ES2296397T3 - Proceso de separacion y de caracterizacion de las funciones potencialmente presentes en una muestra biologica que contiene acidos nucleicos. - Google Patents
Proceso de separacion y de caracterizacion de las funciones potencialmente presentes en una muestra biologica que contiene acidos nucleicos. Download PDFInfo
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Abstract
Proceso de cribado de una muestra biológica que contiene ácidos nucleicos, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: a) la determinación de la función a cribar, b) la preparación de fragmentos de ácido nucleico a partir de dicha muestra, c) la asociación de cada uno de dichos fragmentos con una molécula vectora, d) el aislamiento de cada fragmento asociado con una molécula vectora o con una parte de cada construcción constituida por un fragmento asociado con una molécula vectora, de la etapa (c) e) el tratamiento en un sistema acelular de cada fragmento asociado con una molécula vectora o con una parte de cada construcción constituida por un fragmento asociado con una molécula vectora de la etapa (d) para obtener transcriptos, f) la prueba de la función determinada en la etapa (a) de los transcriptos obtenidos en la etapa (e) o de las proteínas para las cuales codifican después de la traducción de dichos transcriptos.
Description
Proceso de separación y de caracterización de
las funciones potencialmente presentes en una muestra biológica que
contiene ácidos nucleicos.
La presente invención tiene por objeto un
proceso según la reivindicación 1, que permite separar las
funciones potencialmente presentes en una muestra biológica que
contiene ácidos nucleicos y caracterizar dichas funciones, por
expresión proteica in vitro después de la transcripción y la
traducción de fragmentos de ADN. La caracterización de una función
según el proceso de la invención puede hacerse entre otros por el
análisis bioquímico de esta función y eventualmente por la
clonación o la secuenciación de la secuencia polinucleotídica
correspondiente a cada una de las funciones eventualmente presentes
en la muestra estudiada.
De este modo, el proceso según la presente
invención permite muy particularmente la identificación y el
aislamiento de los genes o de las proteínas para las cuales ellos
codifican poseyendo una función determinada o determinable.
La búsqueda de nuevos genes y/o proteínas para
las cuales éstos codifican constituye un objetivo mayor de
numerosos laboratorios de biología molecular. En efecto, la terapia
genética y celular o la creación de animales y de plantas
transgénicas, suscita nuevas esperanzas para la salud, el
diagnóstico y la alimentación humana o animal, pero necesitan entre
otros, identificar numerosos genes y/o actividades proteicas. De
esta forma, existen numerosas técnicas de aislamiento y de cribado
de genes por clonación y expresión.
Una de estas técnicas, llamada genómica,
consiste en secuenciar una parte o la totalidad del genoma de un
organismo, y después buscar por homología con secuencias ya
identificadas en bancos de datos secuencias potencialmente
codificantes. Una vez identificadas, estas secuencias deben ser
subclonadas y expresadas para verificar que las mismas codifican
efectivamente para la propiedad investigada. Además del tiempo
necesario para su puesta en práctica, esta técnica presenta el
inconveniente de poder identificar solamente las funciones homólogas
a aquellas que ya son conocidas y referenciadas en las bases de
datos.
La proteómica es un segundo acercamiento posible
para investigar propiedades interesantes. Consiste en extraer las
proteínas expresadas por un microorganismo y purificarlas. Cada
fracción de purificación es entonces probada para detectar la que
contenga la propiedad investigada. El inconveniente mayor de esta
técnica reside en el hecho de que la misma no permite tener una
relación directa entre la propiedad detectada y el gen que permite
la expresión de esta propiedad. El segundo inconveniente de este
acercamiento es que no permite detectar las propiedades que no han
sido inducidas en el microorganismo de partida.
Una tercera técnica para detectar una función
expresada por un microorganismo consiste en utilizar la clonación
de expresión. Este método tiene por principio extraer el ADN del
microorganismo de partida, fragmentarlo e insertarlo en un vector
de expresión in vivo que es transformado en un hospedero.
Este hospedero es escogido por su capacidad de expresar los genes
del microorganismo de partida. De la misma manera, el vector
siempre es escogido por su compatibilidad con el hospedero de
expresión. La técnica de clonación de expresión se utiliza en el
marco de la investigación de una función en un microorganismo que
tiene características genéticas cercanas a uno de los hospederos
existentes (el mismo perfil de uso de los codones, el mismo
porcentaje GC, ...). En el caso de la investigación de una función
a partir de un gran número de microorganismos de origen genético
variado, el método de clonación de expresión se vuelve inutilizable,
los hospederos no siendo más capaces de expresar los genes
heterólogos que les son provistos.
Además, la clonación de expresión, como los
otros procesos del arte anterior de aislamiento y de cribado de
genes presenta numerosos inconvenientes:
- -
- la toxicidad de los productos de transcripción y de traducción, que pueden inducir recombinaciones genéticas para paliar estos problemas de toxicidad,
- -
- la poca representatividad del banco utilizado,
- -
- el tiempo de puesta en práctica
- -
- la poca compatibilidad entre la secuencia del gen clonado y la puntuación de expresión del vector utilizado,
- -
- niveles de expresión muy variables,
- -
- problemas de uso de los codones,
- -
- problemas de replicación, de modificaciones post-traduccionales,
- -
- el problema ocasionado por la influencia del estado fisiológico de una célula sobre el nivel de expresión de las proteínas cuando se busca la actividad proteica directamente en los extractos celulares de origen,
- -
- una gran dificultad de automatización.
La presente invención pretende precisamente
paliar estos inconvenientes ofreciendo un método rápido y eficaz de
identificación de una función asociada a una secuencia
polinucleotídica contenida en una muestra biológica que posee ácidos
nucleicos, y que permite aislar dicha secuencia.
Este objetivo es alcanzado, gracias a un proceso
de separación y de caracterización de las funciones potencialmente
presentes en una muestra biológica que contiene ácidos nucleicos,
caracterizado por que comprende las etapas siguientes:
- a)
- la determinación de la función a cribar,
- b)
- la preparación de fragmentos de ácidos nucleicos a partir de dicha muestra,
- c)
- la asociación de cada uno de dichos fragmentos con una molécula vectora,
- d)
- el aislamiento de cada fragmento asociado con una molécula vectora o con una parte de cada construcción constituida por un fragmento asociado con una molécula vectora, de la etapa (c)
- e)
- el tratamiento en un sistema acelular de cada fragmento asociado con una molécula vectora o con una parte de cada construcción constituida por un fragmento asociado con una molécula vectora de la etapa (d) para obtener transcriptos,
- f)
- la prueba de la función determinada en la etapa (a) de los transcriptos obtenidos en la etapa (e) o de las proteínas para las cuales estos codifican después de la traducción de dichos transcriptos.
El proceso de la invención ofrece la ventaja de
poder realizar:
- -
- una prueba de las propiedades de los transcriptos de la etapa (e), cuando estos presenten propiedades ventajosas de tipo ARNt, ribosoma, o
- -
- una prueba de las propiedades de las proteínas codificadas por dichos transcriptos.
En el caso en que se prueben las funciones de
las proteínas codificadas por los transcriptos obtenidos en la
etapa (e) el proceso de la invención comprende en la etapa (f) el
tratamiento de dichos transcriptos in vitro con un extracto
celular que permite su traducción en proteína, y después la prueba
de una función de dichas proteínas por cualquier medio
apropiado.
Se entiende más particularmente por función, en
el sentido de la presente invención, la propiedad que puede ser
codificada por una secuencia polinucleotídica. Esta propiedad puede
ser por ejemplo una actividad enzimática o una afinidad si dicha
secuencia codifica para una proteína, o una actividad endonucleasa
por ejemplo si dicha secuencia codifica para un ARNm catalítico.
