CN113121718B - 一种迷果芹多糖psgp-2及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种迷果芹多糖PSGP‑2及其制备方法与应用，该迷果芹多糖PSGP‑2由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成。通过乙醇对迷果芹进行提取，木瓜蛋白酶溶液脱除蛋白和杂质小分子，采用DEAE‑Cellulose 52和Sephadex G‑100柱层分析法进行洗脱，得到迷果芹多糖PSGP‑2。迷果芹多糖PSGP‑2可以抑制肿瘤细胞的增殖，发挥直接抗肿瘤作用，或者，与阿霉素联合用药具有协同抗肿瘤作用，且对正常细胞无杀伤作用，具有减少化疗药物的用量，降低化疗药物的不良反应的优点，可供癌症治疗的药物使用。迷果芹多糖PSGP‑2具有较好的降血脂活性。PSGP‑2可作为抗肿瘤剂和降血脂剂应用于功能食品药品中，为新型的天然药物产品研发提供理论支持，开发中药材的使用价值。

Description

一种迷果芹多糖PSGP-2及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种迷果芹多糖PSGP-2及其制备方法与应用，属于生物医药领域。

背景技术

迷果芹（Sphallerocarpusgracilics（Bess.）K.－Pol）是伞形科（Umbellferae）迷果芹属（SphallerocarpusBess.Ex DC.）单种野生植物。其肉质根性状呈长纺锤形或圆锥形，表面淡黄灰色，有明显的纵皱及横长突起的皮孔样疤痕；顶端圆钝且有残基，四周有黑褐色，似鳞片状的叶鞘基环绕，其下有致密的环状横纹。其根质硬，易折断，断面乳白色，具胡萝卜香气，味淡，微甜。迷果芹的肉质根比较发达，在秋季能够积累大量多糖，营养较为丰富。

多糖作为生命体必须的营养成分，不仅涉及人体内的各种生命活动，同时还能储存能量、支持结构并能防御外界对生命体的攻击。多糖不仅作为重要的生命体物质组成部分，而且它还具有着抗肿瘤，抗氧化等多种活性作用，且对正常细胞无杀伤作用。

目前，肿瘤已成为威胁人类健康的重要疾病。然而，使用化疗药物治疗肿瘤疾病虽然能杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增长，但对正常细胞的损害也大，易引发多种不良反应，且长时间服用容易产生耐药性。

联合用药已具有悠久的历史，在传统中医药方里，多味中药的共同使用就是联合用药的表现。在现代医学中，将天然产物与化疗药物联合使用治疗肿瘤疾病已具有较好的进展。例如：将紫杉醇与阿帕替尼联合治疗，可对晚期胃癌患者起到良好的治疗效果；长春碱和神经酰胺联合能够协同促进肝癌和结直肠癌的凋亡等。

多糖可以结合胆汁酸并且增加粪便排泄，从而降低人体胆固醇，排泄有毒代谢物和次级胆汁酸可以降低患癌症的风险。肝脏中的胆汁酸主要以胆汁盐的方式存在，主要为甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠，肠道内胆酸盐与多糖结合后可直接排泄出体外，并能够减少脂质的乳化吸收，由此体现其降血脂作用。

CN93105147.9公开了迷果芹饮品，但该方法未对迷果芹多糖进行报道。目前也未见有关迷果芹纯化多糖PSGP-2在抗肿瘤药物中的应用及其制备方法研究报道。该发明首次研究了一种迷果芹纯化多糖PSGP-2在降血脂和抗肿瘤药物中的应用及其制备方法，可以为迷果芹多糖的进一步开发提供一定的理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种水法提取的具有直接抗肿瘤活性，协同抗肿瘤活性以及降血脂活性的迷果芹多糖。以下为本发明具体技术方案：

本发明所述的一种迷果芹多糖PSGP-2，所述迷果芹多糖PSGP-2由鼠李糖2.463%、阿拉伯糖9.301%、甘露糖40.019%、葡萄糖19.435%、半乳糖28.782%组成。所述迷果芹多糖PSGP-2的平均相对分子量为31623Da。

