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KR101762047B1 - 스플라이세오스타틴 유사체 - Google Patents

스플라이세오스타틴 유사체 Download PDF

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KR101762047B1
KR101762047B1 KR1020157014679A KR20157014679A KR101762047B1 KR 101762047 B1 KR101762047 B1 KR 101762047B1 KR 1020157014679 A KR1020157014679 A KR 1020157014679A KR 20157014679 A KR20157014679 A KR 20157014679A KR 101762047 B1 KR101762047 B1 KR 101762047B1
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KR
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alkyl
nrr
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hydrogen
optionally substituted
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KR1020157014679A
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English (en)
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KR20150080618A (ko
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케네쓰 존 디리코
알레산드라 에스. 에우스타퀴오
마이클 에릭 그린
하이인 헤
민 헤
프랭크 에리히 코엔
크리스토퍼 존 오도넬
수지에트 푸텐비틸
아노카 사야니 라트나야케
차크라파니 수브라만얌
제스 알렉산더 테스케
후이 유 양
Original Assignee
화이자 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 신규 세포독성 스플라이세오스타틴 유사체 및 유도체, 그의 항체 약물 접합체, 및 암을 비롯한 의학적 상태를 치료하기 위해 상기를 사용하는 방법에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00473

Description

스플라이세오스타틴 유사체 {SPLICEOSTATIN ANALOGS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 11월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 61/722,769, 2012년 11월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 61/723,645, 및 2013년 5월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 61/829,409를 우선권 주장하며, 이들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항체-약물-접합체 (ADC)에서 페이로드로서 유용한 신규 천연 생성물-유래 및/또는 스플라이세오스타틴-기반 화합물, 및 ADC와 관련하여 유용한 페이로드-링커 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 언급된 페이로드, 페이로드-링커 및 ADC를 포함하는 조성물, 및 암을 비롯한 병리학적 상태를 치료하기 위해 이들 페이로드, 페이로드-링커 및 ADC를 사용하는 방법에 관한 것이다.
직접적인 또는 링커를 통한 항체에 대한 약물의 접합은 약물의 접합을 위한 화학적 기의 확인 및 위치, 약물 방출의 메카니즘, 약물 방출을 제공하는 구조적 요소, 및 방출된 유리 약물로의 구조적 변형을 비롯한 다양한 인자의 고려를 포함한다. 추가로, 약물이 항체 내재화 후에 방출되어야 하는 경우에, 약물 방출의 메카니즘은 접합체의 세포내 트래픽킹과 일치하여야 한다.
다수의 다양한 약물 부류에 대해 항체를 통한 전달이 시도되었지만, 단지 몇몇 약물 부류만이 적합한 독성 프로파일을 가지면서 항체 약물 접합체로서 효과적인 것으로 입증된 바 있다.
천연 생성물 FR901463, FR901464 및 FR901465는 인간 암 세포주에 대한 강력한 억제 활성 및 여러 이종이식 종양 모델에서의 효능을 갖는 것으로 보고되었다. (Journal of Antibiotics (1996), 49(12), 1204-1211.) 스플라이세오스타틴 A로 지정된 천연 생성물 FR901464 및 그의 메틸 케탈은 본질적인 하위복합체, U2 snRNA의 성분인 SF3b와 상호작용함으로써 스플라이세오솜을 억제하는 것으로 최근에 보고되었다. (Nature Chemical Biology (2007), 3(9), 576-583.; Nature (London, United Kingdom) (2010), 468(7324), 664-668.)
본 발명은 화합물 및 그를 함유하는 제약 조성물, 그의 제조법, 및 화합물의 용도, 주로 그러나 비배타적으로는 항암제에 관한 것이다.
한 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00001
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 독립적으로 수소, -C1- 6알킬, -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
R13은 수소, C1- 6알킬, C3- 8카르보시클릴, C3- 8헤테로시클릴, C1- 6알킬-C6- 14아릴, C1- 6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, -(C(R)2)m-O-NRR 및 -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 II의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 II>
L-P
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P에 결합되고;
P는 하기 화학식 I의 라디칼이고:
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00002
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 -(C(R)2)m-C(O)- 또는 -(C(R)2)m-이고;
L1은 -할로겐, -NR2,
Figure 112015053331353-pct00003
,
Figure 112015053331353-pct00004
,
Figure 112015053331353-pct00005
,
Figure 112015053331353-pct00006
,
Figure 112015053331353-pct00007
및
Figure 112015053331353-pct00008
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1- 6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00009
,
Figure 112015053331353-pct00010
및
Figure 112015053331353-pct00011
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13은 수소, C1- 6알킬, C3- 8카르보시클릴, C3- 8헤테로시클릴, C1- 6알킬-C6- 14아릴, C1- 6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 II'의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 II'>
L-P'
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P'에 결합되고;
P'는 하기 화학식 I'의 라디칼이고:
<화학식 I'>
Figure 112015053331353-pct00012
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -(C(R)2)m-, -OR", -OCOR13 ', -OC(O)NRR14 ', -OCON(R)N(R)- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 독립적으로 수소, -C1- 6알킬, -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
L1은 -할로겐, -NR2,
Figure 112015053331353-pct00013
,
Figure 112015053331353-pct00014
,
Figure 112015053331353-pct00015
,
Figure 112015053331353-pct00016
,
Figure 112015053331353-pct00017
및
Figure 112015053331353-pct00018
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1- 6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00019
,
Figure 112015053331353-pct00020
및
Figure 112015053331353-pct00021
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13'는 결합, -C1- 6알킬렌-, -C3- 8카르보시클릴-, -C3- 8헤테로시클릴-, -C1- 6알킬-C6- 14아릴-, -C1-6알킬-C5-14헤테로아릴-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R14'는 독립적으로 결합, -NR-, -C3- 10카르보시클릴-, -C3- 10헤테로시클릴-, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR', -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NR- 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 R14'는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -NRR 또는 -SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택되고;
각각의 R"는 독립적으로 결합 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 III>
(AB)-(L-P)b
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P에 결합되고;
P는 하기 화학식 I의 라디칼이고:
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00022
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
AB는 항체이고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 -(C(R)2)m-C(O)- 또는 -(C(R)2)m-이고;
L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00023
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1-6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00024
,
Figure 112015053331353-pct00025
및
Figure 112015053331353-pct00026
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13은 수소, C1- 6알킬, C3- 8카르보시클릴, C3- 8헤테로시클릴, C1- 6알킬-C6- 14아릴, C1- 6알킬-C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
b는 1-20이고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 III'의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 III'>
(AB)-(L-P')b
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P'에 결합되고;
P'는 하기 화학식 I'의 라디칼이고:
<화학식 I'>
Figure 112015053331353-pct00027
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
AB는 항체이고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -(C(R)2)m-C(O)-, -(C(R)2)m-, -OR", -OCOR13 ', -OCONRR14 ', -OCON(R14)N(R15)- 및 -NR14-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 독립적으로 수소, -C1- 6알킬, -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00028
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00029
,
Figure 112015053331353-pct00030
및
Figure 112015053331353-pct00031
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13'는 결합, -C1- 6알킬렌-, -C3- 8카르보시클릴-, -C3- 8헤테로시클릴-, -C1- 6알킬-C6- 14아릴-, -C1-6알킬-C5-14헤테로아릴-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R14'는 독립적으로 결합, -NR-, -C3- 10카르보시클릴-, -C3- 10헤테로시클릴-, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR', -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NR- 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 R14'는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -NRR 또는 -SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택되고;
각각의 R"는 독립적으로 결합 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
b는 1-20이고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 AB가 트라스투주맙, 트라스투주맙 돌연변이체 (예를 들어 본원에 또는 국제 특허 출원 PCT/IB2012/056234에 개시된 트라스투주맙 돌연변이체), 오레고보맙, 에드레콜로맙, 세툭시맙, 비트로넥틴 수용체 (αvβ3)에 대한 인간화 모노클로날 항체, 알렘투주맙, 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-HLA-DR 항체, 131I Lym-1, 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 뮤린 항-HLA-Dr10 항체, 호지킨병 또는 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-CD22 mAb, 라베투주맙, 베바시주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 이필리무맙, 겜투주맙, 종양태아성 단백질 수용체 5T4에 대한 인간화 모노클로날 항체 및 M1/70 (CD11b 수용체에 대한 항체) 및 다른 항체로부터 선택되는 것인, 화학식 III 또는 III'의 항체 약물 접합체 화합물에 관한 것이다.
트라스투주맙은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체를 지칭하는 (INN; 상표명 헤르클론(Herclon), 헤르셉틴(Herceptin))를 지칭한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 L이 1개 이상의 독립적으로 선택된 아미노산 디-라디칼, 바람직하게는 발린, 시트룰린, 페닐알라닌, 리신, 알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 독립적으로 선택된 아미노산 디라디칼을 포함하는 것인, 화학식 II, II', III 또는 III'의 화합물 또는 화합물들에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 L이 세포내 프로테아제에 의해, P, 또는 P를 포함하는 라디칼로부터 절단될 수 있는 것인, 화학식 III 또는 III'의 화합물 또는 화합물들에 관한 것이다.
추가의 측면에 따르면, 본 발명은 항체가 황 또는 황-황 결합에 의해 항체의 시스테인 잔기를 통해, 아미드 결합에 의해 항체의 리신 잔기를 통해, 또는 아미드 결합에 의해 글루타민 잔기를 통해 아미노산 디-라디칼에 부착되는 것인, 화학식 III 또는 III'의 화합물 또는 화합물들에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 유효량의 화학식 I, I', II, II', III 또는 III'의 화합물(들) 또는 그의 염(들) 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 화학식 I, I', II, II', III 또는 III'의 화합물 또는 화합물들 및/또는 그의 염 또는 염들의 제약 조성물에 관한 것이다. 이러한 제약 조성물은 튜불린-형성 억제제, 토포이소머라제 억제제 및 DNA 결합제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료 유효량의 화학요법제를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 또는 그의 증식을 억제하는데 효과적인 양의 화학식 I, I', II, II', III 또는 III'의 화합물 및/또는 그의 염 또는 염들을 사용하여 환자에서 종양 세포 또는 암 세포를 치료하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 또는 그의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 상기 언급된 화합물 중 임의의 하나 및/또는 상기 언급된 항체 약물 접합체 중 임의의 하나를 투여함으로써 암을 치료하기 위해, 유효량의 상기 언급된 화합물 중 임의의 하나 및/또는 상기 언급된 항체 약물 접합체 중 임의의 하나를 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 다른 부르크홀데리아(Burkholderia) 종에 대한 FERM BP-3421의 거의 완전한 16S rRNA 서열을 사용하여 결정된 계통발생학적 관계의 개략적 표현이다.
도 2는 스플라이세오스타틴을 위한 생합성 유전자 클러스터, 및 시토크롬 P450 Fr9R 및 Fe(II)/α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 Fr9P에 의해 촉매된 히드록실화 단계를 강조하는 제안된 생합성 경로이다.
도 3은 ADC 3, 4 및 5에 대한 이종이식편 데이터를 나타내는 그래프이다.
도 4는 ADC 14 및 18에 대한 이종이식편 데이터를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 세포독성 스플라이세오스타틴 유사체를 비롯한 세포독성 천연 생성물, 세포독성 스플라이세오스타틴 유사체를 비롯한 상기 세포독성 천연 생성물을 포함하는 항체 약물 접합체, 및 암 및 다른 병리학적 상태를 치료하기 위해 그를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 세포 또는 연관된 병리학적 상태의 시험관내, 계내 및 생체내 검출, 진단 또는 치료를 위해 이러한 화합물 및/또는 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
정의 및 약어
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 하기 용어 및 어구는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다. 본원에서 상표명이 사용되는 경우에, 문맥에 의해 달리 나타내지 않는 한, 상표명은 제품 제제, 제네릭 약물, 및 상표명 제품의 활성 제약 성분(들)을 포함한다.
본원에서 용어 "항체" (또는 "Ab" 또는 "AB")는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포괄한다. 무손상 항체는 주로 2개의 영역: 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 가변 영역은 표적 항원에 결합하여 그와 상호작용한다. 가변 영역은 특정한 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하여 그에 결합하는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 불변 영역은 면역계에 의해 인식되어 그와 상호작용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York] 참조). 항체는 임의의 유형 또는 부류 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 또는 하위부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다. 항체는 임의의 적합한 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 또는 뮤린 기원의 것이다. 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
용어 "특이적으로 결합한다" 및 "특이적 결합"은 소정의 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 항체는 적어도 약 1x107 M-1의 친화도로 결합하며, 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원 (예를 들어, BSA, 카세인)에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2배 더 높은 친화도로 소정의 항원에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구한다는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "모노클로날 항체"는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 쇄(들)의 나머지가 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다.
"무손상 항체"는 항원-결합 가변 영역 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2, CH3 및 CH4를 항체 부류에 적절하게 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
무손상 항체는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있으며, 이는 항체의 Fc 영역 (예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 보체 의존성 세포독성, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존성 세포-매개 식세포작용을 포함한다.
"항체 단편"은, 바람직하게는 그의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, scFv, scFv-Fc, 항체 단편(들)으로부터 형성된 다중특이적 항체 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편(들), 또는 표적 항원 (예를 들어, 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원)에 면역특이적으로 결합하는 상기 항체 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다.
항체와 관련하여 용어 "가변"은, 서열에서 광범위하게 상이하며 각각의 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용되는 항체의 가변 도메인의 특정 부분을 지칭한다. 상기 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 내의 "초가변 영역"으로 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다.
본원에 사용되는 경우에 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서는 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서는 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서는 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서는 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917])를 포함한다. FR 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 전형적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하며, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (VL)에 연결된 가변 중쇄 도메인 (VH)을 포함한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 디아바디는, 예를 들어 EP 0 404 097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대다수의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 임의로, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596]을 참조한다.
본원에 사용된 "단리된"은 (a) 천연 공급원, 예컨대 식물 또는 동물 세포 또는 세포 배양물, 또는 (b) 합성 유기 화학 반응 혼합물의 다른 성분으로부터 분리된 것을 의미한다. 본원에 사용된 "정제된"은 단리된 경우에 단리물이 단리물의 중량을 기준으로 하여 적어도 95%, 또 다른 측면에서 적어도 98%의 화합물 (예를 들어, 접합체)을 함유하는 것을 의미한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정 시 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"아폽토시스를 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 세포질 세망의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성에 의한 결정 시 프로그램화된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 세포는 종양 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 다양한 방법을 이용하여 아폽토시스와 연관된 세포 사건을 평가할 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 DNA 래더링을 통해 평가할 수 있으며; DNA 단편화와 함께 일어나는 핵/염색질 축합은 저이배체 세포의 임의의 증가에 의해 평가할 수 있다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 치료 유효량의 약물은 암 세포의 개수를 감소시키고/거나; 종양 크기를 감소시키고/거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제 (즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게는 정지)시키고/거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게는 정지)시키고/거나; 종양 성장을 어느 정도 억제하고/거나; 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 약물은, 기존 암 세포의 성장을 억제하고/거나 이를 사멸시킬 수 있는 정도까지 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우에, 효능은 예를 들어 질환 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하고/거나 반응률 (RR)을 결정함으로써 측정될 수 있다.
용어 "상당량"은 혼합물 또는 샘플의 대부분, 즉 집단의 50% 초과를 지칭한다.
용어 "세포내 대사물"은 항체-약물 접합체 (ADC)에 대한 세포 내부의 대사 과정 또는 반응으로부터 생성되는 화합물을 지칭한다. 대사 과정 또는 반응은 ADC의 펩티드 링커의 단백질분해적 절단과 같은 효소적 과정일 수 있다. 세포내 대사물은 세포 내로의 진입, 확산, 흡수 또는 수송 후에 세포내 절단을 겪는 항체 및 유리 약물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "세포내에서 절단된" 및 "세포내 절단"은 세포 내부에서 공유 부착, 예를 들어 약물 모이어티와 항체 사이의 링커가 절단되어 항체로부터 해리된 유리 약물 또는 접합체의 다른 대사물을 생성하는, ADC 등에 대한 세포 내부에서의 대사 과정 또는 반응을 지칭한다. 따라서, ADC의 절단된 모이어티는 세포내 대사물이다.
용어 "생체이용률"은 환자에게 투여되는 주어진 양의 약물의 전신 이용률 (즉, 혈액/혈장 수준)을 지칭한다. 생체이용률은 투여된 투여 형태로부터 전신 순환계에 도달하는 약물의 시간 (속도) 및 총량 (정도) 둘 다의 측정치를 나타내는 절대적인 용어이다.
용어 "세포독성 활성"은 ADC 또는 상기 ADC의 세포내 대사물의 세포-사멸, 세포증식억제 또는 항증식 효과를 지칭한다. 세포독성 활성은 절반의 세포가 생존하는 단위 부피당 농도 (몰 또는 질량)인 IC50 값으로서 표현될 수 있다.
"장애"는 약물 또는 항체-약물 접합체를 사용한 치료로부터 이익을 얻는 임의의 상태이다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환, 예컨대 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 상태를 포함한다. 본원에서 치료할 장애의 비제한적 예는 양성 및 악성 암; 백혈병 및 림프성 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선상, 대식세포, 상피, 기질 및 포배강 장애; 및 염증성, 혈관신생 및 면역 장애를 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 상태 또는 장애를 지칭하거나 또는 기재한다. "종양"은 1개 이상의 암성 세포를 포함한다.
"환자"의 예는 인간, 래트, 마우스, 기니 피그, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 조류 및 가금류를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적 실시양태에서, 환자는 인간이다.
문맥에 의해 달리 나타내지 않는 한, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치유적 치료 및 재발을 방지하기 위한 예방적 조치를 지칭하며, 그 목적은 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 발병 또는 확산을 억제하거나 또는 둔화시키는 (줄이는) 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 또는 목적하는 임상 결과는 검출가능하든 검출불가능하든 증상의 완화, 질환 정도의 약화, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 (부분적이든 전체적이든)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료받지 못한 경우에 예상되는 생존에 비해 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들은 이미 상태 또는 장애를 앓고 있는 자들 뿐만 아니라 상태 또는 장애에 걸리기 쉬운 자들을 포함한다.
암과 관련하여, 용어 "치료하는"은 종양 세포, 암 세포 또는 종양의 성장을 억제하는 것; 종양 세포 또는 암 세포의 복제를 억제하는 것, 전반적 종양 부담의 감소 또는 암성 세포의 수를 감소시키는 것, 및 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 개선하는 것 중 임의의 것 또는 모두를 포함한다.
자가면역 질환과 관련하여, 용어 "치료하는"은 자가면역 항체를 생산하는 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 자가면역 질환 상태와 연관된 세포의 복제를 억제하는 것, 자가면역-항체 부담을 감소시키는 것 및 자가면역 질환의 하나 이상의 증상을 개선하는 것 중 임의의 것 또는 모두를 포함한다.
감염성 질환과 관련하여, 용어 "치료하는"은 감염성 질환을 유발하는 병원체의 성장, 증식 또는 복제를 억제하는 것 및 감염성 질환의 하나 이상의 증상을 개선하는 것 중 임의의 것 또는 모두를 포함한다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 사용과 관련된 적응증(들), 용법, 투여량, 투여, 금기사항, 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 이러한 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 호환가능하게 사용되며, 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 배양물, 또는 전달 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 고의적인 또는 우연한 돌연변이로 인해, DNA 내용 면에서 모든 자손이 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 또한 이해된다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 구별되는 명칭이 의도되는 경우에, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 용어 "알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 지정된 개수의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 탄화수소를 지칭한다 (예를 들어, "C1-C8" 알킬은 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 지칭함). 탄소 원자의 개수가 지정되지 않은 경우에, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 대표적인 직쇄 C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 분지형 C1-C8 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸 및 -2-메틸부틸을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 불포화 C2-C8 알킬은 비닐, 알릴, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐 및 3-메틸-1-부티닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
달리 나타내지 않는 한, "알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 모 알칸의 동일하거나 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터의 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는, 명시된 개수의 탄소 원자, 전형적으로 1-18개의 탄소 원자의 포화, 분지쇄 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알킬렌 라디칼은 메틸렌 (-CH2-), 1,2-에틸렌 (-CH2CH2-), 1,3-프로필렌 (-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸렌 (-CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "C1-C10" 직쇄 알킬렌은 화학식 -(CH2)1-10-의 직쇄, 포화 탄화수소 기이다. C1-C10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데칼렌을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 알킬렌은 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 및 1 내지 6개의 탄소를 갖는다.
달리 나타내지 않는 한, 용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어와 조합되어, 달리 언급되지 않는 한 명시된 개수의 탄소 원자, 및 O, N, Si, S 및/또는 P (여기서, 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있음)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자로 구성된, 완전 포화 또는 1 내지 3의 불포화도를 함유하는 안정한 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 또는 그의 조합을 지칭한다. 헤테로원자(들) O, N 및 S는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 위치될 수 있다. 헤테로원자 Si는 알킬 기가 분자의 나머지에 부착되어 있는 위치를 비롯하여, 헤테로알킬 기의 임의의 위치에 위치될 수 있다. 2개 이하의 헤테로원자는 연속적일 수 있다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.
"할로(C1-6-알킬)"은 1 내지 3개 또는 1 내지 2개의 할로 기로 치환된 C1-6-알킬 기를 지칭하며, 여기서 C1-6-알킬 및 할로는 본원에 정의된 바와 같다. 상기 용어는, 예를 들어 CF3을 포함한다.
용어 "에폭시", 또는 "에폭시 기" 또는 "에폭시 잔기"는 통상의 기술자에게 하기와 같은 단일 결합에 의해 연결된 탄소 원자 및 산소 원자를 포함하는 3원 고리를 지칭하는 것으로 공지되어 있다.
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따라서, 용어 "에폭시드"는 본원에 이전에 정의된 바와 같은 적어도 1개의 에폭시 기를 포함하는 화합물을 지칭한다.
달리 나타내지 않는 한, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 일부로서, 헤테로알킬 (상기 논의된 바와 같음)로부터 유도된 2가 기를 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우에, 헤테로원자는 또한 쇄 말단 중 하나 또는 둘 다를 점유할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, "아릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터의 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된, 6 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 14개의 탄소 원자의 치환된 또는 비치환된 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 전형적인 아릴 기는 벤젠, 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치환된 방향족 기 (예를 들어, 아릴 기)는 하기 기: C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, 할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN 중 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 5개로 치환될 수 있고; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴, 바람직하게는 비치환된 아릴로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 치환된 방향족 기는 -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' 및 -SR' 중 1개 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은, 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자를 가지며 적어도 1개의 탄소 원자를 함유하는 5 내지 14개의 구성원, 예컨대 5 내지 6개의 구성원의 방향족 헤테로사이클 고리를 지칭한다. 헤테로아릴은 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 고리계일 수 있다. 대표적인 헤테로아릴은 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사디아졸릴, 피리딜, 푸릴, 벤조푸라닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 퀴놀리닐, 피롤릴, 인돌릴, 옥사졸릴, 벤족사졸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 이속사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 피리미딜, 아제피닐, 옥세피닐 및 퀴녹살리닐이다. 헤테로아릴은 임의로 치환된다. 전형적인 치환기는 -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3 2-, PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2 -, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, C1-C20 헤테로알킬, C6-C20 아릴, C3-C8 헤테로시클릴, 보호기 또는 전구약물 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: -F, -Cl, -Br 또는 -I이고; 각각의 R은 독립적으로 -H 또는 C1-C6 알킬이다.
용어 "아릴렌", "헤테로아릴렌"은 각각 "아릴" 및 "헤테로아릴"의 2가 버전, 및 "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하는 다른 용어를 지칭한다.
"히드록시"는 기 -OH를 지칭한다.
"치환된 알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환기로 대체된 알킬을 의미한다. 전형적인 치환기는 -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3 2-, PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2 -, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, C1-C20 헤테로알킬, C6-C20 아릴, C3-C8 헤테로시클릴, 보호기 또는 전구약물 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: -F, -Cl, -Br 또는 -I이고; 각각의 R은 독립적으로 -H 또는 C1-C6 알킬이다. 할로겐으로 치환된 치환된 알킬은 때때로 본원에서 할로알킬로서 지칭된다. 아릴, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 및 본원에 기재된 바와 같은 알킬 또는 알킬렌 모이어티를 함유하거나 또는 함유하지 않는 다른 기는 또한 유사하게는 치환될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, "아르알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 상기 정의된 바와 같은 아릴 기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 의미한다.
달리 나타내지 않는 한, "C3-C8헤테로시클릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 3 내지 8개의 탄소 원자 (고리원으로도 지칭됨), 및 N, O, P 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 고리원을 가지며, 모 고리계의 고리 원자로부터의 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 1가 또는 2가의 치환된 또는 비치환된 방향족 또는 비-방향족 모노시클릭 또는 비시클릭 고리계를 지칭한다. 유사하게는, 달리 나타내지 않는 한, "C3-C10헤테로시클릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 3 내지 10개의 탄소 원자 (고리원으로도 지칭됨) 및 N, O, P 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자 고리원을 가지며, 모 고리계의 고리 원자로부터의 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 1가 또는 2가 치환된 또는 비치환된 방향족 또는 비-방향족 모노시클릭 또는 비시클릭 고리계를 지칭한다. 헤테로시클릴에서 1개 이상의 N, C 또는 S 원자는 산화될 수 있다. 헤테로원자를 포함하는 고리는 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 10개 초과의 탄소를 갖는 헤테로시클릴 기, 예를 들어 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 탄소를 갖는 고리 또는 고리계는 또한 용어 "헤테로시클릴"이 탄소의 특정한 수에 대한 언급 없이 사용되는 경우에 C3-C10헤테로시클릴과 함께 가능하고 포괄된다. 유사하게는, 3개 미만의 탄소를 갖는 헤테로시클릴 기, 예를 들어 1 또는 2개를 갖는 고리는 용어 "헤테로시클릴"이 탄소의 특정한 수에 대한 언급 없이 사용되는 경우에 가능하고 포괄된다. 용어 "헤테로시클로알킬"은 모든 탄소 원자가 포화 (즉, 이중 또는 삼중 결합 없이 하기 나타낸 바와 같이 수소 또는 또 다른 치환기에 결합됨)된 비-방향족 헤테로시클릴 고리 또는 고리계를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 헤테로시클로알킬 기는 전형적으로 3 내지 5개의 구성원 및 1 내지 2개의 헤테로원자를 갖는다. 특정 실시양태에서, 헤테로시클로알킬은 에폭시일 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 헤테로시클릴은 안정한 구조를 생성하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 그의 펜던트 기에 부착된다. C3-C8 헤테로시클릴의 대표적인 예는 테트라히드로푸라닐, 옥세타닐, 피라닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 피롤릴, 티오페닐 (티오펜), 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. C3-C8 헤테로시클릴 또는 C3-C10 헤테로시클릴은 C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬, -OR', 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(O)R', 할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 7개 이하의 기로 치환될 수 있으며, 여기서 각각의 R'는 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 치환된 헤테로시클릴은 또한 -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' 및 -SR' 중 1개 이상을 포함할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, "헤테로아르알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 상기 정의된 바와 같은 방향족 헤테로시클릴 기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 의미한다.
달리 나타내지 않는 한, "C3-C8 카르보시클릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 모 고리계의 고리 원자로부터의 1개의 수소 원자 또는 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 1가 또는 2가의 치환된 또는 비치환된 포화 또는 불포화 비-방향족 모노시클릭 또는 비시클릭 카르보시클릭 고리이다. 유사하게는, 달리 나타내지 않는 한, "C3-C10 카르보시클릴"은 그 자체로 또는 또 다른 용어의 일부로서, 모 고리계의 고리 원자로부터의 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-원 1가 또는 2가의 치환된 또는 비치환된 포화 또는 불포화 비-방향족 모노시클릭 또는 비시클릭 카르보시클릭 고리이다. 대표적인 C3-C8 카르보시클릴은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜타디에닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 1,3-시클로헥사디에닐, 1,4-시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 1,3-시클로헵타디에닐, 1,3,5-시클로헵타트리에닐, 시클로옥틸, 시클로옥타디에닐, 비시클로(111)펜탄, 및 비시클로(222)옥탄을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. C3-C8 카르보시클릴 기 또는 C3-C10 카르보시클릴 기는 비치환되거나 또는 C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬, -OR', 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(=O)2R', -S(=O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 7개 이하의 기로 치환될 수 있으며, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택된다. 10개 초과의 탄소를 갖는 카르보시클릴 기, 예를 들어 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 탄소를 갖는 고리계는 또한 용어 "카르보시클릴"이 탄소의 특정한 수에 대한 언급 없이 사용되는 경우에 C3-C10 카르보시클릴과 함께 가능하고 포괄된다. 용어 "시클로알킬"은 모든 탄소 원자가 포화 (즉, 이중 또는 삼중 결합 없이 하기 나타낸 바와 같이 수소 또는 또 다른 치환기에 결합됨)된 카르보시클릴 고리 또는 고리계를 지칭한다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너와 비-중첩가능한 특성을 갖는 분자를 지칭하고, 용어 "비키랄"은 그의 거울상 파트너 상에 중첩가능한 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성질체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만 공간 내 원자 또는 기의 배열이 상이한 화합물을 지칭한다.
"부분입체이성질체"는 2개 이상의 키랄성 중심을 가지며 분자들이 서로의 거울상이 아닌 입체이성질체를 지칭한다. 부분입체이성질체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어 융점, 비점, 스펙트럼 특성 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고해상도 분석 절차 하에 분리될 수 있다.
본원에 사용된 입체화학적 정의 및 규정은 일반적으로 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, McGraw-Hill Book Company, New York (1984); 및 Eliel and Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)]에 따른다. 다수의 유기 화합물은 광학 활성 형태로 존재하고, 즉 이들은 평면-편광의 평면을 회전시키는 능력을 갖는다. 광학 활성 화합물을 기재하는데 있어서, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S는 키랄 중심(들)에 대한 분자의 절대 배위를 나타내는데 사용된다. 접두어 d 및 l, 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-편광 회전의 부호를 나타내는데 사용되며, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. (+) 또는 d의 접두어가 사용되는 화합물은 우선성이다. 주어진 화학 구조에 대해, 이들 입체이성질체는 이들이 서로 거울상인 것을 제외하고는 동일하다. 특정한 입체이성질체가 또한 거울상이성질체로 지칭될 수 있으며, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상이성질체 혼합물이라 불린다. 거울상이성질체들의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로 지칭되며, 이는 화학 반응 또는 과정에서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우에 생성될 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 2종의 거울상이성질체 종의 등몰 혼합물을 지칭한다.
아미노산 "유도체"는 모 아미노산의 공유 부착에 의한, 예컨대 예를 들어 알킬화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등에 의한 치환 또는 변형을 갖는 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 치환된 연결 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 갖는 아미노산의 하나 이상의 유사체가 "유도체"의 정의 내에 추가로 포함된다.
문맥에 의해 달리 나타내지 않는 한, "천연 아미노산"은 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 글리신, 알라닌, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 염"은 화합물의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 화합물은 전형적으로 적어도 1개의 아미노 기를 함유하며, 따라서 상기 아미노 기와의 산 부가염이 형성될 수 있다. 예시적인 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온의 내포를 동반할 수 있다. 반대이온은 모 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 게다가, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다중 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우에는 다중 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 1개 이상의 하전된 원자 및/또는 1개 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
용어 "로딩" 또는 "약물 로딩" 또는 "페이로드 로딩"은 ADC 분자 내 항체당 페이로드 ("페이로드" 및 "페이로드들"은 본원에서 "약물" 및 "약물들"과 호환가능하게 사용됨)의 평균 개수를 나타내거나 또는 지칭한다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개 약물의 범위일 수 있다. 이는 때로는 DAR, 또는 약물 대 항체 비로 지칭된다. 본원에 기재된 ADC의 조성물은 전형적으로 1-20, 특정 실시양태에서는 1-8, 2-8, 2-6, 2-5 및 2-4의 DAR을 갖는다. 전형적인 DAR 값은 2, 4, 6 및 8이다. 항체당 약물의 평균 개수 또는 DAR 값은 통상의 수단, 예컨대 UV/가시 분광분석법, 질량 분광측정법, ELISA 검정 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다. 정량적 DAR 값이 또한 결정될 수 있다. 일부 경우에, 특정한 DAR 값을 갖는 동종 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다. DAR은 항체 상의 부착 부위의 개수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 부착이 시스테인 티올인 경우에, 항체는 단지 1개 또는 수 개의 시스테인 티올 기를 가질 수 있거나, 또는 그를 통해 링커 단위가 부착될 수 있는 단지 1개 또는 수 개의 충분히 반응성인 티올 기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인 티올은 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기의 티올 기이다. 일부 실시양태에서, 시스테인 티올은 쇄간 디술피드 결합을 형성하지 않는 시스테인 잔기의 티올 기이다. 전형적으로, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는, 예를 들어 링커 또는 링커 중간체와 반응하지 않는 다수의 리신 잔기를 함유할 수 있다. 단지 가장 반응성인 리신 기만이 반응성 링커 시약과 반응할 수 있다.
일반적으로 항체는, 존재한다면, 링커를 통해 약물에 연결될 수 있는 유리 및 반응성 시스테인 티올 기를 다수 함유하지는 않는다. 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디술피드 가교로서 존재하며, 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 환원제로 환원되어야 한다. 항체는 반응성 친핵성 기, 예컨대 리신 또는 시스테인을 밝혀내기 위해 변성 조건에 적용될 수 있다. ADC의 로딩 (약물/항체 비)은 (i) 항체에 비해 몰 과량의 약물-링커를 제한하는 것, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한하는 것, 및 (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적 환원 조건을 비롯한 여러 다양한 방식으로 제어될 수 있다. 1개 초과의 친핵성 기가 약물-링커와 반응하는 경우에, 수득되는 생성물은 항체당 1개 이상의 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC의 혼합물이다. 항체당 약물의 평균 개수는, 예를 들어 항체에 대해 특이적이고 약물에 대해 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개별 ADC는 질량 분광분석법에 의해 혼합물 중에서 확인될 수 있고, HPLC, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.
하기는 본원에서 달리 정의 또는 기재되지 않을 수 있는 약어 및 정의의 목록이다: DMSO (디메틸 술폭시드를 지칭함), HRMS (고해상도 질량 분광측정법을 지칭함), DAD (다이오드 어레이 검출을 지칭함), TFA (2,2,2-트리플루오로아세트산 또는 트리플루오로아세트산을 지칭함), TFF (접선 흐름 여과를 지칭함), EtOH (에탄올을 지칭함), MW (분자량을 지칭함), HPLC (고성능 액체 크로마토그래피를 지칭함), 정제용 HPLC (정제용 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭함), etc. (기타 등등을 지칭함), 트리틸 (1,1',1"-에탄-1,1,1-트리일트리벤젠을 지칭함), THF (테트라히드로푸란을 지칭함), NHS (1-히드록시-2,5-피롤리딘디온을 지칭함), Cbz (카르복시벤질을 지칭함), eq. (당량을 지칭함), n-BuLi (n-부틸리튬을 지칭함), OAc (아세테이트를 지칭함), MeOH (메탄올을 지칭함), i-Pr (이소프로필 또는 프로판-2-일을 지칭함), NMM (4-메틸모르폴린을 지칭함), 및 "-" (표에서 이 시점에 이용가능한 데이터가 없음을 지칭함).
본원에 사용된 "H/C"는, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 그의 시스테인 잔기 중 하나를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 트라스투주맙 (상표명 헤르셉틴®)을 지칭한다.
본원에 사용된 "H/K"는, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 그의 리신 잔기 중 하나를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 트라스투주맙을 지칭한다.
본원 전체에 사용된 아미노산 잔기 넘버링 (예를 들어: 위치 114에서의 알라닌)은 카바트(Kabat) 방법의 EU 인덱스를 기초로 한다.
본원에 사용된 "H/TG1-(Q)"는, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 항체 내에 포매된 트랜스글루타미나제 펩티드 (TG1) 기질 태그 내에 있는 그의 천연 또는 조작된 글루타민 잔기 중 하나를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-A114C/C114"는, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 114에서의 알라닌이 치환된 그의 조작된 시스테인 중 하나를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-K392C+L443C/C392+C443"은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 392에서의 리신 및 중쇄의 위치 443에서의 류신이 치환된 그의 조작된 시스테인 잔기 중 하나 또는 둘 다를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-E388C+N421C/C388+C421"은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 388에서의 글루탐산 및 위치 421에서의 아스파라긴이 치환된 그의 조작된 시스테인 잔기 중 하나 또는 둘 다를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-Q347C+K392C/C347+C392"는, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 347에서의 글루타민 및 위치 392에서의 리신이 치환된 그의 조작된 시스테인 잔기 중 하나 또는 둘 다를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-L443C+kK183C/C443+kC183"은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 443에서의 류신 및 경 (카파) 쇄의 위치 183에서의 리신이 치환된 그의 조작된 시스테인 중 하나 또는 둘 다를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-Q347C+L443C/C347+C443"은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 347에서의 글루타민 및 위치 443에서의 류신이 치환된 그의 조작된 시스테인 중 하나 또는 둘 다를 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-kK183C/kC183"은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 경 (카파) 쇄의 위치 183에서의 리신이 치환된 그의 조작된 시스테인을 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
본원에 사용된 "H-N421C/C421"은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 421에서의 아스파라긴이 치환된 그의 조작된 시스테인을 통해 (링커 또는 본 발명의 화합물에) 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다.
일반적으로, 본원에 사용된 "H-(AA1)###(AA2)/(AA2)###" (여기서, (AA1) 및 (AA2)는 제1 및 제2 아미노산임)은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 ###에서의 (AA1)에서 치환된 그의 조작된 (AA2) (여기서, ###은 관련 아미노산(들)의 위치를 나타냄)를 통해 본 발명의 화합물에 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다. "k" 또는 "카파"를 지칭하는 유사한 표기는 경쇄 상의 치환을 타나낼 것이다.
유사하게는, 본원에 사용된 "H-(AA1)###(AA2)+(AA3)####(AA4)/(AA2)###+(AA4)####" (여기서, (AA1), (AA2), (AA3) 및 (AA4)는 제1, 제2, 제3 및 제4 아미노산임)은, HER2/neu 수용체를 방해하는 모노클로날 항체이며 중쇄의 위치 ###에서의 (AA1)에서 치환된 그의 조작된 (AA2) (여기서 ###은 관련 아미노산(들)의 위치를 나타냄)를 통해 본 발명의 화합물에 결합되어 있고 또한 중쇄의 위치 ####에서의 (AA3)에서 치환된 그의 조작된 (AA4) (여기서, ####은 관련 아미노산(들)의 위치를 나타냄)를 통해 본 발명의 화합물에 결합되어 있는 조작된 트라스투주맙을 지칭한다. "k" 또는 "카파"를 지칭하는 유사한 표기는 경쇄 상의 치환을 타나낼 것이다.
본원에 사용된 "-PABC-" 또는 "PABC"는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭한다.
Figure 112015053331353-pct00033
본원에 사용된 "-PABA-" 또는 "PABA"는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭한다.
Figure 112015053331353-pct00034
화합물 및 그의 항체 약물 접합체
한 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00035
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 독립적으로 수소, -C1- 6알킬, -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
R13은 수소, C1- 6알킬, C3- 8카르보시클릴, C3- 8헤테로시클릴, C1- 6알킬-C6- 14아릴, C1- 6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, -(C(R)2)m-O-NRR 및 -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 II의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 II>
L-P
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P에 결합되고;
P는 하기 화학식 I의 라디칼이고:
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00036
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 -(C(R)2)m-C(O)- 또는 -(C(R)2)m-이고;
L1은 -할로겐, -NR2,
Figure 112015053331353-pct00037
,
Figure 112015053331353-pct00038
,
Figure 112015053331353-pct00039
,
Figure 112015053331353-pct00040
,
Figure 112015053331353-pct00041
및
Figure 112015053331353-pct00042
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00043
,
Figure 112015053331353-pct00044
및
Figure 112015053331353-pct00045
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13은 수소, C1- 6알킬, C3- 8카르보시클릴, C3- 8헤테로시클릴, C1- 6알킬-C6- 14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 II'의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 II'>
L-P'
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P'에 결합되고;
P'는 하기 화학식 I'의 라디칼이고:
<화학식 I'>
Figure 112015053331353-pct00046
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -(C(R)2)m-, -OR", -OCOR13 ', -OC(O)NRR14 ', -OCON(R)N(R)- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 독립적으로 수소, -C1- 6알킬, -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
L1은 -할로겐, -NR2,
Figure 112015053331353-pct00047
,
Figure 112015053331353-pct00048
,
Figure 112015053331353-pct00049
,
Figure 112015053331353-pct00050
,
Figure 112015053331353-pct00051
및
Figure 112015053331353-pct00052
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00053
,
Figure 112015053331353-pct00054
및
Figure 112015053331353-pct00055
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13'는 결합, -C1- 6알킬렌-, -C3- 8카르보시클릴-, -C3- 8헤테로시클릴-, -C1- 6알킬-C6-14아릴-, -C1- 6알킬-C5- 14헤테로아릴-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R14'는 독립적으로 결합, -NR-, -C3- 10카르보시클릴-, -C3- 10헤테로시클릴-, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR', -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NR- 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 R14'는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -NRR 또는 -SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택되고;
각각의 R"는 독립적으로 결합 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 III의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 III>
(AB)-(L-P)b
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P에 결합되고;
P는 하기 화학식 I의 라디칼이고:
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00056
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
AB는 항체이고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 -(C(R)2)m-C(O)- 또는 -(C(R)2)m-이고;
L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00057
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00058
,
Figure 112015053331353-pct00059
및
Figure 112015053331353-pct00060
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13은 수소, C1- 6알킬, C3- 8카르보시클릴, C3- 8헤테로시클릴, C1- 6알킬-C6- 14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
b는 1-20이고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 III'의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.
<화학식 III'>
(AB)-(L-P')b
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P'에 결합되고;
P'는 하기 화학식 I'의 라디칼이고:
<화학식 I'>
Figure 112015053331353-pct00061
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
AB는 항체이고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -(C(R)2)m-C(O)-, -(C(R)2)m-, -OR", -OCOR13 ', -OCONRR14 ', -OCON(R14)N(R15)- 및 -NR14-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 독립적으로 수소, -C1- 6알킬, -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00062
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00063
,
Figure 112015053331353-pct00064
및
Figure 112015053331353-pct00065
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13'는 결합, -C1- 6알킬렌-, -C3- 8카르보시클릴-, -C3- 8헤테로시클릴-, -C1- 6알킬-C6-14아릴-, -C1- 6알킬-C5- 14헤테로아릴-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R14'는 독립적으로 결합, -NR-, -C3- 10카르보시클릴-, -C3- 10헤테로시클릴-, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR', -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NR- 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 R14'는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -NRR 또는 -SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택되고;
각각의 R"는 독립적으로 결합 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
b는 1-20이고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
상기 언급된 2가 가변기는, 적절한 경우에, 이러한 라디칼이 분자 내에서 다중 배향으로 위치되는 것을 도시하는 것으로 의도되는 것이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 그러나 하나의 예를 언급하자면, L1과 L3 사이의 L2 모이어티 "-PABC-Cit-Val-C(O)-C1-6알킬-"은 L1-PABC-Cit-Val-C(O)-C1- 6알킬-L3 또는 L1-C1- 6알킬-C(O)-Val-Cit-PABC-L3으로서 위치될 수 있다. 유사하게는, L2는 본원에서 구조가 마찬가지로 다중 배향으로 위치될 수 있는 L2A-L2B-L2C를 포함하는 것으로 정의된다.
따라서, 특정 실시양태에서, 하기 순서의 성분들을 갖는 화학식 III 또는 III'의 ADC가 제공된다:
AB-L1-L2-L3-P;
AB-L1-L2-L3-P';
AB-L1-L2A-L2B-L2C-L3-P; 또는
AB-L1-L2C-L2B-L2A-L3-P.
본원에 기재된 특정 화학적 기 및 모이어티가 상황에 따라 바람직하다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 예컨대 본원에 기재되고 청구된 다양한 페이로드, 링커-페이로드 및 ADC에 관련하여, 하기 중 1개 이상 (또는 모두, 또는 없음)이 적용될 수 있다:
본 발명의 특정 실시양태에서, X1은 바람직하게는 -O-이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, X2는 바람직하게는 -NR-이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R1은 바람직하게는 -OR, -OCOR13, -OCONR14R15 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R2는 바람직하게는 C1- 6알킬이고, 보다 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R3은 바람직하게는 C1- 6알킬이고, 보다 바람직하게는 메틸이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R4는 바람직하게는 수소 또는 -OR이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R5는 바람직하게는 수소 또는 -OR이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R6 및 R7은 서로 독립적으로 히드록실; 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R8은 바람직하게는 수소 또는 -OR이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R9는 독립적으로 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15 및 -(C(R)2)m-N(R)COR13으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R13은 바람직하게는 수소, C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고; 여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, -(C(R)2)m-O-NRR 및 -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, m은 0인 것이 바람직하다. 본 발명의 특정 실시양태에서, m은 1인 것이 바람직하다. 본 발명의 특정 실시양태에서, m은 2인 것이 바람직하다. 본 발명의 특정 실시양태에서, m은 3인 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, X2는 -NH-이고, X1은 -O-이고, R1은 -OCOR13, OH 또는 -OCONR14R15이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 함께 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13은 C1-6 알킬 (보다 바람직하게는 메틸)이고, R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
L1은
Figure 112015053331353-pct00066
또는
Figure 112015053331353-pct00067
이고, L2A, L2B, L2C 및 L3은 모두 부재하는 것이 바람직하다. 대안적으로 R6은 -OH이고, R7은 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬이고, 여기서 염소가 보다 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, X2는 -NH-이고, X1은 -O-이고, R1은 -OCOR13, OH 또는 -OCONR14R15이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 함께 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13은 C1-6 알킬 (보다 바람직하게는 메틸)이고, R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1은 할로겐이고, L3은 -NR-C1- 6알킬-NR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, 알킬 기는 보다 바람직하게는 에틸이고, L2A는 -C(O)-C1- 6알킬-이고, L2B 및 L2C는 부재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, X2는 -NH-이고, X1은 -O-이고, R1은 -OCOR13이고, 여기서 R13은 보다 바람직하게는 수소이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 함께 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13은 C1-6 알킬 (보다 바람직하게는 메틸)이고, R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1은 할로겐이고, L3은 -NR-C1- 6알킬-NR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, 알킬 기는 보다 바람직하게는 에틸이고, L2A는 -C(O)-C1- 6알킬-이고, L2B 및 L2C는 부재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R1은 -OCOR13 또는 -OR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3은 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R은 보다 바람직하게는 수소 또는 메틸이거나 또는 2개의 R 치환기는 함께 6 원 고리를 형성하고, L1은 할로겐, -NR2 또는
Figure 112015053331353-pct00068
이고, L2C는 PABC이고, L2B는 -Cit-Val-이고, L2A는 -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1-6알킬-인 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R1은 -OCOR13 또는 -OR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3은 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R은 보다 바람직하게는 수소 또는 메틸이거나 또는 2개의 R 치환기는 함께 6 원 고리를 형성하고, L1은 할로겐, -NR2 또는
Figure 112015053331353-pct00069
이고, L2C는 부재하고; L2B는 -Ala-Val-이고, L2A는 -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1-6알킬- 또는 -C(O)C1- 6알킬-인 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, L1은 -할로겐, -NR2,
Figure 112015053331353-pct00070
,
Figure 112015053331353-pct00071
,
Figure 112015053331353-pct00072
및
Figure 112015053331353-pct00073
로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R1은 -OCOR13 '이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)NR14R15이고, 여기서 R14 및 R15는 보다 바람직하게는 수소이고, R13'는 결합이고, L3은
Figure 112015053331353-pct00074
이고, 여기서 m은 0이고, X'는 N이고, X"는 -N-이고, X"'는 부재하고, L1은 할로겐이고, L2C는 PABC이고, L2B는 -Cit-Val-이고, L2A는 -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-인 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, X2는 -NH-이고, X1은 -O-이고, R1은 -OCOR13, OH 또는 -OCONR14R15이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 함께 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13은 C1-6 알킬 (보다 바람직하게는 메틸)이고, R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00075
로부터 선택되고,
L2A, L2B, L2C 및 L3은 모두 부재하는 것이 바람직하다. 대안적으로 R6은 -OH이고, R7은 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬이고, 여기서 염소가 보다 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, X2는 -NH-이고, X1은 -O-이고, R1은 -OCOR13, OH 또는 -OCONR14R15이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 함께 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13은 C1-6 알킬 (보다 바람직하게는 메틸)이고, R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00076
로부터 선택되고, L3은 -NR-C1- 6알킬-NR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, 알킬 기는 보다 바람직하게는 에틸이고, L2A는 -C(O)-C1-6알킬-이고, L2B 및 L2C는 부재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, X2는 -NH-이고, X1은 -O-이고, R1은 -OCOR13이고, 여기서 R13은 보다 바람직하게는 수소이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 함께 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13은 C1-6 알킬 (보다 바람직하게는 메틸)이고, R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00077
로부터 선택되고, L3은 -NR-C1- 6알킬-NR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, 알킬 기는 보다 바람직하게는 에틸이고, L2A는 -C(O)-C1- 6알킬-이고, L2B 및 L2C는 부재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R1은 -OCOR13 또는 -OR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3은 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R은 보다 바람직하게는 수소 또는 메틸이거나 또는 2개의 R 치환기는 함께 6 원 고리를 형성하고, L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00078
로부터 선택되고, L2C는 PABC이고, L2B는 -Cit-Val-이고, L2A는 -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-인 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, R1은 -OCOR13 또는 -OR이고, 여기서 R은 보다 바람직하게는 수소이고, R2는 메틸이고, R3은 메틸이고, R4는 -OH이고, R5는 수소이고, R8은 수소이고, R6 및 R7은 에폭시드를 형성하고, R9는 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3은 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R은 보다 바람직하게는 수소 또는 메틸이거나 또는 2개의 R 치환기는 함께 6 원 고리를 형성하고, L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00079
로부터 선택되고, L2C는 부재하고; L2B는 -Ala-Val-이고, L2A는 -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-인 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
Figure 112015053331353-pct00080
로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항체는 트라스투주맙, (C392 + L443) 트라스투주맙 돌연변이체 및 (C392 + C443) 트라스투주맙 돌연변이체로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항체는 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, Gln-함유 펩티드 태그 또는 Q-태그) 또는 폴리펩티드 조작에 의해 (예를 들어, 폴리펩티드 상의 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 그의 임의의 조합을 통해) 반응성 (즉, 아민 및 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아실 공여자로서 공유 결합을 형성하는 능력)이도록 만든 내인성 글루타민으로 조작된 Fc-함유 또는 Fab-함유 폴리펩티드를 통해 결합되는 것이 바람직하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종의 본 발명의 화합물을 포함하는 임의의 상기 언급된 항체 약물 접합체 및 동반되는 정의에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 3 또는 4종의 본 발명의 화합물을 포함하는 임의의 상기 언급된 항체 약물 접합체 및 동반되는 정의에 관한 것이다.
전형적으로 본 발명의 카르복실- 및/또는 아미노-함유 화합물은 비-카르복실 함유 화합물에 비해 뚜렷하고 고유한 장점을 보유한다. 하나의 이러한 장점은 개선된 수용해도이다. 또 다른 장점은 물, 및 생물학적 유체, 예컨대 혈청, 혈액, 뇌 척수액, 및 약물 제제 중에서의 개선된 화학적 안정성이다. 또 다른 장점은 이들을 적절한 음이온, 예컨대 클로라이드, 아세테이트, 및 다른 반대-이온과 쌍을 형성하게함으로써 카르복실레이트 화합물의 염 형태를 용이하게 제조하는 능력이다. 더욱이, 본 발명의 카르복실레이트 화합물은 암 세포주 및 암에 대한 강력하고 개선된 세포독성을 갖는 아미드 및 에스테르 유도체를 제조하는데 용이하게 사용될 수 있다. 카르복실레이트 함유 화합물은 카르복실산 기가 아민, 알콜, 및 페이로드-링커를 수득하기 위한 다른 기를 보유하는 적절하게 개질된 링커 분자와 반응할 수 있기 때문에, 항체에 연결되는 그의 능력에서의 장점을 추가로 갖는다. 카르복실산 화합물은 또한 직접 관능화되어 활성화된 카르복실산 유도체를 수득할 수 있으며, 이는 추가의 링커의 부착 없이 후속적으로 항체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 카르복실산 함유 화합물은 N-히드록시숙신이미드와 반응하여 활성화된 카르복실-NHS 에스테르를 수득할 수 있다. 이에 따라 제조된 카르복실-NHS 에스테르 및 페이로드-링커는 이어서 항체와 반응하여 항체 약물 접합체를 제조할 수 있다.
항체 단위 (Ab 또는 AB)
본원에서 상기 언급된 용어 "항체" (또는 "Ab" 또는 "AB")는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 포괄한다. 게다가, 본원에 기재된 본 발명의 특정 측면은 항체 약물 접합체를 지칭하지만, 접합체의 항체 부분은 수용체, 항원, 또는 주어진 표적-세포 집단과 연관된 다른 수용 모이어티와 특이적으로 결합하거나 또는 반응적으로 회합하거나 또는 복합체를 형성하는 임의의 것으로 대체될 수 있음이 추가로 예상된다. 예를 들어, 항체를 함유하는 것 대신에 본 발명의 접합체는 수용체, 항원, 또는 치료적으로 또는 달리 생물학적으로 변형되도록 시도되는 세포 집단의 다른 수용 모이어티에 결합하거나, 그와 복합체를 형성하거나 또는 그와 반응하는 표적화 분자를 함유할 수 있다. 이러한 분자의 예는 저분자량 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 렉틴, 당단백질, 비-펩티드, 비타민, 영양-수송 분자 (예컨대, 비제한적으로 트랜스페린), 또는 임의의 다른 세포 결합 분자 또는 물질을 포함한다. 특정 측면에서, 항체 또는 다른 이러한 표적화 분자는 항체 또는 다른 표적화 분자와 상호작용하는 특정한 표적 세포 집단에 약물을 전달하도록 작용한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 AB가 트라스투주맙, 트라스투주맙 돌연변이체 (예를 들어 본원에 또는 국제 특허 출원 PCT/IB2012/056234에 개시된 트라스투주맙 돌연변이체), 오레고보맙, 에드레콜로맙, 세툭시맙, 비트로넥틴 수용체 (αvβ3)에 대한 인간화 모노클로날 항체, 알렘투주맙, 항-HLA-DR 항체, 예컨대 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-HLA-DR 항체, 131I Lym-1, 항-HLA-Dr10 항체, 예컨대 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 뮤린 항-HLA-Dr10 항체, 항-cd33 항체, 항-cd22 항체, 예컨대 호지킨병 또는 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-CD22 mAb, 라베투주맙, 베바시주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 이필리무맙 및 겜투주맙으로부터 선택되는 것인 화학식 III 또는 III'의 항체 약물 접합체 화합물에 관한 것이다.
항체 단위 상에 존재할 수 있는 헤테로원자는 황 (한 실시양태에서, 항체의 술프히드릴 기로부터임), 산소 (한 실시양태에서, 항체의 카르보닐, 카르복실 또는 히드록실 기로부터임) 및 질소 (한 실시양태에서, 항체의 1급 또는 2급 아미노 기로부터임)를 포함한다. 이들 헤테로 원자는 항체의 천연 상태, 예를 들어 자연-발생 항체에서 항체 상에 존재할 수 있거나, 또는 화학적 변형을 통해 항체에 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 단위는 술프히드릴 기를 가지며, 항체 단위는 술프히드릴 기의 황 원자를 통해 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 활성화 에스테르 (이러한 에스테르는 N-히드록시숙신이미드, 펜타플루오로페닐 및 p-니트로페닐 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)와 반응하여 이에 따라 항체 단위의 질소 원자 및 카르보닐로 구성되는 아미드 결합을 형성할 수 있는 리신 잔기를 갖는다.
