KR101904666B1

KR101904666B1 - Atp 포스포리보실기 전이효소 변이체 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산방법

Info

Publication number: KR101904666B1
Application number: KR1020170098205A
Authority: KR
Inventors: 박명근; 권나라; 이진남
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2018-11-29
Also published as: US11098333B2; WO2019027267A3; TWI694151B; AR112922A1; JP2020530771A; WO2019027267A2; TW201910512A; AU2018310134B2; CN111315876A; EP3647417A2; BR112020001762A2; JP6789436B2; CN111315876B; US20210010042A1; EP3647417A4; UY37828A; CA3071280C; AU2018310134A1; CA3071280A1

Abstract

본 출원은 ATP 포스포리보실기 전이효소(HisG) 단백질, 및 이를 이용한 히스티딘의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

ATP 포스포리보실 전이효소 변이체 및 이를 이용한 L-히스티딘 생산방법 {An ATP phoshpolybosyltransferase mutation and a method of producing histidine using thereof}

본 출원은 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체 및 이를 이용한 히스티딘의 생산방법에 관한 것이다.

L-히스티딘은 20개의 표준 아미노산들 가운데 하나의 아미노산으로, 영양학적인 관점에서 볼 때 성인에게는 많은 양이 요구되지 않지만, 성장기 어린이들에게는 해당하는 필수 아미노산으로 분류된다. 또한, L-히스티딘은 항산화와 면역 조절 등 중요한 생리적 과정에 관여하여 위장 궤양 치료제, 순환기계 치료제의 원료 및 아미노산 수액 제제 등 의학 산업에 사용된다.

히스티딘은 특히 헤모글로빈에 많이 들어 있어서, 주로 혈분을 원료로 하는 단백질 가수 분해 추출법을 통해 주로 생산된다. 그러나, 이는 낮은 효율과 환경 오염 등의 단점을 지니고 있다. 반면, 미생물 발효법을 통하여 L-히스티딘을 생산 하는 것은 가능하나, 대규모 공업화는 아직 이루어 지지 않았다. 이는 L-히스티딘의 생합성이 뉴클레오티드 합성 전구체인 PRPP와 경쟁 관계를 가지며, 고 에너지를 요구하는 복잡한 생합성 과정 및 조절 메커니즘을 가지고 있기 때문이다.

발효법에 사용되는 미생물의 L-히스티딘 생산능은 종래에는 돌연변이 유발 및 돌연변이체 선발 방법, 유전자 개량을 통한 균주의 신진대사를 조절하는 방법으로 개선시켰다. 최근 미생물을 이용한 히스티딘의 생산은 PRPP로부터 여러 단계를 거쳐 생합성 된다고 알려져 있으나, 히스티딘 생합성에 관여하는 효소들중 첫번째 효소인 ATP 포스포리보실 전이효소는 최종 산물인 L-히스티딘 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 발생하여 공업적으로 L-히스티딘을 대량생산하는데 문제점이 있다 (국제공개특허 제WO2014-029376호).

이러한 배경 하에, 본 출원자들은 L-히스티딘에 의해 저해를 받는 ATP 포스포리보실 전이효소를 개량하기 위해 예의 노력한 결과, 새롭게 개발한 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체를 도입한 미생물이 L-히스티딘을 고수율로 제조할 수 있음을 확인하고 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 ATP 포스포리보실기 전이효소 (ATP Phosphoribosyltransferase, HisG)에서 215번째 아스파라긴 (asparagine) 아미노산 잔기가 알지닌 (arginine)으로, 233번째 글라이신 (glycin) 아미노산 잔기가 히스티딘 (histidine)으로, 235번째 쓰레오닌 (threonine) 아미노산 잔기가 글루타민 (glutamine)으로 치환된, ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체 및상기 단백질을 포함하도록 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는 히스티딘 생산방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 ATP 포스포리보실기 전이효소 (ATP Phosphoribosyltransferase, HisG)에서 215번째 아스파라긴 (asparagine) 아미노산 잔기가 알지닌 (arginine)으로, 233번째 글라이신 (glycin) 아미노산 잔기가 히스티딘 (histidine)으로, 235번째 쓰레오닌 (threonine) 아미노산 잔기가 글루타민 (glutamine)으로 치환된, ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어, "ATP 포스포리보실기 전이효소 (ATP Phosphoribosyltransferase, HisG)"는 화학반응을 촉매하는 글라이코실 트랜스퍼레이즈(glycosyltransferases) 계열 효소로서, 특히 펜토실 트랜스퍼레이즈(pentosyltransferases)에 속한다. 이 효소의 일반적인 명칭은 1-(5-포스포-D-리보실)-ATP:디포스페이트 포스포-알파-D-리보스 트랜스퍼레이즈 (1-(5-phospho-D-ribosyl)-ATP:diphosphate phospho-alpha-D-ribosyl transferase)이다. 상기 효소는 다음과 같은 반응을 촉매한다. 1-(5-phospho-D-ribosyl)-ATP + diphosphate ↔ ATP + 5-phospho-alpha-D-ribose 1-diphosphate. 상기 효소는 히스티딘의 생합성에서 첫번째 단계를 촉매한다.

