CN117925915A - 一种基于RPA CRISPR Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法 - Google Patents
一种基于RPA CRISPR Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925915A CN117925915A CN202410268353.3A CN202410268353A CN117925915A CN 117925915 A CN117925915 A CN 117925915A CN 202410268353 A CN202410268353 A CN 202410268353A CN 117925915 A CN117925915 A CN 117925915A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rpa
- rhabdovirus
- primer
- cas12a
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241001035748 Paralichthys olivaceus rhabdovirus Species 0.000 title claims abstract description 15
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 44
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 36
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 36
- 241000148627 Hirame novirhabdovirus Species 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 29
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 241000269979 Paralichthys olivaceus Species 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 claims description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010009 beating Methods 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 6
- XRZVNIXEBCWMJE-UHFFFAOYSA-N ethanol;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.CCO XRZVNIXEBCWMJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 6
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 241000157468 Reinhardtius hippoglossoides Species 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 13
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 241000711804 Infectious hematopoietic necrosis virus Species 0.000 description 2
- 241000711825 Viral hemorrhagic septicemia virus Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 1
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013079 data visualisation Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法，属于鱼类病理分子诊断技术领域。所述试剂盒，包括crRNA、RPA引物、逆转录酶、Cas12a蛋白、ssDNA探针；所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述检测方法基于重组酶聚合酶扩增结合CRISPR‑Cas12a技术。本发明通过RPA扩增及Cas12a识别可双重特异的对牙鲆弹状病毒进行检测，特异性强，灵敏度可低至8.7拷贝/ul，远高于常规PCR，可以在感染潜伏期检测出牙鲆弹状病毒，从而对牙鲆弹状病毒病进行防治。本发明具有可视化，操作简单的优点，可直接通过肉眼观察试纸条显色结果来判定检测结果，特别适合于在水产现场推广应用。
Description
技术领域
本发明属于鱼类病理分子诊断技术领域，尤其涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系构建的牙鲆弹状病毒检测试剂盒和检测方法。
背景技术
牙鲆弹状病毒（Hirame novirhabdovirus, HIRRV）是一种具有囊膜不分段的单股负链RNA病毒，可引起牙鲆等多种海淡水鱼类病害的重要病毒性病原。HIRRV具有传播性强，病程短，致死率高的特点，是牙鲆养殖过程中最常见的疾病之一，给牙鲆养殖业造成了严重危害，同时也给全球的鱼类养殖业带来了潜在威胁。因此，牙鲆弹状病毒病的快速诊断，可帮助养殖户及时采取相应防控措施，有效控制疾病的暴发和流行，降低养殖风险。
