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CN110192108B - 检测不同的靶标分析物的存在的方法及其相关的试剂盒 - Google Patents

检测不同的靶标分析物的存在的方法及其相关的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用于检测样品中不同靶标分析物的存在的多重诊断方法及其相关试剂盒，所述方法包括向基底提供样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子诸如金纳米粒子，所述基底具有α个分配的空间区域；以及在所述基底上确定在所述基底上的α个分配的空间区域的每一个中由报告粒子产生的颜色的存在，其中所述基底上每个所述分配的空间区域被构造成固定与其他分配的空间区域不同的靶标分析物，其中每种不同颜色的报告粒子被构造成与不同于其他不同颜色的报告粒子的靶标分析物偶联，并且其中α是至少为2的整数且ω是至少为2的整数。在一个实施方案中，所述报告粒子被构造成当两种或更多种不同颜色的报告粒子被共同定位在同一个空间区域中时产生复色，其中由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子的共同定位产生的所述复色与由来自ω种不同颜色的其他颜色组合的报告粒子的共同定位产生的另一复色截然不同。

Description

检测不同的靶标分析物的存在的方法及其相关的试剂盒
技术领域
本公开大体上涉及检测不同的靶标分析物的存在的方法及其相关的试剂盒。
背景技术
基于纸或膜的诊断平台因其低成本、简单的操作和无需设备的信号读出而成为被广泛采用的技术，产生很大市场需求。一个实例是侧流测定(LFA)，其是充分确立的基于纸的平台，用于广泛多样的应用，包括用于生育问题、代谢综合征和器官功能的医疗点诊断。包括LFA的此类诊断平台经常依赖于配体-受体相互作用以识别目的靶标。俘获剂通常是抗体或高亲和力结合蛋白(诸如链霉抗生物素蛋白)，形成俘获-检测剂对从而将靶标分子固定在测试带处并且将它们与报告缀合物连接。许多类型的报告缀合物，包括荧光分子、量子点、上转换无机发光材料、酶和胶体粒子，已经用在包括LFA的诊断平台中。
多重诊断平台(其中在单一平台上分析大量靶标)是高度需要的配置，因为其将大幅度地提高诊断效率并减少所需要的样品体积。目前在包括LFA的基于纸或膜的诊断平台中使用的多重技术是有限的，因为它们典型地通过沿测试条(例如，单一参数)从空间上分开测试线来实现。因此这样的多重能力受空间约束的限制。使用多于一种用于检测的参数的其他现有编码系统与诸如LFA的诊断平台不兼容，其原因是条形码的尺寸大以及用于解码的仪器复杂。
鉴于上述，因此存在着解决或至少减轻上述问题中的一种或多种的需求。
发明内容
在一个方面，提供了一种检测样品中不同靶标分析物的存在的方法，所述方法包括：向基底提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子，所述基底具有α个分配的空间区域；以及在所述基底上确定在所述基底上的α个分配的空间区域的每一个中由报告粒子产生的颜色的存在，其中所述基底上每个所述分配的空间区域被构造成固定与其他分配的空间区域不同的靶标分析物，其中每种不同颜色的报告粒子被构造成偶联与其他不同颜色的报告粒子不同的靶标分析物，并且其中α是至少为2的整数且ω是至少为2的整数。
在一个实施方案中，所述报告粒子被构造成当两种或更多种不同颜色的报告粒子被共同定位在同一个空间区域中时产生复色，其中由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子的共同定位产生的所述复色与由来自ω种不同颜色的其他颜色组合的报告粒子的共同定位产生的另一复色截然不同。
在一个实施方案中，在分配的空间区域中存在由报告粒子的共同定位所产生的复色指示所述样品中至少两种不同的靶标分析物的存在。
在一个实施方案中，ω是3。
在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为550nm至570nm的颜色、吸收波长为400nm至420nm的颜色和吸收波长为610nm至630nm的颜色。
在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：黄色、品红和青色,并且当与其他的ω种不同颜色中的一种或多种组合时被构造成产生选自下列的复色：蓝色、绿色、红色和黑色。
在一个实施方案中，所述分析物包含多核苷酸并且所述方法进一步包括在所述提供步骤之前使所述样品进行扩增反应，所述扩增反应被构造成扩增所述多核苷酸。
在一个实施方案中，所述分析物包含多核苷酸且所述方法进一步包括使所述样品与用于与所述多核苷酸或其扩增子的至少一部分杂交的标记的寡核苷酸接触，所述标记的寡核苷酸被构造成与ω种不同颜色中的至少一种的报告粒子偶联。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括引物。
在一个实施方案中，所述向基底提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子的步骤包括首先向所述基底提供所述样品且随后向所述基底提供具有ω种不同颜色的多种报告粒子。
在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子具有单一局域表面等离子体共振(LSPR)吸收峰。
在一个实施方案中，所述报告粒子包括选自由下述各项组成的组的下列中的一种或多种：固体金纳米粒子、具有金核的固体银纳米粒子和中空的金纳米壳。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括：基于所述空间区域的颜色对每个空间区域分配代码；将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码，其中所述组合代码用来确定所述样品中不同的靶标分析物的存在；和任选地将所述组合代码与预先确定的代码的清单比较以确定所述样品中不同的靶标分析物的存在。
在一个方面，提供了一种用于检测样品中的不同靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：基底，所述基底包括α个分配的空间区域，每个空间区域被构造成固定与其他分配的空间区域不同的靶标分析物；和具有ω种不同颜色的多种报告粒子或其前体，其中每种不同颜色的报告粒子被构造成与其他不同颜色的报告粒子不同的靶标分析物偶联，其中α是至少为2的整数且ω是至少为2的整数。
在试剂盒的一个实施方案中，所述报告粒子被构造成当两种或更多种不同颜色的报告粒子被共同定位在同一个空间区域中时产生复色，其中由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子的共同定位产生的所述复色与由来自ω种不同颜色的其他颜色组合的报告粒子的共同定位产生的另一复色截然不同。
在试剂盒的一个实施方案中，ω是3。
在试剂盒的一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为550nm至570nm的颜色、吸收波长为400nm至420nm的颜色和吸收波长为610nm至630nm的颜色。
在试剂盒的一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：黄色、品红和青色,并且当与其他的ω种不同颜色中的一种或多种组合时被构造成产生选自下列的复色：蓝色、绿色、红色和黑色。
在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于与所述靶标分析物的多核苷酸的至少一部分杂交的寡核苷酸。
在试剂盒的一个实施方案中，所述寡核苷酸包括标记的寡核苷酸，所述标记的寡核苷酸被构造成与ω种不同颜色中的至少一种的报告粒子偶联。
在试剂盒的一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子具有单一局域表面等离子体共振(LSPR)吸收峰。
在试剂盒的一个实施方案中，所述报告粒子包括选自由下述各项组成的组的下列中的一种或多种：固体金纳米粒子、具有金核的固体银纳米粒子、中空的金纳米壳及其任意组合。
在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含：关于下列的说明书：基于所述空间区域的颜色对选自α个空间区域的每个空间区域分配代码，并将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码，所述组合代码用来确定所述样品中不同的靶标分析物的存在；和任选地预先确定的代码的清单，所述预先确定的代码用于与所述组合代码比较以确定所述样品中不同的靶标分析物的存在。
定义
如本文所用，术语“分析物”广义地指被检测的物质。
如本文所用，术语“样品”,除非另外指明，是指较大物体/物质的代表性部分。样品可以是“测试样品”或“对照样品”。“测试样品”通常是可以含有或怀疑含有一种或多种靶标分析物的样品，并且其应该与“对照样品”相区分，“对照样品”通常是已知含有或缺少一种或多种靶标分析物的样品。
术语“纳米”如本文所用应该广义地解释为包括小于约1000nm的尺寸。落在该术语范围内的示例性的子范围包括但不限于小于约900nm、小于约800nm、小于约700nm、小于约600nm、小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约20nm或小于约10nm的范围。因此，“纳米粒子”或“纳米结构”如本文所用广义地指尺寸小于约1000nm的任何粒子或结构，包括但不限于纳米复合材料。此外，术语“纳米粒子”涵盖但不限于胶体纳米粒子形式的纳米粒子。
术语“粒子”如本文所用广义地指离散的实体或离散体。本文所述的粒子可以包括有机粒子、无机粒子或生物粒子。本文所述的使用的粒子也可以是大粒子，其由多个亚微粒子的聚集体或小物体的片段形成。本公开的粒子可以是球体的、基本上球体的或非球体的，诸如不规则形状的粒子或椭球体形状的粒子。术语“尺寸”当用来指粒子时广义地指粒子的最大尺寸。例如，当粒子是基本上球体时，术语“尺寸”可以指粒子的直径；或当粒子是基本上非球体时，术语“尺寸”可以指粒子的最大长度。
术语“偶联”广义地指由任何化学、物理或物理化学相互作用(诸如，共价键、氢键、静电相互作用、极性吸引力、范德华吸引力、疏水相互作用或吸附)导致的两种物质之间的稳定缔合。除非另外说明，否则该术语意在涵盖以下两者：两种物质之间的直接缔合，例如，抗体与蛋白上的抗原的直接结合/缀合，以及两种物质之间通过一种或多种中间手段的间接缔合，例如，抗体和多核苷酸之间借助于一个或多个寡核苷酸和/或标记的缔合。因此，当关于两种物质使用时，“偶联的”是指通过任何此类直接或间接的手段缔合的两种物质。
术语“标记”如本文所用广义地指可以与靶标分析物偶联或掺入在靶标分析物中以辅助靶标分析物的检测的任何物质。尽管在一些情况下“标记”可以直接地检测，但其不需要直接检测，因为其也可以通过替代物(proxy)间接检测，例如，其可以通过由被构造成偶联所述标记的有色报告粒子产生的颜色来间接检测。
术语“与……缔合”在本文中当指两种要素时是用来指两种要素之间的广义关系。所述关系包括，但不限于物理的、化学的或生物的关系。例如，当要素A与要素B缔合时，要素A和B可以彼此直接或间接连接或元素A可以包含元素B或反之亦然。
术语“和/或”，例如，“X和/或Y”被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应当理解为对两种含义或对任一种含义提供明确的支持。
此外，在本文的说明书中，词语“基本上”无论何时使用均要理解为包括，但不限于，“全部地”或“完全地”以及类似用语。另外，术语诸如“包括”、“包含”和类似用语无论何时使用，均意在是非限制性的描述语言，其中除了没有明确述及的其他组分以外，它们广义地包括在此类术语后述及的要素/组分。术语诸如“由……组成”、“组成”和类似术语可以在适当的上下文中被认为是术语诸如“包括”、“包含”和类似术语的子集。因此，在本文公开的使用术语诸如“包括”、“包含”和类似术语的实施方案中，要理解的是这些实施方案提供对使用术语诸如“由……组成”、“组成”和类似术语的相应实施方案的教导。此外，术语诸如“约”、“大概”和类似术语无论何时使用，均典型地意指合理的变化，例如，所公开的值的+/-5％的变化，或所公开的值的4％的变化，或所公开的值的3％的变化，所公开的值的2％的变化，或所公开的值的1％的变化。
