KR20060083227A

KR20060083227A - 고지혈증·고알부민혈증 모델 동물

Info

Publication number: KR20060083227A
Application number: KR1020067008816A
Authority: KR
Inventors: 마사요시 야마구치
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2006-07-20
Also published as: JPWO2005041648A1; US20070079391A1; WO2005041648A1; KR20070117002A; KR20070118199A; EP1688035A1

Abstract

고지혈증이나 고알부민혈증의 예방·치료약의 개발에 유용하며, 특히 노령(노화)기(인간에게 있어서는 중고년)에 고지혈증이나 고알부민혈증을 발증하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물을 제공하는 것이다. 레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 쥐(호모체)를 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 증상을 나타내는 노령(노화)기, 예를 들면 생후 36주까지 사육하는 것에 의해, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물을 얻는다. 이 모델 동물은, 혈청알부민, HDL-콜레스테롤 및 트리글리세리드의 농도가 의미있고 현저하게 상승하며 또한 뼈병태(오스테오파시)도 나타낸다.

트랜스제닉 레규칼신 쥐, 고지혈증, 고알부민혈증

Description

고지혈증·고알부민혈증 모델 동물{HYPERLIPEMIA/HYPERALBUMINEMIA MODEL ANIMAL}

본 발명은 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물, 바람직하게는 노령(노화)기까지 사육한 레규칼신 과잉발현 트랜스제닉 비인간 동물인 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물, 이와 같은 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물을 사용하는 고지혈증 및/또는 고알부민 혈증의 예방·치료약의 스크리닝방법 등에 관한 것이다.

펩티드호르몬이 세포막의 수용체에 결합하고, 세포내에 그 정보를 전달하는 구조 중에, Ca²⁺는 주역의 역할을 담당하고 있다. 세포내에는 Ca²⁺를 결합하는 많은 단백질이 존재하나, 그 작용을 증폭시키는 단백질로서, 칼모듈린은 중요한 역할을 담당하고 있으며, Ca²⁺는 이 칼모듈린에 결합하고, 세포기능의 조절에 관여하는 각종 효소를 활성화한다는 것이 해명되어 있다(Science, 202, 19-27, 1984). 또, Ca²⁺가 프로테인키나아제C나 그 밖의 Ca²⁺결합 단백질(효소도 포함)에 작용한다는 것도 알려져 있다(Science, 233, 305-312, 1986). 레규칼신도, 본 발명자들에 의해 쥐(rat)의 간세포질로부터 단리된 Ca²⁺결합 단백질이다.

레규칼신은, 분자량이 33388의 Ca²⁺결합 단백질이며, 그 Ca²⁺결합정수가 4.19×10⁵M^-1을 나타내고, 6~7개의 고친화성 Ca²⁺결합부위를 가지며, α-헬릭스구조를 34% 포함하는 간장에 현저하게 존재하는 등전점(等電点) pI5.20의 산성단백질이다. 레규칼신은 칼모듈린이나 그 외의 많은 Ca²⁺결합단백질에 보이는 부위 EF핸드구조(영역)를 포함하지 않는 특이한 단백질로서, 예를 들면, Ca²⁺를 결합하는 것에 의해, 칼모듈린은 α-헬릭스함량이 증가하고, 그 구조가 견고해지나, 레규칼신은 α-헬릭스함량이 감소한다. 또 한편, 세포기능의 조절에 있어서, 레규칼신은, 칼모듈린에 의한 효소활성화를 저해하고, 프로테인키나아제C의 활성화도 저해한다는 것이 명백해졌다. 이와 같이, 레규칼신은, 시그널링의 제어 단백질로서 기능하는 등 많은 지견이 축적되어 있다(FEBS Lett, 327, 251-255, 1993).

레규칼신유전자는 쥐에 있어서 X염색체(Xq 11.1-12)에 존재하고, 인간에 있어서도 X염색체에 위치한다. 레규칼신유전자는, 쥐나 인간 외에 원숭이, 마우스, 개, 소, 토끼, 닭 등의 고등동물에서 발견되고 있으나, 효모에는 없고, 고도로 분화된 단백질을 코드하는 것이라고 여겨지고 있다. 레규칼신cDNA는 클로닝되어 있으며, 그 전체 구조도 결정되어 있다(일본국 특개평7-123985호 공보). 쥐의 간의 레규칼신cDNA는, 전체 아미노산을 코드하는 염기쌍이 0.897kb이며, 299의 아미노산을 번역한다. 또, 마우스의 간이나 인간의 간의 레규칼신cDNA의 염기배열도 결정되어 있으며, 쥐의 간의 레규칼신cDNA와 비교하여 각각 94%와 약 89%의 호몰로지를 가지고 있다. 레규칼신mRNA의 발현은, 인간, 쥐, 마우스, 소, 닭 등의 간장에서 발견되며, 이들 간장에는 레규칼신단백질의 존재도 확인되고 있다.

레규칼신은, 다기능성을 갖는 세포내 Ca²⁺시그널링의 제어 단백질로서 특징을 갖는 단백질이며, 세포기능의 조절에 관여하는 중요한 단백질이라는 것이 알려져 있다(Life Sciences 66, 1769-1780, 2000, Biochemical and Biophysical Research Communications 276, 1-6, 2000). 또, 생체내에 있어서의 간장이나 신장에 있어서의 레규칼신의 발현이 간 장해(Molecular and Cellular Biochemisty 131, 173-179, 1994)나, 신장 장해(Molecular and Cellular Biochemisty 151, 55-60, 1995) 시에 저하된다는 것이 동물실험에 의해 명백해져 있으며, 레규칼신과 병태성인(病態成因)과의 관련이 시사되어 있다. 그리고, GOT, GPT 등의 기존의 간기능 마커와 달리 간장에 특이적으로 존재하는 레규칼신의 혈청 중의 농도를 측정하는 것에 의해, 간질환 환자의 혈청을 감별하는 방법, 즉, 간질환 환자의 혈청에서는 레규칼신이 의미있게 상승하고 있는 한편, 건강한 사람의 혈청에서는 레규칼신은 거의 검출되지 않았고, 그 측정이 간질환 환자의 혈청의 감별수단으로서 유용하다는 것도 알려져 있다(일본국 특개평10-26623호 공보).

