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KR102503084B1 - 항-ctla4 및 항-pd-1 이작용성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

항-ctla4 및 항-pd-1 이작용성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR102503084B1
KR102503084B1 KR1020197008463A KR20197008463A KR102503084B1 KR 102503084 B1 KR102503084 B1 KR 102503084B1 KR 1020197008463 A KR1020197008463 A KR 1020197008463A KR 20197008463 A KR20197008463 A KR 20197008463A KR 102503084 B1 KR102503084 B1 KR 102503084B1
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펑 장
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아케소 파마슈티컬스, 인코포레이티드
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Abstract

항-CTLA4(세포독성 T 림프구 연관 항원4) 및 항-PD-1(예정 세포 사멸 1) 이작용성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도. 특히, 항-CLTA4 및 항-PD-1 이작용성 항체는 PD-1을 표적화하는 제1 단백질 작용성 도메인 및 CTLA-4를 표적화하는 제2 단백질 작용성 도메인을 포함한다. 이작용성 항체는 CTLA-4 및 PD-1에 결합할 수 있고, 구체적으로 유기체 상의 CTLA4 및 PD-1의 면역억제를 완화시킬 수 있고, 구체적으로 T 림프구를 활성화시킬 수 있고, 따라서 우수한 응용 가능성을 갖는다.

Description

항-CTLA4 및 항-PD-1 이작용성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도
본 발명은 종양 요법 및 분자 면역학 분야에 속한다. 본 발명은 항-CTLA4 및 항-PD-1 이중특이성 항체, 및 이의 약제학적 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 CTLA4 및 PD-1 단백질에 대항하는 단클론성 항체에 관한 것이다.
세포독성 T 림프구 연관 항원 4(CTLA4)는 유전자 구조, 염색체 위치, 서열 상동성 및 유전자 발현 면에서 CD28 분자와 밀접한 관계가 있고, 둘 모두 공동-자극성 분자 B7에 대한 수용체이고, 활성화된 T 세포의 표면 상에서 주로 발현된다. CTLA4와 B7의 상호작용은 마우스 및 인간에서 T 세포의 활성화를 억제하여, T 세포의 활성화를 음성적으로 조절한다.
항-CTLA4 항체 또는 CTLA4 리간드는 CTLA4가 이의 천연 리간드에 결합하는 것을 방지함으로써, CTLA4에 의한 T 세포에서 음성 신호 변환을 차단할 수 있고, 다양한 항원에 대한 T 세포의 반응성을 강화할 수 있고, 이는 생체내 및 시험관내 연구에서 둘 다에 의해 확인되었다. 현재, 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 악성 흑색종 등을 치료하기 위한 항-CTLA4 항체의 임상 시험이 진행 중이다(Grosso JF., Jure-Kunkel MN., CTLA-4 blockade in tumor models: an overview of preclinical and translational research. Cancer Immun. 2013; 13:5. Epub 2013 Jan 22).
T 세포에 의해 생산된 인터루킨 2(IL-2)는 T 세포의 특정한 하위군의 증식을 조절하는 사이토킨이며, 면역 반응을 조절하고 활성화된 B 세포의 증식을 촉진하고 항체 반응, 조혈 및 종양 감시에 참여하는 중요한 인자이다. 재조합 인간 IL-2는 악성 종양(흑색종, 신장 종양 등을 포함함)의 치료에 대해 미국 FDA에 의해 승인되었고, 만성 바이러스 감염을 치료하는 이의 임상 연구가 또한 진행 중이다(Chavez, A.R., et al., Pharmacologic administration of interleukin-2. Ann N Y Acad Sci, 2009. 1182: p.14-27). 시험관내 실험에서, 항-CTLA4 항체는 구체적으로 CTLA4의 면역억제를 제거하고, T 세포를 활성화시키고, IL-2의 세대를 유도할 수 있고, 이는 신생물 및 기생충 질환에 대한 요법에서 유망한 가능성을 나타낸다.
T 세포 기능에 대한 주요 인자로서, CTLA4 및 항-CTLA4 항체는 면역 미세환경에 개입함으로써 특정한 치료적 효과를 갖고, 이는 높은 효능을 나타내고 전통적인 의학을 보완하여, 요법에서 새로운 기회를 만들어낸다. CTLA4 및 항-CTLA4 항체의 치료적 효과는 다양한 전임상 및 임상 연구에서, 예를 들면, 천식 동물 모델에서 기도 과반응성의 억제, 류머티스성 질환의 발달의 방지, 및 동종 이식에서 면역 내성의 유도 등에서 조사된다. 한편, 단기 임상 시험에서 역효과가 확인되지 않았음에도 불구하고, CTLA4, 예를 들면, 항-CTLA4 항체를 표적화하는 약물의 장기 사용의 잠재적인 효과가 CTLA4-B7 신호 경로에 대한 과도한 차단으로 인하여 자가면역 질환을 유발할 수 있다는 것을 주의하여야 한다. 항체는 이의 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 표적 세포 용해를 유도하거나 병리의 진행을 차단할 수 있기 때문에, 항체, 특히 인간화 항체의 약물 개발은 악성 종양 또는 자가면역 질환을 치료하는데 매우 중요하다.
막관통 수용체 PD-1(예정 세포 사멸 1, 또한 PD-1로도 알려짐)은 CD28 유전자 패밀리의 일원이고, 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포에서 발현한다. PD-1, PDL1 및 PDL2의 수용체는 B7 수퍼패밀리에 속하고; 여기서 PDL1은 T 세포, B 세포, 내피 세포 및 상피 세포를 포함하는 다양한 세포에서 광범위하게 발현하고, PDL2는 오직 항원 제시 세포, 예를 들면, 수지상 세포 및 대식세포에서만 발현한다.
T 세포는 바이러스 감염을 제거하는데 중요한 역할을 하지만, T 세포 항바이러스 반응은 종종 면역병인과 연관된다. PD-1에 의해 매개된 T 세포 활성화의 음성 조절이 감염에 의해 유발된 조직 손상을 감소시키는데 중요함에도 불구하고, PD-1 경로의 차단 또는 억제는 자가면역 질환을 야기할 수 있고, 예를 들면, PD-1 유전자 녹아웃(knockout) 마우스는 췌장 바이러스 감염의 더 효과적인 제거를 보였지만 더 심각한 간 손상을 야기하였다(Iasi et al., 2003, j. Exp. J Med, 198, 39-50). 추가로, 높은 PD-1 발현을 갖는 종양은 종종 검출되기 어려운 암으로 발달한다(Hamanishi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-5). PD-1 발현을 조절하기 위하여 정립된 방법은 생체내 항체 주사를 통한 것이다.
PD-1 항체의 넓은 항종양 가능성 및 놀라운 효능으로 인하여, 일반적으로 PD-1 경로에 대항하는 항체는 다양한 종양, 즉, 비-소세포 폐암, 신장 세포 암종, 난소암, 흑색종(Homet M. B., Parisi G., et al., Anti-PD-1 Therapy in Melanoma. Semin Oncol. 2015 Jun;42(3):466-473), 백혈병 및 빈혈증(Held SA, Heine A, et al., Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML. Curr Cancer Drug Targets. 2013 Sep;13(7):768-74)의 치료에 돌파구를 야기할 것으로 생각된다. 2012년 및 2013년에 미국 암 연구 협회(American Association for Cancer Research: AACR) 및 미국 임상 종양 협회(American Society of Clinical Oncology: ASCO)의 연례 회의에서 전례 없는 임상 효능 데이터의 제시 이후로 줄곧, PD-1 항체는 전세계적인 약제학적 산업에서 R&D에서 가장 인기있는 신규한 약물이 되었다.
인터페론 감마(IFN-γ)는 특이적인 항원에 의해 자극된 후, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포에 의해, 또는 CD4+ Th1 세포 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)로 구성된 이펙터 T 세포에 의해 주요 자연적으로 생성된다. 중요한 선천 면역 및 후천 면역 사이토킨으로서, IFN-γ는 바이러스, 일부 박테리아 및 원생동물 감염을 길항작용하거나 억제하는데 중요한 역할을 한다. 그 동안, IFN-γ는 대식세포를 활성화시킬 수 있고, 2형 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 발현을 유도하여 종양의 진행을 제어하는 면역 반응을 활성화시킬 수 있다(SchoenbornJR, Wilson CB. Regulation of Interferon-gamma Durin g Innate and Adaptive Immune Responses. Advances in Immunology 2007; 96: 41-101).
단일 항원을 표적화하는 단클론성 항체(mAb)는 암, 염증, 감염 질환 등을 치료하는데 사용되어 왔다. 그러나, 많은 질환의 원인 및 생체내 인자는 생물학적 기능을 억제하거나 촉진하는 상이한 신호 경로에서 상이한 단백질, 사이토킨 또는 수용체의 상향 또는 하향 조절을 포함하여 복잡하다. 그러므로, 상이한 표적들을 동시에 차단하는 것은 치료 효능을 개선시킬 수 있고, 이는 상이한 표적과 약물의 조합에 의해 또는 다중 표적을 갖는 하나의 약물, 예를 들면, 다중특이성 항체에 의해 달성될 수 있다.
동시에 2개의 상이한 항원을 표적화하는 이작용성 항체로도 지칭되는 이중특이성 항체는 면역 분류 정제뿐만 아니라 결합 부위 최적화, 합성의 형식, 및 생산량에서 유연성을 갖고 유리한 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 현재는, 이중특이성 항체의 45개를 초과하는 형태가 존재한다(Muller D, Kontermann RE. Bispecific antibodies for cancer immunotherapy: Current perspectives. BioDrugs 2010; 24:89-98). 모리슨(Morrison)의 이름을 딴 IgG-scFv 구조는 많은 이중특이성 항체에서 사용되어 왔다(1997 Coloma MJ, Morrison SL. The Design and production of will be tetravalent bispecific antibodies. Nat Biotechnol. Nature Biotechnology, 1997; 15, 15, 9-163). IgG-scFv 구조를 갖는 이중특이성 항체는 천연 IgG 형식에 대한 이의 유사성으로 인하여 항체 조작, 발현 및 정제에서 이점을 갖는 이중특이성 항체의 이상적인 형태로서 입증되었다(Miller BR, Demarest SJ, et al., Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies. Protein Eng Des Sel 2010; 23:549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A. Rational engineering of antibody therapeutics targeting multiple oncogene pathways. MAbs 2011; 3:299-309).
그러나, 이중특이성 항체는 동일한 세포 상의 2개의 상이한 항원에 대항하는 것이 아닌, 2개의 상이한 세포의 표면 상의 항원에 대항하여 주로 개발되었다. 따라서, PD-1 및 CTLA4 둘 다에 대항하는 이중특이성 항체 약물은 개발될 필요가 있다.
깊은 연구 및 창조적인 작업을 통해, 항원으로서 포유동물 세포에 발현된 재조합 PD-1 또는 CTLA4로 면역화시킴으로써, 본 발명자들은 마우스 비장세포 및 골수종 세포의 융합을 통해 하이브리도마 세포를 수득하였다. 다수의 샘플을 스크리닝한 후, 본 발명자들은 하기 하이브리도마 세포주를 각각 수득하였다:
CCTCC 기탁 등록 번호 C201587로 중국 표준 균주 센터(China Center for Type Culture Collection: CCTCC)에 2015년 6월 16일에 보존된 하이브리도마 세포주 LT002(CTLA4-4G10); 및
CCTCC 기탁 등록 번호 C2015105로 중국 표준 균주 센터(CCTCC)에 2015년 6월 16일에 보존된 하이브리도마 세포주 LT003(PD-1-14C12).
본 발명자들은 놀랍게도 다음과 같은 쇄를 발견하였다:
하이브리도마 세포주 LT002는 CTLA4에 특이적으로 결합하는 특이적인 단클론성 항체(4G10로 명명됨)를 분비할 수 있고, 단클론성 항체는 B7에 대한 CTLA4의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
하이브리도마 세포주 LT003은 PD-1에 특이적으로 결합하는 특이적인 단클론성 항체(14C12로 명명됨)를 분비할 수 있고, 단클론성 항체는 PDL1에 대한 PD-1의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
추가로, 본 발명자들은 CTLA4에 대항하는 인간화된 항체(각각 4G10H1L1, 4G10H3L3, 4G10H4L3 및 8D2H14L2로 명명됨) 및 PD-1에 대항하는 인간화된 항체(14C12H1L1로 명명됨)를 창조적인 방식으로 발생시켰다.
추가로, 본 발명자들은 CTLA4 및 PD-1 둘 다에 결합할 수 있고 B7과 CTLA4의 상호작용, 및 PDL1과 PD-1의 상호작용을 차단할 수 있는 2종의 인간화된 항체의 재조합을 통해 일련의 신규한 인간화된 이중특이성 항체(각각 BiAb001 BiAb002 BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010로 명명됨)를 생성하였다. 이중특이성 항체는 인간 T 세포에 효과적으로 결합하여 이를 활성화시키고, 림프구가 IFN-γ 및 IL-2를 분비하도록 유도할 수 있고, 이는 암, 예를 들면, 폐암, 흑색종, 신장암, 난소암 및 백혈병의 예방 및 치료를 위한 약물로 제조될 가능성이 있다.
하기는 본 발명에 의해 제공된다:
본 발명은 제1 단백질 작용성 영역이 PD-1을 표적화하고, 제2 단백질 작용성 영역이 CTLA4를 표적화하는 이중특이성 항체에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 제1 및 제2 단백질 작용성 영역이 직접적으로 또는 연결 단편을 통해 연결되고; 바람직하게는, 연결 단편은 (GGGGS)n이고, n은 양의 정수, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 제1 및 제2 단백질 작용성 영역이 각각 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들면, 절반 항체(half antibody), Fab, F(ab')2 또는 단일 쇄 항체인, 상기 이중특이성 항체.