De esta forma, el proceso de la invención
permite no sólo detectar una función, sino también caracterizarla
desde un punto de vista bioquímico. Si la función es una actividad
enzimática por ejemplo, puede tratarse del análisis de las
condiciones óptimas de funcionamiento (pH, temperatura,
concentración de sales), de los parámetros cinéticos (Vm, Km), de
los parámetros de inhibición (Ki). Si la función es una afinidad,
puede tratarse de la determinación del Kd, o de la molécula que
tiene más afinidad para esta proteína. Puede tratarse también de la
determinación del tamaño de la proteína traducida o del ARNm
transcripto y eventualmente de la secuenciación del gen
correspondiente.
Se entiende por muestra biológica cualquier
muestra susceptible de contener ácidos nucleicos, como una muestra
de suelo, de vegetal, de sangre, humana o animal, de agua, de
cultivo microbiano, celular o viral, de biopsia, etc..., pero estas
muestras pueden igualmente corresponder a productos de amplificación
(PCR, NASBA, etc...), del ADN genómico, del ADN sintético, del
ARNm, o cualquier producto de ácidos nucleicos salido de los
tratamientos a menudo utilizados por el especialista.
Se entiende por molécula vectora, una o varias
secuencias polinucleotídicas que contienen al menos un promotor de
transcripción para la etapa (e) y eventualmente una sustancia que
facilita el aislamiento del fragmento en la etapa (d).
Ventajosamente esta sustancia puede ser una o varias moléculas de
estreptavidina o de biotina, del grupo polipirol, de anticuerpos,
una secuencia polinucleotídica simple o de doble hebra, un vector
de ADN plasmídico que no comprende preferiblemente secuencias que
permiten la expresión in vivo del fragmento asociado, o
cualquier otro compuesto que permita el aislamiento del fragmento
asociado en la etapa (d).
Se entiende por aislamiento en la etapa (d) del
proceso de la invención, a la subdivisión del lote de los
fragmentos obtenidos en la etapa (c) en subconjuntos, un subconjunto
pudiendo estar constituido por uno o varios fragmentos de ácido
nucleico.
La etapa (b) de preparación de los fragmentos de
ácidos nucleicos del proceso de la invención, puede comprender una
fase de extracción si los ácidos nucleicos no están directamente
accesibles en el muestra biológica, por ejemplo en el caso de
ácidos nucleicos contenidos en células, virus, sangre, elementos
orgánicos, etc.... Esta fase de extracción es entonces contenida en
la etapa (b) de preparación de los fragmentos de ácidos nucleicos.
Igualmente, en el caso donde la muestra biológica está constituida
por ARNm, una etapa de RT-PCR es necesaria para
preparar los fragmentos de ácidos nucleicos de la etapa (b).
Según una forma particular de puesta en práctica
del proceso de la invención, la molécula vectora está compuesta por
dos secuencias polinucleotídicas comprendiendo cada una al menos un
promotor de transcripción. Cada una de estas secuencias está
asociada a un extremo de uno de los fragmentos obtenidos en la etapa
(b).
Según una forma ventajosa de puesta en práctica
del proceso de la invención, el(los) promotor(es) de
transcripción portado(s) por la molécula vectora
es(son) un (unos) promotor(es) de tipo fuerte, tal
como el promotor de transcripción de la RNA polimerasa del fago T7,
SP6, Q\beta o \lambda.
De esta forma, una aplicación particular del
proceso de la invención permite identificar una secuencia
polinucleotídica y/o la proteína correspondiente, que posee una
función, a partir de una muestra que contiene ácidos nucleicos.
Se entiende por vector recombinante en la
aplicación del proceso de la invención explicado con anterioridad,
un vector, por ejemplo plasmídico, en el cual ha sido introducido un
fragmento, y por parte de ese vector, la parte del vector
recombinante que contiene el fragmento obtenido en la etapa (b) y
los elementos necesarios para la puesta en práctica de las etapas
(e) y (f).
Las etapas del proceso de la invención tienen la
ventaja que pueden ser realizadas sucesivamente sin interrupción
por el mismo operador, sobre un dispositivo automatizado que integra
cada una de las etapas, o puede ser realizado de manera discontinua,
eventualmente por operadores diferentes.
La etapa (e) de trascripción y la fase de
traducción de la etapa (f) de los fragmentos son también designados
conjuntamente reacción de Expresión Proteica In Vitro,
designada también reacción EPIV. La reacción EPIV puede ser
simultaneada, lo que significa que la fase de traducción de la etapa
(f) es realizada simultáneamente con la transcripción de la etapa
(e), o descompuesta en dos etapas distintas, (e) de transcripción y
(f) de traducción.
El desacoplamiento de las etapas (e) y (f)
permite optimizar los rendimientos de cada etapa, y de esta forma
producir cantidades más importantes de proteínas, lo que encuentra
toda su utilidad en el caso de las enzimas de poca actividad
específica.
Este desacoplamiento permite también normalizar
la formación de los productos en la etapa (f) y poder comparar
ulteriormente las diferentes funciones expresadas.
El desacoplamiento entre la transcripción de la
etapa (e) y la traducción de la etapa (f) permite igualmente evitar
problemas de degradación de la matriz ADN por las nucleasas si la
misma ha sido preparada por PCR. En efecto, los componentes de la
reacción de transcripción están menos contaminados por nucleasas,
contrariamente a los extractos de traducción.
El desacoplamiento permite además el empleo de
extractos de traducción diferentes según el origen del ADN cribado.
En efecto, la fase de traducción del transcripto en la etapa (f) es
ventajosamente realizada con un extracto de traducción del mismo
origen o de un origen cercano al de la muestra biológica sobre la
cual es practicado el proceso de la invención. De este forma se
optimiza la adecuación entre el origen de las señales de traducción
de los transcriptos y el extracto celular para una eficacia de
traducción óptima. Se puede citar a modo de ejemplo, la utilización
de un extracto de traducción de un organismo extremófilo para el
cribado de un banco de ADN del mismo organismo o de otro organismo
extremófilo (termófilo, halófilo, acidófilo, etc...) o también un
extracto de traducción de células eucariotas para el cribado de un
banco de ADN eucariota. Estos extractos respectivos son
susceptibles de mejorar la eficacia del proceso. Estos extractos son
escogidos por su capacidad de traducir los transcriptos en la etapa
(f).
El proceso de la invención es notable porque
pone en práctica una adecuación entre la puntuación de expresión de
los transcriptos de la etapa (e) y los extractos de traducción
utilizados. Estos extractos están también caracterizados ya sea
porque no contienen la propiedad investigada o porque la contienen
pero la misma no es detectable en las condiciones de pruebas
realizadas para detectar la función investigada. Se trata por
ejemplo de la utilización de un extracto de traducción que contiene
una actividad beta-galactosidasa mesófila que
permite traducir un ARNm de una beta galactosidasa termófila y la
detección de la actividad de esta última a alta temperatura, lo que
elimina la actividad beta-galactosidasa
mesófila.
En función del origen genético de los fragmentos
obtenidos en la etapa (b), por ejemplo ADN de microorganismos Gram
positivos, o negativos, de eucariotas, de virus, etc..., y de la
función probada, diferentes extractos de traducción pueden entonces
ser utilizados.
Una puesta en práctica particular del proceso de
la invención consiste en utilizar en la etapa (f) un extracto de
traducción que sea de hecho una mezcla de varios extractos de
traducción. Puede tratarse por ejemplo del extracto de traducción
de la E. coli que sobre-expresa una proteína
chaperona A mezclada con un extracto de traducción de E.
coli que sobre-expresa una proteína chaperona B.
Cualquier tipo de mezcla es posible desde el momento que
corresponda con las características descritas anteriormente. De la
misma forma, es posible utilizar un extracto de traducción en el
cual es añadido uno o varios ARNt específicos de uno o varios
codones. Los extractos de traducción de esta forma obtenidos
permiten entonces traducir los ARNm que comprenden estos codones
específicos, como por ejemplo la traducción de un ARNm que contiene
un codón ámbar agregando en el extracto de traducción uno o ARNt
supresores.
