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KR102227919B1 - 당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질을 포함하는 화합물 또는 그 염, 및 그것들의 제조 방법 - Google Patents

당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질을 포함하는 화합물 또는 그 염, 및 그것들의 제조 방법 Download PDF

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KR102227919B1
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chain addition
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히로후미 오치아이
켄타 요시다
Original Assignee
가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼
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Abstract

(과제)생리 활성 물질의 수용성을 향상시킬 수 있고, 또한, 광이나 효소적 절단에 의하지 않고 특정한 조건 하에서 생리 활성 물질을 보다 빠르게 방출 가능한 담체 링커를 제공하는 것을 목적으로 한다.(해결 수단)본 발명은, 담체로서 당쇄를 부가한, 신규 당쇄 부가 링커를 제공한다.

Description

당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질을 포함하는 화합물 또는 그 염, 및 그것들의 제조 방법{SUGAR CHAIN-ATTACHED LINKER, COMPOUND CONTAINING SUGAR CHAIN-ATTACHED LINKER AND PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE OR SALT THEREOF, AND METHOD FOR PRODUCING SAME}
본 발명은, 당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질을 포함하는 화합물 또는 그 염, 및 그것들의 제조 방법에 관한 것이다.
생리 활성 물질 등의 약물의 수용성을 향상시키기 위해서, 여러가지 방법이 시도되고 있다. 예를 들면, 수용성이 높은 담체(캐리어)를 약물에 인공적으로 직접 부가한, 담체-약물의 콘쥬게이트(이른바, 약물 유도체)가 알려져 있다. 담체로서는, 친수성 아미노산 서열 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등이 알려져 있다.
그러나, 담체를 약물에 직접 결합시킨 약물 유도체의 경우, 그 입체 구조는, 본래의 약물의 입체 구조와 달라져 버린다. 그 결과, 약물 유도체는, 본래의 약물 분자와 비교하여, 다른 약물 동태학적, 면역원성적, 독물학적 또는 약리학적 특성을 나타낸다. 특히, 예를 들면, 약물 유도체를 백신으로서 이용했을 경우, 본래의 약물 분자와 비교하여, 그 약물 유도체의 항원성은, 통상, 저하된다는 것이 잘 알려져 있다.
또, 담체로서 PEG를 부가한(PEG화) 약물은, 생분해 저항성을 가진다. 따라서, PEG화 약물을 생체 내에 계속 투여하면, 그것이 생체 내에 축적되어, 생체에 약해를 줄 위험성이 있어, 생체 적합성이 충분히 확립되어 있다고는 하기 어렵다(일본 특허 공표 제2007-530569호 공보). 또한, PEG는 분자량 분포(다분산계의 성질(polydisperse nature))를 가진다. 약물을 PEG화하면, 부가되는 PEG의 결합 위치 또는 분자량이 다르기 때문에, 많은 단량체 아이소폼(many different monomeric isoforms:구조는 다르지만 같은 기능을 갖는 단백질)이 생성된다. 생성한 이러한 아이소폼은, 약물의 수용체 분자로의 결합에 관하여 서로 경합할 가능성이 있다(Barry Byrne et al., Drug Discovery Today, (2007), Vol. 12, 319-326페이지).
약물과 담체를, 링커 부분을 개재시켜 결합시킨, 담체 링커-약물의 콘쥬게이트도 개발되어 있다. 이것들은, 표적 장소(혈중 등)에서 작용할 때에, 담체 링커 부분과 약물과의 사이의 결합이 절단되어, 약물 자신이 방출되도록 설계할 수 있다. 이러한 담체 링커-약물의 콘쥬게이트를 사용하는 경우, 담체 링커 부분과 약물과의 사이의 결합의 절단에는, 광이나 효소적 절단이 트리거로서 사용되어 왔다. 그러나, 광을 사용하는 경우, 표적 부위에의 광조사가 어렵고, 생체에의 데미지도 염려된다. 또, 효소적 절단의 경우, 효소량은, 개체간 뿐만 아니라 투여 부위에서 크게 다른 것이 알려져 있다. 따라서, 환자 사이에 약물 치료의 효과의 격차가 생기는 것이 문제가 된다.
이러한 문제에 대하여, 담체 링커-약물의 콘쥬게이트로서 담체 링커 부분이 아미드기를 개재하여 생리 활성 물질 부분에 결합한 것이 보고되었다(국제 공개 제2009/095479호 팜플렛). 국제 공개 제2009/095479호 팜플렛에 개시되는 기술은, 담체 링커 부분과 약물과의 사이의 결합의 절단을 제어할 수 있도록, 담체 링커 부분에 있어서의 분자내 촉매 작용에 의한 자동 가수 분해(autohydrolysis)를 사용하는 것이다. 담체 링커 부분과 생리 활성 물질 부분과의 사이의 결합의 절단의 메커니즘은, 아미드 결합의 절단을 위한, 환상 이미드 형성에 의한 환화-활성화에 근거한다.
상기와 같은 과제를 감안하여, 본 발명은, 생리 활성 물질의 수용성을 향상시킬 수 있고 또한, 특정한 조건 하에서 생리 활성 물질을 보다 빠르게 방출 가능한 담체 링커를 제공하는 것이다.
국제 공개 제2009/095479호 팜플렛은, 다수의, 여러가지 구조를 갖는 담체 링커-약물의 콘쥬게이트가 아미드 결합의 절단에 의해 약물 자신을 방출시키는 것을 확인한 것에 불과하다. 담체로서 PEG를 이용한 다수의 실시예가 있으므로, 일본 특허 공표 제2007-530569호 공보는, 담체의 생분해성에 대하여 주목하고 있지 않다. 또한, 담체로서 물에 녹기 어려운 고급 지방산을 이용한 다수의 실시예가 있으므로, 일본 특허 공표 제2007-530569호 공보는, 담체 링커-약물의 콘쥬게이트, 또는 담체 링커 그것 자신의 용해성에 대해서도 언급하고 있지 않다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 생리 활성 물질의 수용성을 향상시킴과 동시에, 광이나 효소적 절단에 의하지 않고 특정한 조건 하, 생리 활성 물질을 방출 가능한 담체 링커를 발견하였다.
즉, 본 발명은, 그 일 형태에 있어서, 적어도 1개의 카르복시기를 갖는 생리 활성 물질과의 결합용의, 당쇄 부가 링커이며,
상기 당쇄 부가 링커는, 하기 식 (A)로 표시되고,
X-R1-Y-R2 (A)
[화학식 (A) 중,
X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고,
R1은, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 혹은, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이거나, 또는, R1은, -R3-R4-, -R4-R5-, 혹은 -R3-R4-R5-를 의미하고, 여기서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이며, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 또는 황 원자(S)이며,
Y는, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 R1과 결합하고, N이 R2와 결합한다)를 의미하고,
R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 혹은 당쇄 부가 폴리펩티드이거나, 또는, R2는, -R6-R7을 의미하고, 여기서, R6은, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드이며, R7은, 수소 원자(H), -NH2, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 핵산, 또는 PEG이다.]
상기 당쇄 부가 링커는, 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)에 있어서의 탈리기가 탈리함으로써, 상기 생리 활성 물질의 카르복시기와 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 하기 식 (A)로 표시되는, 당쇄 부가 링커
X-R1-Y-R2 (A)
[화학식 (A) 중,
X는, 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고,
R1은, -R3-R4-, -R4-R5-, 또는 -R3-R4-R5-를 의미하고, 여기서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이며, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 또는 황 원자(S)이며,
Y는, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 R1과 결합하고, N이 R2와 결합한다)를 의미하고,
R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드이다.]
인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 하기 식 (A)로 표시되는, 당쇄 부가 링커
X-R1-Y-R2 (A)
[화학식 (A) 중,
X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고,
R1은, -R3-R4-, 또는 -R4-R5-를 의미하고, 여기서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이며, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 또는 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴이며,
Y는, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 R1과 결합하고, N이 R2와 결합한다)를 의미하고,
R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드이다.]
인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 상기 R2 또는 R6의 「당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드」에서, 당쇄는, 아미노산 또는 폴리펩티드에 있어서의, Asn 또는 Cys에 결합하고 있는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 상기 R2 또는 R6의 「당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드」에 있어서의 당쇄는, 4개 이상의 당 잔기로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 상기 R2 또는 R6에 있어서의 「당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드」에 있어서의 당쇄는, 2본쇄 복합형 당쇄, 3본쇄 복합형 당쇄, 또는 4본쇄 복합형 당쇄인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 상기 당쇄가, 디시알로(disialo) 당쇄, 모노시알로 당쇄, 아시알로(asialo) 당쇄, di-GlcNAc 당쇄 및 디만노오스 당쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2본쇄 복합형 당쇄인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 상기 R2 또는 R6의 「당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드」에 있어서의 당쇄가, 하기 식:
[화학식 1]
Figure 112015060219176-pct00001
[화학식중, R10 및 R11는, 동일 또는 상이하고,
[화학식 2]
Figure 112015060219176-pct00002
를 나타낸다. Ac는, 아세틸기를 나타낸다.]
로 표시되는 당쇄인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커의 일 실시 형태에서, 상기 당쇄 부가 링커는, 상기 「당쇄 부가 아미노산, 혹은 당쇄 부가 폴리펩티드」에서, 당쇄는, 아미노산 또는 폴리펩티드와 링커를 개재하지 않고 결합하고 있는 것을 특징으로 한다.
이상 기술한 본 발명의 1 또는 복수의 특징을, 임의로 조합한 것도, 본 발명의 당쇄 부가 링커인 것은 말할 필요도 없다.
또, 본 발명의 다른 형태에 의하면, 상기 당쇄 부가 링커에 유래하는 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염이며,
상기 생리 활성 물질은, 적어도 1개의 카르복시기를 가지고 있고,
상기 당쇄 부가 링커 부분은, 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)에 있어서의 탈리기가 탈리함으로써, 상기 생리 활성 물질 부분의 카르복시기와 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합을 형성하여, 상기 생리 활성 물질 부분과 결합하고 있는,
화합물 또는 그 염을 제공한다.
또, 본 발명의 화합물 또는 그 염의 일 실시 형태에서, 상기 화합물 또는 그 염은, 상기 생리 활성 물질은, 저분자 생리 활성 물질 또는 생체 고분자인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 화합물 또는 그 염의 일 실시 형태에서, 상기 화합물 또는 그 염은, 상기 생체 고분자는, 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 펩티드 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 화합물 또는 그 염의 일 실시 형태에서, 상기 화합물 또는 그 염은, 무수식의 생리 활성 물질과 비교하여, 향상된 수용성을 갖는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 화합물 또는 그 염의 일 실시 형태에서, 상기 화합물 또는 그 염은, 상기 향상된 수용성이, 몰 농도에서, 상기 「무수식의 생리 활성 물질」이라고 비교하여, 10 내지 1,000,000배인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 화합물 또는 그 염의 일 실시 형태에서, 상기 화합물 또는 그 염은, 상기 당쇄 부가 링커 부분에 있어서의 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)와 상기 생리 활성 물질 부분에 있어서의 카르복시기와의 사이에 형성된 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합이, pH 및/또는 온도에 의존하여 절단되는 것을 특징으로 한다.
이상 기술한 본 발명의 1 또는 복수의 특징을, 임의로 조합한 것도, 본 발명의 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염인 것은 말할 필요도 없다.
또, 본 발명의 다른 형태에 의하면, 상기 화합물 또는 그 염을 포함하는 조성물이며, 상기 화합물 또는 그 염에 있어서의 당쇄는, 실질적으로 균일한 조성물을 제공한다.
또, 본 발명의 다른 형태에 의하면, 의약 조성물이며,
(I) 청구항 10에 기재된 화합물 또는 그 염, 및
(II) 약리학적으로 허용되는 담체
를 포함한, 의약 조성물을 제공한다.
또, 본 발명의 의약 조성물의 일 실시 형태에서, 상기 의약 조성물은, 상기 생리 활성 물질은, 대상으로 투여 후에, 활성을 발휘하는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 의약 조성물의 일 실시 형태에서, 상기 의약 조성물은, 백신 접종에 이용되는 것을 특징으로 한다.
이상 기술한 본 발명의 1 또는 복수의 특징을, 임의로 조합한 것도, 본 발명의 의약 조성물인 것은 말할 필요도 없다.
또, 본 발명의 다른 형태에 의하면, 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염의 제조 방법이며,
여기서, 당쇄 부가 링커는, 하기 식 (A)로 표시되고,
X-R1-Y-R2 (A)
[화학식 (A) 중,
X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고,
R1은, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 혹은, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이거나, 또는, R1은, -R3-R4-, -R4-R5-, 혹은 -R3-R4-R5-를 의미하고, 여기서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이며, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 또는 황 원자(S)이며,
Y는, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 R1과 결합하고, N이 R2와 결합한다)를 의미하고,
R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 혹은 당쇄 부가 폴리펩티드이거나, 또는, R2는, -R6-R7을 의미하고, 여기서, R6은, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드이며, R7은, 수소 원자(H), 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 핵산, 또는 PEG이다.]
상기 생리 활성 물질은, 적어도 1개의 카르복시기를 가지고 있고,
상기 방법은, 이하의 스텝,
(a) 상기 당쇄 부가 링커에 있어서의 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)와, 상기 생리 활성 물질의 카르복시기와의 사이에서, 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합이 형성되도록 축합 반응을 행하는 스텝을 포함하는,
제조 방법을 제공한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염의 제조 방법의 일 실시 형태에서, 상기 제조 방법은, 상기 축합 반응의 스텝이, 상기 당쇄 부가 링커가 고상 합성용의 수지에 결합한 상태에서 이루어지는(단, 상기 당쇄 부가 링커가, 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드를 가질 때로 한한다) 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염의 제조 방법의 일 실시 형태에서, 상기 제조 방법은, 스텝(a) 전에, (a＇) 하기 식 (A)로 표시되는 당쇄 부가 링커를 조제하는 스텝
X-R1-Y-R2 (A)
[화학식 (A) 중,
X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고,
R1은, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 혹은, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이거나, 또는, R1은, -R3-R4-, -R4-R5-, 혹은 -R3-R4-R5-를 의미하고, 여기서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이며, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 또는 황 원자(S)이며,
Y는, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 R1과 결합하고, N이 R2와 결합한다)를 의미하고,
R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 혹은 당쇄 부가 폴리펩티드이거나, 또는, R2는, -R6-R7을 의미하고, 여기서, R6은, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드이며, R7은, 수소 원자(H), 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 핵산, 또는 PEG이다.]
를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염의 제조 방법의 일 실시 형태에서, 상기 제조 방법은,
상기 스텝(a＇) 및/또는 상기 스텝(a)이, 수지 상에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염의 제조 방법의 일 실시 형태에서, 상기 제조 방법은,
상기 생리 활성 물질이, 적어도 1개의 카르복시기를 가지고 있고,
상기 방법은, 이하의 스텝,
(a) 수지에, 하기 식 (B)로 표시되는 링커를 결합하는 스텝이며,
상기 링커는, 하기 식 (B)로 표시되고,
X-R1-Y-R2 (B)
[화학식(B) 중,
X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고,
R1은, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 혹은, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이거나, 또는, R1은, -R3-R4-, -R4-R5-, 혹은 -R3-R4-R5-를 의미하고, 여기서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이며, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 또는 황 원자(S)이며,
Y는, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 R1과 결합하고, N이 R2와 결합한다)를 의미하고,
R2는, 아미노산, 혹은 폴리펩티드이거나, 또는, R2는, -R6-R7을 의미하고, 여기서, R6은, 아미노산, 또는 폴리펩티드이며, R7은, 수소 원자(H), -NH2, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 핵산, 또는 PEG이다.]
상기 링커에 있어서의 R2의 아미노산 또는 폴리펩티드의 카르복시기와 상기 수지를 결합하는 스텝과
(b) 상기 수지에 결합한 상기 링커와 상기 생리 활성 물질을 결합하는 스텝이며, 상기 링커는, 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)에 있어서의 탈리기가 탈리함으로써, 상기 생리 활성 물질의 카르복시기와 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합을 형성하여, 상기 생리 활성 물질과 결합하는 스텝과
(c) 상기 링커에 있어서의 R2의 아미노산 또는 폴리펩티드의 측쇄에, 당쇄를 부가하는 스텝
을 포함하는, 제조 방법인 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명의 다른 형태에 의하면, 상술의 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는, 화합물 또는 그 염을 제공한다.
이상 기술한 본 발명의 1 또는 복수의 특징을, 임의로 조합한 것도, 본 발명의 화합물 또는 그 염의 제조 방법인 것은 말할 필요도 없다.
본 발명에 관한, 당쇄 부가 링커는, 수산기가 많고 극성이 높은 당쇄 구조 부분을 갖기 위해, 생리 활성 물질과 결합함으로써 당해 생리 활성 물질의 수용성을 향상시킬 수 있다.
또, 본 발명에 관한, 당쇄 부가 링커는, 광이나 효소적 절단에 의하지 않고, 특정한 조건 하(예를 들면, 생체 내)에서 당해 당쇄 부가 링커와 결합한 생리 활성 물질을 방출할 수 있다.
또, 본 발명에 관한, 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염은, 수용성이다.
또한, 본 발명에 관한, 당쇄 부가 링커 부분에 있어서의 당쇄는 생분해성의 성질을 가지므로 유리하다.
또, 본 발명에 관한, 당쇄 부가 링커 부분에 있어서의 당쇄는 생리 활성 물질의 항원성을 저하시키는데 유리하다.
도 1A 및 도 1B는, 본 발명의 일 실시 형태인 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의 가수 분해 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 이 그래프는, 인큐베이션 시간에 대한 출발 물질의 상대 농도를 플롯한 것이다.
도 2A 및 도 2B는, 본 발명의 일 실시 형태인 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 가수 분해 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 이 그래프는, 인큐베이션 시간에 대한 출발 물질의 상대 농도를 플롯한 것이다.
도 3은, 티오에스테르 결합을 갖는 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)와 티오에스테르 결합을 갖는 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)와 에스테르 결합을 갖는 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)를 가수 분해 시험했을 때의 결과를 나타내는 그래프이다. 이 그래프는, 인큐베이션 시간에 대한 출발 물질의 상대 농도를 플롯한 것이다.
도 4는, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)를 가수 분해 시험했을 때의 결과를 나타내는 그래프이다. 이 그래프는, 인큐베이션 시간에 대한 출발 물질의 상대 농도를 플롯한 것이다.
본 명세서에 있어서, 「당쇄 부가 링커」란, 적어도 1의 카르복시기를 갖는 생리 활성 물질과 결합함으로써, 당해 생리 활성 물질의 수용성을 향상시킬 수 있는 당쇄를 담체로서 갖는 링커를 말한다. 또한, 당해 생리 활성 물질에 결합한 당쇄 부가 링커는, 특정한 조건 하, 예를 들면 생체 내에서, 목적으로 하는 속도로 가수 분해되는 것을 특징으로 한다. 이 가수 분해에 의해 당쇄 부가 링커는 당해 생리 활성 물질로부터 탈리하여, 당해 생리 활성 물질을 방출 가능하게 한다. 방출된 당해 생리 활성 물질은, 당쇄 부가 링커가 부가하기 전 상태로 돌아온다.
본 발명의 일 실시의 형태에서, 당쇄 부가 링커는, 하기 식 (A)로 표시된다.
X-R1-Y-R2 (A)
여기서, 상기 식 (A)에 있어서의 X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)」란, 식 (A): X-R1-Y-R2로 표시되는 당쇄 부가 링커의 X의 위치 존재하는 원자이며, 당해 원자에 결합하는 탈리기가 탈리함으로써 생리 활성 물질과 결합 가능한 원자를 말한다. 당해 원자와 생리 활성 물질과의 결합은, 생리 활성 물질 중의 카르복시기를 개재하여 행해진다.
