KR102363146B1

KR102363146B1 - 간엽 마커와 뉴런 마커를 발현하는 줄기 세포, 이의 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102363146B1
Application number: KR1020187028975A
Authority: KR
Inventors: 이리나 컬키스; 벤세슬라우 크리스치아니 발베르데
Original assignee: 아비타 인터내셔널 리미티드; 푼다카오 부탄탄
Priority date: 2016-03-09
Filing date: 2017-03-09
Publication date: 2022-02-14
Also published as: WO2017153956A1; WO2017153957A1; WO2017153957A9; RU2018134615A3; RU2018134710A; IL261622B1; CA3055399A1; CN109219441B; IL261622A; EP3426267A1; RU2018134710A3; RU2742828C2; IL261623B1; JP2019507772A; KR20180137488A; JP2019510758A; JP7008031B2; CN109312303A; KR102497999B1; IL261623B2

Abstract

본 발명은 CD44 및 CD13을 발현하며 CD146의 발현은 결핍된 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (human immature dental pulp stem cell, hIDPSC)의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, 파킨슨병 (PD), 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 뇌졸증, 자가면역성 뇌척수염, 당뇨병성 신경병증, 녹내장성 신경병증, 알츠하이머 질환, 헌팅턴병 (HD), 자폐증, 정신분열증, 뇌졸증, 허혈증, 운동 장애 및 경련성 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경계 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

간엽 마커와 뉴런 마커를 발현하는 줄기 세포, 이의 조성물 및 이의 제조 방법

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2016년 3월 9일자 미국 출원번호 15/065,259 (미국 공개 번호 US 2016/0184366)에 대해 우선권을 주장하며, 이 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

발명의 기술 분야

본 발명은, 전신 투여에 적합하며, 여러가지 질환, 특히 신경계 질환을 치료하는데 적합한 줄기 세포의 제조 방법, 줄기 세포 및 줄기 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

신경퇴행성 질환의 원인이 되는 유전자와 그 단백질이 동정되기는 했지만, 이들 질환에 관련된 병인 기전은 여전히 알려지지 않아, 효과적인 치료학적 개입 방법은 개발되지 못하고 있다. 현재 알려진 바에 따르면, 헌팅턴 단백질의 돌연변이 형태는, 널리 분포되어 있지만, 예를 들어, 주로 질병의 초기 단계에 선조체 및 대뇌 피질의 심부 층에서 발생하는, 중간 돌기 뉴런 (medium spiny neuron)의 선택적인 소실과 신경퇴행을 유발한다. 이에 세포 테라피가 이 질환 및 그외 비슷한 신경퇴행성 질환의 진행에 긍정적으로 기여할 수 있는 부가적인 또는 대안적인 치료법으로서 조사되었다. 줄기 세포는 생명체의 필수적인 구성 요소로서, 모든 고등 유기체들의 기원 및 발생에 중요한 역할을 담당한다. 뇌 손상은, 예를 들어, 돌연변이된 헌팅틴 (mHTT) 단백질의 축적에 의해 발생되는 뉴런 세포 사멸이 원인이기 때문에, 약물에 기반한 테라피만으로 치료될 가능성이 낮다. 환자의 뇌 손상부에서 신경 조직의 기능과 형태적 디자인을 재건하기 위해서는 줄기 세포에 기반한 테라피가 중요하다. 이 테라피는 2가지 역할로 사용된다: 국소 세포의 생존을 자극하고 염증을 저해하는, 이식된 줄기 세포의 파라크린 작용 (paracrine action) (항-세포자살, 항-염증, 항-반흔, 항-세균 및 혈관신생 작용), 및 고유의 줄기 세포 및 가능하게는 공여 줄기 세포로부터의 새로운 뉴런 생성에 유리한 생물활성 분자의 생산에 의한 뇌 조직 재생.

뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)는 뇌와 척수에서 발견되는 BDNF 단백질 발현을 수행하는 유전자이다. 이 단백질은 세포의 증식, 성숙 (분화) 및 유지에 소정의 역할을 함으로써 신경 세포 (뉴런)의 생존을 증진한다. 뇌에서, BDNF 단백질은 세포와 세포가 교류할 때 신경 세포들 간의 연결부 (시냅시스)에서 활성을 나타낸다. BDNF 단백질은 학습 및 기억에 중요한 시냅스 가소성 (plasticity) 조절에 일조하며, 섭취, 음주 및 체중을 조절하는 뇌 영역에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 즉, BDNF는 이들 기능들 모두 조절하는 추가적인 역학을 담당한다. 누적되고 있는 증거에 따르면, 시냅스 기능부전은, 알츠하이머 질환 등의 신경퇴행성 장애들에서, 주요 병리생리학적 홀마크인 것으로 보인다. BDNF 신호 전달에서의 결함이 헌팅턴병 및 우울증과 같은 몇몇 주요 질환 및 장애들의 발병을 야기한다. 따라서, BDNF 경로의 조작은 다양한 신경 장애 및 정신 장애들에 실행가능한 치료 방법으로 제시된다. BDNF 단독 투여도 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 실행가능한 전략이 된다. 그러나, 신경퇴행성 질환의 증상의 유전자적 그리고 개체별 다형성으로 인해, 개별 환자를 위한 이상적인 용량을 찾기 어렵다. 과량의 BDNF는 뇌에서 종양 형성을 유발할 수 있으며; 다른 한편으로, 저용량의 BDNF는 효과적인 치료를 제공할 수 없다. 줄기 세포는 이식된 후 환자의 생물학적 통제 하에 놓이게 되어, 세포에 의한 BDNF 분비를 개별 환자들에 대해 효과적으로 조절할 수 있다. 또한, 알츠하이머 질환의 치료에 있어 줄기 세포 이식의 이점을 연구한 실험들에서, 이식된 신경 줄기 세포 (NSC)가 숙주 뇌 세포들 간의 새로운 연결 형성을 지원하는 것으로, 입증되었다. 이러한 실험으로, 이러한 연결의 강화가 알츠하이머 질병의 마우스 모델에서 기억 감소를 회복시킬 수 있는 것으로 입증되었다. NSC에 의해 천연적으로 분비되는 인자인 BDNF가 줄기 세포 이식에 의해 발생된 효과를 재현할 수 있는 것으로 보인다.

NSC는 일반적으로 접근하기 어려워, 정맥내 (IV) 주사를 통해서는 줄기 세포 테라피에 적용하기에 충분한 치료학적 용량으로 얻을 수가 없다. 전형적으로, BDNF 분비를 증가시키기 위해 2가지 전략이 사용된다. 첫째, BDNF 분비를 유도하기 위해 시험관내 배양된 줄기 세포의 배양 배지에 성장 인자를 첨가하는 방법이다. 그러나, 이 전략은 줄기 세포가 시험관내 조건에서만 이 성장 인자를 생산하기 때문에, 매우 제한적이다. 그래서, 이 세포를 환자에게 이식할 경우, 세포는 BDNF의 "스톡 (stock)"을 빠르게 소모하여, 신경퇴행성 질환의 장기적인 치료를 어렵게 한다. 또 다른 전략은 BDNF를 과다발현하도록 적절하게 변형된 유전자 조작된 줄기 세포를 제조하는 방법이다. 중요하게 유념해야 할 것은, BDNF를 치료학적으로 충분한 수준으로 생산하도록 심지어 NSC를 유전자 조작하여야 한다는 것이다. 그러나, 유전자 변형은 유전자 테라피 - 여전히 입증이 필요한 방법 - 을 토대로 하는 것이다. 따라서, BDNF 분비가 증가된 줄기 세포를 만들 수 있는 새로운 세포 타입과 세포 배양 방법이 대단히 필요하다.

뇌실하 영역 (SVZ)은 살아있는 동안 새로운 뉴런을 만들고 (Altman J and Das GD 1965), 성인기에는 복구 기능을 하는 세포를 만들어내는, 고유한 뇌 영역이다. SVZ 바로 아래에 위치한 혈관은 신경모세포의 탄젠트 이동 (tangential migration) 방향과 평행하게 뻗어 있으며, BDNF 신호전달을 통해 신경모세포의 이동을 안내한다. 성인 뇌에서 SVZ의 조직화는 연구된 어떠한 다른 척추동물과도 현저하게 다른 것으로 현재 알려져 있다. 구체적으로, 성인 뇌의 경우, 이 영역에는 생체내에서 증식하고 시험관내에서 NSC로서 기능할 수 있는 독특한 성상세포 띠가 존재한다. 중추 신경계에서 성상 세포는 여러가지 중요하고 다양한 기능들을 수행한다. 이들 세포는 뉴런, 성상 세포 및 혈관으로 구성된 신경-혈관 유닛을 형성하는데 관여한다. 성상 세포 프로세스는 혈관에까지 연장되어 혈관과 상호작용한다. 성상 세포진 (astrocytic endfeet)은 혈관벽의 구성 성분인 기저판 (basal lamina)과 긴밀하게 접촉하여, 내피 세포와 함께 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 형성한다. 성인의 뇌에서 신경형성 주변 환경 (neurogenic niche) 뿐만 아니라 혈관 주위로 이동 및 복귀할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 추가적으로 뉴런 및 신경교 세포로 분화될 수 있는, 줄기 세포를 분리하는 것이, 새로운 신경퇴행성 세포 테라피 개발의 토대가 된다.

도파민 (DA)은 성체 SVZ에서 주요 신경생성 (neurogenesis) 인자이다 (Baker et al., 2004). SVZ는 선조체와의 근접성으로 인해 헌팅턴병 (HD) 및 파킨슨 질환 (PD)과 같은 선조체-신경퇴행 관련 장애에 대한 신경퇴행 테라피의 타겟이 된다. 이들 2가지 질환은 서로 다른 임상 증상의 운동 장애를 특징으로 하며, 서로 다른 기전을 통해 SVZ-선조체 DA 미세-회로 경로 (micro-circuitry path)와 관련된 것으로 여겨진다. HD에서 발생하는 질환성 DA 신경지배 (disease-generated DA innervation)는, 선천적인 유전자 변이에 의해 유발되는 선조체 내부 뉴런 퇴행 병태를 보완하기 위한 자연적인 피드백 방어 기전이다 (Parent M et al., 2013). DA 수용체 D2의 조절장애 (dysregulation) 가 마우스 모델에서 헌팅턴병의 발병에 대한 민감한 척도이다 (Crook et al., 2012; Chen et al., 2013). 반면, PD는, 흑질선조체 영역의 신경형성 손상으로 인한, DA 뉴런의 대규모 퇴행과 관련있으며, 이것이 병리학적 주된 원인이다 (Hoglinger et. al., 2004).

외부 세균 또는 바이러스 또는 기생충의 침입을 제한하고, 침입 분자로부터 조직을 보호하고, 아울러 이들을 유기체로부터 항-염증 기전에 의해 제거하기 위해, 신체는 초기 염증 반응을 발동한다. 그러나, 만성 염증 (CI)은 양날의 검이다. CI는 장기간 지속되는 현상으로, 예를 들어, 염증이 자동적으로 계속되는 류마티스 관절염에서와 같이, 염증은 건강한 세포에 계속적으로 유해하게 작용하여 건강한 세포를 파괴한다.

신경퇴행성 질환에서는, 수종의 단백질 분자들이 세포 내부에서 서로 긴밀하게 응집하는데, 이를 병리학자들은 "아밀로이드" 구조라 지칭하며, 이것이 뇌를 막히게 하는 경향이 있다. 이들 단백질은 알츠하이머 질환 (AD)에서 아밀로이드 β 및 τ로, 파킨슨 질환에서는 α 시누클레인으로, 헌팅턴병에서는 헌팅틴으로 동정되었다. 이들 응집체는 종종 뇌에 거대 불용성 침전물을 형성한다. 그러나, 실제 독성인 것은 이들 단백질로 된 작은 용해성 응집체인 것으로 보인다. 뇌내 이들 응집체 축적으로 인해, 전술한 질환들 중에서도 특히 다수의 노화-관련 신경퇴행성 장애들에서 만성 염증 반응이 계속 이어진다 (Nuzzo et al., 2014).

알츠하이머 질환 (AD)에 걸린 환자의 뇌에서, 변성된 조직, 손상된 뉴런과 신경돌기의 존재, 고도의 불용성 아밀로이드 β 펩타이드 침전물 및 신경원섬유 덩어리 (neurofibrillary tangle)는 확실한 염증 자극원이 된다 (Zotova et al., 2010; Schott and Revesz, 2013).

많은 연구들에서, AD에서 관찰되는 만성 염증이 질환의 진행을 가속화하고, 심지어 질환의 촉발 인자일 수 있는 것으로 시사되었다. 두부 손상 및 전신 감염 병력은 전형적으로 뇌 염증을 유발하는 요인이며, AD 발병의 위험 인자인 것으로 알려져 있다. 뇌의 면역 세포, 즉 신경교 세포의 과도한 작용 역시 알츠하이머 질환의 또 다른 홀마크이다. 염증이 뉴런 손상 및 독성과 관련있는 것으로 시사되었지만, 신경교 세포, 뉴런 및 아밀로이드 플라그 간의 관계는 여전히 확실하지 않다. 신경교 세포에 의해 분비되는 염증 매개인자가 뉴런에 극히 유해할 수 있다. 그래서, 이는 신경퇴행의 매개인자로 간주되었다.

밀접하게 관련된 2종의 염증-촉진 단백질, IL-12 및 IL-23은, 세포가 면역학적으로 활성화되었을 때, 미세아교세포에 의해 분비된다. 연구들을 통해, 이들 단백질이 AD 환자의 뇌척수액에 증가된 수준으로 존재한다는 것이, 확인되었다. 뇌에 이미 플라그가 매우 많이 존재하는 늙은 알츠하이머 마우스에서, 이들 염증성 단백질을 차단하면, 용해성의 독성이 더 높은 형태들의 아밀로이드 β의 농도가 감소하였으며, 마우스의 인지 결함이 회복되었다 (Vom Berg et al., 2012; Griffin, 2013).

최근 들어, 단백질 NLRP3 및 미세아교세포 단백질 MRP14의 차단과 같이, 다른 항-염증성 전략들이 발표되었으며, 이들 전략은 또한 동일한 알츠하이머 마우스 모델에서 잘 작동하는 것으로 확인되었다. 이러한 전략은 뇌 염증, 아밀로이드 β 침전 및 인지 장애를 완화시킨다. NLRP3이 결핍되도록 유전자 조작된 알츠하이머 마우스에서, 미세아교세포는, 아밀로이드 β를 훨씬 많이 소비하고 뉴런에 유익한 단백질을 분비하는, 비-염증성 상태로 다시 회복되었다. 또 다른 실험에서는, 미세아교세포 단백질 MRP14를 타겟으로 하였는데, 이 역시 미세아교세포를 비-염증성 상태로 회복시키는데 일조하였다 (Heneka et al., 2013; Zhang et al., 2012).

AD에서 중요한 또 다른 인자는 노화이다. 노화는, 기능적인 결함이 발생하게 되어 단백질을 운반하여 적소에 배치시키는 능력을 잃게 되는, 뉴런과 관련된 일반적인 노화성 문제들을 악화시킴으로써, 알츠하이머를 촉발하는데 일조할 수 있다. 이러한 현상은, 염증이, 염증 부위에서 아밀로이드 β의 생산을 증가시키고, 뉴런에 스트레스를 가하고, 단백질-운반 및 처리 시스템에 대한 노화성 감퇴를 촉발함으로써, 악화 된다. 염증은 미세아교세포를 염증성 상태로 재활성화함으로써, 미세아교세포가 뇌의 질환을 제거하는 능력을 떨어뜨린다 (Swindell et al., 2013).

현재, 염증은 아밀로이드 β의 생산을 증가시킴으로써 AD 프로세스 개시에 기여하는 것으로 추정된다. 염증은 미세아교세포의 아밀로이드 β 제거력을 떨어뜨리기 때문에, AD에서 계속적으로 지속되는 것으로 보인다. 따라서, 계속적인 아밀로이드 β 축적은 염증을 해결할 수 없고, 나이든 AD 환자들에서 더욱 악화된다 (Akiyama et al., 2000; Vom Berg et al., 2012; Zang et al., 2012; Griffin, 2013; Heneka et al., 2013; Swindell et al., 2013; Schott and Revesz, 2013).

헌팅턴병 (HD)에서는 신경퇴행에 대한 염증의 기여가 강력하게 제시되어 있지만, AD에서는 거의 연구되지 않았다 (Soulet and Cicchetti, 2011; Ellrichmann et al., 2013). 즉, HD에서 면역계의 활성화는, 신체의 면역 반응에 중요한 전-염증성 사이토카인, 예를 들어, IL-6 및 TNF-α의 발현 증가에 의해 명확하게 입증되어 있다. 이들 전-염증성 사이토카인은 마우스 모델과 HD 증상 환자 뿐만 아니라 HA 전조증상 환자들의 선조체, 혈장 및 CSF에서 현저하게 증가되었다. 또한, HD 환자 및 마우스 모델 둘다에서, 선천성 면역 세포의 과잉활성이, 중추 선천적인 면역계 (미세아교세포) 및 말초 선천적인 면역계 (단핵세포 및 대식 세포)의 돌연변이 mHTT를 발현하는 골수 세포에서, IL-6 생산 증가를 통해, 검출되었다. 또한, 증상이 개시되기 전 수년간 HD 유전자를 보유한 인간의 혈액에서 사이토카인이 비정상적으로 높은 수준으로 존재한다는 것도 발표되었다 (Bjorkqvist et al., 2008; Trager et al., 2014a, b). 환자의 혈액에서 측정할 수 있는 사이토카인의 조성 및 이의 발현 수준이, 테라피의 초기 개입 필요성과 테라피의 시기를 결정하는데 유용할 수 있다.

혈액 세포는, 세포 내부의 비정상적인 HD 단백질 (헌팅틴)의 존재로 인해, HD 환자에서 과잉 활성인 상태일 뿐만 아니라 뇌의 미세아교세포 역시 과잉 활성인 상태인데, 이는 비정상적인 면역 활성화가 HD에서 가장 초기 이상 현상 중 하나일 수 있음을 의미한다. 환자의 혈액 시그니처가 뇌의 HD 효과 뿐만 아니라 HD 중증도의 마커로서 새로운 통찰력을 제공할 수 있다. 비정상적인 면역 활성화가 HD 진행을 늦추는 것을 목표로 하는 향후 치료의 타겟이 될 수 있다 (Soulet and Cicchetti, 2011, Ellrichmann et al., 2013).

파킨슨 질환은 흑질 (substantia nigra)에서의 느리고 점진적인 도파민성 뉴런 (dopaminergic neuron)이 퇴행되는 특징을 가진 질병이다. 연구자들은, 동물 모델을 이용해, PD에서 면역반응을 일으키는 염증 반응에 말초 신경계 및 중추 신경계 면역 구성요소들이 관여한다는 일관된 결과를 수득하였다. 지속적이고 증가하는 전-염증성 기전의 발현이, 세포 보호 기전을 능가하여 도파민성 뉴런과 같이 감수성이 높은 세포를 세포 사멸 경로로 진행시켜, PD 진행에 결정적인 일련의 현상들을 유발하는, 과정을 야기시킨다 (Doursout et al., 2013). 또한, 신경교 반응, T 세포 침윤 및 염증성 사이토카인의 발현 증가에 의해 발현되는 염증성 반응 뿐만 아니라 그외 활성화된 신경교 세포로부터 유래되는 독성 매개인자도 잘 알려진 PD 특징이다. 그러나, 최근 시험관내 연구에서, 미세아교세포의 활성화와 그에 따른 손상된 도파민성 뉴런에 의해 분비된 매개인자를 통한 성상 세포의 활성화가, 뉴런 소실의 주요 요인은 아니라고 하더라도, 뉴런 소실에 관련있는 것으로 제시되었다 (Hirsch et al., 2003). 환자의 역학 및 유전학 연구는 PD의 병리생리학에서의 신경염증의 역할을 뒷받침해준다. PD 환자에 대한 사후 연구에서, 병든 뇌 영역에 선천적인 면역과 후천적인 면역이 관여한다는 것이 검증되었다. 활성화된 미세아교 세포와 T 림프구가 환자의 흑질에서 검출되었으며, 동시에 전-염증성 매개인자의 발현 증가도 확인되었다 (Tufekci et al., 2012; Hirsch et al., 2012). 2008년부터 2012년까지 파킨슨 환자 87명과 건강한 대조군 37명이 참여한 또 다른 연구에서는, C-반응성 단백질 (CRP), 인터루킨-6, 종양 괴사 인자-α, 에오탁신 (eotaxin), 인터페론 γ-유발성 단백질-10, 단핵세포 주화성 단백질-1 (MCP-1) 및 대식세포 염증성 단백질 1-β와 같은 염증 마커들이 일반적인 혈액 검사에서 검출되었다. 참가자들 모두 물론 신체 검사하였다. 이 연구에서, 신경의 염증 정도가, 나이, 성별 및 질병 기간과 같은 인자들을 제어한 경우에도, 중증의 우울증, 피로 및 인지장애와 유의한 연관성이 있는 것으로, 확인되었다 (Lindqvist et al., 2013). 신경 염증 프로세스가 신경을 보호하기 위한 타겟이 될 수 있으며, 항-염증 전략이 PD 치료의 기본적인 한가지 전략이 될 수 있다.

임상적인 운동 장애 질환 등의 신경퇴행-관련 CNS 질환을 치료하기 위해 여러가지 방법들이 조사되었다 (Wernig M, et al., 2011). 신경-재생 세포 테라피에 사용된 줄기 세포 소스들로는 간엽 줄기 세포 (MSC), 신경 전구 세포 (NP), 인간 태아 뉴런 줄기 세포 (huNSC) 및 만능 줄기 세포 (배아 (ESC) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)) 등이 있다. 신경계 병태에 대한 대부분의 세포 테라피 연구들은 주요 세포 조작 (major cellular manipulation) 및/또는 고 침습성 전달 방법을 통해 뉴런-유사 세포를 이용하였다. 예를 들어, WO 2008/132722 및 미국 특허 공개번호 2013/0344041은 줄기 세포 형질 (trait)을 유도하거나 또는 신경영양 인자를 분비하도록 유전자 조작된 줄기 세포를 개시하였고; WO 2009/144718 및 미국 특허 공개번호 2014/0335059 및 2014/0154222는 배양시 생물학적 물질, 천연 물질 또는 화학적 화합물에 노출시켜 비-유도된 상태에 비해 더 높은 수준으로 신경영양 인자를 분비하게 유도하는 방법을 개시하였으며; 기타 연구들에서는 뉴런 분화의 초기 마커들을 발현하는 태아 줄기 세포의 불멸화된 세포주를 사용하였다. 줄기 세포 테라피 연구들에도 불구하고, 정맥내 (IV) 주사를 이용한 줄기 세포 테라피가 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 뇌 영역에서 BDNF 분비 또는 D2 발현을 통해 직접 신경생성을 유도할 수 있음을 입증한 데이타는 없는 실정이다.

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일 구현예에서, 본 발명은, a) 인간 유치로부터 치수 (DP)를 수득하는 단계; b) DP를 항생제를 포함하는 용액으로 세척하고, DP를 배양 배지가 들어 있는 용기에 두는 단계; c) hIDPSC의 증식 및 부착을 관찰하여 조직절편 배양물 (explant culture)이 확립된 후 DP를 배양 배지가 들어 있는 또 다른 용기로 기계적으로 이동 (transfer)시키는 단계; d) 단계 b) 및 c)를 반복 실시하여, CD44 및 CD13을 발현하며 CD146은 발현하지 않는 hIDPSC를 수득하는 단계를 포함하는, CD44 및 CD13을 발현하며 CD146은 발현하지 않는 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (hIDPSC)의 제조 방법에 관한 것이다.

다른 구현예에서, 본 발명은, a) 인간 유치로부터 치수 (DP)를 수득하는 단계; b) DP를 항생제를 포함하는 용액으로 세척하고, DP를 배양 배지가 들어 있는 용기에 두는 단계; c) hIDPSC의 증식 및 부착을 관찰하여 조직절편 배양물이 확립된 후 DP를 배양 배지가 들어 있는 또 다른 용기로 기계적으로 이동시키는 단계; d) 단계 b) 및 c)를 반복 실시하여, CD44 및 CD13을 발현하나 CD146, HLA-DR 및 HLA-ABC는 발현하지 않는 hIDPSC를 수득하는 단계를 포함하는 방법을 포함하는, CD44 및 CD13은 발현하지만 CD146, HLA-DR 및 HLA-ABC는 발현하지 않는, 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (hIDPSC)의 제조 방법에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 방법은, e) hIDPSC의 샘플을 면역염색하여 CD44, CD13, CD146, HLA-DR 및/또는 HLA-ABC를 검출함으로써, hIDPSC에서 CD44 및 CD13의 발현과 CD146의 발현 결핍을 검증하는 단계를 더 포함한다.

다른 측면에서, 면역염색은 샘플을 유세포 측정으로 분석하는 단계를 수반한다.

특정 구현예들에서, 단계 b) 및 c)는 5번 이상 반복되며, 5회 DP 이동 후 수득한 조직절편 배양물로부터 hIDPSC를 입수한다. 다른 구현예들에서, 단계 b) 및 c)는 10번 이상 반복되며, 10회 DP 이동 후 생성된 조직절편 배양물로부터 hIDPSC를 수득한다.

일 측면에서, 조직절편 배양물은 hIDPSC의 세미-컨플루언트 콜로니 (semi-confluent colony)를 포함한다. 다른 측면에서, 단계 c)에서 hIDPSC의 조직절편 배양물은 수집 전 계대 배양 (passaging)한다. 또 다른 측면에서, hIDPSC의 조직절편 배양물의 계대 배양은 hIDPSC의 효소적 처리 및 hIDPSC를 이동시켜 조직절편 배양물을 증식시키는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 치아에서 치수 (DP)를 추출하는 단계; DP를 제1 용기에서 기본 배양 배지내에서 배양하여 DP 조직절편 배양물을 확립하는 단계로서, DP 조직절편 배양물이 파이브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틴, 폴리라이신, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 에낙틴 (enactin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포외 기질 성분을 첨가하여 또는 첨가없이 배양하는 단계; DP를 제2 용기로 기계적으로 이동시켜 2차 DP 조직절편 배양물을 확립하는 단계; 15차 이상의 DP 조직절편 배양물이 확립될 때까지 DP를 기계적으로 이동시키는 단계를 반복하는 단계; DP 조직절편 배양물을 계대 배양하여 계대 배양된 DP 배양물을 제조하는 단계; 및 초기 회수 집단 (early harvest population)과 후기 회수 집단 (late harvest population)의 계대 배양된 DP 배양물을 조합하여 약학적 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이며, 초기 회수 집단은 처음 15차까지의 DP 조직절편 배양물 중 하나 이상으로부터 확립된 계대 배양된 DP 배양물을 포함하고, 후기 회수 집단은 15차 DP 조직절편 배양물 이후의 하나 이상의 DP 조직절편 배양으로부터 확립된 계대 배양된 DP 배양물을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 단계는 저산소 조건 하에 이루어진다. 일부 구현예에서, 초기 회수 집단 및 후기 회수 집단의 계대 배양된 DP 배양물들을 조합하여 약학적 조성물을 제조하는 단계가, 초기 회수 집단 및 후기 회수 집단의 계대 배양된 DP 배양물들의 냉동 스톡 (frozen stock)을 동시에 해동하고; 해동된 계대 배양된 DP 배양물을 모아 (pooling) 약학적 조성물을 제조하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 제조 방법에서, DP의 기본 배양 배지에서의 배양은 DP를 기계적으로 이동시키기 전 적어도 3일간 지속된다. 일부 구현예에서, 제조 방법은 계대 배양된 DP 배양물의 냉동 스톡을 확립하는 단계를 더 포함한다. 일부 측면에서, 계대 배양된 DP 배양물의 냉동 스톡은 DP 조직절편 배양물의 3회 계대 배양에서 확립된다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 치아로부터 치수 (DP)를 추출하는 단계; DP를 제1 용기에서 기본 배양 배지내에서 배양하여 DP 조직절편 배양물을 확립하는 단계로서, 신경능선 (neural crest) 기원의 조직으로부터 농화된 (enriched) 후기 회수물을 포함하는 줄기 세포가 CD44 및 CD13에 이중 양성인 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 신경능성 기원의 조직으로부터 농화되며 CD44 및 CD13에 대해 이중 양성인 줄기 세포는, 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)이다.

일부 구현예에서, 본 발명은, 치아로부터 치수 (DP)를 추출하는 단계; DP를 제1 용기에서 기본 배양 배지내에서 배양하여 DP 조직절편 배양물을 확립하는 단계로서, 신경능선 기원의 조직으로부터 농화된 후기 회수물을 포함하는 줄기 세포가 초기 회수물로부터 수득되는 줄기 세포와 비교해 내인성 BDNF 및/또는 다른 신경영양 인자 (NF3, NF4 및 NF5)의 증가된 분비 수준을 나타내는 것인 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 신경능성 기원의 조직으로부터 농화되며 내인성 BDNF 및/또는 다른 신경영양 인자 (NF3, NF4 및 NF5)를 높은 수준으로 분비하는 줄기 세포는, 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은, CD44 및 CD13을 발현하고; CD146의 발현은 결핍되고; hIDPSC의 BBB 통과를 허용할 수 있거나, 및/또는 CD146, HLA-DR 및/또는 HLA-ABC의 발현은 결핍되고; 면역 세포에 의한 hIDPSC의 거부 반응을 방지하는, hIDPSC를 제조한다.