본 출원에서 ATP 포스포리보실기 전이효소는, "HisG" 또는 "HisG 단백질"과 혼용될 수 있다. 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 그 예로, 코리네박테리움 속 유래 ATP 포스포리보실기 전이효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로써 서열번호 13의 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소는, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소는 서열번호 13 및 상기 서열번호 13과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 출원의 ATP 포스포리보실기 전이효소로 사용될 수 있음은 자명하다.

본 출원의 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체는 구체적으로, 코리네박테리움속(Corynebacterium) 유래 서열번호 13로 기재된 아미노산 서열을 갖는 ATP 포스포리보실기 전이효소에서 N-말단으로부터 233번째 글라이신 (glycin) 아미노산 잔기, 235번째 쓰레오닌 (threonine) 아미노산 잔기, 또는 215번째 아스파라긴 (asparagine) 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그 예로 상기 233번째 글라이신 (glycin) 아미노산 잔기는 히스티딘 (histidine), 235번째 쓰레오닌 (threonine) 아미노산 잔기는 글루타민 (glutamine), 또는 215번째 아스파라긴 (asparagine) 아미노산 잔기는 알지닌 (arginine)으로 치환된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 본 출원에서의 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체는 서열번호 1 및 상기 서열번호 1과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.

본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 출원에서 ATP 포스포리보실기 전이효소의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 hisG 유전자이며, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다. 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 출원에 포함되며, 구체적으로 서열번호 2로 표시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 변이형 폴리뉴클레오티드 역시 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 출원에 포함된다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포 및 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다. 구체적으로 상기 도입은 형질전환에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로 본 출원의 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 포함하는 미생물은 야생형 ATP 포스포리보실기 전이효소를 포함하는 미생물에 비하여 숙주세포의 성장을 저해함이 없이 히스티딘의 생산능이 향상되므로, 이들 미생물로부터 히스티딘을 고수율로 수득할 수 있다.

본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 출원에서 사용되는 용어 "히스티딘을 생산하는 미생물" 또는 "히스티딘 생산능을 가지는 미생물"이란, 자연적으로 히스티딘 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 히스티딘의 생산능이 없는 모균주에 히스티딘의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다.

상기 히스티딘을 생산하는 미생물은, 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 포함하여 L-히스티딘을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 출원에서 용어 "히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물"이란, 천연형 또는 변이를 통하여 히스티딘 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물의 배양물이 히스티딘을 가지고 있는 것은 이미 알려져 있었다. 다만, 히스티딘의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 밝혀지지 않은 상태이다. 따라서, 본 출원에서 히스티딘 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물이란 천연형 미생물 자체 또는 외부 히스티딘 생산 기작과 관련된 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 히스티딘 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.

본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는, 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물은 고농도의 히스티딘에 노출되더라도 세포 생장과 생존에 영향을 적게 받는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

본 출원의 또 하나의 양태로서, 본 출원은 기술된 미생물을 배양하는 단계 및 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는, 히스티딘을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 히스티딘은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 히스티딘을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 히스티딘을 회수 할 수 있다.

본 출원은 ATP 포스포리보실기 전이효소(HisG) 단백질을 이용하여 히스티딘을 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공한다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. ATP 포스포리보실 전이효소(ATP phosphoribosyltransferase , HisG) 변이체 설계

코리네박테리움속 미생물의 ATP 포스포리보실 전이효소(ATP phosphoribosyltransferase, HisG)는 히스티딘 농도나 퓨린 계열 뉴클레오타이드 등의 농도가 높아지게 되면 ATP 포스포리보실 전이효소의 조절 부위 (regulatory domain)에 기질인 ATP와 경쟁적, 혹은 비경쟁적 결합하게 되어 활성이 약화 된다. 이를 참고하여, 히스티딘이 ATP 포스포리보실 전이효소에 결합하는 것을 방해하며 동시에 구조적으로 활성이 강화되는 변이가 설계되었다.

구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATP 포스포리보실기 전이효소의 N-말단으로부터 233번째 글라이신 (glycin) 아미노산 잔기가 히스티딘 (histidine)으로, 235번째 쓰레오닌 (threonine) 아미노산 잔기가 글루타민 (glutamine)으로, 215번째 아스파라긴 (asparagine) 아미노산 잔기가 알지닌 (arginine)으로 치환된 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체(N215R/G233H/T235Q)가 설계되었다(서열번호 1). 상기 서열번호 1의 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 2이다.

실시예 2. hisG 유전자 클로닝 및 Markerless균주 제작을 위한 염색체 삽입용 벡터 제작

실시예 2-1. N215R변이와 G233H 및 T235Q 변이가 도입된 HisG 유전자 클로닝 및 염색체 삽입용 벡터 제작

야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 유전자를 분리하고, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 hisG 유전자 단편을 얻었다(표 1). 이때, PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 52℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분30초 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 대략 850 bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 상기 얻어진 hisG 유전자의 단편을 TOPO 벡터에 접합 하였으며 제조된 벡터를 pTOPO-hisG 로 명명하였다.

서열번호	프라이머	서열(5'-3')
3	Xba1-Cgl-hisG-F	GGGTCTAGACCCAAACAAAGGCTCGC
4	Xba1-Cgl-hisG-R	GGGTCTAGAGCAAGGTTGGCAACAACC

상기에서 제작한 pTOPO-hisG 벡터를 주형으로 하여 상기 표 1과 하기 표 2에 개시된 프라이머를 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 1차로는 hisG 유전자 내에 변이를 도입하기 위해 변이를 일으키고자 하는 부위를 중심으로 5'말단과 3'말단에 대하여 각각 PCR을 진행한 다음, 2차로 두 개의 PCR 단편을 합치는 PCR을 수행하였다.

구체적으로, 상기 주형의 5'말단은 Xba1-Cgl-hisG-F (서열번호 3)와 Cgl-hisG-G233H/T235Q-R (서열번호 8) 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 주형의 3'말단은 Cgl-hisG-G233H/T235Q-F (서열번호 7)와 Xba1-Cgl-hisG-R (서열번호 4) 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR로 수득된 상기 두 개의 PCR 단편을 2차 PCR의 주형으로 Xba1-Cgl-hisG-F (서열번호 3)과 Xba1-Cgl-hisG-R (서열번호 4) 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 진행하였다. 상기 2차 PCR로 수득된 hisG_G233H/T235Q 유전자의 단편을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. T4 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여, 염색체 삽입용 벡터 pDC를 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 벡터에 상기 절단된 유전자 단편을 접합하여 재조합 벡터를 제조하였다. 제조된 벡터를 pDC-hisG_G233H/T235Q로 명명하였다.

N215R 변이를 추가로 도입하기 위하여, 다시 2차 PCR을 수행하였다. 구체적으로는, pDC-hisG_G233H/T235Q를 주형으로 5'말단은 Cgl13032 hisG N215R-F (서열번호 5)와 Cgl-hisG-G233H/T235Q-R (서열번호 8) 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하고, 3'말단은 Cgl-hisG-G233H/T235Q-F (서열번호 7)와 Cgl13032 hisG N215R-R (서열번호 6) 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 두 개의 PCR 단편을 2차 PCR의 주형으로 Xba1-Cgl-hisG-F (서열번호 3)과 Xba1-Cgl-hisG-R (서열번호 4) 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 진행하였다. 상기 2차 PCR로 수득된 유전자의 단편을 제한효소 XbaI 으로 절단하고, T4 리가아제를 이용하여, 염색체 삽입용 벡터 pDC를 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 벡터에 상기 절단된 유전자 단편을 접합하여 pDC 벡터에 삽입하였다. 이에 제조된 벡터를 pDC-hisG_N215R/G233H/T235Q로 명명하였다. 상기에서 제작된 벡터 내 hisG 변이 도입 여부는 서열분석으로 확인하였다.

