KR20030087562A - 거울상이성체 강화된 β-아미노산의 효소에 의한 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 물 및 주어진 반응 조건하에 물과 2상을 형성하는 유기 용매로 구성된 2상 시스템에서 N-보호되지 않은 β-아미노산 에스테르를 효소에 의해 에스테르 분할시켜 거울상이성체 강화된 β-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

거울상이성체 강화된 β-아미노산의 효소에 의한 제조방법{Process for the enzymatic preparation of enantiomer-enriched β-amino acids}

본 발명은 거울상이성체 강화된 β-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

광학 활성 β-아미노카복실산은 알칼로이드 및 항생제 등의 천연 물질에서 발생하고, 특히 약제의 제조에 있어서의 필수 중간체로서의 중요성이 커지고 있기 때문에, 이를 분리하는 것은 더욱 중요해지고 있다[참조: E. Juaristi, H. Lopez-Ruiz, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 983-1004]. 광학 활성 β-아미노카복실산 및 이의 유도체의 두 유리 형태는 중요한 약리학적 효과가 있으며, 또한 개질된 펩티드의 합성에 사용될 수도 있다.

부분입체이성체 염에 의한 통상적인 라세미체 분할[제안 경로: H. Boesch et al., Org. Proc. Res. Developm. 2001, 5, 23-27] 및 특히, 리튬 페닐에틸아미드의 부분입체선택적 부가[참조: A. F. Abdel-Magid, J. H. Cohen, C. A. Maryanoff, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 955-970]는 β-아미노카복실산의 제조방법으로서 확립되었다. 후자의 방법이 집중 연구 대상으로 고려되어, 그 속에서 발생하는 다수의단점에도 불구하고, 바람직하게 사용되고 있다. 한편으로, 키랄 시약의 화학량론적 양이 필요하며, 여기에는 촉매적 비대칭 방법과 비교하여 큰 단점이 있다. 또한, 고가이고, 게다가, 예를 들면, n-부틸리튬 등의 유해한 보조제가 탈양자화에 의한 화학량론적 시약을 활성화시키는 데 필요하다. 또한, 약 -70℃의 저온에서의 반응의 성능은 만족스러운 입체선택성에 중요하며, 이는 반응기 물질, 추가 비용 및 높은 에너지 소비에 관한 까다로운 요건을 의미한다.

광학 활성 β-아미노카복실산의 제조는 현재 생체촉매적으로 부수적인 역할을 할 뿐이지만, 특히 생체촉매 반응의 경제적이고 생태학적인 이점 때문에 바람직하다. 키랄 시약의 화학량론적 양을 사용할 필요가 없는 대신, 천연 상태의 자연 친화적인 촉매인 소량의 촉매량의 효소가 사용된다. 또한, 수성 매질 중에서 유효하게 사용되는 이러한 생체촉매는 이의 촉매 특성 및 높은 효율성 외에도, 합성 금속 함유 촉매의 다양성과 대조적으로 금속, 특히 중금속을 함유하여 이에 따라 독성인 공급원료를 사용할 필요가 없는 이점이 있다.

선행 기술에서, 예를 들면, β-아미노카복실산의 거울상선택적 N-아실화가 이미 종종 보고된 바 있다.

따라서, 문헌[참조: L.T. Kanerva et al., Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 7, No. 6, pages 1707-1716, 1996]에는 유기 용매와 생체촉매로서의 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica)로부터의 리파제 SP 526 또는 슈도모나스 체파치아(Pseudomonas cepacia)로부터의 리파제 PS 중의 다양한 지환족 β-아미노카복실산과 2,2,2-트리플루오로에틸 에스테르와의 에틸 에스테르의 거울상선택적N-아실화가 기재되어 있다.

문헌[참조: V.M. Sanchez et al., Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 8, No. 1, pages 37-40, 1997]에는 N-아세틸화 β-아미노카복실산 에스테르의 제조를 거쳐 칸디다 안타르크티카로부터의 리파제를 사용한 (±)-에틸 3-아미노부티레이트의 생체촉매적 라세미체 분할이 연구되어 있다.