일 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합성 카세트 서브패밀리 G 멤버 2 (ABCG2), p53 및 비활성 nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 안전성 마커 (safety marker) 하나 이상을 발현하는 줄기 세포를 제조한다. 비활성 nanog는 줄기 세포의 세포질에 주로 위치하는 발현된 nanog이다. 일부 측면에서, 줄기 세포의 적어도 75%가 ABCG2를 발현하거나, 줄기 세포의 적어도 75%가 p53을 발현하거나, 또는 줄기 세포는 5% 이하가 비활성 nanog를 발현한다. 일부 줄기 세포는 추가적으로 안전성 마커 SOX2를 발현한다. 이러한 일부 구현예에서, 줄기 세포는 30% 이하로 SOX2를 발현한다.

본 발명의 방법은 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴트로트로핀-3 (NT3), 뉴트로트로핀-4 (NT4), 뉴트로트로핀-5 (NT5) 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 분비할 수 있는 줄기 세포를 제조한다. 이러한 일부 구현예에서, 약학적 조성물의 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75 (CD271)를 발현한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경상피 (neuroepithelial) 줄기 세포 마커 하나 이상을 발현하는 줄기 세포를 제조한다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75를 발현한다. 이들 세포는 ABCG2, 비활성 nanog, p53 및 SOX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 추가로 발현할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 마커가 ABCG2일 경우 줄기 세포의 적어도 75%가 하나 이상의 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 세포의 적어도 75%가 p53을 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 세포는 5% 이하로 비활성 nanog를 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 세포는 30% 이하로 SOX2를 발현한다.

일부 측면에서, 본 방법은 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 hIDPSC에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은, 신경능성 기원의 조직으로부터 농화된 후기 회수물을 포함하는 줄기 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 신경능성 기원의 조직은 치수이다. 일부 측면에서, 신경능성 기원의 조직으로부터 농화된 줄기 세포는 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)이다. 신경능성 기원의 조직으로부터 농화된 초기 회수 줄기 세포는 처음 15회 또는 처음 25회 회수 사이클로부터 유래되는 IDPSC를 포함하고, 후기 회수 줄기 세포는 60회 이상 또는 26회 이상의 회수 사이클로부터 유래된 IDPSC를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, CD44 및 CD13을 발현하나 CD146의 발현은 결핍되고 hIDPSC를 BBB 통과시킬 수 있거나 및/또는 CD146, HLA-DR 및/또는 HLA-ABC의 발현은 결핍되고 면역 세포에 의한 hIDPSC의 거부 반응을 방지하는, hIDPSC를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 ATP-결합성 카세트 서브패밀리 G 멤버 2 (ABCG2), p53 및 비활성 nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 발현하는 줄기 세포에 관한 것이다. 비활성 nanog는 줄기 세포의 세포질에 주로 위치하는 nanog로 발현된다. 일부 측면에서, 줄기 세포의 적어도 75%가 ABCG2를 발현하거나, 줄기 세포의 적어도 75%가 p53을 발현하거나, 또는 줄기 세포의 5% 이하가 비활성 nanog를 발현한다. 일부 줄기 세포는 추가적으로 안전성 마커 SOX2를 발현한다. 이러한 일부 구현예에서, 줄기 세포는 30% 이하로 SOX2를 발현한다.

본 발명의 줄기 세포는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴트로트로핀-3 (NT3), 뉴트로트로핀-4 (NT4), 뉴트로트로핀-5 (NT5) 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 추가로 분비할 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 약학적 조성물의 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75 (CD271)를 발현한다.

다른 구현예에서, 본 발명의 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경상피 줄기 세포 마커를 하나 이상 발현한다. 일부 측면에서, 본 발명의 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75를 발현한다. 이들 세포는 ABCG2, 비활성 nanog, p53 및 SOX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 추가로 발현할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 마커가 ABCG2일 경우 줄기 세포의 적어도 75%가 하나 이상의 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 세포의 적어도 75%는 p53을 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 세포는 5% 이하로 비활성 nanog를 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 세포는 30% 이하로 SOX2를 발현한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 hIDPSC를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 hIDPSC를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

다른 구현예들에서, 본 발명은 파킨슨병 (PD), 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 뇌졸증, 자가면역성 뇌척수염, 당뇨병성 신경병증, 녹내장성 신경병증, 알츠하이머 질환, 헌팅턴병 (HD), 자폐증, 정신분열증, 간질, 허혈증, 운동 장애 및 경련성 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경계 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 신경계 병태를 치료하기 위해 개체에 전신 투여하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 신경계 질환 또는 병태는 신경퇴행성 질환 또는 병태, 자폐증, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 허혈증, 운동 장애 또는 경련성 장애일 수 있다. 신경퇴행성 질환 또는 병태는 파킨슨병 (PD), 다발성 경화증, 간질, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 뇌졸증, 자가면역성 뇌척수염, 당뇨병성 신경병증, 녹내장성 신경병증, 알츠하이머 질환 또는 헌팅턴병 (HD)일 수 있다.

도 1은 초기 및 후기 회수물에서 유래된 hIDPSC의 면역표현형 결과를 나타낸 것이다. 0-10차 회수물은 초기 회수물로서 규정하였다. 10차 이후의 회수물들은 모두 후기 회수물로 규정하였다.
도 2는 후기 회수물 (13차 회수물)의 3회 계대 배양한 IDPCS를 나타낸 것이다. 이들 세포는 P75 (CD271) (A, C, D), nestin (E-G), CD13 (H) 및 CD73 (I)에 면역 양성이었으며, CD146 (J) 및 HLA-ABC (K)에는 반응하지 않았다. 삽입도는 해당 2차 항체에 대한 대조군이다. A-G 광학 현미경. H-L epi-형광 현미경. 배율: A,J-20X; C, E-G, H, I, L-10X; D, K-40x.
도 3은 a)에서 IDPSC의 LP 집단의 높은 클론형성력을 보여주는 T20, 3회 계대 배양물 3세트로 수행된 CFU-F 분석 결과를 도시한다. b) 및 c)에서는, LP (후기 집단) IDPSC (배치 #11)가 BDNF 및 DARPP 32를 발현하는 세포를 약 80% 포함하는 반면, EP 초기 집단 IDPSC는 이들 마커에 음성 (데이타 도시 안함)이고 D2를 발현하는 세포를 매우 적은 수로 포함함을 입증하기 위해 수행된, FACS 분석 결과를 도시한다.
도 4A는 대조군 세포에서 2차 항체를 이용한 BrdU (B-J)의 양성 면역염색 결과를 도시한 것이다. 도 4B 및 4C는 BrdU 항체와 양성으로 반응하는 LP (후기 집단) IDPSC를 정량한 것이다. (A) - epi-형광, (B) 및 (C) - FACS 분석. 배율 (A)- 200X. (B, E 및 H) - 400X. (C, F, I, D, G 및 J) - 1000X.
도 5는 리프로그래밍 전 (검정색) 및 후 (백색) hIDPSC, 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC) (빗줄 표시)에서 관찰된 내인성 Oct4, Nanog 및 Sox2 유전자 발현에 대한 정량적인 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 유세포 측정에 의한 EP (초기 집단) 및 LP (후기 집단) IDPSC에서 GFAP (신경교 섬유질 산성 단백질) 및 β-III-튜불린 발현을 정량한 결과이다.
도 7은 EP (초기 집단) 및 LP (후기 집단) hIDPSC에 대한 유세포 측정 분석 결과이다. 시험관내 DP 회수 및 hIDPSC 계대 배양 후 CD146 및 CD13 발현에 변화가 관찰되었다. EP-hIDPSC의 경우, ~33%로 CD146 양성 세포가 관찰된 반면, LP-hIDPSC의 경우, 마커에 대한 양성은 1% 미만이었다. EP-hIDPSC의 경우, ~52%로 CD13 양성 세포가 관찰된 반면, LP-hIDPSC의 경우, 세포의 95%가 이 마커에 양성이었다.
도 8은 C57BL-6 마우스의 치수로부터 단리된 IDPSC의 면역염색 결과이다. IDPSC는 Oct4 양성 (A-B)이며, 발현은 주로 핵내 위치한다. 세포는 또한 Nanog에 양성이지만, 발현은 (C)에 제한된다. Nanog+ 세포에서 대칭적인 분열이 관찰되었다 (D). 대칭적인 및 비대칭적인 분열에 의해 생성된 2개의 Sox2+ IDPSC 및 1개의 Sox2- 세포 (E). Sox2+ 세포의 대칭 분열, 단백질의 핵 위치화를 관찰할 수 있다 (F). 세포 Sox2+의 비대칭 분열로 딸 세포는 Sox2 발현을 유실함 (G). A-C: 200x. D-G: 400x.
도 9는 시엽에서 신경 줄기 세포의 분열이 대칭에서 비대칭으로 전환됨을 나타낸 것이다.
도 10은 여러가지 배양 배지에서 7일간 플라스틱 기판 상에 증식시킨 IDPSC에서 미분화된 LSC와 분화된 각막 세포 단백질 (변연 신경외배엽 계통의 일예로서)의 발현을 나타낸 것이다. Epilife, DMEM/KO, KSFM 및 SHEM 배양 배지에서 배양한 IDPSC는 ABCG2를 발현하지 않는다 (A1-A4). 그러나, 기본 배양 배지 (A5)로도 알려진 DMEM/F12에서 배양한 IDPSC에서는 ABCG2가 검출되었다. 이들 세포는 섬유모세포-유사 형태를 나타내었다. Epilife, KSFM 및 DMEM/F12에서 배양한 IDPSC는 CK3/12를 발현하지 않는다 (B1, B3, B5). 그러나, DMEM/KO 및 SHEM에서 배양한 IDPSC는 CK3/12를 발현하였으며, 상피 세포-유사 형태를 나타내었다 (B2, B4). epi-형광 (EF). DAPI로 핵 염색 (청색). 크기 막대: A1-A4, B1, B2 및 B4의 경우 10 ㎛; A5, B3 및 B5의 경우 5 ㎛.
도 11은 양막 (AM) 상에서 여러가지 배양 배지내에 7일간 배양한 IDPSC에서 미분화된 LSC 및 분화된 각막 세포 마커의 발현을 나타낸 것이다. DMEM/F12, SHEM, KSFM 및 DMEM/KO 배양 배지에서 배양한 IDPSC에서 비멘틴이 검출되었다 (A 및 A1-A3). ABCG2가 기본 배양 배지 및 SHEM (B 및 B1)에서 배양한 IDPSC에서 검출되었지만, KSFM 및 DMEM/KO에서 배양한 IDPSC에서는 검출되지 않았다 (B2 및 B3). CK3/12 발현은 DMEM/F12, SHEM 및 KSFM에서 배양한 IDPSC에서 검출되지 않았다 (C, C1 및 C2). CK3/12를 발현하는 일부 IDPSC들이 DMEM/KO에서 배양한 IDPSC에서 검출되었다 (C3). CK3/12를 발현하는 이들 IDPSC는 섬유모세포-유사 형태를 가진다. 핵이 DAPI로 염색되었다 (청색). EF. 크기 막대: A1-A4, B1, B2, B4 = 10 ㎛; A5, B3, B5 = 5 ㎛.
도 12는 조사 제품 CELLAVITA™ (줄기 세포)의 약리학적 효과 실험을 나타낸 것이다.
도 13은 신경계 질환 및 병태를 치료하는데 적합한 초기 및 후기 집단 IDPSC를 모두 포함하는 IDPSC 조성물의 제조 공정의 개략도이다.
도 14는 인간 질환의 동물 모델에서 국소 적용 전 해동 및 이송 후, 장기간 냉동보존시 hIDPSC의 안정성 실험의 타임 라인을 기술한 것이다.
도 15는 HD 질환 모델에서 파일롯 실험의 타임 라인을 기술한 것이다. HD는 3-NP를 투여함으로써 처음 4일간 0일 (D0) - 4일 (D4)에 유도하였다. 5일째 (D5)에, 정맥내 주사를 통해 IDPSC 이식을 투여하였다. 9일 (D9)에 동물을 안락사시킨 후, 뇌 조직을 고정하고, 병소에 대한 조직학적 분석으로 IDPSC 생물분포 및 생착을 검출하였다 (Vybrant + 특이 항체를 이용한 조직면역법).
도 16은 HD 질환 모델에서 그룹 I 실험의 타임 라인을 기술한 것이다. HD는 처음 4일간 0일 (D0) - 4일 (D4)에 유도하였다. 5일째 (D5)에, 정맥내 주사를 통해 IDPSC 이식을 투여하였다. 35일 (D35)에 동물을 안락사시킨 후, 뇌 조직을 고정하고, 병소에 대한 조직학적 분석으로 IDPSC 생물분포 및 생착을 검출하였다 (Vybrant + 특이 항체를 이용한 조직면역법).
도 17은 3-NP-유도된 신경퇴행 프로세스와 이 프로세스에서 IDPSC 이식 효과를 평가하기 위해 사용한 "글로벌 바이오마커" (즉, 국제적으로 허용되는)를 열거한 것이다.
도 18은 신경퇴행을 평가하기 위해 사용한 마커의 위치를 나타낸 것이다. 적색 원은 HD 병소의 일반적인 위치를 표시하는 것으로, 흉터 조직을 형성하고 있으며, 콜라겐 I의 양성 발현이 관찰되었다. 건강한 영역에서는, GABAergic 단백질과 수용체 D2 단백질의 발현을 관찰할 수 있다. IV 투여 후 hIDPSC의 생착은 면역조직화학 방법을 이용한 인간 핵 검출 및 면역형광법을 이용한 CD73 및 hIDPSC의 공동-위치화에 의해 입증한다.
도 19는 동물에 정맥내 주사 후 hIDPSC의 생착을 나타낸 것이다. 광학 단편 (optical cut)에서, 포커스의 여러 깊이 (A1-A4)에서, Vybrant (녹색)으로 염색된 hIDPSC, PI (적색)로 염색된 핵의 존재가 확인된다. 이들 세포는 현저한 모세관 연합 (capillary predominant association) 및 여러가지 형태 타입들을 나타낸다: 뉴런-유사 세포 및 혈관 주위 세포 (A6). A2-A4에서, 여러 가지 위치에서 모세관을 따라 2종의 혈관 주위 세포를 관찰할 수 있다. 이들 2종의 세포는 비슷한 형태를 가진다. A4에서, 축삭의 분기 (embranchment)도 확인된다. A5는 A2-A4에서 확인된 뇌 조직내 뉴런 형태를 개략적으로 도시한 것이다. 뉴런의 핵은 핵소체를 가지고 있으며 약하게 염색되는데, 이는 강하게 염색된 핵과 식별가능한 차이를 보인다. 청색 - 공초점 현미경의 인공 색상. Epi 형광 + 디지탈 간섭 대비 (DIC). 크기 막대 = 10 ㎛.
도 20은 IV 투여 후 4일간 hIDPSC의 생착을 관찰한 것이다. 광학 단편에서 hIDPSC가 Vybrant (녹색)으로 염색되고, 항-hIDPSC 항체 (적색)와 양성으로 반응하는 것으로 확인된다. 이들 결과를 겹치면 노란색으로 나타난다. 이들 세포는 모세관에 인접하게 위치하는 것으로 확인된다. MSC에 대해 2종의 마커를 사용하였다: CD73 및 CD105는 hIDPSC와 양성으로 반응함 (A-D). E. 양성 대조군 시험관내에서 배양한 hIDPSC. 공초점 현미경. Epi 형광 + 디지탈 간섭 대비 (DIC). 크기 막대: A = 5 ㎛; B = 10 ㎛; C = 20 ㎛; D = 5 ㎛.
도 21은 항-인간 핵 (hNu) 항체를 이용한 면역조직화학법의 결과를 도시한 것이다. 랫 뇌의 피질에서 hIDPSC 세포가 단지 몇개 관찰되었지만, 선조체에서는 세포들을 다수개 관찰할 수 있다. 광학 현미경. 90X. 크기 막대: 5 ㎛ (좌) 및 25 ㎛ (우).
도 22는 IDPSC 투여 후 30일에 항-인간 핵 (hNu) 항체를 이용한 면역조직화학법의 결과를 도시한 것이다. 청색 원은 삼각형의 뉴런-유사 바디를 가진 세포를 표시한다. 삼각형 바디를 가진 세포의 크기는 그 세포가 "뉴런"임을 의미한다. 백색 원은 섬유모-유사 세포를 표시한다. 광학 현미경. 90X.
도 23은 항-인간 핵 (hNu) 항체를 이용한 뇌의 면역조직화학법의 결과를 도시한 것이다. 청색 원에서, 선조체 및 SVZ에 위치한 hIDPSC가 관찰된다. 광학 현미경. 90X
도 24는 hIDPSC 이식 후 30일에 CELLAVITA^TM (줄기 세포)-처리 동물에서 뉴런에 대한 DARPP32 양성 면역염색 결과를 나타낸 것이다 (A, B). 무처리 동물 (3-NP + 식염수)에서는 선조체 또는 피질에서 DARPP32의 면역염색이 관찰되지 않는다 (C, D). hIDPSC-처리 동물의 피질 및 선조체에서 랫의 뉴런 생성. 청색 원으로 표시된 뉴런이 존재하는 영역 (C) 및 고배율 (D). 광학 현미경. 배율: 20X 및 90X.
도 25는 IDPSC 투여 전 및 IDPSC 투여 후 30일에 HD 랫 모델의 선조체에서의 수용체 D2의 발현을 나타낸 것이다. 3점 및 2점으로 평가된 동물의 샘플은 3-NP로 처리되었으나 IDPSC 투여되지 않은 동물의 샘플이다. 2점 샘플에서는, 수용체 D2 양성 세포를 단 몇개 관찰할 수 있었지만, 3점 샘플에서는 이들 세포를 관찰할 수 없었다. 1점인 동물 샘플은 3-NP 및 IDPSC 처리된 동물의 것이다. 1점 샘플에서, 수용체 D2 양성 세포를 다수 관찰할 수 있었다. 고 배율의 삽입도는 면역염색 및 뉴런 형태에 대한 상세 결과를 보여준다.
도 26은 HD 질병 모델에서 IDPSC 복수 이식 및 세포 용량 증가에 대한 효과를 조사하기 위한 그룹 II 및 III의 실험 설계를 나타낸 것이다.
도 27은 3-NP에 의해 유도된 HD 랫에서 운동 퇴화 (motor deterioration) 범위를 결정하는 방법의 예시적인 계획을 기술한 것이다.
도 28은 3-NP 유도 전, 3-NP 유도 후 (4일) 및 IDPSC (hIDPSC) 처리 후 파일롯 실험 동물의 체중을 나타낸 것이다.
도 29는 3-NP 유도 전 및 3-NP 유도 후 그룹 II 및 그룹 III 동물의 체중을 나타낸 것이다.
도 30은 3-NP 유도 후 및 hIDPSC 처리 후 30일째의 그룹 II 동물의 체중을 나타낸 것이다.
도 31은 3-NP 유도 후 및 hIDPSC 처리 후 30일째의 그룹 III 동물의 체중을 나타낸 것이다.
도 32는 HD 질병 모델에 대한 파일롯 실험의 타임 라인을 나타낸 것이다 (그룹 I, II, III 및 IV). HD는 처음 4일간 0일 (D0) - 4일 (D4), 3-NP에 의해 유도하였다. 5일 (D5)에, IDPSC 이식을 정맥내 주사를 통해 투여하였다. 9일 (D9)에 동물을 안락사시킨 다음 뇌 조직을 고정하고, IDPSC 생체분포 및 생착을 검출하기 위해 병변을 조직학적으로 분석하였다 (Vybrant + 특이 항체를 이용한 면역조직화학). 그룹 I 및 III는 35일 (D35)에 안락사시키고, 그룹 II 및 IV는 95일에 안락사한 후, 뇌 조직을 고정하고, IDPSC 생체분포 및 생착을 검출하기 위해 병변을 조직학적으로 분석하였다 (Vybrant + 특이 항체를 이용한 면역조직화학).
도 33은 hIDPSC 투여 후 4일에 랫 뇌 조직에서의 hIDPSC의 위치를 나타낸 것이다. hIDPSC 세포는 녹색 (Vybrant)으로, 핵은 적색 (PI)으로 염색하였다 (A1-A4). 세포는 주로 모세관에 위치하였으며, 2가지 유형의 형태들이 관찰되었다: 뉴런-유사 세포 및 혈관 주위 세포. A2, A3 및 A4에서 모세관내 혈관 주위 세포가 서로 다른 위치에 위치함에 주목한다; A4에서, hIDPSC는 축삭 분지 (axon bifurcation)에 위치한다. A5: 뇌 조직에서 뉴런 형태 (A2-A4); A6: 혈관 주위 세포의 위치화를 나타낸 뇌 모세혈관의 개략도. 공초점 현미경. Epi 형광 + 디지탈 간섭 대비 (DIC) 현미경. 크기 막대 = 10 ㎛.
도 34는 IV 투여 후 4일째 hIDPSC 생착을 나타낸 것이다. 광학 단편에서 hIDPSC가 Vybrant (녹색)으로 염색되고, 항-hIDPSC 항체 (적색)와 양성으로 반응하는 것으로 확인된다. 이들 결과를 겹치면 노란색으로 나타난다. 이들 세포는 모세관에 인접한 위치성을 보인다. MSC에 2종의 마커를 사용하였다: CD73 및 CD105는 hIDPSC와 양성으로 반응함 (A-D). E. 양성 대조군 시험관내에서 배양한 hIDPSC. 공초점 현미경. Epi 형광 + 디지탈 간섭 대비 (DIC). 크기 막대: A = 5 ㎛; B = 10 ㎛; C = 20 ㎛; D = 5 ㎛.
도 35는 hIDPSC 투여 후 30일째 랫 뇌 조직내 hIDPSC의 위치화 및 항-인간 핵 (hNu) 양성 염색을 보여주는 면역조직화학 사진이다. 주석: hIDPSC 세포는 피질 (좌)에 수개, 그리고 선조체 (우)에 다수개 존재함. 광학 현미경. 90X 배율. 크기 막대: 각각 5 ㎛ 및 25 ㎛.
도 36은 3-NP 조사 및 IDPSC 투여 후 랫 뇌 조직의 면역조직화학 사진이다. 주석: 세포는 항-인간 핵 (hNu) 면역염색에 양성임. 뉴런-유사 세포는 청색의 원으로 표시되며, 섬유모세포-유사 세포는 백색의 원으로 표시된다. 광학 현미경, 90X 배율.
도 37은 무처리 동물 (3-NP + 식염수) (a-b1); 대조군 동물 (3-NP 또는 hIDPSC 무처리) (c, c1); 및 처리 동물 (3-NP + hIDPSC) (d-f1)의 선조체에서 Nissl 염색 결과를 나타낸 것이다. 실험 그룹들에서 서로 다른 점수가 매겨졌다: 1점 (a, a1, d 및 d1); 2점 (b, b1, e 및 e1); 및 3점 (c, c1, f 및 f1). 넓은 변성 영역 (a, a1); 중증 (d, d1), 중등도 (b, b1, e 및 e1), 경증 (f, f1), 및 신경 소실 없음 (c, c1). 배율: 10X (a-f) 및 20X (a-f1). (b, c, e 및 f)의 삽입도는 전형적인 Nissl-염색된 뉴런 형태를 보여준다 (40X). 광학 현미경 (a-f).
도 38은 무처리 동물 (3-NP + 식염수) (a- b), 대조군 (3-NP 또는 hIDPSC 무처리) 및 (c) 처리 동물 (3-NP + hIDPSC) (d-e1)의 선조체에 대한 DARPP32 면역염색 결과를 나타낸 것이다. (a) 면역염색 음성 (청색 화살표, 스코어 1), (b) 수개의 DARPP32+ 세포 (스코어 2), 및 (c) 대조군 동물 (3-NP 또는 hIDPSC 비처리), DARPP32 면역염색 양성 (스코어 3). (d, d1)에서, 처리 동물에서 뉴런이 소실되고 (3-NP + hIDPSC), DARPP32-염색된 세포가 수개 존재하였다 (스코어 2) (검정색 화살표). (e, e1)에서, anti-DARPP-32 면역염색 결과, 강하게 양성으로 관찰되었다 (스코어 3). 삽입도 (a, b, c, d1)는 DARPP32+ 뉴런 (검정색 화살표)(40X)을 나타낸 것이다. 청색은 HE (헤마톡실린 및 에오신)-염색된 핵이다. 배율: 10X (a, c, d 및 e) 및 20X (d, e1).
도 39는 hIDPSC 투여 후 랫 선조체에서 뉴런 증식을 나타낸 것이다. hIDPSC 투여는, (A) Nissl 염색 및 (B) DARPP32 발현에 따르면, hIDPSC-처리 동물에서 신경보호 효과를 나타내었다. (C) 대조군 대피 hIDPSC 투여 후 뉴런 회복이 관찰된 동물의 수. 대부분의 hIDPSC-처리 동물 (3-NP + hIDPSC)의 스코어는 3 및 2 (중등도 및 경도)인 반면, 대부분의 무처리 동물 (3 NP + 식염수)은 스코어가 2 및 1이었다 (중증 및 중등도).
도 40은 (a-f) 3-NP 주사 및 (g-j) CELLAVITA^TM (줄기 세포) 투여 (a, b) 후, 랫 뇌 조직에서의 BDNF 발현을 나타낸 것이다. 3-NP 주사 후 7일째의 BDNF 발현 결핍 (c, d) 및 30일 후 낮은 수준의 발현 (e, f). 대조군 동물 (3-NP 또는 CELLAVITA^TM 줄기 세포 무처리). CELLAVITA^TM (줄기 세포) 투여 후 7일째 (g, h) 및 30일째 (i, j) BDNF 발현. 배율: 10X (a, c, e, f, g 및 h) 및 20X (b, d, i 및 j).
도 41은 HD의 3-NP 모델에서 CELLAVITA^TM (줄기 세포) 투여 후 30일째 랫 선조체에서의 DARPP32 발현을 나타낸 것이다. 공초점 현미경, A에 사진을 겹쳐 도시함. Epi 형광 + 디지탈 간섭 대비 (DIC) 현미경. B-D: Epi 형광. 크기 막대: 10 ㎛.
도 42는 처리 동물 (3-NP + hIDPSC) 및 무처리 동물 (3-NP + 식염수)에서 체중에 대한 hIDPSC 투여 효과를 나타낸 것이다. 3-NP 투여 전과 투여 후 4일, 그리고 각각의 hIDPSC 투여 후 (30일마다) 체중을 기록하였다. 3-NP-처리 동물에서 3-NP 투여 후 30일, 60일 및 90일에 체중 증가는 관찰되지 않았다. hIDPSC-처리 동물 (용량 1x10⁶)은, 일차 hIDPSC 투여 후 체중이 증가하였다.
도 43은 hIDPSC 정맥내 이식 후 4일에 3-NP 처리 동물의 뇌에서 BDNF 발현을 나타낸 대표적인 도이다. 피질에서 강력한 BDNF 분비가 관찰되었다 (1a, 1b). 해마에서는 BDNF의 분비가 낮은 수준으로 관찰되었다 (1c, 1d). BDNF는 선조체에서 강하게 발현되는 것으로 관찰되었다 (1e, 1f). 대조군 3-NP 그룹은 동일한 뇌 영역들에서 BDNF가 발현되지 않았다 (2a-2f). 광학 현미경. 배율 20X = 1a, 1c, 1e, 2a, 2c, 2e; 배율 40X = 1b, 1d, 1f, 2b, 2d, 2f. 1b와 1d에서 화살 표시 및 1e와 1f에서 별표는 BDNF 분비 세포를 표시한다. 핵을 HE (헤마톡실린 및 에오신)으로 대조염색하였다.
도 44는 hIDPSC 정맥내 이식 후 30일에 3-NP 처리 동물의 뇌에서의 대표적인 BDNF 발현을 나타낸 것이다. 피질에서 BDNF가 강하게 분비되는 것으로 관찰되었다. (1a, 1b). 해마에서는 BDNF가 적게 분비되는 것으로 관찰되었다 (1c, 1d). 선조체에서는 BDNF가 강하게 발현되는 것으로 관찰되었다 (1e, 1f). 대조군 3-NP 그룹의 경우, 동일한 뇌 영역에서 BDNF 분비가 관찰되지 않았다 (2a-2f). 광학 현미경. 배율 20X = 1a, 1c, 1e, 2a, 2c, 2e; 배율 40X = 1b, 1d, 1f, 2b, 2d, 2f. 1b 및 1d의 화살표시 및 1e와 1f의 별표는 BDNF 분비 세포를 표시한다.
도 45는 IDPSC 이식 후 HD-유발된 랫의 기능적인 특징을 평가하기 위한 모든 HD 질병 모델에 대한 실험 설계를 기술한 것이다.
도 46은 정상 MSC와 ES (또는 iPS) 세포 간의 기본적인 차이를 나타낸 것이다. ES 및 iPS 세포에서 종양이 형성되지만 정상적인 MSC에서는 그렇지 않다.
도 47은 신경생성 유도 및 신경보호에 있어 hIDPSC의 개략적인 효능 기전을 도시한 것이다.
도 48은 CELLAVITA^TM (줄기 세포) 단리 및 배치 형성에 있어 초기 단계 발생 프로세스를 도시한 것이다.
도 49는 CELLAVITA^TM (줄기 세포)의 또 다른 초기 단계 제조 프로세스를 도시한 것이다.
도 50은 여러가지 주요 단계들로 구성된 CELLAVITA^TM (줄기 세포) 제조 프로세스를 도시한 것이다.
도 51은 시험 제품 CELLAVITA™ (줄기 세포)의 안전성 실험을 기술한 것이다.