此外，在本文的描述中，某些值可以以范围公开。显示范围的端点的值意在说明优选的范围。无论何时描述范围，均意在该范围覆盖并教导所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。即，范围的端点不应当解释为不可改变的限制。例如，1％至5％的范围的描述意在已经具体地公开了子范围1％至2％、1％至3％、1％至4％、2％至3％等，以及单独地公开了该范围内的值，诸如1％、2％、3％、4％和5％。上述具体的公开的意图可适用于范围的任何深度/宽度。
另外地，当描述一些实施方案时，所述公开可以已经公开了作为特定顺序的步骤的方法和/或过程。然而，除非另外需要，否则要理解所述方法或过程不应当限为所公开的特定顺序的步骤。其他顺序的步骤可以是可能的。本文公开的特定次序的步骤不应当被解释为过度的限制。除非另外需要，否则本文公开的方法和/或过程不应当限为以所写的次序执行的步骤。步骤的顺序可以发生变化并且仍然在本公开的范围内。
具体实施方式
下文公开了检测不同的靶标分析物的存在的方法及其相关试剂盒的非限制性实施方案。
在一个实施方案中，提供了一种确定样品中不同靶标分析物的存在的方法，该方法包括：检测所述样品中的第一参数和第二参数以确定不同靶标分析物的存在，所述第一参数被分配了α个可能变量，所述第二参数被分配了β个可能变量，其中所述第一参数与所述第二参数不同，其中α是至少为1的整数，且β是至少为1的整数。
本文所述的方法的实施方案可以在基于纸或膜的诊断平台诸如LFA中实现，但不限于这些平台。有利地，所述方法的实施方案采用至少两种不同的参数来提高诊断测定的多重能力。
在一个实施方案中，α是至少为2、至少为3、至少为4、至少为5或至少为6或至少为7的整数，且β是至少为2、至少为3、至少为4、至少为5、至少为6或至少为7的整数。有利地，所述方法的实施方案能够提供大量的变量组合，从而允许在单一测试/测定或在单一平台上检测大量的分析物。
在各种实施方案中，所述参数选自由下列各项组成的组：空间位置、颜色、颜色强度、有色区域的色相和尺寸。在一个实施方案中，第一参数包括空间参数。因此，在一个实施方案中，所述第一参数的分配的α个可能变量包括基底上的α个不同的分配的空间位置。在一个实施方案中，第二参数包括颜色参数。因此，在一个实施方案中，所述第二参数的分配的β个可能变量包括β个不同的分配的颜色。
在一个实施方案中，所述方法包括使样品与包括α个不同的分配的空间区域的基底接触，所述空间区域中的每一个被构造成固定不同组的靶标分析物。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括使所述基底与具有不同颜色的报告分子/粒子接触，所述报告分子/粒子标记有选自β种不同的分配的颜色的颜色，且每种不同颜色的报告粒子被构造成与不同的分析物缀合。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述样品与具有不同颜色的报告分子/粒子孵育以形成混合物，所述报告分子/粒子标记有选自β种不同的分配的颜色的颜色，且每种不同颜色的报告粒子被构造成与不同的分析物缀合；以及使所述混合物与基底接触。在各种实施方案中，报告分子具有ω种不同颜色，所述ω种不同颜色选自β种不同的分配的颜色。
因此，在一个实施方案中，提供了一种检测样品中的不同靶标分析物的存在的方法，所述方法包括：向基底提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子，所述基底具有α个分配的空间区域；以及在所述基底上确定在所述基底上的α个分配的空间区域的每一个中由报告粒子产生的颜色的存在，其中所述基底上每个所述分配的空间区域被构造成固定与其他分配的空间区域不同的靶标分析物，其中每种不同颜色的报告粒子被构造成与不同于其他不同颜色的报告粒子的靶标分析物偶联，并且其中α是至少为2的整数且ω是至少为2的整数。
有利地，所述方法的采用空间位置和颜色两者的实施方案可以能够实现高水平的多重检测，从而显著提高多重检测能力并且将诊断平台诸如LFA的应用性扩展到更复杂的分析。此外，为了分析同样数目的靶标分析物，所述方法的实施方案可以在诊断平台诸如FLA上需要较少的测试带，由此减少了制造诊断平台所需的成本和时间。
在一个实施方案中，所述报告粒子被构造成当两种或更多种不同颜色的报告粒子被共同定位在同一个空间区域中时产生复色，其中由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子的共同定位产生的所述复色与由来自ω种不同颜色的其他颜色组合的报告粒子的共同定位产生的另一复色截然不同。在各种实施方案中，可以理解的是，由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子/分子的共同定位产生的所述复色与ω种不同颜色中的每一种截然不同/不同，或至少可以通过视觉或其他方式与ω种不同颜色中的每一种容易地区分。
在一个实施方案中，ω为3。在一个实施方案中，ω至少为3。在一个实施方案中，ω小于β。在一些实施方案中，ω代表报告分子/粒子的不同原色的数目，而β代表不同原色和衍生自原色的可能的复色的总数目。因此，在一个实施方案中，在存在具有三种不同颜色的报告粒子的情况下，存在至少4种、至少5种、至少6种或至少7种可能的分配的颜色。有利地，所述方法的实施方案能够以小输入鉴定大量数目的分析物组合。
在一个实施方案中，所述参数包括视觉上可感知的参数，其中所述视觉上可感知的参数是对人眼而言视觉上可感知的。
因此，在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种对人眼而言是视觉上截然不同的/可区分的/不同的/独特的。在进一步的实施方案中，由来自ω种不同颜色中的两种或更多种不同颜色的报告粒子/分子的共同定位产生的所述复色与ω种不同颜色中的每一种对人眼而言是视觉上截然不同的/可区分的/不同的/独特的。在又进一步的实施方案中，由来自ω种不同颜色中的两种或更多种不同颜色的报告粒子/分子的共同定位产生的所述复色与由来自ω种不同颜色的其他颜色组合的报告粒子/分子的共同定位产生的另一复色对人眼而言是视觉上截然不同的/可区分的/不同的/独特的。
在一个实施方案中，α个分配的空间区域包括α个不同的空间区域。所述不同的空间区域可以通过基底上的不参与检测的一个或多个区域而彼此分隔开，例如不参与检测的这些区域可以基本上是惰性的和/或不与分析物和/或报告粒子产生配体-受体相互作用。例如，这些区域不包含用于固定靶标分析物的俘获剂。在进一步的实施方案中，α个不同的空间区域包括α个对人眼(优选人的肉眼或不借助眼镜的人眼)而言视觉上不同的空间区域。
有利地，所述方法的实施方案不需要使用复杂的/自动的/电子的/电气的装置、设备或仪器用于读数。所述方法的实施方案不需要人造电源并且可以手动执行。所述方法的实施方案因此是基本上无需设备的、容易实施的、便利的、低成本的、有效的并适宜作为医疗点诊断或家庭诊断方法。
在各种实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为约550nm至约570nm的颜色、吸收波长为约400nm至约420nm的颜色和吸收波长为约610nm至约630nm的颜色。在各种实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为约560nm至约565nm的颜色、吸收波长为约405nm至约410nm的颜色和吸收波长为约615nm至约620nm的颜色。在各种实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为约563nm的颜色、吸收波长为约407nm的颜色和吸收波长为约617nm的颜色。在各种实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：黄色、品红和青色。
在各种实施方案中，所述β种可能的分配的颜色包括选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为约550nm至约570nm的颜色、吸收波长为约555nm至约565nm的颜色、吸收波长为约560nm至约565nm的颜色、吸收波长为约563nm的颜色、吸收波长为约400nm至约420nm的颜色、吸收波长为约405nm至约415nm的颜色、吸收波长为约405nm至约410nm的颜色、吸收波长为约407nm的颜色、吸收波长为约610nm至约630nm的颜色、吸收波长为约615nm至约625nm的颜色、吸收波长为约615nm至约620nm的颜色或吸收波长为约617nm的颜色。在各种实施方案中，所述β种可能的分配的颜色包括选自由下列各项组成的组的颜色：青色、品红、黄色、蓝色、绿色、红色、黑色和任选地没有可见的/可检测到的颜色。可以理解的是，在各种实施方案中，颜色是指可为用户/操作者感知的色相。因此，同一色相的色彩、色调和/或色度的变化可以仍被认为是同一颜色，只要用户/操作者仍然感觉这种色彩、色调和/或色度属于同一色相。例如，淡黄色和深黄色可以通常被用户/操作者均认为是黄色。
在各种实施方案中，选自由青色、品红和黄色组成的组的两种或更多种颜色在空间区域中的组合或共同定位产生复色，所述复色对人眼是可见的并且选自由下列各项组成的组：蓝色、绿色、红色和黑色。因此，在各种实施方案中，所述复色选自由下列各项组成的组：蓝色、绿色、红色和黑色。因此，在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：黄色、品红和青色，并且当与其他ω种不同颜色中的一种或多种组合时，被构造成产生选自下列的复色：蓝色、绿色、红色和黑色。因此，在各种实施方案中，原色和复色基于减色系统，所述减色系统减去来自可见白光的波长并反射出其他波长的光以得到可见的原色和复色。
有利地，在各种实施方案中，当颜色是依照本文公开的颜色时，所述颜色对人眼而言，优选地对人的肉眼或未借助眼镜的健康人眼而言，在视觉上是不同的。
在一个实施方案中，在分配的空间区域中存在由报告粒子产生的颜色指示样品中存在至少一种靶标分析物。在一个实施方案中，在分配的空间区域中存在由报告粒子的共同定位产生的复色指示样品中存在至少两种不同的靶标分析物。在特定的实施方案中，在分配的空间区域中存在选自由黄色、品红和青色组成的组的单一颜色指示在所述空间区域中存在一种分析物。在特定的实施方案中，在分配的空间区域中存在选自由蓝色、绿色、红色组成的组的单一复色指示在所述空间区域中存在两种不同的分析物。在特定的实施方案中，在分配的空间区域中存在黑色的复色指示在所述空间区域中存在三种不同的分析物。在一个实施方案中，在分配的空间区域中缺少可见的/可检测到的颜色指示样品中缺少一种或多种靶标分析物。
在一个实施方案中，在两个或更多个分配的空间区域中存在由报告粒子产生的颜色指示样品中存在两种或更多种靶标分析物。同样地，在三个或更多个分配的空间区域中存在由报告粒子产生的颜色可以指示样品中存在三种或更多种靶标分析物，等等，依此类推。
在各种实施方案中，所述靶标分析物包括至少一种氨基酸、至少一种肽、至少一种多肽、至少一种蛋白、至少一种核苷酸、至少一种多核苷酸、至少一种核酸、至少一种DNA、至少一种RNA、至少一种脂质、至少一种糖脂、至少一种糖类、至少一种激素、至少一种细胞、至少一种微生物、至少一种细菌病原体、至少一种细菌DNA、至少一种细菌RNA、至少一种病毒病原体、至少一种病毒DNA、至少一种病毒RNA、上述物质中的任一种的至少一个片段或至少一个亚型、至少一种化学化合物、至少一种有机化合物、至少一种甾体、至少一种维生素、至少一种麻醉剂、至少一种药物、至少一种药物中间体、至少一种药品、至少一种毒素、至少一种杀虫剂、至少一种重金属、至少一种金属、至少一种金属离子、上述物质中的任一种的至少一种代谢物、或其任意组合。在一些实施方案中，多核苷酸或核酸包括双链多核苷酸或双链核酸。在一些实施方案中，分析物包括生物材料。在一些实施方案中，分析物包括天然材料，例如天然存在的生物材料。在其他实施方案中，分析物包括合成材料，例如，杀虫剂。
