JP2006500413A - 代謝制御に関連するＳＫＲＰ、ａｓｔｒａｙ、ｓｔｒｉｎｇ、ＶＡＣＭ - Google Patents

Abstract

本発明は、代謝疾患および障害の診断、研究、予防、および治療において、タンパク質を調節するエネルギー恒常性およびこれらをコードするポリヌクレオチドの新規使用法を開示する。

Description

本発明は、肥満症または(および)糖尿病または(および)代謝症候群の診断、研究、予防、および治療におけるCG7042 (Gadfly アクセッション番号)、astray (GadFly アクセッション番号CG3705)、string (GadFly アクセッション番号CG1395)、またはCG1401 (GadFly アクセッション番号) 相同タンパク質の使用法、これらをコードするポリヌクレオチドの使用法、およびタンパク質およびポリヌクレオチドのエフェクター／修飾因子の使用法に関するものである。

エネルギー消費量に対して摂取熱量がアンバランスであるというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝のさまざまな代謝疾患、例えば肥満や体重の激減が存在する。肥満は世界に最も蔓延している代謝障害の1つであり、重大な健康問題として西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であるが、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想体重の20%以上を超える体重として定義され、多くの場合著しい健康障害をもたらす。肥満は、心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。

肥満は、遺伝的要因、代謝因子、生化学的要因、心理学的要因、および行動要因によって影響を受け、そして非インスリン依存型糖尿病、中性脂肪の増加、炭水化物接合エネルギーの増加および低エネルギー消費のような異なる原因に起因し得る。そのような事情から、肥満は持続可能な好ましい臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。

肥満は単一の障害として考慮されるべきではなく、(潜在的)複合原因による症状の混成群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血中インスリン値の上昇および経口グルコース摂取に対する過度のインスリン反応も特徴とする (Koltermann O.G., (1980) J. Clin. Invest 65: 1272-1284)。2型糖尿病における肥満症の明らかな関与が確認されている (Kopelman P.G., (2000) Nature 404: 635-643)。

高脂血症および遊離脂肪酸の上昇は、肥満症およびインスリン耐性を始めとするさまざまな疾患間の連鎖として定義される「代謝症候群」と明確に相関する。これは多くの場合、同一患者において生じ、そして2 型糖尿病および心血管疾病の発生の主要な危険因子である。脂質値および血糖値のコントロールが、2 型糖尿病、心臓病、およびその他の代謝症候群を治療するために必要であることが示されている (例えば、Santomauro A. T.らの (1999) Diabetes、48: 1836-1841 および Lakka H.M らの (2002) JAMA 288: 2709-2716 を参照)。

糖尿病は身体に深刻な障害を引き起こす疾病である。その理由は、薬剤療法では血糖値の昇降を防止するほど十分に制御することができないためである。糖尿病患者には、糖尿病性ケトアシドーシス、末期症状の腎臓病、糖尿病性網膜症および切断を始めとする重大な合併症の危険がある。また、糖尿病患者にとって発症の危険性が極めて高い代謝症候群、肥満症、高血圧症、心臓病、末梢性血管障害、および感染症のような関連状態が多く存在している。これら合併症の治療に要する費用は、全世界の医療制度の膨大な糖尿病治療費用において相当な比率を占める。

「代謝症候群」(症候群x、インスリン耐性症候群、死の四重奏) のコンセプトは、1966 年にCamus によって初めて記載され、1988年にReaven によって再導入された (Camus J.P. の (1966) Rev Rhum Mal Osteoartic 33: 10-14; Reaven G.M. らの (1988) Diabetes、37: 1595-1607)。今日、代謝症候群は、高血圧、腹部肥満、中性脂肪高値および空腹時血糖値、さらには、HDL コレステロール低値などの心血管系危険因子の集積として一般的に定義されている。インスリン耐性は代謝症候群の発生の危険を大幅に増加する (Reaven G., (2002) Circulation 106: 286-288)。代謝症候群は多くの場合、2 型糖尿病および心疾患の発生に先行する (前出の Lakka H.M.らの2002)。

食物摂取と体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、レプチンまたはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような体重／重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子についての記述がいくつかあるとしても、肥満調整または体重／重量の調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。しかも、マウスに肥満症をもたらすさまざまな単一遺伝子の突然変異体が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている (Friedman J. M. および Leibel R. L.、(1992), Cell 69: 217-220))。肥満(ob)マウスにおいては、単一遺伝子の突然変異(肥満)は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす (Friedman J.M. らの (1991) Genomics 11: 1054-1062)。

以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性経路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝状態の調節のための手段と方法を提供することにあった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴付けられた実施例を提供することによって達成する。

従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において、これらをコードするタンパク質および核酸の新規機能に関連するものである。さらに本発明では、記載したような代謝疾患および障害の診断、治療および予後に有用な新規組成物を提供する。

これまでは、本発明のタンパク質または相同タンパク質がエネルギー恒常性の調節および体重調節および関連障害に関与することは記載されておらず、従って上記のような代謝疾患および機能障害およびその他の疾患における機能は記述されていない。

本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、記載した特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬によって本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用した用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求範囲のみに限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書で使用した全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載した方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料はここに記載する。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。

本発明は、CG7042 (GadFly アクセッション番号)、astray (GadFly アクセッション番号CG3705)、string (GadGly アクセッション番号CG1395)、またはCG1401 (GadFly アクセッション番号) 相同タンパク質(本明細書中では「本発明のタンパク質」と呼ぶ)がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの代謝と保管を調節することを開示する。. また、本発明は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作り出すためのベクター、宿主細胞、および組換え方法に関連するものでもある。また、本発明は、代謝症候群、肥満症、または(および)糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈性心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の診断、研究、予防、および治療における、これらの化合物およびそのエフェクター／修飾因子、例えば、アンチセンス分子、RNAi 分子またはリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識する低分子量有機化合物のような抗体、生物活性核酸の使用法にも関するものである。

ストレス活性化プロテインキナーゼ(SAPK) 経路制御ホスファターゼ1 (SKRP1) はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK) ホスファターゼ(MKP) ファミリーのメンバーである。SKRP1 は、MAPK キナーゼMKK7、c-Jun N末端キナーゼ(JNK) 活性化剤と物理的に相互作用し、MAPK JNK 経路を不活性化する。SKRP1 は、JNK シグナル伝達の精密な制御に寄与し、MKK7 と安定した複合体を選択的に形成することによってJNK シグナル伝達の足場となり、また、MKK7 活性およびMKK7誘導遺伝子転写の制御の足場ともなる (Zama T. らの、(2002) J Biol Chem 277(26): 23919-23926)。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK) は種々の細胞外刺激に反応して活性化し、その活性はMAPK 上流活性化キナーゼおよびホスファターゼ(MKP)のようなプロテインホスファターゼによって制御される。MKP ファミリーのメンバーであるSKRP1 には、全MKP に保存される拡張型活性部位配列モチーフが含まれているが、Cdc25 ホモロジードメインが欠失している。SKRP1 は、MKK7 を介してその生理的基質JNK と相互作用し、それによって生体内JNK 活性の精密な制御につながるものである(Zama T. らの(2002) J Biol 277(26): 23909-23918)。

また、別の二重特異性プロテインホスファターゼおよびMKP ファミリーのメンバーであるMAPK ホスファターゼ1 (MKP-1)が糖尿病ラットにおいて研究されている。MAPK を不活性化する二重特異性ホスファターゼであるMKP-1 のタンパク質発現は、ストレプトゾトシン誘導の真性糖尿病(DM)ラットにおいて減少した。糸球体のMAPK は、複数の機構、つまり、タンパク質含有量の増加、リン酸化の増加、およびMKP-1抑制に起因する酵素の脱リン酸減少などによってDM において活性化される。これらの改変は糖尿病性腎症の病原性に密接な関係を持ち得る(Awazu M. らの、(1999) J amplitude modulation Soc Nephrol 10(4):738-745)。1型糖尿病BB ラットの切除した肝臓におけるMKP-1 の遺伝子発現は変化を示す(Chin S. らの(1995) amplitude modulation J Physiol 269(4 Pt 1): E691-700)。

ホスホセリンホスファターゼ(PSP) は、ホスホアスパラギン酸(phosphoaspartate)酵素中間体を用いてリン酸エステル加水分解を触媒する酵素大群のメンバーである。PSP は、グルタマート受容体のN-メチル-d-アスパラギン酸型の重要なコアゴニストである、脳における定常dセリンレベルの制御因子である可能性が高い(Wang W. らの(2002) J Mol Biol 319(2): 421-431)。PSP はリン酸転移酵素群に属し、触媒作用中にアシルリン酸を形成する(Collet J. F. らの、(1999) J Biol Chem 274(48): 33985-33990)。

String は、初期発生の有糸分裂に必要であり、胚発生における細胞分裂のパターンを予測するダイナミックパターンにおいて転写される。 string mRNA の制御発現は、接合子性に駆動される胚発生における細胞分裂のタイミングと位置を制御する(Edgar B. A. およびO'Farrell P. H. の(1989) Cell 57: 177-187; Edgar B. A. およびO'Farrell P. H.、(1990) Cell 62: 469-480)。string 制御は、一部のG2停止成虫細胞における有糸分裂への早期移行に重要であるが、すべてのG2停止成虫細胞において重要であるとは限らない。string は、成人角質の生成に必須である(Kylsten P. およびSaint R.、(1997) Dev Biol. 192(2): 509-522)。string は、胚における娘中心小体アセンブリの完成に必要とされる(Vidwans S. J. らの、(1999) J Cell Biol 147(7):1371-1378)。

Cdc25 ファミリーのプロテインホスファターゼは、サイクリン依存プロテインキナーゼを活性化することによって細胞分裂周期を積極的に調節する。ヒトおよびげっ歯類では、3つのCdc25 ファミリーメンバー、Cdc25A、Cdc25B、およびCdc25C が同定されている。Cdc25 のマウス形態は、発育中組織および成人マウス組織の両組織において固有の発現パターンを示す。Cdc25C を欠失するマウス(Cdc25C(-／-) マウス) には生存能力があり、明らかな異常を示さない。Cdc25C は、精巣において最も豊富に発現され、継いで胸腺、卵巣、脾臓、および腸において多く発現される。Cdc25A または(および)Cdc25B により、マウスにおけるCdc25C の欠失が補償される可能性がある(Chen M. S. らの(2001) Mol Cell Biol 21(12):3853-3861)。サイクリン依存キナーゼを脱リン酸するCdc25 ホスファターゼは、多くのヒト腫瘍において過剰発現される(Pestell K. E. らの(2000) Oncogene 19(56):6607-6612)。

カリン遺伝子ファミリーメンバーであるバソプレッシン活性化カルシウム(2+)動態(VACM-1)は、細胞シグナル伝達をを調節する。VACM-1 受容体の過剰発現は、アルギニンバソプレッシン(AVP) 結合の増加を結果としてもたらすが、従来のAVP 受容体とアミノ酸配列相同性を持たない。但し、VACM-1 は、サイクリン依存キナーゼ阻害剤のユビキチン媒介劣化を介した細胞分裂周期の制御に関与するタンパク質類のカリンファミリーと相同である。カルシウム(2+) 上のVACM-1 発現効果およびcAMP依存シグナル伝達経路を検討した。VACM-1 遺伝子の発現は、cAMP 産生を低下した(Burnatowska-Hledin M. らの(2000) amplitude modulation J Physiol Cell Physiol 279(1):C266-273)。

これまでは、本発明のCG7042、astray、string 、またはCG1401 タンパク質または相同タンパク質がエネルギー恒常性の調節および体重調節および関連障害に関与することは記載されておらず、従って上記のような代謝疾患および機能障害およびその他の疾患における機能は記述されていない。

CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、相同核酸、特に表1に記載の本発明のヒトホモログタンパク質をコードする核酸である。

本発明は、エネルギー恒常性または(および)中性脂肪の代謝調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に特に関連するものであり、その点で、当該核酸分子は下記から成る。
(a) ショウジョウバエCG7042、astray、string 、またはCG1401 をコードするヌクレオチド配列、またはヒト相同性を有する核酸分子、特に、表1 に記載したヒトタンパク質をコードする核酸、または(および)それに対して相補的な配列、
(b) 50℃にて、1 x SSC および 0.1% の SDS を含む溶液中で(a) の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c) 遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d) ポリペプチドをコード化する配列であって、少なくとも85%、望ましくは少なくとも90%、より望ましくは少なくとも95%、より望ましくは少なくとも98% および最大で99,6% までの同一性を、CG7042、astray、string 、またはCG1401 タンパク質のアミノ酸配列、望ましくは表1 に記載したヒト相同タンパク質のアミノ酸配列に対して持つ配列。
(e) 突然変異によって(a)〜(d) の核酸分子と異なる配列であり、当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製および(または)早期停止を引き起こす配列、または
(ｆ) 少なくとも15 塩基、望ましくは少なくとも20 塩基、より望ましくは少なくとも25 塩基および最も望ましくは少なくとも50 塩基、特に、15〜25 塩基、望ましくは25〜35 塩基、より望ましくは35〜50 塩基および最も望ましくは少なくとも50 塩基の長さを有する (a)〜(e) のヌクレオチド配列の任意の部分配列。

本発明は、CG7042、astray、string 、またはCG1401 または(および)相同タンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、従って、エネルギー恒常性にも関与するというと知見に基づく。また、本発明では、代謝症候群、肥満症、または(および)糖尿病を始めとする代謝疾患または(および)機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、肝臓線維症、または、胆石症のような関連障害の診断、研究、予防、または(および)治療におけるこれらタンパク質およびポリヌクレオチドの使用法を記述する。

従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症、当該遺伝子の機能的断片、当該遺伝子またはその機能的断片によってコード化されたポリペプチドコード、およびその修飾因子／エフェクター、例えばアンチセンス分子、RNAi分子、または当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識するリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは低分子量有機化合物のような抗体、生物学的に活性な核酸において新規機能を有する遺伝子に関するものである。

キイロショウジョウバエのようなモデル個体のゲノムを操作およびスクリーニングする能力は、遺伝子、細胞プロセス、および経路の有意な進化的保存に起因する、より複雑な脊椎動物個体に対する直接的な関連性を有する生物学的および生化学的プロセスを分析するための強力なツールを提供する(例えば、Adams M. D.らの、(2000) Science 287:2185-2195を参照)。モデル個体における新規遺伝子機能の同定は、哺乳動物(ヒト)における反応経路の解明、そしてその調整方法の解明に直接的に貢献する。病理モデル(例: 肥満症を始めとする代謝症候群の徴候としての中性脂肪値の変化)とハエ遺伝子の修飾発現との関係によって、ヒト相同分子種と特定のヒト疾病との関連を同定することができる。

フォーワード遺伝子スクリーニングは、既知の遺伝子の異所性発現に起因する変異表現型を示すハエにおいて実施した(St Johnston D., (2002) Nat Rev Genet 3: 176-188; Rorth P., (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93: 12418-12422 を参照)。本発明においては、遺伝子スクリーニングを用いて、中性脂肪値の著しい変化を反映する体重変化の原因となる突然変異を同定した。

肥満者は、主に中性脂肪含有量の著しい増加を示す。中性脂肪は細胞における最も効果的なエネルギー貯蔵場所である。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を分離するために、数千の専売的および公的に提供されているEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる摂食期間後に検査した(詳細は実施例および図を参照)。さらなる分析のための好ましい候補として中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。遺伝子機能の喪失または獲得に起因する中性脂肪含有量の増減により、中性脂肪として貯蔵されたエネルギー量を制御する用量依存的な様式でのエネルギー恒常性における遺伝子活性が示唆される。

長期にわたる給餌後、中性脂肪測定法を用いて同一遺伝子型を有するハエ集積の中性脂肪含有量を分析した。ショウジョウバエEPラインに対する雄バエのホモ接合性ベクター統合を、これらのハエの中性脂肪含有量を測定するアッセイにおいて分析し、実施例セクションにおいてその詳細を図解した。中性脂肪含有量分析の結果を図1、4、8、および11 にそれぞれ示した。

EPベクター統合に近接して局在するゲノムDNA配列を分離した。それら分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly; FlyBase (1999) Nucleic Acids Research 27:85-88も参照)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってベクター統合部位、および実施例の項においてより詳細に記載した対応遺伝子を同定した。遺伝子の分子構造を、図 2、5、9、および12 にそれぞれ示した。

それによってコード化された、中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質は、公的に利用できる配列データベースで分析し (詳細は実施例を参照)、哺乳動物のホモログを同定した。

エネルギー恒常性における哺乳動物ホモログの機能(作用)は、異なる組織における転写物の発現の分析、および脂肪細胞分化における役割の分析によって、本発明でさらに確証した。発現プロファイリングの研究(詳細は実施例を参照)により、本発明のタンパク質の特定の関連性は哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認される。さらに、本発明のタンパク質が、絶食および遺伝的に誘発された肥満によって調整されることを明らかにする。本発明では、本発明のタンパク質発現を研究するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスなどのインスリン耐性および(または)糖尿病マウスモデルを使用した(例えば、ob (レプチン)マウスまたは db (レプチン受容体)マウス)。そのような糖尿病典型的な症状を呈するマウスは肝脂質蓄積を示し、高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(Bruning J.C. らの(1998) Mol. Cell. 2: 559-569 を参照)。

マイクロアレイは、生体分析化学において日常的に用いられる分析ツールである。マイクロアレイは、固形担体の表面上に分布され、そして該表面に安定して関連する分子を持つ。用語「マイクロアレイ」は、基質上での複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、またはその他の化合物の配列構成を指す。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または(および)抗体のマイクロアレイが作り出されており、遺伝子発現の監視、薬剤の発見、遺伝子シーケンシング、遺伝子マッピング、細菌の同定、およびコンビナトリアルケミストリーのような種々の用途において使用されている。マイクロアレイがとりわけ使用される一領域は、遺伝子発現分析の領域である(実施例6を参照)。アレイ技術を用いて、単一の多型遺伝子または多数の関連遺伝子発現または無関係遺伝子発現プロファイルを研究することができる。単一遺伝子発現を検討する場合には、アレイを用いて特異的な遺伝子またはその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを検討する場合、アレイは、組織特異的であり、毒物試験法において検査する物質によって影響を受け、シグナル伝達カスケードの一部であり、ハウスキーピング機能を実行し、または特異的特定の遺伝的な素因、状態、疾病、または障害に関連する遺伝子を同定するためのプラットフォームを提供する。

マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（例えば、Brennan T.M., (1995) 米国特許第US5474796号; Schena M. らの(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619; Baldeschwieler らの(1995) PCT 出願第号WO9525116; Shalon T.D. and Brown P.O., (1995) PCT 出願第WO9535505号; Heller R.A. らの(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155; Heller M.J. およびTu E., (1997) 米国特許第US5605662号などを参照）。各種マイクロアレイは公知であり、Schena M.、ed. (1999); DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, London において十分に記述されている。

本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片は、マイクロアレイにおけるエレメントとして使用することができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。 これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退を監視し、疾病治療における薬剤の活性を開発及び監視することができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。

マイクロアレイ分析で確定されたように、ホスホセリンホスファターゼ(PSPH)、細胞分裂周期25B (CDC25B)、およびカリン5 (CUL5) は、ヒト一次脂肪細胞において発現差異を示す。このように、PSPH、CDC25B、およびCUL5 は、肥満症、糖尿病、または(および)代謝症候群のようなヒト代謝に関連する状態の治療のための医薬品組成物の製造および薬物に対する有力な候補である。

また、本発明には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含される。従って、本発明のタンパク質または相同タンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、本発明のタンパク質または相同タンパク質を発現する組換え分子を作成することができる。特定の実施形態では、本発明には、ショウジョウバエのCG7042、astray、string 、またはCG1401、またはヒトCG7042、astray、string 、またはCG1401 ホモログ、望ましくは本明細書中で「本発明のタンパク質」と呼ぶ、表 1 に記載したヒト相同タンパク質をコードする核酸が包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、そのタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列(一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する) を作り出すことが可能である。本発明には、可能なコドン選択に基づく組合せの選択によって作り得るありとあらゆる種類のヌクレオチド配列変異体を網羅することができる。

また、本発明に包含されるのは、請求項に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド配列、および特に、種々のストリンジェントな条件下で本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのそれら配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl G.M. らの (1987: Methods Enzymol. 152: 399-407) および Kimmel A.R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511) で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、明確なストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1 時間 1 x SSC および0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃ にて、望ましくは55℃ にて、より望ましくは62℃ にて、および最も望ましくは 68℃ にて、特に1 時間 0.2 x SSC および0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で 50℃ にて、望ましくは 55℃ にて、より望ましくは 62℃ にて、および最も望ましくは 68℃ にて洗浄後、正のハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されるそのタンパク質をコードする改造核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入または置換が含まれ、機能的に同一または等価なタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを結果としてもたらす。

また、コードされたタンパク質には、サイレント変化を作り出し、機能的に等価なタンパク質を結果としてもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入または置換が含まれることもある。計画的アミノ酸交換は、タンパク質の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。さらに本発明は、タンパク質のペプチド断片またはその誘導体、例えば、少なくとも 4 長、望ましくは少なくとも 6 長、最大で 50 長のアミノ酸を有する環状ペプチド、ペプチド擬態のレトロ(retro-inverso)ペプチドなどに関するものである。

また本発明の範囲内には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子も含むものとする。本明細書で使用した「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る、遺伝子の別の形である。対立遺伝子は、構造または機能を改変し得るかどうかわからない変性 mRNA またはポリペプチドを結果としてもたらすことがある。任意の遺伝子には、対立遺伝子形態が含まれない場合も、1 つ以上の対立遺伝子形態が含まれる場合もある。対立遺伝子を作り出す一般の突然変異変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で 1 回以上生じることがある。

本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することが可能である。例えば、使用可能な方法の１つである「制限部位」PCR 法は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知配列を読み出す方法である (Sarkar G. らの (1993) PCR Methods Applic.2:318-322)。また、逆PCR法を用いて、既知領域に基づく分岐プライマーを利用して、配列を増幅または延長することも可能である (Triglia T. らの Nucleic Acids Res. 16:8186)。また、別の使用可能な方法としては、ヒトおよび酵母菌の人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDN断片のPCR増幅を伴うキャプチャPCR法があげられる (Lagerstrom M. らの (1991) PCR Methods Applic. 1: 111-119)。未知配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker J.D. らの (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060 の方法が挙げられる。加えて、PCR 法、ネステッドプライマー、および PROMOTERFINDER ライブラリを用いて、ゲノム DNA 内に入ることも可能である (Clontech社、Palo Alto、Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるために有用である。

生物学的に活性なタンパク質を発現するために、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列または機能的等価物を好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、タンパク質をコードする配列、好適な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、試験管内組換えDNA技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。これらの技術は、Sambrook J. らの(1989) Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. および Ausubel F. M. らの(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. に記載されている。

本発明のさらに別の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列または本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。

種々の発現ベクターと宿主系を利用して、タンパク質または融合タンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴のウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。

試料における本発明のポリヌクレオチド配列の存在は、当該ポリヌクレオチドのプローブまたは部分または断片を用いて、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出することが可能である。核酸増幅系アッセイには、対応タンパク質をコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するために、その遺伝子に特異的な配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本明細書で使用した「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも約10のヌクレオチド、そして約60もの数のヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25のヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプライマーとして使用することが可能である。

多岐にわたる標識技術および共役技術が当業者には周知であり、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。ポリヌクレオチド配列を検出するために標識化されたハイブリダイゼーションまたは PCR プローブを産出する手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、標識化されたRNA プローブの末端標識化、標識化されたヌクレオチドを用いたPCR 増幅、または酵素性合成が含まれる。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn社、Promega社 (ウィスコンシン州マディソン)、およびU.S. Biochemical Corp社 (オハイオ州クリーブランド)) を用いて実行することが可能である。

また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。

本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からの当該タンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって作り出されたタンパク質は、使用する配列および(または)ベクターにもよるが、分泌または細胞内含有させることが可能である。タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するタンパク質の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。その他の組換え構造を用いて、本タンパク質をコードする配列を水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製を促進するドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファン分子などの金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質 A ドメイン、および FLAG 伸長・親和性精製システム(Immunex Corp., Seattle, Wash.)で利用されるドメインなどが含まれるが、これらによって限定されるものではない。精製ドメインと所望のタンパク質との間にあるXA 因子またはエンテロキナーゼ(腸活素)(カリフォルニア州のサンディエゴ市のInvitrogen 社)に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて精製を促進することが可能である。

診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター／修飾因子が、関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、代謝症候群、肥満症または(および)糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎および(または)胆石症、または肝臓線維症のような関連障害において有用であることを明らかにする。従って、本発明のタンパク質核酸およびタンパク質の診断目的および治療目的は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質療法、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、薬剤ターゲッティング／細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)試験管内および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。

本発明の核酸とタンパク質およびそのエフェクターは、下記のように、種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、本発明のタンパク質をコードする相補 DNAおよび特にそのヒトホモログは、遺伝子療法において有用であり、また、本発明のタンパク質および特にそのヒトホモログは、それを必要とする被検体に投与されたときに有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。

本発明の核酸またはその断片は、核酸またはそのタンパク質の存在または量が評価される診断適用例においてもさらに有用であり得る。さらに、本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体を治療または診断方法において使用することも可能である。

例えば一実施態様によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異な抗体は、修飾因子／エフェクター、例えばアンタゴニストとして直接的に用いるか、またはタンパク質を発現する細胞または組織に薬剤をもたらすターゲッティング機構または輸送機構として間接的に用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体一本鎖、Fab 断片、および Fab 発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。

抗体産生のため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、本ンパク質または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって免疫化することが可能である。 宿主の種類にもよるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。本タンパク質に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。

本タンパク質に対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を作り出す任意の技術を用いて作ることが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒト B 細胞ハイブリドーマ技術、EBV ハイブリドーマ技術 (Kohler G. および Milstein C. の (1975) Nature 256: 495-497; Kozbor D. らの (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote R.J. らの (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030; Cole S.P. らの, (1984) Mol. Cell Biochem. 62: 109-120) が含まれるが、これらに限定されるものではない。

しかも、「キメラ抗体」を作り出すために開発された技術である、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である (Morrison S.L. らの (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger M.S. らの (1984) Nature 312: 604-608; Takeda S. らの (1985) Nature 314: 452-454)。あるいは、一本鎖抗体を作り出すために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的な一本鎖抗体を作り出すことが可能である。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ組成物の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である (Kang A.S. らの (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-11123)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生を誘導することによって作り出すことが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによって作り出すことも可能である (Orlandi R. らの (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Winter G. および Milstein C. の (1991) Nature 349: 293-299)。

また、タンパク質に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることが可能である。例えば、そのような断片には、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作り出すことができるF(ab')2断片、およびF(ab')2のスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab 発現ライブラリを作製して、所望の特異性を有するモノクローナル Fab 断片の迅速かつ容易な同定することができる (Huse W.D. らの (1989) Science 246: 1275-1281)。

種々の免疫測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このような免疫学的測定法には、タンパク質とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が関与する。2つの非干渉性タンパク質エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナル系免疫測定法が望ましいが、競合結合実験を用いることも可能である (Maddox D.E. らの(1983) J. Exp. Med. 158: 1211-1216)。

本発明の別の実施例によれば、本発明のポリヌクレオチドまたはその断片またはアプタマー分子、アンチセンス分子、RNAi 分子、またはリボザイムのような核酸修飾因子／エフェクター分子を治療目的のために使用することが可能である。一実施態様によれば、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、本発明のタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。

さらなる実施態様では、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において、アンチセンス分子を使用することが可能である。具体的には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することが可能である。このように、アンチセンス分子を用いて、タンパク質活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、タンパク質をコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニアウィルスまたは種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することができる。当業者に公知の方法を用いて、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrook らの (前出) および Ausubel らの (前出) 両文献に記載されている。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子は、本発明のタンパク質または相同タンパク質またはその断片をコード化する高レベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターを有する細胞または組織の形質転換によってオフにすることができる。そのような構成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNA への組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内因性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より一層長く持続することが可能である。

上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA または PNA を、本発明のタンパク質または相同タンパク質、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対して設計することによって得ることができる。転写開始部位(例えば始動部位から -10〜+10 の間) 由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制することもできる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写調節因子または調節分子の結合に対して二重らせんが十分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療における進歩は文献に記載がある (Gee、J. E.らの(1994) In; Huber 、B. E. and B. I. Carr、Molecular and Immunologic Approaches、Futura Publis hing Co.、Mt. Kisco、N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的で設計することも可能である。

酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために使用することが可能である。リボザイム作用のメカニズムには、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれる。使用することが可能な実施例には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造的特徴に対して評価することが可能となる。また、候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護試験法(ribonuclease protection assay)を用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性を検査することによって行うことができる。

本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、DNA配列の試験管内および生体内転写によってRNA分子を産出することも可能である。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、アンチセンスRNAを構成的または誘導的に合成するこれら相補 DNA構成物は、細胞株、細胞または組織の内に導入することができる。RNA分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、本分子の 5' 末端および(または) 3' 末端でのフランキング配列の追加、または核酸塩基、砂糖および(または)リン酸塩部分、例えば分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく、ホスホロチオエートまたは 2'O-メチルの使用が含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの作成に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。

ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、それらの方法は生体内、試験管内および生体内外交通の使用に同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて行うことが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を始めとする好適な被検体に適用することが可能である。

本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物は、核酸および本発明のタンパク質、または相同核酸またはタンパク質、本発明のタンパク質に対する抗体、または相同タンパク質、擬態、アゴニスト、アンタゴニストまたは本発明のタンパク質の阻害剤、または相同タンパク質または核酸で構成してもよい。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも 1 つの安定化化合物のような他剤と共に投与することもでき、その場合には、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、D 形グルコース(ブドウ糖)および水など(これらに限定されるものではない) の滅菌した生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明に用いられる医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することができ、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸があるが、これらに限定されるものではない。

その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる、活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンのMaack Publishing社) の最新版を参照。

本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合、細胞培養試験法、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養試験法おいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルのいずれかにおいて、治療に有効な投与量を初期に推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、活性成分、例えば、核酸または本発明のタンパク質または相同タンパク質または核酸またはその断片、本発明のタンパク質の抗体または相同タンパク質の、特定の状態を治療するために十分な量のことである。治療効力および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準調剤手順、例えばED50 (50%の集団における治療に有効な用量: 50%有効量)およびLD50 (50%の集団に対して致死的な用量: 50%致死量)によって確定し得る。治療効果と毒性効果間の投与量の比は、治療指数、すなわちLD50／ED50比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養試験法および動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50 を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、本範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被検体に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するために調節する。配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、個別製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は最大で約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、通常、当分野の実務家に提供されている。当業者であれば、タンパク質または抑制剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。さらにポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、個別の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。

別の実施例では、本タンパク質に特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質または相同タンパク質の過剰発現または低発現に関連することを特徴とする状態または疾患の診断のため、または本発明のタンパク質または相同タンパク質、またはそのエフェクター、例えばアゴニスト(作用薬)、アンタゴニストまたは阻害(抑制)剤で治療を受けている患者を監視するための測定法において使用することが可能である。診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にある本タンパク質を検出する方法が含まれる。抗体は、その修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、その抗体を共有的または非共有的のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を用いることが可能であり、そのさまざまなレポーター分子を上述した。

ELISA、RIA、およびFACSを始めとするタンパク質を測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルの遺伝子発現を診断する基準を提供する。遺伝子発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物である被検体、望ましくはヒトから採取した体液または細胞を本タンパク質に対する抗体と結合させることによって決定する。標準複合体の形成量は、種々の方法によって定量化することが可能であるが、測光的な手段を用いることが望ましい。生検細胞の制御試料および疾患試料中に発現したタンパク質の量を標準値と比較する。標準値と被検体値の偏差は、疾患を診断するためのパラメータを樹立する。

本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNA分子とDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体における遺伝子発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、遺伝子発現の不在、存在および過剰を区別すること、および治療介入中のタンパク質レベルの調節を監視することが可能である。