准确灵敏的分子生物学诊断技术对于HIRRV病的早期诊断具有重要意义，对及时遏制该病的暴发与流行至关重要。目前，已报道的HIRRV分子检测方法主要包括一步逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、巢式RT-PCR及RT-qPCR等。但这些方法仍需依赖PCR仪、荧光定量PCR仪等设备，实验操作繁琐、耗时较长，且结果判定不够直观，因此不便在水产现场推广应用。针对病原蛋白的胶体金检测技术虽然可以实现养殖现场的便捷检测，但受限于其灵敏度，当宿主携带低病毒载量时，该技术方法不易检出。HIRRV在牙鲆体内具有潜伏感染的特性，鱼体往往会处于带毒不发病的状态，当环境条件恶化及鱼体免疫力下降时，病毒仍具增殖暴发风险，因此开发一种操作便捷、检测灵敏度高的HIRRV检测方法对于牙鲆弹状病毒病的防治具有重要价值。
近年来，针对人、猪、牛等大型哺乳动物疾病的超高灵敏度快速检测技术的开发与应用已较为成熟，主要是基于重组酶介导的聚合酶扩增技术（RPA）或成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白检测技术（CRISPR-Cas）对组织液加以检测，从而获取直观、极灵敏的检测结果，具有灵敏度超高、简便快捷、价格低廉等一系列优点，在实际检测过程中对仪器的依赖度低，可成功检测潜伏期感染状态，上述技术联用后可进一步提升病原检测灵敏度；此外结合侧向流层析技术（LFD）使检测结果可视化后，可根据显色情况直接判读结果，因此极其适用于养殖现场、基层单位灵敏快速稳定的诊断。
但目前尚无针对HIRRV的CRISPR-Cas检测方法报道，无法解决HIRRV检测技术兼顾检测灵敏度与便捷性的困局，以及同时适用于现场的可视化检测的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是构建一种现场、快速、灵敏的基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法及检测试剂盒，在实现病毒高灵敏检测的基础上，同时具有检测结果肉眼可判的便捷性，可满足HIRRV潜伏感染及鱼体低载量携带病毒的检测需求。
本发明首次将RPA与CRISPR技术联合应用于HIRRV的检测，同时结合运用侧向流层析技术，该检测体系在大大提升病毒检测灵敏度的同时，还可实现场检测结果肉眼可判，突破了以往HIRRV检测技术难以兼顾检测灵敏度与便捷性的困局。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
首先，本发明提供了一种检测牙鲆弹状病毒的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
其次，本发明提供了一种检测牙鲆弹状病毒的试剂盒，包括所述的crRNA、RPA引物、逆转录酶、Cas12a蛋白、ssDNA探针；
所述RPA引物为Primer-F-RPA和Primer-R-RPA，Primer-F-RPA核苷酸序列如SEQID NO.6所示，Primer-R-RPA核苷酸序列如SEQ ID NO.9 所示。
所述ssDNA探针的核苷酸序列为FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin。
最后，本发明还提供一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品总RNA；
（2）以步骤（1）中的总RNA为模板，利用所述RPA引物进行等温扩增反应，得到RPA扩增产物；
（3）利用步骤（2）获取的RPA扩增产物，以及Cas12a蛋白、ssDNA探针、所述的crRNA分子在CRISPR-Cas12a反应体系里反应，获得反应体系溶液；
（4）对步骤（3）的反应体系溶液进行试纸条检测，当试纸条T线显色，则表示待测样品HIRRV病毒阳性，当试纸条只有C线显色，则表示待测样品HIRRV病毒阴性。
步骤（1）所述提取待测样品总RNA包括如下步骤：1、取2mm左右的牙鲆脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶DEPC水；2、加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶K和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min；裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；3、将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；4、向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；5、向病毒核酸吸附柱中加入750μl的Tris-HCl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；6、重复步骤5；7、将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；8、将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶DEPC水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总RNA。
步骤（2）所述等温扩增反应体系包括：RPA缓冲液29.5μl，Primer-F-RPA 2.4μl，Primer-R-RPA 2.4μl，ddH2O 8.2μl，含有基因组RNA的样品上清液4μl，MgOAc 2.5μl和逆转录酶（M-MuLV）0.5μl，总体积为50.5μl，于40℃反应32min。
步骤（3）所述CRISPR-Cas12a反应体系包括：ssDNA探针2μl，缓冲液2μl，crRNA2μl，Cas12a蛋白2μl，RPA扩增产物4μl，ddH2O 8μl，总体积为20μl，于37℃反应15min。
本发明还提供了所述的检测方法在牙鲆弹状病毒病诊断中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明首次设计出识别牙鲆弹状病毒N基因组的crRNA，该crRNA具有高度特异性。
（2）本发明基于重组酶聚合酶扩增结合CRISPR-Cas12a技术，具有超高灵敏度及特异性的特点，对不同拷贝数HIRRV N基因片段的检测结果表明，灵敏度可低至8.7拷贝/μl，检测灵敏度远高于常规PCR，可以在感染潜伏期检测出牙鲆弹状病毒，从而对牙鲆弹状病毒病进行防治。