因此，在一些实施方案中，样品包含或怀疑包含至少一种氨基酸、至少一种肽、至少一种多肽、至少一种蛋白、至少一种核苷酸、至少一种多核苷酸、至少一种核酸、至少一种DNA、至少一种RNA、至少一种脂质、至少一种糖脂、至少一种糖类、至少一种激素、至少一种细胞、至少一种微生物、至少一种细菌病原体、至少一种细菌DNA、至少一种细菌RNA、至少一种病毒病原体、至少一种病毒DNA、至少一种病毒RNA、上述物质中的任一种的至少一个片段或至少一个亚型、至少一种化学化合物、至少一种有机化合物、至少一种甾体、至少一种维生素、至少一种麻醉剂、至少一种药物、至少一种药物中间体、至少一种药品、至少一种毒素、至少一种杀虫剂、至少一种重金属、至少一种金属、至少一种金属离子、上述物质中的任一种的至少一种代谢物、或其任意组合。
在一些实施方案中，所述方法包括获得样品。在一些实施方案中，所述方法包括在将样品提供至基底之前处理所述样品。在将样品提供至基底之前可以采用本领域中已知的处理不同类型的样品的方法。例如，处理生物样品的方法可以涉及细胞裂解、DNA和/或RNA的提取、样品的破碎和/或溶解、纯化和样品浓缩。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将样品基本上溶解/增溶于溶剂中以获得流体样品。因此，在一个实施方案中，所述样品包括流体样品。
在一些实施方案中，其中所述分析物包含多核苷酸或核酸，制备样品包括使所述样品经受适合于将所述核酸分析物扩增到可检测水平的扩增条件。在一些实施方案中，所述分析物包含多核苷酸/核酸,且所述方法进一步包括在提供步骤之前使所述样品进行扩增反应，所述扩增反应被配置成扩增所述多核苷酸/核酸。可以采用本领域中已知的扩增反应。所述扩增反应可以包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环介导等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自我持续序列复制(3SR)、滚环扩增(RCA)或任何其他方法，借助于这些方法可以从多核苷酸模板序列或核酸模板序列生成一个或多个拷贝的特定多核苷酸序列或核酸序列。在一个实施方案中，扩增反应包括等温扩增反应。在一个实施方案中，扩增反应包括LAMP。如可以理解的，与例如常规PCR相比，LAMP具有高扩增效率。与例如使用常规PCR的方法相比，包括使用LAMP进行扩增的所述方法的实施方案因此可以需要较短的时间来完成，因此所述方法的实施方案特别适合作为医疗点诊断方法。
在一些实施方案中，其中所述分析物包含多核苷酸或核酸，制备样品包括使所述样品进行被配置成将所述多核苷酸、所述核酸和/或它们的扩增子与标记偶联的标记程序，所述标记被构造成与ω种不同颜色中的至少一种的报告粒子偶联。在一个实施方案中，所述标记程序包括使所述样品与用于与所述多核苷酸、所述核酸和/或它们的扩增子的至少一部分杂交的寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与所述标记偶联。因此，在一个实施方案中，所述分析物包含多核苷酸/核酸，并且所述方法进一步包括使所述样品与用于与所述多核苷酸/核酸或其扩增子的至少一部分杂交的经标记的寡核苷酸接触，所述经标记的寡核苷酸被构造成与ω种不同颜色中的至少一种的报告粒子偶联。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括引物。因此，在一个实施方案中，所述标记程序与扩增反应同时发生，所述方法包括使所述样品与适合用于扩增所述多核苷酸或所述核酸的经标记的引物接触。在一个实施方案中，所述标记程序包括使所述样品与两种不同的寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸被构造成与双链多核苷酸或核酸的两条互补链中的一条杂交，所述寡核苷酸各自与标记偶联从而最终获得经双重标记的双链多核苷酸或核酸。
在各种实施方案中，所述寡核苷酸包括选自由下列各项组成的组的一种或多种序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24或与上述序列中的任一种具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的序列。
在一个实施方案中，所述标记能够与报告粒子相互作用或偶联。在一个实施方案中，所述标记能够与俘获剂相互作用或偶联，所述俘获剂可以被布置在基底上。在优选的实施方案中，每个标记能够与ω种不同颜色中的一种的报告粒子相互作用或偶联或与可以被布置在基底上的俘获剂中的一种俘获剂相互作用或偶联。在一个实施方案中，所述标记包括配体或半抗原。在各种实施方案中，所述配体或半抗原选自由下列各项组成的组：生物素、洋地黄毒苷(DIG)、二硝基苯酚(DNP)、荧光素诸如6-FAM或FITC、德克萨斯红、5-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、或类似物及其任意组合。
在一个实施方案中，向基底提供样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子的步骤包括分开地或序贯地向基底提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子。在特定的实施方案中，向基底提供样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子的步骤包括首先向基底提供所述样品，随后向基底提供具有ω种不同颜色的多种报告粒子。在一个实施方案中，向基底提供样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子的步骤包括向基底同时提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子，例如作为混合物提供。因此，在一个实施方案中，所述方法包括将所述样品与具有ω种不同颜色的多种报告粒子孵育以形成混合物，并将所述混合物提供至基底。在一个实施方案中，具有ω种不同颜色的多种报告粒子被预先布置在基底中。当所述方法以基于纸或膜的诊断平台诸如LFA实现时，报告粒子可以被预先布置在侧流基底的区域中，例如，在缀合垫中。报告粒子可以被干燥并在缀合垫中固定就位。在一些实施方案中，其中报告粒子被预先布置在基底中，所述基底被构造成当与样品接触时释放所述报告粒子。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括在提供样品和多种报告粒子后冲洗基底。在一些实施方案中，冲洗基底包括利用缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS))和牛血清白蛋白(BSA)冲洗基底。有利地，所述冲洗步骤可以去除靶标分析物和报告粒子的非特异性结合和/或可以去除基本上没有固定到基底上的靶标分析物和报告粒子。
在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子被构造成偶联至少两种不同的靶标分析物。在各种实施方案中，两种不同的靶标分析物是不同属/类别/类型的靶标分析物(例如蛋白/多肽相对于核酸/多核苷酸)。例如，青色颜色的报告粒子可以被构造成偶联基于多肽的靶标分析物和基于多核苷酸的靶标分析物，所述基于多肽的靶标分析物和所述基于多核苷酸的靶标分析物被固定在基底上的不同的分配的空间区域上。如可以理解的是，这在不增加用于检测的输入或参数的数目的情况下提高了所述方法的多重检测能力。
在各种实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子包括纳米结构。在一个实施方案中，所述纳米结构是零维的。在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子包括纳米粒子。在各种实施方案中，零维纳米粒子具有比一维纳米棒和/或二维纳米板更多的对称平面。不希望受任何理论约束，相信零维纳米粒子的对称性导致纳米粒子具有单一等离子体吸收，这可以有益于基于比色法的分析，如本文所述，所述分析涉及两种或更多种颜色在同一空间区域中的共同定位。
因此，在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子具有单一局域表面等离子体共振(LSPR)吸收峰。在各种实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子具有在下述范围内的局域表面等离子体共振(LSPR)吸收峰：约550nm至约570nm、约555nm至约565nm、约560nm至约565nm、约563nm、约400nm至约420nm、约405nm至约415nm、约405nm至约410nm、约407nm、约610nm至约630nm、约615nm至约625nm、约615nm至约620nm、约617nm。在一个实施方案中，ω种不同颜色中的每一种的报告粒子包括纳米粒子或由纳米粒子组成，所述纳米粒子各自具有约563nm、约407nm或约617nm的LSPR吸收峰。有利地，当ω种不同颜色中的每一种的报告粒子的LSPR吸收峰为依照本文所公开的值时，由ω种不同颜色中的每一种的报告粒子生成的颜色以及由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子的共同定位生成的任一种复色对人眼而言可以是视觉上不同的。
在各种实施方案中，纳米粒子包括金属纳米粒子。在一些实施方案中，纳米粒子包括贵金属纳米粒子。在一些实施方案中，所述贵金属纳米粒子包括下列贵金属中的一种或多种的纳米粒子：金、银、铂、钯、钌和铼。在一些实施方案中，所述报告粒子包括选自由下面各项组成的组的下列中的一种或多种：金纳米粒子、银纳米粒子、金-银纳米复合材料及其任意组合。在进一步的实施方案中，所述报告粒子包括选自由下面各项组成的组的下列中的一种或多种：固体金纳米粒子、具有金核的固体银纳米粒子和中空的金纳米壳。在一个实施方案中，所述固体金纳米粒子具有约407nm的LSPR吸收峰。在一个实施方案中，所述具有金核的固体银纳米粒子具有约563nm的LSPR吸收峰。在一个实施方案中，中空的金纳米壳具有约617nm的LSPR吸收峰。如可以理解的，有色的报告粒子的组成可以对其特性有贡献，例如，对其LSPR吸收峰有贡献。
在一个实施方案中，所述报告粒子包括胶体纳米粒子。如可以理解的，因其方便的比色读出和单步操作，胶体纳米粒子的使用是有利的，与使用其他类型的报告粒子/缀合物诸如荧光分子、量子点、上转换无机发光材料和酶相比，其可以极大地提高用户体验，并且显著地减少测定成本和周转时间。
在各种实施方案中，所述报告粒子表现出下列形态中的一种或多种：截角八面体结构、截角立方结构和中空的立方结构。如可以理解的是，有色的报告粒子的形态可以对其特性有贡献，例如，其LSPR吸收峰。
在各种实施方案中，报告粒子包含与纳米粒子偶联的检测剂，所述检测剂被构造成优先地偶联(例如借助于标签)或结合靶标分析物或其部分/片段。在各种实施方案中，检测剂选自由下列各项组成的组：多核苷酸、寡核苷酸、适配体、分子探针、抗体、蛋白、肽、有机化合物、小分子、化合物和分子，它们能够与分析物或其部分/片段相互作用。在一个实施方案中，报告粒子包括纳米粒子-抗体缀合物。
在各种实施方案中，所述方法进一步包括制备报告粒子。在各种实施方案中，制备报告粒子包括在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和/或柠檬酸盐的存在下向金属离子或盐溶液添加强还原剂，例如，向Au3+溶液(Au(III)溶液)添加硼氢化钠(NaBH4)或类似物以形成Au种子粒子。在一些实施方案中，制备报告粒子进一步包括向金属种子粒子添加生长混合物以形成纳米粒子。所述生长混合物可以包含弱酸、碱、洗涤剂、弱还原剂和/或金属离子/盐溶液。例如，所述方法可以包括向Au种子粒子添加CTAB、Au3+和弱还原剂诸如抗坏血酸或类似物以形成Au纳米粒子或固体金纳米粒子。因此，在各种实施方案中，生长混合物和/或金属种子粒子是报告粒子例如纳米粒子的前体。在一些实施方案中，制备报告粒子进一步包括向CTAB/CTAC/柠檬酸盐添加弱还原剂(诸如抗坏血酸)、氢氧化钠(NaOH)、Au种子粒子和Ag+以形成Au@Ag纳米粒子或具有金核的固体银纳米粒子。在进一步的实施方案中，弱还原剂(诸如抗坏血酸)、NaOH、Au种子粒子和Ag+序贯地加入至CTAB/CTAC/柠檬酸盐以形成Au@Ag纳米粒子或具有金核的固体银纳米粒子。在一些实施方案中，制备报告粒子进一步包括向溶液中的Au@Ag纳米粒子添加金盐溶液，优选金(III)盐溶液诸如氯金酸(HAuCl4)、四溴金(III)酸钾(KAuBr4)、氯化金(III)(AuCl3)或四氯金(III)酸钠(NaAuCl4)以形成Au/Ag中空纳米粒子或中空的金纳米壳。在进一步的实施方案中，逐滴地向溶液中的Au@Ag纳米粒子添加金盐溶液以形成Au/Ag中空纳米粒子或中空的金纳米壳。在又进一步的实施方案中，逐滴地向溶液中的Au@Ag纳米粒子添加金盐溶液直至获得青色溶液。在一个实施方案中，金盐溶液包含HAuCl4。如可以理解的，通过使用种子介导的生长法，所得纳米结构的尺寸和形状可以更好地控制，由此避免了在生长阶段期间纳米粒子的波动，导致仅仅形成单晶纳米粒子。因此，在一个实施方案中，纳米粒子包括单晶纳米粒子。
在各种实施方案中，基底包括布置在其上的俘获剂，所述俘获剂被构造成将靶标分析物固定在其上。在各种实施方案中，基底上每个分配的空间区域包含俘获剂，所述俘获剂不同于其他分配的空间区域上布置的俘获剂。因此，在各种实施方案中，基底上每个分配的空间区域包含俘获剂，所述俘获剂被构造成固定与其他分配的空间区域上布置的俘获剂所固定的靶标分析物不同的靶标分析物。在各种实施方案中，俘获剂选自由下列各项组成的组：多核苷酸、寡核苷酸、适配体、分子探针、抗体、蛋白、肽、有机化合物、小分子、化合物和分子，它们能够与分析物或其部分/片段相互作用。在一个实施方案中，俘获剂包括链霉抗生物素蛋白。如可以理解的是，链霉抗生物素蛋白对生物素具有非常高的结合亲和力。因此，在一些实施方案中，俘获剂被构造成通过结合靶标分析物的标记来固定靶标分析物。当所述方法在基于纸或膜的诊断平台诸如LFA中实施时，俘获剂可以被布置在侧流基底的区域中，例如，在指定的测试区或线处。
在特定的实施方案中，俘获剂选自由下列各项组成的组：抗-人绒毛膜促性腺激素(抗-HCG)、抗-甲胎蛋白(抗-AFP)和链霉抗生物素蛋白,且包含在报告粒子中的检测剂选自由下列各项组成的组：抗-HCG、抗-AFP、抗-DIG、抗-FITC和抗-DPN。在特定的实施方案中，俘获剂选自由下列各项组成的组：抗-DIG、抗-FITC和抗-DPN,且包含在报告粒子中的检测剂选自由下列各项组成的组：抗-DIG、抗-FITC和抗-DPN。因此，在一个实施方案中，俘获剂与检测剂相同。如可以理解的是，取决于目标分析物，也可以使用其他俘获剂，只要所述俘获剂能够与靶标分析物偶联即可。也可以使用其他检测剂，只要所述检测剂能够与靶标分析物和报告粒子的纳米粒子偶联即可。
在一个实施方案中，所述基底包括侧流基底。在进一步的实施方案中，所述基底包括侧流条。因此，在一个实施方案中，所述方法包括基于侧流的方法。
在各种实施方案中，所述基底包括对照区/带/线，所述对照区/带/线被构造成固定对照样品或报告粒子。所述对照区/带/线可以远离测试区/带/线定位以防止意欲用于对照区/带/线的报告粒子和意欲用于测试区/带/线的报告粒子的共同定位。在特定的实施方案中，对照区/带/线包含山羊抗-兔抗体用于固定报告粒子。
因此，在一些实施方案中，所述方法进一步包括使基底与对照样品接触用于获得关于所述方法是否被正确执行的指示。对照样品可以包括阳性对照样品、阴性对照样品或两者皆有。如可以理解的是，阳性对照样品的固定可以表示该方法被正确执行，例如，扩增反应是成功的，并且获得的结果不是由于不成功的扩增引起的假阴性。没有可检测到的阴性对照样品的固定可以表示该方法被正确执行，例如，不存在非特异性相互作用和/或非特异性扩增且获得的结果不是假阳性。在各种实施方案中，对照样品与用于检测的报告粒子偶联。在一些实施方案中，所述方法包括在使对照样品与基底接触之前对其进行处理。如可以理解的是，处理样品的方法，如前文公开的那些，可以适用于对照样品。
在各种实施方案中，确定步骤进一步包括将基底的α个分配的空间区域中的每一个中的颜色与参照清单/表进行比较以鉴定存在于样品中的分析物。
在各种实施方案中，β种不同的颜色中的每一种和β种不同的颜色的两种或更多种的任意组合被分配以独特的颜色代码。因此，在各种实施方案中，所述方法进一步包括确定α个分配的空间区域中的每一个中的颜色，并对每个区域分配以相应的颜色代码。在一个实施方案中，其中在一个区域处不存在可检测到的颜色，不同于β种不同的颜色中的每一种和β种不同的颜色中的两种或更多种的任意组合的颜色代码的代码被分配给该区域。在一个实施方案中，颜色代码包括单字母代码。因此，在一个实施方案中，所述方法进一步包括组合每个区域处的相应颜色代码/代码使得得到的α-字母代码被获得用于确定样品中不同靶标分析物的存在。在一个实施方案中，检测样品中不同靶标分析物的存在包括将α-字母代码与预先确定的代码的参照清单/表进行匹配以确定样品中存在的不同靶标分析物的身份。
因此，在一个实施方案中，所述方法进一步包括基于空间区域处的颜色对每个空间区域分配代码；以及将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码,其中所述组合代码用来确定样品中不同靶标分析物的存在。在进一步的实施方案中，所述方法进一步包括将所述组合代码与预先确定的代码的清单比较以确定样品中不同靶标分析物的存在。因此，在一个实施方案中，所述方法进一步包括基于空间区域处的颜色对每个空间区域分配代码；将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码,其中所述组合代码用来确定样品中不同靶标分析物的存在；以及任选地将所述组合代码与预先确定的代码的清单比较以确定样品中不同靶标分析物的存在。
在各种实施方案中，所述方法能够区分第一分析物类型内的至少两种或至少三种不同的亚类以及第二分析物类型内的至少两种或至少三种不同的亚类，并且其中所述第一分析物类型与所述第二分析物类型相同或不同。例如，所述方法的实施方案能够区分DNA的第一分析物类型与蛋白的第二分析物类型，以及在DNA的第一分析物类型内，进一步区分DNA的亚型例如，FITC+DNA-1、DIG+DNA-2和DNP+DNA-3等，以及在蛋白的第二分析物类型内，进一步区分蛋白的亚型，例如，甲胎蛋白(AFP)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)，这些均在单一基底内，即，单一测试。在进一步的实施例中，所述方法的实施方案能够区分HSV病毒的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、HSV-2和HSV-3亚型。所述方法的实施方案因此是高度灵敏的和高度特异性的，尽管具有高水平的多重检测。所述方法的实施方案因此可以产生准确的结果，这在临床和/或实验室场景中是特别重要的。
在一个实施方案中，所述方法能够检测至多达至少N种分析物，其中N大于α、β和/或ω。
在一个实施方案中，所述方法包括诊断方法。在一个实施方案中，所述方法包括体外方法。
在一个实施方案中，提供了一种试剂盒，其包括：基底，所述基底包括α个不同的分配的空间位置，每个空间区域被构造成固定不同的靶标分析物；和具有不同颜色的报告分子/粒子，所述报告分子/粒子标记以选自β种不同的分配的颜色的颜色且每种不同的颜色的报告粒子被构造成与不同的靶标分析物偶联；其中α是至少为1的整数，且β是至少为1的整数。在一个实施方案中，α是至少为2的整数且β是为至少为2的整数。在各种实施方案中，报告分子具有ω种不同颜色，所述ω种不同颜色选自β种不同的分配的颜色。
因此，在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的不同靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：基底，所述基底包括α个分配的空间区域，每个空间区域被构造成固定与其他的分配的空间区域不同的靶标分析物；和具有ω种不同颜色的多种报告粒子或其前体，其中每种不同颜色的报告粒子被构造成与其他不同颜色的报告粒子不同的靶标分析物偶联，其中α是至少为1或至少为2的整数且ω是至少为1或至少为2的整数。
在所述试剂盒中可以提供报告粒子的前体从而允许用户合成所述报告粒子。在各种实施方案中，所述前体包含一种或多种强还原剂(例如NaBH4)、CTAB、CTAC、柠檬酸盐、Au盐、HAuCl4、KAuBr4、AuCl3、NaAuCl4、Au种子粒子、弱还原剂(例如抗坏血酸)、NaOH、Ag盐或AgNO3。Au种子粒子可以指通过本文公开的方法的实施方案所获得的Au种子粒子。
在各种实施方案中，所述试剂盒进一步包括关于由所述前体合成所述报告粒子的说明书。所述说明书可以包括本文公开的用于制备报告粒子的方法的一个或多个步骤。
在各种实施方案中，要理解的是试剂盒内的具有ω种不同颜色的多种报告粒子不意在仅限于与基底分开的组分，因为可选地它们可以与基底物理接触。在一个实施方案中，其中具有ω种不同颜色的多种报告粒子单独地提供，具有ω种不同颜色的多种报告粒子以胶体粒子的形式提供。在一个实施方案中，具有ω种不同颜色的多种报告粒子预先布置在基底上。
在试剂盒的一个实施方案中，ω为3。
在各种实施方案中，试剂盒中的报告粒子包括上文所述的一个或多个特征。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于与靶标分析物的多核苷酸/核酸或其扩增子的至少一部分杂交的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸与标记偶联，所述标记被构造成依次与ω种不同颜色的报告粒子中的至少一种偶联。因此，在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括标记的寡核苷酸，所述标记的寡核苷酸被构造成与ω种不同颜色中的至少一种的报告粒子偶联。
在一个实施方案中，所述标记能够与报告粒子相互作用或偶联。在一个实施方案中，所述标记能够与俘获剂相互作用或偶联，所述俘获剂可以被布置在基底上。在优选的实施方案中，每个标记能够与ω种不同颜色中的一种的报告粒子相互作用或偶联或与可以被布置在基底上的俘获剂中的一种俘获剂相互作用或偶联。在一个实施方案中，所述标记包括配体或半抗原。在各种实施方案中，所述配体或半抗原选自由下列各项组成的组：生物素、DIG、DNP、荧光素诸如6-FAM或FITC、德克萨斯红、TAMRA、或类似物及其任意组合。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括引物。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒包含引物或标记的引物。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一寡核苷酸，例如标记的引物，其被构造成标记靶标分析物的多核苷酸/核酸或其扩增子的第一链；第二寡核苷酸,例如标记的引物，其被构造成标记靶标分析物的多核苷酸/核酸或其扩增子的互补链，或包含两者。在一些实施方案中，所述试剂盒包含两种不同的寡核苷酸，例如两种不同的标记的引物，其中每种寡核苷酸被构造成与靶标分析物的双链多核苷酸/核酸或其扩增子的两条互补链中的一条链杂交以双重标记所述靶标分析物的多核苷酸/核酸或其扩增子。在一个实施方案中，所述试剂盒包含第一寡核苷酸,例如标记的引物，其与选自生物素和德克萨斯红的配体或半抗原偶联；和第二寡核苷酸，例如标记的引物，其与选自由下列各项组成的组的半抗原偶联：洋地黄毒苷(DIG)、二硝基苯酚(DNP)、荧光素(诸如6-FAM或FITC)和TAMRA。
在各种实施方案中，所述试剂盒包含至少4条引物、至少6条引物、至少8条引物、至少10条引物、至少12条引物、至少14条引物、至少16条引物或至少18条引物。在各种实施方案中，所述试剂盒进一步包括选自由下面各项组成的组中的下列试剂中的一种或多种：脱氧核苷酸(NTP)、硫酸镁(MgSO4)、镁离子、等温缓冲液、DNA聚合酶和等温缓冲液。
在各种实施方案中，所述试剂盒中的基底包括如上文所述的一个或多个特征。在一个实施方案中，所述基底包含被布置在基底的α个不同的分配的空间位置上的用于固定靶标分析物的俘获剂，其中每个不同的空间区域中的俘获剂优先地结合不同的靶标分析物。在一个实施方案中，俘获剂选自由下列各项组成的组：多核苷酸、寡核苷酸、适配体、分子探针、抗体、蛋白、肽、有机化合物、小分子、化合物和分子，它们能够与分析物或其部分/片段相互作用。在一个实施方案中，俘获剂包括链霉抗生物素蛋白。在一个实施方案中，所述基底包括侧流条。在一个实施方案中，所述基底包括对照区/带/线，所述对照区/带/线被构造成固定对照样品或报告粒子。