一実施形態によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質または近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、それぞれのタンパク質をコードする核酸配列を同定することが可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは DNA または RNA であり、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来するか、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然遺伝子のイントロンを始めとしたゲノム配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することができ、その例としては 32P または 35S 等の放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブと共役したアルカリホスファターゼ等の酵素標識等が挙げられる。

本発明のタンパク質または相同性を有する核酸に特異的なポリヌクレオチド配列は、タンパク質の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の例には、肥満症または(および)糖尿病を始めとする代謝疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、肥満症または(および)糖尿病を始めとする代謝の疾患と障害に対して治療を受けている患者の進渉状況を監視することができる。ポリヌクレオチド配列は、変性遺伝子発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、定性アッセイまたは定量アッセイ、例えばサザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜系の技術、および PCR 法、またはディップスティック法、ピン ELISA 法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。

特定の実施形態では、本発明のタンパク質に特異的なヌクレオチド配列および相同核酸は、代謝症候群、肥満症および(または)糖尿病を始めとする種々の代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈性心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、または肝臓線維症のような関連障害における活性または誘発を検出するアッセイにおいて有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織の試料に添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後には、その試料を洗浄し、そしてそのシグナルを定量化して標準値と比較する。生検試料または抽出試料のシグナル量が、該試料中でヌクレオチド配列とハイブリダイズした類似試料のシグナル量と比べて著しく変化している場合、該試料における本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするヌクレオチド配列の変更値の存在は、関連疾患の存在を示す。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験または個々の患者の治療監視において、特定の治療上療法の有効性を評価することも可能である。

本発明のタンパク質または相同のタンパク質発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常プロファイルまたは標準プロファイルを樹立する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被検体から抽出した体液または細胞を、本発明のタンパク質または相同核酸をコードする核酸に特異的な配列またはその断片と結合させることによって達成し得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被検体から得た値を、既知量の十分に精製したポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被検者値間の偏差を用いて疾病の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を樹立して、治療プロトコルを開始した時点では、患者の発現レベルが正常患者において観察されるレベルに近づき始めるかどうかを評価するために、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返すことが可能である。連続アッセイから得た結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療効果を明らかにすることができる。

上記のような代謝疾患に関して、個人の生検組織における異常な量の転写物の存在は、疾患の発生に対する素因を示すか、または実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する手段を提供することが可能である。この種のより一層信頼のおける診断により、医療の専門家が予防措置または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発生またはさらなる進行を防止することが可能となる。

本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの診断上での追加用途は、PCR法の使用に関与し得る。このオリゴマーは、化学的に合成しても良いし、酵素的に作成するか、または組換えソースから作り出しても良い。オリゴマーは望ましくは 2 つのヌクレオチド配列から構成され、1 つはセンス方向(5'.fwdarw.3')、他の 1 つアンチセンス方向(3'.rarw.5')で、特定遺伝子または条件の識別のために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセットまたは縮重オリゴマーの集積である2つの同一オリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出および(または)定量化を行なうことができる。

また、本発明の別の実施例によれば、核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブを作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または周知の方法を用いて染色体の特異的な領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134 および Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Verma らの (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y. に記載のとおり) などの文献で論評されているように、FISH、FACS または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体 相補 DNA ライブラリが含まれる。この結果は、他の物理的な染色体マッピング技術および遺伝マップデータと相関し得る。遺伝地図データの例は、1994 Genome issue of Science (265:1981f) にある。物理的染色体地図上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得る。

本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを用いた、染色体標本および連鎖解析のような物理的なマッピング技術の in situ ハイブリダイゼーション法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これによって、位置クローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報が提供される。一旦疾患または症候群が、特定のゲノム領域への遺伝子連鎖、例えばAT〜11q22-23 (Gatti, R.A.らの(1988) Nature 336:577-580)によって大まかに位置決めがされると、その領域にマッピングする全ての配列は、さらなる研究のための関連遺伝子または調節遺伝子に相当し得る。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。

本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、試験管内モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物、例えば、ペプチドまたは低分子量有機化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合、乃至は該作用を調節または模倣する修飾因子／エフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、リガンドまたは基質を同定することができる。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。タンパク質とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすことも可能である。

生体内では、基質に対するCG7042、astray、またはstring 相同ホスファターゼの無修飾ポリペプチドの酵素性ホスファターゼ活性を測定することができる。そのホスファターゼの活性化は、シグナル伝達分子または環境的な影響のような細胞外のまたは細胞内の刺激によって天然の状況において誘導することが可能である。ホスファターゼを含むシステムは、それが細胞または無細胞の環境の生物体、組織、培養であれ、外因的にこの刺激を適用することによって、または種々の技術でこの刺激を模倣することによって作成することが可能であり、さらにその一部を以下に記載した。ホスファターゼを含んだシステムは、(i) 体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、代謝疾患に関連する疾患および障害の診断、試験、予防、および治療の目的のため、(ii) 本発明の遺伝子またはそれらのコード化されたポリペプチに影響を及ぼす治療薬候補、医薬品または薬物を同定または確証する目的のため、(iii) 本発明の遺伝子によってコードした活性化ポリペプチドを含んだ細胞可溶化液を作成する目的のため、(iv) 本発明の遺伝子によってコードしたこのソース活性化ポリペプチドから分離する目的のため産生することが可能である。

しかも、その生理的基質またはその誘導体に対するCG7042、astray、またはstring 相同タンパク質の活性は、細胞系アッセイにおいて測定し得る。また、薬剤は、リン酸化および脱リン酸、ファルネシル化、パルミトイル化、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理、細胞内局在性および劣化のようなのような本発明のタンパク質の翻訳後の修飾を妨害する可能性もある。その上、薬剤は、本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響し、または異種様式で、他のタンパク質、例えば、限定するものではないが、ドッキングタンパク質、酵素、受容体、オンチャンネル、脱共役タンパク質、または翻訳因子を備えた本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響を及ぼし得る。また、薬剤は、タンパク質機能(作用)、例えば、限定するものではないが、下流のシグナル伝達に必要とされる他のタンパク質を備えた本発明のタンパク質の物理的相互作用に作用する可能性がある。

タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で周知である。例えば、本発明のタンパク質に由来する蛍光標識ペプチドの結合タンパク質への結合は、分極の変化によって検出し得る(その逆の場合も同様)。結合相手は完全長タンパク質であっても、完全長タンパク質としての結合相手の1つであっても、単なるペプチドであってよいが、その両方の結合相手が共に蛍光標識される場合、その結合は、蛍光色素の他の蛍光色素への蛍光エネルギー転移(FRET)によって検出することができる。しかも、種々の市販されている、タンパク質間相互作用の検出のために好適なアッセイ原理は当分野で周知であり、例えば、限定するものではないがAlphaScreen (PerkinElmer社)またはAmersham社のシンチレーション近接測定法(SPA)が挙げられる。 あるいは、本発明のタンパク質の細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光標識され、両タンパク質の相互作用が、限定するものではないが、例えばCellomics社またはEvotecOAI社の開発による細胞イメージング読取装置を用いて両タンパク質の同時転座分析によって検出される細胞を利用したスクリーニングアッセイの基盤であり得る。すべての場合において、2つの以上の結合相手は互いに異なるタンパク質であり、その結合相手の1つは本発明のタンパク質であるか、または二量体化および(または)オリゴマー形成の場合は本発明のタンパク質自体であリ得る。1つ(唯一ではない)の対象の標的機構がそのようなタンパク質／タンパク質相互作用である本発明のタンパク質は、CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同タンパク質である。

本発明のタンパク質の酵素活性を判定する測定法は当分野で周知である。また、当技術分野で周知なものには、受容体リガンド結合または受容体下流のシグナル伝達を測定するための種々のアッセイフォーマットもある。

例えば、受容体研究のための放射性リガンド結合方法は、Keen M. (エディタ、(1998) Receptor Binding Techniques、Humana Inc.) によって記載されている。

しかも、市販のアッセイはcAMP レベルを測定する。本アッセイは、内因性cAMP と外因的に付加した標識cAMP 間の競合に基づくものである(例えばAlphaScreen; PerkinElmer 社)。

あるいは、カルシウムシグナル伝達が、カルシウムイオンフラックス測定することができるスクリーニングアッセイの基準でもあり得る。 例えば、排他的ではないが、広範に利用されているのは、Molecular Device 社によって開発された細胞内カルシウム測定用の蛍光ベースのアッセイ法である。このアプリケーションは、例えば、Chambers C. らの(2003) Comb Chem High Throughput Screen. 6: 355-362 に記載されている。

特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書で使用した用語「薬剤」とは、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品のことである。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上での相互作用に必要な機能グループが含まれ、そして典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には、多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。

候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを始めとするさまざまな原料から取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および特異的合成のための多くの手段が提供されている。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に作り出すことができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を介して、天然または合成的に作り出したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを作り出すことが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上での類似体を作り出すために、特異的またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合実験である場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。

また、候補薬剤を、さらに以下に記載したように修飾を含むかまたは含まないタンパク質、ペプチド、脂質、または有機化合物のようなホスファターゼ基質などが本発明のタンパク質またはタンパク質断片によって非リン酸化されるホスファターゼアッセイにおいて見出すことも可能である。治療薬候補は、本発明のタンパク質の酵素性活性を増加または減少する能力によって同定することが可能である。ホスファターゼ活性は、非リン酸化に起因する基質の化学的、物理的または免疫学的な特質の変化によって検出することが可能である。一実施例としては、本発明のポリペプチドによって触媒したホスファターゼ基質からの放射性同位体的に標識したリン酸基の切断が挙げられるであろう。基質の非リン酸化に継いで、当技術分野で周知の技術を用いて基質オートラジオグラフィーを検出することが可能である。

さらに別の実施例によれば、その非リン酸化に起因する基質の質量変化は、質量分析技術によって検出することが可能である。また、基質のリン酸化状態と非リン酸化状態とを区別する分析物を有する基質のリン酸化状態を検出することもできる。そのような分析物は、基質のリン酸化形態とび非リン酸化形態に対して異なる親和性を有することによって、またはリン酸基に対して特定の親和性を有することによって作用することがある。そのような分析物は、限定するものではないが、抗体または抗体誘導体、組換え(型)の抗体様構造、タンパク質、核酸、分子を含んだ複合型の金属イオン、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、親和性クロマトグラフィーマトリックスまたはその他任意の基質に対してリン酸化依存選択性を有する分子であり得る。

そのような分析物は、酵素性反応中またはその後に固形担体上に固定したホスファターゼ基質を検出するために利用することができる。分析物が抗体である場合、その基質に対する結合は、HarlowおよびLane、1998、Antibodies、CSH Lab Press、NY.において記載されているように、種々の技術によって検出することができる。 分析物分子が抗体でない場合には、その結合はその化学的、物理的または免疫学的な特質が内生的にその結合に関連することによって、またはその結合に対して人工的に操作することによって検出することが可能である。