本发明所述的迷果芹多糖PSGP-2的制备方法，包含以下步骤：

第一步，迷果芹粗多糖的提取：将迷果芹粉碎，粉碎后的迷果芹用乙醇萃取进行脱脂处理，过滤，晾干，得到固体药材，用水对固体药材进行多次萃取，过滤，将滤液合并，使用水提醇沉法获得迷果芹粗多糖；

第二步，迷果芹粗多糖脱蛋白和杂质小分子：将第一步中获得的迷果芹粗多糖用水溶解，加入木瓜蛋白酶溶液，水浴反应，离心，过滤，用Savege试剂法脱蛋白，取上层溶液减压旋蒸，透析，定期换水，冷冻干燥，得粗糖聚物SGP-W；

第三步，迷果芹多糖PSGP-2的分离纯化：将第二步得到的粗糖聚物SGP-W用水溶解，用DEAE-Cellulose 52 柱层分析法进行洗脱，洗脱液真空浓缩，透析，冷冻干燥，得到GP-2，将GP-2用水溶解，用Sephadex G-100柱层分析法进行洗脱，洗脱液真空浓缩，透析，冷冻干燥，得到迷果芹多糖PSGP-2。

进一步地，在所述的第一步中，将迷果芹粉碎成1-2cm，粉碎后的迷果芹与乙醇的固液比为1:4（重量：体积），水与固体药材的质量比1:10，萃取次数为2次，萃取时间为3 h。

进一步地，在所述的第二步中，果芹粗多糖与水的质量比为1:10，木瓜蛋白酶溶液的浓度为5%，木瓜蛋白酶溶液与溶解后果芹粗多糖水溶液的体积比为1:5，水浴反应的温度67℃，水浴反应的时间为3.5 h，

进一步地，在所述的第三步中，粗糖聚物SGP-W与水的质量比为1:15，在DEAE-Cellulose 52 柱层分析法中，采用水和NaCl溶液进行梯度洗脱；在Sephadex G-100柱层分析法中，采用水进行洗脱。

进一步地，所述NaCl溶液的浓度为0.1M、0.3M、0.5M。

本发明所述的迷果芹多糖PSGP-2在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为胃癌、卵巢癌、膀胱癌、鼻咽癌和乳腺癌。

进一步地，所述的迷果芹多糖PSGP-2单独用于制备抗肿瘤药物；或者，迷果芹多糖PSGP-2与阿霉素联合使用，用于制备抗肿瘤药物。所述的迷果芹多糖PSGP-2与抗肿瘤药物在肿瘤治疗中具有协同作用，迷果芹多糖PSGP-2与阿霉素联合制备抑制4T1肿瘤细胞增长的药物。

本发明中的迷果芹多糖PSGP-2在制备降血脂食品中的应用，迷果芹多糖PSGP-2具有良好的胆酸盐结合能力，具有较好的降血脂作用。

本发明的有益效果为：

本发明与现有技术相比，具有以下显著性优点：本发明的迷果芹多糖SGP-2具有良好的抗肿瘤活性，特别是协同抗肿瘤活性。迷果芹多糖PSGP-2为天然提取物，对正常细胞无毒，具有良好的安全性。本发明中的迷果芹多糖PSGP-2与Doxorubicin联用可抑制4T1肿瘤细胞的增长，提高肿瘤抑制率，抑制率大于单独Doxorubicin用药的抑制率，具有减少化疗药物的用量，降低化疗药物的不良反应的优点，可供癌症治疗的药物使用。本发明中的迷果芹多糖PSGP-2具有良好的胆酸盐结合能力，具有较好的降血脂作用。本发明所得迷果芹多糖PSGP-2为纯品。

附图说明

图1为迷果芹多糖GP-2的DEAE洗脱曲线图。

图2为迷果芹多糖PSGP-2的Sephadex-G100洗脱曲线图。

图3为迷果芹多糖PSGP-2在200-400 nm处扫描紫外光谱图。

图4为迷果芹多糖PSGP-2的HPGPC图。

图5为迷果芹多糖PSGP-2的红外谱图。

图6为迷果芹多糖PSGP-2的¹H-NMR图。

图7a为混合单糖标准品的GC-MS谱图。

图7b为迷果芹多糖PSGP-2的单糖组成分析的GC-MS谱图。

图8为迷果芹多糖PSGP-2的扫描电镜图。

图9为迷果芹多糖PSGP-2联合Doxorubicin对4T1细胞体外增殖的抑制作用图。

图10为迷果芹多糖PSGP-2联合Doxorubicin对4T1细胞的AM/PI荧光染色图。

图11为迷果芹多糖PSGP-2联合Doxorubicin对4T1细胞的染色线粒体膜的结果图。

图12 为迷果芹多糖PSGP-2对正常细胞L-02的影响。

备注：Doxorubicin为阿霉素的英文名称，简称DOX，本发明中提到的DOX均指的是阿霉素，具体实施方式中的DOX也指的是阿霉素。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 迷果芹多糖PSGP-2的制备