因此，在各种实施方案中，所述试剂盒进一步包括对照样品，所述对照样品被构造成固定在基底上的对照区/带/线中以指示所述方法被正确地执行。在一些实施方案中，所述对照样品包括靶标分析物和/或其片段/亚型/代谢物的等效形式、拷贝或克隆。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于扩增对照样品中的多核苷酸或核酸的对照引物。如可以理解的是，在基底上的对照区或线处检测到对照样品的扩增子可以指示通过该试剂盒获得的结果是有效的。
在各种实施方案中，所述试剂盒进一步包括关于对选自α个空间区域的每个空间区域基于所述空间区域处的颜色分配代码并将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码用于确定所述样品中不同靶标分析物的存在的说明书。在进一步的实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于与所述组合代码比较以确定所述样品中不同靶标分析物的存在的预先确定的代码的清单。因此，在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括关于下列的说明书：对选自α个空间区域的每个空间区域基于所述空间区域处的颜色分配代码，并将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码，所述组合代码用于确定所述样品中不同靶标分析物的存在；和任选地包括预先确定的代码的清单，所述预先确定的代码用于与所述组合代码比较以确定所述样品中不同靶标分析物的存在。
在各种实施方案中，所述试剂盒能够检测至多达至少N种分析物，其中N大于α、β和/或ω。
在一个实施方案中，所述试剂盒是便携式的。在一个实施方案中，所述试剂盒是可再利用的。在一个实施方案中，所述试剂盒是一次性的。在一个实施方案中，所述试剂盒包括诊断试剂盒。在一个实施方案中，所述诊断试剂盒包括医疗点诊断试剂盒。
附图说明
图1示出了对有颜色的报告粒子的表征，所述有颜色的报告粒子包含根据本文公开的一个实施方案的Au/Ag纳米粒子(NP)。(A)(I)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au NP的扫描电子显微镜(SEM)图像。(A)(II)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au NP的透射电子显微镜(TEM)图像。(A)(III)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au NP的几何模型。(A)(IV)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au NP的紫外可见光(UV-vis)谱。(B)(I)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au@Ag核-壳NP的SEM图像。(B)(II)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au@Ag核-壳NP的TEM图像。(B)(III)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au@Ag核-壳NP的几何模型。(B)(IV)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au@Ag核-壳NP的紫外可见光谱。(C)(I)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au/Ag中空的NP的SEM图像。(C)(II)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au/Ag中空的NP的TEM图像。(C)(III)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au/Ag中空的NP的几何模型。(C)(IV)示出了根据本文公开的一个实施方案的Au/Ag中空的NP的紫外可见光谱。
图2示出了用HAuCl4溶液对Au@Ag核-壳NP进行电化学置换(galvanicreplacement)允许调整根据本文公开的一个实施方案的跨越可见光谱的Au/Ag NP的LSPR峰。(A)示出了根据本文公开的一个实施方案通过使Au@Ag核-壳NP溶液与不同体积的20mMHAuCl4溶液反应制备的Au/Ag NP表现出不同的颜色。(B)示出了根据本文公开的一个实施方案在(A)中示出的Au/Ag NP溶液的相应紫外可见吸收光谱。
图3示出了根据本文公开的一个实施方案使用三种原色的NP的颜色组合。(A)示出了根据本文公开的一个实施方案三种原色的NP的组合产生了独特复色的NP混合物。(B)示出了根据本文公开的一个实施方案通过混合不同比率的原色NP所获得的调色板。(C)示出了根据本文公开的一个实施方案通过单一原色NP和NP混合物检测的FITC-标记的dsDNA靶标。
图4图示了根据本文公开的一个实施方案基于空间分离和颜色共同定位的两参数多重检测。(A)描绘了根据本文公开的一个实施方案的检测方案。(B)示出了根据本文公开的一个实施方案对所有32种可能的靶标组合的多重检测。
图5图示了根据本文公开的一个实施方案利用两参数多重策略用于HSV分型的多重LFA。(A)是根据本文公开的一个实施方案的多重HSV分型的示意性图示。(B)示出了根据本文公开的一个实施方案对包括阴性样品的所有8种靶标组合的多重检测。
图6是根据本文公开的一个实施方案制备多色Au/Ag NP(即Au NP(品红溶液)、Au@Ag NP(黄色溶液)和Au中空NP(青色溶液))的示意性图示。
附图详述
图1示出了对包含根据本文公开的一个实施方案的Au/Ag纳米粒子(NP)的有色报告粒子的表征。
图1(A)(I)和(A)(II)分别示出了根据本文公开的一个实施方案的Au NP的大体产品形态和结构。如所示的那样，Au NP表现出类似于(A)(III)中所图示的截角八面体形状。此外，Au NP具有在约563nm处的吸收峰，如(A)(IV)中所示。
图1(B)(I)和(B)(II)分别示出了根据本文公开的一个实施方案的Au@Ag核-壳NP的大体产品形态和结构。如所示的那样，Au@Ag核-壳NP表现出类似于(B)(III)中所图示的截角立方体形状。此外，Au NP具有在约407nm处的吸收峰，如(A)(IV)中所示。
图1(C)(I)和(C)(II)分别示出了根据本文公开的一个实施方案的Au/Ag中空NP的大体产品形态和结构。如所示的那样，Au/Ag中空NP表现出类似于(C)(III)中所图示的中空立方结构。此外，Au/Ag中空NP具有在约617nm处的吸收峰，如(A)(IV)中所示。
图2示出了用HAuCl4溶液对Au@Ag核-壳NP进行电化学置换允许调整根据本文公开的一个实施方案的跨越可见光谱的Au/Ag NP的LSPR峰。
图2A示出了根据本文公开的一个实施方案将20mM HAuCl4逐滴加入至Au@Ag核-壳NP溶液以获得溶液颜色从黄色逐渐改变成橙色、改变成红棕色且最后改变成青色的Au/AgNP溶液。所述颜色是视觉上可区分的。
图2B示出了根据本文公开的一个实施方案随着将20mM HAuCl4逐滴加入至Au@Ag核-壳NP溶液，图2A中的溶液的相应吸收光谱。如所示的那样，利用HAuCl4溶液的体积，可以在约453nm至约620nm调整Au/Ag NP的LSPR峰位置。
图3A示出了根据本文公开的一个实施方案青色、品红和黄色(分别标注为C、M和Y)的NP的组合产生了独特复色的NP混合物，诸如蓝色(标注为B)由青色和品红NP的混合物产生，绿色(标注为G)由青色和黄色NP的混合物产生，红色(标注为R)由黄色和品红NP的混合物产生，以及黑色(标注为K)由所有三种青色、品红和黄色NP的混合物产生。这些颜色是独特的并且很容易通过肉眼区分。
图3B示出了根据本文公开的一个实施方案通过混合不同比率的原色NP所获得的调色板。在第一行上，减小黄色NP的浓度并相应的增加品红NP的浓度导致颜色从黄色到红色到品红的渐变。在第二行上，减小黄色NP的浓度并相应的增加青色NP的浓度导致颜色从黄色到绿色到青色的渐变。在第三行上，减小品红NP的浓度并相应的增加青色NP的浓度导致颜色从品红至蓝色至青色的渐变。
图3C示出了根据本文公开的一个实施方案通过单一颜色NP的原色(分别标注为C、M和Y的青色、品红和黄色)和NP混合物的复色(分别标注为B、G、R和K的蓝色、绿色、红色和黑色)检测的FITC-标记的dsDNA靶标。
图4图示了根据本文公开的一个实施方案基于空间分离和颜色共同定位的两参数多重检测。
图4A描绘了检测方案400。在带411(带A)处检测到HCG 401和AFP 403的形式的两种基于蛋白的靶标，在另一个带413(带B)处检测到三种基于DNA的靶标405、407和409。对于每种蛋白靶标，使用一对抗体形式的检测剂和俘获剂，它们将结合蛋白的不同表位。对于蛋白靶标HCG 401，使用抗-HCG 417形式的检测剂和抗-HCG 415形式的俘获剂。对于蛋白靶标AFP 403，使用抗-AFP 421形式的检测剂和抗-AFP 419形式的俘获剂。俘获剂抗-HCG 415和抗-AFP 419被固定在基底上带411处，而检测剂抗-HCG 417和抗-AFP 421各自分别缀合于黄色纳米粒子431和青色纳米粒子433。对于每个DNA靶标405,407和409，DNA的一端标记以生物素(未显示)形式的配体，另一端标记以分别用于DNA靶标405、407和409中的每一个的FITC 441、DIG 443或DNP 445形式的半抗原。链霉抗生物素蛋白(其是配体生物素的受体)形式的常见俘获剂423被固定在基底上带413处用于俘获生物素-标记的DNA靶标405,407和409。抗-FITC 425、抗-DIG 427和抗-DNP 429形式的检测剂各自分别缀合于青色纳米粒子435、黄色纳米粒子437和品红纳米粒子439。抗体缀合的纳米粒子435、437和439中的每一种因此将分别结合于DNA靶标405、407和409的FITC 441、DIG 443或DNP 445。
图4B示出了根据本文公开的一个实施方案对所有32种可能的靶标组合的多重检测。靶标分析物的存在由信号的位置和颜色两者来报告。多种原色NP的共同定位产生独特的复色。例如，带411处的黄色意指HCG的存在，带413处的品红意指DNP-标记的DNA的存在，且带411处由黄色和青色的共同定位产生的绿色意指HCG和AFP两者的存在。最终的结果由组合代码报告，所述组合代码例如，两字母代码，其中第一个字母表示带411处的颜色信号，第二个字母表示带413处的颜色信号。在图中，用来标注每种颜色信号的单字母代码如下：C–青色、M–品红、Y–黄色、B–蓝色、G–绿色、R–红色以及K–key(黑色)和N–没有可见的/可检测到的颜色(nil)。
图5图示了根据本文公开的一个实施方案利用两参数多重策略用于HSV分型的多重LFA。
图5A是根据本文公开的一个实施方案的多重HSV分型的示意性图示500。通过在环介导等温扩增(LAMP)方法中利用标记的引物，将分别对应于HSV-1病毒DNA、HSV-2病毒DNA和HSV-3病毒DNA的靶标分析物501、503和505中的每一种用配体生物素(未显示)和分别的半抗原DPN 541、FITC 543和DIG 545进行双重标记。包含DNA 507的对照样品也接受利用德克萨斯红547形式的半抗原和TAMRA 549形式的另一个半抗原通过在相同的LAMP方法中使用标记的引物进行双重标记。抗-FITC形式的检测剂511和519各自分别偶联于黄色纳米粒子523和531。黄色纳米粒子523因此能够偶联FITC-标记的HSV-2病毒DNA 503。抗-DIG形式的检测剂513和517各自分别偶联于青色纳米粒子525和529。青色纳米粒子525因此能够偶联于DIG-标记的HSV-3病毒DNA 505。抗-DPN 509形式的检测剂和抗-TAMRA 515形式的另一检测剂各自分别偶联于品红纳米粒子521和527。品红纳米粒子521因此能够偶联于DPN-标记的HSV-1病毒DNA 501。品红纳米粒子527因此能够偶联于TAMRA-标记的对照DNA 507。作为配体生物素的受体的链霉抗生物素蛋白533形式的俘获剂被固定在基底上测试带539处以俘获所有三个生物素/标记的靶标分析物501、503和505以及它们的扩增子。抗-德克萨斯红535形式的另一俘获剂被固定在对照带551处以俘获德克萨斯红-标记的对照DNA 507及其扩增子。山羊抗-兔形式的另一俘获剂537也固定在对照带551处以俘获过量的有色的报告粒子。在对照带551处检测到品红色表示成功地扩增了对照DNA，并且因此也表示成功地扩增了靶标分析物。在对照带551处山羊抗兔形式的俘获剂537将结合过量的有色报告粒子529和531。有效的对照是当对照带551处的颜色为包括品红的任一复色时，换句话说，除黄色、青色、品红和绿色之外的颜色。测试带539处的颜色揭示了哪种靶标存在于样品中。例如，如果样品包含HSV-2病毒DNA，则测试带539处的颜色为青色。如果样品包含HSV-1和HSV-3两者，则测试带539处的颜色为红色。如果样品包含所有三种病毒亚型，则测试带处的颜色为黑色。使用所述方法的实施方案，成功地鉴定了三种病毒亚型中的任一种及其任意组合。
