KR100694929B1 - 핵산을 함유하는 생물학적 시료에 잠재적으로 존재하는기능을 분리하고 특성화는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 a) 핵산을 함유하는 생물학적 시료로부터 핵산 프레그먼트를 준비하는 단계, b) 각각의 상기 프레그먼트를 벡터 분자에 결합시키는 단계, c) 벡터 분자에 결합된 각각의 프레그먼트 또는, 벡터 분자에 결합된 프레그먼트로 이루어진 각각의 구성체의 일부분을 분리하는 단계, d) 단계 c)에서 분리한 벡터 분자에 결합된 각각의 프레그먼트 또는, 벡터 분자에 결합된 프레그먼트로 이루어진 각각의 구성체의 일부분을 시험관내 처리하여 전사물을 얻는 단계, e) 단계 d)에서 얻은 전사물 또는, 상기 전사물을 번역한 후 암호화하는 단백질의 기능을 테스트하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산을 포함하는 생물학적 시료 중에 존재하는 잠재적 기능을 분리 및 특성화하는 방법에 관한 것이다.
핵산, 단백질, 생물학적 시료, 특성화 방법, 자동화 장치
Description
본 발명은 핵산을 함유하는 생물학적 시료에 잠재적으로 존재하는 기능을 분리하고, DNA 프레그먼트(fragment)의 전사 및 번역후 시험관내 단백질 발현에 의해 상기의 기능을 특성화할 수 있는 방법을 그 목적으로 한다. 본 발명의 방법에 의한 기능의 특성화는 특히, 이러한 기능의 생화학적 분석에 의해 그리고 해당 시료내에 임의로 존재하는 기능 각각에 해당하는 폴리뉴클레오티드 서열의 클로닝 또는 서열화에 의해 수행될 수 있다.
마찬가지로, 본 발명에 의한 방법은 특히 측정되거나 또는 측정 가능한 기능을 보유하는 암호화된 유전자 또는 단백질의 식별 및 분리가 가능하다.
신규한 유전자 및/또는 단백질을 암호화하기 위한 연구는 다수의 분자생물학 실험의 주목적을 이루고 있다. 사실상, 유전적 및 세포 요법 또는 형질전환 동물 및 식물의 생성은 사람 또는 동물의 건강, 진단 및 영양에 대한 새로운 희망을 불러일으키나, 이중에서도 다수의 유전자 및/또는 단백질 활성을 식별하여야만 한다. 마찬가지로, 클로닝 및 발현에 의한 유전자 스크리닝 기법이 다수 존재하기도 한 다.
이러한 기법 중에서 게놈 기법으로 불리우는 것은 생명체의 게놈의 일부 또는 전부를 서열분석한 후, 암호화된 잠재적 서열로 기탁된 뱅크에서 이미 식별된 서열과의 상동 관계를 조사하는 것으로 구성된다. 일단 식별되면, 이러한 서열을 클로닝하고 특정 성질에 대해 효과적으로 암호화되었는지를 입증하기 위해 실험하여야 한다. 이를 수행하는데 필요한 시간 이외에도, 이와 같은 기법은 이미 공지된 것과, 해당 염기내의 표준물과의 상동성 기능을 식별할 수 없는 단점을 갖는다.
단백질기법(proteomique)은 해당 성질을 연구할 수 있는 제2의 접근법이 된다. 이는 실험한 단백질을 미생물에 의해 추출하고 이를 정제하는 것으로 구성된다. 각각의 정제 분획이 특정 성질을 포함하는지의 여부에 대해 검출하도록 테스트한다. 이러한 기법의 주된 단점은 이러한 기법이 검출된 성질과, 이러한 성질을 발현할 수 있는 유전자 사이의 직접적인 연관 관계를 갖지 않는다는 점에 있다. 이러한 접근법의 제2의 단점으로는 출발 미생물에서 유발되지 않은 성질은 검출할 수가 없다는 점이다.
미생물에 의해 표현되는 기능을 검출하기 위한 제3의 기법은 발현 클로닝을 이용하는 것으로 구성된다. 이러한 방법의 주요 원리는 출발 미생물의 DNA를 추출하는 것으로, 프레그먼트화시킨 후, 형질전환체 내의 생체내 발현 벡터(vector) 내에 삽입하는 것으로 이루어진다. 이러한 형질전환체는 출발 미생물의 유전자를 표현하는 능력을 기준으로 선택한다. 마찬가지로, 벡터는 항상 발현 형질전환체와의 혼화성을 기준으로 선택한다. 이러한 발현 클로닝 기법은 현존하는 형질전환체와 유사한 유전적 성질을 갖는 미생물에서의 기능의 조사 범위내에서 사용할 수 있다(동일한 코돈 사용 프로필, 동일한 GC 백분율...). 다양한 유전적 기원을 가진 다수의 미생물로부터의 기능을 규명할 경우, 발현 클로닝 방법은 무익하며, 형질전환체는 이들이 공급되는 이종성 유전자를 더이상 표현할 수가 없다.
또한, 유전자를 분리 및 스크리닝하는 종래의 기타의 방법와 마찬가지로, 발현 클로닝은 하기와 같은 다수의 단점을 갖는다.
- 전사 및 번역 산물이 세포 독성을 지니며, 이와 같은 독성 문제점을 대처하기 위해 유전적 재조합을 야기할 수도 있고,
- 사용된 뱅크의 미약한 표현력,
- 수행 시간,
- 클로닝된 유전자의 서열과 사용된 벡터의 발현 정지(ponctuation) 사이의 미약한 혼화성,
- 매우 다양한 발현도,
- 코돈 사용의 문제점,
- 폴딩, 번역후 변이의 문제점,
- 기원 세포 추출물 중의 단백질 활성을 직접 탐색하는 동안 단백질의 발현도에 대한 세포의 생리학적 상태의 영향에 의해 제기되는 문제점,
- 자동화의 어려움.
본 발명은 핵산을 함유하는 생물학적 시료 중에 포함된 폴리뉴클레오티드 서 열과 관련된 기능 식별의 신속하고 효율적인 방법을 제공하고, 상기의 서열을 분리하여 전술한 단점을 해소하고자 하는 것이다.
이러한 목적은 핵산을 함유하는 생물학적 시료에 존재하는 잠재적인 기능을 분리하고 특성화하는 방법에 의해 달성될 수 있는데, 이러한 방법은
a) 핵산을 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산 프레그먼트(fragment)를 준비하는 단계,
b) 각각의 상기 프레그먼트를 벡터(vector) 분자에 결합시키는 단계,
c) 단계 b)의 벡터 분자에 결합된 각각의 프레그먼트 또는, 벡터 분자에 결합된 프레그먼트로 구성된 각각의 구성체의 일부분을 분리하는 단계,
d) 단계 c)의 벡터 분자에 결합된 각각의 프레그먼트 또는, 벡터 분자에 결합된 프레그먼트로 구성된 각각의 구성체의 일부분을 시험관내(in vitro)에서 처리하여 전사물(transcript)을 얻는 단계,
e) 단계 d)에서 얻은 전사물 또는, 상기 전사물을 번역한 후 암호화(cording)한 단백질의 기능을 테스트하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은
- tRNA, 리보자임의 바람직한 특성이 나타나는 동안, 단계 d) 전사물의 성질 테스트 또는
- 이러한 전사물에 의해 암호화된 단백질의 성질의 테스트를 수행할 수 있는 잇점을 제공한다.
단계 d)에서 얻은 전사물에 의해 암호화된 단백질의 기능을 테스트하는 경우, 본 발명의 방법은 단계 e)에서, 단백질로의 번역이 가능한 세포 추출물로 상기의 시험관내 전사물을 처리한 후, 모든 적절한 방법에 의해 상기 단백질의 기능을 테스트하는 것을 포함한다.
보다 상세하게는, 본 발명의 범위내에서 기능이라는 것은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있는 성질을 의미한다. 이러한 성질은 예를 들면 단백질을 암호화 하고 있는 서열의 경우에는 효소 활성 또는 친화도, 또는 이러한 서열이 암호화 하고 있는 촉매 mRNA의 경우에는 엔도뉴클레아제 활성 등이 있다.
또한, 본 발명의 방법은 기능의 검출 뿐 아니라, 생화학적 관점에서 특성화할 수 있다. 이러한 기능이 예를 들면 효소 활성인 경우, 이는 기능(pH, 온도, 염의 농도)의 최적의 조건, 역학적 변수(Vm, Km), 억제 변수(Ki)의 분석과 관련되어 있다. 기능이 친화도인 경우, Kd의 측정 또는 이러한 단백질의 친화도 이상을 갖는 분자와 관련되어 있다. 또한, 번역된 단백질 또는 전사된 mRNA의 크기 및 필요한 경우 해당 유전자의 서열화와 관련되어 있다.
생물학적 시료라는 것은 졸, 식물, 사람의 혈액, 동물 혈액, 물, 미생물 배양액, 세포 배양액, 바이러스 배양액, 생검 배양액 등의 시료와 같이 핵산을 함유할 소지가 있는 모든 시료를 의미하나, 이러한 시료는 또한 증폭(PCR, NASBA 등), 게놈 DNA, 합성 DNA, mRNA의 산물 또는, 당업자가 통상적으로 사용하는 처리로부터 생성된 핵산 산물 모두에 해당될 수도 있다.
