KR101464418B1

KR101464418B1 - 유기 착색 미립자, 이것을 포함하는 진단약 키트 및 인비트로 진단 방법

Info

Publication number: KR101464418B1
Application number: KR1020127011660A
Authority: KR
Inventors: 사토루 요시다; 요시유키 시오미; 도시히코 마츠이; 마사노리 도이; 노부유키 미무라; 다케시 마츠세
Original assignee: 아사히 가세이 셍이 가부시키가이샤
Priority date: 2009-11-17
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2014-11-21
Also published as: CN102667482A; US20120225496A1; EP2503337B1; US20150111307A1; JP5788330B2; TW201122472A; JPWO2011062157A1; CA2780648C; EP2503337A4; CN102667482B; WO2011062157A1; KR20120079139A; EP2503337A1; TWI521206B; ES2596323T3; US9562908B2; CA2780648A1

Abstract

본 발명은, 고감도이며, 또한, 다색 발색이 가능한 면역 크로마토그래피 키트, 및 상기 키트의 요소로서 적합한 유기 착색 미립자를 제공한다. 평균 입자 직경이 10 ㎚∼1000 ㎚이며, 또한, 발색 강도가 1.0∼5.0인 것을 특징으로 하는 유기 착색 미립자를, 셀룰로오스를 출발 원료로 하여 조제하였다. 이러한 유기 착색 미립자를 면역 크로마토그래피 키트에서의 표지로서 사용한 바, 종래 기술과 비교하여 고감도인 면역 크로마토그래피 키트가 되는 것이 판명되었다. 본 발명에 따른 면역 크로마토그래피 키트는, 다색 발색도 가능하고, 신속한 진단에 있어서 유용하다.

Description

유기 착색 미립자, 이것을 포함하는 진단약 키트 및 인비트로 진단 방법{ORGANIC COLORED MICROPARTICLES, DIAGNOSTIC REAGENT KIT CONTAINING THE SAME, AND IN VITRO DIAGNOSIS METHOD}

본 발명은 유기 고분자 유래의 유기 착색 미립자 및 그것을 이용한 진단약 키트 및 인비트로 진단 방법에 관한 것이다.

고분자로 이루어지는 미립자는, 입자 직경, 기계적 강도, 입자 직경의 분포, 형상, 응집 정도의 제어의 용이함으로부터, 여러가지 분야에 이용되고 있으며, 예컨대, 토너, 포장재의 블로킹 방지재, 절연 필러, 결정 핵제, 크로마토그래피용 충전제, 연마제 등을 들 수 있다. 최근에는, 면역 진단 시약용 담체, 액정 디스플레이의 스페이서, 분석 기기의 교정용 표준 입자, 다공막의 검정용 표준 입자 등의 용도에도 응용되고 있다.

고분자로 이루어지는 미립자는, 특히 면역 진단약용 담체 용도에 있어서 사용량이 증대하고 있으며, 그 중에서도 면역 크로마토그래피 방법을 이용한 진단(이하, 「면역 크로마토」라고도 함)에의 사용량이 증대하고 있다. 임신 검사약과 같이, 의약 부외품으로서 의료 관계자 이외의 일반인도 이용할 수 있는 키트가 다수 발매된 것을 우선 요인으로서 들 수 있지만, 그 이외에도 아데노, 로타, 노로 등의 각종 바이러스, B형, C형 각종 간염 검사, O-157 등의 병원성균군이라고 하는 여러가지 검사의 POCT(point-of-care-testing: 환자 근방에서 의사 또는 다른 의료 담당자가 검사를 실시하여 신속하게 결과를 얻는 것)의 수단으로서 수요가 높아지고 있는 것이 배경으로 되어 있다. 최근 인플루엔자의 유행으로, 금후, 면역 크로마토의 사용량은 급증할 것으로 추정된다. 또한 면역 진단약 이외에도, 생화학적인 분석, 유전학적인 분석 등, 임의의 분석 반응 등 여러가지 분야에서 면역 크로마토는 이용되고 있다.

면역 크로마토는, 예컨대, 금속 콜로이드나 폴리스티렌 유래의 착색 라텍스로 이루어지는 발색 미립자로 표지한 항체 또는 항원(리간드)을, 크로마토 기재 상에서 검사 대상 물질과 선택적으로 반응시켜, 복합체를 형성시키면서 전개시킨다. 계속해서, 미리 크로마토 기재 상의 소정의 검출 위치에 항원 또는 항체(상기 리간드와 특이적으로 결합하는 것)를 고정해 두고, 전개시킨 복합체를 포착함으로써 현색시키는 방법을 말한다. 지금까지 여러가지 검토가 이루어져, 간편한 검사 방법으로서 확립되어 있지만, 의료 현장에서는 POCT에서의 의료 종사자의 부담을 감소킬 필요로부터, 면역 크로마토 키트의 추가적인 고감도화, 진단 신속화가 요구되고 있다.

인플루엔자의 진단에서는, 감염 초기의 단계에서는 면역 크로마토에서 양성이 되지 않고, 다음날 검사하면 양성이 되는 경우도 있다. 이 문제를 해결하기 위해 검사의 추가적인 고감도화가 요구되고 있다. 또한, 면역 크로마토 1 키트를 이용한 A형 항원과 B형 항원의 양자의 동시 진단이 일반적이 되고 있다. 이와 같이 검체가 복수 존재하는 경우, 1회의 검사로 복수의 검사 대상 물질을 동시에 검사할 수 있으면 진단 신속화로 이어지지만, 오진을 막기 위해, 시인성을 향상시킬 필요가 있다. 따라서, 검사 대상 물질 검출 시의 발색을 검사 대상마다 색 구분(다색 발색화)하는 것이 바람직하다. 각종 바이러스의 감염증 진단이나, 식품 안전성 진단에서도 1 키트에 의한 복수 피진단물의 동시 진단이 요구되고 있어, 동일한 색 구분이 유효하다고 생각된다.

면역 크로마토의 발색은, 표지에 이용하는 물질에 유래한다. 금속 콜로이드의 경우는, 그 금속종에 따른 플라즈몬 효과에 기인하는 발색이 되기 때문에, 1색으로만 한정된다. 예컨대, 이하의 특허문헌 1에 기재되어 있는 바와 같은, 금 콜로이드를 사용하는 경우에는 적색만의 발색이 된다. 복수 항목의 동시 검사를 상정할 때, 검출 위치의 궁리로 어느 정도의 효과는 기대할 수 있지만, 시인성, 오진 방지의 관점에서는, 적합하다고는 말할 수 없다.

또한, 금속 콜로이드의 경우, 리간드의 결합 방법은 물리 흡착이라고 불리는 원리가 일반적이다. 리간드의 결합 방법으로서는, 물리 흡착, 화학 결합(공유 결합), 이온 결합, 포괄법, 등을 일반적으로 들 수 있다. 물리 흡착이란 기재(예컨대, 발색 미립자)와 결합하는 재료(예컨대, 리간드)와의 사이에 작용하는 소수성 상호 작용을 이용한 결합 방법이다. 실제로는 소수성 상호 작용뿐만 아니라, 정전적 작용, 분자간력, 그 외, 여러가지 메커니즘이 작용하고 있다고 생각된다. 물리 흡착은 그 외의 결합 방법에 대하여 조작이 용이하기 때문에, 간편성이나 비용의 면에서 유리해진다. 그러나 물리 흡착의 경우는, 리간드의 결합 부위가 일정하지 않거나, 계면 활성제의 존재 하에서 흡착이 저해되어 버리거나 하는 등의 문제가 발생하는 경우도 있을 수 있다. 또한 충분한 양의 리간드를 결합할 수 없는 경우도 있을 수 있다.