El tratamiento de la etapa (f) con un extracto
de traducción puede también ser realizado con un extracto universal
de traducción cualquiera que sea el origen de la muestra como por
ejemplo un extracto de E. coli y/o cualquier otro(s)
extracto(s) celular(es) suplemantado(s) o no
por moléculas interesantes como las indicadas anteriormente, por
ejemplo (ARNt, chaperona...).
Es igualmente posible agregar al extracto de
traducción de la etapa (f) uno o varias sustancias que favorezcan
un repliegue o una maduración más eficaz de las proteínas
expresadas, como por ejemplo las chaperonas, detergentes,
sulfobetaínas, extractos membranales, etc...
La prueba de una función de las proteínas
sintetizadas en la etapa (f) puede ser realizada por cualquier
medio apropiado que permita por ejemplo detectar la o las
actividades enzimáticas investigadas. Esta forma de puesta en
práctica será principalmente aplicada durante la investigación de
enzimas con las propiedades originales, como por ejemplo las
enzimas termostables, activas a altas temperaturas, en medio ácido,
en medio con fuerte concentración salina, etc..., a partir de una
muestra de ADN salido de organismo(s) extremófilo(s).
Estas enzimas extremófilas, a menudo activas en condiciones cercanas
a las condiciones fisiológicas de las cepas que las producen
(temperatura, salinidad, pH, etc...) son herramientas especialmente
interesantes para numerosos procesos industriales (Industria
Agroalimentaria, de la nutrición animal, del papel, de los
detergentes, de los textiles, etc...), donde las mismas pueden
sustituir a sus homólogos mesófilos.
El proceso de la invención ofrece la ventaja de
poder realizar:
- -
- una prueba de las propiedades de los transcriptos de la etapa (e), cuando estos presentan propiedades ventajosas de tipo ARNt, ribosoma, o
- -
- una prueba de las propiedades de las proteínas codificadas por dichos transcriptos.
En el caso de un ribosoma que tiene una
actividad endonucleasa por ejemplo, es posible detectar esta
actividad utilizando una matriz nucleotídica que tiene un grupo
fluorescente en una extremidad y un grupo "quencher" en la
otra. En caso de corte de la matriz por el ribosoma, el grupo
fluorescente es separado del grupo "quencher" lo que libera la
fluorescencia del primero.
En el caso de un ARNt, es posible utilizar por
ejemplo una fracción de la reacción que contenga potencialmente
este ARNt e introducirlo en una reacción de traducción in
vitro que contenga el ARNm de un gen reportero donde uno de los
codones solamente puede ser leído por el ARNt investigado. Si la
actividad del reportero es detectada, eso significa que el ARNt
estaba presente en la fracción inicial y que permitió la traducción
in vitro del ARNm del reportero.
En el marco de la puesta en evidencia de una
actividad enzimática, cualquier tipo de substrato específico puede
ser considerado por el especialista para poner en evidencia la
presencia o la ausencia de la función investigada en la etapa (f).
Cualquier(as) transformación(es) de o de los sustratos
por la o las funciones investigadas puede(n) ser
detectada(s)
por cualquier método conocido por el especialista (fluorimetría, colorimetría, absorbancia, viscosidad, etc....).
por cualquier método conocido por el especialista (fluorimetría, colorimetría, absorbancia, viscosidad, etc....).
En el caso de la puesta en evidencia de una
afinidad, es posible utilizar por ejemplo, en función de la
afinidad investigada: anticuerpos-antígenos,
proteína que fija el ADN-ADN,
receptor-ligando, etc..., pruebas tales como la
fijación de ligandos radiomarcados, una detección inmunológica que
comprende la inmovilización de un antígeno, su detección específica
con el anticuerpo investigado y la revelación de este anticuerpo
investigado gracias a un anticuerpo anti-anticuerpo
acoplado a una actividad reportera que puede ser revelada, o una
detección de un antígeno utilizando un anticuerpo de cebra fijado
sobre un soporte capaz de reconocer el antígeno, el antígeno
pudiendo ser detectado por una docena de anticuerpos de conejo
(formación de un sandwich) acoplado indirectamente o no a una
actividad reportera (tipo fosfatasa alcalina o peroxidasa).
Una forma de puesta en práctica particular del
proceso consiste en la etapa (f) en probar, en paralelo o de manera
simultaneada o no, diferentes propiedades de una misma función o
varias funciones.
De esta forma, el proceso de la invención es
notable ya que permite no solamente la detección de las funciones
potencialmente contenidas en una muestra biológica, sino
también:
- -
- su cuantificación, cuando estas propiedades lo permitan como por ejemplo actividades enzimáticas o de afinidad.
- -
- su caracterización especialmente bioquímica, como por ejemplo las condiciones óptimas de funcionamiento en temperatura, pH, concentración salina, etc..., peso molecular, secuencia proteica y eventualmente secuenciación de la secuencia polinucleotídica correspondiente.
El proceso de la invención es también notable
porque es totalmente independiente de la expresión in vivo
de las proteínas. Los hospederos celulares, tal como los
microorganismos, si son utilizados, son solamente para el
aislamiento y la amplificación de los fragmentos heterólogos. En
consecuencia, el proceso de la invención permite evitar todos los
problemas relacionados anteriormente con los métodos de clonación
por expresión del arte anterior. En particular, el proceso de la
invención encuentra todo su interés en la identificación de un gen
que expresa una proteína citotóxica. En este sentido, la molécula
vectora asociada a cada fragmento de la etapa (c) puede ser un
vector plasmídico que no permite de preferencia la expresión de
dicho fragmento in vivo. A modo de ejemplo de un vector de
este tipo se puede citar: pBR322 o pACYC184.
Ventajosamente, los fragmentos preparados en la
etapa (b) del proceso de la invención son obtenidos por la acción
de una o varias endonucleasas sobre los ácidos nucleicos de la
muestra biológica o sobre los productos de PCR de dichos ácidos
nucleicos. Estos fragmentos pueden también ser obtenidos por una
acción mecánica sobre esos ácidos nucleicos, por ejemplo por el
paso por una aguja de jeringuilla, disrupción bajo presión,
sonicación, etc....
En el modo particular de realización del proceso
de la invención donde los ácidos nucleicos de la muestra que pueden
no necesitar de fragmentación, como por ejemplo los bancos
genómicos, la etapa (b) consiste en preparar los fragmentos de esta
muestra para la etapa (c), por ejemplo por extracción, y/o
purificación y/o preparación de las extremidades para la asociación
con las moléculas vectoras, por ejemplo la inserción en el vector
plasmídico.
En una forma particular de puesta en práctica
del proceso de la invención, los fragmentos preparados en la etapa
(a) tienen un tamaño de 1 a varias decenas de kb, preferiblemente de
1 a 40 kb y ventajosamente de 1 a 10 kb cuando la muestra proviene
de un organismo procariota. De preferencia, los fragmentos
preparados en la etapa (a) tienen un tamaño del orden de 5 kb. En
efecto, el tamaño medio de un gen procariota es de alrededor de
1000 pares de bases. Utilizando fragmentos de 5000 pares de bases,
es posible obtener clones portadores del gen completo con su propio
sitio de fijación del ribosoma. En el caso donde el ADN es de origen
eucariota, el tamaño de los fragmentos preparados en la etapa (a)
es mucho más importante, ventajosamente del orden de varias decenas
a varias centenas de kilobases.
Se puede notar que los fragmentos preparados en
la etapa (a) pueden portar un operón parcial o entero.
La muestra biológica a partir de la cual son
preparados los fragmentos de la etapa (b) pueden provenir de uno o
varios organismos procariotas o de células eucariotas, o también de
virus, idénticos o diferentes. Puede tratarse por ejemplo de una
muestra de ácidos nucleicos de un microorganismo o de una mezcla de
microorganismos, o de células eucariotas de tejido o de organismos
idénticos o diferentes. Pero la muestra de ácidos nucleicos puede
igualmente estar constituida por una secuencia o por un banco de
ácido(s) nucleico(s). La muestra biológica puede
estar constituida por organismos y/o por ácidos nucleicos conocidos
o desconocidos. La muestra puede también, ventajosamente estar
constituida por ácidos nucleicos sintéticos.