유럽 특허공보 제8 890 649호에는 아미다제, 프로테아제, 에스테라제 및 리파제를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하이드롤라제의 존재하에 카복실산 에스테르를 사용하여 거울상선택적 아실화시키고 아미노산 에스테르의 미반응 거울상이성체를 후속적으로 분리하여, 라세미체 아미노산 에스테르로부터 광학 활성 아미노산 에스테르를 제조하는 방법이 기재되어 있다.

제WO-A 98/50575호는 라세미체 β-아미노카복실산, 아실 공여체 및 페니실린 G 아실라제를 라세미체 β-아미노카복실산의 거울상이성체를 입체선택적으로 아실화시키는 조건하에 접촉시켜 키랄 β-아미노카복실산 또는 이의 상응하는 에스테르를 수득하는 방법(여기서, 다른 거울상이성체는 실질적으로 반응하지 않고, 이에 따라 키랄 β-아미노카복실산이 수득된다)에 관한 것이다. 역반응 순서 또한 연구되었다[참조: V.A. Soloshonok, V.K. Svedas, V.P. Kukhar, A.G. Kirilenko, A.V. Rybakova, V.A. Solodenko, N.A. Fokina, O.V. Kogut, I.Y. Galaev, E.V. Kozlova, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, Synlett 1993, 339-341; V. Soloshonok, A.G. Kirilenko, N.A. Fokina, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, V.P. Kukhar, V.K. Svedas, E.V. Kozlova, Tetrahedron: Asymmetry 1994, 5, 1119-1126; v.Soloshonok, N.A. Fokina, A.V. Rybakova, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, A.E. Sochorinsky, V.P. Kukhar, M.V. Savchenko, V.K. Svedas, Tetrahedron: Asymmetry 1995, 6, 1601-1610; G. Cardillo, A. Tolomelli, C. Tomasini, Eur. J. Org. Chem. 1999, 155-161]. 이 방법의 단점은 거울상선택적 가수분해 후 생성 혼합물의 후처리가 곤란하다는 점이다. 유리 β-아미노카복실산을 분리시킨 후, 분리하기 곤란한 페닐아세트산과 N-페닐아세틸-β-아미노카복실산의 혼합물이 수득된다.

거울상이성체 강화된 카복실산을 수득하기 위한 리파제와의 이의 반응은 이미 오랫 동안 공지되어 왔다. 미국 특허 제5,518,903호에서, 이러한 원리는 N-보호된 β-아미노산 에스테르로 옮겨졌지만, 결과는 다양하다. 라세미체 N-부톡시카보닐-β-아미노부티르산의 상응하는 벤질 에스테르만이 리파제에 의해 고도로 거울상선택적으로 분해되지만, 잔존하는 사용된 메틸 에스테르 또는 n-부틸 에스테르는 70% ee 이하의 영역에서의 ee 값만을 수득하였다. 이와 관련하여, 명백하게도, 상응하는 메틸 에스테르로부터 n-부틸 에스테르로 넘어가는 공정은 제조된 산의 ee 값의 감소를 동반한다는 것이 제시되어야 한다. 따라서, N-Boc-β-아미노부티르산의 n-부틸 에스테르로부터 출발하여, 효소 리파제(제조원: Asahi)를 사용한 에스테르 가수분해는 8일 후 45% ee의 상응하는 산의 ee 값을 37%의 수율로 감소시킨다. 리파제 PS(제조원: Amano)를 사용하면, 61% ee로 강화된 화합물이 7일 내에 어떠한 속도로도 41%의 수율로 동일한 반응에서 수득된다. 이와 비교하면, 상응하는 메틸 에스테르는 70% ee로 수득된다.