여기서, 탈리기로서는, 생리 활성 물질의 카르복시기와 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)가 결합할 때에 탈리하는 것이면 한정되지 않고, 예를 들면, 수소 원자나, 원자가 하나의 양이온이 되는 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 프랑슘, 은 등이다.
또한, 본 발명의 당쇄 부가 링커는, 상기 식 (A)에 있어서의 X가 탈리기를 갖는 산소 원자(O)인 경우에는, 생리 활성 물질과 에스테르 결합을 형성함으로써 결합한다. 또, 상기 식 (A)에 있어서의 X가, 탈리기를 갖는 황 원자(S)인 경우에는, 생리 활성 물질과 티오에스테르를 형성함으로써 결합한다.
또, 상기 식 (A)에 있어서의 R1은, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 혹은, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이거나, 또는, R1은, -R3-R4-, -R4-R5-, 혹은 -R3-R4-R5-를 의미한다. 여기서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐을 의미한다. 또, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 또는 황 원자(S)를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬」은, 직쇄상 또는 분지쇄상의 알킬을 포함한다. 「C1 내지 C5 알킬」의 예로서는, 이하로 한정되지 않지만, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸 등을 들 수 있다. 이러한 「C1 내지 C5 알킬」은, 1개 또는 복수의 「치환기」로, 각각 독립적으로 치환될 수 있다. 「치환기」의 예로서는, C1 내지 C4 알콕시기(예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 등), 아미노기, 히드록시기, 티올기, 카르복시기, 니트로기, 메실기, 토실기, 또는 할로겐 원자(예를 들면, 불소, 염소, 브롬, 요오드) 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 「치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴」로서는, 이하로 한정되지 않지만, 예를 들면, 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라닐, 페난트릴, 안트릴, o-톨릴, m-톨릴, p-톨릴, 크실릴, 에틸페닐 또는 벤질 등을 들 수 있다.
또, 「치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴」은, 상기로 한정되지 않고, 「C5 내지 C16 아릴」에 있어서의 1개 또는 복수의 수소 원자는, 각각 독립적으로 「치환기」에 의해 치환된 것도 포함한다. 「치환기」의 예로서는, C1 내지 C4 알킬기, C1 내지 C4 알콕시기(예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 등), 아미노기, 히드록시기, 티올기, 카르복시기, 니트로기, 메실기, 토실기, 할로겐 원자(예를 들면, 불소, 염소, 브롬, 요오드), C1 내지 C4 할로겐화 알킬기(예를 들면 염화 메틸기), 페닐기, o-톨릴기, m-톨릴기, p-톨릴기, 크실릴기, 에틸페닐기 또는 벤질기 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에서, 「치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴」로서는, 이하로 한정되지 않지만, 환 구조를 형성하는 탄소 원자가 질소 원자나 산소 원자로 치환된 것을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 인돌, 퀴놀린, 크로멘 등을 들 수 있다.
또, 「치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴」은, 상기로 한정되지 않고, 「C5 내지 C16 헤테로아릴」의 환구조를 형성하는 탄소 원자와 결합하는 1개 또는 복수의 수소 원자가, 각각 독립적으로 「치환기」에 의해 치환된 것을 포함한다. 「치환기」의 예로서는, 알킬기, 알콕시기(예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 등), 히드록시기, 카르복시기, 니트로기, 메실기, 할로겐 원자(예를 들면, 불소, 염소, 브롬, 요오드), 할로겐화 알킬기(예를 들면 염화 메틸기) 등을 들 수 있다.
또, 본 명세서에 있어서, 「치환 또는 비치환된 C2 내지 C5의 알케닐」이란, 직쇄상 또는 분지쇄상의 알케닐을 포함한다. 「치환 또는 비치환된 C2 내지 C5의 알케닐」의 예로서는, 에테닐, 페로페닐, 부테닐 등을 들 수 있다. 또, 「치환 또는 비치환된 C2 내지 C5의 알케닐」은, 상기로 한정되지 않고, 「C2 내지 C5 알케닐」이, 1개 또는 복수의 「치환기」로, 각각 독립적으로 치환된 것도 포함한다. 「치환기」의 예로서는, C1 내지 C4 알콕시기(예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 등), 아미노기, 히드록시기, 티올기, 카르복시기, 니트로기, 메실기, 토실기, 또는 할로겐 원자(예를 들면, 불소, 염소, 브롬, 요오드) 등을 들 수 있다.
또, 본 명세서에 있어서, 「치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐」이란, 직쇄상 또는 분지쇄상의 알키닐을 포함한다. 「치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5의 알키닐」의 예로서는, 에티닐, 프로피닐, 부티닐 등을 들 수 있다. 또, 「치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐」은, 상기로 한정되지 않고, 「C2 내지 C5 알키닐」이, 1개 또는 복수의 「치환기」로, 각각 독립적으로 치환된 것도 포함한다. 「치환기」의 예로서는, C1 내지 C4 알콕시기(예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 등), 아미노기, 히드록시기, 티올기, 카르복시기, 니트로기, 메실기, 토실기, 또는 할로겐 원자(예를 들면, 불소, 염소, 브롬, 요오드) 등을 들 수 있다.
또, 상기 식 (A)에 있어서의 Y는, 식 (A) 중에 존재하고 있어도, 존재하고 있지 않아도 좋다. Y가 식 (A) 중에 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 식 (A) 중의 R1과 결합하고, N이 식 (A) 중의 R2와 결합한다)를 의미한다.
또, 상기 식 (A)에 있어서의 R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 혹은 당쇄 부가 폴리펩티드이거나, 또는, R2는, -R6-R7을 의미한다. 여기서, R6은, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드를 의미한다. 또, R7은, 수소 원자(H), -NH2, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 핵산, 또는 PEG를 의미한다.
본 명세서 중에서, 「당쇄」란, 단위 당(단당 및/또는 그 유도체)이 1개 이상 늘어서서 생긴 화합물을 말한다. 단위 당이 2개 이상 늘어서는 경우, 각각의 단위 당끼리의 사이는, 글리코시드 결합에 의한 탈수 축합에 의해 결합한다. 이러한 당쇄로서는, 예를 들면, 생체 중에 함유되는 단당류 및 다당류(글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산 및 그러한 복합체 및 유도체) 외, 분해된 다당, 당 단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질 등의 복합 생체 분자로부터 분해 또는 유도된 당쇄 등 광범위한 것을 들 수 있지만 그것들로 한정되지 않는다. 당쇄는 직쇄형이어도 분지쇄형이어도 좋다.
또, 본 명세서 중에서, 「당쇄」에는 당쇄의 유도체도 포함되고, 당쇄의 유도체로서는, 예를 들면, 당쇄를 구성하는 당이, 카르복시기를 갖는 당(예를 들면, C-1 위치가 산화되어 카르복실산이 된 알돈산(예를 들면, D-글루코오스가 산화된 D-글루콘산), 말단의 C원자가 카르복실산이 된 우론산(D-글루코오스가 산화된 D-글루쿠론산)), 아미노기 또는 아미노기의 유도체(예를 들면, 아세틸화된 아미노기)를 갖는 당(예를 들면, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-갈락토사민 등), 아미노기 및 카르복시기를 양쪽 모두 갖는 당(예를 들면, N-아세틸뉴라민산(시알산), N-아세틸무람산 등), 데옥시화된 당(예를 들면, 2-데옥시-D-리보오스), 황산기를 포함하는 황산화당, 인산기를 포함하는 인산화당 등인 당쇄를 들 수 있지만 이것들로 한정되지 않는다.
본 발명에서, 바람직한 당쇄는, 당쇄 부가 링커로서 생리 활성 물질에 부가되었을 경우에, 당해 생리 활성 물질의 수용성을 향상시키는 당쇄이다.
또, 본 발명에서, 바람직한 당쇄는, 당쇄 부가 링커로서 생리 활성 물질에 부가되었을 경우에, 당해 생리 활성 물질의 항원성을 저감하는 당쇄이다.
이러한, 본 발명의 당쇄 부가 링커에 있어서의 당쇄는 특별히 한정되지 않고, 생체 내에서 복합 당질(당 펩티드(또는 당 단백질), 프로테오글리칸, 당지질 등)로서 존재하는 당쇄이어도 좋고, 생체 내에서는 복합 당질로서 존재하지 않는 당쇄이어도 좋다.
생체 내에서 복합 당질로서 존재하는 당쇄는, 본 발명의 당쇄 부가 링커가 생체에 투여된다고 하는 관점에서 바람직하다. 이러한 당쇄로서는, 생체 내에서 당 펩티드(또는 당 단백질)로서 펩티드(또는 단백질)에 결합하고 있는 당쇄인 N-결합형 당쇄, O-결합형 당쇄 등을 들 수 있다. 바람직하게는, N-결합형 당쇄가 이용된다. N결합형 당쇄로서는, 예를 들면, 고만노오스(하이만노스)형, 복합(콤플렉스)형, 혼성(하이브리드)형을 들 수 있고, 특히 바람직하게는, 복합형이 좋다.
본 발명에서 사용하는 바람직한 복합형 당쇄로서는, 예를 들면, 아래와 같이 일반식
[화학식 3]
Figure 112015060219176-pct00003
[화학식중, R10 및 R11은, 동일 또는 상이하고,
[화학식 4]
Figure 112015060219176-pct00004
를 나타낸다. Ac는 아세틸기를 나타낸다.]
로 표시되는 당쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 형태에 있어서, 본 발명의 당쇄 부가 링커에 있어서의 당쇄는, 복합형 당쇄이다. 복합형 당쇄란, 2 종류 이상의 단당을 포함하고, 이하에 나타내는 기본 구조와 Galβ1-4 GlcNAc으로 표시되는 락토사민 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.
[화학식 5]
Figure 112015060219176-pct00005
또, 본 발명에서, 복합형 당쇄에는, 2본쇄 복합형 당쇄를 포함한다. 2본쇄 복합형 당쇄란, 기본 구조의 말단의 2개의 만노오스에, 각각 0 내지 3당으로 이루어지는 1본쇄의 당쇄가 결합하고 있는 것을 말한다. 2본쇄 복합형 당쇄로서는, 예를 들면, 이하에 나타내는 디시알로 당쇄,
[화학식 6]
Figure 112015060219176-pct00006
모노시알로 당쇄,
[화학식 7]
Figure 112015060219176-pct00007
[화학식 8]
Figure 112015060219176-pct00008
아시알로 당쇄,
[화학식 9]
Figure 112015060219176-pct00009
di-GlcNAc 당쇄,
[화학식 10]
Figure 112015060219176-pct00010
디만노오스 당쇄,
[화학식 11]
Figure 112015060219176-pct00011
등이 바람직하다. 2본쇄 복합형 당쇄로서는, 디시알로 당쇄 또는 아시알로 당쇄가 보다 바람직하고, 가장 바람직하게는, 디시알로 당쇄이다.
또, 본 발명의 복합형 당쇄에는, 상기의 2본쇄 복합형 당쇄(2 분기형 복합형 당쇄) 외, 3본쇄의 복합형 당쇄(3 분기형 복합형 당쇄), 4본쇄의 복합형 당쇄(4 분기형 복합당쇄)도 포함한다. 예를 들면, 3본쇄, 4본쇄의 복합형 당쇄로서는, 이하의 구조식으로 표시되는, 트리시알로 당쇄
[화학식 12]
Figure 112015060219176-pct00012
[화학식 13]
Figure 112015060219176-pct00013
아래와 같이 구조식으로 표시되는 테트라시알로 당쇄
[화학식 14]
Figure 112015060219176-pct00014
를 들 수 있다. 또, 3본쇄 복합형 당쇄 및 4본쇄 복합형 당쇄로서는, 이러한 트리시알로 당쇄 및 테트라시알로 당쇄의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당 잔기를 상실한 당쇄도 들 수 있다.
또한, 본 발명의 복합형 당쇄에는, 푸코오스가 붙은 것도 포함한다. 푸코오스가 붙은 복합형 당쇄로서는, 이하의 구조식으로 표시되는 푸코오스 함유 복합형 당쇄
[화학식 15]
Figure 112015060219176-pct00015
[화학식 16]
Figure 112015060219176-pct00016
[화학식 17]
Figure 112015060219176-pct00017
[화학식 18]
Figure 112015060219176-pct00018
[화학식 19]
Figure 112015060219176-pct00019
를 들 수 있다. 또, 이러한 푸코오스 함유 복합형 당쇄의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄도 들 수 있다.
또, 본 명세서 중에 있어서 「2본쇄 복합형 당쇄」, 「디시알로 당쇄」, 「모노시알로 당쇄」, 「아시알로 당쇄」, 「di-GlcNAc 당쇄」, 「디만노오스 당쇄」, 「3본쇄 복합형 당쇄」, 「4본쇄 복합형 당쇄」, 「푸코오스 함유 복합형 당쇄」에는, 상기 화학식으로 표시된 것 외에, 화학식으로 표시된 예와 결합 양식이 다른 것도 포함되고, 이러한 당쇄도 본 발명의 당쇄로서 바람직하게 이용된다. 이러한 당쇄로서는, 예를 들면, 디시알로 당쇄 또는 모노시알로 당쇄에서 시알산과 갈락토오스가(α2→3) 결합으로 결합하고 있는 것 등을 들 수 있다.
또, 본 발명의 복합형 당쇄에는, 하기 식으로 표시되는 폴리락토사민 구조 또는 시알릴폴리락토사민 구조를 갖는 당쇄도 포함한다.
[화학식 20]
Figure 112015060219176-pct00020
(식중, n는 2 내지 3의 정수이다.)
[화학식 21]
Figure 112015060219176-pct00021
(식중, n는 2 내지 3의 정수이다.)
또, 본 발명에서 사용되는 고만노오스형 당쇄는, 상술한 복합형 당쇄의 기본 구조에, 추가로 만노오스가 2개 이상 결합하고 있는 당쇄이다. 고만노오스형 당쇄는 부피가 높기 때문에, 펩티드에 고만노오스형 당쇄를 결합시킴으로써 혈중 안정성이 보다 높아질 수 있다. 포유류의 고만노오스형 당쇄와 같이, 5 내지 9개의 만노오스를 포함하는 당쇄가 바람직하지만, 효모의 고만노오스형 당쇄와 같이, 보다 많은 만노오스를 포함하는 당쇄이어도 좋다. 본 발명에 바람직하게 사용되는 고만노오스형 당쇄로서는, 예를 들면,
하이만노스 5(M-5)
[화학식 22]
Figure 112015060219176-pct00022
하이만노스 9(M-9)
[화학식 23]
Figure 112020038241813-pct00023
등을 들 수 있다.
본 발명에서, 바람직한 당쇄로서는, 예를 들면, 인간 체 내에서, 단백질과 결합한 당단백질로서 존재하는 당쇄(예를 들면, 「FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975」에 기재된 당쇄)와 동일한 구조를 갖는 당쇄(구성 당의 종류 및 그러한 결합 양식이 동일한 당쇄) 또는 이것의 비환원 말단으로부터 1 또는 복수의 당을 상실한 당쇄도 들 수 있다. 구체적으로는, 하기에 열거되는 당쇄를 들 수 있다.
[화학식 24]
Figure 112015060219176-pct00024
[화학식 25]
Figure 112015060219176-pct00025
[화학식 26]
Figure 112015060219176-pct00026
[화학식 27]
Figure 112015060219176-pct00027
또, 본 발명의 일 형태에 있어서, 바람직한 당쇄는, 직쇄 구조를 갖는 당쇄이다. 이러한 당쇄로서는, 예를 들면, 올리고히알루론산을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 올리고히알루론산이란, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 교대로 2 내지 32당, 바람직하게는 2 내지 16당, 보다 바람직하게는 4 내지 8당, 직쇄상에 결합한 당쇄를 말한다.
본 발명에 사용되는 올리고히알루론산 중, 특히 바람직한 것으로서 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어지는 단위를 1단위로 했을 경우, 2단위(4당) 이상 8단위(16당) 이하의 당쇄를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, 2단위(4당) 내지 4단위(8당), 가장 바람직하게는 2단위(4당)이다.
본 발명에 바람직하게 이용되는 히알루론산으로서는, 예를 들면,
4당의 올리고히알루론산,
[화학식 28]
Figure 112015060219176-pct00028
8당의 올리고히알루론산
[화학식 29]
Figure 112015060219176-pct00029
등을 들 수 있다.
또, 상기에 구체적으로 들 수 있는 당쇄는, 그것을 구성하는 각 당 잔기의 히드록시기 및/또는 카르복시기가, 보호기에 의해 보호되고 있어도 좋다. 보호기로서는, 예를 들면, 당 잔기의 히드록시기 및/또는 카르복시기를 화학 반응에서 보호할 목적으로 도입되는 당업자에게 공지된 보호기이다. 보다 구체적으로는, 이하로 한정되지 않지만, 예를 들면, 알킬기(메틸기, 에틸기 등), 벤질기, 아실기(아세틸기, 벤조일기, 피바로일기 등), tert-부틸디메틸실릴기, tert-부틸디페닐실릴기, 페나실기, 알릴기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「당쇄 부가 아미노산」은, 당쇄가 결합한 아미노산이다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「아미노산」이란, 그 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연의 아미노산, 예를 들면 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트리프트판(Trp), 프롤린(Pro) 뿐만 아니라, 아미노산 변이체 및 유도체와 같은, 비천연 아미노산도 포함된다. 당업자라면, 이 넓은 정의를 고려하여, 본 명세서에 있어서의 아미노산으로서 예를 들면 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체, 아미노산 유도체 등의 화학 수식된 아미노산; 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등, 생체 내에서 단백질의 구성 재료가 되지 않는 아미노산; 및 당업자에게 공지된 아미노산의 특성을 갖는, 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있다는 것을 당연하게 이해한다. 비천연 아미노산의 예로서는, α-메틸아미노산(α-메틸 알라닌 등), D-아미노산(D-아스파라긴산, D-글루타민산 등), 히스티딘양 아미노산(2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산(「호모」아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 관능기 아미노산이 술폰산기로 치환되는 아미노산(시스테인산 등)을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「당쇄 부가 아미노산」은, 당쇄와 아미노산과의 결합 부위에 특별히 제한은 없지만, 당쇄의 환원 말단에 아미노산이 결합하고 있는 것이 바람직하다. 당쇄가 결합하는 아미노산의 종류에 특별히 한정은 없고, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, D-아미노산의 어떤 것을 이용할 수도 있다. 당쇄 부가 아미노산이 생체 내에 당펩티드(당단백질)로서 존재하는 것과 동일 또는 유사한 구조를 가진다고 하는 관점에서는, 당쇄 부가 아미노산은, N-결합형 당쇄와 같은 당쇄 부가 Asn, O-결합형 당쇄와 같은 당쇄 부가 Ser 및 당쇄 부가 Thr가 바람직하다.
또, 당쇄와 아미노산이란, 링커를 개재하지 않고 결합하고 있어도 좋고, 혹은, 링커를 개재하여 결합하고 있어도 좋다. 당쇄와 아미노산이 링커를 개재하여 결합하고 있는 경우, 링커와의 결합 용이성이라고 하는 관점에서는, 당쇄 부가 아미노산의 아미노산은, 아스파라긴산 또는 글루타민산 등의 분자 내에 2개 이상의 카르복시기를 갖는 아미노산; 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 히스티딘, 트리프트판 등의 분자 내에 2 이상의 아미노기를 갖는 아미노산; 세린, 트레오닌, 티로신 등의 분자 내에 히드록시기를 갖는 아미노산; 시스테인 등의 분자 내에 티올기를 갖는 아미노산; 아스파라긴, 글루타민 등의 분자 내에 아미드기를 갖는 아미노산이 바람직하다. 특히, 반응성의 관점에서는, 당쇄 부가 아미노산의 아미노산은, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민이 바람직하고, 시스테인 또는 아스파라긴이 더욱 바람직하다.