벡터 분자라는 것은 적어도 단계 d)의 전사 프로모터 및 필요할 경우, 단계 c)의 프레그먼트의 분리를 용이하게 하는 물질을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 의미한다. 이러한 물질은 스트렙타비딘 또는 비오틴, 폴리피롤 그룹, 항체의 분자(들), 단일쇄 또는 이본쇄 폴리뉴클레오티드 서열, 결합된 프레그먼트의 생체내의 발현 가능 서열을 선택적으로 포함하지 않는 플라스미드 DNA 벡터 또는, 단계 c)와 관련된 프레그먼트의 분리가 가능한 기타의 모든 화합물이 될 수 있다.
본 발명 방법의 단계 c)에서의 분리라는 것은 단계 b)에서 얻은 프레그먼트의 몫 의 하부조합으로의 하부분류를 의미하는 것으로, 여기서, 하부조합은 핵산 프레그먼트 단독 또는 다수로 구성될 수 있다.
본 발명 방법의 핵산 프레그먼트의 준비 단계 a)는, 세포, 바이러스, 혈액, 유기 성분 등등에 포함된 핵산의 경우와 같이, 핵산이 생물학적 시료 중에서 직접적으로 접근 가능하지 않은 경우 추출상을 포함할 수도 있다. 그리하여 이러한 추출상은 핵산 프레그먼트의 분리 단계 a)에 포함된다. 마찬가지로, 생물학적 시료가 mRNA로 구성되는 경우, RT-PCR 단계는 단계 a)의 핵산 프레그먼트를 생성하는데 필수적이다.
본 발명의 특정한 실시예에 의하면, 벡터 분자는 전사 프로모터 1 이상을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 2 개를 포함한다. 이러한 각각의 서열은 단계 a)에서 얻은 프레그먼트의 말단에 결합되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 벡터 분자에 의해 지지된 전사 프로모터(들)는 파아지 T7, SP6, Qβ 또는 λ의 RNA 중합효소의 전사 프로모터와 같은 강력한 타입(strong type)의 프로모터가 된다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 핵산을 포함하는 시료로부터, 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 해당 단백질을 식별할 수 있다. 상기 과정은
a) 생물학적 시료로부터의 핵산의 프레그먼트를 준비하는 단계,
b) 이러한 각각의 프레그먼트를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 생성하는 단계,
c) 모든 적절한 방법에 의해 각각의 재조합 벡터 또는 이러한 재조합 벡터의 일부를 분리하는 단계,
d) 전사물을 얻기 위해, 단계 c)에서 분리한 재조합 벡터 또는 재조합 벡터의 일부분을 시험관내에서 처리하는 단계,
e) 단계 d)에서 얻은 전사물 또는 전사물의 번역후 상기의 모든 적절한 방법에 의해 암호화된 단백질의 기능을 테스트하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 달성된다.
전술한 본 발명의 방법의 실시예에서 재조합 벡터라는 것은 벡터, 예를 들면 플라스미드 벡터를 의미하는 것으로서, 이는 프레그먼트를 이러한 벡터의 일부분, 단계 a)에서 얻은 프레그먼트를 포함하는 재조합 벡터의 일부분 및 단계 d) 및 필요할 경우 단계 e)의 수행에 필수적인 요소에 의해 도입된다.
본 발명 방법의 단계는 각각의 단계를 통합한 자동화 장치상에서, 동일한 작동유전자에 의해 중단되는 일없이 연속적으로 수행 가능하거나 또는, 필요할 경우 각종의 작동유전자에 의해 불연속적으로 수행될 수 있다,
전사 단계 d) 및 프레그먼트의 단계 e)의 번역상은 EPIV 반응으로 약칭하는 시험관내 단백질 발현 반응과 공동으로 지칭한다. EPIV 반응은 동시에 수행될 수 있으며, 이는 단계 e)의 번역상이 단계 d)의 전사와 함께 동시에 수행되거나 또는 d) 전사 단계 및 e) 번역 단계의 2 개의 별개의 단계로 분해되는 것을 의미한다.
단계 d) 및 단계 e)의 디커플링은 각 단계의 수율을 최적화할 수 있으며, 단 백질을 최대로 생성할 수 있고, 이는 특이성 활성이 약한 효소에서 매우 유용한 것으로 밝혀졌다.
또한, 디커플링은 단계 e)의 산물의 형성을 표준화할 수 있으며, 표현된 각종 기능을 후에 비교할 수 있다.
또한, 단계 d)의 전사와 단계 e)의 번역 사이의 디커플링은 DNA 매트릭스가 PCR에 의해 생성된 경우 DNA 매트릭스가 뉴클레아제에 의해 분해되는 문제점을 배제할 수 있다. 사실상, 전사 반응의 성분은 번역 추출물과는 반대로 뉴클레아제에 의해 덜 오염된다.
디커플링은 스크리닝 처리된 DNA의 기원에 따라 각종 번역 추출물을 사용할 수 있게 된다. 사실상, 단계 e)의 전사물의 번역상은 동일한 기원 또는, 본 발명의 방법을 수행한 생물학적 시료의 세포와 유사한 기원의 번역 추출물을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 그래서, 번역의 최적의 효율을 위한 세포 추출물과 전사물 번역 시그날의 기원 사이의 일치를 최적화하게 된다. 예를 들면, 동일한 생명체 또는 기타의 친극한성 생명체(친고온체, 친할로겐체, 친산성체 등등)의 DNA 뱅크의 스크리닝 또는, 진핵생물 DNA 뱅크의 스크리닝을 위한 진핵생물 세포의 번역 추출물을 위한 친극한성 생명체의 번역 추출물의 용도 등을 들 수 있다. 이러한 각각의 추출물은 기법의 효율을 개선시킬 수 있을 것이다. 이러한 추출물은 단계 e)에서 전사물을 번역하는 용량에 대해 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은 단계 d)의 전사물의 발현의 정지와, 사용된 번역 추출물 사이의 일치를 이용하는 점에서 주목할 만하다. 이러한 추출물은 또한, 규명된 성질을 포함하지 않는다는 점, 규명된 성질을 포함하기는 하나, 규명된 기능을 검출하기 위해 수행한 테스트의 조건하에서 검출되지는 않는 특징을 갖는다. 예를 들면, 친고온성 베타-갈락토시다제의 mRNA의 번역이 가능한 메소필 베타-갈락토시다제 활성을 포함하는 번역 추출물의 사용 및 고온에서의 친고온성 베타-갈락토시다제의 활성의 검출과 관계되어 있는데, 이러한 고온은 메소필 베타-갈락토시다제의 활성을 제거하게 된다.
단계 a)에서 얻은 프레그먼트의 유전적 기원, 예를 들면 그램 양성 미생물, 그램 음성 미생물, 진핵생물, 바이러스 등등의 DNA, 그리고 테스트하는 기능에 따라서, 번역의 각종 추출물을 사용할 수 있게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는, 사실상 복수의 번역 추출물의 혼합물인 번역 추출물을 단계 e)에서 사용하는 것을 포함한다. 예를 들면, 샤페론 B 단백질을 과다발현하는 E. coli.의 번역 추출물과 혼합된 샤페론 A 단백질을 과표현하는 E. coli.의 번역 추출물과 관계되어 있다. 모든 혼합물 유형은 전술한 바와 같은 특성에 해당하는 모멘트를 예상할 수 있다. 마찬가지로, 코돈(들)의 특이성 tRNA(들)을 부가하는 번역 추출물을 사용할 수가 있다. 그리하여 얻은 번역 추출물은 tRNA 억제유전자(들)를 번역 추출물에 부가하면서 앰버 코돈을 포함하는 mRNA의 번역과 같은 특이성 코돈을 포함하는 mRNA를 번역할 수 있다.
또한, 번역 추출물을 사용한 단계 e)의 처리는 예를 들면 앞서 표시한 것(tRNA, 샤페론...)와 같은 해당 분자에 의해서가 아니라, 모든 기타의 보충된 세포 추출물(들) 및/또는 E.
coli
.의 추출물과 같은 시료의 기원이 되는 번역의 통상의 추출물을 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 단계 e)의 번역 추출물에 샤페론, 세정제, 설포베타인, 막 추출물 등과 같은 표현된 단백질의 폴딩 또는 성숙을 더 효율적으로 촉진시키는 물질(들)을 첨가할 수 있다.
단계 e)에서 합성한 단백질의 기능의 테스트는 예를 들면 규명한 효소 활성(들)을 검출할 수 있는 적절한 모든 수단에 의해 수행할 수 있다. 이러한 수행 형태는 친극한성 생명체(들)로부터의 DNA 시료를 출발 물질로 하여 산 배지, 강 염농도의 배지 등등 중에서 고온에서 활성을 띠는 열안정성 효소와 같은 고유한 성질에 대해 효소를 규명할 경우 특히 응용 가능하다. 이러한 친극한성 효소는 주로 이들이 생성되는 균주의 생리적 조건과 유사한 조건(온도, 염도, pH 등)하에서 활성을 띠며, 이러한 조건은 효소가 이의 상동성 메소필로 치환되는 다수의 산업 공정(동물 사육 등의 농업 산업, 제지, 세정제, 직물 분야)에서 중요한 장치에서 형성된다.
본 발명은
- tRNA, 리보자임의 형태의 이로운 성질을 표현하는, 단계 d)의 전사물 특성 테스트 또는
- 상기 전사물에 의해 암호화된 단백질 특성 테스트
를 수행하는 잇점을 제공한다.
예를 들면 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 리보자임의 경우, 한 말단에 형광기를 포함하며, 다른 말단에는 "종결"기를 갖는 뉴클레오티드 매트릭스를 사용하면서 이러한 활성을 검출할 수 있다. 리보자임 매트릭스의 분할의 경우, 형광기는 "종결"기와 분리되며, 이는 1차 형광을 방출하게 된다.
tRNA의 경우, 잠재적인 tRNA를 포함하는 반응 분획을 사용할 수 있으며, 코돈 중의 하나가 규명된 tRNA에 의해 번역될 수 없는 리포터 유전자의 mRNA를 포함하는 시험관내 번역의 반응에서 생성될 수 있다. 리포터의 활성이 검출되는 경우, 이는 tRNA가 초기 분획 중에 존재하며, 리포터의 mRNA의 시험관내 번역이 가능하다는 것을 의미한다.
효소 활성의 증거에 적용되는 범위내에서, 단계 e)에서 규명한 기능의 존재 또는 부재의 증거를 판명하기 위해서는 모든 유형의 특이성 기재가 당업자에 의해 고려될 수 있을 것이다. 규명한 기능(들)에 의한 기질의 총 전환 반응(들)은 당업자에게 공지된 모든 기법(형광법, 비색법, 흡광도, 점도, 등등)에 의해 검출될 수 있다.
친화성의 증거를 판명하기 위해서는, 예를 들면, 규명한 친화성:항체-항원, DNA-DNA 고정된 단백질, 수용체-리간드 등과 관련하여, 방사성 표지된 리간드의 고정, 항원의 고정화를 포함하는 면역 검출, 규명한 항원을 사용한 특이성 검출, 판명할 수 있는 리포터 활성과 커플링된 항체 항-항체로 인한 항체의 규명, 또는 항원의 인식이 가능한 지지체 상에 고정된 양(sheep)의 항체를 사용한 항원의 검출과 같은 테스트를 사용할 수 있으며, 여기서, 항원은 리포터(알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제형)의 활성에 간접적으로 커플링되거나 또는 커플링되지 않은 토끼 2차 항체(샌드위치의 형성)에 의해 검출될 수 있다.
본 발명의 특정 방법의 실시예는 단계 e)에서, 동일한 기능 또는 다수의 기능의 각종 성질을 평행하게 또는 동시에 또는 비-동시적으로 테스트하는 것으로 구성된다.
한편, 본 발명의 방법은 생물학적 시료 중에 함유된 잠재적 기능을 검출할 수 있을 뿐 아니라,
- 예를 들면 효소 활성 또는 친화도와 같은 성질의 정량화가 가능한 경우의 정량화,
- 온도, pH, 염 농도 등등, 분자량, 단백질 서열 및 필요할 경우 해당 폴리뉴클레오티드 서열의 서열화로의 기능의 최적 조건하에서의 생화학적 특성화가 가능한 것을 특징으로 하고 있다.
또한, 본 발명은 단백질의 생체내 발현과는 완전 무관한 것이 특징이다. 이러한 세포 형질전환체, 예컨대 미생물을 사용할 경우, 이는 이종체 프레그먼트의 분리 및 증폭의 경우만을 위한 것이 된다. 결론적으로, 본 발명의 방법은 종래 기술의 발현에 의한 클로닝 기법을 사용하여 전술한 문제점을 모두 해소할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 세포독성 단백질을 표현하는 유전자의 동정에서의 중요성을 발견하였다. 이러한 취지에서, 단계 b)의 각각의 프레그먼트에 결합된 벡터 분자는 생체내 프레그먼트의 발현이 바람직하지 않을 수 있는 플라스미드 벡터가 될 수 있다. 이러한 벡터의 예로는 pBR322 또는 pACYC184 등을 들 수 있다.
본 발명 방법의 단계 a)에서 생성된 프레그먼트는 핵산 PCR의 산물에서 또는 생물학적 시료의 핵산상에서 엔도뉴클레아제(들)의 기능에 의해 얻게 되는 것이 바람직하다. 이러한 프레그먼트는 핵산상에서의 메카니즘 기능에 의해, 예를 들면 주사기 바늘의 통과, 가압하의 파열, 초음파 등에 의해 얻을 수 있다.
시료의 핵산이 예를 들면 게놈 뱅크에 의한 프레그먼트화가 필요하지 않을 수 있는 본 발명의 방법의 특정한 실시예에서, 단계 a)는 예를 들면 플라스미드 벡터내의 삽입과 같은 벡터 분자를 사용한 결합을 위해 말단의 추출 및/또는 정제 및/또는 생성에 의해 단계 b)를 위한 시료의 프레그먼트를 생성하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 방법의 특정한 실시예에서, 단계 a)에서 생성한 프레그먼트는 시료가 원핵생물 생명체로부터 유래한 것일 경우, 크기가 1∼수십 kb, 바람직하게는 1∼40 kb, 이롭게는 1∼10 kb이다. 단계 a)에서 생성된 프레그먼트는 크기가 5 kb 정도인 것이 더욱 바람직하다. 사실상, 원핵생물 유전자의 평균 크기는 약 1,000 개의 염기쌍이다. 5,000 개의 염기쌍을 갖는 프레그먼트를 사용할 경우에는 리보좀 고정의 적절한 부위로 종결되는 유전자를 포함하는 클론을 얻을 수 있다. DNA가 진핵생물 기원인 경우, 단계 a)에서 생성된 프레그먼트의 크기가 매우 크며, 이롭게는 수십 내지 수백 kb 정도가 된다.
단계 a)에서 생성된 프레그먼트는 오페론의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
단계 a)의 프레그먼트를 생성하는 것으로 부터 유래한 생물학적 시료는 동일하거나 또는 상이한 하나 또는 다수의 원핵생물 생명체 또는 진핵생물 세포, 또는 바이러스 세포로부터 유래할 수 있다. 이는 예를 들면 동일하거나 또는 상이한 생명체 또는 조직의 진핵생물 세포 또는 미생물의 혼합물 또는 미생물의 핵산 시료에 관한 것이다. 그러나, 핵산 시료는 핵산(들) 뱅크 또는 서열로 구성될 수 있다. 생물학적 시료는 기지의 또는 미지의 핵산 및/또는 생명체로 이루어질 수 있다. 또한, 시료는 합성 핵산으로 구성되는 것이 바람직하다.
진핵생물 DNA 뱅크의 경우, 전사 반응은 예를 들면 핵 추출물을 사용하여 mRNA의 시험관내 성숙 및 스플라이싱 반응에 의해 완결될 수 있다(3).
본 발명의 방법은 단계 e)에서 밝혀진 기능과 해당 폴리뉴클레오티드 서열 사이에는 직접적인 관계가 있다. 이러한 방법은 특히 기능을 검출하고자 하며 그리고 DNA 게놈으로부터 해당 유전자를 식별하기 위한 것이다. 유전자라는 것은 생물학적 기능과 관련된 DNA 서열 또는 프레그먼트를 의미한다.
전술한 바와 같이, 본 발명 방법의 일 실시예에 의하면, 단계 b)의 핵산 프레그먼트에 결합된 벡터 분자는 플라스미드 벡터이다. 이러한 경우, 본 발명의 단계 b)에서, 각각의 프레그먼트는 클로닝 또는 제한 카세트의 부위 정도를 벡터에 삽입한다. 이러한 플라스미드 벡터는 클로닝 부위의 한쪽에 DNA 중합효소의 프로모터를 포함하면서, 또한, 다른 쪽에 RNA 중합효소의 종결인자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 동일하거나 또는 상이한 RNA 중합효소 프로모터 2개에 의해 둘러싸이고, 필요할 경우 해당 RNA 중합효소의 종결인자(들)의 양쪽에서 동반된 클로닝 부위를 포함하는 벡터를 구성할 수 있다. 우선적으로, 이러한 프로모터 및 임의로 종결인자는 단계 c)에서 재조합 벡터의 분리를 위해 사용할 수 있는 미생물내에서 기능하지 않는 것을 특징으로 한다.
벡터가 RNA 중합효소의 프로모터(들) 및/또는 임의로 종결인자(들)를 포함하 지 않는 경우 또는, RNA 중합효소의 프로모터(들) 및 임의로 종결인자(들)가 단계 d)를 수행하는데 있어서 적절하지 않을 경우, 이러한 프로모터(들) 및 임의로 종결인자(들)는 적절한 임의의 모든 수단에 의해 본 발명의 방법의 단계 c)에서 삽입될 수 있다. 이러한 삽입을 수행하는 것은 프로모터(들) 및 임의로 종결인자(들)의 서열을 지니는 개시물의 세트를 사용하여 PCR을 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명 방법의 특정 실시예에 의하면, 프로모터(들) 및 임의로 종결인자(들)는 예를 들면 T7 RNA 중합효소와 같은 강력한 타입이 될 수 있다.
벡터 분자가 플라스미드 벡터인 경우, 단계 c)에서의 재조합 벡터의 분리는 클론 뱅크를 생성하도록 단계 b)에서 얻은 재조합 벡터의 조합체에 의한 형질전환체 세포의 형질전환에 의해 수행한 후, 적절한 임의의 방법에 의해 벡터 또는, 뱅크의 각각의 클론에 의해 포함된 재조합 벡터의 일부를 추출할 수 있다.
재조합 벡터 또는, RNA 중합효소의 프로모터(들) 및 임의로 종결인자(들)를 동반하는 재조합 벡터의 일부분의 추출은 당업자에게 공지된 모든 기법에 의해 수행될 수 있는데, 이러한 기법의 예로는 소규모 제조 및 경우에 따라서는 소화 또는 PCR 등이 있다. 또다른 예로는 이러한 PCR을 뉴클레아제에 의한 분해의 5'가 보호된 올리고뉴클레오티드, 특히 포스포로티오에이트기에 의한 번역 배지 중에 함유된 뉴클레아제를 사용하여 수행하는 것이 바람직할 수도 있다.
전술한 바와 같이, 단계 c)의 분리는 모든 물리적, 기계적 또는 화학적 수단, 예를 들어 단계 b)에서 벡터 분자에 결합된 프레그먼트 조합의 단순 극한 희석에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 분리는 항체 분자와 같은 벡터 분자상에 포함된 특이성 물질의 성질을 이용하여 수행할 수 있으며, 프레그먼트의 분리는 항체-항원 또는 비오틴의 친화도를 이용하여 수행할 수 있고, 분리는 비오틴-스트렙타비딘 등의 친화도를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명 방법의 일 실시예에 의하면, 프레그먼트 각각 또는, 단계 c)에서 얻은 벡터 분자에 각각 결합된 프레그먼트의 일부의 선별을 수행한다. 이를 위해서, 단계 e)의 번역상의 반응 혼합물 내에 단백질 합성효소(tRNA 비오티닐, 개질된 아미노산 등...)의 마커를 혼입하면서, 단계 c)에서 얻은 벡터 분자에 결합된 프레그먼트 각각 또는, 이러한 프레그먼트의 일부분을 위한 EPIV 반응을 수행한다. 그래서, EPIV 반응의 산물을 예를 들면, ELISA에 의해 표현된 단백질의 존재에 대해 분석한다. EPIV 반응이 음성인 경우의 벡터 분자에 결합된 프레그먼트 또는, 프레그먼트의 일부를 검출하였다. 이러한 프레그먼트는 이들의 삽입물 상에 ORF를 포함하지 않는다. 이와 같은 예비스크리닝 절차를 수행한 후, 이러한 프레그먼트를 단백질과 관련된 활성 식별의 차후 스크리닝을 할 필요가 없게 된다. 이와 같은 예비스크리닝 절차는, 동일한 뱅크의 비-동시적이고 반복적인 스크리닝의 경우에서 시약 및 시간의 잇점을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 방법은 나노역가측정의 플라크 또는 막 또는 칩 형태의 고형의 지지체 상에서 완전 수행된다. 이러한 칩 형태 지지체는 유리 플라크, 니트로셀룰로스막 또는 당업자에게 공지된 모든 유형의 지지체가 될 수 있다. 벡터 분자에 결합된 프레그먼트는 나노역가측정의 플라크 또는 칩 형태의 지지체 상에서 분리되며, 본 발명의 방법을 수행할 수 있는 시약은 지지체 상에 부착된다. 규명한 기능(들)의 테스트는 임의로 세척후 지지체 상에서 직접 수행될 수 있다. 벡터 분자가 플라스미드 벡터인 경우 그리고 본 발명의 방법이 지지체 상에서 수행되는 경우, 재조합 벡터에 의해 형질전환된 콜로니는 동일한 지지체 상에서 별도로 형질전환된 후, 그 자리에서(in situ) 용해되어(3) 각각의 콜로니가 함유하고 있는 재조합 벡터의 카피를 지지체 상에서 방출할 수 있게 된다. 또다른 실시예로는, 각각의 재조합 벡터 또는 재조합 벡터의 일부를 동일한 지지체상에서 서로 별도로 부착시키는 것을 포함한다. 이는 전술한 기법 중 하나에 의해 부착된 DNA를 포함하는 지지체 상에서 EPIV 반응을 수행할 수 있는 시약을 부착시킬 수 있게 된다. 기능의 테스트는 임의로 세정후 지지체 상에서 직접 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은
- 본 발명의 방법에 의해 식별 및 선택한 아직 공지되지 않은 핵산 서열,
- 벡터 분자에 결합된 상기 핵산 서열을 포함하는 프레그먼트,
- 세포 형질전환체가 핵산 서열에 의해 또는 플라스미드 벡터에 의해 형질전환되는, 상기 서열을 포함하는 플라스미드 벡터 또는
- 상기 서열에 의해 암호화된 단백질을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은
- 본 발명의 방법에 의해 분리된 핵산 서열,
- 상기의 서열을 포함하는 프레그먼트에 결합된 벡터 분자,
- 상기 서열을 함유하는 벡터,
- 상기 서열에 의해 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 세포 형질전환체 또 는
- 상기 서열에 의해 암호화된 단백질로 이루어진 모든 뱅크에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 자동화가 가능한 종래의 모든 기법에 비해서 잇점을 제공한다. 벡터 분자가 플라스미드 벡터인 경우, 이러한 자동화는 예를 들면 하기에 의해 수행될 수 있다.
- 단계 b)에서 구성된 뱅크의 각각의 재조합 벡터는 지지체 상에서 콜로니 채집기(Colony Picker) 타입의 로봇에 의해 마이크로플라크의 웰에서 수행할 수 있다.
- 이러한 배양은 BioRobot 9600 타입(키아겐 시판)의 로봇에 의해 수행된 플라스미드 추출 단계를 수행할 수 있거나 또는 PTC 200 또는 PTC 225 타입(로봇화된 커버, 엠제이 리서치 시판)의 자동 열순환기 상에서 MultiProbe 타입(팩커드 시판)의 기기에 의해 수행된 PCR 증폭 단계를 제공할 수 있다.
- PCR 산물의 정제는 BioRobot 9600 자동화기에 의해 수행될 수 있다.
- 단계 d) 및 e)의 EPIV 반응은 MultiProbe 로봇에 의해 완전히 관리될 수 있다. 단계 d)에서 얻은 전사물의 기능 테스트는 로봇 피펫상에서 수행하고, 생성된 판독치는 해당 판독기(lecteur)상에서 얻는다. 전사 반응이 번역 반응을 디커플링시킬 경우, mRNA의 임의의 정제는 BioRobot 9600에 의해 수행될 수 있다.
- 단계 e)에서 합성된 단백질의 활성 테스트는 로봇 피펫에 의해 수행되며, 결과의 판독치는 모든 적절한 방법에 의해 또는 마이크로플라크의 판독기(분광법, 열량법, 형광분석법 등등 수행된 테스트에 따라)상에서 얻는다.
결론적으로, 본 발명은 단계 a)에서 시료를 생성하고, 임의로, 단계 b)에서 벡터 분자와 프레그먼트를 결합시키는 단계를 수행하며, 임의로 단계 c)에서 벡터 분자에 결합된 프레그먼트를 분리하고, 단계 d) 및 e)를 수행하는 것을 포함하는, 지지체(들), 로봇, 자동화기 및 판독기의 배치를 포함하는 전술한 방법을 수행하기 위한 자동화 장치를 포함한다. 본 발명의 방법 또는 본 발명의 방법의 일부[단계 d) 및 e)]를 고수율로 반복하면서, 이와 같은 자동화기는 각종 핵산 시료로부터의 기능을 신속하게 규명할 수 있다.
전술한 바와 같은 특성을 나타내는 모든 플라스미드 벡터는 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 도 2에 도시된 벡터를 들 수가 있는데, 이는 하기와 같이 구성된다.
- 플라스미드 복제의 기원,
- T7 RNA 중합효소와 같은 2개의 동일한 프로모터 또는, Qβ, T3, SP6 등과 같은 RNA 중합효소의 기타의 모든 강력 프로모터를 삽입하고, 필요한 경우 동일한 RNA 중합효소의 종결인자의 양쪽에 수반되는 클로닝 부위. 이러한 프로모터 및 종결인자가 존재할 경우, 이는 재조합 벡터를 분리하기 위해 사용된 미생물에서는 선택적으로 기능을 하지 않는다. 이와 같은 구성체는 이의 삽입 방향이 어떤 것이건 간에, 클로닝 부위에 삽입된 DNA의 프레그먼트를 전사할 수 있다. 양호한 클론을 발견할 가능성은 2 배로 증가하게 된다. 진핵생물 유전자의 평균 크기는 약 1,000 pb이다. 뱅크를 생성하기 위해 약 5,000 pb의 진핵생물 DNA의 프레그먼트를 사용하면, 리보좀의 고착을 위한 적절한 부위[또는 이는 RBS(리보좀 결합 부위)]를 사용하여 완전 유전자를 포함하는 클론을 얻을 수 있는 가능성이 크게 된다. 이와 같은 이중 프로모터계를 사용하여, 유전자는 아무리 최악의 경우라도 mRNA의 개시부의 2,000 개의 염기에 존재하며, 이는 본 발명의 방법에 의해 해당 단백질의 발현을 효과적으로 수행할 수 있게 한다(이는 β-락타마제의 활성에 대해 이하의 실험 부분에서 기재한다).