실시예 2-2. 기공지 HisG 변이가 도입된 유전자 클로닝 및 염색체 삽입용 벡터 제작

공지된 HisG 변이 유전자(N215K/L231F/T235A)가 도입된 미생물의 히스티딘 생산능과 본 출원의 변이가 도입된 미생물의 히스티딘 생산능을 비교 확인하기 위하여, 기공지 변이 유전자의 벡터를 제작하였다(Biochimie. 2012 Mar;94(3):829-38).

HisG 변이 유전자(N215K/L231F/T235A)가 도입된 벡터를 제작하기 위하여, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 pTOPO-hisG template벡터를 주형으로 하여 서열번호 9과 12, 서열번호 10와 11을 각각 프라이머로 사용하여 PCR 증폭하였다(표 2). 증폭된 두 개의 PCR 단편을 2차 PCR의 주형으로 Xba1-Cgl-hisG-F (서열번호 3)과 Xba1-Cgl-hisG-R (서열번호 4) 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 진행하였다. 상기 2차 PCR로 수득된 유전자의 단편을 제한효소 XbaI 으로 절단하고, T4 리가아제를 이용하여, 염색체 삽입용 벡터 pDC를 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 벡터에 상기 절단된 유전자 단편을 접합하여 PDC 벡터에 삽입하였다. 이에 제조된 벡터를 pDC-hisG_N215K/L231F/T235A라고 명명하였다.

서열번호	프라이머	서열(5'-3')
5	Cgl13032 hisG N215R -F	CCTCATGCTGGATTACCGCGTCG
6	Cgl13032 hisG N215R -R	CGACGCGGTAATCCAGCATGAGG
7	Cgl-hisG-G233H/T235Q-F	CAGGCTTATCCCACCCACAGGTATCCCCAC
8	Cgl-hisG-G233H/T235Q-R	GTGGGGATACCTGTGGGTGGGATAAGCCTG
9	Cgl-hisG-N215K-F	GCTGGATTACAAGGTCGACCGCGAC
10	Cgl-hisG-N215K-R	GTCGCGGTCGACCTTGTAATCCAGC
11	Cgl-hisG-L231F/T235A-F	ACCCCAGGCTTCTCCGGCCCAGCAGTATCCCCACT
12	Cgl-hisG-L231F/T235A-R	AGTGGGGATACTGCTGGGCCGGAGAAGCCTGGGGT

실시예 3. HisG 변이 유전자가 삽입된 균주 선별

실시예 3-1. HisG 변이 유전자가 삽입된 야생형 균주 선별

실시예 2에서 제조된, 상기 HisG 변이 유전자를 포함하는 벡터 hisG_N215R/G233H/T235Q를 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)에 일렉트로포레이션법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 염색체상에 변이 유전자가 삽입된 균주를 선별하기 위해 2차 재조합과정(cross-over)을 수행하였다. Xba1-Cgl-hisG-F (서열번호 3)과 Xba1-Cgl-hisG-R (서열번호 4) 프라이머를 사용하여 PCR을 진행했다. PCR 생성물의 서열 분석을 통해 게놈상에 삽입된 DNA 단편 hisG_N215R/G233H/T235Q에 의하여 hisG 변이 유전자가 삽입된 균주를 확인하였고 ATCC13032-161로 명명하였다.

실시예 3-2. HisG 변이 유전자를 포함하는 벡터가 삽입된 L-히스티딘 생산능을 갖는 균주 선별

코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)는 히스티딘을 생산하지 못하므로, 효소의 활성을 측정하고 L-히스티딘의 생산능을 확인하기 위하여, L-히스티딘 생산능을 가진 균주인 HCJ-86(KCCM11795P)를 숙주세포로 이용하였다.

상기 HCJ-86는 다음과 같이 수득하였다. 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 활성화 배지에서 16시간 동안 배양하여 활성화시킨 후, 활성화된 균주를 121℃에서 15분간 멸균한 종배지에 접종하여 14시간 동안 배양하고, 배양액 5㎖를 회수하였다. 상기 회수한 배양액을 100mM 시트르산 완충용액(citric buffer)으로 세척한 후, 최종농도 200 mg/L가 되도록 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG)를 첨가하여 20분 동안 처리하고, 100mM 인산 완충용액(phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG로 처리된 균주를 최소배지에 도말하여 사멸율을 계산해본 결과, 사멸율은 85%였다.

L-히스티딘의 유도체인 1,2,4-트리아졸-3-알라닌(1,2,4-triazole-3-alanine)에 대한 내성을 갖고, L-히스티딘 생산능을 갖는 1종의 변이주를 선별하였다. 상기 변이주를 HCJ-86이라 명명하고, 2015년 12월 22일자로 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11795P를 부여 받았다. HCJ-86의 hisG 유전자 서열분석 결과 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC 13032와 서열이 동일하였는 바, hisG 유전자에 변이는 없는 것으로 확인하였다.

실시예 2에서 제조된 HisG 변이 유전자를 포함하는 벡터들을 (pDC-hisG_G233H/T235Q, pDC-hisG_N215R/G233H/T235Q, pDC-hisG_N215K/L231F/T235A) 코리네박테리움 글루타미쿰 HCJ-86에 전기천공법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 염색체상에 변이 유전자가 삽입된 균주를 선별하기 위해 2차 재조합과정(cross-over)을 수행하였다. Xba1-Cgl-hisG-F (서열번호 3)과 Xba1-Cgl-hisG-R (서열번호 4) 프라이머를 사용하여 PCR을 진행했다. PCR product의 서열 분석을 통해 게놈상에 삽입된 DNA 단편 hisG_G233H/T235Q, hisG_N215R/G233H/T235Q, hisG_N215K/L231F/T235A 에 의하여 hisG 유전자가 변이된 균주 획득을 확인 하였고, 이들은 각각 HCJ-96, HCJ-161, HCJ-162로 명명되었다.

이 중 HCJ-161은 2017년 2월 27일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11982P를 부여받았다.

또한 상기 2차 재조합 과정을 거친 균주들의 서열을 분석하여 hisG_N215R DNA 단편만을 가진 균주를 선별하였고, 이는 HCJ-163으로 명명되었다.

hisG_N215R/L231F/T235A 변이를 가진 균주를 제조하기 위하여, HCJ-161 균주에 벡터 pDC-hisG_N215K/L231F/T235A를 전기천공법으로 형질전환 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 내성을 보이는 균주를 1차 선별했다. 2차 재조합과정(cross-over)을 거친 균주들의 서열을 분석하여, hisG 유전자에 재조합이 일어난 균주 중 hisG_N215R/L231F/T235A 변이를 포함하는 균주를 2차 선별했다. 이렇게 선별된 균주는 HCJ-164로 명명되었다.

hisG_N215K/G233H/T235Q 변이를 가진 균주를 제조하기 위하여, HCJ-162 균주에 벡터 pDC-hisG_G233H/T235Q를 전기천공법으로 형질전환 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 내성을 보이는 균주를 1차 선별했다. 2차 재조합과정(cross-over)을 거친 균주들의 서열을 분석하여, hisG 유전자에 재조합이 일어난 균주 중 hisG_N215K/G233H/T235Q 변이를 포함하는 균주를 2차 선별했다. 이렇게 선별된 균주는 HCJ-165로 명명되었다. 각 균주와 ATP 포스포리보실 전이효소 (ATP phosphoribosyltransferase, HisG)의 변이 형질은 하기 표 3과 같다.