당쇄와 아미노산이 링커를 개재하여 결합하고 있는 경우, 링커로서는, 당해 분야에서 사용되고 있는 것을 널리 사용할 수 있다. 예를 들면,
- NH-(CH2)a-(CO)-CH2-
(식 중, a는 정수이며, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다.) ;
C1-10 폴리메틸렌;
- CH2-R-;
(여기에서, R은, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 탄소환기, 치환된 탄소환기, 복소환기 및 치환된 복소환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로부터 수소 원자가 1개 탈리하여 발생하는 기이다.)
- (CO)-(CH2)a-(CO) -
(식 중, a는 정수이며, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다.)
등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 당쇄 부가 아미노산에서, 당쇄와 아미노산이 링커를 개재하지 않고 결합하고 있는 한 형태로서, 예를 들면, 아스파라긴의 측쇄의 아미노기 상의 수소 원자가, 당쇄의 환원 말단 부분에서 치환되어도 좋다. 이 경우, 당쇄의 환원 말단에 존재하는 탈리기는, 한정되지 않지만, 예를 들면, 염소, 브롬 또는 불소 등이어도 좋다.
본 발명에 있어서의 당쇄 부가 아미노산에서, 당쇄와 아미노산이 링커를 개재하여 결합하고 있는 한 형태로서 예를 들면, 시스테인의 측쇄의 티올기 상의 수소 원자가, 링커를 개재하여 당쇄의 환원 말단에 결합하고 있는 것을 들 수 있다(예를 들면, 링커가 CH2-CONH-의 경우, 당쇄의 환원 말단은 당해 링커 중의 질소 원자에 결합하고 있다). 이 경우, 당쇄의 환원 말단에 결합한 링커의 탈리기는, 한정되지 않지만, 예를 들면, 염소, 브롬 또는 불소 등이어도 좋다.
본 명세서에 있어서, 「당쇄 부가 폴리펩티드」는, 단백질(또는 폴리펩티드 또는 펩티드)에 적어도 1개의 당쇄가 부가된 화합물이면 특별히 한정되지 않는다. 당쇄 부가 폴리펩티드는, 본 명세서에 있어서, 「당단백질」또는 「당펩티드」와 호환적으로 이용해도 좋다. 당쇄 부가 폴리펩티드는, 상술한 당쇄 부가 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이어도 좋다. 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 당쇄와 아미노산과의 결합 형태 및 폴리펩티드를 구성하는 아미노산의 종류 등은, 본 발명에 있어서의 당쇄 부가 아미노산과 동일하게 규정되어도 좋다. 당쇄에 결합하는, 폴리펩티드에 있어서의 아미노산(잔기)은, 폴리펩티드의 N 말단, C 말단으로 한정되지 않고, 적절한 경우에는, 폴리펩티드를 구성하는 아미노산(잔기)의 어떤 것이어도 좋다. 본 발명에 있어서의 당쇄 부가 폴리펩티드에 있어서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 2 내지 100 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 2 내지 10 아미노산 잔기이어도 좋다. 또, 본 발명에 있어서의 당쇄 부가 폴리펩티드에서, 당쇄와 폴리펩티드가 결합하는 부분의 아미노산 이외의 아미노산은, 비교적 자유롭게 선택해도 좋다. 한 형태로서 당쇄와 폴리펩티드가 결합하는 부분의 아미노산이, 예를 들면 아스파라긴, 시스테인, 리신, 글루타민인 한편으로, 당쇄와 폴리펩티드가 결합하는 부분의 아미노산 이외의 아미노산(예를 들면, (당쇄 부가) 링커 부분과 결합하는 아미노산)은 특별히 제한되지 않는 것을 당업자는 이해한다.
본 발명의 화합물 또는 그 염을 생체 내에 투여하는 관점에서는, 본 발명에 있어서의 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드를 구성하는 아미노산은, 생체 내에 존재하는 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 당쇄 부가 링커는, 일 실시의 형태에서, 티오알킬형의 당쇄 부가 링커로 할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 티오알킬형의 당쇄 부가 링커란, 생리 활성 물질과 티오에스테르 결합을 개재하여 결합 가능한 당쇄 부가 링커이며, 그 구조 내에 알킬의 구조를 갖는 당쇄 부가 링커를 말한다.
또, 본 명세서에 있어서, 티오알킬형의 당쇄 부가 링커에는, 생리 활성 물질과 티오에스테르 결합을 개재하여 결합 가능한 당쇄 부가 링커이며, 그 구조 내에 알키닐, 또는 알케닐의 구조를 갖는 당쇄 부가 링커도 포함된다.
보다 구체적으로는, 티오알킬형의 당쇄 부가 링커는,
상기 식 (A)에 있어서의 X가 탈리기를 갖는 황 원자(S)이며,
상기 식 (A)에 있어서의 R1이, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 혹은, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알키닐이거나, 또는, R1은, -R3-R4-, -R4-R5-, 혹은 -R3-R4-R5-를 의미하고, 여기에서, R3 및 R5는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C2 내지 C5 알케닐, 또는, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알키닐이며, R4는, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 또는 황 원자(S)이며,
상기 식 (A)에 있어서의 Y는, 식 (A) 중에 존재하고 있어도, 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 식 (A) 중에 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 식 (A) 중의 R1과 결합하고, N이 식 (A) 중의 R2와 결합한다)이며,
상기 식 (A)에 있어서의 R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 혹은 당쇄 부가 폴리펩티드이거나, 또는, R2는, -R6-R7을 의미하고, 여기서, R6은, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드이며, R7은, 수소 원자(H), -NH2, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 핵산, 또는 PEG인,
당쇄 부가 링커이다.
본 발명의 당쇄 부가 링커는, 일 실시의 형태에서, 티오아릴형의 당쇄 부가 링커로 할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 티오아릴형의 당쇄 부가 링커란, 생리 활성 물질과 티오에스테르 결합을 개재하여 결합 가능한 당쇄 부가 링커이며, 그 구조 내에 아릴의 구조를 갖는 당쇄 부가 링커를 말한다.
보다 구체적으로는, 티오알킬형의 당쇄 부가 링커는,
상기 식 (A)에 있어서의 X가 탈리기를 갖는 황 원자(S)이며,
상기 식 (A)에 있어서의 R1이, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 아릴, 또는 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴이며,
상기 식 (A)에 있어서의 Y는, 식 (A) 중에 존재하고 있어도, 존재하고 있지 않아도 좋고, Y가 식 (A) 중에 존재하는 경우에는, Y는, -CO-, 또는 -CONH-(단, C가 식 (A) 중의 R1과 결합하고, N이 식 (A) 중의 R2와 결합한다)이며,
상기 식 (A)에 있어서의 R2는, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 혹은 당쇄 부가 폴리펩티드이거나, 또는, R2는, -R6-R7을 의미하고, 여기서, R6은, 당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 또는 당쇄 부가 폴리펩티드이며, R7은, 수소 원자(H), -NH2, 치환 혹은 비치환된 C1 내지 C5 알킬, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 아릴, 치환 혹은 비치환된 C5 내지 C16 헤테로아릴, 핵산, 또는 PEG인,
당쇄 부가 링커이다.
본 발명의 바람직한 일 형태에 있어서, 본 발명의 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염에 포함되는 당쇄는, 균일한 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 당쇄가 균일하다는 것은, 당쇄 부가 링커 부분 사이에서 당쇄를 비교했을 경우에, 당쇄 부가 부위, 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 결합 순서, 및 당 사이의 결합 양식이 당쇄 부가 링커 부분 사이에서 동일한 것을 말한다. 또, 당쇄 부가 링커 부분 중에 복수의 동일한 당쇄를 부가할 의도로 제작했을 경우에는, 당쇄가 균일하다는 것은, 당쇄 부가 링커 부분 내에서 부가된 복수의 당쇄의 구조를 비교했을 경우에, 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 결합 순서, 및 당 사이의 결합 양식이 동일한 것도 말한다. 구체적으로는, 당쇄 부가 링커 부분 사이 또는 당쇄 부가 링커 부분 내에서 당쇄를 비교했을 경우에, 적어도90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상에서 당쇄의 구조가 균일한 것을 한다.
균일한 당쇄의 비율이나 균일한 당쇄 부가 링커의 비율은, 예를 들면, HPLC, 캐필러리 전기 영동, NMR, 질량 분석 등을 이용한 방법에 따라 측정하는 것이 가능하다.
본 발명에 사용되는, 아미노산 서열 및/또는 당쇄가 실질적으로 균일한, 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드는, 고상 합성, 액상 합성, 세포에 의한 합성, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등, 당업자에게 공지된 펩티드 제조 방법에, 당쇄 부가 공정을 도입함으로써 제조할 수 있다. 그러한 당쇄 부가 폴리펩티드의 제조 방법에 관해서는, 예를 들면, 국제 공개 제2010/021126호 팜플렛, 국제 공개 제2004/005330호 팜플렛 등을 참조해도 좋다.
또, 당쇄 부가 공정에서 사용하는 당쇄의 제조 방법에 관해서는, 예를 들면, 국제 공개 제03/008431호 팜플렛, 국제 공개 제2004/058984호 팜플렛, 국제 공개 제2004/008431호 팜플렛, 국제 공개 제2004/058824호 팜플렛, 국제 공개 제2004/070046호 팜플렛, 국제 공개 제2007/011055호 팜플렛 등을 참조해도 좋다.
한정은 되지 않지만, 한 형태에서, 본 발명에 사용되는 당쇄 부가 폴리펩티드에는, 아미노산의 결합하고 있지 않는 당쇄를, 아미노산, 또는 폴리펩티드 상의 아미노산에 직접 또는 링커를 개재하여 결합한 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드; 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드에서, 부가한 당쇄에 당 또는 당쇄를 추가로 부가함으로써, 이미 부가된 당쇄를 신장시킨 당쇄 부가 폴리펩티드; 당쇄 부가 아미노산의, 예를 들면, 아미노기 및/또는 카르복시기에, 1 또는 복수(예를 들면, 2개 내지 30개, 바람직하게는 2개 내지 10개)의 아미노산을 결합시키고, 다시 이것을 아미노산 또는 폴리펩티드와 연결시킨 당쇄 부가 폴리펩티드; 아미노산의 결합한 당쇄를, 폴리펩티드 상의 아미노산에 링커를 개재하여 결합시킨 당쇄 부가 폴리펩티드, 등도 포함되어도 좋다.
또, 본 발명에 있어서의 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드에, 당 전이 효소에 의해 여러 가지 당(예를 들면, 푸코오스 등)을 전이함으로써, 목적으로 하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드를 효율적으로 얻어도 좋다. 예를 들면, 당전이 효소(푸코오스 전이 효소)에 의해서 푸코오스를 전이함으로써, 푸코오스를 포함하는 목적으로 하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또, 사용하는 당전이 효소에 의존하여, 결합 양식이 다른 목적으로 하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
푸코오스로서는, 일반적으로 시판되고 있는 푸코오스 또는 화학 합성한 것을 사용할 수 있다.
푸코오스 전이 효소로서는, 일반적으로 시판되고 있는 것, 천연 유래의 것, 유전자 재조합에 의해 생산된 것을 이용할 수 있고, 전이시키는 푸코오스의 종류에 따라 적당히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 당쇄 아스파라긴의 비환원 말단측의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스를 전이시키는 효소인 Fucosyltransferase V(Human, Recombinant, 혈장 유래, 혈청 유래, 유즙 유래, 간장 유래) 등을 들 수 있다. 또, 푸코오스 가수 분해 효소를 이용하고, pH 조정 등에 의해 평형을 어긋나게 함으로써, 푸코오스를 전이시켜도 좋다.
본 명세서에서 「핵산」이란, 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실), 당 잔기, 및 인산으로 이루어지는 뉴클레오티드가 인산 에스테르 결합에 의해 결합한 DNA 또는 RNA를 말하고, 2 내지 2000 뉴클레오티드 잔기를 가진다.
또, 본 명세서에서 「PEG」란, 에틸렌글리콜의 집합체이며, 예를 들면, 「(-CH2-CH2-O-)n」(n은, 2 내지 10000의 정수)로 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시의 형태에서, 바람직한 당쇄 부가 링커는,
식 (A): X-R1-Y-R2로 표시되는 당쇄 부가 링커에서,
X가, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고,
R1이, 벤질, 또는 톨릴 등으로 표시되는 아릴이거나, 또는 R1이, -R3-R4-R5-를 의미하고, R3이 -CH2CH2-이고, R4가 황 원자(S)이며, R5가 -CH2-이고(즉, R1이, -CH2CH2SCH2-로 표시되는 티오에테르이며),
Y가, -CO-를 의미하고,
R2가, NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn 혹은 당쇄 부가 Cys의 C 말단에 아미노산이 1개 또는 복수(예를 들면, 2, 3, 4, 5) 부가한 것을 의미하는, 당쇄 부가 링커이다.
본 발명의 당쇄 부가 링커는, 고상 합성, 액상 합성 등에 의해 제조할 수 있다.
예를 들면, 고상 합성에 의해 식 (A): X-R1-Y-R2로 표시되는 당쇄 부가 링커를 제조하는 경우에는, 수지 상에, R2, Y(존재하는 경우만), R1, X의 순서로, 적당한 화합물을 수지 상에 결합시켜 간다. 이 때, R2, Y, R1, X는, 각 구성 마다 차례로 수지 상에 결합시켜도 좋고, 연속하는 복수의 구성에 상당하는 화합물을 수지 상에 결합시킬 수도 있다. 연속하는 복수의 구성에 상당하는 화합물을 수지 상에 결합시키는 예로서는, 예를 들면, 우선, 수지 상에, 탈리기를 갖는 R2를 결합시킨다. 다음에, Y의 말단에 탈리기를 갖는 X-R1-Y의 하나의 화합물을, 수지 상의 R2와 축합시킴으로써, R2 및 Y의 탈리기가 탈리하고, 수지 상에, 식 (A): X-R1-Y-R2로 표시되는 당쇄 부가 링커를 제작할 수 있다. 또한, 연속하는 복수의 구성에 상당하는 화합물은, X-R1-Y로 한정하지 않고, X, R1, Y, R2의 4개의 구성으로부터 2개 이상이 선택되는 그 밖의 편성도 포함한다.
하기에, 보다 구체적인 고상 합성법에 의한 제조예를 나타낸다.
즉, 고상 합성법에 의한 제조 방법은,
수지 상에, 탈리기를 갖는 R2의 화합물(당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 당쇄 부가 폴리펩티드 등)을 결합시키는 공정과
수지 상의 R2에 대해서, 적어도 2개의 탈리기를 갖는 Y를 결합시키는 공정이며, R2와 Y와의 탈리기가 탈리함으로써, R2와 Y가 결합하는 공정과
수지 상의 Y-R2에 대해서, 적어도 2개의 탈리기를 갖는 R1의 부분에 상당하는 화합물을 결합시키는 공정이며, Y와 R1과의 탈리기가 탈리함으로써, Y와 R1이 결합하는 공정과
수지 상의 R1-Y-R2에 대해서, 적어도 2개의 탈리기를 갖는 X의 부분에 상당하는 화합물을 결합시키는 공정이며, R1과 X와의 탈리기가 탈리함으로써, R1과 X가 결합하는 공정과
수지 상에 합성된 X-R1-Y-R2를 수지로부터 분리하는 공정
을 포함한다.
또, 예를 들면, 고상 합성법에 의한 당쇄 부가 링커의 제조 방법에서, X-R1-Y의 부분에 상당하는 하나의 화합물을 이용하여 수지 상에 결합시키는 제조예에 있어서는,
수지 상에, 탈리기를 갖는 R2의 화합물(당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 당쇄 부가 폴리펩티드 등)을 결합시키는 공정과
수지 상의 R2에 대하여, Y의 말단에 탈리기를 갖는 X-R1-Y의 화합물을 결합시키는 공정이며, R2와 Y와의 탈리기가 탈리함으로써, R2와 Y가 축합하여 수지 상에 X-R1-Y-R2를 형성시키는 공정과
수지 상에 합성된 X-R1-Y-R2를 수지로부터 분리하는 공정
을 포함하는 제조 방법에 의해, 당쇄 부가 링커를 제작할 수 있다.
또한, 고상 합성법에 있어서의 당쇄 부가 링커의 제조 방법에서, 수지 상에 형성된 당쇄 부가 링커를 수지로부터 절단하지 않고, 다시 아미노산을 연결시킬 수 있다(보다 구체적으로는, X로 표시되는 탈리기를 갖는 산소 원자 또는 탈리기를 갖는 황 원자에 다시 아미노산을 연결시킬 수 있다). 이에 따라, 수지로부터 당쇄 부가 링커를 분리할 필요없이, 수지 상에서 생리 활성 물질 부분과 당쇄 부가 링커 부분을 포함하는 화합물을 제조할 수 있다.
고상 합성에 이용되는 수지로서는, 수지(레진)로서는, 통상, 고상 합성에서 사용하는 수지(레진)이면 좋고, 예를 들면, 염소로 관능화된 2-클로로트리틸클로리드 수지(머크사 제조)나, 아미노기로 관능화된 Amino-PEGA 레진(머크사 제조), 수산기를 갖는 NovaSyn TGT 알콜 수지(머크사 제조), Wang 레진(머크사 제조), HMPA-PEGA 레진(머크사 제조), Link Amide 레진(머크사 제조) 등을 이용할 수 있다. 또, Amino-PEGA 레진과 아미노산의 사이에 링커를 존재시켜도 좋고, 이러한 링커로서 예를 들면, 4-히드록시메틸페녹시 아세트산(HMPA), 4-(4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시)-부틸 아세트산(HMPB) 등을 들 수 있다. C 말단의 아미노산이 수지에 미리 결합한 H-Cys(Trt)-Trityl NovaPEG 수지(머크사 제조) 등도 이용할 수 있다.
또, 고상 합성에 의해 제조된 당쇄 부가 링커 내에 존재하는 아미노산 또는 펩티드의 C 말단을 아미드화하는 경우에는, 예를 들면, 아미노기로 관능화된 Rink-Amide-PEGA 레진(머크사 제조)을 이용할 수 있다. 이 레진과 펩티드를 산으로 절단함으로써, 당쇄 부가 링커에 있어서의 아미노산 또는 펩티드의 C 말단 아미노산을 아미드화할 수 있다.
또한, 2-클로로트리틸클로리드 수지는, 고상 합성에서 펩티드쇄를 신장할 때, 말단에 있는 Cys의 라세미화를 방지할 수 있는 점에서 바람직하다.
수지 상에, R2의 부분에 상당하는 화합물(당쇄, 당쇄 부가 아미노산, 당쇄 부가 폴리펩티드 등)을 결합시키는 공정에서, 수지 상에 당쇄 부가 아미노산을 결합시키는 경우에는, 지용성 보호기로 아미노산이 보호된 당쇄 부가 아미노산을 결합시킨다. 또, 수지 상에 당폴리펩티드를 결합시키는 경우에는, 목적으로 하는 아미노산 및 당쇄 부가 아미노산을 순차, 수지 상에 결합시킴으로써, 수지 상에 당쇄 부가 폴리펩티드를 합성할 수 있다.
지용성 보호기로서는, 예를 들면 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)기, t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐기, 아세틸기 등의, 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 들 수 있다. 아미노산에 지용성 보호기를 도입하려면, 예를 들면 Fmoc기를 도입하는 경우에는 9-플루오레닐메틸-N-숙시니미딜카보네이트와 탄산 수소나트륨을 첨가하여 반응을 행함으로써 도입할 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1 내지 5시간 정도 행하는 것이 좋다.
지용성 보호기로 보호한 아미노산으로서는, 시판 중인 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, Fmoc-Ser-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Tyr-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys-OH, Fmoc-Arg-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Asp-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Pro-OH, Boc-Ser-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Tyr-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Lys-OH, Boc-Arg-OH, Boc-His-OH, Boc-Asp-OH, Boc-Glu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr-OH, Boc-Cys-OH, Boc-Met-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Trp-OH, Boc-Pro-OH를 들 수 있다.
또, 지용성 보호기로 보호한 아미노산이며, 측쇄에 보호기를 도입한 것으로서 예를 들면, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Cys(StBu)-OH, Fmoc-Cys(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Boc-Arg(di-Z)-OH, Fmoc-Asp(OBzl)-OH, Boc-Cys(Bzl)-OH, Boc-Glu(OBzl)-OH, Boc-His(Dnp)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Trp(For)-OH, Boc-Tyr(Bzl)-OH를 들 수 있다.
지용성 보호기로 아미노산이 보호된 당쇄 부가 아미노산으로서는, Fmoc-당쇄 부가 Asn, Boc-당쇄 부가 Asn 등을 들 수 있다.
또한, 이러한 당쇄 부가 아미노산은, 상술한 당쇄이며, 동일한 당쇄 구조를 갖는 당쇄가 부가된 아미노산을 이용한다. 이러한 당쇄로서는, 임의의 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 구체적인 수법으로서는, 한정되지 않고, 예를 들면, 당쇄를 화학 합성하는 것(예를 들면, J.Seifert et al. Angew Chem Int. Ed. 2000, 39, p531-534 참조)이나, 천연 또는 인공의 당쇄 공급원으로부터 분리한 것이나 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 이 수법에서, 동일한 구조를 갖는 당쇄 부가 아미노산으로서는, 한정되지 않고, 예를 들면, 천연 또는 인공의 당쇄 공급원으로부터의 동일 구조의 당쇄의 분리는, 예를 들면, WO2004/058789에 기재된 방법에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 계란 등의 천연의 당쇄 공급원으로부터, Seko et al., Biochim Biophys Acta. 1997;1335(1-2): 23-32 등에 기재된 방법으로 당쇄 아스파라긴을 포함하는 혼합물(시알릴글리코펩티드(SGP))을 단리하고, 이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기(예를 들면, Fmoc)를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻고, 이것을 크로마토그래피에 제공함으로써, 이 혼합물에 포함되는 여러 가지 구조의 당쇄를, 그 구조에 따라 분리할 수 있다. 또, 여러 가지의 보호기를 갖거나, 가지지 않는 특정한 구조의 당쇄 아스파라긴은, 예를 들면, 주식회사 당쇄 공학 연구소로부터 입수 가능하다.
수지와 아미노산 또는 당쇄 부가 아미노산을 결합시키는 반응은, 예를 들면, 고상 컬럼에 레진을 넣고, 이 레진을 용제로 세정하고, 그 후 아미노산의 용액을 첨가함으로써 행하는 것이 바람직하다. 세정용 용제로서는, 예를 들면 디메틸포름아미드(DMF), 2-프로판올, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로서는, 예를 들면 디메틸술폭시드(DMSO), DMF, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 수지와 아미노산 또는 당쇄 부가 아미노산과의 결합 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 행하는 것이 좋다.
그 때, 축합제로서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드·염산염(WSC/HCl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 카르보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 1,3-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스피로리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 3-디에톡시포스포릴옥시-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온(DEPBT), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 히드록시숙신이미드(HOSu), 디메틸아미노피리딘(DMAP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-5-아자벤조-1,2,3-트리아진(HODhbt), 히드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU), O-(6-Chloro-1 H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N＇,N＇-tetramethyluronium hexafluorophosphate(HCTU), O-(7-아자벤조트리아졸1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스포네이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TBTU) 등을 이용할 수 있다. 아미노산 또는 당쇄 부가 아미노산과 탈수 축합제와의 사용 비율은, 전자 1 중량부에 대해서, 후자가, 통상 1 내지 10 중량부, 바람직하게는 2 내지 5 중량부이다.
또한, 비환원 말단에 시알산을 갖는 당쇄를 사용할 때, 수지로부터 절단 공정에 있어서의 산처리에 의해, 시알산이 빠져 버리는 수가 있다. 따라서, 산을 사용하는 절단 공정 전에 시알산을 갖는 당쇄를 링커 부분에 도입할 때, 도입하는 당쇄 상의 시알산의 카르복시기가, 보호기에 의해 보호되고 있는 당쇄를 사용하는 것이 바람직하다. 시알산의 카르복실기의 보호기로서는, 벤질(Bn)기 등을 포함하는 아릴기, 에틸기(Et)나 메틸기(Me) 등을 포함하는 알킬기, 디페닐메틸기, 페나실기, 알콕시기, 또는 니트로기 등에 의해 환 구조를 형성하는 탄소에 결합하는 수소 원자가 치환된 페나실기 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 시알산의 카르복시기를, -COOBn, -COOEt, -COOMe, -COOCH(Ph)2, -COOCH2COPh, -COOCH2PhOMe, -COOCH2Ph(OMe)2, -COOCH2PhNO2, 또는, -COOCH2Ph(NO2)2로 표시되도록 보호하는 보호기가 바람직하다. 이와 같이, 시알산의 카르복시기를 벤질기 등으로 보호함으로써, 산에 불안정한 시알산의 탈리를 막는 것이 가능하다.
당쇄 상의 시알산의 카르복시기의 보호 반응은, 당업자에게 주지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면 벤질기, 디페닐메틸기, 페나실기로부터 보호된 시알산 카르복시기의 보호기의 탈보호도, 당업자에게 주지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 탈보호의 반응은, 이하로 한정되지 않지만, 알칼리성 조건 하에서 가수 분해함으로써 행할 수 있다. 탈보호의 반응은, 통상 0 내지 50℃, 바람직하게는, 0 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 0 내지 30℃에서 행하는 것이 좋다. 반응 시간은, 바람직하게는, 통상 5분 내지 5시간 정도이다. 반응 종료 후는, 인산이나 아세트산 등의 약산에 의해 중화한 후, 적절히 공지된 방법(예를 들면, 고속 액체 컬럼 크로마토그래피(HPLC))로 정제하는 것이 좋다.
또, R2가, 핵산, PEG인 경우에도, 당업자는 주지된 방법에 의해, 적절히 수지에 상당하는 화합물을 결합시킬 수 있다.
또, R2가 당쇄인 경우에는, 당쇄가 부가되어 있지 않은 링커의 구조를 수지 상에 합성하고, 수지로부터 절단·단리 후의 링커 말단에 당쇄를 부가함으로써 제조할 수 있다. 당쇄를 부가할 예정인 링커의 말단에는, 예를 들면, 티올기를 갖도록 설계한다. 이에 따라, 수지로부터 단리 후의 링커의 말단에 존재하는 티올기와 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체(또는 할로아세토아미드화 복합형 당쇄 유도체)를 결합시켜, 링커 말단에 당쇄를 도입할 수 있다.
또, R2가 핵산이나 PEG인 경우에도, 핵산 또는 PEG가 부가되어 있지 않은 링커의 구조를 수지 상에 합성하고, 수지로부터 절단·단리 후의 링커 말단에 핵산 또는 PEG를 부가함으로써 제조할 수 있다. 핵산 또는 PEG를 부가할 예정인 링커의 말단에는, 예를 들면, 티올기를 갖도록 설계한다. 이에 따라, 수지로부터 단리 후의 링커의 말단에 존재하는 티올기와 할로아세틸화체(또는 할로아세토아미드화체) 등으로 한 핵산 또는 PEG를 결합시켜, 핵산 또는 PEG를 도입할 수 있다.
또, R2가 당쇄 부가 아미노산이나 당쇄 부가 폴리펩티드이어도, 당쇄가 부가되어 있지 않은 링커의 구조만을 먼저 수지 상에 합성 후, 나중에 R2의 부분에 당쇄를 결합시킬 수도 있다. 당쇄를 R2에 결합시키는 반응은, 고상 합성과 연속해 수지위에서 행해도 좋고, 또는 수지로부터 분리한 후에 행하여도 좋다. 고상 합성과 연속하여 수지 상에서 당쇄를 결합시키는 경우에는, 생리 활성 물질 부분까지 합성한 후에 당쇄 부가 공정을 행해도 좋고, 생리 활성 물질 부분의 합성 전에 당쇄 부가 공정을 행하여도 좋다.
링커 또는 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 갖는 화합물을 합성한 후에 당쇄를 부가할 때, 상술한 바와 같이, 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체(또는 할로아세토아미드화 복합형 당쇄 유도체)를 당해 링커(무보호의 Cys를 포함한다) 또는 당해 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 갖는 화합물(무보호의 Cys를 포함한다)과 반응시킴으로써, 당쇄를 무보호의 Cys의 티올기와 반응시켜, 펩티드에 결합시킬 수 있다. 상기 반응은, 인산 완충액, 트리스-염산 완충액, 구연산 완충액, 아세토니트릴, DMSO, 또는 이러한 혼합 용액 중에서, 통상 0 내지 80℃, 바람직하게는, 10 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 15 내지 35℃에서 행하는 것이 좋다. 반응 시간은, 통상 10분 내지 24시간, 바람직하게는, 통상 30분 내지 5시간 정도이다. 반응 종료 후는, 적절히 공지된 방법(예를 들면, HPLC)으로 정제하는 것이 좋다.
할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체(또는 할로아세토아미드화 복합형 당쇄 유도체)는, 예를 들면, 복합형 아스파라긴 결합형 당쇄의 환원 말단의 1위치의 탄소에 결합하고 있는 수산기를, -NH-(CH2) a-(CO)-CH2X(X는 할로겐 원자, a는 정수이며, 목적으로 하는 링커 기능을 저해하지 않는 한 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0 내지 4의 정수를 나타낸다.)로 치환한 화합물이다.
보다 구체적인 할로아세틸화 복합형 당쇄 유도체와 Cys 함유 펩티드와의 반응예로서는, 인산 완충액 중, 실온에서 반응시킬 수 있다. 반응 종료 후, HPLC로 정제함으로써 당쇄 부가 Cys로 치환한 당쇄 부가 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
또, DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴과 같은 유기 용매와 상기 완충액과의 혼합 용액 중에서 반응을 행할 수도 있다. 이 때, 유기 용매의 비율은, 0 내지 99%(v/v)의 범위에서, 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 완충액으로의 용해성이 낮은 무보호의 Cys를 포함하는 펩티드는, 이러한 유기 용매를 첨가함으로써 반응 용액으로의 용해성을 향상시킬 수 있어 바람직하다.
또, DMSO, DMF, 메탄올, 아세토니트릴과 같은 유기 용매나, 그러한 혼합 용액 중에서 반응을 행할 수도 있다. 그 때, 염기의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 염기로서는, 예를 들면 DIPEA, 트리에틸아민, 피리딘, 2,4,6-콜리딘 등을 들 수 있다.
또, 구아니딘 염산염이나 요소를 완충 용액에 첨가한 혼합 용액 중에서도 반응을 행할 수 있다. 또한, 구아니딘 염산염이나 요소는, 최종 농도가 1M 내지 8M이 되도록 상기 완충액에 첨가할 수 있다. 구아니딘 염산염이나 요소의 첨가에 의해서, 완충액으로의 용해성이 낮은 펩티드의 용해성을 향상시킬 수 있어 바람직하다.
또, 할로아세틸화체(또는 할로아세토아미드화체) 등으로 한 핵산 또는 PEG와 Cys 함유 펩티드와의 반응에 대해서도, 당업자는 공지된 방법에 의해 적절히 행할 수 있다.
수지 상의 R2에 대하여, Y의 부분에 상당하는 화합물을 결합시키는 공정, 수지 상의 Y-R2에 대하여, R1의 부분에 상당하는 화합물을 결합시키는 공정, 수지 상의 R1-Y-R2에 대하여, X의 부분에 상당하는 화합물을 결합시키는 공정에서는, 당업자는, 적절히 각 구성에 상당하는 화합물을 설계·선택하여, 수지 상의 R2에 축합시킬 수 있다.
또, 당업자는, 연속하는 복수의 구성에 상당하는 화합물을 수지 상에 결합하는 경우도, 적절히 화합물 및 반응 조건을 설계·선택할 수 있다.
또한, 당쇄 부가 링커의 X에 상당하는 부분(탈리기를 갖는 산소 원자 또는 탈리기를 갖는 황 원자)은 합성 상 보호기를 필요로 하는 경우가 있다. 산소 원자의 보호기로서는, 트리틸기, 메톡시트리틸기, t-부틸기, 벤질기 등을 들 수 있고, 황 원자의 보호기로서는, 트리틸기, 메톡시트리틸기, t-부틸기, t-부틸티오기, Acm기 등을 들 수가 있다. 보호기의 도입은, 종래 주지된 방법에 의해 행할 수 있다.
수지 상에 합성된 당쇄 부가 링커(식 (A):X-R1-Y-R2)를 수지로부터 분리하는 공정은, 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 산으로서는, 예를 들면, 트리플루오로 아세트산(TFA)과 트리이소프로필실란과 에탄디티올과 물과의 혼합 용액(90:5:2.5:2.5), 아세트산과 트리플루오로에탄올과의 혼합 용액(50:50), HCl 등을 들 수 있다.
또, 수지 상에, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질이 결합한 화합물을 합성했을 때에도, 수지로부터 당해 화합물을 분리하는 공정은, 산으로 처리하는 것이 바람직하다. 사용하는 산이나 반응 조건은, 당쇄 부가 링커를 수지로부터 분리하는 조건과 동일하게 행할 수 있다.
이와 같이 제조된 당쇄 부가 링커는, 탈리기를 갖는 산소 원자 또는 탈리기를 갖는 황 원자에서, 생리 활성 물질과 결합한다. 이와 같이, 당쇄 부가 링커는, 생리 활성 물질과 결합함으로써, 당해 생리 활성 물질의 수용성을 높일 수 있다. 또, 당쇄 부가 링커는, 바람직하게는, 당해 생리 활성 물질의 항원성을 저하시킬 수 있다.
또, 생리 활성 물질과 결합한 당쇄 부가 링커는, 그 구조에 의존하고, 특정의 온도 및 pH의 조건 하, 당해 생리 활성 물질을 일정한 시간 내에 유리시킬 수 있다. 또한, 이 유리된 생리 활성 물질은, 본래의 기능을 가지고 있어, 예를 들면, 생체 내에서 당쇄 부가 링커로부터 유리된 생리 활성 물질은, 본래의 기능을 발휘한다.
또, 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분과의 결합이, 에스테르 결합보다 티오에스테르 결합인 것이, 가수 분해 속도를 빠르게 하는 것이 가능하다. 또, 티오에스테르 결합 중, 티오알킬 구조를 갖는 당쇄 부가 링커보다도 티오아릴 구조를 갖는 당쇄 부가 링커가 보다 빠르게 가수 분해된다.
당업자는, 당쇄 부가 링커 부분의 구조를 적절히 변경함으로써 목적으로 하는 생리 활성 물질 방출 시간을 갖는 당쇄 부가 링커를 설계할 수 있다.
본 발명에서, 생리 활성 물질은, 그 구조의 일부가 변화함으로써(수식되는 것으로), 당쇄 부가 링커 부분과 결합할 수 있다. 그러나, 한번 당쇄 부가 링커 부분이 절단되면, 생리 활성 물질이 유리된다. 당해 유리된 생리 활성 물질의 구조는, 당쇄 부가 링커 부분에 결합하기 전(수식되기 전)의 화합물 구조와 같은 것이 바람직하다. 본 명세서에서는, 당쇄 부가 링커에 결합하고 있지 않는 생리 활성 물질을 「무수식의 생리 활성 물질」이라고 칭한다. 무수식의 생리 활성 물질은, 생리 활성 물질 그 자체가 본래 갖는 약물 동태학적, 면역원성적, 독물학적 또는 약리학적 특성을 갖는 것이 바람직하지만, 그 특성이 개변, 수식 등이 되어 있어도 좋다. 본 발명의 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」은, 소정의 조건 하에서, 당쇄 부가 링커 부분이 절단됨으로써, 무수식의 생리 활성 물질을 방출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 당쇄 부가 링커는, 결합하는 파트너가 되는 생리 활성 물질이 갖는 약물 동태학적, 면역원성적, 독물학적 또는 약리학적 특성등에 악영향을 주지 않는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「생리 활성 물질」은, 한정은 되지 않지만, 생체의 생리 활동에 직접적 또는 간접적으로, 어떠한 작용·영향을 가져오는 물질을 의미한다. 생리 활성 물질은, in vitro 및 in vivo에서의 사용을 의도해도 좋다. 당해 생리 활성 물질은, 그것 자신이 생체 내에서 기능을 발휘하지 않는 것이어도 좋다. 당해 생리 활성 물질은, 어느 형태에서, 약물과 같은 뜻으로 사용되어도 좋다. 당해 생리 활성 물질에는, 백신 또는 의약품으로서 유용한 것뿐만 아니라, 생체의 생리 활동에 직접적으로 작용·영향을 가져오지 않는 물질, 예를 들면 진단약이 포함되어도 좋다. 또, 당해 생리 활성 물질에는, 천연 유래의 것뿐만 아니라, 그 일부를 결실, 수식 또는 치환시킨 것(유도체라고도 한다)도 포함되어도 좋다. 또한, 인공적으로 합성한 물질(예를 들면, 재조합 DNA 테크놀로지 등의 생물학적 어프로치, 또는 펩티드 고상 합성법 등의 화학적 합성 어프로치에 의해 제조한 물질), 또는 천연 유래의 물질의 일부와 인공적으로 합성한 물질의 일부를 융합한 것도 포함되어도 좋다. 따라서, 본 발명에 있어서의 생리 활성 물질에는, 예를 들면, GFP(녹색 형광 단백질) 등의 리포터 단백질 또는 플루오레세인 등의 형광 색소가 융합한 물질도 포함된다.
본 발명에 있어서의 생리 활성 물질은, 적어도 1개의 카르복시기를 가진다. 본 발명에 있어서의 생리 활성 물질은, 생리 활성 물질이 갖는 적어도 1개의 카르복시기에서, 당쇄 부가 링커와 결합한다. 또, 본 발명에 있어서의 생리 활성 물질은, 적어도 1개의 카르복시기를 갖는, 저분자 생리 활성 물질 또는 생체 고분자인 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「생체 고분자」는, 생리 활성 물질 중, 고분자의 유기 화합물인 것을 의미해도 좋다. 한편, 「저분자 생리 활성 물질」은, 생리 활성 물질 중, 저분자의 유기 화합물인 것을 의미해도 좋다. 생체 고분자는, 예를 들면, 단백질, 핵산 또는 다당류 등의 고분자 화합물 또는 그 일부이어도 좋지만, 인공적으로 합성한 것이어도 좋다. 또, 저분자 생리 활성 물질은, 예를 들면, 생체 내에서, 생체 고분자와 상호 작용할 수 있는 것이면 좋고, 인공적으로 합성한 것이어도 좋다. 그러나, 본 명세서에서는, 생체 고분자와 저분자 생리 활성 물질은, 경우에 따라 같은 것을 가리켜도 좋다.
본 발명에 있어서의 생체 고분자는, 일 형태에서, 적어도 1개의 카르복시기를 갖는, 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 펩티드 핵산이거나, 혹은, 그 구조의 일부에, 상기 「단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 펩티드 핵산」을 포함하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 단백질 또는 폴리펩티드에 유래하는 부분을 「펩티드 부분」이라고도 한다.