상기와 같이, 레규칼신 단백질은, 간장에 특이발현되는 것 외에, 신장, 심장, 대뇌(신경세포)에도 낮은 수준으로 발현되고, 세포내의 Ca²⁺시그널링 관련세포의 기능에 관여하며, 그 발현이 저하되면 생리적 이상을 초래하는 특이한 다기능성 단백질이며, 지금까지 쥐의 간장으로부터 단리한 단백질이나 항레규칼신 모노클로날항체를 사용하여, 그 기능해석이 실시되며, 상기의 칼슘시그널의 제어인자로서의 역할 외에, 세포내 칼슘 수송효소의 조절과 프로테아제의 활성화인자로서의 열할과, 세포핵의 칼슘수송의 조절, 세포핵 DNA분해에 있어서의 역할, 간이 재생할 때의 세포핵 기능에 있어서의 역할 등의 세포핵 기능의 조절과, 신뇨세관 칼슘 재흡수에 있어서의 역할 등, 많은 생체조절에 있어서의 레규칼신의 기능적 역할이 본 발명자에 의해 명백하게 되어 있다.

본 발명자는, 레규칼신의 여러가지 기능적 역할의 해명에 대한 연구과정에서 레규칼신이 다른 수많은 Ca²⁺결합 단백질과는 다른 특이적 작용을 갖는 점에 착안하여 칼슘이 관여하는 각종 세포의 기능조절은, 생체내에 있어서의 레규칼신의 발현량과 칼모듈린을 비롯한 다른 수많은 Ca²⁺결합 단백질의 발현량과의 균형에 의해 성립하고 있다고 생각하여, 레규칼신의 발현량과 다른 수많은 Ca²⁺결합 단백질의 발현량과의 균형이 깨진 경우에, 생체에 발생하는 변화·영향을 트랜스제닉 쥐를 제작하여 조사하였다. 쥐의 간장cDNA라이브러리로부터 레규칼신cDNA를 클로닝하고, 레규칼신단백질의 전장(全長)을 코드하는 cDNA를 단리하여, 이 쥐의 레규칼신 전장 cDNA로부터 ORF를 잘라내고, 발현 벡터(pCXN2)에 도입하여 이 유전자 발현 벡터를 쥐의 수정란 웅성전핵(雄性前核)에 마이크로인젝션하고, 이 수정란을 가친(假親) 쥐의 난관에 이식하여 새끼쥐를 발생시켜서 그 새끼쥐의 조직으로부터 DNA를 추출하고, PCR법에 의해 레규칼신 cDNA가 함유되어 있는 쥐를 확인한 결과, 29마리의 새끼쥐로부터 레규칼신 cDNA를 발현하는 호모체의 쥐 5마리(숫컷 4마리, 암컷 1마리)가 작출되고, 이와 같은 트랜스제닉 쥐의 체중의 증가가 의미있게 억제되는 것과, 외견상 어떠한 뼈병태(osteopathy)를 나타내고 있지 않은 상기 레규칼신유전자 도입에 의해 레규칼신 과잉발현능을 획득한 형질전환 쥐에 대하여, 우연히 동물연구용 pQTC(peripheral Quantitative Computed Tomography) 골밀도 측정장치에 의한 뼈의 형태학적(골밀도, 골강도, 골간부 피질골의 두께, 피질골의 주위의 길이) 측정평가, 및 골성분의 생화학적(칼슘량, 골아세포·조골세포의 마커 효소인 알칼리 포스파타아제 활성, 골조직 중의 세포수 지표인 DNA량) 측정평가를 실시한 결과, 특히 대퇴골에 있어서 형태학적으로도, 생화학적으로도, 골량, 골밀도의 감소에 의한 골흡수(골염용해)에 의한 골조직의 취약화, 뼈형태의 변화, 및 꼬리뼈 성장지연 등의 현저한 뼈병태를 나타내는 것이나, 이 레규칼신 과잉발현병태 모델 쥐의 형질이 계대적(繼代的)으로 안정되어 있으며, 상업적 생산에 견딜 수 있다는 것을 보고하고 있다(일본국 특개 2003-164238호 공보).

다른 한편, 고지혈증은, 혈청중의 콜레스테롤이나 트리글리세라이드 등의 지질(脂質)농도가 높게 된 병태를 말하며, 동맥경화, 고혈압, 뇌졸중 등 순환기계 질환의 발증과 밀접한 관계가 있다. 또, 고알부민혈증은 간장에서 합성되는 혈청 중의 알부민농도가 높아진 병태를 말하며, 여러가지 간장의 질환에 관계한다. 상기 고지혈증의 모델 동물에 관한 기술로서, 인간 소상사구체 경화증의 동물 모델로서 유용한 고지혈증 쥐(K.Yamasaki and Y. Yoshikawa저 Laboratory Animal Science A4(2), 1994, 125-130)이나, 외래성 25-수산화비타민D₃24-수산화효소유전자를 조합시킨 DNA를 갖는 신장질환, 골질환, 관절질환, 폐질환, 고지혈증, 동맥경화증, 심장질환, 당뇨병, 비만증, 소화기질환, 감염증, 알레르기질환, 내분비질환, 치매증, 암 등의 비타민D₃ 대사이상으로 기인하는 질환을 나타내는 비(非)인간 포유동물(일본국 특개 평11-9140호 공보)이나, LDL(low density lipoproteins)리셉터 유전자가 불활성화된 비인간 포유동물의 배간세포를 사용하여 얻을 수 있는 고지혈증 치료의 모델에 유용한 병체 모델 동물(일본국 특개 평10-56915호 공보)이나, 당뇨병(NIDDM)쥐(ZDF/Gmi-fa/fa;일본 찰스·리바), SDF(Spontaneously Diabetic Torii)쥐(토리이야쿠힝), WHHL토끼(키타야마라베스/오리엔탈코보)가 알려져 있다.

