天然に生じないコドンを有するアベンコー
ドヌクレオチド配列の産生に有利であり得る。例えば、タンパク質発現率を増大
させるか、又は天然に生じる配列から作製した転写物よりも長い半減期のような
所望の性質を有する組換えＲＮＡ転写物の産生させるために特定の原核細胞宿主
又は真核細胞宿主に好ましいコドンを選択することができる。

【００７９】 遺伝子産物のクローニング、プロセシング、及び／又は発現を改変する変更が
含まれるがこれらに限定されない種々の理由から、アベンコード配列を変化させ
るために、当該分野で一般に既知の方法を用いて、本発明にかかるヌクレオチド
配列を操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチド
の無作為な断片化及びＰＣＲリアセンブリによるＤＮＡシャフリングを使用して
、ヌクレオチド配列を操作することができる。例えば、部位特異的変異誘発を使
用して、新しい制限部位を挿入するか、グリコシル化パターンを変化させるか、
コドン優先度を変化させるか、スプライス変異を産生させるか、又は変異を導入
等することができる。

【００８０】 本発明の別の実施形態では、アベンをコードする天然、修飾、又は組換え核酸
配列を異種配列に連結して融合タンパク質をコードさせることができる。例えば
、これは、アベン活性の抑制剤についてのペプチドライブラリのスクリーニング
にとって、市販の抗体で認識することができるキメラアベンタンパク質をコード
するのに有用であり得る。融合タンパク質を操作してアベンコード配列と異種タ
ンパク質配列との間に位置する切断部位を含ませ、アベンを切断して異種部分か
ら精製されるようにすることができる。

【００８１】 別の実施形態では、アベンをコードする配列を、当該分野で周知の化学的方法
を用いて全部又は一部を合成することができる。あるいはまた、アベンのアミノ
酸配列又はその一部を合成するために、化学的方法を用いてタンパク質自体を産
生することができる。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合成を行うこと
ができ、例えば、ＡＢＩ ４３１ Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
ｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて自動化した合成を行うことができる
。

【００８２】 新たに合成したペプチドを、分離用高速液体クロマトグラフィによって実質的
に精製することができる。合成ペプチドの組成を、アミノ酸分析及び配列決定（
例えば、エドマン分解法）によって確認することができる。さらに、アベンのア
ミノ酸配列又はその任意の部分を、直接合成中に変化させ、及び／又は変異型ポ
リペプチドを産生させるために他のタンパク質又はその任意の部分由来の配列を
用いた化学的方法を使用して組み合わせることができる。

【００８３】 生物学的に活性なアベンの調製に有用な組換えＤＮＡ分子も得られる。好まし
い組換えＤＮＡ分子を、図２に示した配列から選択したＤＮＡ配列、上記のよう
に本発明にかかる組換えタンパク質又はポリペプチドをコードする配列を含むク
ローニング又は発現ベクター、これらの任意のＤＮＡ配列とハイブリッド形成し
更にアベンをコードするＤＮＡ配列、及び上記のＤＮＡ配列に対する遺伝コード
の結果としての縮重であり更にアベンの抗原をコードするＤＮＡ配列によって特
徴づける。

【００８４】 適切なＤＮＡ配列を、一般に、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位の使用によ
る、種々の手順によって、広範な種々の任意の発現ベクターに挿入することがで
きる。適切なベクターには、例えば、以下が含まれる：染色体、非染色体、及び
合成ＤＮＡ配列のセグメントからなるベクター、例えば、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ
１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、及びそれらの誘導体を包含するＥ．ｃｏｌｉ由来
のプラスミド）、より広範な宿主範囲のプラスミド、例えば、ＲＰ４、カリフラ
ワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ファー
ジＤＮＡ、例えば、λファージの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及びＭ１
３又は糸状菌の単鎖ＤＮＡファージのような他のＤＮＡファージ、２μｌプラス
ミド又はその誘導体のような酵母プラスミド、バキュロウイルス、ワクシニアウ
イルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、又は仮性狂犬病ウイルスの
ようなウイルスＤＮＡ、コスミド、ｐＧＥＸベクター（ウィスコンシン州マディ
ソン所在のＰｒｏｍｅｇａ社）、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ核多角体病ウイルス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ又はＴｒ
ｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅのような昆虫宿主中）、及びプラスミド及
びファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、例えば、ファージＤＮＡ又は他
の発現調節配列に使用するために修飾されているプラスミド。

【００８５】 それぞれの特異的クローニング又は発現ビークル内で、本発明にかかるＤＮＡ
配列を挿入するための種々の部位を選択することができる。通常、これらの部位
は切断する制限エンドヌクレアーゼによって示され、これらの部位にＤＮＡ配列
を挿入して組換えＤＮＡ分子を形成させる種々の方法が存在する。これらの方法
には、例えば、ｄＧ−ｄＣ又はｄＡ−ｄＴテーリング、直接的連結反応、合成リ
ンカー、エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼ連結修復反応後の連結反応、又は
ＤＮＡポリメラーゼ及び適切な一本鎖鋳型を用いたＤＮＡ鎖の伸長後の連結反応
が含まれる。勿論、本発明で有用なクローニング又は発現ビークルには、選択さ
れたＤＮＡフラグメントの挿入用の制限エンドヌクレアーゼ部位は必要なく、そ
して挿入は別の手段で行うことができることが理解される。

【００８６】 本発明にかかるＤＮＡ配列の発現用に、これらのＤＮＡ配列を、発現ベクター
中の１以上の発現調節配列に作動可能に連結させる。選択されたＤＮＡ配列をク
ローニングビークルに挿入する前又は後に行うことができるこのような操作的連
結により、発現調節配列は挿入ＤＮＡ配列の発現を制御及び促進することができ
る。

【００８７】 任意の広範な種々の発現調節配列−作動可能に連結された場合にＤＮＡ配列の
発現を制御する配列−をこれらのベクター中で使用して、本発明にかかるＤＮＡ
配列を発現させることができる。このような有用な発現調節配列には、例えば、
以下が含まれる：ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、ｌａｃ又はｔｒｐ系、Ｂ
ＬＵＥＳＣＲＩＰＴ^ＴＭファージミド（カリフォルニア州ラホラ所在のＳｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社）又はＰＳＰＯＲＴＩ^ＴＭプラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）
のハイブリッドｌａｃＺプロモータ、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要な
オペレータ及びプロモータ領域、ｆｄ被覆タンパク質の制御領域、バキュロウイ
ルス多面体プロモータ、ヒトサイトメガロウイルスのプロモータ、３−ホスホグ
リセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモータ、酸性ホスファターゼのプロ
モータ、例えば、Ｐｈｏ５、ＣＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモータ、ＴＭＶωリ
ーダー配列、アデノウイルスの後期プロモータ及び三部リーダー配列、酵母α交
配因子のプロモータ、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨ、植物細胞ゲノム、
例えば、熱ショック、Ｒｕｂｉｓｃｏ、及び貯蔵タンパク質遺伝子由来のプロモ
ータ、並びに原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制
御することが既知の他の配列及びその種々の組み合わせ。

【００８８】 発現ベクターは、また、翻訳開始及び転写終結のためのリボゾーム結合部位に
ついての非コード配列も含む。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子又は哺乳動
物ウイルス由来のプロモータ並びに変化した３’非コード配列が好ましい。

【００８９】 ベクターには、発現の増幅に適切な配列も含んでもよい。哺乳動物細胞では、
さらに、デヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、宿主チャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞の選択に適用する遺伝子への連結によって発現単位を増幅させ
ることができる。グルタミン合成酵素を包含する多くの他の遺伝子が染色体増幅
に使用されている。アベンをコードする配列の多数の非染色体コピーを含む哺乳
動物細胞系の作製が必要である場合、ＳＶ４０又はＥＢＶに基づくベクターを、
適切な選択マーカーと一緒に使用することができる。

【００９０】 ベクター又は発現ビークル、及び特に本発明で使用される選択ＤＮＡフラグメ
ント及び発現調節配列の挿入用にその中で選択された部位を、種々の因子、例え
ば、特定の制限酵素に感受性を示す部位の数、発現するタンパク質の寸法、ベク
ター配列に関連する開始及び終止コドンの位置のような発現の特徴、及び当業者
によって認識される他の因子によって決定することができる。ベクター、発現調
節配列、及び挿入部位の選択を、これらの因子のバランスによって決定するが、
全ての選択が所与の場合に等しく有効ではない。

【００９１】 特異的開始シグナルを使用して、アベンをコードする配列のより有効な翻訳を
行うこともできる。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が
含まれる。アベン、その開始コドン、及び上流配列をコードする配列が適切は発
現ベクターに挿入された場合、さらなる転写又は翻訳調節シグナルは必要ではな
い場合がある。しかし、コード配列のみか又はその一部が挿入された場合、ＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルを得るべきである。さらに、全イン
サートの翻訳を確実にするために、開始コドンが正確な読み枠に存在しなければ
ならない。外因性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成両方の種々の
供給源であり得る。使用する特定の細胞系に適切な転写エンハンサ、例えば、Ｓ
Ｖ４０、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、及びＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）
エンハンサの封入によって発現効率を向上させることができる。

【００９２】 次いで、発現調節配列に作動可能に連結された所望の遺伝子を含む組換えＤＮ
Ａ分子を使用して広範な種々の適切な宿主を形質転換してかかる宿主（形質転換
体）に遺伝子又はそのフラグメントを発現させて、ハイブリッドＤＮＡがコード
するポリペプチド、又はその一部を産生させることができる。組換えＤＮＡ分子
を使用して宿主を形質転換して、複製によって宿主がアベン遺伝子及びそのフラ
グメントの供給源としてのさらなる組換えＤＮＡ分子を産生するようにすること
もできる。

【００９３】 広範な種々の宿主もまた、本発明にかかるＤＮＡ配列の産生に有用である。こ
れらの宿主には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、及びＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓのような細菌、酵母のような菌類、昆虫細胞系、植物細胞、及びＣ
ＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷＩ３８のような動物細胞が含
まれる。これらのいずれかに使用する適切な宿主の選定は、多数の要因によって
制御される。これらの要因には、例えば、選択されたベクターとの適合性、副産
物の毒性、所望のポリペプチドの回収の容易さ、発現の特徴、生物学的安全性及
び費用が含まれる。任意のこれらの要因のみから特定の組換えＤＮＡ分子又はポ
リペプチド用の宿主を絶対的に選択することはできない。その代わりに、全ての
宿主が特定の組換えＤＮＡ分子の発現に等しく有効なではないことを理解して、
これらの要因のバランスを決定しなければならない。

【００９４】 クローニング又は発現ビークルの選択部位に挿入されたＤＮＡ配列には、所望
のポリペプチドをコードする実際の遺伝子の一部ではないヌクレオチドを含み得
るか又はそのタンパク質の全遺伝子のフラグメントのみを含み得ることも理解さ
れる。どのようなＤＮＡ配列が使用されようと形質転換宿主は天然のアベンの生
物活性を有するポリペプチドを産生することのみが必要である。形質転換宿主は
また、アベンポリペプチドに加えて他のタンパク質又は化合物を発現することが
できる。例えば、形質転換宿主を、アベン及びモノクローナル抗体又は目的の他
の組換えタンパク質のような別の化合物を発現するか、アベン及びＢｃｌ−ｘ_Ｌ の両方を発現するように設計することができる。かかる宿主細胞系は、科学者に
とって目的の化合物の産生に有意な臨床又は生物学的用途を有し得る。

【００９５】 例えば、本発明にかかるＤＮＡ配列を、本発明にかかる発現ベクター中の同一
の読み枠中で、少なくとも１つの真核生物又は原核生物のキャリアタンパク質を
コードするＤＮＡ配列又は少なくとも１つの真核生物又は原核生物のシグナル配
列をコードするＤＮＡ配列又はその組み合わせの一部と融合することができる。
このような構築物は、所望のＤＮＡ配列の発現を援助し、宿主細胞由来の所望の
ポリペプチドの精製を改善するか分泌させ、好ましくは成熟させることができる
。あるいはまた、ＤＮＡ配列は、所望のポリペプチドの第１のアミノ酸をコード
する配列に直接融合した他のコドンを含むか又は含まないＡＴＧ開始コドンを含
んでもよい。このような構築物は、例えば、本発明の一部であるメチオニル又は
他のペプチジルポリペプチドを産生することができる。次いで、このＮ末端メチ
オニン又はペプチドを、種々の既知の工程によって細胞内又は細胞外で切断する
ことができるか、又はこのポリペプチドを本発明の組成物及び方法においてそれ
と結合したメチオニン又は他の融合物と共に使用することができる。

【００９６】 宿主に導入した場合、ベクター中に存在する適切なＤＮＡ配列は、コードされ
るタンパク質の一部又は一部のみを発現することができ、これは、発現したタン
パク質が図１に記載のアミノ酸配列と同一の生物活性を惹起することができるの
に十分である。例えば、宿主生物としてＥ．ｃｏｌｉを使用した場合、ＵＧＡコ
ドンは終止コドンであるので、発現タンパク質はベクター中にコードされた抗原
のフラグメントのみであり、この理由で、一般に、適切なＤＮＡ配列中の全ての
ＵＧＡコドンを非終止コドンに変換することが好ましい。ＵＧＡを終止コドンと
して認識する宿主におけるこの問題に関する別の方法は、形質転換生物中のトリ
プトファンとしてタンパク質コード配列内のＵＧＡコドンを翻訳するｔ−ＲＮＡ
をコードするさらなるＤＮＡ配列を含めることである。

【００９７】 さらに、宿主細胞株を、挿入配列の発現調節能力又は所望の様式での発現タン
パク質のプロセシング能力のために選択することができる。このようなポリペプ
チドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質
化、ユビキチン化、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タンパ
ク質の“プレプロ”形態を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正確な挿入
、折りたたみ、及び／又は機能を容易にすることもできる。外来タンパク質の正
確な修飾及びプロセシングを確実にするために、特異的細胞機構及びこのような
翻訳後活性について特徴的な機構を有する異なる宿主細胞、例えばＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷＩ３８を選定することができる。

【００９８】 組換えタンパク質の長期で高収率の産生には、安定な発現が好ましい。例えば
、アベンを安定に発現する細胞系を、同一又は異なるベクター上にウイルスの複
製起点及び／又は内因性発現エレメント並びに選択マーカー遺伝子を含み得る発
現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、細胞を富化
培地中で１〜２日間増殖させて、選択培地と交換することができる。選択マーカ
ーの目的は選択耐性を付与することであり、その存在により、導入配列が首尾よ
く発現する細胞を増殖及び回収することができる。安定に形質転換した細胞の耐
性クローンを、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖させることができる。

【００９９】 多数の選択系を使用して、形質転換細胞系を回収することができる。これらに
は、それぞれｔｋ又はａｐｒｔ細胞に使用することができる単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含
まれるが、これらに限定されない。また、以下の代謝拮抗剤、抗生物質、又は除
草剤耐性を、選択の基本として使用することができる；例えば、メトトレキセー
ト耐性を付与するｄｈｆｒ；アミノグリコシドネオマイシン及びＧ−４１８耐性
を付与するｎｐｔ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）；及びａｌｓ又は
ｐａｔ、それぞれクロルスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ耐性を付与する。以下にさらなる選択遺伝子を記載する：例えば、細胞
がトリプトファンの変わりにインドールを利用し得るｔｒｐＢ、又は細胞がヒス
チジンの変わりにヒスチノールを利用し得るｈｉｓＤ。選択に使用される遺伝子
に加え、アントシアニン、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ、並びにルシ
フェラーゼ及びその基質ルシフェリンのような視覚可能なマーカーを形質転換体
の同定だけでなく特異的ベクター系に起因する一過性又は安定なタンパク質発現
量の定量にも使用することができる。

【０１００】 マーカー遺伝子発現の有無により目的の遺伝子の存在が示唆されるにもかかわ
らず、その存在及び発現を確認する必要があり得る。例えば、アベンをコードす
る配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、アベンをコードする配列を含
む組換え細胞をマーカー遺伝子機能の欠如によって同定することができる。ある
いはまた、マーカー遺伝子を、単一のプロモータの調節下でアベンをコードする
配列と共にタンデムに配置することができる。誘導又は選択に対するマーカー遺
伝子の発現は、通常、縦列遺伝子と同様の発現を示す。

【０１０１】 あるいはまた、アベンをコードする核酸配列を含み、かつアベンを発現する宿
主細胞を、当業者に既知の種々の手順によって同定することができる。これらの
手順には、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成、及び核酸又は
タンパク質の検出及び／又は定量用の膜、溶液、若しくはチップ系の技術を包含
するタンパク質バイオアッセイ又は免疫アッセイ技術が含まれるが、これらに限
定されない。

【０１０２】 図３は、アベンが種々の組織型で発現するかどうかを決定するために行われた
ノーザンブロット分析の結果を示す。図３に示した結果は、アベンが広範な種々
の成体組織中で発現し、特に再生組織中で発現することを示す。ヒーラ、ＩＢ４
、及びラジ細胞系から単離したｍＲＮＡを用いたノーザンブロット分析も行い、
結果を図４に示す。組織及び細胞系の両方で、たった１つの１．７ｋｂのＲＮＡ
種が検出され、これは、５’末端からポリＡの始めまでの１５２６ヌクレオチド
にわたるｃＤＮＡクローンの寸法と一致した。

【０１０３】 細胞中のアベンの発現を確認するために、図５に示すように、アベンに対する
ポリクローナル抗体を用いてラジ細胞溶解物についてウェスタンブロット分析を
行った。図１に示したアミノ酸配列の残基９８〜１１２及び残基２５６〜２６８
それぞれに対応する２つのペプチドに対して、αアベンａ及びαアベンｂと呼ば
れる抗体を作製した。ラジ細胞溶解物を、分析前に核及び細胞質画分に分離した
。図５に示すように、アベンは主に細胞質に局在しているが、核内に見出すこと
もできる。アラニンに対する３つのロイシン１９０、１９２、及び１９４のアベ
ン変異により、細胞基質から核にアベンが再分布し、これは、この領域が核輸送
シグナルをコードし得ることを示す。これらの変異は培養中の海馬神経細胞の抗
アポトーシス機能を向上させるので、核機能が少なくとも神経細胞における抗ア
ポトーシス活性に重要であることを示す。

【０１０４】 図６、図７、及び図８は、アベンの他のＢｃｌ−２ファミリーメンバーと相互
作用する能力を同定するためにＣＯＳ−１細胞分解物に対して行った酵母のツー
ハイブリッド分析及び同時免疫沈降分析の結果を示す。トランスフェクションに
含まれる構造物を（＋）として示す（図６、図７、及び図８）。免疫沈降抗体（
上）及び免疫ブロッティング抗体（端）を示す（図７及び図８）。Ｂｃｌ−２（
図６）、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ（図６、図７、図８）、ＫＳＢｃｌ−２（カポジ肉腫関連
ヘルペスウイルスＢｃｌ−２ホモログ）（図６、図７Ｂ）、及びＢｃｌ−ｘ_Ｌｍ
ｔ１（図６、図８Ａ）（抗アポトーシス活性を保持する変異体）のような抗アポ
ローシスタンパク質は、アベンと相互作用する（図８Ｂ）。しかし、図６に示す
ように、アベンはＢａｘ及びＢａｋのようなプロアポトーシスタンパク質と相互
作用しない。

【０１０５】 アベンがＢｃｌ−２又はＫＳＢｃｌ−２よりもＢｃｌ−ｘ_Ｌと有意に高い親和
性を示すことも注目すべきである（図７Ｂ）。全長アベンが免疫沈降した抗体の
重鎖によってマスクされるようであるので、ＨＡエピトープタグ化Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ 及びその変異体を、フラグエピトープタグ化Ｎ末端欠失アベンと同時トランスフ
ェクトした（図８Ａ）。図７、図７Ｂ、及び図８Ｂで認められるように、アベン
はプロアポトーシスＮ末端短縮Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ（図７Ａ）又は非機能的変異体ｍｔ
７（図８Ａ）と相互作用しなかったが、機能的ループ欠失及びｍｔ１変異体（図
８Ａ）と相互作用したので、これは、アベンがＢｃｌ−２ファミリーメンバーの
抗アポトーシス活性を中継する共通の下流エフェクタであり得ることを示唆する
。

【０１０６】 図９Ａ〜図９Ｅは、アベンとＡｐａｆ−１との間の相互作用を示す。ＨＡエピ
トープタグ化全長アベン及びＨＡタグ化ΔＮ７３アベンを、ヒトＢｃｌ−ｘＬ（
ｈＢｃｌ−ｘＬ）の存在下又は非存在下でＣＯＳ−１細胞にＡｐａｆ−１と共に
同時トランスフェクトし、そして細胞溶解物を抗ＨＡ抗体で沈殿させた。全長及
び短縮アベンは共にトランスフェクトしたｈＢｃｌ−ｘＬの存在下又は非存在下
のいずれかでＡｐａｆ−１と相互作用することができた（図９Ａ）。Ｎ末端短縮
アベンのＡｐａｆ−１と相互作用する能力は、アベンの潜在的に“粘着性を示す
”アルギニン豊富な領域のために偽陽性の可能性を排除した。Ａｐａｆ−１とＨ
Ａ抗体との間の非特異的相互作用の可能性を排除するために、抗アベン抗体を使
用して、同時免疫沈降実験を行った。ＨＡエピトープタグ化Ａｐａｆ−１を、両
アベン抗体によってアベンと同時免疫沈降させた（図９Ｂ、データは示していな
い）。逆の戦略を用いて、ＨＡ−Ａｐａｆ−１と抗ＨＡ抗体の沈降によりアベン
が同時沈降した（図９Ｃ）。

【０１０７】 内因性Ａｐａｆ−１及びアベンタンパク質が相互作用することを立証するため
に、ヒーラ細胞溶解物を、免疫前又は免疫後の抗アベン−ａ血清と免疫沈降させ
てポリクローナル抗Ａｐａｆ−１抗体（Ｘ．Ｗａｎｇから得た）で免疫ブロット
した。免疫後血清のみがアベンと共に内因性Ａｐａｆ−１を同時沈降させたが、
コントロール血清では同時沈降しなかった（図９Ｄ）。同様に、免疫後抗アベン
−ｂ血清のみが２９３Ｔ細胞抽出物由来のＡｐａｆ−１を同時沈殿させた。モノ
クローナル抗Ａｐａｆ−１抗体（Ｙ．Ｌａｚｅｂｎｉｋから得た）でＡｐａｆ−
１を検出した（図９Ｅ）。したがって、２つの異なるアベン抗体が、２つの異な
る細胞型由来の内因性Ａｐａｆ−１を同時沈殿させた。

【０１０８】 図９Ｆ〜図９Ｊは、アベンがＢｃｌ−ｘＬと無関係にＡｐａｆ−１と相互作用
することを示す。上記の図９Ａ〜図９Ｅに記載のように、トランスフェクション
した細胞に対して同時免疫沈降実験を行った。

【０１０９】 図１０（ａ）〜図１０（ｃ）は、３つの異なる細胞系におけるアポトーシスに
対するアベンの存在の結果を示す。番号１は、ベクターコントロールを示し、番
号２はカスパーゼ９を示し、３はＡｐａｆ−１を示し、４はカスパーゼ９＋Ａｐ
ａｆ−１を示し、及び５はカスパーゼ９、Ａｐａｆ−１及びアベンを示す。アベ
ンを、トランスフェクションのマーカーとしてβガラクトシダーゼを使用してＡ
ｐａｆ−１及びカスパーゼ−９と同時トランスフェクトした。Ａｐａｆ−１（３
）又はカスパーゼ−９（２）のみではいずれも細胞死を誘導しなかったが、Ａｐ
ａｆ−１とカスパーゼ−９との同時トランスフェクション（４）では細胞死を誘
導した。Ａｐａｆ−１／カスパーゼ−９の同時トランスフェクション（５）への
アベンの添加により、３つ全ての細胞型における細胞死の割合が減少した。図１
０（ｃ）はまた、異なるタンパク質発現の可能性を排除するために行ったＢＨＫ
細胞溶解物のウェスタンブロットの結果を含むが、これは、類似の量のＡｐａｆ
−１及びカスパーゼ−９がアベンの存在に関係なく発現することを示す。

【０１１０】 図１１に示すように、アベンはシンドビスウイルス感染及び神経細胞アポトー
シスからマウスを保護する。アベンはアポトーシスを阻害し、Ｂｃｌ−ｘＬの抗
アポトーシス機能を向上させる。シンドビスウイルス、神経毒性αウイルスは、
中枢神経系の神経細胞に特異的に感染し、そして新生マウスの致命的結果を伴う
アポトーシスを誘導する〔Ｌｅｗｉｓ等、（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７
０、１８２８〜１８３５、本明細書中で参考として援用される〕。組換えシンド
ビスウイルスベクターから発現したＢｃｌ−２ファミリーメンバーは、神経細胞
アポトーシス及び致命的疾患からマウスを保護する〔Ｌｅｖｉｎｅ等、（１９９
６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、４８１０〜４８
１５、Ｌｅｗｉｓ等、（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５、８
３２〜８３５、共に本明細書中で参考として援用される〕。

【０１１１】 アベンがインビボで神経細胞アポトーシスを妨害するかどうかを決定するため
に、アベン又はコントロールタンパク質、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ）を発現する組換えシンドビスウイルスをマウスに頭蓋内
注射した。感染後、２１日間死亡率を監視した。アベン発現ウイルスを感染させ
た動物（６０％）ではコントロールウイルスを感染させたマウス（１０％）より
有意に良好に生存することにより、アベンがインビボで神経細胞アポトーシスに
対して保護機能を示すことが証明された。

【０１１２】 図１２はアベンを安定に発現する収集したＦＬ５．１２細胞におけるＩＬ−３
の除去によって誘導されるアポトーシス耐性の増加を示す。アベンが別の生理学
的な死の刺激によって誘導される細胞死を保護することができるかを決定するた
めに、アベンを安定に発現する収集したＦＬ５．１２細胞を、ＩＬ−３除去によ
って誘導されたアポトーシスに対する耐性について試験した。データを、３つの
独立した実験について平均（＋／−ＳＥＭ）として示す。試験した全ての時間点
で、アベン発現細胞は約２０％以上の生存度を示した（図１２Ａ）。

【０１１３】 抗アベン−ｂ血清を用いたアベンを安定に発現するプールしたＦＬ５．１２細
胞又はコントロールベクターの免疫ブロット分析を、図１２Ｂに示す。“^＊”は
非特異的バンドを示し、

【外１】 矢印はアベンの位置を示す。免疫ブロット分析により、収集したアベンのトラン
スフェクト細胞中ではアベンの過剰発現が確認されたが、ベクタートランスフェ
クト細胞では確認されなかった。

【０１１４】 図１３は、アベンがＢｃｌ−ｘＬの抗アポトーシス活性を２０〜３０％向上さ
せることを示す。Ｂｃｌ−ｘＬは、カスパーゼ−１誘導アポトーシスから培養Ｂ
ＨＫ（幼若ハムスター腎臓）細胞を約２０％保護した。アベン及びＮ末端短縮ア
ベン（ΔＮ７３）は、Ｂｃｌ−ｘＬの抗アポトーシス活性を２０〜３０％向上さ
せた。したがって、特異的カスパーゼ−１抑制剤ＣｒｍＡ、強力な抗アポトーシ
ス薬だけでなく、２つのタンパク質も共に抗アポトーシス作用する。これらの所
見は、アベンとＢｃｌ−ｘＬとの相互作用によって細胞生存が向上することを示
す。

【０１１５】 図１４Ａ及び図１４Ｂは、アベンがＡｐａｆ−１の自己会合を阻害することを
示す。Ａｐａｆ−１はそのＣＥＤ−３相同ドメインを介してカスパーゼ−９と結
合し、Ａｐａｆ−１自体が会合してそのＣＥＤ−４相同ドメインを介してオリゴ
マーを形成する（Ｈｕ等、１９９９；Ｓａｌｅｈ等、１９９９；Ｚｏｕ等、１９
９９、それぞれ本明細書中で参考として援用する）。目下の証拠により、Ａｐａ
ｆ−１の自己会合によりプロカスパーゼ−９分子を密接に近づけてカスパーゼ−
９の自己又は交差触媒活性化を促進し、結果としてアポトーシスプログラムを活
性化させることが示される。アベンがＡｐａｆ−１と相互作用してＡｐａｆ−１
＋カスパーゼ−９誘導アポトーシスを阻害するので、アベンがＡｐａｆ−１の自
己会合を分裂させる可能性を試験した。アベンは抗ＨＡ抗体との全長Ａｐａｆ−
１の同時免疫沈降を阻害し、このことは、アベンはＡｐａｆ−１の自己会合を阻
害することを示す（図１４Ａ）。ＣＯＳ−１細胞を、Ａｐａｆ−１、Ａｐａｆ−
１のＨＡタグ化ＣＥＤ−３＋４ドメイン及びアベンと同時トランスフェクトした
。全細胞溶解物及び抗ＨＡ免疫沈降を、抗Ａｐａｆ−１抗体で免疫ブロットした
。

【０１１６】 ３つの独立した実験におけるデンシトメトリによる同時沈降Ａｐａｆ−１の定
量により、アベンがＡｐａｆ−１自己会合を一貫して減少させることが証明され
た（図１４Ｂ）。

【０１１７】 図１５Ａ〜図１５Ｄは、アベンが細胞抽出物中のシトクロムｃ及びｄＡＴＰに
よるカスパーゼの活性化を阻害することを示す。緑色蛍光タンパク質との同時ト
ランスフェクションによって同定して約５０％の細胞がトランスフェクトされる
ようにトランスフェクション効率を最適化した。シトクロムｃ及びｄＡＴＰを時
間０の抽出物に添加し、内因性カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の活性化を、
それらの活性な切断産物を検出するための免疫ブロット分析によって長期間監視
した。

【０１１８】 活性化カスパーゼ−９サブユニットを産生するための内因性カスパーゼ−９の
自己プロセシングは、コントロール抽出物と比較してアベンを含む抽出物によっ
て一貫して阻害された（図１５Ａ）。同様に、アベンがカスパーゼ−３のプロセ
シングを阻害することにより、カスパーゼ−９の活性化の阻害によりカスパーゼ
が不完全になりプロカスパーゼ−３がその活性なサブユニットに切断されること
が示唆される（図１５Ｂ）。

【０１１９】 ＣＯＳ−１細胞において図１５Ａ及び図１５Ｂに記載の同一実験を行った。こ
のアッセイにおいて、アベン及びコントロールでトランスフェクトしたＣＯＳ−
１細胞由来の抽出物の調製により同一の結果が得られ、これは、アベンが内因性
カスパーゼの活性化を阻害することをさらに示す（図１５Ｃ及び図１５Ｄ）。

【０１２０】 図１６は、シンドビスウイルス感染ＣＨＯ細胞におけるアベンの保護効果を示
す。アベンによりインビトロでのＣＨＯ細胞の生存率が２０％増加した。これら
の結果は、アベンを使用して、アポトーシス誘導現象で攻撃したインビトロ細胞
培養物の生存度及び有用な寿命を増加させることができることを示す。アベンを
細胞に導入して、照射、温度、成長因子除去、糖質コルチコイド、及び多数のク
ラスの化学療法薬のようなアポトーシス誘導現象から細胞を保護することができ
る。

【０１２１】 細胞培養物の生存度の増加は、生産量の増加及び組換え発現タンパク質及び核
酸の製造費用の削減において多くの産業に利用される。例えば、アベン、又はア
ベン、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、及び他の細胞因子の組合せは、目的のタンパク質を発現す
るベクターを含む細胞系の生存度を増加させて、組換えタンパク質の回収率を増
加させることができる。回収率の増加により、新たな細胞系の樹立に関する費用
及び生存能力の低い細胞の使用に必要であるさらなる発酵が削減される。

【０１２２】 アベンをコードするポリヌクレオチド配列の存在を、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッド形成又はアベンをコードするポリヌクレオチドのフラグ
メントのプローブ又は一部分を使用する増幅によって検出することができる。核
酸増幅系のアッセイは、アベンをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含む形質転換体
を検出するためのアベンをコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチド又はオ
リゴマーの使用を包含する。本明細書中で使用する用語“オリゴヌクレオチド”
又は“オリゴマー”は、プローブ又はアンプリマとして使用することができる、
少なくとも約１０ヌクレオチドで、約６０ヌクレオチドほど、好ましくは約１５
〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列をい
う。

【０１２３】 タンパク質に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを用
いたアベン発現を検出及び測定するための種々のプロトコールは当該分野で既知
である。例として、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（Ｒ
ＩＡ）、蛍光活性化セルソータ法（ＦＡＣＳ）が含まれる。アベン上の２つの非
干渉エピトープに反応性を示すモノクローナル抗体を使用した、２部位のモノク
ローナル系の免疫アッセイが好ましいが、競合結合アッセイを使用することがで
きる。

【０１２４】 広範な種々の標識及び複合技術が当業者に既知であり、種々の核酸及びアミノ
酸アッセイに使用することができる。アベンをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための標識ハイブリッド形成又はＰＣＲプローブの産生手
段には、標識ヌクレオチドを使用したオリゴ標識、ニック翻訳、末端標識又はＰ
ＣＲ増幅が含まれる。あるいはまた、アベンをコードする配列、又はその任意の
部分を、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターにクローン化することができる。こ
のようなベクターは当該分野で既知であり、市販されており、これを使用してイ
ンビトロでのＴ７、Ｔ３、又はＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標
識ヌクレオチドの添加によってＲＮＡプローブを合成することができる。これら
の手順を、種々の市販のキット（ミシガン州カラマズー所在のＰｈａｒｍａｃｉ
ａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、及びＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｒｐ．）を使用して行うことができる。使用することができる適切な
レポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、又は発色体
並びに基質、補因子、インヒビタ、磁性粒子等が含まれる。

【０１２５】 アベンをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞を、細胞培養由
来のタンパク質の発現及び回収に適切な条件下で培養することができる。組換え
細胞によって産生されたタンパク質を、使用した配列及び／又はベクターに依存
して分泌させるか又は細胞内に含有させることができる。当業者に理解されるよ
うに、アベンをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜
又は真核細胞膜によるアベンの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計す
ることができる。

【０１２６】 他の組換え構築物を使用して、アベンをコードする配列を、溶解性タンパク質
の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結
させることができる。このような精製を容易にするドメインには、以下が含まれ
るが、これらに限定されない：固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−
トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリ
ンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニ
ティ精製系（ワシントン州シアトル所在のＩｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）で使用
されるドメイン。精製ドメインとアベンとの間の第ＸＡ因子又はエンテロキナー
ゼに特異的な配列（カリフォルニア州サンジエゴ所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
）のようなリンカー配列の封入を使用して、精製を容易にすることができる。

【０１２７】 このようなベクターの１つにより、アベンを含む融合タンパク質及びチオレド
キシン又はエンテロキナーゼ切断部位に先行する６つのヒスチジン残基をコード
する核酸の発現が得られる。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオン
アフィニティークロマトグラフィ）での精製を容易にする一方で、エンテロキナ
ーゼ切断部位により融合タンパク質からのアベンの精製手段が得られる。

【０１２８】 組換え産生に加えて、アベンのフラグメントを、固相技術を用いた直接的ペプ
チド合成によって産生することができる。タンパク質合成を、手動法又は自動法
を用いて行うことができる。自動化合成を、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて行うことができる。アベンの種々のフラグメント
を、個別に化学合成して化学的方法を用いて組み合わせて全長分子を産生させる
ことができる。

【０１２９】 アベンのＢｃｌ−ｘ_ＬとＡｐａｆ−１との相互作用に基づくと、アベンはアポ
トーシス調節の異常に関連する疾患及び障害において役割を果たすようである。
これらには、癌、自己免疫疾患、リンパ球増殖障害、アテローム性動脈硬化症、
ＡＩＤＳ、免疫不全疾患、虚血性損傷、神経変性疾患、骨粗鬆症、骨髄異形成症
候群、毒素誘導疾患、及びウイルス感染の発症が含まれる。

【０１３０】 アベンが動物モデルにおいて神経細胞アポトーシスのインヒビタとして機能す
ることが示された。シンドビスウイルスベクターから発現した場合、アベンはマ
ウスを致死的シンドビスウイルス感染から保護する。シンドビスウイルスは、ア
ベンの非存在下で中枢神経系の神経細胞を死滅させる向神経性ウイルスである。
したがって、アベンは動物における中枢神経系のウイルス感染神経細胞における
生存促進因子（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ）である。

【０１３１】 したがって、１つの実施形態では、アポトーシスの増加に関連する障害を治療
するためにアベン又はそのフラグメント若しくは誘導体を被験体に投与すること
ができる。このような病態及び疾患には、以下を包含し得るが、これらに限定さ
れない：アルツハイマー病、パーキンソン病、及び筋萎縮性側索硬化症を包含す
る神経変性疾患；再生不良性貧血のような骨髄異形成障害；脳卒中、外傷、及び
心臓発作による虚血性損傷、及びＡＩＤＳ。

【０１３２】 別の実施形態では、上記の病態を治療するために、アベン又はそのフラグメン
ト若しくは誘導体を発現することができるベクターを被験体に投与して、上記の
病態を処置することができる。

【０１３３】 別の実施形態では、癌、自己免疫疾患、及びウイルス感染のようなアポトーシ
スの減少に関連する障害を治療するために、アベンをコードする核酸配列のアン
チセンスを発現するベクターを被験体に投与することができる。このような障害
には、以下が含まれるが、これらに限定されない：脳腫瘍及び腎臓癌；乳癌、前
立腺癌、精巣癌、及び卵巣癌を包含するホルモン依存性癌；リンパ腫、白血病；
全身性紅斑性狼瘡、強皮症、及び関節炎を包含する自己免疫疾患；ヘルペス、Ｈ
ＩＶ、アデノウイルス、及びＨＴＬＶ−１関連悪性障害のようなウイルス感染症
。

【０１３４】 １つの実施形態では、上記の癌、自己免疫疾患、及びウイルス感染を治療又は
予防するために、アベンのアンタゴニスト又はインヒビターを被験体に投与する
ことができる。１つの態様では、アベンに特異的な抗体を、アンタゴニストとし
て直接使用するか、又はアベンを発現する細胞又は組織に薬物を運搬するための
標的化又は送達機構として間接的に使用することができる。

【０１３５】 他の実施形態では、上記の任意の治療薬タンパク質、アンタゴニスト、抗体、
アゴニスト、アンチセンス配列又はベクターを他の適切な治療薬と組み合わせて
投与することができる。当業者は、併用療法での使用に適切な薬剤を従来の薬学
的原理に従って選択することができる。治療薬の組み合わせは、上記種々の障害
の治療又は予防に相乗効果を示すように作用することができる。このアプローチ
を使用して、より低い各薬剤の投薬量で治療効果を得ることができるので、有害
な副作用の潜在性が減少する。

【０１３６】 アベンのアンタゴニスト又はインヒビタを、一般に当該分野で既知の方法を用
いて産生させることができる。特に、精製アベンを使用して、抗体を産生させる
か、又は薬物のライブラリーをスクリーニングしてアベンに特異的に結合する薬
物を同定することができる。

【０１３７】 当該分野でよく知られた方法を用いて抗体を作製することができる。このよう
な抗体には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ポリクローナル、モノ
クローナル、キメラ、ヒト化キメラ、自然化、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及
びＦａｂ発現ライブラリによって産生されたフラグメント。治療用途には中和抗
体が特に好ましい。

【０１３８】 抗体産生には、ヤギ、ラビット、ラット、マウス、ヒト等を包含する種々の宿
主を、アベン又は免疫原としての性質を有するその任意のフラグメント又はオリ
ゴペプチドを注射することによって免疫化することができる。宿主の種に依存し
て、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増加させることができる。
このようなアジュバントには、以下が含まれるが、これらに限定されない：フロ
イントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、及びリゾレシ
チン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホー
ルリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールのような界面活性剤。ヒト
で使用するアジュバントのうち、ＢＣＧ（ウシ弱毒結核菌）及びＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。

【０１３９】 アベンに対する抗体の誘導に使用されるペプチド、フラグメント、又はオリゴ
ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０個のア
ミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。これらは天然タンパク質
のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな、天然に生じる分子の全アミノ酸配
列を含むことができることも好ましい。アベンアミノ酸の短いストレッチを、キ
ーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のよう
な別のタンパク質のアミノ酸と融合させることができる。

【０１４０】 アベンに対するモノクローナル抗体を、細胞系の連続的培養によって抗体分子
が産生される任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術には、ハ
イブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドー
マ技術が含まれるが、これらに限定されない。

【０１４１】 さらに、“キメラ抗体”、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシ
ングの産生用に開発された技術を使用して、適切な抗原特異性及び生物活性を有
する分子を得ることができる。あるいは、一本鎖抗体の産生用に記載された技術
を当該分野で既知の方法を使用し適用して、アベン特異的一本鎖抗体を産生する
ことができる。関連する特異性を有するが、異なるイディオタイプの組成の抗体
を、無作為な免疫グロブリンの組み合わせライブラリ由来の鎖のシャフリングに
よって作製することができる。リンパ球集団におけるインビボ産生の誘導又は極
めて特異的な結合試薬の組換え免疫グロブリンライブラリ又はパネルのスクリー
ニングによって抗体を産生させることもできる。

【０１４２】 アベンの特異的結合部位を含む抗体フラグメントも作製することができる。例
えば、このようなフラグメントには、以下が含まれるが、これらに限定されない
：抗体分子のペプシン消化によって産生させることができるＦ（ａｂ’）_２フラ
グメント及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド結合の還元によって作
製することができるＦａｂフラグメント。あるいは、所望の特異性を有するモノ
クローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にするようにＦａｂ発
現ライブラリを構築することができる。

【０１４３】 スクリーニングに種々の免疫アッセイを使用して、所望の特異性を有する抗体
を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル又はモノク
ローナル抗体のいずれかを用いた競合結合又は免疫放射線アッセイ用の種々のプ
ロトコールは、当該分野でよく知られている。このような免疫アッセイは、典型
的には、アベンとその特異的抗体との間の複合体形成の測定を包含する。２つの
非干渉アベンエピトープに反応性を示すモノクローナル抗体を使用した２部位の
モノクローナル系免疫アッセイが好ましいが、競合結合アッセイを使用すること
もできる。

【０１４４】 本発明の別の実施形態では、アベンをコードするポリヌクレオチド又はその任
意のフラグメント、又はアンチセンス分子を、治療目的で使用することができる
。１つの態様では、アベンをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス
を所望の状況で使用してｍＲＮＡの転写を妨害することができる。特に、細胞を
、アベンをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で形質転換することがで
きる。したがって、アンチセンス分子を使用して、アベン活性を調整するか、又
は遺伝子機能を制御することができる。このような技術は、現在当該分野でよく
知られており、センス又はアンチセンスオリゴマー又はそれより大きなフラグメ
ントを、アベンをコードする配列のコード領域又は調節領域中の種々の位置から
設計することができる。

【０１４５】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス若しくはワクシニアウイルス又は
種々の細菌プラスミド由来の発現ベクターを、標的器官、組織、又は細胞集団へ
のヌクレオチド配列の送達に使用することができる。当業者によく知られた方法
を使用して、アベンをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なアンチセ
ンス分子を発現する組換えベクターを構築することができる。

【０１４６】 アベンをコードするポリヌクレオチド又はそのフラグメントの高レベルを発現
する発現ベクターで細胞又は組織を形質転換することによって、アベンをコード
する遺伝子を遮断することができる。このような構造物を使用して、細胞に翻訳
不可能なセンス又はアンチセンス配列を導入することができる。ＤＮＡに組み込
まれない場合でさえ、このようなベクターは内因性ヌクレアーゼによって無効に
なるまでＲＮＡ分子を転写しつづけることができる。非複製ベクターを用いて１
ヶ月以上及び適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合より長く一過
性発現を継続することができる。

【０１４７】 上述のように、アベンをコードする遺伝子の調節領域、すなわち、プロモータ
、エンハンサ、及びイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又
は他の核酸を設計することによって、遺伝子発現を改変することができる。転写
開始部位、例えば、開始部位から−１０と＋１０との間の位置由来のオリゴヌク
レオチドが好ましい。同様に、“三重らせん体”塩基対合法を用いて阻害するこ
とができる。三重らせん対合が有用である。その理由は、それが、ポリメラーゼ
、転写因子、又は調節分子の結合に十分に開く二重らせんの能力を阻害するから
である。アンチセンス分子を、転写のリボゾームへの結合を阻害することによっ
てｍＲＮＡの翻訳を妨害するように設計することもできる。

【０１４８】 リボザイム、触媒機能を持つＲＮＡ分子を使用して、ＲＮＡの特異的切断を触
媒することもできる。リボザイムの作用機構は、相補性標的ＲＮＡへのリボザイ
ム分子の配列特異的ハイブリッド形成を含み、その後エンドヌクレオチド鎖切断
が続く。使用することができる例には、アベンをコードする配列のエンドヌクレ
オチド鎖切断を特異的かつ有効に触媒することができる操作ハンマーヘッドモチ
ーフリボザイム分子が含まれる。

【０１４９】 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を、最初に以下の配
列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを包含するリボザイム切断部位についての標的
分子をスキャニングすることによって同定する。一旦同定されると、切断部位を
含む標的遺伝子の領域に対応する１５個と２０個との間のリボヌクレオチドの短
いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを操作不可能にすることができる二次構造
の特徴について評価することができる。候補標的の適合性を、リボヌクレアーゼ
保護アッセイを用いた相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成のし易さ
を試験することによって評価することもできる。

【０１５０】 本発明にかかるアンチセンス分子及びリボザイムを、当該分野で既知の任意の
核酸分子合成法によって調製することができる。これらの技術には、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチド化学合成技術が含まれる。ある
いは、アベンをコードするＤＮＡ配列のインビトロ及びインビボ転写によってＲ
ＮＡ分子を作製することができる。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰ６の
ような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する広範な種々のベクターに組
み込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的又は誘導的に合成
するこれらのｃＤＮＡ構造物を、細胞系、細胞、又は組織に移入することができ
る。

【０１５１】 細胞内での安定性及び半減期を増加させるようにＲＮＡ分子を修飾することが
できる。可能な修飾には、以下が含まれるが、これらに限定されない：分子の５
’及び／又は３’末端での隣接配列の付加又は分子の骨格内でのホスホジエステ
ラーゼ連鎖よりもむしろホスホロチオエート又は２’Ｏ−メチルの使用。これら
の全分子におけるこの概念を、イノシン、ケオシン、及びワイブトシンのような
非伝統的な塩基並びに内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないア
デニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル、メチル、チオ
、及び類似の修飾形態の封入によって拡大することができる。

【０１５２】 細胞又は組織へのベクター導入法の多くが利用可能であり、インビボ、インビ
トロ、及びエクスビボでの使用に等しく有用である。エクスビボ治療では、ベク
ターを患者から採取した幹細胞に導入して、自家移植片にクローニングによって
増殖させて、同一の患者に戻すことができる。当該分野でよく知られた方法を用
いて、トランスフェクション及びリポソームによる送達を行うことができる。

【０１５３】 上記の任意の治療法を、このような治療を必要とする任意の被験体、例えば、
イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラビット、サルのような哺乳動物、最も好ましくはヒ
トに適用することができる。広範な種々の成体組織及び細胞系においてアベンＲ
ＮＡ発現を検出したが、これはアベンが遍在性因子であることを意味する。アベ
ンホモログはマウス、ラット、及びラビットのＥＳＴデータベースで認められ、
ヒトゲノム配列決定はアベンを第１５染色体上に定める。しかし、アベンは以前
に同定されたタンパク質との有意なアミノ酸相同性を欠く。ヒトアベンがプロア
ポトーシスの向神経性シンドビスウイルスでの致死的感染からマウスを保護する
という事実もまたアベン機能が種間で保存されることを示す。

【０１５４】 本発明の更なる実施形態は、上述の任意の治療効果を得るための薬学的に許容
できるキャリアと組み合わせた薬学的組成物の投与に関する。このような薬学的
組成物は、アベン、アベンに対する抗体、模倣物、アゴニスト、アンタゴニスト
、又はアベンのインヒビタからなり得る。これらの組成物は単独か、又は少なく
とも１つの他の薬剤、例えば、安定剤化合物と組み合わせて投与することができ
、これらは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストラン、及び水が含まれる
が、これらに限定されない任意の滅菌された成体適合性薬学的キャリア中に投与
することができる。これらの組成物を、単独か、又は他の薬剤、薬物、又はホル
モンと組み合わせて患者に投与することができる。

【０１５５】 本発明で使用される薬学的組成物を、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、
髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、又は直腸手
段が含まれる任意の数の経路で投与することができるが、これらに限定されない
。

【０１５６】 有効成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用することができる
調製物への有効成分の処理を容易にする賦形剤及び助剤が含まれる適切な薬学的
に許容できるキャリアを含んでもよい。さらなる処方及び投与法についての技術
の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ（ペンシルヴェニア州イーストン所在のＭａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏ．）の最新版に見出せる。

【０１５７】 経口投与用の薬学的組成物を、経口投与に適切な投薬量の当該分野でよく知ら
れた薬学的に許容できるキャリアを使用して処方することができる。このような
キャリアにより薬学低組成物を患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプ
セル、液体、ゲル、シロップ、スラリ、懸濁液等として処方することができる。

【０１５８】 有効成分と固体賦形剤とを組み合わせ、任意選択的に得られた混合物を粉砕し
、顆粒状の混合物を処理し、所望であれば、錠剤又は糖衣錠のコアを得るために
適切な助剤を添加した後、経口用の薬学的調製物を得ることができる。適切な賦
形剤は、糖質又はタンパク質の充填剤であり、例えば、ラクトース、スクロース
、マンニトール、又はソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、イネ、
ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセ
ルロース；アラビアゴム及びトラガカントを包含するガム、並びにゼラチン及び
コラーゲンのようなタンパク質である。所望ならば、崩壊薬又は可溶化剤、例え
ば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギニン酸又はアルギニン酸ナトリウ
ムのようなその塩を添加することができる。

【０１５９】 糖衣錠のコアには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポ
ールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、
及び適切な有機溶媒、又は溶媒混合物も包含することができる濃縮糖溶液のよう
な適切なコーティングを組み合わせて使用することができる。製品の識別又は有
効成分の量、すなわち、投与量の特性づけに染料及び色素を錠剤又は糖衣錠コー
ティングに付加することができる。

【０１６０】 経口で使用することができる薬学的調製物には、ゼラチンから作製された押し
出し適合カプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールのような
コーティングから作製されたソフトカプセル、目盛りのあるカプセルが含まれる
。押し出し適合カプセルは、ラクトース又はデンプンのような充填剤又は結合剤
、タルク又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び任意選択的に安定
剤と混合した活性成分を含むことができる。ソフトカプセルでは、有効成分を、
安定剤を含むか含まない適切な液体、例えば、脂肪油、液体、又は液体ポリエチ
レングリコール中に溶解するか、又は懸濁することができる。

【０１６１】 経口投与に適切な薬学的処方物を、ハンクス溶液、リンゲル溶液又は生理学的
に緩衝化された生理食塩水のような水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝
液中で処方することができる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロース
ナトリウム、ソルビトール、又はデキストランのような懸濁液の粘度を上昇させ
る物質を含んでもよい。さらに、有効成分の懸濁液を、適切な油性注射懸濁液と
して調製することができる。適切な親油性溶媒又は賦形剤には、ゴマ油のような
脂肪油又は合成脂肪酸エステル、例えば、エチルオレエート又はトリグリセリド
、又はリポソームが含まれる。任意選択的に、懸濁液は、極度に濃縮された溶液
の調製を可能にするために化合物の安定性を向上させる適切な安定剤又は薬剤も
含んでもよい。

【０１６２】 局所又は経鼻投与用に、浸透させる特定のバリアに適切な浸透剤を処方で使用
する。このような浸透剤は、一般に当該分野で既知である。

【０１６３】 本発明の薬学的組成物を、当該分野で既知の様式、例えば、従来の混合、溶解
、粉砕、糖衣錠作製、すり潰し、乳化、カプセル化、捕捉、又は凍結乾燥で製造
することができる。

【０１６４】 薬学的組成物を塩として得ることができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、
リンゴ酸、及びコハク酸等が包含されるがこれらに限定されない、多くの酸を用
いて形成させることができる。塩は、対応する無塩基形態よりも水溶液又は他の
プロトン溶液中で溶解性を示す傾向がある。他の場合、好ましい調製物は、以下
のいずれか又は全てを含み得る使用前に緩衝液と組み合わせる凍結乾燥粉末であ
り得る：１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び２〜７％マ
ンニトール、４．５〜５．５のｐＨ範囲で、使用に先立ち緩衝液と混合する。

【０１６５】 薬学的組成物を調製した後、組成物を適切な容器に入れて示される状態の処置
のためにラベルを貼る。アベンの投与では、このような表示には、投与量、投与
頻度、及び投与法が含まれるであろう。

【０１６６】 本発明での使用に適切な薬学的組成物には、意図する目的を達成するための有
効量の有効成分を含有する組成物が包含される。有効投与量の決定は、十分に当
業者の能力の範囲内である。

【０１６７】 任意の化合物では、治療有効投与量を、最初に例えば新生物細胞の細胞培養ア
ッセイ又は動物モデル、通常、マウス、ラビット、イヌ、又はブタのいずれかで
評価することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を
決定することもできる。次に、このような情報を使用して、ヒトにおける有用な
投与量及び投薬経路を決定することができる。

【０１６８】 治療有効投与量は、症状又は病状を改善する有効成分、例えば、アベン又はそ
のフラグメント、アベンのアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビタの量を
いう。治療有効性及び毒性を、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手
順、例えば、ＥＤ_５０（集団の５０％で治療的に有効な投与量）及びＬＤ_５０（
集団の５０％で致死的な投与量）によって決定することができる。治療効果と毒
性との間の投与量比が治療指数であり、ＥＤ_５０／ＬＤ_５０比として示すことが
できる。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動
物研究から得たデータを、ヒト用の投薬量範囲の処方に使用する。このような組
成物において含まれる投薬量は、毒性がほとんど無いか全く無いＥＤ_５０を含む
循環濃度範囲内が好ましい。投薬量は、使用される投薬形態、患者の感受性、及
び投与経路に依存してこの範囲内で変化する。

【０１６９】 実施者は、治療が必要な被験体に関連する要因に照らして正確な投薬量を決定
する。投薬量及び投与を、十分なレベルの活性部分が得られるか、又は所望の効
果を維持するように調整する。考慮することができる要因には、病態の重症度、
被験体の身体全体の健康、被験体の年齢、体重、及び性別、食餌、投与時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、及び治療に対する耐性／反応性が含まれ
る。長時間作用性薬学的組成物を、特定の処方物の半減期及びクリアランス速度
に依存して、３〜４日毎、１週間毎、又は２週間に１回投与することができる。

【０１７０】 通常の投薬量は、投薬経路に依存して、約１０ｇの全投与量までで、０．１〜
１００，０００μｇで変化し得る。特定の投薬量及び送達法に関するガイダンス
は文献で得られ、当業者が一般的に利用可能である。当業者は、タンパク質又は
そのインヒビタよりもヌクレオチドについて異なる処方物を使用する。同様に、
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置等に特異
的である。

【０１７１】 別の実施形態では、アベンに特異的に結合する抗体は、アベンの発現によって
特徴づけられる病態又は疾患の診断又はアッセイに用いられ、アベン、アゴニス
ト、アンタゴニスト、又はインヒビタで処置した患者を監視することができる。
診断目的に有用な抗体は上記と同一の様式で治療用に調製することができる。ア
ベンの診断アッセイには、抗体、及びヒトの体液又は細胞若しくは組織の抽出物
中のアベンを検出するための標識を使用する方法が含まれる。修飾又は未修飾の
抗体を使用することができ、これらをレポータ分子と共有結合又は非共有結合で
の結合によって標識することができる。当該分野で既知の広範な種々のレポータ
分子を使用することができ、そのいくつかを上述する。

【０１７２】 アベンを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及びＦＡＣＳを包含する種々の
プロトコールは当該分野で既知であり、これらにより、変化しているか又は異常
なアベン発現レベルの診断の基礎が得られる。アベン発現の正常な又は標準的な
値を、複合体形成に適切な条件下での正常な哺乳動物被験体、好ましくはヒトか
ら得た体液又は細胞抽出物と、アベンに対する抗体との組み合わせによって確立
する。標準的な複合体形成の量を、種々の方法、しかしながら好ましくは光度測
定手段によって定量することができる。被験体試料、コントロール、及び生検組
織からの疾患組織中でのアベンの発現量を、標準値と比較する。標準値と被験体
の値との間の偏差により、疾患診断のパラメータを確立する。

【０１７３】 本発明の別の実施形態では、アベンをコードするポリヌクレオチドを診断に使
用することができる。使用できるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配
列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及び他の核酸が含まれる。ポリヌクレ
オチドを使用して、アベンの発現が疾患と相関し得る生検組織中の遺伝子発現を
検出及び定量することができる。診断アッセイを使用して、アベンの有無及び過
剰発現を区別し、治療介入中のアベンレベルの制御を監視することができる。

【０１７４】 １つの態様では、アベンをコードするゲノム配列を包含するポリヌクレオチド
配列、又は密接に関連する分子を検出することができるＰＣＲプローブとのハイ
ブリッド形成を使用し、アベンをコードする核酸配列を同定することができる。
プローブの特異性、プローブが極度に特異的な領域、例えば、５’調節領域中の
１０個の固有のヌクレオチドから作製されているか、又はあまり特異的ではない
領域、例えば、特に３’コード領域から作製されているかどうか、及びハイブリ
ッド形成若しくは増幅のストリンジェンシー（最大、高い、中間、又は低い）は
、プローブがアベンをコードする天然に生じる配列、対立遺伝子、又は関連配列
のみを同定するかどうかを決定する。

【０１７５】 関連配列の検出にプローブを使用することもでき、プローブは、好ましくは任
意のアベンコード配列由来の少なくとも５０％のヌクレオチドを含むべきである
。本発明にかかるハイブリッド形成プローブは、図２のヌクレオチド配列又は天
然に生じるアベンのプロモータ、エンハンサーエレメント、及びイントロンを包
含するゲノム配列からのＤＮＡ又はＲＮＡ及び誘導体であり得る。

【０１７６】 アベンをコードするＤＮＡ用の特異的ハイブリッド形成プローブの産生手段に
は、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターへのアベン又はアベン誘導体をコードす
る核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベクターは当該分野で既知で
あり、市販されており、これを使用して、適切なＲＮＡポリメラーゼ及び適切な
標識ヌクレオチドの添加によってインビトロでＲＮＡプローブを合成することが
できる。ハイブリッド形成プローブを、種々のレポータ群、例えば、^３２Ｐ、^{３ ５} Ｓのような放射性核種、又はアビジン／ビオチン結合系等を介してプローブに
結合させたアルカリホスファターゼのような酵素標識によって標識することがで
きる。

【０１７７】 アベンをコードするポリヌクレオチド配列を、アベン発現に関連する病態又は
疾患の診断に使用することができる。このような病態又は疾患の例には、脳腫瘍
及び腎臓癌；乳癌、前立腺癌、精巣癌、及び卵巣癌を包含するホルモン依存性癌
；リンパ腫、白血病；全身性紅斑性狼瘡、強皮症、及び関節炎を包含する自己免
疫疾患；ヘルペス、ＨＩＶ、アデノウイルス、及びＨＴＬＶ−１関連悪性障害の
ようなウイルス感染症；アルツハイマー病、パーキンソン病、及び筋萎縮性側索
硬化症を包含する神経変性疾患；再生不良性貧血のような骨髄異形成障害；脳卒
中、外傷、及び心臓発作による虚血性損傷；及びＡＩＤＳが含まれる。アベンを
コードするポリヌクレオチド配列を、サザン又はノーザンブロット分析若しくは
ドットブロット分析又は他のメンブラン系の技術；ＰＣＲ技術；又はアベン発現
の変化を検出するための患者の生検由来の流体又は組織を使用したディップステ
ィック、ピン、ＥＬＩＳＡ又はチップアッセイで使用することができる。このよ
うな定性又は定量法は、当該分野でよく知られている。

【０１７８】 特定の態様では、アベンをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に上
述の癌の活性化又は誘導を検出するアッセイに有用であり得る。アベンをコード
するヌクレオチド配列を標準的な方法で標識して、ハイブリッド形成複合体の形
成に適切な条件下で患者由来の流体又は組織試料に添加することができる。適切
なインキュベーション期間後、試料を洗浄して信号を定量し、標準値と比較する
。生検又は抽出試料中の信号の量が類似のコントロール試料の信号量と有意に変
化している場合、ヌクレオチド配列は、試料中のヌクレオチド配列とハイブリッ
ド形成しており、試料中のアベンをコードするヌクレオチド配列レベルの変化の
存在は、関連疾患の存在を示す。このようなアッセイを使用して、動物研究、臨
床試験、又は個々の患者の処置の監視における特定の治療計画の効果を評価する
こともできる。

【０１７９】 アベンの発現に関連する疾患の診断の基礎を得るために、発現の正常又は標準
的なプロファイルを確立する。これは、ハイブリッド形成又は増幅に適切な条件
下で、動物又はヒトのいずれかの正常な被検体から得た体液又は細胞抽出物とア
ベンをコードする配列又はそのフラグメントとを組み合わせることによって確立
することができる。標準的なハイブリッド形成を、正常な被験体から得た値と既
知の量の実質的に精製したポリヌクレオチドを使用した実験から得た値との比較
によって定量することができる。正常な試料から得た標準値を、疾患の徴候を示
す患者由来の試料から得た値と比較することができる。標準値と被検体の値との
偏差を使用して、疾患の存在を確証する。

【０１８０】 一旦疾患が確証されて、処置プロトコールが開始されると、患者の発現レベル
が通常の患者で認められるレベルに近づき始めるかどうかを評価するためにハイ
ブリッド形成アッセイを定期的に繰り返すことができる。継続的なアッセイから
得た結果を使用して、数日間〜数ヶ月間の範囲にわたる処置の効果を示すことが
できる。

【０１８１】 癌に関して、個体由来の生検組織中に存在する比較的大量の転写物は、疾患発
症の傾向を示すか、又はこれにより実際の臨床症状の出現に先立ち疾患の検出手
段を得ることができる。この型のより決定的な診断により、医療の専門家が予防
のための測定又はより速い積極的処置が行え、これにより、癌の発症又はさらな
る進行を予防することができる。

【０１８２】 アベンをコードする配列から設計したオリゴヌクレオチドの更なる診断の用途
には、ＰＣＲの使用を包含する。このようなオリゴマーを、化学合成するか、酵
素で作製するか、組換え供給源から産生することができる。好ましくは、オリゴ
マーは、２つのヌクレオチド配列、一方はセンス方向（５’→３’）及び他方は
アンチセンス方向（３’←５’）からなり、特異的遺伝子又は条件の同定用に至
適化された条件下で使用される。この同一の２つのオリゴマー、オリゴマーのネ
スト化セット、又はオリゴマーの縮重プールを、密接に関連するＤＮＡ又はＲＮ
Ａ配列の検出及び／又は定量用のあまりストリンジェントでない条件下で使用す
ることができる。

【０１８３】 アベンの発現の定量にも使用することができる方法には、放射性標識又はビオ
チン化ヌクレオチド、コントロール核酸の同時増幅、及び実験結果を挿入した検
量線が含まれる。目的のオリゴマーが種々の希釈物中に存在し、分光光度又は熱
量測定反応によって迅速に定量するＥＬＩＳＡ形式でのアッセイの実行によって
、多数のサンプルの定量速度を速めることができる。

【０１８４】 本発明の別の実施形態では、アベンをコードする核酸配列を使用して、天然に
生じるゲノム配列のマッピングに有用なハイブリッド形成プローブを作製するこ
ともできる。よく知られた技術を用いて、これらの配列を、特定の染色体又は染
色体の特異的領域に対してマッピングすることができる。このような技術には、
ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、又は人為的染色体構築、例えば、人為的な酵母染色体、人
為的細菌染色体、細菌Ｐ１構築物、又は一本鎖染色体ｃＤＮＡライブラリーが含
まれる。

【０１８５】 ＦＩＳＨは、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝子地図データと相関し
得る。物理的染色体地図上のアベンをコードする遺伝子の位置と特異的疾患、又
は特異的疾患の傾向との間の相関関係は、その遺伝病に関連するＤＮＡ領域決定
の一助となり得る。本発明にかかるヌクレオチド配列を使用して、正常な個体、
キャリア、又は罹患個体との間の遺伝子配列の相違を検出することができる。

【０１８６】 染色体調製物のインシトゥハイブリッド形成及び物理的マッピング技術、例え
ば、確立された染色体マーカーを使用した連鎖分析を、遺伝子地図の拡大のため
に使用することができる。別の哺乳動物種、例えば、マウスの染色体上での遺伝
子の配置により、特定のヒト染色体の数又はアームが未知であっても関連するマ
ーカーを明らかにすることができることが多い。物理的マッピングによって、新
規の配列を染色体アーム又はそれらの部分に割り当てることができる。これによ
り、研究者に位置クローニング又は他の遺伝子発見技術を用いた疾患遺伝子につ
いての有益な検索情報が与えられる。特定のゲノム領域への遺伝子連鎖によって
一旦疾患又は症候群がおおよそ位置付けられると、その領域に対する任意の配列
マッピングによりさらなる調査用の関連又は調節遺伝子を示すことができる。本
発明にかかるヌクレオチド配列を使用して、正常な個体、キャリア、又は罹患個
体の間の転座、逆位等による染色体位置の相違を検出することもできる。

【０１８７】 本発明の別の実施形態では、アベン、その触媒性若しくは免疫原性フラグメン
ト又はオリゴペプチドを、任意の種々の薬物スクリーニング技術において化合物
のライブラリをスクリーニングするのに使用することができる。このようなスク
リーニングで使用するフラグメントは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に
固定されているか、細胞表面上に存在するか、細胞内に存在し得る。アベンと試
験される薬剤との間の複合体の結合形式を、評価することができる。

【０１８８】 使用することができる別の薬物スクリーニング技術により、目的のタンパク質
への適切な結合親和性を有する化合物の高処理スクリーニングが得られる。この
方法では、アベンに適用されるように、多数の異なる小さな試験化合物を、プラ
スチック製のピン又はいくつかの他の表面のような固体基質上で合成する。試験
化合物をアベン又はそのフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで、結合した
アベンを、当該分野でよく知られた方法によって検出する。精製したアベンを上
述の薬物スクリーニング技術で使用するためにプレート上に直接コーティングす
ることもできる。あるいは、非中和抗体を使用して、固体支持体上にペプチドを
捕獲して固定することができる。

【０１８９】 別の実施形態では、アベンに特異的に結合することができる中和抗体がアベン
結合について試験化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを使用す
ることができる。この様式では、抗体を使用して、アベンと１以上の抗原決定基
を共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。

【０１９０】 更なる実施形態では、新規の技術が現在既知の、トリプレット遺伝コード及び
特異的塩基対相互作用のような性質が含まれるが、これらに限定されないヌクレ
オチド配列の性質に依存する場合、アベンをコードするヌクレオチド配列を、す
でに開発されている任意の分子生物学技術で使用することができる。

【０１９１】 特定の問題又は環境への本発明の技術の適用は、本明細書中に含まれる教示に
照らして、当業者の能力の範囲内である。本発明の産物及び工程の例を、以下の
実施例で示す。

【０１９２】 例１ ｃＤＮＡライブラリの構築 ｃＤＮＡライブラリをラジ細胞から構築する。凍結細胞を、Ｂｒｉｎｋｍａｎ
ｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ−３０００（ニュージャ
ージー州ウエストベリー所在のＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社
）を用いてグアニジンイソチオシアネート溶液中でホモジナイズして溶解させる
。溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−７０Ｍ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ＬＯＣＡＴＩＯＮ）においてＢ
ｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ロータを用いて５．７ＭのＣｓＣｌクッション上で周囲
温度、２５，０００ｒｐｍで１８時間遠心分離した。ＲＮＡを、酸性フェノール
ｐＨ４．７で抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容量のエタノールで沈
殿させ、無ＲＮアーゼ水中に再懸濁し、３７℃でＤＮアーゼで処理する。次いで
、ｍＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＯＬＩＧＯＴＥＸキット（カリフォルニア州チャッ
ツワース所在のＱＩＡＧＥＮ、ＩＮｃ．）を用いて単離し、これを使用してｃＤ
ＮＡライブラリを構築する。

【０１９３】 ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌ
ａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１８２４８−０１３、Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ社）の推奨プロトコールに従ってｍＲＮＡを取扱う。新規のプラスミドを以
下の手順で構築する。市販のプラスミドＰＳＰＯＲＴＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社
）を、Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素（マサチューセッツ州ベヴァリィ所在のＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化し、プラスミドの突出末端をクレノウ
酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）及び２’−デオキシヌクレ
オチド−５’トリホスフェート（ｄＮＴＰ）で満たし、中間プラスミドを自己連
結させ、細菌宿主、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９に形質転換させる。

【０１９４】 この中間プラスミドの定量物を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化し、突出末端をクレノウ及びｄＮＴＰで満た
し、配列５’．．．ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ．．．３’の１０量体リンカーをリン
酸化し、平滑末端に連結する。連結反応の産物をＥｃｏＲＩで消化し、自己連結
させる。ＪＭ１０９宿主細胞への形質転換後、ｐＩＮＣＹと命名したプラスミド
を単離し、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素を用いてｃＤＮＡの組み込み能力に
ついて試験する。

【０１９５】 ｃＤＮＡをＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂカラム（カタログ番号２７５１０５
−０１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ社）で分画し、４００ｂｐを超える
ｃＤＮＡをｐＩＮＣＹ Ｉに連結する。次いでプラスミドｐＩＮＣＹ ＩをＤＨ
５αＴＭ受容細胞（カタログ番号１８２５８−０１２、Ｇｂｃｏ ＢＲＬ社）に
形質転換させる。

【０１９６】 例２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡを細胞から放出させ、ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６Ｐｌａｓｍ
ｉｄキット（カタログ番号２６１７３、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．）を用いて精製
する。以下の変更以外は推奨されるプロトコールを使用する。１）細菌を２５ｍ
ｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを含む１ｍｌの滅菌Ｔｅｒ
ｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（カタログ番号２２７１１、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬ
ＯＧＩＥＳ^ＴＭ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）中で培養する。２
）インキュベーション後、培養物を１９時間インキュベーションし、インキュベ
ーション終了時に、細胞を０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解する。３）イソプロパ
ノール沈殿後、プラスミドＤＮＡペレットを０．１ｍｌの蒸留水中に再懸濁する
。プロトコールの最終工程後、試料を９６ウェルブロックに移して４℃で保存す
る。

【０１９７】 ｃＤＮＡを、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒｓ ＰＴＣ２０
０（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓを組み合わせたＨａｍ
ｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ社）を用いたサ
ンガー法によって配列決定し、読み枠を決定する。