본 명세서에 있어서, 「단백질」은, 복수의 아미노산이 아미드 결합에 의해 결합하고 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 기존 단백질, 신규 단백질, 또는 그러한 개변체를 포함한다. 본 명세서에 있어서, 「개변체」란, 단백질을 천연 또는 인공적으로 부분적으로 개변한 화합물이다. 그러한 개변으로서 예를 들면, 단백질의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기의, 알킬화, 아실화(예를 들면 아세틸화), 아미드화(예를 들면, 단백질의 C 말단의 아미드화), 카르복실화, 에스테르 형성, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 히드록시화, 탈수 축합 또는 표지 성분의 결합 등을 들 수 있다. 혹은, 당해 개변체는, 기존 단백질 또는 신규 단백질 구조의 일부를 결실, 치환 또는 융합시킨 것 등을 들 수 있다. 생리 활성 물질로서의 생체 고분자가 단백질인 경우, 단백질은, 한정은 되지 않지만, 예를 들면, 고상 합성, 액상 합성, 세포에 의한 합성, 천연에 존재하는 것을 분리 추출하는 방법 등, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 합성해도 좋다.
본 명세서에 있어서, 「폴리펩티드」및 「펩티드」는, 원칙적으로 단백질과 동일 의미로 사용된다. 단, 폴리펩티드 및 펩티드는, 단백질 구조의 일부인 경우나, 고차 구조를 취하지 않는 비교적 짧은 아미노산쇄를 가리키기 위해서 사용되어도 좋다(단백질의 단편). 본 발명에 있어서의 폴리펩티드 또는 펩티드에는, 예를 들면, 아미노산이 2개 결합한 디펩티드, 아미노산이 3개 결합한 트리펩티드, 아미노산이 4개 결합한 테트라펩티드, 아미노산이 통상 10개 이하의 수로 결합한 올리고펩티드도 포함되어도 좋다.
본 명세서에 있어서의 「폴리뉴클레오티드」에는, 한정은 되지 않지만, 2 내지 2000 뉴클레오티드 잔기를 갖는, 1본쇄 또는 2본쇄의 DNA 또는 RNA; 1본쇄 또는 2본쇄의 siRNA, miRNA 또는 핵산(DNA 혹은 RNA) 앱타머, 또는, 그것들이 화학적으로 수식된 화합물이 포함된다. 그러한 수식에는, 한정은 되지 않지만, 당해 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부에 대하여 전하, 분극성(polarizability), 수소 결합, 정전 상호 작용, 또는 유동성(fluxionality)을 더욱 부여하는, 다른 화학기에 의한 수식을 들 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 20 염기쌍 또는 그것 미만의 사이즈를 갖는 올리고 뉴클레오티드이어도 좋다.
본 명세서에 있어서, 「펩티드 핵산」은, 한정은 되지 않지만, 핵산(DNA 또는 RNA)의 당인산 골격을, N-(2-아미노에틸)글리신 골격으로 변환한 수식 핵산을 의미한다. 당해 펩티드 핵산은, 당업자에게 공지된 방법으로 다시 수식되어도 좋다.
본 발명에 있어서의 생체 고분자에는, 이하에 한정은 되지 않지만, 일 형태에서, 예를 들면, 부신 피질 자극 호르몬(ACTH), 옥시토신, 아데노신데아미나아제, 아갈시다아제, α1 안티트립신, α1 프로테아제 인히비터, 알테플라아제, 아밀린, 시믈린, 아니스트레플라아제, 안크로드세린프로테아제, 안티트롬빈 III, 안티트립신, 아프로티닌, 아스파라기나아제, 아토시반, 비팔린(Biphalin), 비발리루딘, 골형성 단백질, 췌장 트립신 인히비터, 카드헤린 단편, 칼시토닌(예를 들면, 연어 유래), 콜라게나아제, 보체 C1 에스테라아제 인히비터, 코노톡신, 사이토카인 수용체 단편, DN 아제, 디놀핀 A, 엔돌핀, 엔푸버티드, 엔케팔린, 에리트로포이에틴, 엑센딘(엑센딘 3 또는 엑센딘 4 등), 제VII 인자, 제VIIa 인자, 제VIII 인자, 제VIIIa 인자, 제IX인자, 피브리놀리신, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 성장 호르몬 방출 펩티드 2(GHRP-2), 난포 자극 호르몬, 그라미시딘, 그렐린, 데스아실형 그렐린, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 갈락토시다아제, 글루카곤, 글루카곤양 펩티드(엑세나티드, GLP-1, GLP-2 등), 글루코세레브로시다아제, 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 열쇼크 단백질(HSP), 포스폴리파아제 활성화 단백질(PLAP), 융모성 성선 자극 호르몬, 헤모글로빈, 히루딘, 인간 세린 프로테아제 인히비터, 히알루로니다아제, 이듀로니다아제, 면역 글로블린(IgG Fc 영역 등), 인터류킨(1α, 1β, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18 또는 21 등), IL-1 수용체 안타고니스트(IL-1 ra), 인슐린, 인슐린양 성장 인자, 인슐린양 성장 인자 결합 단백질(IGFBP), 인터페론(α(α2 a, α2 b, α2 c 등), β(β1 a, β1 b), γ(γ1a, γ1b), λ, ω, ε, κ 등), 세포 내 접착 분자, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), P-셀렉틴 당단백질 리간드(PSGL), 트랜스포밍 증식 인자, 락타아제, 렙틴, 류프롤리드, 황체 형성 호르몬, 나트륨 이뇨 펩티드(ANP, BNP 또는 CNP 또는 그러한 단편), 뉴로펩티드 Y, 판크레리파아제, 췌장 폴리펩티드, 파파인, 부갑상선 호르몬(파라설몬 등), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 펩신, 펩티드 YY, 혈소판 활성화 인자 아세틸히드로라아제(PAF-AH), 프롤락틴, 프로테인 A, 프로테인 C, 티모신 α1, 옥트레오티드, 셀렉틴, 세르모렐린, 가용성 종양 괴사 인자 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD), 소마트로핀(성장 호르몬), 소마토프림, 소마토스타틴, 스트렙토키나아제, 수크라아제, 테를리프레신, 파상풍 독소 C 프래그먼트, 틸락타아제, 트롬빈, 티모신, 갑상선 자극 호르몬, 티로트로핀, 종양 괴사 인자(TNF), TNF 수용체, 조직 플라스미노겐 액티베이터(tPA), 갑상선 호르몬(칼시토닌 등), 유로딜라틴, 요산 옥시다아제, 우로키나아제, 하프텐, 항원 등을 이용한 백신(암 백신, HIV 항원, A형 간염 백신, B형 간염 백신(HBs 항원 등), 인플루엔자 백신, 관절염 백신 등), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 케메린(Chemerin)), HER2 단백질(인간 상피 증식 인자 수용체), 상피 성장 인자(EGF), 혈관 작동성 장관 펩티드, 바소프레신, 지코노티드, 렉틴, 콜린에스테라아제, 아밀라아제, 또는 펩신, 또는 그러한 개변체 혹은 그러한 단편이 포함된다.
본 발명에 있어서의 저분자 생리 활성 물질에는, 일 실시 형태에서, 예를 들면, 적어도 1개의 카르복시기를 갖는, 중추 신경계 활성제, 항감염제, 항알레르기제, 면역 조절제, 항비만제, 항응혈제, 항당뇨병제, 항암제, 항신생물제, 항균제, 항진균류제, 진통제, 피임약, 항염증제, 스테로이드제, 혈관 확장제, 혈관 수축제 또는 심혈관 작동약을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 저분자 생리 활성 물질에는, 이하로 한정은 되지 않지만, 한 형태로서 예를 들면, 아카보즈, 알라프로클레이트, 알렌드로네이트, 아만타딘, 아미카신, 아미넵틴, 아미노글루테티미드, 아미술프리드, 암로디핀, 아모토살렌, 아목사핀, 암옥시실린, 암페타민, 암포테리신 B, 암피실린, 안프레나빌, 암리논, 아닐레리딘, 아프라클로니딘, 아프라마이신, 아르티카인, 아테놀롤, 아토목세틴, 아비자폰, 바클로펜, 베나제프릴, 벤세라지드, 벤조카인, 베탁솔롤, 블레오마이신, 브롬페낙, 브로파로민, 카르베딜롤, 카틴, 카티논, 카르부타미드, 세팔렉신, 클리나플록사신, 시프로플록사신, 데페록사민, 델라비르딘, 데시프라민, 다우노루비신, 덱스메틸페니데이트, 덱스메틸페니데이트, 디아페닐술폰, 디조실핀, 도파민, 도부타민, 도르졸라미드, 독소루비신, 둘록세틴, 에플로니틴, 에날라프릴, 에피네프린, 에피루비신, 에르골린, 에르타페넴, 에스몰롤, 에녹사신, 에탐부톨, 펜플루라민, 페놀도팜, 페노테롤, 핀골리모드, 플레카이니드, 플루복사민, 포스암프레나빌, 프로바트립탄, 프로세미드, 플로옥세틴, 가바펜틴, 가티플록사신, 제미플록사신, 겐타마이신, 그레파플록사신, 헥실카인, 히드랄라진, 히드로클로로티아지드, 이코푼기펜, 이다루비신, 이미퀴모드, 이소프로테레놀, 이스라디핀, 카나마이신 A, 케타민, 라베탈롤, 라미부딘, 레보부놀롤, 레보도파, 레보티록신, 리시노프릴, 로메플록사신, 로라카르베프, 마프로틸린, 메플로퀸, 멜팔란, 메만틴, 메로페넴, 메살라진, 메스칼린, 메틸도파, 메틸렌디옥시메탐페타민, 메토프롤롤, 밀나시프란, 미톡산트론, 목시플록사신, 노르에피네프린, 노르플록사신, 노르트리프틸린, 네오마이신 B, 니스타틴, 오셀타미빌, 파미드론산, 파록세틴, 파주플록사신, 페메트렉시드, 페린도프릴, 펜메트라진, 페넬진, 프레가발린, 프로카인, 슈도에페드린, 프로트립틸린, 레복세틴, 리토드린, 사바루비신, 살부타몰, 세로토닌, 세르트랄린, 시타글립틴, 소탈롤, 스펙티노마이신, 술파디아진, 술파메라진, 세르트랄린, 스펙티노마이신, 술팔렌, 술파메톡사졸, 타크린, 탐술로신, 테르부탈린, 티몰롤, 티로피반, 토브라마이신, 토카이니드, 토수플록사신, 트란돌라프릴, 트라넥삼산, 트라닐시프로민, 트리메트렉사이트, 트로바플록사신, 발라시클로비르, 발간시클로비르, 반코마이신, 바이오마이신, 빌록사진, 잘시타빈, 페니실린, 세팔로스포린, 스트렙토마이신, 데스토마이신, 카수가마이신, 타이로신, 에리트로마이신, 올레안도마이신, 스피라마이신, 린코마이신, 콜리스틴, 바시트라신, 살리노마이신, 모넨신, 라사로시드, 테트라시클린, 클로람페니콜, 버지니아마이신, 술파디메톡신, 옥솔린산, 피로미드산, 디푸라존, 제아랄레논, 디옥시니발레놀, 파툴린, 푸모니신, 오크라톡신, 테트로도톡신, 오카다산, 삭시토신 또는 고니아톡신 등이 포함된다.
본 발명의 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질이 결합한 화합물의 제조는, 상기 방법에 의해 합성·단리한 당쇄 부가 링커를, 생리 활성 물질에 결합시킴으로써 행할 수 있다.
당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질과의 결합은, 당쇄 부가 링커의 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)와 생리 활성 물질의 적어도 1개의 카르복시기가 축합 반응하고, 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합을 개재하여 결합한다.
이 축합 반응의 조건은, 당업자가 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 축합 반응의 축합제로는, PyBOP, DMAP, HCTU 등을 사용할 수 있다. 또, 축합 반응의 용매로서 예를 들면, DMF, DMSO, 디클로로메탄 등을 사용할 수 있다. 축합 반응의 반응은, 예를 들면, 아미노산 측쇄가 보호된 펩티드와 티올기를 갖는 당쇄 부가 링커를 DMF에 용해시키고, PyBOP 및 DIPEA를 첨가함으로써 행할 수 있다. 이 때, 생리 활성 물질이 펩티드인 경우, 펩티드의 C 말단 아미노산의 이성화를 억제할 수 있다는 점에서, 저온(-15℃ 내지 -30℃)에서 반응을 행하는 것이 바람직하다.
또, 생리 활성 물질이 펩티드인 경우에는, 당해 펩티드의 측쇄는 보호기에 의해 보호되어 있는 것이 바람직하다. 펩티드의 측쇄를 보호하고 있는 보호기는, 당쇄 부가 링커와 당해 펩티드와의 결합 후에 탈보호할 수 있다. 펩티드의 측쇄를 보호하는 보호기는, 당업자에게 주지된 보호기를 사용할 수 있고, 예를 들면, 상술한 고상 합성에 사용하는 아미노산의 보호기를 사용할 수 있다. 또, 펩티드로의 보호기의 도입이나 탈보호도, 당업자는 적절히 행할 수 있다.
또, 생리 활성 물질이, 폴리펩티드 등인 경우에는, 고상 합성 중의 수지 상에 결합하고 있는 당쇄 부가 링커에, 생리 활성 물질을 구성하는 아미노산 등을 순차, 직접 결합시킴으로써, 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물을 제조할 수 있다. 수지 상에서 고상 합성법에 의해 생리 활성 물질 부분을 합성하는 반응 조건은, 당업자가 적절히 설정할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은, 상술한 어떠한 제조 방법에 의해 얻을 수 있는(obtainable), 화합물 또는 그 염을 제공하는 것이 바람직하다. 얻을 수 있는 화합물 또는 그 염이란, 상술한 어떠한 제조 방법에 의해 제조되는 것으로는 한정되지 않고, 다른 제조 방법에 따라 제조되는 것도 대상이 된다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은, 상술한 어떠한 제조 방법에 의해 얻어진(obtained), 화합물 또는 그 염을 제공하는 것이 바람직하다.
바람직한 일 형태에 있어서, 본 발명의 당쇄 부가 링커를 사용함으로써, 생리 활성 물질이 난용성인지 여부에 관계없이, 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」으로서, 생리 활성 물질을 수용액, 또는, 수용액으로부터 조제한 에멀젼 중에 용이하게 용해할 수 있다. 당해 용해 후, 당해 당쇄 부가 링커 부분이 절단됨으로써, 무수식의 생리 활성 물질이 방출 가능하다.
본 발명에 있어서의 당쇄 부가 링커 부분은, 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」으로부터, 가수 분해 반응에 의해 절단된다. 또, 바람직한 일 형태에 있어서, 당해 당쇄 부가 링커 부분은, 그 분자 내 촉매 작용에 의해서, 당해 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」으로부터 자기 가수 분해에 의해 절단 가능하다. 그러나, 당해 절단은, 예를 들면, 생체 내에 존재하는 효소에 의한 절단(예를 들면, 에스테르 결합을 절단하는 효소인 에스테라아제를 들 수 있다.) 등의 생물학적 절단을 배제하는 것을 의도하고 있지 않다.
바람직한 일 실시 형태에서, 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 수용액 또는 에멀젼 중에 용해 후, pH 및/또는 온도에 의존하여, 당쇄 부가 링커 부분의 절단이 빨라지는 특징을 가지고 있다(pH 및/또는 온도 의존적 절단). 본 발명의 화합물 또는 그 염 및 당쇄 부가 링커는, 예를 들면, 저온(예를 들면 -80℃ 내지 4℃), 저pH(예를 들면 pH 1 내지 pH 4)에서 보존하여도 좋다. 또, 당쇄 부가 링커 부분에 생리 활성 물질을 결합시켜 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」을 조제하는 공정은, 예를 들면, 저온(예를 들면 0℃ 내지 25℃), 저pH(예를 들면 pH 1 내지 pH 7)에서 행하여도 좋다. 당쇄 부가 아미노산의 N 말단의 아미노기를 C1 내지 C16 아실기, Fmoc기 또는 Alloc기 등으로 보호함으로써, 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」및 당쇄 부가 링커를 안정화시켜도 좋다.
바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 그 염은, 생리적 조건에 가까운 온도 및 pH(예를 들면, 포유 동물의 생체 내의 생리적 환경 또는 그것에 가까운 환경, 예를 들면 35℃ 내지 43℃, pH6.8 내지 7.8 등)에서 사용해도 좋다.
바람직한 일 실시 형태에서, 본 발명의 화합물 또는 그 염을 사용함으로써, 생리 활성 물질을, 수용액, 또는 수용액으로부터 조제하는 에멀젼에 효율적으로 용해시킬 수 있다. 따라서, 바람직한 일 형태에 있어서, 본 발명의 화합물 또는 그 염을 사용함으로써, 수용성이 낮은(난용성의) 생리 활성 물질조차도, 필터 멸균을 행할 수 있다. 또한, 바람직한 다른 형태에서, 본 발명의 화합물 또는 그 염을 사용함으로써, 수용성이 낮은 생리 활성 물질조차도, 생체에 투여하는 것이 가능하다.
바람직한 다른 실시 형태에서, 본 발명의 화합물 또는 그 염을 사용함으로써, 수용성이 높은 생리 활성 물질조차도, 한층 고효율로 수용액, 또는 수용액으로부터 조제하는 에멀젼에 용해할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 유리하게는, 고가의 생리 활성 물질을 포함하는 제재 조제 또는 제재 투여 과정에 있어서의, 물질의 불용성 등으로부터 생길 수 있는 「손실」을 저하시킨다.
또, 바람직한 다른 일 실시 형태에서, 용매 중의 반감기를 미리 알고 있는 본 발명의 당쇄 부가 링커를 적절히 선택함으로써, in vitro 환경 또는 in vivo 환경 중에 방출되는 무수식의 생리 활성 물질의 방출 시간, 타이밍을 제어하는 것이 가능해진다. 예를 들면, 생체 내에 투여 후에, 목적으로 하는 부위에서, 신속히 효과를 발휘시키고자 하는 생리 활성 물질의 송달에도 유리하다.
특히 바람직한 일 실시 형태에서, 본 발명의 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」은, 무수식의 생리 활성 물질과 비교하여, 향상된 수용성을 제공할 수 있다. 상기 향상된 수용성은, 몰 농도로, 2배 내지 1,000,000배인 것이 바람직하고, 10배 내지 1,000,000배인 것이 보다 바람직하고, 100배 내지 1,000,000배인 것이 더욱 바람직하고, 500배 내지 1,000,000배 또는 그 이상인 것이 한층 더 바람직하다. 당업자는, 생리 활성 물질의 용도와 목적에 따라, 필요한 수용성을 갖는 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」또는 당쇄 부가 링커를 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」또는 무수식의 생리 활성 물질의 용해도를 결정하기 위해서 필요한 몰 흡광 계수(비흡광도)는, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면, 아미노산 조성 분석 또는 질소 정량법 등의 방법에 의해 측정한 기존의 단백질 농도의 용액을 시료로 하여 자외 가시 분광 광도법(예를 들면, 280 nm 등의 자외 가시 영역에서의 파장)에 의해 결정해도 좋다.
또, 본 발명의 일실시의 형태로서 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 「조성물」은, 1종 이상의 본 발명의 화합물 또는 그 염에 첨가하고, 임의의 1종 이상의 다른 성분(활성 성분 또는 불활성 성분)을 포함한다. 본 발명의 조성물의 사용은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 앗세이계(예를 들면 in vitro 앗세이계 등)에 이용해도 좋다.
상기와 같이, 본 발명의 일 실시의 형태에서, 당쇄 부가 링커 부분의 당쇄의 구조를 균일하게 할 수 있다. 이 경우에, 당해 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 갖는 화합물 또는 그 염을 포함하는 조성물에 포함되는 당쇄 부가 링커 부분은, 당쇄 구조로 한정하지 않고, 당쇄 부가 링커 부분 전체의 구조도 균일한 것이 바람직하다. 당쇄 부가 링커 부분의 구조가 균일하다는 것은, 당해 조성물 중에 포함되는 당쇄 부가 링커 부분 끼리에서, 당쇄 및 링커 부분을 비교했을 경우에, 당쇄 부가 링커 부분 중의 당쇄 부가 부위, 당쇄를 구성하는 각 당의 종류, 당쇄의 결합 순서, 당 사이의 결합 양식, 링커 부분을 구성하는 구조가 동일한 것을 말한다. 구체적으로는, 조성물 중에 포함되는 당쇄 부가 링커 부분 사이에서, 적어도 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상에서 당쇄의 구조 및 링커 부분이 균일한 것을 말한다.
특히, 당쇄가 균일한 당쇄 부가 링커 부분을 포함하는 조성물 등은, 품질이 일정하고, 특히 의약품의 제조나, 앗세이 등의 분야에서 바람직하다. 균일한 당쇄의 비율이나 균일한 당쇄 부가 링커의 비율은, 예를 들면, HPLC, 캐필러리 전기 영동, NMR, 질량 분석 등을 이용한 방법에 따라 측정하는 것이 가능하다.
또, 본 발명의 「의약 조성물」은, 의약 용도에 적절한 조성물이며, 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 습기 부여제, 붕괴제, 표면 활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 이용하여, 통상의 의약 조성물의 형태로 제재화한 것이다. 이러한 의약 조성물로서는, 예를 들면, 한정은 되지 않지만, 정제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캡슐제, 좌제, 주사제 등을 들 수 있다. 의약 조성물이 대상으로 하는 의약 용도는, 생리 활성 물질 부분으로서 조성물 중에 함유되는 생리 활성 물질이 관여하는 질환, 질병을 대상으로하는 것이어도 좋다. 예를 들면, 생리 활성 물질이 GLP-1 또는 그 유도체인 경우, 대상으로 하는 의약 용도는, 당뇨병 등이어도 좋다. 다른 의약 용도에 대해서도, 각 생리 활성 물질이 관여하는 질환, 질병의 종류를 아울러 고려함으로써, 당업자는 동일하게 이해할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「약리학적으로 허용되는 담체」란, 특별히 제한되지 않는다. 약리학적으로 허용되는 담체를 배합함으로써, 본 발명의 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」의 흡수성이나 혈중 농도에 영향을 미쳐, 체내 동태의 변화를 가져와도 좋다.
특히 바람직하게는, 생리 활성 물질로서 항원을 이용했을 경우, 본 발명의 화합물 또는 그 염 및 그것을 포함하는 본 발명의 의약 조성물은, 백신으로서도 이용 가능하다. 바람직한 일 형태에 있어서, 예를 들면 난용성의 항원이어도, 본 발명의 화합물 또는 그 염으로서 수용액 또는 에멀젼 중에 용해시키는 것이 가능하고, 또, 생체 내에서, 당쇄 부가 링커 부분의 절단 후에, 무수식의 항원을 방출시키는 것이 가능하다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물 또는 그 염 및 당쇄 부가 링커는, 펩티드 백신 등의 여러가지 백신의 개발에 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「백신」(「면역원성 조성물」이라고도 한다)은, 동물에 접종했을 때에, 면역 응답을 일으킬 수 있는 물질을 의미한다. 백신은 항원을 포함하고 있는지, 또는 항원을 발현 가능하고, 이것에 의해 항원에 대한 면역 응답을 유도할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 백신으로서 이용했을 경우, 바이러스 감염, 세균 감염(패혈증 등), 전염병의 예방 또는 치료뿐만 아니라, 면역 응답에 관련할 수 있는 임의의 질환, 예를 들면 암, 자기 면역 질환(예를 들면, I형 당뇨병, 다발성 경화증, 관절 류머티즘 등)의 치료 등에도 사용하는 것이 가능하다.
「항원」이란, 1개 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 분자이며, 숙주의 면역계를 자극하여 항원 특이적인 면역 응답을 유도할 수 있는 것이면 어떠한 것이어 좋다. 면역 응답은, 체액성 면역 응답 및/또는 세포성 면역 응답이어도 좋다. 3개 내지 수 개(예를 들면 5개, 6개) 정도의 아미노산에서도 1개의 에피토프가 될 수 있지만, 통상, 단백질 중의 하나의 에피토프는, 7 내지 15 아미노산, 예를 들면 8, 9, 10, 12, 또는 14 아미노산을 포함하고 있다. 항원은, 일 형태에서, 펩티드 또는 에피토프인 것이 바람직하다. 항원을 암의 치료에 사용하는 경우, 이러한 펩티드는, 암펩티드라고도 한다.
또, 본 발명의 의약 조성물(백신으로서 사용하는 경우를 포함한다)을 생체에 투여하여도 좋다. 그 투여 방법으로서는 특별히 제한은 없고, 각종 제재 형태, 환자의 연령, 성별, 질환 상태, 그 밖의 조건에 따른 방법으로 투여된다. 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제 및 캡슐제의 경우의 투여 방법으로서는, 예를 들면, 경구 투여를 들 수 있다. 또, 주사제의 경우에는, 단독으로, 또는 포도당, 아미노산 등의 통상의 보조액과 혼합하여, 정맥 내, 근육 내, 피내, 피하 또는 복강 내에 투여할 수 있다. 좌제의 경우에는, 직장 내에 투여된다. 특히, 본 발명의 의약 조성물은, 백신으로서 이용했을 경우, 피하 주사, 근육 내 주사, 경구, 스텀프식, 피내 주사 등이어도 좋다.
본 발명의 의약 조성물(백신으로서 사용하는 경우를 포함한다)의 투여량은, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 그 밖의 조건에 따라 적절히 선택하면 좋다. 투여 회수는, 용법, 환자의 연령, 성별, 질환의 정도, 그 밖의 조건에 따라 적절히 선택하면 좋고, 예를 들면, 3회/1일, 2회/1일, 1회/1일, 또 그 혈중 안정성에 따라, 보다 빈도가 적은 투여 회수(예를 들면, 1회/주, 1회/월 등)도 선택할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 당쇄 링커 부분의 절단이 서서히 생김으로써, 생리 활성 물질에 서방성을 제공하여도 좋다. 혹은, 본 발명의 의약 조성물은, 당쇄 링커 부분의 절단이 신속히 생김으로써, 생리 활성물에 속효성을 제공하여 좋다.
또, 어느 일 형태에서, 본 발명은, 당쇄 부가 링커, 또는, 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」의, 생리 활성 물질이 대상으로 하는 질환, 질병의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한 사용에도 관한 것이다. 혹은, 다른 일 형태에서, 본 발명은, 당쇄 부가 링커, 또는, 「당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그 염」의, 생리 활성 물질이 대상으로 하는 질환, 질병의 치료 또는 예방 등을 위한 사용에도 관한 것이다. 예를 들면, 생리 활성 물질이 HER2 또는 그 유도체인 경우, 대상으로 하는 질병은, 암(예를 들면, 유방암) 등이어도 좋다. 다른 각 생리 활성 물질이 대상으로 하는 질환, 질병의 종류에 대해서도, 당업자는 동일하게 이해할 수 있다.
본 발명의 당쇄 부가 링커는, 생분해성의 성질을 갖는 당쇄를 부가하는 구성을 채용한 것으로서, PEG를 부가하는 구성에 비해, 생체로의 악영향이 경감된다. 그 결과, 의약 조성물로서 생체에 투여할 때에, 장기간의 투여가 기대된다.
본 명세서에 있어서의 수용액은, 용매인 물에 물질(예를 들면, 아세트산)이 용해된 액체이면 어느 것이어도 좋고, 당업자에게 공지 또는 신규한 모든 수용액을 대상으로 한다.
본 명세서에 있어서의 에멀젼은, 한정되는 것은 아니지만, 수용액으로부터 조제한 것이면 어느 것이어도 좋다. 에멀젼으로서는, 한정되는 것은 아니지만, 수중 유적(O/W형) 에멀젼 또는 유중 수적(W/O형) 에멀젼이어도 좋다. 수용액 중에 분산 유화시키는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 이용해도 좋다.
본 발명의 화합물 또는 그 염, 또는 본 발명의 의약 조성물을 투여(적용)하는 「대상」이란, 한정은 되지 않지만, 동물(인간, 비인간 포유 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 개, 고양이, 토끼, 소, 말, 양, 염소, 돼지 등) 또는 비포유 동물(예를 들면, 어류, 파충류, 양서류 또는 조류)), 식물, 곤충, 세균, 또는 그것들 유래의 세포(배양 세포를 포함한다), 조직 또는 기관 등을 포함한다. 혹은, 당해 「대상」은, 인공적인 환경(예를 들면 in vitro 반응계 등)이어도 좋다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서의 「대상」은 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 「형태」, 「실시 형태」(예를 들면, 「일 형태」, 「일 실시 형태」, 「다른 형태」)는, 본 발명의 바람직한 일 측면을 나타내는 것이고, 본 발명의 범위는, 소정의 형태로 한정되는 것으로서 해석되는 것을 의도하고 있지 않다. 또, 기술적으로 모순이 생기지 않는 한, 본 발명의 상술한 형태 및 실시 형태의 모든 조합이 가능하다는 것을 당업자는 당연하게 이해한다. 예를 들면, 기술적으로 모순이 생기지 않는 한, 치환기의 모든 조합의 형태가 개시되고 있는 것으로서 당업자는 이해한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는, 특정의 실시 형태를 설명하기 위해서 사용되는 것이며, 발명을 한정하려는 의도는 아니다.
또, 본 명세서에서 사용되는 「포함한다」라는 용어는, 문맥상 분명하게 다른 이해를 해야 하는 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것이며, 그 이외의 사항(부재, 스텝, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.
다른 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술 용어 및 과학 용어를 포함한다.)는, 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해서 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 여기에 사용되는 용어는, 다른 정의가 명시되어 있지 않은 한, 본 명세서 및 관련 기술 분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로서 해석되는 것이 당연하고, 이상화되거나 또는, 과도하게 형식적인 의미에서 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시 형태는 모식도를 참조하면서 설명되는 경우가 있는데, 모식도인 경우, 설명을 명확하게 하기 위해서, 과장되어 표현되고 있는 경우가 있다.
첫째의, 둘째의 등의 용어가 여러 가지 요소를 표현하기 위해서 사용되는데, 이러한 요소는 그러한 용어에 의해서 한정되어서는 안된다는 것이 이해된다. 이러한 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용되는 것이며, 예를 들면, 첫째의 요소를 둘째의 요소라고 기재하고, 마찬가지로 둘째의 요소는 첫째의 요소라고 기재하는 것은, 본 발명의 범위를 일탈하지 않고 가능하다.
이하에서, 본 발명을, 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러가지 형태에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재되는 실시예로 한정되는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
실시예
본 실시예에서 사용되는 약어의 일부를 이하에 설명한다:
Ac: 아세틸(기)
AcOH: 아세트산
Asn: 아스파라긴
Boc:tert-부틸옥시카르보닐기
BrAc: 브로모아세토아미드
Cys: 시스테인
DIC: 디이소프로필카르보디이미드
DIPEA:N, N-디이소프로필에틸아민
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DMF:N, N-디메틸포름아미드
DMSO: 디메틸술폭시드
DTT: 디티오트레이톨
ESI-MS: 일렉트로스프레이 이온화(ElectroSpray Ionization) 질량 분석
Fmoc(기): 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(기)
HCL: 염산
HCTU:O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N, N, N＇, N＇-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HMPB: 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시 부티르산
HMBA: 4-히드록시메틸 벤조산
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸
HPLC: 고속 액체 크로마토그래피
H2O: 물
MSNT: 1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(1-(Mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazole)
PBS: 인산 완충 생리 식염수
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐
SPPS: 펩티드 고상 합성
tBu:tert-부틸기
TFA: 트리플루오로 아세트산
Trt: 트리틸기
또, 하기 실시예에서, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질이 결합한 화합물을 콘쥬게이트라고 기재한다. 예를 들면, 링커 중의 시스테인에 아시알로 당쇄를 갖는 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질인 HER2의 일부(HER의 아미노산 서열 중의 8-16번째의 아미노산을 포함하는 부분)가 결합한 콘쥬게이트는, 당쇄 부가(Cys(asialo)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트라고 표기한다.
또한, HER2(8-16)는, HER(인간 상피 증식 인자 수용체:Human Epidermal Growth Factor Receptor) 패밀리의 하나인 HER2/neu 단백질의 아미노산 서열 중, 8 내지 16 아미노산 잔기에 상당하는 펩티드이다. 이 HER2(8-16)는, HLA(인간 백혈구 항원 분자:Human Leukocyte Antigen) 의 하나인 HLA-A24에 결합능을 가지며, HLA를 개재한 항원 제시에 의해 세포 상해성 T세포(CTL) 유도능을 나타내는, 종양 백신 후보 펩티드로서 동정된 펩티드 프래그먼트이다(Tanaka, H.,et al., Brit.J.Cancer,84(1),94-99,2001)。
(실시예 1-1:당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)의 합성)
[화학식 30]
Figure 112015060219176-pct00030
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 31]
Figure 112015060219176-pct00031
고상 합성용 컬럼에 Rink-Amide-PEGA 수지(100μmol)를 덜고, 디클로로메탄 및 DMF로 세정하였다. 세정 후, Fmoc-Cys(Trt)-OH(234 mg, 0.399 mmol), HCTU(157 mg, 0.380 mmol), 및 2,4,6-트리메틸피리딘(79.6μL, 0.600 mmol)을 포함하는 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 10분간 진탕하였다. 10분 후, DMF로 세정한 후, 이 축합 조작을 다시 한번 반복하였다. 2번째의 축합 조작 종료 후, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정하였다. 세정 후, DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리함으로써 Fmoc 보호기를 제거하고, Cys(Trt)가 결합한 수지 2를 얻었다. 수지 2를 DMF로 세정 후, 4-히드록시메틸 벤조산(61.1 mg, 0.402 mmol), HCTU(157.8 mg, 0.381 mmol), DIPEA(104.5μL, 0.600 mmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 진탕하였다. 1시간 후, DMF 및 디클로로메탄으로 세정하고, 수지 상에 HMBA-Cys(Trt)가 결합한 화합물 3을 얻었다.
고상 합성용 컬럼에, 화합물 3(100μmol)이 결합한 수지의 일부를 덜어, Fmoc-Leu-OH(176.7 mg, 0.500 mmol), MSNT(148.2 mg, 0.500 mmol), 및 N-메틸이미다졸(27.9μL, 0.350 mmol)을 포함하는 디클로로메탄(5.0 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 1시간 진탕하였다. 1시간 진탕 후, 디클로로메탄 및 DMF로 세정하였다. 세정 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리하여 제거함으로써, 수지 상에, Leu-HMBA-Cys(Trt) 4를 얻었다. DMF로 세정 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하고, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로, 수지 상에 화합물 5:Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(Trt)(서열 번호 1)를 합성하였다. 고상 합성법에 있어서의 축합 반응은, 축합제로서 HCTU, 염기로서 N-메틸모르폴린을 사용하여 DMF 중에서 행하였다.
화합물 5 상의 Fmoc 보호기를, DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후, TFA: 트리이소프로필실란: 에탄디티올: 물(=90:5:2.5:2.5)을 첨가하여 실온에서 3시간 진탕하였다. 여과액에 냉각한 에테르를 첨가하여 조 펩티드 6:Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(서열 번호 2)를 침전으로서 얻었다.
얻어진 조 펩티드 6(15.5 mg)을 50 mM DTT를 포함하는 DMSO-0.1 M 인산 완충액(pH7.4) 혼합 용액(9/1, v/v, 240μL)에 용해하고, 30 mM 아시알로 BrAc7이 용해된 DMSO-0.1 M 인산 완충액(pH7.4) 혼합 용액(9/1, v/v, 946μL)을 첨가하여, 실온에서 2시간 진탕하였다.
[화학식 32]
Figure 112015060219176-pct00032
반응 용액을 HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% TFA 물 B:0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=60:40→40:60(20분) 직선 농도 구배 용출]를 이용하고 정제하여, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1): Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(sugar chain added-linker:HMBA-Cys(아시알로)) (서열 번호 3)를 포함하는 획분을 얻었다.
이 획분을, HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% AcOH 물 B:0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=75:25→60:40(30분) 직선 농도 구배 용출]를 이용하고 다시 정제하여, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)(17.2 mg, 5.79μmol)를 얻었다.
ESI-MS calcd for C127H204N20O58S [M+2H]2+ 1485.7, [M+3H]3+ 990.8, [M+4H]4+ 743.3, found 1485.7, 990.8, 743.3.
(실시예 1-2:당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 합성)
[화학식 33 A]
Figure 112015060219176-pct00033
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 33 B]
Figure 112015060219176-pct00034
실시예 1-1에서 얻어진 조 펩티드 6(15.5 mg)을 50 mM DTT를 포함하는 DMSO-0.1 M 인산 완충액(pH7.4) 혼합 용액(9/1, v/v, 240μL)에 용해하였다. 이 혼합 용액에 대하여, 7.5 mM 디시알로 BrAc9를 포함하는 DMSO-0.1 M 인산 완충액(pH7.4) 혼합 용액(9/1, v/v, 3.8 mL)을 첨가하여, 실온에서 5시간 진탕하였다.
[화학식 34]
Figure 112015060219176-pct00035
반응 용액을 HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% TFA 물 B:0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=62:38→52:48(30분) 직선 농도 구배 용출]을 이용하고 정제하여, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8): Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(sugar chain added-linker:HMBA-Cys(디시알로)) (서열 번호 4)를 포함하는 획분을 얻었다.
이 획분을, HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% AcOH 물 B:0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=70:30→50:50(30분) 직선 농도 구배 용출]을 이용하고 다시 정제하여, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)(21.8 mg, 6.13μmol)를 얻었다.
ESI-MS calcd for C149H238N22O74S [M+2H]2+ 1776.8, [M+3H]3+ 1184.8, [M+4H]4+ 888.9, found 1776.8, 1184.8, 888.9.
(실시예 1-3:용해도 측정)
상기의 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)와 당쇄 부가 링커를 갖지 않는 무수식의 HER2-(8-16) 펩티드(화합물 10)(Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu)(서열 번호 5)에 대해서, 수용액으로의 용해도를 측정하였다.
[화학식 35]
Figure 112015060219176-pct00036
보다 구체적으로는, 대상으로 하는 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1), 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8), 또는 무수식의 HER2(8-16) 펩티드(화합물 10)를 마이크로 튜브에 4.5 mg정도씩 덜고, 물을 30μL 첨가하였다. 25℃에서 15분간 진탕한 후, 25℃, 16100×g으로 10분간 원심하였다. 원심 후, 마이크로 튜브의 상청 부분에 대하여, 280 nm의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 농도를 산출하여, 용해도를 구하였다. 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 280 nm에 있어서의 몰 흡광 계수는, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 또는 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8) 중의 펩티드쇄 부분의 280 nm의 흡광도를, 아미노산 분석으로 구한 농도로 나눔으로써 구하였다. 무수식의 펩티드의 280 nm에 있어서의 몰 흡광 계수 ε280은, 당업자에게 공지된 이하의 식을 이용하여 산출하였다.
[수학식 1]
Figure 112015060219176-pct00037
또한, nTrp은 트립토판 잔기의 수, nTyr은 티로신 잔기의 수, nSS는 디술피드 결합의 수를 나타낸다.
(참고 문헌:C. N. Pace et al., Prot. Sci., 1995, 4, 2411-2423).
그 결과, 당쇄 부가 링커가 결합하고 있지 않는 HER2(8-16) 펩티드의, 물로의 용해도는, 0.22 mg/mL(2.1×102μM))이었다. 이 때, 마이크로 튜브 중, HER2(8-16) 펩티드의 침전을 육안으로 확인할 수 있었다. 한편, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)의, 물로의 용해도는, 144 mg/mL 이상인 것을 확인하였다. 놀랍게도, 144 mg/mL의 농도에서조차도, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)의 침전은 확인할 수 없었다. 또, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의, 물로의 용해도는, 121 mg/mL 이상인 것을 확인하였다. 놀랍게도, 121 mg/mL의 농도에서조차도, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 침전은 확인할 수 없었다. 이러한 결과로부터, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 수용액으로의 용해도는, 무수식의 HER2(8-16) 펩티드(화합물 10)와 비교하여, 몰 농도로 하여 모두 190배 이상 용해도가 향상되는 것을 알 수 있었다(표 1A).