- 임의로, 벡터에 의해 포함된 핵산의 프레그먼트의 PCR에 의한 증폭을 위해 하이브리드화 부위로 작용하는 종결인자 모두의 특이성 서열.
- tRNA 유전자로 구성된 선택 유전자(4). 임의로, 항생물질에 대해 내성을 갖는 유전자(또는 기타의 선택 유전자형)은 클로닝 부위에 평행하게 삽입된다. 이러한 항생물질 선택성은 클로닝 벡터의 분리용 증폭에는 사용되지 않는다. 사실상, 단계 b)의 상기 프레그먼트 각각을 삽입하는 동안, DNA의 프레그먼트는 내성 유전자를 대체하게 된다. 이러한 시스템은 항생물질 선택에 따라 좌우되지 않는 잇점을 갖는데, 이는 항생물질의 분해 및 오염의 문제를 제기하게 되며, 임의로 이종체 프레그먼트에 의해 도입된 기타의 ORF를 포함하지 않는 재조합 벡터를 얻을 수 있다. 한편, 최소 배지상에서 그리고 선택의 항생물질을 함유하는 배지상에서 뱅크의 분획을 평행 전개를 수행하면서, 음성 클론 비율을 신속하게 평가할 수 있다.
본 발명의 방법은 해당 뉴클레오티드 서열을 식별하고 특정화하는 미정제 채취물내의 핵산의 기능을 규명할 수 있는 것을 특징으로 한다. 사실상, 이러한 채취물 내에 존재하는 미생물 각각을 분리할 필요가 없다. 채취물내에 함유된 미생물의 분리는 제한된 결과를 제공하는 것으로 알려졌는데, 이는 존재하는 각종 미생물의 수 %만이 회수되기 때문이다. 또한, 본 발명의 방법은 상당한 시간 이득을 제공하게 된다. 본 발명의 방법은 양호한 결과를 산출할 수 있는데, 이는 스크리닝된 생체다양도(biodiversity)가 5∼10 일의 기간 동안 100% 정도가 되기 때문이다. 그래서, 종래의 방법은 수주 내지 수개월 동안의 채취물에 존재하는 생체다양도가 5% 정도로 분리될 수 있으며, 테스트한 단백질 활성을 검출을 위해 균주를 스크리닝하기 위해 그 만큼의 시간이 소요된다. 또한, 본 발명의 방법은 배아 또는 해당 세포내의 단백질 활성을 연구하기 위한 것이기 때문에 바람직하다. cDNA의 게놈 뱅크는 본 발명의 방법에 의해 용이하게 생성 및 스크리닝될 수 있다. cDNA 뱅크의 경우, 벡터 분자는 단계 e)에서 사용한 번역 추출물과 일치하는 번역의 개시 서열을 포함한다. 본 발명의 방법에 있어서 신속성 이외에도, 세포의 생리학을 밝힐 수가 있다. 또한, 본 발명의 방법은 배양과 생리학적 상태의 문제를 해결하지 않고도 단백질 활성을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법은 생명체의 기능을 검출하여 유전자를 직접적으로 그 근원까지 밝힐 수가 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기의 기능을 잠재적으로 포함하는 생명체에서의 기능을 규명할 수 있다. 이러한 기법은 콜렉션의 다수의 생명체의 다수의 기능을 신속하고도 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이는 미생물학적 생체다양성을 개선시킬 수가 있다. 이러한 방법은 분리된 친극한성 생명체 또는 이러한 생명체의 미가공 채취물로부터 산업적으로 유망한 단백질 활성을 식별하는데 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
마지막으로, 본 발명의 방법은 게놈학 영역내에서 유용한 것으로 밝혀졌다. 이러한 개념으로 보아, 본 발명의 방법은 초기 단계에서 서열화를 통하지 않고도 신규한 유전자를 식별할 수 있는데, 이는 해당 핵산 서열의 기능을 직접적으로 검출할 수 있기 때문이다. 생명체의 전체 게놈 DNA에 응용하면, 본 발명의 방법은 이러한 생명체의 총 표현형 특성화에 도달할 수가 있는데, 이것이 "표현형 기법(phenomique)"의 개념에 도입된다.
또한, 본 발명은 전술한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 하기와 같은 것을 포함한다.
- 핵산 프레그먼트의 생성에 필수적인 수단,
- 1 이상의 벡터 분자,
- 1 이상의 중합화제,
- 임의로 1 이상의 번역 세포 추출물,
- 기능(들)을 테스트하는데 필요한 수단,
- 각종 단계를 수행하는데 필요한 완충액.
이러한 키트는 하나의 용기 또는 별도의 용기에 포장될 수 있다.
본 발명의 기타의 잇점 및 특징은 이하의 본 발명의 실시예 및 첨부된 도면을 참조하면 명백할 것이다.
도 1은 본 발명 방법의 실시예를 개략적으로 도시하고 있다.
도 2는 본 발명 방법에 의해 뱅크의 구성체를 위한 클로닝 벡터의 지도의 일례를 도시한다.
도 3은 본 발명의 방법의 실시예의 범위내에 사용된 플라스미드 pADH, pTEM, pET26-Tfu2, pLIPet pGFP의 지도를 도시한다.
도 4는 발현 클로닝에 의해 생체내 생성된 터모코커스 푸미콜란스(Thermococcus
fumicolans)(Tfu)의 DNA 중합효소의 인테인(inteine) 2의 활성을 나타낸다. 레인 1: 스케일 1 kb. 레인 2: 효소를 사용하지 않은 반응. 레인 3: 인테인 2를 사용한 반응.
도 5는 메소필의 번역 추출물을 사용한 EPIV 반응(약 400 ㎚에서의 노출된 후 형광 발광됨)에 의해 생성된 GFP의 활성을 도시한다. 시험관 A: 물(대조군)을 사용한 EPIV 반응. 시험관 B: pGFP 벡터를 사용한 EPIV 반응.
도 6은 메소필 유형의 번역 추출물을 사용한 EPIV 반응에 의해 생성된 Tfu DNA 중합효소의 인테인 2의 활성을 도시한다. 레인 1: 스케일 1 kb. 레인 2: T-(효소를 사용하지 않은 반응). 레인 3: 공시험(DNA를 사용하지 않고 EPIV 추출물을 사용한 반응). 레인 4: T+(생체내에서 생성된 인테인 2를 사용한 반응). 레인 5: 분석[EPIV에 의해 생성된 인테인 2를 사용한 반응(pET26-Tfu2)].
도 7은 친고온성 효소의 활성을 갖는 메소필의 번역 추출물을 사용하여 친고온성 효소의 활성을 검출한 것을 도시한다. 시험관 A: 37℃에서 항온배양한 물(대조군)을 사용한 EPIV 반응. 시험관 B: 37℃에서 항온배양한 EPIV 반응. 시험관 C: 원심분리후 70℃에서 항온배양한 물(대조군)을 사용한 EPIV 반응. 시험관 D: 원심분리후 70℃에서 항온배양한 EPIV 반응.
I.
재료
1)
균주
및
플라스미드
pET26b+ 벡터는 Studier 및 Moffatt(8)에 의해 개발되고, 쏘시에떼 노바겐에서 시판하는 pET 벡터군 중 하나이다. 이러한 벡터는 T7 파아지의 프로모터의 조절하에 유전자의 표현이 가능하다. PINPOINTTM 벡터(프로메가 시판)는 T7 파아지의 RNA 중합효소의 프로모터의 조절하에 cat 유전자(클로르암페니콜 아세틸-트랜스퍼라제에 대해 암호화함)를 포함한다. pHS2-22-21 벡터는 pUC19 플라스미드의 폴리클로닝 부위내에 위치하는 Tfu DNA 중합효소의 인테인 2에 의해 확인된 분할 부위를 역전 PCR에 의해 도입하면서 구성된다. pHS2-22-21 벡터는 인테인 유전자가 삽입되는 부위에서 또는 인테인의 homing 부위(43 pb)를 포함하는 pUC 19에 해당한다.
균주 XL1-블루 [Tn10 proA
+
B
+
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1
lac]는 DNA 플라스미드의 증폭에 사용된다.
2)
시약
하기의 표 I에 기재된 제한 효소 및 변이는 공급업자가 권장한 방법에 따라 사용하였다.
| 효소 | 농도 | 공급업자 |
| Sca I | 10 U/㎕ | 애플리젠 온코 |
| Sal I | 8 U/㎕ | 뉴 잉글런드 바이오랩스 |
| Nde I | 20 U/㎕ | 뉴 잉글런드 바이오랩스 |
| Bam HI | 20 U/㎕ | 뉴 잉글런드 바이오랩스 |
| Eco RI | 20 U/㎕ | 뉴 잉글런드 바이오랩스 |
| T7 RNA 중합효소 | 50 U/㎕ | 뉴 잉글런드 바이오랩스 |
| T4 DNA 리가제 | 400 U/㎕ | 뉴 잉글런드 바이오랩스 |
사용한 완충액은 하기 표 II에 기재한다.
| 완충액 | 조성 |
| T | Tris HCl 10 mM pH 8.0 |
| T7 DNA 중합효소(10×) | Tris HCl 400 mM pH 7.9, 60 mM MgCl2, 20 mM 스퍼미딘, 100 mM DTT |
| IT2(10×) | Tris-OAc 500 mM pH 8.0, 750 mM Mg(OAc)2, 100 mM NH4OAc |
| TADH(2×) | 글리신 100 mM, NaOH pH 10, 20 mM 부탄올 1, 0.9 M NaCl, 4 mM NADP |
| LIP | KH2PO4 0.1 M, pH 6.8, 디옥산 5%, Thesit 5% |
| BETA | NaP 50 mM pH 7.0, 100 ㎍/㎖ 니트로세핀, 0.25 mM DMSO |
| Ligation(10×) | Tris HCl 500 mM pH 7.5, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP, 250 ㎍/㎖ BSA |
II
.
플라스미드의
제조 및 테스트
1) 구성
Tfu DNA 중합효소(itfu
2)의 인테인 2 유전자(Genbank의 승인 번호: Z69882)를 pET26b+ 벡터의 제한 부위 Nde I 및 Sal I의 사이에 삽입하여 도 3에 도시한 바와 같은 플라스미드 pET26-Tfu2를 생성하였다. 마찬가지로, 도 3에 도시된 바와 같이 pADH 벡터를 생성하기 위해 터어모코커스
히드로터말리스(Thermococcus
hydrothermalis)의 알콜 데히드로게나제의 유전자(adh)를 pET26B+의 제한 부위 Nde I 및 Bam HI의 사이에 삽입하고, 플라스미드 pADH, pTEM, pGFP 및 pLIP를 생성하기 위해, E.
coli
.의 β-락타마제 TEM-1의 유전자(bla)(9), 아에쿠오레아
빅토리아(Aequorea victoria)의 녹색 형광 단백질의 유전자(gfp)(6) 및 캔디다 안타르티카(Candida antarctica)의 리파제 B의 유전자(lipB)(Genbank 승인 번호 Y14015)를 pET26b+ 벡터의 제한 부위 Nde I 및 Eco RI의 사이에 각각 삽입하였다. 이와 같은 5 개의 유전자 각각의 경우, 제한 부위 Nde I는 번역의 개시 코돈 ATG와 중첩된다.
각각의 구성체는 제한 프로필의 다수의 분석에 의해 입증된다. XL1-블루 화학적 수용능 세포(1) 200 ㎕를 열 충격(2)에 의해 각각의 플라스미드 10 ng을 사용하여 형질전환시키고, 그리하여 형질전환된 세포는 카나마이신 60 ㎍/㎖ 및 테트라사이클린 12.5 ㎍/㎖를 함유하는 고형 LB 배지상에서 전개시킨다. 이러한 형질전환된 각각의 클론으로부터, DNA 플라스미드의 다량 제조(maxipreparation)는 TIP100형 컬럼(키아겐 시판)을 사용하여 수행하였다. 이소프로판올로 정제한 후, 각각의 DNA 플라스미드를 완충액 T 100 ㎕에서 회수하였다. DNA 플라스미드의 농도는 260 ㎚에서의 분광계에 의해 평가하였다. 각각의 DNA 플라스미드의 순도는 1% TBE 한천 겔상에서 각각의 벡터 0.2 ㎕를 부착시켜 측정하였다.
2)
발현의
생체내
테스트-활성 테스트
- pTEM: chimocompetentes 세포 BL21 DE3(pLysS) 200 ㎕를 열 충격에 의해 pTEM 플라스미드 10 ng을 사용하여 형질전환시키고, 그리하여 형질전환된 세포를 카나마이신 60 ㎍/㎖, 클로르암페니콜 20 ㎍/㎖, IPTG 32 ㎍/㎖ 및 암피실린 100 ㎍/㎖을 함유하는 고형 LB 배지상에서 전개시킨다. 37℃에서 하룻밤 항온배양한 후, 다수의 콜로니가 페트리 상자에서 관찰되었는데, 이것은 플라스미드 pTEM의 TEM-1 유전자가 표현되었고, 기능을 나타내며, 그리고 암피실린에 대한 내성과 비교되는 것으로 밝혀졌다.
- pGFP: chimocompetentes 세포 BL21 DE3(pLysS) 200 ㎕를 열 충격에 의해 pGFP 플라스미드 10 ng을 사용하여 형질전환시키고, 그리하여 형질전환된 세포를 카나마이신 60 ㎍/㎖, 클로르암페니콜 20 ㎍/㎖ 및 IPTG 32 ㎍/㎖을 함유하는 고형 LB 배지상에서 전개시킨다. 37℃에서 하룻밤 항온배양한 후, 다수의 콜로니는 페트리 상자에서 관찰될 수 있다. 전체 콜로니는 약 400 ㎚에서의 자외선에서 여기 상태로 반응하여 녹색 형광을 발광하며, 이는 pGFP 플라스미드의 유전자 gfp가 표현되었고, 기능을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
- pET26-Tfu2: chimocompetentes 세포 BL21 DE3(pLysS) 200 ㎕를 열 충격에 의해 pET26-Tfu2 플라스미드 10 ng을 사용하여 형질전환시키고, 그리하여 형질전환된 세포를 카나마이신 60 ㎍/㎖ 및 클로르암페니콜 20 ㎍/㎖을 함유하는 고형 LB 배지상에서 전개시킨다. 이러한 형질전환의 클론으로 수행한 배양액은 2 시간 동안 37℃에서 0.5 mM IPTG를 사용하여 DO600
㎚=0.5에서 유발되었다. 원심분리후, 박테리아 잔여물을 pH 7.5의 20 mM의 인산나트륨 완충액 중에서 회수하고, 이를 수회의 동결/해동 싸이클에 의해 세포상 용해물을 얻었다. NaCl 구배를 사용하여 QFast-Flow 컬럼상에서 인테인 2를 정제하였다. 이 효소의 활성은 하기와 같은 프로토콜에 의해 테스트하였다. 순수하고, 고농축된 효소 용출 분획 1 ㎕을 100 배 희석하였다. 이 희석물 1 ㎕를 15 분간 70℃에서 IT2 완충액 3 ㎕ 및 pHS2-22-21 플라스미드 220 ng을 사용하여 항온배양하고, 최종 부피 30 ㎕ 중에서 제한 효소 Sca I를 사용하여 선형화하였다. 소화 혼합물 15 ㎕를 1% TBE 한천 겔 상에 부착시켰다. 이동 및 에티듐 브롬화물로 착색시킨 후, 겔을 자외선에 노광시켰다. 도 4에 도시된 바와 같이, 이러한 겔의 분석에 의하면, 934 pb 및 1752 pb 각각의 2개의 밴드가 존재하며, 이는 인테인 2에 의한 pHS2-22-21 벡터의 분할(선형화된 Sca I)에 해당하는 것으로 밝혀졌다. 그래서 pET26-Tfu2 플라스미드의 유전자 itfu
2는 표현되었으며, 이의 산물인 인테인 2는 활성을 지닌다.
- pADH: chimocompetentes 세포 BL21 DE3(pLysS) 200 ㎕를 열 충격에 의해 pADH 플라스미드 10 ng을 사용하여 형질전환시키고, 그리하여 형질전환된 세포를 카나마이신 60 ㎍/㎖ 및 클로르암페니콜 20 ㎍/㎖을 함유하는 고형 LB 배지상에서 전개시킨다. 이러한 형질전환의 클론으로 수행한 배양액은 3 시간 동안 37℃에서 1 mM IPTG를 사용하여 DO600
㎚=0.6에서 유발되었다. 원심분리후, 박테리아 잔여물을 pH 8.0의 50 mM의 인산나트륨-10 mM의 MgCl2 완충액 중에서 회수하고, 리소자임 1 ㎎/㎖, RNAse A 10 ㎍/㎖ 및 DNAse I 100 ㎍/㎖의 존재하에 얼음상에서 30 분간 항온배양하여 세포상 용해물을 얻었다. 이러한 추출 단계에서 얻은 원심분리 부유물을 30 분간 50℃에서 항온배양하고, 이를 다시 원심분리하였다. 이러한 최종 단계에서 얻은 부유물은 활성의 유효량을 위한 효소 추출물로서 작용한다. 음성 대조군은 각각의 플라스미드를 갖지 않는 세포 배양물 BL21 DE3(pLysS)에서 유사한 추출을 동시에 수행하는 것으로 구성된다. 340 ㎚에서의 NADP의 NADPH로의 환원 역학을 분광계를 수행하여 알콜 데히드로게나제의 활성을 테스트하였다. 이를 위해, 효소 추출물 또는 대조군 10 ㎕를 50℃에서 5 분간 TADH 완충액 500 ㎕ 및 물 490 ㎕를 사용하여 항온배양하였다. 이러한 조건하에서, 효소 추출물 15.6 UDO/분/㎖의 활성이 검출되었으며, 반대로 대조군의 경우에는 0 UDO/분/㎖이었다. 그리하여 pADH 플라스미드의 adh 유전자가 표현되었으며, 이의 산물인 알콜 데히드로게나제는 활성을 띠었다.
III.
메소필
균주로부터
생성된 번역 추출물을 사용한 시험관내 단백질 발현(EPIV) 테스트(37
℃
)
각각의 벡터 4 ㎍을 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 pH 6.0 및 2 배 부피의 완전 빙 에탄올의 존재하에 침전시켰다. 침전 잔여물을 70%로 에탄올로 헹구어 미량의 염 모두를 제거하였다. 각각의 침전된 DNA를 완충액 T 4 ㎕에 재현탁시켰다.
이러한 DNA를 2 시간 동안 37℃에서 각각 아미노산 0.1 mM, "S30 Premix" 추출물 20 ㎕ 및 "T7 S30 추출물"(프로메가 시판) 15 ㎕를 최종 부피 50 ㎕ 중에 포함하는 시험관내 단백질 발현 혼합물 중에서 항온배양하였다. "S30 Premixh" 추출물 및 "T7 S30 추출물"은 번역 반응에서 결합된 시험관내 전사 반응에 필요한 모든 성분, 특히 T7 RNA 중합효소, CTP, UTP, GTP, ATP, tRNAs, EDTA, 엽산 및 적절한 염을 포함한다. 번역 추출물은 엔도프로테나제 OmpT 및 프로테아제 lon이 결핍된 E.
coli
. B의 균주로부터 Zubay(10)의 문헌에 기재된 절차에 의해 수행하여 시험관내 표현된 단백질의 안정도가 우수하다는 것을 확인하였다.
음성 대조군은 전사-번역 혼합물 중의 DNA 대신에 초순수 살균수로 항온배양하는 것으로 구성된다. 양성 대조군은 PINPOINTTM 플라스미드 2 ㎍을 항온배양하는 것으로 이루어진다.
EPIV 반응은 각 시료의 효소 활성이 측정될 때까지 얼음상에 보존하였다.
IV
.
활성 유효량
1)
메소필
효소
a)
GFP
활성
도 5에는 대조군 반응을 포함하는 시험관 이외에도 약 400 ㎚에서의 자외선에 노광시킨 pGFP 벡터를 사용한 EPIV 반응의 산물을 포함하는 시험관을 도시한다. pGFP 플라스미드의 EPIV 반응을 포함하는 시험관만이 녹색 형광을 발광하였다. 그러므로, EPIV 반응에 의하면 형광 활성을 지니는 GFP 단백질의 생성이 가능케 된다.
b)
β
-
락타마제
활성
β-락타마제 활성은 니트로세핀 분해의 역학을 분광계로 수행하면서 486 ㎚에서의 색소생산성 세팔로스포린을 분석하였다(5). 이를 위해, pTEM 벡터를 사용한 EPIV 반응물 5, 10 또는 20 ㎕를 2 분간 37℃에서 BETA qsp 1 ㎖ 완충액내에서 항온배양하였다. pTEM 벡터를 사용한 EPIV 반응의 평균 활성은 8.9 UDO/분/㎖의 추출물로 측정되었으나, 대조군 EPIV 반응은 0.6 UDO/분/㎖인 것으로 측정되었다. 그러므로, 시험관내 단백질 발현 반응에 의해, 시험관내 니트로세핀의 분해가 가능한 활성 β-락타마제의 합성이 가능하다.
대조군 PINPOINTTM 벡터는 이의 내성유전자 프로모터의 조절하에 bla 유전자를 지닌다. 그렇지만, 이러한 벡터를 사용한 EPIV 반응의 β-락타마제 활성을 테스트한 바, 6 UDO/분/㎖ 추출물로 측정되었다. 리팜피신 1 ng/㎕ 첨가하여, E.
coli.의 RNA 중합효소의 억제제가 PINPOINTTM 벡터를 사용하여 β-락타마제의 시험관내 발현을 개질시키지 않는다는 점에 주목한다. 그리하여 T7 프로모터의 하부의 2123 pb에 위치하는 PINPOINTTM 벡터의 bla 유전자는 전사 및 번역이 효율적으로 수행된다. 이는 T7 프로모터의 하부의 2000 pb에 위치하는 유전자가 EPIV 반응 동안 효과적으로 전사 및 번역이 수행된다는 것을 의미한다.
2)
친고온체의
효소
a)
인테인
2 활성
활성 인테인 2가 생성되었는지의 여부를 알기 위해 pET26-Tfu2 벡터를 사용한 EPIV 반응을 테스트하였다. 이를 위해, 이러한 EPIV 반응물 5 ㎕을 20 분간 70℃에서 Sca I에 의해 선형화된 pHS2-22-21 벡터 220 ng 및 IT2 완충액 3 ㎕를 사용하여 최종 부피 30 ㎕에서 항온배양하였다. 음성 대조군은 EPIV 반응물 5 ㎕ 대신에 물을 사용한 것으로 이루어진다. 양성 대조군은 1/100 배로 희석한 시험관내 생성된 인테인 2의 희석된 분획 1 ㎕로 이루어진다. 마지막으로, 특이성 대조군은 DNA를 회수하지 않은 EPIV 반응물 5 ㎕를 항온배양하여 수행하였다.
항온배양후, 4 개의 분석물을 페놀-클로로포름으로 추출하고, 이를 무수 에 탄올에 침강시킨 후, 70% 에탄올로 세정하여 염을 제거한다. 각각의 침강 잔여물을 완충액 T 10 ㎕내에서 회수하고, 8 ㎕를 1% TBE 한천 겔상에 부착시켰다. 이동 및 에티듐 브롬화물로 착색시킨 후, 제한 프로필을 분석하기 위해 겔을 자외선에 노광시켰다. 도 6에서 레인 4(양성 대조군)의 밴드와 동일하게 레인 5는 934 pb 및 1752 pb에서 밴드가 나타났는데, 이는 인테인 2가 EPIV 반응에 의해 잘 생성되었으며, 이의 효소는 활성을 띠는 것으로 밝혀졌다. 또한, EPIV 반응은, 각각의 소화 밴드가 레인 3의 대조군에서 관찰되지 않았기 때문에 특이성을 갖는다.
b)
알콜
데히드로게나제
활성
알콜 데히드로게나제의 활성은 340 ㎚에서 NADP의 NADPH로의 환원 역학을 분광계로 수행하여 테스트하였다. 이를 위하여, pADH 벡터를 사용하거나 또는 DNA를 사용하지 않은 EPIV 반응물 5, 10 또는 15 ㎕를 50℃에서 5 분간 TADH 완충액 500 ㎕를 사용하여 최종 부피 1 ㎖ 중에서 항온배양하였다. 이러한 조건하에서, pADH 벡터를 사용한 EPIV 반응의 평균 활성은 2.3 UDO/분/㎖ 추출물로 측정되었으나, 대조군(물을 사용한 EPIV 반응)의 경우에는 0.32 UDO/분/㎖ 추출물로 측정되었다. 그래서 터모코쿠스
히드로터말리스(Thermococcus
hydrothermalis)(Genbank 승인 번호 Y14015)의 ADH는 EPIV 반응 동안 활성 형태로 생성된다.
3)
한랭 효소
572 ㎚에서 색소생산성 지질(1,2-o-디라우릴-rac-글리세로-3-글루타르산-레소루핀 에스테르) 분해의 역학을 분광계로 수행하여 리파제 활성을 테스트하였다. 이를 위해, pLIP 벡터를 사용하거나 또는 DNA를 사용하지 않은 EPIV 반응물 5 ㎕를 70℃에서 15 분 동안 반응 완충액 내에서 기질 100 ㎍의 존재하에 항온배양하였다. 이러한 조건하에서, pLIP 벡터를 사용한 EPIV 반응의 활성은 0.50 UDO/분/㎖ 추출물로 측정되었으나, 대조군의 경우에는 0.04 UDO/분/㎖ 추출물로 측정되었다. 그리하여 캔디다
안타르티카(Candida
antarctica)(진핵생물 생명체)의 리파제 B는 EPIV 반응 동안 활성 형태로 생성된다.
V.
친고온체
성질을 측정하기 위한
메소필
활성을 포함하는 번역 추출물의 사용
터모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)의 베타-갈락토시다제 유전자를 T7 RNA 중합효소의 전사 프로모터를 포함하는 벡터에 삽입하였다. 그리하여 얻은 벡터를 사용하여 베타-갈락토시다제 활성을 갖는 E. coli . 균주의 번역 추출물을 사용하여 EPIV 반응을 수행하였다. 동시에, DNA를 사용하지 않은 EPIV 반응을 수행하였다. Xgal의 존재하에 37℃에서 인산나트륨 완충액(50 mM, pH 7) 중에서 각각의 EPIV 반응의 분획을 항온배양하여 2 개의 시험관은 수분 이내에 청색으로 변색되었다(참고: 도 7의 시험관 A 및 B). 70℃에서 수행한 것을 제외하고, 동일한 조건하에서 Xgal의 존재하에 EPIV 반응 각각의 분획을 항온배양하여 친고온성 베타-갈락토시다제를 암호화한 플라스미드를 사용한 EPIV 반응에 해당하는 시험관만이 청색으로 변색되었다(참고: 도 7의 시험관 C 및 D: 이러한 2 개의 시험관은 70℃에서 활성 테스트 동안 열변성된 후, 침강되는 메소필의 번역 추출물의 단백질을 수집하기 위해 원심분리하였다). 베타-갈락토시다제 메소필의 활성은 상기 온도(베타-갈락토시다제 메소필의 열 변성 온도)에서 검출되지 않는다. 그래서, 이러한 성질이 규명한 성질의 검출 조건내에서 검출되지 않을 경우, 규명한 성질과 유사한 성질을 갖는 번역 추출물을 사용할 수가 있게 된다.
VI.
친극한성
생명체로부터 생성된 번역 추출물
기타의 생명체, 특히 친극한성 생명체의 번역 추출물은 Zubay(1973)의 문헌(10)에 의해 또는 Pratt(1984)의 문헌(7)에 기재된 절차에 의해 세포로부터 생성될 수 있다. 원심분리 속도, 세포 파괴 조건, 및 각족 생성 또는 반응의 완충액은 체계적인 분석에 의해 각각의 번역 추출물 유형에 따라 조절된다. 그래서, 다양한 추출물의 번역을 수행하여 유전적 기원이 무엇이든 간에 유전자를 번역할 수 있어야만 한다. 본 발명은 번역 시스템과 규명한 성질을 위한 암호화된 유전자의 발현 정지 사이의 일치를 얻을 수 있다.
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Claims (69)
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- 핵산을 포함하는 생물학적 시료 중에 존재하는 잠재적 기능을 분리 및 특정화하는 방법에 있어서,a) 핵산을 포함하는 생물학적 시료로부터 핵산 프레그먼트(fragment)를 준비하는 단계,b) 각각의 상기 프레그먼트를 벡터(vector) 분자에 결합시키는 단계,c) 단계 b)의 벡터 분자에 결합된 각각의 프레그먼트 또는, 벡터 분자에 결합된 프레그먼트로 구성된 각각의 구성체의 일부분을 분리하는 단계,d) 단계 c)의 벡터 분자에 결합된 각각의 프레그먼트 또는, 벡터 분자에 결합된 프레그먼트로 구성된 각각의 구성체의 일부분을 시험관내(in vitro)에서 처리하여 전사물(transcript)을 얻는 단계,e) 단계 d)에서 얻은 전사물 또는, 상기 전사물을 번역한 후 암호화(cording)한 단백질의 기능을 테스트하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산을 포함하는 생물학적 시료 중에 존재하는 잠재적 기능을 분리 및 특정화하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 e)는 상기 단계 d)에서 얻은 전사물을, 단백질로의 번역이 가능한 세포 추출물인 번역 추출물로 시험관내 처리하고, 상기 단백질의 기능을 테스트하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 벡터 분자는 상기 단계 d)를 위해 1 이상의 전사 프로모터 및 단계 c)에서의 프레그먼트의 분리를 촉진하는 물질을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 벡터 분자는 각각 1 이상의 전사 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 2 개를 포함하며, 각각의 서열은 단계 a)에서 얻은 프레그먼트의 말단에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 벡터 분자가 갖는 전사 프로모터(들)는 강력한 타입(strong type)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 벡터 분자가 갖는 전사 프로모터(들)는 강력한 타입(strong type)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 전사 단계 d)는 단계 e)의 번역과 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 e)의 전사물의 번역은 생물학적 시료와 동일한 기원 또는 그에 유사한 기원의 번역 추출물을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 번역 추출물은 단계 e)에서 테스트한 기능을 나타내지 않거나, 기능은 나타내되 단계 e)에서 수행한 테스트 조건하에서는 검출되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 번역 추출물은 복수의 번역 추출물의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 번역 추출물은 코돈(들)에 특이적 tRNA, 발현된 단백질의 폴딩 또는 성숙을 더 효율적으로 촉진하는 물질(들), 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 번역 추출물은 시료 기원이 무엇이든 간에 번역에 일반적인 추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 e)는 리보자임 또는 tRNA를 이용하여 같은 전사 기능을 테스트하는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 e)는 효소 활성 또는 친화도를 사용하여 전사물 단백질의 기능을 테스트하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 e)는 단일 기능 또는 다수 기능의 여러가지 특성을 동시에 또는 순차적으로 테스트하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 b)의 각각의 프레그먼트에 결합된 벡터 분자는 생체내 프레그먼트를 발현시키지 않는 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 진핵생물로부터 유래한 것인 경우, 단계 a)에서 생성한 프레그먼트는 크기가 1∼수십 kb인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 진핵생물의 경우, 단계 a)에서 생성한 프레그먼트는 크기가 수십 내지 수백 kb인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 a)에서 생성된 프레그먼트는 부분 또는 전체 오페론을 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 a)의 프레그먼트 생성시 사용된 생물학적 시료는 동일하거나 또는 상이한 원핵생물 생명체(들) 또는 진핵생물의 세포 또는 바이러스로부터 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 a)의 프레그먼트 생성시 사용된 생물학적 시료는 합성 핵산 뱅크 또는 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 a)의 프레그먼트 생성시 사용된 생물학적 시료는 미지의 핵산, 생명체, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 진핵생물 DNA 뱅크이며, 상기 단계 d)의 전사 반응은 핵 추출물에 의한 mRNA의 시험관내 스플라이싱 및 성숙의 반응에 의해 종결되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 b)에서 핵산 프레그먼트에 결합된 벡터 분자는 플라스미드 벡터이고, 각 프레그먼트는 상기 벡터의 클로닝 부위 또는 제한 카세트 부위에 삽입되며, 제조된 플라스미드 벡터는- 클로닝 부위의 한쪽에 RNA 중합효소 프로모터, 그리고 다른 쪽에는 RNA 중합효소의 종결인자,- RNA 중합효소가 동일하거나 또는 상이한 2 개의 프로모터에 의해 둘러 싸이고, 해당 RNA 중합효소의 종결인자가 모두 존재하는 클로닝 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 프로모터 및 이의 종결인자는 단계 c)에서 재조합 벡터의 분리를 위해 사용한 미생물내에서는 사용 불가능한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 클론 뱅크를 생성하기 위한 단계 c)에서의 재조합 벡터의 분리는, 단계 b)에서 얻은 재조합 벡터의 조합체로 세포를 형질전환시킴으로써 수행되며, 그후 뱅크 각각의 클론에 의해 함유된 재조합 벡터 또는 벡터 일부분의 추출을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 방법은 나노역가측정의 플라크 또는 막 또는 칩 형태의 고형의 지지체 상에서 완전 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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- - 플라스미드 복제의 기원,- T7 RNA 중합효소와 같은 2개의 동일한 프로모터 또는, RNA 중합효소의 모든 기타의 강력 프로모터로 둘러싸이고, 동일한 RNA 중합효소의 종결인자의 모두에 수반되는 클로닝 부위,- 벡터가 지닌 핵산 프레그먼트의 PCR에 의한 증폭에 대해 하이브리드 부위로 작용하는, 종결인자 모두의 특이성 서열,- tRNA의 유전자로 이루어진 선택 유전자 및, 클로닝 부위에 평행하게 삽입된 다른 선택 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제35항 내지 제61항에 의한 방법의 단계 b)에서 사용되는 플라스미드 벡터.
- 핵산을 포함하는 생물학적 시료 중에 존재하는 잠재적 기능을 분리 및 특정화하는 방법을 수행하기 위한 키트에 있어서,- 핵산 프레그먼트의 생성에 필요한 수단,- 1 이상의 벡터 분자,- 1 이상의 중합화제,- 1 이상의 번역 세포 추출물,- 기능(들)을 테스트하는데 필요한 수단, 및- 완충액을 포함하는 것을 특징으로 하는 제35항 내지 제61항 중 어느 한 항에 의한 방법을 수행하기 위한 키트.
- 핵산을 포함하는 생물학적 시료 중에 존재하는 잠재적 기능을 분리 및 특정화하는 방법을 수행하기 위한 장치에 있어서,단계 a)의 시료를 생성하고, 단계 b)에서 벡터 분자와 프레그먼트를 결합시키는 단계를 수행하고, 단계 c)에서 벡터 분자에 결합된 프레그먼트를 분리하고, 단계 d) 및 e)를 수행하도록 처리할 수 있는, 지지체(들), 로봇, 자동화기 및 판독기의 배치를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제35항 내지 제61항 중 어느 한 항에 의한 방법을 수행하기 위한 자동화 장치.
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