본 발명의 과제는, 최근의 생활양식의 변화에 따라 급증하고 있는 고지혈증이나 고알부민혈증의 예방·치료약의 개발에 유용한 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물, 특히 노령(노화)기(인간에 있어서는 중고령)에 고지혈증이나 고알부민혈증을 발증하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이나, 이와 같은 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물을 사용하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 예방·치료약의 스크리닝방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명자가 이미 개발한 레규칼신을 과잉발현한 트랜스제닉 쥐는 생후 5주의 성장기에 있어서 골다공증을 일으키고, 그 모델 동물로서의 유용성이 평가되어 이미 출시되어 있다. 이와 같은 레규칼신 트렌스제닉 쥐를 노령(노화)기(인간에 있어서는 중고령)까지 사육하고, 생체기능의 변용에 대하여 조사해 보았다. 노화(생 후 36주)(생후 9개월)에 있어서 쥐를 해부한 결과, 성장기 쥐에 있어서 지금까지 알려져 있던 골량감소와 혈청무기인 농도상승에 추가하여, 새롭게 혈청알부민, HDL-콜레스테롤 및 트리글리세리드의 농도가 의미있고 현저하게 상승하고 있다는 것을 발견하고, 레규칼신 트랜스제닉 쥐는 노화기에 있어서 고알부민혈증 및 고지혈증을 초래한다는 것이 명백해졌다. 혈청알부민, HDL-콜레스테롤 및 트리글리세리드는 간장으로부터 산생방출되기 때문에, 노화기 레규칼신 트랜스제닉 쥐에 있어서는, 간장의 병태를 초래하고 있는 것으로 생각되었다. 실제로, 쥐의 해부시에는, 정상 쥐의 간장과 비교하여, 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 간장에 있어서는, 지방간 양상의 상태를 나타내는 것이 관찰되었다.

그 후, 생후 14, 25, 36, 50주의 트랜스제닉 쥐를 사용하여 고지혈증·고알부민혈증의 발현에 있어서의 노화에 의한 변동에 대하여 조사하였다. 그 결과, 혈청중의 지질(유리지방산, 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤, 유리콜레스테롤)의 농도가 암컷 쥐의 생후 14주부터 높은 수치를 나타내는 것이 발견되었으며, 생후 50주(생후 1년)에서는 현저하다는 것이 명백해졌다. 또 한편, 혈청중 알부민의 농도는 암컷 쥐에 있어서 생후 25주의 것부터 높은 수치를 나타낸다는 것이 명백해졌다.

본 발명은 이들 지견에 기초하여 완성하기에 이른 것이다.

즉, 본 발명은, (1) 레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 비인간 동물로 이루어지는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이나, (2) 트랜스제닉 비인간 동물을 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 증상을 나타내는 노령(노화)기까지 사육하는 것에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이나, (3) 트랜스제닉 비인간 동물(암컷)을, 고알부민혈증의 증상을 나타낼 때까지 사육하는 것에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이나, (4) 비인간 동물이 노령(노화)기에 있어서 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이나, (5) 호모체인 것을 특징으로 하는 상기(1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이나, (6) 비인간 동물이 쥐인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물에 관한 것이다.

또, 본 발명은, (7) 노령(노화)기가, 생후 36주~50주인 것을 특징으로 하는 상기 (6)에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이나, (8) 레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 비인간 동물을 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 모델 동물로서 사용하는 방법이나, (9) 트랜스제닉 비인간 동물을 노령(노화)기까지 사육하여, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 모델 동물로서 사용하는 상기 (8)에 기재된 방법이나, (10) 트랜스제닉 비인간 동물(암컷)을 고알부민혈증의 증상을 나타낼 때까지 사육하여 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 모델동물로서 사용하는 상기 (8)에 기재된 방법이나, (11) 상기 비인간 동물이, 노령(노화)기에 있어서 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 상기 (8)~(10) 중 어느 하나에 기재된 방법이나, (12) 호모체인 것을 특징으로 하는 상기 (8)~(11) 중 어느 하나에 기재된 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (13) 비인간 동물이 쥐인 것을 특징으로 하는 상기 (8)~(12) 중 어느 하나에 기재된 방법이나, (14) 노령(노화)기가, 생후 36주~50주인 것을 특징으로 하는 상기 (13)에 기재된 방법이나, (15) 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물에 피검물질을 투여하여, 혈중의 지질 및/또는 알부민의 양을 측정·평가하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 치료약의 스크리닝방법이나, (16) 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 증상을 나타내는 노령(노화)기에 이르기까지 피검물질을 투여하여 노령(노화)기 이후에 있어서의 혈중의 지질 및/또는 알부민의 양을 측정·평가하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 예방약의 스크리닝방법에 관한 것이다.

도1은, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 칼슘의 측정결과를 나타내는 도면.

도2는, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 무기인의 측정결과를 나타내는 도면.

도3은, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 아연의 측정결과를 나타내는 도면.

도4는, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 글루코스의 측정결과를 나타내는 도면.

도5는, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 트리글리세리드의 측정결과를 나타내는 도면.

도6은, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 HDL-콜레스테롤의 측정결과를 나타내는 도면.

도7은, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 알부민의 측정결과를 나타내는 도면.

도8은, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 체중의 측정결과를 나타내는 도면.