【０１９８】 例３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索 各ｃＤＮＡをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社によって開発され、Ｉ
ＮＨＥＲＩＴ^ＴＭ６７０配列分析システムに組み込んだ検索アルゴリズムを用い
てＧｅｎＢａｎｋ中の配列と比較する。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｅｒｎ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ（パターン特定化言語、カリフ
ォルニア州ロサンゼルス所在のＴＲＷ Ｉｎｃ．）を使用して、相同性領域を同
定する。どのように配列比較を行うかを決定する３つのパラメータは、ウインド
ウサイズ、ウインドウオフセット、及びエラー耐性である。これらの３パラメー
タの比較を使用して、ＤＮＡデータベースを、検索配列に対する相同性領域を含
む配列について検索し、初期値を用いて適切な配列を記録する。その後、偶然の
一致と相同性領域を区別するために、これらの相同性領域を、ドットマトリクス
相同性プロットを用いて試験する。スミス−ウォーターマンアラインメント使用
して、相同性検索の結果を表示する。

【０１９９】 ＤＮＡ配列の相同性で使用するものと類似の方法を用いたＩＮＨＥＲＩＴ^ＴＭ ６７０配列分析システムを用いて、ペプチド及びタンパク質配列相同性を確認す
る。パターン特定化言語及びパラメータウインドウを使用して、初期値を用いて
記録した相同性領域を含む配列について、タンパク質データベースを検索する。
有意な相同性の領域と偶然の一致とを区別するために、ドットマトリクス相同性
プロットを試験する。

【０２００】 ＢＬＡＳＴを使用して、局所配列アラインメントを検索する。配列類似性を決
定するために、ＢＬＡＳＴによりヌクレオチド及びアミノ酸双方の配列を整列さ
せる。アラインメントの局所的性質により、ＢＬＡＳＴは正確な一致の決定又は
ホモログの同定に特に有用である。ＢＬＡＳＴは、ギャップを含まない一致に対
して有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏ
ｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ＨＳＰ）である。

【０２０１】 ＨＳＰは、そのアラインメントが局所的に最大であり、アラインメントスコア
がユーザによって設定された閾値又はカットオフスコアセットを満たすか超える
、任意であるが等しい長さの２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴアプ
ローチは、検索配列とデータベース配列との間のＨＳＰを検索し、見出された任
意の統計的有意性を評価し、及びユーザーが選択した有意性の閾値を満たすそれ
らの一致のみを報告する。パラメータＥは、データベース配列の一致を報告する
ための統計学的に有意な閾値を確立する。Ｅは、全データベース検索の状況内で
のＨＳＰ（又はＨＳＰのセット）の偶然の発生の推定頻度の上限として解釈され
る。一致がＥを満たす任意のデータベース配列が、プログラム出力で報告される
。

【０２０２】 例４ ノーザンブロット分析 ノーザンブロット分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために使用される
実験室での技術であり、これは、特定の細胞種又は組織からのＲＮＡが結合して
いる膜への標識ヌクレオチド配列のハイブリッド形成を含む。

【０２０３】 ＢＬＡＳＴを用いた類似のコンピュータ技術を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ又は
ＬＩＦＥＳＥＱ^ＴＭデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌｓ、ＬＯＣＡＴＩＯＮ）のようなヌクレオチドデータベース中での同一又は関
連分子について検索する。この分析は、多数の膜系のハイブリッド形成よりも非
常に迅速である。さらに、任意の特定の一致が正確か又は相同かで類別されるか
どうかを決定するために、コンピュータ検索の感度を改変することができる。検
索の基本は、（配列同一性％×最大ＢＬＡＳＴスコア％）／１００として定義さ
れる産物スコアである。

【０２０４】 産物スコアは、２つの配列間の類似度及び一致配列の長さの両方を考慮する。
例えば、産物スコアが４０の場合、一致は１〜２％の誤差内で正確であり、７０
の場合、一致は正確である。相同分子を、通常、１５と４０との間の産物スコア
を示す分子の選択によって同定するが、より低いスコアで関連分子を同定するこ
とができる。

【０２０５】 ノーザンブロット分析の結果を、アベンをコードする転写物が生じるライブラ
リのリストとして報告する。発生量及び発生量％も報告する。発生量は、特定の
転写がｃＤＮＡライブラリ中に示される回数を直接反映し、発生量％は発生量を
ｃＤＮＡライブラリ中で試験した全配列数で割ったものである。

【０２０６】 例５ アベンコードポリヌクレオチドの全長又は回収調節配列への伸長 全長アベンコード核酸配列（図２）を使用して、部分的ヌクレオチド配列の全
長配列への伸長のためのものか、又は５’又は３’、イントロン又はゲノムライ
ブラリ由来の他の調節配列の獲得のためのオリゴヌクレオチドプライマを設計す
る。一方のプライマをアンチセンス方向（ＸＬＲ）で伸長を開始するように合成
し、他方をセンス方向（ＸＬＦ）で配列を伸長するように合成する。プライマを
使用して、既知の配列の“外向き”への伸長を容易にし、目的の領域について新
しい、未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを作製する。ＯＬＩＧＯ ４
．０６（ミシガン州プリマス所在のＮａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社
）又は別の適切なプログラムを使用して、ｃＤＮＡから、２２〜３０ヌクレオチ
ド長で、５０％以上のＧＣ含量を有し、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニ
ーリングする初期プライマを設計する。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ二
量体化されるヌクレオチドの任意のストレッチを回避する。

【０２０７】 元のライブラリ、選択されたｃＤＮＡライブラリ、又はヒトゲノムライブラリ
を使用して、配列を伸長する。後者は、５’上流領域を得るのに最も有用である
。より大量の伸長が必要であるか所望する場合、既知の領域をさらに伸長させる
ように更なるプライマのセットを設計する。

【０２０８】 以下のＸＬ−ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）の指示に従って、
酵素及び反応混合物を完全に混合し、非常に忠実に増幅を行う。４０ピコモルの
各プライマ及びキットの他の全ての成分の推奨濃縮物を用いて開始して、Ｐｅｌ
ｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ２００及び以下のパラメータ
を使用してＰＣＲを行う。 工程１ ９４℃で１分間（最初の変性） 工程２ ６５℃で１分間 工程３ ６８℃で６分間 工程４ ９４℃で１５秒間 工程５ ６５℃で１分間 工程６ ６８℃で７分間 工程７ 工程４〜６を更に１５サイクル繰り返す 工程８ ９４℃で１５秒間 工程９ ６５℃で１分間 工程１０ ６８℃で７：１５分間 工程１１ 工程８〜１０を１２サイクル繰り返す 工程１２ ７２℃で８分間 工程１３ ４℃（及び保持）

【０２０９】 反応が配列を伸長しているかどうかを決定するために、５〜１０μｌの一部の
反応混合物を、低濃度（約０．６〜０．８％）のアガロースミニゲルでの電気泳
動によって分析する。最も大きな産物を含むと考えられるバンドを選択し、ゲル
から取り出す。さらなる精製は、ＱＩＡＱＵＩＣＫ^ＴＭ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ
．）のような市販のゲル抽出法の使用を包含する。ＤＮＡの回収後、クレノウ酵
素を使用して、一本鎖のヌクレオチド突出を切り取り、再連結及びクローニング
を容易にする平滑末端を作製する。

【０２１０】 エタノール沈殿後、産物を１３μｌの連結反応緩衝液中に再溶解し、１μｌの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を添加し、この混合物を室温で２〜３時間か１６℃で一昼夜インキュベーション
する。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適切な培地中）を３μｌの連
結反応混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地中で培養する。３７℃
で１時間のインキュベーション後、すべての形質転換混合物を、２×Ｃａｒｂを
含むＬＢ寒天上に平板培養する。翌日、各プレートからいくつかのコロニーを無
作為に取り出し、適切な市場で入手可能な滅菌９６ウェルマイクロタイタープレ
ートの各ウェル中に入れた１５０μｌの液体ＬＢ／２×Ｃａｒｂ中で培養する。
翌日、５μｌの各一昼夜培養物を非滅菌９６ウェルプレートに移し、水で１：１
０に希釈した後、５μｌの各試料をＰＣＲアレイに移す。

【０２１１】 ＰＣＲ増幅用に、伸長反応に使用する４単位のｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ
、ベクタープライマ、及び一方又は両方の遺伝子特異的プライマを含む１８μｌ
の濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３×）を各ウェルに添加する。以下の条件を用い
て増幅を行う。 工程１ ９４℃で６０秒間 工程２ ９４℃で２０秒間 工程３ ５５℃で３０秒間 工程４ ７２℃で９０秒間 工程５ 工程２〜４を更に２９サイクル繰り返す 工程６ ７２℃で１８０秒間 工程７ ４℃（及び保持）

【０２１２】 ＰＣＲ反応物の一部を、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で動かす。Ｐ
ＣＲ産物の寸法を、元の部分的ｃＤＮＡと比較し、適切なクローンを選択し、プ
ラスミドに連結し、配列決定する。

【０２１３】 例６ ハイブリッド形成プローブの標識及び使用 図２に示すヌクレオチド配列由来のハイブリッド形成プローブを使用して、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対から
なるオリゴヌクレオチドの標識を特に記載するが、本質的に同一の手順をより大
きなｃＤＮＡフラグメントを用いて使用する。ＯＬＩＧＯ ４．０６（Ｎａｔｉ
ｏｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）のような最新版のソフトウェアを使用して
、５０ｐｍｏｌの各オリゴマー及び２５０μＣｉのγ−^５２Ｐアデノシン三リン
酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）及びＮＥＮ^ＴＭＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（マサ
チューセッツ州ボストン所在のＤｕＰｏｎｔ社）との組み合わせによって標識し
たオリゴヌクレオチドを設計する。標識化オリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤ
ＥＸ Ｇ−２５超微粒子樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ社
）で実質的に精製する。各センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０^７ カウント／分を含む部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（ＡｓｅＩ、ＢｇｌＩＩ
、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ、又はＰｖｕＩＩ；ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ^{Ｔ Ｍ} ）の１つで消化したヒトゲノムＤＮＡの典型的なメンブラン系のハイブリッド
形成分析で使用する。

【０２１４】 各消化物由来のＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画し、ＮＹＴＲＡＮ
ＰＬＵＳナイロン膜（ニューハンプシャー州ダラム所在のＳｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）に移す。４０℃で１６時間ハイブリッド形成を行う
。非特異的信号を取り除くために、ブロットを、室温での０．１×生理食塩水ク
エン酸ナトリウム及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの漸増的ストリンジ
ェント条件下、連続的に洗浄する。ＸＯＭＡＴ ＡＲ^ＴＭフィルム（ニューヨー
ク州ロチェスター所在のＫｏｄａｋ社）をブロットに暴露するか、又はブロット
をＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒカセット（カリフォルニア州サニーバレ所在のＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｎａｍｉｃｓ社）に数時間暴露した後、ハイブリッド形成
パターンを目視によって比較する。

【０２１５】 例７ アンチセンス分子 アベンコード配列、又はその任意の部分に対するアンチセンス分子を使用して
、天然に存在するアベンのインビボ又はインビトロ発現を抑制する。約２０塩基
対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を特に記載しているが、本質的
に同一の手順をより大きなｃＤＮＡフラグメントに使用する。図２に示すような
、アベンのコード配列に基づいたオリゴヌクレオチドを使用して、天然に生じる
アベンの発現を抑制する。図２に記載のような最も特異な５’配列から相補的オ
リゴヌクレオチドを設計し、これを使用して上流の非翻訳配列へのプロモータの
結合の防止によって転写を抑制するか、又はリボゾームの結合阻害によってアベ
ンコード転写物の翻訳を抑制する。図２のシグナル配列及び５’配列の適切な部
分を使用すれば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ポリペプチドの
シグナル配列又は５’コード配列に翻訳される領域にわたる任意の１５〜２０個
のヌクレオチドが含まれる。

【０２１６】 例８ アベンの発現 適切なベクターへのｃＤＮＡのサブクローニング及び宿主細胞へのベクターの
形質転換によって、アベンの発現を行う。この場合、またｃＤＮＡライブラリの
作製に使用されるクローニングベクター、ＰＳＰＯＲＴを使用してＥ．ｃｏｌｉ
中でアベンを発現する。クローニング部位の上流で、このベクターはβガラクト
シダーゼのプロモータ、その後にアミノ末端Ｍｅｔ、その後に７つのβガラクト
シダーゼ残基を含む配列を包含する。これらの８個の残基の直後には、転写に有
用なバクテリオファージプロモータ及び多数の固有の制限部位を含むリンカーが
存在する。

【０２１７】 単離した、標準的な方法を使用してＩＰＴＧで形質転換した細菌株の誘導によ
り、第１のβガラクトシダーゼの８個の残基、約５〜１５個の残基のリンカー、
及び全長タンパク質が産生される。シグナル残基は、後の活性のアッセイで直接
使用することができる細菌増殖培地にアベンを分泌させる。

【０２１８】 例９ アベン活性の例示 アベンの活性は、顕微鏡用スライド上に播種し、以下のプラスミドで一過性に
トランスフェクトしたＢＨＫ細胞においてアッセイすることができる：アベンを
コードする核酸配列を含むプラスミド、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α、アポ
トーシスを引き起こす）及びβガラクトシダーゼを縦列に配置したコード配列を
含むプラスミド。１２時間後に細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌを含む緩衝液中でイン
キュベーションしてβガラクトシダーゼ活性を視覚化する。位相差顕微鏡又は干
渉対比顕微鏡を使用して、スライドを試験する。ＴＮＦ−αを有するプラスミド
のみを発現する細胞は縮んだ核を示し、強い青色を呈し、膜が小疱を形成する。
両プラスミドを発現する細胞は、ほぼ正常な核であり、強い青色を呈し、ほぼ正
常な膜であり、小疱を形成しない。

【０２１９】 例１０ アベン特異的抗体の産生 ＰＡＧＥ電気泳動又は他の精製技術を使用して実質的に精製されたアベンを用
い、標準的な方法を用いてラビットを免疫化して抗体を産生させる。図２から推
定されるアミノ酸配列を、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎ
ｃ．）を用いて分析して、高免疫原性領域を同定し、対応するオリゴポリペプチ
ドを合成し、これを使用した当業者に既知の手段によって抗体を惹起させる。そ
の時Ｃ末端又は親水性領域付近のエピトープであり得る適切なエピトープの選択
が好ましい。

【０２２０】 典型的には、オリゴペプチドは、１５残基の長さであり、ｆｍｏｃ化学を用い
たＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを使用して合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）との反応によってキーホール
リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ
社）に結合する。ラビットをフロイント完全アジュバント中のオリゴペプチド−
ＫＬＨ複合体を用いて免疫化する。得られた抗血清の 抗ペプチド活性について、例えば、ペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳ
Ａでブロックし、ラビット抗血清と反応させ、洗浄し、放射ヨウ素標識したヤギ
抗ラビットＩｇＧｔｏ反応させることによって試験する。