또 다른 측면에서, 항체 단위는 화학적으로 변형되어 1개 이상의 술프히드릴 기를 도입시킬 수 있는 1개 이상의 리신 잔기를 갖는다. 리신을 변형시키는데 사용될 수 있는 시약은 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트 (SATA) 및 2-이미노티올란 히드로클로라이드 (트라우트 시약)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, 항체 단위는 화학적으로 변형되어 1개 이상의 술프히드릴 기를 가질 수 있는 1개 이상의 탄수화물 기를 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체 단위는 산화되어 알데히드 기를 제공할 수 있는 1개 이상의 탄수화물 기를 가질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Laguzza, et al., 1989, J. Med. Chem. 32(3):548-55] 참조). 상응하는 알데히드는 반응성 부위, 예컨대 예를 들어 히드라진 및 히드록실아민과 결합을 형성할 수 있다. 약물의 부착 또는 회합을 위한 단백질의 변형에 대한 다른 프로토콜은 문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002)] (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
접합체가 항체 대신에 비-면역반응성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 단위를 포함하는 경우에, 유용한 비-면역반응성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 단위는 트랜스페린, 표피 성장 인자 ("EGF"), 봄베신, 가스트린, 가스트린-방출 펩티드, 혈소판-유래 성장 인자, IL-2, IL-6, 형질전환 성장 인자 ("TOP"), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β, 백시니아 성장 인자 ("VGF"), 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II, 소마토스타틴, 렉틴 및 저밀도 지단백질로부터의 아포단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
유용한 폴리클로날 항체는 면역화 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 이종 집단이다. 유용한 모노클로날 항체는 특정한 항원 결정기 (예를 들어, 암 세포 항원, 바이러스 항원, 미생물 항원, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 화학물질, 핵산, 또는 그의 단편)에 대한 항체의 동종 집단이다. 관심 항원에 대한 모노클로날 항체 (mAb)는 배양 중의 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용함으로써 제조될 수 있다.
유용한 모노클로날 항체는 인간 모노클로날 항체, 인간화 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 키메라 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 공지된 다수의 기술 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; 및 Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16]).
항체는 또한 이중특이적 항체일 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기 논의되어 있다.
항체는 표적 세포 (예를 들어, 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 종양 세포 또는 매트릭스에 결합하는 다른 항체의 기능적 활성 단편, 유도체 또는 유사체일 수 있다. 이와 관련하여, "기능적 활성"은 단편, 유도체 또는 유사체가, 단편, 유도체 또는 유사체가 유래되는 항체가 인식하는 것과 동일한 항원을 인식하는 항-항-이디오타입 항체를 도출할 수 있음을 의미한다. 구체적으로, 예시적 실시양태에서, 이뮤노글로불린 분자의 이디오타입의 항원성은 항원을 특이적으로 인식하는 CDR 서열에 대해 C-말단인 프레임워크 및 CDR 서열의 결실에 의해 증진될 수 있다. 항원에 결합하는 CDR 서열을 결정하기 위해, CDR 서열을 함유하는 합성 펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 결합 검정 방법 (예를 들어, BIA 코어 검정)에 의한 항원과의 결합 검정에 사용될 수 있다 (CDR 서열의 위치에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat E et al., 1980, J. Immunology 125(3):961-969] 참조).
다른 유용한 항체는 항체의 단편, 예컨대 비제한적으로 F(ab')2 단편, Fab 단편, Fv, 단일 쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, scFv, scFv-FV, 또는 항체와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자를 포함한다.
추가로, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있는, 인간 부분 및 비-인간 부분 둘 다를 포함하는 재조합 항체, 예컨대 키메라 및 인간화 모노클로날 항체가 유용한 항체이다. 키메라 항체는 상이한 부분들이 상이한 동물 종들로부터 유래된 분자, 예컨대 예를 들어 뮤린 모노클로날로부터 유래된 가변 영역 및 인간 이뮤노글로불린 불변 영역을 갖는 것이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 미국 특허 번호 4,816,397 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 이뮤노글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 분자이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,585,089 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 이러한 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 87/02671; 유럽 특허 공개 번호 0 184 187; 유럽 특허 공개 번호 0 171 496; 유럽 특허 공개 번호 0 173 494; 국제 공개 번호 WO 86/01533; 미국 특허 번호 4,816,567; 유럽 특허 공개 번호 012 023; 문헌 [Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; 및 Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214]; 미국 특허 번호 5,225,539; [Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; 및 Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060] (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
완전 인간 항체가 특히 바람직하며, 이는 내인성 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 모두 또는 일부를 사용하여 통상의 방식으로 면역화된다. 항원에 대해 지시되는 모노클로날 항체는 통상의 하이브리도마 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 보유된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진은 B 세포 분화 동안 재배열되고, 후속적으로 부류 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료상 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 상기 기술에 대한 개관은 문헌 [Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 상기 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 관한 상세한 논의는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 다른 인간 항체는, 예를 들어 아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.) (현재 암젠(Amgen), 캘리포니아주 프리몬트) 및 메다렉스(Medarex) (뉴저지주 프린스턴)로부터 상업적으로 입수될 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "안내된 선택"으로 지칭되는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서는, 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체를 사용하여, 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선택을 안내한다 (예를 들어, 문헌 [Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903] 참조). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯하여, 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan and Carter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, In Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu and Fick, eds., Marcel Dekker, New York, N.Y., Chapter 20, pp. 427-469] 참조).
다른 실시양태에서, 항체는 항체 또는 그의 기능적 활성 단편의 융합 단백질이며, 예를 들어 항체는 N-말단 또는 C-말단에서 공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합)을 통해, 항체로부터 유래되지 않은 또 다른 단백질 (또는 그의 일부, 바람직하게는 단백질 중 적어도 10, 20 또는 50개의 아미노산 일부)의 아미노산 서열에 융합된다. 바람직하게는, 항체 또는 그의 단편은 불변 도메인의 N-말단에서 다른 단백질에 공유적으로 연결된다.
항체는 변형된, 즉 임의의 유형의 분자의 공유 부착 (이러한 공유 부착이 항체가 그의 항원 결합 면역특이성을 보유하도록 허용하는 한)에 의해 변형된 유사체 및 유도체를 포함한다. 예를 들어, 항체의 유도체 및 유사체는, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해적 절단, 세포의 항체 단위 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 추가로 변형된 것들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다수의 화학적 변형 중 임의의 것은, 특이적인 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신 존재 하의 대사 합성 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 유사체 또는 유도체는 1개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다.
항체는 Fc 수용체와 상호작용하는 아미노산 잔기에 변형 (예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)을 가질 수 있다. 특히, 항체는 항-Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기에 변형을 가질 수 있다 (예를 들어, 국제 공개 번호 WO 97/34631 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
암 세포 항원에 대해 면역특이적인 항체는 상업적으로 입수되거나 또는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법, 예컨대 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있다. 암 세포 항원에 대해 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 진뱅크(GenBank) 데이터베이스 또는 그와 유사한 데이터베이스, 문헌 공개로부터, 또는 일상적인 클로닝 및 서열분석에 의해 수득될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 암의 치료를 위한 공지된 항체가 사용될 수 있다. 암 세포 항원에 대해 면역특이적인 항체는 상업적으로 입수되거나 또는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법, 예컨대 예를 들어 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있다. 암 세포 항원에 대해 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 진뱅크 데이터베이스 또는 그와 유사한 데이터베이스, 문헌 공개로부터, 또는 일상적인 클로닝 및 서열분석에 의해 수득될 수 있다. 암의 치료에 이용가능한 항체의 예는 난소암의 치료를 위한 뮤린 항체인 오바렉스(OVAREX); 결장직장암의 치료를 위한 뮤린 IgG2a 항체인 파노렉스(PANOREX) (글락소 웰컴(Glaxo Wellcome), 노스캐롤라이나주); 표피 성장 인자 양성 암, 예컨대 두경부암의 치료를 위한 항-EGFR IgG 키메라 항체인 세툭시맙 에르비툭스(ERBITUX) (임클론 시스템즈 인크.(Imclone Systems Inc.), 뉴욕주); 육종의 치료를 위한 인간화 항체인 비탁신(Vitaxin) (메드이뮨, 인크.(MedImmune, Inc.), 메릴랜드주); 만성 림프구성 백혈병 (CLL)의 치료를 위한 인간화 IgG1 항체인 캄파트(CAMPATH) I/H (류코사이트(Leukosite), 매사추세츠주); 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-HLA-DR 항체인 스마트 ID10 (프로테인 디자인 랩스, 인크.(Protein Design Labs, Inc.), 캘리포니아주); 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 방사성표지된 뮤린 항-HLA-Dr10 항체인 온콜림(ONCOLYM) (테크니클론, 인크.(Techniclone, Inc.), 캘리포니아주); 호지킨병 또는 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-CD2 mAb인 알로뮨(ALLOMUNE) (바이오트랜스플랜트(BioTransplant), 캘리포니아주); 및 결장직장암의 치료를 위한 인간화 항-CEA 항체인 세아시드(CEACIDE) (이뮤노메딕스(Immunomedics), 뉴저지주)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
암 진단 및 요법을 위한 효과적인 세포 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구자들은 하나 이상의 정상적인 비-암성 세포(들)와 비교하여 하나 이상의 특정한 유형(들)의 암 세포의 표면에서 특이적으로 발현되는 막횡단 또는 다르게는 종양-연관 폴리펩티드를 확인하고자 하였다. 종종, 이러한 종양-연관 폴리펩티드는 비-암성 세포의 표면에서와 비교하여 암 세포의 표면에서 보다 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-연관 세포 표면 항원 폴리펩티드의 확인은, 항체-기반 요법을 통해 파괴할 암 세포를 특이적으로 표적화하는 능력을 생성한다.
링커 유닛 (L)
링커 (본원에서 때로는 "[링커]"로 지칭됨)는 약물과 항체를 연결하여 항체 약물 접합체 (ADC)를 형성하는데 사용될 수 있는 이관능성 화합물이다. 이러한 접합체는, 예를 들어 종양 연관 항원에 대해 지시되는 면역접합체의 형성에 유용하다. 이러한 접합체는 세포독성 약물의 종양 세포로의 선택적 전달을 허용한다.
ADC에서, 링커는 항체에 페이로드를 부착시키는데 도움을 준다.
한 측면에서, 제2 반응성 부위, 예를 들어 항체 단위 (예를 들어, 항체) 상에 존재하는 친핵성 기에 대해 반응성인 친전자성 기를 갖는 링커 단위의 제2 섹션이 도입된다. 항체 상의 유용한 친핵성 기는 술프히드릴, 히드록실 및 아미노 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체의 친핵성 기의 헤테로원자는 링커 단위 상의 친전자성 기에 대해 반응성이고, 링커 단위에 대한 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 친전자성 기는 항체 부착에 편리한 부위를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 링커 단위는 항체 상에 존재하는 친전자성 기에 대해 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 링커 단위의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 단위 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체 상의 친전자성 기는 링커 단위에 대한 부착에 편리한 부위를 제공한다.
아미노 관능기는 또한, 이것이 카르복실산, 또는 화합물의 활성화된 에스테르와 반응하여 아미드 연결을 형성할 수 있기 때문에 링커 단위에 유용한 반응성 부위이다. 전형적으로, 본 발명의 펩티드-기반 화합물은 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액상 합성 방법 (예를 들어, 문헌 [Schroder and Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 문맥, 특히 비제한적로 링커 성분, 예컨대 L1, L2 (L2A, L2B 및 L2C 포함) 및 L3에서, 언어 "하나 이상으로부터 선택된" 또는 "하나 이상"은 동일하거나 또는 상이할 수 있는 다중 성분이 순차적으로 배열되거나 배열될 수 있는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어 L3은 -C1-6알킬-, -NR- 또는 다른 개별적으로 열거된 성분, 뿐만 아니라 -C1- 6알킬-NR-, 또는 2종 이상의 열거된 성분 중 임의의 다른 조합일 수 있다.
화합물 및 그의 항체 약물 접합체의 합성
본 발명의 화합물 및 접합체는 하기 실시예에 약술된 합성 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 하기 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물 및 접합체는 화합물에 결합하기 위한 반응성 부위를 갖는 링커 단위의 섹션을 사용하여 제조될 수 있다. 한 측면에서, 제2 반응성 부위, 예를 들어 항체 단위 (예를 들어, 항체) 상에 존재하는 친핵성 기에 대해 반응성인 친전자성 기를 갖는 링커 단위의 제2 섹션이 도입된다. 항체 상의 유용한 친핵성 기는 술프히드릴, 히드록실 및 아미노 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체의 친핵성 기의 헤테로원자는 링커 단위 상의 친전자성 기에 대해 반응성이고, 링커 단위에 대한 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 친전자성 기는 항체 부착에 편리한 부위를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 링커 단위는 항체 상에 존재하는 친전자성 기에 대해 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 링커 단위의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 단위 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체 상의 친전자성 기는 링커 단위에 대한 부착에 편리한 부위를 제공한다.
아미노 관능기는 또한, 이것이 카르복실산, 또는 화합물의 활성화된 에스테르와 반응하여 아미드 연결을 형성할 수 있기 때문에 링커 단위에 유용한 반응성 부위이다. 전형적으로, 본 발명의 펩티드-기반 화합물은 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어 펩티드 화학 분야에 널리 공지된 액상 합성 방법 (예를 들어, 문헌 [Schroder and Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다.
하기 보다 상세히 기재된 바와 같이, 접합체는 본 발명의 화합물에 결합하고 항체에 대한 반응성 부위를 갖는 링커 단위의 또 다른 섹션을 도입시키기 위한 반응성 부위를 갖는 링커의 섹션을 사용하여 제조될 수 있다. 한 측면에서, 링커 단위는 항체 단위, 예컨대 항체 상에 존재하는 친핵성 기와 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 친전자성 기는 항체 부착에 편리한 부위를 제공한다. 항체 상의 유용한 친핵성 기는 술프히드릴, 히드록실 및 아미노 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체의 친핵성 기의 헤테로원자는 링커 단위 상의 친전자성 기에 대해 반응성이고, 링커 단위에 대한 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기는 말레이미드 및 할로아세트아미드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시양태에서, 링커 단위는 항체 단위 상에 존재하는 친전자성 기와 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 항체 상의 친전자성 기는 링커 단위에 대한 부착에 편리한 부위를 제공한다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 링커 단위의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 단위 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
트랜스글루타미나제와의 접합
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 트랜스글루타미나제의 존재 하에, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 (예를 들어, Gln-함유 펩티드 태그 또는 Q-태그) 또는 폴리펩티드 조작 (예를 들어, 폴리펩티드 상에서의 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이 또는 그의 임의의 조합을 통함)에 의해 반응성 (즉, 아민 및 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아실 공여자로서 공유 결합을 형성하는 능력)이도록 만든 내인성 글루타민으로 조작된 Fc-함유 또는 Fab-함유 폴리펩티드에 공유적으로 가교될 수 있으며, 단 본 발명의 화합물은 아민 공여자 작용제 (예를 들어, 반응성 아민을 포함하거나 그에 부착되어 있는 소분자)를 포함하며, 그로 인해 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 노출되거나/접근가능하거나/반응성인 내인성 글루타민을 통해 Fc-함유 또는 Fab-함유 폴리펩티드에 부위-특이적으로 접합되는 아민 공여자 작용제와의 조작된 Fc-함유 폴리펩티드 접합체의 안정한 동종 집단을 형성한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 국제 특허 출원 일련 번호 PCT/IB2011/054899 (그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스글루타미나제의 존재 하에, 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 폴리펩티드 조작에 의해 반응성이도록 만든 내인성 글루타민으로 조작된 Fc-함유 또는 Fab-함유 폴리펩티드에 대한 본 발명의 화합물의 접합을 용이하게 하기 위해, Z는 NH2이다.
인간 경쇄 카파 도메인 불변 영역에 대한 접합
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 인간 경쇄 카파 도메인 불변 영역 (CLκ)의 K188 (카바트에 따른 전장 경쇄 넘버링)의 측쇄에 공유적으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 미국 특허 출원 일련 번호 13/180,204 (이의 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, K188 CLκ에 대한 접합을 용이하게 하기 위해, Z는
Figure 112015053331353-pct00081
이고; R7은 각 경우에 독립적으로 F, Cl, I, Br, NO2, CN 및 CF3으로 이루어진 군으로부터 선택되고; h는 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 조성물 중 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 본 발명의 화합물이 K188 CLκ에서 항체 또는 그의 항원 결합 부분에 접합되어 있는 것인, 항체 (또는 그의 항원 결합 부분)에 공유적으로 접합되어 있는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 촉매 항체, 예컨대 알돌라제 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합 부위에 접합될 수 있다. 알돌라제 항체는 (예를 들어, 접합에 의해) 방해받지 않는 경우에는 지방족 케톤 공여자와 알데히드 수용자 사이의 알돌 부가 반응을 촉매화하는 결합 부위 부분을 함유한다. 미국 특허 출원 공개 번호 US 2006/205670의 내용, 특히 링커를 기재하는 78-118 페이지, 및 항체, 그의 유용한 단편, 변이체 및 변형, h38C2, 결합 부위 및 상보적 결정 영역 (CDR), 및 관련 항체 기술을 기재하는 단락 [0153]-[0233]은 본원에 참조로 포함된다. 용어 "결합 부위"는 항원 결합에 관여하는 CDR 및 인접한 프레임워크 잔기를 포함한다.
조성물 및 투여 방법
다른 실시양태에서, 본 발명의 또 다른 측면은 유효량의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체, 및 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 수의학적 또는 인간 투여에 적합하다.
본 발명의 제약 조성물은 조성물이 환자에게 투여되는 것을 허용하는 임의의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 전형적인 투여 경로는 비제한적으로 비경구, 안구 및 종양내 투여를 포함한다. 비경구 투여는 피하 주사, 정맥내, 근육내 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 한 측면에서, 조성물은 비경구로 투여된다. 구체적 실시양태에서, 조성물은 정맥내로 투여된다.
제약 조성물은 환자에게 조성물을 투여할 시에 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체가 생체이용가능하도록 하기 위해 제제화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 투여 단위 형태를 취할 수 있고, 여기서 예를 들어 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 액체 형태의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 용기는 복수의 투여 단위를 보유할 수 있다.
제약 조성물을 제조하는데 사용되는 물질은 사용되는 양에서 비-독성일 수 있다. 제약 조성물 중 활성 성분(들)의 최적 투여량은 다양한 요인에 따라 달라질 것임이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 관련 요인은 비제한적으로 동물의 유형 (예를 들어, 인간), 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 특정한 형태, 투여 방식, 사용되는 조성물을 포함한다.
조성물이 예를 들어 정제 또는 분말 형태로 존재하도록, 제약상 허용되는 담체 또는 비히클은 고체 또는 미립자일 수 있다. 담체(들)는 액체일 수 있다. 추가로, 담체(들)는 미립자일 수 있다.
조성물은 액체, 예를 들어 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로 존재할 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 조성물에는 하나 이상의 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 및 등장화제가 또한 포함될 수 있다.
액체 조성물은, 이들이 용액이든, 현탁액이든 또는 다른 유사한 형태이든 하기 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리 염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정 오일, 예컨대 합성 모노 또는 디글리세리드 (이는 용매 또는 현탁 매질로서 역할을 할 수 있음), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 시클로덱스트린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 또는 아미노산, 및 장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 조성물은 유리, 플라스틱 또는 다른 물질로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다중-용량 바이알 내에 봉입될 수 있다. 생리 염수는 예시적인 아주반트이다. 주사가능한 조성물은 바람직하게는 멸균된다.
특정한 장애 또는 상태의 치료에 효과적인 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 양은 장애 또는 상태의 성질에 따라 달라질 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 또는 생체내 검정이 최적 투여량 범위 확인을 돕는데 임의로 사용될 수 있다. 조성물에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 따라 달라질 것이며, 진료의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
조성물은 적합한 투여량이 획득되도록 유효량의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체를 포함한다. 전형적으로, 상기 양은 조성물의 중량을 기준으로 하여 적어도 약 0.01%의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체이다. 예시적 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구 투여 단위가 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량%의 양의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체를 함유하도록 제조된다.
정맥내 투여를 위해, 조성물은 환자의 체중 kg당 약 0.01 내지 약 100 mg의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 조성물은 환자의 체중 kg당 약 1 내지 약 100 mg의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 투여된 양은 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체 약 0.1 내지 약 25 mg/kg 체중의 범위 내에 있을 것이다.
일반적으로, 환자에게 투여되는 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 투여량은 전형적으로 약 0.01 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 환자 체중이다. 한 측면에서, 환자에게 투여되는 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 환자 체중이다. 또 다른 측면에서, 환자에게 투여되는 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 환자 체중이다. 또 다른 측면에서, 환자에게 투여되는 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 환자 체중이다. 또 다른 측면에서, 투여되는 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg 환자 체중이다. 또 다른 측면에서, 투여되는 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg 환자 체중이다.
본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국부성일 수 있다. 다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 캡슐 등으로의 캡슐화가 공지되어 있으며, 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체를 투여하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 하나 초과의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체가 환자에게 투여된다.
구체적 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 부위에 국부적으로 본 발명의 하나 이상의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 비제한적으로 수술 동안의 국부 주입; 예를 들어 수술 후의 상처 드레싱과 관련된 국소 적용; 주사; 카테터; 또는 이식 (이식은 막, 예컨대 실라스틱 막 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질의 것임)에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 투여는 암, 종양 또는 신생물 또는 전-신생물 조직의 부위 (또는 이전 부위)에서의 직접 주사에 의한 것일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 투여는 자가면역 질환의 소견 부위 (또는 이전 부위)에서의 직접 주사에 의한 것일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 제어 방출 시스템, 예컨대 비제한적으로 펌프로 전달될 수 있거나, 또는 다양한 중합체 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제어-방출 시스템은 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 표적, 예를 들어 간에 근접하여 위치될 수 있으며, 이에 따라 단지 전신 용량의 분획을 요구할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 랑거(Langer)에 의한 리뷰 (문헌 [Science 249:1527-1533 (1990)])에 논의되어 있는 다른 제어-방출 시스템이 사용될 수 있다.
용어 "담체"는 화합물 또는 그의 항체 약물 접합체와 함께 투여되는 희석제, 아주반트 또는 부형제를 지칭한다. 이러한 제약 담체는 액체, 예컨대 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일일 수 있다. 담체는 염수 등일 수 있다. 추가로, 보조제, 안정화제 및 기타 작용제가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 환자에게 투여되는 경우에, 화합물 또는 접합체 및 제약상 허용되는 담체는 멸균된다. 물은 화합물 또는 접합체가 정맥내로 투여되는 경우에 예시적인 담체이다. 특히 주사액의 경우에, 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 원하는 경우에 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 용액, 펠릿, 분말, 지속-방출 제제 형태, 또는 사용에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 적합한 제약 담체의 다른 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 동물, 특히 인간에 대한 정맥내 투여에 적합화된 제약 조성물로서 상용 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 담체 또는 비히클은 멸균 등장성 수성 완충 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 가용화제를 또한 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위한 조성물은 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제, 예컨대 리그노카인을 임의로 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 활성제의 양을 나타내는 기밀식으로 밀봉된 용기, 예컨대 앰플 또는 사쉐에서, 예를 들어 건식 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 단위 투여 형태로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체가 주입에 의해 투여되는 경우에, 이것은 예를 들어 멸균 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체가 주사에 의해 투여되는 경우에, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 멸균 주사용수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
조성물은 고체 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 쉘을 형성하는 물질은 전형적으로 불활성이며, 예를 들어 당, 쉘락 및 다른 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있다.
고체 형태이든 액체 형태이든, 본 발명의 조성물은 암의 치료에 사용되는 약리학적 작용제를 포함할 수 있다.
화합물 및 그의 항체 약물 접합체의 치료 용도
본 발명의 또 다른 측면은 암을 치료하기 위해 본 발명의 화합물 및 그의 항체 약물 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 억제하거나, 종양 또는 암 세포에서 아폽토시스를 유발하거나, 또는 환자에서 암을 치료하는데 유용하다. 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 따라서 동물 암의 치료를 위한 다양한 셋팅에서 사용될 수 있다. 상기 접합체는 종양 세포 또는 암 세포에 본 발명의 화합물을 전달하는데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 한 실시양태에서, 접합체의 항체는 암-세포 또는 종양-세포-연관 항원에 결합하거나 그와 회합하며, 접합체는 수용체-매개 세포내이입 또는 다른 내재화 메카니즘을 통해 종양 세포 또는 암 세포 내부로 흡수 (내재화)될 수 있다. 항원은 종양 세포 또는 암 세포에 부착될 수 있거나, 또는 종양 세포 또는 암 세포와 연관된 세포외 매트릭스 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 내부에 들어오면, 하나 이상의 특정 펩티드 서열이 하나 이상의 종양 세포 또는 암 세포-연관 프로테아제에 의해 효소적으로 또는 가수분해적으로 절단되어 접합체로부터의 본 발명의 화합물의 방출을 일으킨다. 이어서, 방출된 본 발명의 화합물은 세포 내에서 자유롭게 이동하여 세포독성 또는 세포증식억제 활성을 유도한다. 접합체는 또한 세포내 프로테아제에 의해 절단되어 본 발명의 화합물을 방출할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 종양 세포 또는 암 세포 외부에서 접합체로부터 절단되며, 본 발명의 화합물은 후속적으로 세포에 침투한다.
특정 실시양태에서, 접합체는 접합-특이적 종양 또는 암 약물 표적화를 제공하며, 이에 따라 본 발명의 화합물의 일반적 독성을 감소시킨다.
또 다른 실시양태에서, 항체 단위는 종양 세포 또는 암 세포에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 단위는 종양 세포 또는 암 세포의 표면에 있는 종양 세포 또는 암 세포 항원에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 단위는 종양 세포 또는 암 세포와 연관된 세포외 매트릭스 단백질인 종양 세포 또는 암 세포 항원에 결합한다.
특정한 종양 세포 또는 암 세포에 대한 항체 단위의 특이성은 가장 효과적으로 치료되는 종양 또는 암을 결정하기 위해 중요할 수 있다.
본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체로 치료될 수 있는 암의 특정한 유형은 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 신장, 폐, 식도, 난소, 전립선, 췌장, 피부, 위 및 고환의 암종; 및 백혈병 및 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액 유래 암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
암에 대한 다중-양상 요법. 종양, 전이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 암, 또는 탈제어된 세포 성장을 특징으로 하는 다른 질환 또는 장애는 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 투여에 의해 치료되거나 또는 억제될 수 있다.
다른 실시양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체 및 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 이를 사용한 암의 치료가 불응성인 것으로 밝혀진 바 없는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 화학요법제는 이를 사용한 암의 치료가 불응성인 것으로 밝혀진 바 있는 것이다. 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 또한 암에 대한 치료로서 수술을 겪은 환자에게 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 환자는 또한 추가의 치료, 예컨대 방사선 요법을 받는다. 구체적 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 화학요법제 또는 방사선 요법과 동시에 투여된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 화학요법제 또는 방사선 요법은 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 투여 전 또는 후에 투여된다.
화학요법제는 일련의 세션에 걸쳐 투여될 수 있다. 화학요법제 중 임의의 하나 또는 그의 조합, 예컨대 표준 치료 화학요법제(들)가 투여될 수 있다.
추가로, 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체를 사용한 암의 치료 방법은 화학요법 또는 방사선 요법이 지나치게 독성임이 입증되었거나 입증될 수 있는, 예를 들어 치료할 대상체에 대해 허용되지 않거나 견딜 수 없는 부작용을 일으키는 화학요법 또는 방사선 요법에 대한 대안으로서 제공된다. 어떠한 치료가 허용되거나 견딜 수 있는 것으로 밝혀지는지에 따라, 치료할 환자는 임의로 또 다른 암 치료법, 예컨대 수술, 방사선 요법 또는 화학요법으로 치료될 수 있다.
본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체는 또한 시험관내 또는 생체외 방식으로, 예컨대 백혈병 및 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 암의 치료에 사용될 수 있으며, 이러한 치료는 자가유래 줄기 세포 이식을 포함한다. 이는 동물의 자가유래 조혈 줄기 세포를 수확하고, 모든 암 세포를 제거하고, 이어서 동물의 나머지 골수 세포 집단을 고용량 방사선 요법의 동반과 함께 또는 동반 없이 고용량의 본 발명의 화합물 및/또는 그의 항체 약물 접합체의 투여를 통해 제거하고, 줄기 세포 이식편을 동물에 다시 주입하는 다중-단계 과정을 포함할 수 있다. 이어서, 골수 기능이 복원되고 환자가 회복되는 동안 지지 요법이 제공된다.
본 발명은 하기 실시예에 추가로 기재되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
방출되는 종
본 발명의 추가 실시양태는 하나 이상의 암 세포 또는 종양 세포-연관 프로테아제에 의해 효소적으로 및/또는 가수분해적으로 절단되는 것으로 여겨지는 것에 의해 암 세포 또는 종양 세포 내부에서 또는 그 부근에서 방출되는 화학종을 포함한다. 이러한 화합물은 본원에 기재된 종을 포함하며, 또한 하기 구조에 기재된 것과 같은 화합물을 포함한다:
하기 화학식 II의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염:
<화학식 II>
L-P
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P에 결합되고;
P는 하기 화학식 I의 라디칼이고:
<화학식 I>
Figure 112015053331353-pct00082
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 -(C(R)2)m-C(O)- 또는 -(C(R)2)m-이고;
L1은 -산, -NR-산 및
Figure 112015053331353-pct00083
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00084
,
Figure 112015053331353-pct00085
및
Figure 112015053331353-pct00086
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13은 수소, C1- 6알킬, C3- 8카르보시클릴, C3- 8헤테로시클릴, C1- 6알킬-C6- 14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
산은 -SCH2CH(COOH)(NH2), -NH(CH2)4CH(COOH)(NH2) 및 -C(O)(CH2)2CH(COOH)(NH2)로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
추가로, 하기 화학식 II'의 화합물 또는 화합물들 또는 그의 제약상 허용되는 염:
<화학식 II'>
L-P'
상기 식에서,
L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P'에 결합되고;
P'는 하기 화학식 I'의 라디칼이고:
<화학식 I'>
Figure 112015053331353-pct00087
상기 식에서,
파선은 임의적인 결합을 나타내고;
각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X'는 CR 또는 N이고;
각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
R1은 -(C(R)2)m-, -OR", -OCOR13 ', -OC(O)NRR14 ', -OCON(R)N(R)- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2- 5알킬리덴을 형성하거나,
R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R8은 수소, C1- 6알킬 또는 -OR이고;
R9는 독립적으로 수소, -C1- 6알킬, -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
L1은 -산, -NR-산 및
Figure 112015053331353-pct00088
로부터 선택되고;
L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1- 6알킬-, -C(O)NRC1 - 6알킬-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-, -C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-C(O)-, -C1- 6알킬-S-S-C1- 6알킬-NRC(O)CH2-, -C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1- 6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1- 6알킬(OCH2CH2)1 -6-NRC(O)-, -C(O)-C1- 6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1- 6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1 - 6알킬-, -C1- 6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1- 6알킬-S-, -C(O)-O-C1- 6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고;
L3은 -C1- 6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1- 6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1- 6알킬-페닐-NR-, -NR-C1- 6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1- 6알킬-페닐-C(O)-,
Figure 112015053331353-pct00089
,
Figure 112015053331353-pct00090
및
Figure 112015053331353-pct00091
를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
R13'는 결합, -C1- 6알킬렌-, -C3- 8카르보시클릴-, -C3- 8헤테로시클릴-, -C1- 6알킬-C6-14아릴-, -C1- 6알킬-C5- 14헤테로아릴-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1- 6알킬렌-C3- 10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR, -C1- 6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1- 6알킬-NRR로부터 선택되고;
각각의 R14'는 독립적으로 결합, -NR-, -C3- 10카르보시클릴-, -C3- 10헤테로시클릴-, -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2C(O)OR', -(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NR- 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 R14'는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -NRR 또는 -SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
산은 -SCH2CH(COOH)(NH2), -NH(CH2)4CH(COOH)(NH2) 및 -C(O)(CH2)2CH(COOH)(NH2)로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택되고;
각각의 R"는 독립적으로 결합 및 -C1- 6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
실시예
천연 생성물 생산
하기 절차는 본 발명에서 페이로드로서 유용한 "천연 생성물"의 생산을 약술한다. 용어 "천연 생성물"은 생성물이 발효 공정을 통해 생산되는 것을 나타내지만, 이들 생성물이 공지되거나 또는 자연에서 발견될 수 있는 것으로 시사하지는 않는다. 천연 생성물은 하기에 접두어 "NP"로 나타낸다.
실시예 1
[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP1); [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP2); [(2S,5S,6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-5-히드록시-4-메틸리덴테트라히드로-2H-피란-2-일]아세트산(#NP3);[(2S,6S)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-메틸리덴테트라히드로-2H-피란-2-일]아세트산 (#NP4)의 발효, 추출 및 단리
Figure 112015053331353-pct00092
단계1: 슈도모나스(Pseudomonas) 종 번호 2663 (균주 FERM BP-3421)을 사용한 발효:
슈도모나스 종 번호 2663 (균주 FERM BP-3421)을 국립 산업 기술 종합 연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (AIST 츠쿠바(AIST Tsukuba), 일본 이바라키 305-8566 츠쿠바 히가시 1-1-1 센트럴 6) 내의 국제 특허 생물 기탁소(International Patent Organism Depositary) (IPOD)로부터 획득하였다. 생화학적 (BBL 결정 키트) 및 16S rRNA 서열 분석에 의해 수행된 후속 분류 연구는 FERM BP-3421이 부르크홀데리아 종인 것을 밝혀내었다.
단일 콜로니 단리물을 영양 한천 플레이트 상에 FERM BP-3421 야생형의 동결 배양물을 플레이팅하여 희석함으로써 배양하였다. 시드 배지 (1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl) 50 ml를 함유하는 여러 250 ml 에를렌마이어 플라스크를 한천 성장 배양물로 접종하고, 18-20시간 동안 220 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 시드 배양물을 2.5% (v/v)에서 배플이 없는 2.8 L 페른바흐 플라스크당 생산 배지 (1% 가용성 전분, 1% 글리세린, 0.5% 글루코스, 1% 하이소이 소이펩톤(HySoy Soypeptone), 0.5% 옥수수 침지액, 0.2% 황산암모늄, 0.006% 황산마그네슘.6H2O, 0.2% CaCO3, pH 7.0) 500 ml에 접종하였다. 발효물을 72시간 동안 200 rpm에서 진탕하면서 25℃에서 인큐베이션하였다.
단계2. 발효 브로쓰의 추출: 실시예 1의 단계1로부터의 발효의 종결에서, 습윤 DIAION HP-20 수지 50 g/L를 생산 발효물의 상청액에 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 100 rpm에서 진탕하였다. HP-20을 원심분리에 의해 수집한 다음, 에틸 아세테이트로 주위 온도에서 추출하였다. 보다 상세하게는, FERM BP-3421의 13 L 발효물을 실시예 1의 단계 1에 따라 72시간 동안 25℃에서 수행하였다. 전체 브로쓰를 30분 동안 3800 rpm에서 원심분리하였다. 세포를 버리고, 상청액을 예비-세척된 습윤 HP20 수지 (260 g 건조 중량)와 혼합하였다. 생성된 현탁액을 진탕기 상에서 주위 온도에서 1시간 동안 진탕하였다. 화합물-결합 HP20 수지를 에틸 아세테이트 (각 회 1 L)로 2회 추출하고, 에틸 아세테이트 용액을 셀라이트 상에서 여과하고, 이어서 감압 하에 증발시켜 밝은 색상의 조 추출물 (2.4 g)을 수득하였다.
단계3: [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP1); [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP2)의 단리 및 특성화: 실시예 1의 단계2로부터의 조 추출물을 1:1 아세토니트릴/디메틸 술폭시드 (총 14 mL)의 혼합물 중에 용해시켰다. 점성 용액을 여과한 다음, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다: (칼럼: 워터스(Waters) C18 델타 팩(DELTA PAK) (WAT011801), 300 X 50 mm, 15 μm, 100 A; 이동상 A: 1:1 아세토니트릴/H2O 중 0.02% 아세트산 (vv); 이동상 B: 3:1 아세토니트릴/H2O 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 이동상 C: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v). 구배 : 5분 동안 100% A, 18분에 걸쳐 0%A에서 100% B로 및 2분에 걸쳐 100% B에서 100% C로, 및 2분 동안 100% C. 유량: 50 mL/분.). 13.5 및 18.0분의 체류 시간으로 분획을 수집하고, 동결건조시켜 #NP1 (172.5 mg) 및 #NP2 (227.2 mg)을 각각 백색 분말로서 수득하였다. 14.8분 및 20.5분의 체류 시간으로 분획을 또한 수집하고, 동결건조시켜 2개의 반-정제된 회색빛 분말 I 및 II를 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00093
Figure 112015053331353-pct00094
단계 4: [(2S,5S,6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-5-히드록시-4-메틸리덴테트라히드로-2H-피란-2-일]아세트산 (#NP3)의 단리.
실시예 1의 단계2에서 단리된 반정제된 분말 I을 역상 HPLC (칼럼: YMC-팩-ODS-A, 250 X 30 mm, S-10 μm, 12 nm.: 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산; 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산: 구배 시스템: 23분에 걸쳐 30%에서 100% B로 및 1분 동안 100% B 유지. 유량: 20 mL/분)에 의해 추가로 정제하여 #NP3 (7.6 mg)을 백색 분말로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00095
단계 5: [(2S,6S)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-메틸리덴테트라히드로-2H-피란-2-일]아세트산 (#NP4)의 단리.
실시예 1의 단계2에서 단리된 반정제된 분말 II를 역상 HPLC (칼럼: YMC-팩-ODS-A, 250 X 30 mm, S-10 μm, 12 nm.: 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산; 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산: 구배 시스템: 23분에 걸쳐 30%에서 100% B로 및 1분 동안 100% B 유지. 유량: 20 mL/분)에 의해 추가로 정제하여 #NP4 (12.2 mg)를 백색 분말로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00096
실시예 2
천연 생성물 유사체: (5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-1-(카르복시메틸)-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시펜티톨(#NP5); (6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1-데옥시-4-C-(히드록시메틸)헥스-2-울로피라노스(#NP6); (4-[(아세틸옥시)메틸]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일)아세트산 (#NP7); [6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-(클로로메틸)-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일]아세트산 (#NP8); 4-C-[(아세틸옥시)메틸]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1-데옥시헥스-2-울로피라노스 (#NP9); 6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-C-[({[6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-(클로로메틸)-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일]아세틸}옥시)메틸]-1-데옥시헥스-2-울로피라노스 (#NP10); (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-2,5-디메틸-6-{(2E,4E)-3-메틸-5-[(2S)-4-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일]펜타-2,4-디엔-1-일}테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#NP11)의 발효, 추출 및 단리.
Figure 112015053331353-pct00097
단계 1: 실시예 1의 단계2에서와 같이 제조한 조 고체 추출물 (3.7 g)을 메탄올 중에 용해시키고, 15.0시간의 기간 동안 자동화 분획 수집기를 사용하여 15분 간격에서 수집된 용리액 (총 65개의 분획을 수집함)으로 메탄올을 사용하여 세파덱스(Sephadex) LH20 칼럼 상에서 분별증류하였다. 이로부터의 분획-19를 역상 HPLC (칼럼: YMC-팩-ODS-A, 250 x 30 mm, S-10 um, 12 nm; 이동상 A: 0.2% 아세트산암모늄 (W/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산; 구배: 20분에 걸쳐 30% B에서 60% B로, 5분에 걸쳐 100% B 및 4분 동안 100% B에서 유지 및 2분에 걸쳐 100% B에서 30% B로; 유량: 20 mL/분)에 의해 추가로 정제하여 13개의 분획: 분획 A (4.3-6.4분), B (10.8-11.9분), C (12.5-13.5분), D (13.5-14.6분), E (15.0-16.1분), F (16.5-17.8분), G (19.0-19.8분), H (19.8-21.0분), I (21.8-23.0분), J (23.3-25.4분), J1 (25.4-26.2분), K (27.9-28.5분), L (28.7-29.5분)을 수득하였다.
단계2: (5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-1-(카르복시메틸)-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시펜티톨(#NP5): (6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1-데옥시-4-C-(히드록시메틸)헥스-2-울로피라노스(#NP6); (4-[(아세틸옥시)메틸]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일)아세트산 (#NP7)의 단리
실시예 2의 단계 1로부터의 분획 D를 역상 HPLC (칼럼, 칼럼: C18-페노메넥스(Phenomenex); 루나(Luna) 10μM; 250 x 10 mm.; 이동상 A: 물 중 0.2% 아세트산암모늄 (W/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산; 구배: 5분에 걸쳐 25% B에서 35% B로, 17분에 걸쳐 45% B로, 2분에 걸쳐 70% B로: 유량: 2.5 mL/분)에 의해 추가로 정제하고, 13, 14 및 15분에서 용리된 분획을 수집하고, 동결건조시켰다.
13분에서 용리된 분획은 #NP5를 수득하였다: 수율: 1.0 mg:
Figure 112015053331353-pct00098
단계 3: 6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1-데옥시-4-C-(히드록시메틸)헥스-2-울로피라노스(#NP6)의 단리: 실시예 2의 단계 2로부터의 상기 체류 시간 14.0분에서 수집된 분획을 역상 HPLC (칼럼: 크로모리스(Chromolith): RP 18e, 100-10 mm.: 이동상 A: 물 중 0.2% 아세트산암모늄 (W/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산; 구배: 20분에 걸쳐 25% B에서 33% B로; 유량: 2.5 mL/분)를 사용하여 추가로 정제하여 #NP6을 수득하였다: 수율 4.0 mg,
Figure 112015053331353-pct00099
단계 4: (4-[(아세틸옥시)메틸]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일)아세트산 (#NP7)의 단리: 실시예 2의 단계 2로부터의 상기 체류 시간 15.0분에서 수집된 분획을 역상 HPLC (YMC-팩-ODS-A; 250 X 10 mm, S-5 um, 12 nm. 이동상 A: 물 중 0.2% 아세트산암모늄 (W/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산; 구배: 20분에 걸쳐 30% B에서 50% B로, 5분에 걸쳐 95% B로: 유량: 2.5 mL/분)를 사용하여 추가로 정제하여 #NP7을 수득하였다:
Figure 112015053331353-pct00100
단계 5: [6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-(클로로메틸)-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일]아세트산 (#NP8), 4-C-[(아세틸옥시)메틸]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1-데옥시헥스-2-울로피라노스 (#NP9), 및 6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-C-[({[6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시 )펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-(클로로메틸)-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일]아세틸}옥시)메틸]-1-데옥시헥스-2-울로피라노스 (#NP10)의 단리:
실시예 2의 단계 1로부터의 분획 F를 역상 HPLC (C18-페노메넥스; 루나 250 x 10 mm. 10uM; 이동상 A: 물 중 0.2% 아세트산암모늄 (W/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산;구배: 20분에 걸쳐 40% B에서 45% B로, 5분에 걸쳐 95% B로; 유량: 2.5 mL/분)에 의해 추가로 정제하였다: 8, 13 및 28분에서 용리된 분획을 수집하고, 동결건조시켜 하기를 수득하였다:
Figure 112015053331353-pct00101
Figure 112015053331353-pct00102
Figure 112015053331353-pct00103
단계 6: (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-2,5-디메틸-6-{(2E,4E)-3-메틸-5-[(2S)-4-메틸-6-옥소-3,6-디히드로-2H-피란-2-일]펜타-2,4-디엔-1-일}테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#NP11)의 단리.
실시예 2의 단계 1로부터의 분획 K를 역상 HPLC (C18-페노메넥스; 루나 250 x 10 mm. 10uM; 페노메넥스; 루나 250 x 10 mm. 10uM;; 이동상 A: 물 중 0.2% 아세트산암모늄 (W/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산; 구배: 15분에 걸쳐 40 내지 95% B로. 유량: 2.5 ml/분)에 의해 추가로 정제하여 #NP11을 수득하였다. 수율: 2.0 mg.
Figure 112015053331353-pct00104
실시예 3
FERM BP-3421의 분자 계통발생학적 특성화
단계 1: 게놈 DNA를 FERM BP-3421의 순수한 배양물로부터 단리하고, 거의 완전한 16S rRNA 유전자를 프라이머 8FPL (5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3') (서열 1) 및 1492RPL (5'GGTTACCTTGTTACGACTT3') (서열 2)을 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 DNA 클린 앤드 콘센트레이터™-25 키트 (지모 리서치(Zymo Research))로 정제하고 직접 서열분석하여 하기 16S rRNA 프라이머: 8FPL, pC FWD (5'CTACGGGAGGCAGCAGTGGG3') (서열 3), pC REV (5'CCCACTGCTGCCTCCCGTAG3') (서열 4), pD FWD (5'CAGCAGCCGCGGTAATAC3') (서열 5), pD REV (5'GTATTACCGCGGCTGCTG3') (서열 6), pF FWD (5'CATGGCTGTCGTCAGCTCGT3') (서열 7), pF REV (5'ACGAGCTGACGACAGCCATG3') (서열 8) 및 1492RPL 범위의 이중 가닥을 제공하였다. 완전 이중 가닥 16S rRNA 서열 (서열 1)을 퍼블릭 데이터베이스 (미국 국립 생물 정보 센터)에서 조사하여 FERM BP-3421의 분류학상 소속을 부르크홀데리아 종으로서 결정하였다. 가장 밀접하게 관련된 부르크홀데리아 종 유형 균주 중 16S rRNA 서열 및 부르크홀데리아 종 NRRL B50319 (균주 A396)(US20110207604A1 아솔카(Asolkar) 등, 2011)의 서열 (이는 FERM BP-3421과 100% 동일성을 공유함)을 진뱅크로부터 추출하였다. 다중 서열 정렬을 클러스탈엑스(ClustalX) (버전 1.81)를 사용하여 수행하고, 다른 부르크홀데리아 종과 관련된 FERM BP-3421의 계통발생학적 위치를 표준 트리잉 방법, 예컨대 트리콘(TREECON) (버전 1.3b)으로 결정하였다.
Figure 112015053331353-pct00105
도 1은 다른 부르크홀데리아 종에 대한 FERM BP-3421의 거의 완전한 16S rRNA 서열을 사용하여 결정된 계통발생학적 관계를 도시하였다. 이웃-연결 계통발생학적 나무는 부르크홀데리아 피케티이(Burkholderia pickettii)를 근원으로 하고, 그의 개별 마디에서 부트스트랩 값 (100 반복 및 50% 초과를 기준으로 하여)을 제시하였다. 축척 막대는 뉴클레오티드당 0.02 치환을 나타내었다.
실시예 4
FERM BP-3421의 조작된 균주 #1을 사용한 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP1); 및 [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP2)의 발효, 추출 및 단리
단계1: 스플라이세오스타틴 생합성 유전자 클러스터에 대한 게놈 마이닝:
FERM BP-3421의 게놈을 차세대 기술 (454 및 일루미나(Illumina))을 사용하여 서열분석하였다. 스플라이세오스타틴에 대한 생합성 유전자 클러스터 (도 2)를 게놈 마이닝에 의해 DNA 서열로부터 추론하였으며 (검토를 위해 문헌 [Challis GL 2008 J Med Chem 51: 2618-2628] 참조), 이는 본 발명자들이 트랜스-아실트랜스퍼라제 (AT) 폴리케티드 신타제 (PKS)/비-리보솜 펩티드 신테타제 (NRPS) 하이브리드 경로를 확인하도록 하였다 (검토를 위해 문헌 [J Piel 2010 Nat Prod Rep 27:996-1047] 및 그의 참고문헌 참조). PKS 및 NRPS 유전자 녹아웃 돌연변이체는 스플라이세오스타틴 생합성에서 이들 유전자의 관여를 확인하면서 검출가능한 스플라이세오스타틴 생산이 없는 것을 나타내었다. 본 발명자들의 발견은 문헌 [Zhang F et al. (2011 J Am Chem Soc 133: 2452-62)]에 의해 보고된 것과 일치하였으며, 상기 JACS 논문에 도입된 유전자 용어를 하기에 사용하였다.
도 2는 스플라이세오스타틴에 대한 생합성 유전자 클러스터, 및 시토크롬 P450 Fr9R 및 Fe(II)/α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 Fr9P에 의해 촉매된 히드록실화 단계를 강조하는 제안된 생합성 경로이다. 상단에서의 화살표는 PKS-NRPS 유전자의 코딩 DNA 서열을 나타내고; 보조 유전자는 제시되지 않았다.
단계2: FERM BP-3421의 디옥시게나제 (fr9P) 녹아웃 돌연변이체 균주의 생성 (균주 #1)
유전자 대체 지점의 상류 및 하류에서 2개의 ~700-bp 길이의 DNA 단편을 주형으로서의 FERM BP-3421 게놈 DNA, 및 프라이머 쌍 P1_diox (TGG CGA ACA GAT CGA GTT TG) (서열 10) 및 P2_diox (CTT GCG GAG AAC TGT GAA TGC GCA ATA GAA GCG CTG TCA TGG AAT G) (서열 11), 및 P3_diox (CCG AAA AGT GCC ACC TGA CGT CTA AGA TAA CTC GTG GAT ATT CGG CAA G) (서열 12) 및 P4_diox (AGA ATC CCG CGA TCC CAA C) (서열 13)를 사용하여 PCR (Pfu 울트라™ 폴리머라제, 프로메가(Promega))에 의해 증폭시켰다; 밑줄한 염기는 테트라시클린 저항성 (tet) 마커에 대한 상동성 영역을 나타낸다. tet 마커를 주형으로서의 pEX18Tc (Schweizer HP 1998 Gene 212:77-86), 및 프라이머 쌍 Ptet_f (TTG CGC ATT CAC AGT TCT C) (서열 14) 및 Ptet_r (TCT 태그 ACG TCA GGT GGC AC) (서열 15)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 3개의 단편을 SOE-PCR (Pfu 울트라™ 폴리머라제, 프로메가 사용)에 의해 조립하고, pEX100T의 SmaI 부위 내로 라이게이션하여 (Schweizer HP & Hoang TT 1995 Gene 158:15-22) 플라스미드 pAE-PF12를 생성하였다. 　pAE-PF12를 이. 콜라이(E. coli) S17.1로부터의 접합에 의해 FERM BP-3421 내로 전달하였다. 테트라시클린 (25 μg/ml); 벡터 백본의 역-선별을 위한 수크로스 5%; 및 겐타마이신 (10 μg/ml)을 돌연변이체의 선별에 사용하여 접합 후에 이. 콜라이를 제거하였다. 　돌연변이체를 프라이머 쌍 P1_diox/P4_diox, P1_diox/Ptet_r, 및 TP1_pEX100T (GGA CGA ATC GAA CTC AGG AAC TTG) (서열 16) / TP2_pEX100T (CGA AGA GCG ATT GAG GAA AAG G) (서열 17)를 사용하여 3개의 개별 반응에서 콜로니 PCR (레드 택(RED Taq)®, 시그마(Sigma))에 의해 확인하였으며, 균주 #1을 제공하였다.
단계3: 조작된 균주 #1을 사용한 발효: 조작된 균주 #1을 30℃ 및 220 rpm에서 ~24시간 동안 테트라시클린 (25 mg/L)을 함유하는 시드 배지 (1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl) 중에서 배양하였다. 제2 시드 배양물을 10% (v/v)에서의 제1 시드 배양물과 함께 테트라시클린 (25 mg/L)을 함유하는 새로운 시드 배지를 접종함으로써 생성시키고, 220 rpm에서 ~24시간 동안 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 시드 배양물 850 ml를 사용하여 30-L 생물반응기 (바이오스타트(BIOSTAT)® C 플러스, 사토리우스 BBI 시스템즈(Sartorius BBI Systems)) 내에 함유된 생산 배지 (4% 글리세린, 2% 하이소이 소이펩톤, 0.2% 황산암모늄, 0.01% 황산마그네슘.6H2O, 0.2% CaCO3) 29 L를 접종하였다. 발효를 25℃에서 5일 동안 수행하였다. 초기 교반을 344 rpm에서 설정하고; 초기 기류를 1.3 slpm으로 설정하고; DO를 교반을 증가시키면서 3%에서 제어하였다.
단계4. 발효 브로쓰의 추출: 실시예 4의 단계 3로부터의 발효의 종결에서, 습윤 DIAION HP-20 수지 1.5 kg을 전체 브로쓰에 첨가하고, 혼합물을 밤새 진탕하였다. HP-20을 50μm-150μm 스테인레스 스틸 쐐기형 와이어 메쉬를 통해 여과에 의해 수집하였다. 화합물-결합 HP-20 수지를 에틸 아세테이트로 4회 추출하였다 (각 회 3 L, 45분 동안 진탕하면서). 이어서, 수지를 (2 L 메탄올로 1회 및 풍부한 DI 물로 3회) 세척하고, 수성 여과물 중에 여전히 잔류하는 화합물의 재포획을 위해 재사용하고, 이어서 상기 기재된 동일한 절차를 수행하였다. 합한 에틸 아세테이트 추출물로부터의 용매를 감압 하에 증발에 의해 제거하여 담황색 분말 (137 g)을 수득하였다.
단계 5: [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP1); 및 [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP2)의 단리: 실시예 4의 단계 4로부터의 추출물 1.7 g을 2:1 DMF/ACN (총 22 ml)의 혼합 용매 중에 용해시키고, 여과한 다음, 역상 HPLC (워터스 ODS-A 50 x 300 mm, 15 um, 120 A, 이동상 A: 물 중 0.02% AcOH, 이동상 B: 아세토니트릴 용매계 중 0.02% AcOH, 구배: 2분 동안 50% B, 18분에 걸쳐 75% B로; 2분 동안 100% B. 유량: 50 mL/분; 5회 반복 주사)에 의해 정제하였다. 13.5 및 18.0분의 체류 시간으로의 분획을 수집하고, 동결건조시켜 #NP1 (191 mg) 및 #NP2 (466 mg)를 각각 백색 분말로서 수득하였다.
#NP1.; HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.38분 (순도 98.5%)
#NP2.; HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.97분 (순도 96.5%)
실시예 5
FERM BP-3421의 조작된 균주 #2를 사용한 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP1)의 발효, 추출 및 단리
단계1: 조작된 균주 #2의 생성: 먼저, 벡터 mini-CTX1 (Hoang TT et al. 2000 Plasmid 43:59-72) 내의 tet 마커를 λ-적색-매개된 재조합에 의해 pCR2.1 (인비트로젠(Invitrogen))로부터 네오 (카나마이신 및 네오마이신 저항성)에 의해 대체하였다 (Datsenko KA & Wanner BL. 2000 Proc Natl Acad Sci U S A 97:6640-5). 사용된 프라이머는 P1_네오_pCR2.1 (GTT GGT TTG CGC ATT CAC AGT TCT CCG CAA GAA TTG ATT GCA AGG GCT GCT AAA GGA AG) (서열 18) 및 P2_네오_tet_CTX1_pCR2.1 (TCT TCC GCT TCC TCG CTC ACT GAC TCG CTG CGC TCG GTC ACG GAA ATG TTG AAT ACT CAT ACT C) (서열 19)이었다; 밑줄된 서열은 λ-적색-매개된 재조합에 대한 상동성 영역을 나타낸다. 수득한 벡터는 pAE-PF24로 명명하였다.
PBAD/araC 아라비노스-유도성 시스템을 주형으로서의 pKD46, 및 프라이머 쌍 P1_BADp_f (GCT CTA GAC ATC GAT TTA TTA TGA CAA CTT GAC, 밑줄된 XbaI 부위) (서열 20) 및 P2_BADp_r (CCC AAA AAA ACG GGT ATG G) (서열 21)을 사용하여 PCR (퓨전(Phusion)® 핫 스타트 폴리머라제, 핀자임즈(Finnzymes))에 의해 증폭시켰다. 스플라이세오스타틴 생합성 유전자 클러스터 내에 함유된 시토크롬 P450 유전자 (fr9R)를 위해 코딩된 유전자 (추정 RBS를 포함하지만 프로모터는 포함하지 않음)를 FERM BP-3421로부터의 게놈 DNA, 및 프라이머 쌍 P3_P450_BAD_f (CTA CTG TTT CTC CAT ACC CGT TTT TTT GGG GGG TTG TTG GTT TTT GAA ATT GC, 밑줄된 SOE-PCR에 대한 연장) (서열 22) 및 P4_P450_r (ATG GTG AAG CTT AAG TCG ACA ACC GGC ATT CC, 밑줄된 HindIII 부위) (서열 23)을 사용하여 PCR (퓨전® 핫 스타트 폴리머라제, 핀자임즈)에 의해 증폭시켰다. 이에 따라 수득한 2개의 단편을 SOE-PCR (퓨전® 핫 스타트 폴리머라제, 핀자임즈)에 의해 조립하고, 이어서 pAE-PF24의 SpeI 및 HindIII 부위로 라이게이션하여 pAE-PF29를 생성하였다. pAE-PF29를 이. 콜라이 S17.1로부터의 접합에 의해 조작된 균주 #1 내로 전달하였다. 카나마이신 (500 μg/ml); 및 겐타마이신 (10 ug/ml)을 돌연변이체의 선별에 사용하여 접합 후에 이. 콜라이를 제거하였다. 돌연변이체를 프라이머 세트 TP1_CTX1_마커 (GCA TTC ACA GTT CTC CGC AAG) (서열 24) 및 TP2_CTX1_마커 (CTC GCT CAC TGA CTC GCT G) (서열 25), 및 T3_mini-CTX1_f (GCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG) (서열 26) 및 MCS_mini-CTX1_r (CTA TAG GGC GAA TTG GGT AC) (서열 27)을 사용하여 2개의 콜로니 PCR 반응 (레드 택®, 시그마)에 의해 확인하였으며, 조작된 균주 #2를 제공하였다.
단계2: 조작된 균주 #2를 사용한 발효: 조작된 균주 #2를 30℃ 및 220 rpm에서 ~24시간 동안 테트라시클린 (25 mg/L)을 함유하는 시드 배지 (1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl) 중에서 배양하였다. 제2 시드 배양물을 10% (v/v)에서의 제1 시드 배양물과 함께 테트라시클린 (25 mg/L)을 함유하는 새로운 시드 배지를 접종함으로써 생성시키고, 220 rpm에서 ~24시간 동안 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 시드 배양물을 사용하여 2.5% (v/v)에서 배플이 없는 2.8 L 페른바흐 플라스크당 생산 배지 (4% 글리세린, 2% 하이소이 소이펩톤, 1.5% L-아라비노스, 0.2% 황산암모늄, 0.01% 황산마그네슘.6H2O, 0.2% CaCO3) 550 ml를 접종하였다. 발효물을 200 rpm에서 4일 동안 진탕하면서 25℃에서 인큐베이션하였다.
단계3. 발효 브로쓰의 추출: 실시예 5의 단계 2로부터의 발효의 종결에서, 습윤 DIAION HP-20 수지 100 g/L를 생산 발효물 ~6 L에 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 진탕하였다. HP-20을 50μm-150μm 스테인레스 스틸 쐐기형 와이어 메쉬를 통해 여과에 의해 수집하였다. 화합물-결합 HP-20 수지를 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다 (각 회 2 L). 보다 상세하게는, 수지를 카보이에 전달하고, 2 L 에틸아세테이트를 첨가하고, 1시간 동안 진탕하고, 50μm-150μm 스테인레스 스틸 쐐기형 와이어 메쉬를 통해 여과함으로써 각 추출을 수행하였다. 합한 에틸 아세테이트 추출물로부터의 용매를 감압 하에 증발에 의해 제거하여 담황색 조 추출물 (17.25 g)을 수득하였다.
단계 4: [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP1)의 단리, 실시예 5의 단계 3로부터의 추출물 0.12 g을 2:1 DMF/ACN (총 22 ml)의 혼합 용매 중에 용해시키고, 여과한 다음, 역상 HPLC (YMC ODS-A 30 x 250 mm, 10 um, 120 A, 이동상 A: 물 중 0.02% AcOH, 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% AcOH. 구배: 2분 동안 30% B, 18분에 걸쳐 100% B로; 2분 동안 100% B. 유량: 20 mL/분)에 의해 정제하였다. 15.0분의 체류시간으로의 분획을 수집하고, 동결건조시켜 #NP1 (73.6 mg)을 백색 분말로서 수득하였다.
#NP1.; HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.36분 (순도 92.5%)
실시예 6
FERM BP-3421의 조작된 균주 #3을 사용한 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-히드록시-7-메틸-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#NP12); 및 [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP2)의 발효, 추출 및 단리
Figure 112015053331353-pct00106
단계1: 조작된 균주 #3의 생성: 유전자 대체 지점의 상류 및 하류에서 2개의 ~700-bp 길이의 DNA 단편을 주형으로서의 FERM BP-3421 게놈 DNA, 및 프라이머 쌍 P1_P450 (GCA TCC AAT CAC TTG AAC AGG) (서열 28) 및 P2_P450 (CTT GCG GAG AAC TGT GAA TGC GCA AGC CAT CAT TCT CGA CAT TTC C) (서열 29), 및 P3_P450 (CCG AAA AGT GCC ACC TGA CGT CTA AGA AGA TTG TGA CGG TAC TGA AGC) (서열 30) 및 P4_P450 (AGA GAA CGA TCG CTC CAC AG) (서열 31)을 사용하여 PCR (Pfu 울트라™ 폴리머라제, 프로메가)에 의해 증폭시켰다; 밑줄된 염기는 테트라시클린 저항성 (tet) 마커에 대한 상동성 영역을 나타낸다. tet 마커를 주형으로서의 pEX18Tc (Schweizer HP 1998 Gene 212:77-86), 및 프라이머 쌍 Ptet_f (TTG CGC ATT CAC AGT TCT C) (서열 32) 및 Ptet_r (TCT 태그 ACG TCA GGT GGC AC) (서열 33)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 3개의 단편을 SOE-PCR (Pfu 울트라™ 폴리머라제, 프로메가 사용)에 의해 조립하고, pEX100T의 SmaI 부위 내로 라이게이션하여 (Schweizer HP & Hoang TT 1995 Gene 158:15-22) 플라스미드 pAE-PF11을 생성하였다. pAE-PF11을 이. 콜라이 S17.1로부터의 접합에 의해 FERM BP-3421 내로 전달하였다. 테트라시클린 (25 μg/ml); 벡터 백본의 역-선별을 위한 수크로스 5%; 및 겐타마이신 (10 μg/ml)을 돌연변이체의 선별을 위해 사용하여 접합 후에 이. 콜라이를 제거하였다. 돌연변이체를 프라이머 쌍 P1_P450/Ptet_r 및 TP1_pEX100T (GGA CGA ATC GAA CTC AGG AAC TTG) (서열 34) / TP2_pEX100T (CGA AGA GCG ATT GAG GAA AAG G) (서열 35)를 사용하여 2개의 콜로니 PCR (레드 택®, 시그마) 반응에서 확인하였으며, 균주 #3을 제공하였다.
단계2: 조작된 균주 #3을 사용한 발효: 조작된 균주 #3을 30℃ 및 220 rpm에서 ~24시간 동안 테트라시클린 (25 mg/L)을 함유하는 시드 배지 (1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl) 중에서 배양하였다. 제2 시드 배양물을 10% (v/v)에서의 제1 시드 배양물과 함께 테트라시클린 (25 mg/L)을 함유하는 새로운 시드 배지를 접종함으로써 생성시키고, 220 rpm에서 ~24시간 동안 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 시드 배양물을 사용하여 배플이 없는 2.8-L 페른바흐 플라스크 내에 함유된 2.5% (v/v)에서의 생산 배지 (4% 글리세린, 2% 하이소이 소이펩톤, 0.2% 황산암모늄, 0.01% 황산마그네슘.6H2O, 0.2% CaCO3) 400 ml를 접종하였다. 발효물을 200 rpm에서 5일 동안 진탕하면서 25℃에서 인큐베이션하였다.
단계3. 발효 브로쓰의 추출: 실시예 6의 단계 2로부터의 생산 배양물을 30분 동안 4,200 rpm에서 원심분리하여 세포를 제거하였다. 습윤 DIAION HP-20 수지 50 g을 상청액 (12.5% w/v)에 첨가하고, 혼합물을 200 rpm에서 1시간 동안 진탕하였다. 화합물-결합 HP-20을 원심분리에 의해 수집한 다음, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다 (각 추출의 경우에 250 ml). 합한 추출물을 MgSO4 (이어서 이를 와트만 종이를 사용하여 여과에 의해 제거함)로 건조시킨 후, 용매를 감압 하에 증발에 의해 제거하여 밝은 색상의 조 추출물을 수득하였다.
단계4: [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP2) 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-히드록시-7-메틸-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#NP12)의 단리: 실시예 6의 단계3으로부터의 조 추출물의 절반을 정제용, 정상 HPLC: (칼럼: 프린스턴 SFC 2-에틸피리딘, 250 × 21.2 mm, 5 μm; 이동상 A: 헵탄; 이동상 B: 에탄올 (변성). 구배 : 1.5분 동안 5% B, 8.5분에 걸쳐 100% B로, 2분 동안 100% B, 0.5분에 걸쳐 5% B로 및 2.5분 동안 5% B. 유량: 27 mL/분)에 의해 정제하였다. 6.58분 및 8.18분의 체류 시간으로의 분획을 수집하고, 동결건조시켜, #NP12 (163 mg, 89% 순도, 매우 밝은 황색빛 분말로서), 및 #NP2 (205 mg, 89% 순도, UV에 의함)를 각각 수득하였다.
#NP12: HPLC (프로토콜 P): 체류 시간 = 12.65분 (순도 89%); LC/MS: m/z 474.2 [M+H+-H2O]+ 및 514.2 [M+Na+]+
#NP2: HPLC (프로토콜 P): 체류 시간 = 12.46분 (순도 89%); LC/MS: m/z 520.2 [M+H+]+
단계 5: (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-히드록시-7-메틸-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#NP12)의 단리: 실시예 6의 단계 4로부터의 6.58-분 분획의 절반을 역상 HPLC: (칼럼: 페노메넥스 루나 C18, 150 × 21.2 mm, 5 μm; 이동상 A: 물; 이동상 B: 아세토니트릴. 구배: 1.5분 동안 20% B, 8.5분에 걸쳐 70% B로, 2분에 걸쳐 100% B로, 0.5분에 걸쳐 20% B로. 유량: 27 mL/분)에 의해 정제하였다. 체류 시간 8.25분으로의 분획을 수집하고, 동결건조시켜 #NP12 (28 mg)를 백색 분말로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00107
실시예 7
부르크홀데리아 종 MSMB 43을 사용한 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP1); [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#NP2)의 발효, 추출 및 확립 생산
단계 1: 부르크홀데리아 종 MSMB 43을 사용한 발효: 부르크홀데리아 종 (제안된 명칭 "부르크홀데리아 훔프티두엔시스(Burkholderia humptydooensis)") MSMB 43을 질병 관리 예방 센터(Centers for Disease Control and Prevention; CDC) 및 멘지스 보건 연구 대학(Menzies School of Health Research)으로부터 획득하였다. MSMB 43을 동결보존물로부터의 영양 한천 플레이트 상에서 배양하고, 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 한천 성장 배양물을 시드 배지 (1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl) 10 ml를 함유하는 25 × 150 mm 배양물 튜브에 접종하였다. 시드 배양물을 220 rpm에서 18-20시간 동안 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 시드 배양물을 2.5% (부피/부피)에서의 250 ml 에를렌마이어 플라스크당 생산 배지 (1% 가용성 전분, 1% 글리세린, 0.5% 글루코스, 1% 하이소이 소이펩톤, 0.5% 옥수수 침지액, 0.2% 황산암모늄, 0.006% 황산마그네슘.6H2O, 0.2% CaCO3, pH 7.0) 50 ml에 접종하였다. 발효물을 200 rpm에서 72시간 동안 진탕하면서 25℃에서 인큐베이션하였다.
단계 2: 발효물의 LC-MS 분석.
발효물을 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 상청액을 0.22 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 막을 통해 여과하였다. 각 상청액의 일부를 디메틸 술폭시드 (10:1)와 혼합하고, 액퀴티 UPLC (워터스) 기기: 칼럼: 엑스브리지(XBridge) C18, 4.6X150 mm, 3.5 uM 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배 12.0분에 걸쳐 5%에서 100% B로; 3.0분 동안 100% B (주입 부피: 5.0 uL)를 사용하여 LC-MS에 의해 분석하였다. 발효 제5일에, MSMB43은 체류 시간 및 질량 분광측정법 데이터에 의해 분명한 바와 같이 각각 150 mg/L 및 50 mg/L의 적정에서 NP1 및 NP2를 생산하였다.
NP1: m/z: 535.9 (M+H)+, 체류 시간: 13.31분
NP2: m/z: 519.9 (M+H)+, 체류 시간: 14.58분
합성 실험 절차
특히 산소- 또는 수분-민감성 시약 또는 중간체를 사용한 경우에, 실험은 일반적으로 불활성 분위기 (질소 또는 아르곤) 하에 수행하였다. 상업적 용매 및 시약, 예컨대 적절한 경우에는 무수 용매 (일반적으로, 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company) (위스콘신주 밀워키)로부터의 슈어-실(Sure-Seal)™ 제품)은 일반적으로 추가의 정제 없이 사용하였다. 질량 분광측정법 데이터는 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LCMS) 또는 대기압 화학적 이온화 (APCI)로부터 기록하였다. 핵 자기 공명 (NMR) 데이터에 대한 화학적 이동은 사용된 중수소화 용매로부터의 잔류 피크를 기준으로 하여 백만분율 (ppm, δ)로 표시하였다.