바람직하게는, 상기 제1 단백질 작용성 영역은 면역글로불린이고, 상기 제2 단백질 작용성 영역은 단일 쇄 항체이거나;
바람직하게는, 상기 제1 단백질 작용성 영역은 단일 쇄 항체이고, 상기 제2 단백질 작용성 영역은 면역글로불린이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 제1 단백질 작용성 영역 또는 제2 단백질 작용성 영역의 수량이 독립적으로 1, 2, 또는 그 초과인, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM; 바람직하게는 IgG, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 단일 쇄 항체가 면역글로불린의 중쇄의 c-말단에 부착되는, 상기 이중특이성 항체. 하나의 면역글로불린은 2개의 중쇄로 구성되기 때문에, 따라서 하나의 면역글로불린 분자는 2개의 단일 쇄 항체 분자에 연결된다. 바람직하게는, 2개의 상기 단일 쇄 항체 분자는 동일하다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서,
상기 면역글로불린의 중쇄 가변 영역이 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고, 상기 면역글로불린의 경쇄 가변 영역이 서열번호 32 내지 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고/하거나;
상기 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역이 서열번호 35 - 37, 또는 서열번호 35, 서열번호 41 및 서열번호 37, 또는 서열번호 42 내지 44의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고; 상기 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역이 서열번호 38 내지 40, 또는 서열번호 45 내지 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서,
상기 면역글로불린의 중쇄 가변 영역이 서열번호 35 내지 37, 또는 서열번호 35, 서열번호 41 및 서열번호 37, 또는 서열번호 42 내지 44의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고; 상기 면역글로불린의 경쇄 가변 영역이 서열번호 38 내지 40, 또는 서열번호 45 내지 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고/하거나;
상기 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역이 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고; 상기 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역이 서열번호 32 내지 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서,
상기 면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 16 또는 서열번호 20으로부터 선택되고; 상기 면역글로불린의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 18 또는 서열번호 22로부터 선택되고/되거나;
상기 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14 또는 서열번호 25로부터 선택되고; 상기 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12 또는 서열번호 27로부터 선택되는, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서,
상기 면역글로불린의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14 또는 서열번호 25로부터 선택되고; 단일 쇄 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12 또는 서열번호 27로부터 선택되고/되거나;
상기 단일 쇄 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 16 또는 서열번호 20으로부터 선택되고; 상기 면역글로불린의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열번호 18 또는 서열번호 22로부터 선택되는, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 면역글로불린이 마우스가 아닌 종, 예를 들면, 인간으로부터의 비-CDR 영역을 함유하는, 상기 이중특이성 항체.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 면역글로불린의 불변 영역은 인간화된다. 예를 들면, 중쇄의 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 등록: P01857이고; 경쇄의 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 등록: P01834이다.
본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 상기 이중특이성 항체가 약 10-5M 미만, 예를 들면, 약 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 또는 그 미만인 kD로 CTLA4 단백질 및/또는 PD-1 단백질에 결합하는, 상기 이중특이성 항체.
본 발명은 또한 이의 중쇄 가변 영역이 서열번호 29 내지 31, 서열번호 35 내지 37, 또는 서열번호 35, 서열번호 41, 및 서열번호 37, 또는 서열번호 42 내지 44, 및 서열번호 32 내지 34, 또는 서열번호 38 내지 40, 또는 서열번호 45 내지 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고; 경쇄 가변 영역이 서열번호 32 내지 34, 또는 서열번호 38 내지 40, 또는 서열번호 45 내지 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 이중특이성 항체에 관한 것이다.
바람직하게는, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역에서 CDR은 동일하지 않다.
본 발명은 항체의 중쇄 가변 영역을 인코딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 상기 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 29 내지 31, 서열번호 35 내지 37, 또는 서열번호 35, 서열번호 41, 및 서열번호 37, 또는 서열번호 42 내지 44로부터 선택되고; 서열번호 32 내지 34, 또는 서열번호 38 내지 40, 또는 서열번호 45 내지 47로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
본 발명은 항체의 경쇄 가변 영역을 인코딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 상기 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 32 내지 34, 또는 서열번호 38 내지 40, 또는 서열번호 45 내지 47로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
본 발명은 본 발명에 기재된 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 기재된 단리된 핵산 분자 또는 본 발명에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 적절한 조건하에 배양하고, 상기 이중특이성 항체를 세포 배양으로부터 회수함으로써, 본 발명에 기재된 이중특이성 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체 및 검출 가능한 마커로서 접합 파트너를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 접합 파트너는 방사성 동위원소, 플루오레세인, 발광 물질, 색채가 풍부한 성분, 또는 효소이다.
본 발명은 이중특이성 항체 또는 본 명세서에 기재된 접합체로 구성된 시약 키트에 관한 것이다.
구체적으로, 시약 키트는 상기 이중특이성 항체를 특이적으로 인식하는 2차 항체를 함유할 수 있고; 임의로, 이러한 2차 항체는 검출 가능한 마커, 예를 들면, 방사성 동위원소, 플루오레세인, 발광 물질, 색채가 풍부한 성분, 또는 효소를 함유할 수 있다.
본 발명은 샘플에서 CTLA4 및/또는 PD-1의 존재 또는 수준의 검출을 위한 시약 키트를 준비하기 위한 본 발명에 기재된 상기 이중특이성 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 상기 이중특이성 항체 또는 접합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 임의로, 이는 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명은 종양 또는 빈혈증의 예방 및/또는 치료, 종양 또는 빈혈증의 진단에 사용되는 약물을 제조하기 위한 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체 또는 접합체의 용도에 관한 것이고; 구체적으로, 상기 종양은 흑색종, 신장암, 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 비-소세포 폐암, 난소암 및 백혈병일 수 있다.
본 발명자들은 동물 실험을 통해 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체 BiAb004가 PD-1 HuGEMM 마우스의 우측에 피하 접종된 MC38 종양 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있고, PD-1 HuGEMM 종양 함유 마우스에서 종양 부피의 성장은 유의미하게 억제된다는 것을 발견하였다.
본 발명은 하기 목적의 약물을 제조하기 위한 본 발명에 기재된 이중특이성 항체 또는 접합체의 용도에 관한 것이다:
샘플에서 CTLA4 수준의 시험,
B7에 대한 CTLA4 결합의 차단,
CTLA4 활성 또는 CTLA4 수준의 조절(예를 들면, 하향조절),
CTLA4의 면역억제의 제거,
T 림프구의 활성화, 또는
T 림프구에서 IL-2 분비의 증가;
및/또는
PDL1에 대한 PD-1 결합의 차단,
PD-1 활성 또는 PD-1 수준의 조절(예를 들면, 하향조절),
PD-1의 면역억제의 제거, 또는
T 림프구에서 IFN-γ 분비의 증가.
본 발명은 본 발명에 기재된 이중특이성 항체 또는 접합체의 유효량을 필요한 세포 또는 대상체에 적용하는 생체내 또는 시험관내 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기로부터 선택된다:
샘플에서 CTLA4 수준의 시험,
B7에 대한 CTLA4 결합의 차단,
CTLA4 활성 또는 CTLA4 수준의 조절(예를 들면, 하향조절),
CTLA4의 면역억제의 제거,
T 림프구의 활성화, 또는
T 림프구에서 IL-2 분비의 증가;
및/또는
PDL1에 대한 PD-1 결합의 차단,
PD-1 활성 또는 PD-1 수준의 조절(예를 들면, 하향조절),
PD-1의 면역억제의 제거, 또는
T 림프구에서 IFN-γ 분비의 증가.
본 발명에서 시험관내 실험에서, 본 발명에 기재된 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-CTLA4-항-PD-1 이중특이성 항체는 모두 IFN-γ의 분비를 유도할 수 있고, 면역 반응을 활성화시킬 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체 또는 접합체의 유효량을 필요한 대상체에 적용하는 과정을 포함하는 종양 또는 빈혈증의 예방 및/또는 치료, 또는 종양 또는 빈혈증의 진단 방법에 관한 것이고; 구체적으로, 상기 종양은 흑색종, 신장암, 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 비-소세포 폐암, 난소암 또는 백혈병일 수 있다.
종양 또는 빈혈증의 예방 및/또는 치료, 또는 종양 또는 빈혈증의 진단을 위한 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체 또는 이의 접합체의 용도로서, 구체적으로, 상기 종양은 흑색종, 신장암, 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 비-소세포 폐암, 난소암 또는 백혈병일 수 있다.
하기 목적의 본 명세서에 기재된 이중특이성 항체 또는 이의 접합체의 용도:
B7에 대한 CTLA4 결합의 차단,
CTLA4 활성 또는 CTLA4 수준의 조절(예를 들면, 하향조절),
CTLA4의 면역억제의 제거
T 림프구의 활성화, 또는
T 림프구에서 IL-2 분비의 증가;
및/또는
PDL1에 대한 PD-1 결합의 차단,
PD-1 활성 또는 PD-1 수준의 조절(예를 들면, 하향조절),
PD-1의 면역억제의 제거, 또는
T 림프구에서 IFN-γ 분비의 증가.
항체 약물, 특히 단클론성 항체(MAB)는 다양한 질환의 치료에서 우수한 효능을 나타냈다. 치료적 항체를 수득하기 위한 전통적인 방법은 동물을 항원으로 면역화시켜 항원-특이적인 항체를 발생시키거나, 친화도 성숙에 의해 낮은 친화도 항체를 개선시키는 것이다. 그러나, 이들 방법은 시간- 및 노력-소모적이고, 종종 항원 상에서 특이적인 에피토프(epitope)를 표적화하지 않을 수 있다.
항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 이의 항원에 대한 항체의 결합을 결정하고; 각각의 쇄의 가변 영역은 3개의 고도의 가변 영역을 함유하고, 이는 상보성 결정 영역(CDR)이라 지칭된다(중쇄(H)의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 구성되고; 경쇄(L)의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 구성되고; 문헌[Kabat et al(Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition(1991), 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md)]에 의해 명명됨).
당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 통상적인 기술을 사용하여 VBASE2 데이터베이스를 통해 (1) - (13)에 열거된 단클론성 항체에서 CDR의 아미노산 서열을 분석하고, 결과는 하기와 같다:
(1) 14C12
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시된다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
HCDR1: GFAFSSYD(서열번호 29)
HCDR2: ISGGGRYT(서열번호 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY(서열번호 31)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LCDR1: QDINTY(서열번호 32)
LCDR2: RAN(서열번호 33)
LCDR3: LQYDEFPLT(서열번호 34)
(2) 14C12H1L1
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 22로 표시된다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 14C12의 것들과 동일하다.
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 14C12의 것들과 동일하다.
(3) 4G10
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시된다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
HCDR1: GYSFTGYT(서열번호 35)
HCDR2: INPYNNIT(서열번호 36)
HCDR3: ARLDYRSY(서열번호 37)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LCDR1: TGAVTTSNF(서열번호 38)
LCDR2: GTN(서열번호 39)
LCDR3: ALWYSNHWV(서열번호 40)
(4) 4G10H1L1
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시된다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 4G10의 것들과 동일하다.
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 4G10의 것들과 동일하다.
(5) 4G10H3L3
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 4G10의 것들과 동일하다.
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 4G10의 것들과 동일하다.
(6) 4G10H4L3
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시된다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
HCDR1: GYSFTGYT(서열번호 35)
HCDR2: INPYNDIT(서열번호 41)
HCDR3: ARLDYRSY(서열번호 37)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 4G10의 것들과 동일하다.
(7) 8D2H14L2
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시된다.
중쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
HCDR1: GFTFSDNW(서열번호 42)
HCDR2: IRNKPYNYET(서열번호 43)
HCDR3: TAQFAY(서열번호 44)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LCDR1: ENIYGG(서열번호 45)
LCDR2: GAT(서열번호 46)
LCDR3: QNVLRSPFTF(서열번호 47)
(8) BiAb001
중쇄 가변 영역의 9개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
HCDR1: GFAFSSYD(서열번호 29)
HCDR2: ISGGGRYT(서열번호 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY(서열번호 31)
HCDR4: GYSFTGYT(서열번호 35)
HCDR5: INPYNNIT(서열번호 36)
HCDR6: ARLDYRSY(서열번호 37)
HCDR7: TGAVTTSNF(서열번호 38)
HCDR8: GTN(서열번호 39)
HCDR9: ALWYSNHWV(서열번호 40)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LCDR1: QDINTY(서열번호 32)
LCDR2: RAN(서열번호 33)
LCDR3: LQYDEFPLT(서열번호 34)
(9) BiAb002
중쇄 가변 영역의 9개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
(10) BiAb003
중쇄 가변 영역의 9개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
(11) BiAb004
중쇄 가변 영역의 9개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
(12) BiAb007
중쇄 가변 영역의 9개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
HCDR1: GFAFSSYD(서열번호 29)
HCDR2: ISGGGRYT(서열번호 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY(서열번호 31)
HCDR4: GYSFTGYT(서열번호 35)
HCDR5: INPYNDIT(서열번호 41)
HCDR6: ARLDYRSY(서열번호 37)
HCDR7: TGAVTTSNF(서열번호 38)
HCDR8: GTN(서열번호 39)
HCDR9: ALWYSNHWV(서열번호 40)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
(13) BiAb010
중쇄 가변 영역의 9개의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:
HCDR1: GFAFSSYD(서열번호 29)
HCDR2: ISGGGRYT(서열번호 30)
HCDR3: ANRYGEAWFAY(서열번호 31)
HCDR4: GFTFSDNW(서열번호 42)
HCDR5: IRNKPYNYET(서열번호 43)
HCDR6: TAQFAY(서열번호 44)
HCDR7: ENIYGG(서열번호 45)
HCDR8: GAT(서열번호 46)
HCDR9: QNVLRSPFTF(서열번호 47)
경쇄 가변 영역의 3개의 CDR의 아미노산 서열은 BiAb001의 것들과 동일하다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양의 실험실 기술, 분자 유전학, 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 화학, 및 면역학은 당해 분야에서 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 한편, 본 발명을 더 잘 이해하기 위하여, 달리 지시되지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CTLA4(세포독성 T-림프구 항원 4)의 아미노산 서열"은 전장 CTLA4 단백질뿐만 아니라 CTLA4의 세포외 단편(CTLA4ECD), 또는 CTLA4ECD를 함유하는 단편, 또는 CTLA4ECD의 융합 단백질, 예를 들면, 마우스 또는 인간 IgG Fc 단편(mFc 또는 hFc)과의 융합의 단편을 지칭한다. 그러나, CTLA4 단백질의 아미노산 서열은 이의 생물학적 기능에 영향을 미치지 않는 천연 또는 인공 돌연변이 또는 변이(치환, 결실, 및/또는 부가를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)를 가질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 이해된다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "CTLA4 단백질"은 또한 천연 또는 인공 변이체를 함유하는 이들 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, CTLA4 단백질의 서열 단편을 지칭하는 경우, 천연 또는 인공 변이체를 함유하는 서열 단편이 또한 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "PD-1(예정 세포 사멸 단백질 1, NCBI 젠뱅크(GenBank): 005018nM)의 아미노산 서열"은 전장 PD-1 단백질뿐만 아니라 PD-1의 세포외 단편(PD-1ECD), 또는 PD-1ECD를 함유하는 단편, 또는 PD-1ECD의 융합 단백질, 예를 들면, 마우스 또는 인간 IgG Fc 단편(mFc 또는 hFc)과의 융합의 단편을 지칭한다. 그러나, PD-1 단백질의 아미노산 서열은 이의 생물학적 기능에 영향을 미치지 않는 천연 또는 인공 돌연변이 또는 변이(치환, 결실, 및/또는 부가를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)를 가질 수 있다는 것이 당해 분야의 숙련가에 의해 이해된다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "PD-1 단백질"은 또한 천연 또는 인공 변이체를 함유하는 이들 아미노산 서열을 포함한다. 추가로, PD-1 단백질의 서열 단편을 지칭하는 경우, 천연 또는 인공 변이체를 함유하는 서열 단편이 또한 포함된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 구체적으로 기재되지 않는 경우, 본 명세서에 기재된 B7 단백질은 이의 아미노산 서열이 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 기존의 문헌 또는 젠뱅크에 개시된 서열로부터 참조될 수 있는 B7-1 및/또는 B7-2 단백질이다. 예를 들면, B7-1(CD80, NCBI 유전자 ID: 941) 및 B7-2(CD86, NCBI 유전자 ID: 942).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "EC50"은 최대 효과의 50%의 농도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 일반적으로 두 쌍의 펩타이드(각각 "경"(L)쇄 및 "중"(H)쇄와 쌍을 이룸)로 구성되는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 일반적으로, 중쇄는 고분자량의 폴리펩타이드 쇄로 이해될 수 있고, 경쇄는 저분자량의 폴리펩타이드 쇄를 지칭한다. 항체의 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류되고, 항체의 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε 중쇄로 분류되고, 이는 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 항체를 정의한다.