1）：迷果芹粗多糖的提取

将2.5 Kg迷果芹根切成1-2 cm的小段，用10 L 95%乙醇，在60℃的条件下萃取2h对其进行除脂预处理。萃取后过滤，分离出固体药材，晾干以备用。取预处理后的迷果芹固体药材0.625 Kg，使用6.25 L去离子水对其进行萃取，在90℃的条件下萃取2次，每次3 h。萃取结束后过滤，分离得滤液。将两次萃取得到的滤液合并，加入4倍体积的95%乙醇溶液，并及时搅拌，静置48h。取沉淀对其进行冷冻干燥，即得迷果芹粗多糖。

2）：迷果芹粗多糖脱蛋白和杂质小分子

配置5%木瓜蛋白酶水溶液，加入到用去离子水复溶的迷果芹粗多糖溶液 (迷果芹粗多糖与水的质量比按1:15进行溶解) 中，在67℃的条件下水浴反应3.5h。离心、过滤，用Savege试剂（氯仿和正丁醇以4∶1混合）法脱蛋白，重复操作5次。取上层溶液在37℃的条件下对其进行减压旋蒸操作。放入透析袋，在去离子水中透析48 h，每6h更换水一次。最后将透析过后的糖溶液冷冻干燥，得粗糖聚物SGP-W，保存。

3）：迷果芹多糖PSGP-2的分离纯化

取300 mg的粗糖聚物SGP-W，用20 mL去离子水溶解，上样至阴离子交换柱，填料为DEAE-Cellulose 52，依次用500 mL的去离子水、500 mL的0.1M NaCl溶液、500 mL的0.3MNaCl溶液、500 mL的0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，以每根试管10 mL进行进样。采用苯酚-硫酸法对其进行显色反应，对洗脱液隔管取样1 mL，加入1 mL新配制的6%苯酚溶液和3 mL浓硫酸。然后在490 nm紫外波长下测量吸光度值，绘制出DEAE-Cellulose 52洗脱曲线，如图1所示。图1为迷果芹多糖GP-2的DEAE洗脱曲线图，横坐标为试管数，纵坐标为吸光度值，根据吸光度值的变化，图1中共显示2个洗脱主峰GP-1和GP-2，分别对应为0.3M 和0.5MNaCl洗脱液分离的产物。根据GP-2洗脱主峰显示的位置，读出相应的横坐标确定试管数，并将这些试管内的溶液合并于旋蒸瓶中，用旋转蒸发仪在70℃下真空浓缩，透析48 h，冷冻干燥得GP-2样品。

取40 mg GP-2样品，用2 mL去离子水溶解，上样至凝胶柱，填料为SephadexG-100，用去离子水洗脱，以每根试管5 mL进行进样。采用苯酚-硫酸法进行显色反应，对洗脱液每管取样1 mL，加入1 mL新配制的6% 苯酚溶液和3 mL浓硫酸。然后在490 nm紫外波长下测量吸光度值，绘制Sephadex G-100洗脱曲线，如图2所示。图2为迷果芹多糖PSGP-2的Sephadex-G100洗脱曲线图，横坐标为试管数，纵坐标为吸光度值，根据吸光度值的变化，图2中共显示1个洗脱主峰。根据洗脱主峰显示的位置，读出相应的横坐标确定试管数，并将这些试管内的溶液合并于旋蒸瓶中，使用旋转蒸发仪在70℃下真空浓缩，用水透析48 h，冷冻干燥，得到迷果芹多糖PSGP-2。