본원에서, 본 명세서 및 청구항에서 사용되는 동사 "포함한다" 및 이의 활용형은 비-배타적인 의미로 용어 다음에 오는 항목들을 포함하는 의미로 사용되지만, 구체적으로 대상을 배제하는 것을 의미하는 것은 아니다. 또한, 부정 관사 ("a" 또는 "an")로 요소를 언급하는 것은, 문맥상 요소 하나 및 단 하나만 존재하는 것으로 명시되지 않은 한, 2 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 부정 관사 ("a" 또는 "an")는 일반적으로 "하나 이상"을 의미한다.

본원에서, 세포 집단에서 유전자의 발현 수준 (대상 항원에 대해 면역양성 수준이 높은)을 언급할 때, 용어 "높은 발현"은 집단의 75% 이상이 그 유전자를 발현한다는 것을 의미한다.

본원에서, 세포의 집단에서 유전자의 발현 수준을 언급할 때, 용어 "낮은 발현"은 집단 중 30% 이하로 그 유전자를 발현하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 낮은 발현은 집단 중 25% 이하로 그 유전자를 발현하는 것을 의미한다.

본원에서, 세포의 집단에서 유전자의 발현 수준을 언급할 때, 용어 "비-발현"은 집단에서 대상 유전자를 발현하는 검출가능한 세포가 없다는 것을 의미한다. 검출가능한 발현이 없다는 것은 발현을 측정하는 방법의 오차 범위내에서의 발현을 포함한다.

본원에서, 용어 "개체" 또는 "환자"는, 비-배타적인 예로, 인간 및 기타 영장류 (예, 침팬치 및 기타 유인원 및 원숭이 종), 농장 동물 (예, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 가축 (예, 개 및 고양이), 실험 동물 (예, 마우스, 랫 및 기니아 피그와 같은 설치류) 및 조류 (예, 닭, 칠면조 및 그외 가금류, 오리, 거위 등과 같은 가축 조류, 야생 조류 및 스포츠 조류) 등의, 임의의 척추동물을 의미한다. 일부 구현예에서, 개체는 포유류일 수 있다. 다른 구현예에서, 개체는 인간일 수 있다.

본원에서, 용어, "줄기 세포"는, 특정 조건에서 성숙한 기능성 세포로 분화할 수 있는, 미성숙한 비-특수 세포 (immature, unspecialized cell)를 지칭한다.

본원에서, 용어, "신경 줄기 세포" 또는 "NSC"는 최종적으로 뉴런, 성상 세포 및 희소돌기신경교로 분화할 수 있으며, 자가-재생가능한, 다능성 세포를 지칭한다.

본원에서, 용어 "신경 전구 세포"는 신경 줄기 세포 보다 세포 분화 단계가 진행된 미분화된 세포를 지칭한다. 즉, 이들 세포는 신경 줄기 세포로부터 유래되며, 중추 신경계 (CNS) 및 말초신경계 (PNS) 중 2가지 이상의 타입으로 분화할 수 있는 후대를 생산할 수 있다.

본원에서, 용어 "신경 전구 세포" 또는 "NPC"는 신경 줄기 세포와 이의 미분화된 후대 전체로 구성되는 혼성 세포 집단을 지칭한다. 즉, NPC는 NPC 및 NSC 둘다 포함한다. 또한, NPC는, 각각 뉴런과 신경교 세포를 생성하는, 뉴런 NPC와 신경교 NPC로 분류될 수 있다.

본원에서, 용어 "회수 사이클 (harvest cycle)"은 장기 (예, 치수와 같이 신경능성 기원의 장기) 또는 조직을, 조직내 줄기 세포의 부착 및 증식 후, 새로운 세포 배양 용기로 이동시킨 다음, IDPSC 증식물을 보존 (예, 냉동보존) 및/또는 서브-배양하는 것으로 구성된다. 조직절편 기법을 이용하여 장기 배양물 (치수)로부터 최초 단리된 줄기 세포는 초기 집단이며, 즉 1차 회수 사이클로부터 단리된 줄기 세포 (장기 배양의 1차 이동)는 초기 집단 세포이다. 예를 들어, 치수 조직으로부터 줄기 세포 단리물, 인간 탈락 유치 (SHED) 유래의 줄기 세포는, 이들 세포가 SHED 탈락 후 폐기되는 치수로부터 단 한번 효소적 방법을 이용해 단리되므로, 초기 및 후기 집단으로 나눌 수 없다. 즉, 단 한가지 SHED 세포 집단만 단리할 수 있다. 또한, 효소적 분해 후, SHED는 세포 배양 플라스크에서 다른 플라스크로 이동시켜, 세포 계대 배양을 계속할 수 있으며, 계대 배양은 일반적으로 SHED가 세미-컨플루언스에 도달되었을 때, 수행한다.

미성숙 치수 줄기 세포 (IPDSC)는, SHED와 대조적으로, 효소적 방법이 적용되지 않는다. IDPSC는, DP를 1차로 플라스틱에 부착시켜 세포 증식 후, 치수의 조직절편 배양물로부터 단리할 수 있다 - 초기 집단 세포. 이 단계에, 치수는 버리지 않으며, 후속적인 조직절편 치수 배양에 사용된다 - 후기 집단. 즉, 2차 또는 이후 차 회수 사이클로부터 단리된 IDPSC들이 후기 집단 세포이다. 예를 들어, 2차 이상의 회수 사이클로부터 단리된 IDPSC는 미분화된 줄기 세포의 후기 집단이다. 본원에서, 용어 "초기 계대"는 조직절편 배양의 처음 5회 계대 배양으로부터 유래되는 세포를 지칭한다. 본원에서, 용어 "후기 계대"는 5회 계대 이후의, 예를 들어 조직절편 배양의 6회 이상의 계대에서 유래되는 세포를 지칭한다. 즉, IDPSC는 초기 집단 또는 후기 집단으로부터 유래될 수 있으며, 또한 초기 계대 또는 후기 계대로 분류될 수 있다.

본 발명은 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (hIDPSC)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 혈액/뇌 장벽 (BBB)을 통과할 수 있으며 신경생성을 유도할 수 있는, 신경능성 기원의 조직으로부터 유래되는, 초기 줄기 세포 집단과 후기 줄기 세포 집단으로 구성된, hIDPSC의 고유한 줄기 세포 집단에 관한 것이다. 신경능선 기원의 조직으로는, 예를 들어, 치아, 치주 및 모낭 조직 등이 있다. 모낭 조직으로는 코털의 모낭 조직 등이 있다.

hIDPSC를 3-NP (3-니트로프로피온산) HD 랫 모델에서 평가하였다. hIDPSC는, 이식 당 형광 단백질 (Vibrant)로 표지된 세포 1x10⁶ 및 1x10⁷개 (3x10⁶세포/kg 및 3x10⁷세포/kg)를 정맥내 주사하고, 1달 후, 특이 항-인간 항체를 이용한 이후 면역조직화학 분석에서, 랫 뇌에 생착한 것으로 확인되었다. 세포 생착은 여러가지 뇌 구획들 (피질, 선조체 및 뇌실하 영역-SVZ)에서 관찰되었다.

BBB 통과 능력은 줄기 세포 테라피의 전신 투여 (예, IV 투여)를 가능하게 하여 신경계 병태를 치료할 수 있으며, 이는 보다 국소화된 투여 방법 보다 유의한 이점을 제공해준다. 전신 투여는 덜 침습적일 뿐만 아니라, 줄기 세포가 필요한 위치로 이동하기 위해 떠나게 되므로 투여 부위에서 유해한 세포 덩어리가 생길 위험성을 낮추는데 좋다. 예를 들어, 줄기 세포 테라피의 척추강내 (IT) 투여가 전임상 및 임상 연구에서 일반적으로 고려되지만, 이 방법은 줄기 세포가 MSC일 경우 상당한 위험성이 존재할 수 있다. 세포 밀도에 따라, 뇌실내를 통해 뇌 실질 (아마도, 염증에서 유래된 화학주성 인자 신호에 대한 반응으로)에 유입된 골수-유래 MSC가, 중증 알레르기성 뇌척수염 실험 동물에서 64% 수준으로 세포 덩어리를 유발하는 것으로 기록되었다. 초기 계대에서 정상 핵형의 MSC 역시 나이브 (naive) 동물에서 덩어리 형성을 유발하였다 (Grigoriadis et al., 2011). 따라서, CNS에 직접 이식된 MSC는 중요성이 아직 파악되지 않은 국소 병태를 스스로 발생시킬 수 있다 (Snyder et al., 2011). 이 덩어리의 체적은 세포 밀도와 상호 관련있는 것으로 보인다. 즉, 세포 수 뿐만 아니라 적용 횟수는 IV와 대조적으로 IT 및 ICV 이용시 제한적이며, 위험 요소일 수 있다.

hIDPSC의 조성물은 간엽 및 신경상피 줄기 세포 면역표현형 (immunophenotype)을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 약학적 조성물 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 간엽 및 신경상피 줄기 세포의 분자 프로파일 발현은 MSC 및 신경상피 세포/전구 세포의 마커와 신경-보호 및 면역-보호 인자를 코딩하는 유전자의 발현이다.

MSC 면역표현형을 발현하는 세포는 CD44의 발현을 포함한다. 기존의 다발성 경화증 동물 모델에서, NCS가 염증이 발생된 내피 세포에 붙은 다음, BBB를 통과하여 염증이 발생된 CNS 영역으로 내피-통과 이동 (trans-endothelial migration)하는 과정이, 기능성 세포 유착 분자 (CAM), 특히 CD44의 구성적인 발현에 의해 순차적으로 매개되는 것으로, 확인되었다 (Rampon C et al., 2008). hIDPSC가 BBB를 통과하는 정확한 기전은 명확하지 않지만, 이들 세포가 혈관주위 세포와 유사한 특징을 가지고 있어 이러한 능력을 가지는 것으로 생각된다 (Barros et al., 2014). 혈관주위 세포는 신경혈관 유닛에서 내피 세포 및 성상 세포 기능의 통합 (integration of endothelial and astrocyte function) 및 BBB 규제에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다 (Armulik et al., 2010; Liu et al., 2012). 이전 연구 (Yilmaz et al., 2011)에 따르면, 간엽 줄기 세포 (MSC)는 전신 투여 후 혈관 내피 세포 셀렉틴 E 및 L의 리간드인 CD44의 발현으로 인해 뇌에 생착할 수 있다 (Dimitroff, et al., 2001). MSC는 백혈구와 비슷한 귀소 기전 (homing mechanism)을 가진다. 백혈구 이동의 제1 단계는, 혈류에서의 자유롭게 이동하는 백혈구의, 셀렉틴으로 알려진 당단백질에 의해 매개되어, 포획 과정을 수반한다. P- 및 E-셀렉틴은 혈관 내피세포에 의해 발현되며, 혈관을 통한 백혈구 이동시 롤링 반응하기 위한 기본 매개인자이다 (Luster et al., 2005). MSC는 뇌 등의 몇몇 장기에 생착하기 위해 이러한 기전 또는 비슷한 기전을 이용할 수 있다 (Sackstein et al., 2008). 즉, CD44는 뇌로 MSC가 이동하기 위한 핵심 인자로 보인다. BM MSC와 마찬가지로, hIDPSC는 CD44를 발현하는데, 이는 또한 정맥내 투여된 후 CD44가 뇌 등의 몇몇 장기로의 hIDPSC 이동에 참여한다는 것을 시사해준다 (Barros et al., 2014, Castanheira et al., 2013). 놀랍게도, hIDPSC는, 또한, 다중기능성 단백질이자 세포 이동, 세포 증식, 세포 분화에 다양한 역할을 수행하는 (Taylor et al., 1993; Mina-Osorio et al., 2008a/b), CD13 (아미노펩티다제 N)을 발현한다 (Kerkis et al., 2006; Kerkis and Caplan, 2012). CD13은, 모세관 형성 프로세스에서, 혈관신생 마커로서, 혈관신생 구축 및 혈관신생 신호 조절에 참여한다 (Bhagwat et al., 2001). 이는, hIDPSC의 이동하여 뇌 혈관 구조로 타겟팅되는 능력에 이의 작용 가능성을, 시사해준다. 3-NP 랫 실험에서, hIDPSC가 뇌 모세관과 긴밀하게 결합 (tight association)하는 것으로 확인되었다.

일부 구현예에서, IDPSC는 CD146, HLA-DR 및/또는 HLA-ABC의 발현 결핍을 나타낸다. 이들 마커의 발현 결핍은 안전한 이종성 테라피 (heterologous therapy)로서의 hIDPSC의 사용을 가능하게 해준다. 내피는 분자 교환에 중요한 역할을 수행하지만, 또한 혈액과 기저 조직 간의 면역 세포의 교환에도 중요한 역할을 담당한다. 내피세포 분자 S-Endo 1 항원 (CD146)은 주로 내피 정션에 위치하며, 내피의 온전성을 뒷받침하는 것으로 제안된 바 있다. 따라서, 인간에서, MCAM (CD146)은 건강한 개체의 말초 순환계에서 T 세포에서 발현된다 (3%). 또한, MCAM 양성 T 세포는 또한 내피 단층에 증가된 결합력을 나타내었으며, 이들 세포는 후천적인 면역 반응의 초기 구성성분일 수 있었다 (Dagur et al., 2015). 즉, 이 마커를 발현하는 줄기 세포는 BBB에 결합하지만 BBB를 통과하지 않을 뿐만 아니라, 면역 반응성일 수 있다.

간엽 줄기 세포 유전자형 패턴은 또한 만능성 마커 OCT3/4 및 nanog의 낮은 발현을 포함한다. 흥미롭게도, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 줄기 세포는 c-Myc, KLf-4, 및 REX-1을 발현하지 않아도 된다. 실제, 이들 줄기 세포는 c-Myc, KLf-4, 및 REX-1에 음성일 수 있다.

신경상피 줄기 세포 분자 프로파일을 발현하는 줄기 세포는, 비멘틴, 네스틴 (nestin), SOX2, p75 및 신경 세포 발생 및 생존에 필수적인 다른 신경영양 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의, 바람직하게는 2종의, 더 바람직하게는 3종 이상의 NPC- 및 NSC-바이오마커를 발현한다. p75는 신경영양성 수용체 마커이다. 최근 연구에서, p75NTR 및/또는 TrkB 발현 또는 이의 신호전달의 정상화가 헌팅턴병에서 BDNF (뇌-유래 신경영양 인자)의 신경보호 테라피를 향상시킬 것이라는 가설이 제기되었다 (Brito et al., 2013).

뉴런 발생 및 증식에 필수적인 신경영양 인자의 예로는 BDNF (뇌-유래 신경영양 인자), GNDF (신경교 세포주-유래 신경영양 인자), NGF (신경 성장인자) 및 NT (뉴로트로핀) 등이 있다. BNDF는, 도파민-관련 신경퇴행성 질환인, 헌팅턴병 (Gauthier et al.; Strand et al.) 및 파킨슨병 (Mogi et al.)에서 중요한 역할을 담당한다. 몇몇 연구들에서, 야생형 HD-과발현성 htt 단백질이 CNS 세포에서 BDNF 발현을 증가시키지만, 돌연변이된 htt 단백질은 BDNF의 하향 조절을 야기하여, 충분하지 않은 신경영양성 공급과 뉴런 세포 사멸을 유발하는 것으로, 입증되었다 (Zuccato et al., 2001). AD 환자의 뇌에는 NGF 수준이 낮지만 (Calissano et al.); NGF 투여로 노화된 설치류에서 콜린성 위축증을 일부 경감시킬 수 있다 (Fischer W et.al). 일부 구현예에서, 바람직한 NGF는 NGF-β이다. 뉴런 발생 및 생존에 필수적인 NT로는 NT3, NT4 또는 NT5를 포함한다. NT4 및 NT5는 감각 및 운도 축삭 생장을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

일부 구현예에서, 줄기 세포는 약학적 조성물이 필요한 개체에 자가인 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 줄기 세포는 약학적 조성물이 필요한 개체에 동종이계인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기 세포는 약학적 조성물이 필요한 개체에 자가인 세포와 동종이계인 세포의 조합을 포함한다.

일 구현예에서, 줄기 세포는 치아 조직, 치주 조직 및 모낭 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경능성 기원의 조직으로부터 단리된다. 바람직한 구현예에서, 신경능선 기원의 조직은 치수이다. 가장 바람직한 구현예에서, 줄기 세포는 미성숙 치수, 예를 들어, 국제 출원번호 PCT/IB14/59850 및 미국 특허 출원번호 14/2140,016에 개시된 바와 같이, 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)로부터 유래된다. IDPSC는 복수의 뉴런 마커를 보유하며, 뉴런으로의 확고한 분화를 이행한다. IDPSC 면역표현형의 새로운 점은 이들 뉴런 마커와 동시에 MSC의 전형적인 마커의 예상치 못한 발현이며, 이는 국제 세포 테라피 학회의 다능성 간엽 기질 세포를 정의하는 최소 기준에 따른 면역표현형을 나타낸다 (Dominici et al., 2006). MSC의 IDPSC에 의한 발현과 복수의 뉴런 마커의 조합은 MSC (Dominici et al., 2006)에서 전형적이지 않으며, MSC에서 언급된 바 없다.

본 발명에서 고려되는 약학적 조성물은 바람직하게는 등장성 (isotonic)이다. 정맥내 주사하는 경우, 미성숙 줄기 세포의 집단은 주사 당 세포 10⁴ - 10¹⁰개, 예를 들어 체중 1 kg 당 세포 10⁴, 10⁵, 10⁶ 및 10⁷개이어야 한다. 줄기 세포의 집단을 포함하는 약학적 조성물은 다른 약학적 활성 화합물 또는 용법에 부가적으로 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 또 다른 약학적 활성 화합물 또는 치료 용법을 추가로 포함할 수 있다.

간엽 줄기 세포

체내에서, MSC는 골수, 탯줄 조직, 치수 및 지방 패드에서 발견된다. 그러나, 골수에는 MSC가 비교적 드물며, 세포 10,000개 당 단 1개로 존재하지만, 다른 소스에는 이들 세포가 현저하게 더 많다. 유기체에서, MSC는 인간 생애 동안 질병, 외상 또는 상해시 조직 재생을 담당한다. MSC의 이러한 기능은 자기-재생 및 가소성 (분화력 - 다양한 세포 타입 생성) 능력에 의해 매개된다. MSC는 전술한 조직으로부터 단리하여, 실험실에서 용이하게 배양할 수 있다. 환자로부터 이들 세포를 한정된 수로 수득한 후, 시험관내에서 MSC를 빠르게 증폭시킬 수 있으며, 향후 임상적인 활용을 위해 냉동보존될 수 있다.

MSC는, 재생성 미세환경을 구축함으로써 "영양 활성 (trophic activity)"을 제공하는 사이토카인, 및 면역조절성 세포 기능에 기여하며 심지어 미토콘드리아 만큼 큰 산물을 도움이 필요한 손상된 세포로 이동시키는 기타 분자 등의 다양한 생활성 분자를 분비할 수 있다. MSC는 생체내 이식되면, 주화성 자극에 반응하여, 국소 부위 및 주변 부위에서 상해 병소로 이동할 수 있다. 또한, MSC는 만성 염증을 줄이고, 세포 자살을 저해하고, 근섬유모 세포의 외형을 부여하고, 흉터 형성을 저해하고, 조직-내인성 전구체의 세포분열을 자극하도록 작용하여, 손상된 조직을 리모델링할 수 있다. 이는 MSC가 "의학적 신호전달 세포"로 지칭되는 이유이다. MSC는 새로운 혈관이 생성되는 과정인 혈관신생을 자극하며, 이는 새로운 신경 세포가 생성되는 과정인 신경생성과 밀접하게 연관되어 있다. 혈관은 뉴런 전구 세포가 손상된 뇌 영역으로 이동하기 위한 프래임워크로서 중요한 역할을 수행한다. 또한, MSC에 의해 분비된 인자는 산화 손상의 파괴 효과를 감소시킨다. 이러한 모든 작용 기전을 이용해, MSC는 손상된 미세환경을 현저하게 개선하여, 세포의 복원을 유발할 수 있다. 즉, MSC는 "세포 파라메딕스 (cellular paramedics)"인 것으로 여겨진다.

인간으로부터 수득된 MSC를 추적하기 위해 표지하여 일부 타입의 조직 손상을 가진 마우스에 주입하였을 때, 이들 세포는 손상된 조직 전역으로 거의 일관되게 이동한다. 이들 세포는, 질환 모델에 따라, 상당한 기간 동안 조직에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. MSC가 계속적으로 존재하는 것은 중요한 일이지만, 잠재적으로 긍정적인 장기간의 치료 효과가 지속될 수 있는 것으로 확인되어, 치료제 개발에 필연적이진 않다.

기능성 면역 시스템을 이용하거나 또는 이용하지 않고 수행된 손상된 마우스 실험들에서 동일한 결과가 수득되었으므로, 일시적인 MSC 존재가 숙주 면역계 작용의 결과가 아님을 인지하는 것이 중요하다. 추가적인 조사를 통해, MSC가 면역계를 억제하고 염증을 저하하는 것으로, 확인되었다. 다시 말해, MSC가 유기체들 간에 전달될 수 있으며, 이는 이식시 유기체의 면역계가 외부 조직을 공격할 때 발생하는 면역 거부 반응이 매우 낮다는 것을 의미한다. 이러한 결과는, MSC가 숙주의 면역계에 의한 거부 반응을 피할 수 있기 때문에, MSC는 숙주에 이식 또는 주사하기 위한 양호한 후보인자가 된다 (Le Blank, Ringden, 2006; English, 2012; Miguel et al., 2012; Griffin et al., 2012; Ankrum et al., 2014).

세포 테라피의 결정적인 의문은, 다수의 여러 방식으로 접근해 온, MSC의 뇌 전달 경로이다. MSC를 뇌로 전달하기 위해 몇가지 방법들, 예를 들어 척추강내, 정맥내, 척수를 둘러싼 공간으로의 주사 및 심지어 코를 통한 경로가 제안되어 왔다. 발생 초기에, MSC와 비슷한 특징들을 공유한, 미성숙 내피 세포와 신경 전구체, 뉴런, 방사 신경교 및 혈관 주위 세포 간의 복잡한 다세포성 상호작용의 결과로서, 혈액/뇌 장벽 (BBB)이 형성되는데, 이것이 혈류와 뇌 간질 공간 (interstitial space) 간의 선택 분자 또는 세포의 운반을 통제한다. BBB는 뇌 악성 및 신경퇴행성 장애를 치료하기 위해 치료제 (약물 또는 세포)를 전달하는데 상당한 문제가 된다. 전신-주입된 MSC는, 이의 영양성, 면역 조절성 또는 그외 조작된 치료학적 인자를 분비하는 능력과 재생력 때문에, 급성 손상, 염증성 질환, 중추 신경계 (CNS)의 뇌졸증 및 심지어 뇌 암을 치료할 수 있다. 그러나, MSC가 정상 상태 및 병적 상태에서 BBB를 통과하여 이동하는 능력을 가지는 지는 아직 파악되지 않았다 (Liu et al., 2013).

MSC의 전신 주입 (예, IV)은 최소한으로 침습적이며, 진행 중인 많은 임상 실험들에서 사용되는 편리한 방법이다. 따라서, 이식된 MSC가 회귀하여 뇌내 허혈성의 손상된 부위에 생착됨으로써 치료학적 효과를 발휘할 수 있을지를 이해하는 것이 중요하다. 아직까지 최소한으로 조작된 MSC의 전신 전달시, BBB를 통해 세포가 뇌에 직접 이식될 수 있다는 데이타는 시사되거나 또는 개시된 바 없다.

MSC를 입수, 배양할 수 있는 간단성 뿐만 아니라 이의 고유한 "영양 활성" 및 면역 거부반응 없이 숙주에 전달할 수 있는 가능성은, MSC를 이용한 줄기 세포 테라피가 신경계 질환 및 병태, 예를 들어, 신경퇴행을 치료하는 유망한 방법인 이유이다. 최근 발표에 따르면, MSC는 세포의 분화 및 생존을 자극하는 단백질인 영양 인자를 분비함으로써 신경퇴행 회복을 지원할 수 있다. 이들 인자의 효과는 신경 세포가 생존을 유지시킬 수 있는 몇 가지 프로세스를 수행할 수 있게 해준다: 축삭 연장, 생장 및 세포 부착. MSC가 뇌에서 세포 증식 및 회복을 촉진할 수 있다는 증거에도 불구하고, MSC가 다른 신경 세포와 신호 전달 및 소통할 수 있는 능력을 가진 성숙한 신경 세포가 될 수 있다는 것은 아직까지 명확하게 검증되지 않았다.

선행 연구들에서 HD 동물 모델에서 MSC 테라피의 잠재성이 조사되었다 (HD가 QA 또는 3-NP에 의해 유도된 화학적 모델 및 마우스 형질전환주 R6/2-J2, N171-82Q 및 R6/2). 그러나, 이들 저자들은 이 세포를 시험 MSC로 지칭하였지만, 이들 세포는 국제 세포 테라피 학회에 의해 규정된 MSC의 전형적인 면역표현형을 가진 것으로 검증되지 않았다 (Dominici et al., 2006). 이들 전-임상 실험에서는 산소가 정상 수준인 조건 (산소 정상 상태) 또는 산소 수준이 낮은 조건 (저산소증)에서 배양한, 골수, 지방세포 조직 및 제대혈 뿐만 아니라 단핵구 세포로부터 유래되는, 동종이계 및 이종성 일차 배양물과 불멸화 세포주를 이용하였다. 즉, 이들 실험에서는, 국제 세포 테라피 학회에 따라 MSC로 간주되는 세포가, 배양시 사전 특수 조작하지 않고도 신경계 질환의 치료에 성공적으로 사용될 수 있다는 것을, 입증하지 못하였다.

이들 실험들에 사용된 세포 수는 대뇌 반구/선조체 당 10⁵, 2 x 10⁵, 4 x 10⁵, 5 x 10⁵, 최대 10⁶개로 다양하였다. MSC 이식물의 투여 시기는 실험 기간 내내 상당히 다양하며, 시기는 1-3일, 2-4주 및 8주이다. 이들 세포는 직접 이식 후 뇌에서 발견되었지만, 뇌내 직접 전달은 매우 침습적이며, 위험성이 높은 시술이다. 따라서, 이들 연구에서는, IV 주사에 의한 전신 투여 등의 줄기 세포 테라피를 투여하는 최소 침습적인 방법이 사용될 수 있는지를, 입증하지 못하였다.

한가지 실험을 제외한 모든 실험들에서는 10회 이하의 계대 배양 세포를 이용하는 방법에 의해 함유된 세포를 사용하였다. 실험에서는 40회 및 50회 계대 배양한 마우스 제대혈-유래 (mUBC-유래) MSC를 사용하였다. 흥미롭게도, 실험에서, 단계 특이적인 배아 항원-4 (stage specific embryonic antigen-4, SSEA4)와 같은 만능 줄기 세포 마커의 발현이 계대 배양에 따라 증가되고, 고차수로 계대 배양 (high-passage)된 mUCB-유래 MSC의 이식이 저차수로 계대 배양 (low-passage)된 mUCB-유래 MSC의 이식과 달리 유의한 운동 이점 (motor benefit)을 부여한다는 것이, 관찰되었다. 공교롭게도, 고차수의 계대 배양으로 인한, 잠재적인 만능성 기원 및 핵형의 높은 돌연변이 위험성으로, 임상적인 활용이 어렵다.

이들 실험들과 대조적으로, 본 발명은, 국제 세포 테라피 학회에 의해 규정된 MSC에 전형적인 면역표현형을 가진 IDPSC의 고유 집단을 심지어 최소 침습적인 투여, 예를 들어 고전적인 IV 전달 경로로 이용하는, 신경계 질환 및 병태의 치료 방법을 제공한다.

추정의 MSC로 HD를 치료하는 이전 실험들에서 입증된 바와 같이, 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 한가지 희망은 줄기 세포를 이용하는 것이다. 공교롭게도, 선조체에 태아 공여 조직을 투여하는 치료만 임상 실험까지 진행되었으며, 소규모 실험에 불과하였다.

HD에서 세포 테라피는 질환에 취약한 뉴런 집단을 보호하거나 및/또는 기능 부전성 뉴런 또는 사멸이 진행 중인 뉴런을 대체하기 위한 것이다. 따라서, HD 세포 테라피에서 임상 진행은 발병된 선조체에 태아-유래 세포를 이식하는 프로토콜 확립에 집중되었다. 이러한 전략은 임상에서 줄기 세포 테라피 개발에 도움이 되며, 수년 간의 개선과 안정성를 제공하지만, 질병에 대한 영구적인 치유는 되지 못한다 (Bachoud-Levi et al., 2006). 수술 후 3년 내지 10년에 걸친 장기간의 환자 추적 결과, HD에서 태아 선조체의 이종이식이 안전한 것으로 확립되었다. 그러나, 아마도 HD 환자에서 보다 성공적이었던 이식 발표와 비교해, 이들 안전성 실험에서 이식한 세포의 양이 적었기 때문에, 지속적인 기능적인 효과는 관찰되지 않았다 (Barker et al., 2013).

줄기 세포 테라피의 사용은, 세포내 및 세포 기전이 HD 표현형과 연루되어 있기에, 필연적이다. 또한, 줄기 세포 테라피는 뇌 조직 재생 과정을 가속화할 수 있다. 줄기 세포는, HD시 가장 많이 손상된 뇌 영역을 회복시키는데 도움이 되는, 중요한 테라피이다. 약물 방식만으로는 특히 HD 후기에 손상된 뇌 영역을 회복시킬 수 없을 것이다.

