KR20240120829A

KR20240120829A - 망가니즈 익스포터 신규 변이체 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산 방법

Info

Publication number: KR20240120829A
Application number: KR1020230013200A
Authority: KR
Inventors: 한종윤; 신원주; 필 김; 조영일
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2023-01-31
Filing date: 2023-01-31
Publication date: 2024-08-08
Also published as: CN118420726A; WO2024162636A1

Abstract

본 발명은 망가니즈 익스포터 신규 변이체 및 이를 이용한 L-히스티딘 생산 방법에 관한 것으로, 상기 망가니즈 익스포터 변이체는 망가니즈 익스포터를 구성하는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환됨으로써 단백질 활성이 변화되어, 이를 포함하는 재조합 미생물은 L-히스티딘을 효율적으로 생산할 수 있다.

Description

망가니즈 익스포터 신규 변이체 및 이를 이용한 L-히스티딘 생산 방법{Novel variant of manganese exporter and method for producing L-histidine using the same}

본 발명은 망가니즈 익스포터 신규 변이체 및 이를 이용한 L-히스티딘 생산 방법에 관한 것이다.

L-히스티딘(L-histidine)은 사람이나 동물 체내에서 합성되지 않는 필수아미노산으로서 외부에서 공급되어야 하며, 일반적으로 세균이나 효모와 같은 미생물을 이용한 발효에 의해 생산된다. L-히스티딘 생산은 자연상태에서 수득된 야생형 균주나 이의 L-히스티딘 생산능이 향상되도록 변형된 변이주를 이용할 수 있다.

최근에는 L-히스티딘의 생산 효율을 개선시키기 위해 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되는 대장균, 코리네박테리움 등의 미생물을 대상으로 유전자 재조합 기술을 적용하여 우수한 L-히스티딘 생산능을 갖는 다양한 재조합 균주 또는 변이주 및 이를 이용한 L-히스티딘 생산 방법이 개발되고 있다. 특히 L-히스티딘의 생합성 경로에 관여하는 효소, 전사인자, 수송 단백질 등의 유전자를 대상으로 하거나, 또는 이들의 발현을 조절하는 프로모터에 변이를 유도하여 L-히스티딘의 생산량을 증대시키려는 시도가 있었다. 그러나 L-히스티딘 생산에 직간접적으로 연관된 효소, 전사인자, 수송 단백질 등 단백질의 종류가 수십 ~ 수백여 종에 이르기 때문에 이러한 단백질의 활성 변화에 따른 L-히스티딘 생산능 증가 여부에 관해 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-1904666호 한국등록특허 제10-2004917호

본 발명은 신규한 망가니즈 익스포터 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용한 L-히스티딘의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 서열번호 3의 아미노산 서열에서 25번째 글리신이 아스파트산으로 치환된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 망가니즈 익스포터 변이체를 제공한다.

본 발명에서 사용된 “망가니즈 익스포터(manganese exporter)”는 망간 유출 펌프(manganese efflux pump)로 기능할 것으로 예상되는 단백질로, 망간에 대한 내성을 부여한다. 상기 망가니즈 익스포터는 mntP 유전자에 의해 암호화되거나 망가니즈 익스포터 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 망가니즈 익스포터는 서열번호 4의 염기서열에 의해 암호화된 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 망가니즈 익스포터는 서열번호 4의 망가니즈 익스포터를 암호화하는 유전자 서열 또는 이와 실질적 동일성을 가지는 서열일 수 있다. 여기서 “실질적 동일성”이란 각각의 유전자 서열, 즉 염기서열 또는 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 뉴클레오티드 서열을 최대한 대응되도록 정렬하여 분석하였을 때 상기 임의의 다른 뉴클레오티드 서열이 각각의 뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 의미한다.