En el caso de un banco de ADN eucariota, la
reacción de transcripción puede ser completada por una reacción de
splicing y de maduración in vitro de los ARNm
utilizando por ejemplo un extracto nuclear (3).
El proceso de la invención asegura una relación
directa entre la función de puesta en evidencia en la etapa (f) y
la secuencia polinucleotídica correspondiente. Entonces, en
particular, este proceso está totalmente destinado a detectar las
funciones y a identificar los genes correspondientes a partir del
ADN genómico. Se entiende por gen a un fragmento o a una secuencia
de ADN asociada a una función biológica.
Como se ha indicado anteriormente, según una
forma particular de realizar el proceso de la invención, la
molécula vectora asociada a los fragmentos de ácidos nucleicos en la
etapa (c) es un vector plasmídico. En este caso, en la etapa (c)
del proceso de la invención, cada fragmento está insertado en un
vector al nivel de un sitio de clonación o de un cassette de
restricción. Este vector plasmídico está caracterizado porque
comprende un promotor de ARN polimerasa por un lado del sitio de
clonación y eventualmente un terminador de ARN polimerasa por el
otro lado. También es posible concebir un vector que comprende un
sitio de clonación enmarcado por dos promotores de ARN polimerasa
idénticos o diferentes y eventualmente flanqueados por ambas partes
del o de los terminadores de ARN polimerasa correspondientes. Estos
promotores y eventualmente terminadores tienen preferiblemente por
característica no funcionar
en el microorganismo que puede ser utilizado para la separación de los vectores recombinantes en la etapa (d).
en el microorganismo que puede ser utilizado para la separación de los vectores recombinantes en la etapa (d).
En el caso donde el vector no posea
promotor(es) y/o eventual(es) terminador(es) de
ARN polimerasa, o en el caso donde el(los)
promotor(es) y eventual(es) terminador(es) de
ARN polimerasa no son adecuados para realizar la etapa (e),
ese(esos) promotor(es) y eventual(es)
terminador(es) pueden ser insertados en la etapa (d) del
proceso de la invención por cualquier medio apropiado. Una puesta en
práctica ventajosa de esta inserción consiste en realizar una PCR
con un juego de cebadores que portan las secuencias del(de
los) promotor(es) y terminador(es).
Según una forma de puesta en práctica particular
del proceso de la invención, el(los) promotor(es) y
eventual(es) terminador(es) son de tipo fuertes como
por ejemplo aquellos de la T7 ARN polimerasa.
En el caso, donde la molécula vectora es un
vector plasmídico, el aislamiento del vector recombinante en la
etapa (d) puede ser realizado por transformación de células
hospederas por el conjunto de los vectores recombinantes obtenidos
en la etapa (c) de manera de crear un banco de clones, y después en
este se realiza una extracción del vector o de una parte del vector
recombinante contenido por cada clon del banco por cualquier medio
apropiado.
La extracción del vector recombinante o de una
parte del vector recombinante flanqueado de promotor(es) y
de eventual(es) terminador(es) de ARN polimerasa puede
ser realizada por cualquier método conocido por el especialista,
como por mini preparación y eventualmente digestión o por PCR. Una
alternativa ventajosa consiste en realizar esta PCR con los
oligonucleótidos protegidos en 5' de los ataques de nucleósidos,
principalmente de las nucleasas contenidas en el medio de
traducción, por los grupos fosforotioatos.
Como se ha indicado anteriormente, el
aislamiento en la etapa (d) puede ser realizado por cualquier medio
físico, mecánico o químico como por ejemplo una simple dilución
extrema del conjunto de los fragmentos asociados a la molécula
vectora en la etapa (c). Pero el aislamiento puede también
ventajosamente ser realizado utilizando las propiedades de una
sustancia específica incluida en la molécula vectora, como una
molécula de anticuerpos, y el aislamiento del fragmento es
realizado utilizando la afinidad
anticuerpos-antígeno, o una biotina y el
aislamiento es realizado utilizando la afinidad
biotina-estreptavidina, etc....
Según una forma particular de puesta en práctica
del proceso de la invención, se efectúa una selección de los
fragmentos o parte de aquellos asociados cada uno a una molécula
vectora obtenida en la etapa (d). Para esto, se realiza una
reacción EPIV para cada uno de los fragmentos o parte de aquellos
asociados a una molécula vectora obtenida en la etapa (d)
incorporando en la mezcla de reacción de la fase de traducción de
la etapa (f) un marcador de síntesis proteica (ARNt biotinilado,
ácido aminado modificado, etc...). Cada producto de la reacción
EPIV es entonces analizado, por ejemplo por ELISA, para la presencia
de una proteína expresada. Los fragmentos o parte de aquellos
asociados a una molécula vectora para los cuales la reacción EPIV es
negativa son determinados. Estos fragmentos no poseen ORF sobre su
inserto. A continuación a este procedimiento de
pre-cribado, estos fragmentos son eliminados de los
cribados ulteriores de identificación de actividades ligadas a una
proteína. Tal procedimiento de pre-cribado permite
una ganancia de tiempo y de reactivos en el caso de un cribado
repetitivo, y no simultáneo del mismo banco.
Según una forma particular de puesta en
práctica, el proceso de la invención es realizado completamente
sobre un soporte sólido de tipo micro plaqueta o membrana o placa de
nanotitulación. El soporte de tipo micro plaqueta puede ser una
placa de cristal, una membrana de nitrocelulosa o cualquier otro
soporte conocido por el especialista. Los fragmentos asociados a la
molécula vectora son aislados sobre este soporte de tipo micro
plaqueta o membrana o placa de nanotitulación y los reactivos que
permiten poner en práctica el proceso de la invención son colocados
sobre este soporte. La prueba de la o de las funciones investigadas
puede ser llevada directamente sobre el soporte después de un
eventual lavado de este. En el caso donde la molécula vectora es un
vector plasmídico y donde el proceso de la invención es realizado
sobre un soporte, las colonias transformadas por los vectores
recombinantes son trasferidas separadamente unas de otras a un mismo
soporte, y después lisadas in situ (3) con el fin que cada
colonia pueda librar sobre el soporte las copias del vector
recombinante que ella contiene. Otra forma de puesta en práctica
del mismo tipo consiste en depositar separadamente unos de otros
sobre un mismo soporte cada vector o parte del vector recombinante.
Es posible entonces depositar reactivos que permitan realizar una
reacción EPIV sobre el soporte que comprende el ADN depositado según
una de las técnicas descritas anteriormente. La prueba de una
función puede ser conducida directamente sobre el soporte después de
un eventual lavado del mismo.
El proceso de la invención ofrece la ventaja con
relación a otros métodos del arte anterior de ser automatizable. En
el caso en el que la molécula vectora es un vector plasmídico, esta
automatización puede ser conducida por ejemplo de la siguiente
manera:
- -
- Cada vector recombinante del banco constituido en la etapa (c) puede ser puesto en cultivo sobre un soporte, en un pozo de micro placa por un robot de tipo Colony Picker.
- -
- Este cultivo puede servir en una etapa de extracción plasmídica realizada por un robot tipo Biorobot 9600 (QIAGEN), o en una etapa de amplificación PCR puesta en práctica por una máquina de tipo MultiProbe (PACKARD), sobre un termociclador automático de tipo PTC 200 o PTC 225 (tapa robotizada - MJ RESEARCH).
- -
- La purificación eventual de los productos PCR puede ser conducida por el autómata BioRobot9600.
- -
- La reacción EPIV de las etapas (e) y (f) puede ser totalmente dirigida por el robot MultiProbe. Las pruebas de las funciones de los transcriptos obtenidos en la etapa (d) pueden ser efectuadas sobre el robot pipeteador y la lectura de los resultados es obtenida sobre un lector correspondiente. Si la reacción de transcripción es desacoplada de la reacción de traducción, la purificación eventual de los ARNm puede ser realizada por el BioRobot 9600.
- -
- Las pruebas de actividad de las proteínas sintetizadas en al etapa (f) son efectuadas por el robot pipeteador, y la lectura de los resultados es obtenida sobre un lector (espectrofotometría, colorimetría, fluorimetría, etc..., en función de la prueba realizada) de micro placas o por cualquier otro medio apropiado.
Cualquier vector plasmídico que presenta las
características definidas anteriormente puede ser utilizado en el
proceso de la invención. Se puede citar a modo de ejemplo, un vector
representado en la figura 2 y construido a la manera siguiente:
- -
- Un origen de replicación plasmídico
- -
- Un sitio de clonación enmarcado por dos promotores idénticos, como el de la T7 ARN polimerasa, o de cualquier otro promotor fuerte de ARN polimerasa, tal como el Q\beta, T3, SP6, etc..., y eventualmente flanqueado por ambas partes por el terminador de la misma ARN polimerasa. Estos promotores y terminadores si están presentes, no funcionan preferiblemente en el microorganismo utilizado para separar los vectores recombinantes. Tal construcción permite transcribir un fragmento de ADN insertado en el sito de clonación, cualquiera que sea su sentido de inserción. La probabilidad de encontrar un buen clon es entonces multiplicada por dos. El tamaño medio de un gen procariota es de alrededor de 1000 pb. Utilizando fragmentos de ADN procariota de alrededor de 5000 pb para generar el banco, es muy probable obtener clones que porten genes completos, con su propio sitio de fijación del ribosoma (o RBS por Ribosoma Binding Site). Con este sistema de doble promotor, el gen está situado a lo peor a 2000 bases del principio del ARNm, lo que permite una expresión eficaz de la proteína correspondiente por el proceso de la invención (como reportado en la parte experimental a continuación sobre la actividad \beta-lactamasa).
- -
- Eventualmente secuencias específicas por ambas partes de los terminadores, sirviendo de sitios de hibridación para una amplificación por PCR del fragmento de ácido nucleico portado por el vector.
- -
- Un gen de selección constituido por un gen de ARNt (4). Eventualmente, en paralelo, un gen de resistencia a un antibiótico (u otro tipo de gen de selección) es insertado en el sitio de clonación. Esta selección antibiótica solamente es utilizada para la amplificación preparativa del vector de clonación. En efecto, durante la inserción de cada uno de dichos fragmentos de la etapa (c), un fragmento de ADN se sustituye en este gen de resistencia. Este sistema presenta la ventaja de no depender de una selección antibiótica, que posea problemas de contaminación y de degradación del antibiótico, y permite obtener un vector recombinante que no posee otro ORF que aquel eventualmente introducido por el fragmento heterólogo. Por otra parte, permite evaluar muy rápidamente la tasa de clones negativos, practicando una extensión paralela de una fracción del banco sobre un medio mínimo y sobre un medio que contiene el antibiótico de selección.
El proceso de la invención es notable porque
permite investigar funciones de ácidos nucleicos en las
extracciones brutas, caracterizarlas e identificar la secuencia
nucleotídica correspondiente. En efecto, evita aislar cada
microorganismo presente en esta extracción. El aislamiento de los
microorganismos contenidos en una extracción es conocido por dar
resultados limitados, ya que solamente algunos por cientos de la
diversidad de los microorganismos presentes son recuperados.
Además, el proceso de la invención ofrece una ganancia de tiempo
considerable. El método de la invención permite realizar un mejor
resultado, ya que la biodiversidad cribada es del orden del 100%,
en un plazo de 5 a 10 días. Cuando los métodos del arte anterior
permiten aislar en del orden de 5% la biodiversidad presente en una
extracción en varias semanas incluso varios meses, y otro tanto
tiempo es necesario para cribar estas cepas en vista de detectar una
actividad proteica probada. El proceso de la invención es
igualmente ventajoso para investigar las actividades proteicas en un
germen o una célula dada. Un banco genómico o de ADN puede ser
fácilmente preparado y cribado según el proceso de la invención. En
el caso de un banco de ADNc, la molécula vectora comprende una
secuencia de iniciación de la traducción en adecuación con el
extracto de traducción utilizado en la etapa (f). Además de su
rapidez, el proceso de la invención permite liberarse de la
fisiología celular. De esta manera es posible detectar las
actividades proteicas sin tener que resolver problemas de cultivo
de estados fisiológicos. El proceso de la invención permite
remontar directamente al gen a partir de la detección de una función
de un organismo. Permite también investigar una función en un
organismo que contiene potencialmente dicha función. Esta técnica
permite, gracias a su rapidez y eficacia, cribar una o varias
funciones de un gran número de organismos de una colección y por lo
tanto valorar su biodiversidad microbiológica. Este procedimiento
encontrará toda su utilidad en la identificación de actividades
proteicas con interés industrial a partir de organismos extremófilos
aislados, o también de una extracción bruta de dichos
organismos.
En fin, el proceso de la invención encuentra un
interés en el campo de la genómica. Por su concepción, permite
identificar nuevos genes sin pasar por la secuenciación en primera
etapa, ya que permite pasar directamente de la detección de una
función a la secuencia de ácido nucleico correspondiente. Aplicado a
la totalidad del ADN genómico de un organismo, el proceso de la
invención permite acceder a la caracterización del fenotipo total de
este organismo, lo que introduce la noción de "fenómico".
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán en los ejemplos de realización de la invención que siguen
y que se refieren a los diseños en anexo, en los cuales:
La figura 1 es una representación esquemática de
un ejemplo de puesta en práctica del proceso de la invención.
La figura 2 representa un ejemplo de mapa de un
vector de clonación para la construcción de un banco según el
proceso de la invención.
La figura 3 representa los mapas de las
plásmidos pADH, pTEM, pET26-Tfu2, pLIPetpGFP
utilizados en el marco de los ejemplos de realización del proceso de
la invención.
La figura 4 representa la actividad de la
inteina 2 de una ADN polimerasa de Thermococcus
fumicolans (Tfu) producida in vivo por clonación de
expresión. Pista 1: escala 1Kb. Pista 2: reacción sin enzima. Pista
3: reacción con inteina 2.
La figura 5 representa la actividad de la GFP
producida por reacción EPIV (emisión de fluorescencia seguida de una
exposición a alrededor de 400 nm) con extractos de traducción
mesófila. Tubo A: reacción EPIV con agua (testigo). Tubo B: reacción
EPIV con el vector pGFP.
La figura 6 representa la actividad de la
inteina 2 de la Tfu ADN polimerasa producida por reacción EPIV con
los extractos de traducción de tipo mesófilo. Pista 1: escala 1Kb.
Pista 2: T-(reacción sin enzima). Pista 3: Blanco (reacción con
extracto EPIV sin ADN). Pista 4: T+(reacción con inteina 2 producida
in vivo). Pista 5: Ensayo (reacción con inteina 2 producida
por EPIV (pET26-Tfu2)).
La figura 7 representa la detección de la
actividad de una enzima termófila utilizando un extracto de
traducción mesófilo que contiene dicha actividad. Tubo A: reacción
EPIV con agua (testigo) incubada a 37ºC, Tubo B: reacción EPIV
incubada a 37ºC, Tubo C: reacción EPIV con agua (testigo) incubada a
70ºC después de la centrifugación, Tubo D: reacción EPIV incubada a
70ºC después de la centrifugación.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pET26b+ es parte de la familia de los
vectores pET desarrollado por Studier y Moffatt (8) y
comercializado por la sociedad NOVAGEN. Este vector permite expresar
los genes bajo el control del promotor del fago T7. El vector
PINPOINT^{TM} (PROMEGA) porta el gen cat (que codifica para la
cloranfenicol acetil-transferasa) bajo control del
promotor de la ARN polimerasa del fago T7. El vector
pHS2-22-21 fue construido
introduciendo por PCR inversa el sitio de corte reconocido por la
inteina 2 de la Tfu ADN polimerasa posicionada en el sitio de
policlonación del plásmido pUC19. El vector
pHS2-22-21 corresponde a pUC 19 que
contiene el homing site (43 pb) de la inteina o el sitio en
el cual el gen de inteina está insertado.
La cepa XL1-Blue
[Tn10proA^{+}B^{+}lacl^{q}
\Delta(lacZ)M15/recA1 endA1
gyrA96(NAl^{r})thi
hsdR17(r_{k}^{-}m_{k}^{+})supE44 relA1 lac] fue
empleada para la amplificación del ADN plasmídico.
\vskip1.000000\baselineskip
Las enzimas de restricción y de modificaciones
reportadas en la tabla I abajo, han sido utilizadas según las
recomendaciones de los proveedores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los tampones utilizados están descritos en la
tabla II abajo.
El gen de la inteina 2 de la Tfu ADN polimerasa
(itfu2) (número de acceso en el Genbank: Z69882) ha sido insertado
entre los sitios de restricción Nde I y Sal I del
vector pET26b+ con el fin de crear el plásmido
pET26-Tfu2 representado en la figura 3. De la misma
forma, el gen de la alcohol deshidrogenasa (adh) de
Thermococcus hydrothermalis ha sido insertado entre los
sitios de restricción Nde I y Bam HIdel vector
pET26B+ para crear el vector pADH, y los genes de la
\beta-lactamasa TEM-1 (bla)
de Escherichia coli (9), y de la Green Fluorescent Protein
(gfp) de Aequorea victoria (6) y de la lipasa B de
Candida antarctica (lipB) (número de acceso Y14015 en el
Genbank) han sido insertados respectivamente entre los sitios de
restricción Nde I y Eco RI del vector pET26b+, para
crear los plásmidos pADH, pTEM, pGFP y pLIP representados en la
figura 3. Para cada uno de estos cuatro genes, el sitio de
restricción Nde I está superpuesto con el codón ATG de la
iniciación de la traducción.
Cada construcción fue verificada por varios
análisis del perfil de restricción. 200 \mul de células
XL1-Blue quimiocompetentes (1) fueron transformadas
con 10 ng de cada plásmido por un choque térmico (2), y las células
de esta forma transformadas fueron extendidas sobre medio LB sólido
que contiene 60 \mug/ml de canamicina y 12,5 \mug/ml de
tetraciclina. A partir de un clon de cada una de estas
transformaciones, una maxipreparación de ADN plasmídico fue
realizada con una colonia de tipo TIP100(QIAGEN). Después de
la precipitación en el isopropanol, cada ADN plasmídico fue
repuesto en 100 \mul de tampón T. La concentración de estos ADN
plasmídicos fue evaluada por una dosificación espectrofotométrica a
260 nm). La pureza de cada ADN plasmídico fue verificada
depositando 0,2 \mul de cada uno de los vectores sobre gel de
agarosa TBE 1%.
- -
- pTEM: 200 \mul de células BL21 DE3 (pLysS) quimiocompetentes fueron transformadas con 10 ng del plásmido pTEM por un choque térmico, y las células de esta forma transformadas fueron extendidas sobre medio LB sólido que contiene 60 \mug/ml de canamicina, 20 \mug/ml de cloranfenicol, 32 \mug/ml de IPTG y 100 \mug/ml de ampicilina. Después de una noche de incubación a 37ºC, colonias muy numerosas pudieron ser observadas sobre la caja de Pétri, revelando de esta manera que el gen TEM-1 del plásmido pTEM es expresado y funcional, y le confiere una resistencia a la ampicilina.
- -
- pGFP: 200 \mul de células BL21 DE3 (pLysS) quimiocompetentes fueron transformadas con 10 ng del plásmido pGFP por un choque térmico, y las células de esta manera transformadas fueron extendidas sobre medio LB sólido que contiene 60 \mug/ml de canamicina, 20 \mug/ml de cloranfenicol y 32 \mug/ml de IPTG. Después de una noche de incubación a 37ºC, colonias muy numerosas pudieron ser observadas sobre la caja de Pétri. La totalidad de estas colonias reaccionaron a una excitación a los rayos ultravioletas (alrededor de 400 nm) emitiendo una luz fluorescente verde, lo que permitió verificar que el gen gfp del plásmido pGFP es expresado y funcional
- -
- pET26-Tfu2: 200 \mul de células BL21 DE3 (pLysS) quimiocompetentes fueron transformadas con 10 ng del plásmido pET26-Tfu2 por un choque térmico y las células de esta manera transformadas fueron extendidas sobre medio LB sólido que contiene 60 \mug/ml de canamicina y 20 \mug/ml de cloranfenicol. Un cultivo realizado a partir de un clon de esta transformación fue inducido a DO_{600nm}= 0,5 con 0,5 mM de IPTG durante dos horas a 37ºC. Después de la centrifugación, el residuo bacteriano fue retomado en el tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,5 y la lisis celular fue obtenida gracias a varios ciclos de congelación/descongelación. La inteina 2 fue seguidamente purificada sobre una colonia QFast-Flow con un gradiente de NaCl. La actividad de esta enzima fue probada según el protocolo siguiente: 1 \mul de la fracción de elusión más concentrada en enzima pura fue diluida cien veces. Un \mul de esta dilución fue incubado 15 minutos a 70ºC con 3 \mul de tampón IT2 y 220 ng del plásmido pHS2-22-21, linearizado con la enzima de restricción Sca I, en un volumen final de 30 \mul. 15 \mul de esta mezcla de digestión fueron depositados sobre un gel de agarosa TBE 1%. Después de la migración y coloración con bromuro de etidium, el gel fue expuesto a los rayos ultravioletas. Como muestra la figura 4, el análisis de este gel revela la presencia de dos bandas de respectivamente 934 pb y 1752 pb, correspondientes al corte del vector pHS2-22-21 (linearizado Sca I) por la inteina 2. El gen itfu2 del plásmido pET26-Tfu2 es entonces expresado y su producto, la inteina 2, está activa.
- -
- pADH: 200 \mul de células BL21 DE3 (pLysS) quimiocompetentes fueron transformadas con 10 ng del plásmido pADH por un choque térmico, y las células de esta manera transformadas fueron extendidas sobre medio LB sólido que contiene 60 \mug/ml de canamicina y 20 \mug/ml de cloranfenicol. Un cultivo realizado a partir de un clon de esta transformación fue inducido a DO_{600nm}=0,6 con 1 mM de IPTG durante tres horas a 37ºC. Después de la centrifugación, el residuo bacteriano fue retomado en el tampón de fosfato de sodio 50 mM-MgCl_{2} 10 mM pH 8,0 y la lisis celular fue obtenida incubando 30 minutos sobre el hielo en presencia de 1 mg/ml de lisozima, 10 \mug/ml de RNAsa A y 100 \mug/ml de DNAsa I. El sobrenadante de centrifugación de esta etapa de extracción fue incubado 30 minutos a 50ºC, y centrifugado de nuevo. El sobrenadante de esta última etapa sirvió de extracto enzimático por las dosificaciones de actividad. Un testigo negativo fue constituido en paralelo realizando una extracción similar sobre un cultivo de células BL21 DE3 (pLysS) que no porta ningún plásmido. La actividad alcohol deshidrogenasa fue probada siguiendo espectrofotométricamente la cinética de reducción del NADP en NADPH a 340 nm. Para esto, 10 \mul del extracto enzimático o del testigo, fueron incubados a 50ºC durante 5 minutos con 500 \mul de tampón TADH y 490 \mul de agua. En estas condiciones, una actividad de 15,6 UDO/min/ml de extracto enzimático fue detectada, contra 0 UDO/min/ml para el testigo. El gen adh del plásmido pADH es entonces expresado y su producto, la alcohol deshidrogenasa, está activa.
\vskip1.000000\baselineskip
4 \mug de cada vector fueron precipitados en
presencia de un décimo de volumen de acetato de sodio 3M pH 6,0 y
de dos volúmenes de etanol absoluto glacial. Los residuos de
precipitación fueron enjuagados en etanol a 70% para eliminar toda
traza de sales. Cada ADN precipitado fue resuspendido en 4 \mul de
tampón T.
Este ADN es incubado dos horas a 37ºC en una
mezcla de expresión proteica in vitro que contiene 0,1 mM de
cada uno de los 20 ácidos aminados, 20 \mul de extracto "S30
Premix" y 15 \mul de "T7 S30 extracto" (PROMEGA) en un
volumen final de 50 \mul. Los extractos "S30 Premix" y "T7
S30 extracto" contienen todos los elementos necesarios para una
reacción de transcripción in vitro acoplada a una reacción de
traducción, principalmente: T7 ARN polimerasa, CTP, UTP, GTP, ATP,
ARNts, EDTA, ácido fólico y sales apropiadas. El extracto de
traducción fue realizado según el procedimiento descrito por Zubay
(10) a partir de una cepa de Escherichia coli B deficiente
en endoproteinasa OmpT y en proteasa Ion, lo que asegura una mejor
estabilidad de las proteínas expresadas in vitro.
Un testigo negativo fue constituido incubando
agua estéril ultra pura en lugar del ADN en la mezcla de
transcripción-traducción. El testigo positivo fue
concebido incubando 2 \mug del plásmido PINPOINT^{TM}.
Las reacciones EPIV fueron conservadas sobre el
hielo hasta que la actividad enzimática de cada muestra pudo ser
evaluada.
La figura 5 muestra el tubo que contiene el
producto de la reacción EPIV con el vector pGFP que fue expuesto a
los rayos ultravioletas a alrededor de 400 nm, al lado del tubo que
contiene la reacción testigo. Sólo el tubo que contiene la reacción
EPIV del plásmido pGFP emitió una luz fluorescente verde. La
reacción EPIV permitió entonces la producción de una proteína GFP
que tiene una actividad fluorescente.
La actividad \beta-lactamasa
fue evaluada siguiendo espectrofotométricamente la cinética de
degradación de la nitrocefina, una cefalosporina cromogénica, a 486
nm (5). Para esto 5, 10 o 20 \mul de la reacción EPIV con el
vector pTEM son incubados 2 minutos a 37ºC en el tampón BETA qsp 1
ml. La actividad media de la reacción EPIV con el vector pTEM pudo
ser estimada en 8,9 UDO/min/ml de extracto, contra 0,6 UDO/min/ml de
extracto con la reacción EPIV testigo. La reacción de expresión
proteica in vitro permitió entonces la síntesis de una
\beta-lactamasa activa, capaz de degradar la
nitrocefina in vitro.
El vector testigo PINPOINT^{TM} porta el gen
bla bajo el control de su promotor endógeno. Sin embargo, la
actividad \beta-lactamasa de la reacción EPIV con
este vector fue probada y evaluada a 6 UDO/min/ml de extracto.
Conviene remarcar que la adición de rifampicina a 1 ng/\mul,
inhibidor de la ARN polimerasa de E. coli, no modifica
significativamente la expresión in vitro de la
\beta-lactamasa con el vector PINPOINT^{TM}. El
gen bla del vector PINPOINT^{TM}, situado a 2123 pb río
abajo del promotor T7 es entonces transcripto y traducido
eficazmente. Esto implica que un gen situado a 2000 pb río abajo de
un promotor T7 es eficazmente transcripto y traducido durante una
reacción EPIV.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción EPIV con el vector
pET26-Tfu2 fue probada con el fin de saber si una
inteina 2 activa podía ser producida. Para esto, 5 \mul de esta
reacción EPIV fue incubada 20 minutos a 70ºC con 220 ng del vector
pHS2-22-21, linearizado por
Sca I, y 3 \mul de tampón IT2 en un volumen final de 30
\mul. Un testigo negativo fue constituido reemplazando los 5
\mul de la reacción EPIV por agua. El testigo positivo contenía 1
\mul de la fracción purificada de inteina 2 producida in
vitro diluida en 1/100. En fin, un testigo de especificidad fue
realizado incubando 5 \mul de la reacción EPIV que no ha recibido
ADN.
Después de la incubación, los cuatro ensayos
experimentaron una extracción en fenol-cloroformo y
una precipitación en etanol absoluto, seguido de un enjuague con
etanol a 70% con el fin de eliminar las sales. Cada residuo de
precipitación fue retomado en 10 \mul de tampón T, y 8 \mul
fueron depositados sobre un gel de agarosa TBE 1%. Después de la
migración y coloración con bromuro de etidium el gel fue expuesto a
los rayos ultravioletas para analizar los perfiles de restricción.
La aparición de bandas a 934 y 1752 pb sobre la pista 5 de la
figura 6, idénticas a las bandas de la pista 4 (testigo positivo)
revela que la inteina 2 es bien producida por la reacción EPIV, y
que esta enzima está activa. Además, la reacción EPIV es específica
ya que ninguna banda de digestión puede ser observada sobre el
testigo de la pista 3.
La actividad alcohol deshidrogenasa fue probada
siguiendo espectrofotométricamente la cinética de reducción del
NADP en NADPH a 340 nm. Para esto, 5, 10 o 15 \mul de la reacción
EPIV con el vector pADH, o sin ADN, fueron incubados a 50ºC durante
cinco minutos con 500 \mul de tampón TADH en un volumen final de
1ml. En estas condiciones, la actividad media de la reacción EPIV
con el vector pADH fue estimada en 2,3 UDO/min/ml de extracto,
contra 0,32 UDO/min/ml de extracto para el testigo (reacción EPIV
con el agua). El ADH de Thermococcus Hydrothermalis (número
de acceso Y14015 en el Genbank) fue entonces producido bajo forma
activa durante la reacción EPIV.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad lipasa fue probada siguiendo
espectrofotométricamente la cinética de degradación de un lípido
cromogénico
(1,2-0-dilauryl-rac-glycero-3-glutaric
acid-resorufin ester) a 572 nm. Para esto, 5 \mul
de la reacción EPIV con el vector pLIP, o sin ADN fueron incubados a
70ºC durante quince minutos en el tampón de reacción en presencia
de 100 \mug de sustrato. En estas condiciones, la actividad de la
reacción EPIV con el vector pLIP fue estimada en 0.50 UDO/min/ml de
extracto contra 0.04 UDO/min/ml de extracto para el testigo. La
lipasa B de Candida antartica (organismo eucariota) fue
entonces producida bajo forma activa durante la reacción EPIV.
El gen de la beta-galactosidasa
de Thermotoga neapolitana fue insertado en un vector que
contiene el promotor de transcripción de la T7 RNA polimerasa. El
vector de esta forma obtenido fue utilizado para realizar una
reacción EPIV con un extracto de traducción de una cepa de E.
coli que posee una actividad
beta-galactosidasa. En paralelo, una reacción EPIV
sin ADN fue efectuada. Incubando a 37ºC una fracción de cada una de
las reacciones EPIV en presencia de Xgal a 37ºC en un tampón de
fosfato de sodio (50 mM, pH 7), los dos tubos se tornaron azules en
algunos minutos (cf figura 7 tubos A y B). Incubando una fracción de
cada una de las reacciones EPIV en presencia de Xgal en las mismas
condiciones pero a 70ºC, sólo el tubo correspondiente a la reacción
EPIV con el plásmido que codifica para la
beta-galactosidasa termófila se tornó azul (cf
figura 7 tubos C y D: estos dos tubos fueron centrifugados para
manchar las proteínas del extracto de traducción mesófilo que
precipitaron seguidamente a su desnaturalización térmica durante la
prueba de actividad a 70ºC). La actividad
beta-galactosidasa mesófila no es ya detectable a
esta temperatura (desnaturalización térmica de la
beta-galactosidasa mesófila). Es entonces posible
utilizar un extracto de traducción que contiene una propiedad
similar a la propiedad investigada si esta propiedad no es
detectable en las condiciones de detección de la propiedad
investigada.
\vskip1.000000\baselineskip
Extractos de traducción de otros organismos y en
particular de organismos extremófilos pueden ser preparados a
partir de células según uno de los procedimientos descritos por
Zubay (1973) (10) o por Pratt (1984) (7). Las velocidades de
centrifugación, las condiciones de ruptura de las células y los
diferentes tampones de preparación o de reacción serán ajustadas
para cada tipo de extracto de traducción por ensayos sistemáticos.
Realizando de esta manera una gama de extractos de traducción se
hace posible traducir un gen cualquiera que sea su origen genético:
el proceso de la invención permite entonces tener una adecuación
entre el sistema de traducción y la puntuación de expresión del gen
que codifica para la propiedad investigada.
\vskip1.000000\baselineskip
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for transformation of Escherichia coli, dans DNA cloning: a
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suppressor genes: tRNAPheCUA y tRNACysCUA, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 83, 6548-6552.
5) O'Callaghan C.H., Morris A.,
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for detection of beta-lactamases by using a
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6) Prasher D.C., Eckenrode V.K.,
Ward W.W., Prendergast F.G y Cormier M.J.,
1992, Primary structure of the Aequorea victoria
green-fluorescent protein, Gene, 111,
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7) Pratt J.M., 1984, Coupled
transcription-translation in prokaryotic
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practical approach, Hames B.D. y Higgins S.J., Eds, JRL
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9) Sutcliffe J.G., 1978,
Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of
Eschericchia coli plasmid pBR322, Proc. Natl. Acad.
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10) Zubay G., 1973, In
vitro synthesis of protein in microbial system, Ann. Rev.
Genet., 7, 267-287.
Claims (33)
1. Proceso de cribado de una muestra biológica
que contiene ácidos nucleicos, caracterizado porque comprende
las etapas siguientes:
- a)
- la determinación de la función a cribar,
- b)
- la preparación de fragmentos de ácido nucleico a partir de dicha muestra,
- c)
- la asociación de cada uno de dichos fragmentos con una molécula vectora,
- d)
- el aislamiento de cada fragmento asociado con una molécula vectora o con una parte de cada construcción constituida por un fragmento asociado con una molécula vectora, de la etapa (c)
- e)
- el tratamiento en un sistema acelular de cada fragmento asociado con una molécula vectora o con una parte de cada construcción constituida por un fragmento asociado con una molécula vectora de la etapa (d) para obtener transcriptos,
- f)
- la prueba de la función determinada en la etapa (a) de los transcriptos obtenidos en la etapa (e) o de las proteínas para las cuales codifican después de la traducción de dichos transcriptos.
2. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la etapa (f) comprende el tratamiento de
los transcriptos obtenidos en la etapa (e) in vitro con un
extracto celular que permite su traducción en proteína, y después la
prueba de una función de dichas proteínas por cualquier medio
apropiado.
3. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra
corresponde a una extracción bruta.
4. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra
biológica comprende uno o varios organismos.
5. Proceso según la reivindicación 4,
caracterizado porque los microorganismos de la muestra no son
aislados.
6. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los ácidos
nucleicos de la muestra son desconocidos.
7. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque un banco de ADN
genómico es preparado en la etapa (b).
8. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado porque un banco de
ADNc es preparado en la etapa (b).
9. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
molécula vectora está compuesta por una o varias secuencias
polinucleótidas que comprenden al menos un promotor de transcripción
para la etapa (e) y eventualmente una sustancia que facilita el
aislamiento del fragmento en la etapa (d).
10. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
molécula vectora está compuesta por dos secuencias polinucleótidas
que comprenden cada una al menos un promotor de transcripción cada
una de estas secuencias estando asociadas a una extremidad de uno de
los fragmentos obtenidos en la etapa (b).
11. Proceso según una de las reivindicaciones 9
o 10, caracterizado porque el o los promotores de
transcripción portados por la molécula vectora son de tipo
fuerte.
12. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa
(e) de transcripción es realizada simultáneamente o no con la
traducción de la etapa (f).
13. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 12, caracterizado porque el extracto de
traducción no presenta la función probada en la etapa (f), o la
presenta pero entonces no es detectable en las condiciones de la
prueba realizada en dicha etapa (f).
14. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 13, caracterizado porque el extracto de
traducción es una mezcla de varios extractos que poseen
características diferentes.
15. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 14, caracterizado porque el extracto de
traducción está complementado por uno o varios ARNts presentes en
poca cantidad o ausente del extracto utilizado, y/o una o varias
sustancias que favorecen un repliegue o la maduración más eficaz de
las proteínas expresadas.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 15, caracterizado porque el extracto de
traducción es un extracto universal de traducción cualquiera que sea
el origen de la muestra.
17. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
traducción del transcripto en la etapa (f) es realizada con un
extracto de traducción del mismo origen o de un origen cercano al de
la muestra biológica.
18. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la etapa
(f) consiste en probar la función de los transcriptos como ribosoma
o ARNt.
19. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la etapa (f)
consiste en probar la función de las proteínas traducidas de dichos
transcriptos para una actividad enzimática o una afinidad.
20. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa
(f) consiste en probar en paralelo o de manera simultánea diferentes
propiedades de una misma función o varias funciones.
21. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
molécula vectora asociada a cada fragmento de la etapa (c) es un
vector plasmídico que preferiblemente no permite la expresión de
dicho fragmento in vivo.
22. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
promotores y eventuales terminadores no funcionan en el
microorganismo utilizado para la separación de los vectores
recombinantes en la etapa (d).
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los
fragmentos preparados en la etapa (b) tienen un tamaño de 1 a varias
decenas de kb, preferiblemente de 1 a 40 kb y ventajosamente de 1 a
10 kb cuando la muestra biológica proviene de un organismo
procariota.
24. Proceso según la reivindicación 23,
caracterizado porque los fragmentos preparados en la etapa
(b) pueden portar un operón parcial o entero.
25. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque los fragmentos
preparados en la etapa (b) tienen ventajosamente un tamaño del orden
de varias decenas a varias centenas de kilobases en el caso de un
organismo eucariota.
26. Proceso según la reivindicación 25,
caracterizado porque la muestra biológica es un banco de ADN
euraciota y porque la reacción de transcripción de la etapa (e) es
completada por una reacción de splicing y de maduración in
vitro de los ARNm utilizando un extracto nuclear.
27. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
molécula vectora asociada a los fragmentos de ácido nucleico en la
etapa (c) es un vector plasmídico, y porque en la etapa (c) cada
fragmento es insertado en un vector al nivel de un sitio de
clonación o de un cassette de restricción, dicho vector plasmídico
comprendiendo:
- -
- un promotor de ARN polimerasa por un lado del sitio de clonación y eventualmente un terminador de ARN polimerasa por el otro lado, o
- -
- un sitio de clonación enmarcado por dos promotores de ARN polimerasa idénticos o diferentes y eventualmente flanqueados por ambas partes del o de los terminadores de ARN polimerasa correspondientes.
28. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra
biológica proviene de uno o varios organismos procariotas o células
eucariotas, o también de virus, idénticos o diferentes.
29. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque la muestra
biológica está constituida por una secuencia o por un banco de
ácidos nucleicos sintéticos.
30. Proceso según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque el aislamiento del vector
recombinante en la etapa (d) es realizado por transformación de
células hospederas por el conjunto de vectores recombinantes
obtenidos en la etapa (c) de manera de crear un banco de clones, y
después porque se realiza una extracción del vector o de una parte
del vector recombinante contenido por cada clon del banco por
cualquier medio apropiado.
31. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es
realizado completamente sobre un soporte sólido de tipo micro
plaqueta o membrana o placa de nanotitulación.
32. Utilización del proceso según cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, para la identificación de un
fragmento de ácido nucleico que codifica para el transcripto o la
proteína que posee la función determinada.
\newpage
33. Utilización según la reivindicación 32,
caracterizada porque comprende una etapa suplementaria de
secuenciación de un fragmento de ácido nucleico que codifica para el
transcripto o la proteína que posee la función determinada.
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