（3）本发明具有可视化，操作简单的优点，可直接通过肉眼观察试纸条显色结果来判定检测结果，特别适合于在水产现场推广应用。
附图说明
图1 是本发明crRNA筛选结果图。
图2 是本发明RPA引物筛选结果图。
图3是本发明RPA反应温度优化结果图。
图4是本发明RPA反应时间优化结果图。
图5是本发明的检测方法与PCR对样品的检测对比结果图。
图6是本发明检测方法的灵敏度检测结果图。
图7是本发明检测方法的特异性检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1：基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法
1、溶液制备：
溶液A：RPA缓冲液29.5μl，Primer-F-RPA 2.4μl，Primer-R-RPA 2.4μl，ddH2O 8.2μl和逆转录酶（M-MuLV）0.5μl，总体积为43μl；
其中，Primer-F-RPA核苷酸序列具体为：TCTCTGCATGAAGTCCATCATCGACTCTGCCAGGAG（SEQ ID NO.6），Primer-R-RPA核苷酸序列具体为：TTCTCATTGATCCCGTAGGACTTGAAGTACCCATC（SEQ ID NO.9）。
溶液B：ssDNA探针2μl，CRISPR反应缓冲液2μl，crRNA 2μl，Cas12a蛋白2μl，ddH2O8μl，总体积为16μl；
其中，ssDNA探针的核苷酸序列为FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin；crRNA的核苷酸序列为：TAATTTCTACTAAGTGTAGATCGGTCATGTCCTCGACGTCT（SEQ ID NO.1）。
2、样本总RNA的提取
（1）取2mm左右牙鲆的脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶DEPC水；（2）加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶K和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min。裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；（3）将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；（4）向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；（5）向病毒核酸吸附柱中加入750μl的Tris-HCl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；（6）重复步骤（5）；（7）将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；（8）将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶DEPC水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总RNA。
3、RPA恒温扩增
（1）取5μl步骤2中的离心液和2.5μl MgOAc（终浓度为14mM，由试剂盒提供）加入步骤1中制备的溶液A中，混匀；
（2）手持或置于简易40℃培养箱中孵育32min，得RPA扩增产物。
4、数据可视化
（1）取4μl步骤3的RPA扩增产物加入步骤1溶液B中，混匀；
（2）手持或置于37℃简易培养箱中孵育15min，得反应体系溶液；
（3）吸取5μl反应后的溶液加到65μl的H2O混匀，将试纸条插到混匀后的溶液，反应5min后，当试纸条T线显色，则表示待测样品HIRRV病毒阳性，当试纸条只有C线显色，则表示待测样品HIRRV病毒阴性。
实施例2：crRNA的筛选
1、crRNA设计
从NCBI下载所有HIRRV N基因的序列，并通过Bioedit分析HIRRV N基因的恒定区域。crRNA设计要求在核酸序列的5'端具有PAM序列（TTTV），根据crRNA设计要求在恒定区设计5条crRNA。设计得到5条crRNA序列如SEQ ID NO.1-5。
2、具有HIRRV的脾脏组织总RNA的提取
（1）取2mm左右牙鲆的脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶DEPC水；（2）加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶K和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min。裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；（3）将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；（4）向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液。（5）向病毒核酸吸附柱中加入750μl的Tris-HCl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；（6）重复步骤（5）；（7）将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；（8）将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶DEPC水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总RNA。
3、将待测基因组反转后进行PCR扩增
将提取脾脏组织的RNA，利用随机引物反转成cDNA作为模板，以设计的特异性引物扩增包含crRNA识别序列的PCR产物，引物序列如SEQ ID NO.12-13，PCR产物的凝胶电泳结果如图1A所示，分子量为706bp，与理论值相符。
4、配制CRISPR体系，筛选crRNA