최근의 문헌(Faulconbridge et al.,)의 결과로부터, pH 8에서 리파제 PS(제조원: Amano)를 사용한 방향족 β-아미노산 에틸 에스테르의 에스테르 가수분해는 허용되는 수율 및 매우 우수한 거울상이성체의 과량으로 발생한다고 추론되어 있다(참조: Tetrahedron Letters 2000, 41, 2679-81). 생성물은 99% ee 이하의 거울상이성체 순도로 수득되지만, 수성 현탁액 중에서 독점적으로 수행되는 합성에는 몇가지 단점이 동반된다. 한편으로, 결정화가 이러한 조건하에서 선택적이지만, 반응 자체는 비교 실시예 2에 기재한 바와 같이, 85.1% ee의 낮은 ee 값을 생성한다고 밝혀졌다. 종합적으로, 이는 한편으로는, 불필요한 거울상이성체의 형성으로 인한 수율 감소를 의미하고, 다른 한편으로는, 또한 ee 값이 변경된 결정화 조건 때문에 기술적 규모에 대한 경미한 공정 변동의 함수로서 쉽게 99% ee 또는 98% ee까지 떨어질 수 있음을 포함한다. 그러나, 가능한 한 98% ee 초과, 특히 99% 초과의 ee 값이 약제학적 적용 요건이다. 또한, 예를 들면, 한외여과에 의한 우수한 효소 분리를 보정하기 위하여, 현탁액 중에서의 성능 뿐만 아니라 순수하게 액상인 매질에서의 성능이 바람직하다. 최선으로는, 높은 ee 값이 당해 단계에서 또한 생성되어야 하며, 이는 존재하는 문헌 공정으로 달성될 수 없다(이와 관련하여, 비교 실시예 1 및 2를 참조한다).

유기 용매를 사용한 단상 반응 매질의 존재하에서의 효소에 의한 가수분해는 나가타 등에 의한 문헌[참조: S. Katayama, N. Ae, R. Nagata, Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 4295-4299]에 보고되어 있다. 이러한 경우, 사이클릭 β-아미노산 에스테르가 사용된다. 아세톤(90%)과 물(10%)로 구성된 용매 혼합물을 사용하여 20시간의 반응 시간으로 거울상선택률 94% ee 및 전환율 50%의 최상의 결과가달성된다. 물의 비율이 더 낮으면 더 불량한 결과가 달성된다. 일반적으로, 즉시 물에 용해되는 용매를 사용하는 것이 물에 난용성인 용매를 사용하는 것과 비교하여 더 우수하다는 것이 입증되었다. 따라서, 유기 매질로서 물과 20% 아세톤으로 포화시킨 디이소프로필 에테르를 사용하면 58% ee의 ee 값만이 생성될 뿐이다. 이와는 반대로, 아세톤과 THF 외에 추가로 즉시 물에 용해되는 용매가 적합한 것으로 입증되었지만(95% ee), 이러한 경우 임의의 완료된 범위로의 전환율을 달성하기 위해서는 긴 반응 시간(96시간)이 필요하다.

그러나, 지금까지, 유기 용매가 존재하는 특성을 갖는 이러한 성공적인 합성은 사이클릭 β-아미노산 에스테르의 제조로만 국한된 채로 남아 있다. 사이클릭 β-아미노산 에스테르에 대한 문헌(위를 참조)에 명시되어 있는 최적의 조건하에서, 대단히 낮은 수율 및 허용되지 않는 긴 반응 시간이 개환 펜던트의 목적하는 표적 화합물의 제조에서 수득된다(비교 실시예 1).

따라서, 본 발명의 목적은 β-아미노산의 효소에 의한 제조방법을 추가로 제공하는 것이다. 특히, 당해 방법은 유리하게는 공업적 규모에서 경제적으로나 생태적으로 사용가능해야 하며, 즉 환경 적합성, 산업적 안전성, 프로세싱의 엄격함, 시공 수율 및 선택률과 관련하여 특히 우수하다.

더욱 자세히 언급되어 있지는 않지만, 선행 기술로부터 명백하게 벗어나는 이들 및 추가의 목적은 청구항 1의 내용의 특성을 갖는 방법에 의해 달성된다. 종속항인 청구항 2 내지 8은 본 발명의 바람직한 양태에 관한 것이다.