균주	HisG 변이 형질
HCJ-96	HisG (G233H/T235Q)
HCJ-161	HisG (N215R/G233H/T235Q)
HCJ-162	HisG (N215K/L231F/T235A)
HCJ-163	HisG (N215R)
HCJ-164	HisG (N215R/L231F/T235A)
HCJ-165	HisG (N215K/G233H/T235Q)

실시예 4. ATP 포스포리보실 전이효소들의 활성 측정

실시에 4-1. ATP 포스포리보실 전이효소 수득

종배지 25㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 및 실시예 3에서 선별된 균주(HCJ-96, HCJ-161, HCJ-162, HCJ-163, HCJ-164, HCJ-165)들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하여 종 배양액을 얻었다. 그 후, 생산배지 24㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에, 1㎖의 종 배양액을 접종하고, 30℃에서 45시간 동안 200rpm으로 배양하였다. 배양 후 수득한 세포를 초음파 분쇄한 뒤 원심분리 하였으며 이로부터 수득한 상층액을 ATP 포스포리보실 전이효소의 활성 평가를 위해 사용하였다. 한편, 실시예 4-1에서 사용한 배지의 조성은 하기 표 4과 같다.

종류	배지의 조성 및 pH
종배지	포도당 5%, 박토펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.25%, 효모엑기스 1%, 요소 0.4%, pH 7.2
생산배지	포도당 5%, 황산암모늄 2%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200 ㎍/L, 탄산칼슘 30g, pH 7.2

실시예 4-2. ATP 포스포리보실 전이효소들의 활성 측정

상기 실시예 4-1에서 수득한 ATP 포스포리보실 전이효소 야생형과 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체들의 활성을 측정하였다. 상기 효소들의 활성을 파악하기 위한 평가 조건은 기존 문헌 보고를 참고하여 진행하였다 (Biochimie. 2012 Mar;94(3):829-38.).

상기 효소들의 활성 평가를 위해, 상층액은 단백질 정량을 하여 농도를 동일하게 맞춰 주었다. 상기 효소들을 시료 효소로 하여, 반응 조건은 정량된 단백질 0.05mg에 총 500ul이 되도록 반응 조성물 들을 섞은 뒤, 30℃에서 290nm의 UV파장으로1분 30초 동안 측정하였다. 활성이 낮은 ATP 포스포리보실 전이효소 야생형은, 활성 측정을 위해서 상층액 단백질 0.3mg 가 사용되었으며 290nm의 UV파장으로 30분간 측정되었다. 상기 효소들의 활성을 측정하기 위한 반응액의 조성은 다음과 같다.

반응 조성
100 mM Tris pH8.5
150 mM KCl
10 mM MgCl
5 mM ATP
0.5 mM PRPP
1U yeast pyrophosphatase
ATP 포스포리보실 전이효소 + DDW
total	500ul

측정한 결과, 상기 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체들은 야생형 효소보다 효소 활성이 증가 했음을 확인 할 수 있었다. 특히 N215R/G233H/T235Q 변이를 갖는 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체는, 야생형 효소 보다 약 160배의 높은 활성을 보였다(표 6).

ATP 포스포리보실 전이효소 (HisG) 활성

효소 종류	활성 (U/mg)
HisG	0.013
HisG (G233H/T235Q)	1.381
HisG (N215R/G233H/T235Q)	2.082
HisG (N215K/L231F/T235A)	0.387
HisG (N215R)	0.021
HisG (N215R/L231F/T235A)	0.408
HisG (N215K/G233H/T235Q)	1.3

실시예 4-3. ATP 포스포리보실 전이효소 변이체들의 히스티딘에 의한 활성 저해 정도 측정

ATP 포스포리보실 전이효소 야생형 및 상기 실시예 4-1에서 수득한 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체들의 L-히스티딘에 의한 활성 억제 정도를 측정하였다. 구체적으로, 각각 0mM, 50mM, 또는 100mM의 L-히스티딘을 포함하는 상기 실시예 4-2의 반응 조성액에서, 상기 실시예 4-2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 효소들의 활성을 측정하였다. 측정한 결과 상기 야생형 효소는 50mM 및 100mM의 L-히스티딘 농도에서 활성이 완전하게 저해 받는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만, 상기 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체들은 L-히스티딘에 의해 활성 저해를 적게 받았으며, 특히 N215R/G233H/T235Q 변이를 갖는 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체 100mM의 L-히스티딘이 있는 조성액에서도 가장 높은 활성을 보였다(표 7).