【０２２１】 例１１ 特異的抗体を使用した天然に生じるアベンの精製 天然に生じるアベンか又は組換えアベンを、アベンに特異的な抗体を用いた免
疫親和性クロマトグラフィによって実質的に精製する。アベン抗体のＣｎＢｒ活
性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ社）のような
活性化クロマトグラフィ用樹脂にアベンを共有結合させることによって免疫親和
性カラムを構築する。結合後、樹脂を、製造者の指示に従ってブロックして洗浄
する。

【０２２２】 アベンを含む培地を免疫親和性カラムに通し、カラムを、アベンを有利に吸着
する条件下（例えば、界面活性剤の存在下での高いイオン強度の緩衝液）で洗浄
する。カラムを、抗体／アベン結合を破壊する条件下（例えば、ｐＨ２〜３、又
は高濃度の尿素又はチオシアネートイオンのようなカオトロープ）で溶出し、ア
ベンを収集する。

【０２２３】 例１２ アベンと相互作用する分子の同定 アベン又はその生物学的に活性なフラグメントを、^１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−
Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する。マルチウェルプレートのウェルに予め配置した候
補分子を、標識したアベンとインキュベーションし、洗浄し、及び標識したアベ
ンの複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のアベンを使用し
て得たデータを用いて候補分子を有するアベンの数、親和性、及び会合について
の値を計算する。

【０２２４】 アベンと相互作用する分子の他の同定法には、ウェスタンブロッティング、免
疫沈降、同時免疫沈降、ワンハイブリッド系、及びツーハイブリッド系が含まれ
る。適切なワンハイブリッド系には、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を検出するＭ
ＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
社）が含まれ、適切なツーハイブリッド系には、酵母におけるタンパク質−タン
パク質相互作用検出用のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ＬｅｘＡ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉ
ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ＧＡＬ４
Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、並びに哺乳動
物細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用検出用の哺乳動物ＭＡＴＣＨＭ
ＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）が包含
される。

【０２２５】 例１３ インビボでのシンドビスウイルス感染及び神経細胞アポトーシスに対するアベン
誘導保護 ３日齢のＣＤ−１マウスを、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）をコードするコントロールシンドビスウイルス又はＨＡ−アベ
ンをコードするシンドビスウイルスでの脳内注射によってインキュベーションし
、２１日間監視した。群当り４０匹のマウスからなる群についての生存率を、図
１１に示すように求めた。データは、アベンがインビボで神経細胞アポトーシス
に対して保護効果を有することを示した。

【０２２６】 例１４ インビトロでのアベンで安定にトランスフェクトした細胞の生存度 アベンで安定にトランスフェクトしたＦＬ５．１２細胞の生存度を、ＩＬ−３
欠乏培地中での再懸濁後の種々の時間間隔でのトリパンブルー排除によって決定
した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。データを収集し、アベンがＩＬ−３除去によっ
て誘導されたアポトーシスに対する耐性を増加させることを示した。

【０２２７】 例１５ アベンでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞の生存度 トランスフェクトされた細胞を記録するために、ＢＨＫ細胞を、表示の構築物
＋ＧＡＬプラスミドを用いてトランスフェクトした（図１３）。全ての細胞が等
量のＤＮＡを得られるように空のベクターを誘導した。図１３に示すように、生
存率を、視覚可能なブルー細胞の割合として決定した。データは、アベンがＢｃ
ｌ−ｘＬの抗アポトーシス活性を増加させることを示した。

【０２２８】 例１６ 宿主細胞系における組換えタンパク質発現量の増加 宿主細胞系を、誘導プロモータの調節下で、アベン又はアベンの生物学的に活
性なフラグメントを発現することができるベクターで安定にトランスフェクトし
た。目的の組換えタンパク質を発現することができる第２のベクターを、アベン
ベクターで安定にトランスフェクトした細胞系（“アベン細胞系”）に導入する
。第２のベクターによってコードされる組換えタンパク質を、アベン細胞系中で
発現させて、収集する。

【０２２９】 例１７ アベンによるＡｐａｆ−１の自己会合の抑制 ＣＥＤ−３及びＣＥＤ−４相同性ドメインを含むＡｐａｆ−１（ＨＡ−Ａｐａ
ｆ−１−３＋４）のＮ末端４５５アミノ酸を発現する構造物を、アベンを含むか
含まない全長Ａｐａｆ−１で同時トランスフェクトした（図１４Ａ）。図１４Ａ
に記載のように同時免疫沈降したＡｐａｆ−１を、オートラジオグラフの濃度測
定によって定量し、相対単位を示した（図１４Ｂ）。

【０２３０】 例１８ 細胞抽出物中のシトクロムｃ及びｄＡＴＰによるカスパーゼの活性化のアベンに
よる抑制 アベン又はベクターのみでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から抽出物を調
製し、内因性カスパーゼ−９（パネルＣ）又は内因性カスパーゼ−３（パネルＤ
）について免疫ブロット分析を行うのに先立ち、種々の時間間隔でｄＡＴＰとイ
ンキュベーションした（図１５Ａ〜図１５Ｄ）。プロ形態及び切断産物を矢印で
示す。

【０２３１】 例１９ アベンによるＣＨＯ細胞の生存度の増加 アベン、アベン−リバース、ＣＡＴ、及びモックコントロールを、ＣＨＯ細胞
中で安定に発現させた。アベンは、インビトロでＣＨＯ細胞の生存度を約２０％
増加させる（図１６）。

【０２３２】 例２０ アベンによるＢｃｌ−２ファミリーメンバーとの相互作用 酵母のツーハイブリッド及び同時免疫沈降分析をＣＯＳ−１細胞溶解物に対し
て行ったところ、アベンの他のＢｃｌ−２ファミリーメンバーとの相互作用能力
が示された。トランスフェクションに含まれる構造物を、（＋）で示す（図６、
図７、及び図８）。免疫沈降抗体（上）及び免疫ブロッティング抗体（端）を示
す（図７及び図８）。

【０２３３】 例２１ アベン及びＡｐａｆ−１の相互作用 Ａｐａｆ−１及びアベンを、Ｂｃｌ−ｘＬの存在下又は非存在下で、ＨＡ−ア
ベン又はＨＡ−ΔＮ７３アベンと共にＣＯＳ−１細胞に同時トランスフェクトし
た。すべての細胞溶解物又は抗ＨＡ免疫沈降物を、表示の抗体で免疫ブロットし
た。トランスフェクト及び非トランスフェクト細胞の双方における内因性Ｂｃｌ
−ｘＬを、抗Ｂｃｌ−ｘＬ抗体を用いて検出した（図９Ａ）。

【０２３４】 細胞の溶解物及び抗アベン−ｂ免疫沈降物を、ＨＡ−Ａｐａｆ−１及びＨＡ−
ｗｔ−又はΔＮ７３−アベンと共に同時トランスフェクトし、抗ＨＡ抗体を用い
て免疫ブロットした（図９Ｂ）。

【０２３５】 ヒーラ細胞抽出物を、免疫前又は免疫後アベン−ａ抗血清を用いて免疫沈降さ
せ、Ａｐａｆ−１に対するポリクローナル抗体（Ｘ．Ｗａｎｇから得た）を用い
て免疫ブロットした（図９Ｄ）。

【０２３６】 ２９３Ｔ細胞抽出物を、免疫前又は免疫後アベン−ｂ抗血清で免疫沈降させ、
Ａｐａｆ−１に対するモノクローナル抗体（Ｙ．Ｌａｚｅｂｎｉｋから得た）を
用いて免疫ブロットした（図９Ｅ）。

【０２３７】 例２２ Ｂｃｌ−ｘＬと無関係なアベンによるＡｐａｆ−１との相互作用 上記の例２１に記載のトランスフェクト細胞に対して同時免疫沈降実験を行っ
た（図９Ｆ〜図９Ｊ）。データは、アベンがＢｃｌ−ｘＬと無関係にＡｐａｆ−
１と相互作用することを示した。

【０２３８】 上記の明細書中に記載の全ての刊行物及び特許書類は、本明細書中で参考とし
て援用される。上記の記載、図面、及び実施例は、本発明の目的、特徴、及び利
点を達成するための好ましい実施形態の例示のみを目的としている。本発明は例
示の実施形態に制限されることを意図しない。本明細書の特許請求の範囲の精神
及び範囲内で行われる本発明の任意の修正形態は、本発明の一部と考えるべきで
ある。

【０２３９】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> HARDWICK, J. MARIE CHENG, EMILY H. Y. CHAU, B. NELSON <120> A NOVEL INHIBITOR OF PROGRAMMED CELL DEATH <130> J5450.0016/P016 <140> 09/512,346 <141> 2000-02-24 <150> 60/122,104 <151> 1999-02-26 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1566 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (53)..(1138) <220> <221> modified_base <222> (1533)..(1534) <223> a, t, c, g, other or unknown <400> 1 gggcgtctcc gcagctcggc tcccgcgcgc tcagcaccac cagcggcgcc ag atg cag 58 Met Gln 1 gcg gag cga gga gct cgg gga ggc cgt ggg cgg cgg cca ggc cgc ggc 106 Ala Glu Arg Gly Ala Arg Gly Gly Arg Gly Arg Arg Pro Gly Arg Gly 5 10 15 cgg cct ggc gga gat cgc cac agc gag cgg ccc gga gcc gca gcg gcg 154 Arg Pro Gly Gly Asp Arg His Ser Glu Arg Pro Gly Ala Ala Ala Ala 20 25 30 gta gcc aga ggc ggc ggc gga ggc ggc ggc ggg gac gga ggc gga cgc 202 Val Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Arg 35 40 45 50 cgg ggc cgt ggc cgt ggc cgg ggc ttc cgc ggc gct cgc gga ggc cga 250 Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Phe Arg Gly Ala Arg Gly Gly Arg 55 60 65 gga gga gga ggc gcc ccg cga ggc agc cgc cgg gag ccg gga ggc tgg 298 Gly Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Ser Arg Arg Glu Pro Gly Gly Trp 70 75 80 ggc gca ggg gcc agc gcg ccg gtt gaa gat gac agc gat gca gag acc 346 Gly Ala Gly Ala Ser Ala Pro Val Glu Asp Asp Ser Asp Ala Glu Thr 85 90 95 tat gga gaa gag aat gat gaa cag gga aat tat tct aaa aga aag att 394 Tyr Gly Glu Glu Asn Asp Glu Gln Gly Asn Tyr Ser Lys Arg Lys Ile 100 105 110 gtc tct aac tgg gat cga tat caa gat att gaa aaa gag gtc aat aat 442 Val Ser Asn Trp Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Glu Lys Glu Val Asn Asn 115 120 125 130 gaa agt gga gag tca cag agg gga aca gat ttc agt gtc ctc ctt agc 490 Glu Ser Gly Glu Ser Gln Arg Gly Thr Asp Phe Ser Val Leu Leu Ser 135 140 145 tct gca ggg gac tca ttc tca cag ttc cgg ttt gct gag gag aaa gaa 538 Ser Ala Gly Asp Ser Phe Ser Gln Phe Arg Phe Ala Glu Glu Lys Glu 150 155 160 tgg gat agt gaa gct tct tgt cca aaa cag aat tca gca ttt tat gtg 586 Trp Asp Ser Glu Ala Ser Cys Pro Lys Gln Asn Ser Ala Phe Tyr Val 165 170 175 gat agt gag tta ttg gtt cga gcc ctt caa gag ctg cct ctc tgc ctc 634 Asp Ser Glu Leu Leu Val Arg Ala Leu Gln Glu Leu Pro Leu Cys Leu 180 185 190 cga ctc aac gtt gct gcc gaa ctg gtc cag ggt aca gtt cct tta gag 682 Arg Leu Asn Val Ala Ala Glu Leu Val Gln Gly Thr Val Pro Leu Glu 195 200 205 210 gtt cct cag gtg aaa cca aag aga act gat gat ggc aag gga tta ggg 730 Val Pro Gln Val Lys Pro Lys Arg Thr Asp Asp Gly Lys Gly Leu Gly 215 220 225 atg cag tta aag ggg ccc ttg ggg cct gga gga agg ggg ccc atc ttt 778 Met Gln Leu Lys Gly Pro Leu Gly Pro Gly Gly Arg Gly Pro Ile Phe 230 235 240 gag ctg aaa tct gtg gct gct ggc tgc cct gtg ttg ctg ggc aaa gac 826 Glu Leu Lys Ser Val Ala Ala Gly Cys Pro Val Leu Leu Gly Lys Asp 245 250 255 aac cca agc ccg ggt cct tca agg gat tct cag aaa ccc act tcc cca 874 Asn Pro Ser Pro Gly Pro Ser Arg Asp Ser Gln Lys Pro Thr Ser Pro 260 265 270 ctg cag tca gca gga gac cat ttg gaa gaa gaa cta gat ctg ttg ctt 922 Leu Gln Ser Ala Gly Asp His Leu Glu Glu Glu Leu Asp Leu Leu Leu 275 280 285 290 aat tta gat gca cct ata aaa gag gga gat aac atc tta cca gat cag 970 Asn Leu Asp Ala Pro Ile Lys Glu Gly Asp Asn Ile Leu Pro Asp Gln 295 300 305 acg tct cag gac ctg aaa tcc aag gaa gat ggg gag gtg gtc caa gag 1018 Thr Ser Gln Asp Leu Lys Ser Lys Glu Asp Gly Glu Val Val Gln Glu 310 315 320 gaa gaa gtt tgt gca aaa cca tct gtg act gaa gaa aaa aac atg gaa 1066 Glu Glu Val Cys Ala Lys Pro Ser Val Thr Glu Glu Lys Asn Met Glu 325 330 335 cct gag caa cca agt acc tcc aaa aat gtt acc gag gaa gag ctg gaa 1114 Pro Glu Gln Pro Ser Thr Ser Lys Asn Val Thr Glu Glu Glu Leu Glu 340 345 350 gac tgg ttg gac agc atg att tcc taaaaagggg gaaaaaagtg cctgaagcaa 1168 Asp Trp Leu Asp Ser Met Ile Ser 355 360 atcttggttg ccttctaacg gcaggtgggc ataaggctgt ccttcaggac cagccagttt 1228 acaagcatgt ctcaagctag tgtgttccat tatgctcaca gcagtaaatg cctacctctg 1288 tgtttgacat ctgaaagaat acattgaagc agcttgttgc atttgttttt ctggcttagt 1348 aatctaatag atttccttaa gggcaggaga tagactctgg cccttgtttc tagcctcctt 1408 ccttgcagtg tttacaacat agccagtgtt tacagcatag cagatgctgc tgctggttaa 1468 gagaatagat gcaaacaagg catgcatttg gccaaaataa acaaatgctg gtctgtccaa 1528 aaaannaaaa aaaaaaaaaa aggccttcgt ggcctcga 1566 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Ala Glu Arg Gly Ala Arg Gly Gly Arg Gly Arg Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Arg Pro Gly Gly Asp Arg His Ser Glu Arg Pro Gly Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Val Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly 35 40 45 Gly Arg Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Phe Arg Gly Ala Arg Gly 50 55 60 Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Ser Arg Arg Glu Pro Gly 65 70 75 80 Gly Trp Gly Ala Gly Ala Ser Ala Pro Val Glu Asp Asp Ser Asp Ala 85 90 95 Glu Thr Tyr Gly Glu Glu Asn Asp Glu Gln Gly Asn Tyr Ser Lys Arg 100 105 110 Lys Ile Val Ser Asn Trp Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Glu Lys Glu Val 115 120 125 Asn Asn Glu Ser Gly Glu Ser Gln Arg Gly Thr Asp Phe Ser Val Leu 130 135 140 Leu Ser Ser Ala Gly Asp Ser Phe Ser Gln Phe Arg Phe Ala Glu Glu 145 150 155 160 Lys Glu Trp Asp Ser Glu Ala Ser Cys Pro Lys Gln Asn Ser Ala Phe 165 170 175 Tyr Val Asp Ser Glu Leu Leu Val Arg Ala Leu Gln Glu Leu Pro Leu 180 185 190 Cys Leu Arg Leu Asn Val Ala Ala Glu Leu Val Gln Gly Thr Val Pro 195 200 205 Leu Glu Val Pro Gln Val Lys Pro Lys Arg Thr Asp Asp Gly Lys Gly 210 215 220 Leu Gly Met Gln Leu Lys Gly Pro Leu Gly Pro Gly Gly Arg Gly Pro 225 230 235 240 Ile Phe Glu Leu Lys Ser Val Ala Ala Gly Cys Pro Val Leu Leu Gly 245 250 255 Lys Asp Asn Pro Ser Pro Gly Pro Ser Arg Asp Ser Gln Lys Pro Thr 260 265 270 Ser Pro Leu Gln Ser Ala Gly Asp His Leu Glu Glu Glu Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Leu Asn Leu Asp Ala Pro Ile Lys Glu Gly Asp Asn Ile Leu Pro 290 295 300 Asp Gln Thr Ser Gln Asp Leu Lys Ser Lys Glu Asp Gly Glu Val Val 305 310 315 320 Gln Glu Glu Glu Val Cys Ala Lys Pro Ser Val Thr Glu Glu Lys Asn 325 330 335 Met Glu Pro Glu Gln Pro Ser Thr Ser Lys Asn Val Thr Glu Glu Glu 340 345 350 Leu Glu Asp Trp Leu Asp Ser Met Ile Ser 355 360 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker <400> 3 cggaattccg 10