实施例2 迷果芹多糖PSGP-2纯度和分子量的测定

配制1 mg/mL PSGP-2多糖水溶液，紫外光谱在200-400 nm处扫描，检测样品中游离的核酸和蛋白质的存在，结果如图3所示。图3为迷果芹多糖PSGP-2在200-400 nm处扫描紫外光谱图，由图3可知，迷果芹多糖PSGP-2在260 nm和280 nm两个波长处都没有吸收峰，说明不含有游离的核酸和蛋白质。

运用高效凝胶渗透色谱 (HPGPC) 法对多糖样品的纯度进行分析，并测定分子量。取5 mg迷果芹多糖PSGP-2，加入5 mL超纯水制成1 mg/mL的多糖溶液。使用高效凝胶色谱仪测定其保留时间，结果如图4所示。图4为迷果芹多糖PSGP-2的HPGPC图，由图4可知，迷果芹多糖PSGP-2为单一狭窄的对称峰，可以判断其为单一组分纯品，其平均相对分子量为31623Da。

实施例3 迷果芹多糖PSGP-2的红外分析

迷果芹PSGP-2多糖，经研细、压片机压片后在波长4000cm^-1 - 400cm^-1范围内进行红外光谱扫描分析，对其进行结构解析，结果如图5所示。图5为迷果芹多糖PSGP-2的红外谱图，由图5可知，可以确定PSGP-2相应的结构信息，具体为：波长3434.60 cm^-1处的峰为-OH的伸缩振动，波长2927.41 cm^-1处的峰为C-H键的伸缩振动，波长1612.20 cm^-1处的峰表示有结合水的存在，波长1388.50 cm^-1处的峰表示C-H的变角振动，波长1070.30 cm^-1处的峰表示其存在吡喃糖环。由此可见，PSGP-2是。一种具有五元糖环结构的多糖

实施例4 迷果芹多糖PSGP-2的核磁分析

迷果芹多糖PSGP-2（约60 mg）溶解在D₂O中。使用600 MHz的Bruker核磁共振光谱仪进行检测。结果如图6所示，图6为迷果芹多糖PSGP-2的¹H-NMR图。异头氢信号在δ5.08 -5.06 ppm，这是PSGP-2中存在α构型糖残基的信号。由此可见，PSGP-2为α构型吡喃糖。

实施例5 迷果芹多糖PSGP-2的单糖分析

选用葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖为单糖标准品。将每种单糖标准品称取1mg放入反应瓶中，加入4mL 的3 M 的三氟乙酸溶液（TFA），在氮气保护下120℃下水解处理10 h。反应后，75℃下减压浓缩，以除去多余的TFA。再加入50mg盐酸羟胺和1mL吡啶，90℃下反应40min。待冷却后，加入1mL乙酸酐进行乙酰化反应。反应完全后的样品，采用3 mL三氯甲烷进行萃取，使用0.22 µm有机微孔滤膜进行过滤，滤液进行GC-MS分析。

将5mg的迷果芹多糖PSGP-2置入反应瓶中，加入4mL的3M的TFA溶液，于120℃的油浴锅中反应10 h。使用旋转蒸发仪在75℃下旋干多余的TFA。加入50mg的盐酸羟胺和0.5 mL的吡啶，90℃反应40 min，冷却后加入0.5 mL的醋酸酐，90℃乙酰化反应40 min。减压浓缩蒸干，用1mL的氯仿萃取，过滤，滤液进行GC-MS分析。上述实验结果如图7a，图7b所示，图7b为迷果芹多糖PSGP-2的单糖组成分析的GC-MS谱图，图7a为混合单糖标准品的GC-MS分析图（1：鼠李糖；2：阿拉伯糖；3：岩藻糖；4：木糖；5：甘露糖；6：葡萄糖；7：半乳糖），图7b为PSGP-2的GC-MS图。由图7a中可知每种单糖的保留时间。由图7b可知，共显示5个峰，对照上图的保留时间，确定相应单糖种类，得到迷果芹PSGP-2多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，且其单糖组成比例分别为2.463%、9.301%、40.019%、19.435%、28.782%。

实施例6 迷果芹多糖PSGP-2的扫描电镜分析

将干燥迷果芹多糖PSGP-2样品均匀地平铺在胶带上，使用离子建设仪喷上一层导电金粉，制得的样品放置在样品台上，使用扫描电镜在不同放缩倍数下观察其形态。PSGP-2的扫描电镜图片如图8所示。图8为迷果芹多糖PSGP-2的扫描电镜图，其中，a为放缩250倍时扫描电镜图，b为放缩2000倍时扫描电镜图，c为放缩4000倍时扫描电镜图，d为放缩6000倍时扫描电镜图。由图8可知，在低倍数下（250倍），PSGP-2图像显示有不规则的卷曲薄片状结构。但是随着倍数的放大，可以看到平滑薄膜形状，说明PSGP-2不具有规整性。

实施例7 迷果芹多糖PSGP-2的直接抗肿瘤活性研究

将0.2 mg/mL的迷果芹多糖PSGP-2作用于人胃癌细胞MGC-803、人卵巢癌细胞A2780、人膀胱癌细胞T24、人鼻咽癌细胞CNE-2和小鼠乳腺癌细胞4T1共五种肿瘤细胞（此五种癌细胞均购自中国生命科学学院）中，以MTT法初步研究其直接抗肿瘤活性。

1、细胞培养：在培养瓶中分别接种上述各细胞使其贴壁生长，将培养瓶放入温度为37℃且CO₂含量为5%的培养箱中培养。待细胞贴壁长满培养瓶后进行传代或冻存。

2、种板：分别取处于对数生长期的上述五种癌细胞，用PBS缓冲液（磷酸根浓度0.01M，PH为7.2-7.4）轻微洗涤3次。加入2mL的0.25% 的胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，然后加入2mL含10%胎牛血清的RPMI.1640培养基终止胰蛋白酶消化，离心(1000 r/ min)5min，去上清液，加入2mL新鲜的含10%胎牛血清的RPMI.1640培养基，轻轻吹打，制成单个细胞悬浮液，通过细胞计数，以每孔150μL的容量接种于96孔板中，每孔细胞数范围为20000-30000，培养箱中培养48h。

3、加药：给药组：将迷果芹多糖PSGP-2溶解在水中，配置成10 mg/mL的迷果芹多糖SGP-2水溶液，把迷果芹多糖PSGP-2水溶液用不含胎牛血清的RPMI.1640不完全培养液稀释成0.2 mg/mL的溶液作用于上述五种癌细胞，对其的抗肿瘤活性进行探究，以及筛选出抗肿瘤效果最好的肿瘤细胞，以供后续研究。每孔加150 µL，每个浓度设6个复孔。同时设置空白对照组：每孔加150µL不含胎牛血清的RPMI.1640培养基，培养箱中培养24h后，弃掉培养基，每孔加入100 µL的1×MTT药物（1 mg/mL）和不含胎牛血清的RPMI.1640不完全培养液的混合溶液，继续培养4小时。使用酶标仪测定，进行初步筛选。在490 nm处测定每孔的OD值。各样品的抑制率按以下计算公式换算：

抑制率(%)=(1-OD_样品/OD_对照)×100

其中，OD样品是给药组的OD值，OD空白是空白组的OD值

在0.2 mg/mL迷果芹多糖 PSGP-2的较低浓度下，对人胃癌细胞MGC-803的抑制率为7.38%，对人卵巢癌细胞A2780的抑制率为1.87%，人膀胱癌细胞T24的抑制率为1.42%，对人鼻咽癌细胞CNE-2的抑制率为2.36%，对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制率为18.58%。将迷果芹多糖PSGP-2的浓度变为0.8 mg/mL时，对人胃癌细胞MGC-803的抑制率为23.14%，对人卵巢癌细胞A2780的抑制率为25.78%，人膀胱癌细胞T24的抑制率为26.44%，对人鼻咽癌细胞CNE-2的抑制率为29.76%，对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制率为32.66%。表明PSGP-2具有一定的直接抗肿瘤作用。说明迷果芹多糖PSGP-2可以抑制人胃癌细胞MGC-803、人卵巢癌细胞A2780、人膀胱癌细胞T24、人鼻咽癌细胞CNE-2和小鼠乳腺癌细胞4T1共五种肿瘤细胞的增殖，具有一定的直接抗肿瘤的作用。

实施例8 迷果芹多糖SGP-2的协同抗肿瘤活性研究

选用迷果芹多糖PSGP-2与Doxorubicin，考察两种药物的协同作用，以小鼠乳腺癌细胞4T1为模型，利用MTT 法、Calcein-AM/PI 染色共聚焦成像法和JC-1 染色检测线粒体膜电位变化实验法初步研究协同抗肿瘤活性。

1、细胞培养：在培养瓶上接种小鼠乳腺癌细胞4T1细胞，将含10%胎牛血清的RPMI.1640培养基放入温度为37℃且CO₂含量为5%的培养箱中培养。待细胞贴壁长满培养瓶后进行传代或冻存。

2、种板：取处于对数生长期的细胞，用PBS缓冲液（磷酸根浓度0.01M，PH为7.2-7.4）轻微洗涤3次。加入浓度为2mL的0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，然后加入含2mL的10%胎牛血清的RPMI.1640培养液，终止胰蛋白酶消化，离心(1000 r/ min) 5min，去上清液，加入2mL新鲜的含10%胎牛血清的RPMI.1640培养液，轻轻吹打，制成单个细胞悬浮液，通过细胞计数，以每孔150μL的容量接种于96孔板中，每孔细胞数范围为20000-30000，培养箱中培养48h。

3、MTT细胞实验加药：给药组：将迷果芹多糖PSGP-2和Doxorubicin分别溶解在水中，配置成10 mg/mL的迷果芹多糖溶液和1mM的DOX溶液，把上述的两种溶液用不含胎牛血清的RPMI.1640不完全培养液分别稀释成相应浓度（20μM DOX，20μM DOX+0.25 mg/mLPSGP-2，20μM DOX+0.5 mg/mL PSGP-2，20μM DOX+1.0 mg/mL PSGP-2）的溶液。每孔加150 µL，每个浓度设6个复孔。空白照组：每孔加150µL不含胎牛血清的RPMI.1640培养基，培养箱中培养24h后，弃掉培养基，每孔加入100 µL的1×MTT药物（1 mg/mL）和不含胎牛血清的RPMI.1640培养基的混合溶液，继续培养4小时，使用酶标仪测定，进行初步筛选。在490 nm处测定每孔的OD值。各样品的抑制率按以下计算公式换算：

抑制率(%)=(1-OD_样品/OD_对照)×100

其中，OD样品是给药组的OD值，OD空白是空白组的OD值

4、Calcein-AM/PI 染色共聚焦成像实验和JC-1 染色检测线粒体膜电位变化实验加药：将小鼠乳腺癌细胞4T1接种于共聚焦培养皿中，孵育24h后，每孔加入150 µL相应浓度的Doxorubicin和PSGP-2（具体浓度为20μM DOX，20μM DOX+0.25 mg/mL PSGP-2，20μM DOX+0.5 mg/mL PSGP-2，20μM DOX+1.0 mg/mL PSGP-2）的混合溶液，孵育12h。激光照射5min后，后用Calcine AM和PI以及JC-1染液进行染色（30 min），并利用共聚焦激光扫描显微镜（Olympus FV1000-IX81）进行观察。

采用 MTT 法检测迷果芹多糖PSGP-2与Doxorubicin联合用药作用，结果如图9所示。图8为迷果芹多糖PSGP-2联合DOX对4T1细胞体外增殖的抑制作用图，由图9可知，20 μMDoxorubicin 在反应24h后，对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制率为45.22%；0.25 mg/mL 迷果芹多糖PSGP-2 在反应24h后，对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制率为19.35%；然而，将20 μMDoxorubicin和0.25 mg/mL 迷果芹多糖PSGP-2联合使用后，对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制率达60.20%，与单独使用20 μM Doxorubicin用药比较，对小鼠乳腺癌细胞4T1抑制率提高近15%。将0.5 mg/mL 迷果芹多糖PSGP-2在反应24h后，对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制率为46.58%；然而，将20 μM Doxorubicin和0.5 mg/mL 迷果芹多糖PSGP-2联合使用后，对小鼠乳腺癌细胞4T1的抑制率为71.42%，与单独使用20 μM Doxorubicin用药比较，对小鼠乳腺癌细胞4T1抑制率提高25%以上。MTT实验数据表明，与Doxorubicin单独用药相比，迷果芹多糖PSGP-2与Doxorubicin联用可以提高肿瘤抑制率，由此可见PSGP-2和Doxorubicin具有协同增效抗肿瘤作用。