한편, 이하의 특허문헌 2에 개시되어 있는 바와 같이, 폴리스티렌 등의 라텍스 입자를 이용하는 경우는, 분산 염료나 유용 염료, 안료로 이루어지는 발색단을 미립자에 포함시켜 이용함으로써, 색 구분이 가능하다. 또한, 일반적으로 리간드의 결합 방법으로서는 물리 흡착, 화학 결합 등 임의의 방법을 선택할 수 있다. 그 때문에 상기 물리 흡착의 문제를 회피하는 것도 가능하다. 그러나, 특허문헌 2의 실시예에 따르면, 입자에의 염착량이 6 wt％ 정도로 낮고, 발색의 강도가 약한 것으로 되어 있었다. 그 때문에, 면역 크로마토에 이용하는 경우는, 명료한 발색 결과를 얻을 수 없어, 신뢰성이 부족한 것으로 되어 있다.

이하의 특허문헌 3에는, 셀룰로오스를 염색한 미립자가 개시되어 있지만, 셀룰로오스 미립자량에 대한 염료 함유량이 20 wt％ 정도이기 때문에, 얻어지는 염색 미립자는 연한 것이 된다. 이것을 이하의 특허문헌 4에 있는 바와 같이, 물리 흡착 혹은 화학 결합에 의해 항체를 부여하여 면역 크로마토에 이용하였지만, 항체의 결합량이 충분하지 않고, 또한 미립자 자체의 발색이 약하기 때문에, 명료한 발색 결과를 얻을 수 없다.

특허문헌 1: 일본 특허 공개 평성7-60159호 공보 특허문헌 2: 일본 특허 제2955405호 명세서 특허문헌 3: 국제 공개 WO2008/084854 팜플렛 특허문헌 4: 국제 공개 WO2009/123148 팜플렛

본 발명은 상기 현상을 감안하여, 발색성이 높고, 또한, 색 구분이 가능한 유기 착색 미립자를 얻어, 그것에 리간드를 결합시키고, 진단약, 특히 면역 크로마토에 적용함으로써, 면역 크로마토 키트의 고감도화를 달성하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 예의 검토하여, 실험을 거듭한 결과, 셀룰로오스를 출발 원료로 하여, 농색으로 염색한 미립자를 얻는 것에 성공하였다. 또한 놀랍게도, 셀룰로오스를 농색으로 염색함으로써 물리 흡착에 의한 리간드의 결합이 가능해지고, 나아가 필요에 따라 반응성 활성기를 도입함으로써 공유 결합에 의해서도 리간드를 결합하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 그리고 그것을 진단약용 담체로서 면역 크로마토에 적용한 바, 면역 크로마토 키트의 고감도화를 실현할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 평균 입자 직경이 10 ㎚∼1000 ㎚이며, 또한, 발색 강도가 1.0∼5.0인 것을 특징으로 하는 유기 착색 미립자.

[2] 상기 유기 착색 미립자의 중량의 10 wt％∼80 wt％가 착색 성분인, 상기 [1]에 기재된 유기 착색 미립자.

[3] 상기 착색 성분이 염료인, 상기 [2]에 기재된 유기 착색 미립자.

[4] 상기 유기 착색 미립자의 중량의 20 wt％∼90 wt％가 셀룰로오스 유래인, 상기 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 유기 착색 미립자.

[5] 물리 흡착에 의해 리간드가 결합된, 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 유기 착색 미립자.

[6] 반응성 활성기를 갖는, 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 유기 착색 미립자.

[7] 상기 반응성 활성기가 원자수 3 이상의 스페이서 구조를 갖는, 상기 [6]에 기재된 유기 착색 미립자.

[8] 공유 결합에 의해 상기 반응성 활성기에 리간드가 결합된, 상기 [6] 또는 [7]에 기재된 유기 착색 미립자.

[9] 상기 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 유기 착색 미립자를 포함하는 진단약 키트.

[10] 면역 크로마토그래피 키트인, 상기 [9]에 기재된 진단약 키트.

[11] 상기 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 유기 착색 미립자를 사용하는 공정을 포함하는 인비트로 진단 방법.

[12] 면역 크로마토그래피 방법인, 상기 [11]에 기재된 인비트로 진단 방법.

본 발명에 따른 유기 착색 미립자는, 종래 기술의 라텍스 입자의 발색성에 비교하여 각별히 현저하게 우수한 발색성을 갖고 있으며, 또한 항체 등의 리간드를 흡착하는 것이 가능하기 때문에, 면역 크로마토에 적용할 수 있고, 선택적이고 특이적인 반응에서 포착된 경우의 발색이, 보다 현재화함으로써, 고감도의 면역 크로마토 키트를 제공하는 것이 가능해지며, 또한, 발색을 다색으로 하는 것이 가능하기 때문에, 복수의 검사 대상의 동시 측정에 유용하다. 또한, 본 발명의 유기 착색 미립자는, 리간드와의 결합 방법으로서 염료에서 유래하는 물리 흡착 이외에도, 화학 결합 등 임의의 방법을 선택할 수 있기 때문에, 여러가지 검사 대상 물질에 대하여 응용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 오진이 적은 조기 진단을 가능하게 하고, 검사의 신속화에 크게 기여하며, 면역 크로마토의 적용 범위를 크게 넓힐 수 있다.

<평균 입자 직경>

이하, 본원 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명에서의 유기 착색 미립자란, 평균 입자 직경이 10 ㎚∼1000 ㎚이며, 또한, 발색 강도가 1.0∼5.0인 유기 착색 미립자를 말한다. 평균 입자 직경의 바람직한 범위는, 100 ㎚∼900 ㎚이며, 보다 바람직하게는 200 ㎚∼800 ㎚이다. 평균 입자 직경이 1000 ㎚를 넘으면, 면역 크로마토 키트에 이용하였을 때에 전개가 느려, 평가의 신속화로 연결되지 않으며, 또한 전개막 상에 포착되기 쉬워져, 백그라운드 자체가 발색하여 버림으로써 기대하는 검출 개소에서의 발색이 불명료해지는 경향이 있다. 특히 검출 개소에 있어서는, 보충 시약의 도포에 기인하여, 전개막의 공극 크기가 작게 변화하고 있는 경우가 많다. 그 때문에 그곳에서는 표지가 포착되기 쉬운 경향이 있으며, 즉 의양성(擬陽性)이 나오기 쉽다. 이미 검사 키트로서 신뢰할 수 없는 것이 되어 버린다.

<발색 강도>

본 발명에서의 발색 강도란, 유기 착색 미립자의 분산액을 광로 길이 10 ㎜로 하여, 400 ㎚∼800 ㎚의 범위에서 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 행하고, 분산매의 백그라운드 성분을 뺌으로써, 분산 기질 자체의 흡광도 곡선을 얻으며, 그 최대값(ABS)을 분산 기질의 중량 퍼센트로 나누어, 0.01 wt％당으로 산출한 값으로서 정의한다. 적분구를 이용함으로써, 입자의 산란광의 영향을 저감시킬 수 있기 때문에, 얻어진 값은 미립자의 발색 정도의 지표로서 충분할 수 있고, 이 수치가 클수록 발색이 명료하다고 판단할 수 있다. 본 발명의 미립자의 발색 강도는 1.0 이상이지만, 클수록 바람직하다. 발색 강도를 증대시키기 위해서는, 분산되는 염료나 안료로서 발색이 높은 것을 이용하거나, 염색 횟수를 늘리는 등의 수단을 선택할 수 있다. 그러나, 발색 강도를 5.0 이상으로 하기 위해서는, 일반적인 염료를 이용한 수회의 염색으로는 도달할 수 없기 때문에, 경제성을 고려하면 발색 강도는 1.0∼5.0이며, 보다 바람직하게는 1.5∼5.0이고, 더욱 바람직하게는 2.0∼5.0이다. 발색 강도가 1.0보다 작은 경우는, 발색이 약하기 때문에, 면역 크로마토 키트에 이용하였을 때에 검출 부위의 시인성이 뒤떨어져, 검사 결과의 신뢰성을 손상시켜 버린다.