〔표 1A〕
당쇄 부가 링커-HER2(8-16) 콘쥬게이트의 물로의 용해도
Figure 112015060219176-pct00038
또, 상기 수용액으로의 용해도 측정과 동일한 방법에 의해, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)와 당쇄 부가 링커를 갖지 않는 무수식의 HER2-(8-16) 펩티드(화합물 3)에 대하여, 0.1% 아세트산(AcOH) 수용액으로의 용해도를 측정하였다.
그 결과, 당쇄 부가 링커가 결합하고 있지 않는 HER2(8-16) 펩티드의, 아세트산 수용액으로의 용해도는, 0.52 mg/mL(4.9×102μM))이었다. 이 때, 마이크로 튜브 중, HER2(8-16) 펩티드의 침전을 육안으로 확인할 수 있었다. 한편, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)의, 아세트산 수용액으로의 용해도는, 110 mg/mL 이상인 것을 확인하였다. 놀랍게도, 110 mg/mL의 농도에서조차도, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)의 침전은 확인할 수 없었다. 또, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의, 아세트산 수용액으로의 용해도는, 104 mg/mL 이상인 것을 확인하였다. 놀랍게도, 104 mg/mL의 농도에서조차도, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 침전은 확인할 수 없었다. 이러한 결과로부터, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 수용액으로의 용해도는, 무수식의 HER2(8-16) 펩티드(화합물 10)와 비교하여 몰 농도로 하여 모두 69배 이상 용해도가 향상되는 것을 알 수 있었다(표 1B).
〔표 1B〕
당쇄 부가 링커-HER2(8-16) 콘쥬게이트의 아세트산 수용액(0.1% AcOH)으로의 용해도
Figure 112015060219176-pct00039
(실시예 1-4:수용액 중에서의 가수 분해 거동의 추적)
실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 얻어진 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 가수 분해시의 거동을 추적하였다. 동결 건조한 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)에 대하여, 미리 반응 온도(25℃ 또는 37℃)로 한 완충 용액(아세트산 완충액(pH4.0) 또는 PBS(pH7.4)) 를 첨가함으로써, 가수 분해 반응을 개시하였다. 또, 반응 중의 온도는, 블록 인큐베이터를 이용하여 일정한 온도(25℃ 또는 37℃)가 되도록 유지하였다. 적당한 시간 간격으로, 일정한 양의 용액을 HPLC에 인젝트함으로써 가수 분해 반응을 추적하였다. 출발 물질에 상당하는 HPLC의 피크 면적으로부터 상대 출발 물질 농도를 구하였다. 인큐베이션 시간에 대하여, 출발 물질의 상대 농도를 플롯하였다. 그 결과, 직선상의 플롯이 얻어졌으므로, 가수 분해 반응이 일차 반응이라는 것이 나타났다. 또, 출발 물질의 소실 반감기 t1/2를, 식 t1/2=ln(2)/k(k는 직선 플롯의 기울기)로부터 산출하였다. 각 조건 하에 있어서의 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 반감기를, 표 2 및 표 3에 나타낸다.
〔표 2〕
당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)의 가수 분해 반감기
Figure 112015060219176-pct00040
〔표 3〕
당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 가수 분해 반감기
Figure 112015060219176-pct00041
당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)는 모두, 서서히 가수 분해되어 무수식의 HER2(8-16) 펩티드(화합물 10)를 생성하는 것이 확인되었다. 또, 표 2 및 표 3에 나타내는 봐와 같이, pH가 높을수록, 가수 분해 속도가 빠르다는 것이 확인된(Entry(엔트리) 1과 3의 비교(25℃), Entry 2와 4의 비교(37℃)) 。 또, pH7.4의 조건하에 있어서는, 온도가 높을수록, 가수 분해가 빠르다는 것이 확인되었다(Entry 3과 4의 비교). 또한, pH4.0, 37℃의 조건 하에서는, 화합물 1 및 화합물 8이 모두 매우 안정하고, 48시간의 추적 후에 생성된 가수 분해물 10은 출발 물질의 1% 이하로 거의 가수 분해되지 않은 것을 알 수 있었다. 또, pH7.4, 25℃의 조건 하에 있어서는, 아시알로 당쇄 부가 링커를 갖는 펩티드보다도, 디시알로 당쇄 부가 링커를 갖는 펩티드가, 가수 분해 속도가 빨랐다. 한편, pH7.4, 37℃의 조건에서는, 아시알로 당쇄 부가 링커를 갖는 펩티드보다, 디시알로 당쇄 부가 링커를 갖는 펩티드가, 가수 분해 속도가 느린 결과가 되었다. 이와 같이, 부가하는 당쇄의 종류를 선택함으로써도, 특정한 조건 하에 있어서의 바람직한 가수 분해 속도를 조정할 수 있다.
(실시예 2:고상 상에서의 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)의 합성)
[화학식 36A]
Figure 112015060219176-pct00042
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 36B]
Figure 112015060219176-pct00043
고상 합성용 컬럼에 Rink-Amide-PEGA 수지(100μmol)를 덜어, 디클로로메탄 및 DMF로 세정하였다. 세정 후, Fmoc-Cys(tButhio)-OH(173.4 mg, 0.402 mmol), HCTU(157 mg, 0.380 mmol), 및 2,4,6-트리메틸피리딘(79.6μL, 0.600 mmol)을 포함하는 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 10분간 진탕하였다. 10분 후, 수지를 DMF로 세정하였다. 세정 후, DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리함으로써 Fmoc 보호기를 제거하여, 수지 상에 Cys(StBu(tButhio))가 결합된 화합물 11을 얻었다. 수지 상의 화합물 11을 DMF로 세정 후, 4-히드록시메틸 벤조산(60.8 mg, 0.400 mmol), HCTU(157 mg, 0.380 mmol), DIPEA(104.5μL, 0.600 mmol)를 포함하는 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 진탕하였다. 10분 후, DMF 및 디클로로메탄으로 세정하여, 수지 상에 HMBA-Cys(StBu)가 결합한 화합물 12를 얻었다. 수지 상의 화합물 12에 Fmoc-Leu-OH(176.3 mg, 0.499 mmol), MSNT(149.0 mg, 0.503 mmol), 및 N-메틸이미다졸(27.9μL, 0.350 mmol)을 포함하는 디클로로메탄(5.0 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 3시간 진탕하였다. 디클로로메탄 및 DMF로 세정 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리하여 제거함으로써, 수지 상에 Leu-HMBA-Cys(StBu)가 결합한 화합물 13을 얻었다. DMF로 세정 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하고, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법에서 보호된 펩티드가 결합한 수지 상에 아미노산 측쇄가 보호된 화합물 14:Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(StBu)(서열 번호 6)를 합성하였다. 축합 반응은, 축합제로서 HCTU, 염기로서 N-메틸모르폴린을 사용하여 DMF 중에서 행하였다.
화합물 14가 결합한 수지의 일부(10μmol)에, 0.2 M 탄산 수소 암모늄 수용액(500μL) 및 0.1 M DTT가 용해된 DMF 용액(1 mL)을 첨가하여, 실온에서 진탕하였다. 6시간 후, DMF로 세정함으로써, 수지 상에 화합물 15:Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-HMBA-Cys(서열 번호 7)를 얻었다. 화합물 15에, 아시알로 BrAc7(52.8 mg, 30.0μmol) 및 DIPEA(10.5μL, 60.3μmol)가 용해된 DMSO-DMF 혼합 용액(1/1, v/v, 500μL)을 첨가하여, 실온에서 12시간 진탕함으로써, 수지 상에 화합물 16:Fmoc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(sugar chain added-linker:HMBA-Cys(아시알로)) (서열 번호 8)를 얻었다. DMF로 세정 후, Fmoc 보호기를, DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후, 트리플루오로 아세트산: 트리이소프로필실란: 에탄디티올: 물(=90:5:2.5:2.5)를 첨가하여 실온에서 3시간 진탕하였다. 여과액에 냉각한 에테르를 첨가하여 조 펩티드 1을 침전으로서 얻었다. 얻어진 조 펩티드 1(15.5 mg)을 HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% TFA 물 B:0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=65:35→53.4:46. 6(24분) 직선 농도 구배 용출]을 이용하고 정제하여, 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1): Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(sugar chain added-linker:HMBA-Cys(아시알로)) (5.0 mg, 1.7μmol)를 얻었다.
(실시예 3-1:티오알킬 구조를 갖는, 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의 합성)
티올기를 갖는 당쇄 부가 링커(화합물 17)의 합성
[화학식 37]
Figure 112015060219176-pct00044
인산 완충액(0.1 M, pH6.72, 4.0 mL)에 용해한 아시알로 BrAc7(131.7 mg, 75μmol)을, 인산 완충액(0.1 M, pH6.72, 4.0 mL)에 용해한 에탄디티올(63μL, 750μmol, 10 eq)에 천천히 적하하고 첨가하여 실온에서 40분 반응시켰다. HPLC에 의해 반응의 종료를 확인한 후, HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% TFA 물 B:0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=99:1(0-1분 )→80:20(30분)] 를 이용하고 정제하여, 티올기를 갖는 당쇄 부가 링커인 목적의 화합물 17(118.3 mg, 수율89%)을 얻었다.
ESI-MS calcd for C66H111N5O46S2: [M+2H]2+ 888.36, found 888.34.
티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의 합성
[화학식 38A]
Figure 112015060219176-pct00045
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 38B]
Figure 112015060219176-pct00046
Prelude(상표) 펩티드 합성기로 수지 상에 합성한 아미노산 측쇄가 보호된 펩티드를, AcOH-TFE(1/1, v/v) 용액으로 처리함으로써 수지로부터 잘라냈다. 여과액을 감압 하에서 농축 건고함으로써 아미노산 측쇄가 보호된 펩티드(화합물 18): Boc-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu(서열 번호 9)를 얻었다.
얻어진 펩티드(화합물 18)(63.5 mg, 41.8μmol), 티올기를 갖는 당쇄 부가 링커(화합물 17)(41.5 mg, 23.4μmol), PyBOP(121.8 mg, 234μmol)를 DMF(1 mL)에 용해시켜, 질소 분위기하, -15℃로 냉각하였다. 이 용액에, DIPEA(40.0μL, 40.7μmol)를 첨가하여 -15℃에서 교반하였다. 3시간 후, TFA(100μL)를 첨가하여 감압 하에서 농축 건고하였다. 얻어진 잔사에, TFA-H2O(95/5, v/v) 용액(1 mL)을 첨가하여 3시간 교반하였다. 용액에 에테르를 첨가하여 조 펩티드를 침전으로서 얻었다. 얻어진 조 펩티드를 HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% TFA 물 B:0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=65:35→35:55(30분) 직선 농도 구배 용출]을 이용하고 정제하여, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20): Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(sugar chain added-linker: SCH2CH2SCH2CONH (아시알로)) (서열 번호 10)(6.9 mg, 수율 10.5%)를 얻었다.
ESI-MS calcd for C118H196N18O55S2: [M+2H]2+ 1406.52, [M+3H]3+ 938.01, found 1406.10, 937.73.
(실시예 3-2:티오아릴 구조를 갖는 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 합성)
[화학식 39 A]
Figure 112015060219176-pct00047
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 39 B]
Figure 112015060219176-pct00048
디클로로메탄 중, 4-머캅토페닐 아세트산(화합물 22)(1.0 g, 6.1 mmol)에 염화 트리틸(2.0 g, 7.1 mmol)을 작용시킴으로써, 화합물 23(2.8 g)을 얻었다. Rink-Amide-PEGA 수지 상에, 2잔기의 아미노산으로 이루어지는 당펩티드(Asn(아시알로)-Gly)가 결합한 화합물 24(62μmol)에 대하여, 화합물 23(320μmol), HOBt(50.7 mg, 375μmol), 및 DIC(54μL, 522μmol)을 포함하는 DMF(2.0 mL) 용액을 첨가하여, 실온에서 1시간 진탕시킴으로써, 수지 상에 화합물 25를 얻었다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후, TFA: 트리이소프로필실란: 물(=92.5:5:2.5) 용액을 첨가하여 실온에서 3시간 진탕 후, 여과액을 감압 하 농축함으로써 당쇄 부가 링커인 화합물 26(19.6 mg, 10μmol, 수율16%)을 얻었다.
ESI-MS calcd for C76H120N8O49S: [M+2H]2+ 981.34, found 981.37.
당쇄 부가 링커인 화합물 26(8.6 mg, 4.4μmol), 아미노산 측쇄가 보호된 펩티드(화합물 18)(35.0 mg, 23.0μmol), 및 PyBOP(22.8 mg, 43.8μmol)을 DMF(0.4 mL)에 용해시켜, 질소 분위기 하, -15℃로 냉각하였다. 이 용액에, DIPEA(7.5μL, 76.4μmol)를 첨가하여 -5℃ 내지 -10℃에서 교반하였다. 2.5시간 후, TFA(50μL)를 첨가하여 감압 하에서 농축 건고하였다. 얻어진 잔사에, TFA-H2O(95/5, v/v) 용액(1 mL)을 첨가하여 3시간 교반하였다. 용액에 에테르를 첨가하여 조 펩티드를 침전으로서 얻었다.
얻어진 조 펩티드를 HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% TFA 물 B:0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=65:35→35:55(30분) 직선 농도 구배 용출]을 이용하고 정제하여, 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21): Arg-Trp-Gly-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-(sugar chain added-linker:4-thiobenzoic acid-Asn(아시알로)-Gly)(서열 번호 11)(2.3 mg, 수율 17.5%)를 얻었다.
ESI-MS calcd for C128H205N21O58S1: [M+2H]2+ 1500.09, [M+3H]3+ 1000.39, found 1499.67, 1000.08.
(실시예 3-3:용해도 측정)
당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 7) 대신에, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20) 및 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1-3과 동일하게 하여, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20) 및 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 물로의 용해도를 측정하였다. 또한, 비교로서 무수식의 HER2-(8-16) 펩티드(화합물 10)의 용해도를 측정하였다. 그 결과, 당쇄 부가 링커가 결합하고 있지 않는 HER2(8-16) 펩티드의, 물로의 용해도는, 0.22 mg/mL(2.1×102μM))이었다. 이 때, 마이크로 튜브 중, HER2(8-16) 펩티드의 침전을 육안으로 확인할 수 있었다. 한편, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의, 물로의 용해도는, 77.4 mg/mL 이상인 것을 확인하였다. 놀랍게도, 77.4 mg/mL의 농도에서조차도, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의 침전은 확인할 수 없었다. 또, 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의, 물로의 용해도는, 76.7 mg/mL 이상인 것을 확인하였다. 놀랍게도, 76.7 mg/mL의 농도에서조차도, 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8)의 침전은 확인할 수 없었다. 이러한 결과로부터, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20) 및 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 수용액으로의 용해도는, 무수식의 HER2-(8-16) 펩티드(화합물 10)와 비교하여, 몰 농도로 하여 모두 100배 이상 용해도가 향상되는 것을 알 수 있었다.
〔표 4〕
티오알킬형 또는 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트의 수용액으로의 용해도
Figure 112015060219176-pct00049
(실시예 3-4:수용액 중에서의 가수 분해 거동의 추적)
실시예 3-1 및 실시예 3-2에서 얻어진 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20) 및 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 가수 분해 시의 거동을 추적하였다. 구체적으로는, 동결 건조한 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8) 대신에, 동결 건조한 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20) 및 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)를 이용하여 반응 온도를 4℃, 25℃, 또는 37℃으로 한 것 이외는, 실시예 1-4와 동일하게 하여, 가수 분해의 거동을 추적하였다.
또한, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)에 대하여 가수 분해 시험을 하여, HPLC 분석을 행했더니, 무수식의 HER2(8-16) 펩티드(화합물 10)가 생성된 것을 확인하였다. 하기 화학식은, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의 가수 분해 반응을 나타내고, 화합물 27은 화합물 20의 가수 분해 반응에 의해서 생기는, 당쇄 부가 링커를 나타낸다.
[화학식 40A]
Figure 112015060219176-pct00050
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 40B]
Figure 112015060219176-pct00051
실시예 1-4와 동일하게 하여, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)에 관하여, 인큐베이션 시간에 대한 출발 물질의 상대 농도를 플롯한 그래프를 도 1A 및 도 1B에 나타낸다. 또, 각 조건하에 있어서의 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의 반감기를, 표 5에 나타낸다.
〔표 5〕
티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)의 가수 분해 반감기
Figure 112015060219176-pct00052
표 5에 나타내는 바와 같이, PBS 중(pH7.4)에 있어서의 가수 분해 반감기는, 25℃에서는 5일인데 반해, 37℃에서는 32시간이었다. 이 결과로부터, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)는, 온도가 높을수록 가수 분해 속도가 향상되는 것을 알 수 있었다(Entry(엔트리) 1과 2의 비교(pH 4.0), Entry 3, 4 및 5의 비교(pH 7.4)). 또, 37℃에 있어서의 pH의 영향을 관찰했더니, 아세트산 완충액(pH4.0) 중에서의 가수 분해 반감기는 24일이므로, pH가 높을수록 가수 분해가 촉진되는 것이 확인되었다(Entry 2와 5의 비교). 이와 같이, 에스테르 결합을 갖는 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1, 8)와 마찬가지로, 티오에스테르 결합을 갖는 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)도 온도 및/또는 pH가 높을수록, 가수 분해 속도가 빠른 것이 확인되었다.
또, 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)를 가수 분해하여, HPLC 분석을 행했더니, 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)와 마찬가지로, 무수식의 HER2-(8-16) 펩티드(화합물 10)가 생성된 것을 확인하였다. 하기 화학식은, 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 가수 분해 반응을 나타내고, 화합물 28은 화합물 21의 가수 분해 반응에 의해서 생기는 당쇄 부가 링커를 나타낸다.
[화학식 41A]
Figure 112015060219176-pct00053
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 41B]
Figure 112015060219176-pct00054
또, 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)에 대해서도, 인큐베이션 시간에 대하여, 출발 물질의 상대 농도를 플롯한 그래프를 도 2A 및 도 2B에 나타낸다. 또, 각 조건하에 있어서의 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 반감기를, 표 6에 나타낸다.
〔표 6〕
티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)의 가수 분해 반감기
Figure 112015060219176-pct00055
또, 표 6에 나타내는 바와 같이, PBS 중(pH7.4)에 있어서의 가수 분해 반감기는, 4℃에서는 66시간, 25℃에서는 25시간인데 반하여, 37℃에서는 4.0시간이었다. 이 결과로부터, 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)는, 온도가 높을수록 가수 분해 속도가 향상되는 것을 알 수 있었다(Entry(엔트리) 1과 2의 비교(pH 4.0), Entry 3, 4 및 5의 비교(pH 7.4)). 또, 37℃에 있어서의 pH의 영향을 관찰했더니, 아세트산 완충액(pH4.0) 중에서의 가수 분해 반감기는 10일이므로, pH가 높을수록 가수 분해가 촉진되는 것이 확인되었다(Entry 2와 5의 비교). 이와 같이, 에스테르 결합을 갖는 당쇄 부가 링커 -HER2-(8-16) 콘쥬게이트와 마찬가지로, 티오에스테르 결합을 갖는 당쇄 부가 링커 -HER2-(8-16) 콘쥬게이트도 온도 및/또는 pH가 높을수록, 가수 분해 속도가 빠른 것이 확인되었다.