ssDNA探针2μl，缓冲液2μl，Cas12a蛋白2μl，PCR扩增产物4μl，ddH2O 8μl，总体积为18μl，然后将设计好的crRNA分别加到对应的反应体系中，37℃下反应15min。吸取每个反应体系的反应液5μl加到65μl的ddH2O中混匀，然后将试纸条插入混匀后的溶液中，看试纸条显色结果。
如图1B所示，crRNA（UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGUCAUGUCCUCGACGUCU，SEQ ID NO.1）切割效果最好。
实施例3：RPA引物的筛选
1、具有HIRRV的脾脏组织RNA基因组的提取
（1）取2mm左右的脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶DEPC水；（2）加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶K和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min；裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；（3）将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；（4）向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；（5）向病毒核酸吸附柱中加入750μl的Tris-HCl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；（6）重复步骤（5）；（7）将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；（8）将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶DEPC水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总RNA。
2、筛选RPA引物
（1）按照RPA引物设计标准设计了3个正向引物和3个反向引物，引物序列如SEQ IDNO.6-11并从Sangon Biotech订购；（2）使用从脾脏中提取的RNA作为模板进行RPA引物筛选，设计好的3个正向引物和3个反向引物形成7种组合进行RPA扩增；（3）反应结束后用DNA快速提取液提取RPA反应液，然后配制2.5%的琼脂糖凝胶电泳对RPA扩增结果进行分析。结果如图2所示，Primer-F1-RPA SEQ ID NO. 6和Primer-R1-RPA SEQ ID NO. 9结果表现得最好。
实施例4：RPA反应温度和反应时间优化
1、具有HIRRV的脾脏组织RNA基因组的提取
（1）取2mm左右的脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶DEPC水；（2）加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶K和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min。裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；（3）将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；（4）向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；（5）向病毒核酸吸附柱中加入750μl的Tris-HCl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；（6）重复步骤（5）；（7）将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；（8）将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶DEPC水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总RNA。
2、反应温度优化
为了优化RPA反应体系，设置四种反应温度（36℃、38℃、40℃、42℃、44℃和46℃）。各个温度下RPA反应结束后，用DNA快速提取液提取RPA反应液，然后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示。从图中可以看出反应在40℃下的扩增效果最好。
3、反应时间优化
为了优选检测反应的时间，通过设置不同的孵育反应时间：20min、23min、26min、29min和32min，反应结果如图4所示，反应时间为32min的RPA扩增效果最好。
实施例5：随机样品中HIRRV的检测
随机选取15个牙鲆样品，并用水作为对照品，使用本发明实施例1的检测方法和PCR技术分别对样品和对照品进行检测。
PCR技术检测：
1、试验材料：引物HIRRVF核苷酸序列为GTGCCAATGGTACACGGACAA（SEQ ID NO.14）和HIRRVR核苷酸序列为TGATCTCCGCATGTGCCTCTA（SEQ ID NO.15）；qPCRmix（Takara，#RR820A）；
2、具体步骤为：提取15个牙鲆脾脏的RNA，用NanoDrop8000分光光度计检测RNA的纯度和浓度。然后，将脾脏样本的总RNA利用随机引物逆转录为cDNA，利用引物（RNRf: 5’-GTGCCAATGGTACACGGACAA-3’和RNRr: 5’-TGATCTCCGCATGTGCCTCTA-3’）进行 HIRRV G 基因片段的 PCR 扩增。每个样品 3个重复，健康牙鲆的样品作为阴性对照。反应程序为: 95 °C预变性5min，95 °C 变性30秒，58 °C 退火30秒，72°C 延伸1min，50个循环，72°C10min。对PCR扩增产物进行1%凝胶电泳分析来判定牙鲆弹状病毒病。