<유기 착색 미립자의 소재(재료)>

본 발명에서의 유기 착색 미립자의 소재는, 발색 강도가 높고, 안정 분산된 것이면 특별히 한정되지 않는다. 염료나 안료를 이용하여 농색화 가능한 소재를 적용할 수 있지만, 농염화(濃染化)하고, 또한 강고한 염착을 실현하는 편이, 면역 크로마토에 의한 검사시나, 키트의 장기 보관의 품질 안정화에 기여하기 때문에 바람직하다. 강고한 염착을 달성하기 위해서는, 예컨대, 공유 결합성의 반응 염료를 이용할 수 있고, 반응 염료로 염색할 수 있는 것으로서, 셀룰로오스 유래의 것을 들 수 있다. 셀룰로오스 유래의 것으로 이루어지는 미립자는 대량의 수산기를 갖기 때문에, 많은 반응성 염료를 공유 결합에 의해 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 농염화한 후에도 물 등에의 안정 분산성을 유지할 수 있다. 그렇기 때문에, 유기 착색 미립자의 소재로서는, 셀룰로오스를 이용하면 적합하지만, 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 재생 셀룰로오스, 정제 셀룰로오스, 천연 셀룰로오스 등을 이용할 수 있다. 일부 유도체화된 셀룰로오스를 이용하여도 좋다. 바람직하게는, 유기 착색 미립자의 중량의 20 wt％∼90 wt％는 셀룰로오스 유래이다. 보다 바람직하게는, 유기 착색 미립자의 중량의 20 wt％∼80 wt％는 셀룰로오스 유래이다. 더욱 바람직하게는 20 wt％∼70 wt％이다.

<유기 착색 미립자의 소재의 제조 방법>

본 발명에서의 유기 착색 미립자의 소재의 제조 방법은 특별히 한정되지 않는다. 습식 분쇄 등에 의한 역학적인 방법을 이용하여, 분급하여 원하는 평균 입자 직경의 미립자를 얻어도 좋지만, 본 발명에서는 셀룰로오스를 그 양용매에 용해하고, 물, 유기 용매, 암모니아 등을 혼합한 응고액을 이용함으로써 셀룰로오스 미립자를 조제하고 있다. 이 방법을 이용함으로써 얻어지는 셀룰로오스 미립자의 입자 직경을 응고액의 조성에 의해 조정하는 것이 가능해진다. 본 발명의 유기 착색 미립자의 소재의 제조 방법을 한정하는 것을 의도하지 않지만, 이하, 구체예에 의해, 보다 상세하게 설명한다.

우선, 셀룰로오스 린터를 셀룰로오스의 양용매에 용해시킨다. 본 발명에서는 양용매에는 공지의 방법으로 조제한 구리 암모니아 용액을 이용한다. 그리고 응고액으로서는 유기 용매+물+암모니아 혼합계를 주로 이용한다. 이 응고액을 교반하면서, 조제해 둔 구리 암모니아 셀룰로오스 용액을 부가하여 응고를 행한다. 추가로 황산을 부가하여 중화, 재생을 행함으로써, 원하는 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리를 얻을 수 있다. 이 슬러리를 희석, 정제, 건조시킴으로써, 셀룰로오스 미립자 분산액이나 셀룰로오스 미립자를 얻을 수 있다.

<착색 방법>

본 발명에서의 유기 착색 미립자의 소재의 착색 방법도 특별히 한정되는 것은 아니며, 염료를 이용하는 방법, 안료를 이용하는 방법 등 여러가지 것을 이용할 수 있다. 그 중에서도 발색 강도를 높게 할 수 있는 점에서 염료를 이용하는 방법이 바람직하고, 직접 염료, 함금 염료, 산성 염료, 반응 염료, 염기성 염료, 분산 염료, 황화 염료, 식물 염료, 나프톨 염료 등, 각종 염색제를 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서 유기 착색 미립자로서 셀룰로오스 미립자를 이용하는 경우, 셀룰로오스 미립자의 표면적은, 섬유의 표면적에 비해서 현저하게 크기 때문에, 염착량을 매우 크게 할 수 있고, 유기 착색 미립자 중 10 wt％ 이상이 착색 성분인 미립자를 얻을 수도 있다. 그러나, 발색성과 경제성의 관점에서, 착색 성분은, 유기 착색 미립자의 10 wt％∼80 wt％가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20 wt％∼80 wt％이며, 더욱 바람직하게는 30 wt％∼80 wt％이다. 또한, 본 발명에 있어서는, 셀룰로오스 미립자를 농색으로 염색할 수 있고, 또한 장기간 안정 즉 습윤 견뢰도가 우수한 것으로 하기 위해, 공유 결합으로 염착시키는 것이 바람직하다고 하는 관점에서, 반응 염료를 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명에서의 유기 착색 미립자에 대한 착색 성분의 비율은, 착색 전후의 중량 변화로부터 산출할 수 있다. 본 발명에 있어서는 착색의 방법으로서 염색을 이용하고, 그 과정에서, 원심 분리를 이용하기 때문에, 모든 입자를 회수할 수 없는 경우도 있지만, 이 경우는 회수된 입자의 중량과 염색 전의 입자의 중량으로부터 착색 성분의 비율을 산출하는 것으로 한다. 예컨대 1.0 g의 셀룰로오스 미립자를 염색하여 2.0 g의 유기 착색 미립자가 얻어진 경우는 50 wt％가 된다. 또한, 필요에 따라, 유기 착색 미립자와 착색 성분을 분리하는 조작, 예컨대, 산이나 알칼리 처리에 의한 공유 결합의 절단이나, 미립자를 팽윤시키거나, 그 외 최적의 세정 조작 등에 의해 유기 미립자와 착색 성분을 분리하여 산출하는 것도 가능하다.

<리간드>

본 발명에서의 리간드란, 특정 검사 대상 물질에 선택적이며 또한 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 물질이다. 그 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 항체, 항원, 효소, 유전자, 호르몬, 세포, 핵산, 펩티드, 단백질 등을 들 수 있다.

<염색에 의한 리간드의 물리 흡착>

본 발명에 있어서는 염료를 이용하여 셀룰로오스를 농색으로 염색하는 것만으로 리간드의 물리 흡착이 가능하다. 염색만으로는 물리 흡착 성능이 불충분한 경우는, 필요에 따라 셀룰로오스의 유도체화와 조합함으로써 친수 소수 밸런스를 조정하여도 괜찮다. 셀룰로오스를 농색으로 염색하는 것만으로 리간드의 물리 흡착이 가능해지는 이유는 밝혀져 있지 않지만, 염색에 의해 셀룰로오스가 소수화되었기 때문이라고 생각된다. 일반적으로, 필름 등에서는 접촉각을 측정함으로써 친수 소수의 정도를 알 수 있지만, 나노 미립자에서는 접촉각을 측정하는 것은 곤란하다. 그래서 모델로서 평탄한 셀룰로오스인 셀로판(등록 상표)을 농색으로 염색하여 접촉각을 측정한 바, 미염색의 셀룰로오스의 접촉각이 20도∼30도 정도인데 대하여, 충분히 염색한 셀로판(등록 상표)에서는, 염료의 염착량에 비례하여 40도∼100도에도 도달하는 것을 확인할 수 있었다. 일반적인 염료는, 벤젠, 나프탈렌, 안트라퀴논, 아조 등 소수성이 강한 구조를 갖는다. 본 발명에 있어서는, 섬유의 염색 조건에서는 통상 생각할 수 없는 대량의 염료를 셀룰로오스에 결합시킨 결과, 항체가 물리 흡착할 수 있는 정도의 소수화를 달성할 수 있었다고 예상된다. 단백질 정량법으로 일반적인 로리법을 이용하여, 결합하고 있는 마우스 IgG 항체를 정량한 바, 본 발명에서의 유기 착색 미립자와 같이, 충분히 염색되어 있는 경우는, 항체의 결합을 확인할 수 있었다. 한편, 염색 강도가 지나치게 낮으면, 미염색 입자와의 차가 인정되지 않으며, 항체 결합량은 낮은 경향에 있었다.