거울상이성체 강화된 N-보호되지 않은, 특히 개환 β-아미노산의 제조방법은 N-보호되지 않은, 특히 개환 β-아미노산 에스테르의 거울상이성체 혼합물을 주어진 반응 조건하에서 2상을 형성하는 물과 유기 용매로 구성된 2상 시스템에서 가수분해 효소를 사용하여 효소 가수분해시킴으로써 수행된다는 사실의 결과, 놀랍게도, 그러나 다른 한편으로는 마찬가지로 유리한 방법으로, 위의 목적이 달성된다. 이와 관련하여, 놀랍게도, 이제까지 공지된 유기/수성 시스템에서보다 실질적으로 반응성이 더 높을 뿐만 아니라, 우수한 거울상선택성도 달성된다. 2상 시스템에서의 반응은 생성물이 99% ee 이상에서 생성되는 방법으로 최적화시킬 수도 있다(실시예 4). 또한, 본 발명에 따르는 실시예 3의 ee 값(89% ee)은 순수하게 수성인 시스템에서의 실험(비교 실시예 2, 81.5% ee)과 비교하여 현저히 우수한 것으로 밝혀졌다. 유기 용매의 프로세싱 이점 외에도, 본 발명의 방법은 결과적으로 또한, 수성 표준 매질과 비교하여 생성물의 더 높은 거울상선택률을 발생시키는 이점이 있다.

대상의 방법에서 화학식 1의 화합물이 바람직하다.

위의 화학식 1에서,

R 및 R"은 서로 독립적으로 (C₁-C₈)-알킬, (C₂-C₈)-알케닐, (C₂-C₈)-알키닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (C₆-C₁₈)-아릴, (C₇-C₁₉)-아르알킬, (C₃-C₁₈)-헤테로아릴, (C₄-C₁₉)-헤테로아르알킬, ((C₁-C₁₈)-알킬)_1-3-(C₃-C₈)-사이클로알킬, ((C₁-C₈)-알킬)_1-3-(C₆-C₁₈)-아릴 및 ((C₁-C₁₈)-알킬)_1-3-(C₃-C₁₈)-헤테로아릴이고,

R'은 H, (C₁-C₈)-알킬, (C₂-C₈)-알케닐, (C₂-C₈)-알키닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (C₆-C₁₉)-아릴, (C₇-C₁₉)-아르알킬, (C₃-C₁₈)-헤테로아릴, (C₄-C₁₉)-헤테로아르알킬, ((C₁-C₈)-알킬)_1-3-(C₃-C₈)-사이클로알킬, ((C₁-C₈)-알킬)_1-3-(C₆-C₁₈)-아릴 및 ((C₁-C₈)-알킬)_1-3-(C₃-C₁₈)-헤테로아릴이다.

원칙적으로, 당해 기술분야의 숙련가는 적합한 에스테르 그룹을 자유롭게 선택할 수 있다. 숙련가는 경제적 및 반응 공학적 측면을 기본으로 하여 선택한다. 에스테르를 형성하기에 바람직한 알콜은 특히 반응 혼합물로부터, 임의로는 증류시켜 용이하게 제거할 수 있는 것이다. β-아미노산 알킬 에스테르 또는 β-아미노산 아릴 에스테르를 사용하는 것이 본 발명에 따르는 방법에서 매우 특히 바람직하다. 적합한 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급 부틸, 이소부틸 또는 3급 부틸 에스테르를 사용하는 것이 매우 바람직하다.

반응 파라미터의 선택 또한 당해 기술분야의 숙련가에 달렸다. 숙련가는 경로 실험을 기본으로 한 각각의 경우에 대하여 개별적인 파라미터를 결정한다. 어쨌든, pH 4 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9, 보다 바람직하게는 7 내지 8.5의 값이 대상물의 효소 공정에 적합하다. 리파제 PS(제조원: Amano)가 약 pH 8에서 특히 적합한 것으로 입증되었다.

온도에 관해서는, 원칙적으로 동일한 요건이 pH에 대하여 존재한다. 여기서, 역시, 효소가 가장 최적으로 작용하는 온도에 따라, 가능한 한 최적의 온도가 각각의 경우에 대하여 측정될 수 있다. 호고온성 유기체로부터의 효소에 대해서는, 100℃ 이하의 고온이 가능하다. 기타의 효소는, 역시 가능하게는 빙 매트릭스 중에서 <0℃ 내지 -15℃에서만 최적으로 작용한다. 바람직하게는 반응 동안 달성된 온도는 15 내지 40℃, 보다 바람직하게는 20 내지 30℃의 범위일 수 있다.

사용되는 효소의 선택은 당해 기술분야의 숙련가의 임무이다. 다수의 적합한 효소가 문헌(참조: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz, H. Waldmann, VCH, 1995, page 165) 및 당해 문헌에 인용된 문헌으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 리파제는 에스테르 가수분해에 대해 선택되며, 보다 바람직하게는, 슈도모나스 체파치아로부터의 리파제 PS(제조원: Amano)가 사용된다.

적용을 위하여, 고려중인 폴리펩티드는 균질하게 정제된 화합물로서 또는 재조합형으로서 제조된 효소로서 유리 형태로 사용될 수 있다. 추가로, 폴리펩티드는 무상의 게스트 유기체의 성분으로서 또는 필요한 만큼 많이 정제된 호스트 유기체의 소화된 세포 물질과 결합하여 사용될 수도 있다.

고정된 형태의 효소를 사용하는 것도 가능하다[참조: Sharma B. P.; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialien - Techniken undAnwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852]. 유리하게는, 고정화는 동결건조[참조: Paradkar, V.M.; Dordick, J.S. (1994)], 거의 무수 유기 용매에 용해된 α-키모트립신의 수성 유사 활성[참조: J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-1010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997)], 균질한 유기 용매 중의 효과적인 글리코실 전이 촉매로서의 리피 피복된 다양한 글리코사이드 하이드롤라제[참조: Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992)], 톨루엔 중의 활성 형태의 효소를 용해시키는 수단으로서의 키모트립신과 에틸 셀룰로스 사이의 착체 형성[Biocatalysis 6, 291-305]을 통하여 발생시킨다. 에어로졸 OT, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 Brij 52(디에틸 그릴콜 모노세틸 에테르) 등의 계면활성제 물질[참조: Kamiya, N.; Okazaki, S. -Y; Goto, M. (1997)], 무수 벤젠 중에서 촉매적으로 활성인 계면활성제-호스래디시 퍼옥시다제 착체[참조: Biotechnol. Tech. 11, 375-378]의 존재하에서의 동결건조가 특히 매우 바람직하다.

유퍼기트(Eupergit), 특히 유퍼기트 C및 유퍼기트 250L(Rohm)에 고정화시키는 것이 대단히 바람직하다[요약을 위하여 다음 참조: E. Katchalski-Katzir, D.M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2000, 10, 157]. 히스티딘 태그(헥사히스티딘)를 결합시켜 개질시킨 폴리펩티드와 결합한 Ni-NTA에 고정시키는 것도 역시 바람직하다[참조: Petty, K.K. (1996), Metal-chelate affinity chromatography In: Ausubel, F.M. et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, New York: John Wiley and Sons].

CLEC로서의 용도 또한 생각할 수 있다[참조: St. Clair, N.; Wang, Y. -F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383].

이들 방법으로 유기 용매로 인하여 불안정한 폴리펩티드로부터 수성 용매와 유기 용매의 혼합물 또는 전체적으로 유기 매질 중에서 작용할 수 있는 폴리펩티드를 발생시킬 수 있다.

대상의 반응은 목적에 맞게 제공된 어떠한 반응 용기 속에서라도 수행할 수 있다. 상세하게는, 이는 통상의 회분식 반응기, 루프 반응기 또는 효소 막 반응기이다[참조: Bommarius, A.S.; Drauz, K.; Groeger, U.; Wandrey, C.; Membrane Bioreactors for the Production of Enantiomerically Pure α-Amino Acids, in: Chirality in Industry (eds.: Collins, A.N.; Sheldrake, G.N.; Crosby, J.) 1992, John Wiley & Sons, pages 371-397].

모든 유형의 수 불용성 또는 수 난용성 유기 용매 및 이들의 혼합물이 주어진 반응 조건하에서 물과 2상을 형성하는 유기 상으로서 적합하여, 즉 결과적으로, 수 불용성 또는 수 난용성이고 본 발명에 따르는 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 이들은 에테르, 케톤, 에스테르, 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 측쇄 탄화수소이다.

이와 관련하여, 메틸 3급-부틸 에테르(MTBE), 디이소프로필 에테르, 에틸 아세테이트, 헥산, 헵탄, 사이클로헥산, 메틸사이클로헥산 및 톨루엔, 또한 임의의 적합한 바람직한 이들의 혼합물이 특히 적합한 것으로 입증되었다.

임의로 수 불용성 지지 재료 및/또는 소량의 성분 또는 안정화제 위에 흡착된 형태로 존재하는 효소가 사용되는 경우, 효소와 지지체를 용이하게 분리할 수 있다면, 반응에서 효소를 사용하기 전에 불용성 지지체 및/또는 미량 성분 또는 안정화제를 분리함으로써 사용된 효소의 불용성 지지 재료로 인한 효소의 오염이 발생하지 않도록 하는 것이 유리한 것으로 입증되었다. 예를 들면, 유리하게 사용될 수 있는 리파제 PS(제조원: Amano)는 실리카 지지체에 흡착되어 있다. 이러한 경우, 따라서, 효소 수용액은 반응물을 반응 매질에 가하기 전에 여과시켜 반응 시스템으로부터 규산을 제거할 수 있다. 효소의 활성 또는 가공 안정성은 대체적으로, 이러한 공정에 부정적인 영향을 미치지는 않는다.

본 발명의 영역 내에서, "N-보호되지 않음"은 산의 β-질소원자가 반응 조건하에 안정한 N-보호 그룹에 의해 블로킹되지 않음을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 특히 Z, Boc, Fmoc, Eoc, Moc, 아세틸 등의 일반적인 보호 그룹이 이러한 것으로 간주된다.

(C₁-C₈)-알킬로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급 부틸, 3급 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 또는 옥틸과 모든 결합 이성체가 고려된다. 이들은 (C₁-C₈)-알콕시, (C₁-C₈)-할로알킬, OH, 할로겐, NH₂, NO₂, SH 또는 S-(C₁-C₈)-알킬로 일치환 또는 다치환될 수 있다.

(C₂-C₈)-알케닐은 하나 이상의 이중결합을 갖는, 메틸을 제외한, 위에 나타낸 바와 같은 (C₁-C₈)-알킬 라디칼을 의미하는 것으로 이해해야 한다.

(C₂-C₈)-알키닐은 하나 이상의 삼중결합을 갖는, 메틸을 제외한, 위에서 나타낸 바와 같은 (C₁-C₈)-알킬 라디칼을 의미하는 것으로 이해해야 한다.

(C₁-C₈)-아실은 -C≡O 관능기에 의해 분자에 결합된 (C₁-C₈)-알킬 라디칼을 의미하는 것으로 이해해야 한다.

(C₃-C₈)-사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸 라디칼 등을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 이들은 하나 이상의 할로겐 및/또는 N, O, P, S 원자 함유 라디칼로 치환될 수 있고/거나, 예를 들면, 1-, 2-, 3-, 4-피페리딜, 1-, 2-, 3-피롤리디닐, 2-, 3-테트라하이드로푸릴, 2-, 3-, 4-모르폴리닐과 같이, N, O, P, S 원자 함유 라디칼을 환에 포함할 수 있다. 이들은 (C₁-C₈)-알콕시, (C₁-C₈)-할로알킬, OH, 할로겐, NH₂, NO₂, SH, S-(C₁-C₈)-알킬, (C₁-C₈)-아실, (C₁-C₈)-알킬에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있다.

(C₆-C₁₈)-아릴 라디칼은 탄소수 6 내지 18의 방향족 라디칼을 의미하는 것으로 이해된다. 특히, 이들은 페닐, 나프틸, 안트릴, 페난트릴, 비페닐 라디칼 등의 화합물을 포함한다. 이들은 (C₁-C₈)-알콕시, (C₁-C₈)-할로알킬, OH, 할로겐, NH₂, NO₂, SH, S-(C₁-C₈)-알킬, (C₁-C₈)-아실, (C₁-C₈)-알킬에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있다.

(C₇-C₁₉)-아르알킬 라디칼은 (C₁-C₈)-알킬 라디칼에 의해 분자에 결합되는(C₆-C₁₈)-알킬 라디칼이다.

(C₁-C₈)-알콕시는 산소원자에 의해 고려중인 분자에 결합된 (C₁-C₈)-알킬 라디칼이다.

(C₁-C₈)-알콕시카보닐은 -OC(O) 관능기에 의해 고려중인 분자에 결합된 (C₁-C₈)-알킬 라디칼이다. 이는 다른 옥시카보닐 라디칼에 대한 동의어이다.

(C₁-C₈)-할로알킬은 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 치환된 (C₁-C₈)-알킬 라디칼이다.

(C₃-C₁₈)-헤테로아릴 라디칼은 본 발명의 영역 내에서, 질소, 산소 또는 황 등의 헤테로원자를 환에 함유하는 탄소수 3 내지 18의 5, 6 또는 7원 방향족 환 시스템을 나타낸다. 이러한 헤테로방향족으로는 특히 1-, 2-, 3-푸릴, 예를 들면, 1-, 2-, 3-피롤릴, 1-, 2-, 3-티에닐, 2-, 3-, 4-피리딜, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-인돌릴, 3-, 4-, 5-피라졸릴, 2-, 4-, 5-이미다졸릴, 아크리디닐, 퀴놀리닐, 페난트리디닐, 2-, 4-, 5-, 6-피리미디닐이 고려된다. 이들은 (C₁-C₈)-알콕시, (C₁-C₈)-할로알킬, OH, 할로겐, NH₂, NO₂, SH, S-(C₁-C₈)-알킬, (C₁-C₈)-아실, (C₁-C₈)-알킬에 의해 일치환 또는 다치환될 수 있다.

(C₄-C₁₉)-헤테로아르알킬은 (C₇-C₁₉)-아르알킬 라디칼에 상응하는 헤테로방향족 시스템을 의미하는 것으로 이해해야 한다.

할로겐으로서 적합한 것은 불소, 염소, 브롬 및 요오드이다.

용어 "거울상이성체 강화됨"은 본 발명의 영역 내에서, 광학 거울상체(antipodes)와의 혼합물에서 거울상이성체의 비율이 50% 초과 100% 미만의 범위임을 의미하는 것으로 이해해야 한다.

나타낸 구조는 모든 가능한 부분입체이성체, 거울상이성체 및 가능한 이들의 혼합물을 나타낸다.

언급한 참고 문헌은 본 발명의 공개에 포함시키는 것으로 간주한다.

실험 실시예;

비교 실시예 1:

라세미 화합물 에틸 rac-3-아미노-3-페닐프로피오네이트 9.2mmol(1.79g)을 물 25㎖와 아세톤 25㎖로 이루어진 용매 혼합물 50㎖에 용해시키고, 1M 수산화나트륨 용액(제조원: Merck)을 가하여 자동 pH 보정에 의하여 용액을 pH 8.2로 설정한다. 반응 온도가 20℃에 이르면, 아마노 리파제 PS(수도모나스 체파치아; 제조원: Amano Enzymes, Inc.) 200mg을 가하여 반응을 시작한다. 3, 5 및 24시간의 반응 시간 후에, (S)-3-아미노-3-페닐프로피온산의 형성된 전환율을 측정한다. 이러한 공정에서, 3시간 후 1.8%, 5시간 후 2.0%, 24시간 후 5.5%의 전환율이 측정된다. 거울상선택률 값은 낮은 전환율을 고려하여 불만족스러운 반응 과정 때문에 측정되지 않았다. 전환율은 HPLC에 의해 측정되었다.

비교 실시예 2:

라세미 화합물 에틸 rac-3-아미노-3-페닐프로피오네이트 9.2mmol(1.79g)을물 50㎖에 용해시키고, 1M 수산화나트륨 용액(제조원: Merck)을 가하여 자동 pH 보정에 의하여 용액을 pH 8.2로 설정한다. 에스테르를 완전히 용해시키기 위하여, 아세톤 3㎖를 추가로 용액에 가한다. 반응 온도가 20℃에 이르면, 아마노 리파제 PS(수도모나스 체파치아; 제조원: Amano Enzymes, Inc.) 200mg을 가하여 반응을 시작한다. (S)-3-아미노-3-페닐프로피온산에 대하여 3 및 6시간의 반응 시간 후에 형성된 전환율을 측정하고, 또한 6시간 후에 거울상 선택률을 측정한다. 이러한 공정에서, 3시간 후 18.5% 또는 6시간 후 37.8%의 전환율 및 85.1% ee(6시간 후)의 거울상선택률이 측정된다. 전환율 및 거울상선택률은 HPLC에 의해 측정되었다.

실시예 3:

라세미 화합물 에틸 rac-3-아미노-3-페닐프로피오네이트 9.2mmol(1.79g)을 물 25㎖와 유기 용매 성분으로서 메틸 3급-부틸 에테르(MTBE) 25㎖로 이루어진 용매 혼합물 50㎖에 용해시키고, 1M 수산화나트륨 용액(제조원: Merck)을 가하여 자동 pH 보정에 의하여 용액을 pH 8.2로 설정한다. 반응 온도가 20℃에 이르면, 아마노 리파제 PS(수도모나스 체파치아; 제조원: Amano Enzymes, Inc.) 200mg을 가하여 반응을 시작한다. 3, 5 및 24시간의 반응 시간 후에, (S)-3-아미노-3-페닐프로피온산의 형성된 전환율을 측정한다. 이러한 공정에서, 3시간 후 23.5%의 전환율 또는 15시간 후에 약 50% 이상의 정량적 전환율 및 89.0% ee의 거울상선택률(15시간 후)이 측정된다. 전환율 및 거울상선택률 값은 HPLC에 의해 측정되었다.

실시예 4:

물 81㎖를 용해시키고, 아마노 리파제 PS(수도모나스 체파치아; 제조원:Amano Enzymes, Inc.) 1.45g을 여기에 가한다. 이어서, 용해되지 않은 고체를 여과시킨다. 메틸 3급 부틸 에테르(MTBE) 81㎖를 유기 용매 성분으로서 여액으로서 수득되는 수성 효소 용액에 가한다. 2상 시스템을 1M 수산화나트륨 용액(제조원: Merck)을 가하여 자동 pH 보정에 의하여 pH 8.2로 설정한다. 온도가 20℃에 이르면, 이어서 라세미 화합물 n-프로필 rac-3-아미노-3-페닐프로피오네이트 188.2mmol(39.0g)을 가하고, 반응을 시작한다. 반응 시간은 15시간이고, 목적하는 생성물 (S)-3-아미노-3-페닐프로피온산로 구성된 백색 침전물이 생성된다. 15시간의 반응 시간 후, 아세톤 160㎖를 가하여 침전을 완료하고, 교반을 45분 동안 지속하고, 고체를 여과시킨다. 고체를 소량의 아세톤으로 수 회 세척한 다음, 진공하에 건조시킨다. 목적하는 (S)-3-아미노-3-페닐프로피온산 12.91g을 수득하며, 이는 수율 41.6%에 상응한다. 생성물의 거울상선택률은 99.6% ee이다. 거울상선택률은 HPLC에 의해 측정하였다. 화학적 순도에 대해서는 98.8%가 측정되었다(분쇄시켜 측정됨). 생성물의 구조는 NMR 분광법에 의해 추가로 확인하였다.

본 발명의 방법으로 거울상이성체 강화된 β-아미노산을 환경 친화적이면서 경제적으로 수득할 수 있다.

Claims (8)

1. N-보호되지 않은, 특히 개환 β-아미노산 에스테르의 거울상이성체 혼합물을 하이드롤라제를 사용하여 효소 가수분해시켜 거울상이성체 강화된 N-보호되지 않은, 특히 개환 β-아미노산을 제조하는 방법으로서,

   가수분해가 물 및 주어진 반응 조건하에서 물과 2상을 형성하는 유기 용매로 구성된 2상 시스템에서 수행되는 방법.
2. 제1항에 있어서, β-아미노산 알킬 에스테르 또는 β-아미노산 아릴 에스테르가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 적합한 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급 부틸, 이소부틸 또는 3급 부틸 에스테르가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응의 pH가 4 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9, 보다 바람직하게는 7 내지 8.5임을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 동안의 온도가 -15 내지 +100℃, 바람직하게는 +15 내지 +40℃, 보다 바람직하게는 +20 내지 +30℃임을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 리파제, 바람직하게는 슈도모나스 체파치아(Pseudomonas cepacia)로부터의 리파제 PS가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응이 효소 막 반응기에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 에테르, 케톤, 에스테르, 포화 또는 불포화 직쇄 또는 측쇄 탄화수소가 유기 용매로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.