다른 실시예 또는 방법에서의 절차를 참고하는 합성의 경우에, 반응 프로토콜 (반응 시간 및 온도)이 달라질 수 있다. 일반적으로, 반응에 이어서 박층 크로마토그래피 LCMS 또는 HPLC를 수행하고, 적절한 경우에는 후처리에 적용시켰다. 정제는 실험에 따라 달라질 수 있다: 일반적으로, 용리액/구배에 사용된 용매 및 용매 비는 적절한 체류 시간을 제공하도록 선택하였다. 달리 명시되지 않는 한, 역상 HPLC 분획을 냉동건조/동결건조를 통해 농축시켰다. 중간체 및 최종 화합물을 (0℃) 또는 실온에서 질소 하에 밀폐된 바이알 또는 플라스크 내에 저장하였다.
화합물 명칭은 ACD 랩스(ACD Labs) 소프트웨어로 생성하였다.
분석에 사용된 HPLC 조건
프로토콜 AA 및 AB: 칼럼: 페노메넥스 루나 C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5μm; 이동상 A: 물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 5%에서 100% B로 (10분에 걸쳐)A 또는 (20분에 걸쳐)B; 유량: 0.75 mL/ 분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 215, 254 nm; 주입 부피 10 μL; 기기: HP 1100.
프로토콜 B: 칼럼: 워터스 선파이어 C18, 50x 4.6 mm, 5 μm; 이동상 A: 물 중 0.05% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.05% 포름산 (v/v); 구배: 4분에 걸쳐 5%에서 95% B로, 1분 동안 95% B에서 유지. 유량: 2.0 mL/분. 온도 : 실온; 검출: DAD 215 nm; 주입 부피 4 μL; 기기: 워터스 LC 및 ZQ 질량 분광계.
프로토콜 C: 칼럼: 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC HSS T3, C18, 2.1 x 50 mm, 1.7 μm; 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배: 0.1분에 걸쳐 5% B로, 2.5분에 걸쳐 5%에서 95% B로, 0.35분에 걸쳐 95% B로; 유량:　1.25 mL/분. 온도: 60℃; 검출: 200-450nm; MS (+) 범위 100-2000 달톤; 주입 부피: 5 μL; 기기: 워터스 액퀴티.
프로토콜 D: 칼럼: 워터스 액퀴티 UPLC HSS T3, C18, 2.1 x 50 mm, 1.7μm; 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배: 0.1분에 걸쳐 5% B로, 1.5분에 걸쳐 5%에서 95% B로, 0.35분에 걸쳐 95% B; 유량: 1.25 mL/분. 온도: 60℃; 검출: 200-450nm; MS (+) 범위 100-2000 달톤; 주입 부피: 5 μL; 기기: 워터스 액퀴티.
프로토콜 E: 칼럼: 페노메넥스 루나 C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 μm; 이동상 A:　물 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 23.5분에 걸쳐 0%에서 100% B로; 유량: 1.5 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 210 nm; 주입 부피: 10 μL; 기기: 애질런트(Agilent) 1100 HPLC
프로토콜 F: 칼럼: 페노메넥스 루나 C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 μm; 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배: 1.5분에 걸쳐 5% B, 8.5분에 걸쳐 5%에서 100% B로, 이어서 1분 동안 100% B; 유량: 0.75 mL/분. 온도: 45℃; 검출: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) 범위 150-2000 달톤; 주입 부피: 10 μL; 기기: 애질런트 1200 LCMS.
프로토콜 G: 칼럼: 아틀란티스(Atlantis) dC18, 50 x 4.6 mm, 5 μm; 이동상 A: 물 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 4.0분에 걸쳐 5%에서 95% B로, 선형; 이어서 1분에 걸쳐 95% B에서 유지. 유량:　2 mL/분. 온도: 실온; 검출: DAD 215 nm; MS (+) 범위 160 -1000 달톤; 주입 부피 4 uL; 기기: 워터스 996 PDA.
프로토콜 H: 칼럼: 페노메넥스 루나 C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 μm; 이동상 A: 물 ; 이동상 B: 아세토니트릴; 구배: 1.5분에 걸쳐 5% B, 8.5분에 걸쳐 5%에서 100% B로, 이어서 1분 동안 100% B; 유량: 0.75 mL/분. 온도: 25℃; 검출: DAD 215 nm, 254 nm; MS (+) 범위 150-2000 달톤; 주입 부피: 10 μL; 기기: 애질런트 1200 LCMS.
프로토콜 I: 칼럼: 엑스티메이트(Xtimate) C18, 2.1 x 30 mm, 3 μm; 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배 0.9분에 걸쳐 0%에서 60% B로, 0.6분에 걸쳐 60% B; 0.5분 동안 100% B; 유량: 1.2mL/분. 검출: DAD 220 nM; 온도: 25℃; 주입 부피: 1 μL; 기기: 애질런트.
프로토콜 J: 칼럼: 엑스티메이트 C18, 2.1 x 30 mm, 3 μm; 이동상 A: 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 0.9분에 걸쳐 10%에서 80% B로, 0.6분에 걸쳐 80% B; 0.5분 동안 100% B; 유량: 1.2 mL/분. 검출: DAD 220 nM; 온도: 25℃; 주입 부피: 1 μL; 기기: 애질런트.
프로토콜 K: 칼럼: 페노메넥스 루나 PFP, 100 x 3 mm, 5 μm; 이동상 A: 물 중 0.05% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.05% 포름산 (v/v); 구배: 9분에 걸쳐 5%에서 95% B로, 1분 동안 95% B에서 유지. 유량: 1.0 mL/분. 온도: 실온; 검출: DAD 215 nm; 주입 부피: 4 μL; 기기: 워터스 LC 및 ZQ 질량 분광계.
프로토콜 L: 칼럼: 페노메넥스 제미니(Gemini)-NX, C18, 4.6 mm x 50 mm, 110A, 3μm, 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배; 0.0 - 4.10분에 걸쳐 5%에서 100% B로; 4.10-4.50분 100% B에서 유지; 유량: 1.25 mL/분. 온도: 60℃; 검출: 200-450nm; MS (+) 범위 100-2000 달톤; 주입 부피: 5 μL; 기기: 워터스 액퀴티.
프로토콜 M: 칼럼: 페노메넥스 제미니-NX, 4.6 mm x 50 mm, C18, 3 μm, 110A; 이동상 A :　물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배: 4.10분에 걸쳐 5%에서 100% B로, 0.4분 동안 100% B에서 유지, 이어서 0.5분에 걸쳐 100%에서 5% B로; 유량: 1.5 mL/분. 온도: 60℃; 검출: HP1100 DAD (1315A), 200-450nm 스캔; 1 nm 간격; MS ESI(+/-), 100-1200 m/z 스캔, 0.5초 스캔 시간, 센트로이드; 주입 부피: 5 μL; 기기: HPLC 펌프, DAD 검출기, 칼럼 오븐 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) (델라웨어주 윌밍톤)로부터의); 오토샘플러 및 MS 검출기 (워터스 코포레이션(Waters Corporation) (매사추세츠주 밀포드)으로부터의); ELS 검출기 (배리안 메디칼 디바이시스(Varian medical devices) (캘리포니아주 팔로 알토)로부터의).
프로토콜 N: 칼럼: YMC ODS-A, 4.6 x 150 mm, 5 μm; 이동상 A: 물 중 0.01% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.01% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 15분에 걸쳐 10%에서 100% B로; 유량: 1.0 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 230 nm; 주입 부피: 5 μL; 기기: 애질런트 1100 HPLC.
프로토콜 O: 고해상도 전기분무 이온화 질량 스펙트럼 (HRESIMS)을 능동 차폐 9.4 테슬라(Tesla) 초전도 자석 (마그넥스 사이언티픽 리미티드, 영국), 외부 브루커(Bruker) 아폴로(APOLLO) ESI 소스, 및 신라드(Synrad) 50W CO2 CW 레이저를 장착한 브루커 (매사추세츠주 빌러리카) APEXII FTICR 질량 분광계를 사용하여 수득하였다. 샘플을 50 μL/분의 유량에서 1:1 (v:v) 물:아세토니트릴 (0.25% 포름산)로 이루어진 담체 용매를 사용하여 질량 분광계 내로 유동 주입하였다. 브루커 엑스마스(Bruker Xmass) 소프트웨어를 데이터 획득 및 분석을 위해 사용하였다. 질량 스펙트럼을 HP 조정 믹스를 사용하여 외부에서 보정하였다.
프로토콜 P: 칼럼: YMC ODS-A, 4.6 x 150 mm, 5 μm; 이동상 A: 물 중 0.01% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.01% 트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 19분에 걸쳐 10%에서 100% B로; 유량: 1.0 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 230 nm; 주입 부피: 5 μL; 기기:　애질런트 1100 HPLC.
프로토콜 Q: 칼럼: 칼럼: 애질런트 포로쉘 300SB-C8, 75 x 2.1 mm, 2.6 μm; 이동상 A:　물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배: 4분에 걸쳐 20% B에서 45% B로; 유량:　1.0 mL/분. 온도: 60℃; 검출: 220 nm; MS (+) 범위 400-2000Da; 주입 부피: 10 μL; 기기: 애질런트 1100 LC, 워터스 마이크로매스ZQ MS. 디컨볼루션을 MaxEnt1을 사용하여 수행하였다.
정제에 사용된 HPLC 조건
방법 A: 칼럼: 페노메넥스 제미니, C18, 30 x 100 mm, 5 μm; 이동상 A:　물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배:　가변적임, 15-20분에 걸쳐 A 중 B의 증가하는 구배; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 215 nm, 254 nm; 주입 부피: 가변적임; 기기: 길슨(Gilson).
방법 B*: 칼럼: YMC ODS- A, 30 x 250 mm, 10 μm; 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 가변적임, 15-20분에 걸쳐 A 중 B의 증가하는 구배; 유량: 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 230 nm; 주입 부피: 가변적임, 0.5-2 mL; 기기: 배리안 프로스타 모델 330 정제용 HPLC.
방법 C*: 칼럼: 페노메넥스 루나 C18(2), 150 x 21.2 mm, 5 μm; 이동상 A:물; 이동상 B: 아세토니트릴; 구배: 가변적임, 10분에 걸쳐 A 중 B의 증가하는 구배; 유량: 27 mL/분. 온도: 실온; 검출: DAD 210-360 nm; MS (+) 범위 150-2000 달톤; 기기: 워터스 프랙션링스(Waters FractionLynx) LCMS.
방법 D*: 칼럼: 워터스　선파이어(Sunfire), C18, 19x100 mm, 5 μm; 이동상 A:　물 중 0.05% 포름산 (v/v); 이동상 B:　아세토니트릴 중 0.05%　포름산 (v/v); 구배: 가변적임, 10-20분에 걸쳐 A 중 B의 증가하는 구배; 유량: 25 mL/분. 검출: DAD 215 nm MS (+) 범위 160-1000 달톤; 기기: 워터스 프랙션링스.
방법 E: 칼럼: 워터스　선파이어, C18, 19x100 mm, 5 μm; 이동상 A:　물 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (v/v); 이동상 B:　아세토니트릴 중 0.05%　트리플루오로아세트산 (v/v); 구배: 8.5분에 걸쳐 10에서 50% B로, 0.5분에 걸쳐 50에서 100% B로, 1분 동안 100% B에서 유지. 유량: 25 mL/분. 검출: DAD 215 nm MS (+) 범위 160-1000 달톤; 기기: 워터스 프랙션링스.
방법 F*: 칼럼 : 워터스 C18 델타 팩 (WAT011801), 300 X 50 mm, 15 μm; 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 가변적임, 15-20분에 걸쳐 A 중 B의 증가하는 구배; 유량: 50 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 230 nm; 주입 부피: 가변적임, 0.5-5 mL; 기기: 배리안 프로스타 모델 330 정제용 HPLC.
방법 G*: 칼럼: YMC ODS-A, 50 x 300 mm, 12 μm, 120 A. 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 3분 동안 40% B, 20분에 걸쳐 40-100% B 및 3분 동안 100% B. 유량; 20 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 230 nm; 주입 부피: 가변적임, 0.5-5 mL; 기기: 배리안 프로스타 모델 330 정제용 HPLC.
방법 H: 칼럼: 크로모리스 RP-18e 100-10 mm. 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 30분에 걸쳐 20-55% B, 4분에 걸쳐 55-100% B, 2분에 걸쳐 100-20% B 및 2분 동안 20% B. 유량; 2.5 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 230 nm; 주입 부피: 가변적임, 0.025-0.1 mL; 기기: 애질런트 1100 분석용 HPLC.
방법 I: 칼럼: C18 세미프렙 YMC-팩 ODS-A 250x10 mm (S-5 μm, 12 nm). 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 22분에 걸쳐 18-25% B, 1분에 걸쳐 25-95% B, 4분 동안 95% B, 1분에 걸쳐 95-18% B 및 6분 동안 18% B. 유량: 2.5 mL/분. 온도: 제어되지 않음. 검출: DAD 230 nm. 주입 부피: 가변적임, 0.025-0.1 mL. 기기: 애질런트 1200 분석용 HPLC.
방법 J: 칼럼: C18 세미프렙 YMC-팩 ODS-A 250x10 mm (S-5 μm, 12 nm). 이동상 A: 물 중 0.02% 아세트산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v); 구배: 30분에 걸쳐 20-30% B, 1분에 걸쳐 30-95% B, 4분 동안 95% B, 2분에 걸쳐 95-20% B 및 6분 동안 20% B. 유량: 2.5 mL/분. 온도: 제어되지 않음. 검출: DAD 230 nm. 주입 부피: 가변적임, 0.025-0.1 mL. 기기: 애질런트 1200 분석용 HPLC.
방법 K: 칼럼: 크로모리스 RP-18e 100-10 mm. 이동상 A: 물 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 (v/v); 구배: 20분에 걸쳐 30-65% B, 1분에 걸쳐 65-95% B, 2분에 걸쳐 95-30% B. 유량; 2.5 mL/분. 온도: 제어되지 않음; 검출: DAD 230 nm; 주입 부피: 가변적임, 0.025-0.1 mL; 기기: 애질런트 1200 분석용 HPLC.
일부 경우에, 정제 HPLC 조건에 대한 약간의 사소한 변경, 예컨대 비제한적으로 구배, 구배 길이 및 유량에서의 변화 (이는 기호 *에 의해 표시됨)가 이루어졌다.
일반적 절차
일반적 절차 A: 활성화된 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르의 제조.
Figure 112015053331353-pct00108
0℃에서 테트라히드로푸란 중 산의 0.1 M 용액에 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (2.2 당량)에 이어서 N-히드록시 숙신이미드 (2.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온되도록 하고, 교반하였다. 반응 진전을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였다; 반응은 통상적으로 1-72시간 이내에 완료되었다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 수득하였다.
일반적 절차 B: NHS 에스테르로부터의 아미드의 제조.
Figure 112015053331353-pct00109
0℃에서 테트라히드로푸란, N,N-디메틸포름아미드 또는 N,N-디메틸아세트아미드 중 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (1 당량) (0.1M)에 아민 (1 내지 10 당량)을 첨가하였다. 반응 진전을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였다; 반응은 통상적으로 1-72시간 이내에 완료되었다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적 아미드 생성물을 수득하였다.
일반적 절차 C: 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르의 제조
Figure 112015053331353-pct00110
0℃에서 테트라히드로푸란 중 산의 0.05M 용액에 DCC (1 당량)에 이어서 테트라히드로푸란 (0.3 M) 중에 용해시킨 펜타플루오로페놀 (2 내지 4 당량)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 교반하였다. 반응 진전을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였다; 반응은 통상적으로 1-48시간 이내에 완료되었다. 반응물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르를 수득하였다.
일반적 절차 D: NHS 에스테르로부터의 아미드의 제조를 위한 라이브러리 프로토콜. 아민 (1 당량)을 테트라히드로푸란 (1 mL, 0.04 M) 중에 용해시키고, N,N-디이소프로필에틸아민 (5 당량)을 첨가하고, 이어서 메탄올 (0.2 mL)을 첨가하였다. 이어서, 전체 용액을 테트라히드로푸란 (1 mL, 0.04 M) 중에 용해시킨 N-히드록시 숙신이미드 에스테르 (1 당량)의 냉각된 용액 (0℃)에 적가하였다. 반응물을 30분 동안 (0℃)에서 교반한 다음, 실온으로 가온되도록 하고, 72시간 이하 동안 교반하였다. 반응 진전을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였다; 반응은 통상적으로 1-72시간 이내에 완료되었다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하고, 목적 생성물이 존재하는 분획을 합하고, 동결건조시켜 표적 아미드를 수득하였다.
일반적 절차 E: NHS 에스테르의 계내 형성을 통한 아미드의 제조.
Figure 112015053331353-pct00111
테트라히드로푸란 또는 N,N-디메틸포름아미드, 또는 N,N-디메틸아세트아미드 중 산 (1 당량) (0℃ 또는 실온)의 용액 (0.08 M)에 DCC (2.2 당량)에 이어서 N-히드록시숙신이미드 (2.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 0℃에서 교반하거나 또는 실온으로 가온되도록 하고, LC/MS에 의한 분석이 대부분의 출발 산이 소모된 것으로 나타날 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 재냉각시키고, 아민 (1 내지 20 당량)을 첨가하고, 실온으로 가온하고, 교반하였다. 반응 진전을 LC-MS (또는 HPLC 또는 TLC)에 의해 모니터링하였다; 반응은 통상적으로 1-72시간 이내에 완료되었다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적 아미드를 수득하였다.
일반적 절차 F: NHS 에스테르로부터의 아미드의 제조. 메탄올 (0.2 mL) 중 아민 (또는 아민-산 염) (1.0 당량) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (5당량)의 혼합물을 15분 동안 교반하고, 생성된 용액을 테트라히드로푸란 (1.0 mL)중 NHS 에스테르 (1.0 당량)의 용액으로 옮겼다. 반응물을 LC/MS에 의한 분석이 대부분의 NHS-에스테르 출발 물질이 소모된 것으로 나타날 때까지 추가 아민 (1-3 당량)을 첨가하면서 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피에의해 정제하여 목적 아미드 생성물을 수득하였다.
실시예 A1
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 #B1의 제조.
Figure 112015053331353-pct00112
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 #B1의 합성. 테트라히드로푸란 (2 mL, 0.096 M) 중 #NP1 (103 mg, 0.192 mmol, 1 당량)의 냉각된 (0℃) 용액에 DCC (87.1 mg, 0.422 mmol, 2.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 15분 동안 교반하였다. N-히드록시숙신이미드 (48.6 mg, 0.422 mmol, 2.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 (0℃)에서 15분 동안 교반하고, 실온으로 가온시키고, 72시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 중압 역상 C18 크로마토그래피 (구배: 아세토니트릴 중 5%에서 90% 물, 각각의 상에서 0.02% 아세트산 포함)에 의해 정제하였다. 목적 생성물이 존재하는 분획을 동결건조시켜 #B1을 고체로서 수득하였다. 수율: 66.6 mg, 0.103 mmol, 54%.
Figure 112015053331353-pct00113
실시예 A2
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B2)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00114
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B2)의 합성. 테트라히드로푸란 (6 mL, 0.13 M) 중 #NP2 (430 mg, 0.828 mmol, 1 당량)의 냉각된 (0℃) 용액에 DCC (376 mg, 1.82 mmol, 2.2 당량)에 이어서 N-히드록시숙신이미드 (210 mg, 1.82 mmol, 2.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온되도록 하였다. 18시간 후, 백색 고체를 여과하고, 여과물을 황색 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B2를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 204 mg, 0.331 mmol, 40%.
Figure 112015053331353-pct00115
실시예 A3
펜타플루오로페닐 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B3)의 합성
Figure 112015053331353-pct00116
단계 1. 펜타플루오로페닐 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B3)의 합성. 테트라히드로푸란 (0.7 mL, 0.06 M) 중 #NP1 (25 mg, 0.047 mmol, 1 당량)의 용액에 DCC (9.7 mg, 0.047 mmol, 1 당량)에 이어서 테트라히드로푸란 (0.3 mL, 0.3M) 중 펜타플루오로페놀 (17.3 mg, 0.094 mmol, 2 당량)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 여과하고, 필터 케이크를 아세토니트릴로 헹구었다. 합한 여과물을 진공 하에 농축시키고, 조 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B3을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 21.6 mg, 0.030 mmol, 65%.
Figure 112015053331353-pct00117
실시예 A4
(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B5)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00118
단계 1. [(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B4)의 합성. 테트라히드로푸란/물 (1.5 mL, 0.012 M)의 1:1 혼합물 중에 용해시킨 #NP1 (10.2 mg, 0.019 mmol, 1 당량)의 용액에 수산화리튬 (6 mg, 0.25 mmol, 13 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 1/2시간 동안 교반하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B4를 고체로서 수득하였다. 수율: 2 mg, 0.004 mmol, 20%.
Figure 112015053331353-pct00119
단계 2. (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B5)의 합성. 실시예 A1에서 #B4를 #NP1 대신에 사용한 것을 제외하고는 #B1의 일반적 합성 절차에 따라 제조하였다. 조 반응물을 진공 하에 농축시킨 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B5를 고체로서 수득하였다. 수율: 16.2 mg, 0.027 mmol, 64%.
Figure 112015053331353-pct00120
실시예 A5
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B6)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00121
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B6)의 합성. 히드라진 (테트라히드로푸란 중 1M 용액 0.615 mL, 0.615 mmol, 5 당량)을 디클로로메탄 (3 mL, 0.04M) 중에 용해시킨 #B1 (78 mg, 0.12 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 추가의 히드라진 (테트라히드로푸란 중 1M 용액 0.615 mL, 0.615 mmol, 5 당량)을 첨가하였다. 1시간 후, 반응물을 물로 희석하고, 디클로로메탄 (3 X)으로 추출하고, 유기 층을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B6을 고체로서 수득하였다. 수율: 43 mg, 58%.
Figure 112015053331353-pct00122
실시예 A6
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B7)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00123
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B7)의 합성. 테트라히드로푸란 (4 mL, 0.07 M) 중 #NP2 (140 mg, 0.269 mmol, 1 당량)의 용액에 DCC (122 mg, 0.592 mmol, 2.2 당량)에 이어서 N-히드록시 숙신이미드 (68.1 mg, 0.592 mmol, 2.2 당량)를 첨가하였다. 18시간 후, 히드라진 (테트라히드로푸란 중 1M 용액 0.576 mL, 0.576 mmol, 2.1 당량)을 첨가하였다. 30분 후, 추가의 히드라진 (테트라히드로푸란 중 1M 용액 1 mL, 1 mmol, 3.7 당량)을 첨가하였다. 10분 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 C*)에 의해 정제하여 #B7을 고체로서 수득하였다. 수율: 78 mg, 0.145 mmol, 54%. HPLC (프로토콜 F): m/z 534.4 [M+H]+, 체류 시간 = 8.143분 (순도 100%).
실시예 A7
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[(2-히드록시에틸)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B8), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B9), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-옥소-2-[(4-술파모일벤질)아미노]에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B10), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-아미노벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B11), 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(피페라진-1-일)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B12), 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B13), 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(히드록시아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트(#B14)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00124
단계 1a. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[(2-히드록시에틸)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B8)의 합성. 일반적 절차 D에 따라, 2-아미노에탄올 (2.0 mg, 0.033 mmol, 1.03 당량), 테트라히드로푸란 (1 mL), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.028 mL, 0.160 mmol, 5 당량), 메탄올 (0.2 mL) 및 #B1 (20 mg, 0.032 mmol, 1 당량)로부터, 조 목적 물질을 합성하였으며, 이를 역상 크로마토그래피 (방법 D*)에 의해 정제하여 #B8을 고체로서 수득하였다. 수율: 17.6 mg, 0.031 mmol, 97%. HPLC (프로토콜 B): m/z 579.6 [M+H]+, 체류 시간 = 2.00분 (순도 100%).
단계 1b. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B9)의 합성. 테트라히드로푸란 (1 mL, 0.024 M) 중에 용해시킨 #B1 (15 mg, 0.024 mmol, 1 당량)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 M 용액 0.069 mL, 0.480 mmol, 20 당량)를 첨가하였다. 3 1/2시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하고, 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 C*)에 의해 정제하여 #B9를 고체로서 수득하였다. 수율: 6 mg, 0.012 mmol, 50%.
Figure 112015053331353-pct00125
단계 1c. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-옥소-2-[(4-술파모일벤질)아미노]에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B10)의 합성. 일반적 절차 D에 따라, 4-(아미노메틸)벤젠술폰아미드, 히드로클로라이드 염 (9.2 mg, 0.041 mmol, 1 당량), 테트라히드로푸란 (1 mL), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.035 mL, 0.200 mmol, 5 당량), 메탄올 (0.2 mL) 및 #B1 (25 mg, 0.040 mmol, 1 당량)로부터 조 목적 물질을 합성하였으며, 이를 역상 크로마토그래피 (방법 D*)에 의해 정제하여 #B10을 고체로서 수득하였다. 수율: 15.5 mg, 0.022 mmol, 55%.
Figure 112015053331353-pct00126
단계 1d. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-아미노벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B11)의 합성. 일반적 절차 D에 따라, 4-(아미노메틸)아닐린 (3.9 mg, 0.032 mmol, 1 당량), 테트라히드로푸란 (1 mL), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.011 mL, 0.064 mmol, 2 당량), 메탄올 (0.2 mL) 및 #B1 (20 mg, 0.032 mmol, 1 당량)로부터 조 목적 물질을 합성하였으며, 이를 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B11을 고체로서 수득하였다. 수율: 17.6 mg, 0.027 mmol, 86%.
Figure 112015053331353-pct00127
단계 1e. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(피페라진-1-일)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B12). 테트라히드로푸란 (0.24 mL, 0.048 M) 중에 용해시킨 #B1 (15.5 mg, 0.024 mmol, 1 당량)의 용액에 피페라진 (2.5 mg, 0.029 mmol, 1.2 당량)을 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 물로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 합한 유기부를 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B12를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8.2 mg, 0.012 mmol, 52%.
Figure 112015053331353-pct00128
단계 1f. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B13). 테트라히드로푸란 (0.500 mL, 0.06 M) 중에 용해시킨 #B1 (18.8 mg, 0.03 mmol, 1 당량)의 용액에 1-메틸피페라진 (3.6 mg, 0.036 mmol, 1.2 당량)을 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 물로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 합한 유기부를 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B13을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 11.6 mg, 0.017 mmol, 57%.
Figure 112015053331353-pct00129
단계 1g. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(히드록시아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B14). 테트라히드로푸란 (0.450 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드 (0.175 mL) 중에 용해시킨 #B1 (30.7 mg, 0.049 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (32 mg, 0.245 mmol, 5 당량) 및 히드록실아민 히드로클로라이드 (10.6 mg, 0.152 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3 X)로 추출하고, 합한 유기부를 물로 다시 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B14를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 11.8 mg, 0.021 mmol, 43%.
Figure 112015053331353-pct00130
실시예 A8
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B15)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00131
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B15)의 합성. 테트라히드로푸란 (3 mL, 0.06 M) 중에 용해시킨 #B2 (108 mg, 0.175 mmol, 1 당량)의 용액에 암모니아 (메탄올 중 7 M 용액 0.500 mL, 3.5 mmol, 20 당량)를 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 용매를 진공 하에 제거하고, 조 목적 물질을 중압 역상 C18 크로마토그래피 (구배: 아세토니트릴 중 0%에서 90% 물, 각각의 상에서 0.02% 아세트산 포함)의해 정제하여 #B15를 고체로서 수득하였다. 수율: 23.9 mg, 0.045 mmol, 26%.
Figure 112015053331353-pct00132
실시예 A9
[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B16), 및 (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B17)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00133
단계 1. [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B16)의 합성. 테트라히드로푸란/물 (3 mL, 0.016 M)의 1:1 혼합물 중에 용해시킨 #NP2 (25 mg, 0.048 mmol, 1 당량)의 용액에 수산화리튬 (15 mg, 0.63 mmol, 13 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B16을 고체로서 수득하였다. 수율: 17 mg, 0.035 mmol, 74%.
Figure 112015053331353-pct00134
단계 2. (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B17)의 합성. 실시예 A1에서 #B16을 #NP1 대신에 사용한 것을 제외하고는 #B1의 일반적 합성 절차에 따라 제조하였다. 조 반응물을 진공 하에 농축시킨 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B17을 고체로서 수득하였다. 수율: 28 mg, 0.043 mmol, 43%
Figure 112015053331353-pct00135
실시예 A10
4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐리덴)에틸]페녹시}부탄산 (#B18), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-4-옥소부톡시}페닐)에틸리덴]히드라지닐}-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B19)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00136
단계 1. 4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐리덴)에틸]페녹시}부탄산 (#B18)의 합성. 에탄올 (1 mL, 0.06 M) 중 #B7 (35 mg, 0.066 mmol, 1 당량)의 용액에 4-(4-아세틸페녹시)부탄산 (73.3 mg, 0.330 mmol, 5 당량)에 이어서 빙초산 (0.250 mL)을 첨가하고, 반응물을 37℃로 가열하였다. 3 1/2시간 후, 반응물을 여과하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B18을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 25.5 mg, 0.034 mmol, 52%. LCMS (프로토콜 D); m/z 737.38 [M+H]+, 체류 시간 = 0.88분.
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-4-옥소부톡시}페닐)에틸리덴]히드라지닐}-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B19)의 합성. 테트라히드로푸란 (0.7 mL, 0.049 M) 중에 용해시킨 #B18 (25 mg, 0.034 mmol, 1 당량)의 용액에 DCC (15.5 mg, 0.075 mmol, 2.2 당량)에 이어서 N-히드록시 숙신이미드 (8.60 mg, 0.075 mmol, 2.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B19를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 13 mg, 0.015 mmol, 46%. LCMS (프로토콜 D); m/z 835.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.92분.
실시예 A11
4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐리덴)에틸]페녹시}부탄산 (#B20), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-4-옥소부톡시}페닐)에틸리덴]히드라지닐}-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B21)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00137
단계 1. 4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐리덴)에틸]페녹시}부탄산 (#B20)의 합성. 에탄올 (0.500 mL, 0.06 M) 중 #B6 (18.1 mg, 0.033 mmol, 1 당량)의 용액에 4-(4-아세틸페녹시)부탄산 (36.7 mg, 0.165 mmol, 5 당량)에 이어서 빙초산 (0.125 mL)을 첨가하고, 반응물을 37℃로 가열하였다. 1시간 후, 반응물을 여과하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B20을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 24.9 mg, 0.028 mmol, 85%. LCMS (프로토콜 C); m/z 754.5 [M+H]+, 체류 시간 = 1.47분.
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-4-옥소부톡시}페닐)에틸리덴]히드라지닐}-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B21)의 합성. 테트라히드로푸란 (0.550 mL, 0.05 M) 중에 용해시킨 #B20 (21.3 mg, 0.028 mmol, 1 당량)의 용액에 DCC (13.5 mg, 0.062 mmol, 2.2 당량)에 이어서 N-히드록시 숙신이미드 (7.3 mg, 0.062 mmol, 2.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 5시간 동안 교반하고, 추가의 DCC (5 mg, 0.022 mmol, 0.8 당량)에 이어서 N-히드록시 숙신이미드 (5 mg, 0.042 mmol, 1.5 당량)를 첨가하였다. 18시간 후, 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B21을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 11 mg, 0.013 mmol, 47%.
Figure 112015053331353-pct00138
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-(히드록시아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B22)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00139
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-(히드록시아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B22)의 합성. 테트라히드로푸란 (1.8 mL) 및 N,N-디메틸포름아미드 (0.600 mL) 중에 용해시킨 #B2 (100.8 mg, 0.175 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (114 mg, 0.875mmol, 5 당량) 및 히드록실아민 히드로클로라이드 (10.6 mg, 0.152 mmol, 3 당량)를 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 반응물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3x)로 추출하고, 합한 유기부를 물로 다시 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 중압 역상 C18 크로마토그래피 (구배: 아세토니트릴 중 10%에서 100% 물, 각각의 상에서 0.02% 아세트산 포함)에 의해 정제하여 #B22를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 68 mg, 0.127 mmol, 73%.
Figure 112015053331353-pct00140
실시예 A12
N-[3-(2-{2-[(브로모아세틸)아미노]에톡시}에톡시)프로파노일]-D-발릴-N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]페닐}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-D-오르니틴아미드 (#B27)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00141
단계 1. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B23)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2 mL, 0.16 M) 중 tert-부틸 (4-아미노벤질)카르바메이트 (75.4 mg, 0.339 mmol, 1.3 당량)의 용액에 2,6-디메틸피리딘 (140 mg, 1.3 mmol, 5 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (169 mg, 1.3 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (HOAt, 71.1 mg, 0.522 mmol, 2 당량)을 5분 동안 교반하였다. 전체 반응 혼합물을 N,N-디메틸포름아미드 (2 mL, 0.13 M) 중 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (200 mg, 0.261 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하고, 반응물을 50℃로 5시간 동안 가열하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 중압 역상 C18 크로마토그래피 (구배: 아세토니트릴 중 10%에서 100% 물, 각각의 상에서 0.02% 트리플루오로아세트산 포함)에 의해 정제하여 #B23을 고체로서 수득하였다. 수율: 40 mg, 0.047 mmol, 18%.
단계 2. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[4-(아미노메틸)페닐]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드, 디 트리플루오로아세트산 염 (#B24)의 합성. 디클로로메탄 (2 mL, 0.023 M) 중 #B23 (40 mg, 0.047 mmol, 1 당량)의 현탁액에 디클로로메탄/ 트리플루오로아세트산의 1:1 용액 (2 mL)을 첨가하였다. 45분 후, 반응물을 진공 하에 오렌지색 검 #B24로 농축시키고, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. 수율: 46 mg (가정된 정량적 수율). LCMS (프로토콜 D): m/z 750.4 [M+H]+, 체류 시간 = 0.73분.
단계 3. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-발릴-N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]페닐}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-D-오르니틴아미드 (#B25)의 합성. 테트라히드로푸란 (1 mL, 0.047 M) 중 #B24 (46 mg, 0.047 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (12.8 mg, 0.017 mmol, 2.1 당량)을 첨가하였다. 이어서, 전체 혼합물을 테트라히드로푸란 (1 mL) 중 #B1 (29.7 mg, 0.047 mmol, 1 당량)의 용액에 적가하였다. 18시간 후, 메탄올 (0.4 mL)을 첨가하였다. 48시간 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 조 생성물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B25를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 12.2 mg, 0.009 mmol, 20%. HPLC (프로토콜 AA): 체류 시간 = 9.140 (순도 =89%). LCMS (프로토콜 D): m/z 1268.7 [M+H]+, 체류 시간 = 0.92분.
단계 4. D-발릴-N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]페닐}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-D-오르니틴아미드 (#B26)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.3 mL, 0.3 M) 중 #B25 (12 mg, 0.009 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘 (N,N-디메틸포름아미드 1 mL 중 원액 0.050 mL의 0.2 mL)을 첨가하였다. 30분 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하고, 목적 생성물이 존재하는 분획을 동결건조시켜 #B26을 고체로서 수득하였다. 수율: 6.6 mg, 0.006 mmol, 70%. HPLC (프로토콜 AA): 체류 시간 = 6.957 (순도 =89%). LCMS (프로토콜 D): m/z 1045.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.69분.
단계 5. N-[3-(2-{2-[(브로모아세틸)아미노]에톡시}에톡시)프로파노일]-D-발릴-N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]페닐}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-D-오르니틴아미드 (#B27)의 합성. 테트라히드로푸란 (0.6 mL, 0.01 M) 중 #B26 (6 mg, 0.006 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (원액 [1 mL 테트라히드로푸란 중에 0.01 mL N,N-디이소프로필에틸아민을 용해시킴으로써 제조됨] 0.25 mL, 0.012 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반하였다. 전체 혼합물을 2-브로모-N-[2-(2-{3-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-3-옥소프로폭시}에톡시)에틸]아세트아미드 (2.4 mg, 0.006 mmol, 1 당량)의 냉각된 (0℃) 용액에 적가하였다. 반응물을 (0℃)에서 5분 동안 교반한 다음, 실온으로 가온되도록 하였다. 16시간 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B27을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.4 mg, 0.001 mmol, 20%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1348.7 [M+Na]+, 체류 시간 = 0.77분.
실시예 A13
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-({4-[(3-{2-[(N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}글리실)아미노]페닐}프로파노일)술파모일]벤질}아미노)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B37)의 제조
Figure 112015053331353-pct00142
단계 1. 메틸 (2E)-3-(2-{[N-(tert-부톡시카르보닐)글리실]아미노}페닐)프로프-2-에노에이트 (#B28)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (350 mL) 중 N-(tert-부톡시카르보닐)글리신 (13.4 g, 77.1 mmol, 1 당량), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (22.1 g, 115.7 mmol, 1.5 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (11.4 g, 84.8 mmol, 1.1 당량), 4-(디메틸아미노)피리딘 (0.9 g, 7.4 mmol, 0.10 당량)의 용액에 실온에서 메틸 (2E)-3-(2-아미노페닐)프로프-2-에노에이트 (15 g, 84.7 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 반응물을 50℃로 가온시키고, 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 물 (400 mL)로 희석하고, 시트르산 (200 mL 포함)으로 세척하고, 에틸 아세테이트 (300 mL X 3)로 추출하였다. 유기 층을 염수 (150 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 8:1에서 1:1로부터의 석유 에테르: 에틸 아세테이트로 용리시키면서 정제하여 화합물 #B28 (20 g, 71%)을 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00143
단계 2. 메틸 3-(2-{[N-(tert-부톡시카르보닐)글리실]아미노}페닐)프로파노에이트 (#B29)의 합성. 에틸 아세테이트 (350 mL) 및 메탄올 (300 mL) 중 화합물 #B28 (20 g, 59.8 mmol, 1 당량) 및 Pd/C (2.0 g)의 현탁액을 진공 하에 탈기하고, H2로 여러 번 퍼징하였다. 반응 혼합물을 H2 (30 Psi) 하에 실온에서 9시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트 (100 mL)로 세척하였다. 여과물을 증발 건조시켜 화합물 #B29를 오일로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다: 수율 (20.75 g, 가정된 정량).
Figure 112015053331353-pct00144
단계 3. 3-(2-{[N-(tert부톡시카르보닐)글리실]아미노}-페닐)프로판산 (#B30)의 합성. 테트라히드로푸란 (200 mL) 중 #B29 (20.75 g, 59.8 mmol, 1 당량)의 용액에 물 (155 mL) 중 수산화나트륨 (12.24 g, 0.306 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물 pH를 시트르산에 의해 pH 5~6으로 조정하고, 에틸 아세테이트 (400 mL X 2)로 추출하였다. 유기 층을 염수 (150 mL X 2)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켜 #B30을 고체로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다. 수율: 21.5 g (가정된 정량).
Figure 112015053331353-pct00145
단계 4. 3-[2-(글리실아미노)페닐]프로판산 (#B31)의 합성. 에틸 아세테이트 (100 mL) 중 #B30 (10 g, 31.1 mmol, 1 당량)의 용액에 HCl/디옥산 (70 mL)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반한 다음, 농축 건조시켰다. 잔류물을 tert-부틸 메틸 에테르 (50 mL)로부터 재결정화하여 #B31을 고체 (5.9 g, 26.5 mmol, 85.5%, 3 단계에 걸쳐)로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00146
단계 5. 3-(2-{[N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)글리실]아미노}페닐)프로판산 (#B32)의 합성. 테트라히드로푸란 (25 mL) 및 물 (10 mL) 중 #B31 (1.11 g, 4.98 mmol, 1 당량) 및 중탄산나트륨 (528 mg, 7.47 mmol, 1.5 당량)의 용액에 테트라히드로푸란 (45 mL) 및 1,2-디메톡시에탄 (10 mL) 중 9H-플루오렌-9-일메틸 {6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}카르바메이트 (2.7 g, 5.98 mmol, 1.2 당량)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물 pH를 시트르산에 의해 pH 5~6으로 조정하고, 디클로로메탄 (100 mL X 2)으로 추출하였다. 유기 층을 염수 (100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 100:1에서 10:1의 디클로로메탄: 메탄올로 용리시키면서 정제하여 #B32 (1.1 g, 1.97 mmol, 39.7%)를 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00147
단계 6. 9H-플루오렌-9-일메틸 {6-[(2-{[2-(3-{[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)술포닐]아미노}-3-옥소프로필)페닐]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-6-옥소헥실}카르바메이트 (#B33)의 합성. 디클로로메탄 (30 mL) 중 #B32 (900 mg, 1.62 mmol, 1 당량) 및 tert-부틸 (4-술파모일벤질)카르바메이트 (787 mg, 2.59 mmol, 1.6 당량), 4-(디메틸아미노)피리딘 (198 mg, 1.62 mmol, 1 당량), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (369 mg, 1.2 mmol, 0.7 당량)의 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물 pH를 시트르산에 의해 pH 5~6으로 조정하고, 디클로로메탄 (30 mL X 2)으로 추출하였다. 유기 층을 염수 (100 mL)로 세척하고, 황산나트륨상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 100:1에서 20:1의 디클로로메탄: 메탄올로 용리시키면서 정제하여 #B33을 고체 (800 mg, 0.972 mmol, 60.0%)로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00148
단계 7. 9H-플루오렌-9-일메틸 (6-{[2-({2-[3-({[4-(아미노메틸)페닐]술포닐}아미노)-3-옥소프로필]페닐}아미노)-2-옥소에틸]아미노}-6-옥소헥실)카르바메이트 (#B34)의 합성. 디클로로메탄 (3 mL, 0.02 M) 중 (#B33) (52.6 mg, 0.063 mmol, 1 당량)의 현탁액에 트리플루오로아세트산 (0.6 mL)을 첨가하고, 2시간 동안 교반한 다음, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴 (3X)과 공비혼합시켜 #B34 (45.7 mg, 0.063 mmol, 가정된 정량)를 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 후속 단계에 그대로 사용하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 726.3 [M+H]+, 체류 시간 = 0.73분.
단계 8. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[3-(2-{[N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)글리실]아미노}페닐)프로파노일]술파모일}벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B35)의 합성. 테트라히드로푸란 (0.5 mL, 0.12 M) 중 #B34 (45.7 mg, 0.063 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (24.4 mg, 0.189 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 전체 반응 혼합물을 테트라히드로푸란 (0.5 mL) 중 #B1 (40 mg, 0.063 mmol, 1 당량)의 냉각된 (0℃) 용액에 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온되도록 하였다. 1시간 후, 반응물을 진공 하에 농축시켜 #B35 (55 mg, 0.053 mmol, 70%)를 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 후속 단계에 그대로 사용하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1243.6 [M+H]+, 체류 시간 = 0.95분.
단계 9. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[3-(2-{[N-(6-아미노헥사노일)글리실]아미노}페닐)프로파노일]술파모일}벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 포르메이트 염 (#B36)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 중 #B35 (55 mg, 0.053 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘 (원액 [1 mL N,N-디메틸포름아미드 중에 0.05 mL를 용해시킴으로써 제조됨] 0.2 mL, 0.106 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 30분 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B36을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 30 mg, 0.027 mmol, 52%.
Figure 112015053331353-pct00149
단계 10. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-({4-[(3-{2-[(N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}글리실)아미노]페닐}프로파노일)술파모일]벤질}아미노)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B37)의 합성. 테트라히드로푸란 중 #B36 (20 mg, 0.018 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (9.8 mg, 0.076 mmol, 4.2 당량) 및 메탄올 (0.1 mL)을 첨가하였다. 전체 혼합물을 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 (4.2 mg, 0.018 mmol, 1 당량)의 냉각된 (0℃) 용액에 첨가하고, 0℃에서 5분 동안 교반한 다음, 실온으로 가온되도록 하였다. 18시간 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B37을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.8 mg, 0.003 mmol, 18%.
Figure 112015053331353-pct00150
실시예 A14
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B40)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00151
단계 1. (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B39)의 합성. 4:1 테트라히드로푸란:물 (2.2 mL) 중 #B15 (38 mg, 0.075 mmol, 1 당량)의 용액에 수산화리튬 (15.6 mg, 0.652 mmol, 8.7 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물로 세척하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (3X)로 추출하고, 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B39를 고체로서 수득하였다. 수율: 16.7 mg, 0.035 mol, 47%.
Figure 112015053331353-pct00152
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 #B40의 합성: 디클로로메탄 (3 mL) 중 #B39 (106 mg, 0.222 mmol, 1 당량)의 용액에 트리에틸아민 (79 mg, 0.777 mmol, 3.5 당량), 4-N,N'-디메틸아미노 피리딘 (18.9 mg, 0.155 mmol, 0.7 당량) 및 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (207 mg, 0.666 mmol, 3 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이 혼합물의 1/5에 피페리딘 (18.9 mg, 0.222 mmol, 1 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 D*)에 의해 정제하여 #B40을 수득하였다. 수율 2.7 mg, 0.021 mmol, 9.5%. HPLC (프로토콜 B) m/z 588.4 [M+H]+, 체류 시간 = 2.82분 (순도= 100%).
실시예 A15
N-[3-(2-{2-[(브로모아세틸)아미노]에톡시}에톡시)프로파노일]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드(#B43)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00153
단계 1. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B41)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2.6 mL) 중 #B7 (56 mg, 0.1 mmol, 1 당량)의 용액에 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (FMocValCitPABC-PNP, WO04010957, 121 mg, 0.15 mmol, 1.5 당량), N,N'-디이소프로필에틸아민 (56 mg, 0.4 mmol, 4.0 당량), 2,6-디메틸피리딘 (45 mg, 0.4 mmol, 4.0 당량,) 및 3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-올 (14.3 mg, 0.105 mmol, 1.05 당량)을 첨가하였다. 50℃에서 1.5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 조 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B41을 고체로서 수득하였다. 수율: 72 mg, 0.06 mmol, 59%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1183.5 [M+Na]+, 체류 시간 = 0.95분.
단계 2. L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B42)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.7 mL) 중 #B41 (50 mg, 0.043 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘 (66 mg, 0.78 mmol, 20 당량)을 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 조 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B42를 수득하였다. 수율: 31 mg, 0.033 mmol, 76%. LCMS (프로토콜 D): m/z 939.3 [M+H]+, 체류 시간 = 0.66분.
단계 3. N-[3-(2-{2-[(브로모아세틸)아미노]에톡시}에톡시)프로파노일]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5 일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B43)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 #B42 (10 mg, 0.011 mmol, 1 당량)의 용액에 2-브로모-N-[2-(2-{3-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-3-옥소프로폭시}에톡시)에틸]아세트아미드 (4.3 mg, 0.011 mmol, 1 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 디메틸술폭시드 (0.2 mL)로 희석하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B43을 고체로서 수득하였다. 수율: 8.8 mg, 0.007 mmol, 66%. HPLC (프로토콜 AA) 체류 시간 = 7.69분 (순도= 71%). LCMS (프로토콜 A): m/z 1220.4 [M+H]+, 체류 시간 = 0.77분.
실시예 A16
N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B47)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00154
단계1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (#B44)의 합성. N,N-디이소프로필에틸아민 (3.8 mL, 22.12 mmol, 1.9 당량)을 N,N-디메틸포름아미드 (50 mL, 0.24 M) 중 6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥산산 (4.2 g, 11.80 mmol, 1 당량) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 5.6 g, 14.75 mmol, 1.25 당량)의 용액에 실온에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 이어서, L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (WO04010957로부터의, 5.6 g, 14.75 mmol, 1.25 당량)를 혼합물에 첨가하였다. 15시간 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄을 첨가함으로써 침전시키고, 여과하여 #B44를 회백색 고체로서 수득하였다. 수율: 6.9 g, 9.6 mmol, 82%. LCMS 715.6 (M+H)+
단계 2. 4-[(N~5~-카르바모일-N~2~-{(3S)-3-[(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)아미노]-4-메틸펜트-1-엔-2-일}-L-오르니틸)아미노]벤질 4-니트로페닐 카르보네이트 (#B45)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (3 mL, 0.2 M) 중 #B44 (500 mg, 0.7 mmol, 1 당량) 및 4-니트로페닐 카르보네이트 (638 mg, 2.1 mmol, 3 당량)의 용액을 N,N-디이소프로필에틸아민 (365 μL, 2.1 mmol, 3 당량)으로 처리하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, SiO2 상에서 흡수시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (구배: 디클로로메탄 중 0에서 25% 메탄올로)에 의해 정제하여 #B45를 고체로서 수득하였다. 수율: 402 mg, 0.476 mmol, 68%. LCMS (프로토콜 L): m/z 880.7 [M+H]+ 체류 시간 3.39.
단계 3. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5 일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B46)의 합성. 표제 화합물을 화합물 #B41의 제조에 기재된 절차를 사용하여 #B6 71 mg (0.13 mmol) 및 #B45 171 mg (0.194 mmol)으로부터 10% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1290.5 [M+H]+, 체류 시간 = 0.91분.
단계 4. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B47)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.35 mL) 중 #B46 (19 mg, 0.015 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘 (25 mg, 0.3 mmol, 20 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 디메틸술폭시드 (0.7 mL)로 희석하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B47을 고체로서 수득하였다. 수율: 3 mg, 0.0028 mmol, 18%. HPLC (프로토콜 AA) 체류 시간 = 6.65, 6.69분 (순도 = 91%). LCMS (프로토콜 D): m/z 1069.9 [M+H]+, 체류 시간 = 0.61분.
실시예 A17
N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B48)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00155
단계 1. 화합물 #B9 (113 mg, 0.217 mmol)를 일반적 절차 E에서와 같이 조 #B7로 전환시켰다. LCMS (프로토콜 D): m/z 534.1 [M+H]+, 체류 시간 = 0.77분. 조 물질을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다.
단계 2. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B48)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2.8 mL) 중 조 #B7 (60 mg, 0.11 mmol, 1 당량)의 용액에 2,6-디메틸피리딘 (48 mg, 0.448 mmol, 4 당량), N,N'-디이소프로필에틸아민 (57.9 mg, 0.448 mmol, 4 당량) 및 HOAt (15.2 mg, 0.112 mmol, 1 당량)를 첨가하였다. 반응물을 50℃로 가온하고, 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 피페리딘 (191 mg, 2.24 mmol, 20 당량)을 천천히 첨가하고, 2.0시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 C*)에 의해 정제하여 #B48을 고체로서 수득하였다. 수율 6.4 mg, 0.005 mmol, 5.2%. HPLC (프로토콜 F): m/z 1052.6 [M+H]+, 체류 시간 = 7.114분 (순도 100%).
실시예 A18
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B49)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00156
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B49)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (7.0 mL) 중 #NP1 (1.5 g, ~50% 순도, 2.8 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 1.07 g, 4.5 mmol, 1.6 당량), 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 1.0 mL)의 혼합물을 주위 온도에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B49를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 730.7 mg, 80% 수율.
Figure 112015053331353-pct00157
실시예 A19
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-디메틸-6-[(2E,4E)-3-메틸-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-옥소-2-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}펜타-2,4-디엔-1-일]테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B50)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00158
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-디메틸-6-[(2E,4E)-3-메틸-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-옥소-2-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}펜타-2,4-디엔-1-일]테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B50)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2 mL) 중 #NP2 (284 mg, 92% 순도, 0.47 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 220 mg, 0.58 mmol, 1.2 당량) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 0.1 mL)의 혼합물을 주위 온도에서 60분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B50을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 307.0 mg, 88% 수율
Figure 112015053331353-pct00159
실시예 A20
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({2-[(아이오도아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B52)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00160
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-아미노에틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B51)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (1.0 mL) 중 #B49 (50.5 mg, 92% 순도, 0.08 mmol, 1.0 당량) 및 9H-플루오렌-9-일메틸 (2-아미노에틸)카르바메이트 (32.1 mg, 0.11 mmol, 1.4 당량)의 용액에 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 20 μL)을 교반하면서 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 용액에 피페리딘 (30 μL, 0.35 mmol, 4.4 당량)을 천천히 첨가하고, 용액을 주위 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B51을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 38.8 mg, 86% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 6.61분 (순도 97%). LCMS (프로토콜 M): m/z 578.8 [M+H]+.
단계 2. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({2-[(아이오도아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B52)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2.5 mL) 중 아이오도아세트산 (40.3 mg, 0.22 mmol, 7.3 당량) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 61.6 mg, 0.3 mmol, 10.0 당량)의 용액을 실온에서 10분 동안 교반하고, 담황색 용액을 N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 #B51 (21.1 mg, 85.0% 순도, 0.031 mmol, 1.0 당량)에 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B52를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 10.3 mg, 37% 수율.
Figure 112015053331353-pct00161
실시예 A21
(2Z,4S)-4-히드록시-N-{(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({2-[(아이오도아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}펜트-2-엔아미드 (#B54)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00162
단계 1. [(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B4)의 합성. #NP1 (192 mg, ~50% 순도, 0.18 mmol, 1.0 당량), 탄산칼륨 (300 mg, 2.4 mmol, 13.5 당량), 및 메탄올 (5 mL)의 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 중화시키고, 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 G)를 사용하여 정제하여 #B4를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 50.2　mg. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 7.39분 (순도 96%). LCMS (프로토콜 M): m/z 494.3 [M+H]+.
단계 2. (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-아미노에틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B53)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (1.0 mL) 중 #B4 (23.4 mg, 0.047 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 34.0 mg, 0.09 mmol, 2.0 당량) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (20.0 μL)의 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 에탄-1,2-디아민 (80 μl, 1.3 mmol, ~30 당량)을 첨가하고, 생성된 용액을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B53을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 31 mg. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 5.58분 (순도 50%). LCMS (프로토콜 M): m/z 536.4 [M+H]+
단계 3. (2Z,4S)-4-히드록시-N-{(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({2-[(아이오도아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}펜트-2-엔아미드 (#B54)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2 ml) 중 아이오도아세트산 (35 mg, 0.18 mmol, 6 당량) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 49.8 mg, 0.24 mmol, 8 당량)의 용액을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 #B53 (31.0 mg, ~50% 순도, ~0.03 mmol, 1.0 당량)에 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 조 #B54를 백색 분말 (23.0 mg)로서 수득하였다. 이 물질을 상이한 구배 시스템으로 재정제하여 #B54를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 15.9　mg, 27% 수율, 3 단계에 걸쳐.
Figure 112015053331353-pct00163
실시예 A22
메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B55)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00164
단계 1. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B55)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (500 μL) 중 #NP1 (9.9 mg, 92% 순도, 0.018 mmol, 1.0 당량), 탄산칼륨 (40 mg, 0.33 mmol, 18 당량), 및 아이오도메탄 (30 μL, 0.31 mmol, 17 당량)의 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 중화시키고, 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B55를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 7.8 mg, 77% 수율.
Figure 112015053331353-pct00165
실시예 A23
[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-3,6-디메틸-5-({(2Z,4S)-4-[(피페리딘-1-일카르보닐)옥시]펜트-2-에노일}아미노)테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B60) 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({2-[(아이오도아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B62)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00166
단계 1. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-(1-에톡시에톡시)-1,6-디옥사스피로[2.5] 옥트-5-일]아세테이트 (#B56)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (4.0 mL) 중 #NP1 (195 mg, ~50% 순도, 0.18 mmol, 1.0 당량) 및 탄산칼륨 (200 mg, 1.6 mmol, 9 당량)의 혼합물에 아이오도메탄 (500 μL, 18 당량)을 첨가하였다. 생성된 용액을 120분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 물과 에틸 아세테이트 (10 mL 각각의 상) 사이에 분배하였다. 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 감압 하에 증발시켜 #B55를 필름 (191.2 mg, ~50% 순도)으로서 수득하였다. 다음에, 조 #B55 (191.0 mg, 0.18 mmol, 1.0 당량)를 피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (PPTS, 56.1 mg, 0.22 mmol, 1.2 당량)와 혼합하고, 무수 디클로로메탄 (2.0 ml) 중 에틸 비닐 에테르 (2.5 ml, 43 mmol)를 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 부분적으로 증발시킨 다음, 에틸 아세테이트 (10 mL)/중탄산나트륨 수용액 (포화, 10 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 감압 하에 증발시켜 #B56 (187.1 mg)을 수득하였다. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 13.2분 (순도 50%). LCMS (프로토콜 M): m/z 549.5 [M+H-CHCH3OCH2CH3]+. 이를 후속 반응에 그대로 사용하였다.
단계 2. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-(1-에톡시에톡시)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트- 5-일]아세테이트 (#B57)의 합성. 메탄올 (4 ml) 중 #B56 (187.1 mg, ~50% 순도, 0.15 mmol, 1.0 당량), 탄산칼륨 (120 mg, 0.98 mmol, 6.5 당량)의 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 증발 건조시켜 #B57 (171.5 mg)을 수득하였으며, 이를 후속 반응에 그대로 사용하였다. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.9분 (순도 50%). LCMS (프로토콜 M): m/z 507.5 [M+H-CHCH3OCH2CH3]+.
단계 3. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-(1-에톡시에톡시)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B58)의 합성. 디클로로메탄 (4.0 mL) 중 #B57 (171 mg, 50% 순도, 0.15 mmol, 1.0 당량), 비스(p-니트로페닐)카르보네이트 (320.1 mg, 1.0 mmol, 7 당량), 4-(디메틸아미노)피리딘 (9.8 mg, 0.08 mmol, 0.5 당량), 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 150 μL)의 용액을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 피페리딘 (500 μL, 5.8 mmol, 38 당량)을 천천히 첨가하고, 생성된 황색 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 빙냉수 (20 mL)를 첨가하고, 유기 용매를 감압 하에 증발에 의해 제거하였다. 이에 따라 형성된 침전물을 여과에 의해 수집한 다음, 진공 하에 건조시켜 #B58 (347.0 mg)을 수득하였으며, 이를 후속 반응에 그대로 사용하였다. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 13.20분 (순도 25%). LCMS (프로토콜 M): m/z 691.7 [M+H]+.
단계 4. [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-3,6-디메틸-5-({(2Z,4S)-4-[(피페리딘-1-일카르보닐)옥시]펜트-2-에노일}아미노)테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-(1-에톡시에톡시)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B59)의 합성. 아세토니트릴 (10 ml) 중 #B58 (347 mg, ~25% 순도, 0.13 mmol, 1.0 당량)의 용액에 1M 수산화리튬 (1 mL) 및 물 (1 mL)을 첨가하였다. 생성된 탁한 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였으며, 이는 서서히 투명해졌다. 추가의 1M 수산화리튬 (1.0 mL)을 첨가하고, 용액을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 n-부탄올 (30 mL)과 물 (30 mL) 사이에 분배하였다. 상부 층을 H2O (20 mL)로 세척한 다음, 감압 하에 증발 건조시켜 #B59 (280.2 mg)를 수득하였으며, 이를 후속 반응에 그대로 사용하였다. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 7.43분 (순도 30 %). LCMS (프로토콜 M): m/z 677.4 [M+H]+.