图5B示出了根据本文公开的一个实施方案对包括阴性样品的所有8种靶标组合的多重检测。测试带539的颜色指示存在于样品中的病毒DNA的类型。最终结果通过指示测试带539处的颜色信号的代码来报告，例如，单字母代码。在图中，用来标注每种颜色信号的单字母代码如下：C–青色、M–品红、Y–黄色、B–蓝色、G–绿色、R–红色和K–key(黑色)和N–没有可见的/检测到的颜色(nil)。
图6是根据本文公开的一个实施方案制备多种颜色的Au/Ag NP(即Au NP(品红溶液)、Au@Ag NP(黄色溶液)和Au中空NP(青色溶液))的示意性图示600。简言之，典型的合成开始于制备Au种子粒子601。向Au种子粒子601添加HAuCl4形式的试剂609导致形成品红AuNP 603。向Au种子粒子601添加AgNO3形式的试剂611导致形成黄色Au@Ag NP 605。进一步向黄色Au@Ag NP 605逐滴添加HAuCl4形式的试剂613导致形成青色Au/Ag中空NP 607。
实施例
通过下面的实施例、表格以及适用时结合附图，本公开的示例性实施方案将更好地被本领域普通技术人员理解并对于本领域普通技术人员来说容易是显而易见的。示例性实施方案不一定是互斥的，因为一些实施方案可以与一个或多个实施方案组合以形成新的示例性实施方案。
在本文提供的实施例中，发明人证明了基于测试带的空间分隔和测试样点的颜色的用于基于纸或膜的诊断平台诸如LFA的两参数多重策略。在这些实施例中，本文公开的平台基于测试带的定位以及信号读出的颜色来区分靶标。视觉上可区分的颜色的Au/Ag NP通过简单地改变它们的组成和形态来进行微调，其被采用作为报告子。不同组合的靶标将在每个位置处展示具有特有的颜色的独特位置的信号。与单参数多重策略相比，本文使用的实施例中的两参数多重策略需要较少的测试带和较少的粒子类型来实现高度的多重检测，这极大地提高了LFA的多重检测能力和应用性。
具有可调整的颜色的报告NP
Au/Ag NP系统被选择作为报告NP。此系统的一个最有用的特征是源自局域表面等离子体共振(LSPR)的特有的和高度可调的光学特性。对NP的形态和组成的严密控制允许对LSPR峰在可见光谱的宽范围内进行微调。这样杰出的调整能力赋予了Au/Ag NP系统在比色感测和标记应用中的极大前途。
在此实施例中采用具有特有的等离子体吸收的0-D Au、Au@Ag和中空Au/Ag NP。选择0-D NP代替1-D纳米棒和2-D纳米板，其原因是出于其对称的形状。这样的对称性导致单一的等离子体吸收，这可以有益于测定设计中的唯一的共同定位特征。
使用种子介导的生长法合成Au NP和Au@Ag NP。Au NP表现出截角八面体形状，吸收峰在～563nm(图1A)。Au@Ag NP则采取截角立方体形状，吸收峰在～407nm(图1B)。用HAuCl4溶液对Au@Ag NP进行电化学置换允许直接调整纳米结构的跨越可见光谱的LSPR峰。
图2A示出了通过使Au@Ag NP与不同体积的HAuCl4溶液(20mM)反应制备的几瓶Au/Ag NP溶液。溶液的颜色在视觉上是可区分的。相应的吸收光谱(图2B)表明，利用HAuCl4溶液体积可在453至620nm调整Au/Ag NP的LSPR峰位置。电化学置换反应还导致从实心立方体到中空结构的形态改变(图1C)。
NP调色板
发明人选择了三种减色法原色的NP用于后续试验。黄色(Y)NP、品红(M)NP和青色(C)NP中每一种的吸收分别以407nm、563nm、617nm为中心。三种原色的选择性组合提供了具有在视觉上可区分的复色的全部调色板(图3A)。通过混合品红和青色NP，获得蓝色(B)(由于粒子的聚集，其在LFA测试条上看上去略带紫色)。混合黄色和青色NP得到绿色。黄色和品红NP的混合物得到红色(R)。所有三种原色的组合得到黑色(K)。上述颜色是独特的，可以很容易通过肉眼区分。通过以不同比率混合三种原色NP，发明人能够获得颜色的全部光谱(图3B)。
作为概念验证，发明人用具有全部7种前述的颜色(C、M、Y、B、G、R和K)的原色NP和复色的NP混合物标记了抗-异硫氰酸荧光素(FITC)抗体。测试条在测试带处固定了链霉抗生物素蛋白。靶标DNA一端用生物素，另一端用FITC进行双重标记。当靶标流过测试条时，双链DNA(dsDNA)分子将通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用积聚在测试带处。抗体缀合的NP在测试带处通过dsDNA靶标与FITC结合并呈现各种颜色(图3C)。
检测剂抗体可以与单一类型的NP缀合，在这种情况下测试带将展现一种原色。可选地，检测剂抗体可以与NP混合物缀合，由此不同类型的NP将共同定位在测试带处并展现复色。这些颜色在测试条上都是视觉上可区分的。
用于LFA的空间-颜色两参数多重检测
不像常规的单参数多重检测，发明人的策略使用了两种参数的组合来实现高度的多重检测。发明人采用的用于多重检测LFA的两个参数是空间和颜色。发明人利用三个颜色的NP在条上的两个不同位置处分析了5种靶标。首先，两个测试带沿着流路空间分开(图4A)。两个基于蛋白的靶标(甲胎蛋白(AFP)和人绒毛膜促性腺激素(HCG))在带A处检测，三个基于DNA的靶标在带B处检测。对于每种蛋白靶标，使用与蛋白的不同表位结合的一对抗体进行检测。抗体之一固定在测试条上作为俘获抗体，另一种抗体与报告NP缀合。对于每种DNA靶标，DNA的一端标记以生物素，另一端标记以半抗原分子(FITC,洋地黄毒苷(DIG)或二硝基苯酚(DNP))。链霉抗生物素蛋白用作被固定在测试条上的共用俘获剂。用于每种靶标的检测剂抗体与三种原色NP中之一缀合。抗-HCG缀合于黄色NP；抗-AFP缀合于青色NP；抗-FITC缀合于黄色NP；抗-DIG缀合于青色NP；抗-DNP缀合于品红NP。将所有5种NP-缀合的抗体混合。当混合物流过测试条时，如果样品中存在对应的靶标，则每种类型的NP将积聚在测试带处。在缺少对应的靶标的情况下，NP将向下游流动，不会在测试带处留下任何痕迹。
靶标的存在由信号的位置和颜色来报告(图4B和C)。基于信号的颜色和位置可以区分32种可能的靶标组合中的任一种(具有25种组合的5种靶标)。带A处的黄色意味着HCG的存在，带B处的品红表示存在DNP标记的DNA。如果在样品中存在多于一种蛋白靶标或DNA靶标，则不同的原色NP将共同定位在一个测试带处，产生特有的复色。每种颜色表示独特的靶标组合。例如，FITC-标记的和DNP-标记的DNA靶标的存在将在带B处产生红色斑点，HCG-标记的和AFP-标记的蛋白靶标的存在将在带A处产生绿色斑点。最终的结果由两字母颜色代码来报告，在两字母颜色代码中，第一个字母和第二个字母分别表示带A和带B处的颜色信号(图4B)。例如，CB被翻译为AFP+、HCG-、FITC-、DIG+和DNP+。GK表示存在所有5种靶标。NR(N为Nil)提示不存在任一种蛋白靶标，且仅存在FITC和DNP-标记dsDNA靶标。使用两参数多重策略，发明人成功地分析了所有32种可能的靶标组合(图4B)。
本申请公开的平台的独特特征是两参数策略，发明人采用该策略来促进高度的多重检测。一个参数是空间分开。靶标被分组并在测试条上空间分开。信号的位置指示靶标属于哪一组。另一参数依赖于颜色。当不同的原色NP共同定位在同一测试带处时，其将产生特有的复色，所述复色包含靶标信息。所述两参数多重检测相对于单参数方式具有显著的优势。假定对于每个参数有相同的输入数目N，单参数多重检测仅可以检测具有数目为2N种不同组合的N种靶标。在两参数多重检测中，用于每个参数的N个输入允许检测具有数目为22N种不同组合的2N种靶标。因此，两参数策略相当大地提高了多重检测能力。两参数策略也可以减少所需输入的数目，但仍然实现相同程度的多重检测。
例如采用图4中的试验来检测5种靶标，传统的单参数多重检测平台需要5个单独的测试带。在制造的情况下，大多数液体打印设备具有有限数目的打印头，这意味着5个测试带不得不被多轮打印。在每轮中，打印头需要被清洗且抗体溶液不得不被重新加载，这将导致试剂浪费和显著的时间延迟。相比而言，两参数策略将仅需要两个测试带，这可以容易地在单轮中进行打印。这将极大地减少成本和制造周期。在基于颜色的单参数多重检测中，由于光谱的重叠难以超出3种靶标。NP共同定位将导致颜色与基色难以区分。例如，如果除了三种原色以外使用绿色粒子来检测第四种靶标，青色和绿色的共同定位将得到暗绿色，很难想象通过肉眼区分它。
单纯疱疹病毒的多重分型
单纯疱疹病毒是一个DNA病毒大家族，其导致人体多种类型的疾病。广泛传播的单纯疱疹病毒中的一些包括单纯疱疹病毒-1(HSV-1)和HSV-2(它们导致口和生殖器疱疹)，以及水痘带状疱疹病毒(也已知为HSV-3，其导致水痘和带状疱疹)。在此实施例中，发明人应用了两参数多重策略通过使用环介导等温扩增(LAMP)扩增病毒DNA并使用多重LFA检测LAMP扩增子来检测前述的三种单纯疱疹病毒。三个靶标特异性LAMP引物组和一个内对照引物组用于每个反应中(下表1)。
表1.引物序列
Figure BDA0002092764440000341
每个引物组包含6条引物。在HSV-1、HSV-2和HSV-3引物组中，FIP引物标记以生物素，LF引物分别标记以FITC、DIG和DPN。在内对照引物组中，FIP引物标记以德克萨斯红，LF引物标记以5-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)。抗-FITC、抗-DIG抗体分别标记以黄色和青色NP，抗-DPN和抗-TAMRA抗体标记以品红NP。链霉抗生物素蛋白被固定在测试带处以俘获所有三种靶标扩增子。抗-德克萨斯红抗体被固定在对照带处以俘获内对照扩增子。山羊-抗-兔抗体也固定在对照带处以俘获过量的抗-FITC黄色NP和抗-DIG青色NP(图5A)。
在靶标的存在下，病毒DNA被扩增至可检测水平，并且每个扩增子用生物素和半抗原分子双重标记。当扩增子流过LFA测试条时，其通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用被俘获在测试带处。抗体缀合的NP将识别所述半抗原并用相应的NP标记(tag)该扩增子以揭示其身份(图5A)。内对照确保成功的LAMP反应。内对照扩增子将被对照带处的品红NP标记。对照带处的山羊-抗-兔抗体将结合过量的黄色和青色NP。最后，测试斑点的颜色揭示了哪种靶标存在于样品中(图5B)。例如，如果样品含有HSV-2，则测试斑点的颜色为青色。如果样品含有HSV-1和HSV-3两者，则测试斑点的颜色为红色。如果样品含有所有三种类型的病毒，则斑点呈现黑色。
发明人成功地使用此方法鉴定了样品中的所有三种病毒及其组合。理想地，对照斑点的颜色应当是黑色。然而，由于事实是不同量的青色和黄色NP会在测试斑点处被消耗，因此三种原色NP可能在对照斑点处以不同的比率存在。因此，只要对照斑点包含至少两种原色且其中之一是品红，则其被认为是有效的对照。换句话说，有效的对照斑点可以是除黄色、青色、品红或绿色以外的任意颜色。
总之，发明人基于测试带的空间分隔和测试斑点的颜色开发了一种用于基于纸或膜的诊断平台(诸如LFA)的两参数多重检测策略。首先，不同组的靶标被分隔到LFA测试条上的不同测试带。另外，发明人选择了三种原色的形态和组成受控的Au/Ag NP作为报告粒子。当与抗体缀合时，每种类型的原色NP将通过其颜色报告对应靶标的存在。原色NP的共同定位将产生复色的阵列，其指示各种靶标组合。与传统的单参数多重检测相比，两参数策略将极大地提高LFA的多重检测能力。使用所述两参数多重策略，发明人成功地使用LFA区分了两种蛋白靶标和三种DNA靶标的所有可能组合。发明人还成功地通过组合LAMP和LFA进行了对三种单纯疱疹病毒的多重分型。