경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역 및 불변 영역은 아미노산 약 12개 이상으로 구성된 "J" 영역을 통해 연결되고, 중쇄는 아미노산 약 3개 이상으로 구성된 "D" 영역을 또한 함유한다. 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 구조적 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)으로 구성된다. 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄의 불변 영역은 구조적 도메인 CL로 구성된다. 항체의 불변 영역은 다양한 면역 세포(예를 들면, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 보체 성분 1q(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 상대적으로 보존성인 영역에 의해 분리된, 가변성이 높은 영역(상보성 결정 영역(CDR)으로 알려짐)으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 순으로 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 각각의 중쇄/경쇄의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 영역 또는 도메인에 대한 아미노산의 할당은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.)(1987 and 1991), 또는 Chothia & Lesk(1987) j. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al.(1989) Nature 342:878-883]에 의한 정의를 따른다. 특히, 중쇄는 또한 3개 초과, 예를 들면, 6, 9, 또는 12개의 CDR을 함유할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 이중특이성 항체의 경우, 중쇄는 이의 C 말단에 연결된 또 다른 항체의 scFv를 갖는 IgG 항체의 중쇄일 수 있고, 따라서 이 중쇄는 9개의 CDR을 함유한다. 용어 "항체"는 항체를 제조하는 임의의 특정한 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 이는, 특히, 재조합 항체, 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 포함한다. 항체는 상이한 아이소폼, 예를 들면, IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은 동일한 항원에 특이적으로 결합하고/하거나 항원에 대항하는 전장 항체와 경쟁하는 능력을 유지하는, 전장 항체의 단편을 함유하는 폴리펩타이드를 지칭하고, 이는 또한 "항원 결합 부분"으로도 지칭된다. 모든 목적으로 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7(Paul, W., 2nd edition, Raven Press, N.Y.(1989))]을 참조한다. 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 단백질분해 효소 또는 화학물질에 의해 온전한 항체를 절단함으로써 제조될 수 있다. 몇몇 경우에, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 및 CDR 단편, 단일 쇄 항체(예를 들면, scFV), 키메라 항체, 다이아바디(diabody), 및 폴리펩타이드를 포함하고, 이는 특이적인 항원 결합 능력을 부여하는데 충분한 항체의 적어도 일부분을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "Fd 단편"은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 용어 "Fv 단편"은 항체의 단일 아암(arm)으로부터의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 용어 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다(Ward et al., Nature 341:544 546(1989)). 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 용어 "F(ab')2 단편"은 힌지(hinge) 영역에서 다이설파이드에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 함유하는 항체 단편을 지칭한다.
몇몇 경우에, 항체의 항원 결합 단편은 단일 폴리펩타이드 쇄가 함께 연결된 VL 및 VH 도메인으로 구성된 단일 쇄 항체(예를 들면, scFv)이다(예를 들면, 문헌[Bird et al., Science 242: 423-426(1988) 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883(1988) 참조). 이러한 scFv 분자는 공통적인 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH. 적절한 링커는 GGGGS 또는 이의 변이체의 반복부, 예를 들면, (GGGGS)4 또는 이의 변이체의 아미노산 서열일 수 있다(Holliger et al.,(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 다른 적용 가능한 링커는 문헌[Alfthan, et al.,(1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi, et al.,(2001) Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu, et al.,(1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al.,(1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 및 Roovers, et al.,(2001) Cancer Immunol]에 기재되었다.
몇몇 경우에, 항원 결합 단편은 다이아바디, 즉, 이량체 항체이고, 이의 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄 위에 이어지고, 동일한 쇄 위의 2개의 도메인 사이의 쌍을 이루게 하기에는 링커가 너무 짧기 때문에, 도메인은 또 다른 쇄 위의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 되어 2개의 항원 결합 부위를 발생시킨다(예를 들면, 문헌[Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993), 및 Poljak R. J. et al., Structure 2: 1121-1123(1994))을 참조한다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상적인 기술(예를 들면, 재조합 DNA 기술 또는 효소/화학 절단)을 사용하여 항원 결합 단편(예를 들면, 상기 기재된 항체 단편)은 제공된 항체로부터 수득될 수 있고, 완전한 항체에 대하여 동일한 방식으로 특이성이 선별될 수 있다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "항체"는 온전한 항체뿐만 아니라 항체의 항원 결합 단편을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mAb" 및 "단클론성 항체"는 고도로 균질한 항체 분자들의 집단으로부터의 항체 또는 항체 단편을 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들이 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론성 항체는 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대항하여 고도로 특이적이다. 다클론성 항체는 단클론성 항체와 상이하게, 일반적으로 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 적어도 2개 또는 그 이상의 상이한 항체를 함유한다. 단클론성 항체는 문헌[Kohler et al.,(Nature, 256: 495,(1975))]에 최초로 기술된 하이브리도마 기술뿐만 아니라 재조합 DNA 기술(미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 경쇄 및/또는 중쇄의 부분이 하나의 항체로부터 유래되고(특정한 종으로부터 유래되거나 특이적인 항체 분류 또는 하위분류에 속할 수 있음) 경쇄 및/또는 중쇄의 다른 부분이 또 다른 항체로부터 유래되는(동일하거나 상이한 종으로부터 유래되거나 동일하거나 상이한 항체 분류 또는 하위분류에 속할 수 있음) 항체를 지칭한다. 그럼에도 불구하고, 이는 항원 결합 활성을 보유한다(U.S.P to Cabilly et al., 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855(1984)).
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화된 항체"는 이의 CDR 또는 CDR의 부분이 비-인간 항체(공여자 항체)로부터의 CDR로 교체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)로부터 유도된 항체 또는 이의 단편을 지칭하고, 여기서 공여자 항체는 예측 가능한 특이성, 결합 친화도, 및 반응성이 있는 비-인간 항체(예를 들면, 마우스, 래트, 또는 토끼로부터의 것)일 수 있다. 추가로, 항체의 성능을 추가로 개선하거나 최적화하기 위하여, 수용자 항체의 프레임워크 영역(FR)의 일부 아미노산 잔기는 비-인간 종의 상응하는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있거나 다른 항체의 상응하는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있다. 인간화된 항체에 대한 더 상세한 내용에 대하여, 예를 들면, 문헌[Jones, et al., Nature, 321: 522-525(1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329(1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992); 및 Clark, Immunol. Today, 21: 397-402(2000)]을 참조한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. "에피토프"는 또한 당해 분야에서 "에피토프"는 "항원 결정인자"로 알려져 있다. 에피토프 또는 항원 결정인자는 일반적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 기, 예를 들면, 아미노산, 탄수화물 또는 글리코사이드 쇄로 구성되고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 예를 들면, 에피토프는 전형적으로 "선형" 또는 "입체형상"일 수 있는 독특한 공간 형상으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속적이거나 비연속적인 아미노산으로 구성된다. 예를 들면, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, volume 66, G. E. Morris, Ed.(1996)]을 참조한다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들면, 항체) 사이의 상호작용 지점은 1차 아미노산 서열에 따라 선형으로 존재하고; 입체형상 에피토프에서, 상호작용 지점은 1차 아미노산 서열에 따라 분리된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리하다" 또는 "단리된"은 인공적인 수단에 의해 천연 상태로부터 수득되는 것을 지칭한다. "단리된" 성분 또는 구성분이 천연에서 발생하면, 이의 천연 환경이 변화되었거나, 또는 물질이 천연 환경으로부터 단리되었거나, 또는 양쪽 모두일 것이다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 살아있는 동물에서 생체 내에서 천연적으로 발생하고, 동일한 천연 상태에서 고순도로 분리되는 경우, "단리된" 것으로 기술된다. 용어 "단리하다" 또는 "단리된"은 인공 또는 합성 물질의 존재, 또는 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순물의 존재를 배제하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이. 콜라이(E. coli) 발현 시스템"은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(균주) 및 벡터로 구성된 발현 시스템을 지칭하고, 여기서 이. 콜라이(균주)는 상업적으로 이용 가능하고, 이는 GI698, ER2566, BL21(DE3), B834(DE3) 및 BLR(DE3)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 전달 비히클을 지칭한다. 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 단백질을 발현할 수 있게 하는 벡터는 발현 벡터로 지칭된다. 벡터가 운반하는 유전 물질 성분이 숙주 세포 내에서 발현되도록, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 인공 염색체, 예를 들면, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC); 박테리오파지, 예를 들면, λ 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 벡터들이 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 동물 바이러스는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들면, 단순 헤르페스 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스(예를 들면, SV40)를 포함하지만 이들로 제한되지 않을 수 있다. 벡터는 프로모터, 전사 개시 인자, 인핸서, 선별 요소 및 리포터 유전자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 발현을 제어하기 위한 여러 성분을 포함할 수 있다. 추가로, 벡터는 또한 복제 개시 부위를 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 진핵생물 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 진균 세포, 예를 들면, 효모 및 아스페르길루스(Aspergillus), 곤충 세포, 예를 들면, S2 드로소필라(drosophila) 세포 및 Sf9, 또는 동물 세포, 예를 들면, 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK293 세포 또는 인간 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 벡터를 도입할 수 있는 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 경우에, 용어 "상동성"은 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 핵산 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되는 경우, 예를 들면, 2개의 DNA 분자에서의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성을 갖는다. 2개의 서열 사이의 "퍼센트 상동성"은 2개의 서열의 매칭된 위치의 수를 비교된 위치의 총 수로 나누고 100을 곱하는 함수에 의해 계산된다. 예를 들면, 2개의 서열의 10개의 위치 중 6개가 매칭되는 경우, 2개의 서열의 상동성은 60%이다. 예를 들면, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT의 상동성은 50%이다(6개의 위치 중 3개의 위치가 매칭된다). 일반적으로, 2개의 서열이 최대 동일성을 제공하도록 정렬되는 경우 비교된다. 이러한 정렬은 문헌[Needleman et al.(1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453]의 방법에 의해 실시되는 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, ALIGN 프로그램(DNAstar, Inc.)을 사용하여 단순하게 발생될 수 있다. 또는, ALIGN 프로그램(버전 2.0)으로 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller(Comput. Appl Biosci.，4:11-17(1988))]에 의해 제시된 알고리즘을 사용하여, PAM120 잔기 중량 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 2개의 서열의 퍼센트 상동성이 계산된다. 추가로, 문헌[Needleman and Wunsch(J MoI Biol. 4-453(1970))]의 알고리즘으로 실시된 GCG 소프트웨어 팩키지(www.gcg.com에서 이용 가능함)로 통합된 GAP 프로그램, 블로섬(Blossum) 62 매트릭스, PAM250 매트릭스뿐만 아니라 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하여 2개의 아미노산 서열의 퍼센트 상동성을 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적인 결합"은 2개의 분자 사이의 무작위가 아닌 결합, 즉, 항체와 항원 사이의 상호작용을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체(또는 항원에 특이성을 갖는 항체)는 약 10-5M 미만, 예를 들면, 10-6M, 10-7M, 10-8 M, 10-9M, 10-10M 미만 또는 훨씬 그 미만인 친화도(KD)로 항원에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 특이적인 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수를 지칭하고, 이는 항체과 항원 사이의 결합 친화도를 기술한다. 평형 해리 상수가 작을수록, 항체는 항원에 더 단단하게 결합하고, 항체와 항원 사이의 친화도는 더 높다. 일반적으로, 항체는, 예를 들면, 비아코어(BIACORE) 기기 상에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 측정한 바, 약 10-5M 미만, 특히, 약 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M, 또는 10-10M, 또는 그 미만의 해리 평형 상수(KD)로 항원에 결합한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론성 항체" 및 "mAb"는 동일한 의미를 갖고 상호 교환적으로 사용되고; 용어 "다클론성 항체" 및 "PcAb"는 동일한 의미를 갖고 상호 교환적으로 사용되고; 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 갖고 상호 교환적으로 사용된다. 또한 본 발명에서, 아미노산은 일반적으로 당해 분야에 알려진 단일 문자 또는 3 문자 약어로 표현된다. 예를 들면, 알라닌은 A 또는 Ala로 표현될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하이브리도마" 및 "하이브리도마 세포주"는 상호 교환적으로 사용되고, 용어 "하이브리도마" 및 "하이브리도마 세포주"가 사용되는 경우, 이들은 또한 하이브리도마 세포주의 서브클론 및 자손 세포를 포함한다. 예를 들면, 하이브리도마 세포주 LT002 또는 LT003을 지칭하는 경우, 이는 또한 하이브리도마 세포주 LT002 또는 LT003의 서브클론 및 자손 세포를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"는 약리학 및/또는 생리학에서 대상체 및 활성 성분에 대해 상용성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하고, 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있고(예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995] 참조), pH 조정제, 계면활성제, 아주반트, 이온 강도 강화제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들면, pH 조정제는 포스페이트 완충제를 포함하지만 이것으로 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 트윈(Tween) 80을 포함하지만 이들로 제한되지 않으며; 이온 강도 강화제는 염화나트륨을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아주반트"는 본 명세서에서 사용된 경우에, 용어 "아주반트"는 항원과 함께 또는 미리 신체에 전달되었을 때 항원에 대한 신체의 면역 반응을 강화할 수 있거나 면역 반응의 유형을 변화시킬 수 있는 비-특이적 면역 강화제를 지칭한다. 알루미늄 아주반트(예를 들면, 수산화알루미늄), 프로인트 아주반트(예를 들면, 완전 프로인트 아주반트 및 불완전 프로인트 아주반트), 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 지질다당류, 사이토킨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 아주반트가 있다. 프로인트 아주반트가 동물 실험에서 가장 통상적으로 사용되는 것이고, 수산화알루미늄이 임상 시험에서 널리 사용되는 것이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 효과를 부분적으로 또는 완전하게 달성하는데 충분한 양을 지칭한다. 예를 들면, 예방적 유효량(예를 들면, B7에 대한 CTLA4 결합 또는 CTLA4의 과반응성과 연관된 질환, 예를 들면, 종양)은 질환(예를 들면, B7에 대한 CTLA4 결합의 과반응성과 연관된 질환 또는 CTLA4의 과반응성과 연관된 질환, 예를 들면, 종양)을 예방하거나 중단시키거나 지연시키는데 충분한 치료제의 양으로서 정의되고; 치료적 유효량은 아픈 환자에서 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 중단시키는 치료제의 양이다. 이러한 유효량의 결정은 전적으로 당해 분야의 숙련가의 능력의 범위 내에 속한다. 예를 들면, 치료적 유효량은 질환의 중증도, 환자 자신의 면역계의 전체 상태, 환자의 일반적인 배경, 예를 들면, 연령, 체중 및 성별, 약물의 투여, 및 동일한 시기의 다른 치료에 따라 좌우될 것이다.
