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KR102068600B1 - Pdl-1 항체, 그 약학적 조성물 및 그 용도 - Google Patents

Pdl-1 항체, 그 약학적 조성물 및 그 용도 Download PDF

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KR102068600B1
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통통 쉐
위 샤
종민 맥스웰 왕
량 샤오
리춘 왕
징이 왕
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쓰촨 케룬-바이오테크 바이오파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

프로그래밍된 세포 사멸 인자 1 리간드 (PDL-1) 또는 항원 조합 세그먼트에 대한 단일클론 항체가 제공된다. 단일클론 항체는 PDL-1과 특이적으로 결합하여, 신체 면역에서 PDL-1의 저해를 해제시킬 수 있으며, 이로써 T 림프구를 활성화한다. 또한, 상기한 단일클론 항체를 포함하는 약학적 조성물과 그 용도가 제공된다.

Description

PDL-1 항체, 그 약학적 조성물 및 그 용도
본 발명은 종양 테라피 및 분자 면역학 분야에 관한 것으로서, anti-PDL-1 항체, 그 약학적 조성물 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 anti-PDL-1 단일클론 항체에 관한 것이다.
PD-1/PDL-1 신호전달 경로는 면역관용 (immune tolerance), 미생물 감염 및 종양 면역 회피를 규제하는데 필연적이다. PD-1 (programmed cell death 1)은 주로 T 세포와 기타 면역 세포 상에 발현되며, 이의 리간드 PDL-1은 다양한 인간 종양 타입들에서 높은 수준으로 발현된다. PDL-1 단백질의 존재는 인간 유방암, 폐암, 위암, 결장직장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장 세포 암종, 방광암, 췌장암, 신경교종 및 흑색종에서 면역조직화학적 분석에 의해 확인되어 왔다. 또한, PDL-1의 발현 수준은 환자의 임상 치료 및 예후와 밀접하게 관련되어 있다.
PD-1/PDL-1 신호전달 경로의 차단은 저해된 T 세포를 활성화하여, 활성화된 T 세포가 암 세포를 공격하게 유도할 수 있다. PD-1/PDL-1 신호전달의 차단은 종양 세포를 사멸시키는 역할을 수행하는 종양 항원 특이적인 T 세포의 증식을 촉진하여, 국소 종양의 성장을 저해할 수 있으며 (Julie R et al., 2012, N Engl J Med. 366: 2455-2465); PDL-1 단일클론 항체는 종양 침윤성 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 상향 조절할 수 있는데, 이는 PD-1/PDL-1 신호전달 경로의 차단이 면역 반응을 유도하도록 종양 세포의 면역 반응에 역할을 한다는 것을 의미한다 (Blank C et al., 2006, Int. J. Cancer. 119:317-327).
아울러, PDL-1은 생체내에서 B7-1에 결합할 수 있다. PDL-1/B7-1 복합체는 T 세포 활성화의 네거티브 신호인 것으로 실험에서 확인된 바 있으며, 이들 상호작용은 T 세포 표면 활성화 마커의 하향 조절을 유도하여 T 세포의 증식을 저해할 수 있다.
IL-2 (interlukin-2)는 Th 세포에 의해 분비되는 림프카인의 일종으로, 매우 다양한 면역 활성을 가지고 있다: ① T 세포의 증식 및 분화 자극; ② 세포독성 T 림프구의 생성 자극; ③ NK 세포의 증식 및 분화 자극, 그리고 NK 세포의 활성 강화; ④ 시험관내에서 3-6일간 IL-2 자극 하에 림프구로부터 전환되는 종양 살상 면역 세포 타입인 림포카인 활성화된 살상 세포 (LAK 세포)의 생성 자극. IFN-γ (interferon-gamma)는 T 세포에 의해 생산되어, 종양 세포의 증식을 저해하고, MHC에 의한 항원 제시를 높이고, 종양 괴사 인자의 발현을 자극하고, 종양 혈관신생을 방지할 수 있다. 최근 실험에서는, IFN-γ가, 종양 세포의 Fas/FasL 발현을 조절하고, 종양 세포의 Fas 매개 세포자살 민감성을 강화하여 악성 종양 세포의 저해를 유도함으로써, 면역 시스템의 공격으로부터 회피하는 종양 세포의 능력을 억제할 수 있는 것으로 발표되었다.
현재, PDL-1 경로를 타겟팅하는 항체가 비-소 세포성 폐암, 신장 세포 암종, 난소암, 흑색종 등의 다양한 종양 치료에 돌파구가 될 것으로 일반적으로 간주되고 있다 (Homet M. B., Parisi G., et al., Anti-PD1 Therapy in Melanoma. Semin Oncol. 2015 Jun;42(3):466-473), leukemia and anemia (Held SA, Heine A, et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML. Curr Cancer Drug Targets. 2013 Sep;13(7):768-74).
현재, T 림프구를 활성화하기 위해 우수한 결합 친화성 및 차단 효능 (PD-1에 대한 PDL-1)을 가진 새로운 anti-PDL-1 항체의 개발이 여전히 요구되고 있다.
심층적인 연구와 독창적인 작업을 통해, 본 발명자들은 항원으로서 포유류 세포에 의해 발현된 재조합 PDL-1을 사용하여 마우스를 면역화하고, 마우스로부터 비장 세포를 수집하여 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 구축하였다. 다수의 하이브리도마를 스크리닝하여, 다음과 같은 하이브리도마 세포 균주를 입수하였다: 2015년 8월 4일자로 중국의 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 수탁번호 CCTCC No. C2015133로 기탁된, LT005.
본 발명자들은, 하이브리도마 세포 균주 LT005가 PDL-1에 특이적으로 결합하여 PD-1에 대한 PDL-1의 결합을 효과적으로 차단할 수 있는 단일클론 항체 (5C10으로 지칭됨)를 분비할 수 있다는 것을, 놀랍게도 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 PD-1에 대한 PDL-1의 결합을 차단하는 5F10 및 9F6로 지칭되는 2종의 다른 단일클론 항체도 발견하였다.
아울러, 본 발명자들은 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1 및 5C10H2L2로 각각 지칭되는 PDL-1에 대한 인간화된 항체를 독창적으로 생산하였다.
또한, 본 발명자들은 ADCC (항체-의존적인 세포-매개 세포독성) 및/또는 CDC (보체-의존적인 세포독성)를 효과적으로 낮추기 위해, 5C10H2L2의 불변부를 창의적으로 돌연변이시켜, 5C10H2L2-IgG1mt 항체를 제작하였다.
또한, 본 발명자들은, 본 발명의 항체, 특히, 5C10, 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1, 5C10H2L2, 5F10, 9F6 및 5C10H2L2-IgG1mt가 인간 T 세포에 효과적으로 결합하여 IFN-γ 및 IL-2의 분비를 유도하도록 활성화할 수 있으며, 그래서 폐암, 흑색종, 신장 종양, 난소암, 백혈병 및 빈혈의 예방 및 치료에 잠재력이 있다는 것을 확인하였다.
이에, 다음과 같은 발명이 제공된다:
일 측면에서, 본 발명은 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것으로서:
상기 단일클론 항체는 서열번호 15-17에 기재된 CDR을 포함하는 중쇄 가변부, 및/또는 서열번호 18-20에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 가지거나;
상기 단일클론 항체는 서열번호 29-31에 기재된 CDR을 포함하는 중쇄 가변부, 및/또는 서열번호 32-34에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 가지거나;
상기 단일클론 항체는 서열번호 35-37에 기재된 CDR을 포함하는 중쇄 가변부, 및/또는 서열번호 38-40에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 가진다.
5C10, 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1 또는 5C10H2L2의 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같다:
HCDR1: GFSLSNYD (서열번호 15)
HCDR2: IWTGGAT (서열번호 16)
HCDR3: VRDSNYRYDEPFTY (서열번호 17)
LCDR1: QSIGTN (서열번호 18)
LCDR2: YAS (서열번호 19)
LCDR3: QQSNSWPYT (서열번호 20) .
5F10의 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같다:
HCDR1: GFDIKDTY (서열번호 29)
HCDR2: IDPADGNT (서열번호 30)
HCDR3: ARGLGAWFAS (서열번호 31)
LCDR1: QDITNS (서열번호 32)
LCDR2: YTS (서열번호 33)
LCDR3: QQGHTLPPT (서열번호 34).
9F6의 CDR의 아미노산 서열은 다음과 같다:
HCDR1: GFNIKDTY (서열번호 35)
HCDR2: IDPANGNT (서열번호 36)
HCDR3: SRGPPGGIGEYIYAMDY (서열번호 37)
LCDR1: SSVSSSY (서열번호 38)
LCDR2: STS (서열번호 39)
LCDR3: HQYHRSPPT (서열번호 40)
상기한 CDR들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 통례적인 기술적인 방법을 통해 수득할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 가변부의 아미노산 서열을 VBASE2 데이타베이스의 IMGT definition를 사용해 입수할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서,
중쇄 가변부는 서열번호 2, 서열번호 6 및 서열번호 10으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, 및/또는 경쇄 가변부는 서열번호 4, 서열번호 8 및 서열번호 12로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지거나;
중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 21이고, 및/또는 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 23이거나;
중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 25이고, 및/또는 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 27이다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 하기 (1)-(7)로부터 선택된다:
(1) 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내며, 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 4 (5C10)에 나타냄;
(2) 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타내며, 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 8 (5C10H1L1)에 나타냄;
(3) 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 10에 나타내며, 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 12 (5C10H2L2 또는 5C10H2L2-IgG1mt)에 나타냄;
(4) 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타내며, 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 12 (5C10H1L2)에 나타냄;
(5) 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 10에 나타내며, 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 8 (5C10H2L1)에 나타냄;
(6) 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 21에 나타내며, 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 23 (5F10)에 나타냄;
(7) 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 25에 나타내며, 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 27 (9F6)에 나타냄.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정부 단편 (complementary determining region fragment), 단쇄 항체 (예, scFv), 인간화 항체, 키메라 항체 또는 디아바디 (diabody)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 100 nM 미만, 예를 들어, 10 nM 미만, 1 nM 미만, 0.9 nM 미만, 0.8 nM 미만, 0.7 nM 미만, 0.6 nM 미만, 0.5 nM 미만, 0.4 nM 미만, 0.3 nM 미만, 0.2 nM 미만 또는 0.1 nM 미만의 EC50으로 PDL-1에 결합하며, 바람직하게는, EC50은 간접적인 ELISA 방법에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 단일클론 항체는 비-CDR 영역 (non-CDR region)을 포함하는데, 이 비-CDR 영역은 뮤라인 이외의 종, 예를 들어 인간 항체로부터 유래된다.
바람직하게는, 단일클론 항체의 불변부는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변부로부터 선택된다.
바람직하게는, 단일클론 항체의 불변부는 돌연변이된 인간 IgG1 불변부이고; 더 바람직하게는, 돌연변이된 인간 IgG1 불변부는 EU 번호 지정 체계에 따라 234, 235 및 237번 위치에 1, 2 또는 3개의 돌연변이를 가지며, 이들 돌연변이는 L234A, L235A 및 G237A로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편에서, 단일클론 항체는 하이브리도마 세포주 LT005에서 생산되며, 이 하이브리도마 세포주 LT005는 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 기탁되었으며, 수탁번호는 CCTCC NO: C2015133이다.
본 발명의 다른 측면은 항체의 중쇄 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 A에 관한 것으로서, 여기서:
항체는 서열번호 15-17에 기재된 CDR을 포함하는 중쇄 가변부를 가지며;
바람직하게는, 항체의 중쇄는 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지며;
더 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 1, 서열번호 5 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 29-31에 기재된 CDR을 포함하는 중쇄 가변부를 가지며,
바람직하게는, 항체의 중쇄는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지며,
더 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 35-37에 기재된 CDR을 포함하는 중쇄 가변부를 가지며,
바람직하게는, 항체의 중쇄는 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지며,
더 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 또 다른 측면은, 항체의 경쇄 가변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 B에 관한 것으로서, 여기서:
항체는 서열번호 18-20에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 가지며,
바람직하게는, 항체의 경쇄는 서열번호 4, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지며;
더 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 3, 서열번호 7 또는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 32-34에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 가지며,
바람직하게는, 항체의 경쇄는 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지며,
더 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 38-40에 기재된 CDR을 포함하는 경쇄 가변부를 가지며,
바람직하게는, 항체의 경쇄는 서열번호 27의 아미노산 서열을 가지며,
더 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 가진다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기한 핵산 분자 A와 핵산 분자 B를 포함하는 단리된 핵산 분자 C에 관한 것으로서, 선택적으로, 핵산 분자 C는 핵산 분자 A와 핵산 분자 B를 연결하기 위한 링커 서열을 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 단리된 핵산 분자 A, 단리된 핵산 분자 B 또는 단리된 핵산 분자 C를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 단리된 핵산 분자 A, 단리된 핵산 분자 B 또는 단리된 핵산 분자 C, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
용어 "단리된 핵산 분자 A", "단리된 핵산 분자 B" 또는 "단리된 핵산 분자 C"에서, 문자 A, B 또는 C는 단순히 명확하게 하거나 또는 구분하기 위한 목적으로 사용된 것일 뿐, 문자 자체가 특별한 의미를 가지는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 숙주 세포를 적절한 조건 하에 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 전술한 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 기탁되고 수탁번호가 CCTCC NO: C2015133인, 하이브리도마 세포주 LT005에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 하이브리도마 세포주 LT005에 의해 분비되는 항체 또는 그 단편의 항원 에피토프에 경쟁적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체 또는 그 항원 결합 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 활성들 중 임의의 한가지 활성을 가진다:
PD-1 또는 B7-1에 대한 PDL-1의 결합을 차단하는 약물,
PDL-1 활성 또는 PDL-1 농도를 조절 (예, 하향 조절)하는 약물,
PD-1 또는 PDL-1에 의한 신체 면역의 억제를 제거하는 약물, 또는
T 림프구에서 IFN-γ 및/또는 IL-2의 발현을 강화하는 약물.
본 발명의 또 다른 측면은 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 커플링 파트 (coupling part)를 포함하는 접합체에 관한 것으로서, 단일클론 항체는 본원에 언급된 임의의 하나의 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 커플링 파트는 검출가능한 표지물질이며, 바람직하게는 커플링 파트는 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 (colored substance) 또는 효소이다.
본 발명의 또 다른 측면은 전술한 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 접합체를 포함하는 키트에 관한 것이며;
바람직하게는, 키트는 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 특이적으로 인지하는 2차 항체를 더 포함하며, 선택적으로 2차 항체는 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소 등의 검출가능한 표지 물질로 표지된다.
본 발명의 또 다른 측면은 키트의 제조에 있어, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 접합체의 용도에 관한 것으로서, 키트는 샘플에서 PDL-1의 농도 또는 존재를 검출하기 위해 사용된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 접합체를 포함하며, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 더 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 또는 빈혈을 예방 및/또는 치료 및/또는 보강 치료 (adjuvant treating) 및/또는 진단하기 위한 약제의 제조에 있어, 본 발명의 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 접합체의 용도에 대한 것이며; 바람직하게는, 상기 종양은 유방암, 폐암, 예를 들어 비-소 세포성 폐암, 간암, 위암, 결장직장암, 예를 들어 대장암 또는 직장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 신경교종, 흑색종 및 백혈병으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 약물의 제조에 있어 본 발명의 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 접합체의 용도에 관한 것이다:
PD-1 또는 B7-1에 대한 PDL-1의 결합을 차단하는 약물,
PDL-1 활성 또는 PDL-1 농도를 조절 (예, 하향 조절)하는 약물,
PD-1 또는 PDL-1에 의한 신체 면역의 억제를 제거하는 약물, 또는
T 림프구에서 IFN-γ 및/또는 IL-2의 발현을 강화하는 약물.
본 발명의 또 다른 측면은 세포에 본 발명의 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 접합체를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 생체내 또는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 방법은:
PD-1 또는 B7-1에 대한 PDL-1의 결합을 차단하는 방법,
PDL-1 활성 또는 PDL-1 농도를 조절 (예, 하향 조절)하는 방법,
PD-1 또는 PDL-1에 의한 신체 면역의 억제를 제거하는 방법, 또는
T 림프구에서 IFN-γ 및/또는 IL-2의 발현을 강화하는 방법.
본 발명의 일 구현예에서, 상기한 방법은 치료학적 목적은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 접합체를 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 빈혈의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서; 바람직하게는, 종양은 유방암, 폐암, 예를 들어 비-소 세포성 폐암, 간암, 위암, 결장직장암, 예를 들어 대장암 또는 직장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 신경교종, 흑색종 및 백혈병으로부터 선택된다.
본 발명에서, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명에 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 또한, 본 발명에 사용되는 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학 관련 실험 공정들은 해당 분야에서 사용되는 일반적인 공정들이다. 또한, 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 해당 용어들에 대한 정의 및 설명이 후술된다.
본원에서, PDL-1 단백질 (Programmed death-ligand 1, NCBI GenBank ID: NP_054862.1)의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 전장 PDL-1 단백질, 또는 PDL-1의 세포외 도메인 (PDL-1ECD) 또는 PDL-1ECD 함유 단편; PDL-1ECD의 융합 단백질, 예를 들어, 마우스 또는 인간의 IgG Fc (mFc 또는 hFc)와 융합된 단편도 포함된다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, PDL-1 단백질은 아미노산 서열의 돌연변이가 천연적으로 또는 인위적으로 도입 (비-제한적인 예, 치환, 결손 및/또는 부가)되지만 생물학적 기능에는 영향이 없는 것도 포함한다. 즉, 본 발명에서, 용어 "PDL-1 단백질"은 전술한 서열 및 이의 천연 또는 인공 변이체를 포함하여 이러한 모든 서열을 포괄하여야 한다. 또한, PDL-1 단백질의 서열 단편을 언급하는 경우, 이는 전술한 서열 단편 뿐만 아니라 천연 또는 인공 변이체의 대응되는 서열 단편도 지칭하는 것이다.
용어 EC50은 본원에서 최대 효능의 50%에 해당되는 농도, 즉 최대 효능의 50%를 유발할 수 있는 농도를 지칭한다.
용어 "항체"는 2쌍의 폴리펩타이드 체인들 (각각의 쌍은 "경" (L)쇄와 "중" (H)쇄로 구성됨)로 통상 구성되는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체 경쇄는 κ와 λ 체인으로 분류할 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε로 분류할 수 있으며, 대응되는 항체는 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변부 및 불변부는 약 12개 이상의 아미노산으로 된 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 3개 이상의 아미노산으로 된 "D" 영역을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (VH)와 중쇄 불변부 (CH)로 구성된다. 중쇄 불변부는 3개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변부 (VL)와 경쇄 불변부 (CL)로 구성된다. 경쇄 불변부는 하나의 도메인 (CL)으로 구성된다. 항체의 불변부는 면역글로불린이 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 다양한 면역시스템 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 컴포넌트 (C1q) 등에 결합하는 것을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역들은 매우 가변적인 영역 (상보성 결정 영역, CDR)과 CDR이 배치된 프래임워크 (FR)로 지칭되는 보존적인 영역으로 더욱 나뉠 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 CDR 3개와 FR 4개로 구성된다: 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변부 (VH 및 VL)는 항원 결합 부위를 형성한다. 각 영역 도메인의 아미노산 배정은 Kabat sequences of proteins of immunological interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)), 또는 Chothia & Lesk (J. Mol. Biol. 196:901-917(1987); Chothia et al. Nature 342:878-883(1989))의 정의에 따른다. 용어 "항체"는 임의의 특수한 항체 제조 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 특히 재조합 항체, 단일클론 항체 및 다클론 항체를 포함한다. 항체는 서로 다른 이소형 또는 서브이소형, 예를 들어, IgG (예, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
본원에서, 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어는 전장 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하며, 이것은 전장 항체와 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력 및/또는 전장 항체와 "항원 결합 파트"라고 알려져 있는 항원 특이 결합에 대해 경쟁하는 능력을 유지한다. Fundamental Immunology, Ch . 7 (Paul, W., ed., second edition, Raven Press, N.Y. (1989)) 문헌에서 종종 나타나듯이, 모든 목적으로 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 완전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은, Fab, Fab', F (ab')2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정부 (CDR) 단편, 단쇄 항체 단편 (예, scFv), 키메라 항체, 다이아바디 및 항체의 항원 특이적인 결합력을 부여하기에 충분한 폴리펩타이드의 적어도 일정 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하며; 용어 "Fv 단편"은 항체의 단쇄 VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하고; 용어 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하고 (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)); 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하고; 용어 "F(ab')2 단편"은 힌지부내 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 의미한다.
일부 경우에, 항체의 항원 결합 단편은, VL 및 VH 도메인이 링커에 의해 일가 분자를 형성하여 하나의 폴리펩타이드 체인을 형성하는 단쇄 항체 (예, scFv)이다 (예, Bird et al., Science 242:423-426 (1988) 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). 이러한 scFv 분자는 일반 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-Linker-VH-COOH 또는 NH2-VH-Linker-VL- COOH. 적절한 최신 링커 기술은 반복적인 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 구성된다. 예를 들어, (GGGGS)4가 사용될 수 있으며, 이의 변이체 역시 사용될 수 있다 (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 발명에 사용될 수 있는 그외 링커들은 Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol에 기술되어 있다.
일부 경우에, 항체의 항원 결합 단편은 디아바디, 즉, VH와 VL이 하나의 폴리펩타이드 체인으로 발현되는 2가 항체로서, 매우 짧은 링커가 사용되어 동일 체인에서 유래한 2개의 도메인은 쌍이 형성되지 않게 방지되며, 즉, 도메인이 다른 체인의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하게 강제되어 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다 (예, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), 및 Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994)).
다른 경우, 항체 항원 결합 단편은 커플링 암 (arm)에 의해 커플링된 제1 항체 (단편) 및 제2 항체 (단편) 또는 항체 모방체로 정의되는 "2중 특이성 항체"이며, 커플링 방법으로는 비-제한적인 예로 화학 반응, 유전자 융합 및 효소 반응을 포함한다. 항체 항원 결합 단편은 3중 특이 항체 또는 4중 특이 항체와 같은 "다중 특이성 항체"일 수 있으며, 전자는 3종의 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 후자는 4종의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 지정된 안키린 리피트 단백질 (DARPin, designed ankyrin repeat protein)은 CN104341529A에서와 같이 IgG 항체, scFv-Fc 항체 단편에 연결 또는 이와 조합되며; anti-IL-17a fynomer는 WO2015141862A1에서와 같이 anti-IL-6R 항체와 연결 또는 조합된다.
또 다른 경우에, 항체 항원 결합 단편은 제1 항체 (단편) 및 제2 생물학적 기능성 단편 (항체도 이의 모방체도 아님)이 커플링 암에 의해 커플링된 것으로 정의되는, "이중 특이성 항체 접합체"로서, 커플링 방법은 비-제한적인 예로, 화학 반응, 유전자 융합 및 효소 반응이 있으며, 제2 생물학적 기능성 단편으로는 결합 활성을 가진 펩타이드, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 방사핵종, 핵산, 소분자 독소, 수용체 또는 리간드 등이 있으며, 접합체는 각 단편의 활성을 보유하므로, 2중 기능/이중 특이성을 가진다.
항원 결합 단편 (예, 전술한 항체 단편)은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법 (예, 재조합 DNA 또는 효소적 또는 화학적 절단 방법)을 통해 해당 항체 (본 발명의 경우, 예, 5C10, 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1 및 5C10H2L2)로부터 수득할 수 있으며, 동일한 특이적인 스크리닝 방법을 온전한 항체 (intact antibody)로서 항원 결합 단편에 적용할 수 있다.
본 발명에서, 명시적으로 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 온전한 항체 뿐아니라 항체의 항원 결합 단편도 포함한다.
본원에서, 용어 "mAb" 및 "단일클론 항체"는 상동성이 높은 그룹에서 항체 또는 항체 분자로부터 유래되는 단편을 지칭하며, 이 그룹은 천연 돌연변이가 발생하지 않은 한 동일한 항체 분자들로 된 그룹이다. 단일클론 항체는 항원 상의 하나의 에피토프에 대해 높은 수준의 특이성을 가진다. 다클론 항체는 단일클론 항체와 차이가 있으며, 다클론 항체는 통상적으로 동일 항원에서 여러가지 에피토프들을 인지하는 2개 이상의 서로 다른 항체를 포함한다. 단일클론 항체는 통상적으로 Kohler et al (Nature, 256:495, 1975)에 의해 최초로 발표된 하이브리도마 기법을 통해 입수할 수 있지만, 재조합 DNA 기법 (미국 특허 4,816,567)으로도 입수할 수 있다.
본원에서, 용어 "키메라 항체"는 (특정 종으로부터 유래될 수 있거나 또는 특이 항체 클래스 또는 서브클래스에 속할 수 있는) 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 파트, 그리고 (동일 또는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 동일 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속할 수 있는) 다른 항체의 또 다른 경쇄 및/또는 중쇄 파트로 구성되지만, 타겟 항원에 대한 결합 활성은 여전히 보유하는, 항체를 지칭한다 (미국 특허 4,816,567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)).
본원에서, 용어 "인간화 항체"는 CDR 전체 또는 일부가 비-인간 항체 (공여 항체)의 CDR 영역으로 교체된 인간 면역글루불린 (어셉터 항체)를 지칭하며, 공여 항체는 예상되는 특이성, 친화성 또는 반응성을 지닌 비-인간 (예, 마우스, 랫 또는 토끼) 항체일 수 있다. 또한, 항체의 성능을 추가로 개선하기 위해, 어셉터 항체의 프래임워크 영역 (FR)의 아미노산 잔기를 비-인간 항체의 아미노산으로 또는 다른 항체의 아미노산으로 치환할 수 있다. 인간화된 항체에 대한 보다 상세한 내용은, 예를 들어, Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992); 및 Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)를 참조한다.
인간화 방법은 인간화에 사용되는 통상적인 방법들 중 한가지 이상의 방법들의 조합 사용하며, 예를 들어, 후술한 방법이 이용된다.
인간화는 CDR 그래프팅에 의해 구현할 수 있다. 이 방법에서, 마우스 항체의 CDR 영역을 먼저 결정한 다음 마우스 중쇄 및 경쇄의 CDR 6개를 마우스 FR 영역과 상동성이 높은 인간 소스의 주형에 그래프팅한다. 인간 소스 주형은 오리지날 생식세포 서열 (생식세포), 예를 들어, IMGT 데이타베이트로부터 유래된 생식세포 서열로부터 선택할 수 있으며, 또한 유전자 은행에서 유래되는 항체 서열과 같은 성숙 항체 서열로부터 선택할 수 있다. 역 돌연변이가 CDR 그래프팅된 항체에 도입될 수도 있다. 인간 주형의 일부 아미노산이 항체 친화성을 높이기 위해 마우스 주형의 아미노산으로 역 돌연변이될 수 있다.
인간화는 또한 SDR 그래프팅에 의해 구현할 수 있다. 이 방법에서, 마우스 항체의 SDR 영역을 먼저 결정하여야 한다. SDR 영역은 알라닌 스캐닝과 같은 방법으로 결정할 수 있다. 그런 후, 마우스 SDR 영역을 마우스 주형과 상동성이 높은 인간 주형으로 그래프팅한다. 인간 소스 주형은 오리지날 생식세포 서열 (생식세포), 예를 들어, IMGT 데이타베이트로부터 유래된 생식세포 서열로부터 선택할 수 있으며, 또한 유전자 은행에서 유래되는 항체 서열과 같은 성숙 항체 서열로부터 선택할 수 있다. 역 돌연변이가 SDR 그래프팅된 항체에 도입될 수도 있다. 인간 주형의 일부 아미노산이 항체 친화성을 높이기 위해 마우스 주형의 아미노산으로 역 돌연변이될 수 있다. Tamura, M., D. E. Milenic, M. Iwahashi, E. Padlan, J. Schlom & S. V. Kashmiri: Structural correlates of an anti-carcinoma antibody: identification of specificity determining residues (SDRs) and development of aminimally immunogenic antibody variant by retention of SDRs only. J. Immunol., 164, 1432-41 (2000).
또한, 인간화는 리서페이싱 (resurfacing)에 의해 구현할 수 있다. 이 방법에서, 컴퓨터 상동성 모델링 또는 단백질 결정 구조 분석을 통해 마우스 항체 모델을 입수할 수 있다. 항체 표면 상의 아미노산을 모델에 따라 결정할 수 있으며, 이들 아미노산을 인간 항체의 대응되는 아미노산으로 돌연변이시킨다. 동일 부위에서 빈도가 높은 인간 항체의 아미노산을 선택할 수 있다. Padlan, E. A.: A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol., 28, 489-98 (1991).
인간화는 또한 슈퍼인간화 (superhumanization)에 의해 구현할 수 있다. 이 방법에서, 먼저 마우스 항체의 CDR 영역을 결정한 다음 6개의 CDR과 상동성이 높은 인간 서열을 주형으로 정하여 여기에 마우스 CDR 6개를 그래프팅한다. 인간 소스 주형은 오리지날 생식세포 서열 (생식세포), 예를 들어, IMGT 데이타베이트로부터 유래된 생식세포 서열로부터 선택할 수 있으며, 또한 유전자 은행에서 유래되는 항체 서열과 같은 성숙 항체 서열로부터 선택할 수 있다. 역 돌연변이가 CDR 그래프팅된 항체에 도입될 수 있다. 인간 주형의 일부 아미노산을, 항체 친화성을 높이기 위해, 마우스 주형의 아미노산으로 역 돌연변이할 수 있다. Tan, P., D. A. Mitchell, T. N. Buss, M. A. Holmes, C. Anasetti & J. Foote: "Superhumanized" antibodies: reduction of immunogenic potential by complementarity determining region grafting with human germline sequences: application to an anti-CD28. J. Immunol., 169, 1119-25 (2002).
용어 "분리한다 (separate)" 또는 "분리된다 (be separated)"는 자연 상태에서 인공적인 수단에 의해 어떤 것을 취득하는 것을 지칭한다. 자연에 일종의 "분리" 물질 또는 성분이 존재한다면, 이는 물질 또는 성분이 존재하는 천연 환경이 바뀌었거나 또는 이것이 천연 환경 하에 분리되었거나, 또는 이 2가지 경우가 모두 발생할 수 있다. 예를 들어, 살아있는 동물의 경우, 분리되지 않은 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드가 존재하고, 이러한 자연 상태 하에 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드를 고 순도로 단리하는 과정은 분리된다고 지칭한다. 용어 "분리한다" 또는 분리된다"는 인공 또는 합성 물질의 존재를 배제하는 것은 아니며, 활성에 영향을 미치지 않는 그외 불순물의 존재를 배제하는 것도 아니다.
본원에서, 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 비히클을 지칭한다. 발현 벡터는 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있는 벡터이다. 벡터는 형질전환, 형질전이 또는 형질감염에 의해 숙주 세포로 도입되어, 숙주 세포에 수송된 유전 인자를 발현할 수 있다. 벡터는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 비-제한적인 예로, 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 인공 염색체, 예를 들어, 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체 (PAC); 파지, 예를 들어, λ 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스 등이 있다. 벡터로서 사용될 수 있는 동물 바이러스로는 비-제한적으로 레트로바이러스 (렌티바이러스 등), 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예, 헤르페스 심플렉스 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 파포바바이러스 (예, SV40) 등이 있다. 벡터는 다양한 발현-조절 인자를 포함할 수 있으며, 비-제한적인 예로, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 인자 및 리포터 유전자 등이 있다. 또한, 벡터는 복제 오리진을 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "숙주 세포"는 벡터를 도입하기 위해 사용할 수 있는 세포를 지칭하며, 비-제한적인 예로, 원핵생물 세포, 예를 들어 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 바실러스 섭틸리스 (bacillus subtilis), 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포 또는 아스퍼질러스, 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라 세포 S2 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예를 들어 섬유모세포, CHO 세포, COS 세포, NS0 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포 등이 있다.
본원에서, 용어 "특이적인 결합"은 2개의 분자 간의 비-랜덤 결합 반응을 지칭하며, 예를 들어 항체 및 이의 타겟 항원 간의 반응을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원 (또는 항원에 특이성을 가진 항체)에 대한 항체의 특이적인 결합은 본원에서 항원에 대한 결합 친화성 (KD)이 10-5 M 미만, 예를 들어, 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만 또는 심지어 그 보다 낮은 수준인 항체를 지칭한다.
본원에서, 용어 "KD"는 항체와 항원 간의 결합 친화성을 나타내기 위해 사용되는, 특이적인 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수이다. 평형 해리 상수가 작을수록 항체 항원 결합은 강하고, 항체와 항원 간의 친화성은 높다. 통상적으로, Fortebio 분자 상호작용 검출기로 측정시, 항체 (예, 본 발명의 단일클론 항체 5C10, 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1 및 5C10H2L2)는 항원 (예, PDL-1 단백질)에 KD 10-5 M 미만으로, 예를 들어, 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만 또는 심지어 그 보다 낮은 수준으로 결합한다.
용어 "단일클론 항체"와 "mAb"는 동일한 의미를 가지며, 상호 호환적으로 사용되며; 용어 "다클론 항체" 및 "pAb"는 동일한 의미를 가지며 상호 호환적으로 사용가능하며; 용어 "폴리펩타이드"와 "단백질"은 동일한 의미를 가지며 상호 호환적으로 사용된다. 또한, 본 발명에서, 아미노산은 통상 본 기술 분야에서 허용되는 한문자 또는 3문자 약어로 표시된다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala으로 표시될 수 있다.
용어 "하이브리도마"와 "하이브리도마 세포주"는 상호 호환적으로 사용되며, "하이브리도마" 및 "하이브리도마 세포주" 용어들이 언급된 경우, 이는 하이브리도마의 서브클론 및 자손 세포도 포함한다. 예를 들어, 하이브리도마 세포주 LT005가 언급된 경우, 이는 본원에서 하이브리도마 세포주 LT005의 서브클론 및 자손 세포도 지칭하는 것이다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 부형제"는 약학 및 생리학 분야에서 수여 개체 및 활성 성분과 함께 사용가능한, 당해 기술 분야에 널리 공지된, 비히클 및/또는 부형제를 지칭하며 (예, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), 비-제한적인 예로, pH 조절제, 계면활성제, 보강제, 이온 세기 강화제 등이 있다. 예를 들어, pH 조절제로는 비-제한적인 예로, 포스페이트 완충화된 염수가 있으며, 계면활성제로는 비-제한적인 예로, 양이온성, 음이온성 또는 비-이온성 계면활성제, 예로 Tween-80이 있으며; 이온 세기 강화제로는 비-제한적인 예로, 염화나트륨이 있다.
본원에서, 용어 "보강제"는, 항원에 앞서 또는 항원과 함께 신체에 전달되었을 때 항원에 대한 면역 반응을 강화하거나 또는 면역 반응의 유형을 바꾸는 비-특이적인 면역 자극 물질을 지칭한다. 다수 유형의 보강제들이 있으며, 비-제한적인 예로, 알루미늄 보강제 (예, 알루미늄 하이드록사이드), 프로인트 보강제 (예, 완전 프로인트 보강제 및 불완전 프로인트 보강제), 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum), 리포폴리사카라이드, 사이토카인 등이 있다. 프로인트 보강제가 동물 실험에서 가장 많이 사용되는 보강제이다. 알루미늄 하이드록사이드 보강제는 임상 실험에서 훨씬 자주 사용된다.
본원에서, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 일부 달성하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 종양 등의 질환을 예방하기 위한 유효량은 본원에서 종양과 같은 질환을 예방, 저해 또는 발생을 지연하는데 충분한 양을 지칭한다. 질환을 치료하기 위한 유효량은 본원에서 질병과 합병증에 걸린 환자를 치유하거나 또는 적어도 저해하는데 충분한 양을 지칭한다. 이러한 유효량의 결정은 당해 기술 분야의 당업자의 능력내에서 이루어지며, 예를 들어, 질병을 치료하기 위한 유효량은 질병의 심각성, 환자의 전체적인 면역 시스템 상태, 환자의 전체적인 상태, 예를 들어, 나이, 체중 및 성별, 약물 전달 및 동시에 적용되는 기타 치료에 따라 결정될 것이다.
발명의 효과
본 발명의 단일클론 항체 5C10은 PDL-1에 특이적으로 결합하여, PDL-1을 PD-1과의 상호작용으로부터 매우 효과적으로 차단하고, PDL-1에 의한 면역 시스템의 면역 억제를 특이적으로 제거하고, T 림프구를 활성화할 수 있다.
도 1. PDL-1ECD-mFc 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 마커 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼에 주입된 샘플 (10 ㎕); 통과 분획 (10 ㎕); 용출 분획 (10 ㎕).
도 2. PD-1-hFc 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 크로마토그래피 컬럼에 주입된 샘플 (10 ㎕); 마커 (10 ㎕).
도 3. B7-1-hFc 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 크로마토그래피 컬럼에 주입된 샘플 (10 ㎕); 마커 (10 ㎕).
도 4. 항체 5C10의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 마커 (10 ㎕); 환원된 단백질 샘플 (1 ㎍); 크로마토그래피 컬럼의 통과 분획; 비-환원된 단백질 샘플 (1 ㎍).
도 5. 5C10H1L1 (인간화 항체 5C10)의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 마커 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼의 용출 분획 (10 ㎕); 통과 분획 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼에 주입된 샘플 (10 ㎕).
도 6. 5C10H1L2 (인간화 항체 5C10)의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 마커 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼의 용출 분획 (10 ㎕); 통과 분획 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼에 주입된 샘플 (10 ㎕).
도 7. 5C10H2L1 (인간화 항체 5C10)의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 마커 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼의 용출 분획 (10 ㎕); 통과 분획 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼에 주입된 샘플 (10 ㎕).
도 8. 5C10H2L2 (인간화 항체 5C10)의 SDS-PAGE 분석. 좌측에서 우측으로 샘플 및 이의 로딩 양: 마커 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼의 용출 분획 (10 ㎕); 통과 분획 (10 ㎕); 크로마토그래피 컬럼에 주입된 샘플 (10 ㎕).
도 9. PDL-1에 대한 항체 5C10H2L2의 결합 카이네틱스 파라미터.
도 10. PDL-1에 대한 항체 HpLp의 결합 카이네틱스 파라미터.
도 11. PDL-1에 대한 항체 PCAB의 결합 카이네틱스 파라미터.
도 12. 항체 5C10, 5C10H2L2 및 HpLp (Fortebio)에 의한 PD-1과의 상호작용으로부터 PDL-1 차단.
도 13. 5C10H1L1의 PDL-1 양성 293T 세포에 대한 결합.
도 14. 5C10H1L2의 PDL-1 양성 293T 세포에 대한 결합.
도 15. 5C10H2L1의 PDL-1 양성 293T 세포에 대한 결합.
도 16. 5C10H2L2의 PDL-1 양성 293T 세포에 대한 결합.
도 17. HpLp의 PDL-1 양성 293T 세포에 대한 결합.
도 18. PCAB의 PDL-1 양성 293T 세포에 대한 결합.
도 19. 간접 ELISA에 의해 측정한 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2 또는 5C10H2L1의 인간 PDL-1 재조합 단백질에 대한 결합.
도 20. 간접 ELISA에 의해 측정한 5C10H2L2 또는 HpLp의 원숭이 PDL-1 재조합 단백질에 대한 결합.
도 21. ELISA에 의해 측정한 5C10H2L2의 인간 PDL-1, 인간 PDL-2 또는 마우스 PDL-1 재조합 단백질에 대한 결합.
도 22. PDL-1에 대한 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2 또는 5C10H2L1과 PD-1의 경쟁적인 결합 (경쟁적인 ELISA).
도 23. PDL-1에 대한 5C10H2L2과 B7-1의 경쟁적인 결합 (경쟁적인 ELISA).
도 24. 5C10H2L2는 PD-1과의 상호작용으로부터 PDL-1을 차단함으로써 IFN-γ의 분비를 증가시킨다.
도 25. 5C10H2L2는 PD-1과의 상호작용으로부터 PDL-1을 차단함으로써 IL-2의 분비를 증가시킨다.
도 26A. Biacore에 의해 측정한 FcγRIIIa에 대한 5C10H2L2-IgG1mt의 결합 친화성 및 카이네틱 상수.
도 26B. Biacore에 의해 측정한 FcγRIIIa에 대한 Tecentriq®의 결합 친화성 및 카이네틱 상수.
도 27A. Biacore에 의해 측정한 C1q에 대한 5C10H2L2-IgG1mt의 결합 친화성 및 카이네틱 상수.
도 27B. Biacore에 의해 측정한 C1q에 대한 Tecentriq®의 결합 친화성 및 카이네틱 상수.
도 28. 5C10H2L2-IgG1mt의 비-소 세포성 폐암 세포 치유 효과.
생물학적 물질의 보존에 대한 언급
하이브리도마 세포 LT005는 우한 대학 (Postcode: 430072)의 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 2015년 8월 4일자로 수탁번호 CCTCC No. C2015133으로 기탁되었다.
본 발명을 수행하기 위한 특수 모델
아래 실시예들은 당해 기술 분야의 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조 및 이용하는 방법에 대한 충분한 설명과 내용을 제공하기 위해 기술되며, 본 발명자가 본 발명으로서 간주하는 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 실시예에 언급되지 않은 기법 또는 조건은 문헌에 따라 또는 제조 설명에 따라 수행할 수 있다. 제조사가 언급하지 않은 시약 또는 장치는 상업적으로 구입할 수 있는 통례적인 제품이다.
본 발명에 사용되는 BALB/c 마우스는 광동 의학 실험실 동물 센터로부터 구입하였다. 본 발명에 사용되는 T 세포는 Akeso Biopharma Co., Ltd.로부터 구입하였다.
제조예 1: 재조합 단백질 PDL - 1ECD -mFc
1. PDL - 1ECD -mFc의 유전자 합성
PDL-1ECD으로 지칭되는 PDL-1 (programmed cell death 1 ligand 1, NCBI GenBank ID: NP_054862.1)의 세포외 도메인과 마우스 IgG의 Fc 단편 (mFc)을 포함하도록 키메라 유전자를 설계하였다. 293F 세포에서 타겟 유전자의 발현 효율을 개선하기 위해, 뉴클레오티드 서열의 코돈을 최적화하여, GenScript Biotech Co., Ltd.에서 합성하였다. 과학 문헌들에, PDL-1과 PD-L1은 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 본 발명은 PDL-1으로 지칭하는 것으로 통일시켰다.
2. pUC57simple - PDL - 1ECD -mFc 플라스미드 제작
GenScript Biotech Co., Ltd.에서 합성한 PDL-1ECD-mFc 융합 유전자를 발현 벡터 pUC57simple (공급사 GenScript Biotech Co., Ltd.)에 클로닝하여, pUC57simple-PDL-1ECD-mFc 플라스미드를 수득하였다.
3. pcDNA3 .1- PDL - 1ECD -mFc의 재조합 플라스미드 제작
플라스미드 pUC57simple-PDL-1 ECD-mFc를 효소 절단 (Xba I 및 BamH I)한 다음 전기영동하였다. 회수한 PDL-1ECD-mFc 유전자 단편을 라이게이션에 의해 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하여 pcDNA3.1-PDL-1ECD-mFc 플라스미드를 수득하였다. 라이게이션 산물을 지침서에 따라 E. coli DH5α 균주 (TIANGEN BIOTECH CO. LTD.)에 형질전환하였다. pcDNA3.1-PDL-1ECD-mFc 양성 콜로니를 스크리닝에 의해 수득한 다음 통상적인 방법으로 증폭시켰다. 재조합 플라스미드를 키트 설명서에 따라 키트를 사용해 추출하였다 (TIANGEN BIOTECH (Beijing) CO. LTD.; DP103-03).
4. 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-PDL-1 ECD-mFc를 리포펙타민 형질감염 키트 (Invitrogen)를 사용해 293F 세포 (Invitrogen)에 형질감염시켰다.
5. 형질감염된 293F 세포는 7일간 배양하였다. 재조합 단백질이 함유된 배양물의 상층액을 고속 원심분리, 미세다공성 막 진공 여과 및 HiTrap 단백질 A HP 컬럼에 의해 정제하여, PDL-1ECD-mFc 융합 단백질을 수득한 다음 전기영동 로딩 완충제를 첨가하여 환원 조건 하에 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 타겟 단백질의 분자량은 약 53 kD이다.
제조예 2: 재조합 단백질 PD-1-hFc 제조
1. PD-1-hFc의 유전자 합성
PD-1ECD로 지칭되는 PDL-1 (programmed cell death protein 1, NCBI GenBank ID: NP_005009.2)의 세포외 도메인과 인간 IgG의 Fc 단편 (hFc)을 포함하도록 키메라 유전자를 설계하였다. 293F 세포에서 타겟 유전자의 발현 효율을 개선하기 위해, 뉴클레오티드 서열의 코돈을 최적화하여, GenScript Biotech Co., Ltd.에서 합성하였다.
2. pUC57simple -PD- 1ECD - TEV -hFc 플라스미드 제작
PD-1ECD-TEV-hFc 유전자를 발현 벡터 pUC57simple (GenScript Biotech Co., Ltd.)에 클로닝하여 pUC57simple- PD-1ECD- TEV- hFc 플라스미드를 수득하였다.
3. 플라스미드 pcDNA3 .1-PD- 1ECD - TEV -hFc 제작
플라스미드 pUC57simple-PD-1ECD-TEV-hFc를 효소 (Xba I 및 BamH I)로 분해하였다. 정제된 PD-1ECD-TEV-hFc 유전자 단편을 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하여 pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc를 제조한 다음 이를 E. coli DH5α 균주 (TIANGEN)에 형질감염시켰다. 양성 콜로니를 스크리닝에 의해 수득한 다음 통상적인 E. coli DH5α 배양 기법으로 증폭시킨 후 재조합 플라스미드를 키트 설명서에 따라 키트를 사용해 추출하였다 (TIANGEN BIOTECH (Beijing) CO. LTD.; DP103-03).
4. 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc를 리포펙타민 형질감염 키트 (Invitrogen)를 사용해 293F 세포 (Invitrogen)에 형질감염시켰다.
5. 293F 세포를 pcDNA3.1- PD-1ECD- TEV-hFc로 형질감염시키고, 7일간 배양하였다. 재조합 단백질이 함유된 배양물의 상층액을 고속 원심분리, 미세다공성 막 진공 여과 및 Mabselect SuRe 컬럼에 의해 정제하여, PD-1ECD-TEV-hFc 융합 단백질을 수득한 다음 전기영동 로딩 완충제를 첨가하여 환원 조건 하에 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다 (도 2).
제조예 3: 재조합 단백질 B7-1-hFc 제조
1. B7-1-hFc의 유전자 합성
B7-1 (B7-1ECD; Cluster of Differentiation 80 (또한, CD80 및 B7-1), NCBI GenBank ID: NP_005182.1)의 세포외 도메인과 인간 IgG의 Fc 단편 (hFc)을 포함하도록 키메라 유전자를 설계하였다. 293F 세포에서 타겟 유전자의 발현 효율을 개선하기 위해, 뉴클레오티드 서열의 코돈을 최적화하여, GenScript Biotech Co., Ltd.에서 합성하였다.
2. pUC57simple -B7- 1ECD -hFc 플라스미드 제작
B7-1ECD-hFc 유전자를 발현 벡터 pUC57simple (GenScript Biotech Co., Ltd.)에 클로닝하여 pUC57simple-B7-1ECD-hFc 플라스미드를 수득하였다.
3. 플라스미드 pcDNA3 .1-B7- 1ECD -hFc 제작
플라스미드 pUC57simple-B7-1ECD-hFc를 효소 (Xba I 및 BamH I)로 분해하였다. 정제된 B7-1ECD-hFc 유전자 단편을 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen)에 라이게이션에 의해 클로닝하여 pcDNA3.1- B7-1ECD - hFc를 제조하였다. 라이게이션 산물을 이후 E. coli DH5α 균주 (TIANGEN)에 형질감염시켰다. 콜로니 스크리닝을 수행하여, pcDNA3.1- B7-1ECD - hFc 양성 콜로니를 수득한 다음 클론을 통상적인 E. coli DH5α 배양 기법으로 증폭시키고, 재조합 플라스미드를 키트 설명서에 따라 키트를 사용해 추출하였다 (TIANGEN BIOTECH (Beijing) CO. LTD.; DP103-03).
4. 재조합 플라스미드 pcDNA3.1-B7-1ECD-hFc를 리포펙타민 형질감염 키트 (Invitrogen)를 사용해 293F 세포 (Invitrogen)에 형질감염시켰다.
5. 293F 세포를 pcDNA3.1- PD-1ECD- TEV-hFc로 형질감염시키고, 7일간 배양하였다. 재조합 단백질이 함유된 배양물의 상층액을 고속 원심분리, 미세다공성 막 진공 여과 및 Mabselect SuRe 컬럼에 의해 정제하여, B7-1ECD-hFc 융합 단백질을 수득한 다음 전기영동 로딩 완충제를 첨가하여 환원 조건 하에 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다 (도 3).
실시예 1: 하이브리도마 세포주 LT005와 단일클론 항체 5C10, 5F10 및 9F6의 제조.
포유류 세포에 의해 발현된 재조합 PDL-1 ECD-mFc 단백질을 면역원으로 사용해 마우스를 면역화하였다. 면역화된 마우스의 비장 세포를 회수하여, 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조하였다. 많은 수의 샘플을 스크리닝한 후, 하이브리도마 세포주 LT005를 수득하였으며, 이는 PDL-1에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체 5C10을 생산하였다. 다른 2종의 단일클론 항체 5F10 및 9F6 역시 본 발명에서 수득하였다.
상세 내용은 다음과 같다:
1. 하이브리도마 세포 제조
제조예 1에서 수득한 재조합 PDL-1 ECD-mFc 융합 단백질을 면역원으로 사용해 BALB/C 마우스 (Guangdong Medical Lab Animal Center.)를 면역화하였다. 면역화된 마우스의 비장 세포를 회수하여 마우스 골수종 세포와 융합시켜 통상적인 방법에 따라 하이브리도마 세포를 제조하였다 (예, Stewart, S.J., "Monoclonal Antibody Production", in Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds. G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000).
코팅 항원으로서 PDL-1 ECD-mFc를 이용해 간접 ELISA 분석을 수행하여 PDL-1 ECD-mFc에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 수득하였다. 하이브리도마 세포로 경쟁적인 ELISA를 수행하고, PDL-1과의 결합시 PD-1 (제조예 2에서 수득한 PD-1-hFc)과 경쟁하는 단일클론 항체를 분비하는 것을 선별하였다. 단일클론 항체 5C10을 생산하는 안정적인 하이브리도마 세포주 LT005를 제한 희석에 의해 추가로 수득하였다.
하이브리도마 세포주 LT005는 우한 대학 (Postcode: 430072)의 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 2015년 8월 4일자로 수탁번호 CCTCC No. C2015133으로 기탁하였다.
마찬가지로, 뮤라인 항체 (각각 5F10 및 9F6로 명명됨)를 생산하는 2종의 다른 하이브리도마 세포주를 수득하였다.
2. 단일클론 항체 5C10 , 5F10 및 9F6의 제조
PDL-1-5C10 하이브리도마 세포주를 10% (low IgG) 소 태아 혈청 (FBS)이 포함된 배지에서 7일간 배양한 다음 세포 배양 상층액을 수집 및 정제하여 항체 5C10을 수득하였다.
마찬가지로, 상기한 방법에 따라 항체 5F10, 9F6를 수득하였다.
3. 항체 5C10의 SDS-PAGE 분석
정제된 단백질 샘플에 환원된 로딩 완충제와 비-환원된 로딩 완충제를 각각 첨가하였다. 정제시의 통과 분획과 함께, 샘플들을 모두 끓이고, 분석하기 위해 SDS-PAGE에 로딩하였다. 그 결과, 환원된 단백질의 분자량은 약 50 kD 및 25 kD이었고, 비-환원된 단백질의 분자량은 약 150 kD인 것으로 확인되었다 (도 4).
4. 뮤라인 항체 5C10 , 5F10 및 9F6에 대한 친화성, 경쟁적인 친화성 및 세포 친화성 측정:
항체의 친화성은 실시예 9 및 13에 각각 언급된 방법을 사용해 ELISA 및 경쟁적인 ELISA에 의해 측정하였고, 세포 친화성은 실시예 8에 언급된 방법을 사용해 FACS에 의해 측정하였다.
그 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1: 뮤라인 항체 5C10, 5F10 및 9F6의 친화성, 경쟁적인 친화성 및 세포 친화성
Figure 112017126634093-pct00001
그 결과, 3종의 뮤라인 항체는 기준 항체 PCAB (실시예 5에서 수득함) 보다 친화성 및 경쟁적인 친화성 측면에서 열등하지 않은 것으로 나타났다. 5C10은 세포 친화성 및 양성% 측면에서 가장 성능이 우수하였다. 5F10은 세포 친화성이 PCAB 보다 우수하고, 9F6의 양성 %는 PCAB 보다 높다.
실시예 2: 단일클론 항체 5C10 , 5F10 및 9F6의 중쇄 및 경쇄의 서열 획득.
전체 mRNA를 실시예 1에서 수득한 하이브리도마 세포주 LT005로부터 RNA 분리 키트 (TIANGEN, DP430)를 제조사의 설명서에 따라 사용해 추출하였다.
TransGen Biotech TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix kit를 제조사의 설명에 따라 사용해 cDNA를 합성하고, PCR에 의해 증폭하였다. PCR 산물에 대해 pEASY-T1 클로닝 키트 (Transgen CT101)의 설명서에 따라 TA-클로닝을 수행하였다. TA-클로닝 산물을 서열분석하였으며, 그 결과는 다음과 같다:
항체 5C10의 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (360 bp):
CAGGTGCAACTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAACCTGTCCATTACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTAAGCAACTATGATATAAGCTGGATTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTCGGAGTAATATGGACTGGTGGAGCCACAAATTATAATTCAGCTTTCATGTCCAGACTGAGCATCAGTAGGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATATATTACTGTGTGAGAGATTCGAACTATAGGTACGACGAGCCGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (서열번호 1)
항체 5C10의 VH의 아미노산 서열 (120 aa):
QVQLKESGPGLVAPSQNLSITCTVSGFSLSNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTGGATNYNSAFMSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRDSNYRYDEPFTYWGQGTLVTVSA (서열번호 2)
항체 5C10의 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (318 bp):
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGCATTGGCACAAACATACACTGGTTTCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTACTACTGTCAACAAAGTAATAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATA (서열번호 3)
항체 5C10의 VL의 아미노산 서열 (106 aa):
DILLTQSPAILSVSPGERVSLSCRASQSIGTNIHWFQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPYTFGGGTKLEI (서열번호 4)
마찬가지로, 단일클론 항체 9F6와 5F10의 경쇄 및 중쇄 서열을 입수하였다.
항체 5F10의 VH의 아미노산 서열 (117 aa):
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPADGNTRYDPKFQDKTTITTDTSSNTAHLQLSSLTSEDTAVYYCARGLGAWFASWGQGTLVTVSA (서열번호 21)
항체 5F10의 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (351 bp):
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCGACATTAAAGACACCTATATCCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGGACGGTAATACTAGGTATGACCCGAAGTTCCAGGACAAGACCACTATAACAACCGACACATCCTCCAACACAGCCCACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGAGGCCTCGGAGCTTGGTTTGCTTCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (서열번호 22)
항체 5F10의 VL의 아미노산 서열 (106 aa):
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNSLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGHTLPPTFGGGTKLEI (서열번호 23)
항체 5F10의 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (318 bp):
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTACCAATTCCTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCCACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTCATACGCTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATC (서열번호 24)
항체 9F6의 VH의 아미노산 서열 (124 aa):
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMYWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSANTAYLQLSSLTSEDTAVYYCSRGPPGGIGEYIYAMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 25)
항체 9F6의 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (372 bp):
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCGCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTTCTAGAGGCCCTCCAGGAGGTATCGGCGAGTATATCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 26)
항체 9F6의 VL의 아미노산 서열 (107 aa):
QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPPTFGGGTKLEI (서열번호 27)
항체 9F6의 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (321 bp):
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCACCCACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATC (서열번호 28)
실시예 3: 인간화 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1 및 5C10H2L2의 경쇄 및 중쇄 서열 설계
PDL-1 단백질의 3차원 결정 구조（PDB Code 3BIK，Lin, DY et. al., PNAS USA 105(8):3011-6 (2008)와 실시예 2의 서열에 기반한 컴퓨터 모델링에 의해 수득한 5C10 구조를 돌연변이 설계에 이용하여, 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1, 5C10H2L2의 돌연변이된 항체 가변부 서열을 제작하였다 (중쇄의 불변부는 Ig gamma-1 체인 C 영역임, ACCESSION: P01857; 경쇄의 불변부는 Ig κ 체인 C 영역임, ACCESSION: P01834). 가변부의 서열들은 아래에 나타낸다:
1. 인간화된 단일클론 항체 5C10H1L1의 경쇄 및 중쇄의 서열
항체 5C10H1L1의 VH의 뉴클레오티드 서열 (360 bp):
CAGGTCCAGCTGCAGGAGTCAGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGTGAGAACCTGTCAATCACCTGCACAGTCTCTGGCTTCTCACTGAGCAATTACGACATCAGTTGGATTCGACAGCCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGACAGGCGGGGCAACTAACTATAATCCAGCCTTTAAAAGCCGGCTGACCATTTCCAGAGACAACTCCAAGTCTCAGGTGTCTCTGAAAATGAGCTCCCTGCAGGCCGCTGATACCGCTGTGTACTATTGTGTCAGGGACAGCAATTACCGCTATGATGAGCCCTTCACATACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTGACCGTCTCTAGT (서열번호 5)
항체 5C10H1L1의 VH의 아미노산 서열 (120 aa):
QVQLQESGPGLVKPSENLSITCTVSGFSLSNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTGGATNYNPAFKSRLTISRDNSKSQVSLKMSSLQAADTAVYYCVRDSNYRYDEPFTYWGQGTLVTVSS (서열번호 6)
항체 5C10H1L1의 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (321 bp):
GAAATCGTGCTGACACAGAGCCCTGACACACTGAGCGTGACTCCCAAGGAGAAAGTCACCCTGACATGCCGGGCATCACAGAGCATCGGAACAAACATTCACTGGTTCCAGCAGAGACCAGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCAAATACGCCTCCGAATCTATCAGTGGCATTCCTTCCCGATTCTCAGGCAGCGGGTCCGGAACCGACTTTACTCTGACCATTAACTCTGTGGAGGCTGAAGATGCCGCTACATACTATTGCCAGCAGTCTAATAGTTGGCCTTATACCTTCGGCCAGGGGACAAAGCTGGAGATCAAA (서열번호 7)
항체 5C10H1L1의 VL의 아미노산 서열 (107 aa):
EIVLTQSPDTLSVTPKEKVTLTCRASQSIGTNIHWFQQRPGQSPKLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSVEAEDAATYYCQQSNSWPYTFGQGTKLEIK (서열번호 8)
2. 인간화된 단일클론 항체 5C10H2L2의 경쇄 및 중쇄 서열
항체 5C10H2L2의 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (360 bp):
CAGGTCCAGCTGCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCTCCGAGACACTGTCTATCACCTGCACAGTCAGCGGCTTCTCACTGAGCAACTACGACATCTCCTGGATTCGACAGCCCCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGACAGGCGGGGCAACTAACTATAATCCAGCCCTGAAATCTCGGCTGACTATTAGTAGAGACAACTCAAAGAATCAGGTGTCCCTGAAAATGAGCTCCGTCACCGCCGCTGATACAGCTGTGTACTATTGTGTCAGGGACAGCAATTACCGCTATGATGAGCCCTTTACCTACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTGACCGTCTCTAGT (서열번호 9)
항체 5C10H2L2의 VH의 아미노산 서열 (120 aa):
QVQLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLSNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTGGATNYNPALKSRLTISRDNSKNQVSLKMSSVTAADTAVYYCVRDSNYRYDEPFTYWGQGTLVTVSS (서열번호 10)
항체 5C10H2L2의 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (321 bp):
GAAATCGTGCTGACACAGTCTCCTGATACCCTGAGCGTGACTCCCAAGGAGAAAGTCACCCTGACATGCAGGGCATCACAGAGCATCGGAACAAACATTCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCAAATACGCCTCCGAATCTATTAGTGGAGTGCCTTCCCGCTTCTCAGGCAGCGGGTCCGGAACCGACTTTACTCTGACCATCAACTCTGTGGAGGCTGAAGATGCCGCTACATACTATTGCCAGCAGTCTAATAGTTGGCCTTATACCTTCGGCCAGGGGACAAAGCTGGAGATCAAA (서열번호 11)
항체 5C10H2L2의 VL의 아미노산 서열 (107 aa):
EIVLTQSPDTLSVTPKEKVTLTCRASQSIGTNIHWFQQKPGQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSVEAEDAATYYCQQSNSWPYTFGQGTKLEIK (서열번호 12)
3. 인간화된 단일클론 항체 5C10H1L2의 경쇄 및 중쇄의 서열
항체 5C10H1L2의 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열: 서열번호 5
항체 5C10H1L2의 VH의 아미노산 서열: 서열번호 6
항체 5C10H1L2의 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: 서열번호 11
항체 5C10H1L2의 VL의 아미노산 서열: 서열번호 12
4. 인간화된 단일클론 항체 5C10H2L1의 경쇄 및 중쇄의 서열
항체 5C10H2L1의 VH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열: 서열번호 9
항체 5C10H2L1의 VH의 아미노산 서열: 서열번호 10
항체 5C10H2L1의 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열: 서열번호 7
항체 5C10H2L1의 VL의 아미노산 서열: 서열번호 8
실시예 4: 5C10 인간화 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1, 5C10H2L2 제조 및 이의 SDS-PAGE 분석
5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1 및 5C10H2L2에 대한 중쇄의 cDNA (VH: 서열번호 5 또는 서열번호 9; CH: hIgG1)와 경쇄의 cDNA (VL: 서열번호 7 또는 서열번호 11; CL: 인간 κ 서열)를 벡터 pUC57simple (GenScript Biotech Co., Ltd)에 클로닝하여, pUC57simple-5C10H1, pUC57simple5C10L1, pUC57simple-5C10H2 및 pUC57simple-5C10L2 플라스미드를 수득하였다.
제조예 1에 언급된 방법에 따른 서열을 벡터 pcDNA3.1에 추가로 클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 추출하여, 293F 세포를 공동-형질감염시켰다. 7일간 배양한 후, 배양 상층액을 고속 원심분리, 미세다공성 막 진공 여과 및 HiTrap 단백질 A HP 컬럼에 의해 정제하였다.
정제된 단백질 샘플에 환원된 및 비-환원된 로딩 완충제를 각각 첨가하고, 샘플들을 모두 끓인 다음 분석을 위해 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 그 결과는 도 5, 도 6, 도 7 및 도 8로 도시하며, 도면에서 환원된 샘플은 단백질 마커의 50kD 및 25KD에 각각 해당되는 밴드 2개를 겔 상에 나타내며, 비-환원된 단백질은 150 kD의 밴드를 나타낸다.
실시예 5: 인간화 항체 5C10H2L2의 결합 카이네틱 파라미터 분석
항원 PDL-1 (NCBI GenBank ID: NP_054862.1, 뉴클레오티드 서열: 서열번호 13; 아미노산 서열: 서열번호 14)에 대한 인간화 항체 5C10H2L2의 결합 카이네틱 파라미터를 Fortebio으로 측정하였다.
1. 샘플 준비
(1) 제조예 1에 언급된 방법으로 PDL-1-mFc 단백질을 제조한 다음, PDL-1-mFc 단백질을 TEV 프로테아제로 분해하고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, PDL-1 항원을 수득하였다.
PDL-1의 DNA 서열 (870 bp):
ATGAGGATTTTCGCCGTCTTTATCTTTATGACCTACTGGCATCTGCTGAACGCTTTTACTGTGACCGTCCCCAAGGATCTGTATGTGGTGGAGTACGGAAGCAACATGACTATCGAGTGCAAGTTCCCCGTGGAAAAACAGCTGGACCTGGCCGCTCTGATTGTCTATTGGGAGATGGAAGATAAGAATATCATTCAGTTTGTGCACGGCGAGGAAGACCTGAAAGTCCAGCATAGCTCCTACAGGCAGCGCGCCCGACTGCTGAAGGATCAGCTGTCCCTGGGGAACGCAGCCCTGCAGATCACCGACGTGAAACTGCAGGATGCTGGAGTCTACAGGTGCATGATCTCTTACGGCGGGGCTGATTATAAGCGCATTACAGTGAAAGTCAATGCACCTTATAACAAGATCAATCAGAGAATTCTGGTGGTCGACCCAGTGACCAGTGAGCACGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCAGAAGTGATCTGGACCTCTAGTGATCATCAGGTCCTGTCAGGGAAAACCACAACTACCAACAGCAAGCGAGAGGAAAAACTGTTCAATGTGACATCCACTCTGAGGATCAACACAACTACCAATGAGATTTTCTATTGCACTTTTCGGAGACTGGACCCTGAGGAAAACCACACCGCAGAGCTGGTCATCCCAGAACTGCCACTGGCACACCCACCTAATGAGCGAACACACCTGGTCATCCTGGGAGCCATTCTGCTGTGCCTGGGCGTCGCTCTGACTTTCATTTTTCGGCTGAGAAAGGGGCGGATGATGGACGTGAAAAAGTGTGGCATTCAGGATACTAACTCAAAAAAGCAGTCCGATACCCATCTGGAAGAAACC (서열번호 13)
PDL-1의 아미노산 서열 (290 aa):
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET (서열번호 14)
(2) 양성 대조군 항체 HpLp 및 PCAB 제조
본 발명에서, 양성 대조군으로서 HpLp 또는 PCAB를 선택하였으며, HpLp는 아테졸리주맵 (Atezolizumab, 상품명 Tecentriq®)이고, PCAB는 임상 실험 중인 PDL-1 항체이사.