MSC는, 추출된 인간 치아, 즉 영구치 및 유치로부터 효소 분해에 의해 (Gronthos et al. 2000; Miura et al., 2003) 또는 국제 출원번호 PCT/IB14/59850및 미국 특허 출원번호 14/2140,016에 개시된 바와 같이, 장기 배양 후 조직절편 (미성숙 치수 줄기 세포, IDPSC) 기법에 의해, 수득할 수 있다. IDPSC는, 배아 형성 초기에 존재하는 조직 덩어리인 해부학적으로 외배엽성 간엽 세포 조직, 더 정확하게는 신경능선으로부터 기원하는, 치수 조직으로부터 수득된다. 이는 궁극적으로 목과 두개골의 경질 조직 및 연조직을 형성한다.

신경능선 기원의 IDPSC는, 태아기에 다양한 주로 외배엽 조직으로 이동하여, 자가-재생 능력을 갖추고, 배아 줄기 (ES) 세포와 거의 동일한 발생 잠재성을 발휘하는 것으로 알려져 있지만, 시험관내에서 배상체 (embryonic body)를 그리고 생체내에서 기형종을 형성할 위험성이 없다 (Kerkis and Caplan, 2012). 신경능성 기원의 이동 후 (postmigratory) 줄기 세포는 모든 두개안면 뼈, 중추 신경계와 말초 신경계의 대부분의 세포와 조직 뿐만 아니라 수종의 비-신경 세포 타입, 예를 들어, 특히 심혈관계의 평활근 세포, 피부의 색소 세포, 연골, 결합 조직, 각막 상피 및 치수를 만든다. 신경능성 기원의 이동 후 출생 후 줄기 세포 (postmigratory postnatal stem cell)는 발생 잠재력이 제한적임에도 불구하고, 이들 세포는 배아 카운터파트와 비슷한 기능적 특징과 매우 다양한 세포 타입으로 분화하는 능력을 유지한다 (Le Douarin et al., 2004, 2007, 2008; Dupin et al., 2007; Le Douarin & Dupin, 2003, 2012).

시험관내 IDPSC는 뉴런과 신경교 세포로의 획일적인 분화를 진행한다. 인간 IDPSC의 생체내 이식시 뉴런 등의 다양한 조직들에서 밀집된 생착이 관찰되었다. 뉴런 운명 분화는, 서로 다른 배아 기원에 기초한 체간 골격 및 사지골격 (골수 및 장골릉 (ileac crest))과 비교해, 치수 등의 구강안면 뼈의 후생적 "기억"에 기초로 한다. 치조골 (즉, 상아질, 치수 및 치주 인대) 등의 상악골, 하악골은 신경능선 세포에 의해서만 형성되지만, 체간 골격 및 사지골격은 중배엽으로부터 발생한다. 즉, IDPSC는 신경 재생 및 신경보호 잠재성을 가지고 있다.

Logan A 등은, 복수의 NTF (신경영양 인자)가 신경보호에 상승적인 작용을 발휘하기 위해 세포에 의해 생산되어야 함을, 발표하였다. 즉, hIDPSC 세포가 복수의 NTF를 발현 및 분비하는 것이 중요하다. 최근 간행물에서, NGF (신경 성장인자), BDNF 및 NT3와 같은 복수의 NTF 유전자 발현과 더불어, 신경 지원 (neural support)에서 치수 줄기 세포 (DPSC)의 파라크린 작용 기전의 증거가 발표되었으며, 이들 결과는 hIDPSC가 hBMSC (골수 유래 MSC) 또는 hAMSC (지방세포 유래 MSC) 보다 축삭 절단된 RGC의 신경보호 및 신경생성을 현저하게 더 촉진한다는 것을 입증해준다 (Mead B et al. 2013; Mead B et al., 2014; Martens W et al., 2013). 유리체강내 이식된 DPSC는 망막 테라피에서의 BMSC 보다 더 적합한 세포 타입인 것으로 제시되었다 (Mead B et al., 2014). 이들 실험에서는 성체 랫에서 트립신으로 효소 처리하여 수득한 DPSC (=SHED)를 사용하였다.

아울러, 최근 들어, 병변 부위로의 인접하고 직접적인 직접 경막 이식 (dura transplantation)에 의해 SHED 이식을 이용한, 척수 손상 설치류 모델의 실험 결과가 보강되었으며, SHED는 세포-자율 활성과 파라크린 신경재생 활성을 통한 신경보호 및 신경재생 측면에서 인간 피부 섬유모 세포주 3종 보다 우수하였다 (Sakai et al., 2012). 이들 실험에서는 미성숙한 성체 사랑니를 콜라게나제로 효소 처리하여 수득한 DPSC 배양물을 사용하였다. DPSC를 이식하는 중에, 면역억제를 위해 동물에 또한 사이클로스포린이 처리되었다.

줄기 세포의 전신 투여 안전성

이식조직이 자가이식조직이지 않은 한, 숙주의 면역계가 이식조직을 공격할 위험성은 항상 존재한다. 심지어 충분히 매칭된 동종이식에도 면역억제 전처리가 필요하다. 이는 줄기 세포 이식에도 적용된다.

이식된 세포를 공격하는 숙주 면역계를 피하기 위해, 치료학적 줄기 세포 집단은 면역원성이어서는 안된다. 면역원성은 동종이계 줄기 세포가 이식 후 숙주 면역계와 만났을 때 면역 반응을 유발하는 능력이다 (Schu S et al., 2012). 주 조직적합성 복합체 (MHC)가 일치되지 않는 NPC를, 마우스 간염 바이러스-유발성 CNS 탈수초화가 발병된 마우스에 이식하면, T 세포 침윤과 NPC 거부 반응이 증가하였다 (Weinger JG et al., 2012). 그러나, 최근 증거는 미분화된 성체 줄기 세포가 면역학적으로 면책된 상태로 되어 정상적인 동종이계 거부반응의 진행으로부터 탈출할 수 있을 가능성을 뒷받침해준다 (Bifari F et al. 2010). 면역학적으로 면책된 상태는, 세포가 MHC 발현에 대해 결핍 상태라면, 세포의 집단에 가능한 일이다. 예를 들어, 인간에서 면역원성은, MHC의 인간 버전인, 인간 백혈구 항원 (HLA)에 기본적으로 음성인 줄기 세포의 집단에 의해서는 발생할 수 없다. 따라서, IDPSC의 질적 제어 특징인 HLA-DR의 부재는, 환자에 대해 유해한 면역억제 전처리가 필요하지 않는, 전신성 세포 테라피에 사용될 세포의 필수 마커이다.

줄기 세포 이식의 또 다른 위험성은, 이들 세포가 다른 세포 타입으로 분화될 가능성으로 인해, 특히 미분화된 세포의 경우, 종양 발생 위험성 증가이다. 만능 줄기 세포, 특히 hESC 및 iPSC 세포는 시험관내에서 배상체를, 생체내에서는 기형종을 닮은 구체를 형성할 수 있다. 만능성 세포에 적용하기 위해 현재 이용가능한 기법들은 종양 발생 위험성을 가지고 있다. 특정 유전자의 발현 및 발현 결핍은 줄기 세포 집단의 전신 투여 위험성을 감소시킨다.

Nanog는 내부 세포 덩어리 (inner cell mass)의 만능성 세포 유지 및 배아 줄기 세포의 형성과 관련있는 전사 인자이다. Nanog는 백혈병 저해 인자 (LIF)이자, 전사-독립형 인자-3 (STAT-3)의 활성인자이다. 이는 OCT4 및 SOX2에 의해 조절되며, 이후 각각의 프로모터 유전자 영역에 결합함으로써 OCT4, SOX2 및 그 자신의 발현을 상향 조절한다 (Boyer et al, 2005; Loh et al., 2006; Li, 2010). 요컨대, 이들 3종의 전사 인자는 만능 줄기 세포의 분화를 방지하는데 기본적인 역할을 수행한다 (Boyer et al., 2005). 세포 핵에 OCT3/4, SOX2, NANOG의 형질감염은 지금까지 성체 체세포에서 만능성을 유도 (iPSC 생성)하여, 배아 줄기 세포의 이론적인 전체 특징 패턴을 형성하기에 충분하였다: 체내 200개 타입의 세포로 분화, 무한정 증폭, 재생력, 배상체 형성, 기형종 형성. 기형종 형성은 세포 테라피의 안전을 위협하는 주된 요인이다. 그러나, 핵에서 nanog의 발현 부재는 줄기 세포 집단이 전신 투여에 적합한 지를 결정하기 위한 기본적인 안전성 마커이다. 생체내에서 미분화된 줄기 세포의 종양형성력 (tumorigenicity)의 결여에는 핵내 nanog의 부재가 필수적이다. 즉, 비활성 nanog, 즉 세포질에 위치한 nanog를 발현하는 미분화된 줄기 세포 역시 생체내 종양형성능이 없다.

전신 투여에 적합한 줄기 세포 집단에 대한 또 다른 중요한 안전성 마커는 p53의 발현이다. 이 단백질은 다세포 유기체에 중요하며, 이는 세포 주기를 조절하여, 종양 억제인자로서 기능함으로써 암을 방지한다.

ABCG2 단백질 발현 역시 줄기 세포 집단이 전신 투여에 적합한지를 나타내는 안전성 마커이다. ATP-결합 카세트 (ABC)인 ABCG2 단백질 (BCRP) 발현은 MSC 미분화된 집단의 표현형을 결정하는 중요한 결정인자이다. ABCG2는, 이의 발현이 분화에 따라 급격하게 하향 조절되므로, 다양한 소스 유래의 미분화된 줄기 세포에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 특히, ABCG2 트랜스포터는 알츠하이머 질환 (AD)에서, AD 사례 및 대조군에서 조직병리학적으로 검증된 바와 같이 Aβ를 적극적으로 수송한다. 전장 유전체 연관 (Genome-wide association) 연구 (Bertram L et al., 2007)에서, ABC 유전자의 변이체인 ABCA7에 유전자 변이체 등의 AD 위험성을 조절하는 유전자들이 동정되었다. ABCA7 발현 증가는, AD시 증가된 ABCA7 발현이 질환 진행을 차단하는데 충분하지 않음에도 불구하고, AD 위험성을 낮추는 것으로 판단되었다 (Jared B et al., 2014).

이에, 본 발명의 약학적 조성물의 일부 구현예는 ATP-결합성 카세트 서브-패밀리 G 멤버 2 (ABCG2), 비활성 nanog, p53 및 SOX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 발현하는 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 줄기 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 안전성 마커는 ATP-결합성 카세트 서브-패밀리 G 멤버 2 (ABCG2), 비활성 nanog 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택된다. IDPSC는 ABCG2와 p53을 높은 수준으로 발현하지만, 비활성 nanog와 SOX2는 낮은 수준으로 발현한다. 예를 들어, 하나 이상의 안전성 마커가 ABCG2 또는 p53일 경우, 줄기 세포의 약학적 조성물은 하나 이상의 안전성 마커를 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%로 발현한다. 한편, 하나 이상의 안전성 마커가 비활성 nanog 또는 SOX2일 경우, 줄기 세포들 중 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 5% 미만이 하나 이상의 안전성 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 약학적 조성물의 줄기 세포는 ABCG3, p53, 비활성 nanog 및 SOX2를 공동 발현하며, 이때 줄기 세포의 적어도 75%가 ABCG2를 발현하고, 줄기 세포의 적어도 75%가 p53을 발현하며, 줄기 세포는 5% 이하로 비활성 nanog를 발현하며, 줄기 세포는 30% 이하로 SOX2를 발현한다.

약학적 조성물의 또 다른 구현예는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴트로트로핀-3 (NT3), 뉴트로트로핀-4 (NT4), 뉴트로트로핀-5 (NT5) 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 발현하는 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 줄기 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 줄기 세포는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 높은 수준으로 발현한다. 예를 들어, 세포의 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%가 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 발현한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물의 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75를 공동 발현한다.

일부 측면에서, 이들 구현예에서, 약학적 조성물은 HLA-DR 음성인 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 줄기 세포를 포함한다. 약학적 조성물의 줄기 세포는 또한 c-Myc, KLf-4 및 REX-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특정 MSC 마커에 대해 음성일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물의 줄기 세포는 HLA-DR, c-Myc, KLf-4 및 REX-1에 음성이다.

또한, 약학적 조성물에 대한 다양한 구현예들이 조합될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 ABCG2, 비활성 nanog 및 p53으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 발현하며, 또한 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 더 발현하는, 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 줄기 세포를 포함할 수 있다. 다른 예로, 약학적 조성물은 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포를 발현하며; ABCG2, 비활성 nanog, p53 및 SOX2로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 추가로 발현하는, 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 줄기 세포를 포함할 수 있다.

약학적 조성물의 이용 방법

본 발명은, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 전신 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질환 및 병태를 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 신경계 질환 및 병태의 치료 방법은 신경퇴행성 질환 모델에서 신경생성을 촉진하며, 예방적이다. 일부 구현예에서, IV 투여에 의해서와 같이, 줄기 세포 집단을 전신 투여하면 세포가 뇌로 직접 전달된다. 일부 측면에서, 신경생성은 줄기 세포 집단의 자가-분화에 의해 및/또는 내인성 줄기 세포의 이동 및 분화 활성화에 의해 이루어진다. 일부 측면에서, 신경생성은 바람직하게는 도파민성 (dopamine-associated)이다.

본 방법의 일부 구현예에서, 신경계 질환 또는 병태는, 줄기 세포가 혈액/뇌 장벽 (BBB)을 통과하여 신경생성을 유도함으로써, 치료된다. 일부 측면에서, 줄기 세포는 BBB를 통과한 후 선조체 등의 뇌 실질에 직접 이식된다. 일부 구현예에서, 유도된 신경생성은 도파민성이다. 예를 들어, 도파민성 신경생성은 줄기 세포의 자가-분화 또는 외인성 줄기 세포에 의한 내인성 줄기 세포의 이동 및 분화의 활성화를 통해 이루어진다. 일부 측면에서, 대량의 도파민성 신경생성이 뇌실하 영역 (SVZ)에서 발생한다.

일부 구현예에서, 본 방법은 개체에서 DA 수용체의 양을 측정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에서 DA 수용체의 양을 측정하는 단계는 DA 수용체를 검출하기 위해 개체의 사진을 촬영하는 것을 포함한다. 본 방법의 가장 바람직한 구현예에서, 신경생성은 도파민 수용체 D2에 의해 매개되며, 즉, 일부 구현예에서, 측정되는 DA 수용체는 수용체 D2이다.

본 방법의 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 신경보호를 제공한다. 예를 들어, 전신성 신경보호는 약학적 조성물의 줄기 세포의 신경영양 인자 및 면역보호인자의 높은 기저 발현 수준과 분비 패턴과 함께 제공된다. 일부 측면에서, 약학적 조성물의 줄기 세포는 IDPSC이다.

신경계 질환 및 병태로는, 예를 들어, 자폐증, 정신분열증, 간질, 뇌졸증 및 허혈증, 신경퇴행성 질환 또는 병태, 운동 장애 또는 경련성 장애 등이 있다. 신경퇴행성 질환 또는 병태는, 예를 들어, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 뇌졸증, 자가면역성 뇌척수염, 당뇨병성 신경병증, 녹내장성 신경병증, 알츠하이머 질환 및 헌팅턴 질환일 수 있다. 운동 장애로는, 예를 들어, 투렛 증후군, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 진행성 연수 마비, 척수성 근위축증 (SMA), 소아마비-후 증후군 (post-polio syndrome, PPS) 등이 있다. 경련성 장애로는 예를 들어, 간질 등이 있다.

일부 구현예에서, 신경계 질환 및 병태의 치료 방법은 초기 HD로 진단된 개체에서 천연적인 신경-보호 기전을 지원한다. 다른 구현예에서, 신경계 질환 및 병태의 치료 방법은 PD로 진단된 개체에서 DA 뉴런 소실을 복원한다.

또한, 본 발명은 HD 위험성 개체에 대한 예방 테라피로서 약학적 조성물의 이용 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은, ATP-결합성 카세트 서브-패밀리 G 멤버 2 (ABCG2), 비활성 nanog 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 발현하는 신경능선 기원의 조직으로부터 유래된 미분화된 줄기 세포를 포함하는, 신경계 병태를 치료하기 위해 개체에 전신 투여하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 측면에서, 비활성 nanog는 미분화된 줄기 세포의 세포질에서 주로 위치하는 발현된 nanog이다. 다른 측면에서, 미분화된 줄기 세포들 중 적어도 75%는 하나 이상의 마커가 ABCG2 또는 p53일 경우 하나 이상의 마커를 발현한다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 바이오마커가 nanog일 경우, 미분화된 줄기 세포는 5% 이하로 하나 이상의 마커를 발현한다.

일부 구현예에서, 미분화된 줄기 세포는 ABCG2, 비활성 nanog 및 p53을 발현한다. 일 측면에서, 미분화된 줄기 세포들 중 적어도 75% 이상은 ABCG2를 발현하고, 미분화된 줄기 세포들 중 적어도 75% 이상은 p53을 발현하고, 미분화된 줄기 세포는 5% 이하로 비활성 nanog를 발현한다. 다른 측면에서, 미분화된 줄기 세포는 SOX2를 추가로 발현하며, 미분화된 줄기 세포는 30% 이하로 SOX2를 발현한다. 또 다른 측면에서, 미분화된 줄기 세포는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴트로트로핀-3 (NT3), 뉴트로트로핀-4 (NT4), 뉴트로트로핀-5 (NT5) 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 추가로 발현한다.

다른 구현예들에서, 미분화된 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75를 발현한다. 일 구현예에서, 본 발명은 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 발현하는 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 미분화된 줄기 세포를 포함하는, 신경계 병태를 치료하기 위해 개체에 전신 투여하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

특정 측면에서, 미분화된 줄기 세포는 BDNF, NT3, NT4, NT5 및 p75를 발현한다. 다른 측면에서, 미분화된 줄기 세포는 ABCG2, 비활성 nanog, p53 및 SOX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 더 포함한다. 특정 측면에서, 비활성 nanog는 미분화된 줄기 세포의 세포질에서 주로 위치하는 발현된 nanog이다.

또 다른 구현예에서, 하나 이상의 마커가 ABCG2 또는 p53일 경우, 미분화된 줄기 세포들 중 적어도 75%는 하나 이상의 마커를 발현한다. 특정 측면에서, 미분화된 줄기 세포는 HLA-DR에 음성이다. 일 구현예에서, 신경능선 기원의 조직은 치수이다. 또 다른 측면에서, 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 미분화된 줄기 세포는 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)이다.

다른 측면에서, 본 발명은, ABCG2, 비활성 네스틴 및 p53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 발현하는 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 미분화된 줄기 세포를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 전신 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 약학적 조성물의 미분화된 줄기 세포는 DNF, NT3, NT4, NT5 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 더 발현한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은, DNF, NT3, NT4, NT5 및 p75로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신경상피 줄기 세포 마커를 발현하는, 신경능선 기원의 조직으로부터 유래되는 미분화된 줄기 세포를 포함하는 약학적 조성물을, 개체에 전신 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질환 또는 병태의 치료 방법에 관한 것이다.

특정 구현예들에서, 약학적 조성물의 미분화된 줄기 세포는 ABCG2, 비활성 네스틴, p53 및 SOX2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안전성 마커를 더 발현한다.

다른 측면에서, 개체에 약학적 조성물을 정맥내 투여한다. 일부 구현예에서, 신경계 질환 또는 병태는 혈액/뇌 장벽을 통과하여 신경생성을 유도하는 미분화된 줄기 세포의 집단에 의해 치료된다. 일 측면에서, 신경계 질환 또는 병태는 도파민성 신경생성을 통해 신경생성을 유도하는 미분화된 줄기 세포에 의해 치료된다. 다른 측면에서, 도파민성 신경생성은 미분화된 줄기 세포의 자가-분화를 통해서이거나, 또는 미분화된 줄기 세포에 의한 내인성 줄기 세포의 이동 및 분화의 활성화를 통해서이다.

특정 구현예들에서, 약학적 조성물의 미분화된 줄기 세포는 신경영양 인자 및 면역보호 인자를 공급한다. 다른 구현예들에서, 약학적 조성물의 미분화된 줄기 세포는 전신 신경보호를 제공한다. 일 구현예에서, 미분화된 줄기 세포는 개체의 자가 세포이거나 및/또는 동종이계 세포이다.

특정 측면에서, 신경계 질환 또는 병태는 신경퇴행성 질환 또는 병태이다. 신경퇴행성 질환 또는 병태는 파킨슨병 (PD), 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 뇌졸증, 자가면역성 뇌척수염, 당뇨병성 신경병증, 녹내장성 신경병증, 알츠하이머 질환 및 헌팅턴병 (HD)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 측면에서, 본 방법은 초기 HD로 진단된 개체에 약학적 조성물을 전신 투여하는 단계를 포함하며, 개체에 천연적인 신경보호 기전을 지원해준다. 다른 측면에서, 본 방법은 PD로 진단된 개체에 약학적 조성물을 전신 투여하는 단계를 포함하며, 개체에서 도파민성 뉴런 소실을 회복시킨다. 다른 구현예에서, 신경계 질환 또는 병태는 자폐증, 정신분열증, 뇌졸증 및 허혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 신경계 질환 또는 병태는 운동 장애 및 경련성 장애로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 측면에서, 약학적 조성물은 개체에 1회 투여로 투여된다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 개체에 정맥내 1회 주사로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 개체에 1차 투여 및 2차 투여로 투여된다.

다른 구현예들에서, 약학적 조성물은 개체에 1차 및 2차 정맥내 주사로 투여된다. 일부 측면에서, 약학적 조성물의 2차 투여 또는 정맥내 주사는, 1차 투여 또는 정맥내 주사 후 적어도 7일 간격으로 이루어진다.

일 측면에서, 본 방법은 개체에서 DA 수용체의 양을 측정하는 단계를 더 포함한다. 다른 측면에서, 본 방법은 개체에서 DA 수용체의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 이는 DA 수용체를 검출하기 위해 개체의 사진을 촬영하는 것을 포함한다. 일 측면에서, DA 수용체는 수용체 D2이다.

본 발명은 하기 실시예를 들어 추가로 설명되나, 이들 실시예는 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원 전체에서 모든 참조문헌, 특허 및 발표된 특허 출원들의 내용과 도면은 모든 목적으로 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

실시예

실시예 1. 초기 및 후기 회수물 IDPSC의 특징 규명 및 초기 및 후기 회수물 IDPSC로부터 신경 세포 및 신경교 세포의 유도

초기 및 후기 회수물 IDPSC의 특징 규명

hIDPSC의 특성을 확인하기 위해, 초기 (n = 8) 및 후기 (n = 4) 회수물 (표 1)에서, 세포 2 x 10⁵개에 대해 간엽 마커 CD13, CD105, CD73, CD90, CD44에 대한 유세포 측정 분석을 수행하였다. 세포를 PBS (칼슘 및 마그네슘 무첨가)로 2번 헹구고, 시험 항체를 첨가하여 실온에서 15분 두었다. 그런 후, 세포를 차가운 PBS로 2번 헹구고, Becton-Dickinson 유세포 측정기로 분석하였다. PE (FL2), FITC (FL1), APC (FL4)의 형광을 575 nm, 53 nm 및 600 nm 방출 파장에서 각각 검출하였다.

표 1. FACS 실험에 사용된 세포 리스트

배치 번호	회수물 번호 (H)	계대배양 번호 (P)
초기 회수물:
1	0	3
6	0	3
10	0	3
11	0	3
17	0	3
22	0	3
24	0	3
26	0	4
후기 회수물:
11	13	3
11	16	9
24	13	3
26	10	2

초기 회수물 및 후기 회수물 유래 세포들은 간엽 마커를 고 수준으로 발현하였다. 이들 집단은 HLA-DR 및 HLA-ABC 항원 발현에 음성이어서, 이들 세포 집단의 동종이계 이식이 가능하다. 이들 집단은 간엽 줄기 세포 마커, 예를 들어, CD13 및 CD44 등에 이중 면역양성이었으며, 또한 네스틴, P75 (CD271), 신경상피 줄기 세포 마커 및 신경 성장인자 (NGF)를 발현하며 (도 1과 2A-2L 및 표 2 참조), CD146과 HLA-ABC에 음성이었다.

DP 조직 및 조직절편 배양의 멀티-회수 (multiharvest) 후, IDPSC는 콜로니 형성력을 나타내었다 (도 3). 콜로니 형성 분석 (CFU-F)을 각 플레이트에서 접종된 세포 480개에 대해 T20, P3에 3세트로 수행하였으며, 8일에 여러 개의 콜로니가 생겼으며, 각 플레이트에서 콜로니 약 100개가 형성되었다 (도 3). 콜로니 형성력은 줄기 세포의 기본 특징들 중 하나이다. 즉, 이 능력은, 세포가 언급된 멀티-회수 장기 및 조직 이식 방법을 이용해 수득시, 유지되는 것으로 판단되었다. 또한, LP IDPSC의 증식 활성을 도 4에 나타낸 바와 같이 평가하였으며, 이들 세포는 매우 높은 증식율을 나타내었다.

표 2. FACS 분석에 의한 동일 공여체 유래 hIDPSC로부터 세포 마커 발현 비교.

표 2는 동일한 공여체로부터 유래된 hIDPSC의 여러 회수물들에서 세포 마커 발현을 비교하여 나타낸다 (즉, H0P3 = 1차 회수; H13P3 = 후기 회수; H16P9 = 후기 회수). 후기 회수 집단이 초기 회수 집단 보다 NGF 수준이 더 높았다. 아데노신 트리포스페이트 결합 카세트 (ABC) 트랜스포터의 발현도 세포에서 테스트하였다. ABC 트랜스포터는 생물학적 막을 통해 매우 다양한 범위의 물질들을 능동 수송 (active transport)하는데 참여한다. 이들 트랜스포터는 일반적으로 다약제 내성 발현과 연관되어 있으며, 또한 지질 수송, 세포 이동 및 분화 등의 복수의 생리학적 프로세스와 항상성 프로세스에도 참여한다. 또한, ABC 트랜스포터가 표현형 마커이고, 줄기 세포의 기능성 조절인자로서 사용된다는 증거도 존재한다 (Bunting 2002). 초기 회수 집단과 후기 회수 집단 모두 MDR1 유전자의 산물인 ABCB1 단백질을 발현하였지만, 발현은 후기 회수 집단에서 더 높았다. Islam et al. (2005)에 따르면, ABCB1은 인간 태아 신경 줄기/전구 세포 (hNSPC)에서 발현된다.

FACS 분석에서, IDPSC의 LP (배치 #11)는 BDNF 및 DARPP 32를 발현하는 세포를 약 80% 포함하지만, EP는 이들 마커에 음성이며 (데이타 도시 안함), D2를 발현하는 세포의 수가 매우 적다 (도 3). hIDPSC 초기 회수물 및 후기 회수물의 특징을 추가로 규명하기 위해, 배지 내 BDNF의 양으로 표시되는 전체 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 수준을 ELISA로 측정하였다 (표 3). BDNF 수준은 제조사 프로토콜에 따라 인간 BDNF Quantikine ELISA 키트를 사용해 정량하였다 (R&D Systems, Minneapolis, MN). 여러 회수물 유래 세포 (1 x 10⁶)를 75 cm 플라스틱 플라스크에 접종하였다. 접종 후 약 4일에 상층액을 회수하였다. 그 결과는 BDNF 농도로 나타낸다. BDNF는 모든 세포 서브세트들에서 분비되었으며, 후기 회수물에서 그 수준이 4-10배 높았다.

표 3. hIDPSC의 초기 회수물 및 후기 회수물에서의 전체 BDNF 농도.

배치 번호	회수 (H) 및 계대 배양 (P) 번호	BDNF 농도 ( pg /ml)
11	H0P3	13
24	H10P2	154
26	H13P3	43

hIDPSC가 BDNF를 훨씬 많이 분비함을 보여주는 다른 MSC와의 비교.

1 x 10⁶ hIDPSC에 의해 분비되는 BDNF 평균 농도는, Gothelf et al. 2014 (Clin Transl Med. 2014 3:21)의 MSC 등의 다른 타입의 MSC 보다 수배 더 높은, 6589 pg이다. Gothelf 등에 따라, 1 mM 다이부티릴 사이클릭 15 AMP (cAMP), 20 ng/ml 인간 염기성 섬유모세포 성장인자 (hbFGF), 5 ng/ml 인간 혈소판 유래 성장인자 (PDGF-AA) 및 50 ng/ml 인간 헤레굴린 β1을 포함하는 배지에서 72시간 동안 BM-MSC를 배양함으로써, 골수-유래 MSC (BM-MSC)가 신경영양 인자를 분비하는 세포 (BM-MSC-NTF)로 분화하도록 유도하였다. 유도 배지는 BDNF 분비를 거의 2배 증가시켰지만 (827 pg BNDF/10⁶ BM-MSC vs. 1640 pg BNDF/10⁶ BM-MSC-NTF 세포), hIDPSC는 여전히 BM-MSC-NTF 보다 BDNF를 4배 더 많이 분비하였다. 즉, hIDSPC는 신경영양 인자를 분비하도록 유도된 골수-유래 MSC 보다 신경보호 잠재성이 훨씬 더 높다.

Oct4 , Nanog , Sox2 및 p53의 발현

MSC는 일반적으로 Oct4, Nanog 및 Sox2와 같은 만능성 마커를 문헌에 언급된 바와 같이 낮은 수준으로 발현하는 것으로 알려져 있다 (Jiang et al., 2002; Guillot et al., 2007). 인간 배아 줄기 세포 및 hIDPSC로부터 수득된 심지어 유도 만능 줄기 세포와 비교해, hIDPSC가 상기한 마커들을 매우 낮은 수준으로 발현한다는 것을, 본 발명에서 확인하였다 (도 5). 보다 중요하게도, hIDPSC가 P53을 높은 수준으로 발현함을 확인하였다. 종양 억제인자 유전자 p53은 베이 (bay)에서 암을 유지하는데 도와주는 마스터 조절인자로 잘 알려져 있다. p53 경로 차단은 분화된 세포의 유도 만능 줄기 세포로의 변환 용이성과 효율을 현저하게 향상시킨다 (Dolgin, 2009).

초기 회수물 및 후기 회수물 IDPCS로부터 신경 세포 및 신경교 세포의 유도

뉴런 시스템은 2가지 클래스의 신경 전구체 세포들로 구성된다: 뉴런으로 분화되는 뉴런 NPC, 및 신경교로 분화되는 신경교 NPC. 이들 뉴런 NPC와 신경교 NPC는 동일한 신경외배엽 전구체로부터 생성된다. 신경 전구체 세포의 3번째 클래스인 신경아교모세포도 제시되었다. 이 3번째 클래스의 세포는 뉴런 전구체로서 작용할 수 있는 방사 신경교 세포를 포함하며, 이후 신경생성 후 성상 세포만 생성하는 방향으로 진행된다.

세포 테라피에서 세포 집단이 뉴런 NPC 또는 신경교 NPC인지를 구분하는 능력은, 신경교와 뉴런의 손상 또는 소실을 주로 동반하는 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 효과적인 세포 테라피 전략을 개발하는데 매우 중요하다. 이들 세포의 분화를 유도함으로써 뉴런 또는 신경교로의 분화 가능성을 기존 세포 집단에서 테스트할 수 있다.

EP (초기 집단) 및 LP (후기 집단) IDPSC의 뉴런 및 신경교 생성력을, 기존 프로토콜에 따라, 초기 (P2) 및 후기 (P7) 계대 배양 시점에 EP 및 LP IDPSC에서 뉴런 분화를 유도함으로써, 테스트하였다 (Kerkis et al., 2006) (도 6). 7일 후, 세포를 수집하고, GFAP (성신경교 섬유질 산 단백질) 및 β-III-튜불린 항체를 각각 이용한 유세포 측정에 의해 분석하였다. 치수 (DP) 회수 프로토콜에 따라 확립한 EP (B-E, 좌) 및 LP (B-E, 우) 간에는 이들 마커를 발현하는 세포의 수에 현저한 차이가 존재하였다. 한편, 효소 분해 후 수득한 다른 계대 (P2 및 P7)들에서는 이들 단백질의 유의한 발현 차이는 검출되지 않았다 (도 6). 놀랍게도, IDPCS는 뉴런 NPC 및 신경교 NPC일 수 있다. 초기 DP 회수 (EP IDPSC)에서, 신경교 분화로 주로 결정된 신경 전구 세포가 단리되었지만, 후기 DP 회수 (LP IDPSC)에서는 주로 뉴런 분화로 결정된 신경 전구 세포가 단리되었다.

즉, DP 회수는 뉴런 및 신경교로 발생 잠재성을 가진 NPC 집단을 확립하는데 중요하다. 인간 유치에서 유래된 줄기 세포인 SHED는, DP 회수없이 치수 세포로부터 단리된 줄기 세포이기 때문에, 초기 집단 또는 후기 집단으로 분류할 수 없다. 단일한 SHED 집단은 뉴런으로 결정되고 신경교로 결정되지 않은 전구체를 포함한다. Miura et al. (2003)에서, SHED의 뉴런 분화로 β-III-튜불린, GAD 및 NeuN의 발현이 증가되었지만, 네스틴, GFAP, CNPase 및 NFM의 발현은 분화 유도 후에도 동일하게 유지되었다 (Miura 의 도 4I 참조).

실시예 2. 초기 ( EP ) 및 후기 (LP) hIDPSC에서 CD146 및 CD13 발현

CD146 및 CD13 발현을 EP-hIDPSC 및 LP-hIDPSC에서 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 7의 결과는 CD13이 EP-hIDPSC에서 52%, LP-hIDPSC에서 95%로 발현됨을 보여준다. 이들 결과는, 시험관내 DP 회수 및 hIDPSC 계대 배양을 통해 CD13을 발현하고 CD146의 발현은 결핍된 hIDPSC가 증가된 수준으로 생성됨을, 입증해준다.

실시예 3. IDPSC와 SHED의 비교

여러가지 소스 (예, 골수 및 지방 조직) 유래의 MSC는 여러가지 자극에 차별적으로 반응할 수 있다 (Fraser JK et al., 2006). 배양 조건 (예, 인간 혈청 또는 소 태아 혈청 (FCS)이 첨가된 배지, 또는 무-혈청 배지)은 동일한 기원의 대응한 MSC들의 분화 잠재력에 영향을 미칠 수 있다 (Lindroos et al., 2011; Lizier et al., 2012). 분화 효율의 차이 (즉, 구분되는 하위집단의 존재)가 MSC 집단들의 이종성 (heterogeneity)을 극명하게 반영할 가능성이 매우 높다 (Ho et al., 2008; Tormin et al., 2009; Mareddy et al., 2009; Rada et al., 2011). 여러가지 그룹들에서 사용된 여러가지 단리 및 배양 프로토콜이 구분되는 분화 잠재력을 가진 특정 MSC 하위 집단이 풍부한 것에 대한 이유가 될 수 있다 [Ho et al., 2008; Pevsner-Fischer et al., 2011; Rada et al., 2011).

SHED 및 IDPSC는 서로 다른 단리 방법으로 제조되며, 서로 다른 줄기 세포 환경으로부터 유래된다. 그래서, SHED 및 IPSC가 서로 다른 줄기 세포 마커를 발현한다는 것은 놀라운 일이 아니다 (표 4 참조). SHED는 혈관 주위 환경으로부터 기원하였으며, STRO-1 및 CD146 양성 세포는 면역조직화학적 염색에 따르면 남아있는 치수의 혈관 주위에 위치한 것으로 확인되었다. 생체외 증폭시킨 SHED 중 일부 (9%)만 FACS에서 STRO-1 항체에 양성으로 염색되었다.

표 4. SHED와 IDPSC 간의 차이

SHED	IDPSC
혈관주위 환경	혈관주위 환경 신경얼기 상아질모세포밑 신경얼기 환경 (Subodontoblastic plexus niche) 비-세포성 구역 및 세포-풍부 구역
치수 전체 (DP)	분쇄된 치수
효소 분해: 1시간	줄기 세포 이동
동일한 DP로부터 한번에 단리할 수 있음	30회 단리를 위해 최대 30회 DP 이동가능
배양 배지: 하기 성분이 첨가된 이글스 α 변형 배지 (GIBCO/BRL): 20% FCS 100 μM l-아스코르브산 2-포스페이트 2 mM l-글루타민 100 unit/ml 페니실린 100 ㎍/ml 스트렙토마이신	배양 배지: 하기 성분이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM)/Ham's F12 (1:1): 15% 소 태아 혈청 100 U/ml 페니실린 100 g/ml 스트렙토마이신 2 mM L-글루타민 2 mM 비-필수 아미노산
단일 세포 현탁물 세포 여과기 (cell strainer) 사용	증식
DP 외층과 가장 가까운 층에만 접근	DP의 외부 및 내부 파트에 접근
기본 마커 : 혈관주위	기본 마커 : 간엽 줄기 세포 (MSC) 배아 줄기 세포 (ES 세포) 뉴런 전구 세포 혈관주위
BMP-4가 요구되는 골형성 분화	불필요
EGF, FGF 및 랫 혈청이 요구되는 신경생성 분화	불필요
TGF-β3 및 bFGF 또는 TGF-β가 요구되는 연골 분화	불필요
세포 테라피에 충분한 수의 SHED를 수득하기 위해 고도의 계대 배양이 요구됨	DP를 여러번 이동시키면 몇번의 계대 배양으로도 충분한 IDPSC가 확보됨

분화를 유도하기 위한 조건이 SHED와 IDPSC 간에 서로 다르다. 예를 들어, 뉴런 분화를 유도하기 위해서는, SHED에는 EGF 20 ng/ml (BD Bioscience), FGF 40 ng/ml (BD Bioscience) 및 3% 랫 혈청이 필요하다. 신경 형태를 나타내고 뉴런 마커의 발현을 증가시키기 위해, 신경 유도 배양에 4주가 요구된다.

일부 이런 차이로 인해, IDPSC는 신경생성에 대해 SHED를 능가하는 이점을 가진다. 한 실험에서, SHED를 면역손상된 마우스의 해마 치상회에 주사하였다. 데이타에 따르면, SHED는 마우스 해마에서 10일을 초과하는 기간 동안 생존할 수 있으며, 미분화된 SHED에 의해서도 발현되는, NFM을 발현할 수 있다 (Miura et al., 2003). 다른 실험에서, 분화 전 SHED (7일간 시험관내에서 EGF와 bFGF의 조합에 의해 구축된 SHED-유래 구체)를 파킨슨 랫에 이식하였다. 세포 현탁물 (200,000/㎕)을 랫의 2 DA-고갈된 선조체 부위에 주사하였다 (부위 당 2.5 ㎕). DA 뉴런으로의 어느 정도의 분화가 관찰되었다 (Wang et al, 2010). 3번째 실험에서, 신경 결손 (neurological defciit) 및 사망율 발생율이 높은 출생 전후 저산소성-허혈증 (HI)으로 인해 유발된, 마우스의 손상된 뇌에 생후 5일에 SHED를 주사하였다. 사이클로스포린 A를 사용해 생착된 세포를 이종의 (xenogeneic) 숙주 면역 반응으로부터 보호하였음에도 불구하고, 생착된 SHED 이식 후 8주에 뉴런, 희소돌기신경교 또는 성상 세포로 분화된 세포는 없거나 또는 매우 적었다 (Yamagata et al. 2013).

상기한 3가지 실험 전체에서 공통된 주제는, SHED가 사이클로스포린 A와 함께 투여된다는 것이다. 사이클로스포린 A는 랫에서 허혈성 뇌 경색 영역의 크기를 줄이고, 외상성 뇌 경색 설치류 모델에서 시냅스 기능부전 및 세포 사멸로부터 보호할 뿐만 아니라 헌팅턴병에서 미토콘드리아 기능 이상으로부터 선조 뉴런 (striatal neuron)을 보호하는 것으로 나타났다 (Matsomoto et al., 1999; Albensi et al. 2000; Leventhal et al., 2003). 따라서, 파킨슨 랫 및 HI에서 관찰된 효과는 SHED 뿐만 아니라 사이클로스포린 A의 개입에 의한 것일 수 있다.

실시예 4. 신경계 병태의 치료에 있어 다른 치료학적 줄기 세포와의 비교

표 5에 나타낸 바와 같이, Avita International LTD 사의 hIDPSC는 다른 치료학적 줄기 세포 보다 효과적인 것으로 시판되거나 또는 임상 실험 중에 있다. Avita International LTD 사의 hIDPSC는 면역원성 위험성이 매우 낮은 우수한 안전성 프로파일을 가지며, 냉동보존이 가능해 제조 단가가 낮다.

표 5. Maxim Research에서 수정된 사항을 비교한 표.

회사 (ticker)	BrainStorm Cell Therapeutics Inc. (BCLI)	NeuralStem Inc. (CUR)	Kadimastem ( KDST )	Avita International LTD
세포 소스	골수 유래 자가 MSC	동종이계; 8주령 태아 척수-유래 세포	hESC (배아) 및 iPSC (성체)	치수 유래 hIDPSC
변형	신경영양 인자 분비 유도	없음	성상 세포 전구 세포로의 분화 유도	없음
세포 안전성 프로파일	면역원성 위험성이 낮아, 양호함	원치않는 분화 (기형종) 위험성 및/또는 거부반응 위험성이 존재하는, 매우 낮은 안전성	원치않는 분화 (기형종) 위험성 및/또는 거부반응 위험성이 존재하는, 매우 낮은 안전성	면역원성 위험성이 낮아, 양호함
면역-억제	불필요	필요	필요	불필요
냉동-보존	초기 증식기에, MSCNC의 냉동보존 가능성은 아직 조사되지 않음	세포는 증식 및 냉동 가능함	세포는 분화된 상태로 냉동가능함	세포는 증식 및 냉동 가능함
임상 실험	동정적 치료: I/II상 완전 (이스라엘); II상 진행중 (미국)	2014년에 I/II상 착수 (멕시코); 4Q2014에 II상 종료 (미국)	아직 임상 실험 안됨	I상 진행 중 (브라질)
단가	높음	낮음	낮음	낮음

실시예 5. 멸균 IV 주사에 사용된 IDPSC ( Cellavita )의 분석 인증

동물 모델에 IV 주사용으로 사용된 IDPSC의 대표 배치에 대한 분석 인증 (표 6)은 IDPSC의 특징 결과를 검증해준다.

표 6

분석 방법	특징	설명
형태 검사	형태	역상 현미경 검경에서 정상적인 섬유모세포와 비슷한 형태가 관찰됨
트리판 블루 배제를 통한 세포 생존성	생존성	> 95%
PCR 마이코플라스마 검사	마이코플라스마 검출	검출 불가
CFU	세포 형성 단위 분석	콜로니 > 5개
LAL	내독소 검출	≤ 2 Eu/체중 kg/투여
정균 활성 및 정진균 활성	무균성	검출 불가
그람 염색 기법	미생물 오염	검출 불가
MTT/ 또는 XTT	세포 증식 속도	24시간에 세포수 적어도 2배
FACS 분석 (MSC 마커)	표현형 분석	양성: CD73, CD105, CD44 음성: CD45, HLA-ABC
사이토카인 및 성장인자 분비 분석	사이토카인 및 뉴런 인자 분석	양성: NGF, 및/또는 BDNF, IL8
FACS 분석	뉴런 마커	양성: SOX2, 및/또는 Nestin

실시예 6. 줄기 세포 치료제를 안전하게 전신 투여하기 위한 파라미터 동정

IDPSC는 Oct4 핵 위치화를 나타낸다 (도 8A-B). 대부분의 IDPSC가 세포질에 nanog를 가지고 있으며 (도 8C-D), 매우 드물게는 물론 핵에도 위치하는 것으로 확인된다. IDPSC에서 Sox2의 세포내 위치는 주로 핵이며 (도 8E-G), 일부 세포에서는 역시 세포질에도 위치하는 것으로 관찰할 수 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은, 양쪽 딸 세포에서 Nanog 및 Sox2의 발현 관찰되는 경우 대칭적인 분열을 관찰할 수 있으며 (도 8D-F), 분열 후 딸 세포들이 이들 마커를 발현하지 않거나 또는 줄기 세포의 특징을 상실하게 되어 덜 강력한 전구체 또는 분화된 세포로 되는 경우에는, 비대칭적으로 분열되는 것을 관찰 수 있었다 (도 8E-F).

본 데이타에 따르면, 만능 줄기 세포와는 대조적으로, IDPSC는 MSC 또는 성체 줄기 세포로 분류된다. Nanog의 세포내 위치화는, 이 단백질이 대체로 비활성임을 의미한다. 이는 만능 줄기 세포와 만능 줄기 세포 마커를 발현하는 성체 줄기 세포 간의 현격한 차이이다. 이들 세포는 클래식 MSC 보다 성숙도가 약하며, 더 다양한 성숙 세포로 분화할 수 있지만, nanog가 비활성 상태이므로 기형종을 생산하진 못한다. 대칭 분열 및 비대칭 분열에 대한 결과로, 이들 세포가 비대칭적인 신경 줄기 세포 분열을 모방한다는 것이, 명백하게 입증된다 (도 9).

기형종 형성은 배아 또는 유도 만능 줄기 세포 (ES 세포 및 iPS 세포) 등의 임의의 만능성 세포의 만능성을 평가하기 위한 기본 도구이다. 세포의 기형종 형성력을 평가하기 위해 확립된 일관된 프로토콜을, 최근 Gropp et al., 2012에 의해 공개된 프로토콜과 유사한 방식으로 본 실험에 이용하였다. 본 발명자들의 최근 발표한 방법은 미분화된 마우스 또는 인간의 ES 및 iPS 세포를 정해진 수로 마트리겔과 함께 면역결핍 마우스에 피하로 공동-이식하는 방법을 기초로 한다. 본 발명자의 방법은, 마우스 ES 세포 및 인간 iPS 세포 10⁶개 (세포 10⁵개를 이용하는 Gropp et al., 2012의 방법과 차이점)를 이용할 때, 재현성 및 수율이 매우 높은 것으로 입증되었다. 다수 동물과 장기간 추적 기간 (최대 6개월) 동안, 사례의 100%로 기형종 형성이 관찰되었다. 또한, 본 발명자들은 이 방법을 유치의 치수, 탯줄 및 지방 조직으로부터 유래된 세포 등의 다른 성체 MSC의 생물-안전성 분석에 이용하였다.

기형종 분석의 주요 기준

다음으로서, 기형종 분석을 위한 기준을 평가하였다: 민감성 및 정량화 quantitativity); 세포수 확정 (definitive) 및 단일 세포 현탁물 제조; 만능성 세포 마커 및 핵형에 있어 시험 세포의 면역표현형; 마트리겔과 함께 시험 세포로의 공동-이식. 기형종 발생을 쉽게 모니터링할 수 있도록, 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하 (s.c)이식하였다.

종양 발생을 4달 (~16주)부터 모니터링하였다. 기형종의 조직학적 기준은 만능성 세포의 3종의 배엽층으로부터 유래된 세포로의 분화이다. 이들 실험은 병리학자에 의해 통상적으로 수행되었다.

성체/간엽 줄기 세포에서, 세포 주사 부위에서의 정상 조직 온전성에 대한 모든 타입 또는 변화를 고려하였다.

기형종 기준 적용

A. 실험 시스템 (S):

a. 마우스 배아 줄기 세포

b. 마우스 3T3 섬유모세포, 영구불변의 마우스 세포주 Balbc 3T3 세포주, 클론 A31

c. 인간 iPS-IDPSC

d. 인간 ES 세포

e. 인간 IDPSC

본 발명자들이 확립한 여러가지 마우스 ES 세포주의 만능성을 규명하고, 아울러 높은 25회 이상의 계대 배양에서 ES 세포의 만능성을 검증하고 마우스 ES 세포주로부터 수득한 서브-클론의 특징을 규명하기 위해, 다양한 실험들에 전술한 방법을 이용하였다 (Sukoyan et al., 2002; Carta et al., 2006; Kerkis et al., 2007; Lavagnolli et al., 2007; Hayshi et al., 2010).

아울러, 다른 그룹에서 발표한 최근 발표 내용에 따르면, 이 방법을 이용해 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)로부터 유래된 iPS 세포의 만능성이 규명되었다 (Beltrao-Braga et al., 2011). 이 문헌에서는, 인간 IDPSC가 iPS-IDPSC의 대조군으로 사용되었다. 본 발명자들은, iPS-IDPSC가 3종의 모든 배엽층으로부터 기원한 조직을 가진 적절한 기형종을 형성하지만, hIDPSC는 임의 타입의 기형종 또는 임의의 다른 타입의 신생물을 형성할 수 없다는 것을, 확인하였다. 또한, iPS-IDPSC는 핵에서 Nanog를 발현하였지만, hIDPSC는 그렇지 않았다.

결과

미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)의 집단 단리에 이용된 배양물과 마찬가지로 언급된 멀티-회수 조직절편들은 배아 줄기 세포 마커 Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81 뿐만 아니라 몇가지 간엽 줄기 세포 마커를 적어도 15회 계대 배양 중에 발현하면서, 동시에 줄기 세포의 정상적인 핵형과 증폭 속도 특징을 유지하였다. 이들 마커의 발현은 이들 세포로부터 수득된 서브클론에서 유지되었다. 또한, 이들 세포는 시험관내에서 화학적으로 정의된 배양 조건 하에 평활근 및 골격근, 뉴런, 연골 및 뼈로 일정한 분화를 이행하도록 유도할 수 있다. IDPSC는 크기가 작고 세포 소기관내 (cell organelle) 세포질이 거의 없음에도 불구하고, 나이브 만능성 세포와 차이가 있으며, 전형적인 간엽-섬유모세포 유사 형태를 보인다는 점에 특히 유념한다. 즉, IDPSC는, 상피 타입인 ES 및 iPS 세포와는 대조적으로, 간엽 타입이다 (도 8). MSC와 ES 또는 iPS 세포들 간의 기본적인 차이는, MSC는 이동성이며, 플라스틱 부착성이고, 세포외 기질을 합성하며, 세포 정션 프리 세포 (cell junction free cell)라는 것이다.

B. 실험 시스템:

a. 초기 (n = 10) 및 후기 계대 배양 (n = 10)에서 3종의 IDPSC 일차 배양물

b. 인간 일차 섬유모세포

아울러, 본 방법은 만능성 마커들을 발현하는 골수, 간, 난황낭, 요막 및 양수로부터 유래된 개 태아 줄기 세포를 사용해 검증하였다.

IDPSC는 만능성 마커를 발현하는 줄기 세포를 다양한 수 (세포의 1-25%)로 포함하는 MSC 집단으로 구성된다 (Lizier et al., 2012). 이 세포를 NOD/SCID 마우스 (n = 20)에 이식하고, 4달간 (~16주간) 종양 발생을 모니터링하였다. 세포 주사부위에서 정상적인 조직 온전성에 어떤 타입의 변화가 발생하였는지 주의를 기울였다. 이 프로토콜을 IDPSC 집단에 적용하였으며, 특히 세포의 사용 개수에 따라 적용하여, IDPSC의 20%가 만능성 마커를 발현하는 것을 기본으로 하여 계산하였다. ES 및 iPS 세포를 이용한 이전 실험에서는, 세포를 10⁶개 사용하였지만, IDPSC 및 대조군 세포 최기성 (teratogenicity)에는 세포 5 x 10⁶개를 사용하였다. 4달 후, 육안으로 종양이 관찰되지 않더라도, 마우스를 안락사시키고, 뇌, 폐, 신장, 비장, 간 등의 여러 작기에서 냉동 조직 절편을 입수하였으며, 병리학자에 의해 분석을 수행하였다.

조사한 장기들 모두에서 IDPSC의 DNA가 존재하는 것으로 확인되었지만, 종양 형성이나 또는 어떠한 형태학적 변형은 관찰되지 않았다.

실시예 7. 줄기 세포 치료제의 효과적인 전신 투여를 위한 파라미터 동정

줄기 세포의 적절한 집단을 확립하기 위한 세포 배양 조건.

배양 조건, 예를 들어, 배양 배지 및 부착성 표면이 세포의 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 유전자로는 ABCG2와 비멘틴이 있는데, 이 2종의 유전자는 치료학적 용도, 특히 본 발명과 같이 전신 용도의 세포 시스템에 있어 세포의 배양 적합성을 나타낼 수 있다. 테스트에 가장 적합한 배양 배지 형태는 5-10-15%의 FBS, 항생제 및 글루타메이트가 첨가된 DMEM/F12 기본 배지이며, 세포가 배양 접시 또는 플라스틱 비드에 직접 부착하도록 부착 층 (예, 세포외 기질 (ECM) 또는 스캐폴드) 없이 배양하여야 한다. 상피 배양 배지 조건에서 배양된 세포는, 상피-유사 세포로 변환된다. 다양한 제노-프리 (xeno-free) 배지를 이용할 경우, 성장 인자가 첨가되어야 할 것이며, Terumo 중공사 생물반응조, 비드가 구비된 엔펜도르프-뉴 브런즈윅 생물반응조 등과 같은, 생물반응조를 비롯하여, 3D 배양 조건으로 현재 세포의 규모를 확대하기 위해서는 적절한 ECM 코팅을 선택하는 것이 유용할 수 있다. ABCG2 발현과 세포의 미분화 상태 간의 연관성을 도 10 및 도 11에 나타낸 바, 배양 배지 변화 또는 코팅 층으로 인해 ABCG2가 발현되지 않게 되면, 세포는 보다 명확하게 섬유모세포 또는 상피 세포와 비슷한 형태를 가지게 된다. 또 다른 놀라운 사실은, 기존에 배아 줄기 세포를 유지 또는 유도하기 위해 일반적으로 사용된 전형적인 배지, 즉 둘베코의 변형된 이글 배지 (DEME) 혈청 넉아웃 배지 KOSR (KSFM)은, hIDPSC로부터 유래된 만능성 세포를 유지시키거나 또는 구축하는데 유용하지 않다는 것이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기한 스캐폴드/ECM 매트릭스 코팅 또는 스캐폴드를 포함하는 파이브로넥틴 첨가 및 무첨가 배지를 사용하였을 때, hIDPSC는 섬유모세포-유사 세포 (도 11) 또는 상피 유사 세포로 분화되었다. 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM)를 단독으로 사용한 경우와 대조적으로, B27이 첨가되거나, 선택적으로 FGF 및/또는 EGF가 첨가되면, 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM) 또는 NB (Neurobasal medium)는 뉴런 유사 계통의 형성을 유도하는 것으로 확인되었다. 세포를 신경 계통으로 분화시키는 예시적인 프로토콜들은 이전 특허 출원, 예를 들어 국제 출원번호 PCT/IB14/59850 및 미국 특허 출원 번호 14/2140,016에 이미 기술되어 있다.

각막 세포로의 분화

재료 및 방법

hIDPSC 세포 배양을 위한 잠재적인 파이브로넥틴 -함유 스캐폴드로서 양막의 탈상피화 (de-epithelialization)

양막 (AM)을 공여 태반에서 수득하여, -8℃에 보관하였다 (Covre JL at al 2011). AM을 사용하기 전에, 실온에서 해동시키고, PBS로 3번 헹구었다. 그런 후, AM을 니트로셀룰로스 멤브레인에서 꺼내 다시 헹구었다. 상피를 제거하기 위해, AM을 2시간 동안 EDTA와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 기계적으로 상피를 제거하였다. AM은 상피 제거 후 투명해졌다. 완전히 투명한 AM을 인서트 위로 옮겼다 (Covre JL at al 2011 및 Melo GB at al 2007).

IDPSC 배양

인간 IDPSC (2n = 46, XX)를 유치의 치수에서 단리하여, 기존에 공지된 바와 같이 특징을 규명하였다 (Kerkis et al. 2006). hIDPSC는, 15% 소 태아 혈청 (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 unit/mL 페니실린 (Gibco, Grand Island, NY), 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Gibco), 2 mM L-글루타민 (Gibco) 및 2 mM 비-필수 아미노산 (Gibco)이 첨가된, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM)/Ham's F12 (1:1; Invitrogen, Carls- bad, CA)에서 유지시켰다. 배양 배지를 매일 교체하였으며, 세포는 3일 마다 교체하였다. 80% 컨플루언스에 도달한 후, 세포를 멸균한 포스페이트-완충화된 염수 (PBS; Gibco; 0.01 M, pH 7.4)로 2번 헹군 다음 0.25% 트립신/EDTA (Invitrogen)로 효소 처리하고, 미리 준비한 양막 위에 접종하였다.

배양 배지

AM에서 IDPSC를 배양하는데 가장 좋은 배양 배지를 선정하기 위해, 다음의 배양 배지를 테스트하였다: A) 첫번째 배지: SHEM (supplemental hormonal epithelial medium), 즉, 1.05 mM 칼슘, 5 ㎍/ml 결정질 보바인 인슐린 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 30 ng/ml 콜레라-독소 (Calbiochem, San Diego, CA), 2 ng/ml 상피 성장 인자 (EGF, R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN), 0.5% 다이메틸 설폭사이드 (DMSO, Sigma Aldrich), 0.5 ㎍/ml 하이드로코르티손, 5 ng/ml 소듐 셀레나이트, 5 ㎍/ml 아포-트랜스페린 및 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된, 둘베코의 변형된 이글스 배지/Ham's F-12 영양제 혼합물 (DMEM/F12; Invitrogen, Gibco Cell Culture, Port- land, OR; 1:1)의 조합. 별도로 기재한 것을 제외한 모든 시약은 Invitrogen Corporation (Grand Island, NY) 사에서 구입하였다. B) 두번째 배지: 0.09 mM 칼슘, 30 mg/ml 뇌하수체 보바인 추출물, 0.2 ng/ ml EGF, 10% FBS 및 암피실린/스트렙토마이신이 첨가된, 각질 형성 세포 무혈청성 배지 (KSFM). C) 세번째 배지: 0.06 mM 칼슘, 1% "인간 각막 증식 첨가제" (Cascade Biologics), 0.2% 뇌하수체 보바인 추출물, 5 g/ml 보바인 인슐린, 0.18 mg/ml 하이드로코르티손, 5 ㎍/ml 보바인 트랜스페린, 0.2 ng/ml EGF, 1% 페니실린 G 소듐 (페니실린 G 소듐 10,000 g/ml, 스트렙토마이신 설페이트 25 mg/ml, 암포테리신 B/0.85% NaCl) 및 5% FBS가 첨가된, Epilife 배지 (Cascade Biologics, Portland, OR). D) 넉아웃 배지 (Knockout media).

항체

마우스 항-인간 단일클론 항체: ABCG2 (Chemicon) 및 세포질/핵 단일클론 항체: 마우스 항-사이토케라틴 3/12 (K3/ 12) (RDI, Flanders, NJ, USA)를 인간 및 토끼와 반응시켰다. 마우스 항-인간 IDPSC 항체를 기술된 바와 같이 수득하였으며 (Kerkis et al., 2006), 본 발명자들은 이전 실험들에서 성공적으로 사용한 바 있다 (Fonseca et al., 2009; Monteiro et al., 2009).