[발명의 효과]
본 발명에서 단클론성 항체, 4G10H1L1 및 4G10H3L3은 CTLA4에 특이적으로 결합할 수 있고, CLTA4 및 B7의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있으며, CLTA4의 면역억제를 특이적으로 제거하여 T 림프구를 활성화시킬 수 있다.
단클론성 항체 14C12H1L1은 CTLA4에 특이적으로 결합할 수 있고, CTLA4 및 B7의 상호작용을 효과적으로 차단하며, CTLA4의 면역억제를 특이적으로 제거하여 T 림프구를 활성화시킨다.
본 발명의 이중특이성 항체는 종양, 예를 들면, 흑색종, 신장암, 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 비-소세포 폐암, 난소암 및 백혈병의 예방 및/또는 치료를 위한 약물을 제조할 수 있는 가능성을 갖는다.
도 1. 단클론성 항체 4G10의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 마커 5㎕; BSA 1㎍.
도 2. 단클론성 항체 4G10H1L1의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 마커 5㎕.
도 3. 단클론성 항체 4G10H3L3의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 마커 5㎕.
도 4. 단클론성 항체 14C12H1L1의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 마커 5㎕; BSA 1㎍.
도 5. 이중특이성 항체 BiAb001의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 마커 5㎕; 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; BSA 1㎍.
도 6. 이중특이성 항체 BiAb002의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 마커 5㎕; 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; BSA 1㎍.
도 7. 이중특이성 항체 BiAb003의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 마커 5㎕; 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; BSA 1㎍.
도 8. 이중특이성 항체 BiAb004의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 마커 5㎕; 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; BSA 1㎍.
도 9. 이중특이성 항체 BiAb007의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 마커 5㎕; 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; BSA 1㎍.
도 10. 이중특이성 항체 BiAb010의 SDS-PAGE 결과. 좌로부터 우로: 마커 5㎕; 비-환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; 환원된 로딩 완충제 중의 항체 1㎍; BSA 1㎍.
도 11. 항체 4G10의 결합 동역학.
도 12. 항체 4G10 H1L1의 결합 동역학.
도 13. 항체 4G10H3L3의 결합 동역학.
도 14. 항체 4G10H4L3의 결합 동역학.
도 15. 항체 14C12의 결합 동역학.
도 16. 항체 14C12 H1L1의 결합 동역학.
도 17. CTLA4 및 항체 BiAb001의 결합 동역학.
도 18. CTLA4 및 항체 BiAb002의 결합 동역학.
도 19. CTLA4 및 항체 BiAb003의 결합 동역학.
도 20. CTLA4 및 항체 BiAb004의 결합 동역학.
도 21. CTLA4 및 항체 BiAb007의 결합 동역학.
도 22. PD-1 및 항체 BiAb001의 결합 동역학.
도 23. PD-1 및 항체 BiAb002의 결합 동역학.
도 24. PD-1 및 항체 BiAb003의 결합 동역학.
도 25. PD-1 및 항체 BiAb004의 결합 동역학.
도 26. PD-1 및 항체 BiAb007의 결합 동역학.
도 27. PD-1 및 항체 BiAb010의 결합 동역학.
도 28. CTLA4에 대한 4G10H1L1 및 4G10H3L3 결합의 간접 ELISA 결과.
도 29. B7에 대항하는 CTLA4에 대한 4G10H1L1 및 4G10H3L3 결합의 경쟁 ELISA 결과.
도 30. PD-1에 대한 14C12 및 14C12H1L1 결합의 간접 ELISA 결과.
도 31. PDL1에 대항하는 PD-1에 대한 14C12 및 14C12H1L1 결합의 경쟁 ELISA 결과.
도 32. CTLA4에 대한 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004 결합의 간접 ELISA 결과.
도 33. PD-1에 대한 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004 결합의 간접 ELISA 결과.
도 34. B7에 대항하는 CTLA4에 대한 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004 결합의 경쟁 ELISA 결과.
도 35. PDL1에 대항하는 PD-1에 대한 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004 결합의 경쟁 ELISA 결과.
도 36. 293T-CTLA4 세포의 표면 상의 CTLA4에 대한 4G10H1L1 결합의 EC50.
도 37. 293T-CTLA4 세포의 표면 상의 CTLA4에 대한 4G10H3L3 결합의 EC50.
도 38. 293T-PD-1 세포의 표면 상의 PD-1에 대한 14C12H1L1 결합의 EC50.
도 39. 293T-CTLA4 세포의 표면 상의 CTLA4에 대한 BiAb001 결합의 EC50.
도 40. 293T-CTLA4 세포의 표면 상의 CTLA4에 대한 BiAb002 결합의 EC50.
도 41. 293T-CTLA4 세포의 표면 상의 CTLA4에 대한 BiAb003 결합의 EC50.
도 42. 293T-CTLA4 세포의 표면 상의 CTLA4에 대한 BiAb004 결합의 EC50.
도 43. 293T-PD-1 세포의 표면 상의 PD-1에 대한 BiAb001 결합의 EC50.
도 44. 293T-PD-1 세포의 표면 상의 PD-1에 대한 BiAb002 결합의 EC50.
도 45. 293T-PD-1 세포의 표면 상의 PD-1에 대한 BiAb003 결합의 EC50.
도 46. 293T-PD-1 세포의 표면 상의 PD-1에 대한 BiAb004 결합의 EC50.
도 47. T 세포 표면 항원 CTLA4에 대한 4G10H3L3의 결합 활성.
도 48. T 세포 표면 항원 PD-1에 대한 14C12H1L1의 결합 활성.
도 49. 14C12H1L1 및 4G10H3L3의 것들과 비교된 T 세포 표면 항원에 대한 BiAb003 및 BiAb004의 결합 활성.
도 50. 혼합 림프구의 IFN-γ 분비에 대한 4G10H1L1 및 4G10H3L3의 효과.
도 51. 혼합 림프구의 IFN-γ 분비에 대한 14C12H1L1의 효과.
도 52. 14C12H1L1 및 4G10H1L1의 것들과 비교된 혼합 림프구의 IFN-γ 분비에 대한 BiAb001 및 BiAb002의 효과.
도 53. 14C12H1L1 및 4G10H3L3의 효과와 비교된 혼합 림프구의 IFN-γ 분비에 대한 BiAb003 및 BiAb004의 효과.
도 54. 혼합 림프구의 IL-2 분비에 대한 4G10H3L3의 효과.
도 55. 혼합 림프구의 IL-2 분비에 대한 14C12H1L1의 효과.
도 56. 14C12H1L1 및 4G10H3L3의 것들과 비교된 혼합 림프구의 IL-2 분비에 대한 BiAb003 및 BiAb004의 효과.
도 57. PBMC, MDA-MB-231 및 Raji 세포의 공동-배양에 의해 유도된 IL-2 분비에 대한 4G10H1L1 및 4G10H3L3의 효과.
도 58. PBMC, MDA-MB-231 및 Raji 세포의 공동-배양에 의해 유도된 IL-2 분비에 대한 14C12H1L1의 효과.
도 59. 4G10H1L1, 4G10H3L3, 및 14C12H1L1의 것들과 비교된 PBMC, MDA-MB-231 및 Raji 세포의 공동-배양에 의해 유도된 IL-2 분비에 대한 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 효과.
도 60. PD-1 HuGEMM 마우스에서 MC38 종양 모델의 종양 성장에 대한 BiAb004의 효과.
기탁된 생물학적 물질의 설명
LT002(CTLA4-4G10), 하이브리도마 세포주는 2015년 6월 16일에 중국 표준 균주 센터(CCTCC)에 보존되었다. 기탁 등록 번호: C201587, 기탁 장소: 중국 우한의 우한 대학, 우편 번호: 430072.
LT003(PD-1-14C12), 하이브리도마 세포주는 2015년 6월 16일에 중국 표준 균주 센터(CCTCC)에 보존되었다. 기탁 등록 번호: C2015105, 기탁 장소: 중국 우한의 우한 대학, 우편 번호: 430072.
본 발명은 이제 상세하게 설명될 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 인식될 것인 바와 같이, 하기 실시예는 오직 본 발명의 설명을 위하여 사용될 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 기술 또는 조건의 특정한 설명이 없는 경우는 당해 분야의 문헌(예를 들면, 문헌[Guide to Molecular Cloning, written by J Sambrook, et al, translated by Peitang Huang, et al, third Edition, Science Press])에 따라 또는 제품 사용 설명서에 따라 수행되었다. 특정한 제조사가 없는 시약 또는 기기는 모두 상업적으로 이용 가능한 통상적인 제품이었다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 사용된 T 세포는 아케소 바이오파마 인크(Akeso Biopharma, Inc.)로부터 입수하였고, BALB/C 마우스는 광동 메디칼 라보라토리 애니멀 센터(Guangdong Medical Laboratory Animal Center)로부터 구입하였다. 사용된 PD-1 HuGEMM 마우스는 난징 갤럭시 바이오파르마 코 엘티디(Nanjing Galaxy Biopharma Co., Ltd.)로부터 입수하였고; MC38 세포는 상하이 푸단 IBS 셀 센터(Shanghai Fudan IBS Cell Center)로부터 입수하였다.
실시예 1: 항-CTLA4 항체 4G10의 제조
1. 하이브리도마 세포주 LT002의 정립
항원으로서 CTLA4-mFc(인간 CTLA4 단백질(젠뱅크 ID: NP 005205.2) 세포외 영역 및 마우스 IgG1Fc 단백질의 융합 단백질)를 사용하여, 면역화된 BALB/C 마우스(광동 메디칼 라보라토리 애니멀 센터로부터 구입함)의 비장세포 및 마우스 골수종 세포를 현재 정립된 방법으로(예를 들면, 문헌[Stewart, S.J., "Monoclonal Antibody Production", in Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds.G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000]) 융합하여 하이브리도마 세포를 수득하였다.
TEV 프로테아제로 융합 단백질 CTLA4-mFc를 소화시켜 CTLA4 단백질을 생성하고, 정제 칼럼으로 추가로 정제하였다. 마이크로플레이트를 항원으로서 CTLA4로 코팅하고, 상기 하이브리도마 세포를 간접 ELISA로 선별하여 CTLA4에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 분비하는 것들을 선택하였다. 간접 ELISA를 통해 선별된 하이브리도마 세포를 리간드 B7-1(CD80, NCBI 유전자 ID: 941) 및 B7-2(CD86, NCBI 유전자 ID: 942)에 대항하는 경쟁 ELISA로 추가로 선별하여 CTLA4에 경쟁적으로 결합하는 단클론성 항체를 분비하는 것들을 선택한 다음, 안정한 하이브리도마 세포주를 제한된 희석 방법에 의해 수득하였다. 이러한 하이브리도마 세포주를 LT002(CTLA4-4G10)로 명명하였고, 이의 분비된 단클론성 항체를 4G10으로 명명한다.
LT002(CTLA4-4G10), 하이브리도마 세포주는 2015년 6월 16일에 중국 표준 균주 센터(CCTCC)에 보존되었다. 기탁 등록 번호: C201587, 기탁 장소: 중국 우한의 우한 대학, 우편 번호: 430072.
2. 항-CTLA4 항체 4G10의 제조
10% 저 IgG 소 태아 혈청을 함유한 IMDM 배지(1% 스트렙토마이신을 함유한 IMDM 배지, 5% CO2, 37℃에서 세포 배양기에서 배양됨)를 사용하여 본 발명의 LT002 세포를 배양한 다음, 7일 배양 후, 세포 배양 상청액을 수확하고, 고속 원심분리로 정제하고, 미세다공성 막 및 HiTrap 단백질 A HP 칼럼을 통한 여과로 항체 4G10을 수득하였다. 정제된 4G10을 SDS-PAGE 전기영동에서 확인하였고, 결과를 도 1에 나타냈다.
실시예 2: 항-CTLA4 항체 4G10의 서열 분석
항체 4G10의 서열 분석
세포/박테리아 총 RNA 추출 시약 키트(티아젠(Tiangen), 제품 번호 DP430)의 설명서에 따라 상기 실시예 1에서 제조된 하이브리도마 세포주 LT002로부터 mRNA를 추출하였다.
RT-PCR를 위하여 인비트로겐 수퍼스크립트(Invitrogen SuperScript)(등록상표) III 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템(First-Strand Synthesis System)을 사용하여 cDNA를 합성하고, PCR로 증폭시켰다.
pEASY-T1 클로닝 키트(Cloning Kit)(트라스젠(Transgen) CT101)의 설명서에 따라 PCR 증폭된 생성물에 대하여 TA 클로닝을 직접적으로 수행하였다.
TA 클로닝의 생성물을 직접적으로 서열 분석하였고, 서열 분석 결과는 하기와 같았다:
중쇄 가변 영역의 핵산 서열: (372bp)
CAGGTCAAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAACCTTGAATGGATTGGACTTATTAATCCTTACAATAATATTACTAACTACAACCAGAAGTTCATGGGCAAGGCCACATTTACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGACTGACATCTGAAGACTCTGGAGTCTATTTCTGTGCAAGACTCGACTATAGGTCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT(서열번호 1)
인코딩된 아미노산 서열: (124aa)
QVKLQESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNNITNYNQKFMGKATFTVDKSSSTAYMELLRLTSEDSGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVY(서열번호 2)
경쇄 가변 영역의 핵산 서열: (378bp)
CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTTTGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTAGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCAAGGGCAATTCTGC(서열번호 3)
인코딩된 아미노산 서열: (126aa)
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNFANWVQEKPDHLFTSLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGQPKSSPSVTLFQGQFC(서열번호 4)
실시예 3: CTLA4에 대항하는 인간화된 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 4G10H4L3의 디자인 및 제조
1. 항-CTLA4 인간화된 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 4G10H4L3의 경쇄 및 중쇄 서열의 디자인
CTLA4 단백질의 3차원 결정 구조(Nat. Struct. Biol.,(1997) 4 p.527) 및 실시예 2에서 수득된 항체 4G10의 아미노산 서열을 기초로, 항체 컴퓨터 가상 환경(in silico) 모델링을 수행하고, 마우스형으로부터 인간형으로의 아미노산의 돌연변이를 조작하여 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 4G10H4L3의 가변 영역의 아미노산 서열(중쇄의 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 등록: P01857이고, 경쇄의 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 등록: P01834이었음)을 수득하였다.
가변 영역의 디자인된 서열은 하기와 같다:
(1) 인간화된 단클론성 항체 4G10H1L1의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 핵산 서열: (345bp)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCTCTTGCAAGGCCAGCGGATACAGTTTCACTGGCTATACCATGAACTGGGTCAAACAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGGCTGATTAATCCTTACAACAACATCACCAACTACAACCAGAAGTTCATGGGAAAAGCAACCTTTACAGTGGACAAGAGCATTTCCACAGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGACTTCAGACGATAGCGGGGTCTATTTTTGTGCAAGGCTGGATTATCGCTCTTACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACTGTCTCCGCT(서열번호 5)
인코딩된 아미노산 서열: (115aa)
QVQLVESGAELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQAPGQGLEWIGLINPYNNITNYNQKFMGKATFTVDKSISTAYMELSRLTSDDSGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA(서열번호 6)
경쇄 가변 영역의 핵산 서열: (327bp)
CAGGCTGTCGTCACTCAGGAACCTTCACTGACTGTGAGCCCAGGAGGAACTGTCACCCTGACATGCGGAAGCTCCACCGGAGCAGTGACCACATCCAACTTCGCCAATTGGGTCCAGGAAAAGCCAGGCCAGGCATTTCGATCCCTGATCGGAGGCACAAACAATCGGGCTTCTTGGGTGCCCGCAAGATTCTCAGGAAGCCTGCTGGGGGGAAAAGCCGCTCTGACCATTAGTGGCGCTCAGCCTGAGGACGAAGCCGAGTACTTCTGCGCTCTGTGGTATAGCAACCACTGGGTGTTTGGCGGGGGAACAAAGCTGACTGTGCTG(서열번호 7)
인코딩된 아미노산 서열: (109aa)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNFANWVQEKPGQAFRSLIGGTNNRASWVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(서열번호 8)
(2) 인간화된 단클론성 항체 4G10H3L3의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 핵산 서열: (345bp)
CAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCGCCTCAGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCCAGCGGGTACAGTTTCACTGGATATACCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCCAGGGGCTGGAGTGGATCGGCCTGATTAACCCTTACAACAACATCACTAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGGAGAGTGACCTTTACAGTGGACACCAGCATTTCCACAGCCTACATGGAACTGTCCCGGCTGAGATCTGACGATACAGGCGTGTACTTCTGCGCTAGGCTGGATTACCGCAGCTATTGGGGACAGGGCACACTGGTGACTGTCAGCGCA(서열번호 9)
인코딩된 아미노산 서열: (115aa)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWIGLINPYNNITNYAQKFQGRVTFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA(서열번호 10)
경쇄 가변 영역의 핵산 서열: (327bp)
CAGGCTGTCGTCACTCAGGAACCTTCACTGACCGTGTCTCCTGGCGGGACTGTCACCCTGACATGCGGCAGCTCCACAGGGGCCGTGACCACAAGTAACTTCCCAAATTGGGTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCCCGGAGTCTGATCGGAGGCACCAACAACAAGGCCAGCTGGACACCCGCACGGTTCAGCGGCAGCCTGCTGGGCGGCAAGGCCGCTCTGACAATTAGCGGAGCCCAGCCTGAGGACGAAGCCGAGTACTATTGCGCTCTGTGGTACTCCAACCACTGGGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACTGTGCTG(서열번호 11)
인코딩된 아미노산 서열: (109aa)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNFPNWVQQKPGQAPRSLIGGTNNKASWTPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEAEYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL(서열번호 12)
(3) 인간화된 단클론성 항체 4G10H4L3의 중쇄 및 경쇄 서열
중쇄 가변 영역의 핵산 서열: (345bp)
CAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCGCCTCAGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCCAGCGGGTACAGTTTCACTGGATATACCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCCAGGGGCTGGAGTGGATCGGCCTGATTAACCCTTACAACGACATCACTAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGGAGAGTGACCTTTACAGTGGACACCAGCATTTCCACAGCCTACATGGAACTGTCCCGGCTGAGATCTGACGATACAGGCGTGTACTTCTGCGCTAGGCTGGATTACCGCAGCTATTGGGGACAGGGCACACTGGTGACTGTCAGCGCA(서열번호 13)
인코딩된 아미노산 서열: (115aa)
QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWIGLINPYNDITNYAQKFQGRVTFTVDTSISTAYMELSRLRSDDTGVYFCARLDYRSYWGQGTLVTVSA(서열번호 14)
경쇄 가변 영역의 핵산 및 인코딩된 아미노산 서열은 4G10H3L3의 것들과 동일하다.
2. 인간화된 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 4G10H4L3의 제조
중쇄의 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 등록: P01857이었다. 경쇄의 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 등록: P01834이었다.
4G10H1L1, 4G10H3L3, 4G10H4L3의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA를 pUC57심플 벡터로 개별적으로 클로닝하여 각각 pUC57심플-4G10H1 및 pUC57심플-4G10L1, pUC57심플-4G10H3 및 pUC57심플-4G10L3, 및 pUC57심플-4G10H4 및 pUC57심플-4G10L3을 수득하였다. 이들을 pcDNA3.1 벡터로 서브클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 293F 세포로 형질감염시키고, 배양 배지를 수확하고 정제하여 인간화된 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 4G10H4L3을 수득하였다. 정제된 4G10H1L1 및 4G10H3L3을 SDS-PAGE 전기영동으로 확인하고, 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타냈다.
실시예 4: 항-PD-1 항체 14C12의 제조
1. 하이브리도마 세포주 LT003의 정립
항원으로서 PD-1-mFc를 사용하여, 면역화된 BALB/C 마우스(광동 메디칼 라보라토리 애니멀 센터로부터 구입함)의 비장세포 및 마우스 골수종 세포를 현재 정립된 방법으로(예를 들면, 문헌[Stewart, S.J., "Monoclonal Antibody Production", in Basic Methods in antibody Production and Characterization, Eds.G.C. Howard and D.R. Bethell, Boca Raton: CRC Press, 2000]) 융합하여 하이브리도마 세포를 수득하였다.
마이크로플레이트를 항원으로서 PD-1-mFc로 코팅하고, 간접 ELISA를 사용하여 PD-1에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 선별하였다.
경쟁 ELISA로 하이브리도마 세포를 추가로 선별하여 리간드 PDL1-hFc(PDL1 젠뱅크 ID: NP_054862.1)에 대항하여 PD-1에 경쟁적으로 결합하는 항체를 분비하는 것들을 선택한 다음, 제한된 희석 방법에 의해 안정한 하이브리도마 세포주 LT003(PD-1-14C12)를 수득하였고, 이의 분비된 단클론성 항체는 14C12로 명명한다.
LT003(PD-1-14C12), 하이브리도마 세포주는 2015년 6월 16일에 중국 표준 균주 센터(CCTCC)에 보존되었다. 기탁 등록 번호: C2015105, 기탁 장소: 중국 우한의 우한 대학, 우편 번호: 430072.
2. 항-PD-1 항체 14C12의 제조
10% 저 IgG 소 태아 혈청을 함유한 IMDM 배지(1% 스트렙토마이신을 함유한 IMDM 배지, 5% CO2, 37℃에서 세포 배양기에서 배양됨)를 사용하여 본 발명의 LT003 세포를 배양한 다음, 7일 배양 후, 세포 배양 상청액을 수확하고 정제하여 항체 14C12를 수득하였다.
실시예 5: 항체 14C12의 서열의 획득
항체 14C12의 서열의 획득
세포/박테리아 총 RNA 추출 시약 키트(티아젠, 제품 번호 DP430)의 설명서에 따라 상기 실시예 4에서 제조된 하이브리도마 세포주 LT003으로부터 mRNA를 추출하였다.
RT-PCR를 위하여 인비트로겐 수퍼스크립트(등록상표) III 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템을 사용하여 cDNA를 합성하고, PCR로 증폭시켰다.
pEASY-T1 클로닝 키트(트라스젠 CT101)의 설명서에 따라 PCR 증폭된 생성물에 대하여 TA 클로닝을 직접적으로 수행하였다.
TA 클로닝의 생성물을 직접적으로 서열 분석하였고, 서열 분석 결과는 하기와 같았다:
중쇄 가변 영역의 핵산 서열: (354bp)
GAGGTCAAACTGGTGGAGAGCGGCGGCGGGCTGGTGAAGCCCGGCGGGTCACTGAAACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCATGGGTGAGGCAGACCCCTGAGAAGCGCCTGGAATGGGTCGCTACTATCAGCGGAGGCGGGCGATACACCTACTATCCTGACTCTGTCAAAGGGAGATTCACAATTAGTCGGGATAACGCCAGAAATACTCTGTATCTGCAGATGTCTAGTCTGCGGTCCGAGGATACAGCTCTGTACTATTGTGCAAACCGGTACGGCGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTGCC(서열번호 15)
인코딩된 아미노산 서열: (118aa)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSA(서열번호 16)
경쇄 가변 영역의 핵산 서열: (318bp)
GACATTAAGATGACACAGTCCCCTTCCTCAATGTACGCTAGCCTGGGCGAGCGAGTGACCTTCACATGCAAAGCATCCCAGGACATCAACACATACCTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGCAAAAGCCCCAAGACCCTGATCTACCGGGCCAATAGACTGGTGGACGGGGTCCCCAGCAGATTCTCCGGATCTGGCAGTGGGCAGGATTACTCCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGTATGAAGACATGGGCATCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCTCTGACCTTTGGAGCAGGCACAAAACTGGAACTG(서열번호 17)
인코딩된 아미노산 서열: (106aa)
DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLEL(서열번호 18)
실시예 6: PD-1에 대항하는 인간화된 항체 14C12H1L1의 디자인, 제조 및 검정
1. 인간화된 항체 14C12H1L1의 경쇄 및 중쇄 서열의 디자인
PD-1 단백질의 3차원 결정 구조(Shinohara T, et al., Structure and chromosomal localization of the human PD-1 gene(PDCD1). Genomics 1995, 23(3): 704-6) 및 실시예 5에서 수득된 항체 14C12의 아미노산 서열을 기초로, 항체 컴퓨터 가상 환경 모델링을 수행하고, 마우스형으로부터 인간형으로의 아미노산의 돌연변이를 조작하여 항체 14C12H1L1의 가변 영역의 아미노산 서열을 수득하였다.
가변 영역의 디자인된 서열은 하기와 같다:
중쇄 가변 영역의 핵산 서열: (354bp)
GAAGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGGCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCAGCTTCCGGATTCGCCTTTAGCTCCTACGACATGTCCTGGGTGCGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGATTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGATACACCTACTATCCTGACAGCGTCAAGGGCCGGTTCACAATCTCTAGAGATAACAGTAAGAACAATCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCACTGTACTATTGTGCCAACCGCTACGGGGAAGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT(서열번호 19)
인코딩된 아미노산 서열: (118aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSS(서열번호 20)
경쇄 가변 영역의 핵산 서열: (321bp)
GACATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCCATGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGGGTCACCTTCACATGCCGCGCTAGTCAGGATATCAACACCTACCTGAGCTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAAAGCCCCAAGACACTGATCTACCGGGCTAATAGACTGGTGTCTGGAGTCCCAAGTCGGTTCAGTGGCTCAGGGAGCGGACAGGACTACACTCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACATGGCAACCTACTATTGCCTGCAGTATGATGAGTTCCCACTGACCTTTGGCGCCGGGACAAAACTGGAGCTGAAG(서열번호 21)
인코딩된 아미노산 서열: (107aa)
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK(서열번호 22)
2. 인간화된 항체 14C12H1L1의 제조 및 SDS-PAGE 전기영동
중쇄의 불변 영역은 Ig 감마-1 쇄 C 영역, 등록: P01857이고; 경쇄의 불변 영역은 Ig 카파 쇄 C 영역, 등록: P01834이다.
14C12H1L1의 중쇄 cDNA 및 경쇄 cDNA를 pcDNA3.1 벡터로 개별적으로 클로닝하여 재조합 발현 플라스미드를 수득하였다. 재조합 플라스미드를 293F 세포로 형질감염시켰다. 293F 세포 배양 배지를 정제하고 시험하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 환원된 표적 단백질이 약 24.5kD 및 49kD에서 나타났고, 비-환원된 표적 단백질이 약 147kD에서 나타났다.
실시예 7: 이중특이성 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010의 중쇄 및 경쇄의 서열 디자인, 발현 및 검정
1. 서열 디자인
본 발명의 이중특이성 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010는 모두 모리슨 디자인(IgG-scFv)에 속하고, 여기서 IgG 항체의 각각의 중쇄는 또 다른 항체의 scFv 단편과 연결된다. 중쇄 및 경쇄의 구성은 하기 표 1이 나타난다.
[표 1]
Figure 112019038465404-pct00001
표 1에서: (1) 아래첨자 "V"로 표시된 항체 서열은 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 지칭한다. 아래첨자 "V"가 없는 것은 불변 영역의 전장 중쇄 또는 경쇄이다. 이들 가변 영역 또는 아미노산의 전장 서열 및 이들의 코딩 핵산 서열은 상기 실시예에 기재된 상응하는 서열을 구현한다.
(2) 링커 1 아미노산 서열은 (GGGGS)3(서열번호 23)이다.
링커 2 아미노산 서열은 (GGGGS)4(서열번호 24)이다.