단계 5. [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-3,6-디메틸-5-({(2Z,4S)-4-[(피페리딘-1-일카르보닐)옥시]펜트-2-에노일}아미노)테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B60)의 합성. 메탄올 (5 mL) 중 #B59 (280.2 mg, ~30% 순도, 0.12 mmol, 1.0 당량) 및 피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (PPTS, 250.4 mg, 1 mmol, 8.0 당량)의 용액을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, 4℃에서 18시간 동안 정치되도록 하였다. 이어서, 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B60을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 78.4 mg, (40% 수율, 단계 1-5에 걸쳐) HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.84분 (순도 96.7%). LCMS (프로토콜 M): m/z 605.4 [M+H]+.
단계 6. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-아미노에틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B61)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (1.0 mL) 중 #B60 (38.2 mg, 0.06 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 40.1 mg, 0.1 mmol, 1.7 당량), 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 20.0 μL)의 용액을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이 용액에 1,2-에틸렌디아민 (120 μL, 2 mmol, 33 당량)을 첨가하고, 생성된 용액을 20분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B61을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 14.2 mg, xx%) HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 7.86분 (순도 70%). LCMS (프로토콜 M): m/z 647.8 [M+H]+.
단계 7. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({2-[(아이오도아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B62)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2 mL) 중 아이오도아세트산 (20.3 mg, 0.1 mmol, 7 당량) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 31.6 mg, 0.15 mmol, 10 당량)의 용액을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, N,N-디메틸포름아미드 (0.2 ml) 중 #B61(14.0 mg, ~70% 순도, 0.015 mmol, 1.0 당량)을 함유하는 바이알에 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B62를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 3.7　mg, (11%, 단계 6-7에 걸쳐)
Figure 112015053331353-pct00167
실시예 A24
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B63)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00168
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B63)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (1.0 mL) 중 #B49 (43.2 mg, 92.1% 순도, 0.065 mmol, 1.0 당량)의 용액에 순수한 프로필아민 (30 μL, 0.5 mmol, 7.0 당량)을 첨가하였다. 생성된 용액을 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O와 에틸 아세테이트 (각각 10 ml) 사이에 분배하였다. 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 감압 하에 증발시켜 #B63을 수득하였다. 수율: 40.4 mg, 100%.
Figure 112015053331353-pct00169
실시예 A25
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-디메틸-6-[(2E,4E)-3-메틸-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}펜타-2,4-디엔-1-일]테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B64)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00170
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-디메틸-6-[(2E,4E)-3-메틸-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}펜타-2,4-디엔-1-일]테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B64)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #NP2 (28.7 mg, 91% 순도, 0.055 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 24.8 mg, 0.065 mmol, 1.2 당량), 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 30 μL)의 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 순수한 프로필아민 (30 μL, 0.5 mmol, 7.0 당량)을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B64를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 34.1 mg, 86%.
Figure 112015053331353-pct00171
실시예 A26
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B66)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00172
단계 1. (3R,4R,5R,7S)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5] 옥트-4-일 아세테이트 (#B64a)의 합성. 피리딘 (0.5 mL) 중 #B63 (44.0 mg, ~90% 순도, 0.076 mmol, 1.0 당량)의 용액에 아세트산 무수물 (150 μL, 1.6 mmol, 21.0 당량))을 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙냉수 (10 mL)로 옮기고, 20분 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트 (30 mL)와 물 (30 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 물 (3 x 20 mL)로 세척하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 디메틸 술폭시드 (150 μL) 중에 용해시키고, 용액을 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) (시그마 69509, 0.5 mg/mL, 총 15 mL)에 의해 생산된 에스테라제를 함유하는 1M 트리스 완충 용액 (pH 7.0)에 천천히 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트 (2 x 20 mL)와 물 (20 mL) 사이에 분배하였다. 합한 유기 층을 물 (2 x 20 mL)로 세척한 다음 감압 하에 증발시켜 #B64a를 회백색 분말로서 수득하였다. 수율: 44.9 mg, (가정된 정량) HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.51분 (순도 88%). LCMS (프로토콜 M): m/z 577.6 [M+H]+.
단계 2. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(아세틸옥시)-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B65)의 합성. 디클로로메탄 (1 mL) 중 #B64a (14.7 mg, 0.025 mmol, 1.0 당량), 비스(p-니트로페닐)카르보네이트 (38.4 mg, 0.13 mmol, 5 당량), p-디메틸아미노피리딘 (1.6 mg, 0.013 mmol, 0.5 당량), 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 30 μL)의 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이 반응 용액에 피페리딘 (60 μL, 0.7 mmol, 28 당량)을 천천히 첨가하고, 용액을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 빙냉수 (10 mL)를 첨가하고, 유기 용매를 감압 하에 증발에 의해 제거하였다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척한 다음, 감압 하에 증발시켜 #B65를 수득하였다. 수율 26.2 mg, (가정된 정량) HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 13.1분 (순도 45%). LCMS (프로토콜 M): m/z 688.5 [M+H]+.
단계 3. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B66)의 합성. 메탄올 (1.5 mL) 중 #B65 (26.1 mg, ~45% 순도, 0.017 mmol, 1.0 당량), 탄산칼륨 (51 mg, 0.41 mmol, 24 당량)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 에틸 아세테이트와 물 (10 mL 각각의 상) 사이에 분배하였다. 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 감압 하에 증발 건조시킨 다음, 이를 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B66을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 7.3 mg, (44%, 단계 1-3에 걸쳐).
Figure 112015053331353-pct00173
실시예 A27
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일피페리딘-1-카르복실레이트 (#B67), 및 2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B67)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00174
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일피페리딘-1-카르복실레이트 (#B67)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.8 mL) 중 #B60 (실시예 A23, 23.0 mg, 96.7% 순도, 0.038 mmol, 1.0 당량) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 13.1 mg, 0.06 mmol, 1.7 당량)의 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이 용액에 N,N-디메틸포름아미드 (0.2 ml) 중 N-히드록실 숙신이미드 (34.5 mg, 0.3 mmol, 7.7 당량)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B67을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 9.4 mg, 39%.
Figure 112015053331353-pct00175
실시예 A28
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 2-메틸프로파노에이트 (#B71)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00176
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(1-에톡시에톡시)-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B68)의 합성. 무수 디클로로메탄 (1.0 mL) 중 #B63 (실시예 A24, 35.0 mg, 92% 순도, 0.06 mmol, 1.0 당량), 피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (PPTS, 7.1 mg, 0.028 mmol, 0.4 당량), 및 에틸 비닐 에테르 (0.5 mL, 8.6 mmol, 매우 과량의 양)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 (10 mL)/물(10 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 감압 하에 증발시켜 #B68을 수득하였다. 수율: 36.1 mg. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 12.33분 (순도 90%). LCMS (프로토콜 M): m/z 577.6 [M+H-CHCH3OCH2CH3]+.
단계 2. (2Z,4S)-N-{(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(1-에톡시에톡시)-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B69)의 합성. 메탄올 (1.0 mL) 중 #B68 (36.1 mg, 0.05 mmol, 1.0 당량) 및 탄산칼륨 (50 mg, 0.4 mmol, 8 당량)의 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 증발 건조시켜 #B69를 수득하였다. 수율: 33.4 mg. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.458 및 10.459분 (순도 87.6%). LCMS (프로토콜 M): m/z 535.5 [M+H-CHCH3OCH2CH3]+.
단계 3. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(1-에톡시에톡시)-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 2-메틸프로파노에이트 (#B70)의 합성. 피리딘 (500 μL) 중 #B69 (33.0 mg, 0.049 mmol, 1.0 당량) 및 이소부티르산 무수물 (100 μL, 0.75 mmol, 15 당량)의 용액을 35℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 증발시켜 #B70을 수득하였다. 수율: 37.3 mg. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 14.06 (순도 88.3%). LCMS (프로토콜 M): m/z 605.6 [M+H-CHCH3OCH2CH3]+,
단계 4. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 2-메틸프로파노에이트 (#B71)의 합성. 무수 메탄올 (2.0 ml) 중 #B70 (17.8 mg, 0.023 mmol, 1.0 당량), 피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (60 mg, 0.24 mmol, 10 당량)의 용액을 실온에서 60분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B71을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 8 mg, (50%, 단계 1-4에 걸쳐).
Figure 112015053331353-pct00177
실시예 A29
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(피페리딘-1-일)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B72)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00178
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(피페리딘-1-일)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B72)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (4.0 mL) 중 #NP1 (163.0 mg, 92% 순도, 0.27 mmol, 1.0 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, 160.0 mg, 1 mmol, 4 당량), 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드-HCl (EDC, 195.0 mg, 1 mol, 4 당량)의 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 0℃에서 트리에틸아민 (50 μL) 및 피페리딘 (180 μL, 2.1 mmol, 7.5 당량)을 후속적으로 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 0℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 20 mL)와 물 (20 mL) 사이에 분배하였다. 합한 유기 층을 물 (2 x 10 mL)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 감압 하에 증발시켜 조 #B72를 회백색 유리 (223.5 mg, 79.5% 순도)로서 수득하였다. 이 물질의 일부 (33.1 mg)를 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B72를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 27.4 mg, 100%
Figure 112015053331353-pct00179
실시예 A30
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(트랜스-3-아미노시클로부틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B73)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00180
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(트랜스-3-아미노시클로부틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B73)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (3.0 mL) 중 #NP1 (50.2 mg, 94% 순도, 0.09 mmol, 1.0 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, 65.5 mg, 0.43 mmol, 4.7 당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드-HCl (EDC, 70 mg, 0.37 mmol, 4 당량)의 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 0℃에서 N,N-디메틸포름아미드 (1.0 mL) 및 트리에틸아민 (200 μL) 중 트랜스-1,3-디아미노시클로부탄 (112 mg, 1.3 mmol, 14 당량)을 후속적으로 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 중화시키고, 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B73을 무색 유리로서 수득하였다. 수율: 64.3 mg, 100%.
Figure 112015053331353-pct00181
실시예 A31
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({트랜스-3-[(아이오도아세틸)아미노]시클로부틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B74)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00182
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({트랜스-3-[(아이오도아세틸)아미노]시클로부틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B74)의 합성. 무수 N,N-디메틸포름아미드 (2.0 mL) 중 아이오도아세트산 (38.6 mg, 0.21 mmol, 5.9 당량) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 64.2 mg, 0.31 mmol, 9 당량)의 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 생성된 담황색 용액을 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #B73 (실시예 A30, 27.1 mg, 0.035 mmol, 1.0 당량)에 천천히 첨가한 다음, 실온에서 15분 동안 교반하였다. 생성물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B74를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 14.2 mg, 41%.
Figure 112015053331353-pct00183
실시예 A32
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-N-{4-[({[트랜스-3-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로부틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B75)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00184
단계 1. N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-N-{4-[({[트랜스-3-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로부틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B75)의 합성. 무수 N,N-디메틸포름아미드 (0.6 ml) 중 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-{4-[({[(4 니트로벤질)옥시]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-오르니틴아미드 (MalCValCitPABA-PNP, 문헌 [Eur. Pat. Appl. (1994)], EP624377, 23.1 mg, 0.03 mmol, 1.3 당량) 및 #B73 (15.5 mg, 85% 순도, 0.022 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 30 μL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B75를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 12.6 mg, 28%. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.3분 (순도 91%). LCMS (프로토콜 M): m/z 1202.5 [M+H]+.
실시예 A33
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(트랜스-4-아미노시클로헥실)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B76)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00185
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(트랜스-4-아미노시클로헥실)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B76)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (3.0 mL) 중 #NP1 (40.2 mg, 92% 순도, 0.07 mmol, 1.0 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, 62.5 mg, 0.4 mmol, 5.8 당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드-HCl (EDC, 72.2 mg, 0.38 mmol, 5 당량)의 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 0℃에서 N,N-디메틸포름아미드 (1.5 mL) 및 트리에틸아민 (50 μL) 중 트랜스-1,4-디아미노시클로헥산 (290.0 mg, 2.5 mmol, 30 당량)을 후속적으로 첨가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하고, 0℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 중화시키고, 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B76을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 48.2 mg, 100%.
Figure 112015053331353-pct00186
실시예 A34
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(5-아미노펜틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B77)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00187
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(5-아미노펜틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B77)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (3.0 mL) 중 #NP1 (30.5 mg, 92% 순도, 0.056 mmol, 1.0 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, 38.0 mg, 0.24 mmol, 4.4 당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드-HCl (EDC, 54.0 mg, 0.28 mmol, 5 당량)의 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 0℃에서 트리에틸아민 (50 μL) 및 1,5-펜탄디아민 (50 μL, 0.5 mmol, 9 당량)을 후속적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 중화시키고, 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하였다. 22.0분의 체류 시간으로의 피크를 수집하고, NH4OH로 중화시키고, 동결 건조시켜 #B77을 백색 분말로서 수득하였다. 수율 23.1 mg, 68% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 7.67분 (순도 91%). LCMS (프로토콜 M): m/z 620.6 [M+H]+.
실시예 A35
N-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸알라닌 (#B79)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00188
단계 1. N-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸알라닌 (#B78)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2.0 mL) 중 #NP2 (118.3 mg, 94.0% 순도, 0.2 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 31.7 mg, 0.083 mmol, 0.4 당량), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 10 μL)의 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 1:1 피리딘/디메틸 술폭시드 (1.0 mL) 중 트리에틸아민 (100 μL) 및 2-메틸알라닌 (32.5 mg, 0.3 mmol, 1.3 당량)을 후속적으로 첨가하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도에서 2.0시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B78을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 54.3 mg, 45% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 11.29분 (순도 94.1%). LCMS (프로토콜 M); m/z 605.6 [M+H]+.
단계 2. N-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸알라닌 (#B79)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (200 μL) 중 #B78 (6.6 mg, 0.011 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 6.0 mg, 0.016 mmol, 1.5 당량), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 3.0 μL)의 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 프로필아민 (3.6 μL, 0.06 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 생성된 용액을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B79를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.9 mg, 70% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 12.31분 (순도 100%). LCMS (프로토콜 M): m/z 646.7 [M+H]+; 668.7 [M+Na]+.
실시예 A36
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-(2-{[2-메틸-1-옥소-1-(프로필아미노)프로판-2-일]아미노}-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B81)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00189
단계 1. N-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸알라닌 (#B80)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2.0 mL) 중 #NP1 (122.4 mg, 92.0% 순도, 0.22 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 33.2 mg, 0.087 mmol, 0.4 당량), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 10 μL)의 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 1:1 피리딘/디메틸 술폭시드 (1.0 mL) 중 트리에틸아민 (100 μL) 및 2-메틸알라닌 (36.4 mg, 0.35 mmol, 1.2 당량)을 후속적으로 첨가하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도에서 2.0시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B80을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 52.7 mg, 42% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.28분 (순도 90%). LCMS (프로토콜 M): m/z 621.6 [M+H]+.
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-(2-{[2-메틸-1-옥소-1-(프로필아미노)프로판-2-일]아미노}-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B81)의 제조. N,N-디메틸포름아미드 (200 μL) 중 #B80 (6.0 mg, 90% 순도, 0.01 mmol, 1.0 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 5.1 mg, 0.013 mmol, 1.3 당량), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 3.0 μL)의 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 프로필아민 (3.6 μL, 0.06 mmol, 6 당량)을 첨가하고, 생성된 용액을 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B81을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.7 mg, 87% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.95분 (순도 99%). LCMS (프로토콜 M): m/z 662.7 [M+H]+.
실시예 A37
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[({4-[(N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}글리실)아미노]벤질}옥시)카르보닐]아미노}벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B123)의 제조
Figure 112015053331353-pct00190
단계 1: 9H-플루오렌-9-일메틸 {2-[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)아미노]-2-옥소에틸}카르바메이트 (#B118)의 합성: 0℃에서 건조 DMF (160 mL) 중 Fmoc-글리신 (16 g, 54 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (14 g, 108 mmol, 2.0 당량) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트 (16 g, 54 mmol, 1.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 건조 DMF (50 mL) 중 tert-부틸 [4-(글리실아미노)벤질]카르바메이트 (12 g, 54 mmol, 1.0 당량)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 얼음 물 (400 mL)에 붓고, EtOAc (400 mLx2)로 추출하였다. 유기 층을 염수 (200 mLx2)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc (200 mL) 및 석유 에테르 (400 mL)로부터 재결정화하여 #B118 (18 g, 66.6%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00191
단계 2: tert-부틸 [4-(글리실아미노)벤질]카르바메이트 (#B119)의 합성: DMF (70 mL) 중 #B118 (7.0 g, 14.0 mmol, 1.0 당량)의 용액에 실온에서 피페리딘 (4.7 mL, 47.5 mmol, 3.4 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 석유 에테르 (100 mLx2)로 세척하고, EtOAc (50 mL) 및 석유 에테르 (200 mL)로 재결정화하여 #B119 (3.3 g, 84.6%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00192
단계 3: 9H-플루오렌-9-일메틸 [6-({2-[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)아미노]-2-옥소에틸}아미노)-6-옥소헥실]카르바메이트 (#B120)의 합성: 0℃에서 건조 DCM (50 mL) 중 6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥산산 (2.66 g, 7.53 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.93 g, 15.1 mmol, 2.0 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 2.86 g, 7.53 mmol, 1.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, #B119 (2.1 g, 7.53 mmol, 1.0 당량)를 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 고체를 DCM으로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 #B120 (4 g, 86.4%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00193
단계 4: 9H-플루오렌-9-일메틸 {6-[(2-{[4-(아미노메틸)페닐]아미노}-2-옥소에틸)아미노]-6-옥소헥실}카르바메이트 트리플루오로아세테이트 염 (#B121)의 합성: 0℃에서 건조 DCM (20 mL) 중 #B120 (1 g, 1.63 mmol, 1.0 당량)의 현탁액에 트리플루오로아세트산 (6 mL, 매우 과량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 물 (30 mL) 중에 현탁시키고, 동결건조시켜 #B121 (1.2 g, 100%)을 미황색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00194
단계 5: (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)글리실]아미노}벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B122)의 합성: 테트라히드로푸란 (1.0 mL) 및 메탄올 (0.1 mL) 중 #B121 (32.7 mg, 0.044 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (26.0 mg, 0.2 mmol, 4.5 당량)을 첨가하였다. 전체 반응 혼합물을 테트라히드로푸란 (1.0 mL) 중 #B1 (28 mg, 0.044 mmol, 1 당량)의 냉각된 (0℃) 용액에 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온되도록 하였다. 1시간 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B122 (12.4 mg, 0.011 mmol, 27%)를 수득하였다: LCMS (프로토콜 D): m/z 1032.6 [M+H]+, 체류 시간 = 0.92분.
단계 6: (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[({4-[(N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}글리실)아미노]벤질}옥시)카르보닐]아미노}벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B123)의 합성. 디메틸포름아미드 (0.7 mL, 0.01 M) 중 #B122 (12.4 mg, 0.012 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘 (원액 [1 ml DMF 중에 100 uL 피페리딘을 용해시킴으로써 제조됨] 11 uL, 0.013 mmol, 1.1 당량)을 첨가하였다. 반응물을 16시간 동안 교반한 다음, 테트라히드로푸란 (0.5 mL) 중 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (2.8 mg, 0.012 mmol, 1 당량)의 용액을 적가하였다. 반응물을 16시간 동안 교반하고, 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B123을 고체로서 수득하였다. 수율: 2.5 mg, 0.027 mmol, 22%. LCMS (프로토콜 D):　m/z　932.2 [M+H]+ 체류 시간 = 0.76분.
실시예 A38
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-카르밤이미드아미도-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B124) 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(N'-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}카르밤이미드아미도)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B125)의 제조
Figure 112015053331353-pct00195
단계 1: (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-카르밤이미드아미도-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B124) 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(N'-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}카르밤이미드아미도)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B125)의 합성: 0℃에서 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 1.0 mL) 중 #NP1 (135 mg, ~60% 순도, ~0.15 mmol) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 72 mg, 0.19 mmol, 1.2 당량)의 혼합물에 N,N'-디이소프로필에틸아민 (30 uL, #당량)을 첨가하였다. 주위 온도에서 10분 동안 교반한 후, 혼합물을 1:1 메틸술폭시드/물 (3.0 mL) 중 구아니딘 히드로클로라이드 (400 mg, 4.1 mmol, 28 당량) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민 (100 uL)의 용액으로 옮겼다. 생성된 버용액을 20분 동안 교반하고, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 (#B124) 및 (#B125)를 백색 분말로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00196
Figure 112015053331353-pct00197
본원에 개시된 것과 유사한 이량체 화합물, 예를 들어 본원 전체를 통해 기재된 바와 같은 치환을 갖는 이량체 화합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
실시예 A39
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[N'-(브로모아세틸)카르밤이미드아미도]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B126)의 제조
Figure 112015053331353-pct00198
단계 1: (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[N'-(브로모아세틸)카르밤이미드아미도]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B126)의 합성: N,N-디메틸포름아미드 (1 ml) 중 #B124 (24.0 mg, 0.042 mmol, 1.0 당량) 및 브로모아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (24.1 mg, 0.092 mmol, 2.0 당량)의 용액에 N,N'-디이소프로필에틸아민 (10 uL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반하고, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B126을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 5.7　mg, 20%.
Figure 112015053331353-pct00199
실시예 A40
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[{2-[(아이오도아세틸)(메틸)아미노]에틸}(메틸)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B128)의 제조
Figure 112015053331353-pct00200
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(메틸(2-(메틸아미노)에틸)아미노)]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B127)의 합성: N,N-디메틸포름아미드 (2.0 mL) 중 #B49 (54.5 mg, 0.084 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N'-디메틸-1,2-에틸렌디아민 (120 uL, 1.1 mmol, 12 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 5분 동안 교반하고, 생성물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 (#B127)을 수득하였다. 수율: 29.1 mg, 57%. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 6.92분 (순도 76%). LCMS (프로토콜 M): m/z 606.3 [M+H]+.
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[{2-[(아이오도아세틸)(메틸)아미노]에틸}(메틸)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B128)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (2.0 mL) 중 아이오도아세트산 (43.1 mg, 0.23 mmol, 4.8 당량) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 64.10 mg, 0.3 mmol, 6.3 당량)의 용액을 주위 온도에서 10분 동안 교반한 다음, N,N-디메틸포름아미드 (0.2 ml) 중 (#B127) (29.1 mg, 76.0% 순도, 0.048 mmol, 1 당량)의 용액으로 옮겼다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하고, 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 (#B128)을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 12.2 mg, 54%.
Figure 112015053331353-pct00201
실시예 A41
(2Z)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-옥소펜트-2-엔아미드 (#B129)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00202
단계 1. (2Z)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-옥소펜트-2-엔아미드 (#B129)의 합성: 0℃에서 디클로로메탄 (2 mL) 중 #B39 (60 mg, 0.13 mmol, 1 당량)의 용액에 데스-마르틴 퍼아이오디난 (119 mg, 0.27 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 빙조를 제거하였다. 35분 후 포화 중탄산나트륨 및 디클로로메탄을 첨가하고, 수성 층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B129를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 19.04 mg, 0.04 mmol, 32%.
Figure 112015053331353-pct00203
실시예 A42
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 메틸[2-(메틸술파닐)에틸]카르바메이트(#B130)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00204
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B131)의 합성: 0℃에서 디클로로메탄 (3 mL) 중 #B9 (119 mg, 0.22 mmol, 1 당량)의 용액에 2,6-루티딘 (104 μL, 0.89 mmol, 4 당량)에 이어서 tert-부틸-디메틸실릴-트리플루오로메탄술포네이트 (160 μL, 067 mmol, 3 당량)를 적가하였다. 70분 후, 반응물을 포화 중탄산나트륨 및 디클로로메탄으로 희석하고, 추출하고, 용매 분리기 튜브 상에서 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (5%에서 100%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B131을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 34 mg, 0.05 mmol, 23%. LCMS (프로토콜 C): m/z 671.3 [M+Na]+, 체류 시간 = 2.08분.
단계 2. (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B132)의 합성. 4:1 테트라히드로푸란:물 (1 mL) 중 #B131 (32 mg, 0.049 mmol, 1 당량)의 용액에 수산화리튬 (11.7 mg, 0.49 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 21시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 및 물에 녹였다. 수성 층을 에틸 아세테이트 (3X)로 추출하고, 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 100%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B132를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 11.3 mg, 0.019 mol, 38%. LCMS (프로토콜 D): m/z 629.3 [M+Na]+, 체류 시간 = 0.98분.
단계 3. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 메틸[2-(메틸술파닐)에틸]카르바메이트 (#B133)의 합성: 디클로로메탄 (1.8 mL) 중 #B132 (63.2 mg, 0.104 mmol, 1 당량)의 용액에 트리에틸아민 (73 μL, 0.520 mmol, 5 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (8.9 mg, 0.073 mmol, 0.7 당량) 및 비스-(4-니트로페닐)-카르보네이트 (106 mg, 0.343 mmol, 3.3 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 이 혼합물의 1/3에 N-메틸-2-(메틸술파닐)에탄아민 히드로클로라이드 (24.6 mg, 0.174 mmol, 1.67 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 물로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 용매 분리기 튜브 상에서 여과하고, 디메틸 술폭시드 (1 mL)로 희석하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B133을 수득하였다. 수율: 15.2 mg, 0.021 mmol, 20%. LCMS (프로토콜 C): m/z 760.76 [M+Na]+, 체류 시간 = 2.19분.
단계 4. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 메틸[2-(메틸술파닐)에틸]카르바메이트 (#B130)의 합성: 0℃로 냉각시킨 테트라히드로푸란 (0.4 mL) 중 #B133 (15.2 mg, 0.021 mmol, 1 당량)의 용액에 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (테트라히드로푸란 중 1 M, 53 μL, 0.053 mmol, 2.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 10분 후에 실온으로 가온시켰다. 1.5시간 후, 반응물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B130을 수득하였다. 수율: 8.5 mg, 0.014 mmol, 65%.
Figure 112015053331353-pct00205
실시예 A43
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B134)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00206
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B135)의 합성: 실시예 A42의 단계 3에 기재된 절차를 사용하여, 화합물 #B133의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B132 63.2 mg (0.104 mmol, 1.0 당량), 트리에틸아민 (73 μL, 0.520 mmol, 5 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (8.9 mg, 0.073 mmol, 0.7 당량) 및 비스-(4-니트로페닐)-카르보네이트 (106 mg, 0.343 mmol, 3.3 당량) 및 피페리딘 (14.8 mg, 0.174 mmol, 1.7 당량)으로부터 18% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 740.5 [M+Na]+, 체류 시간 = 1.13분.
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페리딘-1-카르복실레이트 (#B134)의 합성: 화합물 #B130에 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B135 13.5 mg (0.019 mmol) 및 테트라부틸암모늄 플루오라이드 12.8 mg (테트라히드로푸란 중 1 M 53 μL, 0.053 mmol, 2.5 당량)으로부터 76% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00207
실시예 A44
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페라진-1-카르복실레이트, 아세테이트 염 (#B136)의 제조
Figure 112015053331353-pct00208
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 피페라진-1-카르복실레이트, 아세테이트 염 (#B136)의 합성: 화합물 #B133의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 37 mg (0.078 mmol) 트리에틸아민 (39.7 mg, 0.39 mmol, 5 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (6.7 mg, 0.055 mmol, 0.7 당량), 비스-(4-니트로페닐)-카르보네이트 (84.7 mg, 0.273 mmol, 3.5 당량) 및 피페라진 (16.8 mg, 0.195 mmol, 2.5 당량)으로부터 27% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00209
실시예 A45
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 -4-메틸피페라진-1-카르복실레이트 (#B137)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00210
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일-4-메틸피페라진-1-카르복실레이트, 아세테이트 염 (#B137)의 합성: 화합물 #B133의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 37 mg (0.078 mmol) 트리에틸아민 (39.7 mg, 0.39 mmol, 5 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (6.7 mg, 0.055 mmol, 0.7 당량), 비스-(4-니트로페닐)-카르보네이트 (84.7 mg, 0.273 mmol, 3.5 당량) 및 1-Me-피페라진 (19.5 mg, 0.195 mmol, 2.5 당량)으로부터 27% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00211
실시예 A46
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-{[(1H-이미다졸-1-일카르보닐)아미노]메틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B138), 및 (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(아미노메틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드, 아세테이트 염 (#B139) 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(아미노메틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B140)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00212
단계 1a. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-{[(1H-이미다졸-1-일카르보닐)아미노]메틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B138)의 합성: 실온에서 아세토니트릴 (0.6 mL) 중 #B22 (15.9 mg, 0.030 mmol, 1 당량)의 용액에 카르보닐 디이미다졸 (7.4 mg, 0.045 mmol, 1.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 60℃로 5.5시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각시켰다. 물 및 디클로로메탄을 첨가하고, 수성 층을 추출하였다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B138을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.4 mg, 0.0059 mmol, 20%. LCMS (프로토콜 C): m/z 585.4 [M+H]+, 체류 시간 = 1.40분. HPLC (프로토콜 AA) 체류 시간 = 7.426분 (순도 83%).
단계 1b. (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(아미노메틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드, 아세테이트 염 (#B139)의 합성: 실온에서 아세토니트릴 (2.2 mL) 중 #B22 (35.2 mg, 0.066 mmol, 1 당량)의 용액에 카르보닐 디이미다졸 (16.2 mg, 0.099 mmol, 1.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 60℃로 5시간 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 아세토니트릴 (33 mL), 물 (17 mL), 및 1 N NaOH (17 mL)의 용액에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 물로 희석하고, 아세토니트릴을 진공 하에 제거하였다. 수용액을 디클로로메탄으로 추출하고, 아세트산 (0.5 mL)으로 중화시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴에 녹이고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B139를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 7.7 mg, 0.015 mmol, 23%.
Figure 112015053331353-pct00213
단계 1c. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(아미노메틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B140)의 합성: 실온에서 아세토니트릴 (3.1 mL) 중 #B22 (50.8 mg, 0.095 mmol, 1 당량)의 용액에 카르보닐 디이미다졸 (23.4 mg, 0.143 mmol, 1.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 65℃로 4시간 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 아세토니트릴 (83 mL), 물 (6 mL), 및 1 N NaOH (6 mL)의 용액을 첨가하고, 실온에서 35분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 아세트산 (0.35 mL)으로 중화시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 아세토니트릴에 녹이고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B140을 수득하였다. 수율: 15 mg, 0.030 mmol, 32%. LCMS (프로토콜 C): m/z 491.3 [M+H]+, 체류 시간 = 1.13분.
Figure 112015053331353-pct00214
실시예 A47
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[(트랜스-4-히드록시시클로헥실)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B141), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[(시스-3-히드록시시클로부틸)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B142), 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(2-메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B143), 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(1-메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B144), 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(1,2-디메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B145)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00215
단계 1a. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[(트랜스-4-히드록시시클로헥실)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B141)의 합성: 테트라히드로푸란 (0.5 mL) 중에 용해시킨 #B1 (19.7 mg, 0.031 mmol, 1 당량)의 용액에 트랜스-4-아미노시클로헥산올 (5.7 mg, 0.049 mmol, 1.6 당량)을 첨가하였다. 1.5시간 동안 교반한 후, 반응물을 물로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 합한 유기부를 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B141을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 11.8 mg, 0.019 mmol, 60%.
Figure 112015053331353-pct00216
단계 1b. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{2-[(시스-3-히드록시시클로부틸)아미노]-2-옥소에틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B142)의 합성. 실온에서 테트라히드로푸란/N,N-디메틸포름아미드 (5:1, 0.6 mL) 중 #B1 (16.2 mg, 0.026 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (13.7 μL, 0.078 mmol, 3 당량) 및 트랜스-3-아미노시클로부탄올 히드로클로라이드 (4.8 mg, 0.039 mmol, 1.5 당량) (12:48 pm)를 첨가하고, 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 추가의 N,N-디메틸포름아미드 (100 uL), N,N-디이소프로필에틸아민 (13 uL, 0.078 mmol, 3 당량) 및 트랜스-3-아미노시클로부탄올 히드로클로라이드 (3 mg, 0.024 mmol, 0.9 당량)를 첨가하고, 반응물을 추가의 30분 동안 교반하였다. 반응물을 디메틸 술폭시드로 희석하고, 진공 하에 농축시켜 테트라히드로푸란을 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B142를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 9.5 mg, 0.016 mmol, 61%.
Figure 112015053331353-pct00217
단계 1c. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(2-메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B143) 및 (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-(1-메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B144)의 합성: 실온에서 테트라히드로푸란/N,N-디메틸포름아미드 (2:1, 0.75 mL) 중 #B1 (32.4 mg, 0.051 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (71.8 μL, 0.408 mmol, 8 당량) 및 N-메틸히드라진 술페이트 (22.1 mg, 0.15 mmol, 3 당량)를 첨가하고, 반응물을 20분 동안 교반하였다. 추가의 N,N-디메틸포름아미드 (250 uL)를 첨가하였다. 추가로 30분 후, 추가의 N,N-디이소프로필에틸아민 (35 uL, 0.20 mmol, 4 당량) 및 N-메틸히드라진 술페이트 (15 mg, 0.10 mmol, 2 당량)를 첨가하고, 반응물을 45분 동안 교반하였다. 반응물을 물 및 에틸 아세테이트로 희석하고, 수성 층을 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B143 및 #B144를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00218
Figure 112015053331353-pct00219
단계 1d. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(1,2-디메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B145)의 합성: 실온에서 테트라히드로푸란/N,N-디메틸포름아미드 (1:1, 1 mL) 중 #B1 (29.7 mg, 0.047 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (116 μL, 0.658 mmol, 14 당량)에 이어서 N,N'-디메틸히드라진 디히드로클로라이드 (31.3 mg, 0.235 mmol, 5 당량)를 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 반응물을 물 및 에틸 아세테이트로 희석하고, 수성 층을 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B145를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 2.2 mg, 0.0038 mmol, 8%.
Figure 112015053331353-pct00220
실시예 A48
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-D-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B146)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00221
단계 1. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-D-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B146)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.3 mL) 중 #B47 (10.4 mg, 0.009 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (6.3 μL, 0.036 mmol, 4 당량)에 이어서 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 (4.2 mg, 0.017 mmol, 1.9 당량)을 첨가하고, 15분 동안 교반한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B146을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.6 mg, 0.004 mmol, 43%.
Figure 112015053331353-pct00222
실시예 A49
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(아미노메틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B147)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00223
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(아미노메틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B147)의 합성: 아세토니트릴 (2.3 mL) 중 #B14 (40 mg, 0.073 mmol, 1 당량)의 용액에 실온에서 CDI (29.8 mg, 0.182 mmol, 2.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 40분 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 65℃로 4시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 아세토니트릴 (63 mL), 물 (4.5 mL) 및 1 N NaOH (4.5 mL)의 용액에 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 아세트산 (270 uL)을 첨가하고, 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 수득된 잔류물을 아세토니트릴에 녹이고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B147을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.1 mg, 0.0088 mmol, 12%.
Figure 112015053331353-pct00224
실시예 A50
메틸 [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B148)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00225
단계 1. 메틸 [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B148)의 합성: 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (4.5 mL) 중 #NP2 (204 mg, 0.393 mmol, 1 당량)의 용액에 탄산칼륨 (272 mg, 1.96 mmol, 5 당량) 및 아이오도메탄 (740 μL, 11.8 mmol, 30 당량)을 첨가하고, 반응물을 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 여과하고, 물 (3x)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. LCMS (프로토콜 D): m/z 534.42 [M+H]+, 체류 시간 = 0.89분. 조 물질을 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 2. 메틸 [(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B148)의 합성. 실온에서 메탄올 (3.5 mL) 중 실시예 A#50의 단계 1로부터의 조 물질의 용액에 탄산칼륨 (136 mg, 0.056 mmol, 2.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 메탄올로 여과하고, 디메틸 술폭시드 (2 mL)로 희석시키고, 진공 하에 농축시켰다. 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 90%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B148을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 91.6 mg, 0.18 mmol, 48%.
Figure 112015053331353-pct00226
실시예 A51
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 4-(메틸술파닐)부타노에이트 (#B149)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00227
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 4-(메틸술파닐)부타노에이트 (#B149)의 합성. 디클로로메탄 (0.5 mL) 중 #B148 (12 mg, 0.024 mmol, 1 당량)의 용액에 4-(메틸티오)부탄산 (32.2 mg, 0.24 mmol, 10 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (2.9 mg, 0.023 mmol, 1 당량), 및 DIC (41.3 μL, 0.264 mmol, 11 당량)를 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 디메틸술폭시드 (0.8 mL)로 희석하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B149를 검으로서 수득하였다. 수율: 9.7 mg, 0.016 mmol, 66%.
Figure 112015053331353-pct00228
실시예 A52
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{[(브로모아세틸)아미노]메틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B150)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00229
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{[(브로모아세틸)아미노]메틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B150)의 합성: 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 #B147 (7 mg, 0.01 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (8.5 μL, 0.048 mmol, 4 당량) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 (4.2 mg, 0.018 mmol, 1.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B150을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 2.9 mg, 0.005 mmol, 40%.
Figure 112015053331353-pct00230
실시예 A53
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B151)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00231
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B152)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 중 #B140 (10.7 mg, 0.022 mmol, 1 당량)의 용액에 2,6-루티딘 (10.2 μL, 0.088 mmol, 4 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (15.5 μL, 0.088 mmol, 4 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (2.7 mg, 0.022 mmol, 1 당량), 및 #B45 (22.9 mg, 0.026 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 40분 동안 교반하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B152를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 14.9 mg, 0.012 mmol, 55%. LCMS (프로토콜 C): m/z 1231.6 [M+H]+, 체류 시간 = 1.97분.
단계 2. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드, 아세테이트 염 (#B153)의 합성: 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B152 14.9 mg (0.012 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 20.4 mg (0.24 mmol, 20.0 당량)으로부터 86% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 C): m/z 1009.83 [M+H]+, 체류 시간 = 1.35분.
단계 3. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B151)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B153 11 mg (0.01 mmol, 1.0 당량) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 3.5 mg (0.015 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 5.2 mg (0.04 mmol, 4.0 당량)으로부터 70% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00232
실시예 A54
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B154)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00233
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B155)의 합성. #B152의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B147 13 mg (0.023 mmol), 2,6-루티딘 9.9 mg, (0.092 mmol, 4 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 12.0 mg (0.092 mmol, 4 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 2.8 mg, (0.023 mmol, 1 당량) 및　24.6 mg (0.028 mmol, 4당량), #B45 (22.9 mg, 0.026 mmol, 1.2 당량)로부터 41% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1247.93 [M+H]+, 체류 시간 = 0.91분.
단계 2. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드, 아세테이트 염 (#B156)의 합성. #B153의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B155 11.9 mg (0.01 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 17.0 mg (0.2 mmol, 20.0 당량)으로부터 66% 수율로 제조하였다. HPLC (프로토콜 AA) 체류 시간 = 7.001분 (순도 82%). LCMS (프로토콜 D): m/z 1025.4 [M+H]+, 체류 시간 = 0.69분.
단계 3. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]메틸}카르바모일)옥시]메틸}페닐)-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B154)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B156 6.1 mg (0.006 mmol, 1.0 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 5.0 mg (0.015 mmol, 7.0 당량) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 3.5 mg (0.015 mmol, 1.5 당량)으로부터 46% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00234
실시예 A55
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-{1-[4-({5-[(브로모아세틸)아미노]펜틸}옥시)페닐]에틸리덴}히드라지닐]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B157)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00235
단계 1. 9H-플루오렌-9-일메틸 [5-(4-아세틸페녹시)펜틸]카르바메이트 (#B158)의 합성: 톨루엔 (50 mL) 중 (9H-플루오렌-9-일)메틸 5-히드록시펜틸카르바메이트 (5 g, 15.4 mmol, 1 당량), 1-(4-히드록시페닐)에타논 (2.1 g, 15.4 mmol, 1 당량), 및 트리페닐포스핀 (4.53 g, 16.9 mmol, 1.1 당량)의 용액에 DIAD (3.43 g, 16.9 mmol, 1.1 당량)를 0-10℃에서 적가하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 에틸 아세테이트로 희석하고, 수성 포화 염화암모늄 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 10:1에서 7:1의 석유 에테르: 에틸 아세테이트로 용리시키면서 정제하고, 추가로 역상 크로마토그래피에 의해 정제하여 #B158 (3.6 g, 53%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00236
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-(1-{4-[(5-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}펜틸)옥시]페닐}에틸리덴)히드라지닐]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B159)의 합성. 화합물 #B20의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B6 30.8 mg (0.056 mmol, 1.0 당량) 및 #B158 124.0 mg (0.28 mmol, 5.0 당량)로부터 33% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 975.4 [M+H]+, 체류 시간 = 1.05분.
단계 3. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-(1-{4-[(5-아미노펜틸)옥시]페닐}에틸리덴)히드라지닐]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B160)의 합성. #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B159 17.8 mg (0.018 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 30.7 mg (0.36 mmol, 20.0 당량)으로부터 64% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 753.62 [M+H]+, 체류 시간 = 0.66분.
단계 4. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-{1-[4-({5-[(브로모아세틸)아미노]펜틸}옥시)페닐]에틸리덴}히드라지닐]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B157)의 합성: 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B160 6.2 mg (0.008 mmol, 1.0 당량) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 2.8 mg (0.012 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 4.2 mg (0.032 mmol, 4.0 당량)으로부터 46% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00237
실시예 A56
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-({[N-(브로모아세틸)-베타-알라닐]아미노}메틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B161)의 제조
Figure 112015053331353-pct00238
단계 1. 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-베타-알라니네이트 (#B162)의 합성. 실온에서 테트라히드로푸란 (3.5 mL) 중 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-β-알라닌 (297 mg, 0.95 mmol, 1 당량)의 용액에 N-히드록시숙신이미드 (112 mg, 0.954 mmol, 1 당량) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (228 mg, 1.05 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 반응물을 4시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 세척하면서 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 95%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B162를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 320 mg, 0.78 mmol, 82%. LCMS (프로토콜 D): m/z 431.0 [M+Na]+, 체류 시간 = 0.91분.
단계 2. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-베타-알라닐}아미노)메틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B163)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #B147 (15.1 mg, 0.027 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (14.3 μL, 0.081 mmol, 3 당량) 및 #B162 (22.1 mg, 0.054 mmol, 2 당량)를 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 목적 #B163 및 미반응 #B162의 혼합물을 수득하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 800.4 [M+H]+, 체류 시간 = 0.97분. 이 물질을 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 3. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(베타-알라닐아미노)메틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B164)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B163 15.7 mg (0.02 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 34.1 mg (0.4 mmol, 20.0 당량)으로부터 63% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 578.41 [M+H]+, 체류 시간 = 0.62분.
단계 4. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-({[N-(브로모아세틸)-베타-알라닐]아미노}메틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B161)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B164 7.3 mg (0.013 mmol, 1.0 당량) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 4.5 mg (0.019 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 6.8 mg (0.052 mmol, 4.0 당량)으로부터 43% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00239
실시예 A57
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}카르보닐)피페라진-1-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B165)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00240
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[4-(tert-부톡시카르보닐)피페라진-1-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B166)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.9 mL) 중 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (32 mg, 0.17 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (90.8 μL, 0.52 mmol, 3 당량) 및 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (4.2 mg, 0.034 mmol, 0.2 당량)에 이어서 #B45 (151 mg, 0.17 mmol, 1 당량)를 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 반응물을 DMSO (2.5 mL)로 희석하고, 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 95%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B166을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 114 mg, 0.12 mmol, 71%. LCMS (프로토콜 C): m/z 927.5 [M+H]+, 체류 시간 = 1.89분.
단계 2. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-(4-{[(피페라진-1-일카르보닐)옥시]메틸}페닐)-L-오르니틴아미드 (#B167)의 합성. 2분리형 용기 내에서, 실온에서 아세토니트릴 (6 mL) 중 #B166 (총 106 mg, 0.11 mmol, 1 당량)의 현탁액에 TFA (800 μL)를 첨가하고, 반응물을 1.5-2시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 아세토니트릴로 재희석시키고, 진공 하에 농축 (3x)시켰다. 조 목적 물질을 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 100%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B167을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 62 mg, 0.066 mmol, 57%. LCMS (프로토콜 D): m/z 827.4 [M+H]+, 체류 시간 = 0.72분.