<반응성 활성기에 의한 리간드의 화학 결합>

본 발명에 있어서는 리간드의 결합 방법으로서 물리 흡착 뿐만 아니라 화학 결합을 선택할 수도 있다. 일반적으로는 물리 흡착은 조작이 간편하며 비용이 저렴하다고 하는 메리트가 있지만 이하와 같은 문제가 발생할 가능성도 지적되고 있다. 예컨대, 리간드의 결합 부위가 일정하게 되지 않아 반응의 선택성을 잃어버리는 문제, 계면 활성제의 존재 하에서 결합하고 있던 리간드가 떨어져 버리는 문제 등이다. 그래서 이들 문제를 해결하기 위해, 상황에 따라 리간드와 공유 결합을 형성하는 화학 결합 방식을 취하는 경우도 있다. 또한 화학 결합 방식에서는 리간드의 결합량을 물리 흡착보다 더욱 많게 할 수 있는 경우도 있다.

<반응성 활성기>

본 발명에서의 반응성 활성기는 리간드를 공유 결합시키기 위해 이용한다. 반응성 활성기의 대표적인 예로서는 카르복실기, 아미노기, 알데히드기, 티올기, 에폭시기, 수산기 등을 들 수 있다. 종류는 특별히 한정되지 않지만, 카르복실기 및 아미노기가 바람직하다. 카르복실기의 경우는, 카르보디이미드를 이용하여 리간드의 아미노기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 반응성 활성기를 도입하는 타이밍은 염색 전에 미리 도입해 두어도 괜찮고, 염색 후에 도입하여도 좋다. 도입하는 부위는 유기 미립자여도 괜찮고 염료 부분에 도입하여도 좋다. 또한, 염료의 구조의 일부를 반응성 활성기로 해두어도 괜찮다.

본 발명에서의 반응성 활성기의 도입은 적외 분광 분석 장치에 의해 확인할 수 있다. 예컨대, 카르복실기의 경우, 유리산형이면 1730 ㎝^-1 전후의 흡수로 확인할 수 있다. 또한 아미노기의 경우, 1급 아미노기이면 1600 ㎝^-1 전후의 흡수로 확인할 수 있다. 단 반응성 활성기의 도입량을 정량하는 것은 매우 곤란하다. 이는 대량의 염료 성분이 존재하기 때문이며, 일반적인 정량 방법으로는 정량할 수 없다. 본 발명에서는 적외 분광 분석 장치로 도입의 가부만을 판단하였다.

<스페이서 구조>

본 발명에서의 반응성 활성기는 원자수 3 이상의 스페이서 구조를 갖는 것이 바람직하다. 본원 발명자들은, 고도로 농색화된 유기 착색 미립자에 반응성 활성기를 도입하여 리간드를 화학 결합시켜 면역 크로마토에 이용할 때에, 원자수 3 이상의 스페이서 구조를 가지면 감도가 보다 향상되는 것을 발견하였다. 이 이유는 밝혀져 있지 않지만, 예컨대, 대량으로 존재하는 염료의 입체 장해나 전하의 영향에 의해, 리간드와 검사 대상 물질의 선택적 반응이 방해될 가능성이 있다고 생각된다.

스페이서 구조란 반응성 활성기와 유기 착색 미립자의 사이에 존재하는 원자를 가리킨다. 또한, 스페이서 구조가 분기하고 있는 경우는 주쇄의 원자수를 가리키는 것으로 한다. 예컨대, 일반적으로 알려져 있는 카르복시메틸셀룰로오스는 셀룰로오스의 수산기의 일부가 카르복시메틸기로 치환된 것이다. 이 경우의 반응성 활성기는 카르복실기이며, 스페이서 구조는 -CH₂-, 즉 원자수 1의 스페이서 구조가 된다. 본 발명의 실시예에서는 이하의 4종류의 방법으로 스페이서 구조를 갖는 반응성 활성기를 도입하였다. 화합물 1∼4의 구조를, 각각, 화학식 1∼4에 나타낸다. 본래는 수산기의 일부에 염료도 결합하고 있지만 염료는 생략한다.

<화합물 1>

염색 셀룰로오스 미립자와 5-헥센산을 반응시켜 카르복실기를 도입하였다. 주쇄의 원자수, 즉 스페이서 구조의 원자수는 5가 된다.

<화합물 2>

염색 셀룰로오스 미립자와 16헵타데센산을 반응시켜 카르복실기를 도입하였다. 주쇄의 원자수, 즉 스페이서 구조의 원자수는 16이 된다.

<화합물 3>

염색 셀룰로오스 미립자와 에피클로로히드린을 반응시켜 에폭시기를 도입하고, 나아가 6-아미노헥산산과 반응시킴으로써 카르복실기를 도입하였다. 주쇄의 원자수, 즉 스페이서 구조의 원자수는 9가 된다.

<화합물 4>

염색 셀룰로오스 미립자와 에피클로로히드린을 반응시켜 에폭시기를 도입하고, 나아가 암모니아와 반응시킴으로써 1급 아미노기를 도입하였다. 주쇄의 원자수, 즉 스페이서 구조의 원자수는 3이 된다.

상기 스페이서 구조는 최대로 원자수 16이지만, 보다 긴 스페이서 구조여도 괜찮다. 보다 긴 스페이서 구조는 염색 셀룰로오스 미립자와 반응시키는 화합물을 바꿈으로써 달성할 수 있고, 도입한 반응성 활성기를 이용하여 재연장하여도 얻을 수 있다. 원리적으로는 매우 긴 스페이서 구조도 도입 가능하지만, 도입의 용이함, 비용의 관점에서 생각하면 바람직하게는 원자수 3∼100이며, 보다 바람직하게는 3∼50, 더욱 바람직하게는 3∼20이다.

<유기 착색 미립자의 분산 방법>

상기 착색 방법으로 얻어진 유기 착색 미립자, 즉 염색 셀룰로오스 미립자는, 분산액인 채의 상태이며 네버 드라이인 채로 이용하는 것도 가능하지만, 각종 시약, 계면 활성제, 완충제를 첨가하여 분산액의 안정화를 도모하여도 좋다. 또한 필요에 따라 건조를 행함으로써 미립자 단체로 또는 각종 농도의 분산액으로 조제하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서는, 염색 미립자를 분산시키는 액체의 종류는, 미립자를 용해 또는 팽윤시키지 않는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 물이나 각종 무기 화합물 수용액, 알코올류, 에테르류, 알데히드류, 케톤류, 지방산류, 아민류, 그 외 유기 용매를 이용할 수 있다. 각종 화합물을 임의의 비율로 혼합한 용매를 이용하여도 좋고, 또한 이들 용매와 상용성이 있는 소수성 용매와 혼합하여 이용하는 것도 가능하다.