아테졸리주맵 (상품명 Tecentriq®)을 라로슈 사에서 구입하였다. HpLp (KF025HpLp로 알려져 있음)의 제조 방법은 US 2010/0203056 A1 (예, 실시예 10)에서 찾아볼 수 있으며, HpLp 항체의 VH 서열은 서열번호 20에 기재되어 있고, VL 서열은 서열번호 21에 기재되어 있다.
PCAB의 제조 방법은 US 7,943,743 B2 (예, 실시예 1)에서 찾아볼 수 있으며, 항체의 VH 서열은 서열번호 1에 기재되어 있고, VL 서열은 서열번호 11에 기재되어 있다.
2. 방법
항원 PDL-1에 대한 5C10H2L2, HpLp 및 PCAB의 결합 친화성을 검출하기 위해, 아미노-커플링과 후속적인 에탄올아민을 이용한 블록킹에 의해 항원 PDL-1 (5 ㎍/mL)을 AR2G 센서 표면에 코팅하였다. PBST 중에 평형화한 후, 바이오센서 상에 포획된 항원과 항체 간의 결합을 수행하고, 항체를 PBST (10 mM)를 이용한 3배 희석에 의해 연속 희석하였다 (최초 농도: 200 nM). 항원 PDL-1에 대한 5C10H2L2, HpLp 및 PCAB의 결합 친화성을 Fortebio Data Analysis 7.0에 의해 분석하였다.
3. 결과
PDL-1에 대한 5C10H2L2, HpLp 및 PCAB의 결합 친화성과 카이네틱 상수를 표 2 및 도 9-11에 나타낸다.
표 2: PDL-1에 대한 5C10H2L2, HpLp 및 PCAB의 결합 친화성과 카이네틱 상수
Figure 112017126634093-pct00002
KD: 해리 상수; Kon: 결합 속도 상수 (association rate constant); Kdis: 해리 속도 상수; KD=Kdis/Kon.
이들 결과는, 3종의 항체 모두 매우 높은 수준의 친화성으로 항원에 결합함을 보여준다. 또한, 5C10H2L2 및 HpLp의 결합 친화성은 PCAB의 항원 결합 친화성 보다 높았다.
실시예 6: 항체 5C10, 5C10H2L2 및 HpLp에 의한 PDL-1의 PD-1과의 상호작용 차단 (Fortebio)
PDL-1을 PD-1과의 상호작용으로부터 차단하는 5C10, 5C10H2L2 및 HpLp의 차단력을 검출하기 위해, 아미노-커플링과 후속적인 에탄올아민을 이용한 블록킹을 통해 항원 PDL-1 (5 ㎍/mL)을 AR2G 센서 표면에 코팅하였다. PBST 중에 평형화한 후, 바이오센서 상에 포획된 항원과 항체 간의 결합을 수행하고, 항체를 PBST (10 mM)를 이용한 3배 희석에 의해 연속 희석하였다 (최초 농도: 33.33 nM). 바이오센서 팁을 PD-1 단백질 (10 ㎍/ml)이 함유된 용액에 420초간 담구었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 각 항체는 인간 PDL-1이 PD-1에 결합하는 것을 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 저해할 수 있었으며, 각 농도의 형광 강도와 피팅한 EC50을 표 3에 나타내었다.
표 3: 항체 5C10, 5C10H2L2 및 HpLp에 의한 PDL-1의 PD-1과의 상호작용 차단
Figure 112017126634093-pct00003
그 결과, 3종의 항체 모두 인간 PDL-1이 PD-1에 결합하는 것을 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 저해할 수 있는 것으로 확인된다.
실시예 7: 항체 5C10H2L2 및 HpLp에 의한 PDL-1의 PD-1과의 상호작용 차단
PD1/PDL-1 상호작용을 차단하는 5C10H2L2의 차단력을 PD1/PDL-1 결합 분석 키트 (CISBIO; 63ADK000CPLPEH)를 이용한 HTRF에 의해 HpLp와 비교하였다. 항체 5C10H2L2 및 HpLp를 희석 완충제를 사용해 3배 희석 (최초 농도: 100 ㎍/mL; 농도 10종)으로 연속 희석하였다. 샘플 2 ㎕, PDL-1-EuK 4 ㎕ 및 Tag-PD1 4 ㎕를 용액에 첨가한 다음 잠깐 원심분리하여 인큐베이션하였다 (실온에서 20분). anti-Tag-XL665 10 ㎕를 용액에 추가로 첨가한 다음 순간 원심분리 후 인큐베이션하였다 (실온에서 2시간). 마지막으로, PHERA star Fs (BMG)에 의해 값을 판독하고, 데이타를 Graph Prism으로 분석하였다.
그 결과, HpLp 및 5C10H2L2는 PD1/PDL-1 상호작용을 차단하는 차단력이 비슷한 것으로 확인되었다 (각각 67.29 ng/mL 및 68.97ng/mL). 이들 2가지 항체 모두 인간 PDL-1이 PD-1에 결합하는 것을 효과적으로 저해할 수 있었다.
실시예 8: FACS에 의해 측정한 PDL-1 발현 세포에 대한 인간화된 anti-PDL-1 항체의 결합성
먼저, PDL-1을 발현하는 293T 세포를 구축한 다음, 숙주 세포를 인간화된 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1 및 양성 대조군 항체 (HpLp 및 PCAB)로 표지하였다. 세포 표면 상에 천연적인 형태로 존재하는 항원에 대한, 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1 및 양성 대조군 항체 (HpLp 및 PCAB)의 특이적인 결합성을 FACS에 의해 분석하였다.
상세한 내용은 다음과 같다:
1. PDL-1을 발현하는 293T 세포 구축
293T 세포를 PDL-1을 함유한 벡터 pLenti6.3-PDL-1 (Invitrogen 사에서 구입)로 리포펙타민 형질감염 키트 (Invitrogen 사에서 구입)를 사용해 형질감염시켰다. 안정적으로 PDL-1을 발현하는 세포를 스크리닝을 통해 수득하였다.
2. 항체 표지 및 FACS 분석
통상적으로 트립신 처리를 실시한 다음 293T 세포를 수집하였으며, 수집관 당 세포의 수는 2 x 105개 였다. 각 항체 희석물을 PBS (1% BSA)를 첨가하여 각각 50 nM, 20 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM 및 0 nM 농도로 준비하였다. 그런 후, 항체 희석물을 PDL-1을 발현하는 293T 세포와 함께 얼음 위에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 PBS로 3번 세척하였다. FITC-염소-항-인간 IgG를 PBS로 희석 (1: 100)하여, 이를 각 튜브에 100 ㎕씩 넣은 다음 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 3번 헹군 후, 세포를 PBS 300 ㎕로 재현탁하고, 유세포 측정의 FITC 채널을 통해 형광 신호를 검출하였다.
3. 결과
PDL-1을 발현하는 293T 세포에 대한 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L1, 5C10H2L2 및 양성 대조군 항체 (HpLp 및 PCAB)의 결합성을 도 13-18에 도시하였다.
그 결과, 항체들 모두 293T 세포의 표면 상의 PDL-1에 농도-의존적인 방식으로 효과적으로 결합할 수 있었다. 결합된 항체에 대한 형광 정량 분석을 실시한 후, 결합 곡선을 표준 모델과 피팅하여, 각 항체의 결합 효율 EC50을 표 4에 나타낸 바와 같이 계산하였다.
표 4: 293-T 표면 항원 PDL-1에 대한 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1, HpLp, PCAB의 결합성에 대한 FACS에 의한 형광 강도 분석
Figure 112017126634093-pct00004
그 결과, 항체들 모두 293T 세포의 표면 상의 타겟 단백질 (PDL-1)에 농도-의존적인 방식으로 효과적으로 결합할 수 있었다.
실시예 9: 간접 ELISA에 의한 PDL-1에 대한 인간화된 Anti-PDL-1 항체의 결합 친화성 측정
간접적인 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA)을 수행하여 인간 PDL-1에 대한 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1 및 양성 대조군 항체 (HpLp 및 PCAB)의 결합 친화성을 평가하였다. ELISA 플레이트를 인간 PDL-1으로 코팅하여 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 1% BSA를 37℃에서 2시간 동안 처리하여 차단 처리하였다. 그런 후, 항체를 각 웰에 첨가하여, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 여기에 2차 항체, HRP 접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson, 109-035-088)를 첨가하였다. 발색 반응을 위해 TMB 기질 (Neogen, 308177)을 첨가하여 5분간 인큐베이션하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 19에 도시한다. 도에 나타낸 바와 같이, 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1, HpLp 및 PCAB는 인간 PDL-1에 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 결합할 수 있다. 각 농도의 형광 강도와 그래프 피팅을 통해 EC50로 표시되는 계산된 결합 효율은 표 5에 나타낸다.
표 5: 인간 PDL-1에 대한 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1, HpLp 및 PCAB의 결합성 (간접 ELISA)
Figure 112017126634093-pct00005
그 결과, 본 발명의 항체들은 인간 PDL-1에 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 결합할 수 있었다.
실시예 10: 간접 ELISA에 의한 원숭이 PDL-1에 대한 항체 5C10H2L2의 결합 친화성
실험 동물을 대상으로 수행되는 약동할 및 독성 실험을 고려하여, 본 실험의 목적은 항체 5C10H2L2가 원숭이 PDL-1에 결합하는 지를 확인하는 것으로, 항체 5C10H2L2가 PDL-1에 결합할 수 있다면, 원숭이를 약동학 및 독성 실험에 이용할 수 있다.
원숭이 PDL-1에 대한 5C10H2L2 및 양성 대조군 HpLp의 결합성을 간접 ELISA에 의해 측정하였다. 원숭이 PDL-1으로 ELISA 플레이트를 코팅하여 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음 PBS 중의 1% BSA로 37℃에서 2시간 동안 블록킹하였다. 그런 후, 항체를 각 웰에 첨가하여, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 여기에 2차 항체, HRP 접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson, 109-035-088)를 첨가하였다. 발색 반응을 위해 TMB 기질 (Neogen, 308177)을 첨가하여 5분간 인큐베이션하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
원숭이 PDL-1에 대한 5C10H2L2 및 HpLp의 결합 활성 결과를 도 20에 도시한다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 5C10H2L2 및 HpLp는 원숭이 PDL-1에 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 결합할 수 있다. 각 농도의 형광 강도와 그래프 피팅을 통해 EC50로 표시되는 계산된 결합 효율은 표 6에 나타낸다.
표 6: 원숭이 PDL-1에 대한 항체 5C10H1L2의 결합성 (간접 ELISA).
Figure 112017126634093-pct00006
그 결과, 항체 5C10H2L2 및 HpLp 둘다 원숭이 PDL-1에 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 결합할 수 있었으며, 5C10H2L2의 결합력이 HpLp 보다 높았다.
실시예 11: 간접 ELISA에 의한 인간 PDL-1, 인간 PD-L2 및 마우스 PDL-1에 대한 항체 5C10H2L2의 결합성
인간 PDL-1, 인간 PD-L2 (Sino Biological Inc., Cat. 10292-H08H) 및 마우스 PDL-1 (Sino Biological Inc., Cat. 50010-M08H)에 대한 5C10H2L2의 결합성을 간접 ELISA에 의해 분석하였다. 인간 PDL-1, 인간 PD-L2 또는 마우스 PDL-1을 ELISA 플레이트에 0.5 ㎍/ml 농도로, 각 웰 당 100 ㎕ 씩 넣고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 항체를 1 ㎍/ml에서 시작해 연속 희석하였다 (3배 희석; 농도 11종). 웰을 1% BSA로 37℃에서 2시간 동안 블록킹하였다. 2차 항체로서 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) (Jackson, 109-035-088)를 1:20000 희석 비율로 첨가하였다. 발색 반응을 위해 TMB 기질 (Neogen, 308177)을 첨가하여 5분간 인큐베이션하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
인간 PDL-1, 인간 PD-L2 및 마우스 PDL-1에 대한 5C10H2L2 결합 결과는 도 21에 도시한다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 5C10H2L2는 인간 PDL-1에 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 결합할 수 있다. 각 농도의 형광 강도와 그래프 피팅을 통해 EC50=9.16ng/ml로 표시되는 계산된 결합 효율에 따르면, 인간 PD-L2 및 마우스 PDL-1에는 결합하지 않는다.
결론적으로, 5C10H2L2는 인간 PDL-1에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 아테졸리주맵은 마우스 PDL-1 (Tecentriq® PHARMACOLOGY REVIEW, FDA, Application number 761034Orig1s000)에 결합할 수 없다. 이러한 데이타는 5C10H2L2 항체가 우수한 특이성을 가지고 있다는 것을 의미한다.