さらに別の実施例によれば、ホスファターゼ基質は、基質のリン酸化状態の分析に好適な信号を作成するために、結合または検出を促進する目的で設計された特色または内因性の特色を有することが可能である。これらの特色は、限定するものではないが、ビオチン分子またはその誘導体、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ部分、6以上の連続したヒスチジン残基の1部分、アミノ酸配列またはエピトープ(抗原決定基)タグとしての機能(作用)に対するハプテン、蛍光色素、酵素または酵素断片であり得る。ホスファターゼ基質は、これらまたは他の特色に対して、立体障害を回避するために分子のスペーサアームを用いて連鎖することが可能である。

一実施例によれば、ホスファターゼ基質は蛍光色素を用いて標識することが可能である。溶液中における標識基質に対する分析物の結合の後に、文献(例えば、Parker, G. J. らの(2000) J. Biomol. Screen. 5: 77-88 を参照) において記載されているように蛍光偏光の技術を行うことが可能である。この実施例の変形例によれば、蛍光性トレーサー分子は、分析物がホスファターゼ活性を検出するために、当業者であれば間接蛍光偏光として公知の技術によって基質と競合することが可能である。蛍光染色標識リン酸化ペプチドのホスホリル基に対して特異的結合をする際にdark quencher (失活剤) としての機能を果たす鉄化合物を利用する市販アッセイ。切断は、ホスファターゼによって非リン酸化された後、染色標識ペプチド基質の観察される蛍光放出強度の増大を結果としてもたらす(例えばPierce)。

使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、PCT出願公開番号WO84／03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物をプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で合成する。試験用化合物は、本発明のタンパク質またはその断片と反応させ洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。

別の実施例によれば、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験化合物と特に競合し、競合薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。

本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて、遺伝子導入動物または部位特定の遺伝子改変を細胞株において作成することができる。これらの遺伝子導入非ヒト動物は、生体内における本発明のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子導入動物、特に哺乳動物の遺伝子導入動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの検討のためのモデル系として役立つことができる。代謝障害を有する種々の非ヒトモデルを用いて、本発明のタンパク質のエフェクター／修飾因子を検査することができる。本発明のタンパク質の異所性発現(例えば過剰発現または発現の欠如)、特定の給餌条件、および(または)生物学的活性化合物の投与により、代謝障害のモデルを作ることができる。

本発明の一実施例によれば、そのようなアッセイでは、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病マウスモデルが使用される (例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(前出のBruning らの1998 を参照)。感受性の野生型マウス(例えばC57Bl／6)は、高脂肪食を与えた場合、類似の症状を示す。そのようなマウス菌株における本発明のタンパク質発現の検査に加えて(実施例セクションを参照)、これらのマウス用いて、候補エフェクター／修飾因子の投与が、例えば肝臓、血漿、または脂肪組織における脂質蓄積を改変するかどうかを、FPLC、比色法、血糖検査、インスリン耐性検査などおよびその他当技術分野で周知の標準アッセイなどを用いて検査することもできる。

遺伝子導入動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座を改変する場合、非ヒト胚幹細胞における相同組換えを介して作ることが可能である。別法としては、本発明のタンパク質をコードする核酸構成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスなど動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。修飾された細胞または動物は、本発明のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。例えば、一連の小欠失および(または)置換を、本発明のタンパク質をコードする遺伝子において行い、膵臓の分化などにおけるタンパク質の特定のドメイン、機能の役割を決定することが可能である。

その上、所定の特異的構成物様の本発明の遺伝子変異体には、本発明のタンパク質発現または優性阻害型突然変異の発現を阻止するアンチセンス分子が含まれる。本発明の遺伝子発現の上方制御が表現型における変化の容易な検出を結果としてもたらす場合、例えば、lac-Z またはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。

また、通常には発現されない細胞や組織、または異常発生中の細胞や組織には、本発明の遺伝子発現またはその変異体を提供することも可能である。しかも、本発明のタンパク質発現を通常には産生されない細胞中に提供することによって、細胞行為の変化を誘引することが可能である。

相同組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対するホモロジー領域も含まれる。ランダム統合のためのDNA構成物には、組換えを仲介するための相同領域が含まれる必要はない。都合よく、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーを含む。ランダム統合のためのDNA構成物には、本発明のタンパク質、調節エレメント(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は当分野で周知である。非ヒト胚幹(ES)細胞は、ES細胞株を用いても良いし、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得しても良い。そのような細胞は、適切な線維芽細胞-支持細胞層の上で増殖さしめてから、白血病抑制因子(LIF) の存在下で増殖する。

非ヒトESまたは胚細胞または体細胞の多能性ヒト幹細胞を形質移入する場合、それらの細胞を用いて遺伝子導入動物を作り出すことが可能である。形質移入後、細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同組換えまたは構成物の統合の発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目の過排卵雌から取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小凹部に入れる。ES細胞をトリプシン処理し、そしてその修飾細胞は桑実胚に密接して凹部に置く。次の日には、凝集体を偽妊娠の雌の子宮角に移す。次に、雌に出産せしめる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1世代)。F1-世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾した雄および雌を交尾させ、ホモ接合性の子孫を作り出す。その遺伝子改変が成長の過程における死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植用または類遺伝子性移植用、または移植、または体外培養用として維持することができる。遺伝子導入動物は、動物モデル、家畜など、例えばマウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、ブタなどのような任意の非ヒト哺乳動物であり得る。遺伝子導入動物は、機能的研究、薬物スクリーニングおよび他の用途において用いることが可能であり、そして生体内における本発明タンパク質の機能および調節の研究に有用である。

また、最終的に、本発明は少なくとも下記の 1 つから成るキットに関するものである。
(a) 本発明のタンパク質または(および)その機能的断片の核酸分子コーディング;
(b) 本発明のタンパク質または(および)機能的断片または(および)そのアイソフォーム;
(c) (a) の核酸から成るベクター;
(d) (a) の核酸または(c) のベクターから成る宿主細胞;
(e) (a) の核酸によってコード化されたポリペプチド;
(f) (a)の核酸によってコード化された融合ポリペプチド;
(g) (a) の核酸、および(または) (b)、(e)、および(または) (f) のポリペプチドの抗体、アプタマーおよび(または)別のエフェクター／修飾因子、および
(g) (a) の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。

本キットは、上述のように、診断用または治療用またはスクリーニング用に使用することが可能である。本キットには、さらに取扱説明書が含まれる場合がある。

各図が示すのは下記のとおりである:
図1 は、ショウジョウバエCG7042 (Gadflyアクセッション番号)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、HD-EPコレクションの全ハエを含有する対照(「EP対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、注釈した転写単位へのPベクター統合(「HD-EP37139」と呼ぶ、コラム2)によって引き起こされるHD-EP(3)37139 ハエの中性脂肪含有量の変化である。

図2 は、変異型CG7042 (Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す。

図3 は、哺乳動物の(マウス)組織におけるCG7042 (GadFly アクセッション番号) ホモログの発現を示す。

図3A は、野生型マウス組織における二重特異性ホスファターゼTS-DSP1 (TS-DSP1) に類似するタンパク質発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図3B は、異なるマウスモデルにおけるTS-DSP1 発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図3C は、標準食を与えたマウスと比較した高脂肪食を与えたマウスにおけるTS-DSP1 発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図3D は、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のTS-DSP1
発現のリアルタイム PCR 分析示す。

図4 は、ショウジョウバエastray (GadFly アクセッション番号CG3705) 変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、HD-EPコレクションの全ハエを含有する対照(コラム1では「EP対照」と呼ぶ) と比較した、注釈した転写単位へのPベクター統合(それぞれ、コラム2 では「HD-EP36956」と呼び、コラム3 では「HD-EP36964」と呼ぶ)によって引き起こされるHD-EP(3)36956 およびHD-EP(3)36964 ハエの中性脂肪含有量の変化である。

図5 は、変異型astray (aay; Gadfly アクセッション番号CG3705) 遺伝子座の分子構造を示す。

図6 は、哺乳動物(マウス)組織におけるastray ホモログの発現を示す。

図6A は、野生型マウス組織におけるホスホセリンホスファターゼ(Psph) 発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図6B は、異なるマウスモデルにおけるPsph 発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図6C は、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のPsph 発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図7 は、 哺乳動物(ヒト)組織におけるヒトastray ホモログの発現を示す。ここに示したのは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト脂肪細胞におけるホスホセリンホスファターゼ(PSPH) 発現のマイクロアレイ分析である。

図8 は、ショウジョウバエstring (GadFly アクセッション番号CG1395) 変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、HD-EPコレクションの全ハエを含有する対照(「EP対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、注釈した転写単位へのPベクター統合(コラム2 では「HD-EP36936」と呼ぶ) によって引き起こされるHD-EP(3)36936 ハエの中性脂肪含有量の変化である。

図9 は、変異型string (Gadfly アクセッション番号CG1395) 遺伝子座.の分子構造を示す。

図10 は、哺乳動物(ヒト) 組織におけるヒトstring ホモログの発現を示す。ここに示したのは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト脂肪細胞における細胞分裂周期25B (CDC25B) 発現のマイクロアレイ分析である。

図11 は、ショウジョウバエCG1401 (Gadflyアクセッション番号)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、HD-EPコレクションの全ハエを含有する対照(「EP対照」と呼ぶ、コラム1)と比較した、注釈した転写単位へのPベクター統合(コラム2 では「HD-EP36858」と呼ぶ) によって引き起こされるHD-EP(3)36858 ハエの中性脂肪含有量の変化である。

図12 は、変異型CG1401 (Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す。

図13 は、哺乳動物の(マウス)組織におけるCG1401 (GadFly アクセッション番号) ホモログの発現を示す。

図13A は、野生型マウス組織における理研ｃＤＮA 4921514I20 遺伝子(4921514I20Rik)発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図13B は、異なるマウスモデルにおける4921514I20Rik 発現のリアルタイムを示す。

図13C は、標準食を与えたマウスと比較した高脂肪食を与えたマウスにおける4921514I20Rik 発現のリアルタイムPCR分析を示す。

図13D は、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の4921514I20Rik 発現のリアルタイム PCR 分析を示す。

図14 は、哺乳動物の(マウス) 組織におけるヒトCG1401 (GadFly アクセッション番号) ホモログの発現を示す。ここに示したのは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト脂肪細胞におけるカリン5 (CUL5) 発現のマイクロアレイ分析である。

各実施例は本発明を図解するものである:
実施例 1: 中性脂肪含有量の測定
変異体ハエはハエ変異在庫コレクションから取得する。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加給餌をパン酵母(サッカロミセスセレビジエ)とともに EPラインHD-EP(3)37139、HD-EP(3)36956、HD-EP(3)36964、HD-EP(3)36936、およびHD-EP(3)36858 に与えた。EPベクターを生存能力のあるホモ接合性統合として含有するショウジョウバエの中性脂肪含有量の平均変化を対照ハエ (図1、4、8、および11をそれぞれ参照) と比較検討した。中性脂肪含有量の定量のため、ハエを5分間、90℃ にて水溶性の緩衝液中において水浴を用いてインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらなる 5 分間 90℃ にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma 中性脂肪(INT 336-10 または-20)アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエの中性脂肪含有率抽出を決定した。基準としてBIO-RAD DCタンパク質アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って同一抽出のタンパク質含有量を測定した。この実験およびアッセイを何度か繰り返した。