(3) 8D2H14L2의 중쇄 가변 영역(8D2H14V)의 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSSRLSCAASGFTFSDNWMNWVRQAPGKGLEWLAQIRNKPYNYETYYSASVKGRFTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTGVYYCTAQFAYWGQGTLVTVSS(서열번호 25)
8D2H14V의 인코딩된 핵산 서열:
GAGGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCTCCCGGCTGTCATGTGCCGCTAGCGGCTTCACCTTTTCCGACAACTGGATGAATTGGGTGCGACAGGCACCAGGCAAAGGACTGGAGTGGCTGGCTCAGATCCGGAACAAGCCCTACAATTATGAAACATACTATAGCGCCTCCGTGAAAGGCCGGTTCACTATTAGTAGAGACGATTCTAAGAACAGCGTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAGACAGAGGATACTGGCGTCTACTATTGCACAGCACAGTTTGCCTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTCTCTAGT(서열번호 26)
(4) 8D2H14L2의 경쇄 가변 영역(8D2L2V)의 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYGGLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLASGVSSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNVLRSPFTFGSGTKLEIK(서열번호 27)
8D2L2V의 인코딩된 핵산 서열:
GACATCCAGATGACTCAGAGCCCCTCAAGCCTGTCTGCAAGTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACATGTCGCACCTCCGAAAACATCTACGGGGGACTGAATTGGTATCAGCGCAAGCCCGGCAAATCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCTACCAACCTGGCATCTGGGGTGTCCTCTCGATTTTCAGGGAGCGGCAGCGGCACCGACTATACTCTGACCATTAGTTCACTGCAGCCTGAGGATGTGGCCACATACTATTGCCAGAATGTCCTGAGATCACCATTCACTTTTGGGAGCGGAACCAAACTGGAAATTAAG(서열번호 28)
2. 항체 BiAb001의 발현 및 정제
BiAb001의 중쇄 및 경쇄의 cDNA를 pUC57심플 벡터(젠스크립트(GenScript)에 의해 제공됨)로 개별적으로 클로닝하여 플라스미드 pUC57심플-BiAb001H 및 pUC57심플-BiAb001L을 각각 수득하였다.
pUC57심플-BiAb001H 및 pUC57심플-BiAb001L을 효소(HindIII&EcoRI)로 개별적으로 소화시키고, 전기영동을 통해 회수된 중쇄 및 경쇄의 유전자를 pcDNA3.1 벡터로 각각 서브클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 추출하고, 293F 세포로 공동-형질감염시켰다. 7일 배양 후, 배양 상청액을 고속 원심분리 및 농축에 의해 수확하고, 1 단계로 HiTrap 단백질 A HP 칼럼 상의 로딩 및 일루션(Elution) 완충제로 용리시킴으로써 정제하여 항체를 수득하고 PBS 중에 저장하였다.
정제된 항체 샘플을 환원된 단백질 전기영동 로딩 완충제 및 비-환원된 단백질 전기영동 로딩 완충제에 각각 가하였다. 끓인 후, 샘플을 SDS-PAGE 전기영동 상에서 시험하였다. BiAb001 전기영동의 결과는 도 5에 나타내고, 여기서 환원된 단백질 샘플은 23.6kD 및 75.8kD에서 나타나고, 비-환원된 단백질 샘플(개별 항체)는 199kD에서 나타났다.
3. 항체 BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010의 발현 및 정제
BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010의 정제된 항체를 BiAb001의 제조에 사용된 상기 언급된 방법에 따라 수득하였다.
정제된 항체 샘플을 환원된 단백질 전기영동 로딩 완충제 및 비-환원된 단백질 전기영동 로딩 완충제에 각각 가하였다. 끓인 후, 샘플을 SDS-PAGE 전기영동 상에서 시험하였다. BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010 전기영동의 결과를 도 6, 7, 8, 9 및 10에 각각 나타내고, 여기서 환원된 단백질 샘플은 23.6kD 및 75.8kD에서 나타나고, 비-환원된 단백질 샘플(개별 항체)은 199kD에서 나타났다.
실시예 8: 항체 결합 동역학의 결정
포르테비오(Fortebio) 분자 상호작용 기기로 항원 및 항체의 결합 동역학을 측정하였다.
1. 항원 CTLA4에 대한 항체 4G10 및 이의 인간화된 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3, 및 4G10H4L3의 결합 동역학을 측정하였다.
1.1 TEV 프로테아제에 의한 CTLA4-mFc 소화 및 칼럼 정제로 CTLA4 항원을 수득하였다.
1.2 항체 4G10을 아민 커플링 방법으로 AR2G 바이오센서스(Biosensors)에 고정화시킨 다음, 에탄올아민 및 PBST 중의 평형으로 차단한 다음, CTLA4에 결합시켰다. CTLA4를 268.1, 134.1, 67, 33.5, 16.8, 8.38, 4.19, 및 0nM의 농도로 PBST로 이중 구배 희석시켰다. 해리가 또한 PBST 중에 있었다. 180, 90, 45, 22.5, 11.25, 5.625, 2.813 및 0nM의 항원 농도로 인간화된 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 4G10H4L3을 4G10의 것과 유사한 방법으로 측정하였다.
1.3 항원 CTLA4에 대한 항체 4G10 및 이의 인간화된 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3, 및 4G10H4L3의 결합 동역학을 하기 표 1, 및 도 11, 도 12, 도 13 및 도 14에 각각 나타낸다.
2. 항원 PD-1에 대한 항체 14C12 및 이의 인간화된 항체 14C12H1L1 결합 동역학
2.1 TEV 프로테아제에 의한 PD-1-mFc 소화 및 칼럼 정제로 PD-1 항원을 수득하였다.
2.2 항원 PD-1(1㎍/㎖의 항원 농도)을 비오틴으로 표지화한 후, SA 센서의 표면 위에 고정화시키고, PBST 중의 평형 후, 이는 항체 14C12 및 14C12H1L1에 각각 결합한다. 항체를 200nM로부터 매회 3배 묽게 PBST로 희석하고, 해리가 또한 PBST 중에서 있었다.
2.3 항원에 대한 항체 14C12 및 14C12H1L1의 결합 동역학을 하기 1 및 도 15 및 16에 나타낸다.
3. 항원 CTLA4에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010의 결합 동역학.
3.1 CTLA4(1㎍/㎖ 항원 농도)를 비오틴으로 표지화한 후, SA 센서의 표면 상에 고정화시키고, PBST 중의 평형 후, 이는 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010에 각각 결합한다. 항체를 200nM로부터 매회 3배 묽게 PBST로 희석하고, 해리가 또한 PBST 중에서 있었다.
3.2 항원 CTLA4에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010의 결합 동역학을 표 1 및 도 17-21에 각각 나타낸다.
4. 항원 PD-1에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010의 결합 동역학
4.1 항원 PD-1(1㎍/㎖의 항원 농도)을 비오틴으로 표지화한 후, SA 센서의 표면 상에 고정화시키고, PBST 중의 평형 후, 이는 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010에 각각 결합한다. 항체를 200nM로부터 매회 3배 묽게 PBST로 희석하였다. 해리가 또한 PBST 중에서 있었다.
4.2 항원 PD-1에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, BiAb004, BiAb007 및 BiAb010의 결합 동역학을 표 2, 및 도 22 내지 도 27에 나타낸다.
[표 2]
Figure 112019038465404-pct00002
결과는 하기를 나타냈다:
항체 4G10 및 이의 인간화된 항체는 항원 CTLA4에 대하여 우수한 친화도를 갖는다. 항체 14C12 및 14C12H1L1은 둘 다 항원 PD-1에 대하여 우수한 친화도를 갖는다.
이중특이성 항체는 항원 CTLA4 및 PD-1에 대하여 우수한 친화도를 갖는다.
실시예 9: ELISA에 의해 측정된 항원에 대한 항체의 결합 활성
1. 항원 CTLA4에 대한 인간화된 항체 4G10H1L1 및 4G10H3L3의 결합 활성
1.1 CTLA4에 대한 인간화된 항체 4G10H1L1 및 4G10H3L3의 결합 활성을 간접 ELISA로 결정하였다.
항원과 함께 4℃에서 밤새 배양한 후, 마이크로플레이트를 37℃에서 2시간 동안 1% BSA로 차단한 다음, 항체를 가하고, 37℃에서 30분 동안 배양한 다음, HRP-표지화된 2차 항체(염소 항-인간 IgG(H+L))(잭슨(Jackson), 109-035-088)를 가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. TMB(네오젠(Neogen), 308177)를 가하여 5분 동안 반응시켰다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더에서 450nm의 파장에서 판독하였다.
결합 결과를 도 28에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 4G10H1L1 및 4G10H3L3은 둘 다 CTLA4 단백질에 용량-의존적으로 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도 강도는 표 3에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, 4G10H1L1 및 4G10H3L3의 EC50은 각각 0.048nM 및 0.067nM인 것으로 결정되었다.
[표 3]
Figure 112019038465404-pct00003
1.2. B7에 대항하는 경쟁 ELISA에 의한 CTLA4에 대한 인간화된 항체 4G10H1L1 및 4G10H3L3의 결합 활성
항원을 마이크로플레이트에 B7/1-hFc(B7/1 젠뱅크 ID: NP 005182.1)로 4℃에서 밤새 코팅한 다음, 1% BSA로 2시간 동안 차단 후, 항체 및 CTLA4-mFc 항체의 혼합물을 가하고(희석 농도는 표 4에 나타냄), 30분 동안 37℃에서 배양한 다음, 효소로 표지화된 2차 항체를 가한 다음, 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 450nm의 흡수 값을 효소-표지화된 기기 상에서 측정하였다(표 4 참조).
B7-1에 대항하여 경쟁하는 CTLA4에 대한 항체의 결합 결과는 도 29에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 4G10H1L1 및 4G10H3L3은 B7-1에 대항하여 경쟁하고, CTLA4 단백질에 용량-의존적으로 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도는 표 4에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, CTLA4과 4G10H1L1 및 4G10H3L3 결합의 EC50은 각각 1.297nM 및 1.229nM인 것으로 결정되었다.
[표 4]
Figure 112019038465404-pct00004
2. ELISA에 의해 측정된 항원 PD-1에 대한 단클론성 항체 14C12 및 이의 인간화된 항체 14C12H1L1의 결합 활성
2.1 항원 PD-1에 대한 단클론성 항체 14C12 및 14C12H1L1의 결합 활성을 하기와 같이 간접 ELISA로 결정하였다:
PD-1-mFc와 함께 4℃에서 밤새 배양한 후, 마이크로플레이트를 37℃에서 2시간 동안 1% BSA로 차단하고, 항체를 가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하고, HRP-표지화된 2차 항체(염소 항-인간 IgG(H+L))(잭슨, 109-035-088)를 가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. TMB(네오젠, 308177)를 가하여 5분 동안 반응시켰다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더에서 450nm의 파장에서 판독하였다.
PD-1에 대한 항체 14C12 및 14C12H1L1의 결합 결과는 도 30에 나타냈다. 자명하게, 14C12 및 14C12H1L1은 둘 다 PD-1 단백질에 용량-의존적으로 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도는 표 5에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, PD-1에 대한 14C12 및 14C12H1L1 결합의 EC50은 각각 0.175nM 및 0.043nM인 것으로 결정되었다.
[표 5]
Figure 112019038465404-pct00005
2.2. PDL1에 대항하는 경쟁 ELISA에 의한 항원 PD-1에 대한 하이브리도마에 의해 제조된 단클론성 항체 14C12 및 이의 인간화된 항체 14C12H1L1의 결합 활성은 하기와 같이 측정되었다:
PD-1-hFc 또는 PD-1-mFc와 함께 4℃에서 밤새 배양한 후, 마이크로플레이트를 37℃에서 2시간 동안 1% BSA로 차단한 다음, 상이한 농도(희석 경사도에 대하여 표 6 참조)개별적인 항체, 14C12 또는 14C12H1L1의 혼합물 및 및 PDL1-hFc 또는 PDL-1-mFc를 마이크로플레이트에 가하여 10분 동안 반응시킨 다음, HRP-표지화된 2차 항체를 가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더에서 450nm의 파장에서 판독하였다(표 6 참조).
PDL1에 대항하여 경쟁하는 PD-1에 대한 항체의 결합 결과는 도 31에 나타냈다. 항체 14C12 및 이의 인간화된 항체 14C12H1L1은 PDL1에 대항하여 경쟁하여 PD-1 단백질에 용량-의존적으로 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도 강도는 표 6에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하여, 곡선 시뮬레이션을 통해 계산된 PD-1와 14C12 및 14C12H1L1 결합의 EC50은 각각 0.853nM 및 0.37nM인 것으로 결정되었다.
[표 6]
Figure 112019038465404-pct00006
3. ELISA에 의해 측정된 항원에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004의 결합 활성
3.1 항원 CTLA-4에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 결합 활성을 간접 ELISA로 결정하였다(본 발명의 실시예의 1.1에 기재된 방법을 지칭함).
항원 CTLA4에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004의 결합 결과는 도 32에 나타냈다. 자명하게, 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004는 CTLA4 단백질에 용량-의존적으로 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도는 표 7에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, CTLA4에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004 결합의 EC50는 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 결정되었다.
[표 7]
Figure 112019038465404-pct00007
3.2 항원 PD-1에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 결합 활성을 간접 ELISA로 결정하였다(본 발명의 실시예의 2.1에 기재된 방법을 지칭함).
항원 PD-1에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 결합 결과는 도 33에 나타냈다. 자명하게, 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004는 PD-1 단백질에 용량-의존적으로 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도 강도는 표 7에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, PD-1에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004 결합의 EC50은 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 결정되었다.
[표 8]
Figure 112019038465404-pct00008
3.3 B7/1-hFc에 대항하는 경쟁 ELISA에 의한 CTLA4에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 각각의 결합 활성(본 발명의 실시예의 1.2에 기재된 방법을 지칭함).
결합 결과는 도 34에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004는 용량-의존적으로 항원 CTLA4에 효과적으로 결합하고 B7/1에 대한 CTLA4 결합을 억제할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도 강도는 표 9에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004의 EC50은 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 결정되었다.
[표 9]
Figure 112019038465404-pct00009
3.4 PDL1에 대항하는 경쟁 ELISA에 의한 항원 PD-1에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 결합 활성(본 발명의 실시예의 2.2에 기재된 방법을 지칭함)
결합 결과는 도 35에 나타냈다. 자명하게, 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004는 용량-의존적으로 항원 PD-1에 효과적으로 결합하고 PDL1에 대한 PD-1 결합을 억제할 수 있다. 상이한 용량에서 흡광도 강도는 표 10에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, CTLA4에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004의 EC50은 하기 표 10에 나타낸 바와 같이 결정되었다.
[표 10]
Figure 112019038465404-pct00010
실시예 10: 유세포 분석 방법에 의한 세포 표면 항원에 대한 항체의 결합 활성
CTLA4 또는 PD-1 항원을 발현하는 숙주 세포 293T를 각각 건설하고, 본 발명에서 제조된 인간화된 항체로 표지화하였다. 이의 고유 입체형태에서 상응하는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력을 유세포 분석으로 분석하고 입증하였다.
1. CTLA4 또는 PD-1을 발현하는 293T 숙주 세포의 건설
293T 세포를 CTLA4-함유 플라스미드 pLenti6.3-CTLA4 또는 PD-1-함유 플라스미드 pLenti6.3-PD-1(벡터 pLenti6.3은 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation)으로부터 구입하였음)로 형질감염시키고, 선별하여 각각 293T-CTLA4 또는 293T-PD-1을 발현하는 CTLA4 또는 PD-1의 안정한 풀을 수득하였다.