迷果芹多糖PSGP-2联合Doxorubicin对小鼠乳腺癌细胞4T1的AM/PI染色成像如图10所示。图9为迷果芹多糖PSGP-2联合Doxorubicin对4T1细胞的AM/PI荧光染色图，绿色为活细胞，红色为死细胞。由图10可知，随着迷果芹多糖PSGP-2浓度的增加，荧光呈红色的面积在增加，表示细胞在孵卵12h后小鼠乳腺癌细胞4T1死亡数目增加。可见迷果芹多糖PSGP-2和Doxorubicin在细胞水平上促进肿瘤细胞凋亡，具有协同增效抗肿瘤作用。

使用JC-1 染色检测线粒体膜电位变化实验研究迷果芹多糖PSGP-2联合Doxorubicin对4T1细胞肿瘤抑制作用的实验结果如图11所示。图11为迷果芹多糖PSGP-2联合Doxorubicin对4T1细胞的染色线粒体膜的结果图，由图11可知，与单独的20 μMDoxorubicin用药相比，随着迷果芹多糖PSGP-2样品浓度的增加，红色荧光强度显著下降，绿色荧光显著增强，由此可见显示细胞线粒体膜电位下降，迷果芹多糖PSGP-2与Doxorubicin联合使用具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

由此可见，将迷果芹多糖PSGP-2与Doxorubicin联合用药，具有抗肿瘤协同增效作用，有望进一步开发。

实施例9

将0，0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL，1.0 mg/mL的迷果芹多糖PSGP-2溶液作用于人正常肝细胞L-02中，以MTT法初步研究其直接抗肿瘤活性。

1、细胞培养：在培养瓶中接种L-02细胞使其贴壁生长，将培养瓶放入温度为37℃且CO₂含量为5%的培养箱中培养。待细胞贴壁长满培养瓶后进行传代或冻存。

2、种板：分别取处于对数生长期的细胞，用PBS缓冲液（磷酸根浓度0.01M，PH为7.2-7.4）轻微洗涤3次。加入2mL的0.25% 的胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，然后加入2mL含10%胎牛血清的RPMI.1640培养基终止胰蛋白酶消化，离心(1000 r/ min) 5min，去上清液，加入2mL新鲜的含10%胎牛血清的RPMI.1640培养基，轻轻吹打，制成单个细胞悬浮液，通过细胞计数，以每孔150μL的容量接种于96孔板中，每孔细胞数范围为20000-30000，培养箱中培养48h。

3、加药：给药组：将迷果芹多糖PSGP-2溶解在水中，配置成10 mg/mL的迷果芹多糖PSGP-2水溶液，把迷果芹多糖PSGP-2水溶液用不含胎牛血清的RPMI.1640不完全培养液稀释成相应浓度（0，0.0625 mg/mL，0,125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL，1.0 mg/mL）的溶液作用于上述的L-02细胞，对其细胞毒性进行测定。每孔加150 µL，每个浓度设6个复孔。同时设置空白对照组：每孔加150µL不含胎牛血清的RPMI.1640培养基，培养箱中培养24h后，弃掉培养基，每孔加入100 µL的1×MTT药物（1 mg/mL）和不含胎牛血清的RPMI.1640不完全培养液的混合溶液，继续培养4小时。使用酶标仪测定，进行初步筛选。在490 nm处测定每孔的OD值。各样品的抑制率按以下计算公式换算：