EP コレクション(「EP対照」と呼ぶ)の全ハエの平均中性脂肪値を100%として、図1、4、8、および11の第1コラムにそれぞれ示す。測定値の標準偏差は細いバーとして示した。

HD-EP(3)37139 ホモ接合性ハエ(図1のコラム2、「HD-EP37139」)、HD-EP(3)36956 およびHD-EP(3)36964 ホモ接合性ハエ(図4のコラム2、「HD-EP36956」、および図4のコラム3「HD-EP36964」)、HD-EP(3)36936 ホモ接合性ハエ(図8のコラム2、「HD-EP36936」)、およびHD-EP(3)36858 ホモ接合性ハエ(図11のコラム2、「HD-EP36858」) は、対照群(図5のコラム2、「HD-EP36936」) と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す。HD-EP(3)36858ホモ接合性ハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図7のコラム2 では「HD-EP36858」)。. 以上の点から、遺伝子活性の減少は、エネルギー貯蔵中性脂肪の代謝における変化の原因となる。

実施例 2: 代謝制御に関連するショウジョウバエ遺伝子の同定
本発明のタンパク質をコードする核酸を、プラスミド救出技術を用いて同定した。EP ベクター(本明細書中でHD-EP(3)37139、HD-EP(3)36956、HD-EP(3)36964、HD-EP(3)36936、およびHD-EP(3)36858)統合に近接して局在するゲノムDNA 配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってそのベクター統合部位、および対応する遺伝子を同定した。これらの遺伝子座位の分子構造を、図2、5、9、および12 に示した。

HD-EP(3)37139 ベクターは、ｃＤＮA CG7042-RA のリーダー配列、およびセンス方向における塩基対49でのｃＤＮA CG7042-RB に対してホモ接合性で生存統合する。HD-EP(3)37139 のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座 3L, 61B2 にある。図 2 では、ゲノム DNA 配列を、HD-EP(3)37139 の統合部位を含む図の中間における縮尺した黒の二重矢印としてのアセンブリによって表した。チェックマークは、ゲノム DNA (チェックマークにつき 1000 塩基対) の塩基対における長さに相当する。図上部の灰色矢印は BAC クローンを表し、図最上部の黒色矢印は染色体断面図を表す。ショウジョウバエラインHD-EP37139のPエレメントの挿入部位を黒色の三角形として図下半部に示し、標識化する。予測遺伝子 (Berkeley ショウジョウバエゲノムプロジェクト GadFly リリース3 によって予測されたように) のcＤＮA 配列は濃灰色バー (エキソン) として示し、濃灰色線 (イントロン) によって連鎖し、標識化する (図下部キーも参照)。ショウジョウバエCG7042 遺伝子(GadFly アクセッション番号) の予測cDNA図下半部に示した。

図5、9、および12 では、ゲノムDNA 配列を、HD-EP(3)36956、HD-EP(3)36964、HD-EP(3)36936、またはHD-EP(3)36858の各ラインのベクター統合部位が含まれる中間に、黒の点線としてアセンブリによって表す。番号はゲノムDNA座標を表す。図の上部はセンス鎖 「+」を表し、下部はアンチセンス鎖 「-」を表す。ショウジョウバエのラインにおけるPエレメントの挿入部位は、「Pエレメント+」または(および)「Pエレメント-」に三角形またはボックスとして示した。転写したDNA配列(EST)を「EST +」、「EST -」、「IPI +」、または(および)「IPI -」ラインにおいて灰色バーとして示し、そして予測cDNAは、「cDNA +」および／または「cDNA -」ラインにおけるバーとして示した。cDNAの予測エキソンは濃灰色バーとして示し、そして予測イントロンは薄灰色バーとして示す(図下部の凡例も参照)。

HD-EP(3)36956 ベクターは、アンチセンス方向におけるCG3705-RA の370 塩基対 5' にホモ接合性で生存統合し、HD-EP(3)36964 ベクターは、アンチセンス方向におけるCG3705-RA の転写始動の1003 塩基対 3' にホモ接合性で生存統合し、astray (aay; GadFly アクセッション番号CG3705と呼ぶ) として同定される。HD-EP(3)36956 およびHD-EP(3)36964 ベクター統合の染色体局在部位は、遺伝子座 3L、67B1 (FlyBaseによれば)、67B4 (GadFly リリース3 によれば) にある。図5 では、ゲノムDNA座標は、染色体3L上の9379500位置で始まり、9382625位置で終わる)。ショウジョウバエHD-EP(3)36956 およびHD-EP(3)36964 ラインにおけるPエレメントの挿入部位は、「Pエレメント」ラインの三角形として示し、標識化した。 astray 遺伝子の予測ｃＤＮA に示した「ｃＤＮA +」ラインを標識化する(aay、CG3705 と呼ぶ)。対応EST を「EST +」ラインに示した。

HD-EP(3)36936 ベクターは、センス方向におけるショウジョウバエ遺伝子の塩基対144 でｃＤＮA にホモ接合性に生存統合し、string (GadFly アクセッション番号CG1395) として同定する。ベクター統合HD-EP(3)36936 の染色体局在部位は遺伝子座 3R、98F13 (FlyBase によれば)、99A5 (GadFly リリース3 によれば) にある。図9 では、ゲノムDNA座標は、染色体3R上の25065000位置で始まり、25075000位置で終わる)。ショウジョウバエHD-EP(3)36936ラインにおけるPエレメントの挿入部位を「Pエレメント-」ラインに三角形として示し、標識化する。「ｃＤＮA -」ラインに示したstring 遺伝子の予測ｃＤＮA を標識化する(string 、CG1395 と呼ぶ)。対応EST を「EST -」ラインに示した。

HD-EP(3)36858 ベクターは、アンチセンス方向におけるショウジョウバエ遺伝子のｃＤＮA の1663 塩基対 5' にホモ接合性で生存統合し、CG1401-RA (GadFly アクセッション番号CG1401と呼ぶ) として同定する。ベクター統合HD-EP(3)36858 の染色体局在部位は、遺伝子座 3R、98F4 (FlyBase によれば)、98F6 (GadFly リリース3 によれば) にある。図12 では、ゲノムDNA座標は、染色体3R上の24873000位置で始まり、24873000位置で終わる)。ショウジョウバエHD-EP(3)36858ラインにおけるPエレメントの挿入部位を「Pエレメント+」ラインにボックスとして示し、標識化する。「cDNA -」ラインに示したCG1401 遺伝子の予測cDNA を標識化する。対応EST を「EST -」ラインに示した。

上記の遺伝子発現は、転写単位へのベクター統合によって影響され、エネルギー貯蔵中性脂肪量の変化をもたらし得る。

実施例 3: ヒト相同遺伝子およびタンパク質の同定
それによってコード化された中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質を、BLASTアルゴリズム探索を用いて、公的に利用できる配列データベースにおいてさらに分析し、そして哺乳動物のホモログを同定した(表1を参照)。

用語「GenBankアクセッション番号に示されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド」とは、対応するGenBankアクセッション番号下に保管されるヌクレオチド配列の発現可能な遺伝子に関するものである。用語「GenBankアクセッション番号」とは、NCBI GenBankデータベースエントリに関するものである(Bensonらの(2000) Nucleic Acids Res.28: 15-18を参照)。 Drosphila CG7042、astray、string 、およびCG1401 に対して相同性を有する配列を、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI) の非重複タンパク質データベースの公的に利用できるプログラムBLASTP 2.2.3 を用いて同定した(Altschul S.F. らの(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 を参照)。

表 1: ショウジョウバエ(Dm) 遺伝子のヒトホモログ

CG7042、astray、string 、または CG1401 相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、表1に記載の核酸である。

また、ヒト二重特異性ホスファターゼ19 は、特許出願WO01／73060、WO01／12819、WO01／81590、およびWO00／60099 においても参照される。また、ヒト細胞分裂周期25A は、特許出願WO93／10242、WO02／070680、およびWO01／27077 においても参照される。 また、ヒト細胞分裂周期25C は、特許出願WO96／12820、EP1096014、WO01／16300、およびWO98／30680 においても参照される。

本発明のポリペプチドをコードするマウス相同cDNA を、GenBank アクセッション番号NM_024438 (CG7042; Mm 二重特異性ホスファターゼ19に対するマウスホモログ)、NM_133900 (astray; Mm 発現配列AI480570に対するマウスホモログ)、NM_007658 (string ; Mm 細胞分裂周期25 ホモログA、Cdc25aに対するマウスホモログ)、NM_023117 (string ; Mm 細胞分裂周期25 ホモログB、Cdc25bに対するマウスホモログ)、NM_009860 (string ; Mm 細胞分裂周期25 ホモログC、Cdc25cに対するマウスホモログ)、XM_134805 (CG1401; Mm 理研ｃＤＮA 4921514I20 遺伝子に対するマウスホモログ) として同定した。

実施例4: 哺乳動物(マウス)の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、さまざまなマウス菌株(望ましくは標準モデル系における肥満症および糖尿病研究であるマウス菌株C57Bl／6J、C57Bl／6 ob／obおよびC57Bl／KSdb／db)は、Harlan Winkelmann(33178 Borchen、Ger many) から購入し、一定の温度に維持し(望ましくは22℃)、湿度を40パーセントおよび望ましくは明暗サイクルを14／10時間とした。マウスには標準食を与えた(例えばssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号niff M-Z V1126-000)。絶食実験(「絶食野生型マウス」)に関しては、野生型マウスを、食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた(例えば、Schnetzler B. らの 1993, J Clin Invest 92: 272-280, Mizuno T.M. らの 1996, Proc Natl Acad Sci U S A 93: 3434-3438 を参照)。さらなる実験では、野生型 (wt) マウスに制限食 (望ましくは Altromin C1057 mod 制御、4.5% の粗脂肪) または高脂肪食 (望ましくは Altromin C1057 mod. 高脂肪、23.5% の粗脂肪) を与えた。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って単離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで 零下80℃にて保管した。