2. 세포 표면 항원에 대한 항체 결합
개별적인 항원을 발현하는 상기 수득된 숙주 세포를 트립신을 사용하여 소화시키고, 각각 2×105 세포를 함유하는 튜브에 배분하였다. PBSA 완충제(1% BSA)를 사용하여 항체를 경사로 희석하고, 얼음 상에서 2시간 동안 상응하는 항원을 발현하는 293T 세포와 함께 배양하였다. FITC-표지화된 염소 항-인간 IgG(1:500) 100㎕를 각각의 튜브에 가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 PBS 300㎕ 중에 재현탁시키고, FITC 채널을 사용하는 유세포 분석기 상에서 형광 신호를 측정하였다.
2.1 세포 표면 항원에 대한 항체의 결합 활성
293T-CTLA4 세포에 대한 인간화된 항체 4G10H1L1 및 4G10H3L3의 결합 결과는 도 36 및 도 37에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 4G10H1L1 및 4G10H3L3은 용량-의존적으로 숙주 세포 293T-CTLA4의 표면 상에 발현된 표적 단백질 CTLA4에 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 형광 강도는 표 11에 나타냈다. 그 다음, 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, CTLA4에 대한 4G10H1L1 및 4G10H3L3 결합의 EC50은 각각 7.58nM 및 10.54nM인 것으로 결정되었다.
[표 11]
Figure 112019038465404-pct00011
2.2 293T-PD-1 세포에 대한 인간화된 항체 14C12H1L1의 결합 결과는 도 38에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 14C12H1L1는 용량-의존적으로 숙주 세포 293T-PD-1의 표면 상에 발현된 표적 단백질 PD-1에 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 형광 강도는 표 12에 나타냈다. 형광 강도의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, PD-1에 대한 14C12H1L1 결합의 EC50은 1.89nM인 것으로 결정되었다.
[표 12]
Figure 112019038465404-pct00012
2.3 293T-CTLA4 세포에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 결합 결과는 도 39-42에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004는 용량-의존적으로 숙주 세포 293T-CTLA4의 표면 상에 발현된 표적 단백질 CTLA4에 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 형광 강도는 표 13에 나타냈다. 형광 강도의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 EC50은 하기 표 13에 나타낸 바와 같이 결정되었다.
[표 13]
Figure 112019038465404-pct00013
2.4 293T-PD-1 세포에 대한 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 결합 결과는 도 43-46에 나타냈다. 자명하게, 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004는 용량-의존적으로 숙주 세포 293T-PD-1의 표면 상에 발현된 PD-1에 효과적으로 결합할 수 있다. 상이한 용량에서 형광 강도는 표 14에 나타냈다. 흡광도 값의 정량 분석을 사용하는 곡선 시뮬레이션을 통해, BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004의 EC50은 하기 표 14에 나타낸 바와 같이 결정되었다.
[표 14]
Figure 112019038465404-pct00014
3. T 세포 표면 항원 CTLA4 및 PD-1에 대한 항체의 결합 활성
PBMC를 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus)(GE 헬쓰케어(GE Healthcare) 제품 번호: 171440-02)에 의해 단리하고, 추가로 단리하여 CD4+ 세포를 수득한 다음, 세포를 PHA로 3일 동안 자극한 다음, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 상이한 농도로 항체와 혼합한 다음, 얼음 상에서 1.5시간 동안 배양하였다. 그 다음, 배양 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, FITC-표지화된 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치(Jackson immunoresearch) 제품 102155). 그 다음, 세포를 얼음 상에서 암실에서 1시간 동안 배양하고, PBS로 1회 세척한 다음, 형광 신호를 유세포 분석기 상에서 측정하였다.
대조군 항-PD-1 항체 니볼루맙(Nivolumab)은 상업적으로 이용 가능하고, 이의 정보는 또한 웹사이트[http://www.drugbank.ca/drugs/DB09035]에서 찾을 수 있고;
대조군 항-CTLA4 항체 이필리무맙(Ipilimumab)은 상업적으로 이용 가능하고, 이의 정보는 또한 웹사이트[http://www.drugbank.ca/drugs/DB06186]에서 찾을 수 있다.
3.1 T 세포에 대한 인간화된 항체 4G10H3L3의 결합 결과는 도 47에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 4G10H3L3은 용량-의존적으로 T 세포의 표면 상에 발현된 표적 단백질 CTLA4에 효과적으로 결합할 수 있다.
3.2 T 세포에 대한 인간화된 항체 14C12H1L1의 결합 결과는 도 48에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 14C12H1L1은 용량-의존적으로 T 세포의 표면 상에 발현된 표적 PD-1에 효과적으로 결합할 수 있다.
3.3 14C12H1L1 및 4G10H3L3의 것과 비교된 T 세포에 대한 항체 BiAb003 및 BiAb004의 결합 활성은 도 49에 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 BiAb003, BiAb004, 14C12H1L1, 및 4G10H3L3은 용량-의존적으로 T 세포의 표면 상에 발현된 표적 단백질 PD-1에 효과적으로 결합할 수 있다. 추가로, T 세포에 대한 항체 BiAb003, BiAb004, 및 14C12H1L1의 결합 활성은 항체 4G10H3L3, 니볼루맙, 및 이필리무맙의 것들보다 더 강하였다. 형광 강도는 표 15에 나타냈다.
[표 15]
Figure 112019038465404-pct00015
실시예 11: 혼합 림프구 반응: 사이토킨 IFN-γ 및 IL-2의 분비
PBMC를 피콜-파크 플러스(GE 헬쓰케어 제품 번호: 171440-02)로 단리한 다음, IL-4(페프로테크(Peprotech) K2513, 1000U/㎖) 및 GM-CSF(페프로테크 H1513, 1000U/㎖)와 혼합하여 6일 동안 유도한 다음, TNF-α(페프로테크 G1513, 200U/㎖)를 가하여 3일 동안 유도하여 DC 세포를 수득하였다.
T 세포를 PBMC로부터 단리하고, 상기로부터 수득된 DC 세포와 1:10의 비로 혼합하여 상이한 비의 각각의 항체(hIgG는 대조군임)와 함께 5-6일 동안 배양하였다. IFN-γ 또는 IL-2의 분리를 ELISA 시약 키트(둘 다 다케웨(Dakewe)로부터 구입하였음)로 각각 측정하였다.
DC 세포 및 T 세포의 혼합된 배양 후, IFN-γ 분비는 도 50-도 53에 나타냈다. DC 세포 및 T 세포의 혼합된 배양 후, IL-2 분비는 도 54-56에 나타냈다.
도면에 도시된 바와 같이, 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 14C12H1L1뿐만 아니라 이중특이성 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003, 및 BiAb004는 모두 혼합 림프구에서 IFN-γ 및 IL-2의 분비를 효과적으로 유도할 수 있다. 1nM 또는 10nM 항-PD-1 항체 14C12H1L1에 의해 유도된 IFN-γ 분비는 100nM 대조군 항체 니볼루맙의 것과 유사하였다. 100nM 항-CTLA4 항체 4G10H1L1 및 4G10H3L3에 의해 유도된 IFN-γ 분비는 100nM 대조군 항체 이필리무맙의 것보다 우수하였다(도 52).
실시예 12: 유도된 IL-2 분비
단리된 PBMC(실시예와 동일한 방법)를 PHA(상하이 센치 바이오테크 코 엘티디(Shanghai Shenqi Biotech Co.), Ltd, 50㎕/㎖)로 3일 동안 자극한 다음, PBMC(자원 혈액 공여자로부터, 5×104 세포/웰)를 Raji 세포(ATCC로부터, 5×104 세포/웰) 및 MDA-MB-231 세포(ATCC로부터, 1×104 세포/웰)와 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 항체(100nM)를 가하고 혼합하고 함께 배양하였다. 3일 동안 공동-배양 후, IL-2의 분비를 ELISA 시약 키트(다케웨로부터 구입함)로부터 설명서에 따라 측정하였다.
혼합된 세포 배양 후, IL-2 분비는 도 57, 도 58, 및 도 59에 각각 나타냈다. 도면에 도시된 바와 같이, 항체 4G10H1L1, 4G10H3L3 및 14C12H1L1뿐만 아니라 이중특이성 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004는 PBMC에 의한 IL-2의 분비를 효과적으로 유도할 수 있다. 항-PD-1 항체 14C12H1L1은 대조군 항체 니볼루맙(도 58)보다 더 높은 IL-2 분비를 유도할 수 있고, 이중특이성 항체 BiAb001, BiAb002, BiAb003 및 BiAb004는 14C12H1L1+4G10H1L1 또는 14C12H1L1+4G10H3L3와 동일한 IL-2 분비에 대한 효과를 갖는다(도 59).
실시예 13: PD-1 HuGEMM 마우스에서 MC38 종양 모델의 종양 성장에 대한 항체 BiAb004의 영향
MC38 종양 세포를 PD-1 HuGEMM 마우스(1×106 세포/마우스, 인간 PD-1 유전자 이식 마우스)의 우측에 피하 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 144 mm3에 도달했을 때, 마우스를 각 군에서 8마리의 마우스로 종양 부피당 4개의 실험군으로 무작위로 나누었다. 항체를 복부 투여를 통해 제공하고, 특정한 군 및 투여량은 하기와 같았다:
아이소타입 대조군(용량: 2.67㎎/㎏),
BiAb004 고용량 군(용량: 2.67㎎/㎏),
BiAb004 저용량 군(용량: 0.267㎎/㎏),
상기 3개의 군을 항체로 매주 2회, 총 5회 주사하였다. 주사 후, 종양 크기를 매주 2회 측정하였다.
결과는 도 60에 나타냈다.
자명하게:
BiAb004 고용량, 및 BiAb004 저용량 군에서 종양 크기는 모두 통계적으로 아이소타입 대조군에서의 것들보다 유의미하게 작았다(각각 P < 0.001, P < 0.05). BiAb004 저용량 군은 PD-1 HuGEMM 마우스에서 MC38 종양 모델에 대한 통계적으로 유의미한 항종양 효과를 나타냈다.
본 발명의 특정한 실시형태가 상세하게 기재되어 있지만, 당해 분야의 숙련가에게 인식될 바와 같이, 이러한 상세한 설명은 우리가 개시한 모든 교시에 따라 다양한 변형 및 치환을 초래할 수 있다. 이들 변화는 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 완전한 범위는 첨부된 청구범위 및 임의의 등가물에 의해 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> AKESO PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-CTLA4 AND ANTI-PD-1 BIFUNCTIONAL ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION THEREOF AND USE THEREOF <130> IPA190440-US <150> CN 201610705624.2 <151> 2016-08-23 <160> 47 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 4G10 heavy chain variable region <400> 1 caggtcaagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga accttgaatg gattggactt attaatcctt acaataatat tactaactac 180 aaccagaagt tcatgggcaa ggccacattt actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240 atggaactcc tcagactgac atctgaagac tctggagtct atttctgtgc aagactcgac 300 tataggtctt attggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagccaa aacgacaccc 360 ccatctgtct at 372 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 4G10 heavy chain variable region <400> 2 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 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ccaaactgac tgtcctaggc cagcccaagt cttcgccatc agtcaccctg 360 tttcaagggc aattctgc 378 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 4G10 light chain variable region <400> 4 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Phe Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Ser 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105 110 Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Gln Gly Gln Phe Cys 115 120 125 <210> 5 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 4G10H1L1 heavy chain variable region <400> 5 caggtgcagc tggtggagtc tggggccgag ctggtgaagc ccggcgcctc catgaagatc 60 tcttgcaagg 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Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Phe Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Lys Ala Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 13 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 4G10H4L3 heavy chain variable region <400> 13 caggtgcagc tggtcgagtc tggggccgaa gtgaagaaac ccggcgcctc agtgaaggtc 60 agctgcaagg ccagcgggta cagtttcact ggatatacca tgaactgggt ccgacaggcc 120 cctggccagg ggctggagtg gatcggcctg attaaccctt acaacgacat cactaactac 180 gcacagaagt tccaggggag agtgaccttt acagtggaca ccagcatttc cacagcctac 240 atggaactgt cccggctgag atctgacgat acaggcgtgt acttctgcgc taggctggat 300 taccgcagct attggggaca gggcacactg gtgactgtca gcgca 345 <210> 14 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 4G10H4L3 heavy chain variable region <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ile Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Asp Tyr Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 15 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 14C12 heavy chain variable region <400> 15 gaggtcaaac tggtggagag cggcggcggg ctggtgaagc ccggcgggtc actgaaactg 60 agctgcgccg cttccggctt cgcctttagc tcctacgaca tgtcatgggt gaggcagacc 120 cctgagaagc gcctggaatg ggtcgctact atcagcggag gcgggcgata cacctactat 180 cctgactctg tcaaagggag attcacaatt agtcgggata acgccagaaa tactctgtat 240 ctgcagatgt ctagtctgcg gtccgaggat acagctctgt actattgtgc aaaccggtac 300 ggcgaagcat ggtttgccta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtctc tgcc 354 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 14C12 heavy chain variable region <400> 16 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 17 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 14C12 light chain variable region <400> 17 gacattaaga tgacacagtc cccttcctca atgtacgcta gcctgggcga gcgagtgacc 60 ttcacatgca aagcatccca ggacatcaac acatacctgt cttggtttca gcagaagcca 120 ggcaaaagcc ccaagaccct gatctaccgg gccaatagac tggtggacgg ggtccccagc 180 agattctccg gatctggcag tgggcaggat tactccctga ccatcagctc cctggagtat 240 gaagacatgg gcatctacta ttgcctgcag tatgatgagt tccctctgac ctttggagca 300 ggcacaaaac tggaactg 318 <210> 18 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 14C12 light chain variable region <400> 18 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 <210> 19 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 14C12H1L1 heavy chain variable region <400> 19 gaagtgcagc tggtcgagtc tgggggaggg ctggtgcagc ccggcgggtc actgcgactg 60 agctgcgcag cttccggatt cgcctttagc tcctacgaca tgtcctgggt gcgacaggca 120 ccaggaaagg gactggattg ggtcgctact atctcaggag gcgggagata cacctactat 180 cctgacagcg tcaagggccg gttcacaatc tctagagata acagtaagaa caatctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag ggctgaggac accgcactgt actattgtgc caaccgctac 300 ggggaagcat ggtttgccta ttgggggcag ggaaccctgg tgacagtctc tagt 354 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 14C12H1L1 heavy chain variable region <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 14C12H1L1 light chain variable region <400> 21 gacattcaga tgactcagag cccctcctcc atgtccgcct ctgtgggcga cagggtcacc 60 ttcacatgcc gcgctagtca ggatatcaac acctacctga gctggtttca gcagaagcca 120 gggaaaagcc ccaagacact gatctaccgg gctaatagac tggtgtctgg agtcccaagt 180 cggttcagtg gctcagggag cggacaggac tacactctga ccatcagctc cctgcagcct 240 gaggacatgg caacctacta ttgcctgcag tatgatgagt tcccactgac ctttggcgcc 300 gggacaaaac tggagctgaa g 321 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 14C12H1L1 light chain variable region <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker 1 <400> 23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker 2 <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 25 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 8D2H14L2 heavy chain variable region <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ser Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ala Gln Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 8D2H14L2 heavy chain variable region <400> 26 gaggtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc ctggaggaag ctcccggctg 60 tcatgtgccg ctagcggctt caccttttcc gacaactgga tgaattgggt gcgacaggca 120 ccaggcaaag gactggagtg gctggctcag atccggaaca agccctacaa ttatgaaaca 180 tactatagcg cctccgtgaa aggccggttc actattagta gagacgattc taagaacagc 240 gtgtacctgc agatgaatag cctgaagaca gaggatactg gcgtctacta ttgcacagca 300 cagtttgcct attggggaca gggcaccctg gtgacagtct ctagt 345 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> The amino acid sequence of 8D2H14L2 light chain variable region <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleic acid sequence of 8D2H14L2 light chain variable region <400> 28 gacatccaga tgactcagag cccctcaagc ctgtctgcaa gtgtgggcga tagggtcacc 60 atcacatgtc gcacctccga aaacatctac gggggactga attggtatca gcgcaagccc 120 ggcaaatccc ctaagctgct gatctacggc gctaccaacc tggcatctgg ggtgtcctct 180 cgattttcag ggagcggcag cggcaccgac tatactctga ccattagttc actgcagcct 240 gaggatgtgg ccacatacta ttgccagaat gtcctgagat caccattcac ttttgggagc 300 ggaaccaaac tggaaattaa g 321 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 14C12HCDR1 <400> 29 Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 14C12HCDR2 <400> 30 Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 14C12HCDR3 <400> 31 Ala Asn Arg Tyr Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 14C12LCDR1 <400> 32 Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 1 5 <210> 33 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 14C12LCDR2 <400> 33 Arg Ala Asn 1 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 14C12LCDR3 <400> 34 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 4G10HCDR1 <400> 35 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 4G10HCR2 <400> 36 Ile Asn Pro Tyr Asn Asn Ile Thr 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 4G10HCDR3 <400> 37 Ala Arg Leu Asp Tyr Arg Ser Tyr 1 5 <210> 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PRT <213> Artificial <220> <223> 8D2H14L2LCDR3 <400> 47 Gln Asn Val Leu Arg Ser Pro Phe Thr Phe 1 5 10