면역형광 염색

세포를 유리 커버-슬립 상에서 최대 70% 컨플루언스로 배양하였으며, 또한 AM 상에서 배양하고, PBS (Gibco)로 헹군 다음 4% 파라포름알데하이드 (Sigma)로 밤새 고정하였다. 커버슬립을 20 mM Tris-HCl pH 7.4 (Vetec, Duque de Caxias, RJ, Brazil), 0.15 M NaCl (Dinamica Reagent, Sao Paulo, SP, Brazil) 및 0.05% Tween-20 (Sigma)이 첨가된 트리스 완충화된 염수 (TS)로 3번 헹구었다. 15분간 0.1% Triton X-100 (Santa Cruz Biotechnology)을 처리해 투과화하였다. 세포를 3번 헹구고, 30분간 PBS pH 7.4 (Gibco) 중의 5% 소 혈청 알부민 (Sigma) 내에서 배양하였다. 각 슬라이드에 여러가지 희석 비율 (ABCG2 및 K3/12 (1:100), 및 anti-hIDPSC (1:1000))로 1차 항체를 첨가하여 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 세포극 TBS (3회)로 헹군 다음, 항-마우스 항체-접합된 플루오레세인 이소티아시아네이트 FITC) 2차 항체를 1:500 희석 비율로 첨가하여 1시간 동안 암 조건에서 배양하였다. 현미경 슬라이드를 안티페드 (antifade) 용액 (Vectashield 탑재 매질, Vector Laboratories, Hercules, CA, USA)에 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 첨가하여 넣고, 공초점 현미경으로 분석하였다. 대조군 반응은 1차 항체 대신 PBS와 인큐베이션한 다음 세척 후 대응되는 2차 항체와 인큐베이션하였다. 실험들 모두 3세트로 수행하였다.

결과

플라스틱 기판에서 여러가지 배양 배지 중에 배양한 IDPSC에서의 미분화된 LSC 및 분화된 각막 세포 단백질의 발현

LSC 특징 분석에 일반적으로 사용되는 BCG2 단백질 (ATP-결합성 카세트 서브-패밀리 G 멤버 2), 그리고 타입 I 중간 필라멘트 체인을 코딩하며 둘다 각막 상피에서 발현되는 CK3 (사이토케라틴 3)와 사이토케라틴 12의 발현 패턴을 분석하였다. 도 12는, IDPSC가 7일간 각각의 배양 배지에서 배양하였을 때, 시험 단백질의 발현에 차별적인 반응을 나타내었다는 것을 보여준다. 플라스틱 표면에서 배양한 IDPSC는, SHEM, KSFM, Epilife 및 DMEM/KO (도 10 A1-A4)에서 배양된 경우, ABCG2를 발현하지 않았지만, 기본 배양 배지에서 배양되었을 때에만 이 단백질을 발현하였다 (도 10 A5). 흥미롭게도, SHEM 및 DMEM/KO에서 배양한 IDPSC는, 7일 후, 그 형태가 섬유모세포 유사 형태 (도 10 A5)에서 상피 유사 형태 (도 10 B2 및 B4)로 바뀌었으며, CK3/12를 발현하기 시작하였으며, 반면 Epilife 및 KSFM 및 DMEM/F12에서 배양한 IDPSC는 K3/12 발현을 개시하지 않았다 (도 10 B1, B3, B5).

AM 상에서 여러가지 배양 배지에서 배양한 IDPSC에서의 미분화된 LSC 및 분화된 비멘틴 마커의 발현

다음으로, 7일간 AM 상에서 배양한 IDPSC에서 이들 마커와 추가적으로 비멘틴의 발현을 검증하였다 (도 11). Epilife 배지에서 배양하였을 때 세포의 생존성이 매우 낮고 (50% 미만) Epilife와 조합한 경우 AM 상에서 세포의 부착성이 낮기 때문에, 본 실험에서 Epilife는 제외시켰다. 모든 샘플들에서 비멘틴 발현이 관찰되었는데 (도 11 A-A3), DMEM/F12 및 SHEM (도 11 A 및 A2)에서 배양된 IDPSC에서는 양성이었고, KSFM 및 DMEM/KO (도 11 A2 및 A3)에서 배양된 IDPSC에서는 약한 양성으로 관찰되었다. ABCG2 항체는 SHEM 및 DMEM/F12 (도 11 B 및 B1)에서 배양된 IDPSC에서 강한 면역양성을 나타내었지만, KSFM (도 11 B2)에서 배양된 IDPSC에서는 관찰되지 않았으며, DMEM/KO (도 11 B3)에서 배양된 IDPSC에서는 면역양성이 약하게 관찰되었다. IDPSC는 DMEM/F12 e KSFM (도 11 C 및 C4)에서 배양된 IDPSC와 반응하지 않았으며, SHEM 및 DMEM/KO (도 11 C1 및 C3)에서 배양하였을 때, K3/12에 대해 면역양성을 나타내었다.

실시예 8. 전임상 약물 실험

도 12는 시험 제품 CELLAVITA™ (줄기 세포)의 여러가지 임상 용도를 조사하는 것을 목표로 하는 전임상 약물 실험을 요약 개시한다. 다수 실험들이 다양한 적응증에 대한 세포의 약리학적 효능을 조사하기 위해 수행되었지만, 이들 모두 제품의 안전성 프로파일과 제안된 정맥내 투여의 안전성 프로파일을 입증한다.

실시예 9. 제품 설명 및 상세 내용

표 7은 CELLAVITA^TM (줄기 세포) 상세 설명.

표 7: 약물 제품에 대해 공개된 내용

분석 방법	특징	상세 설명
외형-형태 검사	형태학	역상 현미경 검경에서 정상적인 섬유모세포와 비슷한 형태
트리판 블루 배제에 의한 세포 생존성	생존성	>95%
세포 배가	세포 배가	24시간 동안 세포 수 적어도 2배 증가
CFU	세포 형성 단위 분석	콜로니 >5개
무균성 (21 CFR/EP/USP)	미생물 오염	14일 후 증식 검출되지 않음
내독소 (LAL)	≤1.0 EU/mg A280 단백질	<0.005 EU/mg A280 단백질
PCR 마이코플라스마 검사	마이코플라스마 검출 배양 - 증식 검출 안됨	검출불가
불순물
FACS 분석	동종이계 마커	HLA 클래스 II 음성
FACS 분석	HSC 마커	CD34 음성
FACS 분석	MSC 표현형 분석	CD73, CD105 양성
FACS 분석	뉴런 인자 표현형 분석	NGF, 네스틴 양성
분석
ELISA 분석	뉴런 인자	BDNF 양성

분석 절차

안전성 QC - 마이코플라스마 검사

마이코플라스마 검사는 인-하우스 RT-PCR 검사 (EZ-PCR Biological Industries, Israel)로 제조사의 프로토콜에 따라 hIDPSC 배양 중에 정기적으로 수행한다.

안전성 특징 - 핵형 분석

핵형 분석은 핵형 안정성을 입증하기 위해 수행되었으며, 데이타는 이미 공개되어 있다 (Kerkis et al., 2006; Beltrao-Braga, 2011; Lizier et al., 2012).

안전성 및 동일성 (Identity) QC - 세포 표면 항원의 유세포 분석

세포 표면 마커의 면역염색은 다양한 표면 항원 마커들에 대한 단일클론 항체로 수행하였다: HLA-DR-FITC, CD44-FITC, CD45-APC, CD105-PE, CD73-FITC, CD90-APC (eBioscience CA, USA), SOX2-PE, Nestin-PE, β-III 튜불린-APC, NGF-PE (R&D systems, MN, USA). 세포 2 x 10⁵개를 FACS 실험에 사용하였다. 세포를 PBS (w/o Ca 및 Mg)로 2번 헹구고, 50 ㎕ PBS에 현탁하였다. 그런 후, 세포를 항체와 함께 실온에서 15분 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 PBS로 2번 헹군 다음 Becton-Dickinson 유세포 측정기로 분석하였다. PE (FL2), FITC (FL1), APC (FL4)의 형광도를 각각 방출 파장 575 nm, 530 nm 및 600 nm에서 검출하였다.

활성 생물분석 QC - ELISA 분석

인간 BDNF Quantikine ELISA 키트 (R&D Systems, MN, USA)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용해 BDNF 농도를 정량하였다.

여러가지 회수물에서 세포 1x10⁶개를 75-cm² 플라스틱 플라스크에 접종하였다. 접종한 지 대략 4일 후 상층액을 회수하였다. 결과는 BDNF 농도로 나타내었다.

배치 분석

표 8은 배치 번호 001H1-30/P1-5/F 분석 결과를 열거한다.

표 8: 배치 번호 001H1-30/P1-5/F

분석 방법	특징	상세 설명	결과
특징
외형-형태 검사	형태학	역상 현미경 검경에서 정상적인 섬유모세포와 비슷한 형태	검증됨
트리판 블루 배제에 의한 세포 생존성	생존성	>95%	검증됨
세포 배가	세포 배가	24시간 동안 세포 수 적어도 2배 증가	검증됨
CFU	세포 형성 단위 분석	콜로니 >5개	검증됨
안전성
무균성 (21 CFR/EP/USP)	미생물 오염	14일 후 증식 검출되지 않음	검증됨
내독소 (LAL)	≤1.0 EU/mg A280 단백질	<0.005 EU/mg A280 단백질	검증됨
PCR 마이코플라스마 검사	마이코플라스마 검출 배양 - 증식 검출 안됨	검출불가	검증됨
FACS 분석	동종이계 마커	HLA-DR 음성	검증됨
FACS 분석	HSC 마커	CD34 음성	검증됨
동일성: 간엽 줄기 세포 마커 및 뉴런 마커
FACS 분석	MSC 표현형 분석	CD13, CD73, CD105 양성	검증됨
FACS 분석	뉴런 인자 표현형 분석	GF, 네스틴 양성	검증됨
활성 생물분석
ELISA 분석	뉴런 인자	BDNF 양성	검증됨

안정성

Avita에서 hIDPSC 안정성에 대한 non GMP, non GLP 실험을 수행하였다. 이를 위해, 최종 배치의 편차를 줄일 수 있는 단일 마스터 세포 은행을 확립하였다. 이는 5개의 배치로 구성되며, 이들 각각은 개체 한명의 치수로부터 유래된다. 세포는 도 13에 나타낸 바와 같이 준비하였다. hIDPSC의 안정성 실험의 타임라인을 도 14에 나타낸다.

냉동보존하기 전 4개의 배치 유래의 hIDPSC의 줄기 세포 마커의 발현, 세포 증식의 다이나믹스 및 분화력 뿐만 아니라, 누드 마우스에 주사 후 여러 장기에서의 생체분포 및 이동성을 조사하였다. CELLAVITA^TM (줄기 세포)는, 4개의 독립 배치에서 유래된 6회 계대 배양한 세포들이, 표준 배양 조건에서, CD105, CD73, 및 CD13과 같은 간엽 줄기 세포 (MSC)의 표면 마커를 발현하는 것으로, 확인되었다. 그럼에도 불구하고, 이들 세포는 CD45, CD34, CD14, CD43 및 HLA-DR은 발현하지 않았다. 이들 세포는 조골세포, 지방세포 및 연골모세포, 근육 세포로 분화할 수 있었으며, 또한 시험관내에서 뉴런으로 분화할 수 있었다. 정상 마우스에 이식된 후, 이들 세포는 특히 간, 비장, 뇌 및 신장에 현저하게 생착하는 것으로 관찰되었다.

안정성 프로그램 개발

과거 경험을 통해, 초기 세포 폴 (일차 세포) 및 이의 최종 블렌드 (P5 증식 후 모든 이동물 혼합)는, -192℃에서 냉동보존하였을 때 안정적임을 입증하였다.

실시예 10. 헌팅턴병 동물 모델 실험

헌팅턴병 (HD) - 신경퇴행 모델.

헌팅턴병 (HD)은 특정 뇌 세포를 손상시키는 뇌의 유전 질환이다. 이 질병은 뇌의 신경 세포 일부를 손상시켜, 그 부위의 뇌의 기능 저하 및 점진적인 소실을 발생시킨다. 이는 움직임, 인지 (지각, 인식, 사고, 판단) 및 거동에 영향을 미칠 수 있다. 근육에서 자발적이고 일시적인 수축으로 나타나는 무도병으로 불리우는 전형적인 비-자발적인 움직임이 발생한다. 이 증상은 이 병에 걸린 환자의 90% 이상에서 존재한다. 시간이 지남에 따라, 환자의 자발적인 움직임은 점차 느려지게 되고, 균형을 잡는데 상당한 어려움을 나타내게 된다. 종종 단어를 분명하게 표현하지 못하며 (구음 장애), 음식물을 삼키기 어렵다 (연하곤란). 환자는 근육 강직, 치매 및 우울증 및 망상과 같은 정신 장애를 나타낼 수도 있다.

HD 및 뉴런 세포 소실.

HD은 기저핵에서 중간 돌기 뉴런, 주로 GABAergic 뉴런이 점진적인 소실되는 특징을 가진다. 또한, HD는 선조체 D1 및 D2 수용체의 현저한 감소와 관련있으며, 최근 마우스 모델에서 헌팅턴병의 민감한 척도로서 도파민 수용체 D2의 조절장애 (disregulation)가 보고된 바 있다 (Crook et al., 2012; Chen et al., 2013). HD는, 미상 핵 및 내과피를 또한 포함하는, 일반적으로 선조체로 지칭되는 신선조체 (neostriatum)에서 가장 두드러진다. HD 뇌의 95%에서 평균 체적이 58% 감소하는 선조 위축증이 사후 분석에서 드러났다 (Lange et al., 1976; Vonsattel and DiFiglia, 1998). 뇌 피질에서 최대 29%, 시상에서 28%, 그리고 종뇌 백색질에서 29-34%의 체적 감소가 HD 환자들에서 또한 관찰되었다 (De la Monte et al., 1988). 또한, HD 환자들에서, 전체 뇌 체적은, 건강한 대조군 뇌와 비교해, 19% 감소되었다 (Halliday et al., 1998).

면역계 및 HD.

오늘날, 몇몇 신경퇴행성 질환 발병에 신경염증이 핵심적인 역할을 한다는 일관된 증거들이 존재한다. HD에서 신경퇴행에 염증이 기여한다는 것이 강력하게 제시되어 있다. 따라서, HD에서 면역계의 활성화는 마우스 모델과 증상성 환자 및 무증상성 환자에서 IL-6과 같은 사이토카인의 발현 증가에 의해 명백하게 입증되었다. HD에서 CNS의 선천 면역 세포의 활성화는, 몇몇 신경퇴행성 질환의 발병 기전과 직접 관련되어 있는, 미세아교세포 및 성상 세포를 통해 발생한다.

HD 및 신경 성장인자.

몇가지 연구들에서, 야생형 htt 단백질이 CNS 세포에서 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)의 발현을 증가시키는 반면, 돌연변이된 htt 단백질은 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)를 하향 조절하여, 신경영양 지원이 불충분해지고 뉴런 세포가 사멸된다는 것을, 확인하였다 (Zuccato et al., 2001).

전임상 모델에 Cellavita 적용

HD의 여러가지 화학 모델 (퀴놀린산, QA; 3-니트로프로피온산, 3-NP) 및 유전자 모델 (R6/2-J2; N171-82Q, R6/2)들이 기존 발표 문헌들에 사용되었다. 본 발명자들은 3-NP를 전신 투여하여 클래식 HD-유사 증상을 유도하는 모델을 비-배타적인 예로서 사용하였다. 전임상 안전성 평가의 1차 목표는, 1) 인간에서 초기 안전한 용량과, 이후의 용량 증가 계획을 확인하고; 2) 잠재적인 독성 타겟 장기를 파악하고, 이러한 독성이 가역적인지에 대한 실험을 수행하고; 3) 임상 모니터링할 안전성 파라미터를 동정하고; 4) 랫 뇌에서 IDPSC를 확인하는 것이다.

본 실험에서 HD는, 크랩스 사이클과 컴플렉스 II를 저해하는 숙시네이트 데하이드로게나제의 비가역적인 저해제인, 3-NP를 사용해 유도하였으며, 랫과 영장류 둘다에 3-NP를 전신 투여하여 부차적인 흥분독성 기전의 결과로서 선택적인 선조체 병변을 야기할 수 있다 [95-96]. 이러한 병변은 HD 환자들에서 관찰되는 여러가지 운동 및 신경병리학적 증상들을 정확하게 재현한다. 3-NP의 전신 투여로, 선조체 NADPH-디아포라제 (diaphorase) 및 거대 콜린성 뉴런의 차별적인 보존 (sparing)이 발생하였으며, 전자 수송 체인의 선조체 GABAergic 뉴런 활성이 상당히 감소되었다.

본 발명자들은 전임상 실험에 출발 체중이 300 g - 350 g인 3월령의 Wistar 랫을 사용하였다. HD는 매일 3-NP (Sigma-Aldrich) 20 mg/kg을 4일간 복막내 주사하여 유도하였다. 인간 IDPSC는 Kerkis 등 (2006)에 의해 이미 확립된 프로토콜에 따라 단리하였다. 이들 세포를 4회 계대 배양으로 증식시켰다. 세포는, CD105, CD90, 및 CD73과 같은 MSC 마커; CD146과 같은 혈관주위세포 마커; 및 CD271과 같은 신경능선 줄기 세포 마커에 대해 면역양성을 나타내었다. 이 세포는 CD45 (혈액 세포 마커) 및 HLA II (주 조직적합성 복합체; 인간 백혈구 항원 클래스 II 분자)에 대해서는 음성이었다. 모든 과정은 신경계 질환을 전공한 수의사의 참관 및 감독 하에 진행하였다.

A. 3-NP로 유도된 HD 랫 실험 모델에서 hIDPSC의 단기 작용.

선조체 및 기타 뇌 구역에서 IDPSC의 이동 및 생물분포를 관찰하기 위해, 미리 Vybrant (녹색-염료 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; V12883)로 염색하였다. 3-NP 산으로 HD를 유도한 지 24시간 후, IDPSC 총 1x10⁶개를 정맥내 (꼬리 정맥)으로 이식하고, 4일 후 (파일롯 실험) 또는 35일 후 (그룹 I 실험), 동물을 안락사시켰다. 조직 분석 및 면역조직화학 분석을 위해 뇌를 채취하였다 (도 15 및 16).

3-NP에 의해 유도한 신경퇴행의 진행과 실험 군에서 진행에 대한 IDPSC 이식 효과를 평가하기 위해, 도 17의 글로벌 바이오마커들을 사용하였다.

결과: 파일롯 실험

도 18은 hIDPSC가 선조체와 피질 실질 조직 전체에 생착되었음을 보여준다. 조직은 특이적인 항-인간 세포 핵 항체 (갈색) 및 항-hIDPSC 항체 (녹색)를 이용한 면역조직화학법에 의해 분석하였다. hIDPSC는 인간 MSC 마커인 CD73 (적색)와 공동-위치하였으며, 따라서 노란색으로 나타났다.

(2) 갈색으로 면역염색된 선조체 GABAergic 뉴런에 의해 표시되는 신경생성 유도에 대한 효과, 및 (3) 선조체의 뉴런에서 수용체 D2 (갈색)의 발현을 나타낸 고 배율로 도시된 DA 뉴런 버스트 (neuron burst), (4) 콜라겐 1은 3-NP에 의한 HD-유사 선조체 병변 모방으로 발병된 영역을 갈색으로 나타냄.

3-NP 산으로 HD를 유도한 다음, 마우스에서 인간의 HD 증상과 비슷한 기능적 및 해부학적 특징들이 관찰되었다:

1. 대부분의 동물에서 선조체에 병변이 생겼다.

2. 3-NP를 주사한 동물 전부에서 체중 감소가 나타났으며, 무기력한 상태를 나타내고, HD 유도 후 4일째에 우울증 증상을 나타내었다.

3. IDPSC 이식 후 4일에, IDPSC 처리 동물과 대조군 (무처리) 간에 유의한 체중 차이는 없었다.

4. 양쪽 그룹에서 무기력 증상 및 우울증 행태가 관찰되었다.

5. IDPSC 이식 후 4일에, 전뇌의 피질하 영역 전체 - 선조체에 분포되었다 (도 19).

이때, hIDPSC는 anti-IDPSC 항체 CD73 및 CD105 둘다에 대한 면역염색 결과는 양성이었으며, 이는 이식 후 4일에 대부분의 세포가 여전히 미분화된 상태라는 것을 입증해준다. hIDPSC는 주로 선조체의 실질부에 모세관에 근접하게 위치하였다 (도 20).

따라서, 3-NP에 의해 유발된 HD 랫에 IV로 이식된 IDPSC는 BBB를 통과하여 병변 영역으로 이동할 수 있었다. 이들 세포는 모세관 주변 실질부에 현저한 생착성을 나타내었다. 이식 후 4일에, 이들 세포는 여전히 미분화된 상태이지만; 뉴런-유사 형태를 보이는 세포도 몇몇 관찰되었다.

결과: 그룹 I 실험

본 실험의 목표는 IV 주사 후 30일에 랫의 뇌에서 IDPSC를 동정하는 것이었다. IDPSC 주사 후 30일에, 이들 세포는 피질에서, 주로 뇌 혈관 주위 세포가 전형적으로 위치하는 모세관에 가까운 선조체에서 관찰되었다 (도 21). 랫의 뇌에서 입수한 추가적인 연속 조직 절편에서, 실질부내 IDPSC가 뉴런과 비슷한 형태로 존재하는 것으로 확인되었다 (도 22). 예상치 못하게도, IDPSC는 성체 뇌에서 뉴런의 줄기 세포 환경으로 여겨지는 뇌실하 영역 (SVZ)에서 관찰되었다 (도 23). 또 다른 예상치 못한 놀라운 결과는, hIDPSC 이식한 랫에서 DARPP32 양성 뉴런이 확실하게 생산된다는 것이었다 (도 24). 중요한 점은, 도파민- 및 cAMP-조절되는 포스포단백질 Mr 32 kDa (DARPP-32)이 먼저 선조체에서 도파민 및 단백질 키나제 A (PKA)의 주요 타겟으로서 동정되었다는 것이다. DARPP-32 인산화 상태의 조절은, 다양한 신경전달 물질, 신경조절인자, 신경펩타이드 및 스테로이드 호르몬을 통해 뇌의 여러 영역에서 도파민 민감성 (dopaminoceptive) 뉴런에 도달하는 정보를 통합하는 기전을 제공해준다 (Svenningsson et al., 2004). HD는 선조체 D1 및 D2 수용체의 현저한 감소와 연관되어 있으며, 최근 들어 마우스 모델에서 헌팅턴병 발병에 대한 민감한 척도로서 도파민 수용체 D2의 조절장애가 보고된 바 있으므로(Crook et al., 2012; Chen et al., 2013), 본 발명자들은 이 마커를 3-NP 유발된 랫에서 IDPSC의 가능성있는 효과를 평가하기 위해 사용하였다.

놀랍게도, 본 발명자들은, 무처리 그룹과 비교해, IDPSC 투여받은 랫에서 수용체 D2의 발현에 현저한 차이를 관찰하였으며, 대조군 동물의 선조체에서는 수용체 D2를 발현하는 세포를 거의 관찰할 수 없었다. 따라서, 정량할 수 있는 이 단백질에 대한 3점 시스템 (도 25)을 제안하였다.

B. 3-NP로 유도된 HD 랫 실험 모델에서 hIDPSC의 장기 작용.

새로운 실험 설계 (도 26)를 진행하고, 여러가지 IDPSC 이식 및 세포수 증가를 목표로, 2가지 새로운 실험 (그룹 II 및 그룹 III)을 수행하였다. 관찰한 임상 마커는 체중 감소 및 운동 장애 정도이다. 운동 장애 정도는 HD에서 근육긴장이상, 무기력, 하지 약화, 엎드린 자세, 옆으로 누운 자세, 또는 indh의 상향 조절 (즉, 운동 성능 결함 상향 조절)을 확인함으로써 결정할 수 있다. 도 27은 운동 장애를 평가하는 예시적인 점수 평가 시스템을 나타낸다. HD 유도 후 시험 동물 전부에 대한 임상 평가 결과를 표 9에 나타낸다. 도 28-31은 파일롯 실험, 그룹 II 실험 및 그룹 III 실험에서 동물의 체중 변화를 보여준다. 장기간의 실험에서, IDPSC 처리 동물이 무처리 동물 보다 체중이 더 높았다.

표 9. 3-NP를 이용한 HD 유도 후, 4가지 실험에 대한 임상 평가 요약.

그룹	동물 수	hIDPSC 이식 횟수	3-NP 유도 후 행동 변화	생존성
파일롯	25	1 IV	체중 감소; 무기력	정상 수명
I	20	1 IV	체중 감소; 무기력	정상 수명
II	20	-	-	16마리 사망
IIa	20	1 IV	체중 감소; 무기력	2마리 사망
III	20	2 IV	체중 감소; 무기력; 걸음걸이 비정상; 로타로드 실험 불능; 하지 강직; 및 하지를 뻗은 상태로 엎드린 자세 (15일)	8마리 사망

실시예 11. 헌팅턴병의 3- 니트로프로피온산 (3-NP) 랫 모델

윤리적 문제

모든 실험은 브라질 상파울로 상파울로 대학의 핵 에너지 연구소의 윤리 위원회 (Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN)로부터 승인을 받았다. 실험 동물에 대한 유지, 관리 및 취급 프로토콜은 브라질 현행 법률과 국제적으로 용인되는 규범 및 프로토콜을 따른다. 실험 동물을 다루는 모든 종사자들은 스태프 연구자/기술자로서 충분히 적합한 자격을 가지고 있으며, 현행 브라질 법령에 준하여 실험 과학 목적에 따른 동물 이용에 대한 적절한 훈련을 이수받았다.

주 목표

연구 그룹에서는 헌팅턴병의 3-NP 화학 모델에서 hIDPSC의 신경보호 및/또는 신경 조직 리모델링 효과를 조사하였다.

동물 모델

미토콘드리아 독소인 3-니트로프로피온산 (3-NP)의 전신 투여를 설치류와 인간을 제외한 영장류에 헌팅턴병의 화학 모델로서 사용하였으며, 이를 이용해 잠재적인 약물 테라피를 조사하였다. 3-NP는, 주로 선조체 그리고 GABAergic 중간 돌기 투사 뉴런 (medium spiny projection neuron) 및 돌기 인터뉴런 (spiny interneuron)에서 세포 사멸을 유발하는, 비-가역적인 미토콘드리아 숙시네이트 데하이드로게나제 (SDH) 저해제이다. 이 물질은 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있어, 전신 투여하여 선조체 또는 전체 선조체 (corpus striatum)의 선택적인 신경퇴행을 유발할 수 있다. 약물 용법에 따라, 3-NP 투여는 헌팅턴병의 여러 단계를 시뮬레이션할 수 있다. 3-NP를 2회 복막내 주사하면 질환 초기 단계의 운동과다 증상을 마우스에 유발하고, 4회 이상 투여하면 질환 후기 단계의 활동저하 상태를 유발한다 (Beal et al., 1993; Brouillet et al., 1995; Yang et al., 2008; Borlogan et al., 1997).

3-NP 처리 동물 (화학적 모델)은, 형질전환 (transgenics)과 비교해, 중요한 한계를 가지고 있다는 것에 유념하여야 한다. 3-NP 모델의 경우, 선조 병변은, 정상적인 내인성 뉴런 전구체가 존재하고 계속적인 신경퇴행을 제공하는 유전자 백그라운드는 없기 때문에, 10-12일 후 자발적으로 회복될 수 있다. 따라서, 실험군과 대조군 간의 운동 및 기능 개선 차이가 자발적인 신경재생 이전에 관찰될 수 있다.

간략한 hIDPSC 이식 프로토콜

350-450 g의 Lewis 랫 (n = 124)에 3-NP 20 mg/kg을 하루에 1번 4일간 복막내 (IP) 주사하였다. 동물은 12시간의 명/야 사이클 하에 사육하고, 물과 사료는 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 랫에 3-NP를 IP 주사하여 뇌 손상을 유도하였다. 그런 후, 마취시키고, kg 당 각각 0.35x10⁶ 및 3.5x10⁶에 해당되는, hIDPSC 1x10⁶개/식염수 250 ㎕ 또는 1x10⁷개/식염수 300 ㎕ 용액을 동물 1마리 당 1회 또는 3회 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 복수 투여는 30일 간격으로 행하였다 (도 32).

각 처리군을 식염수만 투여한 대조군 ('무처리')과 쌍을 지었다. 동물을 표 10에 나타낸 바와 같이 5개의 그룹으로 나누었다.

표 10. 본 실험에 사용된 동물의 그룹 및 수.

그룹	처리	총 수	사망	실험에 포함된 동물 수
1 (n=40)	처리 = hIDPSC 1x10⁶, 1회 투여 (n=19)	19	2	17
1 (n=40)	무처리 = 식염수 (n=20)	21	0	20
2 (n=40)	처리 = hIDPSC 1x10⁶, 3회 투여 (n=19)	19	5	14
2 (n=40)	무처리 = 식염수 (n=21)	21	9	12
3 (n=21)	처리 = hIDPSC 1x10⁷, 1회 투여 (n=10)	10	0	10
3 (n=21)	무처리 = 식염수 (n=11)	11	0	11
4 (n=23)	처리 = hIDPSC 1x10⁷, 3회 투여 (n=14)	14	5	9
4 (n=23)	무처리 = 식염수 (n=9)	9	3	6
5 (n=10)	대조군 = 3-NP, 식염수 또는 hIDPSC 비-투여 (n=10)	10	0	10

기능 분석

반-정량적인 신경학적 척도

보행력을 Ludolph et al., (1991)에서 개조된 정량적인 신경학적 척도를 사용해 각 실험군에서 1명의 맹검 검사자에 의해 주당 2회 평가하였다. 이 척도는 다음과 같이 평평한 나무 표면에서 랫의 보행 거동 (0-4점)을 측정한다: 0: 정상 거동; 1: 대체적으로 느림; 2: 협동운동장애 및 걸음걸이 비정상; 3: 앞다리 마비 또는 결함, 움직임 불능; 및 4: 누운 자세에서 일어나지 못함.