本発明において開示した試験管内分化におけるタンパク質の役割を分析するため、哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞 (例えば、Green H. および Kehinde O., 1974, Cell 1: 113-116) をAmericanTissue Culture Collection (米国バージニア州ハナサスのATCC、; ATCC- CL 173) から入手した。3T3-L1細胞は線維芽細胞として維持し、従来技術に記述されているように脂肪細胞に分化した(例えば、Qiu Z. らの 2001、J. Biol. Chem. 276: 11988-11995; Slieker L.J. らの 1998、BBRC 251: 225-229)。手短に言えば、細胞はDMEM／10% FCS (Invitrogen社、Karlsruhe、ドイツ)において50,000細胞／ウェルを6ウェル プラスチック皿に二通りにプレーティングし、5%の二酸化炭素、37℃の加湿環境において培養した。集密日(0日目: d0と定義した)に、細胞をDMEM／HamF12 (3:1; Invitrogen社)、フェチュイン(300マイクロg／ml; Sigma社、Munich、ドイツ)、トランスフェリン(2マイクロg／ml; Sigma社)、パントテン酸(17マイクロM; Sigma社)、ビオチン(1マイクロM; Sigma社)、およびEGF (0.8nM; Hoffmann-La Roche社、Basel、スイス)を含んだ無血清(SF)培地に移した。分化は、デキサメサゾン(DEX; 1マイクロM; Sigma社)、3-メチル-イソブチル-1-メチルキサンチン(MIX; 0.5mM; Sigma社)、およびウシインスリン(5マイクロg／ml; Invitrogen社)を添加することによって誘導した。集密日(d4)後の4日間は、分化が完了するまで、細胞をウシインスリン(5マイクロg／ml)を含んだSF培地中に保持した。分化手順の異なる時点、第0日目(密集日)を始めに、第2日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチンの追加)、および10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。

RNA をTrizol試薬 (例えば、ドイツ KarlsruheのInvitrogen社製)を使用して組織および細胞から分離し、さらにRNeasy キット(例えば、ドイツ Qiagen社製) と共に DNase処理を使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全RNAを逆転写(望ましくはInvitrogen社、Karlsruhe、ドイツからのSuperscriptII RNaseH- Reverse Transcriptaseを利用する)し、全RNAをTaqman分析の対象とし、望ましくはTaqman2xPCR Master Mix (Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ; このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaq ゴールドDNポリメラーゼ、Amper ase UNG、dUTP を有する dNTP、受動基準 Rox および最適化された緩衝液成分などが含まれる) を GeneAmp 5700 配列検出システム (Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ) 上に用いた。

Taqman分析は、望ましくは下記のプライマー／プローブペアを用いて実施した:
二重特異性ホスファターゼTS-DSP1 (TS-DSP1) 配列(GenBank アクセッション番号AK018369) に類似するマウスタンパク質増幅用:
マウスTS-DSP1 フォーワードプライマー(配列識別番号: 1): 5'- ACT GCC CTG TCG TTG GTG -3'; マウスTS-DSP1 リバースプライマー(配列識別番号: 2): 5'- AGT TGT TCC ATG AAG CCA GGA -3'; マウスTS-DSP1 Taqman プローブ(配列識別番号: 3): (5／6-FAM)- AGA GGC GAG ACC ATC CAT ATG TCC GA -(5／6-TAMRA)。

マウスホスホセリンホスファターゼ(Psph) 配列(GenBank アクセッション番号NM_133900) の増幅用:
マウスPsph フォーワードプライマー(配列識別番号: 4): 5'- TGG CAC TGA TCC AGC CCT -3'; マウスPsph リバースプライマー(配列識別番号: 5): 5'- TCA GAT GTG GCG GGT GCT -3'; マウスPsph Taqman プローブ(配列識別番号: 6): (5／6-FAM)- CAG GGA TCA AGT CCA GAG GCT CCT AGC T - (5／6-TAMRA)。

マウス理研ｃＤＮA 4921514I20 遺伝子(4921514I20Rik) 配列(GenBank アクセッション番号XM_134805) の増幅用:
マウス4921514I20Rik フォーワードプライマー(配列識別番号: 7): 5'- TTG CAA CGG AAC TCC CAG -3'; マウス4921514I20Rik リバースプライマー(配列識別番号: 8): 5'- TGG GTG AGT TGA CTT GAG GGT C -3'; マウス4921514I20Rik Taqman プローブ(配列識別番号: 9): (5／6-FAM)- TAG TAG CTT TTC CCA AGC TCA AAC GGC AAG - (5／6-TAMRA)。

図では、相対RNA発現をX軸上に示す。図3A-C、6A-B、および13A-Cでは、検査した組織をX軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。図3D、6C、および13D では、X軸は時間軸を表す。「d0」は第0 (ゼロ)日目(実験開始日)を指し、「d2」〜「d10」は脂肪細胞分化の第2日目〜第10日目を指す。

代謝における本発明のタンパク質の機能(作用)は、異なる組織における転写物の発現の分析、および脂肪細胞分化における役割の分析によって、本発明でさらに確証した。

本発明の一実施例では、本発明のタンパク質発現を研究するため、レプチン経路に遺伝子ノックアウトを保有するマウスのような(例えば、ob／ob (レプチン) またはdb／db (レプチン受容体／リガンド) マウス) インスリン耐性および(または)糖尿病マウスモデルを使用した。 そのような糖尿病典型的な症状を呈するマウスは肝脂質蓄積を示し、高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(Bruning J.C. らの(1998) Mol. Cell. 2: 559-569 を参照)。

また、さらなる発明の実施の形態では、本発明のタンパク質をコードする mRNA の発現も、高脂肪食を与えた場合に糖尿病、脂質蓄積、および血漿脂質高値の徴候を示す感受性の野生型マウス (例えば、C57Bl／6) において検討した。

発現プロファイリングの諸研究により、本発明のタンパク質の特定の関連性が哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認される。

Taqman 分析は、二重特異性ホスファターゼTS-DSP1 (TS-DSP1) に類似するタンパク質がいくつもの哺乳動物組織において発現されることが明らかにされており、その発現レベルは、脳および視床下部において最も高く、次いで他の組織、例えば白色脂肪組織(WAT)、茶色脂肪組織(BAT)、筋肉、精巣、および肺臓において高いことが分かっている。さらに、TS-DSP1 は、肝臓、結腸、小腸、心臓、脾臓、および腎臓.において低いが強いレベルで発現される。また、図3A に示したように、野生型マウスの膵臓および骨髄において著しい発現を検出することも可能である。発明者らは、例えば、TS-DSP1 の発現が、野生型マウスと比較して絶食マウスのBAT、脳、小腸および骨髄において下方制御されることを見出した。さらに、TS-DSP1の発現は、野生型マウスと比較して遺伝的に誘発された肥満マウス(ob／ob)の骨髄において下方制御される。(図3B を参照)。高脂肪食を与えた野生型マウスでは、図3Cに示したように、TS-DSP1の発現はBATおよび筋肉において上方制御される。本発明では(図 3D を参照)、TS-DSP1 の mRNA が成熟脂肪細胞への分化中に発現および制御されることを明らかにする。以上の点から、TS-DSP1 タンパク質が脂質生成において役割を果たす可能性がある。

野生型マウスの代謝活性組織における TS-DSP1 の発現も、代謝障害を研究するために使用される異なる動物モデルにおける TS-DSP1 の調節も、この遺伝子がエネルギー恒常性において中枢的な役割を果たすことを示唆する。この仮説は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の発現によって支持される。

Taqman 分析により、ホスホセリンホスファターゼ(Psph)がいくつもの哺乳動物組織において発現されることが明らかにされており、その発現レベルは、野生型マウスの精巣、WAT およびBATにおいて最も高く、次いで、野生型マウスの他組織、例えば筋肉、肝臓、視床下部、脳結腸、心臓、肺臓、脾臓および腎臓において高いことが分かっている。その上、図6A に示したように、Psph は、野生型マウス小腸、膵臓、および骨髄においても低いが強いレベルで発現される。発明者らは、例えば、Psph の発現が、野生型マウスと比較して絶食マウスのBATおよび骨髄において下方制御され、結腸において上方制御されることを見出した(図6B を参照)。本発明では(図6C を参照)、Psph のmRNA が成熟脂肪細胞への分化中に発現および上方制御されることを明らかにする。以上の点から、Psph タンパク質が脂質生成において役割を果たす可能性がある。

代謝障害を研究するために使用される動物モデルにおいて制御されたPsph の発現は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の上方制御と共に、この遺伝子がエネルギー恒常性において中枢的な役割を果たすことを示唆する。

Taqman 分析により、いくつもの哺乳動物組織において理研ｃＤＮA 4921514I20 遺伝子(4921514I20Rik)が発現されることが明らかにされており、その発現レベルは、WAT、視床下部、および小腸において最も高く、次いで他の組織、例えば肝臓、脳、精巣、結腸、脾臓、および腎臓において高いことが分かっている。その上、4921514I20Rik は、図13A に示したように、野生型マウスのBAT、筋肉、心臓、肺臓、および骨髄において低いが強いレベルで発現される。発明者らは、例えば、野生型マウスと比較すると、4921514I20Rik が遺伝的に誘発された肥満マウス(ob／ob) の骨髄において下方制御されることを見出した。その上、野生型マウスに比較すると、4921514I20Rik が絶食 マウスのBAT、脾臓と骨髄において下方制御される (図13B を参照)。高脂肪食を与えた野生型マウスでは、図13Cに示したように、4921514I20Rik の発現はBATおよび肝臓において上方制御される。本発明では(図 13D を参照)、4921514I20Rik のmRNA が成熟脂肪細胞への分化中に発現および一過性に上方制御されることを明らかにする。以上の点から、4921514I20Rik タンパク質が脂質生成において重要な役割を果たす可能性がある。

代謝障害を研究するために使用される異なる動物モデルの代謝活性組織(例えばBATおよび肝臓)において制御された4921514I20Rik の発現は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の制御発現と共に、この遺伝子がエネルギー恒常性において中枢的な役割を果たすことを示唆する。

実施例5. ヒト組織における本発明のタンパク質の転写物の発現差異の分析
実施例4 において記載したように、ヒト初代脂肪組織からのRNA調整を行った。ターゲット作成、ハイブリダイゼーションおよび走査を製造者説明書に記載されたように実施した( Affymetrix Technical Manual、2002、obtained from Affmetrix、Santa Clara、USAを参照)。

図7、10、および14 においてX 軸は時間軸に相当し、これらの図で示したのは、脂肪細胞分化の0日目および12日目である。Y軸は蛍光強度を表す。ホスホセリンホスファターゼ(PSPH)、細胞分裂周期25B (CDC25B)、およびヒト脂肪細胞株(SGBS)分化を用いたカリン5 (CUL5)遺伝子の発現分析(Affymetrix GeneChipsを用いた) は、脂肪細胞におけるヒトPSPH、CDC25B、およびCUL5 遺伝子の発現差異を明確に示す。さまざまな非依存性の実験を行った。さらに、本実験は、PSPH、CDC25B、およびCUL5 転写物(図7、10、および14を参照) が、分化中には12日目と比較して0日目に最も豊富なであることを示す。