본 발명에서의 망가니즈 익스포터는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 망가니즈 익스포터는 야생형 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “변이체”는 특정 유전자의 아미노산 서열 중 N-말단, C-말단 및/또는 내부에서 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution), 치환(substitution), 결실(deletion), 변형(modification) 또는 부가(addition)되어 변이 전 아미노산 서열과 상이하나, 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 의미한다. 여기서 “보존적 치환”이란 하나의 아미노산을 구조적 및/또는 화학적 성질이 유사한 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미하며, 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나, 또는 전혀 영향을 미치지 않을 수 있다. 상기 아미노산으로는 알라닌(Ala), 이소루신(Ile), 발린(Val), 루신(Leu), 메티오닌(Met), 아스파라긴(Asn), 시스테인(Cys), 글루타민(Gln), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 아스파트산(Asp), 글루탐산(Glu), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 라이신(Lys), 글리신(Gly) 및 프롤린(Pro)으로부터 선택된 것이다.

또한, 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거되거나, 또는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 것을 포함한다.

이러한 단백질 변이체는 그 능력이 변이 전 단백질에 비하여 증가 (강화)되거나, 변하지 않거나, 또는 감소 (약화)될 수 있다. 여기서 "증가 또는 강화"는 단백질 자체의 활성이 변이 전 단백질에 비하여 증가한 경우, 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 증가 또는 번역 증가 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 야생형 균주 또는 변이 전 단백질을 발현하는 균주에 비하여 높은 경우, 및 이들의 조합을 포함한다. 또한 "감소 또는 약화"는 단백질 자체의 활성이 변이 전 단백질에 비해 감소한 경우, 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 활성 정도가 야생형 균주 또는 변이 전 단백질을 발현하는 균주에 비하여 낮은 경우, 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명에서는 변이체가 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 등과 혼용될 수 있다.

본 발명에서의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에서 25번째 위치한 아미노산인 글리신이 아스파트산으로 치환된 망가니즈 익스포터로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 망가니즈 익스포터 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 여기서 "상동성" 또는 "동일성"이란 기준이 되는 아미노산 서열과 임의의 다른 아미노산 서열을 최대한 대응되도록 정렬하여 분석하였을 때 두 아미노산 서열 간의 일치율(%)을 의미한다. 이러한 망가니즈 익스포터 변이체는 그 기능 또는 특성을 유지하는 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 망가니즈 익스포터 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 사용된 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 망가니즈 익스포터 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양상은 상기 망가니즈 익스포터 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용된 “벡터(vector)”는 숙주세포에 목적 유전자를 전달하여 발현시키기 위한 수단으로 사용되는 모든 유형의 핵산 서열 운반 구조체를 의미한다. 상기 벡터는 특별한 언급이 없는 한, 담지된 핵산 서열이 숙주세포 유전체 내 삽입되어 발현되도록 하는 것 및/또는 독자적으로 발현되도록 하는 것을 의미할 수 있다. 이러한 벡터는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하며, “작동가능하게 연결된(operably linked)”이란 목적 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결된 것을 의미하고, “조절요소”는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 벡터의 일례로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들면, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로는 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, Charon21A 등이 있으며, 플라스미드 벡터로는 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 발현을 위한 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 유전자 또는 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

본 발명에서 사용된 “재조합 벡터”는 적합한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 이때, 상기 "적합한 숙주세포"는 벡터가 복제 가능한 것으로서 복제가 개시되는 특정 염기서열인 복제 원점을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 메탈로 티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예컨대, 아데노 바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토 메갈로 바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 가진다.

상기 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체 (숙주세포)를 선별하기 위한 것으로 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커는 대표적인 예로 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

재조합 벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다.

재조합 미생물을 제작하기 위하여 원핵세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, E. coli XL1-Blue와 같은 대장균 속 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 코리네박테리움 속 균주, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 슈도모나스 종과 같은 다양한 장내균과 균주 등이 이용되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

재조합 미생물을 제작하기 위하여 진핵세포에 형질전환을 하는 경우에는 숙주세포로서 효모 (예컨대, 사카로마이세스 세레비지에), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 “형질전환(transformation)”은 외부 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미하며, “형질전환체(transformat)”는 외부 DNA가 도입되어 목적 유전자의 발현을 안정적으로 유지하는 숙주세포를 의미한다.