Au/Ag NP的合成
具有三种原色的NP的总体合成路线图示在图6中。
典型的合成以制备用于合成Au NP和Au@Ag核-壳NP的Au种子NP开始。种子介导的生长法提供了对金属纳米结构的尺寸和形状的更好控制。在种子介导的生长法中采用具有相对大尺寸的单晶种子避免了NP在生长阶段期间的结构波动，并导致仅形成单晶NP。
Au种子NP的合成基于利用NaBH4-还原的Au种子的种子介导的生长。对于NaBH4-还原的Au种子的制备，首先通过持续搅拌将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)在30℃溶解来制备7mL 75mM CTAB溶液。将87.5μL 20mM HAuCl4溶液加入至CTAB溶液。然后将0.6mL冰冷的NaBH4溶液(10mM)在强力混合下快速地注入到混合物中以形成褐色的种子溶液。在30℃轻轻地继续搅拌2-5h以分解过量的NaBH4。生长溶液如下制备：将90μL 20mM HAuCl4溶液和1.392mL 38.8mM抗坏血酸(以所述的次序)添加至在清洁试管中的处于30℃的43mL 16.7mMCTAB溶液，每次添加后充分混合。将0.54mL NaBH4-还原的种子溶液加入至生长溶液并充分混合。使混合物在30℃静置过夜。
对于Au NP(品红溶液)的制备，将0.36mL的Au种子NP溶液添加至45mL的含有16mMCTAB、0.04mM HAuCl4和1.2mM抗坏血酸的生长混合物。将混合物充分搅拌并使其静置过夜。溶液的颜色改变成品红，指示形成Au NP。Au NP采取了在尺寸和形状方面均具有良好的单分散性的截角八面体形态(图1A)。在TEM图像中在转角中具有轻微截短的菱形透射是在<110>方向上观察的NP。
对于Au@Ag核-壳NP(黄色溶液)的制备，将4.64mL 38.8mM抗坏血酸、180μL 1MNaOH和1.8mL Au种子溶液以所述的次序添加到38mL 18.9mM CTAB溶液，接着添加0.45mL20mM AgNO3。充分混合混合物，并使其在恒温震荡仪中在40℃过夜。溶液的颜色改变为黄色，指示形成了Ag壳。Au@Ag NP采取了截角立方体形态(图1B)。Au核心可以清楚地从TEM图像中利用较暗的对比度观察到。
对于Au/Ag中空NP(青色溶液)的制备,在恒温震荡仪上将157.4μL 20mM HAuCl4水溶液逐滴加入至45mL已合成的Au@Ag核-壳NP溶液。Ag壳将根据3Ag+AuCl4 -→Au+3Ag++4Cl-被HAuCl4氧化，因为AuCl4 -/Au(1.002V相对于标准氢电极(SHE))的标准还原电势的正性比Ag+/Ag(0.7996V相对于SHE)更高。当内部的Ag被氧化以产生中空的结构时，得到的Au原子将沉积在Ag壳模板上并展现其形态。根据反应化学计量，随着沉积一个Au原子，从Ag壳移除三个Ag原子。Au的量将为Ag的33.3at％从而完全地替换整个Ag壳，并随后产生中空的Au/Ag纳米结构。中空的内部在TEM图像中清晰可见(图1C)。随着逐滴添加HAuCl4溶液，溶液逐渐从黄色改变成橙色，改变成红褐色，并最终改变成青色。随着将13.5、27、40.5、54、67.5、81、94.5、108、121、135、146.2和157.4μL 20mM HAuCl4添加到45mL已合成的Au@Ag核-壳NP溶液，获得了0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.3、0.325和0.35的HAuCl4/Ag比率。得到的溶液和相应的紫外可见光谱显示在图2A和2B中。
材料表征
NP的结构在以200kV加速电压操作的FEI Tecnai F20电子显微镜上通过透射电子显微镜法(TEM)进行分析。使用场发射扫描电子显微镜法(FESEM)(JEOL JSM-7400F)来检查大体产品形态。TEM样品通过如下步骤制备：将一滴经洗涤的产品分配在铜载网上，接着在室温下在空气中干燥。由岛津(Shimadzu)UV-vis-NIR分光光度计UV-3600记录光吸收谱。
抗体与Au/Ag NP的缀合
在此研究中选择三种减色法原色(青色、品红和黄色)的NP用于多重检测。在合成后，通过以8,000g离心10min洗涤NP。然后弃去上清液，并将NP重新悬浮在5mM磷酸盐缓冲液(pH＝5.5)中。下一步，在相同的条件下使NP接受另一轮洗涤。最后，将黄色NP、品红NP和青色NP分别以20、10和10的光密度(OD)重新悬浮在5mM磷酸盐缓冲液(pH＝5.5)中。
检测剂抗体通过被动吸附与NP缀合。进行滴定以评估标记需要的蛋白量。通过观察聚集度来确定蛋白的最适量。理想地，蛋白不应导致NP聚集和改变颜色。确定5μg、2.5μg和0.5μg将分别用来缀合1000OD·μL的青色、品红和黄色NP。
为了使抗体与NP缀合，将所需量的抗体(10μg用于青色NP，5μg用于品红NP，以及2.5μg用于黄色NP)在5mM磷酸盐缓冲液(pH＝5.5)中稀释至200μL。将储存浓度(OD＝10用于青色NP，OD＝10用于品红NP，以及OD＝20用于黄色NP)的200μL NP与稀释的抗体混合，并在室温孵育～6h。孵育后，将200μL 10mM CTAB添加到混合物中并孵育10min。下一步，表面上吸附有抗体的NP通过以2000g离心15min进行冲洗。弃去上清液，粒子重新悬浮于200μL 5mM磷酸盐缓冲液(pH＝5.5)中。
对于图3中图示的LFA试验，所有NP缀合于抗-FITC(Abcam,Cambridge,英国)。对于图4和图5中图示的LFA试验中，抗-FITC和抗-HCG(Arista Biologicals,Pennsylvania,USA)缀合于黄色NP。抗-DIG(Fitzgerald,Massachusetts,USA)和抗-AFP(Thermo Pierce,Illinois,USA)缀合于青色NP。抗-DNP(LifeSpan Biosciences,Washington,USA)缀合于品红NP。对于图5中图示的试验，抗-TAMRA缀合于品红NP。
LFA测试条的制备
对于图3中图示的LFA试验，利用200mM磷酸盐缓冲液(pH＝8)将链霉抗生物素蛋白(Promega,Wisconsin,USA)稀释至1mg/mL，并将1μL经稀释的链霉抗生物素蛋白分配到HF135硝基纤维素测试条(Merck Millipore,Massachusetts,USA)上。对于图4中图示的LFA试验，将1μL相同条件的链霉抗生物素蛋白分配到测试带B上。将HCG(Arista Biologicals,Pennsylvania,USA)和AFP(Arista Biologicals,Pennsylvania,USA)的俘获抗体混合并各自在200mM磷酸盐缓冲液(pH＝8)中稀释到0.5mg/mL。将1μL抗体混合物分配到测试带A上。分配后，将测试条在真空下干燥30min。然后用市售的封闭溶液(Candor Bioscience,Wangen,德国)将它们封闭另外30min。随后，用5mM磷酸盐缓冲液(pH＝7-7.5)洗涤测试条1h。最后，在使用前测试条在真空下干燥3h。
对于HSV分型，用200mM磷酸盐缓冲液(pH＝8)将链霉抗生物素蛋白(Promega,Wisconsin,USA)稀释到1mg/mL，并将1μL经稀释的链霉抗生物素蛋白分配到测试条(HF135,Merck Millipore,Massachusetts,USA)的测试带上。将抗-德克萨斯红和山羊-抗-兔混合并各自在200mM磷酸盐缓冲液(pH＝8)中稀释到0.5mg/mL。将1μL抗体混合物分配到对照带上。其余的程序与上面所述相同。
样品和测定条件
对于图3中所图示的LFA试验，仅使用一种类型的dsDNA。任意的76-bp DNA寡核苷酸T20(Integrated DNA technology,Iowa,USA)在其5’末端处标记以生物素。其互补链(Integrated DNA technology,Iowa,USA)在其5’末端处标记以荧光素。两条链以等摩尔比例在1×tris缓冲盐水(1×TBS,First base technology,新加坡)中混合。将混合物在95℃加热10min，然后使其冷却至室温。为制备样品，将杂交的dsDNA用1×TBS稀释到1μM。将5μL生物素-FITC dsDNA靶标添加到50μL补充了5％牛血清白蛋白(BSA)的1×磷酸盐缓冲盐水(1×PBS,First base technology,新加坡)中。然后将样品施加到测试条。将NP缀合物添加到50μL补充了5％BSA的1×PBS，并在样品已经流过后施加到测试条。对于三种原色，在各个反应中使用青色NP(2.5μL)、品红NP(5μL)和黄色NP(10μL)。对于复色，将上面提到的相同体积的不同NP在补充了5％BSA的1×PBS中混合，并施加到测试条。最后，测试条用50μL补充了5％BSA的1×PBS的洗涤。
对于图4中图示的LFA试验，使用总计5种靶标。重组的HCG(Arista Biologicals,Pennsylvania,USA)和AFP(Arista Biologicals,Pennsylvania,USA)抗原购自商业来源。使用相同的76-bp DNA寡核苷酸T20。三条互补链分别标记以FITC、DIG和DNP。通过将生物素化的T20与三种标记的互补寡核苷酸杂交来制备三种dsDNA靶标。得到的dsDNA靶标分别用生物素-FITC、生物素-DIG和生物素-DNP双重标记。为了制备样品，将5μL 10μg/mL的HCG抗原、5μL 10μg/mL的AFP抗原和2μL 1μM的每种dsDNA靶标添加至50μL补充了5％BSA的1×PBS。每种样品可以含有或可以不含有所有靶标。将样品首先施加至测试条，并使其流过。通过将5种NP-缀合的检测剂抗体(2.5μL青色抗-DIG、2.5μL青色抗-AFP、5μL品红抗-DNP、10μL黄色抗-FITC和10μL黄色抗-HCG)与25μL补充了10％BSA的1×PBS混合来制备检测剂混合物。在样品已经流过后将报告NP的混合物施加到测试条。最后，测试条用50μL补充了5％BSA的1×PBS洗涤。
HSV分型
所有三种类型的病毒DNA获自美国典型培养物保藏所(American Type CultureCollection(ATCC),Virginia,USA)。所有引物订购自Integrated DNA Technology(IDTDNA,Iowa,USA)。三个靶标特异性引物组获自Kaneko等人41且内对照引物组使用PrimerExplorer软件(https://primerexplorer.jp/e/)自己设计而成。LAMP配方显示在下表2中。LAMP试剂购自New England Biolab(NEB,Massachusetts,USA)。反应在65℃进行1h。在扩增后，将3μL扩增子加入至50μL补充了5％BSA的1×PBS中，并施加至测试条。在样品流到测试条后，将在25μL补充10％BSA的1×PBS中含有2.5μL青色抗-DIG、5μL品红抗-DNP、5μL黄色抗-FITC和5μL品红抗-TAMRA的检测剂混合物施加到测试条。最后，测试条用50μL补充了5％BSA的1×PBS洗涤。
表2.LAMP配方
Figure BDA0002092764440000411
应用性
基于纸或膜的诊断平台诸如LFA是广泛用于医疗点诊断法中的充分确立的平台。本文已经公开了用于在诊断平台诸如LFA上进行多重检测的新策略。除了空间分隔以外，本文公开的方法的实施方案采用形态和组成受控的三种原色的Au/Ag纳米粒子来加入另一参数用于多重检测。原色粒子的共同定位可以产生复色的阵列作为各种靶标组合的指示。这种两参数多重策略显著地提高了LFA的多重检测能力，并且将LFA的应用性延伸到更复杂的分析。在提供的实施例中，使用所提议的两参数多重LFA，发明人成功地鉴定了两种蛋白和三种DNA靶标的所有32种组合。发明人还通过利用环介导等温扩增来扩增病毒DNA，并使用两参数多重LFA来检测扩增子，从而成功地鉴定了三种单纯疱疹病毒亚型。
本文公开的方法和相关试剂盒的实施方案提供了检测样品中不同的靶标分析物的高度多重检测策略，其不仅是灵敏和特异性的，而且相对地不需要设备、容易实施、低成本和有效，使得它们成为合适的医疗点诊断法或家庭诊断法。