실시예 12: 경쟁적인 ELISA에 의한, PDL-1에 대한 인간화된 항체의 경쟁적인 결합 활성 측정
경쟁적인 ELISA를 수행하여, 인간 PDL-1에 대한 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1 및 양성 대조군 (HpLp 및 PCAB)의 경쟁적인 결합성을 평가하였다. ELISA 플레이트를 수용체로 코팅하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 웰을 1% BSA로 37℃에서 2시간 동안 블록킹하였다. 그런 후, 항체와 PDL-1-mFc를 혼합하여 실온에서 15분간 인큐베이션한 다음, 각 웰에 첨가하여, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 여기에 2차 항체, HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG (H+L) (Jackson, 109-035-062)를 첨가하였다. 발색 반응을 위해 TMB 기질 (Neogen, 308177)을 첨가하여 5분간 인큐베이션하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
PDL-1에 대한 이들 항체의 결합 활성 결과는 도 22에 도시한다. 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1, HpLp 및 PCAB가 PDL-1에 결합할 때 PD-1과 농도 의존적으로 방식으로 경쟁할 수 있음을 알 수 있다. 각 농도의 형광 강도와 그래프 피팅을 통해 EC50로 표시되는 계산된 결합 효율은 표 7에 나타낸다.
표 7: PDL-1에 대한 항체 5C10H1L1, 5C10H1L2, 5C10H2L2, 5C10H2L1, HpLp 및 PCAB의 경쟁적인 결합성 (경쟁적인 ELISA)
Figure 112017126634093-pct00007
그 결과, 검출 항체 모두 항원 PDL-1에 경쟁적이고 효과적으로 농도 의존적인 방식으로 결합할 수 있는 것으로, 나타났다.
실시예 13: 경쟁적인 ELISA에 의한, PDL-1에 대한 항체 5C10H2L2의 B7-1과의 경쟁적인 결합 활성 측정
PDL-1과의 결합시 B7-1 (B7-1-hFc, 제조예 3에서 제조됨)과 경쟁하는 5C10H2L2 및 양성 대조군 항체 (HpLp 및 PCAB)의 결합 경쟁력을 경쟁적인 ELISA에 의해 측정하였다. ELISA 플레이트를 PDL-1으로 코팅하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 웰을 1% BSA로 37℃에서 2시간 동안 블록킹하였다. 그런 후, 항체와 PDL-1-mFc를 혼합하여 실온에서 15분간 인큐베이션한 다음, 각 웰에 첨가하여, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 여기에 2차 항체, HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG (H+L) (Jackson, 109-035-062)를 첨가하였다. 발색 반응을 위해 TMB 기질 (Neogen, 308177)을 첨가하여 5분간 인큐베이션하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
PDL-1과의 결합시, 5C10H2L2의 B7-1과의 경쟁 결과는 도 23에 도시하며, 5C10H2L2, HpLp 및 PCAB는 PDL-1와의 결합시 B7-1과 효과적으로 경쟁할 수 있다. 각 농도의 형광 강도와 그래프 피팅을 통해 EC50로 표시되는 계산된 결합 효율은 표 8에 나타낸다.
표 8: PDL-1에 대한 항체 5C10H2L2, HpLp ,PCAB 및 B7-1의 경쟁적인 결합성에 대한 경쟁적인 ELISA 결과
Figure 112017126634093-pct00008
*불완전 경쟁. 경쟁적인 결합 실험에서 HpLp의 데이타 윈도우 (data window)가 다른 2종의 항체 보다 작다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 1:27 희석에서 시작하여 HpLp 농도 증가 (예, 1: 9, 1: 3, 3 ㎍/ml)에 따른 OD 감소는 명확하지 않다.
이들 결과는, 측정한 항체들 모두 PDL-1과의 결합에 대해 B7-1과 경쟁할 수 있으며, 5C10H2L2의 경쟁적인 결합 활성이 PCAB 보다 더 강하며, 5C10H2L2의 EC50이 PCAB의 거의 절반 수준이라는 것을 보여준다. HpLp의 경쟁적인 결합 활성은 이의 농도 증가에 따라 유의하게 증가하지 않는다.
실시예 14: 5C10H2L2 및 양성 대조군 항체 (HpLp 및 PCAB)의 세포 생물 활성 분석
말초혈 단핵구 세포 (PBMC)에서 IL-2 및 IFN-γ 분비에 잇어 단일클론 항체 5C10H2L2 및 양성 대조군 (HpLp 및 PCAB)의 효과를 조사하기 위해, Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare LOT No. 171440-02)를 이용해 PBMC를 분리하였다. IL-4 (Peprotech K2513, 1000 U/ml) 및 GM-CSF (Peprotech H1513, 1000 U/ml)를 PBMC에 첨가하여 6일간 유도하였다. 그 후, TNF-α (Peprotech G1513, 200 U/ml)를 PBMC에 추가로 첨가하여 세포를 3일간 유도하여 DC 세포를 수득하였다.
PBMS로부터 T 세포를 분리하였다. 이를 DC 세포와 10:1 비율로 혼합하여 함께 배양하였다. 항체 5C10H2L2 (대조군으로서 hIgG)를 여러가지 농도로 첨가하여 5-6일간 배양한 후, ELISA를 수행하여 IFN-γ (Dakewe Biotech Inc.에서 구입한 키트) 및 IL-2 (Dakewe Biotech Inc. 사의 키트)의 분비를 평가하였다.
DC 및 T 세포 혼합물에서의 IFN-γ 및 IL-2 분비 결과는 각각 도 24 및 도 25에 도시하였다. 그 결과, 5C10H2L2, HpLp 및 PCAB는 IFN-γ와 IL-2의 분비를 농도 의존적인 방식으로 효과적으로 유도할 수 있었다.
실시예 15: 변형된 IgG1 불변부를 가진 단일클론 항체 5C10H2L2-IgG1mt의 설계 및 제조
본 발명에서, 중쇄 불변부는 Ig gamma-1 체인 C 영역, ACCESSION: P01857이고; 경쇄 불변부는 Ig κ 체인 C 영역, ACCESSION: P01834이다. EU 번호 지정 체계에 따른 234, 235 및 237번 위치의 아미노산을 다음과 같이 변형시켰다: L234A, L235A 및 G237A. 돌연변이 항체는 5C10H2L2-IgG1mt로 명명하였으며, 실시예 4의 방법에 따라 제조하였다.
실시예 16: ForteBio으로 측정한 FcγRIIIa에 대한 5C10H2L2-IgG1mt의 다이나믹 친화성
1. FcγRIIIa에 대한 5C10H2L2-IgG1mt, Tecentriq®의 친화성 및 결합 카이네틱스를 ForteBio (Pall Cat. No. Octet, Qke)에 의해 다음과 같이 규명하였다:
정제된 FcγRIIIa-바이오틴을, 표준 방법과 ForteBio에 구비된 키트를 이용하여, 고정된 환경 (1 ㎍/ml FcγRIIIa-Biotin, 300초) 하에 바이오틴-스트렙타비딘 결합에 의해 스트렙타비딘-코팅된 SA 칩에 커플링하였다. 칩에 항체를 농도 4000 nM로 120초간 노출시켜 결합시킨 다음 PBST (pH7.4) 중에 180초간 인큐베이션하여 해리시켰다. 결합 및 해리 그래프를 Octet 소프트웨어로 분석하였다.
그 결과는 도 26A 및 26B에 도시하며, 도에서 5C10H2L2-IgG1mt 및 Tecentriq®는 FcγRIIIa에 결합하지 않아, 이들 둘다 ADCC 활성을 가지고 있지 않은 것으로 나타났다.
2. C1q (Fitzgerald, Cat. No. 32R-AC049)에 대한 5C10H2L2-IgG1mt, Tecentriq®의 친화성 및 결합 카이네틱스를 ForteBio에 의해 하기와 같이 규명하였다:
정제된 항체를 표준 방법과 ForteBio에 구비된 키트를 이용하여, 고정된 환경 (20 ㎍/ml 항체-Biotin, 300초) 하에 바이오틴-스트렙타비딘 결합에 의해 스트렙타비딘-코팅된 SA 칩에 커플링하였다. 칩에 C1q를 농도 200 nM (2배 희석)로 120초간 노출시켜 결합시킨 다음 PBST (pH7.4) 중에 180초간 인큐베이션하여 해리시켰다. 결합 및 해리 그래프를 Octet 소프트웨어로 분석하였다. 결합 상수 추정에 있어 친화성의 영향력을 최소화하기 위해, 결합 단계 및 해리 단계의 개시 시기에 해당되는 데이타 세그먼트만 피팅하였다. KD, Kon 및 Koff 결과는 표 9에 나타내며, 그래프는 도 27A 및 27B에 도시한다.
표 9: C1q에 대한 5C10H2L2-IgG1mt 및 Tecentriq®의 친화성 및 결합 카이네틱스
Figure 112017126634093-pct00009
그 결과, C1q에 대한 다이나믹 친화성은 5C10H2L2-IgG1mt가 Tecentriq® 보다 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 17: 5C10H2L2-IgG1mt의CDC 활성
PDL-1 양성 종양 세포 HCC1954 (ATCC Cat. No. CRL-2338)를 해당 배지 (RPMI1640 + 10% 소 혈청)에서 배양하고, 5C10H2L2-IgG1mt는 배지 (RPMI1640 + 10% 인간 혈청)로 10000 ㎍/mL에서 시작하여 연속 희석하였다 (5배 희석, 10회). 상기한 종양 세포에 트립신을 처리하고, 세포가 든 수개의 튜브를 수집하여, 해당 배지 (RPMI1640 + 10% 인간 혈청)로 다시 현탁한 다음 항체가 여러가지 희석 비율로 담긴 96-웰 플레이트 (10000 세포/웰)에 넣어 5시간 인큐베이션하였다. 그 후, CCK8 시약 (Dongren Chemical Technology Co., Ltd., Cat. No. CK04, Lot: JJ744) 20 ㎕를 각 웰에 첨가하여 3시간 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, Model: SpectraMax M2)를 사용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 미토콘드리아 내부의 데하이드로게나제 활성은 HCC1954 세포에 대한 항체의 독성을 반영한다.
그 결과, 5C10H2L2-IgG1mt는 HCC1954 세포에 CDC 효과를 나타내지 않았다.
실시예 18: 대장암에 대한 생체내 종양 저해 효과
1. 샘플
5C10H2L2-IgG1mt, Tecentriq® 및 인간 IgG는 Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co. Ltd. 사에서 구입하였다. Tecentriq®는 Roche 사에서 구입하였고, 인간 IgG는 Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Co., Ltd. 사에서 구입하였다.
준비: 샘플 3종을 0.1% BSA가 첨가된 식염수로 원하는 농도로 희석한다.
세포 및 동물
MC-38/H-11 세포는 마우스 대장암 MC-38 세포 (Cobioer, Cat. CBP60825)으로부터 유래된 것으로서, 이의 내인성 마우스 PDL-1이 CRISPR/Cas9에 의해 낫아웃되었고 인간 PDL-1이 이 세포로 형질감염된 세포이다. 즉, MC-38/H-11 세포는 인간 PDL-1 단백질만 발현한다.
7-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스는 Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd. 사에서 구입하였다.
2. 절차
각 마우스에 MC-38/H-11 세포 1 x 105개를 피하 접종하고, 무작위로 그룹화하여 종양 접종 2일째 (D0)부터 2일마다 (Q2D) 샘플들을 복막내 주사 (IP) 투여하였다. 주사 용량은 다음과 같다: 인간 IgG (15 mg/kg), 5C10H2L2-IgG1mt (1.5, 5, 15 mg/kg) 및 Tecentriq® (15 mg/kg). 각 그룹은 마우스 10마리로 구성되며, 주사액의 부피는 체중 10 g 당 0.1 mL/10 g이었다.
3. 실험 지표 (Experimental indicator)
종양 증식에 대한 약물의 효과는 T/C% 또는 종양 증식 저해 (TGI) (%)로 표시한다.
종양의 직경은 노기스 (vernier caliper)로 1주일에 2회 측정하였다. 종양의 부피 (V)는 다음과 같이 계산하였다:
V = 1/2 x a x b2, 여기서, a와 b는 각각 길이와 너비이다.
T/C% = T/C x 100, 여기서 C는 대조군의 종양 부피 또는 종양 무게이고, T는 처리군의 종양 부피 또는 종양 무게이다.
종양 증식 저해 (TGI) (%) = (C - T)/C x 100, 여기서 C는 대조군의 종양 부피 또는 종양 무게이고, T는 처리군의 종양 부피 또는 종양 무게이다.
4. 결과
아래 표 10에 나타낸다.
표 10: MC-38/H-11의 대장암 피하 이종이식물에 대한 5C10H2L2-IgG1mt (1.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 15mg/kg)와 Tecentriq®의 효능
Figure 112017126634093-pct00010
주석: 마우스를 무작위로 그룹으로 나누었으며, 1차 투여는 D0에 행하였다. D27은 1차 투여 후 27일째를 의미한다.