细胞活力(%)=(OD_样品/OD_对照)×100

其中，OD样品是给药组的OD值，OD空白是空白组的OD值

如图12所示，细胞活力值不低于100%，说明迷果芹纯化多糖PSGP-2对正常细胞并无杀伤作用，其不具有毒副作用，具有较好的安全性。

实施例10

通过体外胆酸盐结合实验评价了PSGP-2的降血脂活性。选择牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠作为结合剂。计算不同浓度的多糖溶液与其的结合率。使用磷酸盐缓冲液（0.1mol /L，PH = 6.3）配置10 mg / mL的胃蛋白酶溶液和10 mg / mL的胰蛋白酶溶液。在具塞试管中加入5mg的多糖样品和3mL的胃蛋白酶溶液，然后加入1 mL 加入0.01mol / L HCl溶液，在37℃下摇动1小时。反应结束后，使用0.1 mol / L 的NaOH溶液将pH值调节到6.3，然后加入4 mL胰蛋白酶溶液，在37℃下摇动1小时。向每个具塞试管中分别加入4 mL甘氨胆酸钠溶液（0.4 mmol / L，由pH 6.3的0.1 mol / L磷酸缓冲液制备）和4 mL牛磺胆酸钠溶液（pH6.3的0.1 mol / L磷酸盐缓冲液制备）。在37℃摇动1小时后，将混合物转移到离心管中。通过以4000 rpm离心10分钟来收集上清液。用于紫外光度计下387nm处测定甘氨酸钠胆酸钠和牛磺胆酸钠的含量。

结合率(%) = (加入量一剩余量) / 加入量

实验结果表明。PSGP-2的牛磺胆酸钠结合率为28.58%，甘氨胆酸钠的结合率为48.01%，结合率较高，体现良好的降血脂价值。

实施例仅用来进一步解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，在不脱离本发明技术特征的情况下，利用本发明所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效变换，均仍属于本发明保护范围内。

Claims (6)

1.一种迷果芹多糖PSGP-2，其特征在于，所述迷果芹多糖PSGP-2由鼠李糖2.463%、阿拉伯糖9.301%、甘露糖40.019%、葡萄糖19.435%、半乳糖28.782%组成，所述迷果芹多糖PSGP-2的平均相对分子量为31623Da；

所述的迷果芹多糖PSGP-2由以下制备方法制得，具体步骤如下：

第一步，迷果芹粗多糖的提取：将迷果芹粉碎，粉碎后的迷果芹用乙醇萃取进行脱脂处理，过滤，晾干，得到固体药材，用水对固体药材进行多次萃取，过滤，将滤液合并，使用水提醇沉法获得迷果芹粗多糖；

第二步，迷果芹粗多糖脱蛋白和杂质小分子：将第一步中获得的迷果芹粗多糖用水溶解，加入木瓜蛋白酶溶液，水浴反应，离心，过滤，用Sevage试剂法脱蛋白，取上层溶液减压旋蒸，透析，定期换水，冷冻干燥，得粗糖聚物SGP-W；

第三步，迷果芹多糖PSGP-2的分离纯化：将第二步得到的粗糖聚物SGP-W用水溶解，粗糖聚物SGP-W与水的质量比为1:15，用DEAE-Cellulose 52 柱层分析法进行洗脱，采用水和NaCl溶液进行梯度洗脱，所述NaCl溶液的浓度为0.5M，洗脱液真空浓缩，透析，冷冻干燥，得到GP-2，将GP-2用水溶解，用Sephadex G-100柱层分析法进行洗脱，洗脱液为去离子水，洗脱液真空浓缩，透析，冷冻干燥，得到迷果芹多糖PSGP-2。

2.根据权利要求1所述的迷果芹多糖PSGP-2，其特征在于，在所述的第一步中，将迷果芹粉碎成1-2cm，粉碎后的迷果芹的重量与乙醇的体积之比为1:4，水与固体药材的质量比1:10，萃取次数为2次，萃取时间为3 h。

3.根据权利要求1所述的迷果芹多糖PSGP-2，其特征在于，在所述的第二步中，迷果芹粗多糖与水的质量比为1:10，木瓜蛋白酶溶液的浓度为5%，木瓜蛋白酶溶液与溶解后迷果芹粗多糖水溶液的体积比为1:5，水浴反应的温度67℃，水浴反应的时间为3.5 h。

4.由权利要求1-3任一项所述的迷果芹多糖PSGP-2在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，肿瘤为胃癌、卵巢癌、膀胱癌、鼻咽癌和乳腺癌中的一种。

5.权利要求4所述的迷果芹多糖PSGP-2在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，迷果芹多糖PSGP-2单独用于制备抗肿瘤药物；或者，迷果芹多糖PSGP-2与阿霉素联合使用，用于制备抗肿瘤药物。

6.由权利要求1-3任一项所述的迷果芹多糖PSGP-2在制备降血脂功能食品中的应用，其特征在于，具有较好的胆酸盐结合能力，具有降血脂功能。

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