단계 3. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}카르보닐)피페라진-1-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B168)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.4 mL) 중 #B39 (13.5 mg, 0.028 mmol, 1 당량)의 용액에 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (3.4 mg, 0.028 mmol, 1 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (24.7 μL, 0.14 mmol, 5 당량) 및 비스(4-니트로페닐)카르보네이트 (10.6 mg, 0.034 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 6시간 동안 교반되도록 하였다. N,N-디메틸포름아미드 (500 uL) 중 #B167 (34.5 mg, 0.037 mmol, 1.3 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (12 uL, 0.07 mmol, 2.5 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 DMSO (500 ul)로 희석하고, 디클로로메탄을 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B168을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 13 mg, 0.01 mmol, 35%. LCMS (프로토콜 C): m/z 1329.6 [M+H]+, 체류 시간 = 1.81분.
단계 4. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}카르보닐)피페라진-1-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드, 아세테이트 염 (#B169)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B168 13 mg (0.01 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 17.0 mg (0.2 mmol, 20.0 당량)으로부터 80% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1107.5 [M+H]+, 체류 시간 = 0.69분.
단계 5. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}카르보닐)피페라진-1-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B165)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B169 9.4 mg (0.008 mmol, 1.0 당량) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 2.8 mg (0.012 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 4.2 mg (0.032 mmol, 4.0 당량)으로부터 69% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00241
실시예 A58
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}피페라진-1-일)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B170)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00242
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}피페라진-1-일)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B171)의 합성: 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.1 mL) 중 #B1 (15 mg, 0.024 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디메틸포름아미드 (0.6 mL) 중 #B167 (28.2 mg, 0.03 mol, 1.25 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (16.8 μL, 0.096 mmol, 4 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 디메틸 술폭시드로 희석하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B171을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 17.8 mg, 0.013 mmol, 55%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1345.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.92분.
단계 2. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}피페라진-1-일)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B172)의 합성: 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B171 17.8 mg (0.013 mmol) 및 피페리딘 22.1 mg (0.26 mmol, 20.0 당량)으로부터 79% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 C): m/z 1122.6 [M+H]+, 체류 시간 = 1.23분.
단계 3. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}피페라진-1-일)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N~5~-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B170)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B172 12.1 mg (0.01 mmol) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 3.5 mg (0.015 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 5.2 mg (0.04 mmol, 4.0 당량)으로부터 57% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00243
실시예 A59
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S,7S)-7-[(부타노일아미노)메틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B173)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00244
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S,7S)-7-[(부타노일아미노)메틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B173)의 합성. 0℃에서 디클로로메탄 (0.4 mL) 중 #B140 (6.7 mg, 0.014 mmol, 1 당량)의 용액에 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (0.4 mg, 0.003 mmol, 0.2 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (12.3 μL, 0.07 mmol, 5 당량) 및 부티르산 (6.8 μL, 0.074 mmol, 5.3 당량)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물에 DCC (8 mg, 0.042 mmol, 3 당량)를 첨가하고, 반응물을 45분 동안 교반하였다. 반응물을 에틸 아세테이트 및 포화 중탄산나트륨으로 희석하고, 추출하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B173을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.4 mg, 0.006 mmol, 43%.
Figure 112015053331353-pct00245
실시예 A60
재조합 Fr9P를 사용한 생체촉매작용에 의한 [(3R,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-5-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B174)의 제조
Figure 112015053331353-pct00246
단계 1. 재조합 Fr9P 효소의 생산 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 정제. 코돈-최적화된 Fr9P 유전자 (실시예 4의 단계 1에 기재된 바와 같음)를 합성하고, pGS-21a (젠스크립트(GenScript))의 NcoI-HindIII 부위 내로 라이게이션하여 pAE-PF16을 생성하였다. 재조합, his6-GST 태그부착된 Fr9P 단백질을 생성하고, 플라스미드 pAE-PF16을 사용하여 변환시킨 후에 이. 콜라이 BL21(DE3)로부터 정제하였다. 0.5 L 배지 (100 mg/L 암피실린을 갖는 테리픽 브로쓰)를 함유하는 2개의 2.8-L 페른바흐 플라스크를 각각 밤새 LB 배양물 20 ml로 접종하고, 200 rpm, 25℃에서 인큐베이션하였다. OD600이 ~0.9에 도달했을 때, 세포를 0.2 mM IPTG로 유도하고, 인큐베이션을 25℃ 및 200 rpm에서 재개하였다. 18-20시간 후, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, -80℃에서 동결시켰다. 세포 펠릿을 ~50 ml 빙냉 용해 완충제 [10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4; 500 mM NaCl; 20 mM 이미다졸; 10% 글리세롤; 리소자임 1 mg/ml; 0.5% (v/v) 트윈(Tween) 20; 20 mM β-메르캅토에탄올] 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 얼음 상에서 초음파처리한 후, 세포 용해물을 14,000 rpm 및 4℃에서 45분 동안 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브에 옮기고, 다시 14,000 rpm 및 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 5 ml Ni-NTA 수지 슬러리 (퀴아젠(Qiagen))를 얼음 상에서 작은 비커 내에 함유된 상청액 분획 (투명한 용해물)에 첨가하고, 1시간 동안 서서히 교반하였다. 현탁액을 팔콘 튜브에 옮기고, 3,000 rpm 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 수지를 각각 30 ml 빙냉 세척 완충제 [10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4; 500 mM NaCl; 40 mM 이미다졸; 10% 글리세롤; 20 mM β-ME]로 3회 세척하고, 이어서 3,000 rpm 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 수지를 일회용 칼럼으로 옮기고, 각각 2.5 ml 세척 완충제로 3회 이상 세척하였다. 효소를 3x 2.5 ml 용리 완충제 [10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4; 500 mM NaCl; 250 mM 이미다졸; 10% 글리세롤; 20 mM β-ME]로 용리시켰다. 완충제를 PD-10 칼럼을 사용하여 50 mM MOPS pH 7.5로 교환하고, 용액을 30 kDa의 분자량 컷 오프를 갖는 비바스핀(Vivaspin) 칼럼을 사용하여 농축시켰다. 저장 완충제는 50 mM MOPS pH 7.5, 2 mM DTT 및 10% 글리세롤 (-80℃에서 저장하는 경우에) 또는 50% 글리세롤 (-20℃에서 저장하는 경우에)을 함유하였다. 정제된 효소의 수율은 배양물 리터당 ~25 mg이었다.
단계 2. 재조합 Fr9P를 사용한 [(3R,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-5-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B174)의 합성. 50 mM MOPS 완충제 pH 7.5 중 #NP2 (1 mg, 0.4 mM, 1 당량)의 수용액에 α-케토글루타레이트 (0.8 mM 최종 농도, 2 당량), 아스코르브산나트륨 (0.08 mM, 0.2 당량), NH4Fe(II)SO4 (0.04 mM, 0.1 당량) 및 실시예 #A60의 단계 1로부터의 재조합 Fr9P (1.2 μM, 0.003 당량)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 반응물을 아세트산을 사용하여 pH ~4-5로 산성화시키고, 에틸아세테이트의 동등 부피로 3회 추출하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 0.25 ml 아세토니트릴에 재현탁시키고, 여과하고, 역상 크로마토그래피 (방법 H)에 의해 정제하였다. 18.5분의 체류 시간으로의 분획을 수집하고, 수산화암모늄으로 중화시킨 후, 이를 감압 하에 농축시켰다. 수성 농축물을 아세트산을 사용하여 pH ~4로 산성화시키고, 에틸아세테이트의 동등 부피로 2회 추출하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 #B174를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 0.2 mg.
Figure 112015053331353-pct00247
실시예 A61
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 메틸[2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸]카르바메이트 (#B175)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00248
단계 1. N-메틸-2-(피리딘-2-일디술파닐)에탄아민, 트리플루오로아세테이트 염 (#B176)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (1 mL) 중 tert-부틸 메틸[2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸]카르바메이트 (Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 6469) (90 mg, 0.3 mmol, 1 당량)의 용액에 TFA (1 mL)를 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 아세토니트릴 (3X)과 공비혼합하여 #B176을 오일로서 수득하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 201.1 [M+H]+, 체류 시간 = 0.43분. 조 물질을 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 2. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 메틸[2-(피리딘-2-일디술파닐)에틸]카르바메이트 (#B175)의 합성: 실온에서 디클로로메탄 (0.5 mL) 중 #B39 (19.5 mg, 0.041 mmol, 1 당량)의 용액에 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (5 mg, 0.041 mmol, 1 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (21.7 μL, 0.123 mmol, 3 당량) 및 비스(4-니트로페닐)카르보네이트 (18.9 mg, 0.62 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 2.5시간 동안 교반되도록 하였다. 추가의 비스(4-니트로페닐)카르보네이트 (3.1 mg, 0.008 mmol, 0.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 추가로 1.5시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄 (0.4 mL) 중 #B176 (44.1 mg, 0.103 mmol, 2.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (54 μL, 0.31 mmol, 7.5 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄 (0.2 mL) 중 #B176 (17 mg, 0.04 mmol, 1 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (44 μL, 0.25 mmol, 6 당량)의 추가의 용액을 첨가하고, 반응물을 추가로 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DMSO (1 mL)로 희석하고, 디클로로메탄을 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 100%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B175를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 7.6 mg, 0.011 mmol, 26%.
Figure 112015053331353-pct00249
실시예 A#62
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(2,2-디메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일 }아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B177)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00250
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(2,2-디메틸히드라지닐)-2-옥소에틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B177)의 합성. 실온에서 테트라히드로푸란 (1 mL) 중에 용해된 #B1 (26.8 mg, 0.042 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디메틸 히드라진 (16 μL, 0.21 mmol, 5 당량)을 첨가하였다. 40분 동안 교반한 후, 추가의 N,N-디메틸 히드라진 (6.4 μL, 0.084 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 반응물을 5분 동안 교반하였다. 반응물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 합한 유기부를 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용매를 진공 하에 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B177을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 14.5 mg, 0.025 mmol, 60%.
Figure 112015053331353-pct00251
실시예 A#63
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({트랜스-3-[(1H-이미다졸-1-일카르보닐)아미노]시클로부틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B178)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00252
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-({트랜스-3-[(1H-이미다졸-1-일카르보닐)아미노]시클로부틸}아미노)-2-옥소에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]- 2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B178)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.5 mL) 중 #B73 (15.3 mg, 0.025 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (8.8 μL, 0.05 mmol, 2 당량) 및 카르보닐디이미다졸 (4.9 mg, 0.03 mmol, 1.2 당량)을 첨가하고, 반응물을 25분 동안 교반하였다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, DMSO (0.8 mL)로 희석하고, 농축시켜 디클로로메탄을 제거하였다. 조 목적 물질을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B178을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 3.2 mg, 0.0045 mmol, 18%.
실시예 A#64
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(테트라히드로피리다진-1(2H)-일)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B179)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00254
단계 1. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-[2-옥소-2-(테트라히드로피리다진-1(2H)-일)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피라 n-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B179)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.6 mL) 중 #B1 (18.1 mg, 0.029 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (51.1 μL, 0.29 mmol, 10 당량) 및 헥사히드로피리다진 디히드로클로라이드 (18.5 mg, 0.12 mmol, 4 당량)를 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B179를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 10.7 mg, 0.018 mmol, 61%.
Figure 112015053331353-pct00255
실시예 A#65
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N-5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B180)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00256
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-(9,9-디메틸-3,7-디옥소-2,8-디옥사-4,6-디아자데스-1-일)페닐]-L-오르니틴아미드 (#B181)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (1 mL) 중 tert-부틸 아미노메틸카르바메이트 히드로클로라이드 (문헌 [J.Org.Chem., 1980, 45, 1703], 32.9 mg, 0.18 mmol, 1 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (47 μL, 0.27 mmol, 3 당량)의 용액을 N,N-디메틸포름아미드 (2 mL) 중 #B45 (161.5 mg, 0.18 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 적가하였다. 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (2 mg, 0.016 mmol, 0.1 당량)을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 tert-부틸 메틸 에테르로 희석하고, 여과하였다. 필터 케이크를 정제용 HPLC에 의해 정제하여 #B181을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 20 mg, 0.00023 mmol, 13%.
Figure 112015053331353-pct00257
단계 2. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(아미노메틸)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 트리플루오로아세테이트 염 (#B182)의 합성. #B181 (20 mg, 0.00023 mmol)에 0℃에서 예냉된 트리플루오로아세트산 (1.3 mL)을 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 농축시키고, 아세토니트릴에 녹이고, 3회 재농축시켜 #B182를 검으로서 수득하였으며, 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다: 수율: 25 mg, 0.028 mmol, 100%. LCMS (프로토콜 D): m/z 787.6 [M+H]+, 체류 시간 = 0.75분.
단계 3. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B183)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 #NP2 (14.5 mg, 0.028 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (19.7 μL, 0.11 mmol, 4 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (12 mg, 0.031 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. DMF (0.6 mL) 중 #B182 (25.2 mg, 0.028 mmol, 1 당량)를 첨가하고, 반응물을 45분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B183을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 9.8 mg, 0.0076 mmol, 27%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1288.94 [M+H]+, 체류 시간 = 0.94분.
단계 4. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 아세테이트 염 (#B184)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B183 11.9 mg (0.009 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 15.3 mg (0.18 mmol, 20.0 당량)으로부터 75% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1066.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.73분.
단계 5. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N-5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B180)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B184 7.6 mg (0.01 mmol) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 2.6 mg (0.011 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 3.7 mg (0.028 mmol, 4.0 당량)으로부터 61% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00258
실시예 A#66
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B185)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00259
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[2-(tert-부톡시카르보닐)-2-메틸히드라지닐]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B186)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (1 mL) 중 tert-부틸 1-메틸히드라진카르복실레이트 (34.8 mg, 0.24 mmol, 1.3 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (64.4 μL, 0.37 mmol, 2 당량) 및 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (11.1 mg, 0.091 mmol, 0.5 당량)에 이어서 #B45 (161 mg, 0.18 mmol, 1 당량)를 첨가하고, 반응물을 교반되도록 하였다. 4시간 후, 추가의 N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 tert-부틸 1-메틸히드라진카르복실레이트 (14 mg, 0.096 mmol, 0.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 DMSO (1 mL)로 희석하고, 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 100%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B186을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 26.1 mg, 0.029 mmol, 16%. LCMS (프로토콜 D): m/z 887.6 [M+H]+, 체류 시간 = 0.92분.
단계 2. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(2-메틸히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 트리플루오로아세테이트 염 (#B187)의 합성. #B186 (16.5 mg, 0.019 mmol, 1 당량)에 실온에서 트리플루오로아세트산 (1 mL)을 첨가하고, 반응물을 20분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 농축시키고, 아세토니트릴에 녹이고, 3회 재농축시켜 #B187을 검으로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 809.6 [M+Na]+, 체류 시간 = 0.80분.
단계 3. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B188)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 #NP1 (8.7 mg, 0.016 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (11.3 μL, 0.064 mmol, 4 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (7.4 mg, 0.019 mmol, 1.2 당량)에 이어서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 #B187 (17.1 mg, 0.019 mmol, 1.2 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (5.7 μL, 0.032 mmol, 2 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B188을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8.3 mg, 0.0064 mmol, 40%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1304.9 [M+H]+, 체류 시간 = 0.93분.
단계 4. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 아세테이트 염 (#B189)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B188 8.3 mg (0.006 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 10.2 mg (0.12 mmol, 20.0 당량)으로부터 80% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1082.81 [M+H]+, 체류 시간 = 0.66분.
단계 5. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}-2-메틸히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B185)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B189 5.5 mg (0.005 mmol, 1 당량), 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 1.7 mg (0.011 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 2.6 mg (0.02 mmol, 4.0 당량)으로부터 63% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00260
실시예 A#67
N-{7-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-7-옥소헵타노일}-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B190)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00261
단계 1. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B191)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #B6 (19.4 mg, 0.035 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (24.7 μL, 0.14 mmol, 4 당량), 2,6-루티딘 (16.3 μL, 0.14 mmol, 4 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (4.3 mg, 0.035 mmol, 1 당량) 및 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (40.6 mg, 0.053 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 2.5시간 동안 교반하였다. 추가의 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (13.5 mg, 0.018 mmol, 0.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 추가로 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B191을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 9.4 mg, 0.0081 mmol, 23%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1177.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.90분.
단계 2. L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 아세테이트 염 (#B192)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B191 9.4 mg (0.008 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 13.6 mg (0.16 mmol, 20.0 당량)으로부터 56% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 955.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.65분.
단계 3. N-{7-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-7-옥소헵타노일}-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B190)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.3 mL) 중 #B192 (4.5 mg, 0.004 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (3.5 μL, 0.02 mmol, 5 당량)에 이어서 1,1'-[(1,7-디옥소헵탄-1,7-디일)비스(옥시)]디피롤리딘-2,5-디온 (문헌 [J.Am.Chem.Soc. 2006, 128, 2802]에서와 같이 제조됨, 8.9 mg, 0.025 mmol, 6.2 당량)을 첨가하고, 반응물을 35분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B190을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 1.65 mg, 0.0014 mmol, 34%.
Figure 112015053331353-pct00262
실시예 A#68
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 (#B193)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00263
단계 1. 6-[(브로모아세틸)아미노]헥산산 (#B194)의 합성. 6-아미노헥산산 (14.2 g, 0.11 mol, 1 당량))을 0℃에서 물 (30 mL) 중 KOH (6.2 g, 0.11 mol, 1 당량)에 첨가하였다. 탄산칼륨 용액 (2.8 N)을 적가하여 pH > 7.8로 조정하면서 브로모아세틸 브로마이드 (26.1 g, 0.13 mol, 1.2 당량)를 적가하였다. 첨가한 후, 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 M HCl에 의해 산성화시켜 pH을 1로 조정하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄:메탄올 50:1로 용리시키면서 정제하여 #B194 (10.2 g, 38%)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2. 펜타플루오로페닐 6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노에이트 (#B195)의 합성. 디클로로메탄 (400 mL) 중 #B194 (8 g, 31.7 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (13.3 g, 45.7 mmol, 1.45 당량) 및 피리딘 (10 g, 127 mmol, 4 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.5 M HCl로 세척하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 에틸 아세테이트 (PE 중 49.2%)로 용리시키면서 정제하여 #B195 (9.5 g, 71.7%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00264
단계 3. 메틸 (2E)-3-(2-{[N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐]아미노}페닐)프로프-2-에노에이트 (#B196)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (600 mL) 중 메틸 (2E)-3-(2-아미노페닐)프로프-2-에노에이트 (14 g, 79.1 mmol, 1 당량), N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닌 (22.4 g, 119 mmol, 1.5 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (16.1 g, 119 mmol, 1.5 당량), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (22.8 g, 119 mmol, 1.5 당량), 및 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (1.93 g, 15.8 mmol, 0.2 당량)의 혼합물을 50℃에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (1500 mL) 및 물 (500 mL)로 희석하였다. 유기 층을 분리하고, 물 (300 mL x 2)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 20:1에서 5:1의 석유 에테르:에틸 아세테이트로 용리시키면서 정제하여 조 #B196 (21 g, 76.4%)을 황색 오일로서 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 4. 메틸 3-(2-{[N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐]아미노}페닐)프로파노에이트 (#B197)의 합성. 메탄올 (1 L) 중 조 #B196 (21 g, 60.3 mmol, 1 당량)의 용액에 20℃에서 Pd/C (4 g)를 첨가하고, 반응 혼합물을 수소 (35 psi) 하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축 건조시켜 조 #B197 (19 g, 90.5%)을 황색 오일로서 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 5. 3-(2-{[N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닐]아미노}페닐)프로판산 (#B198)의 합성. 테트라히드로푸란 (150 mL) 중 조 #B197 (19 g, 54.2 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 수산화나트륨 (110 mL, 2 M)을 첨가하고, 반응물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 테트라히드로푸란을 진공 하에 제거하고, 생성된 용액을 1 M HCl에 의해 pH = 3-4로 조정하고, 에틸 아세테이트 (100 mL x 3)로 추출하였다. 추출물을 염수 (20 mL x 1)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켜 조 #B198 (16 g, 88.9%)을 갈색 오일로서 수득하였다.
단계 3. 3-[2-(L-알라닐아미노)페닐]프로판산 트리플루오로아세테이트 염 (#B199)의 합성. 디클로로메탄 (150 mL) 중 #B198 (16 g, 47.5 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 TFA (100 mL)를 첨가하고, 반응물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축 건조시키고, 잔류물을 후속 단계에 추가의 정제 없이 직접 사용하였다.
단계 4. 3-[2-({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닐}아미노)페닐]프로판산 (#B200)의 합성. 아세톤 (50 mL) 및 물 (100 mL) 중 #B199 (5 g, 21.1 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 중탄산나트륨 (5.30 g, 63.4 mmol, 3 당량)을 첨가하였다. 이어서, 아세톤 (50 mL) 중 9H-플루오렌-9-일메틸카르보노클로리데이트 (4.94 g, 19.1 mmol, 0.9 당량)를 0℃에서 적가하였다. 반응물을 1 M HCl을 사용하여 pH = 3-4로 조정하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 메탄올:디클로로메탄 (1.5%~2%)으로 용리시키면서 정제하여 조 생성물을 수득하였으며, 이를 추가로 정제용 HPLC에 의해 정제하여 백색 고체를 수득하였으며, 이를 SFC-분리에 의해 추가로 정제하여 #B200 (560 mg, 5.8%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00265
단계 5. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 3-[2-({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-알라닐}아미노)페닐]프로파노에이트 (#B201)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.5 mL) 중 #B148 (21.2 mg, 0.043 mmol, 1 당량)의 용액에 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (3.5 mg, 0.029 mmol, 0.67 당량), N,N-디메틸포름아미드 (0.3 mL) 중 #B200 (39.4 mg, 0.086 mmol, 2 당량)의 용액, 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (23.2 mg, 0.107 mmol, 2.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 2.5시간 동안 교반되도록 하였다. 추가의 DCC (23 mg, 0.107 mmol, 2.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 추가로 2시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 DMSO (0.7 mL)로 희석하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B201을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8.6 mg, 0.009 mmol, 21%. LCMS (프로토콜 D): m/z 954.57 [M+Na]+, 체류 시간 = 1.10분.
단계 6. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 3-[2-(L-알라닐아미노)페닐]프로파노에이트 아세테이트 염 (#B202)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B201 15.1 mg (0.016 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 27.2 mg (0.32 mmol, 20.0 당량)으로부터 70% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 955.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.65분.
단계 7. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 (#B203)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 #B202 (9 mg, 0.01 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (8.5 μL, 0.048 mmol, 4 당량)에 이어서 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발리네이트 (10.5 mg, 0.024 mmol, 2 당량)를 첨가하고, 반응물을 20분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B203을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 7.4 mg, 0.007 mmol, 60%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1031.9 [M+H]+, 체류 시간 = 1.11분.
단계 8. L-발릴-N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 아세테이트 염 (#B204)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B203 7.4 mg (0.007 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 11.9 mg (0.14 mmol, 20.0 당량)으로부터 87% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 809.9 [M+H]+, 체류 시간 = 0.81분.
단계 9. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-메톡시-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 (#B193)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 #B204 (5.3 mg, 0.006 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (6.3 μL, 0.036 mmol, 6 당량)에 이어서 #B195 (2.9 mg, 0.007 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B193을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.1 mg, 0.004 mmol, 65%.
Figure 112015053331353-pct00266
실시예 A#69
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}테트라히드로피리다진-1(2H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B205)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00267
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N5-카르바모일-N-(4-{[(테트라히드로피리다진-1(2H)-일카르보닐)옥시]메틸}페닐)-L-오르니틴아미드 (#B206)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 헥사히드로피리다진 디히드로클로라이드 (11.1 mg, 0.07 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (49.3 μL, 0.28 mmol, 4 당량) 및 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (4.3 mg, 0.035 mmol, 0.5 당량)에 이어서 #B45 (61.6 mg, 0.07 mmol, 1 당량)를 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (5%에서 95%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B206을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 19.8 mg, 0.024 mmol, 34%. LCMS (프로토콜 D): m/z 827.63 [M+H]+, 체류 시간 = 0.84분.
단계 2. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}테트라히드로피리다진-1(2H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B207)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.15 mL) 중 #NP1 (15.5 mg, 0.029 mmol, 2 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (19.7 μL, 0.11 mmol, 8 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (11.3 mg, 0.029 mmol, 2.1 당량)에 이어서 N,N-디메틸포름아미드 (0.6 mL) 중 #B206 (11.4 mg, 0.014 mmol, 1 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 22시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B207을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.2 mg, 0.003 mmol, 22%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1345.2 [M+H]+, 체류 시간 = 0.97분.
단계 3. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}테트라히드로피리다진-1(2H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 아세테이트 염 (#B208)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B207 9.8 mg (0.007 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 11.9 mg (0.14 mmol, 20.0 당량)으로부터 67% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1122.95 [M+H]+, 체류 시간 = 0.74분.
단계 4. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}테트라히드로피리다진-1(2H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B205)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B208 5.6 mg (0.005 mmol, 1 당량), 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 1.7 mg (0.007 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 2.6 mg (0.02 mmol, 4.0 당량)으로부터 52% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00268
실시예 A#70
(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B209)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00269
단계 1. (2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]-4-히드록시펜트-2-엔아미드 (#B209)의 합성. 0℃에서 테트라히드로푸란 (0.4 mL) 중 #B4 (13.1 mg, 0.027 mmol, 1 당량)의 용액에 DCC (11.7 mg, 0.054 mmol, 2 당량)를 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반하였다. N-히드록시숙신이미드 (6.3 mg, 0.054 mmol, 2 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 5시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 아세토니트릴로 희석하고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (0.5 mL)에 녹이고, 히드라진 (THF 중 1 M, 270 μL, 0.27 mmol, 10 당량)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 10분 동안 교반하고, 디메틸 술폭시드로 희석하고, 농축시켜 디클로로메탄을 제거하고, 여과하였다. 조 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B209를 고체로서 수득하였다. 수율: 8.1 mg, 59%.
Figure 112015053331353-pct00270
실시예 A#71
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-브로모-6-메틸-2,5,8,11,18-펜타옥소-9-(프로판-2-일)-3,4,7,10,17-펜타아자노나데스-1-일]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B210)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00271
단계 1. 9H-플루오렌-9-일메틸-{6-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-6-옥소헥실}카르바메이트 (#B211)의 합성. 테트라히드로푸란 (250 mL) 중 6-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)헥산산 (6 g, 16.9 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 N-히드록시숙신이미드 (2.13 g, 18.5 mmol, 1.1 당량) 및 DCC (3.5 g, 18.59 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 반응물을 20℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 -20℃로 냉각시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 MTBE (300 mL) 중에서 20분 동안 교반하고, 다시 여과하였다. 필터 케이크를 진공 하에 건조시켜 #B211 (5.6 g, 73%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발린 (#B212)의 합성. 0℃에서 물 (60 mL) 및 테트라히드로푸란 (30 mL) 중 L-발린 (1.5 g, 12.8 mmol, 1 당량)의 용액에 NaHCO3 (1.37 g, 16.3 mmol, 1.3 당량)을 첨가하였다. 이어서, 디메톡시에탄 (80 mL) 및 테트라히드로푸란 (80 mL) 중 #B211 (5.67 g, 12.6 mmol, 0.98 당량)의 용액을 0-10℃에서 적가하고, 반응물을 20℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 시트르산을 첨가하여 4로 조정하고, 반응 혼합물을 농축시켰다. 에틸 아세테이트 (450 mL) 및 메탄올 (50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 100:1에서 8:1의 디클로로메탄:메탄올로 용리시키면서 정제하여 #B212 (2.6 g, 45%)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 3. 2,5-디옥소피롤리딘-1-일-N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발리네이트 (#B213)의 합성. 0℃에서 테트라히드로푸란 (60 mL) 중 #B212 (2 g, 4.42 mmol, 1 당량)의 용액에 N-히드록시숙신이미드 (0.53 g, 4.65 mmol, 1.05 당량) 및 DCC (0.88 g, 4.65 mmol, 1.05 당량)를 첨가하고, 반응물을 20℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 -20℃로 냉각시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 MTBE (300 mL) 중에서 20분 동안 교반하고, 여과하였다. 필터 케이크를 진공 하에 건조시켜 #B213 (1.9 g, 79%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 4. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-L-알라닌 (#B214)의 합성. 0℃에서 물 (15 mL) 및 테트라히드로푸란 (10 mL) 중 L-알라닌 (0.32 g, 3.6 mmol, 1.04 당량)의 용액에 NaHCO3 (0.44 g, 5.19 mmol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 이어서, 디메톡시에탄 (30 mL) 중 #B213 (1.9 g, 3.46 mmol, 1 당량)의 용액을 0-10℃에서 적가하고, 반응물을 20℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 시트르산을 첨가하여 4로 조정하고, 반응 혼합물을 농축시켰다. 디클로로메탄 (400 mL) 및 메탄올 (50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 100:1에서 8:1의 디클로로메탄:메탄올로 용리시키면서 정제하여 잔류물을 수득하였으며, 이를 메탄올/테트라히드로푸란 (3:1)으로 3회 재결정화하여 #B214 (490 mg, 27%)를 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00272
단계 5. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(12S,15S)-1-(9H-플루오렌-9-일)-15-메틸-3,10,13,16,19-펜타옥소-12-(프로판-2-일)-2-옥사-4,11,14,17,18-펜타아자이코산-20-일]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B215)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 #B214 (11.5 mg, 0.022 mmol, 1.2 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (12.7 μL, 0.072 mmol, 4 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (8.5 mg, 0.022 mmol, 1.2 당량)에 이어서 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #B6 (10 mg, 0.018 mmol, 1 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 35분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B215를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 14.6 mg, 0.014 mmol, 77%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1056.0 [M+H]+, 체류 시간 = 0.94분.
단계 6. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{2-[(2S)-2-({(2S)-2-[(6-아미노헥사노일)아미노]-3-메틸부타노일}아미노)프로파노일]히드라지닐}-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트, 아세테이트 염 (#B216)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B215 20.8 mg (0.02 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 34.1 mg (0.4 mmol, 20.0 당량)으로부터 85% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 833.9 [M+H]+, 체류 시간 = 0.65분.
단계 7. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-브로모-6-메틸-2,5,8,11,18-펜타옥소-9-(프로판-2-일)-3,4,7,10,17-펜타아자노나데스-1-일]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B210)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B216 15.2 mg (0.017 mmol, 1 당량), 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 6.1 mg (0.026 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 8.9 mg (0.068 mmol, 4.0 당량)으로부터 57% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00273
실시예 A#72
(2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필-2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라진카르복실레이트 (#B217)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00274
단계 1. 메틸 (2R)-2-(아세틸술파닐)프로파노에이트 (#B218)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (60 mL) 중 티오아세트산칼륨 (3.9 g, 34.4 mmol, 1.2 당량)의 용액에 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 중 S-메틸-2-클로로프로파노에이트 (3.5 g, 28.7 mmol, 1 당량)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물 (150 mL)에 붓고, 석유 에테르 (100 mL)로 3회 추출하였다. 추출물을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 #B218 (4.4 g, 94.8%)을 미황색 오일로서 수득하였다.
단계 2. (2R)-2-술파닐프로판-1-올 (#B219)의 합성. 테트라히드로푸란 (116 mL) 중 LAH (3.4 g, 89.5 mmol, 5 당량)의 현탁액에 0℃에서 테트라히드로푸란 (29 mL) 중 #B218 (2.9 g, 17.9 mmol, 1 당량)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 2 N HCl (50 mL)로 조심스럽게 켄칭하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (100 mL)으로 5회 추출하고, 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용액을 약 150 mL로 진공 하에 농축시키고, 용액을 후속 단계에 추가의 정제 없이 직접 사용하였다.
단계 3. (2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올 (#B220)의 합성. 0℃에서 에탄올 (120 mL) 중 알드리티올-2 (5.9 g, 26.8 mmol, 1.5 당량) 및 아세트산 (1.07 g, 17.9 mmol, 1 당량)의 용액에 THF (150 mL, ~17.9 mmol, 1 당량) 중 #B219의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 석유 에테르:에틸 아세테이트 (10:1에서 4:1로)로 용리시키면서 정제하여 황색 오일을 수득하였으며, 이를 SFC로 다시 정제하여 #B220 (860 mg, 24%)을 미황색 오일로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00275
단계 4. 4-니트로페닐-(2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필 카르보네이트 (#B221)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.9 mL) 중 #B220 (111 mg, 0.554 mmol, 1 당량)의 용액에 피리딘 (99.4 μL, 1.22 mmol, 2.2 당량)에 이어서 디클로로메탄 (0.9 mL) 중 4-니트로페닐클로로포르메이트 (140 mg, 0.665 mmol, 1.2 당량)의 용액을 적가하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 반응물을 디클로로메탄 및 물로 희석하고, 2회 추출하고, 염수로 세척하고, 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄으로 용리시키면서 정제하여 #B221을 검으로서 수득하였다. 수율: 45 mg, 0.123 mmol, 22%. LCMS (프로토콜 D): m/z 367.2 [M+H]+, 체류 시간 = 0.99분.
단계 5. (2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필-2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라진카르복실레이트 (#B217)의 합성. 실온에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (12.7 μL, 0.072 mmol, 4 당량), 2,6-루티딘 (8.4 μL, 0.072 mmol, 4 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (2.2 mg, 0.018 mmol, 1 당량)이 첨가된 N,N-디메틸포름아미드 (0.1 mL) 중 #B6 (9.8 mg, 0.018 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디메틸포름아미드 (0.3 mL) 중 #B221 (10 mg, 0.027 mmol, 1.5 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 5.5시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B217을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.9 mg, 0.0076 mmol, 42%.
Figure 112015053331353-pct00276
실시예 A#73
N2-아세틸-L-리실-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드, 아세테이트 염 (#B222)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00277
단계 1. N2-아세틸-N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신 (#B223)의 합성. 0℃에서 테트라히드로푸란/물 (200 mL/200 mL) 중 N6-(tert-부톡시카르보닐)-L-리신 (22.5 g, 91.5 mmol, 1 당량) 및 K2CO3 (63.1 g, 0.457 mol, 5 당량)의 혼합물에 아세틸 클로라이드 (8.62 g, 0.109 mol, 1.2 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 하에 농축시켜 테트라히드로푸란을 제거하고, 수성 층을 2 M HCl을 사용하여 pH = 1로 조정하고, EtOAc (100 mL)로 3회 추출하였다. 추출물을 염수 (100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 #B223 (23.1 g, 87.7%)을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 2. N2-아세틸-L-리신 히드로클로라이드 염 (#B224)의 합성. 0℃에서 에틸 아세테이트 (400 mL) 중 #B223 (23.1 g, 0.080 mmol, 1 당량)의 용액에 질소 하에 에틸 아세테이트 (250 mL) 중 HCl (g)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 에틸 아세테이트로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 #B224 (18.5 g, >100%)를 백색 고체로서 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 3. N2-아세틸-N6-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리신 (#B225)의 합성. 0℃에서 아세톤/물 (80 mL/80 mL) 중 #B224 (8 g, 35.6 mmol, 1 당량) 및 NaHCO3 (5.99 g, 71.3 mmol, 2 당량)의 혼합물에 아세톤 (80 mL) 중 Fmoc-Cl (9.41 g, 36.3 mmol, 1.02 당량)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 2 N HCl을 사용하여 pH = 3-4로 조정하고, 에틸 아세테이트 (100 mL)로 3회 추출하였다. 추출물을 염수 (100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 조 생성물 (7 g)을 황색 오일로서 수득하였다. 조 생성물에 디클로로메탄 및 tert-부틸메틸 에테르 (100 mL)를 첨가하고, 현탁액을 30분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 필터 케이크를 진공 하에 건조시켜 #B225 (3.25 g, 22.2%)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 4. N2-아세틸-N6-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (#B226)의 합성. 0℃에서 N,N-디메틸포름아미드 (20 mL) 중 #B225 (1.04 g, 2.54 mmol, 1 당량)의 혼합물에 질소 하에 N-메틸모르폴린 (769 mg, 7.61 mmol, 3 당량), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드-HCl (632 mg, 3.30 mmol, 1.3 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (445 mg, 3.30 mmol, 1.3 당량) 및 L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-(히드록시메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (WO04010957로부터의, 1.01 g, 2.66 mmol, 1.05 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 tert-부틸메틸 에테르 (300 mL)에 붓고, 여과하였다. 고체를 디클로로메탄 (50 mL) 및 물 (50 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 #B226 (1.87 g, 95.6%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 5. N2-아세틸-N6-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (#B227)의 합성. 0℃에서 N,N-디메틸포름아미드 (30 mL) 중 #B226 (1.87 g, 2.43 mmol, 1 당량) 및 비스-(4-니트로페닐)카르보네이트 (2.21 g, 7.28 mmol, 3 당량)의 혼합물에 N,N-디이소프로필에틸아민 (313 mg, 2.43 mmol, 1 당량)을 질소 하에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 tert-부틸메틸에테르 (50 mL)에 붓고, 여과하였다. 고체 (1.95 g)을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 #B227 (580 mg, 25.7%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00278
단계 6. N2-아세틸-N6-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (#B228)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 #B209 (8.1 mg, 0.016 mmol, 1 당량)의 용액에 2,6-루티딘 (7.5 μL, 0.064 mmol, 4 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (11.3 μL, 0.064 mmol, 4 당량) 및 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (2 mg, 0.016 mmol, 1 당량)에 이어서 #B227 (17.8 mg, 0.019 mmol, 1.2 당량)을 첨가하고, 반응물을 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B228을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.5 mg, 0.004 mmol, 26%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1306.1 [M+H]+, 체류 시간 = 0.81분.
단계 7. N2-아세틸-L-리실-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드, 아세테이트 염 (#B222)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B228 9.5 mg (0.007 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 11.9 mg (0.14 mmol, 20.0 당량)으로부터 79% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00279
실시예 A#74
메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-메톡시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B229)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00280
단계 1. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B230)의 합성. 0℃에서 디클로로메탄 중 #B55 (66.8 mg, 0.122 mmol, 1 당량)의 용액에 2,6-루티딘 (71.1 μL, 0.61 mmol, 5 당량)에 이어서 tert-부틸(클로로)디메틸실란 (86.3 μL, 0.366 mmol, 3 당량)을 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온되도록 하였다. 1시간 후, 반응물을 0℃로 냉각시키고, 수성 NaHCO3으로 켄칭하고, 디클로로메탄으로 3회 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 100%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B230을 검으로서 수득하였다. 수율: 68 mg, 0.001 mmol, 84%. LCMS (프로토콜 D): m/z 686.58 [M+Na]+, 체류 시간 = 1.16분.
단계 2. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B231)의 합성. 실온에서 메탄올 (1 mL) 중 #B230 (68 mg, 0.1 mmol, 1 당량) 용액에 K2CO3 (35.2 mg, 0.255 mmol, 2.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 세척하면서 여과하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 역상 중압 액체 크로마토그래피에 의해 물 중 0.02% 아세트산 (v/v) 및 아세토니트릴 중 0.02% 아세트산 (v/v) (10%에서 100%로)으로 용리시키면서 정제하여 #B231을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 33.2 mg, 0.053 mmol, 52%. LCMS (프로토콜 D): m/z 622.55 [M+H]+, 체류 시간 = 1.09분.
단계 3. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-메톡시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B232)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #B231 (24.7 mg, 0.04 mmol, 1 당량)의 용액에 MeI (37.5 μL, 0.6 mmol, 15 당량) 및 Ag2O (55.6 mg, 0.24 mmol, 6 당량)을 첨가하고, 반응물을 암소에서 23시간 동안 교반되도록 하였다. 추가의 MeI (38 μL, 0.6 mmol, 15 당량) 및 Ag2O (55 mg, 0.24 mmol, 6 당량)을 첨가하고, 반응물을 추가로 25시간 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트 상에서 여과하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B232를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 9.4 mg, 0.015 mmol, 37%. LCMS (프로토콜 D): m/z 636.7 [M+H]+, 체류 시간 = 1.19분.
단계 4. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-메톡시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B229)의 합성. 0℃에서 테트라히드로푸란 (0.4 mL) 중 #B232 (12.6 mg, 0.02 mmol, 1 당량)의 용액에 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (테트라히드로푸란 중 1 M, 20.7 μL, 0.02 mmol, 1 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. 추가의 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (테트라히드로푸란 중 1 M, 10.3 uL, 0.01 mmol, 0.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 45분 동안 교반하였다. 반응물을 농축시키고, DMSO에 녹이고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B229를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.9 mg, 0.01 mmol, 47%.
Figure 112015053331353-pct00281
실시예 A#75
N2-아세틸-L-리실-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드, 아세테이트 염 (#B233)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00282
단계 1. N2-아세틸-N6-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-리실-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B234)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.8 mL) 중 #B6 (20.5 mg, 0.037 mmol, 1 당량)의 용액에 2,6-루티딘 (17.3 μL, 0.148 mmol, 4 당량), N,N-디이소프로필에틸아민 (26 μL, 0.148 mmol, 4 당량) 및 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (4.5 mg, 0.037 mmol, 1 당량)에 이어서 #B227 (45 mg, 0.048 mmol, 1.3 당량)을 첨가하고, 반응물을 4시간 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B234를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 18.5 mg, 0.014 mmol, 37%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1348.1 [M+H]+, 체류 시간 = 0.88분.
단계 2. N2-아세틸-L-리실-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드, 아세테이트 염 (#B233)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.7 mL) 중 #B234 (18.5 mg, 0.014 mmol, 1 당량)의 용액에 피페리딘 (27.6 μL, 0.28 mmol, 20 당량)을 첨가하고, 반응물을 20분 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 백색 고체를 수득하였으며, 이를 추가로 역상 크로마토그래피 (방법 C, 페노메넥스 루나 PFP(2) 칼럼)에 의해 정제하여 #B233을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8 mg, 0.07 mmol, 50%.
Figure 112015053331353-pct00283
실시예 A#76
메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B235)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00284
단계 1. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B235)의 합성. 실온에서 메탄올 (1 mL) 중 #B55 (60 mg, 0.11 mmol, 1 당량) 용액에 K2CO3 (37.7 mg, 0.273 mmol, 2.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 세척하면서 여과하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B235를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 31.2 mg, 0.06 mmol, 56%.
Figure 112015053331353-pct00285
실시예 A#77
(2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B236)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00286
단계 1. (2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B236)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.3 mL) 중 #NP1 (10.4 mg, 0.019 mmol, 1 당량) 및 #B220 (11.5 mg, 0.057 mmol, 3 당량)의 용액에 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (2.3 mg, 0.019 mmol, 1 당량) 및 N,N'-디-이소-프로필카르보디이미드 (8.9 μL, 0.057 mmol, 3 당량)를 첨가하고, 반응물을 75분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 농축시키고, DMSO에 녹이고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B236을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 7.6 mg, 0.011 mmol, 55%.
Figure 112015053331353-pct00287
실시예 A#78
N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B237)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00288
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B238)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.4 mL) 중 #NP1 (20.4 mg, 0.038 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (40.2 μL, 0.228 mmol, 6 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (19 mg, 0.049 mmol, 1.3 당량)에 이어서 N,N-디메틸포름아미드 (0.7 mL) 중 #B182 (34.2 mg, 0.038 mmol, 1 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 45분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B238을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 16.1 mg, 0.012 mmol, 33%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1305.3 [M+H]+, 체류 시간 = 0.92분.
단계 2. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B239)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B238 16.1 mg (0.012 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 20.4 mg (0.24 mmol, 20.0 당량)으로부터 88% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1083.1 [M+H]+, 체류 시간 = 0.67분.
단계 3. N-{6-[(브로모아세틸)아미노]헥사노일}-L-발릴-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)메틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B237)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B239 11.5 mg (0.011 mmol), 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 4 mg (0.017 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 5.7 mg (0.044 mmol, 4.0 당량)으로부터 62% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00289
실시예 A#79
메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-메톡시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-메톡시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B240)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00290
단계 1. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-8-메톡시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-메톡시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B240)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #B235 (24.2 mg, 0.048 mmol, 1 당량)의 용액에 MeI (45 μL, 0.7 mmol, 15 당량) 및 Ag2O (66.7 mg, 0.29 mmol, 6 당량)를 첨가하고, 반응물을 암소에서 23시간 동안 교반되도록 하였다. 추가의 MeI (45 μL, 0.7 mmol, 15 당량) 및 Ag2O (67 mg, 0.29 mmol, 6 당량)을 첨가하고, 반응물을 추가로 24시간 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트 상에서 여과하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B240을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 12.2 mg, 0.023 mmol, 48%.
Figure 112015053331353-pct00291
실시예 A#80
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(카르바모일아미노)메틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B241), 및 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{[(프로필카르바모일)아미노]메틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B242)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00292
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-(이소시아네이토메틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B243)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (1 mL) 중 #NP1 (25.6 mg, 0.048 mmol, 1 당량)의 용액에 트리에틸아민 (7.3 mg, 0.072 mmol, 1.5 당량)에 이어서 디페닐포스포릴 아지드 (11.7 μL, 0.053 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 반응물을 20시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 디클로로메탄으로 희석하고, 5% NaHCO3 (수성)으로 3회 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 오일을 아세토니트릴 (1 mL) 중에 용해시키고, 50℃로 1시간 동안 가열하였다. 반응물을 냉각시켜 #B243을 아세토니트릴 중 용액으로서 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. 완전 전환이 가정되었다. LCMS (프로토콜 D): m/z 533.6 [M+H]+, 체류 시간 = 0.88분.
단계 2. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(카르바모일아미노)메틸]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B241)의 합성. 실온에서 아세토니트릴 (0.5 mL) 중 #B243 (12.8 mg, 0.024 mmol, 1 당량)의 용액에 NH3 (메탄올 중 7 M, 34.3 μL, 0.24 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 농축시키고, DMSO로 희석하고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B241을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 6.7 mg, 0.012 mmol, 51%.
Figure 112015053331353-pct00293
단계 3. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{[(프로필카르바모일)아미노]메틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B242)의 합성. 실온에서 아세토니트릴 (0.4 mL) 중 #B243 (9 mg, 0.02 mmol, 1 당량)의 용액에 n-프로필아민 (7 μL, 0.085 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 반응물을 10분 동안 교반하였다. 반응물을 DMSO (0.7 ml)로 희석하고, 진공 하에 농축시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B242를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 8 mg, 0.014 mmol, 80%.
Figure 112015053331353-pct00294
실시예 A#81
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{[({[(2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필]옥시}카르보닐)아미노]메틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B244)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00295
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-히드록시-7-{[({[(2R)-2-(피리딘-2-일디술파닐)프로필]옥시}카르보닐)아미노]메틸}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B244)의 합성. 실온에서 디클로로메탄 (0.4 mL) 중 #B147 (8.2 mg, 0.014 mmol, 1 당량)의 용액에 트리에틸아민 (12.3 μL, 0.088 mmol, 6.3 당량)에 이어서 디클로로메탄 (0.3 mL) 중 #B221 (9.4 mg, 0.026 mmol, 1.9 당량)을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (1 mg, 0.008 mmol, 0.6 당량)을 첨가하고, 반응물을 2시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 농축시키고, DMSO (800 uL)에 녹이고, 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B244를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4 mg, 0.005 mmol, 40%.
Figure 112015053331353-pct00296
실시예 A#82
N-(24-브로모-23-옥소-4,7,10,13,16,19-헥사옥사-22-아자테트라코산-1-오일)-L-발릴-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)에틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B245)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00297
단계 1. tert-부틸 1-히드록시-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트 (#B246)의 합성. 3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1,17-디올 (25 g, 88.7 mmol, 1 당량), tert-부틸 프로프-2-에노에이트 (11.3 g, 88.7 mmol, 1 당량) 및 벤질트리메틸암모늄 히드록시드 (2.5 mL)의 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 에틸 아세테이트:디클로로메탄 (4%~10%)으로 용리시키면서 정제하여 #B246 (9.63 g, 25.7%)을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 2. tert-부틸 1-{[(4-메틸페닐)술포닐]옥시}-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트 (#B247)의 합성. 디클로로메탄 (150 mL) 중 #B246 (9.63 g, 23.5 mmol, 1 당량) 및 트리에틸아민 (3.56 g, 35.2 mmol, 1.5 당량)의 용액에 0℃에서 4-메틸벤젠술포닐 클로라이드 (6.69 g, 35.2 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 (150 mL)으로 세척하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (200 mL x 3)로 재추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 메탄올:디클로로메탄 (0.5%~0.8%)으로 용리시키면서 정제하여 #B247 (9.21 g, 69.7%)을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 3. tert-부틸 1-아지도-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트 (#B248)의 합성. 아세톤/물 (150 mL/150 mL) 중 #B247 (13.0 g, 23.0 mmol, 1 당량)의 용액에 아지드화나트륨 (3.20 g, 49.2 mmol, 2.1 당량) 및 아이오딘화나트륨 (621 mg, 3.45 mmol, 0.15 당량)을 첨가하고, 반응물을 환류 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (150 mL x 3)로 추출하고, 유기 상을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 에틸 아세테이트:석유 에테르 (12-35%)로 용리시키면서 정제하여 #B248 (8.30 g, 83. 1%)을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 4. tert-부틸 1-아미노-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-오에이트 (#B249)의 합성. 메탄올 중 #B248 (8.30 g, 19.1 mmol, 1 당량) 및 Pd/C (1.0 g)의 현탁액을 실온에서 수소 벌룬 하에 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공 하에 농축시켜 #B249 (7.80 g, 100%)를 황색 오일로서 수득하였으며, 이를 후속 단계에 직접 사용하였다.
단계 5. tert-부틸 1-브로모-2-옥소-6,9,12,15,18,21-헥사옥사-3-아자테트라코산-24-오에이트 (#B250)의 합성. 디클로로메탄 (300 mL) 중 #B249 (5.80 g, 14.1 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (5.50 g, 42.6 mmol, 3 당량) 및 브로모아세틸 브로마이드 (4.24 g, 21.3 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축 건조시키고, 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 메탄올:디클로로메탄 (0.5-0.8%)로 용리시키면서 정제하여 #B250 (5.20 g, 69.3%)을 황색 고체로서 수득하였다.
단계 6. 1-브로모-2-옥소-6,9,12,15,18,21-헥사옥사-3-아자테트라코산-24-oic 산 (#B251)의 합성. 디클로로메탄 (100 mL) 중 #B250 (5.20 g, 9.80 mmol, 1 당량)의 용액에 0℃에서 트리플루오로아세트산 (100 mL)을 첨가하고, 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켜 #B251 (6.00 g, 100%)을 황색 오일로서 수득하였다.
단계 7. 펜타플루오로페닐 1-브로모-2-옥소-6,9,12,15,18,21-헥사옥사-3-아자테트라코산-24-오에이트 (#B252)의 합성. 디클로로메탄 (150 mL) 중 #B251 (4.65 g, 9.80 mmol, 1 당량) 및 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 (4.12 g, 14.7 mmol, 1.5 당량)의 용액에 피리딘 (4.65 g, 9.80 mmol, 1.5 당량)을 0℃에서 적가하고, 용액을 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 2 M HCl (150 mL x 2)로 세척하고, 수성 상을 디클로로메탄 (150 mL x 2)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피에 의해 메탄올:디클로로메탄 (1.5-2%)로 용리시키면서 정제하여 황색 오일을 수득하였으며, 이를 추가로 정제용 HPLC에 의해 정제하여 #B252 (1.20 g, 19.1%)를 황색 오일로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00298
단계 8. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)에틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B253)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.8 mL) 중 #B51 (18.5 mg, 0.032 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (22.5 μL, 0.128 mmol, 4 당량)에 이어서 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (29.1 mg, 0.038 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 70분 동안 교반하였다. 추가의 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(4-니트로페녹시)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드 (4.9 mg, 0.006 mmol, 0.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 추가로 30분 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B253을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 13.1 mg, 0.011 mmol, 34%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1206.2 [M+H]+, 체류 시간 = 0.91분.
단계 9. L-발릴-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)에틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B254)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B253 13.1 mg (0.011 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 18.7 mg (0.22 mmol, 20.0 당량)으로부터 76% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 984.0 [M+H]+, 체류 시간 = 0.67분.
단계 10. N-(24-브로모-23-옥소-4,7,10,13,16,19-헥사옥사-22-아자테트라코산-1-오일)-L-발릴-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)에틸]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B245)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.15 mL) 중 #B254 (8.2 mg, 0.008 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (5.7 μL, 0.032 mmol, 4 당량)에 이어서 N,N-디메틸포름아미드 (0.3 mL) 중 #B252 (7.5 mg, 0.012 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B245를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 5.4 mg, 0.0038 mmol, 47%.
Figure 112015053331353-pct00299
실시예 A#83
N-(24-브로모-23-옥소-4,7,10,13,16,19-헥사옥사-22-아자테트라코산-1-오일)-L-발릴-N-[2-(3-{[트랜스-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로헥실]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 (#B255)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00300
단계 1. 트랜스-4-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]시클로헥실 (2E)-3-(2-니트로페닐)프로프-2-에노에이트 (#B257)의 합성. 디클로로메탄 (100 mL) 중 (2E)-3-(2-니트로페닐)프로프-2-엔산 (8.26 g, 55.8 mmol, 1 당량)의 용액에 #B256 (12 g, 55.8 mmol, 1 당량)에 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드-HCl (10.9 g, 55.8 mmol, 1 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (680 mg, 5.58 mmol, 0.1 당량) 및 트리에틸아민 (23 mL, 167.7 mmol, 3 당량)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축시키고, 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 석유 에테르/에틸 아세테이트 (4:1)로 용리시키면서 정제하여 #B257 (8.8 g, 40%)을 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2. 트랜스-4-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]시클로헥실 (2E)-3-(2-아미노페닐)프로프-2-에노에이트 (#B258)의 합성. 에틸 아세테이트 (150 mL) 중 #B257 (7.8 g, 20 mmol, 1 당량)의 용액에 SnCl2 2수화물 (25 g, 0.11 mol, 5.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 16시간 동안 교반하였다. 용액 pH를 수성 NaHCO3을 사용하여 pH = 8-9로 조정하고, 여과하였다. 필터 케이크를 에틸 아세테이트/메탄올로 3회 세척하고, 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 석유 에테르/에틸 아세테이트 (4:1) 및 에틸 아세테이트/메탄올 (20:1)로 용리시키면서 정제하여 #B258 (850 mg, 12%)을 황색 고체로서 수득하였다.
단계 3. 트랜스-4-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]시클로헥실 3-(2-아미노페닐)프로파노에이트 (#B259)의 합성. 실온에서 에틸 아세테이트 (10 mL) 중 #B258 (800 mg, 2.2 mmol, 1 당량)의 용액에 Pd/C (1 g)를 첨가하고, 혼합물을 수소 (35 psi) 하에 30분 동안 교반하였다. 반응물을 여과하고, 진공 하에 농축시켜 조 #B259 (500 mg, 63%)를 백색 고체로서 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 4. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-{2-[3-({트랜스-4-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]시클로헥실}옥시)-3-옥소프로필]페닐}-L-알라닌아미드 (#B260)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (20 mL) 중 #B259 (400 mg, 1.1 mmol, 1 당량)의 용액에 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-L-알라닌 (453 mg, 1.1 mmol, 1 당량), 4-N,N-디메틸아미노 피리딘 (12 mg, 0.1 mmol, 0.1 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (460 mg, 1.2 mmol, 1.1 당량)를 첨가하고, 반응물을 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 디클로로메탄/메탄올 (20:1에서 10:1로)로 용리시키면서 정제하여 #B260 (110 mg, 13%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00301
단계 5. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-(2-{3-[(트랜스-4-아미노시클로헥실)옥시]-3-옥소프로필}페닐)-L-알라닌아미드 트리플루오로아세테이트 염 (#B261)의 합성. #B260 (34.8 mg, 0.046 mmol, 1.0 당량)에 0℃에서 예냉된 트리플루오로아세트산 (0.8 mL)을 첨가하고, 반응물을 실온으로 가온시키면서 10분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 농축시키고, 아세토니트릴에 녹이고, 3회 재농축시켜 #B261를 검으로서 수득하였으며, 후속 단계에 추가의 정제 없이 사용하였다. 완전 전환이 가정되었다. LCMS (프로토콜 D): m/z 655.8 [M+H]+, 체류 시간 = 0.81분.
단계 6. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-[2-(3-{[트랜스-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로헥실]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 (#B262)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 #B4 (14.1 mg, 0.029 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (30.6 μL, 0.17 mmol, 6 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (13.6 mg, 0.035 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 5분 동안 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드 (0.6 mL) 중 #B261 (35.4 mg, 0.046 mmol, 1.6 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B262를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 22.8 mg, 0.02 mmol, 70%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1131.2 [M+H]+, 체류 시간 = 0.96분.
단계 7. L-발릴-N-[2-(3-{[트랜스-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로헥실]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 (#B263)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B262 22.8 mg (0.02 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 34.1 mg (0.40 mmol, 20.0 당량)으로부터 88% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 908.54 [M+H]+, 체류 시간 = 0.64분.
단계 8. N-(24-브로모-23-옥소-4,7,10,13,16,19-헥사옥사-22-아자테트라코산-1-오일)-L-발릴-N-[2-(3-{[트랜스-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로헥실]옥시}-3-옥소프로필)페닐]-L-알라닌아미드 (#B255)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL) 중 #B263 (16.1 mg, 0.018 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 N,N-디이소프로필에틸아민 (12.7 μL, 0.072 mmol, 4 당량)에 이어서 #B252 (9.4 mg, 0.034 mmol, 1.9 당량)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 15분 동안 교반되도록 하였다. N,N-디메틸포름아미드 (0.3 mL) 중 추가의 #B252 (8.8 mg, 0.014 mmol, 0.75 당량)를 첨가하고, 반응물을 추가 15분 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B255를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 14.4 mg, 0.011 mmol, 59%.
Figure 112015053331353-pct00302
실시예 A#84
메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-메톡시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일] 아세테이트 (#B265) 및 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-메톡시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B264)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00303
단계 1. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-메톡시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일] 아세테이트 (#B265)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.7 mL) 중 #NP1 (32.9 mg, 0.061 mmol, 1 당량)의 용액에 MeI (114 μL, 1.83 mmol, 30 당량) 및 Ag2O (170 mg, 0.73 mmol, 12 당량)을 첨가하고, 반응물을 암소에서 72시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 N,N-디메틸포름아미드 (0.8 mL)로 세척하면서 셀라이트 상에서 여과하고, 두 부분으로 분할하였다. 한 부분을 단계 2로 보내었으며, 다른 부분을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B265를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.66 mg, 0.008 mmol, 14%.
Figure 112015053331353-pct00304
단계 2. 메틸 [(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-메톡시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세테이트 (#B264)의 합성. 실온에서 메탄올 (0.6 mL) 중 #B265 (20 mg, 0.035 mmol, 1 당량)의 용액에 K2CO3 (12.2 mg, 0.088 mmol, 2.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 45분 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 에틸 아세테이트로 세척하면서 여과하였다. 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B264를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.2 mg, 0.008 mmol, 23%.
Figure 112015053331353-pct00305
실시예 A#85
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-카르바모일벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B266)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00306
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-카르바모일벤질)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B266)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #B1 (18.7 mg, 0.03 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (21.2 μL, 0.12 mmol, 2 당량) 및 4-(아미노메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드 염 (11.2 mg, 0.06 mmol, 2 당량)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B266을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 15.4 mg, 0.023 mmol, 77%.
Figure 112015053331353-pct00307
실시예 A#86
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-카르바모일페닐)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B267)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00308
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-카르바모일페닐)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B267)의 합성. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #NP1 (12.4 mg, 0.023 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (20.2 μL, 0.12 mmol, 5 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (10.9 mg, 0.028 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 5분 동안 교반하였다. 4-아미노벤즈아미드 (6.3 mg, 0.046 mmol, 2 당량)를 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B267을 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 4.5 mg, 0.007 mmol, 30%.
Figure 112015053331353-pct00309
실시예 A#87
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-브로모-6-메틸-2,5,8,11,18-펜타옥소-9-(프로판-2-일)-3,4,7,10,17-펜타아자노나데스-1-일]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B268)의 제조.
Figure 112015053331353-pct00310
단계 1. N-(6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥사노일)-L-발릴-N-(4-{9-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3,7-디옥소-2-옥사-4,6,8-트리아자논-1-일}페닐)-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B269)의 합성. 아세토니트릴 (1 mL) 중 #B243 (19.7 mg, 0.037 mmol, 1 당량)의 용액에 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL)를 첨가하고, 아세토니트릴을 진공 하에 제거하였다. 이 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (32.6 μL, 0.19 mmol, 5 당량)에 이어서 #B182 (40.5 mg, 0.045 mmol, 1.22 당량)의 용액을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 추가의 N,N-디이소프로필에틸아민 (32.6 μL, 0.19 mmol, 5 당량)을 첨가하고, 반응물을 추가 70분 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 A)에 의해 정제하여 #B269를 백색 고체로서 수득하였다. 수율: 12 mg, 0.009 mmol, 25%. LCMS (프로토콜 D): m/z 1320.4 [M+H]+, 체류 시간 = 0.91분.
단계 2. N-(6-아미노헥사노일)-L-발릴-N-(4-{9-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3,7-디옥소-2-옥사-4,6,8-트리아자논-1-일}페닐)-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 아세테이트 염 (#B270)의 합성. 화합물 #B47의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B269 19.8 mg (0.015 mmol, 1.0 당량) 및 피페리딘 25.5 mg (0.3 mmol, 20.0 당량)으로부터 69% 수율로 제조하였다. LCMS (프로토콜 D): m/z 1097.78 [M+H]+, 체류 시간 = 0.64분.
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-브로모-6-메틸-2,5,8,11,18-펜타옥소-9-(프로판-2-일)-3,4,7,10,17-펜타아자노나데스-1-일]-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B268)의 합성. 화합물 #B150의 제조를 위해 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 #B270 12 mg (0.01 mmol, 1 당량), 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 3.5 mg (0.015 mmol, 1.5 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 5.2 mg (0.04 mmol, 4.0 당량)으로부터 64% 수율로 제조하였다.
Figure 112015053331353-pct00311
실시예 #A88
(2E)-4-아미노-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]펜트-2-엔아미드 (#B271) 및 (2Z)-4-아미노-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]펜트-2-엔아미드 (#B272)의 제조
Figure 112015053331353-pct00312
단계 1. (2E)-4-아미노-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]펜트-2-엔아미드 (#B271) 및 (2Z)-4-아미노-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]펜트-2-엔아미드 (#B272)의 합성: 100 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4 (3.57 ml)에 #B129 (7 mg, 0.23 ml DMSO 중, 1 당량), 이소프로필아민 (포스페이트 완충제 pH 3 중에 제조된 1 M 용액 1.475 ml, pH ~7의 용액을 제공함, 100 당량), 피리독살 포스페이트 (포스페이트 완충제 pH 7.4 중 50 mM 용액 0.295 ml, 1 당량), 및 ATA-P2-B01 효소 생산물 (33 mg, 0.33 ml 포스페이트 완충제 pH 7.4 중, 코덱시스(Codexis), 로트 # D11134, 아세토페논에 대해 R-선택적)을 첨가하였다. 30℃, 200 rpm에서 19시간 동안 인큐베이션한 후, pH를 수산화나트륨을 사용하여 ~12로 조정하고, 반응물을 에틸아세테이트의 동등 부피로 7회 추출하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 0.25 ml 아세토니트릴/물 1:1에 재현탁시키고, 여과하고, 역상 크로마토그래피에 의해 총 10회 실행 (방법 I)으로 정제하였다. 10 및 13분의 체류 시간으로의 분획을 수집하고, 수산화암모늄으로 중화시킨 후, 동결건조시켜 각각 #B271 및 #B272를 백색 고체로서의 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00313
Figure 112015053331353-pct00314
실시예 #A89
(2E)-4-아미노-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]펜트-2-엔아미드 (#B273)의 제조
Figure 112015053331353-pct00315
단계 1. (2E)-4-아미노-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-아미노-2-옥소에틸)-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]펜트-2-엔아미드 (#B273)의 합성. #B129 (2.9 mg, 0.1 ml DMSO 중, 1 당량)에 피리독살 포스페이트 (포스페이트 완충제 pH 7.4 중 50 mM 용액 0.125 ml, 1 당량), 및 이소프로필아민 (포스페이트 완충제 pH 3 중에 제조된 1 M 용액 0.625 ml, pH ~7의 용액을 제공함, 100 당량), ATA-251 효소 생산물 (15 mg, 0.15 ml 포스페이트 완충제 pH 7.4 중, 코덱시스, 로트 # D11140, 아세토페논에 대해 S-선택적) 및 100 mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4 (1.6 ml)의 혼합물 (이들을 45℃, 200 rpm에서 1시간 동안 사전-인큐베이션함)을 첨가하였다. 37℃, 200 rpm에서 22시간 동안 인큐베이션한 후, pH를 수산화나트륨을 사용하여 ~12로 조정하고, 반응물을 에틸아세테이트의 동등 부피로 7회 추출하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 잔류물을 0.25 ml 아세토니트릴/물 1:1에 재현탁시키고, 여과하고, 역상 크로마토그래피에 의해 총 4회 실행 (방법 J)으로 정제하였다. 9분의 체류 시간으로의 분획을 수집하고, 수산화암모늄으로 중화시킨 후, 동결건조시켜 #B273을 백색 고체로서의 수득하였다. 수율: 0.7 mg.
Figure 112015053331353-pct00316
실시예 #A90
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S)-7-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B274)의 제조
Figure 112015053331353-pct00317
단계 1. [(3R,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-5-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B174)의 합성. 50 mM MOPS 완충제 pH 7.5 중 #NP2 (4 mg, 0.4 mM, 1 당량)의 수용액에 α-케토글루타레이트 (0.8 mM 최종 농도, 2 당량), 아스코르브산나트륨 (0.08 mM, 0.2 당량), NH4Fe(II)SO4 (0.04 mM, 0.1 당량) 및 실시예 #A60의 단계 1로부터의 재조합 Fr9P (1.6 μM, 0.004 당량)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 반응물을 아세트산을 사용하여 pH ~4-5로 산성화시키고, 에틸아세테이트의 동등 부피로 3회 추출하였다. 용매를 감압 하에 증발시켜 #B174를 수득하였으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다. LCMS m/z 536 [M+H]+.
단계 2. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S,7S)-7-히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B274)의 합성
0℃에서 DMF (0.05M) 중 #B174 (4.0 mg; 0.0075 mmol)에 HATU (1.4 당량)을 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. DIPEA (1 당량)에 이어서 DMF 중 프로필아민 (1.5 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 아세토니트릴로 희석하고, 역상 HPLC (프로토콜 K): 체류 시간 = 10.8분에 의해 정제하였다; 생성물을 함유하는 분획을 즉시 동결 및 동결건조시켜 #B274를 백색 고체 (2.4 mg; 수율 60%)로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00318
실시예 #A91
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4,7-디히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B275)의 제조
Figure 112015053331353-pct00319
단계 1. [(3R,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-5,8-디히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세트산 (#B276)의 합성: 50 mM MOPS 완충제 pH 7.5 중 #NP1 (4 mg, 0.4 mM, 1 당량)의 수용액에 α-케토글루타레이트 (0.8 mM 최종 농도, 2 당량), 아스코르브산나트륨 (0.08 mM, 0.2 당량), NH4Fe(II)SO4 (0.04 mM, 0.1 당량) 및 실시예 #A60의 단계 1로부터의 재조합 Fr9P (1.2 μM, 0.003 eq)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한 후, 반응물을 아세트산을 사용하여 pH ~4-5로 산성화시키고, 에틸아세테이트의 동등 부피로 3회 추출하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 수득한 조 #B276을 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 2. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4,7-디히드록시-7-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일}아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B275)의 합성
0℃에서 DMF (0.05M) 중 #B276 (4.3 mg; 0.0080 mmol)에 HATU (1.4 당량)을 첨가하고, 5분 동안 교반되도록 하였다. DIPEA (1 당량)에 이어서 DMF 중 프로필아민 (1.5 당량)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 추가량의 HATU (0.7 당량), DIPEA (1당량) 및 프로필아민 (1 당량)을 첨가하고, 혼합물을 추가의 30분 동안 교반하였다. 조 생성물을 아세토니트릴로 희석하고, 역상 HPLC (프로토콜 K): 체류 시간 = 8.60분에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 즉시 동결 및 동결건조시켜 #B275를 백색 고체 (2.3 mg; 수율 49%)로서 수득하였다.
Figure 112015053331353-pct00320
실시예 #A92
N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-N-{4-[({[트랜스-4-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로헥실]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B277)의 제조
Figure 112015053331353-pct00321
단계 1. N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-N-{4-[({[트랜스-4-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-8-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}아미노)시클로헥실]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드 (#B277)의 합성. 무수 N,N-디메틸포름아미드 (1.5 ml) 중 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]-L-발릴-N5-카르바모일-N-{4-[({[(4 니트로벤질)옥시]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-오르니틴아미드 (MalCValCitPABC-PNP, 문헌 [Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869]에서와 같이 제조됨, 16.5 mg, 0.022 mmol, 1.1 당량) 및 B76 (11.9 mg, 83% 순도, 0.019 mmol, 1.0 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (30 μL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 0.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B277을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 9.3 mg, 40%. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.5분 (순도 94%). LCMS (프로토콜 M): m/z 1229.5 [M+H]+.
실시예 #A93
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(트랜스-4-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]아미노}시클로헥실)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B278)의 제조
Figure 112015053331353-pct00322
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(트랜스-4-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]아미노}시클로헥실)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B278)의 합성. 무수 N,N-디메틸포름아미드 (1.0 mL) 중 6-말레이미도헥산산 (24.2 mg, 0.11 mmol, 5 당량) 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 49.5 mg, 0.24 mmol, 11 당량)의 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ml) 중 #B76 (13.0 mg, 83% 순도, 0.021 mmol, 1.0 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B278을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 8.6 mg, 49%. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 9.6분 (순도 96%). LCMS (프로토콜 M): m/z 824.4 [M+H]+.
실시예 #A94
(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-1-(카르복시메틸)-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-D-에리트로-펜티톨 (#NP5) [PF-06739239]의 제조
Figure 112015053331353-pct00323
단계 1. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-1-(카르복시메틸)-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-D-에리트로-펜티톨 (#NP5)의 합성. 무수 테트라히드로푸란 (1.0 mL) 중 #NP1 (101 mg, ~70% 순도, ~0.19 mmol, 1 당량)의 용액을 0℃에서 무수 아세트산 (1.0 mL) 중 염화리튬 (61 mg, 1.4 mmol, 7 당량)의 용액과 혼합하였다. 생성된 용액을 주위 온도에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #NP5를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 54.6 mg, ~76%.
Figure 112015053331353-pct00324
실시예 #A95
(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-[2-옥소-2-(펜타플루오로페녹시)에틸]-D-에리트로-펜티톨 (#B279)의 제조
Figure 112015053331353-pct00325
단계 1. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-[2-옥소-2-(펜타플루오로페녹시)에틸]-D-에리트로-펜티톨 (#B279)의 합성. 건조 N,N-디메틸포름아미드 (200 uL) 중 #NP5 (18.2 mg, 0.032 mmol, 1 당량) 및 HATU (16.8 mg)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (20 uL)을 첨가하고, 용액을 주위 온도에서 5분 동안 교반한 다음, N,N-디메틸포름아미드 (150 ul) 중 펜타플루오로페놀 (25 mg, 0.13 mmol, 4 당량)과 혼합하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 B*)를 사용하여 정제하여 #B279를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 15.1 mg, 74%.
Figure 112015053331353-pct00326
실시예 #A96
(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-1-[2-({2-[(브로모아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-D-에리트로-펜티톨 (#B280)의 제조
Figure 112015053331353-pct00327
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)아미노]-2-옥소에틸}-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B281)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 중 #NP1 (122.1 mg, ~67% 순도, 0.22 mmol, 1.2 당량) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 151 mg, 0.30 mmol, 1.7 당량)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 60 uL)을 첨가하고, 생성된 용액을 주위 온도에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 N-플루오레닐메틸옥시카르보닐-1,2-디아미노에탄 히드로브로마이드 (73 mg, 0.2 mmol, 1 당량)를 첨가하고, 생성된 용액을 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B281을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 114.5 mg, 64% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 12.7분 (순도 99%). ESIMS (양성) m/z 800.7 [M+H]+.
단계 2. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-{2-[(2-{[(9 H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}에틸)아미노]-2-옥소에틸}-D-에리트로-펜티톨 (#B282)의 합성. 무수 테트라히드로푸란 (0.4 mL) 중 #B281 (44.5 mg, 0.056 mmol)의 용액을 건조 아세트산 (0.2 mL) 중 염화리튬 (30.0 mg, 0.71 mmol)의 용액과 혼합하였다. 반응물을 주위 온도에서 1.5시간 동안 교반한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B282를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 48.0 mg, 100% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 16.0분 (순도 96%). ESIMS (양성) m/z 836.7 [M+H]+.
단계 3. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1-{2-[(2-아미노에틸)아미노]-2-옥소에틸}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-D-에리트로-펜티톨 (#B283)의 합성. DMF (2 mL) 중 #B282 (48 mg, 0.057 mmol)의 용액에 피페리딘 (20 uL)을 첨가하였다. 용액을 주위 온도에서 1시간 동안 교반한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B283을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 26.4 mg, 92% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 6.8분 (순도 91%). ESIMS (양성) m/z 614.6 [M+H]+.
단계 4. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-1-[2-({2-[(브로모아세틸)아미노]에틸}아미노)-2-옥소에틸]-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-D-에리트로-펜티톨 (#B280)의 합성. DMF (0.5 ml) 중 #B283 (9.1 mg, 0.015 mmol) 및 1-[(브로모아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 (6.2 mg, 0.024 mmol)의 용액에 N,N'-디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 5.0 uL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B280을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 5.8 mg, 53% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.0분 (순도 99%). ESIMS (양성) m/z 736.6 [M+H]+.
실시예 #A97
(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-(2-메톡시-2-옥소에틸)-D-에리트로-펜티톨 (#B284)의 제조
Figure 112015053331353-pct00328
단계 1. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-(2-메톡시-2-옥소에틸)-D-에리트로-펜티톨 (#B284)의 합성. N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 중 #NP5 (6.2 mg, 0.011 mmol, 1 당량) 및 탄산칼륨 (20.0 mg, 0.14 mmol, 12 당량)의 현탁액에 메틸 아이오다이드 (20 uL, 0.32 mmol, 29 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B284를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 5.6 mg, 90% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 12.7분 (순도 97%). ESIMS (양성) m/z 586.4 [M+H]+.
실시예 #A98
(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(2S,4S,6S)-4-(클로로메틸)-4-히드록시-6-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]테트라히드로-2H-피란-2-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일} 아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B285)의 제조
Figure 112015053331353-pct00329
단계 1. [(2S,4S,6S)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-4-(클로로메틸)-4-히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일]아세트산 (#NP8)의 합성. 무수 테트라히드로푸란 (1.0 mL) 중 #NP2 (70.4 mg, 90% 순도, 0.19 mmol, 1 당량)의 용액을 0℃에서 건조 아세트산 (1.0 mL) 중 염화리튬 (50 mg, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액과 혼합하였다. 용액을 주위 온도에서 1.5시간 동안 교반한 다음, 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #NP8을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 52.0 mg, 72% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 11.4분 (순도 98%). ESIMS (양성) m/z 556.2 [M+H]+.
단계 2. (2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(2S,4S,6S)-4-(클로로메틸)-4-히드록시-6-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]테트라히드로-2H-피란-2-일}-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일]-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일} 아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B285)의 합성. 무수 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 ml) 중 #NP8 (5.0 mg, 0.009 mmol, 1 당량), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 5.2 mg, 0.014 mmol, 1.5 당량), 및 디이소프로필에틸아민 (휘니그 염기, 5.0 uL)의 용액을 주위 온도에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 순수한 프로필아민 (5.0 uL, 0.08, 9 당량)을 첨가하고, 용액을 1시간 동안 교반한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B285를 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.2 mg, 90% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 11.8분 (순도 95%). ESIMS (양성) m/z 597.4 [M+H]+.
실시예 #A99
(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-D-에리트로-펜티톨 (#B286)의 제조
Figure 112015053331353-pct00330
단계 1. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-[2-옥소-2-(프로필아미노)에틸]-D-에리트로-펜티톨 (#B286)의 합성. 무수 테트라히드로푸란 (1.0 ml) 중 #B63 (18.4 mg, 0.032 mmol, 1 당량)의 용액을 건조 아세트산 (0.5 mL) 중 염화나트륨 (50.0 mg)의 현탁액과 혼합하였다. 이어서, 용액을 50℃에서 5시간 동안 교반하고, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B286을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 17.5 mg, 94% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.9분 (순도 97%). ESIMS (양성) m/z 613.6 [M+H]+.
실시예 #A100
(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{[트랜스-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)시클로부틸]아미노}-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B287) 및 (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-(2-{[트랜스-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)시클로부틸]아미노}-2-옥소에틸)-D-에리트로-펜티톨 (#B288)의 제조
Figure 112015053331353-pct00331
단계 1. (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{[트랜스-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)시클로부틸]아미노}-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트 (#B287)의 합성. 1:2:3 디메틸술폭시드/포화 중탄산나트륨/물 (총 6 mL) 중 #B73 (32.5 mg, 0.05 mmol, 1 당량)의 용액에 N-메톡시카르보닐말레이미드 (45 mg, 0.29 mmol, 6 당량)를 첨가하였다. 이어서, 현탁액을 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 생성물을 에틸 아세테이트 (10 mL)로 추출하였다. 유기 층을 무수 염화마그네슘 상에서 건조시킨 다음, 감압 하에 증발 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (2 mL) 중에 재용해시키고, 트리에틸아민 (90 uL)을 첨가한 다음, 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 중화시키고, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B287을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 4.3 mg, 11% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.1분 (순도 97%). ESIMS (양성) m/z 684.4 [M+H]+.
단계 2. (1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(아세틸옥시)펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,5-안히드로-3-C-(클로로메틸)-2-데옥시-1-(2-{[트랜스-3-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)시클로부틸]아미노}-2-옥소에틸)-D-에리트로-펜티톨 (#B288)의 합성. 무수 테트라히드로푸란 (200 uL) 중 #B287 (2.7 mg)의 용액을 0℃에서 건조 아세트산 (200 uL) 중 염화리튬 (13 mg)의 용액과 혼합하였다. 용액을 주위 온도에서 0.5시간 동안 교반한 다음, 역상 크로마토그래피 (방법 F*)를 사용하여 정제하여 #B288을 백색 분말로서 수득하였다. 수율: 0.8 mg, 26% 수율. HPLC (프로토콜 N): 체류 시간 = 10.6분 (순도 92%). ESIMS (양성) m/z 720.7 [M+H]+.
접합 절차
일반적 접합 절차 A: 상업적으로 입수가능한 헤르셉틴 항체 (제넨테크 인크.(Genentech Inc.))를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자(론자))에 투석하였다. 이어서, 투석한 항체 (5-10 mg/mL)를 50 mM 보레이트 완충제 pH 8.7 중에서 2시간 동안 실온에서 반응성 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 함유하는 PL (3-12) 당량의 링커-페이로드 (디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 10 mM)와 반응시켰다. 일부 경우에, 50 mM 보레이트 완충제 pH 8.7을 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자)에 의해 대체하였다. 일부 경우에, 링커-페이로드의 용해도/반응성을 개선시키기 위해, 디메틸아세트아미드 (DMA) 또는 DMSO를 첨가하여 최종 반응 혼합물 중 10-15% (v/v) 총 유기 용매 성분을 달성하였다. 이어서, 반응 혼합물을 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스(GE Healthcare Sephadex) G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스(GE Superdex) 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러(GE AKTA Explorer) 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시키고, 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 10mM 소듐 숙시네이트 완충제, 5.4% 트레할로스 pH 5.1로 완충제 교환하였다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 B: 상업적으로 입수가능한 헤르셉틴 항체 (제넨테크 인크.) 또는 치료 항체를 50 mM 포스페이트 완충제 pH 6.8에 투석하였다. 투석한 항체 (5-10 mg/mL)를 50 mM 포스페이트 완충제 pH 6.8 중에서 2-20시간 동안 실온에서 반응성 펜타플루오로페닐 에스테르를 함유하는 PL (4-12) 당량의 링커-페이로드 (디메틸아세트아미드 (DMA) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 5-30 mM)와 반응시켰다. 일부 경우에, 링커-페이로드의 용해도/반응성을 개선시키기 위해, DMA 또는 DMSO를 첨가하여 최종 반응 혼합물 중 10-15% (v/v) 총 유기 용매 성분을 달성하였다. 이어서, 반응 혼합물을 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시키고, 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 10mM 소듐 숙시네이트 완충제, 5.4% 트레할로스 pH 5.1로 완충제 교환하였다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 C: 상업적으로 입수가능한 헤르셉틴 항체 (제넨테크 인크.) 또는 치료 항체를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자)에 투석하였다. 투석한 항체를 y(1-7) 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 증류수 중 5mM)의 첨가에 의해 환원시키고, DPBS, 5mM 2,2',2",2"'-(에탄-1,2-디일디니트릴로)테트라아세트산 (EDTA), pH 7.0 (완충제 A)을 사용하여 15 mg/mL 최종 항체 농도로 희석하였다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시켰다. PL (2 내지 15) 당량의 링커-페이로드 (디메틸아세트아미드 (DMA) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 5-10mM)의 첨가에 의해 접합을 수행하였다. 일부 경우에, 링커-페이로드의 용해도/반응성을 개선시키기 위해, DMA 또는 DMSO를 첨가하여 최종 반응 혼합물 중 10-15% (v/v) 총 유기 용매를 달성하고, 완충제 A를 첨가하여 10 mg/mL 최종 항체 농도를 달성하였다. 이어서, 반응물을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, 필요할 경우에 AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시켰다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 D: 치료 항체를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자)에 투석하였다. 투석한 항체를 y(1-7) 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 증류수 중 5mM)의 첨가에 의해 환원시키고, DPBS, 5mM 2,2',2",2"'-(에탄-1,2-디일디니트릴로)테트라아세트산 (EDTA), pH 7.0 (완충제 A)을 사용하여 15 mg/mL 최종 항체 농도로 희석하였다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시켰다. PL (2 내지 15) 당량의 링커-페이로드 (디메틸아세트아미드 (DMA) 중 5-10mM)의 첨가에 의해 접합을 수행하였다. 일부 경우에, 링커-페이로드의 용해도/반응성을 개선시키기 위해, DMA 또는 DMSO를 첨가하여 최종 반응 혼합물 중 10-15% (v/v) 총 유기 용매를 달성하고, 20X 보레이트 완충제 및 DPBS를 첨가하여 50 mM 보레이트 완충제 pH 8.7 중에서 10 mg/mL 최종 항체 농도를 달성하였다. 반응물을 3시간 동안 37℃에서 또는 16시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, 필요할 경우에 AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시켰다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 E: 천연 항체에 비해 여분의 시스테인 잔기를 보유하는 치료 항체를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자)에 투석하였다. 투석한 항체를 100 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 증류수 중 5mM)의 첨가에 의해 환원시키고, DPBS, 5mM 2,2',2",2"'-(에탄-1,2-디일디니트릴로)테트라아세트산 (EDTA), pH 7.0 (완충제 A)을 사용하여 15 mg/mL 최종 항체 농도로 희석하였다. 이어서, 반응물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 환원 후, TCEP를 밀리포어 아미콘 울트라(Millipore Amicon Ultra) 4mL 50KD MWCO 한외여과 장치를 사용하여 반응 혼합물로부터 제거하였다. 반응 혼합물을 원래 부피 1/10로 4회 농축시키고, 완충제 A를 사용하여 각 회 원래 부피로 재희석하였다. 일부 경우에, 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 완충제 A로 완충제 교환하였다. 대안적 방법, 예컨대 접선 흐름 여과 (TFF) 또는 투석이 또한 특정한 상황에 유용하였다. 환원 후, 항체의 환원된 힌지/내부 디술피드를 1-1.5mM 데히드로아스코르베이트 (DHA)를 사용하여 완충제 A 중에서 실온에서 밤새 재산화시켰다. 산화 후, DHA를 밀리포어 아미콘 울트라 4mL 50KD MWCO 한외여과 장치를 사용하여 반응 혼합물로부터 제거하였다. 반응 혼합물을 원래 부피 1/10로 4회 농축시키고, 50 mM 보레이트 완충제 pH 8.7을 사용하여 각 회 원래 부피로 재희석하였다. 일부 경우에, 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 50 mM 보레이트 완충제 pH 8.7로 완충제 교환하였다. 대안적 방법, 예컨대 TFF 또는 투석이 또한 특정한 상황에 유용하였다. PL (3 내지 12) 당량의 링커-페이로드 (디메틸아세트아미드 (DMA) 중 10mM)의 첨가에 의해 접합을 수행하였다. 일부 경우에, 링커-페이로드의 용해도/반응성을 개선시키기 위해, DMA 또는 DMSO를 첨가하여 최종 반응 혼합물 중 10-15% (v/v) 총 유기 용매를 달성하고, 20X 보레이트 완충제 및 DPBS를 첨가하여 50 mM 보레이트 완충제 pH 8.7 중에서 5-10 mg/mL 최종 항체 농도를 달성하였다. 반응물을 3시간 동안 37℃에서 또는 16시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, 필요할 경우에 AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시켰다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 F: 천연 항체에 비해 여분의 시스테인 잔기를 보유하는 치료 항체를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자)에 투석하였다. 투석한 항체를 100 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 증류수 중 5mM)의 첨가에 의해 환원시키고, DPBS, 5mM 2,2',2",2"'-(에탄-1,2-디일디니트릴로)테트라아세트산 (EDTA), pH 7.0 (완충제 A)을 사용하여 15 mg/mL 최종 항체 농도로 희석하였다. 이어서, 반응물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 환원 후, TCEP를 밀리포어 아미콘 울트라 4mL 50KD MWCO 한외여과 장치를 사용하여 반응 혼합물로부터 제거하였다. 반응 혼합물을 원래 부피 1/10로 4회 농축시키고, 완충제 A를 사용하여 각 회 원래 부피로 재희석하였다. 일부 경우에, 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 완충제 A로 완충제 교환하였다. 대안적 방법, 예컨대 접선 흐름 여과 (TFF) 또는 투석이 또한 특정한 상황에 유용하였다. 환원 후, 항체의 환원된 힌지/내부 디술피드를 1-1.5mM 데히드로아스코르베이트 (DHA)를 사용하여 완충제 A 중에서 실온에서 밤새 재산화시켰다. 산화 후, DHA를 밀리포어 아미콘 울트라 4mL 50KD MWCO 한외여과 장치를 사용하여 반응 혼합물로부터 제거하였다. 반응 혼합물을 원래 부피 1/10로 4회 농축시키고, 완충제 A를 사용하여 각 회 원래 부피로 재희석하였다. 일부 경우에, 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 완충제 A로 완충제 교환하였다. 대안적 방법, 예컨대 접선 흐름 여과 (TFF) 또는 투석이 또한 특정한 상황에 유용하였다. PL (2 내지 15) 당량의 링커-페이로드 (디메틸아세트아미드 (DMA) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 5-10mM)의 첨가에 의해 접합을 수행하였다. 일부 경우에, 링커-페이로드의 용해도/반응성을 개선시키기 위해, DMA 또는 DMSO를 첨가하여 최종 반응 혼합물 중 10-15% (v/v) 총 유기 용매를 달성하고, 완충제 A를 첨가하여 5-10 mg/mL 최종 항체 농도를 달성하였다. 반응물을 1-2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, 필요할 경우에 AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시켰다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 G:　접합 반응을 원심 한외여과 장치, 예컨대 아미콘 울트라 50k 울트라셀 필터 (부품 #UFC805096, GE)의 상부 부분에서 수행하였다. L-시스테인의 132 mM 원액을 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자) 5mM 2,2',2",2"'-(에탄-1,2-디일디니트릴로)테트라아세트산 (EDTA), pH 7.0 (완충제 A) 중에서 제조하였다. 이 용액 (50 uL)을 완충제 A 950 uL 중에서 여분의 시스테인 잔기를 보유하는 개별 돌연변이 항체 (5 mg)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물 중 최종 시스테인 농도는 6.6 mM이었다.　 반응물을 실온에서 1.5 시간 동안 정치되도록 한 후, 반응 튜브를 원심분리하여 이 물질을 대략 100 uL로 농축시켰다.　 혼합물을 완충제 A를 사용하여 1 mL로 희석하였다.　 이 과정을 시스테인 환원제 모두를 제거하기 위해 4회 반복하였다. 생성된 물질을 완충제 A 중에서 1 mL로 희석하고, 말레이미드 링커-페이로드 (디메틸 아세트아미드 (DMA) 중) (대략 5 당량)의 5 mM 용액 중 16 uL로 처리하였다. 실온에서 1.5시간 동안 정치시킨 후, 반응 튜브를 원심분리하여 이 물질을 대략 100 μL로 농축시켰다.　 혼합물을 DPBS를 사용하여 1 mL로 희석하였다.　 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, 필요할 경우에 AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시켰다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 H: 트랜스글루타민 효소-반응성 글루타민 잔기를 보유하는 치료 항체를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자)에 투석하였다. 25 mM 트리스 완충제 pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.31 mM 환원된 글루타티온 중 0.5-5.0 mg/mL 트랜스글루타미나제 반응성 글루타민 함유 항체를 5.0 - 20.0배 몰 과량의 아미노 알킬 링커 보유 페이로드 (디메틸아세트아미드 (DMA) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 5-10mM) 및 2% w/v 트랜스글루타미나제 (아지노모토 액티바 TI(Ajinomoto Activa TI))와 혼합함으로써 트랜스글루타미나제 매개 접합을 수행하였다. 이어서, 반응물을 4-16시간 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, 필요할 경우에 AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시켰다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
일반적 접합 절차 I: 천연 항체에 비해 여분의 시스테인 잔기를 보유하는 치료 항체 돌연변이체를 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS, 론자)에 투석하였다. 투석한 항체를 x(25-100) 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP, 증류수 중 5mM)의 첨가에 의해 환원시키고, DPBS, 5mM 2,2',2",2"'-(에탄-1,2-디일디니트릴로)테트라아세트산 (EDTA), pH 6.5-7.4 (완충제 A)를 사용하여 15 mg/mL 최종 항체 농도로 희석하였다. 이어서, 반응물을 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 환원 후, TCEP를 밀리포어 아미콘 울트라 4mL 50KD MWCO 한외여과 장치를 사용하여 반응 혼합물로부터 제거하였다. 반응 혼합물을 원래 부피 1/10로 4회 농축시키고, 완충제 A를 사용하여 각 회 원래 부피로 재희석하였다. 일부 경우에, 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 완충제 A로 완충제 교환하였다. 환원 후, 항체의 환원된 힌지/내부 디술피드를 1mM 데히드로아스코르베이트 (DHA)를 사용하여 완충제 A 중에서 실온에서 밤새 재산화시켰다. 산화 후, DHA를 밀리포어 아미콘 울트라 4mL 50KD MWCO 한외여과 장치를 사용하여 반응 혼합물로부터 제거하였다. 반응 혼합물을 원래 부피 1/10로 4회 농축시키고, 완충제 A를 사용하여 각 회 원래 부피로 재희석하였다. PL (2 내지 10) 당량의 링커-페이로드 (디메틸아세트아미드 (DMA) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중 5-10mM)의 첨가에 의해 접합을 수행하였다. 일부 경우에, 링커-페이로드의 용해도/반응성을 개선시키기 위해, DMA 또는 DMSO를 첨가하여 최종 반응 혼합물 중 10-15% (v/v) 총 유기 용매를 달성하고, 완충제 A를 첨가하여 5-10 mg/mL 최종 항체 농도를 달성하였다. 반응물을 1-4시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 후속적으로 제조업체의 지시에 따라 지이 헬스케어 세파덱스 G-25 M 완충제 교환 칼럼을 사용하여 DPBS (pH7.4)로 완충제 교환하였다. 조 물질을 지이 슈퍼덱스 200 칼럼 및 DPBS (pH7.4) 용리액으로 지이 AKTA 익스플로러 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 정제하였다. 이어서, 필요할 경우에 AKTA로부터의 합한 단량체 분획을 농축시켰다. ADC를 순도를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광측정법 (LC-ESI MS)을 통해 추가로 특성화하여 약물-항체 비 (로딩)를 계산하였다. 단백질 농도는 UV 분광광도계를 통해 결정하였다.
접합체의 분석에 사용되는 SEC 및 HPLC-ESI MS 조건:
프로토콜 1:
프로토콜 1 (SEC): 칼럼: 칼럼: TSK-겔 G3000SWxl, 300 x 7.8 mm, 10 μm; 이동상: 포스페이트 완충제 염수 (PBS, 1X), pH 7.4, 2% 아세토니트릴 포함; 등용매; 유량:　1 mL/분. 온도: 실온; 주입 부피: 5 μL; 기기: 애질런트 1100 HPLC.
프로토콜 1b: 칼럼: 슈퍼덱스 200 5/150 GL, 5 x 150 mm, 13 μm; 이동상: 포스페이트 완충제 염수 (PBS, 1X), pH 7.4, 2% 아세토니트릴 포함; 등용매; 유량:　1 mL/분. 온도: 실온; 주입 부피: 5 μL; 기기: 애질런트 1100 HPLC.
프로토콜 2: 프로토콜 2 (HPLC): 칼럼: 칼럼: 애질런트 포로쉘 300SB-C8, 75 x 2.1 mm, 2.6 μm; 이동상 A: 물 중 0.1% 포름산 (v/v); 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (v/v); 구배: 4분에 걸쳐 20% B에서 45% B로; 유량:　1.0 mL/분. 온도: 60℃; 검출: 220 nm; MS (+) 범위 400-2000Da; 주입 부피: 10 μL; 기기: 애질런트 1100 LC, 워터스 마이크로매스ZQ MS.　 디컨볼루션을 MaxEnt1을 사용하여 수행하였다. 샘플을 100배 과량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP) 또는 디티오트레이톨 (DTT)로 처리하고, 주사 전에 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
프로토콜 3: 칼럼: 액퀴티 UPLC BEH 200 SEC 1.7um; 이동상: 450mM NaCl; 유량:　0.5 mL/분. 온도: 35C; 주입 부피: 10 μL.
트라스투주맙 시험관내 및 생체내 연구
하기 연구에 대해, 접합된 세포독성제 부재 하의 트라스투주맙은 동등한 항체 농도에서 유의한 시험관내 효력 또는 생체내 효능을 나타내지 않는 것이 주목된다.
시험관내 세포 검정 절차
표적 발현 (BT474 (유방암), N87 (위암), HCC1954 (유방암), MDA-MB-361-DYT2 (유방암)) 또는 비-발현 (MDA-MB-468) 세포를 처리 전에 24시간 동안 96-웰 세포 배양 플레이트에 시딩하였다. 세포를 3배 연속 희석 항체-약물 접합체 또는 유리 화합물 (즉, 약물에 접합된 항체가 없음)로 10개 농도에서 2벌로 처리하였다. 세포 생존율은 처리 96시간 후에 셀타이터(CellTiter) 96® AQueous 1 용액 세포 증식 MTS 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 상대적 세포 생존율은 비처리된 대조군의 백분율로서 결정하였다. IC50 값은 XLfit v4.2 (IDBS, 영국 서리 길드포드)로 4 파라미터 로지스틱 모델 #203을 사용하여 계산하였다. 결과를 표 4 및 9에 나타내었다. 효력은 0.0002 nm로부터 상향의 범위였다. 다른 세포주에서의 시험은 표 9A에 보고된다. 유사한 절차 및 기술을 사용하였다.
생체내 N87 종양 이종이식편 모델 (도 3 및 4)
항체-약물 접합체의 생체내 효능 연구를 N87 세포주를 사용한 표적-발현 이종이식편 모델을 사용하여 수행하였다. 효능 연구를 위해, 종양 크기가 250 내지 350 mm3에 도달할 때까지 50% 매트리겔 중 750만개의 종양 세포를 6-8 주령의 누드 마우스에 피하로 이식하였다. 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 처리에 대한 종양 반응에 따라, 동물에 1-10 mg/kg의 항체 약물 접합체를 주사하여 매 4일마다 4회 처리하였다. 모든 실험 동물을 매주 체중 변화에 대해 모니터링하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 처음 50일 동안은 주 2회, 및 그 후에는 주 1회 측정하고, 하기 식: 종양 부피 = (길이 x 너비2) / 2를 사용하여 계산하였다. 동물은 인도적으로 그의 종양 부피가 2500 mm3에 도달하기 전에 안락사시켰다. 종양 크기는 처리 제1주 후에 감소하는 것으로 관찰되었다. 처리가 중지된 후에 동물을 종양 재성장에 대해 계속 모니터링할 수 있다.
N87 마우스 이종이식편 생체내 스크리닝 모델에서의 ADC 3, 4 및 5 및 ADC 14 및 15의 시험 결과를 도 3 및 4에 제시하였다.
표 1은 실시예 #B82-#B108에 대한 제조 세부사항을 제공한다.
표 2는 실시예 #B82 - #B108에 대한 특성화 데이터를 제공한다.
표 3은 페이로드-링커 #B109 - #B117의 제조를 제공한다.
표 4는 천연 생성물 및 합성 유사체에 대한 시험관내 세포독성 데이터를 제시한다.
표 5는 페이로드-링커 #B109 - #B117에 대한 특성화 데이터를 제공한다.
표 6은 ADC의 구조 및 이들을 제조하는데 사용된 페이로드 링커를 제공한다.
표 7은 예시된 ADC의 일반적 제조 방법을 제공한다.
표 8은 예시된 ADC에 대한 분석 데이터를 제공한다.
표 9는 표 9: ADC에 대한 시험관내 세포독성 데이터를 제시한다.
<표>
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1아민을 메탄올에 용해시키고, 과량의 N,N-디이소프로필에틸아민으로 유리 염기화시킴. 전체 혼합물을 반응에 첨가함.
2출발 아민을 문헌 [Eur. Pat. Appl. (1996)], EP 694536 A1 19960131에 기재된 바와 같이 제조함
3HPLC 분획을 암모니아 히드록시드로 중화시킨 다음, 동결건조시킴
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<표 6> ADC의 구조 및 이들을 제조하는데 사용된 페이로드 링커
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<표 7> ADC의 일반적 제조 방법
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1 반응 시간 = 16시간, 2 반응 시간 = 4시간 3 반응 시간 = 20시간
a 2,2',2"- 포스판트리일트리프로판산의 양 (TCEP)= 사용된 y
* 사용된 반응 완충제는 50 mM 보레이트 완충제 대신에 DPBS, 5 mM EDTA pH 7.0임.
** 사용된 반응 완충제는 50 mM 보레이트 완충제 대신에 180mM HEPES 완충제 pH8.8임.
<표 8> ADC의 분석 데이터
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<표 9> ADC에 대한 시험관내 세포독성 데이터
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<표 9A> ADC에 대한 시험관내 세포독성 데이터
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Figure 112015053331353-pct00390
Figure 112015053331353-pct00391
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. Subramanyam, Chakrapani Koehn, Frank DiRico, Kenneth Green, Michael E He, Haiyin He, Min O'Donnell, Christopher J Puthenveetil, Sujiet J Ratnayake, Anokha J Teske, Jesse Yang, Winnie H Eustaquio, Alessandra S <120> Spliceostatin Analogs and Methods for Their Preparation <130> PC71885A <150> 61/722,769 <151> 2012-11-05 <150> 61/723,645 <151> 2012-11-07 <150> 61/829,409 <151> 2013-05-31 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 ctacgggagg cagcagtggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 cccactgctg cctcccgtag 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 cagcagccgc ggtaatac 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 gtattaccgc ggctgctg 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 catggctgtc gtcagctcgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 acgagctgac gacagccatg 20 <210> 9 <211> 1494 <212> DNA <213> Burkholderia sp. FERM BP-3421 <400> 9 agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcatgc cttacacatg caagtcgaac 60 ggcagcacgg gtgcttgcac ctggtggcga gtggcgaacg ggtgagtaat acatcggaac 120 atgtcctgta gtgggggata gcccggcgaa agccggatta ataccgcata cgatctacgg 180 atgaaagcgg gggatcttcg gacctcgcgc tatagggttg gccgatggct gattagctag 240 ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg atcagtagct ggtctgagag gacgatcagc 300 cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga 360 caatggggga aaccctgatc cagcaatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt cgggttgtaa 420 agcacttttg tccggaaaga aatcctttgg gctaataccc cggggggatg acggtaccgg 480 aagaataagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt 540 taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg caggcggttt gttaagacag atgtgaaatc 600 cccgggctta acctgggaac tgcatttgtg actggcaagc tagagtatgg cagagggggg 660 tagaattcca cgtgtagcag tgaaatgcgt agagatgtgg aggaataccg atggcgaagg 720 cagccccctg ggccaatact gacgctcatg cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780 ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg tcaactagtt gttggggatt catttcctta 840 gtaacgtagc taacgcgtga agttgaccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc 900 aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggatgatgt ggattaattc gatgcaacgc 960 gaaaaacctt acctaccctt gacatggtcg gaatcctgaa gagattcggg agtgctcgaa 1020 agagaaccga tacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080 taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc ttagttgcta cgcaagagca ctctaaggag 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgg 1200 gtagggcttc acacgtcata caatggtcgg aacagagggt tgccaacccg cgagggggag 1260 ctaatcccag aaaaccgatc gtagtccgga ttgcactctg caactcgagt gcatgaagct 1320 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttt taccagaagt ggctagtcta accgcaagga 1440 ggacggtcac cacggtagga ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt aacc 1494 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 tggcgaacag atcgagtttg 20 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 cttgcggaga actgtgaatg cgcaatagaa gcgctgtcat ggaatg 46 <210> 12 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagataa ctcgtggata ttcggcaag 49 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 agaatcccgc gatcccaac 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 ttgcgcattc acagttctc 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 tcttagacgt caggtggcac 20 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 ggacgaatcg aactcaggaa cttg 24 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 cgaagagcga ttgaggaaaa gg 22 <210> 18 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg caagggctgc taaaggaag 59 <210> 19 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtca cggaaatgtt gaatactcat 60 actc 64 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 gctctagaca tcgatttatt atgacaactt gac 33 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 cccaaaaaaa cgggtatgg 19 <210> 22 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 ctactgtttc tccatacccg tttttttggg gggttgttgg tttttgaaat tgc 53 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 atggtgaagc ttaagtcgac aaccggcatt cc 32 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 gcattcacag ttctccgcaa g 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 ctcgctcact gactcgctg 19 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 gcaattaacc ctcactaaag g 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 ctatagggcg aattgggtac 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 gcatccaatc acttgaacag g 21 <210> 29 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 cttgcggaga actgtgaatg cgcaagccat cattctcgac atttcc 46 <210> 30 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaga ttgtgacggt actgaagc 48 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 agagaacgat cgctccacag 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 ttgcgcattc acagttctc 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 tcttagacgt caggtggcac 20 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 ggacgaatcg aactcaggaa cttg 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 cgaagagcga ttgaggaaaa gg 22

Claims (43)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 I>
    Figure 112017009614619-pct00392

    상기 식에서,
    파선은 임의적인 결합을 나타내고;
    각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2-5알킬리덴을 형성하거나,
    R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
    R8은 수소, C1-6알킬 또는 -OR이고;
    R9는 독립적으로 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-N(R)COR13, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15 및 -(C(R)2)m-NR14N(R)R15로부터 선택되고;
    R13은 수소, C1-6알킬, C3-8카르보시클릴, C3-8헤테로시클릴, C1-6알킬-C6-14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
    각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3-10카르보시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10카르보시클릴, -C3-10헤테로시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2NRR, -C1-6알킬, C6-14아릴, -C1-6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
    여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, -(C(R)2)m-O-NRR 및 -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
    각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
  2. 제1항에 있어서, R6 및 R7이 에폭시 고리를 형성하거나; 또는 R9가 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15 또는 -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15인 화합물 또는 염.
  3. 제1항에 있어서, X1이 -O-이고; X2가 -NR-이고; R1이 -OR, -OCOR13, -OCONR14R15 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2가 C1- 6알킬이고; R3이 C1-6알킬이고; R4가 수소 또는 -OR이고; R5가 수소 또는 -OR이고; R6 및 R7이 각각 독립적으로 히드록실; 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R6 및 R7이 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티가 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; R8이 수소 또는 -OR이고; R9가 독립적으로 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15 및 -(C(R)2)m-N(R)COR13으로부터 선택되고; R13이 수소, C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 각각의 R14 및 R15가 독립적으로 수소, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1-6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6- 14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고; 여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리가 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18이 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, -(C(R)2)m-O-NRR 및 -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, X2가 -NH-이고, X1이 -O-이고, R1이 -OCOR13, OH 또는 -OCONR14R15이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 함께 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, 또는 -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15이고, R13이 C1-6 알킬이고, R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하는 것인 화합물.
  5. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure 112015053331353-pct00393