MC-38/H-11 피하 이식체에 대한 1.5, 5 및 15 mg/kg 5C10H2L2-IgG1mt의 TGI는 평균 종양 부피로 계산하였을 때 각각 63.9%, 75.8% 및 68.6%이었다. 각 그룹에서의 개체별 종양 크기 차이가 매우 큰 것을 감안하면, 종양 증식 저해를 계산하는데 종양 부피 중앙값을 사용하는 것이 합리적이었다. 이 경우에 TGI 비율은 100%, 100% 및 100%였다. 기준 약물 Tecentriq® (15mg/kg)의 TGI는 93.8%였다 (종양 부피 중앙값으로 계산함). MC-38/H-11에 대한 5C10H2L2-IgG1mt (1.5, 5, 15 mg/kg)의 TGI는, 종양 무게 중앙값으로 계산하였을 때, 100%, 100% 및 100%였다. Tecentriq®의 TGI는 93.7%였다. 중앙 종양 부피 및 중앙 종양 무게로 계산한 TGI는 매우 일관적이었는데, 이는 종양 부피에 대한 계산의 신뢰성을 의미한다. 5C10H2L2-IgG1mt (1.5, 5, 15 mg/kg)는 종양 증식을 저해할 뿐만 아니라 종양 형성도 저해하였다. 실험 종료시 (D27), 1.5, 5, 15 mg/kg 5C10H2L2-IgG1mt의 종양 발생율은 각각 40%, 40% 및 40%이었다. Tecentriq® 그룹의 종양 발생율은 50%였다. 약물들 모두 종양이 생긴 마우스에서 허용성이 우수하였으며, 유의한 체중 감소 또는 기타 증상은 관찰되지 않았다. Tecentriq®와 비교해, 5C10H2L2-IgG1mt (1.5, 5, 15 mg/kg)는 대장암 세포 MC-38/H-11 피하 이식 모델에서 보다 강력한 항종양 효과를 나타내었다.
실시예 19: 폐암에 대한 생체내 종양 저해 효과
동물 모델링 방법: NOG 마우스에 비-소 세포성 폐암 세포 HCC827 (ATCC Cat. No. CRL-2868)을 피하 접종하였다. 종양의 부피가 100 mm3에 도달하면, 마우스에 활성화된 인간 PBMC를 정맥내 주사하여, 투여 전의 인간 면역 시스템을 모방하였다.
투약 계획: 10 mg/kg, 정맥내 주사, 2일마다 1회, 총 4회. 종양 부피를 투여 후 1주일에 2번 측정하였다. 마우스를 3개의 그룹으로 나누었다: 대조군 (IgG), 5C10H2L2-IgG1mt 및 Tecentriq®, 각 그룹 당 마우스 6마리.
종양 증식 그래프를 도 28에 도시한다.
그 결과, 5C10H2L2-IgG1mt 그룹의 종양 부피는 4일부터 Tecentriq® 그룹 및 IgG 대조군 보다 명확하게 더 작은 것으로 확인되었다. 5C10H2L2-IgG1mt 그룹의 종양 증식은 거의 완전히 저해되었다. 이와는 대조적으로, Tecentriq® 그룹과 IgG 대조군에서는 종양이 계속 증식하였다. 그 결과, 본 발명의 항체는 Tecentriq® 보다 생체내 항종양 효과가 더 강력한 것으로 입증되었다.
본 발명의 구체적인 구현예들이 상세하게 기술되어 있음을 당해 기술 분야의 당업자는 인지할 것이다. 기술된 전체 상세한 설명에 따라, 본 발명의 보호 범위내에서 이들 상세한 내용에 대한 다양한 변형 및 치환이 행해질 수 있다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구항 및 이의 임의 등가의 내용에 의해 규정된다.
China Center for Type Culture Collection CCTCCC2015133 20150804
SEQUENCE LISTING <110> SICHUAN KELUN-BIOTECH BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> A PDL-1 ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF AND USE THEREOF <130> IEC150063PCT <150> 201610122117.6 <151> 2016-03-04 <160> 40 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence encoding VH of antibody 5C10 <400> 1 caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagaa cctgtccatt 60 acctgcactg tctctgggtt ctcattaagc aactatgata taagctggat tcgccagcca 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctcggagta atatggactg gtggagccac aaattataat 180 tcagctttca tgtccagact gagcatcagt agggacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtgag agattcgaac 300 tataggtacg acgagccgtt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of VH of antibody 5C10 <400> 2 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Asn Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 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<400> 27 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence encoding VL of antibody 9F6 <400> 28 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacc cacgttcggt 300 ggaggcacca agctggaaat c 321 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 29 Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 30 Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 <400> 31 Ala Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Ser 1 5 10 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR1 <400> 32 Gln Asp Ile Thr Asn Ser 1 5 <210> 33 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR2 <400> 33 Tyr Thr Ser 1 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 34 Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR1 <400> 35 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR2 <400> 36 Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr 1 5 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HCDR3 <400> 37 Ser Arg Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Glu Tyr Ile Tyr Ala Met Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR1 <400> 38 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 39 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR2 <400> 39 Ser Thr Ser 1 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> LCDR3 <400> 40 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr 1 5

Claims (47)

  1. 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    상기 단일클론 항체가 서열번호 15에 기재된 HCDR1, 서열번호 16에 기재된 HCDR2 및 서열번호 17에 기재된 HCDR3 을 포함하는 중쇄 가변부, 및 서열번호 18에 기재된 LCDR1, 서열번호 19에 기재된 LCDR2 및 서열번호 20에 기재된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변부를 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변부는 서열번호 2, 서열번호 6 및 서열번호 10으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, 및 상기 경쇄 가변부는 서열번호 4, 서열번호 8 및 서열번호 12로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중쇄 가변부가 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변부가 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지거나;
    상기 중쇄 가변부가 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변부가 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지거나;
    상기 중쇄 가변부가 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변부가 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지거나;
    상기 중쇄 가변부가 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변부가 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지거나;
    상기 중쇄 가변부가 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고, 상기 경쇄 가변부가 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정부 단편 (complementary determining region fragment), 단쇄 항체, 인간화 항체 (humanized antibody), 키메라 항체 및 디아바디 (diabody)로부터 선택되는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단쇄 항체가 scFv인, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 100 nM 미만의 EC50으로 PDL-1에 결합하는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 10 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM 또는 0.1 nM 미만의 EC50으로 PDL-1에 결합하는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 EC50은 간접적인 ELISA 방법 (indirect ELISA method)에 의해 측정되는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 비-CDR 영역 (non-CDR region)을 포함하며, 상기 비-CDR 영역은 뮤라인 이외의 다른 종으로부터 유래된, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 단일클론 항체는 비-CDR 영역 (non-CDR region)을 포함하며, 상기 비-CDR 영역은 인간 항체로부터 유래된, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 단일클론 항체의 불변부는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 불변부로부터 선택되는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 단일클론 항체의 불변부는 돌연변이된 인간 IgG1 불변부인, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 돌연변이된 인간 IgG1 중쇄 불변부가 EU 번호 지정 체계에 따라 234, 235 또는 237번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 가지며, FcγRIIIa 및/또는 C1q에 대한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 다이나믹 친화성 (dynamic affinity)이 EU 번호 지정 체계에 따라 234, 235 또는 237번 위치에서 하나 이상의 돌연변이 후 낮아지는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 돌연변이된 인간 IgG1 불변부가 EU 번호 지정 체계에 따라 234, 235 또는 237번 위치에서 1, 2 또는 3개의 돌연변이를 가지며, 상기 돌연변이가 L234A, L235A 및 G237A로부터 선택되는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 돌연변이가 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 감소시키는, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단일클론 항체가 하이브리도마 세포주 LT005에 의해 생산되며,
    상기 하이브리도마 세포주 LT005는 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 기탁되며, 수탁 번호가 CCTCC NO: C2015133인, 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  17. 단일클론 항체의 중쇄 가변부를 코딩하는 핵산 분자, 및 단일클론 항체의 경쇄 가변부를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 단리된 핵산 분자로서,
    상기 단일클론 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 15에 기재된 HCDR1, 서열번호 16에 기재된 HCDR2 및 서열번호 17에 기재된 HCDR3 을 포함하고; 및
    상기 단일클론 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 18에 기재된 LCDR1, 서열번호 19에 기재된 LCDR2 및 서열번호 20에 기재된 LCDR3을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 단일클론 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지고; 및
    상기 단일클론 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 4, 서열번호 8, 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는, 단리된 핵산 분자.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 단일클론 항체의 중쇄 가변부를 코딩하는 핵산 분자가 서열번호 1, 서열번호 5, 또는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 가지고; 및
    상기 단일클론 항체의 경쇄 가변부를 코딩하는 핵산 분자가 서열번호 3, 서열번호 7, 또는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 가지는, 단리된 핵산 분자.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체의 중쇄 가변부를 코딩하는 핵산 분자 및 단일클론 항체의 경쇄 가변부를 코딩하는 핵산 분자를 연결하기 위한 링커를 더욱 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  22. 제17항의 단리된 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법으로서,
    제22항에 따른 숙주 세포를 적절한 조건 하에 배양하는 단계; 및
    숙주 세포 배양물로부터 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  24. 수탁 번호 CCTCC No: C2015133으로 CCTCC (China Center for Type Culture Collection)에 기탁된 하이브리도마 세포주 LT005.
  25. 접합체로서,
    단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 모이어티를 포함하며,
    상기 단일클론 항체가 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고,
    상기 모이어티가 검출가능한 표지물질 (detectable label)이며,
    상기 모이어티가 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 (colored material) 또는 효소인, 접합체.
  26. 이중 기능성 항체 접합체 (bifunctional antibody conjugate)로서,
    단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접합 파트 (conjugated part)를 포함하며,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제1의 생물학적 기능성 단편이며, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고,
    상기 접합 파트는 제2의 생물학적 기능성 단편 (biological functional fragment)인, 이중 기능성 항체 접합체.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 제2의 생물학적 기능성 단편은 결합 활성을 가지며, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 핵종, 핵산, 소분자 독소, 수용체 또는 리간드인, 이중 기능성 항체 접합체.
  28. 다중특이성 항체 (multispecific antibody)로서,
    제1 항체 또는 그 단편을 부가적인 항체 또는 그 단편, 또는 항체 모방체와 접합함으로써 형성되며,
    각각의 항체 또는 그 단편 또는 항체 모방체가 오리지날 결합 특이성을 보유하며,
    상기 제1 항체 또는 그 단편은 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 다중특이성 항체.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 다중특이성 항체는 이중특이성 항체 (bispecific antibody) 또는 삼중특이성 항체 (tri-specific antibody) 또는 사중특이성 항체 (tetra-specific antibody)인, 다중특이성 항체.
  30. 키트로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 키트.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 키트는 상기 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 특이적으로 인지하는 이차 항체를 더 포함하는, 키트.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 이차 항체는 검출가능한 표지물질로 표지되며, 상기 검출가능한 표지물질이 방사성 동위원소, 형광 물질, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소인, 키트.
  33. 샘플에서 PDL-1의 존재 또는 수준을 검출하는데 사용하기 위한 키트의 제조 방법으로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용하는, 제조 방법.
  34. 종양 또는 빈혈을 예방 또는 치료 또는 보조 치료 (adjuvant treatment) 또는 진단하기 위한 약학적 조성물로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며,
    상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는, 약학적 조성물.
  35. 종양 또는 빈혈을 예방 또는 치료 또는 보조 치료 (adjuvant treatment) 또는 진단하기 위한 약학적 조성물로서,
    제26항의 이중 기능성 항체 접합체를 포함하며,
    상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는, 약학적 조성물.
  36. 종양 또는 빈혈을 예방 또는 치료 또는 보조 치료 (adjuvant treatment) 또는 진단하기 위한 약학적 조성물로서,
    제28항의 다중특이성 항체를 포함하며,
    상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는, 약학적 조성물.
  37. 종양 또는 빈혈을 예방 또는 치료 또는 보조 치료 (adjuvant treatment) 또는 진단하기 위한 약제의 제조 방법으로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용하는, 제조 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 종양이 유방암, 폐암, 간암, 위암, 결장직장암, 식도암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 전립선암, 방광암, 췌장암, 신경교종, 흑색종 및 백혈병으로부터 선택되는, 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 폐암이 비-소 세포성 폐암인, 제조 방법.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 결장직장암이 대장암 또는 직장암인, 제조 방법.
  41. 종양 또는 빈혈을 예방 또는 치료 또는 보조 치료 (adjuvant treatment) 또는 진단하기 위한 약제의 제조 방법으로서,
    제26항의 이중 기능성 항체 접합체를 이용하는, 제조 방법.
  42. 종양 또는 빈혈을 예방 또는 치료 또는 보조 치료 (adjuvant treatment) 또는 진단하기 위한 약제의 제조 방법으로서,
    제28항의 다중특이성 항체를 이용하는, 제조 방법.
  43. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용한, a) 내지 d) 중 한가지 약물의 제조 방법:
    a) PD-1 또는 B7-1에 대한 PDL-1의 결합을 차단하기 위한 약물;
    b) PDL-1 활성 또는 PDL-1 수준을 하향 조절하기 위한 약물;
    c) PD-1 또는 PDL-1에 의한 면역 억제를 제거하기 위한 약물; 또는
    d) T 림프구에 의한 IFN-γ 및/또는 IL-2의 발현을 강화하기 위한 약물.
  44. 시험관내 방법으로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효량으로 세포에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 방법이,
    a) PD-1 또는 B7-1에 대한 PDL-1의 결합을 차단하는 방법;
    b) PDL-1 활성 또는 PDL-1 수준을 하향 조절하기 위한 방법;
    c) PD-1 또는 PDL-1에 의한 면역 억제를 제거하기 위한 방법; 또는
    d) T 림프구에 의한 IFN-γ 및/또는 IL-2의 발현을 강화하기 위한 방법인, 시험관내 방법.
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
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