L-히스티딘에 의한 ATP 포스포리보실 전이효소 (HisG) 활성 억제

	효소 활성 (U/mg)
	0mM	50mM	100mM
HisG	0.013	0	0
HisG (G233H/T235Q)	1.381	0.64	0.542
HisG(N215R/G233H/T235Q)	2.082	1.435	1.335
HisG (N215K/L231F/T235A)	0.387	0.202	0.023
HisG (N215R)	0.021	0	0
HisG (N215R/L231F/T235A)	0.408	0.157	0
HisG (N215K/G233H/T235Q)	1.3	0.679	0.413

실시예 5. ATP 포스포리보실 전이효소 변이체가 도입된 L-히스티딘 생산 균주의 생산능 측정

상기 실시예 3에 선별된 균주의 L-히스티딘 생산능을 측정하여 활성이 증가한 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체가 실제 L-히스티딘 생산에 미치는 영향을 확인하였다.

종배지 25㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에, 모균주인 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032), 및 변이주 (ATCC13032-161, HCJ-96, HCJ-161, HCJ-162, HCJ-163, HCJ-164, HCJ-165)을 각각 접종한 후, 30℃에서 20시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하여 종 배양액을 얻었다. 그 후, 생산배지 24㎖를 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에, 1㎖의 종 배양액을 접종하고, 30℃에서 45시간 동안 200rpm으로 배양하여 L-히스티딘을 생산하도록 하였다. 배양 종료 후, 액체 고속 크로마토그래피를 이용하여 L-히스티딘의 생산량을 측정하였다. 자세한 분석 방법 및 농도는 하기 표 8과 같다.

분석 항목		Histidine
STD 농도		STD 1 : 0.011 g/L STD 2 : 0.033 g/L STD 3 : 0.100 g/L
이동상		A: 25mM-KH₂PO₄ + 12mM-Octane sulfonic acid sodium salt pH 2.5 (by H₃PO₄) B: 25mM-KH₂PO₄ + 12mM-Octane sulfonic acid sodium salt : Acetonitrile = 50 : 50 pH 2.5 (by H₃PO₄) A : B = 80 : 20
분석 조건	시스템	HPLC
	시료주입량	5㎕
	flow rate	1.0 ml / min
	컬럼	CAP CELL PAK C18 (ACR) 3 ㎛ 4.6 x 150 mm
	컬럼 온도	40℃
	디텍터	UV 210nm
	Run time	12min

균주	L-히스티딘 농도(g/L)
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032	0
ATCC 13032 -161	0.5
HCJ-86	1.6
HCJ-96 [hisG (G233H/T235Q)]	1.9
HCJ-161 [hisG (N215R/G233H/T235Q)]	2.3
HCJ-162 [hisG (N215K/L231F/T235A)]	1.6
HCJ-163 [hisG (N215R)]	1.6
HCJ-164 [hisG (N215R/L231F/T235A)]	1.5
HCJ-165 [hisG (N215K/G233H/T235Q)]	2.1

그 결과, 야생형 코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032는 L-히스티딘을 전혀 생산하지 못하였으나, 본원의 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체로 형질전환된 ATCC 13032-161는 0.5g/L 생산하는 것을 확인하였다. 또한, HCJ-161 는 2.3 g/L 로, 모균주인 HCJ-86 대비 43.75% 증가하였다 (표 9). HCJ-86, HCJ-96, HCJ-162, HCJ-163, HCJ-164는 모두 1.6~1.9 g/L 수준의 히스티딘이 생성되었으며, ATP 포스포리보실 전이효소 변이체 (N215R/G233H/T235Q) 를 가진 균주인 HCJ-86가 가장 높은 효소 활성 및 L-히스티딘 생산능을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 결과적으로 본원의 ATP 포스포리보실 전이효소 변이체 (N215R/G233H/T235Q)를 이용하여, L-히스티딘을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11982P