도9는, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 대퇴골의 골간부와 골간단부의 칼슘의 양의 측정결과를 나타내는 도면.

도10은, 본 발명의 생후 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 대퇴골의 골간부와 골간단부의 DNA양(세포수의 지표)의 측정결과를 나타내는 도면.

도11은, 본 발명의 생후 14, 25, 36주 및 50주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 유리지방산의 측정결과를 나타내는 도면.

도12는, 본 발명의 생후 14, 25, 36주 및 50주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 트리글리세리드의 측정결과를 나타내는 도면.

도13은, 본 발명의 생후 14, 25, 36주 및 50주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 HDL-콜레스테롤의 측정결과를 나타내는 도면.

도14는, 본 발명의 생후 14, 25, 36주 및 50주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 유리콜레스테롤의 측정결과를 나타내는 도면.

도15는, 본 발명의 생후 14, 25, 36주 및 50주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 혈청 알부민의 측정결과를 나타내는 도면.

본 발명의 모델 동물로서는, 레규칼신유전가가 도입되어 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 비인간 동물로 이루어지는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델 동물이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 또, 본 발명의 방법으로서는, 레규칼신유전자가 도입되어 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 비인간 동물을, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 모델동물로서 사용하는 방법이라면 특별히 제한되지 않으며, 여기서, 레규칼신을 과잉발현한다는 것은, 야생형의 비인간 동물의 레규칼신발현량에 비하여 의미있게 다량의 레규칼신을 발현하는 것을 말한다. 또, 상기 비인간 동물로서는, 쥐(rat), 마우스, 소, 돼지, 닭, 개구리, 인간, 개, 토끼 등을 들 수가 있으나, 그 중에서도 쥐가 바람직하다. 모델 동물로서 자주 사용되고 있는 마우스에서는 장기가 작아서 병태를 해석하는 데에 한계가 있기도 하지만, 예를 들면, 혈압측정 등 쥐에 있어서는 이것이 가능해지며, 병태해명이나 유전자 치료를 위한 동물실험적 수단으로서 극히 유용해진다.

상기 트랜스제닉 비인간 동물로서는, 예를 들면, 사이토메가로바이러스-IE 인핸서, 치킨β-액틴 프로모터, 레규칼신유전자, 토끼β-글로빈폴리A시그널의 순으로 배열된 직쇄DNA가 도입된 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있다. 예를 들면, 마커유전자, 사이토메가로바이러스-IE인핸서, 치킨β-액틴 프로모터, cDNA삽입사이토, 토끼β-글로빈폴리A시그널 등을 갖는 발현벡터(pCXN2)에 레규칼신 전장(全長)cDNA를 도입한 것을 사용하면, 효율적으로 트랜스제닉 비인간동물을 얻을 수가 있다.

또, 상기 트랜스제닉 비인간동물의 바람직한 양태로서, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 증상을 나타내는 노령(노화)기까지 사육하는 것에 의해 얻을 수가 있는 트랜스제닉 비인간동물이나, 고알부민혈증의 증상을 나타낼 때까지 사육하는 것에 의해 얻을 수 있는 암컷 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있으며, 또, 레규칼신유전자가, 서열표의 서열번호 2에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자인 트랜스제닉 비인간동물, 특히, 서열표의 서열번호2에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자가, 서열표의 서열번호 1에 기재된 DNA배열로 이루어지는 쥐 레규칼신유전자인 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있으나, 레규칼신유전자의 유래로서는, 쥐 외에, 마우스, 소, 돼지, 닭, 개구리, 인간, 개, 토끼 등 특별히 제한되는 것은 아니다.

또, 상기 트랜스제닉 비인간동물의 바람직한 양태로서, 호모체인 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있다. 이와 같은 변이염색체를 호모에 갖는 호모체는, 염색체를 헤테로에 갖는 쥐 등의 비인간동물끼리를 교배하는 것에 의해 얻을 수가 있고, 레규칼신발현량이 헤테로체 보다도 많기 때문에, 실험모델동물로서 특히 적당하다.

또, 상기 트랜스제닉 비인간동물로서, 노령(노화)기에 있어서, 고지혈증 및/ 또는 고알부민혈증의 증상에 추가하여, 뼈병태를 나타내는 비인간동물이 바람직하고, 여기서 뼈병태란, 골다공증으로 대표되는 칼슘 뼈(골)대사이상 등에 의해 골량의 감소, 뼈조직의 취약화, 뼈형태의 변화, 뼈성장의 지연 등의 뼈와 그 성장이 정상이 아닌 상태를 말한다. 노령(노화)기에 있어서, 고지혈증이나 고알부민혈증의 증상에 추가하여, 뼈병태를 나타내는 비인간 모델동물의 경우, 고지혈증이나 고알부민혈증의 예방·치료약의 스크리닝에 사용할 수가 있는 것 외에, 노령(노화)기에 있어서의 골다공증의 예방·치료약의 스크리닝에도 사용할 수가 있다.

비인간동물이 쥐인 경우, 즉 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 쥐의 경우, 노령(노화)기로서, 생후 30주 이상, 바람직하게는 생후 36주~50주를 들 수가 있다. 또, 암컷의 트랜스제닉 쥐의 경우, 생후 25주의 것부터 혈청 중의 알부민 농도가 높은 수치를 나타낸다.