Claims (30)

  1. 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    PD-1에 결합하는, 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역; 및 CTLA4에 결합하는, 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 각각 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역이 서열번호 29 내지 34의 아미노산 서열을 갖는 6개 CDR을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 (i) 서열번호 35 내지 40, (ii) 서열번호 35, 41 및 37 내지 40, 및 (iii) 서열번호 42 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 6개 CDR을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    PD-1에 결합하는, 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역; 및 CTLA4에 결합하는, 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 각각 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역이 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32 내지 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 서열번호 35 내지 37의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 38 내지 40의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    PD-1에 결합하는, 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역; 및 CTLA4에 결합하는, 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 각각 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역이 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32 내지 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 서열번호 35, 41, 및 37의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 38 내지 40의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    PD-1에 결합하는, 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역; 및 CTLA4에 결합하는, 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 각각 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역이 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 32 내지 34의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 서열번호 42 내지 44의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 45 내지 47의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역의 중쇄 가변 영역이 서열번호 16 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역의 경쇄 가변 영역이 서열번호 18 또는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역의 중쇄 가변 영역이 서열번호 2, 서열번호 6, 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역의 경쇄 가변 영역이 서열번호 4, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역의 중쇄 가변 영역이 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역의 경쇄 가변 영역이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역의 중쇄 가변 영역이 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역의 경쇄 가변 영역이 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 직접적으로 연결되거나 연결 단편에 의해 연결되는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 연결 단편이 (GGGGS)n이고, n이 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 절반 항체(half antibody), Fab, F(ab')2 또는 단일 쇄 항체를 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역이 면역글로불린을 포함하고, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 단일 쇄 항체를 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역이 단일 쇄 항체를 포함하고, 상기 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역이 면역글로불린을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 적어도 2 이상의 제1 단백질 작용성 영역, 적어도 2 이상의 제2 단백질 작용성 영역 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제12항에 있어서, 상기 단일 쇄 항체가 상기 면역글로불린의 중쇄의 C-말단에 부착되는, 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 하나 이상의 단리된 핵산 분자.
  20. 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로서, 여기서 하나 이상의 단리된 핵산 분자는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  21. 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포주로서, 여기서 하나 이상의 단리된 핵산 분자는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 숙주 세포주.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은 숙주 세포주를 적절한 조건하에 배양하는 단계 및 상기 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 숙주 세포주는 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 포함하고, 여기서 하나 이상의 단리된 핵산 분자는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 제1 단백질 작용성 영역 및 적어도 하나의 제2 단백질 작용성 영역을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  23. 접합체로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 검출 가능한 마커로서 접합 파트너를 포함하는, 접합체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 접합 파트너가 방사성 동위원소, 플루오레세인, 발광 물질, 색채가 풍부한 성분, 또는 효소인, 접합체.
  25. 샘플에서 CTLA4, PD-1, 또는 이들의 조합의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 키트로서,
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나, 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 검출 가능한 마커로서 접합 파트너를 포함하는 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 키트가 상기 이중특이성 항체를 특이적으로 인식하는 2차 항체를 추가로 포함하는, 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 2차 항체가 검출 가능한 마커를 포함하는, 키트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 검출 가능한 마커가 방사성 동위원소, 플루오레세인, 발광 물질, 색채가 풍부한 성분, 또는 효소인, 키트.
  29. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나, 또는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 검출 가능한 마커로서 접합 파트너를 포함하는 접합체를 포함하는, 종양의 예방, 치료, 보조 치료, 또는 진단을 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 약제학적 조성물이 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 종양이 흑색종, 신장암, 전립선암, 방광암, 결장직장암, 위장관암, 간암, 비-소세포 폐암, 난소암 또는 백혈병인, 약제학적 조성물.
KR1020197008463A 2016-08-23 2017-08-22 항-ctla4 및 항-pd-1 이작용성 항체, 이의 약제학적 조성물 및 이의 용도 KR102503084B1 (ko)

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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018000621A (es) 2015-07-13 2018-05-11 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos anti-pd-1, anticuerpos anti-pd-1 activables, y metodos de uso de los mismos.
EP4257613A3 (en) 2016-06-14 2023-12-13 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
CN106967172B (zh) 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途
CN106977602B (zh) * 2016-08-23 2018-09-25 中山康方生物医药有限公司 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
WO2018035710A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
CN108866635B (zh) * 2017-05-09 2021-11-26 安升（上海）医药科技有限公司 多特异性蛋白药物及其文库、以及制备方法和应用
WO2019042153A1 (zh) 2017-09-01 2019-03-07 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 重组双特异性抗体
CN117343193A (zh) * 2017-11-02 2024-01-05 西雅图免疫公司 双特异性抗体及其制备和使用方法
WO2019179421A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/ctla-4 antibody molecules
CN110407942B (zh) * 2018-04-27 2022-02-22 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对kn044的单域抗体
EP3802613A4 (en) 2018-06-05 2022-03-09 Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co., Ltd. DIMERE AND ITS USE
CN110684113A (zh) * 2018-07-06 2020-01-14 复旦大学 一种抗PD-1抗原和抗c-Met抗原的双特异性抗体及其构建方法
CN109762068A (zh) * 2018-08-09 2019-05-17 源道隆（苏州）医学科技有限公司 一种可靶向ctla4和pd-1的单基因双特异性抗体及其应用
CN109053895B (zh) * 2018-08-30 2020-06-09 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
WO2020057611A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific ctla-4/pd-1 polypeptide complexes
WO2020057610A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific anti-ctla-4/pd-1 polypeptide complexes
CN111763261B (zh) * 2019-04-02 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 一种融合蛋白及其用途
CN112175087B (zh) * 2019-07-02 2022-05-13 深圳市迈加瑞生物技术有限公司 一种抗CD4和TGFβ的双特异性抗体、其药物组合及其用途
EP3998286A4 (en) * 2019-07-11 2023-04-26 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. QUAD VALUE SYMMETRIC BISPECIFIC ANTIBODIES
MX2022001321A (es) * 2019-08-02 2022-05-20 Akeso Pharmaceuticals Inc Anticuerpo biespecifico anti-ctla4/anti-pd-1 y uso del mismo.
EP4008351A4 (en) * 2019-08-02 2023-08-09 CTTQ-Akeso (ShangHai) Biomed. Tech. Co., Ltd. ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND ASSOCIATED MEDICAL USE
CN112442126B (zh) * 2019-09-04 2022-07-29 杭州济元基因科技有限公司 一种抗人cs1抗原的单克隆抗体及其car-t细胞
CN110563845A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 滨州医学院 抗igsf9抗体、药物组合物及其应用
MX2022006330A (es) 2019-11-25 2022-08-17 Akeso Biopharma Inc Anticuerpo biespecífico anti-pd-1 anti-vegfa, composición farmacéutica y uso del mismo.
JP2023504630A (ja) * 2019-12-04 2023-02-06 江蘇康寧杰瑞生物制薬有限公司 腫瘍治療のための二重特異性融合タンパク質
MX2022013311A (es) * 2020-04-22 2022-11-14 Akeso Biopharma Inc Anticuerpo biespecifico anti-cd73-anti-pd-1 y uso del mismo.
WO2021213523A1 (zh) * 2020-04-24 2021-10-28 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pd-1抗体和抗ctla-4抗体的组合在预防或治疗癌症中的用途
CN113577255B (zh) * 2020-04-30 2023-09-08 中国科学院上海药物研究所 肿瘤纳米疫苗、其制备方法及用途
CN111944760A (zh) * 2020-08-14 2020-11-17 广东先康达生物科技有限公司 一种分泌双特异性抗体的免疫细胞及其应用
CN112079926A (zh) * 2020-09-17 2020-12-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 抗人ctla4单克隆抗体及其应用
US20240018254A1 (en) * 2020-10-23 2024-01-18 Akeso Biopharma, Inc Anti-cd73 antibody and use thereof
IL305805A (en) 2021-03-12 2023-11-01 Akeso Biopharma Inc A pharmaceutical combination containing a bispecific anti-PD-1-anti-VEGFA antibody and its use
CN118530341A (zh) * 2021-03-12 2024-08-23 中山康方生物医药有限公司 提高含有免疫球蛋白Fc片段的药物的有效性的方法
CA3213734A1 (en) 2021-04-14 2022-10-20 Yu Xia Use of antibody in anti-tumor treatment
CN113501879B (zh) * 2021-06-30 2022-09-06 拜盖特生物科技(上海)有限公司 一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法
AU2022355381A1 (en) 2021-09-29 2024-05-02 Akeso Biopharma, Inc. Anti-lag3 antibody, pharmaceutical composition and use
CN118541390A (zh) * 2022-01-30 2024-08-23 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 抗ctla4/ox40双特异性抗体及其用途
IL315159A (en) 2022-02-24 2024-10-01 Akeso Pharmaceuticals Inc A pharmaceutical preparation containing a bispecific antibody of anti-4 CTLA anti-1-PD and CHIAURANIB
WO2024051223A1 (zh) 2022-09-09 2024-03-14 中山康方生物医药有限公司 药物组合及用途
CN116396392B (zh) * 2023-01-17 2023-10-27 珠海重链生物科技有限公司 一种特异性针对异羟基洋地黄毒甙元的抗体及其相关应用
CN118615438A (zh) * 2023-03-07 2024-09-10 康方药业有限公司 包含抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的药物组合及其用途
WO2024212988A1 (zh) * 2023-04-10 2024-10-17 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1双特异性抗体的医药用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014209804A1 (en) * 2013-06-24 2014-12-31 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US7521051B2 (en) 2002-12-23 2009-04-21 Medimmune Limited Methods of upmodulating adaptive immune response using anti-PD-1 antibodies
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US9029508B2 (en) 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2738252C (en) 2008-09-26 2018-05-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
CN102822198B (zh) * 2010-03-12 2016-08-31 艾伯维生物医疗股份有限公司 Ctla4蛋白和其用途
GB201103955D0 (en) 2011-03-09 2011-04-20 Antitope Ltd Antibodies
PT2691112T (pt) 2011-03-31 2018-07-10 Merck Sharp & Dohme Formulações estáveis de anticorpos para o recetor pd-1 humano de morte programada e tratamentos relacionados
CA2833636A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Amplimmune, Inc. Antibodies and other molecules that bind b7-h1 and pd-1
WO2014022758A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Single agent anti-pd-l1 and pd-l2 dual binding antibodies and methods of use
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
SG11201604738TA (en) * 2013-12-12 2016-07-28 Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
CN105873615B (zh) * 2014-01-03 2020-12-25 豪夫迈·罗氏有限公司 共价连接的helicar-抗helicar抗体缀合物及其用途
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
CN104974253A (zh) 2014-04-01 2015-10-14 上海中信国健药业股份有限公司 抗ctla-4/pd-1双特异性抗体、其制备方法及应用
CN105296433B (zh) * 2014-08-01 2018-02-09 中山康方生物医药有限公司 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途
CN104987421A (zh) * 2015-05-13 2015-10-21 北京比洋生物技术有限公司 抗ctla-4和pd-1的双重可变结构域免疫球蛋白
CN105175545B (zh) 2015-10-20 2019-01-25 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用
CN105175544B (zh) * 2015-10-20 2021-04-09 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗pd-1人源化单克隆抗体及其应用
CN108367069B (zh) * 2015-12-14 2022-08-23 宏观基因有限公司 对于pd-1和ctla-4具有免疫反应性的双特异性分子及其使用方法
CN105754990A (zh) 2016-01-29 2016-07-13 深圳精准医疗科技有限公司 一种pd-1/ctla-4双特异性抗体的制备方法及其应用
WO2018035710A1 (en) 2016-08-23 2018-03-01 Akeso Biopharma, Inc. Anti-ctla4 antibodies
CN106977602B (zh) 2016-08-23 2018-09-25 中山康方生物医药有限公司 一种抗pd1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
CN106967172B (zh) * 2016-08-23 2019-01-08 康方药业有限公司 抗ctla4-抗pd-1 双功能抗体、其药物组合物及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014209804A1 (en) * 2013-06-24 2014-12-31 Biomed Valley Discoveries, Inc. Bispecific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022130393A (ja) 2022-09-06
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US20240010728A1 (en) 2024-01-11
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IL264964A (ko) 2019-04-30
US11578128B2 (en) 2023-02-14
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US20190185569A1 (en) 2019-06-20
JP7425604B2 (ja) 2024-01-31

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