베이스라인에서, 양쪽 그룹의 전체 랫 (30)들은 3-NP 처리 전 정상적인 거동을 나타내었고 현저한 걸음걸이 이상이 관찰되지 않아, 0점을 매겼다. 3-NP 투여 종료시 (4일), 3-NP 유도 후, 랫 총 76마리에서 전반적인 느린 상태 (1점)가 관찰되었고; 2마리는 이동 어려움 (2점); 20마리는 앞다리 및 뒷다리 결함으로 인한 운동 불능 (3점); 24마리는 누워있으며 결국 사망하였다 (4점). HIDPSC 이식한 지 24시간 후, 3-NP + hIDPSC (양쪽 투여 경우) 처리 랫은 3-NP 처리 랫과 비교해 우수한 성능을 나타내었다. 그러나, hIDPSC 이식 후 5일째에, 랫은 hIDPSC 이식 후 보다 낮은 향상된 결과를 나타내었다. 랫 총 27마리는 정상 스코어였다 (0점). 또한, hIDPSC 이식 후, 랫 20마리는 1점, 3마리는 2점, 그리고 2마리는 3점이었으며, 4점인 랫은 없었다 (표 12). 반면, 대조군 (3-NP + 식염수)의 경우, 랫 38마리는 1점, 1마리는 2점, 5마리는 3점, 그리고 1마리는 4점이었다 (표 11).

표 11. 3-NP 처리 종료 (4일) 5일 후, 신경학적 순위 척도 점수. 점수는 대조군 (3-NP + 식염수)의 랫 점수이다.

그룹	0점	1점	2점	3점	4점
GI	0	16	0	0	0
GII	0	9	0	3	0
GIII	0	10	0	1	0
GIV	0	3	1	1	1
총	4	38	1	5	1

표 12. 3-NP 처리 종료 (4일) 5일 후, 신경학적 순위 척도 점수. 점수는 처리군 (3-NP + hIDPSC)의 랫 점수이다.

그룹	0점	1점	2점	3점	4점
GI	8	11	0	0	0
GII	10	3	0	1	0
GIII	7	3	0	0	0
GIV	2	3	3	1	0
총	27	20	3	2	0

표 13은 3NP 처리 후 (4일 투여), 3NP 유도 후 1일 및 5일, 및 hIDPSC 이식 후, 대조군 (3NP + 식염수) 및 hIDPSC 그룹 (3NP + hIDPSC 이식)의 신경학적 점수를 나타낸다. 걸음걸이 이상이 없는 정상 행동 (0점); 전반적인 느림 (1점); 협동운동장애 및 걸음걸이 이상 (2점); 3: 앞다리 또는 뒷다리의 움직임 불능 (3점); 및 4: 누운 자세에서 일어나지 못함 (4점). 마지막 그룹은 결국 사망하였다 (4점). 그룹 1 = 처리 = 1 x 10⁶ hIDPSC, 1회 투여; 그룹 2 = 처리 = 1 x 10⁶ hIDPSC, 3회 투여; 그룹 3 = 처리 = 1 x 10⁷ hIDPSC, 1회 투여; 그룹 4 = 처리 = 1 x 10⁷ hIDPSC, 3회 투여.

표 13. 다양한 그룹의 랫들의 신경학적 점수.

동물	처리	용량, hIDPSC 및 횟수	신경학적 점수 AF 3NP	신경학적 점수 AF 1일	신경학적 점수 AF 5일
그룹 I
1	3NP+SAL	GI	1	1	1
2	3NP+SAL	GI	1	1	1
3	3NP+SAL	GI	1	1	1
4	3NP+SAL	GI	1	1	1
5	3NP+SAL	GI	1	1	1
6	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
7	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
8	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
9	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
10	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
11	3NP+SAL	GI	1	1	1
12	3NP+SAL	GI	1	1	1
13	3NP+SAL	GI	1	1	1
14	3NP+SAL	GI	1	1	1
15	3NP+SAL	GI	1	1	1
16	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
17	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
18	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
19	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
20	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
64	3NP+SAL	GI	1	1	1
65	3NP+SAL	GI	1	1	1
66	3NP+SAL	GI	1	1	1
67	3NP+SAL	GI	3	3	1
68	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
69	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
70	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
71	3NP+SAL	GI	1	1	1
72	3NP+SAL	GI	1	1	1
73	3NP+SAL	GI	1	1	1
74	3NP+SAL	GI	1	1	1
75	3NP+SAL	GI	1	1	1
76	3NP+HIDPSC	GI	1	1	1
77	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
78	3NP+HIDPSC	GI	4	4	사망
79	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
80	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
81	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
82	3NP+HIDPSC	GI	1	0	0
83	3NP+HIDPSC	GI	4		사망
그룹 II
21	3NP+SAL	GII	4	4	사망
22	3NP+SAL	GII	3	3	3
23	3NP+SAL	GII	3		사망
24	3NP+SAL	GII	3	4	사망
25	3NP+SAL	GII	4	4	사망
26	3NP+HIDPSC	GII	3	3	3
27	3NP+HIDPSC	GII	4		사망
28	3NP+HIDPSC	GII	4	4	사망
29	3NP+HIDPSC	GII	3	3	1
30	3NP+HIDPSC	GII	3	3	1
31	3NP+SAL	GII	4	4	3
32	3NP+SAL	GII	4	4	사망
33	3NP+SAL	GII	4	4	사망
34	3NP+SAL	GII	4	4	사망
35	3NP+SAL	GII	3	3	사망
36	3NP+SAL	GII	3	3	3
37	3NP+HIDPSC	GII	3		사망
38	3NP+HIDPSC	GII	4	4	사망
39	3NP+HIDPSC	GII	3	3	1
40	3NP+HIDPSC	GII	4	4	사망
21A	3NP+SAL	GII	4	4	사망
22A	3NP+SAL	GII	1	1	1
23A	3NP+SAL	GII	1	1	1
24A	3NP+SAL	GII	1	1	1
25A	3NP+SAL	GII	1	1	1
26A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
27A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
28A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
29A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
30A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
31A	3NP+SAL	GII	1	1	1
32A	3NP+SAL	GII	1	1	1
33A	3NP+SAL	GII	1	1	1
34A	3NP+SAL	GII	1	1	1
35A	3NP+SAL	GII	1	1	1
36A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
37A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
38A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
39A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
40A	3NP+HIDPSC	GII	1	0	0
그룹 IV
84	3NP+SAL	GIII	1	1	1
85	3NP+SAL	GIII	1	1	1
86	3NP+SAL	GIII	1	1	1
87	3NP+SAL	GIII	1	1	1
88	3NP+SAL	GIII	1	1	1
89	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	0
90	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	0
91	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	0
92	3NP+SAL	GIII	1	1	1
93	3NP+SAL	GIII	1	1	1
94	3NP+SAL	GIII	1	1	1
95	3NP+SAL	GIII	1	1	1
104	3NP+SAL	GIII	3	3	3
96	3NP+SAL	GIII	1	0	1
97	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	1
98	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	1
99	3NP+HIDPSC	GIII	2	2	1
100	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	0
101	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	0
102	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	0
103	3NP+HIDPSC	GIII	1	0	0
그룹 III
41	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	사망
42	3NP+HIDPSC	GIV	3	3	1
43	3NP+SAL	GIV	3	3	사망
44	3NP+HIDPSC	GIV	3	3	0
45	3NP+SAL	GIV	4	4	사망
46	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	2
47	3NP+HIDPSC	GIV	3	3	1
48	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	3
49	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	사망
50	3NP+SAL	GIV	4	4	사망
51	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	2
52	3NP+SAL	GIV	4	4	4
53	3NP+SAL	GIV	3	3	3
54	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	사망
55	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	사망
56	3NP+HIDPSC	GIV	3	3	1
57	3NP+SAL	GIV	3	3	2
58	3NP+HIDPSC	GIV	4	4	2
59	3NP+HIDPSC	GIV	3	3	사망
60	3NP+SAL	GIV	1	1	1
61	3NP+SAL	GIV	1	1	1
62	3NP+HIDPSC	GIV	1	0	0
63	3NP+SAL	GIV	1	1	1

조직병리학적 및 면역조직학적 분석

조직병리학적 및 면역조직학적 분석을, hIDPSC 주사 후 7일, 30일 및 90일에 수행하였으며; 동물에 4% 파라포름알데하이드 (PBS 중에 0.1 mol/L로 제조)를 주입하였다. 조직 단편을 에탄올 농도 감소 시리즈 (75, 95 및 100%)에서 탈수시키고, 0.1% 크레실 바이올렛을 이용한 Nissl 염색으로 염색하였다. 항-인간 핵 및 항-hIDPSC (1:1000, Abcam Plc)와 같은 항체 2종을 사용해 랫 뇌에서 hIDPSC의 존재를 확인하였다. hIDPSC의 신경보호 및 신경회복 효과를 평가하기 위해, anti-GABAergic 중간 돌기 뉴런 DARPP32 (1:1000, Abcam Plc), 도파민 D2 (1:800) 및 BDNF (1:500) 항체를 사용하였다.

랫 뇌에서의 hIPDSC 생착

실험에서 가장 의미있는 발견 사실 중 한가지는, hIDPSC가 피질 및 선조체에서 검출되었다는 것으로, 이는 이 세포가 혈액-뇌 장벽을 통과하여 손상 부위로 이동할 수 있다는 것을 의미한다 (도 33). 도 33에서, 광학적 조직 단편에서, 포커스의 여러 깊이 (A1-A4)에서, Vybrant (녹색)으로 염색된 IDPSC의 존재가 확인되었으며, 핵은 PI (적색)로 염색되었다. 이들 세포는 현저한 모세관 연합 (capillary predominant association) 및 여러가지 형태 타입들을 나타낸다: 뉴런-유사 세포 및 혈관 주위 세포. A2, A3 및 A4에서, 여러 가지 위치에서 모세관을 따라 2종의 혈관 주위 세포를 관찰할 수 있으며, 이들 2종의 세포는 형태가 비슷하다. A4에서, 축삭의 분기 (embranchment)도 확인된다. 뉴런의 핵은 핵소체를 가지고 있으며 약하게 염색되는데, 이는 강하게 염색된 핵과 차이를 관찰할 수 있다. 청색은 공초점 현미경의 인공 색상이다. 현미경은 epi 형광 + 디지탈 간섭 대비 (DIC) 현미경이고, 크기 막대는 10 ㎛이다.

아울러, hIDPSC 투여 후 4일에, 몇몇 세포는 특이 MSC 항체 (anti-CD73 및 anti-CD105)에 양성이었으며, 이는 일부 세포가 여전히 그 시점에 미분화된 상태라는 것을 의미한다 (도 34). 그럼에도 불구하고, hIDPSC-유래 뉴런-유사 세포 및 미세혈관 유래 혈관 주위 세포 (perivascular cells from microvessels)도 동일한 기간에 관찰되었다 (도 33).

도 34에서, 광학적 절단 단편에서 IDPSC가 Vybrant (녹색)으로 염색되며, 항-IDPSC 항체 (적색)와 양성으로 반응하는 것으로 확인된다. 이들 결과가 겹쳐져 노란색으로 나타난다. 이들 세포는 모세관에 인접한 위치성을 나타낸다. MSC에 대해 2가지 마커를 사용하였다: CD73 및 CD105는 IDPSC와 양성으로 반응함. Epi 형광 + 디지탈 간섭 대비 (DIC)를 이용한 공초점 현미경을 사용하였다. 크기 막대: A = 5 ㎛; B = 10 ㎛; C = 20 ㎛; D = 5 ㎛.

hIDPSC 투여 후 30일에, 피질에서 hIDPSC는 몇개만 관찰되었고, 선조체에서 모세관을 따라 많이 관찰되었다 (도 35). 랫 뇌에서 수득된 연속 단편들에서 실질에 위치된 IDPSC의 뉴런 유사 형태가 확인되었다 (도 35). 또한, 뉴런-유사 세포 및 섬유모세포-유사 세포도 관찰되었는데, 이는 hIDPSC가 분화를 이행한다는 것을 검증해주는 것이다 (도 36). 예상치 못하게도, IDPSC는, 성체 뇌에서 뉴런의 줄기 세포 환경으로 생각되는, 뇌실하 영역 (SVZ)에서도 관찰되었다 (도 35).

신경보호 및 신경회복 효과

3-NP-유발성 선조체 병변을 Nissl 염색 및 DARPP32 발현을 이용한 뉴런 소실에 의해 확인하였다 (각각 도 37 및 도 38). Nissl 염색을 이용해 뇌 및 척수에서 뉴런 구조를 식별하며 (도 37), DARPP32는 GABAergic 뉴런에서 발현되고 건강한 포유류의 선조체에 주로 존재하는 세포골격 마커이다 (도 38). 이 2종의 마커를 사용해, 선조체에서 뉴런의 소실을 다음과 같이 점수를 매겼다:

● 1점 (심각): 현저한 뉴런 소실, 변성 부위가 존재하며, 외측 선조체 (lateral striatum)에서 DARPP32 면역염색성이 약하며, 중심 선조체에 세포가 거의 또는 전혀 존재하지 않음;

● 2점 (보통): 중간 수준의 뉴런 소실, "진한 뉴런" (사멸 또는 세포자살 뉴런) 및 수개의 DARPP32+ 세포 존재; 및

● 3점 (약함): 신경 소실은 없음, DARPP32로 강하게 면역염색됨 (Vis et al., 2001).

3-NP-처리 동물에서는 대조군 (3-NP 또는 hIDPSC 무처리)과 비교해 완전한 또는 부분적인 뉴런 소실이 관찰되었다. 2가지 실험 그룹 (처리 및 무처리)은 대조군과 비교해 선조체에서 뉴런 소실에 대해 다른 점수가 매겨졌다. 그러나, 형태측정에 의한 조직학적 분석을 통해, 대부분의 hIDPSC-처리 동물은 3점 및 2점이지만, 대부분의 무처리 동물 (3-NP + 식염수)은 뉴런 소실 점수가 2점 및 1점인 것으로 확인되었다 (도 38). 가시적인 위축증 증상을 나타낸 동물은 없었다 (도 37 및 도 38).

도 39는 랫 선조체에서 hIDPSC 이식 이후의 뉴런 생장을 도시한 것이다. hIDPSC 투여는, (A) Nissl 염색 및 (B) DARPP32 발현에 따르면, hIDPSC-처리 동물에서 신경회복 효과를 나타내었다. (C) hIDPSC 투여 후 대조군 대비 뉴런 회복을 나타낸 동물의 수. 대부분의 hIDPSC-처리 동물 (3-NP + hIDPSC)은 3점 및 2점 (중간 및 약함)인 반면, 대부분의 무처리 동물 (3 NP + 식염수)은 2점 및 1점이었다 (심각 및 중간).

또한, 본 발명자들은, DARPP32 발현이 무처리 동물 보다 hIDPSC-처리 동물에서 더 높은 것으로 관찰하였는데 (도 40), 이는 뉴런의 재생을 의미한다. 도 40의 광학적 단편들에서, 뉴런이 DARPP32와 양성으로 반응하는 것으로 확인된다.

도파민 수용체 D2의 조절장애가 마우스 모델에서 HD 발병에 민감한 척도인 것으로 발표되었다 (Crook et al., 2012). hIDPSC 이식한 랫에서 DARPP32 양성 뉴런이 강건하게 생성되는 놀라운 예상치 못한 결과가 수득되었다. 이와는 대조적으로, 대조군에서는 이런 현상이 관찰되지 않았다 (도 38). 중요한 점은, 도파민- 및 cAMP-조절되는 뉴런 포스포단백질 (DARPP-32)이 먼저 선조체에서 도파민 및 단백질 키나제 A (PKA)의 주요 타겟으로서 동정되었다는 것이다. DARPP-32 인산화 상태의 조절은, 다양한 신경전달 물질, 신경조절인자, 신경펩타이드 및 스테로이드 호르몬을 통해 뇌의 여러 영역에서 도파민 민감성 (dopaminoceptive) 뉴런에 도달하는 정보를 통합하는 기전을 제공해준다 (Svenningsson et al., 2004). HD는 선조체 D1 및 D2 수용체의 현저한 감소와 연관되어 있으며, 최근 들어 마우스 모델에서 헌팅턴병 발병에 대한 민감한 척도로서 도파민 수용체 D2의 조절장애가 보고된 바 있으므로 (Crook et al., 2012; Chen et al., 2013), 본 발명자들은 이 마커를 3-NP 유발된 랫에서 IDPSC의 잠재적인 효과를 평가하는데 사용하였다.

놀랍게도, 본 발명자들은, 무처리 그룹과 비교해, IDPSC 투여받은 랫에서 수용체 D2의 발현에 현저한 차이를 관찰하였으며, 대조군 동물의 선조체에서는 수용체 D2를 발현하는 세포는 거의 관찰할 수 없었다 (도 41).

감소된 BDNF mRNA 및 단백질 수준이 HD 환자의 소뇌, 미상, 피각, 선조체 및 뇌 피질에서 관찰되었다 (Adachi et al., 2014). 현 연구에서, BDNF 발현은 hIDPSC 투여 후 7일 및 30일에 hIDPSC-처리 동물의 선조체, 미상, 피각 및 뇌실하 영역에서 관찰되었다 (도 40). 뇌실하 영역에서의 BDNF 발현은, hIDPSC가 신경생성을 촉진한다는 것을 의미한다. 무처리 동물 (3-NP + 식염수)에서는 BDNF 발현이 관찰되지 않았다.

hIDPSC는 운동신경세포 마커인 DARRP32와 동일한 위치에서 관찰되었는데, 이는 hIDPSC가 성숙한 뉴런으로 분화한다는 것을 의미한다. DARRP32 발현은 HD의 3-NP 모델에서 hIDPSC 투여 후 30일에 hIDPSC-처리 동물의 선조체에서 검출되었다 (도 41). 이러한 데이타는 hIDPSC가 GABAergic 돌기 뉴런으로 생체내에서 분화한다는 것을 시사해준다. 선조체에서 신경전달물질과 신경조절인자 신호의 통합이 기저핵 기능에 핵심적인 역할을 담당하다는 것에 유념하여야 한다. 또한, DARPP32는 도파민 및 글루타메이트에 반응한 GABAergic 중간 돌기 뉴런들의 통합에 중요한 인자이다 (Fernandez et al., 2006).

조직학적 및 면역조직화학적 분석을 통해, hIDPSC가 혈액-뇌 장벽을 통과하여, 선조체 및 피질 등의 HD에 의해 영향을 받은 여러 부위들에 도달할 수 있다는 것이, 밝혀졌다. 형태측정에 의한 조직학적 분석에서, 대부분의 hIDPSC-처리 동물들은 무처리 동물 (3-NP + 식염수)과 비교해 선조체에서의 뉴런 소실이 적었다. 또한, hIDPSC는, 헌팅턴병에서 하향 조절되는 BDNF, DARPP32 및 D2 수용체 발현의 상향 조절에 의해 드러난 바와 같이, 신경보호 및 신경회복 효과를 나타내었다 (Van Dellen et al., 2000; Crook and Housman, 2012).

안전성

실험 기간 동안 처리 동물 및 무처리 동물에서 다음과 같은 생리학적 파라미터들을 기록하였다: 체중과 사료 및 물 섭취. 사망 건수는 hIDPSC-처리 동물이 3-NP-주사 랫들에 비해 적게 관찰되어, hIDPSC 투여가 안전한 것으로 보인다. 또한, 이들 결과에 따라, hIDPSC 투여는 3-NP의 신경독성 작용으로부터 동물을 보호함으로써 전체 생존성을 개선시키는 것으로 보인다 (표 14).

표 14. 생존 동물 수 대 사망 동물 수.

그룹	동물 수/그룹	사망 수/그룹	동물 수/그룹	사망 수/그룹	실험에 참여한 동물 수
	3NP + SAL 그룹	3NP + 3NP + SAL 그룹	3NP + HIDPSC 그룹	3NP + HIDPSC 그룹
G I (n=40)	19	0	21	2	38
G II (n=40)	21	9	19	5	26
G III (n=21)	11	0	10	0	21
G IV (n=23)	9	3	14	5	15
대조군 G V (n=10)	10				10
총	60	12	64	12	110

hIDPSC의 안전성을 분석하는 일차 실험은 HD 실험의 3-니트로프로피온산 (3-NP) 랫 모델이었다. 이 실험에서, 2가지 세포 용량을 주사하였다: 1x10⁶ 및 1x10⁷ 세포/이식 또는 각각 3x10⁶ 세포/kg 및 3x10⁷ 세포/kg. 3-NP-처리 랫에 IV 1회 주사하거나, 또는 1달 간격으로 총 3번 IV 주사하였다.

3x10⁶ 세포/kg로 투여한 3-NP-유발성 동물에서는 7마리가 사망하였으며, 3x10⁷ 세포/kg으로 투여한 동물에서는 5마리가 사망하였다. 위약 군 (3-NP 유발, 세포 이식을 수행하지 않음)에서는, 동일 마리수 (12)의 동물이 사망하였다. 사망한 랫들은 모두 매우 심각한 질환 증상을 나타내었으며; 3-NP 투여 5일 이내에 사망하였다. hIDPSC의 반복 투여시 추가적인 사망은 발생하지 않았다. 이들 데이타를 토대로, 초기 사망에 대한 가능성 있는 원인은 3-NP 독성이었다. hIDPSC를 반복 이식 후에는 사망이 발생하지 않았으므로, 이는 hIDPSC 이식의 안전성을 뒷받침해준다 (표 14).

헌팅턴병 환자는 종종 적절한 또는 고-칼로리 식사에도 불구하고 점진적인 체중 감소를 보인다. 체중 감소는 에너지 대사 감소에 의해 유발되는 3-NP 신경독성의 지표일 수 있다 (Saydoff et al., 2003; Colle et al., 2013). 3-NP 처리 동물에서, 3-NP 투여 후 4일에 현저한 체중 감소는 관찰되지 않았다. 오히려, hIDPSC 이식 후 30일에는, hIDPSC 그룹 (1x10⁶ 세포 용량)은 무처리 군 (3NP)와 비교해 현저한 체중 증가를 나타내었다. 즉, hIDPSC는 체중 감소를 약화시켰다 (p = 0.01) (도 42).

HD는 질병의 진행을 정지시키거나 또는 반전시키기 위해 이용가능한 치료법이 없는 임상적인 쇠약성 질병이다. 다수의 HD 치료제들이 직면하는 한가지 주요 장애물은, 이것이 신경퇴행성 장애여서, 일부 타겟화된 전신 전달 약물이 타겟에 도달하지 못할 수 있으며; 약물의 뇌로의 이동이 혈액-뇌 장벽 (BBB)에 의해 통제된다는 것이다. BBB는 순환성 혈액을 신경계를 둘러싸고 있는 세포외 체액과 분리시키는 높은 선택성의 투과성 장벽이다. 따라서, 세포에 기반한 치료제를 이용한 치료에는, 세포가 일반적으로 BBB를 통과하지 못하기 때문에, BBB를 우회하는 국소 전달이 필요할 것으로 보인다 (즉, 선택적인 투과성 장벽을 통한 주사).

광범위한 연구들에서, hIDPSC는 간엽 줄기 세포 (MSC) 특성을 가지고 있으며, 면역조절 인자와 신경영양 인자를 분비할 수 있는 것으로, 확인되어 있다. 또한, 공인된 HD 랫 모델에서의 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 통해, hIDPSC가 BB를 통과하여 선조체 및 피질 등의 HD에 의해 병든 여러 영역에 도달할 수 있다는 것도, 밝혀졌다. 형태측정에 의한 조직학적 분석에서, 대부분의 hIDPSC-처리 동물들은 무처리 동물과 비교해 선조체에서의 뉴런 소실이 적었다. 또한, hIDPSC는, 헌팅턴병에서 하향 조절되는 BDNF, DARPP32 및 D2 수용체 발현의 상향 조절에 의해 드러난 바와 같이, 신경보호 및 신경회복 효과를 나타낸다 (Van Dellen et al., 2000; Crook and Housman, 2012).

마지막으로, hIDPSC의 안전성 프로파일을 평가하는 실험들은 이 세포가 기형종을 형성하지 않으며, 염색체 이상을 유발하지 않으며, 또한 인간/마우스 키메라를 형성할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 실험에서 hIDPSC는 HD 치료에 안전하고 효과적인 것으로 시사된 바, 본 발명자들은 HD 치료에 hIDPSC의 사용을 제안한다.

실시예 12. 뇌에서 hIDPSC의 신경보호 효과. (3-NP로 유발된) 랫 HD 모델에서 BDNF 발현에 대한 전신 투여 ( 정맥내 ) 후 hIDPSC의 단기 및 장기 효과.

서론

뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)와 같은 신경영양 인자는 중추 신경계 뉴런의 기능에 필수 기여인자이다. BDNF는 뉴런의 생존과 증식에 중요한 역할을 담당하며, 신경전달물질 조절인자로서 작용하며, 학습 및 기억에 필연적인 뉴런 가소성에 참여한다. BDNF는 또한 신경계에서 뉴런의 분화, 성숙 및 생존을 지원하며, 신경보호 효과를 나타낸다. BDNF는 신경 줄기 세포 (NSC)로부터 새로운 뉴런의 생장을 자극 및 통제한다. 헌팅턴 병에서 BDNF의 감소된 수준은 뉴런 소실과 연관되어 있다. 실험들에서 질환에 걸린 뇌에서 BDNF의 이용성이 감소된 것으로 확인된 바, 이는 신경계 장애, 특히 HD에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 시사되고 있다. BDNF는, 비-병리학적 조건에서는, 피질, 뇌 흑질 치밀부 (substantia nigra pars compacta), 편도체 및 시상에서 합성된다. 이들 구역 전체가 선조체에 BDNF를 공급한다. HD에서, 선조체내 BDNF의 결핍은 뇌 피질에서의 BDNF 유전자의 전사 감소 또는 BDNF 소낭 수송 감소 (또는 이 둘다)가 원인일 수 있다. HD에서 관찰되는 BDNF 발현 감소는, HD 운동 장애와 관련있을 수 있는, 도파민성 뉴런의 기능을 손상시킨다. 그 결과, BDNF 수준 증가가 HD 치료에 도움이 될 수 있는지를 조사하기 위한 다수 실험들이 수행되었다^(1-7).

재료 및 방법

화학적인 HD 모델 . 체중이 350-450 g인 Lewis 랫에 3-니트로프로피온산 (3-NP) 20 mg/kg (Sigma Aldrich)을 하루에 1번 4일간 복막내 주사하였다. 동물은 12시간의 명/야 사이클 하에 사육하고, 물과 사료는 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 랫에 3-NP를 주사하여 뇌 손상을 유도하였다. 3-NP 투여 후, 피질, 해마 및 선조체에서 BDNF 발현 감소가 발생한다.

hIDPSC 이식. 동물을 마취시키고, hIDPSC 1x10⁶개를 PBS (포스페이트 완충화된 염수) 200 ㎕ 중에 꼬리 정맥을 통해 1회 주사하였다. 대조군 동물에는 동일한 경로로 PBS 200 ㎕만 주사하였다.

면역조직화학법 . BDNF의 발현을 anti-human anti-BDNF (Santa Cruz) 항체와 면역조직화학적 분석을 사용해 분석하였다. 3-NP로 유도하고 hIDPSC 또는 위약을 처리한 HD 동물을, 세포 이식 후 4일 및 30일에 안락사시키고, 뇌를 분리하여, 각각의 뇌 구획을 절개하고 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드에 고정한 다음 파라핀에 넣었다. 파라핀 슬라이드를 일반적인 기법을 이용해 탈파라핀화하였다. 그런 후, 슬라이드를 10분간 암모니아 하이드록사이드 (Sigma-Aldrich)와 함께 인큐베이션하고, 각각 5분씩 증류수로 4번 헹구었다. 슬라이드의 항원 탐색을, 95℃로 설정된 수조 안에서 35분간 소듐 사이트레이트 pH 6.0 완충제 (Sigma-Aldrich)를 사용해 수행하였다. 슬라이드를 15분간 과산화수소 (Sigma-Aldrich)로 블록킹 처리한 다음 토끼의 다클론 anti-human BDNF 항체 (N-20)를 BSA (Sigma-Aldrich) 중에 1:500으로 희석하여 첨가하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 슬라이드를 각 5분씩 PBS로 3번 헹구고, PBS에서 1:100으로 희석한 Anti-Rabbit AP (SC-2057) (항체 둘다 미국 텍사스 달라스에 위치한 Santa Cruz Biotechnologies 사에서 구입함)를 첨가하여 실온에서 40분간 두었다. 그런 후, 슬라이드를 각 5분씩 PBS에서 3번 헹구었다. 마지막으로, permanent fast red system (Abcam, Boston, MA, USA)을 이용해 갈색 염색을 수행하였다. 면역염색한 단편들을 헤마톡실린 (Sigma-Aldrich)으로 대조염색하여, 광 현미경 (Axio Observer; Zeiss, Jena, Germany)으로 검경하였다.

결과

hIDPSC 이식의 단기 효과 : 랫에서 3-NP에 의한 HD 유도 직후 및 hIDPSC 이식 후 4일 경과시 BDNF 발현.

도 43은 NSC 환경으로 알려져 있는 랫의 피질 (도 43 1a 및 1b)과 선조체 (도 43 1e 및 1f)에 BDNF 양성인 세포가 상당히 많다는 것을 보여준다 (본 도면 및 이하 도면에서 갈색 부분). 이 세포는 해마 (도 43 1c 및 1d)에서도 몇개 관찰되었다. 그러나, 이 세포는 성숙한 뉴런이 아닌 뉴런 전구체와 비슷한 형태를 나타내었다. 식염수 (PBS) 처리한 3-NP 처리 동물에서는 어떠한 BDNF 분비 세포도 관찰되지 않았다 (도 43 2a - 2f).

hIDPSC 이식의 장기 효과 : 랫에서 3-NP에 의한 HD 유도 직후 및 hIDPSC 이식 후 30일 경과시 BDNF 발현.