본 발명의 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 치료약의 스크리닝방법으로서는, 상기 본 발명의 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물에, 피검물질을 투여하여 혈중의 지질 및/또는 알부민의 양을 측정·평가하는 방법이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 또, 본 발명의 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 예방약의 스크리닝방법으로서, 상기 본 발명의 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물이, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 증상을 나타내는 노령(노화)기까지, 피검물질을 투여하고, 노령(노화)기 이후에, 혈중의 지질 및/또는 알부민의 양을 측정·평가하는 방법이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 피검물질로서는, 공지의 합성화합물, 펩티드, 단백질 등의 외에, 예를 들면 포유동물의 조직추출물, 세포배양상청 등이나, 각종 식물의 추출성분 등이 사용된다. 예를 들면, 피검화합물을 본 발명의 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물에 경구적 또는 비경구적으로 투여하고, 상기 모델동물에 있어서의 혈중의 지질 및/또는 알부민의 양을 측정·평가하거나, 간장의 병태의 관찰·평가를 실시하는 것에 의해, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 예방·치료약을 스크리닝할 수가 있다. 또, 이들 스크리닝에 있어서, 야생형 비인간동물, 특히 동복(同腹)의 야생형 비인간동물에 있어서의 경우와 비교·평가하는 것이 개체레벨에서 정확한 비교실험을 할 수가 있기 때문에 바람직하다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

[트랜스제닉 쥐의 제작]

(RNA의 조제)

위스터계 웅성 쥐(rat:3주령)로부터 간장을 적출하고, 구아니딘-이소티오시아네이트액(4M구아니디늄 티오시아네이트, 25mM 구연산나트륨(pH 7.0), 0.5%사르코실, 0.1M 2-메르캅토에탄올, 2M아세트산나트륨)으로 균질화하였다. 이것을 페놀-클로로포름-이소아밀알코올혼합액으로 추출하여, 4℃, 10,000×g에서 20분간 원심하였다. 물층에 이소프로판올을 첨가하고, -20℃에서 방치하여, RNA를 침전시켰다. 회수한 침전은 디에틸피로카보네이트 처리한 0.5% 도데실황산나트륨에 용해하였다. 이를 올리고(dT)셀룰로오스칼럼에 통과시켜 폴리(A) + RNA를 정제하였다.

(cDNA 라이브러리의 제작)

정제한 폴리(A) + RNA(5㎍)에 50unit의 Moloney-Murine Leukemia 바이러스 역전사효소와 올리고(dT)18 프라이머 링커를 첨가하고, 1개 사슬 cDNA를 합성하였다. 또한, 합성한 1개 사슬 cDNA에 대장균 리보뉴클레아제H와 DNA폴리메라아제Ⅰ를 첨가하고, 2개 사슬 cDNA를 합성하였다. 이것에 EcoRI 어댑터를 부가하고, XhoI, EcoRI로 소화한 파지발현벡터(λZAPII)와 연결하였다. 다시 패키징 엑스트랙트(Packaging Extract)를 사용하여 파지에 패키징하여 cDNA라이브러리의 파지를 제작하였다.

(RC cDNA클론의 선발)

쥐 간의 cDNA라이브러리의 파지 약 1 x 10⁶개를 대장균과 혼합하여 20개의 한천평판에 식균하였다. 42℃에서 3시간 반 동안 인큐베이팅한 후, 평판에 10mM이소프로필티오β-D-갈락토시드로 처리한 니트로셀룰로오스막을 얹고, 37℃에서 3시간 반동안 인큐베이팅하였다. 니트로셀룰로오스막은 브로킹한 후, 항 RC토끼혈청(×200)과 실온에서 2시간 인큐베이팅하였다. 막은 세정한 후, 알칼리포스파타제결합 항 토끼 IgG항체를 가하여 인큐베이팅하였다. 이것을 발색액(0.35mM니트로블루 테트라졸륨, 0.4mM5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트)에 침지하여 발색시키고, RC cDNA양성 플라크를 동정(同定)하였다.

(플라스미드벡타에로의 서브클로닝)

파지벡터λZAPII는, 그 서열중에 플라스미드벡터인 pBluescript의 염기서열을 포함하며, λZAPII에 클로닝된 RC의 cDNA단편은 이 pBluescript에 삽입되어 있 다. 또, pBluescript의 양단에는 헬퍼파지의 복제개시점과 종결점이 존재하고 있다. 여기서 상기 동정한 플라크로부터 파지를 단리(單離)하고, R408헬퍼파지와 함께 대장균SURE에 감엽시키고, RC의 cDNA단편을 포함하는 pBluescript를 대장균내에서 합성시키고, 헬퍼파지의 형태로 대장균 체외로 방출시켰다. 이 파지액을 다시 대장균SURE에 감염시키고, RC의 cDNA단편을 갖는 플라스미드로서 균내에서 복제하였다. 이 대장균을 50㎍/㎖ 앰피실린함유의 LB평판에 식균하고, 앰피실린 내성(耐性) 콜로니를 선택하였다.

(cDNA인서트의 염기서열의 결정)

Sequenase시스템(US Biochemical사 제조)을 사용하여 cDNA인서트의 전(全)염기서열을 결정하였다. 즉, 플라스미드DNA를 EcoRI로 절단하고, 단편은 알칼리변성처리한 후, 프라이머를 가하여 어닐링하였다. 이것에 35S dCTP, 0.1M DTT, Sequenase용 효소액을 첨가한 후, 4등분하고, 각각에 ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP를 가하여, 37℃에서 5분간 인큐베이팅하였다. 이들은 아크릴아미드겔 전기영동법으로 분리하고, 오토라디오그래피를 실시하고, 염기서열을 판독하였다. 서열번호1에 레규칼신cDNA의 전(全)염기서열을 나타낸다. 또, 얻어진 아미노산서열도 서열번호2에 나타낸다. 이들로부터 계산되는 레규칼신의 분자량은 33,388이었다. 이 값은 정제한 레규칼신을 SDS폴리아크릴아미드 전기영동법에 의해 산출한 분자량과 일치하였다.