또한, 아시알로 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트인 화합물 20, 21, 및 1의 37℃, PBS 중(pH7.4)에 있어서의 가수 분해 속도는, 티오에스테르 결합을 갖는 티오아릴형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 21)(4.0시간) >티오에스테르 결합을 갖는 티오알킬형 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 20)(32시간) >에스테르 결합을 갖는 당쇄 부가 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1)(78시간)의 순서였다(도 3). 이 결과로부터, 에스테르형보다 티오에스테르형이, 가수 분해 속도가 빠른 것이 나타났다. 또, 티오에스테르형 중에서도, 티오알킬형보다 티오아릴형이 빠르게 가수 분해되는 것을 알 수 있었다.
(실시예 4-1.당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)의 합성)
이 케메린 9는, G단백질 공액형 리셉터인 ChemR23 아고니스트 활성을 가지므로, 면역 질환, 염증성 질환, 당뇨병의 치료 및/또는 예방제로서의 가능성을 가지고 있다. 그러나, 케메린 9는, 생체 내에서 단백 분해 효소에 의한 분해를 받아 매우 불안정하다는 것이 알려져 있다(특허 문헌 JP2010-229093). 그래서, 이 케메린 9에, 본 발명의 일 실시 형태인 당쇄 부가 링커를 도입하여, 제조된 콘쥬게이트의 가수 분해 반감기의 평가를 행하였다. 우선, 에스테르 결합을 개재하여, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커와 케메린 9(서열 번호 12:YFPGQFAFS, 특허 문헌 US2003096299에 개시되는, 서열 번호 31-36의 아미노산 서열에 상당)가 결합한 콘쥬게이트를 합성하였다.
[화학식 42]
Figure 112015060219176-pct00056
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 43]
Figure 112015060219176-pct00057
고상 합성용 컬럼에 Rink-Amide-PEGA 수지(100μmol)를 덜고, 디클로로메탄 및 DMF로 세정하였다. 세정 후, Fmoc-Cys(Trt)-OH(234 mg, 0.399 mmol), HCTU(157 mg, 0.380 mmol), 및 2,4,6-트리메틸피리딘(79.6μL, 0.600 mmol)을 포함하는 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 10분간 진탕하였다. 10분 후, DMF로 세정한 후, 이 축합 조작을 다시 한번 반복하였다. 2번째의 축합 조작 종료 후, 수지를 DMF 및 디클로로메탄으로 세정하였다. 세정 후, DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리함으로써 Fmoc 보호기를 제거하고, 수지 상에 Cys(Trt)가 결합한 화합물 2를 얻었다. 수지 상의 화합물 2를 DMF로 세정 후, 4-히드록시메틸 벤조산(61.1 mg, 0.402 mmol), HCTU(157.8 mg, 0.381 mmol), DIPEA(104.5μL, 0.600 mmol)의 DMF(2.5 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 진탕하였다. 1시간 후, DMF 및 디클로로메탄으로 세정하여, 수지 상에, HMBA-Cys(Trt)가 결합한 화합물 3을 얻었다.
얻어진 화합물 3이 결합하고 있는 수지의 일부(50μmol)에, Fmoc-Ser(tBu)-OH(96.9 mg, 0.253 mmol), MSNT(74.1 mg, 0.250 mmol), 및 N-메틸이미다졸(14.0μL, 0.177 mmol)을 포함하는 디클로로메탄(2.5 mL) 용액을 첨가하여 실온에서 1시간 진탕하였다. 1시간 진탕 후, 디클로로메탄 및 DMF로 세정하였다. 세정 후, Fmoc 보호기를 DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리하여 제거함으로써, 수지 상에 Ser(tBu)-HMBA-Cys(Trt)가 결합한 화합물 30을 얻었다. DMF로 세정 후, Prelude(상표) 펩티드 합성기를 이용하고, Fmoc법에 의한 펩티드 고상 합성법으로 수지 상에 아미노산 측쇄가 보호된 펩티드가 결합한 화합물 31:Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Pro-Gly-Gln(Trt)-Phe-Ala-Phe-Ser(tBu)-HMBA-Cys(Trt)(서열 번호 13)를 합성하였다. 고상 합성법에 있어서의 축합 반응은, 축합제로서 HCTU, 염기로서 N-메틸모르폴린을 사용하여 DMF 중에서 행하였다.
화합물 31상의 Fmoc 보호기를, DMF 중의 20%의 피페리진으로 처리함으로써 제거하였다. DMF 및 디클로로메탄으로 세정 후, TFA: 트리이소프로필실란: 에탄디티올: 물(=90:5:2.5:2.5)을 첨가하여 실온에서 3시간 진탕하였다. 여과액에 냉각한 에테르를 첨가하여 조 펩티드 32:Tyr-Phe-Pro-Gly-Gln-Phe-Ala-Phe-Ser-HMBA-Cys(서열 번호 14)를 침전으로서 얻었다.
얻어진 조 펩티드 32(14.2 mg), 디시알로 BrAc9(41.6 mg, 17.7μmol), 및 TCEP(16.0 mg, 55.8μmol)을 7 M구아니딘 염산염을 포함하는 0.2 M 인산 완충액(pH6. 8, 1.15 mL)에 용해하고, 실온에서 반응시켰다. 3시간 후, 반응 용액을 HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ20 x250mm, 유속:7.0 mL/분, 용리액 A:0.1% AcOH 물 B:0.09% AcOH/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=70:30→55:45(10분) 직선 농도 구배 용출]을 이용하고 정제하여, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29): Tyr-Phe-Pro-Gly-Gln-Phe-Ala-Phe-Ser-(sugar chain added-linker:HMBA-Cys(디시알로)) (서열 번호 15)(19.0 mg, 5.33μmol)를 얻었다.
ESI-MS calcd for C151H217N19O77S [M+3H]3+ 1187.8, [M+4H]4+ 891.1, [M+5H]5+ 713.1, found 1187.8, 891.1, 713.1.
(실시예 4-2:수용액 중에서의 가수 분해 거동의 추적)
실시예 4-1에서 얻어진 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)의 가수 분해 시의 거동을 추적하였다. 구체적으로는, 동결 건조한 당쇄 부가(Cys(아시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 1) 및 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커 -HER2(8-16) 콘쥬게이트(화합물 8) 대신에, 동결 건조한 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)를 이용하고, 완충 용액으로서 아세트산 완충액(pH4.0), PBS(pH7.4), 붕산 완충액(pH9.0)을 사용한 것 이외에는, 실시예 1-4와 동일하게 하여, 가수 분해의 거동을 추적하였다.
당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)를 가수 분해하고, HPLC 분석을 행했더니, 케메린 9의 아미노산 서열을 갖는 무수식의 케메린 9의 펩티드: Tyr-Phe-Pro-Gly-Gln-Phe-Ala-Phe-Ser(화합물 33)가 생성된 것을 확인하였다. 하기 화학식은, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)의 가수 분해 반응을 나타낸다.
[화학식 44 A]
Figure 112015060219176-pct00058
식 중, R은 이하의 화학식을 나타낸다.
[화학식 44 B]
Figure 112015060219176-pct00059
실시예 1-4와 동일하게 하여, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)에 대하여, 인큐베이션 시간에 대한 출발 물질의 상대 농도를 플롯한 그래프를 도 4에 나타낸다. 또, 각 조건 하에 있어서의 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)의 반감기를, 표 7에 나타낸다.
〔표 7〕
당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29) 완충액 중에서의 가수 분해 반감기
Figure 112015060219176-pct00060
표 7에 나타내는 바와 같이, 아세트산 완충액(0.1 M, pH4.0) 중, 37℃의 조건 하에서는, 49시간의 추적 후에 생성된 가수 분해물(화합물 33)은 출발 물질(화합물 29)의 1% 이하로 거의 가수 분해되지 않은 것을 알 수 있었다(또한, 당쇄 구조 중의 비환원 말단에 존재하는 시알산의 탈리가 관찰되었다. 탈시알산체의 함량은, 가수 분해의 거동 시험의 개시 전후에서, 4.7%에서 8.7%로 증가하였다). 한편, PBS 중(pH7.4) 및 붕산 완충액 중(pH9.0)에서는 가수 분해 반응이 진행하여, 케메린 9의 아미노산 서열을 갖는 무수식의 펩티드(화합물 33)가 얻어지는 것을 알 수 있었다. 얻어진 곡선으로부터 구해진 반감기는, PBS 중, 37℃에서 45.0시간(1.9일)이었다. 또, 붕산 완충 용액(0.1 M, pH9.0) 중 37℃에서 가수 분해 거동을 추적한 결과, 반감기는 0.83시간(50분)이었다.
또, 50 mM 수산화 나트륨 수용액에 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)를 용해시켰더니, 2분만에 완전하게 소실되고, 케메린 9의 아미노산 서열을 갖는 무수식의 펩티드(화합물 33)가 생성되었다. 문헌에서의 보고와 같이, 알칼리성 조건에서는, 가수 분해가 매우 빠르다는 것이 확인되었다.
또, 당쇄 부가(Cys(디시알로)형) 링커-케메린 9 콘쥬게이트(화합물 29)는 다른 화합물과 마찬가지로, pH를 올림으로써 가수 분해 속도가 향상되는 것이 확인되었다(Entry1, 2, 및 3). 또, 동일한 pH의 경우, 온도가 높을수록 가수 분해가 촉진되는 것이 확인되었다(Entry3 및 4).
가수 분해의 거동 시험 후, 반응액의 HPLC[컬럼:SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5μm), φ4.6 x250mm, 유속:0.7 mL/분, 용리액 A:0.1% TFA 물 용리액 B:0.09% TFA/10% 물/90% 아세토니트릴, 그라디언트 A:B=95:5→50:50(20분) 직선 농도 구배 용출]분석을 행하였다. 그 결과, 유지 시간 10.2분만에 당쇄 부가 링커 부분(화합물 34)의 피크가 확인되었다.
화합물 34의 ESI-MS: (m/z) calcd for C97H153N9O65S[M+2H]2+ 1258.93, [M+3H]3+ 839.62, found 1258.98, 839.65.
이러한 결과로부터, 본 발명의 당쇄 부가 링커가 결합한 콘쥬게이트는, 투여 전에는 실온에서 저pH의 용액으로 조제함으로써 화합물의 가수 분해는 일어나지 않고, 투여 후는 생체 조건 하에서 가수 분해되어 펩티드 본래의 활성이 발휘된다고 기대할 수 있다.
<110> GLYTECH, INC. <120> SUGAR CHAIN-ATTACHED LINKER, COMPOUND CONTAINING SUGAR CHAIN-ATTACHED LINKER AND PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE OR SALT THEREOF, AND METHOD FOR PRODUCING SAME <130> IPA150554-JP <150> JP2012-263752 <151> 2012/11/30 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc group <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Pbf group <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Boc group <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys(Trt) type linker moiety bonding to Resin <400> 1 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys type linker moiety <400> 2 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys(asialo) type linker moiety <400> 3 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys(disialo) type linker moiety <400> 4 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chemically synthesized <400> 5 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc group <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Pbf group <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Boc group <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys(StBu) type linker moiety bonding to Resin <400> 6 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc group <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Pbf group <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Boc group <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys type linker moiety bonding to Resin <400> 7 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys(asialo) type linker moiety bonding to Resin <400> 8 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Boc group <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Pbf group <220> <221> BINDING <222> (2)..(2) <223> Boc group <400> 9 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> SCH2CH2SCH2CONH(asialo) type linker moiety <400> 10 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> 4-thiobenzoic acid-Asn(asialo)-Gly type linker moiety <400> 11 Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> Fmoc group <220> <221> BINDING <222> (1)..(1) <223> tBu group <220> <221> BINDING <222> (5)..(5) <223> Trt group <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> tBu group <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys(Trt) type linker moiety bonding to Resin <400> 13 Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys type linker moiety <400> 14 Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> BINDING <222> (9)..(9) <223> HMBA-Cys(disialo) type linker moiety <400> 15 Tyr Phe Pro Gly Gln Phe Ala Phe Ser 1 5

Claims (23)

  1. 카르복시기를 갖는 생리 활성 물질과의 결합을 위한 당쇄 부가 링커로서,
    상기 당쇄 부가 링커는, 하기 식 (A)로 표시되고,
    X-R1-Y-R2 (A)
    [식 (A) 중,
    X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고, 여기에서 상기 탈리기는 수소 원자, 및 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 프랑슘, 은의 1가 양이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    R1은, C5 내지 C16 아릴 또는 -CH2CH2SCH2-를 의미하고,
    Y는, -CO-를 의미하고,
    R2는, NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn 혹은 당쇄 부가 Cys의 C 말단에 아미노산이 부가된 것을 의미하고,
    상기 NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Cys에서 당쇄는, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산, 이들의 복합체 및 유도체로부터 선택되는 단당류 및 다당류; 분해된 다당; 당 단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질로부터 분해 또는 유도된 당쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    상기 유도체는, 당쇄를 구성하는 당이 카르복시기, 아미노기, 아세틸화된 아미노기, 아미노기와 카르복시기 모두, 황산기 또는 인산기를 갖는, 또는 데옥시화되어 있는 것이다],
    상기 당쇄 부가 링커는, 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)에 있어서의 탈리기가 이탈함으로써, 상기 생리 활성 물질의 카르복시기와 결합할 수 있는,
    당쇄 부가 링커.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R2의 NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Cys에서 당쇄는, 4개 내지 32개의 당으로 이루어지는,
    당쇄 부가 링커.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R2의 NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Cys에서 당쇄는, 2분기형 복합형 당쇄, 3분기형 복합형 당쇄, 또는 4분기형 복합형 당쇄인,
    당쇄 부가 링커.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 당쇄가,
    하기로 표시되는 디시알로 당쇄
    Figure 112020038241813-pct00069
    ,
    하기로 표시되는 모노시알로 당쇄
    Figure 112020038241813-pct00070
    또는
    Figure 112020038241813-pct00071
    ,
    하기로 표시되는 아시알로 당쇄
    Figure 112020038241813-pct00072
    ,
    하기로 표시되는 di-GlcNAc 당쇄
    Figure 112020038241813-pct00073
    , 및
    하기로 표시되는 디만노오스 당쇄
    Figure 112020038241813-pct00074

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 2분기형 복합형 당쇄인,
    당쇄 부가 링커.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 R2의 NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Cys에서 당쇄가, 하기 식으로 표시되는 당쇄인, 당쇄 부가 링커:
    Figure 112020038241813-pct00061

    식 중, R10 및 R11은, 동일하거나 상이하고,
    Figure 112020038241813-pct00062

    를 나타내고, Ac는 아세틸기를 나타낸다.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Cys에서 당쇄는, 아미노산과 링커를 통하지 않고 결합하는,
    당쇄 부가 링커.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 당쇄 부가 링커로부터 유래하는 당쇄 부가 링커 부분(moiety)과 생리 활성 물질 부분(moiety)을 포함하는 화합물 또는 그의 염으로서,
    상기 생리 활성 물질은, 카르복시기를 가지는 단백질 또는 폴리펩티드이고,
    상기 당쇄 부가 링커 부분은, 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)에 있어서의 탈리기가 이탈함으로써, 상기 생리 활성 물질 부분의 카르복시기와 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합을 형성하여, 상기 생리 활성 물질 부분과 결합하는,
    화합물 또는 그의 염.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서,
    무수식의 생리 활성 물질과 비교하여, 향상된 수용성을 갖는,
    화합물 또는 그의 염.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 향상된 수용성이, 몰 농도로 상기 무수식의 생리 활성 물질의 수용성의 10 내지 1,000,000배인,
    화합물 또는 그의 염.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 당쇄 부가 링커 부분의 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)와 상기 생리 활성 물질 부분의 카르복시기와의 사이에 형성된 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합이, pH, 온도, 또는 pH와 온도에 의존하여 절단되는,
    화합물 또는 그의 염.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그의 염의 제조 방법으로서,
    상기 당쇄 부가 링커는, 하기 식 (A)로 표시되고,
    X-R1-Y-R2 (A)
    [식 (A) 중,
    X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고, 여기에서 상기 탈리기는 수소 원자, 및 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 프랑슘, 은의 1가 양이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    R1은, C5 내지 C16 아릴 또는 -CH2CH2SCH2-를 의미하고,
    Y는, -CO-를 의미하고,
    R2는, NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 당쇄 부가 Cys, 또는 당쇄 부가 Asn 혹은 당쇄 부가 Cys의 C 말단에 아미노산이 부가된 것을 의미하고,
    상기 NH-당쇄, 당쇄 부가 Asn, 또는 당쇄 부가 Cys에서 당쇄는, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산, 이들의 복합체 및 유도체로부터 선택되는 단당류 및 다당류; 분해된 다당; 당 단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질로부터 분해 또는 유도된 당쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    상기 유도체는, 당쇄를 구성하는 당이 카르복시기, 아미노기, 아세틸화된 아미노기, 아미노기와 카르복시기 모두, 황산기 또는 인산기를 갖는, 또는 데옥시화되어 있는 것이다],
    상기 생리 활성 물질은, 카르복시기를 가지는 단백질 또는 폴리펩티드이고,
    상기 방법은,
    (a) 상기 당쇄 부가 링커의 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)와, 상기 생리 활성 물질의 카르복시기와의 사이에서, 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합이 형성되도록 축합 반응을 수행하는 단계를 포함하는,
    제조 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 축합 반응의 단계는, 상기 당쇄 부가 링커가 고상 합성용의 수지에 결합한 상태에서 수행되는(단, 상기 당쇄 부가 링커가, 당쇄 부가 아미노산 또는 당쇄 부가 폴리펩티드를 가질 때에 한한다),
    제조 방법.
  18. 당쇄 부가 링커 부분과 생리 활성 물질 부분을 포함하는 화합물 또는 그의 염의 제조 방법으로서,
    상기 생리 활성 물질은, 카르복시기를 가지는 단백질 또는 폴리펩티드이고,
    상기 방법은,
    (a) 수지에, 하기 식 (B)로 표시되는 링커를 결합시키는 단계로서,
    상기 링커는, 하기 식 (B)로 표시되고,
    X-R1-Y-R2 (B)
    [식 (B) 중,
    X는, 탈리기를 갖는 산소 원자(O) 또는 탈리기를 갖는 황 원자(S)를 의미하고, 여기에서 상기 탈리기는 수소 원자, 및 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 프랑슘, 은의 1가 양이온으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    R1은, C5 내지 C16 아릴 또는 -CH2CH2SCH2-를 의미하고,
    Y는, -CO-를 의미하고,
    R2는, 아미노산을 의미한다],
    상기 링커에서 R2로 표시되는 아미노산의 카르복시기와 상기 수지를 결합시키는 단계,
    (b) 상기 수지에 결합한 상기 링커와 상기 생리 활성 물질을 결합시키는 단계로서, 상기 링커는, 상기 산소 원자(O) 또는 황 원자(S)에 있어서의 탈리기가 이탈함으로써, 상기 생리 활성 물질의 카르복시기와 에스테르 결합 또는 티오에스테르 결합을 형성하여, 상기 생리 활성 물질과 결합하는 단계, 및
    (c) 상기 링커의 R2의 아미노산의 측쇄에, 당쇄를 부가하는 단계
    [상기 당쇄는, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 크실로오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 시알산, 이들의 복합체 및 유도체로부터 선택되는 단당류 및 다당류; 분해된 다당; 당 단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 당지질로부터 분해 또는 유도된 당쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    상기 유도체는, 당쇄를 구성하는 당이 카르복시기, 아미노기, 아세틸화된 아미노기, 아미노기와 카르복시기 모두, 황산기 또는 인산기를 갖는, 또는 데옥시화되어 있는 것이다]
    를 포함하는, 제조 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 기재된 제조 방법에 의해 얻을 수 있는, 화합물 또는 그의 염.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
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