상기 형질전환은 숙주세포에 따라 적합한 벡터 도입 기술이 선택되어 목적 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 벡터 도입은 전기천공법(electroporation), 열 충격(heat-shock), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 초산 리튬-DMSO법, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.

상기 형질전환체는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질감염, 형질전환, 또는 감염된 세포를 포함하며, 재조합 숙주세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물과 동일한 용어로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 에스케리치아(Escherichia) 속 균주인 것일 수 있다.

상기 에스케리치아 속 균주로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리치아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae), 에스케리치아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리치아 헤르만니(Escherichia hermannii), 에스케리치아 불네리스(Escherichia vulneris) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서의 형질전환체는 전술한 망가니즈 익스포터 변이체 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 균주, 상기 망가니즈 익스포터 변이체 또는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주, 또는 상기 망가니즈 익스포터 변이체에 대한 활성을 가지는 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 L-히스티딘 생산능을 가지는 것일 수 있다.

상기 형질전환체는 자연적으로 L-히스티딘 생산능을 가지고 있거나, 또는 인위적으로 L-히스티딘 생산능이 부여된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체는 망가니즈 익스포터 활성이 변화되어 L-히스티딘 생산능이 향상된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 “생산능이 향상된”은 모균주에 비해 L-히스티딘의 생산성이 증가된 것을 의미한다. 상기 모균주는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 야생형 에스케리치아 속 균주이거나 야생형으로부터 변이된 에스케리치아 속 균주일 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환체는 망가니즈 익스포터 변이체가 도입됨으로써 망가니즈 익스포터의 활성이 변화하여 모균주에 비해 증가된 L-히스티딘 생산능을 나타낸다. 보다 구체적으로, 상기 형질전환체는 모균주에 비해 L-히스티딘 생산량이 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 증가하거나, 또는 1.1배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배 또는 10배 증가된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일례로, 상기 망가니즈 익스포터 변이체를 포함한 형질전환체는 모균주에 비해 L-히스티딘 생산량이 5% 이상, 구체적으로는 5 내지 50% (바람직하게는 10 내지 40%) 증가된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는 L-히스티딘의 생산 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 에스케리치아 속 균주에 대한 배양 배지는 공지된 문헌 (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20 내지 45℃, 예를 들면 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160시간일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지에서 L-히스티딘을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-히스티딘을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-히스티딘을 회수하는 단계는 배양 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-히스티딘을 회수하는 단계는 L-히스티딘을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 망가니즈 익스포터 변이체는 망가니즈 익스포터를 구성하는 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환됨으로써 단백질 활성이 변화되어, 이를 포함하는 재조합 미생물은 L-히스티딘을 효율적으로 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 망가니즈 익스포터 변이체를 발현하는 균주 제작

망가니즈 익스포터의 아미노산 서열 (서열번호 3)에서 25번째 위치한 글리신(G)이 아스파트산(D)으로 치환된 변이체가 L-히스티딘의 생산에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상기 망가니즈 익스포터 변이체를 발현하는 플라스미드 및 상기 벡터가 도입된 균주를 제작하였다.

1-1. mntP_G25D가 도입된 플라스미드 제작

대장균(Escherichia coli) DS9H (MG1655) (수탁번호 KCTC14419BP)(이하 'DS9H'라 함)의 genomic DNA를 주형으로 프라이머 mntP_G25D_first-F 및 mntP_G25D_first-R의 프라이머 쌍과 프라이머 mntP_G25D_second-F 및 mntP_G25D_second-R의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 이후, mntP 유전자의 25번 아미노산 변이를 포함하는 두 개의 PCR 산물을 각각 주형으로 사용하여 프라이머 mnt_G25D_first-F 및 mntP_G25D_second-R의 프라이머 쌍으로 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 하나의 단편으로 연결시켰다. PCR 단편과 pTRC99A 플라스미드 (ADDGENE)에 제한효소 EcoRI 및 HindIII (NEB)을 처리하고 T4 리가아제(ligase)를 사용하여 클로닝하였다. 구축된 플라스미드는 pTRC99A-mntP_G25D로 명명하였고, 프라이머 pTRC99A-CF 및 pTRC99A-CR의 프라이머 쌍을 사용하여 서열을 확인하였다.

PCR 증폭에서는 pfu premix (bioneer)를 사용하였고, 95℃에서 5분 변성한 후 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초를 30회 반복하고 72℃에서 5분간 반응시켰다.

플라스미드 제작에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

프라이머 명칭	서열번호	프라이머 서열 (5’-3’)
mntP_G25D_first-F	5	ATATGAATTCAAGCAATGAAATAATATATTCCAACAG
mntP_G25D_first-R	6	GGTTTATGGAGGGTGGCATC
mntP_G25D_second-F	7	GATGCCACCCTCCATAAACC
mntP_G25D_second-R	8	ATATAAGCTTTTAACCGTGGAAGTGCGTCC
pTRC99A-CF	9	ACCAATGCTTCTGGCGTCAG
pTRC99A-CR	10	TACTGCCGCCAGGCAAATTC

1-2. mntP_G25D가 도입된 변이주 제작

mntP_G25D가 도입된 플라스미드 pTRC99A-mntP_G25D를 E. coli DS9H 균주의 크로모좀에 도입하기 위해 원스텝 불화성화 방법을 이용하였다 (Warner et al., PNAS, 6:6640-6645(2000)).

먼저, 상동 재조합(homologous recombination)을 위한 mntP 유전자의 앞쪽과 뒤쪽 단편을 얻기 위해 대장균(Escherichia coli) DS9H의 genomic DNA를 주형으로 하여 프라이머 mntP_HF-F 및 mntP_HF-R의 프라이머 쌍과 프라이머 mntP_HR-F 및 mntP_HR-R의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 통해 mntP_HF와 mntP_HR 단편을 각각 증폭하였다. 그리고 카나마이신 항생제 마커와 FRT가 포함된 카세트를 얻기 위해, pKD13 플라스미드 (CGSC)로부터 프라이머 FRT+mntP_HF-F 및 FRT-R의 프라이머 쌍을 사용해 증폭하여 카세트 단편을 얻었다. 마지막으로 mntP_G25D를 얻기 위해서, pTRC99A-mntP_G25D 플라스미드로부터 프라이머 mntP-F 및 mntP+mntP_HR-R의 프라이머 쌍을 사용하여 mntP_G25D 단편을 얻었다. 최종적으로 증폭된 4개의 PCR 단편들을 주형으로 사용하여 프라이머 mntP_HF-F 및 mntP_HR-R의 프라이머 쌍으로 오버랩핑(overlapping) PCR을 이용하여 하나의 단편으로 연결시켰다. 하나로 연결된 DNA 단편을 pKD46 플라스미드 (CGSC)를 가지고 있는 E. coli DS9H 균주에 전기청공법으로 도입하였다. 이후 카나마이신 내성을 보이는 세포주들을 대상으로 프라이머 mntP-CF 및 mntP-CR의 프라이머 쌍을 사용해 PCR을 수행하여 mntP_G25D가 도입된 균주들을 확인하였다.

mntP_G25D 도입이 확인된 균주들을 대상으로 항생제 내성 유전자인 카나마이신 마커를 제거하는 과정을 수행하였다. mntP_G25D 도입이 확인된 균주에 pCP20 플라스미드 (ADDGENE)를 도입하여 FLP 재조합을 유도한 후, 항생제 (카나마이신) 첨가 및 미첨가된 LB 평판배지들에서 각각 생장 여부를 통해 항생제 제거 여부를 확인하였다. 항생제가 제거된 균주들은 LB 평판배지에서 생장을 하지만, 항생제 (카나마이신)가 첨가된 LB 평판배지에서는 생장하지 못함을 이용하여 확인하였다. 그리고 최종적으로 프라이머 mntP-CF 및 mntP-CR의 프라이머 쌍을 사용하여 서열을 확인하였고, mntP_G25D가 도입된 변이주를 DS9H_::mntP_G25D로 명명하였다.

PCR 증폭에서는 pfu premix (bioneer)를 사용하였고, 95℃에서 5분 변성한 후 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초를 30회 반복하고 72℃에서 5분간 반응시켰다.

변이주 제작에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

프라이머 명칭	서열번호	프라이머 서열 (5’-3’)
mntP_HF-F	11	TTCTTCGCCAATGTCTGGAT
mntP_HF-R	12	TATTGATAACGATTTTCATTTGG
FRT+mntP_HF-F	13	AATGAAAATCGTTATCAATAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
FRT-R	14	ATCAATTCGCGCTAACTCACACATGAGAATTAATTCCGGGG
mntP-F	15	CCCGGAATTAATTCTCATGTGTGAGTTAGCGCGAATTGATCTG
mntP+mntP_HR-R	16	CACCTCTGGCAGCGTTCTTATTAACCGTGGAAGTGCGTCC
mntP_HR-F	17	TAAGAACGCTGCCAGAGGTG
mntP_HR-R	18	TGGGTCATTACTGCCACGCC
mntP-CF	19	ATCATGGTGCGTTAATAACGAC
mntP-CR	20	TTGCCGTTTTCCGATACCAG

실험예 1. 망가니즈 익스포터 변이체를 발현하는 균주의 L-히스티딘 생산능 평가

모균주 DS9H와 mntP_G25D가 도입된 변이주 DS9H_::mntP_G25D의 L-히스티딘 생산능을 비교하였다.

하기 표 3의 히스티딘 생산용 배지 10 mL가 담긴 100 mL 플라스크에 각 균주 (모균주 또는 변이주)를 부피 기준으로 1%씩 접종하여 34℃, 200 rpm의 조건으로 72시간 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC (Agilent)를 사용하여 배지 내 L-히스티딘의 농도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

성분	농도
포도당	8%
황산마그네슘	0.1%
황산암모늄	2.0%
MSG	0.1%
일인산칼륨	0.1%
효모추출물	0.1%
황산칼륨	0.02%
티아민-HCl	20 ppm
니코틴산	10 ppm
황산철	5 ppm
황산아연	5 ppm
황산망간	5 ppm
탄산칼슘 (별도멸균)	5.0%

균주 명칭	L-히스티딘 (%)
DS9H	0.78
DS9H_::mntP_G25D	0.99

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 망가니즈 익스포터 변이체가 도입된 변이주는 25번째 글리신이 아스파트산으로 치환됨으로써 모균주에 비해 L-히스티딘 생산량이 약 27% 향상된 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 망가니즈 익스포터의 점 돌연변이 도입이 L-히스티딘 생산성에 대한 유효한 효과를 제공함을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)

KCTC14419BP

20201228

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 3의 아미노산 서열에서 25번째 글리신이 아스파트산으로 치환된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 망가니즈 익스포터 변이체.
청구항 1의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 1의 변이체 또는 청구항 2의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체.
청구항 3에 있어서,
상기 형질전환체는 에스케리치아(Escherichia) 속 미생물인 것인 형질전환체.
청구항 3에 있어서,
상기 형질전환체는 L-히스티딘 생산능을 가지는 것인 형질전환체.
청구항 3의 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 형질전환체 또는 형질전환체가 배양된 배지로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는 L-히스티딘의 생산 방법.