수탁일자 : 20170227

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> An ATP phoshpolybosyltransferase mutation and a method of producing histidine using thereof <130> KPA170157-KR <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HisG <400> 1 Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys 20 25 30 Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu 35 40 45 Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His 65 70 75 80 Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala 85 90 95 Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile 100 105 110 Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly 115 120 125 Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile 130 135 140 Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr 165 170 175 Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu 180 185 190 Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn 195 200 205 Phe Leu Met Leu Asp Tyr Arg Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala 210 215 220 Thr Ala Val Thr Pro Gly Leu Ser His Pro Gln Val Ser Pro Leu Ala 225 230 235 240 Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala 245 250 255 Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu 260 265 270 Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile 275 280 <210> 2 <211> 846 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> hisG <400> 2 atgttgaaaa tcgctgtccc aaacaaaggc tcgctgtccg agcgcgccat ggaaatcctc 60 gccgaagcag gctacgcagg ccgtggagat tccaaatccc tcaacgtttt tgatgaagca 120 aacaacgttg aattcttctt ccttcgccct aaagatatcg ccatctacgt tgctggtggc 180 cagctcgatt tgggtatcac cggccgcgac cttgctcgcg attcccaggc tgatgtccac 240 gaagttcttt ccctcggctt cggttcctcc actttccgtt acgcagcacc agctgatgaa 300 gagtggagca tcgaaaagct cgacggcaag cgcatcgcta cctcttaccc caaccttgtt 360 cgcgatgacc tcgcagcacg tgggctttcc gctgaggtgc tccgcctcga cggtgcagta 420 gaggtatcca tcaagcttgg tgtcgcagat gccatcgccg atgttgtatc caccggccgc 480 acgctgcgtc agcaaggtct tgcacctttc ggcgaggttc tgtgcacctc tgaggctgtc 540 attgttggcc gcaaggatga aaaggtcacc ccagagcagc agatcctgct tcgccgcatc 600 cagggaattt tgcacgcgca gaacttcctc atgctggatt accgcgtcga ccgcgacaac 660 ctggacgctg ccactgcagt aaccccaggc ttatcccacc cacaggtatc cccactggca 720 cgcgacaact gggttgctgt acgcgccatg gtgccacgca ggtcagctaa cgccatcatg 780 gataagcttg ctggactcgg cgctgaagcc atcctggctt ctgaaatccg catcgcccgc 840 atctag 846 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xba1-Cgl-hisG-F <400> 3 gggtctagac ccaaacaaag gctcgc 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xba1-Cgl-hisG-R <400> 4 gggtctagag caaggttggc aacaacc 27 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl13032 hisG N215R -F <400> 5 cctcatgctg gattaccgcg tcg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl13032 hisG N215R -R <400> 6 cgacgcggta atccagcatg agg 23 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl-hisG-G233H/T235Q-F <400> 7 caggcttatc ccacccacag gtatccccac 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl-hisG-G233H/T235Q-R <400> 8 gtggggatac ctgtgggtgg gataagcctg 30 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl-hisG-N215K-F <400> 9 gctggattac aaggtcgacc gcgac 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl-hisG-N215K-R <400> 10 gtcgcggtcg accttgtaat ccagc 25 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl-hisG-L231F/T235A-F <400> 11 accccaggct tctccggccc agcagtatcc ccact 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl-hisG-L231F/T235A-R <400> 12 agtggggata ctgctgggcc ggagaagcct ggggt 35 <210> 13 <211> 281 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> HisG <400> 13 Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys 20 25 30 Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu 35 40 45 Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His 65 70 75 80 Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala 85 90 95 Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile 100 105 110 Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly 115 120 125 Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile 130 135 140 Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr 165 170 175 Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu 180 185 190 Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn 195 200 205 Phe Leu Met Leu Asp Tyr Asn Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala 210 215 220 Thr Ala Val Thr Pro Gly Leu Ser Gly Pro Thr Val Ser Pro Leu Ala 225 230 235 240 Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala 245 250 255 Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu 260 265 270 Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile 275 280

Claims

서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 ATP 포스포리보실기 전이효소 (ATP Phosphoribosyltransferase, HisG)에서 215번째 아스파라긴 (asparagine) 아미노산 잔기가 알지닌 (arginine)으로, 233번째 글라이신 (glycin) 아미노산 잔기가 히스티딘 (histidine)으로, 235번째 쓰레오닌 (threonine) 아미노산 잔기가 글루타민 (glutamine)으로 치환된, ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체.
제1항에 있어서, 상기 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체.
제1항의 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제1항의 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제1항의 ATP 포스포리보실기 전이효소 변이체를 포함하거나, 제4항의 벡터로 형질전환된, 히스티딘(Histidine)을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
제5항의 히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는, 히스티딘 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 히스티딘 생산방법.