【図面の簡単な説明】

【図１】 アベンのアミノ酸配列を示す図である。

【図２】 アベン遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。

【図３】 広範な種々の組織におけるアベンの発現を例示する多組織ノーザンブ
ロットを示す図である。

【図４】 異なる細胞系のノーザンブロットを示す図である。

【図５】 ポリクローナル抗ペプチド抗体を用いたラジ細胞溶解物からの内因性
アベンの探索を例示するウェスタンブロット分析を示す図である。アベンの大部
分は、細胞質の細胞画分に局在している。

【図６】 アベンと種々の異なるＢｃｌ−２ファミリーメンバー及びＢｃｌ−ｘ _Ｌ 変異体との間の相互作用を示す図である。

【図７】 ７Ａは、アベンがプロアポトーシスタンパク質（ΔＮ ６１Ｂｃｌ−
ｘ_Ｌ）と相互作用しないことを示す同時免疫沈降分析を示す図である。７Ｂは、
アベンとＢｃｌ−２ファミリーメンバーとの相互作用を示す図である。

【図８】 ８Ａは、アベンが機能的なＢｃｌ−ｘ_Ｌと相互作用することを示す同
時免疫沈降分析を示す図である。８Ｂは、アベンとＢｃｌ−２ファミリーメンバ
ーとの相互作用を示す図である。

【図９】 ９Ａ〜Ｅは、アベンとＡｐａｆ−１との間の相互作用を示す図である
。 ９Ｆ〜Ｊは、アベンとＡｐａｆ−１との間の相互作用がＢｃｌ−ｘＬと無関係
であることを示す図である。

【図１０】 （ａ）〜（ｃ）は、３つの異なる細胞系におけるカスパーゼ−９と
Ａｐａｆ−１との同時トランスフェクションによって誘導されたアポトーシスの
百分率を示す棒グラフである。アベンの添加により、アポトーシスが阻害された
。図１０（ｃ）は、アベンの存在下又は非存在下での類似の量のＡｐａｆ−１及
びカスパーゼ−９が発現されたことを示すＢＨＫ細胞溶解物のウェスタンブロッ
トも含まれる。

【図１１】 マウスにおけるシンドビスウイルス感染及び神経アポトーシスに対
するアベンのインビボでの保護効果を示す図である。

【図１２】 １２Ａ及び１２Ｂは、アベンを安定に発現する収集したＦＬ５．１
２細胞におけるＩＬ−３除去によって誘導されたアポトーシスに対する耐性の増
加を示す図である。

【図１３】 アベンがＢＨＫ細胞におけるＢｃｌ−ｘＬの抗アポトーシス活性を
２０〜３０％増加させることを示す図である。

【図１４】 １４Ａ及び１４Ｂは、アベンがＡｐａｆ−１の自己会合を抑制する
ことを示す図である。

【図１５】 １５Ａ〜Ｄは、アベンが内因性カスパーゼの活性化を抑制すること
を示す図である。

【図１６】 シンドビスウイルスに感染したＣＨＯ細胞におけるアベンの保護効
果を示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年９月６日（２００１．９．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 5/00 ４Ｃ０８６ 48/00 7/00 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 5/00 9/00 ４Ｈ０４５ 7/00 17/00 9/00 19/02 17/00 25/16 19/02 25/28 25/16 31/12 25/28 31/16 31/12 31/18 31/16 31/22 31/18 35/00 31/22 35/02 35/00 37/00 35/02 41/00 37/00 43/00 １０５ 41/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/46 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/46 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エミリー エイチ−ワイ チェン アメリカ合衆国 ミズーリ州 63112 セ ントルイス ウォーターマン ブルーヴァ ード 5583 ビー (72)発明者 ネルソン ショー ビー アメリカ合衆国 メリーランド州 21211 ボルティモア フォール ブリッジ ド ライヴ 4404 ナンバー エイチ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA61 CA04 DA02 DA03 DA06 EA04 GA11 HA11 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ08 QQ43 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR51 QR55 QR56 QS33 QS34 QS36 QX07 4B065 AA26X AA90X AA91X AA93X AA93Y AB01 BA02 CA23 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA18 NA14 ZA011 ZA021 ZA151 ZA161 ZA361 ZA511 ZA891 ZA961 ZA971 ZB011 ZB051 ZB071 ZB211 ZB261 ZB271 ZB331 ZC371 ZC551 4C085 AA13 AA16 BB11 CC03 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA02 ZA15 ZA16 ZA36 ZA51 ZA89 ZA96 ZA97 ZB01 ZB05 ZB07 ZB21 ZB26 ZB27 ZB33 ZC37 ZC55 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA01 ZA02 ZA15 ZA16 ZA36 ZA51 ZA89 ZA96 ZA97 ZB01 ZB05 ZB07 ZB21 ZB26 ZB27 ZB33 ZC37 ZC55 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 CA40 DA75 DA76 EA28 EA50 FA74

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図１（配列番号 ）のアミノ酸配列を含む、実質的に精製され
   たタンパク質。
2. 【請求項２】 図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグ
   メントを含む、分離アミノ酸化合物。
3. 【請求項３】 前記フラグメントが（配列番号 ）のアミノ酸７１〜１０８を
   含む、請求項２記載の分離アミノ酸化合物。
4. 【請求項４】 前記フラグメントが（配列番号 ）のアミノ酸７４〜１０４を
   含む、請求項２記載の分離アミノ酸化合物。
5. 【請求項５】 前記フラグメントが（配列番号 ）のアミノ酸２８９〜３６２
   を含む、請求項２記載の分離アミノ酸化合物。
6. 【請求項６】 請求項２記載の分離アミノ酸化合物及び薬学的に許容できるキャ
   リアを含む、組成物。
7. 【請求項７】 請求項３記載の分離アミノ酸化合物及び薬学的に許容できるキャ
   リアを含む、組成物。
8. 【請求項８】 請求項４記載の分離アミノ酸化合物及び薬学的に許容できるキャ
   リアを含む、組成物。
9. 【請求項９】 請求項５記載の分離アミノ酸化合物及び薬学的に許容できるキャ
   リアを含む、組成物。
10. 【請求項１０】 請求項２記載の化合物に結合し得る、抗体。
11. 【請求項１１】 前記抗体がキメラ抗体である、請求項１０記載の抗体。
12. 【請求項１２】 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１０記載の抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１記載のタンパク質をコードする、ＤＮＡ配列。
14. 【請求項１４】 請求項２記載の分離アミノ酸化合物をコードする、ＤＮＡ配列
    。
15. 【請求項１５】 前記ＤＮＡが少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され
    ている、請求項１４記載のＤＮＡ配列。
16. 【請求項１６】 請求項１４記載のＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む、
    アンチセンスヌクレオチド配列。
17. 【請求項１７】 前記アンチセンスヌクレオチド配列が少なくとも１つの調節配
    列に作動可能に連結されている、請求項１６記載のアンチセンスヌクレオチド配
    列。
18. 【請求項１８】 請求項１５記載のＤＮＡを含むベクターであって、前記ベクタ
    ーが前記ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現し得る、ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１６記載のアンチセンスヌクレオチド配列を含むベクタ
    ーであって、前記ベクターが前記アンチセンスヌクレオチド配列によってコード
    されるポリヌクレオチド配列を発現し得る、ベクター。
20. 【請求項２０】 請求項２記載の分離アミノ酸化合物をコードするＤＮＡ配列を
    含むベクターで形質転換された宿主細胞であって、前記宿主細胞が前記ベクター
    のＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現し得る、宿主細胞。
21. 【請求項２１】 請求項２記載の分離アミノ酸化合物をコードするＤＮＡ配列を
    含むベクターで安定に形質転換された宿主細胞であって、前記宿主細胞が前記ベ
    クターのＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現し得る、宿主細胞。
22. 【請求項２２】 請求項２記載の分離アミノ酸化合物をコードするＤＮＡ配列に
    相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された宿主細
    胞であって、前記宿主細胞が前記ベクターのＤＮＡによってコードされるポリヌ
    クレオチド配列を発現し得る、宿主細胞。
23. 【請求項２３】 請求項２記載の分離アミノ酸化合物を細胞に導入する工程を含
    む、アポトーシスの抑制方法。
24. 【請求項２４】 請求項６記載の組成物を動物に投与する工程を含む、動物細胞
    におけるアポトーシスの抑制方法。
25. 【請求項２５】 請求項２記載の分離アミノ酸化合物をアポトーシス調節タンパ
    ク質と細胞内で接触させる工程を含む、細胞におけるアポトーシスの抑制方法。
26. 【請求項２６】 図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラ
    グメントを抗アポトーシスタンパク質と細胞内で接触させる工程を含む、細胞に
    おけるアポトーシスの抑制方法。
27. 【請求項２７】 図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラ
    グメントのアンタゴニストを細胞内に導入する工程を含む、細胞におけるアポト
    ーシスの促進方法。
28. 【請求項２８】 請求項１０記載の抗体を細胞内に導入する工程を含む、細胞に
    おけるアポトーシスの促進方法。
29. 【請求項２９】 請求項１６記載のアンチセンスヌクレオチド配列を細胞内に導
    入する工程を含む、細胞におけるアポトーシスの促進方法。
30. 【請求項３０】 図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラ
    グメントを動物に投与する工程を含む、動物における神経細胞アポトーシスの抑
    制方法。
31. 【請求項３１】 図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラ
    グメントを含む分離アミノ酸化合物を細胞培養物に導入する工程を含む、細胞培
    養物における細胞の生存度の向上方法。
32. 【請求項３２】 図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラ
    グメントを含むベクターを宿主細胞系に導入する工程、組換えタンパク質を発現
    し得る第２のベクターを前記宿主細胞系に導入する工程、及び前記組換えタンパ
    ク質の収量が向上するように前記分離アミノ酸化合物及び前記組換えタンパク質
    を発現させる工程を含む、宿主細胞系からの組換えタンパク質の発現率の向上方
    法。
33. 【請求項３３】 前記組換えタンパク質が抗体である、請求項３２記載の方法。
34. 【請求項３４】 生物学的に活性なフラグメントを動物に投与する工程を含む、
    図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントに対する
    抗体の作製方法。
35. 【請求項３５】 請求項１０記載の抗体を生物学的に活性なフラグメントを含む
    と考えられる生体試料と接触させる工程を含む、図１（配列番号 ）のアミノ
    酸配列の生物学的に活性なフラグメントの存在の検出方法。
36. 【請求項３６】 核酸プローブを生物学的に活性なフラグメントをコードする核
    酸配列とハイブリッド形成させる工程を含む、図１（配列番号 ）のアミノ酸
    配列の生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸の検出方法。
37. 【請求項３７】 請求項１４記載のＤＮＡをハイブリッド形成プローブと接触さ
    せる工程を含む、図１（配列番号 ）のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラ
    グメントをコードするポリヌクレオチド配列の存在の検出方法。
38. 【請求項３８】 請求項１８記載のベクターを動物に投与する工程を含む、動物
    におけるアポトーシスの抑制方法。
39. 【請求項３９】 前記ベクターをトランスフェクションによって投与する、請求
    項３８記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記ベクターをリポソーム注射によって投与する、請求項３８
    記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記ベクターをエクスビボ治療によって投与する、請求項３８
    記載の方法。
42. 【請求項４２】 請求項１９記載のベクターを動物に投与する工程を含む、動物
    におけるアポトーシスの増加方法。
43. 【請求項４３】 前記ベクターをトランスフェクションによって投与する、請求
    項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記ベクターをリポソーム注射によって投与する、請求項４２
    記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記ベクターをエクスビボ治療によって投与する、請求項４２
    記載の方法。