本领域技术人员要理解的是，在不背离如广义描述的本公开的精神或范围的前提下，可以对具体的实施方案作出其他改变和/或改进。因此，本发明的实施方案应被认为在所有方面都是说明性的且不是限制性的。
序列表
<110> Agency for Science, Technology and Research
<120> 检测不同的靶标分析物的存在的方法及其相关的试剂盒
<130> 1702371
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 1
ccagacgttc cgttggtagg tcactttgac tattcgcgca cc 42
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 2
ccatcatcgc cacgtcggac tcggcgtctg ctttttgtg 39
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 3
cagccacaca cctgtgaa 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 4
tccgtcgagg catcgttag 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 5
aaatcctgtc gccctacaca gcgg 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 6
caccccgcga cgggacgccg 20
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 7
ccctggtacg tgacgtgtac gagtatggag ggtgtcgcg 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 8
aaatgcttcc ctgctggtgc ccgccgagtt cgatctggt 39
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 9
tcagcccatc ctccttcg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 10
gcccacctct acccacaa 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 11
cacgtctttg gggacggcgg ct 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 12
atctgggacc gcgccgcgga gacat 25
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 13
ctcccactgg tacgtcaagt ggagggtcaa aaaccctggc 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 14
ttcctcaaca tccccgacat cgtacccgat gggggatacc 40
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 15
ccaatacgac caccggatc 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 16
tggcttcgtc tcgaggattt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 17
cgaaatgtag gatataaagg 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 18
catccttata ttcaaaagta gct 23
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 19
cgacgaccct tctttttcct caagccaaac ctaaaaccag c 41
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 20
tctcgataaa gtctctacag agaccttttt ccagatcttc acgc 44
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 21
gtgaagcaaa acgtagcg 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 22
ctgactacgt agacgctc 18
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 23
agcggctgct cgccttt 17
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸序列
<400> 24
accgttgata ttacttgtgc cgaag 25

Claims (22)

1.一种检测样品中不同靶标分析物的存在的方法，所述方法包括下述步骤：
向基底提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子，所述基底具有α个分配的空间区域；以及
确定在所述基底上的每个分配的空间区域中由报告粒子产生的颜色的存在，
其中所述基底上每个所述分配的空间区域被构造成固定与其他分配的空间区域不同的靶标分析物，
其中每种不同颜色的报告粒子被构造成与不同的靶标分析物偶联，并且
其中α是至少为2的整数且ω是至少为3的整数，
其中所述报告粒子被构造成当两种或更多种不同颜色的报告粒子被共同定位在同一个空间区域中时产生复色，其中由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子的共同定位产生的所述复色与由来自ω种不同颜色的其他颜色组合的报告粒子的共同定位产生的另一复色截然不同，
其中在分配的空间区域中存在由报告粒子的共同定位所产生的复色指示所述样品中至少两种不同的靶标分析物的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中ω是3。
3.根据权利要求1所述的方法，其中ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为550nm至570nm的颜色、吸收波长为400nm至420nm的颜色和吸收波长为610nm至630nm的颜色。
4.根据权利要求1所述的方法，其中ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：黄色、品红和青色,并且当与其他的ω种不同颜色中的一种或多种组合时被构造成产生选自下列的复色：蓝色、绿色、红色和黑色。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包含多核苷酸，并且所述方法进一步包括：在向基底提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子的步骤之前，使所述样品进行扩增反应，所述扩增反应被构造成扩增所述多核苷酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包含多核苷酸，并且所述方法进一步包括使所述样品与标记的寡核苷酸接触，其中所述标记的寡核苷酸用于与所述多核苷酸或其扩增子的至少一部分杂交，所述标记的寡核苷酸被构造成与ω种不同颜色中的至少一种的报告粒子偶联。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述寡核苷酸包括引物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中向基底提供所述样品和具有ω种不同颜色的多种报告粒子的步骤包括首先向所述基底提供所述样品且随后向所述基底提供所述具有ω种不同颜色的多种报告粒子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中ω种不同颜色中的每一种的报告粒子具有单一局域表面等离子体共振(LSPR)吸收峰。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告粒子包括选自由下述各项组成的组中的一种或多种：固体金纳米粒子、具有金核的固体银纳米粒子和中空的金纳米壳。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法进一步包括下述步骤：
基于所述空间区域的颜色对每个空间区域分配代码；和
将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码，其中所述组合代码用来确定所述样品中不同的靶标分析物的存在。
12.根据权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括下述步骤：
将所述组合代码与预先确定的代码的清单比较以确定所述样品中不同的靶标分析物的存在。
13.一种用于检测样品中的不同靶标分析物的试剂盒，所述试剂盒包含：
基底，所述基底包括α个分配的空间区域，每个空间区域被构造成固定与其他分配的空间区域不同的靶标分析物；和
具有ω种不同颜色的多种报告粒子或其前体，其中每种不同颜色的报告粒子被构造成与不同的靶标分析物偶联，
其中α是至少为2的整数且ω是至少为3的整数，
其中所述报告粒子被构造成当两种或更多种不同颜色的报告粒子被共同定位在同一个空间区域中时产生复色，其中由来自ω种不同颜色的两种或更多种不同颜色的报告粒子的共同定位产生的所述复色与由来自ω种不同颜色的其他颜色组合的报告粒子的共同定位产生的另一复色截然不同，并且
其中所述报告粒子的前体能够合成所述报告粒子。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中ω是3。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：吸收波长为550nm至570nm的颜色、吸收波长为400nm至420nm的颜色和吸收波长为610nm至630nm的颜色。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，其中ω种不同颜色中的每一种是选自由下列各项组成的组的颜色：黄色、品红和青色,并且当与其他ω种不同颜色中的一种或多种组合时被构造成产生选自下列的复色：蓝色、绿色、红色和黑色。
17.根据权利要求13所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于与所述靶标分析物的多核苷酸的至少一部分杂交的寡核苷酸。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸包括标记的寡核苷酸，所述标记的寡核苷酸被构造成与ω种不同颜色中的至少一种的报告粒子偶联。
19.根据权利要求13所述的试剂盒，其中ω种不同颜色中的每一种的报告粒子具有单一局域表面等离子体共振(LSPR)吸收峰。
20.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述报告粒子包括选自由下述各项组成的组中的一种或多种：固体金纳米粒子、具有金核的固体银纳米粒子和中空的金纳米壳。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含：
关于下列的说明书：基于所述空间区域的颜色对选自α个空间区域的每个空间区域分配代码，并将分配给每个空间区域的代码组合以获得组合代码，所述组合代码用来确定所述样品中不同的靶标分析物的存在。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含：
预先确定的代码的清单，所述预先确定的代码用于与所述组合代码比较以确定所述样品中不同的靶标分析物的存在。
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