도 44는 BDNF를 분비하는 피질에서 형태학적으로 성숙한 뉴런들이 상당히 많이 존재함을 보여준다 (도 44 1a 및 1b). 해마에도 BDNF 분비 세포가 존재하지만 (도 44 1c 및 1d), 선조체에서 다수의 BDNF 발현 세포들이 관찰되었다 (도 44 1e 및 1f). 대조군의 경우, BDNF 분비는 여전히 관찰되지 않았다 (도 44 2a - 2f).

결론

본 실험에서, 각각 10마리 이상으로 구성된 4개의 그룹에서, 다수 세포들에 의한 BDNF 발현이 선조체 및 피질에서 검출되었으며, 해마에서도 소수지만 검출되었다. 2개의 그룹은 3-NP 동물로 구성되며, hIDPSC 이식 후 4일 (도 43) 및 30일 (도 44)에 BDNF 발현을 분석하였다. 대조군 2 그룹은 PBS만 처리한 3-NP 동물로 구성되며, 각각 4일 (도 43) 및 30일 (도 44) 후 분석하였다. 이들 데이타는, 3-NP 처리 랫의 뇌에서 이식 직후 hIDPSC가 내인성 랫 줄기 세포에 의한 BDNF 발현 유도를 통해 작동하는 신경보호 효과를 시사해주며, 이러한 효과는 내인성 랫 NSC의 생존과 성숙 뉴런으로의 분화에 영향을 주었다. 또한, hIDPSC 이식으로 이식 후 30일에 뉴런이 재생되었다 (도 44).

이전 실험들은 선조체에서의 BDNF 결핍을 HD 발병과 밀접하게 연관시킨다. 현재, HD를 치료하기 위해 개발된 약물들은 증상을 약화시킬 순 있지만, 질병의 진행을 지연시키지 못한다. 따라서, 선조체에서 선조체 BDNF 수준을 회복시키는 것이 HD에 치료학적 잠재성을 가질 수 있다. 또한, 실시예 10 및 11에서, hIDPSC 처리 HD 동물에서 행동학적 표현형이 개선되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 BDNF 발현이 HD 환자에서 관찰되는 기능적인 결함을 해결할 수 있음을 시사해준다^6,7.

실시예 13. 개에서 다발성 경화증-유사 개 홍역 바이러스 ( CDV )에 대한 수의학적 치료

CDV는 개에서 다발성 경화증의 병인과 비슷한 병인을 가진 잘-확립된 바이러스-유발성 탈수초 모델이다. 본원에 기술된 실시예에서 확인된 기능 회복에 따르면, Cellavita 방법에 의해 배양한 hIDPSC에서, 슈반 세포의 마커인 p75 뉴로트로핀 수용체의 발현에 대한 본원의 전술한 내용과 관련있는 CDV 병리생리학적 병태에서, IDPSC가 신경교 생성 (gliogenesis)을 유도하거나; 및/또는 기능성 회복을 제공하기 위한 면역보호 기전을 유도하는 것으로 보인다. 테스트한 개 20마리에 대한 결과는 표를 참조한다 (본원에 나타내지 않은 비슷한 회복 결과는 홍역-유사 바이러스 질환과 비슷한 증상을 IDPSC에 의해 성공적으로 치료된 적은 수의 말을 이용한 실험에서 확인되었음).

아래 표 15는 간략하게 환자 대부분의 증상이 회복되고; 단 1명만 전혀 효과가 없었다는 것을 보여준다. 대부분의 환자는 2차 이식 후 증상이 회복되었지만, 몇몇 환자는 1차 이식 후 이미 회복되는 경향성을 보였다. 3차 이식 후 90% 이상에서 부분 회복이 확인되었다. 약 50%는 3차 이식 후 완전히 회복되었다.

표 15. IDSPC 이식 전 및 이식 후 개 20마리의 신경계 병태.

환자	기저 수준 (이식 전)	결과 (이식 후)
환자	기저 수준 (이식 전)	1차 이식	2차 이식	3차 이식
1	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 대부전 마비.	서서 체중을 지탱하지 못함, 앞다리에 경도의 운동실조 및 뒷다리에 중등도의 운동실조	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비
2	사지마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 앞다리의 경도의 운동실조 및 뒷다리 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 경도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	보행 정상
3	사지마비	서서 체중을 지탱하지 못함, *경도의 운동실조* 및 뒷다리 대부전 마비	앞다리 보행 정상, 아주 경미한 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	보행 정상
4	서서 체중을 지탱하지 못함, 및 뒷다리에 대부전 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 중등도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 매우 경미한 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	보행 정상
5	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 대부전 마비.	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 균형을 잡지 못함 (falta de equilibrio)	보행 정상
6	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 앞다리에 중등도의 운동실조, 뒷다리에 중증의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비
7	서 있지 못하며, 서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 뒷다리에 대부전 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 중등도 내지 경도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 중등도 내지 경도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 중등도 내지 경도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비
8	양측 하지 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 경도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	보행 정상	보행 정상
9	양측 하지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 매우 경미한 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	보행 정상
10	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 경도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 매우 경미한 운동실조 및 사지 대부전 마비	보행 정상
11	양측 하지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 경도의 운동실조 및 뒷다리 대부전 마비	보행 정상
12	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 대부전 마비.	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 경도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	보행 정상
13	양측 하지 마비	서서 체중을 지탱할 수 있음, 경도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	보행 정상	보행 정상
14	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 대부전 마비.	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 대부전 마비
15	사지마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비
16	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱함, 및 빙빙 돌면서 걸음 (walking with circle march)	서서 체중을 지탱함, 및 빙빙 돌면서 걸음
17	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱함, 중등도 내지 경도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 및 경도의 운동실조 및 사지 대부전 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비
18	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 마비.	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비
19	서서 체중을 지탱하지 못함, 중증의 운동실조, 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비
20	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비.	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 경도의 운동실조 및 사지 마비	서서 체중을 지탱하지 못함, 중등도의 운동실조 및 사지 마비

표 16. 환자 설명 및 줄기 세포의 투여 횟수 및 개에 사용된 세포의 양

환자	품종	나이 (개월)	성별	체중 (kg)	1회 이식시 사용된 세포 수
1	잡종	24	M	20	4x 10 ⁶
2	잡종	8	M	7	4x 10 ⁶
3	잡종	15	F	3	6x 10⁶
4	잡종	17	F	8	4x 10⁶
5	잡종	18	M	8	4x 10⁶
6	잡종	12	M	4	4x10⁶
7	푸들	24	F	8	4x10⁶
8	푸들	14	M	17	4x10⁶
9	잡종	20	F	15	6x 10⁶
10	잡종	21	M	25	6x10⁶
11	잡종	21	F	28	4x10⁶
12	잡종	19	M	19	4x10⁶
13	래브라도 레트리버	19	F	25	6x10⁶
14	푸들	24	F	6	4x10⁶
15	독일계 셰퍼드	22	F	23	4x10⁶
16	핀셰르	36	M	4	4x10⁶
17	잡종	36	M	3	4x10⁶
18	미국계 핏불테리어	41	F	26	6x10⁶
19	잡종	30	F	27	6x10⁶
20	래브라도 레트리버	28	F	29	4x10⁶

실시예 14. hIDPSC의 멀티회수 장기 및 조직 조직절편 배양의 산업적인 규모 확장을 위한 배치 방출 프로세스 - 후기 집단 방법에 의한 CELLAVITA ^TM ( 줄기 세포 ) 제품

명명

CELLAVITA^TM (줄기 세포)는 최종 제형화되기 전 단계의 벌크 물질이다. CELLAVITA^TM (줄기 세포)는 약물 물질 (DS)로 언급된다. IV 주사용 CELLAVITA^TM (줄기 세포)는 약물 제품 (Drug Product, DP)으로 언급된다. CELLAVITA^TM (줄기 세포) 물질 프로세스는 공여체 스크리닝 및 테스트에서 시작해, 최종 제형화 및 세포 스톡의 냉동보존하기 전 단계에서 종료된다. 약물 제품의 제조는 부가적인 부형제를 첨가한 CELLAVITA^T (줄기 세포) 물질의 제형화를 수반한다.

일반 절차

일 구현예에서, CELLAVITA^TM (줄기 세포)는 멀티-회수 장기 및 조직의 조직절편 배양을 통해 수득한 CD13, CD105 (Endoglin), CD73, CD29 (인테그린 b-1), CD44 및 네스틴과 같은 신경능선/간엽 줄기/전구 세포를 발현하는 줄기 세포이다 (Kerkis et al., 2009; Kerkis et al., 2006).

다른 구현예에서, CELLAVITA^TM (줄기 세포)는 MSC 세포의 모든 기본적인 특성을 가진 MSC-유사 세포이다. 이 세포는 국제 세포 테라피 학회의 간엽 및 조직 줄기 세포 위원회에 의해 확립된 다능성 간엽 기질 세포를 정의하는 최소 기준에 따라 정의된다. 이 정의는 표준 배양 조건에서 유지시, 플라스틱-부착성, CD105, CD73 및 CD90의 발현성, CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79alpha 또는 CD19 및 HLA-DR 표면 분자의 발현 결핍 및 조골세포, 지방세포 및 연골모세포로의 시험관내 분화력을 포함한다 (Dominici et al., 2006).

조사 제품 CELLAVITA ^TM ( 줄기 세포 )의 제조 방법

6-12세 연령의 어린이의 건치만 Cellavita™의 배양에 이용할 수 있다. 환자의 법적 후견인이 환자의 건강에 대한 적정 질문지에 답하고, 기증자 적격성에 대한 유럽 위원회 지침 (COMMISSION DIRECTIVE 2006/17/EC)에 의해 권고된 바에 따라 감염성 질환을 검출하기 위해 혈청 검사용 혈액 샘플을 채혈한다. 의무 검사에는 HIV-1 및 -2 (Anti-HIV-1 및 -2) 테스트, HTLV-1 및 -2 테스트, HBV (특히, HBsAg, Anti-HBc), HCV (특히, anti-HCV-Ab), 및 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) (매독) 검사가 있다 (COMMISSION DIRECTIVE 2006/17/EC).

충치와 같은 치아 질병이 없는 건강한 치아만 자연적인 치아 빠짐 또는 외과적 적출 후 수집한다. 불필요한 검사를 피하기 위해, 배양 (2주간의 세포 배양 후 실험실에서 측정하는 프로세스)할 수 있는 치수가 있는 치아를 가진 기증자만 기능자 적합성 검사 (채혈) 센터에 돌아가도록 요청한다.

치아 수집, 용기, 수송

자발적인 탈락 직후 치아를 15 mL 무균 원심분리 관에 든 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 500 mM 겐타마이신으로 구성된 멸균 이송 용액 3 mL에 담구었다. 치아는 4℃에 보관하고, 48-72시간내에 진행한다.

치수 단리 및 세척 절차

건강한 개체의 금방 빠진 유치를 50% pen/strep 용액 (100 unit/mL 페니실린, 100 unit/ mL 스트렙토마이신) 및 50% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 포함하는 멸균 용액으로 반복적으로 헹군다. 멸균 바늘을 사용해 치아에서 치수를 분리한다.

hIDPSC 줄기 세포 증식을 위한 원료 물질로서 사용가능한 치수의 선별

금방 수득한 치수 (DP)는 3% Pen/strep 용액 (100 unit/mL 페니실린, 100 unit/ mL 스트렙토마이신)을 포함하는 용액에서 헹군다. 치수의 일차 접종 및 생존성 검사를 15% 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone), 100 unit/mL 페니실린, 100 unit/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 2 mM 비-필수 아미노산이 첨가된 치수 유지 배지에서 수행한다. 이 과정은 일반적으로 최대 1주일 소요된다. DP가 생존가능한 것으로 간주되면, 이를 회수하여 hIDPSC를 계대배양한다. 수득한 hIDPSC는 향후 임상 연구를 위해 GTP 조건 하에 냉동보존한다.

제안된 제조 방법에 대한 설명

일 측면에서, 제조 방법은 1차 CELLAVITA^TM (줄기 세포) 단리 및 배치 포뮬레이션 프로세스를 도시한 도 48에 예시된 단계를 포함한다. 수직 경로는 (5차 회수 전 치수로부터 단리된) 초기 집단-hIDPSC 및 (5회차 회수 이후의 치수로부터 단리된) 후기 집단-hIDPSC의 기계적 치수 이동 (회수) 프로세스를 도시한다. 수평 경로는 세포를 반복 계대 배양을 통해 교체하는 전통적인 세포 배양의 효소적 방법을 도시한다. 최종 배치 산물은 치수 회수 및 계대 배양 (5회 이하)으로부터 수득한 hIDPSC를 합한 것이다.

다른 측면에서, 제조 방법은 도 48 및/또는 도 49에 예시된 단계를 포함한다. 제조 방법은 CELLAVITA^TM (줄기 세포) 단리 및 배치 형성 (batch formation)을 포함한다. 수직 경로는 5차 회수 전 치수로부터 단리된 초기 집단-hIDPSC 및 5차 이후의 치수 (DP) 회수 DP로부터 단리한 후기 집단-hIDPSC에 대한 기계적 DP 이동을 나타내며; 수평 경로는 세포를 반복 계대 배양을 통해 교체하는 전통적인 세포 배양의 효소적 방법을 도시한다. 최종 배치 산물은 DP 회수 및 계대 배양 (5회 이하)으로부터 수득한 hIDPSC를 합한 것이다.

CELLAVITA^TM (줄기 세포)의 제조는 GMP 규정에 따라 최신 클린 룸 시설에서 수행된다. 일 구현예에서, 이 제조 방법은 도 50에 개략적으로 도시된 단계를 따른다.

hIDPSC 회수

hIDPSC의 세미-컨플루언트 콜로니 형성이 치수 조직절편에서 검출되면, DP를 DP 유지 배지에서 연속 배양하기 위해 새로운 세포 배양 용기로 이동시킨다.

hIDPSC 계대 배양

hIDPSC는 멸균 PBS로 헹구고, TrypLE 용액으로 헹군 다음 원심분리한다. 펠릿을 DP 유지 배지에 재현탁한 후 조직 배양 플라스크에 접종한다 (계대 배양 1-P1). 세포가 약 80% 컨플루언스에 도달하면, 다음 플라스크로 이동시킨다 (계대 배양 2-P2). 세포는 습식 5% CO₂ 배양기에서 배양한다.

냉동하기 전 안전성 검사

P5의 hIDPSC는 무균성 및 마이코플라스마 검사를 위한 세포 컨디셔닝화된 배지 수집을 위해 적어도 3-5일간 배양 유지한다.

● 무균성 검사는 ISO, GMP 공인된 방법으로 수행한다.

● 마이코플라스마 검사는 인-하우스 RT-PCR 검사 (EZ-PCR Biological Industries)를 이용해 ISO, GMP 공인된 방법에 따라 수행한다.

동결 및 보관

hIDPSC 동결 프로토콜은 표준 동결 저장 프로토콜에 적합하게 변형된다. - P5의 hIDPSC를 90% FBS 및 10% DMSO (GMP/US 약제 등급)로 구성된 냉동 배지 1 mL이 든 2 mL 냉동보존 바이얼로 이동시킨다. 바이얼 1개 당 세포 1x10⁶개를 냉동보존한다.

냉동보존 바이얼을 이소프로필 알코올로 충전된 Nalgene Cryo 1oC 냉동 용기 안에 넣고, 밤새 -80℃에 둔다. 그 후, 바이얼을 액체 질소 보관 탱크의 기체 상에 넣고, 위치를 기록한다.

물질 관리

표 17은 물질 관리에 사용된 프로세스를 나타낸다.

표 17 물질 관리

시약	사용 농도	기원 소스/국가	제조사	제조 단계
유치	치아 1개	브라질	NA	원료
둘베코 변형된 이들 배지-F12 (DMEM-F12)	500 mL	이스라엘 베이트 하멕	Biological Industries(BI)	수송 용액
칼슘 및 마그네슘이 무첨가된 둘베코의 포스페이트 완충화된 염수(DPBS)	500 mL	이스라엘 베이트 하멕	Biological Industries(BI)	식염수
겐타마이신	500 mL	이스라엘 베이트 하멕	Biological Industries(BI)	식염수
소 태아 혈청	90%	워싱턴	HyClone	유지 배지; 냉동 배지.
L-글루타민 용액	2 mM	이스라엘 베이트 하멕	Biological Industries(BI)	유지 배지
페니실린-스트렙토마이신 용액	100,000 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신	이스라엘 베이트 하멕	Biological Industries(BI)	식염수
비-필수 아미노산	2 mL	이스라엘 베이트 하멕	Biological Industries (BI)	유지 배지
TrpLE	1X		Gibco	세포-분해 효소
DMSO	10%		sigma	냉동보존

실시예 15. 생체내 종양형성능

기형종의 형성은 배아 또는 유도 만능 줄기 세포 (ES 세포 및 iPS 세포)와 같은 임의의 만능성 세포의 만능성을 확인하는 필수 도구이다. Gropp et al., 2012에서 기술된 프로토콜에서 변형한 프로토콜을 세포의 기형종 형성력을 평가하는데 사용하였다. 본원에 기술된 방법은 정해진 수의 미분화된 마우스 또는 인간 ES 및 iPS 세포와 마트리겔을 면역결핍 마우스에 피하 공동-이식하는 것을 기초로 한다. 사용된 새로운 방법에서, 마우스 ES 세포 및 인간 iPS 세포 10⁶개를 사용하였을 때 (세포 10⁵개를 사용한 Gropp et al., 2012의 방법과 차이점), 재현성과 효율이 높은 것으로 확인되었다. 다수 동물과 장기간 추적 기간 (최대 6개월) 동안에 사례의 100%로 기형종 형성이 관찰되었다. 또한, 이 방법을 사용해, 유치의 치수, 탯줄 및 지방 조직으로부터 유래된 세포 등의 또 다른 성체 MSC 타입에 대한 생물-안전성을 분석하였다.

본 발명자들은 hIDPSC로부터 유도 만능 줄기 세포가 유래된다는 것을 관찰하였다. hIDPSC 유래 iPS 세포의 만능성은 기형종 형성으로 검사하였으며, 인간 배아 줄기 (ES) 세포와 hIDPSC를 대조군으로 사용하였다. ES 세포를 대상으로 한 일반적인 기형종 형성 프로토콜을 이용하였다 (Hentze et al., 2009). 이 프로토콜에 따라, 각 세포주 세포 10⁶개: hIDPSC-iPS 세포, ES 세포 hIDPSC를 4주령의 SCID 수컷의 뒷다리 근육에 접종하였다. hIDPSC-iPS 세포 또는 ES 세포가 접종된 동물에서, 3달 후 기형종 형성이 관찰되었다. 그러나, 이 실험에서 음성 대조군으로 사용한 동물 10마리에 접종된, hIDPSC는 추적 3개월 후 또는 6개월 후에도 기형종은 형성되지 않았다. 동물들 중 5마리가 1년 동안 생존하였으며, 그 이후에도 기형종 형성은 관찰되지 않았다.

조직학적으로, 만능 줄기 세포에서 기형종 형성에는 3개의 배엽으로부터 유래된 조직의 발생이 필요하다. 성체/간엽 줄기 세포의 경우, 이식 부위에서 정상 조직의 온전성에 어떠한 변화를 살펴보았다. 6개월 후, hIDPSC를 접종받고 기형종이 발생되지 않은 동물을 희생시키고, 동물의 뇌, 폐, 신장, 비장 및 간을 분석하였다. hIDPSC에서 DNA 존재는 상기한 장기들에서 모두 검증되었지만, 종양 형성 또는 임의의 형태적 변화는 관찰되지 않았다. 즉, 본 발명자들은 종양 형성 및 면역 거부 반응 위험성에 대한 조사 제품 CELLAVITA^TM (줄기 세포)의 안전성을 확보하였다.

또한, 척수 손상, 두개골 결함, TLSCD (total limbal stem cell deficiency), 근위축증 및 대퇴골두의 골괴사 (ONFH) 동물 모델에서 hIDPSC를 이용한 이전의 연구들에서 확인된 바와 같이, 기형종 형성 및/또는 면역 거부반응 위험성은 관찰되지 않았다 (Costa et. al., 2008; Kerkis et al., 2008; Monteiro et al., 2009; Gomes et al., 2010; Feitosa et al., 2010; Almeida et al., 2011).

도 51은 조사 제품 CELLAVITA™ (줄기 세포)의 안전성을 보여주는 이미 공개된 또 다른 전임상 실험을 요약 개시한다.

실시예 16. 기형종 분석의 기본 판단 기준

본 발명자들은, 기형종 분석의 다음 판단 기준을 조사하였다: 민감도 및 정량화; 확정 세포수 및 단일 세포 현탁물 제조; 만능성 세포 마커의 발현에 대한 조사 세포의 면역형과 핵형; 조사 세포와 마트리겔의 공동-이식. 세포를 기형종 발생을 쉽게 모니터링할 수 있는 NOD/SCID 마우스에 피하 (s.c.) 이식하였다.

종양 발생을 4달 (~16주)부터 모니터링하였다. 기형종의 조직학적 판단 기준은 3종의 배엽 유래 세포로의 만능성 세포의 분화성이다. 이런 실험은 일반적으로 병리학자가 수행하였다.

성체/간엽 줄기 세포의 경우, 세포 주사 부위에서 정상적인 조직 온전성에 있어 모든 유형 또는 모든 변화를 고려하였다.

기형종 판단 기준의 적용

A. 실험 시스템(들):

a. 마우스 배아 줄기 세포

b. 마우스 3T3 섬유모세포, 영구적인 마우스 세포주 Balbc 3T3 세포주, 클론 A31

c. 인간 iPS-IDPSC

d. 인간 ES 세포

e. 인간 IDPSC

본 발명자들은, 다양한 연구에 전술한 방법을 이용해, 본 발명에서 확립된 여러가지 마우스 ES 세포주의 만능성을 규명하고, 아울러 ES 세포 만능성을 25회 이상의 계대 배양에서 검증하고, 마우스 ES 세포주로부터 수득된 서브-클론의 특징을 규명하였다 (Sukoyan et al., 2002; Carta et al., 2006; Kerkis et al., 2007; Lavagnolli et al., 2007; Hayshi et al., 2010).

또한, 본 발명자 그룹의 최근 발표 문헌에서는, 이 방법을 이용해, 미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC) 유래 iPS 세포의 만능성을 규명하였다 (Beltra-Braga et al., 2011). 상기 문헌에서, 인간 IDPSC는 iPS-IDPSC에 대한 대조군으로 사용되었다. 본 발명자들은, iPS-IDPSC가 3종의 모든 배엽으로부터 기원한 조직을 가진 적절한 기형종을 형성하지만, hIDPSC는 어떠한 타입의 기형종 또는 그외 다른 타입의 신생물을 형성할 수 없다는 것을, 확인하였다. 또한, iPS-IDPSC는 핵에서 Nanog를 발현하였지만, hIDPSC는 그렇지 않았다.

결과

미성숙 치수 줄기 세포 (IDPSC)의 집단을 단리하기 위해 사용된 배양물과 같이 언급된 멀티-회수 조직절편은, 배아 줄기 세포 마커 Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81 뿐만 아니라 여러가지 간엽 줄기 세포 마커를 적어도 15회 계대 배양하는 동안 발현하지만, 줄기 세포의 정상 핵형과 증식 속도를 유지한다. 이들 마커의 발현은 이들 세포에서 수득한 서브클론에서 유지되었다. 또한, 이들 세포는 시험관내에서 화학적으로 정의된 배양 조건에서 평활근, 골격근, 뉴런, 연골 및 뼈로 한결같이 분화되게 유도할 수 있다. IDPSC는 크기가 작고, 세포 소기관의 세포질 함량이 적음에도 불구하고, 전형적인 간엽 - 섬유모세포 유사 형태를 나타내는 나이브 만능성 세포와 다르다는 것에 유념하는 것이 중요하다. 따라서, IDPSC는, 상피 타입인 ES 및 iPS 세포와 대조적으로, 간엽 타입이다. MSC와 ES 또는 iPS 세포 간의 기본적인 차이는 MSC가 이동성 및 플라스틱 부착성이라는 점으로, 세포외 기질을 합성하며, 세포 정션 프리 세포 (cell junction free cell)이다.

B. 실험 시스템(들):

a. IDPSC, 초기 계대 배양 (n = 10) 및 후기 계대 배양 (n = 10)시 3종의 일차 배양물

b. 인간 일차 섬유모세포

아울러, 이 방법은 만능성 마커를 또한 발현하는 골수, 간, 난황낭, 요막 및 양수로부터 유래된 개 태아 줄기 세포를 이용해 검증하였다.

IDPSC는 만능성 마커를 발현하는 줄기 세포를 가변적인 개수 (세포의 1-25%)로 포함하는 MSC의 집단으로 구성된다 (Lizier et al., 2012). 이들 세포를 NOD/SCID 마우스 (n = 20)에 이식하고, 4달 (~16주)부터 종양 발생을 모니터링하였다. 세포 주사 부위에서 정상 조직 온전성에 대한 모든 유형의 변화에 주의를 기울였다. 이 프로토콜은 IDPSC 집단, 특히 IDPSC 중 20%가 만능성 마커를 발현하는 것을 기준으로 계산된 사용 세포수에 맞게 조정하였다. ES 세포 및 iPS 세포에 대한 이전 테스트에서, 이들 세포가 10⁶개 사용되었지만, IDPSC 및 대조군 세포에서 최기성 테스트에서는 세포 5 x 10⁶개를 사용하였다. 4달 후, 육안으로 종양이 관찰되지 않았지만, 마우스를 희생시켜, 뇌, 폐, 신장, 비장, 간 등의 다양한 장기들에서 냉동 조직 단편을 입수하였으며, 병리학자가 이를 분석하였다.

테스트한 장기 전체에서 IDPSC DNA의 존재가 관찰되었지만, 종양 형성 또는 어떠한 형태학적 변화는 관찰되지 않았다.

Claims

뇌-혈액 장벽을 통과할 수 있는 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (human immature dental pulp stem cell, hIDPSC)의 제조 방법으로서,
상기 방법이 하기 a) - f)를 포함하는 방법:
a) 치수 (dental pulp, DP)를 수득하는 단계;
b) 상기 DP를 항생제를 포함하는 용액으로 세척하는 단계;
c) 상기 DP를 저산소 조건에서 플라스틱 표면에 배양 배지 중에 배치하여 조직절편 배양물 (explant culture)을 확립하는 단계;
d) 상기 DP를 다른 플라스틱 표면 상의 배양 배지 중에 기계적으로 이동 (transfer)시키는 단계;
e) 단계 c) 및 d)를 반복 실시하는 단계;
f) 플라스틱 표면에 부착된, CD44 및 CD13을 발현하는 hIDPSC를 2차 또는 이후 사이클에서 조직절편 배양물로부터 수득하는 단계로서, 상기 수득된 hIDPSC의 80% 이상이 뇌-유래 신경영양 인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 및 도파민- 및 cAMP-조절성 포스포단백질 (Dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein, DARPP-32)을 분비하는 것인, 단계.
제1항에 있어서,
상기 단계 c) 및 d)를 5회 이상 반복하고,
상기 DP의 5회 이동 후 생성된 조직절편 배양물로부터 hIDPSC를 수집하는, 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 c) 및 d)를 10회 이상 반복하고,
상기 DP의 10회 이동 후 생성된 조직절편 배양물로부터 hIDPSC를 수집하는, 방법.
제3항에 있어서,
상기 단계 c) 및 d)를 15회 이상 반복하고,
상기 DP의 15회 이동 후 생성된 조직절편 배양물로부터 hIDPSC를 수집하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 c)에서 상기 hIDPSC의 조직절편 배양물을 수집하기 전에 계대 배양하는 단계를 더 포함하고, 상기 계대 배양이 hIDPSC의 효소적 처리 및 조직절편 배양물의 증식을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
g) 수집한 hIDPSC의 샘플을, HLA-DR 및 HLA-ABC로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커로 면역염색하여, HLA-DR 또는 HLA-ABC의 발현 결핍 또는 이들의 조합을 확인하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항생제가 페니실린 및 스트렙토마이신으로 구성되며;
상기 배양 배지가 둘베코의 변형된 이글 배지 (DEME), Ham's F12, 소 태아 혈청 및 L-글루타민을 포함하고;
상기 플라스틱 표면이 배양 접시 또는 배양 비드에 의해 제공되고;
상기 DP가 인간 유치 (deciduous tooth)로부터 유래되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조직절편 배양물이 hIDPSC의 세미-컨플루언트 콜로니 (semi-confluent colony)를 포함하는, 방법.
CD44 및 CD13을 발현하는 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (hIDPSC)를 포함하는 조성물로서, 상기 hIDPSC의 약 80% 또는 그 이상이 뇌-유래 신경영양 인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 및 도파민- 및 cAMP-조절성 포스포단백질 (Dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein, DARPP-32)을 분비하는 것인, 조성물.
제1항의 방법에 따른 방법으로 수득되는 인간 미성숙 치수 줄기 세포 (hIDPSC)를 포함하는, 조성물.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 hIDPSC의 75% 이상이 ATP-결합성 카세트 서브패밀리 G 멤버 2 (ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)를 발현하는, 조성물.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 hIDPSC는 CK3/12 발현이 결핍된, 조성물.
제9항에 있어서,
상기 hIDPSC는 HLA-DR 및 HLA-ABC의 발현이 결핍된, 조성물.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 hIDPSC는 수회 계대 배양 후 콜로니-형성력을 유지하는, 조성물.
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