经图5结果可知，在15个样品中，样品1、2、6、7、8、9、10、12、13、14经PCR检测和凝胶电泳分析后，其具有明显阳性扩增条带，使用实施例1方法检测这些样品，检测试纸条也均显示阳性。样品3、4、5、11、15经PCR检测和凝胶电泳分析后，不具有阳性扩增条带，应用实施例1方法检测结果也均为阴性，以上实验结果表明本发明的检测方法在对临床样品检测时具有良好的准确性。
实施例6：灵敏度检测
标准样本的制备：以含有目标样本的溶液为模板，通过设计的引物1（GAGTAGGGCAGTTCTGGCTCGGATT）和引物2（GGAGGCAACCCAAGGCGACATAG）制备符合要求的质粒，然后在引物1的5’端加上T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG），通过T7体外转录试剂盒合成目的片段。
标准样本的纯化：用Monarch RNA Cleanup Kit（T2040L NEB）对T7体外转录试剂盒合成的具有目标片段的溶液进行纯化，用NanoDrop One spectrophotometer（ThermoScientific）对纯化后的溶液的浓度进行测量，并通过下面公式计算拷贝数：
Concentration (copies/μl) =
用水将含有特定拷贝数的HIRRV RNA片段的样本进行梯度稀释，稀释为5个梯度：1：8.7×100拷贝/μl；2：8.7×101拷贝/μl；3：8.7×102拷贝/μl；4：8.7×103拷贝/μl；5：8.7×104拷贝/μl；以超纯水作为阴性对照（Negative control, NC）。通过实施例1的步骤进行检测。结果如图6所示，除阴性对照以外，各稀释度的病毒阳性样品均检测为阳性，表明本发明方法的检测灵敏度可达8.7×100拷贝/μl。
实施例7：特异性检测对比
检测方法：区别在于样品为1：水；2：IHNV阳性样本；3：VHSV阳性样本；4：HIRRV阳性样本；其余检测步骤均与实施例1相同。
常规PCR检测方法：
1、试验材料：引物HIRRVF核苷酸序列为GAGTAGGGCAGTTCTGGCTCGGATT（SEQ IDNO.12）、引物HIRRVR核苷酸序列为GGAGGCAACCCAAGGCGACATAG（SEQ ID NO.13）；2×EasyTap PCR SuperMix来自NEBiolabs。
2、具体检测步骤：提取各样品RNA，利用随机引物反转成cDNA，其它步骤与常规PCR检测步骤相同。
经图7结果可知，通过常规PCR和本发明方法分别检测上述4个样品，发现只有HIRRV阳性样本检测结果为阳性，而IHNV与VHSV病毒阳性样本及阴性对照样本的检测结果均为阴性，说明本发明检测方法具有很好的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测牙鲆弹状病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。
2.一种检测牙鲆弹状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的crRNA。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPA引物，所述RPA引物为Primer-F-RPA和Primer-R-RPA；所述Primer-F-RPA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述Primer-R-RPA核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括逆转录酶、Cas12a蛋白、ssDNA探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA探针的核苷酸序列为FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin。
6.一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取待测样品基因组RNA；（2）以步骤（1）中的基因组RNA为模板，利用权利要求3中所述RPA引物进行等温扩增反应，得到RPA扩增产物；（3）利用步骤（2）获取的RPA扩增产物，以及Cas12a蛋白、ssDNA探针、权利要求1所述的crRNA分子在CRISPR-Cas12a反应体系里反应，获得反应体系溶液；（4）对步骤（3）的反应体系溶液进行试纸条的检测，当试纸条T线显色，则表示待测样品HIRRV病毒阳性，当试纸条只有C线显色，则表示待测样品HIRRV病毒阴性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述提取待测样品基因组RNA包括如下步骤：1、取2mm左右的牙鲆脾脏组织块用小型研磨器研磨，然后向研磨的组织中加200μl无酶DEPC水；2、加入250μl的无机磷酸盐缓冲液、20μl的蛋白酶K和1.0μl的核糖核酸载体，剧烈振荡使其充分混匀，56℃孵育15min；裂解后室温13000g离心3min，将上清转移至新的1.5ml离心管中；向上清中加入250μl无水乙醇，充分吸打混匀；3、将裂解液转移至病毒核酸吸附柱中，温室静置2min，13000g离心2min，弃滤液；4、向病毒核酸吸附柱中加入500μl的异硫氰酸胍缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；5、向病毒核酸吸附柱中加入750μl的Tris-HCl乙醇缓冲液，温室13000g离心1min，弃滤液；6、重复步骤5；7、将病毒核酸吸附柱安置于新的2ml无酶离心管上，温室13000g离心2min；8、将病毒核酸吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在病毒核酸吸附柱膜的中央加入40μl无酶DEPC水，温室静置5min，然后温室13000g，离心2min，得脾脏总RNA。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述等温扩增反应体系包括：RPA缓冲液29.5μl，Primer-F-RPA 2.4μl，Primer-R-RPA 2.4μl，ddH2O 8.2μl，含有基因组RNA的样品上清液5μl和MgOAc 2.5μl，逆转录酶0.5μl，总体积为50.5μl，于40℃反应32min。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述CRISPR-Cas12a反应体系包括：ssDNA探针2μl，缓冲液2μl， crRNA 2μl，Cas12a蛋白2μl，RPA扩增产物4μl，ddH2O 8μl，总体积为20μl，于37℃反应15min。