このように、前脂肪細胞が成熟脂肪細胞に分化するためには、PSPH、CDC25B、およびCUL5タンパク質が著しく 減少される必要がある。以上の点から、前脂肪細胞におけるPSPH、CDC25B、およびCUL5 には、脂肪質の分化を阻害する能力が備わっている。以上の点から、PSPH、CDC25B、およびCUL5 タンパク質は、ヒト代謝の調節、特に脂質生成の調節において重要な役割を果たすことが可能であるので、これらのタンパク質は肥満症、糖尿病、または(および)代謝症候群において重要な役割を果たす可能性がある。

本発明のために、当事者にとっては当然のことだが、本明細書の至る所で言及した任意の機能の任意の組み合わせをここに明示的に開示する。

図１は、ショウジョウバエCG7042 (Gadflyアクセッション番号)変異体の中性脂肪含有量を示す 図２は、変異型CG7042(Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す 図３Ａは、野生型マウス組織における二重特異性ホスファターゼTS-DSP1(TS-DSP1) に類似するタンパク質発現のリアルタイムPCR分析を示す 図３Ｂは、異なるマウスモデルにおけるTS-DSP1発現のリアルタイムPCR分析を示す 図３Ｃは、標準食を与えたマウスと比較した高脂肪食を与えたマウスにおけるTS-DSP1発現のリアルタイムPCR分析を示す 図３Ｄは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のTS-DSP1発現のリアルタイムPCR分析示す 図４は、ショウジョウバエastray (GadFly アクセッション番号CG3705)変異体の中性脂肪含有量を示す 図５は、変異型astray (aay; Gadfly アクセッション番号CG3705)遺伝子座の分子構造を示す 図６Ａは、野生型マウス組織におけるホスホセリンホスファターゼ(Psph)発現のリアルタイムPCR分析を示す 図６Ｂは、異なるマウスモデルにおけるPsph発現のリアルタイムPCR分析を示す 図６Ｃは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のPsph発現のリアルタイムPCR分析を示す 図７は、哺乳動物(ヒト)組織におけるヒトastray ホモログの発現を示す 図８は、ショウジョウバエstring (GadFly アクセッション番号CG1395)変異体の中性脂肪含有量を示す 図９は、変異型string (Gadfly アクセッション番号CG1395)遺伝子座.の分子構造を示す 図１０は、哺乳動物(ヒト)組織におけるヒトstring ホモログの発現を示す 図１１は、ショウジョウバエCG1401(Gadflyアクセッション番号)変異体の中性脂肪含有量を示す 図１２は、変異型CG1401(Gadflyアクセッション番号)遺伝子座の分子構造を示す 図１３Ａは、野生型マウス組織における理研ｃＤＮA 4921514I20遺伝子(4921514I20Rik)発現のリアルタイムPCR分析を示す 図１３Ｂは、異なるマウスモデルにおける4921514I20Rik発現のリアルタイムを示す 図１３Ｃは、標準食を与えたマウスと比較した高脂肪食を与えたマウスにおける4921514I20Rik発現のリアルタイムPCR分析を示す 図１３Ｄは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の4921514I20Rik発現のリアルタイムPCR分析を示す 図１４は、哺乳動物の(マウス)組織におけるヒトCG1401 (GadFly アクセッション番号)ホモログの発現を示す

Claims (33)

1. CG7042、astray、string 、または(および)CG61401 相同タンパク質または(および)その機能的断片、CG7042、astray、string 、またはCG61401 相同タンパク質をコードする核酸分子または(および)その機能的断片または(および)当該核酸分子の修飾因子／エフェクターまたは(および)当該タンパク質から成り、医薬用に許容できるキャリア、希釈液または(および)添加物と共に提供される医薬品組成物。
2. 核酸分子が脊椎動物または昆虫のCG7042、astray、string 、またはCG1401 核酸、特に表 1 に記載のヒトタンパク質をコードする核酸、または(および)それに対して相補的な核酸分子またはその機能的断片またはその変異型である請求項 1 の組成物。
3. 当該核酸分子が下記から成る群から選択されるような請求項1 または請求項2 に記載の組成物:
   (a) 表 1 に示したポリペプチドをコードする核酸分子、または(および)当該ポリペプチドのアイソフォーム、断片または(および)変異体;
   (b) 表1に示した核酸分子から成る核酸分子か、または表1に示した核酸分子である核酸分子;
   (c) (a)または(b)で定義した核配列に対する遺伝子暗号の結果として変性される核酸分子;
   (d) 50℃ にて、1 x SSC および 0.1% の SDS (ドデシル硫酸ナトリウム) を含んだ溶液中において、請求項 2 で定義した核酸分子、または (a)〜(c) において定義した核酸分子および(または)それに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする核酸分子;
   (e) ポリペプチドをコード化する核酸分子であり、少なくとも 85%、望ましくは少なくとも 90%、より望ましくは少なくとも 95%、より望ましくは少なくとも 98%、および最大で 99,6% までの同一性を、表1に記載または請求項2において定義したヒトタンパク質CG7042、astray、string またはCG1401、望ましくは表1 に記載のポリペプチドまたは (a) において定義したポリペプチドに対して持つ核酸分子;
   (f) 当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、重複または早期停止を引き起こす突然変異によって(a)〜(e)の核酸分子と異なる核酸分子。
4. 核酸分子が DNA 分子、特に相補 DNA またはゲノム DNA である請求項 1〜3 の任意の 1 項の組成物。
5. 当該核酸がポリペプチドををコードし、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与するような請求項 1〜4 の任意の 1 項の成分。
6. 当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項 1〜5 の任意の 1 項の組成物。
7. 組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項 1〜6 の任意の 1 項の組成物。
8. ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項 1〜5 の任意の 1 項の組成物。
9. 当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項 8 の組成物。
10. 当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項 1〜7 の任意の 1 項の組成物。
11. 診断用組成物である請求項1〜10の任意の 1 項の組成物。
12. 治療用組成物である請求項1〜10の任意の 1 項の組成物。
13. 検出および(または)検証用、代謝症候群、肥満症、および(または)糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、細胞、細胞塊、器官臓器および(または)被検体における摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防用の薬剤の製造のための請求項1〜12の任意の 1 項の組成物。
14. 生体内で利用するための特許請求の範囲 1〜13 の任意の一項に記載の組成物
15. 試験管内で利用するための特許請求の範囲 1〜13 の任意の一項に記載の組成物
16. 肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群の治療用の医薬品製造のため、およびCG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 に記載のポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を管理のためのCG7042、astray、string 、またはCG1401 相同タンパク質またはアイソフォーム、機能的断片 またはその変異体、具体的には表 1 に記載した核酸分子コードする核酸分子の使用法、特に請求項 3 による核酸分子(a)、(b)、または (c)、および(または)それによってコード化されたポリペプチドおよび(または)機能的断片および(または)当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異体および(または)当該核酸分子またはポリペプチドの修飾因子／エフェクターの使用法。
17. CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 に記載のポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するための、CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同タンパク質またはアイソフォーム、機能的断片またはその変異体、具体的には表 1 に記載した核酸分子をコードする核酸分子の使用法、特に請求項 3 (a)、(b)、または (c) に記載の核酸分子、および(または)それによってコード化されたポリペプチドおよび(または)機能的断片および(または)当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異体および(または)当該核酸分子または当該ポリペプチドの修飾因子／エフェクターの使用法。
18. CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 によるポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子導入動物。
19. CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 によるポリペプチドの発現が増加および(または)減少する請求項 18 に記載の動物。
20. CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 によるポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
21. ヒト細胞である請求項 20 に記載の細胞。
22. 哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法の手順は下記の通りである。
    (a) 当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下での、CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 によるポリペプチドまたはその機能的断片を用いた(ポリ)ペプチドの回収にコンタクトする手順;
    (b) 結合しない(ポリ)ペプチドを除去する手順、および
    (c) 当該CG7042、astray、string 、またはCG1401相同なポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを同定する手順。
23. CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 によるポリペプチド結合標的との相互作用を調節／影響する薬剤のための、下記の手順から成るスクリーニング方法:
    (a) 下記から成る混合物をインキュベートする手順。
    (aa) CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 によるポリペプチドまたはその機能的断片;
    (ab) 当該ポリペプチドまたはその機能的断片の結合標的および薬剤; および
    (ac) 当該ポリペプチドまたはその機能的断片が基準親和性で特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下の候補薬剤;
    (b) 薬剤の親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該ポリペプチドまたはその機能的断片の結合親和性を検出する手順; および
    (c) 薬剤の親和性と基準親和性間の差異を確定する手順。
24. CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同ポリペプチド、特に請求項 3 によるポリペプチド結合標的との相互作用を調節／影響する薬剤のための、下記の手順から成るスクリーニング方法:
    (a) 下記から成る混合物をインキュベートする手順。
    (aa) 当該ポリペプチドまたはその機能的断片;
    (ab) 当該ポリペプチドまたはその機能的断片が基準活性を持つ条件下の候補薬剤;
    (b) 薬物の存在における活性を確定するための、当該ポリペプチドまたはその機能的断片の活性を検出する手順; および
    (c) 本薬剤の存在下の活性と標準活性間の差を確定する手順
25. 医薬用に許容できるキャリア、希釈剤およびおよび(または)添加剤を有する請求項 22 または 24 に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項23の方法によって同定された薬剤を含む組成物を作り出す方法。
26. 当該組成物が、肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の防止、軽減または(および)治療するための医薬品組成物である請求項25の方法。
27. 肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈性心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防用の医薬品組成物の調製ための、請求項 22 の方法によって同定する(ポリ)ペプチドの使用法、または請求項 23 または 24 の方法によって同定する薬剤の使用法。
28. 肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整のための請求項 1〜6 または 10 の任意の項において定義した核酸分子の使用法。
29. 肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整のための請求項 1〜6、8 または 9 の任意の項において定義したポリペプチドの使用法。
30. 肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整のための請求項 7 において定義したベクターの使用法。
31. 肥満症、糖尿病、および(または)代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための薬物の調整のための請求項 20 または 21 において定義した宿主細胞の使用法。
32. CG7042、astray、string 、または(および)CG1401 相同遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト導入遺伝子動物の産生のための、CG7042、astray、string 、またはCG1401 相同核酸分子の使用法または(および)その機能的断片の使用法。
33. 少なくとも下記の 1 つを備えたキット。
    (a) CG7042、astray、string 、または(および)CG1401 相同核酸分子または(および)その機能的断片;
    (b) CG7042、astray、string 、または(および)CG1401 相同アミノ酸分子または(および)機能的断片または(および)そのアイソフォーム;
    (c) (a) の核酸から成るベクター;
    (d) (a) の核酸または(c) のベクターから成る宿主細胞;
    (e) (a) の核酸によってコード化されたポリペプチド;
    (f) (a)の核酸によってコード化された融合ポリペプチド;
    (g) (a) の核酸、および(または) (b)、(e)、および(または) (f) のポリペプチドの抗体、アプタマーおよび(または)別の修飾因子／エフェクター、および
    (h) (a)の核酸アンチセンスオリゴヌクレオチド。

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