(도입유전자의 구축)

얻어진 쥐 레규칼신 전장(全長) cDNA를 포함하는 플라스미드, RC- 900(glycerol stock ; RC-F), 벡터-pBluescript SK(-)로부터, ORF 전부를 포함하는 DNA단편을 PstI를 사용하여 잘라내었다. 이 잘라낸 PstI플래그멘트를 pBluescriptⅡKS(+)의 PstI사이트에 조합시켰다. 이어서 EcoRI로 잘라내고, 얻어진 EcoRI플래그멘트를, 발현벡터 pCXN2(클론테크사 제조)(Gene 108, 193-199, 1991)의 EcoRI사이트에 도입하고, 쥐 레규칼신발현벡터 RC/pCXN2를 조제하였다. 이 RC/pCXN2을 SalI와 SfiI와 MluI로 절단하고, 선형화된 3.6kbp의 플래그멘트를 얻었다.

(트랜스제닉 쥐의 제작)

쥐의 전핵기 수정란에로의 상기 선형화된 3.6kbp의 DNA플래그멘트 용액의 마이크로인젝션은 하기의 요령으로 실시하였다. 생후 4주의 스프래그-도리(SD, Sprague-Dawley)계 암컷 쥐를 명암사이클 12시간(명(明)시간 4 : 00∼16: 00), 온도 약 23℃, 습도 약 55%로 사육하고, 질 스메아법에 의해 암컷의 성 주기를 관찰하여 호르몬처리일을 선택하였다. 암컷 쥐에 150IU/kg의 임마(임신말)혈청성 성선자극호르몬(니혼젠야쿠샤 제조 「PMS젠야쿠」)을 복강내에 투여하여 과잉배란처리를 실시하고, 그 48시간 후에 150IU/kg의 인간 태반성 성선자극 호르몬(산쿄에르야쿠힝(주) 제조 「프베로겐」)을 복강내 투여한 후, 수컷과의 동거에 의해 교배시키고, 인간태반성 성선자극호르몬 투여 32시간 후에 난관관류에 의해 전핵기 수정난을 채취하였다.

이와 같이 하여 조제한 위스터 쥐의 수정란의 웅성전핵(雄性前核)에, 상기 3.6kbp의 DNA플래그멘트용액(5ng/㎕농도)을 현미경주입하였다. DNA 플래그멘트가 주입된 난을, C02인큐베이터내에서 m-KRB(m-크레브스링거 완충액)배지를 사용하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 2세포에로 발생이 진행하고, 이상이 보이지 않는 2세포기배를 9마리의 가친(정관결찰수컷과 교배시킨 가짜임신암컷 쥐)의 난관내에 1마리당 20∼30개 정도를 이식하고, 29마리의 새끼를 얻었다. 산후 4주까지 생존한 27마리의 새끼쥐의 꼬리로부터 DNA를 채취하고, 채취한 DNA를 프라이머huRC-1;GGAGGCTATGTTGCCACCATTGGA(서열번호3), 프라이머huRC-2;CCCTCCAAAGCAGCATGAAGTTG(서열번호4)를 사용하여 PCR법에 의해 검정하였다(도 4). 그 결과, 합계 5마리(수컷 4마리, 암컷 1마리)의 쥐에 도입유전자의 존재를 확인하였다. 그 중 5마리가 차세대에 도입유전자를 전달하였다.

실시예 2

[노화사육과 성분의 측정]

(노화(가령:加齡)사육)

실시예 1에서 얻어진 트랜스제닉 쥐(헤테로체)의 계통 가운데, 꼬리조직에 있어서의 레규칼신발현량이 가장 많은 계통끼리를 교배시키는 것에 의해, 트랜스제닉 쥐(호모체)를 얻었다. 또, 호모체인 것은, 쥐 꼬리조직으로부터 추출한 게놈DNA에로의 도입유전자의 조합을 PCR법으로 확인하고, 헤테로체의 cDNA량의 2배 이상의 조합량을 검출하는 것에 의해 확인하였다. 이와 같은 호모체의 암·수 6마리씩의 트랜스제닉 쥐와, 스프래그-도리(SD, Sprague-Dawley)계 암·수 6마리씩의 야생형 쥐(6마리)를, 25℃의 공조설비를 갖춘 사육실에서 고형사료(오리엔탈코보(효모), MF)를 자유롭게 섭취시켜서, 출산일로부터 36주까지 사육하였다.

(해부와 측정항목)

에테르 마취하에서, 상기 36주령까지 사육한 쥐를 해부하고, 심장천자(穿刺)에 의해 채혈하는 것과 동시에, 대퇴골 조직을 적출하였다. 혈액은 실온에서 2.0분간 방치하고, 3000회전으로 5분간 원심분리하여 혈청을 채취하였다. 혈청은, 그 성분을 측정할 때까지 -32℃로 보존하였다. 대퇴골 조직은, 냉(冷)0.25M 자당 용액 중에서 근육조직을 벗겨내고, 골간부(피질골)와 골간단부(해면골)조직으로 분리하여 골수를 세정제거하여 골질을 얻었다. 혈청성분은, 와코준야꾸코교샤 제품의 측정용 키트를 사용하여, 칼슘(칼슘C-테스트와코), 무기인(P-테스트와코), 아연(아연 테스트와코), 글루코스(글루코스 테스트와코), 트리글리세리드(트리글리세리드 테스트와코), HDL-콜레스테롤(HDL-콜레스테롤 테스트와코) 및 알부민(알부민 테스트와코)을 각각 정량하였다. 대퇴골조직의 골간부와 골간단부 조직중의 칼슘의 양(mg/g 골건조 중량)의 측정은, 골간부(피질골)와 골간단부(해면골)를, 100℃에서 6시간 건조하여 중량을 측정하고, 120℃에서 24시간 분해하고 액량을 측정한 후, 그 후 6N염산에 용해하여 골칼슘량을 원자흡광도로 측정하였다. 골조직 중의 DNA량(세포수의 지표)의 측정은, 골간부(피질골)와 골간단부(해면골)를 각각 빙냉한 6.5mM 바르비탈 완충액(pH7.4) 3ml에 침전시키고, 작은 단편으로 절단한 후, 빙냉한 0.1N수산화나트륨용액 4.0ml에서 24시간 흔들어 혼합하여 알칼리추출한 후, 10,000rpm에서 5분간 원심분리하고, 얻어진 상청을 DNA양의 측정에 사용하고, DNA양은 Ceriotti의 방법(J.Biol.Chem.,214,39-77,1955)에 준하여 측정하였다. 얻어진 실험결과의 유의차 검정을 위한 통계적 처리는 Student's t-검정을 사용하여 실시하였다.

(혈청성분의 측정결과)

트랜스제닉 쥐(호모체)와 야생형의 구별, 또 암·수별로, 혈청중의 칼슘, 무기인, 아연, 글루코스, 트리글리세리드, HDL-콜레스테롤, 알부민의 각 농도를 측정한 결과를 도1~7 및 표1에 나타낸다. 도1~7 및 표1의 각 값은 6마리의 쥐의 평균치와 그 표준오차를 나타낸다. 또, 도1~7 및 표1 중, *:P＜0.05(대조군의 값과 비교하여), **:P＜0.025(대조군의 값과 비교하여), 및 #:P＜0.001(대조군의 값과 비교하여)을 나타낸다. 표1로부터, 무기인(암컷), 트리글리세리드(암·수), HDL-콜레스테롤(암·수) 및 알부민(암컷)의 농도가 의미있게 상승하나, 칼슘, 아연 및 글루코스는 의미있게 변동하지 않는다는 것을 알 수 있다. 레규칼신 트랜스제닉 쥐에 있어서, 혈청무기인의 상승은 5주령의 쥐에 있어서도 발견되었으나, 혈청 트리글리세리드, HDL-콜레스테롤 및 알부민의 증가에 대해서는 알려져 있지 않았다.

이상의 지견으로부터, 고령기에 있어서의 레규칼신 트랜스제닉 쥐는, 간장병태에 관계한 고알부민혈증 및 고지혈증을 초래한다는 것이 명백해졌다. 또한, 도8 및 표1에 나타내는 바와 같이, 36주령에 있어서의 쥐의 체중은, 레규칼신 트랜스제닉 쥐에 있어서, 정상쥐(야생형)와 비교하여 의미있게 변동하고 있지 않았다.

(골조직중의 칼슘량의 측정결과)

대퇴골조직의 골간부와 골간단부 조직중의 칼슘량(mg/g 골건조중량)의 측정결과를 도9에 나타낸다. 도9로부터, 36주령의 레규칼신 트랜스제닉 쥐의 대퇴골의 골간부와 골간단부의 칼슘량은, 수컷 및 암컷 중 어느것에 있어서도 정상쥐(야생형)와 비교하여 의미있게 감소하고 있다는 것을 확인하고, 레규칼신 트랜스제닉 쥐에 있어서는 노화시에 있어서도 골량감소가 초래된다는 것이 명백해졌다. 도9 중, *:P＜0.01(대조군의 값과 비교하여)을 나타낸다.

(골조직 중의 DNA량의 측정결과)

대퇴골 조직의 골간부와 골간단부 조직 중의 DNA량(세포수의 지표)의 측정결과를 도10에 나타낸다. 도10으로부터, 골조직 중의 DNA량은, 특히, 골간단부에 있어서 수컷 및 암컷의 레규칼신 트랜스제닉 쥐에 있어서 의미있게 감소하고 있는 것이 발견되었으며, 골형성이 억제되는 것이라고 여겨졌다. 도10 중, *:P＜0.01(대조군의 값과 비교하여)을 나타낸다.

실시예 3

[주령 14, 25, 36, 50의 트랜스제닉 쥐에 있어서의 성분의 측정]

생후 14, 25, 36, 50주에 있어서의 레규칼신 과잉발현 쥐를 사용하여 고지혈증·고알부민혈증의 발현에 대하여 조사하였다. 레규칼신 트랜스제닉 쥐(호모체의 암·수)와 정상쥐(암·수)는, 각 생후 14, 25, 36주 및 50주에 있어서 해부하여 채혈하고, 혈청중의 지질(유리지방산, 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤, 유리콜레스테롤), 및 혈청중의 칼슘, 무기인, 아연, 글루코스 및 요소질소의 농도를 실시예 2와 동일하게 하여 측정하고, 이들 각 성분의 노화에 의한 변동을 조사하였다. 또한, 유리지방산과 요소질소의 측정에는, 와코준야꾸코교 제품인 측정용 키트「NEFAC-테스트와코」 및 「요소질소B-테스트와코」를 사용하였다. 결과를 도11~15 및 표2에 나타낸다. 도11~15 및 표2의 각 값은 6마리의 쥐의 평균치와 그 표준오차를 나타낸다. 또 도11~15 중, *:P＜0.01(대조군인 각 주령(週齡)의 정상쥐의 값과 비교하여)을 나타내고, 표2 중, ^aP＜0.05, ^bP＜0.01(대조군인 각 주령의 정상쥐의 경우와 비교하여)을 나타낸다.

그 결과, 도11~14에 나타내는 바와 같이, 혈청중 지질(유리지방산, 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤, 유리콜레스테롤)농도가, 암컷 쥐의 14주령부터 높은 수치를 나타내는 것이 발견되었으며, 50주령(생후 1년)에서는 현저하다는 것이 명백해졌다.

다른 한편, 도15에 나타내는 바와 같이, 혈청 중 알부민의 농도는 암컷쥐에 있어서 25주령의 것부터 높은 수치를 나타내는 것이 명백해졌다.

이와 같은 암컷쥐에 있어서 고지혈증 및 고알부민혈증이 현저한 것은, 레규칼신유전자가 X염색체에 위치하고 있는 것과 관련되어 있다고 추측할 수 있다.

또한, 표2에 나타내는 바와 같이, 혈청 칼슘의 농도가 레규칼신 트랜스제닉 쥐(수컷, 암컷)의 생후 50주에서 의미있게 상승하는 것이 발견되었으며, 또, 혈청무기인의 농도는 생후 14, 25, 36주의 레규칼신 트랜스제닉 쥐에 있어서 의미있게 상승하였다.

또한, 혈청 중, 아연, 글루코스 및 요소질소 농도는 레규칼신 트랜스제닉 쥐(수컷, 암컷)의 생후 14, 25, 36주 및 50주에 있어서 정상쥐와 비교하여 의미있게 변동하지 않았다.

이와 같이, 레규칼신 트랜스제닉 쥐에 있어서는, 고지혈증이 극히 특징적이었으며, 특히 암컷쥐에 있어서의 고알부민혈증도 특이한 현상이었다.

레규칼신 트랜스제닉 쥐가 고지혈증·고알부민혈증 모델동물로서 유용하다는 것을 더욱 뒷받침하는 지견이 얻어졌다.

본 발명의 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물을 사용하면, 노화기에 있어서의 간장병태 및 고지혈증 발증 메커니즘의 기초적 지견을 얻을 수 있을 뿐 아니라, 고지혈증이나 고알부민혈증의 임상예를 나타내는 질환의 예방·치료제의 개발에 유리하게 이용할 수가 있다.

<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY <120> Model animal with hyperlipidemia and hyperalbuminemia <130> YG2004-17PCT <150> JP2003-374098 <151> 2003-11-04 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 900 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(897) <400> 1 atg tct tcc atc aag att gaa tgt gtt tta agg gag aac tac agg tgt 48 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys 1 5 10 15 ggg gag tcc cct gtg tgg gag gag gca tca aag tgt ctg ctg ttt gta 96 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val 20 25 30 gac atc cct tca aag act gtc tgc cga tgg gat tcg atc agc aat cga 144 Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg 35 40 45 gtg cag cga gtt ggt gta gat gcc cca gtc agt tca gtg gca ctt cga 192 Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 cag tca gga ggc tat gtt gcc acc att gga acc aag ttc tgt gct ttg 240 Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 aac tgg gaa gat caa tca gta ttt atc cta gcc atg gtg gat gaa gat 288 Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp 85 90 95 aag aaa aac aat cga ttc aat gat ggg aag gtg gat cct gct ggg aga 336 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 tac ttt gct ggt acc atg gct gag gaa acc gcc cca gct gtt ctg gag 384 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 cgg cac caa ggg tcc ttg tac tcc ctt ttt cct gat cac agt gtg aag 432 Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys 130 135 140 aaa tac ttt aac caa gtg gat atc tcc aat ggt ttg gat tgg tcc ctg 480 Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 gac cat aaa atc ttc tac tac att gac agc ctg tcc tac act gtg gat 528 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp 165 170 175 gcc ttt gac tat gac ctg cca aca gga cag att tcc aac cgc agg act 576 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr 180 185 190 gtt tac aag atg gaa aaa gat gaa caa atc cca gat gga atg tgc att 624 Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 gat gtt gag ggg aag ctt tgg gtg gcc tgt tac aat gga gga aga gta 672 Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 att cgc cta gat cct gag aca ggg aaa aga ctg caa act gtg aag ttg 720 Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 cct gtt gat aaa aca act tca tgc tgc ttt gga ggg aag gat tac tct 768 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser 245 250 255 gaa atg tac gtg aca tgt gcc agg gat ggg atg agc gcc gaa ggt ctt 816 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu 260 265 270 ttg agg cag cct gat gct ggt aac att ttc aag ata aca ggt ctt ggg 864 Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 gtc aaa gga att gct cca tat tcc tat gca ggg taa 900 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295 <210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys 1 5 10 15 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val 20 25 30 Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg 35 40 45 Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp 85 90 95 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp 165 170 175 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr 180 185 190 Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser 245 250 255 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer huRC-1 <400> 3 ggaggctatg ttgccaccat tgga 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer huRC-2 <400> 4 ccctccaaag cagcatgaag ttg 23

Claims

레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 비인간동물로 이루어지는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물.
제1항에 있어서,

상기 트랜스제닉 비인간동물을, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 증상을 나타내는 노령(노화)기까지 사육하는 것에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물.
제1항에 있어서,

상기 트랜스제닉 비인간동물(암컷)을 고알부민혈증의 증상을 나타낼 때까지 사육하는 것에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 비인간동물이 노령(노화)기에 있어서 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

호모체인 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 비인간동물이 쥐(rat)인 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물.
제6항에 있어서,

상기 노령(노화)기가 36주령~50주령인 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물.
레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 비인간동물을 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 모델동물로서 사용하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 트랜스제닉 비인간동물을 노령(노화)기까지 사육하여, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 모델동물로서 사용하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 트랜스제닉 비인간동물(암컷)을 고알부민혈증의 증상을 나타낼 때까지 사육하여, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 모델동물로서 사용하는 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 비인간동물이 노령(노화)기에 있어서 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

호모체인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 비인간동물이 쥐(rat)인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 노령(노화)기가, 36주령~50주령인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물에, 피검물질을 투여하여 혈중의 지질 및/또는 알부민의 양을 측정·평가하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 치료약의 스크리닝방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 모델동물이, 고지혈증 및/또는 고알부민혈증의 증상을 나타내는 노령(노화)기까지 피검물질을 투여하여 노령(노화)기 이후에 있어서의 혈중의 지질 및/또는 알부민의 양을 측정·평가하는 것을 특징으로 하는 고지혈증 및/또는 고알부민혈증 예방약의 스크리닝방법.