<입도 분포>

본 발명의 유기 착색 미립자의 입도 분포는, 이하의 식 (1):

CV값=(입도 분포 측정 장치로부터 구한 체적 입도 분포에서의 표준 편차)/(입도 분포 측정 장치로부터 구한 체적 평균 메디안 사이즈)×100

로 구한다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 전술한 대로, 입자 직경이 지나치게 크면, 면역 크로마토 키트에 있어서, 백그라운드의 발색이나, 의양성이 보여지는 경향이 있기 때문에, 입도 분포는 작은 쪽이 적합하며, 70％ 이하가 바람직하다. CV값을 작게 하고자 할 때는 미립자 제조 조건에 따라 조정은 가능하지만, 염색 전, 염색 후의 각 단계에 있어서 여과, 원심 분리 등의 조작에 의해 입자를 분급하여도 좋다. 본 발명에 있어서는, 적합한 CV값의 범위는, 경제성도 감안하여 10％∼70％이지만, 보다 바람직하게는 10％∼60％, 더욱 바람직하게는 10％∼50％이다.

<면역 크로마토>

본 발명의 유기 착색 미립자는 면역 크로마토그래피 방법에 따른 면역 측정법에 적합하게 이용된다.

이하, 면역 크로마토그래피 방법의 대표예를 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 샌드위치 분석 전반에 적용할 수 있다. 면역 크로마토그래피 방법은, 대체로, 피검출 물자인 항원 또는 항체와 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원에, 금속 콜로이드나 폴리스티렌 유래의 착색 라텍스로 이루어지는 발색 미립자를 표지로서 미리 결합시킨다. 한편, 크로마토 기재 상의 소정 개소에, 항원 또는 항체에 특이적으로 반응하는 항체 또는 항원을 라인형으로 도포한다. 검사시에 있어서, 상기 표지-항체 또는 항원을, 피검출 물질인 항원 또는 항체와 접촉시킴으로써, 복합체를 형성시키고, 이것을 크로마토 기재 상에서 전개시키지만, 이 복합체는, 라인형으로 도포한 1차 항체에 의해 포착이 가능하다(샌드위치 분석). 이때 표지 물질도 포착되기 때문에, 소정 개소에서의 현색이 발생하게 된다. 육안에 의한 피검출 물질의 유무를 판정할 수 있기 때문에, 간편한 검사 방법으로서, 최근, 널리 보급되고 있다. 또한 항원 또는 항체를 이용하는 면역 반응 뿐만 아니라, 피검출 물질과 특이적인 반응을 일으키는 리간드를 이용함으로써 여러가지 검사가 가능해진다. 면역 진단약 이외에도, 생화학적인 분석, 유전학적인 분석 등, 임의의 분석 반응 등 여러가지 분야에서 면역 크로마토는 이용되고 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

우선, 본 발명에서의 유기 착색 미립자 또는 착색 미립자 분산체의 측정법에 대해서 상세하게 설명한다.

특별히 기재가 없는 한 모든 조작은 25℃의 환경 하에서 실시하였다.

(1) 입도(입자 직경) 분포: 닛키소사 제조 나노트랙 입도 분포 측정 장치 UPA-EX150을 이용하여 셀룰로오스 미립자 분산체를 측정하였다. 특별히 기재가 없는 한, 셀룰로오스 미립자를 분산시키는 액체로서 물을 이용하고, 셀룰로오스 미립자 농도는 약 0.1 wt％로 측정하며, 적산 횟수는 30회로 하였다. 또한 CV값은 30회의 적산에 의해 얻어진 체적 입도 분포에서의 표준 편차를 체적 평균 메디안 사이즈로 나눈 것을 산출하였다.

(2) 발색 강도: 니혼분코 제조 JASCO·V-650에 적분구 유닛 ISV-722 부가하여 이용하며, 셀룰로오스 미립자, 및 비교예가 되는 착색 폴리스티렌 라텍스 및 금 콜로이드의 흡광도를 측정하였다. 미립자 농도는 0.01 wt％∼0.1 wt％로 측정하였다. 계속해서, 400 ㎚∼800 ㎚의 가시광 범위에서의 흡광도 피크의 최대값(ABS)을, 미립자의 중량 퍼센트로 나누어, 0.01 wt％ 부근에서 산출한 값을 구하였다.

(3) 반응성 활성기의 도입 가부의 확인: 반응성 활성기를 도입한 미립자 분산액을 건조하여, 반응성 활성기를 도입한 미립자를 얻었다. 퍼킨엘머 제조 적외 분광 분석 장치 Spectrum100을 이용하여 반사법으로 적외 흡수 스펙트럼을 측정하고, 도입 전후의 흡수 스펙트럼을 비교한다. 카르복실기의 경우, 유리산형의 1730 ㎝^-1 전후의 흡수로 확인하고, 아미노기의 경우, 1급 아미노기의 1600 ㎝^-1 전후의 흡수로 확인하였다.

또한, 셀룰로오스 미립자 분산체, 염색 셀룰로오스 미립자 분산체의 응집을 풀기 위해, 마이크로플루이딕스사 제조 유압식 초고압 호모게나이저 M-110-E/H를 이용하였다. 그 때의 처리 압력은 50 ㎫이며, 고압부인 챔버를 10회 통과시키는 조작을 행하였다.

[실시예 1]

<미립자의 조제>

셀룰로오스 린터를 구리 암모니아 용액에 용해시키고, 계속해서 물 및 암모니아로 희석하여, 셀룰로오스 농도 0.37 wt％의 구리 암모니아 셀룰로오스 용액을 조제하였다. 그 용액의 구리 농도는 0.13 wt％이며, 암모니아 농도는 1.00 wt％였다. 계속해서, 테트라히드로푸란 농도 90 wt％, 물 농도 10 wt％의 응고액을 조제하였다. 자석 교반기를 이용하여 응고액 5000 g을 천천히 교반하면서, 미리 조제해 둔 셀룰로오스 농도 0.37 wt％의 구리 암모니아 셀룰로오스 용액 500 g을 첨가하였다. 5초 정도 교반을 계속한 후에 10 wt％의 황산 1000 g을 부가하여 중화, 재생을 행하여, 원하는 셀룰로오스 미립자를 함유한 슬러리 26500 g을 얻었다. 얻어진 슬러리를 10000 rpm의 속도로 10분간 원심 분리하였다. 침전물을 디캔테이션에 의해 추출하고, 탈이온물을 주입하여 교반하며, 재차 원심 분리하였다. pH가 6.0∼7.0이 될 때까지 이 조작을 수회 반복하고, 그 후 고압 호모게나이저에 의한 분산 처리를 행하여, 셀룰로오스 미립자 분산체 150 g을 얻었다. 또한 모든 조작은 25℃의 환경 하에서 행하였다.

<미립자의 염색>

다음에, 상기한 바와 같이 하여 조제한 셀룰로오스 미립자의 염색을 행하였다. 미립자 농도를 1.0 wt％로 조정한 셀룰로오스 미립자 분산체 100 g에 대하여, 황산나트륨 30 g, 반응성 염료로서 다이스타 가부시키가이샤 제조 Levafix Navy CA Gr.(등록 상표)(이하, 청계 A라고도 함) 1 g을 부가하여 교반시키면서 항온조를 이용하여 60℃까지 승온시켰다. 60℃로 승온 후에 탄산나트륨 4 g을 부가하여, 2시간 염색을 행하였다. 계속해서 얻어진 조염색 미립자를 수산화 나트륨 5 wt％ 수용액으로 세정하고, 원심 분리로 회수, 순수로 수세한 후 원심 분리로 회수한다고 하는 일련의 조작을 1사이클로 하여, 동일한 조작을 계 3사이클까지 실시하여, 염색 미립자를 얻었다. 염료 성분의 비율은 유기 착색 미립자의 중량의 49％였다.

염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 미염색 셀룰로오스 미립자를, 동일한 조작으로 염색하지만, 계 10사이클까지 실시하여, 염색 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 3]

실시예 1에서 얻은 미염색 셀룰로오스 미립자를, 반응 염료로서 다이스타 가부시키가이샤 제조 Levafix Rubine CA Gr.(등록 상표)(이하, 적계 B라고도 함) 1 g을 이용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 셀룰로오스 미립자 및 염색 셀룰로오스 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 4]

응고에 이용하는 응고액이, 테트라히드로푸란 농도 95 wt％, 물 농도 5 wt％인 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로, 셀룰로오스 미립자 및 염색 셀룰로오스 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 5]

실시예 4에서 얻은 미염색 셀룰로오스 미립자를, 반응 염료로서 다이스타 가부시키가이샤 제조 Levafix Rubine CA Gr.(등록 상표)(적계 B) 1 g을 이용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 셀룰로오스 미립자 및 염색 셀룰로오스 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 6]

응고에 이용하는 응고액이, 아세톤 농도 26.5 wt％, 암모니아 농도 0.20 wt％, 물 농도 73.3 wt％인 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로, 셀룰로오스 미립자 및 염색 셀룰로오스 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[비교예 1]

응고에 이용하는 응고액이, 테트라히드로푸란 농도 97 wt％, 물 농도 3 wt％인 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로, 셀룰로오스 미립자 및 염색 셀룰로오스 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 7]

비교예 1에서 얻은 염색 셀룰로오스 미립자를 니혼 미리포아 가부시키가이샤 제조의 공극 크기 0.8 μ의 니트로셀룰로오스 유래의 여과막을 이용하여 여과하여 여과액을 채취하였다. 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 8]

실시예 1에서 얻은 미염색 셀룰로오스 미립자를, 실시예 1과 동일한 조작으로 염색하였지만, 1사이클만의 염색을 행하여, 염색 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[실시예 9]

실시예 1에서 얻은 미염색 셀룰로오스 미립자를, 황산나트륨 15 g, 반응 염료로서 다이스타가부시키가이샤 제조 Levafix Rubine CA Gr.(등록 상표)(적계 B) 0.5 g으로 한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작으로 염색하였지만, 1사이클만의 염색을 행하여, 염색 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[비교예 2]

실시예 1에서 얻은 미염색 셀룰로오스 미립자를, 황산나트륨 6 g, 반응성 염료로서 다이스타가부시키가이샤 제조 Levafix Navy CA Gr.(등록 상표)(청계 A) 0.2 g으로 한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 조작을 행하여, 염색 미립자를 얻었다. 염색 후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[비교예 3]

실시예 6에서 얻은 미염색 셀룰로오스 미립자를, 황산나트륨 6 g, 반응성 염료로서 다이스타가부시키가이샤 제조 Remazol Black B HI-GRAN. 150(등록 상표)(이하, 청계 C라고도 함)을 0.2 g으로 한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 조작을 행하여, 염색 미립자를 얻었다. 염색 전후의 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[비교예 4]

염색 폴리스티렌 라텍스 입자로서, BangsLaboratories사 제조의 DS02B(PrimaryBlue(등록 상표), 평균 입자 직경 0.47 ㎛)의 발색 강도를 측정하였다. 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

[비교예 5]

평균 입자 직경이 0.04 ㎛인 금 콜로이드 입자의 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 1에 나타낸다.

<성능 평가 1>

실시예 1∼비교예 5의 염색, 착색 또는 발색 입자를 이용하여, 면역 크로마토그래피용의 키트를 제작하여, 성능 평가를 실시하였다.

<물리 흡착에 의한 항체 결합 염색 미립자의 조제>

실시예 1∼비교예 4에서 얻어진 염색 또는 착색 미립자를 인산 완충액(이하, 「PBS」라고 함)에 의해, 고형분 농도가 1 중량％가 되도록 희석 조정하여, 얻어진 1 중량 염색 입자 인산 완충액 현탁액 1 ㎖와, 인간 융모성 고나도트로핀(이하 「hCG」라고 함)에 대한 마우스 유래의 모노클로널 항체(MedixBiochemica사 제조 #5014 항hCG 항체)를 PBS로 100 ㎍/㎖로 희석하여 얻어진 항체 희석액 1 ㎖를 에펜도르프 원심관에 채취하며, 실온에서 2시간 진탕하여, 염색 입자에 모노클로널 항체를 결합시키고, 계속해서 0.1 중량％의 농도로 소혈청 알부민(이하, BSA라고 함)을 함유하는 PBS를 이용하여 3회, 원심 세정하며, 최종적으로 2 ㎖가 되도록 재분산시킴으로써, 항체 결합 염색 미립자 분산액을 얻었다.

<항체 결합 금 콜로이드의 조제>

농도 0.01 중량％의 염화금 수용액 200 ㎖를 비등시키고, 이것에 농도 1 중량％의 시트르산나트륨 수용액을 부가하여, 용액의 색이 연한 노란색으로부터 보라색∼적색으로 변할 때까지 가열 비등을 행하여, 비교예 5에 나타내는 평균 입자 직경이 0.04 ㎛인 금 콜로이드 입자의 분산액을 조제하였다. 계속해서 얻어진 금 콜로이드 분산액에 50 mM 인산2수소칼륨 용액을 부가하여 pH를 8로 조정하고, 이것에 hCG에 대한 모노클로널 항체를, 금 콜로이드 입자 분산액 1 ㎖당 10 ㎍가 되는 비율로 부가하며, 그 10 ㎖에 농도 30 중량％의 BSA(소혈청 알부민)를 0.1 ㎖ 부가하고, 원심 침강 처리하여, 부상액을 제거하며, BSA를 농도 0.1 중량％로 함유하는 PBS를 이용하여 3회 원심 침강 처리에 의해 세정하고, 재분산시킴으로써, 항체 결합 금 콜로이드 입자 분산액을 얻었다.

<크로마토그래피 기재(멤브레인)의 조제>

시판 멤브레인 필터(미리포아사 제조 HF120, 25 ㎜×300 ㎜)의 한쪽 단(이하, 이 한쪽 단은 스트립의 하단이 되고, 다른 한쪽 단은 스트립 상단이 됨)으로부터 7 ㎜의 위치에 액체 분사 장치를 이용하여 전개 방향으로 수직, 즉 멤브레인 장변에 평행하게, 테스트 라인용의 항체를 폭 약 1 ㎜가 되도록 분사 인쇄하였다. 보다 자세하게는 테스트 라인 항체로서, 마우스 유래의 항hα-서브유닛 항체(MedixBiochemica사 제조 #6601)를 이용하며, PBS로 0.5 ㎎/㎖로 조정한 것을, 1.0 μL/㎝가 되도록 분무하였다. 또한, 동일하게 하단으로부터 12 ㎜의 위치에는 컨트롤 라인용의 항체를 폭 1 ㎜로 분사 인쇄하였다. 보다 자세하게는 컨트롤 라인으로서, 토끼 유래의 항마우스 항체(Daco사 제조 Z0259)를 이용하며, PBS로 0.5 ㎎/㎖로 조정한 것을, 1.0 μL/㎝가 되도록 분무하였다. 각각의 항체를 분무한 후, 1시간 건조시키고, 이어서 유성 카제인을 포함하는 붕산 완충액을 이용한 블로킹을 행하며, 수크로오스를 포함하는 Tris-HCl 완충액을 이용하여 세정을 행하고, 실온에서 하룻밤 정착을 시킴으로써, 크로마토용 멤브레인을 조제하였다.

<크로마토 평가 샘플 제작>

얻어진, 각 실시예, 비교예에 기재된 염색 입자를 이용한 크로마토용 멤브레인에, 20 ㎜×300 ㎜의 여과지성의 흡수 패드를 상단으로부터 5 ㎜의 사이가 중첩되도록 장변끼리로 접촉시킨 후, 기요틴 커터로 5 ㎜폭마다 절단함으로써 샘플을 제작하였다. 단순 계산으로 60 샘플 만들 수 있게 된다.

<크로마토그래피 평가>

전개 시험에 이용한, hCG 함유 시료는 이하와 같이 하여 조제하였다.

hCG를, 1 중량％ 농도로 BSA를 함유하는 PBS에 의해 희석하여, hCG 농도가 각각 100, 10, 0 mIU/㎖인 hCG를 함유시켰다. 이 시료액에, 상기에서 얻어진 5 ㎜폭 키트 샘플의 하단으로부터 2 ㎜를 침지하여, 시료액을 전개시켰다. 10분 경과 후, 멤브레인 필터 상에서의 반응 부위(표지 인쇄부)에서의 현색을 육안으로 관찰하였다. 평가 기준으로서, 테스트 라인에서 발색이 보이지 않는 경우를 (-), 발색이 보이는 경우를 (+), 발색이 뚜렷이 보이는 경우를 (++), 발색이 강하게 보이는 경우를 (+++)를 이용하였다. 평가 결과를, 이하의 표 2에 나타낸다.

모든 실시예, 비교예에 있어서, 컨트롤 라인의 발색이 보였다. hCG 농도가 100 mIU/㎖에서는, 실시예 1∼9, 및 비교예 1, 4, 5에 있어서, 테스트 라인의 발색이 보였다. 또한, hCG 농도가 10 mIU/㎖로 연한 농도에 있어서도, 실시예 1∼9 및 비교예 1 및 비교예 5에 있어서 테스트 라인의 발색이 보였다.

비교예 1에서는, 특히 항원 농도가 높은 측에서, 백그라운드의 정색(呈色)에 의해 겉보기 감도가 내려가는 현상이 보여졌다. 또한 시료 중에 hCG가 없어도 발색하는 경향, 즉 의양성이 보여졌다. 실시예 7에 있어서, 비교예 1의 입자를 여과한 것을 이용한 바, 백그라운드의 정색은 남지만, 의양성은 보이지 않게 되었기 때문에, 입자 직경이 과대하면 의양성이 발생한다고 생각된다. 입자 직경이 과대한 경우는 진단약 키트에 부적당하다. 실시예 1∼9에서 의양성이 보이지 않았기 때문에, 실시예 1∼9는, 고감도라고 할 수 있다.

한편, 비교예 2∼4에서는, 염료의 발색 강도가 작기 때문에, hCG 농도 10 mIU/㎖에서는 발색은 검출할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 유기 착색 미립자를 이용하면, 폴리스티렌 라텍스와 비교하여 고감도가 되는 것을 이해할 수 있다.

또한, 비교예 5의 금 콜로이드와의 비교에 있어서는 동등 또는 그 이상의 감도를 나타내는 것도 이해할 수 있다. 즉, 본 발명의 유기 착색 미립자를 이용함으로써, 고감도 진단이 청색계에서도 적색계에서도 가능해진다.

<반응성 활성기의 도입>

계속해서 실시예 1에서 얻어진 염색 미립자에 카르복실기나 아미노기 등의 반응성 활성기의 도입을 행하였다.

[실시예 10]

실시예 1에서 얻은 청색 염색 미립자 분산액의 일부에 순수, 이소프로필알코올(와코쥰야쿠사 제조, 시약 특급)을 부가하여, 분산 매체의 이소프로필알코올:물의 비가 85:15가 되며, 또한 분산 매체 내의 입자 농도가 0.50 wt％가 되도록 조정하였다. 얻어진 염색 셀룰로오스 미립자 분산액 20 g을 회전자와 함께 시험관에 넣고, 유리제 환류관을 부착하였다. 약 10℃의 수돗물을 환류시켜 냉각하면서, 셀룰로오스 미립자 분산액이 50℃가 되도록 워터 배스에서 30분간 가열하였다. 또한 가열은 자석 교반기를 이용하여 천천히 교반시키면서 행하였다. 그 후, 40 wt％의 가성 소다 용액 74 ㎎을 교반하면서 부가하고, 더욱 30분간 교반을 계속하며, 그 후 클로로아세트산나트륨(와코쥰야쿠사 제조) 216 ㎎을 부가하였다. 3시간 동안, 교반 및 환류를 계속하며, 카르복실기의 도입을 행하였다. 3시간 경과 후, 워터 배스에 의한 가열을 멈추고, 가지형 플라스크를 얼음물로 식혀, 반응 후 슬러리의 온도가 20℃가 될 때까지 냉각하였다. 냉각 후에 교반을 계속하면서, 10 wt％ 염산을 1.0 g 부가하여 반응 후 슬러리의 PH를 산성으로 하였다. 미립자의 세정과 마찬가지로 원심 분리기를 이용하여, 디캔테이션-탈이온수에 의한 희석을 수회 반복, PH를 6.0∼7.0로 하고, 더욱 고압 호모게나이저에 의한 분산 처리를 행하여, 카르복실화 염색 미립자 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액의 일부를 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 3에 나타낸다.

[실시예 11]

실시예 1에서 얻은 청색 염색 미립자 분산액의 일부에 순수, 아세톤(와코쥰야쿠사 제조, 시약 특급)을 부가하고, 분산 매체의 아세톤:물의 비가 1:1이 되며, 또한 분산 매체 내의 입자 농도가 1.0 wt％가 되도록 조정하였다. 얻어진 염색 셀룰로오스 미립자 분산액 10.0 g을 회전자와 함께 유리제 시험관에 넣고, 유리제 환류관을 부착하였다. 약 10℃의 수돗물을 환류시켜 냉각하면서, 셀룰로오스 미립자 분산액이 40℃가 되도록 워터 배스에서 30분간 가열하였다. 또한 가열은 자석 교반기를 이용하여 천천히 교반시키면서 행하였다. 그 후, 5-헥센산(와코쥰야쿠사 제조) 705 ㎎, 질산2암모늄세륨(와코쥰야쿠사 제조) 677 ㎎, 1 ㏖/L 질산(와코쥰야쿠사 제조) 617 ㎖를 부가하였다. 3시간 동안, 교반 및 환류를 계속하며, 카르복실기의 도입을 행하였다. 반응 후의 처리는 실시예 10과 동일하게 하여, 카르복실화 염색 미립자 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액의 일부를 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 3에 나타낸다.

[실시예 12]

카르복실화를 위해 부가하는 반응제가 16-헵타데센산(와코쥰야쿠사 제조) 1654 g인 것 이외에는 실시예 11과 동일한 방법으로 카르복실화 염색 미립자 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액의 일부를 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 3에 나타낸다.

[실시예 13]

실시예 1에서 얻은 청색 염색 미립자 분산액의 일부에 순수를 부가하고, 분산 매체 내의 입자 농도가 1.0 wt％가 되도록 조정하였다. 얻어진 염색 미립자 분산액 10.0 g을 회전자와 함께 유리제 시험관에 넣고, 유리제 환류관을 부착하였다. 약 10℃의 수도물을 환류시켜 냉각하면서, 셀룰로오스 미립자 분산액이 35℃가 되 도록 워터 배스에서 30분간 가열하였다. 또한 가열은 자석 교반기를 이용하여 천천히 교반시키면서 행하였다. 그 후, 에피클로로히드린(와코쥰야쿠사 제조) 571 g을 부가하고, 30분 동안, 교반 및 환류를 계속하여, 에폭시기의 도입을 행하였다. 그 후, 워터 배스의 온도를 50℃로 승온시키고, 6-아미노헥산산(와코쥰야쿠사 제조) 810 g을 부가하여, 1시간 동안, 교반 및 환류를 계속하며, 카르복실기의 도입을 행하였다. 반응 후의 처리는 실시예 10과 동일하게 하여, 카르복실화 염색 미립자 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액의 일부를 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 3에 나타낸다.

[실시예 14]

에폭시기의 도입 후에 부가하는 반응제가 25 wt％ 암모니아수(와코쥰야쿠사 제조) 840 g인 것 이외에는 실시예 13과 동일하게 하여, 아미노화 염색 미립자 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액의 일부를 평균 입자 직경과 발색 강도를 측정한 결과를 이하의 표 3에 나타낸다.

<적외 분광 분석 장치에 의한 반응성 활성기의 확인>

실시예 10∼14에서 얻어진 카르복실화 및 아미노화 염색 미립자 분산액을 건조시켜, 카르복실화 및 아미노화 염색 미립자를 조정하고, 적외 분광 분석 장치에 의해 반응성 활성기의 도입을 확인하였다. 카르복실화 염색 미립자는 1730 ㎝^-1 전후, 아미노화 염색 미립자는 1600 ㎝^-1 전후, 각각의 흡수가 증가하고 있어, 반응성 활성기의 도입에 성공한 것을 확인하였다.

<성능 평가 2>

실시예 10∼14의 반응성 활성기를 도입한 염색 미립자에 항체를 화학 결합시키고, 그 후 면역 크로마토그래피용의 키트를 제작하여, 성능 평가를 실시하였다.

<화학 결합에 의한 항체 결합 염색 미립자의 조제 1>

2-모르폴리노에탄술폰산(와코쥰야쿠사 제조), 가성 소다, 순수를 이용하여 pH가 5.2이며 농도가 50 mM인 2-모르폴리노에탄술폰산 완충액(이하, 「MES」라고 함)을 조제하고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(와코쥰야쿠사 제조, 이하 카르보디이미드라고 함)을 MES 완충액에 더 용해시켜, 카르보디이미드 농도가 20 wt％가 되도록 조정하였다. 실시예 10∼13에서 얻어진 카르복실화 염색 미립자를 원심 분리기를 이용하여 침강시킨 후, 상기 MES 완충액에 재분산시켜 고형분 농도가 1 중량％가 되도록 농도를 조정하여, 카르복실화 염색 미립자 MES 완충액 분산체를 얻었다. 카르복실화 염색 미립자 MES 완충액 분산체 10 g에 대하여, 20 wt％의 카르보디이미드 용액 1 g을 부가하고, 항온 진탕조를 이용하여 25도의 환경 하에서 1시간 반응시키며, 반응 종료 후에 10,000 rpm의 속도로 30분간 원심 분리를 행하였다. 침전물을 디캔테이션에 의해 추출하고, 인산 완충액을 부가하여 교반하며, 카르보디이미드 활성화 염색 미립자를 인산 완충액에 분산시켰다. 미립자의 세정과 마찬가지로 원심 분리기를 이용하며, 디캔테이션-인산 완충액에 의한 희석을 3회 반복하여, 미반응의 카르보디이미드를 제거하였다. 얻어진 카르보디이미드 활성화 염색 미립자를 이용하여, 물리 흡착에 의한 항체 결합 염색 미립자의 조제와 동일한 순서로 화학 결합에 의한 항체 결합 염색 미립자를 조제하였다.

<화학 결합에 의한 항체 결합 염색 미립자의 조제 2>

아미노화 염색 미립자 분산액을 원심 분리기를 이용하여 침강시킨 후, 상기 인산 완충액에 재분산시켜 고형분 농도가 1 중량％가 되도록 농도를 조정하여, 아미노화 염색 미립자 인산 완충액 분산체를 얻었다. 아미노화 염색 미립자 PBS 완충액 분산체 10 g에 대하여, 25％ 글루타르알데히드 용액(와코쥰야쿠사 제조) 1 g을 부가하고, 항온 진탕조를 이용하여 37도의 환경 하에서 2시간 반응시키며, 반응 종료 후에 10,000 rpm의 속도로 30분간 원심 분리를 행하였다. 침전물을 디캔테이션에 의해 추출하고, 인산 완충액을 부가하여 교반하여, 글루타르알데히드 활성화 염색 미립자를 인산 완충액에 분산시켰다. 미립자의 세정과 마찬가지로 원심 분리기를 이용하며, 디캔테이션-인산 완충액에 의한 희석을 3회 반복하여, 미반응의 글루타르알데히드를 제거하였다. 얻어진 글루타르알데히드 활성화 염색 미립자를 이용하여, 물리 흡착에 의한 항체 결합 염색 미립자의 조정과 동일한 순서로 화학 결합에 의한 항체 결합 염색 미립자를 조제하였다. 0.1 중량％의 농도로 소혈청 알부민을 부가하기 전에 1 g의 글리신을 부가함으로써 미반응의 알데히드를 제거하였다.

<크로마토그래피 평가>

실시예 10∼14에서 얻어진 화학 결합에 의한 항체 결합 염색 미립자와, 실시예 1로부터 얻어진 물리 흡착에 의한 항체 결합 염색 미립자의 면역 크로마토용 미립자로서의 평가를 행하였다.

평가는 상기와 동일한 순서로, hCG 농도가 각각 10, 1, 0 mIU/㎖인 3수준에서 행하였다. 평가 결과를 이하의 표 4에 나타낸다.

실시예 11∼14의 화학 결합에 의한 항체 결합 미립자는 hCG 농도가 1 mIU/㎖여도 발색이 보였다. 이들은 모두 반응성 활성기가 갖는 스페이서의 원자수가 3 이상이다. 그에 대하여, 실시예 1의 물리 흡착에 의한 항체 결합 염색 미립자, 및 실시예 10의 스페이서의 원자수가 1인 화학 결합에 의한 항체 결합 미립자는 hCG 농도가 1 mIU/㎖에서는 발색이 보이지 않았다. 이들의 결과로부터 본 발명의 유기 미립자는 화학 결합에 의한 리간드 담지도 가능한 것을 알 수 있다.

본 발명의 유기 착색 미립자는, 면역 진단, 면역 크로마토그래피용의 표지로서 유용하며, 신속한 평가를 가능하게 하는 고감도 면역 크로마토그래피 키트에 적합하게 이용 가능하다.

Claims

평균 입자 직경이 10 ㎚∼1000 ㎚이며, 또한, 발색 강도가 1.0∼5.0인 것을 특징으로 하는 유기 착색 미립자로서, 상기 유기 착색 미립자의 중량의 10 wt％∼80 wt％가 착색 성분이고,
상기 발색 강도는 유기 착색 미립자의 분산액을 광로 길이 10 ㎜로 하여, 400 ㎚∼800 ㎚의 범위에서 적분구를 이용한 가시 흡광도 측정을 행하고, 분산매의 백그라운드 성분을 뺌으로써, 분산 기질 자체의 흡광도 곡선을 얻으며, 그 최대값(ABS)을 분산 기질의 중량 퍼센트로 나누어, 0.01 wt％당으로 산출한 값인 것인 유기 착색 미립자.
제1항에 있어서, 상기 착색 성분이 염료인 유기 착색 미립자.
제1항에 있어서, 상기 유기 착색 미립자의 중량의 20 wt％∼90 wt％가 셀룰로오스 유래인 유기 착색 미립자.
제1항에 있어서, 물리 흡착에 의해 리간드가 결합된 유기 착색 미립자.
제1항에 있어서, 반응성 활성기를 갖는 유기 착색 미립자.
제5항에 있어서, 상기 반응성 활성기가 원자수 3 이상의 스페이서 구조를 갖는 유기 착색 미립자.
제5항에 있어서, 공유 결합에 의해 상기 반응성 활성기에 리간드가 결합된 유기 착색 미립자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 유기 착색 미립자를 포함하는 진단약 키트.
제8항에 있어서, 면역 크로마토그래피 키트인 진단약 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 유기 착색 미립자를 사용하는 공정을 포함하는 인비트로 진단 방법.
제10항에 있어서, 면역 크로마토그래피 방법인 인비트로 진단 방법.
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