    Figure 112015053331353-pct00394

    Figure 112015053331353-pct00395

    Figure 112015053331353-pct00396

    Figure 112015053331353-pct00397

    Figure 112015053331353-pct00398

    Figure 112015053331353-pct00399

    Figure 112015053331353-pct00400

    Figure 112015053331353-pct00401

    Figure 112015053331353-pct00402

    Figure 112015053331353-pct00403
  6. 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 II>
    L-P
    상기 식에서,
    L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P에 결합되고;
    P는 하기 화학식 I의 라디칼이고:
    <화학식 I>
    Figure 112015053343660-pct00404

    상기 식에서,
    파선은 임의적인 결합을 나타내고;
    각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X'는 CR 또는 N이고;
    각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
    각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
    Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
    R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2-5알킬리덴을 형성하거나,
    R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
    R8은 수소, C1-6알킬 또는 -OR이고;
    R9는 -(C(R)2)m-C(O)- 또는 -(C(R)2)m-이고;
    L1은 -할로겐, -NR2,
    Figure 112015053343660-pct00405
    ,
    Figure 112015053343660-pct00406
    ,
    Figure 112015053343660-pct00407
    ,
    Figure 112015053343660-pct00408
    ,
    Figure 112015053343660-pct00409
    및
    Figure 112015053343660-pct00410
    로부터 선택되고;
    L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
    L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1-6알킬-, -C(O)NRC1-6알킬-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1-6알킬-S-S-C1-6알킬-NRC(O)CH2-, -C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6알킬-, -C1-6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1-6알킬-S-, -C(O)-O-C1-6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
    L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
    L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고, 여기서 -PABA-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112015053343660-pct00478
    ,
    -PABC-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112015053343660-pct00479
    ;
    L3은 -C1-6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1-6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1-6알킬-페닐-NR-, -NR-C1-6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1-6알킬-페닐-C(O)-,
    Figure 112015053343660-pct00411
    ,
    Figure 112015053343660-pct00412
    및
    Figure 112015053343660-pct00413
    를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
    R13은 수소, C1-6알킬, C3-8카르보시클릴, C3-8헤테로시클릴, C1-6알킬-C6-14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
    각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3-10카르보시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10카르보시클릴, -C3-10헤테로시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2NRR, -C1-6알킬, C6-14아릴, -C1-6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
    여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
    각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
  7. 하기 화학식 II'의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 II'>
    L-P'
    상기 식에서,
    L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P'에 결합되고;
    P'는 하기 화학식 I'의 라디칼이고:
    <화학식 I'>
    Figure 112017009614619-pct00486

    상기 식에서,
    파선은 임의적인 결합을 나타내고;
    각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X'는 CR 또는 N이고;
    각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
    각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
    Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
    R1은 -(C(R)2)m-, -OR", -OCOR13', -OC(O)NRR14', -OCON(R)N(R)- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2-5알킬리덴을 형성하거나,
    R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
    R8은 수소, C1-6알킬 또는 -OR이고;
    R9는 독립적으로 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-NR14N(R)R15 및 -(C(R)2)m-N(R)COR13으로부터 선택되고, 여기서 R13은 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    L1은 -할로겐, -NR2,
    Figure 112017009614619-pct00487
    ,
    Figure 112017009614619-pct00488
    ,
    Figure 112017009614619-pct00489
    ,
    Figure 112017009614619-pct00490
    ,
    Figure 112017009614619-pct00491
    및
    Figure 112017009614619-pct00492
    로부터 선택되고;
    L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
    L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1-6알킬-, -C(O)NRC1-6알킬-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1-6알킬-S-S-C1-6알킬-NRC(O)CH2-, -C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6알킬-, -C1-6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1-6알킬-S-, -C(O)-O-C1-6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
    L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
    L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고, 여기서 -PABA-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112017009614619-pct00493
    ,
    -PABC-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112017009614619-pct00494
    ;
    L3은 -C1-6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1-6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1-6알킬-페닐-NR-, -NR-C1-6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1-6알킬-페닐-C(O)-,
    Figure 112017009614619-pct00495
    ,
    Figure 112017009614619-pct00496
    및
    Figure 112017009614619-pct00497
    를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
    R13은 수소, C1-6알킬, C3-8카르보시클릴, C3-8헤테로시클릴, C1-6알킬-C6-14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
    R13'는 결합, -C1-6알킬렌-, -C3-8카르보시클릴-, -C3-8헤테로시클릴-, -C1-6알킬-C6-14아릴-, -C1-6알킬-C5-14헤테로아릴-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3-10카르보시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10카르보시클릴, -C3-10헤테로시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2NRR, -C1-6알킬, C6-14아릴, -C1-6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
    여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
    각각의 R14'는 독립적으로 결합, -NR-, -C3-10카르보시클릴-, -C3-10헤테로시클릴-, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR', -(CH2CH2O)1-6CH2CH2NR- 및 -C1-6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기서 R14'는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -NRR 또는 -SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
    각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택되고;
    각각의 R"는 독립적으로 결합 및 -C1-6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, L1이
    Figure 112015053331353-pct00424
    또는
    Figure 112015053331353-pct00425
    이고, L2A, L2B, L2C 및 L3이 모두 부재하는 것인 화합물.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, R6이 -OH이고, R7이 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬인 화합물.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, X2가 -NH-이고, X1이 -O-이고, R1이 -OCOR13, -OH 또는 -OCONR14R15이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 함께 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13이 C1-6 알킬이고, R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1이
    Figure 112015053331353-pct00426
    또는
    Figure 112015053331353-pct00427
    이고, L2A, L2B, L2C 및 L3이 모두 부재하는 것인 화합물.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서, X2가 -NH-이고, X1이 -O-이고, R1이 -OCOR13, -OH 또는 -OCONR14R15이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 함께 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13이 C1-6 알킬이고, R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1이 할로겐이고, L3이 -NR-C1- 6알킬-NR이고, L2A가 -C(O)-C1-6알킬-이고, L2B 및 L2C가 부재하는 것인 화합물.
  12. 제6항 또는 제7항에 있어서, R1이 -OCOR13 또는 -OR이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3이 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R이 수소 또는 메틸이거나, 또는 여기서 2개의 R 치환기가 함께 6 원 고리를 형성하고, L1이 할로겐, -NR2 또는
    Figure 112015053331353-pct00428
    이고, L2C가 PABC이고, L2B가 -Cit-Val-이고, L2A가 -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1-6알킬-인 화합물.
  13. 제6항 또는 제7항에 있어서, R1이 -OCOR13 또는 -OR이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3이 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R이 수소 또는 메틸이거나, 또는 2개의 R 치환기가 함께 6 원 고리를 형성하고, L1이 할로겐, -NR2 또는
    Figure 112015053331353-pct00429
    이고, L2C가 부재하고; L2B가 -Ala-Val-이고, L2A가 -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1 - 6알킬- 또는 -C(O)-C1-6알킬-인 화합물.
  14. 제6항 또는 제7항에 있어서, L1이 -할로겐, -NR2,
    Figure 112015053331353-pct00430
    ,
    Figure 112015053331353-pct00431
    ,
    Figure 112015053331353-pct00432
    및
    Figure 112015053331353-pct00433
    로부터 선택되는 것인 화합물.
  15. 제6항 또는 제7항에 있어서, R1이 -OCOR13 '이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)NR14R15이고, R13'가 결합이고, L3이
    Figure 112015053331353-pct00434
    이고, 여기서 m이 0이고, X'가 N이고, X"가 -N-이고, X"'가 부재하고, L1이 할로겐이고, L2C가 PABC이고, L2B가 -Cit-Val-이고, L2A가 -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1-6알킬-인 화합물.
  16. 제6항 또는 제7항에 있어서, X1이 -O-이고; X2가 -NR-이고; R1이 -OR, -OCOR13, -OCONR14R15 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2가 C1- 6알킬이고; R3이 C1-6알킬이고; R4가 수소 또는 -OR이고; R5가 수소 또는 -OR이고; R6 및 R7이 각각 독립적으로 히드록실; 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R6 및 R7이 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티가 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; R8이 수소 또는 -OR이고; R9가 독립적으로 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15 및 -(C(R)2)m-N(R)COR13으로부터 선택되고; R13이 수소, C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 각각의 R14 및 R15가 독립적으로 수소, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1-6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6- 14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고; 여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리가 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18이 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, -(C(R)2)m-O-NRR 및 -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되는 것인 화합물.
  17. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure 112015053331353-pct00435

    Figure 112015053331353-pct00436

    Figure 112015053331353-pct00437

    Figure 112015053331353-pct00438

    Figure 112015053331353-pct00439

    Figure 112015053331353-pct00440

    Figure 112015053331353-pct00441

    Figure 112015053331353-pct00442

    Figure 112015053331353-pct00443

    Figure 112015053331353-pct00444

    Figure 112015053331353-pct00445

    Figure 112015053331353-pct00446
  18. 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 III>
    (AB)-(L-P)b
    상기 식에서,
    L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P에 결합되고;
    P는 하기 화학식 I의 라디칼이고:
    <화학식 I>
    Figure 112015053343660-pct00447

    상기 식에서,
    파선은 임의적인 결합을 나타내고;
    AB는 항체이고;
    각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X'는 CR 또는 N이고;
    각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
    각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
    Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
    R1은 -R, -OR, -OCOR13, -OCONR14R15, -OCON(R14)NR(R15), =O (산소에의 이중 결합) 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2-5알킬리덴을 형성하거나,
    R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
    R8은 수소, C1-6알킬 또는 -OR이고;
    R9는 -(C(R)2)m-C(O)- 또는 -(C(R)2)m-이고;
    L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
    Figure 112015053343660-pct00448
    로부터 선택되고;
    L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
    L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1-6알킬-, -C(O)NRC1-6알킬-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1-6알킬-S-S-C1-6알킬-NRC(O)CH2-, -C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6알킬-, -C1-6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1-6알킬-S-, -C(O)-O-C1-6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
    L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
    L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고, 여기서 -PABA-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112015053343660-pct00482
    ,
    -PABC-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112015053343660-pct00483
    ;
    L3은 -C1-6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1-6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1-6알킬-페닐-NR-, -NR-C1-6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1-6알킬-페닐-C(O)-,
    Figure 112015053343660-pct00449
    ,
    Figure 112015053343660-pct00450
    및
    Figure 112015053343660-pct00451
    를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
    R13은 수소, C1-6알킬, C3-8카르보시클릴, C3-8헤테로시클릴, C1-6알킬-C6-14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
    각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3-10카르보시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10카르보시클릴, -C3-10헤테로시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2NRR, -C1-6알킬, C6-14아릴, -C1-6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
    여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
    각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    b는 1-20이고;
    각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
  19. 하기 화학식 III'의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 III'>
    (AB)-(L-P')b
    상기 식에서,
    L은 링커 모이어티 L1-L2-L3이고, 여기서 L3은 P'에 결합되고;
    P'는 하기 화학식 I'의 라디칼이고:
    <화학식 I'>
    Figure 112017009614619-pct00498

    상기 식에서,
    파선은 임의적인 결합을 나타내고;
    AB는 항체이고;
    각각의 X1은 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S- 및 -NR-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X'는 CR 또는 N이고;
    각각의 X"는 X"가 L2 또는 추가의 L3에 결합하는 경우에 CH-, CR-(C(R)2)m-NR-, CR-(C(R)2)m-O-; CR-(C(R)2)m-C(O)NR-, CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-, CR-(C(R)2)m-SO2NR-, CR-(C(R)2)m-NR-NR-, CR-(C(R)2)m-NR-C(O)- 또는 N-이거나, 또는 다르게는 O, S, CRR, CR-(C(R)2)m-NRR 또는 NRR이고;
    각각의 X"'는 X"'가 L2에 결합하는 경우에 -(C(R)2)m-NR- 또는 CR-(C(R)2)m-O-이거나, 또는 다르게는 R이고;
    Y는 -C(R)2-, -O-, -NR- 또는 -S-이고;
    R1은 -(C(R)2)m-C(O)-, -(C(R)2)m-, -OR", -OCOR13', -OCONRR14', -OCON(R14)N(R15)- 및 -NR14-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 독립적으로 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R4 및 R5는 독립적으로 수소, -OR, -NR14R15 및 옥소로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 히드록실; 및 히드록실 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 R로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C2-5알킬리덴을 형성하거나,
    R6 및 R7은 함께 옥소이거나, 또는
    R6 및 R7은 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티는 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
    R8은 수소, C1-6알킬 또는 -OR이고;
    R9는 독립적으로 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)-SR, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15, -(C(R)2)m-NR14N(R)R15 및 -(C(R)2)m-N(R)COR13으로부터 선택되고, 여기서 R13은 수소 및 C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    L1은 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
    Figure 112017009614619-pct00499
    로부터 선택되고;
    L2는 L2A-L2B-L2C 또는 L2C-L2B-L2A이고, 여기서,
    L2A는 -O-, -C(O)-, -C(O)NR-, -C(O)-C1-6알킬-, -C(O)NRC1-6알킬-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-, -C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-C(O)-, -C1-6알킬-S-S-C1-6알킬-NRC(O)CH2-, -C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-, -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-, -N=CR-페닐-O-C1-6알킬-C(O)-, -C(O)-C1-6알킬(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-(NR-C(O)-C1-6알킬)1-4-, -C(O)-C1-6알킬-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6알킬-, -C1-6알킬-, -S-, -C(O)-C1-6알킬-페닐-NR-, -O-C1-6알킬-S-, -C(O)-O-C1-6알킬-S- 및 (-CH2-CH2-O-)1-20으로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2A는 부재하고;
    L2B는 AA0-aa로부터 선택되고, 여기서 AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이고, aa는 12이고;
    L2C는 -PABA- 및 -PABC-로부터 선택된 1개 이상의 성분을 포함하거나, 또는 L2C는 부재하고, 여기서 -PABA-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112017009614619-pct00500
    ,
    -PABC-는 하기 구조 또는 그의 변이체를 지칭하고
    Figure 112017009614619-pct00501
    ;
    L3은 -C1-6알킬-, -NR-C3-C8헤테로시클릴-NR-, -NR-C3-C8카르보시클릴-NR-, -NR-C1-6알킬-NR-, -NR-C1-6알킬-, -S-, -NR-, -NR-NR- 및 -NR-C(O)-NR- 중 1개 이상으로부터 선택되고, 여기서 2개의 R 기는 임의로 연결되어 4-10 원 고리, -NR-C1-6알킬-페닐-NR-, -NR-C1-6알킬-페닐-SO2-NR-, -SO2-, -NR-C1-6알킬-페닐-C(O)-,
    Figure 112017009614619-pct00502
    ,
    Figure 112017009614619-pct00503
    및
    Figure 112017009614619-pct00504
    를 형성하거나, 또는 L3은 부재하고;
    R13은 수소, C1-6알킬, C3-8카르보시클릴, C3-8헤테로시클릴, C1-6알킬-C6-14아릴, C1-6알킬-C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R13은 -NRR 또는 -SO2NRR로 임의로 치환되고;
    R13'는 결합, -C1-6알킬렌-, -C3-8카르보시클릴-, -C3-8헤테로시클릴-, -C1-6알킬-C6-14아릴-, -C1-6알킬-C5-14헤테로아릴-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R14 및 R15는 독립적으로 수소, 히드록실, -NRR, -NRNR2, -C3-10카르보시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10카르보시클릴, -C3-10헤테로시클릴, -C1-6알킬렌-C3-10헤테로시클릴, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2NRR, -C1-6알킬, C6-14아릴, -C1-6알킬렌-C6-14아릴 및 -C5-14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는 R14 및 R15는 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3-10헤테로시클릴 고리를 형성하고,
    여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
    각각의 R14'는 독립적으로 결합, -NR-, -C3-10카르보시클릴-, -C3-10헤테로시클릴-, -(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR', -(CH2CH2O)1-6CH2CH2NR- 및 -C1-6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기서 R14'는 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18은 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -NRR 또는 -SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1-6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0-6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, (xv) -(C(R)2)m-O-NRR 및 (xiv) -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되고;
    각각의 R은 독립적으로 수소 및 -C1-6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 R'는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬, C1-C8 헤테로알킬 및 아릴로부터 선택되고;
    각각의 R"는 독립적으로 결합 및 -C1-6알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    b는 1-20이고;
    각각의 m은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이다.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, X1이 -O-이고; X2가 -NR-이고; R1이 -OR, -OCOR13, -OCONR14R15 및 -NR14R15로 이루어진 군으로부터 선택되고; R2가 C1- 6알킬이고; R3이 C1- 6알킬이고; R4가 수소 또는 -OR이고; R5가 수소 또는 -OR이고; R6 및 R7이 각각 독립적으로 히드록실; 및 할로겐으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 치환기로 임의로 치환된 C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R6 및 R7이 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 5-원 헤테로시클로알킬 모이어티를 형성하고, 여기서 상기 헤테로시클로알킬 모이어티가 R로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고; R8이 수소 또는 -OR이고; R9가 독립적으로 -(C(R)2)m-C(O)OR, -(C(R)2)m-C(O)NR14R15, -(C(R)2)m-NR14R15, -(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15, -(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15 및 -(C(R)2)m-N(R)COR13으로부터 선택되고; R13이 수소, C1- 6알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 각각의 R14 및 R15가 독립적으로 수소, -NRR, -NRNR2, -C3- 10카르보시클릴, -C3- 10헤테로시클릴, -C1-6알킬, C6- 14아릴, -C1- 6알킬렌-C6- 14아릴 및 -C5- 14헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고; 여기서 R14, R15, 또는 둘 다, 또는 R14 및 R15로 형성된 고리가 -(C(R)2)m-R18로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 R18이 독립적으로 (i) -NRR, (ii) -C(NRR)(C(O)OR), (iii) -S-R, (iv) 할로겐, -CF3, -(C(R)2)m-NRR 또는 -(C(R)2)m-SO2NRR 중 1개 이상으로 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴, (v) -SO2R, (vi) -S-S-C1- 6알킬-C(O)OR, (vii) -SO2NRR, (viii) -C(O)NRR, (ix) -C(O)OR, (x) -NRR, -SO2NRR 또는 -NR-C(O)(CH2)0- 6NRR로 임의로 치환된 -C4-6 시클로알킬, (xi) -R, (xii) -OR, (xiii) -N(R)NRR, (xiv) -C(O)N(R)NRR, -(C(R)2)m-O-NRR 및 -S-S-C1-6알킬-NRR로부터 선택되는 것인 화합물.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, X2가 -NH-이고, X1이 -O-이고, R1이 -OCOR13, OH 또는 -OCONR14R15이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 함께 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13이 C1-6 알킬이고, R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1이 AB에의 결합 및 -NR-(AB에의 결합)으로부터 선택되고, L2A, L2B, L2C 및 L3이 모두 부재하는 것인 화합물.
  22. 제18항 또는 제19항에 있어서, X2가 -NH-이고, X1이 -O-이고, R1이 -OCOR13, OH 또는 -OCONR14R15이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 함께 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13이 C1-6 알킬이고, R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1이 AB에의 결합 및 -NR-(AB에의 결합)으로부터 선택되고, L3이 -NR-C1- 6알킬-NR이고, 여기서 R이 수소이고, 알킬 기가 에틸이고, L2A가 -C(O)-C1-6알킬-이고, L2B 및 L2C가 부재하는 것인 화합물.
  23. 제18항 또는 제19항에 있어서, X2가 -NH-이고, X1이 -O-이고, R1이 -OCOR13이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 함께 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, R13이 C1-6 알킬이고, R14 및 R15가 이들이 연결되어 있는 원자 또는 원자들과 함께 C3- 10헤테로시클릴 고리를 형성하고, L1이 AB에의 결합 및 -NR-(AB에의 결합)으로부터 선택되고, L3이 -NR-C1-6알킬-NR이고, 여기서 R이 수소이고, 알킬 기가 에틸이고, L2A가 -C(O)-C1- 6알킬-이고, L2B 및 L2C가 부재하는 것인 화합물.
  24. 제18항 또는 제19항에 있어서, R1이 -OCOR13 또는 -OR이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3이 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R이 수소 또는 메틸이거나, 또는 2개의 R 치환기가 함께 6 원 고리를 형성하고, L1이 AB에의 결합으로부터 선택되고, L2C가 PABC이고, L2B가 -Cit-Val-이고, L2A가 -C(O)-C1- 6알킬-NRC(O)C1-6알킬-인 화합물.
  25. 제18항 또는 제19항에 있어서, R1이 -OCOR13 또는 -OR이고, R2가 메틸이고, R3이 메틸이고, R4가 -OH이고, R5가 수소이고, R8이 수소이고, R6 및 R7이 에폭시드를 형성하고, R9가 -(C(R)2)m-C(O)-이고, L3이 -NR-NR-이고, 여기서 각각의 R이 수소 또는 메틸이거나, 또는 2개의 R 치환기가 함께 6 원 고리를 형성하고, L1이 AB에의 결합 및 -NR-(AB에의 결합)으로부터 선택되고, L2C가 PABC이고, L2B가 -Cit-Val-이고, L2A가 -C(O)-C1-6알킬-C(O)- 또는 -C(O)-C1-6알킬-인 화합물.
  26. 제18항 또는 제19항에 있어서, L2C가 부재하고; L2B가 -Ala-Val-이고, L2A가 -C(O)-C1-6알킬-NRC(O)C1-6알킬-인 화합물.
  27. 제18항 또는 제19항에 있어서, L1이 AB에의 결합, -NR-(AB에의 결합) 및
    Figure 112015053331353-pct00457
    로부터 선택되는 것인 화합물.
  28. 제18항 또는 제19항에 있어서, 항체가 트라스투주맙 및 K392C+L443C 트라스투주맙 돌연변이체로부터 선택되는 것인 화합물.
  29. 제18항 또는 제19항에 있어서, 항체가 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아실 공여자 글루타민-함유 태그 또는 폴리펩티드 조작에 의해 반응성이도록 만든 내인성 글루타민으로 조작된 Fc-함유 또는 Fab-함유 폴리펩티드를 통해 결합되는 것인 화합물.
  30. 제18항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure 112015053331353-pct00458

    Figure 112015053331353-pct00459

    Figure 112015053331353-pct00460

    Figure 112015053331353-pct00461

    Figure 112015053331353-pct00462

    Figure 112015053331353-pct00463

    Figure 112015053331353-pct00464

    Figure 112015053331353-pct00465

    Figure 112015053331353-pct00466

    Figure 112015053331353-pct00467

    Figure 112015053331353-pct00468

    Figure 112015053331353-pct00469

    Figure 112015053331353-pct00470

    Figure 112015053331353-pct00471

    Figure 112015053331353-pct00472

    여기서, -X 또는 -S-X는 항체 AB를 나타낸다.
  31. 제18항, 제19항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 AB가 트라스투주맙, 트라스투주맙 돌연변이체, 오레고보맙, 에드레콜로맙, 세툭시맙, 비트로넥틴 수용체 (αvβ3)에 대한 인간화 모노클로날 항체, 알렘투주맙, 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-HLA-DR 항체, 131I Lym-1, 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 뮤린 항-HLA-Dr10 항체, 호지킨병 또는 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화 항-CD2 mAb, 라베투주맙, 베바시주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 오파투무맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 이필리무맙, 겜투주맙, 종양태아성 단백질 수용체 5T4에 대한 인간화 모노클로날 항체, M1/70 (CD11b 수용체에 대한 항체), 및 다른 항체로부터 선택되는 것인 화합물 또는 염.
  32. 제6항, 제7항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, P가 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물의 라디칼을 나타내는 것인 화합물 또는 염.
  33. 제6항, 제7항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, L이 1개 이상의 독립적으로 선택된 아미노산 디-라디칼을 포함하는 것인 화합물 또는 염.
  34. 제6항, 제7항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, L이 발린, 시트룰린, 페닐알라닌, 리신, 알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 독립적으로 선택된 아미노산 디라디칼을 포함하는 것인 화합물 또는 염.
  35. 제6항, 제7항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, L이 세포내 프로테아제에 의해, P, 또는 P를 포함하는 라디칼로부터 절단될 수 있는 것인 화합물 또는 염.
  36. 제18항 또는 제19항에 있어서, AB가 황 또는 황-황 결합에 의해 AB의 시스테인 잔기를 통해 아미노산 디-라디칼에 부착되는 것인 화합물 또는 염.
  37. 제18항 또는 제19항에 있어서, AB가 리신 잔기를 통해 아미노산 디-라디칼에 부착되는 것인 화합물 또는 염.
  38. 제18항 또는 제19항에 있어서, AB가 아미드 결합에 의해 AB의 글루타민 잔기를 통해 아미노산 디-라디칼에 부착되는 것인 화합물 또는 염.
  39. 제18항, 제19항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편인 화합물 또는 염.
  40. 유효량의 제1항 내지 제7항, 제17항 내지 제19항 및 제30항 중 어느 한 항의 화합물 또는 염, 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 환자에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  41. 삭제
  42. 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 또는 그의 증식을 억제하는데 효과적인 양의 제1항 내지 제7항, 제17항 내지 제19항 및 제30항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하는, 환자에서 종양 세포 또는 암 세포를 치료하는 것을 포함하여, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 또는 그의 증식을 억제하기 위한 제약 조성물.
  43. 삭제
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