10.权利要求6～9任意一项所述的检测方法在检测牙鲆弹状病毒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410268353.3A CN117925915A (zh) | 2024-03-10 | 2024-03-10 | 一种基于RPA CRISPR Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410268353.3A CN117925915A (zh) | 2024-03-10 | 2024-03-10 | 一种基于RPA CRISPR Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925915A true CN117925915A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90770466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410268353.3A Pending CN117925915A (zh) | 2024-03-10 | 2024-03-10 | 一种基于RPA CRISPR Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925915A (zh) |
-
2024
- 2024-03-10 CN CN202410268353.3A patent/CN117925915A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110408726B (zh) | 利用Taqman低密度微流体芯片技术检测29种呼吸道病原体的方法 | |
| CN113637778B (zh) | 一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法 | |
| CN110527710B (zh) | 一种用于检测ntrk基因融合突变的引物、探针及试剂盒 | |
| CN111286559A (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN113718045A (zh) | 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用 | |
| CN115725789A (zh) | 一种用于检测猴痘病毒的核酸组合、试剂盒及方法 | |
| CN114015792B (zh) | 一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒与检测方法 | |
| CN112941240B (zh) | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN115058543A (zh) | 一组鉴别Delta变异毒株和Omicron变异毒株的引物组和试剂盒 | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| CN116042878B (zh) | 一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法 | |
| CN116042879A (zh) | 一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和疫苗株的试剂盒与检测方法 | |
| KR101236197B1 (ko) | 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단 | |
| CN117925915A (zh) | 一种基于RPA CRISPR Cas12a体系检测牙鲆弹状病毒的试剂盒及方法 | |
| CN111500774B (zh) | 一种流行性出血病病毒及血清型鉴定rt-pcr试剂盒 | |
| CN115725782A (zh) | 一种鳗鲡疱疹病毒rpa引物及检测试剂盒 | |
| CN118222762A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测病毒性出血性败血症病毒的试剂盒及方法 | |
| CN115786587A (zh) | 一种用于同时检测4种病原体的多重pcr的引物组及其检测方法、试剂盒 | |
| CN114395643A (zh) | 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法 | |
| CN107988429B (zh) | 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用 | |
| CN108531622B (zh) | 结核分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群的杂交膜条和检测试剂盒 | |
| CN116004870B (zh) | 一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法 | |
| CN116515840B (zh) | 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法 | |
| CN111235317A (zh) | 一种检测prrsv和pcv的引物组合物、试剂盒及方法 | |
| CN111647665B (zh) | 一种日本血吸虫cfDNA及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |