KR100647404B1 - 트레할로오스 포스포릴라아제, 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

더어모아네로븀속(Thermoanaerobium屬)에 속하는 미생물로부터 수득되며 무기 인산의 존재하에 트레할로오스를 가인산(加燐酸) 분해(phosphorolysis)하여 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산을 생성하는 열 안정성의 트레할로오스 포스포릴라아제. 또한 트레할로오스 포스포릴라아제는 재조합 DNA 기술에 의해서도 제조할 수 있다. 기타 당의 존재하에 당(糖) 공여체로서의 β-D-글루코오스-1-인산에 효소를 작용시키면 종래에는 알려져 있기는 하였으나 얻기가 거의 불가능하였던 글루코실-D-갈락토시드를 비롯한 글루코실 전이당을 공업적 규모로 비교적 저렴하게 제조할 수 있다.

Description

트레할로오스 포스포릴라아제, 그 제조방법 및 용도

본 발명은 신규의 트레할로오스 포스포릴라아제(trehalose phosphorylase), 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 무기 인산 및/또는 그 염(이하, 별다른 불편이 생기지 않는 한, 본 명세서를 통하여 "무기 인산" 으로 줄여 기재함)의 존재하에 트레할로오스를 가인산(加燐酸) 분해(phosphorolysis)하여 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산 및/또는 그 염(이하, 별다른 불편이 생기지 않는한 본 명세서를 통하여 "β-D-글루코오스-1-인산"으로 줄여 기재함)을 생성하고, 역으로 β-D-글루코오스-1-인산과 D-글루코오스로부터 트레할로오스와 무기 인산을 생성하는 신규의 트레할로오스 포스포릴라아제와, 이 트레할로오스 포스포릴라아제의 제조방법과, 이 트레할로오스 포릴라아제를 사용하여 제조된 글루코실 전이당을 함유한 당 조성물 및 이 당 조성물을 함유한 조성물에 관한 것이다.

근래, 말토오스와 트레할로오스 등의 올리고당과 이들의 기능이 각광을 받고 있으며, 이들의 특이하고도 상이한 각종 제조방법에 대하여 여러가지 측면에서 연구가 되어있다. 말토오스 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, 트레할로오스 포스포릴라아제 및 셀로비오스 포스포릴라아제 등의 각종 포스포릴라아제를 상기한 올리고당의 제조방법으로서 사용할 수 있다고 하는 것은 알려져 있다.

L. R. Marechal 등은 문헌[The Journal of Biological Chemistry, Vol.247, No.10, pp. 3,223-3,228(1972)]에서 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)는 트레할로오스 포스포릴라아제를 세포 내에서 산생한다고 보고하였고, S. Murao 등은 문헌[Agriculture and Biological Chemistry, Vol.49, No.7, pp.2,113-2,118(1985)]에서 이 효소의 성질에 대해 보고하였다. K. Aisaka 등은 일본국 특허공개 제59,584/95호 공보에서 카텔라토스포라 페루기네아종(Catellatospora ferruginea種)에 속하는 미생물과 키네오스포리아 오란티아카종(Kineosporia aurantiaca種)에 속하는 미생물에 의하여 산생되는 미생물 기원의 트레할로오스 포스포릴라아제에 대해 보고하였다. H. Kizawa 등은 문헌[Bioscience, Biotechnolgy and Biochemistry, Vol.59, No.10, pp.1,908-1,912(1995)]에서 마이크로코커스 바리안스(Micrococcus varians)종에 속하는 미생물도 이러한 효소를 산생하는 것으로 보고하였으며, 또한 M. Yoshida 등은 문헌[Oyo-Toshitsu-Kagaku, Vol.42, No.1, pp.19-25(1995)]에서 플레시오모나스(Plesiomonas) sp. SH-35종에 속하는 미생물이 트레할로오스 포스포릴라아제를 산생하는 것으로 보고하고 있다. 이들 트레할로오스 포스포릴라아제 중에서 마이크로코커스 바리안스, 유글레나 그라실리스 및 플레시오모나스 sp.에 속하는 미생물 유래의 효소들은 열적 안정성이 각각 30℃ 이하, 40℃ 이하 및 45℃ 이하로서 낮으므로 대규모 생산시에 반응효율이 비교적 낮고 효소반응 도중에 세균 오염을 일으킨다.

본 발명은 공업적으로 유리한 열적 안정성을 가진 신규의 트레할로오스 포스포릴라아제와, 그 제조방법과, 이 효소를 사용하여 제조된 글루코실 전이당을 함유하는 당 조성물 및 그 용도를 제공한다.

상기한 과제를 해결하여 이제까지 알려진 바 없는 양호한 열적 안정성을 가진 트레할로오스 포스포릴라아제를 제조하고자 본 발명자들은 이러한 효소를 산생하는 미생물에 대하여 널리 검색한 결과, 더어모아네로븀속(Thermoanaerobium屬)에 속하는 더어모아네로븀 브로키이(Thermoanaerobium brockii) ATCC 35047이 신규의 트레할로오스 포스포릴라아제를 산생함을 발견하여 그 제조방법을 확립하였다. 또한 본 발명자들은 당질 존재하에 당 공여체로서의 β-D-글루코오스-1-인산과 효소를 접촉시켜 생성된 글루코실 전이당을 함유한 당 조성물 및 이 당 조성물을 함유한 조성물을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 의한 트레할로오스 포스포릴라아제는 더어모아네로븀속에 속하는 미생물 유래의 효소와 무기 인산 존재하에 트레할로오스를 가인산 분해하여 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산을 생성하는 효소를 포함한다. 이 트레할로오스 포스포릴라아제는 다음과 같은 작용 및 물리화학적 성질을 가지고 있다.

(1) 작용

(가) 무기 인산 존재하에 트레할로오스를 가인산 분해하여 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산을 생성함.

(나) D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산으로부터 트레할로오스와 무기 인산을 생성하며 당 공여체로서 β-D-글루코오스-1-인산을 이용하여 글루코실기의 기타 당으로의 전이반응을 촉진함.

(2) 분자량

SDS-PAGE에서 88,000 ± 5,000 달톤

(3) 등전점

앰폴라이트를 사용하는 전기영동에서 pI 5.4 ± 0.5

(4) 최적온도

pH 7.0에서 30분 유지하였을 경우 약 70℃.

(5) 최적 pH

60℃에서 30분간 유지하였을 경우 약 7.0 ∼ 7.5

(6) 열적 안정성

pH 7.0에서 1시간 유지하였을 경우 온도 약 60℃까지 안정

(7) pH 안정성

4℃에서 24시간 유지하였을 경우 pH 약 6.0 ∼ 9.0에서 안정

(8) 활성화 및 안정화

1mM 디티오드레이톨에 의해 활성화됨

(9) 활성저해

1mM Cu⁺⁺,Pb⁺⁺, Zn⁺⁺, Hg⁺⁺, Mg⁺⁺ 또는 Mn⁺⁺에 의해 저해됨

트레할로오스 포스포릴라아제는 부분 아미노산 서열로서 서열번호(SEQ ID NO:) 1, 서열번호(SEQ ID NO:) 2 또는 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 아미노산 서열을 가지며 전체적으로는 서열번호(SEQ ID NO :) 4의 아미노산 서열을 가진다. 이 기술분야에 있어서 소요의 단백질을 산생하는 미생물이 분리된 것이 존재한다면 이 단백질의 기능성 균등물은 미생물을 적당한 돌연변이 유발원으로 처리하여 쉽사리 얻을 수 있거나, 혹은 소요의 단백질을 코우드하는 DNA가 존재한다면 단백질의 기능성 균등물은 일반적인 재조합 DNA 기술을 DNA에 적용함으로써 쉽사리 얻을 수 있다. 물론 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제는 이러한 기능성 균등물을 포함한다. "기능성 균등물" 이라 함은 실질적으로 트레할로오스 포스포릴라아제와 동일한 활성을 가하고 있고, 아미노산 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환되고 아미노산 하나 이상이 N 말단 및/또는 C 말단에 부가되거나 내부 아미노산 서열에 삽입되며 N 말단 및/또는 C 말단 영역의 아미노산 하나 이상이 결실되고 내부 아미노산 서열의 아미노산 하나 이상이 결실된 효소의 아미노산 서열을 가지고 있는 단백질을 뜻한다. 상기한 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제는 이 효소를 산생하는 미생물의 배양물 등의 천연의 공급원으로부터 분리하여 얻거나, 돌연변이 유발원으로 처리하여 얻게 되는 이들의 돌연변이주의 배양물로부터 분리하여 얻거나, 또한 재조합 DNA 및 펩티드 합성 기술을 적용하여 효소를 인공적으로 합성한 것이라도 좋다.

본 발명의 DNA는 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 코우드하는 상기한 DNA 모두를 포함한다. 이러한 DNA의 예로서는 서열번호(SEQ ID NO :) 4의 아미노산 서열을 가지며 서열번호(SEQ ID NO :) 5의 뉴클레오티드 서열을 코우드하는 것들 및 그 기능성 균등물을 들 수 있다.

"기능성 균등물" 이라 함은 트레할로오스 포스포릴라아제와 실질적으로 동일한 작용을 가진 단백질을 코우드하고, 염기 하나 이상이 다른 염기와 치환되는 서열번호(SEQ ID NO :) 5의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA를 뜻한다. 상기한 DNA에 추가하여 본 발명의 DNA는 상기한 DNA 이외에 개시 코돈 이니시에이터, 정지 코돈, Shine-Dalgarno 서열, 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열, 적당한 제한효소에 의한 인식 서열, 프로모우터, 인핸서 및 터미네이터 등의 하나 이상의 DNA에 5' 말단 및/또는 3' 말단이 연결되어 있는 또 다른 DNA를 포함한다.

이들 DNA의 공급원과 제조방법에 대해서는 본 발명에서 특히 한정하고 있지 않다. 예컨대 DNA의 천연 공급원으로서 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047을 비롯한 더어모아네로븀속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 본 발명의 DNA를 함유한 DNA는 배양된 미생물의 균체 파쇄물부터 DNA 획분을 채취함으로써 얻을 수 있다. 채취된 DNA 그 자체를 본 발명에서 사용할 수 있으며, 본 발명의 DNA를 함유하는 단편을 자율 복제 가능한 벡터속에 도입하여 극히 바람직한 재조합 DNA를 제조할 수 있다. 즉, 일반적인 재조합 DNA 기술을 상기한 DNA에 적용하여 유전자 라이브러리를 얻고, 하이브리다이제이션법 등의 선별법을 적용하여 서열번호(SEQ ID NO:) 5 등의 뉴클레오티드 서열에 근거한 유전자 라이브러리로부터 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 코우드하는 소망하는 재조합 DNA를 선별함으로써 재조합 DNA를 일반적으로 얻을 수 있다. 이렇게 하여 수득한 재조합 DNA는 대장균속에 속하는 미생물 등의 적당한 숙주속에 도입하여 얻는 형질 전환체를 배양하여 증폭시킨 다음 이 배양물에 일반적인 알칼리-SDS법을 적용하여 소망하는 양의 본 발명의 DNA를 쉽게 얻을 수 있다. 상기한 미생물의 파쇄된 균체 또는 균체로부티 채취한 DNA를 템플레이트로 사용하고 서열번호(SEQ ID NO:) 5에 근거하여 화학 합성한 DNA를 프라이머로 사용하여 종래방법으로 PCR법을 적용하거나 서열번호(SEQ ID NO:) 5를 함유한 DNA를 화학 합성함으로써 본 발명의 DNA를 쉽사리 얻을 수 있다. 본 발명의 DNA의 상기한 기능상 균등물은, 예컨대 상기한 재조합 DNA에 부위 특이적 돌연변이 유발법을 적용하거나, 재조합 DNA를 템플레이트로서 사용하고 소요의 뉴클레오티드 서열로 변환된 뉴클레오티드 서열을 가진 화학합성된 DNA를 프라이머로서 사용하여 PCR법을 적용함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 DNA는 자율 복제 가능한 벡터속에 도입된 재조합 DNA 형태의 것들을 포함한다. 상기한 바와 같이 이들 재조합 DNA는 본 발명의 DNA 제조에 극히 유용하며, 또한 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제 제조에도 유용하다. 상기한 바와 같이 소망하는 DNA를 일단 얻은후에는 일반적인 재조합 DNA 기술을 적용하여 DNA를 적당한 벡터속에 삽입함으로써 이들 재조합 DNA를 비교적 쉽게 얻을 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 적당한 숙주에서 복제성질을 가진 것들이 있다. 다음의 벡터들, 예컨대 대장균에 속하는 미생물을 숙주로 사용하는 pUC 18, Bluescript II Sk(+), pkk223-3 및 λgt · λC; 숙주로서 바실루스속에 속하는 미생물을 필요로 하는 pUB110, pTZ4, pC194, p11, Ø 11 및 Ø 105; 및 적어도 두종류의 숙주를 필요로 하는 pHY3OOPLK, pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7 등의 벡터들을 본 발명에서 유리하게 사용할 수가 있다. 벡터속에 본 발명의 DNA를 삽입하는 방법의 예에 대해서 설명하면 적당한 벡터와, 이렇게 하여 수득한 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 DNA를 함유한 DNA를 제한효소로써 분해하고 생성된 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 적절하게 사용되는 이러한 제한효소의 예로서는 Acc I, Alu I, Bam HI, Bgl II, Bst XI, Eco RI, Hind III, Not I, Pst I, Sac I, Sal I, Sma I, Spe I, Xba I 및 Xho I 등이 있다. DNA 단편과 벡터 단편을 연결할 경우, 예컨대 적당한 제한효소 인식 서열을 가진 화학적으로 합성한 DNA들을 사용할 수 있다. DNA와 DNA를 연결하자면 어니일링한 후에 균체내 및 균체외에서 DNA 리가아제로써 접촉시킨다.

본 발명의 DNA는 DNA가 도입되는 형질 전환체 형태의 것들을 포함한다. 이러한 형질 전환체는 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제와 본 발명의 DNA를 얻는데 극히 유용하다. 예컨대 대장균 및 바실루스속의 미생물, 악티노마이세스 및 효모를 형질 전환체용의 숙주 미생물로서 임의로 사용할 수 있다. 이 형질 전환체는 상기한 재조합 DNA를 적당한 숙주속에 도입함으로써 통상적으로 얻을 수 있다. 대장균속에 속하는 미생물을 사용할 경우에는 미생물과 재조합 DNA를 칼슘 이온 존재하에 배양하는 반면, 바실루스속에 속하는 미생물을 사용할 경우에는 면역담당 세포법 및 원형질체법을 적용한다. 본 발명의 DNA를 제조하기 위한 상기한 방법은 그 자체가 예컨대 문헌[J. Sumbruck et al. in "Molecular Cloning A Laboaratory Manual", 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재된 방법에 사용된 종래의 공지된 방법이다.

본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 제조하는 방법은 효소를 산생하는 미생물을 배양하고 산생된 효소를 배양물로부터 채취함에 그 특징이 있다. 본 발명에 사용된 이러한 미생물의 종(種) 및 속(屬)과 배양방법에는 특별히 한정은 없다. 이러한 미생물의 예로서는 더어모아네로븀속에 속하는 것들, 바람직하게는 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047 및 본 발명의 DNA를 적당한 숙주 미생물속에 도입하여 얻은 형질 전환체를 포함한다.

미생물이 생육할 수 있고 본 발명의 효소를 산생할 수 있는 배지이면 어떠한 천연 영양배지 또는 합성 영양배지라도 본 발명의 방법에 사용하여 미생물을 배양할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 탄소원으로서는 미생물이 이용할 수 있는 것들이면 되는데, 예컨대 말토오스, 트레할로오스, 덱스트린 및 전분 등의 당질, 당밀, 효모 추출물 등의 당 함유물 등의 천연물도 사용할 수 있다. 배지에 함유된 이들 탄소원의 농도는 그 종류에 따라 적절히 선택한다. 예컨대, 바람직한 당의 농도는 20w/v% 이하인데, 미생물의 생육과 증식을 고려하여 5w/v% 이하이다. 본 발명에서 사용되는 질소원의 예로서는 암모늄염, 질산염 등의 질소함유 무기 화합물과, 우레아, 코온 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스(extract) 및 육 엑스 등의 질소함유 유기 화합물 등이 있다. 필요에 따라 무기 화합물, 예컨대 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 인산, 망간, 아연, 철, 구리, 몰리브덴 및 코발트 등의 염을 본 발명에서 사용할 수 있다.

미생물을 온도 50 ~ 80℃, 바람직하게는 60 ~ 70℃ 및 pH 5 ~ 8, 바람직하게는 pH 6.5 ~ 7.5에서 선택되는 조건하에서 혐기적으로 배양한다. 미생물이 충분히 생육할 수 있을 정도이면 본 발명에서는 어떠한 배양시간이더라도 사용할 수 있는데, 바람직하게는 10 ~ 50시간이다. 상기한 형질 전환체의 배양에 있어서는 통상적으로 호기적인 조건하에서 20 ~ 65℃의 온도 및 pH 2 ~ 9에서 통기교반법으로 약 1 ~ 6일 동안 배양한다.

미생물을 배양한후 본 발명의 효소를 배양물로부터 채취한다. 일반적으로 균체내에 효소활성이 존재하기 때문에 균체 그대로 혹은 처리된 균체를 조효소로서 얻을 수 있다. 배양물 전체를 조효소로서 사용할 수도 있다. 균체와 영양배지를 종래의 고-액 분리법을 사용하여 분리할 수 있다. 예컨대 배양물의 직접 원심분리 방법, 여과조제를 배양물에 가한후 또는 프리코우팅한후 배양물을 여과하는 방법, 및 평필터 및 중공사(hollow fiber) 등의 멤브레에 의한 배양물의 여과방법 등이 있다. 조효소로서는 균체 그데로를 사용할 수 있고, 또한 처리된 균체 자체를 사용할 수 있으며, 필요에 따라 이들을 부분 정제효소로 제조할 수도 있다.

처리된 균체의 종류에는 균체의 단백질 획분, 미처리 및 처리된 균체의 고정화 물질 및 건조처리, 동결건조 처리 및 계면 활성제, 효소, 초음파, 기계적 마쇄, 및 기계적인 압력 등의 방법으로 처리된 균체를 포함한다. 본 발명의 효소를 미정제 형태 또는 정제형태로 사용할 수 있고, 처리된 균체를 효소정제에 사용되는 종래의 방법, 예컨대 황산 암모늄에 의한 염석법, 아세톤 및 알코올에 의한 침전법 및 평막 및 중공사에 의한 막농축법/투석법으로 추가로 더욱 처리할 수 있다.

미처리 및 처리된 균체를 종래의 방법, 예컨대 이온교환 수지에 의한 결합법, 수지 및 멤브레인에 의한 공유결합/흡착법 및 고분자 물질에 의한 포괄법 등의 방법으로 고정화한다.

조효소를 그대로 또는 종래의 정제방법으로 정제하여 사용한다. 예컨대 처리된 균체를 황산 암모늄을 사용하여 염석함으로써 조효소를 얻은 다음, 이 효소를 투석한후 "DEAE-TOYOPEARL"(일본국의 Tosoh사 판매의 음이온 교환수지)를 사용하는 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, "CM-TOYOPEARL"(일본국의 Tosoh사 판매의 수지)를 사용하는 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피, "BUTYL-TOYOPEARL" (일본국의 Tosoh사 판매의 소수성 수지)를 사용하는 소수성 칼럼 크로마토그래피 및 "ULTROGEL AcA44 RESIN"(프랑스국의 Sepracor/IBF s.a.사 판매의 겔 여과 칼럼 크로마토그래피용의 겔)를 사용하는 겔 여과 칼럼 크로마토그래피에 의하여 연속하여 처리함으로써 전기 영동적으로 단일의 효소의 단백질 밴드를 얻는다.

본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 활성을 다음과 같이 측정한다. 즉 기질로서 1.0w/v% 트레할로오스를 함유한 20mM 인산 완충액(pH 7.0) 2ml에 효소액 0.2ml을 가하고, 이 용액을 60℃에서 30분간 인큐베이트하여 반응 혼합물을 0.5ml의 양으로 샘플링하고, 이 샘플을 100℃에서 10분간 인큐베이트하여 효소반응을 정지시킨다. 가열된 샘플에 D-글루코오스 옥시다아제/퍼옥시다아제 시약 0.5ml을 가하고 이 혼합물을 교반하여 40℃에서 30분간 유지하고, 5-N 염산을 2.5ml 가하여 이 혼합물을 교반한 다음, 혼합물의 흡광도를 파장 525㎚에서 측정한다. 효소활성 1 단위를 1분당 D-글루코오스 1μmole을 생성하는 효소의 양으로 정의한다. 말토오스 포스포릴라아제와 코지비오스 포스포릴라아제의 활성은 기질로서의 트레할로오스 대신에 말토오스와 코지비오스를 각각 사용하는 외에는 상기한 측정방법과 동일한 방법으로 측정할 수 있다.

트레할로오스 포스포릴라아제를 사용하여 글루코실 전이당을 함유한 당 조성물을 제조하는 본 발명의 효소반응에 있어서 수용체로서의 기타 적당한 당류, 예컨대 D-크실로오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, D-푸코오스 및 L-푸코오스 등의 단당류와 더불어 당 공여체로서의 β-D-글루코오스-1-인산에 효소를 작용시켜 글루코실기를 상기한 환원당에다 전이시킴으로써 글루코실-D-크실로시드, 글루코실-D-갈락토시드, 트레할로오스, 글루코실-D-푸코시드 및 글루코실-L-푸코시드를 생성시킨다.

시약으로서 시판되고 있는 β-D-글루코오스-1-인산을 그데로 본 발명에서 당 공여체로 사용할 수 있는데, 이것은 적당한 포스포릴라아제와 기질인 당을 무기 인산 및/또는 그 염의 존재하에 접촉시켜 제조할 수 있다. 예컨대 무기 인산 및/또는 그 염의 존재하에서 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스에 작용시키거나, 말토오스에 말토오스 포스포릴라아제를 작용시키거나, 코지비오스 포스포릴라아제를 코지비오스에 작용시킴으로써 제조할 수 있다. β-D-글루코오스-1-인산을 생성하는 상기한 포스포릴라아제의 반응 중의 어느 한가지 반응을 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 사용하는 동일한 반응계에서 실시하여 글루코실 전이당을 생성시킬 경우에 있어서, 계에 β-D-글루코오스-1-인산을 직접 공급하여 유리한 특징으로서의 제조비 절감 및 공정 단계수의 간소화를 도모할 수 있다. 상기한 무기 인산으로서는 오르토인산 및 축합 인산을 포함하는데, 통상적으로 오르토인산이 바람직하게 사용된다. 무기 인산의 염으로서는 상기한 무기 인산 유래의 일반적인 인산이온의 화합물들을 포함하는데, 통상적으로는 큰 수용성을 가진 인산 나트륨염 및 인산 칼륨염이 바람직하게 사용된다.

예컨대 본 발명의 효소를 상기한 트레할로오스 포스포릴라아제로서 사용할 수 있으며, 세균 유래의 말토오스 포스포릴라아제 시판품을 그대로 사용할 수 있다. 코지비오스 포스포릴라아제의 경우에는 본 발명의 동일한 출원인에 의해 출원된 일본국 특허출원 제311,235/96호(발명의 명칭 : 코지비오스 포스포릴라아제, 그 제조방법 및 용도)에 개시된 효소를 사용할 수 있다. 상세한 것은 이 명세서에 기재되어 있다. 예컨대, 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047의 종배양물을 문헌[ATCC Catalogue of BACTERIA AND BACTERIOPHAGES, l8th edition, pp.452-456(1992)]에 기재된 미생물용 영양배지에 접종하고, 혐기성 조건하에 65℃에서 배양한 다음 배양물을 원심분리하여 균체를 초음파 파쇄처리한후 상청액을 채취함으로써 코지비오스 포스포릴라아제 활성을 가진 소요의 획분을 얻는다.

본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 사용하는 글루코실 전이당 생성반응에 사용되는 기질의 농도는 특별히 한정되지 않는다. 일반적으로 바람직하게는 당 공여체로서의 β-D-글루코오스-1-인산 1 ~ 20w/w%(이하, 별달리 명시하지 않는한 본 명세서를 통하여 "w/w%" 를 간단히 "%" 로 표기함)와 수용체 1 ~ 20%를 함유하는 용액을 사용한다. 상기한 바와 같이 적당한 포스포릴라아제의 작용에 의한 β-D-글루코오스-1-인산 생성반응을 상기한 글루코실 전이당 생성반응과 동일한 반응계에서 실시할 경우, 다음과 같이 하는 것이 바람직하다. 즉, 트레할로오스 포릴라아제를 기질에 작용시킬 경우, 인산 2수소 나트륨 등의 인산염 약 0.5 ∼ 20mM의 존재하에 글루코실 전이반응의 기질로서 β-D-글루코오스-1-인산 대신에 약 1 ~ 20%의 트레할로오스 용액을 사용한다. 기타의 포스포릴라아제를 기질에 작용시킬 경우에는 글루코실 전이반응용의 기질로서 β-D-글루코오스-1-인산 대신에 인산 2수소 나트륨 등의 인산염 약 0.5 ∼ 20mM과 함께 말토오스 또는 코지비오스를 약 1 ~ 20% 공존시킨다. 사용되는 당의 종류에 따라 고형물 기준으로 말토오스 포스포릴라아제 또는 코지비오스 포스포릴라아제를 당질 1g당 약 0.1 ∼ 50 단위의 양으로 공존시키는 것이 바람직하다.

상기한 반응은 기질 존재하에 사용되는 효소를 실활하지 아니하는 온도, 즉, 약 70℃ 이하, 바람직하게는 약 15 ~ 65℃에서 실시한다. 반응 pH는 통상적으로 약 4.0 ~ 9.0의 pH, 바람직하게는 약 5.0 ~ 7.5의 pH로 조정한다. 반응시간은 효소반응 속도에 따라 적절히 선택할 수 있는데, 고형물 기준으로 효소를 기질 g당 약 0.1 ~ 50 단위의 양으로 사용할 경우에는 통상적으로 약 0.1 ~ 100시간이다. 상기한 바와 같이 상이한 포스포릴라아제의 작용에 의한 β-D-글루코오스-1-인산 생성반응을 글루코실 전이당 생성반응과 동일한 반응계에서 실시할 경우에는 반응온도와 pH는 이들의 열적 안정성에 따라 사용된 포스포릴라아제를 실활하지 않는 온도와 pH로 설정하는 것이 바람직하다.

따라서 수득한 반응 혼합물에는 기질로 사용된 당에 상응한 글루코실 전이당을 함유한다. 글루코실 전이당의 수득율은 효소반응에 사용된 기질의 농도, 기질의 종류 및 반응조건에 따라 달라진다. 예컨대 무기 인산 존재하에 10% 트레할로오스와 5% D-갈락토오스를 기질로 사용할 경우에는 글루코실갈락토시드가 약 30%의 수득율로 생성한다. 본 명세서를 통하여 글루코실 전이당의 수득율이라 하는 것은 고형물당 반응 혼합물중의 전체 당류에 대하여 생성된 당의 백분율(%)을 뜻한다.

반응 혼합물중에서의 글루코실 전이당의 함유량을 최고 가능한 수준으로 증가시키자면 반응 혼합물중에서 생성된 D-글루코오스를 분해하여 제거하는 효소 공급원을 혼합물중에 공존시켜 당전이 반응을 촉진시킨다. 적당한 포스포릴라아제를 사용하는 상기한 β-D-글루코오스-1-인산 생성반응을 글루코실 전이반응과 동일한 반응계에서 실시하여 당 공여체를 직접 공급할 경우에는 이러한 기술을 이용하여 반응공정 도중 생성된 부생물인 D-글루코오스를 분해하여 제거함과 아울러 당전이 반응을 촉진시킬 수 있다.

효소 공급원으로는 D-글루코오스 분해 활성을 가진 미생물, 이 미생물의 배양물, 미처리 균체와 처리된 균체 및 D-글루코오스 분해 활성을 가진 효소를 포함한다. D-글루코오스 분해 활성이 비교적 높지만 생성된 전이당을 분해하는 작용이 전혀 없거나 실질적으로 없는 미생물이면 어떠한것이라도 사용할 수 있는데, 효모가 바람직하다. 글루코오스 옥시다아제, 카탈라아제, 피라노오스 옥시다아제, 글루코오스 데히드로게나아제, 글루코키나아제 및 헥소키나아제 등의 어떠한 효소라도 사용할 수 있는데, 이들 효소중에서 글루코오스 옥시다아제와 카탈라아제가 바람직하게는 사용된다.

이렇게 하여 수득한 글루코실 전이당을 함유하는 반응 혼합물을 통상적인 방법으로 여과하고 원심분리하여 불순물을 제거한 다음, 활성탄에 의한 탈색 및 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염 등의 정제단계를 거쳐 농축함으로써 시럽상 제품을 얻는다. 필요에 따라 이 시럽상 제품을 임의로 분무건조에 의해 건조하여 분말상 제품으로 할 수 있다.

반응 혼합물로부터 당을 분리하고 수득한 혼합물을 정제함으로써 글루코실 전이당을 함유한 본 발명의 당 조성물을 당질 고함유 제품으로 가공할 수 있다. 이러한 분리방법의 예로서는 불순물을 분리, 제거하는 방법들이 있는데, 즉, 효모를 사용하여 단당류를 제거하는 발효법(효모 발효법), 멤브레인 여과법 및 칼럼 크로마토그래피 등에 의한 협잡당류의 제거방법 및 반응 혼합물의 pH를 알칼리성으로 조정하고 혼합물을 가열하여 환원당을 분해하는 방법 등을 들 수 있다. 더욱 상세하게는 일본국 공개특허 제23,799/83호 공보 및 제72,598/83호 공보에 개시된 강산형 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 협잡 당류를 제거함으로써 필요로하는 글루코실 전이당 고함유 획분을 채취하는 협잡당류의 제거방법을 공업적인 규모로 유리하게 사용할 수 있다. 이 경우에 있어서 통상적인 고정상법, 이동상법 및 의사(擬似) 이동상법을 유리하게 이용할 수 있다.

불순물이 제거된 용액을 통상의 방법으로 여과하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음, 활성탄에 의한 탈색, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염 등의 정제처리를 하여 농축함으로써 시럽상 제품을 얻는다. 필요에 따라 시럽상 제품을 분무건조 등의 방법으로 건조하여 분말상 제품으로 얻을 수도 있다.

이렇게 하여 수득한 본 발명의 글루코실 전이당을 함유하는 당 조성물은 통상적으로 고형물 기준으로 글루코실 전이당을 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%을 함유한다.

본 발명의 글루코실 전이당을 함유하는 당 조성물은 맛, 감미, 삼투압 조절성, 보습성, 광택 부여성, 결정화 방지성 및 노화 방지성, 충치 예방성, 비피드균 성장촉진성 및 미네랄 흡수 촉진성 등이 만족스럽다. 이들 성질과 기능이 만족스럽기 때문에 본 발명의 당 조성물을 음식물, 담배, 사료, 애완동물용 먹이, 화장품, 의약품, 성형물, 일상 식품 및 농수산품, 화학공업용 시약 및 제품 등의 각종 조성물에 널리 유리하게 사용할 수 있다.

글루코실 전이당을 함유하는 본 발명의 당 조성물을 그대로 감미용 조미료로 사용할 수 있다. 필요에 따라 본 발명의 당 조성물을 적당량의 1종 이상의 기타 감미료, 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 트레할로오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신 및 알라닌과 더불어 사용할 수 있고, 또한 필요에 따라 덱스트린, 전분 및 락토오스 등의 증량제 등과 더불어 사용할 수 있다,

본 발명의 당 조성물은 신맛, 쓴맛, 짠맛, 떫은맛, 단맛을 가진 각종 물질과 잘 조화하는 감미를 가지며 내산성과 내열성도 양호하다. 따라서 일반 음식물에 있어서 감미료, 맛개량제 및 품질 개량제로서 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물은 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 모로미(거르지 않은 술), 히시오(거르지 않은 간장), 후리카게(조미된 어육), 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이-즈(설탕, 간장, 식초가 혼합된 소오스), 훈마츠-수시-수(초밥용 분말 식초), 츄카-노-모토(중화 요리용 조미료), 텐츠유(일본식 튀김 식품용 수우프), 멘츠유(일본식 국수용 소오스), 소오스, 켓찹, 타쿠안-츠케-노-모토(단무지용 프리믹스), 하쿠사이-츠케-노-모토(배추 겉절임용 프리믹스) 등의 절임식품용 프리믹스, 야구니쿠-노-타레(일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 즉석 스튜우 믹스, 즉석 수우프 믹스, 다시-노-모토(즉석 스톡 믹스), 복합 조미료, 미린(감미나는 술), 신미린(합성 미린), 테이블 시럽, 커피 시럽 등의 각종 조미료에 사용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물은 센베이(쌀 크래커), 아라레-모치(입방체의 쌀떡), 오코시(기장과 쌀로 된 케이크), 모치(쌀떡), 만주(팥 잼 넣은 만두), 우이로(단맛의 젤리), 안(팥 잼), 요캉(단맛의 팥 젤리), 미즈-요캉(연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠(요캉의 일종), 젤리, 파오 드 카스텔라 및 아메다마(일본식 토피) 등의 각종 일본식 과자류, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디 등의 양과자류; 아이스 크리임, 셔어벳 등의 빙과류; 카지츠-노-시럽-즈케(과실의 시럽 절임), 코리밋츠(빙수용 설탕 시럽) 등의 시럽류; 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류; 잼, 마아멀레이드, 시럽-즈케(과실 피클류), 토카(당과) 등의 과실과 야채의 가공 식품류; 후쿠진-즈께(적색의 무우 피클), 베타라-즈케(통무우 피클), 센마이-즈케(썰은 무우 절임), 라쿄-즈케(파 절임) 등의 절임 및 절임 제품; 햄, 소오세지 등의 축육제품류; 어육 햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와(어묵의 일종), 튀김 등의 어육제품; 우니-노-시오카라(성게 내장젓), 이카-노-시오카라(오징어젓), 수-콘부(가공된 다시마), 사키-수루매(말린 오징어채), 후구-노-미린-보시(미린으로 조미된 말린 복어) 등의 각종 진미류; 김, 산나물, 말린 오징어, 소어(小魚), 조개 등의 츠쿠다니(간장에 졸인 음식류); 니마매(볶은 콩), 감자 샐러드, 콘부-마키(다시마 말이) 등의 평상시 식품; 유(乳)제품; 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림류; 청주, 합성주, 와인, 리큐르 등의 주류; 커피, 홍차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등의 소프트 드링크류; 인스탄트 푸딩 믹스, 인스탄트 핫 케이크 믹스, 즉석 시루코(아즈키팥죽을 쌀떡과 혼합한 인스탄트 믹스), 인스탄트 수우프 믹스 등의 즉석 식품류; 및 이유식, 치료식, 드링크제, 밥, 국수 및 냉동식품 등의 각종 음식물에 대한 감미 부여, 맛 개량 및 상기 식품의 품질 개량 등에 마음데로로 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 당 조성물은 가축, 가금, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 당 조성물을 담배, 치약, 립스틱, 입술 연지, 립 크림, 내복약, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제, 가아글제, 화장품, 의약품 등의 페이스트상 및 액상의 기타 조성물에 있어서 감미료, 맛 개량제 및 품질 개량제 등으로서 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 당 조성물은 유효 성분과 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리 활성 물질은 물론이거니와 이 생리활성 물질을 함유한 건강 식품, 의약품 등에 품질 개량제와 안정제로서 사용할 수 있다. 이러한 생리활성 물질의 예로서는 α-, β- 및 γ-인터페론, 종양괴사 인자-α(TNF-α), 종양 괴사인자-β(TNF-β), 대식세포 유주(遊走) 저지인자, 콜로니 자극인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨 1, 2, 6, 12, 15 및 18 등의 림포카인류; 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 조직 플라스미노젠 활성화제, 란포 자극 호르몬, 태반 호르몬 등의 호르몬류; BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 유구열도산 반시뱀 항독소 및 인간 면역 글로불린 등의 생물제제; 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신 및 황산 카나마이신 등의 항생물질; 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등의 비타민류; 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소류; 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 글로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등의 엑스류; 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균류, 및 로얄젤리 등의 기타의 각종 생리활성 물질을 들 수 있다. 본 발명의 당 조성물을 사용함으로써 상기한 각종 생리활성 물질을 그 유효 성분과 활성을 상실하거나 실활함이 없이 안정성이 극히 높고 고품질의 건강 식품과 의약품 등으로 용이하게 제조할 수 있게 된다.

상기한 바와 같이 본 발명에서 말하는 "조성물" 이란 용어는 경구용 및 비경구용 음식물, 화장품 및 의약품 뿐만 아니라 일상 제품, 농수산품, 화학공업용 시약 및 제품을 포함한다. 상기한 각종 조성물에 본 발명의 당 조성물을 함유시키는 방법은, 예를 들자면 혼합, 혼화, 용해, 용융, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 고화 등의 공지의 방법을 포함한다. 본 발명의 당 조성물을 통상적으로 0.1% 이상, 바람직하게는 0.5% 이상의 양으로 하여 각종 조성물에 함유시킨다.

아래의 실험에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

실험 1 : 트레할로오스 포스포릴라아제 제조

문헌["ATCC Catalogue of BACTERIA AND BACTERIOPHAGES", 18th edition, pp.452-456(1992)]에 기재된 더어모아네로븀 브로키이용 배지 제조방법에 준하여, 탄소원으로서 0.5w/v% 글루코오스 대신에 0.5w/v% 트레할로오스를 사용하여 배지를 제조하고, 이 배지 100ml을 취하여 100ml 용량의 가압용기에 넣은 다음, 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047을 접종하여 60℃에서 48시간 동안 방치하여 종배양물로 하였다.

종배양물 제조시에 사용된 것과 동일한 신선한 영양배지 약 10L를 취하여 11리터 용량의 스테인레스강제 병에 넣고 가열하여 멸균한후 60℃로 냉각하고 여기에 종배양물 1v/v%을 접종한후 60℃에서 약 40시간 동안 정치배양하였다.

수득한 배양물 약 40L을 원심분리하여 습균체 92g을 얻은 다음, 10mM 인산 완충액에 부유시키고 초음파 처리하고 원심분리하여 파쇄된 균체 현탁액의 상청액을 얻었다. 이 상청액의 활성은 트레할로오스 포스포릴라아제 0.3 단위/ml이었다.

실험 2 : 트레할로오스 포스포릴라아제 정제

실험 1의 상청액을 UF 멤브레인으로 농축하여 트레할로오스 포스포릴라아제 활성 약 30 단위/ml을 가진 효소 농축물 약 360ml을 얻었다.

이 효소 농축액 300ml을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대해 24시간 투석하고 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 수득한 상청액 380ml을 "DEAE-TOYOPEARL 650 GEL"(일본국의 Tosoh사 판매의 이온교환 칼럼 크로마토그래피용 겔) 380ml을 사용하는 이온교환 칼럼 크로마토그래피 처리를 하였다.

본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 이 겔에 흡착시키고 0M로부터 0.5M까지 증가하는 염화 나트륨을 직선 기울기하에서 공급함으로써 용출시켰다. 약 0.1M 염화 나트륨에서 용출하는 효소활성 획분을 채취하고, 한데 모아 용액중의 효소를 다음과 같이 정제하였다. 즉, 1.5M 황산 암모늄을 함유한 동일한 신선한 완충액에 대하여 용액을 투석하고 투석액을 원심분리하여 불용물을 제거한 다음, 그 상청액을 "BUTYL-TOYOPEARL 650 GEL" 100ml을 사용하는 소수성 칼럼 크로마토그래피 처리를 하였다. 겔에 흡착된 트레할로오스 포스포릴라아제를 1.5M로부터 0.5M까지 감소하는 황산 암모늄의 직선 기울기하에서 용출시켜 효소활성 획분을 채취하였다.

이들 획분을 한데 모아 "ULTROGEL AcA44 RESIN"(프랑스국의 Sepracor/IBF s.a.사 판매의 겔 여과 칼럼 크로마토그래피용 겔) 300ml을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피 처리를 한 다음, 효소활성 획분을 채취하였다.

상기한 정제단계에서 수득한 정제 효소의 수득율은 파쇄된 균체 현탁액의 상청액의 효소활성에 대하여 약 25%이었다. 이 효소의 비활성은 단백질 1㎎당 78.2 단위이었다. 표준 단백질로서 소혈청 알부민을 사용하는 Lowry법에 의해 단백질을 정량하였다.

7.5w/v% 폴리아크릴아미드를 사용하는 겔 전기 영동에서 이 시료의 순도를 측정한 결과, 이 시료는 단일 단백질 밴드로서 검출된 비교적 고순도의 단백질이었음이 판명되었다.

실험 3 : 트레할로오스 포스포릴라아제의 성질

실험 2에서의 트레할로오스 포스포릴라아제 시료에 대해 10w/v% 겔을 사용하여 SDS-PAGE 처리를 하였다. 이와 병행하여 전기영동 처리된 마아커 단백질(marker protein)(일본국의 Japan Bio-Rad Laboratories사 판매)과 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 그 분자량은 88,000 ± 5,000 달톤이었고, "TSKGel G4000SW" (일본국의 Tosoh사 판매의 겔 여과용 겔)이 충전된 직경 7.5㎜, 길이 600㎜의 칼럼을 사용한 겔 여과에서는 분자량이 190,000 ± 10,000 달톤이었음이 판명되었다.

정제 트레할로오스 포스포릴라아제를 2w/v% "AMPHOLINE"(스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB사 판매의 앰폴라이트)를 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 한 다음, 단백질 밴드와 겔의 pH를 측정한 결과, 이 효소의 pⅠ는 5.4 ± 0.5이었다.

본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 활성에 미치는 온도와 pH의 영향을 효소활성 측정법에 준하여 조사하였다. 온도가 미치는 영향을 조사하기 위하여 효소 시험시에 사용된 60℃ 대신에 약 50 ~ 85℃에서 효소를 반응시켰다. pH가 미치는 영향을 조사할 경우에 있어서는 효소활성 측정시에 사용된 완충액의 pH 대신에 약 4 ~ 9의 pH에서 효소를 반응시켰다. 이들 두가지 경우에 있어서 효소시험시의 경우와 마찬가지로 효소반응을 정지시킨 다음 생성된 글루코오스를 정량하였다. 이들 결과는 도 1 및 도 2에 나와 있는데, 이들은 각각 온도와 pH의 영향에 대한 데이터로서 최대치에 대한 상대치로 나타낸 것이다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0에서 30분간 유지하였을 경우 약 70℃ 이었고 최적 pH는 60℃에서 30분간 유지하였을 경우 약 7.0 ~ 7.5이었다. 이 효소의 열적 안정성은 10mM 인산 완충액(pH 7.0)중에 효소를 용해하고 약 40 ~ 85℃에서 1시간 동안 유지한후 냉각하여 효소 시험법에 따라 잔존효소의 활성을 측정함으로써 결정하였다. 이 효소의 pH 안정성은 약 4 ~ 10의 상이한 pH의 완충액 중에 효소를 용해하고 각 효소액을 약 4℃에서 24시간 동안 유지한후 각 용액의 pH를 7.0로 조정한 다음 효소 시험법에 따라 잔존효소의 활성을 측정함으로써 결정하였다. 이들 결과는 도 3 및 도 4에 나와 있는데, 이들은 각각 효소의 열적 안정성과 pH 안정성에 대한 데이터로서 최대치에 대한 상대치로 나타낸 것이다. 효소의 열적 안정성은 약 60℃ 이하이었고 pH 안정성은 약 6.0 ~ 9.0 이었다. 이 효소의 활성은 1mM Cu⁺⁺, Pb⁺⁺, Zn⁺⁺, Hg⁺⁺, Mg⁺⁺ 또는 Mn⁺⁺에 의해 저해되었다.

실험 4 : 트레할로오스 포스포릴라아제의 부분 아미노산 서열

실험 4-(1) : N말단 아미노산 서열

실험 2의 방법으로 제조한 정제효소 표품 일부를 증류수에 대해 투석하고 단백질 중량으로 투석 효소 약 40㎍을 N 말단 아미노산 서열 분석용 시료로 사용하였다. "PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A"(미합중국의 Applied Biosytems사 판매의 장치)를 사용하여 N 말단으로부터 5개 아미노산 잔기까지 분석하였다. 분석된 부분 아미노산 서열은 서열번호(SEQ ID NO:) 1이었다. 동일한 신선한 효소 표품을 사용하여 보다 정밀한 분석을 한 결과, 이 효소는 N 말단에서 서열번호(SEQ ID NO:) 6의 아미노산 서열을 가지고 있었음이 판명되었다.

실험 4-(2) : 내부 부분 아미노산 서열

실험 2의 방법으로 제조한 정제효소 표품 일부를 10mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 대해 투석하고 이 투석액을 1㎎/ml의 단백질 농도가 되도록 동일한 신선한 완충액으로 희석하였다. 수득한 용액 1ml에 리실 엔도펩티다아제(일본국의 Wako Pure Chemical Industries사 판매의 효소 표품)를 10㎍ 가하고 30℃에서 22시간 효소반응시켜 펩티드를 생성시켰다. "μBONDASPHERE C-18 COLUMN(직경 2.1㎜, 길이 150㎜)" (미합중국의MILLIPORE사의 Waters Chromatography Div. 판매의 역상 HPLC용 칼럼), 유속 : 0.9ml/min, 실온하 및 0.1v/v% 트리플루오로아세트산중에서 Ov/v%로부터 48v/v%까지 증가하는 아세토니트릴의 직선 기울기하에서 120분간의 처리 조건하에서 역상 HPLC(high performance liquid chromatography)를 하여 펩티드를 분리하였다.

칼럼에서 용출된 펩티드를 210㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 서로간에 분명하게 분리된 두가지 펩티드, 즉 체류 시간이 66분인 TP10 및 체류 시간이 86분인 TP14를 별도로 채취하고 진공건조하여 0.1v/v% 트리플루오로아세트산과 50v/v% 아세토니트릴의 용액 200μl중에 용해하였다. 각각의 펩티드를 프로우틴시켄서에서 분석하여 N 말단으로부터 5개 아미노산 잔기까지를 확인하였다. TP10과 TPl4는 각각 서열번호(SEQ ID NO:) 2 및 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 아미노산 서열을 나타내었다. 동일한 분석에 의하여 신선한 동일한 효소 표품에 대해 보다 정밀한 분석을 한 결과, TP14는 그 N 말단에서 서열번호(SEQ ID NO:) 7을 나타내었다.

실험 5 : 트레할로오스 포스포릴라아제에 의한 당 가수분해 반응에 대한 기질 특이성

D-글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 락토오스, 트레할로오스, 네오트레할로오스, 셀로비오스, 멜리비오스, 코지비오스, 이소말토오스, 소포로오스, 젠티비오스, 니제로오스 및 라미나리비오스, 말토펜타오스 및 4-0-α-D-글루코실트레할로오스 중에서 선택된 1종의 당의 수용액에 실험 2의 방법으로 얻은 정제 트레할로오스 포스포릴라아제를 고형물 기준으로 당질 1g당 10 단위 혼합하고 5mM 인산 수소 2나트륨 존재하에 60℃ 및 pH 7.0에서 24시간 유지하였다.

각 반응액중의 당의 농도는 2w/v%이었다. 반응전 용액과 반응후 혼합물을 "KIESELGEL 60(20×2O㎝)" (미합중국의 Merck사 판매의 TLC용 알루미늄 플레이트)을 사용하여 박층 크로마토그래피(이하, 간단히 "TLC" 라 함)를 하였다. 전개 용매계로서 1-부탄올/피리딘/물(=7:3:1, 체적비)을 사용하고, 플레이트에서 각 시료를 실온에서 1회 전개한 후, 플레이트에 20v/v% 황산/메탄올 용액을 분무하고 110℃에서 약 10분간 가열하여 발색시켰다. 각 플레이트에서 검출된 혼합물과 용액의 스폿(spot)을 비교하여 각 당질에 효소가 작용하였는가를 체크하였다. 그 결과는 표 1에 나와 있다.

(주) + : 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 작용에 의해 가수분해 됨.

- : 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 작용에 의해 가수분해되지 않음.

표 1에 나온 바와 같이 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제는 트레할로오스에 대해 강력한 기질 특이성을 나타내었고 여기에 작용하여 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산을 생성하였으나 기타의 당류에는 작용하지 않았음을 알 수 있다.

실험 6 : 트레할로오스 포스포릴라아제에 의한 글루코실 전이당 생성반응에서의 수용체에 대한 특이성

당 공여체로서 β-D-글루코오스-1-인산과 표 2에 나온 수용체로서 단당류, 올리고당류 및 당알코올 중의 1종을 건조중량으로 동일한 양으로 하여 용해한 수용액에 실험 2의 방법으로 얻은 정제 트레할로오스 포스포릴라아제를 β-D-글루코오스-1-인산 1g당 10 단위 혼합하고 60℃ 및 pH 7.0에서 24시간 효소반응시켰다. 실험 5에서와 마찬가지로 반응전 용액과 반응후 혼합물을 TLC처리한 다음, 플레이트를 발색시켰다. 플레이트에서 검출된 혼합물과 용액의 각 시료의 스폿을 비교하여 반응후 혼합물의 새로 검출된 스폿에 근거하여 전이당의 생성하였는가를 판정하였다. 새로 검출된 스폿의 발색정도를 육안으로 관찰함으로써 전이당의 수득율을 상대적으로 평가하였다. 그 결과는 표 2에 나와 있다.

(주) - : 글루코실 전이당의 생성이 없음.

+ : 글루코실 전이당이 비교적 소량 생성함.

++ : 글루코실 전이당이 비교적 다량 생성함.

+++ : 글루코실 전이당이 상당히 다량 생성함.

표 2에 나온 바와 같이 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제는 당 공여체인 β-D-글루코오스-1-인산으로부터 D-크실로오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, 2-데옥시-D-글루코오스, D-푸코오스, L-푸코오스, 글루코사민 및 N-아세틸 글루코사민 등의 수용체로서의 환원성 알도오스쪽으로 글루코실기를 효과적으로 전이시킴으로써 글루코실 전이당을 생성함이 판명되었다. 본 발명의 효소의 기질 특이성을 고려할 때 이들 글루코실 전이당은 비환원성당인 것으로 판단되었다. α-D-글루코오스-1-인산을 β-D-글루코오스-1-인산 대신 당 공여체로서 사용하였을 경우 글루코실 전이당은 전혀 생성되지 않았다.

실험 6에서 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제에 의해 당전이 반응을 통해 생성되는 것으로 판명된 글루코실 전이당중 몇가지에 대해 아래의 실험 7 및 8을 참조하여 이들의 상세한 구조에 대하여 설명한다.

실험 7 : D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산으로부터의 글루코실 전이당

실험 6에서 기질로서 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산을 사용하여 얻은 반응 혼합물의 일부를, 1%의 농도가 되도록 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 희석하고, 수득한 희석액 0.5ml에 트레할라아제 표품(미합중국의 Sigma Chemical사 판매)을 1.0 단위 가하고 45℃에서 20시간 효소반응시켰다. 트레할라아제로 처리 또는 미처리된 반응 혼합물의 일부를 건조하고 피리딘에 용해하여 트리메틸실릴화하였다. 수득한 생성물을 "SILICONE OV-l7/CHROMOSOLB W" (일본국의 GL Sciences사 판매의 GLC용 수지)를 2%충전한 직경 3㎜, 길이 2m의 스테인레스강제 칼럼을 사용하여 캐리어 가스로서 질소 가스를 유량 40ml/분으로, 칼럼 오븐 온도 160 ~ 320℃, 승온속도 7.5℃/min의 조건하에서 가스 크로마토그래피(이하, 간단히 "GLC" 라 함) 분석을 하였다. 당 성분을 수소염 이온화 검출기로 검출하였다.

그 결과, 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 작용에 의해 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산으로부터 생성된 글루코실 전이당의 피이크의 체류 시간은 순수한 트레할로오스의 것과 일치하였음이 판명되었고, 트레할라아제의 처리에 의하여 피이크가 소실하여 D-글루코오스를 생성하였음이 판명되었다. 트레할라아제의 기질 특이성을 고려하면 이 글루코실 전이당은 트레할로오스인 것으로 추정되었다.

실험 8 : 글루코실-D-갈락토시드

본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제에 의한 D-갈락토오스로의 당전이 반응을 통해 생성된 글루코실 전이당을 확인하고자 글루코실 전이당을 제조하여 분리한 다음 구조를 확인하였다. 그 방법은 다음과 같다. 즉, 5% 트레할로오스, 2.5% D-갈락토오스 및 5mM 인산 2수소 나트륨을 함유한 수용액을 제조하고, 이 수용액을 pH 5.0으로 조정한후, 이 용액에 실험 2의 방법으로 제조한 정제 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 15 단위 가하고 60℃에서 72시간 반응시키고, 반응 혼합물을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존하는 효소를 실활하고, 제조한 혼합물로부터 얻은 시료에 대해 실험 7의 방법에 따라 GLC분석을 하였다. 그 결과, 반응 혼합물중에는 트레할로오스, D-갈락토오스, D-글루코오스 및 β-D-글루코오스-1-인산의 것과는 다른 체류시간을 가진 물질이 비교적 다량 함유되어 있음이 확인되었는대, 이것은 글루코실 전이당인 것으로 추정되었다. 이 GLC 데이터에 근거하여 당의 수득율은 약 30%이었다. 나머지 반응 혼합물을 pH 7.0으로 조정하고 여기에 잔존하는 트레할로오스 1g당 25 단위의 트레할라아제를 가한후 45℃에서 20시간 효소반응시켜 반응 혼합물중에 잔존하는 트레할로오스를 분해하였다. 생성물을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존하는 트레할라아제를 실활한후 활성탄으로 탈색하고 여과한후 H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염 및 정제하여 농도 약 50%되게 농축하여 아래와 같이 칼럼 크로마토그래피 처리한 다음, 글루코실 전이당 고함유 획분을 채취하였다.

분획에 사용된 수지는 "XT-1016"(일본국의 Tokyo Organic Chemical Industries사 판매의 알칼리 금속 강산형 양이온 교환수지, Na형, 가교도 4%)이었다. 이 수지를 물에 부유시켜 직경 3㎝, 길이 1m인 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4개에 충전한후 이들을 직열로 연결하여 전체 겔층 깊이가 약 4m되게 하였다. 칼럼 내부온도를 40℃로 유지하면서 당액을 수지에 대해 5v/v%의 체적으로 하여 칼럼에 공급한 다음, 40℃의 온수를 SV(공간속도) 0.15의 유속으로 칼럼을 통과시켜 당액을 분획하고, 글루코실 전이당 고함유 획분을 채취하였다.

각 획분을 한데 모아 탈염하고 정제한후 농축하여 농도 약 40%의 농축액을 얻은 다음 "YMC-Pack OSD" (일본국의 YMC사 판매의 옥타데실 실리카 겔)이 충전된 칼럼에서 크로마토그래피 처리하여 글루코실 전이당을 함유한 획분을 채취하였다. 이들 획분을 한데 모아 농도 약 40%로 농축한 다음, 상기한 칼럼 크로마토그래피 처리를 재차 하였다. 수득한 글루코실 전이당 고함유 용액을 탈염, 정제 및 농축하여 진공하에 건조함으로써 효소반응에 사용된 원료당에 대해 고형물 기준으로 약 20%의 수득율로 당함유 분말제품을 얻었다. 실험 7의 방법에 준하여 이 분말제품을 GLC 분석한 결과, 고형물 기준으로 글루코실 전이당을 약 98% 함유하고 있음이 판명되었다.

글루코실 전이당 고함유 분말제품을 산으로 분해한후 GLC분석을 한 결과, 이 당은 산으로 분해했을 경우 D-글루코오스와 D-갈락토오스를 약 1:1의 몰비로 생성하였음이 판명되었다. 이 분말제품을 메틸화하고 산으로 가수분해한후 환원시켜 아세틸화함으로써 부분 메틸헥시톨아세테이트를 얻은 다음, GLC분석을 하여 2,3,4,6-테트라-O-메틸-1,5-디-O-아세틸글루시톨 및 2,3,4,6-테트라-O-메틸-1,5-디-O-아세틸갈락티톨을 검출하였다. 이 데이터로부터 글루코실 전이당은 D-글루코오스와 D-갈락토오스가 1:1의 몰비로 구성되어 있고, D-글루코오스의 C-1의 OH기와 D-갈락토오스의 C-1의 OH기가 이들 당 사이의 결합에 관여하고 있음이 확인되었다.

글루코실갈락토시드의 구조를 보다 구체적으로 확인하고자 이 당질에 대해 비선광도와 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과, 다음과 같은 측정치를 얻었다: 비선광도 [α]^D _2O=+223°(c=0.97, H₂O); ¹³C-NMR 스펙트럼(100㎒, D₂O): TSP로부터의 oppm: 96.16, 95.97, 75.37, 74.94, 74.14, 73.90, 72.53, 72.11, 71.80, 70.76, 64.03, 및 63.37.

이들 데이터는 화학합성한 화합물인 α-D-갈락토피라노실 α-D-글루코피라노시드의 진정한 데이터와 거의 일치하였으며, 이로부터 글루코실갈락토시드는 글루코실-D-갈락토시드, 즉 α-D-갈락토피라노실 α-D-글루코피라노시드로서 D-글루코오스와 D-갈락토오스가 α,α-1,1 결합을 통해 서로 결합된 이당인 것을 확인하였다.

실험 9 : 급성독성 시험

실험 8의 방법으로 제조한 글루코실-D-갈락토시드 고함유 분말상 제품, 실시예 A-12의 방법으로 제조한 글루코실-D-크실로시드 고함유 분말상 제품, 실시예 A-14의 방법으로 제조한 글루코실-D-푸코시드 고함유 분말상 제품 및 실시예 A-15의 방법으로 제조한 글루코실-L-푸코시드 고함유 분말상 제품의 급성독성 시험을 7 주령 dd계 마우스에게 각각 경구투여하여 시험하였다. 그 결과, 최대 투여량인 50g/마우스 체중 kg을 투여해도 마우스의 사망예가 없었다. 이 데이터로부터 이들 당류는 독성이 극히 낮음을 알 수 있다.

실시예 A는 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제와, 이 효소를 코우드하는 DNA 및 이 효소를 사용하여 제조된 글루코실 전이당을 함유한 당의 제조방법을 설명하는데, 물론 이들 실시예는 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 A-1 : 효소액

더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047을 실험 1에서 사용한 것과 동일한 신선한 배지에서 온도를 65℃로 설정하여 실험 1의 방법에 따른 혐기성 조건하에서 퍼어멘터를 사용하여 약 30시간 배양하였다. 수득한 배양물을 원심분리하여 균체를 얻은 다음, 이것을 초음파 파쇄하고 원심분리하였다. 상청액을 "DEAE-TOYOPEARL GEL"이 충전된 칼럼에 공급하여 겔에 흡착시키고, 0M로부터 0.5M까지 증가하는 염화 나트륨의 직선 기울기하에서 수용액을 공급하여 칼험으로부터 용출시킨 다음, 약 0.1M 염화 나트륨에서 용출하는 트레할로오스 포스포릴라아제 활성획분을 채취하였다. 이들 획분을 한데 모아 한외여과 멤브레인으로 농축함으로써 트레할로오스 포스포릴라아제를 약 20 단위/ml 함유한 효소액을 원료 배양물의 총활성에 대해 약 40%의 수율로 얻었다.

실시예 A-2 : DNA 제조

실험 1의 방법에 따라 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047을 실험 1과 동일한 신선한 영양배지에 접종하고 60℃에서 24시간 배양하였다. 증식된 세포를 원심분리에 의하여 배양물로부터 분리하고 적당량의 Tris-EDTA-식염수 완충액(이하, 간단히 "TES 완충액"이라 함)(pH 8.0) 중에 부유시킨후, 균체 부유액에 대해 리소자임 0.05w/v%을 가하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 이어서 효소처리된 혼합물을 -80℃에서 1시간 동결한후 여기에 TES 완충액(pH 9.0)을 가하고, 이어서 60℃의 TES 완충액-페놀 혼합액을 가한 다음 충분히 교반하고 냉각하여 원심분리함으로써 생성된 윗층을 채취하였다. 여기에 2배 체적의 차거운 에탄올을 가하고 생성된 침전을 채취하여 적당량의 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해한후, 여기에 리보뉴클레아제 7.5㎍과 프로테아제 l25㎍을 혼합하여 37℃에서 1시간 유지하였다. 수득한 혼합물에 클로로포름과 이소아밀 알코올의 혼합액을 가한 다음, 교반하여 방치한후 생성된 윗층을 채취하였다. 여기에 차거운 에탄올을 가한후 생성된 침전을 채취하여 70v/v% 차거운 에탄올로 세척하고 진공하에 건조하여 DNA를 얻었다. 이 DNA를 SSC 완충액(pH 7.1)에 농도 약 1㎎/ml되도록 용해하여 -80℃에서 동결하였다.

실시예 A-3 : 형질 전환체 및 재조합 DNA 제조

실시예 A-2의 DNA 용액 1ml을 용기에 넣고, 여기에 제한효소 Alu I를 약 20 단위 가하고 37℃에서 30분간 유지하여 DNA를 부분적으로 소화시켰다. 수득한 혼합물을 수크로오스 밀도 한외여과하여 약 2,000 ~ 5,000 염기쌍의 DNA 단편을 채취하였다. 이와 병행하여 "BluescriptII SK(+)"(미합중국의 Stratagene Cloning Systems사 판매의 플라스미드 벡터)를 제한효소 Sma I으로써 완전히 분해하고, 분해된 벡터 0.3㎍과 DNA 단편 약 3㎍을 "DNA LIGATION KIT"(일본국의 Takara Shuzo사제)를 사용하여 이 키트에 첨부된 방법에 따라 연결하였다. 수득한 재조합 DNA를 사용하여 "EPICURIAN COLI XL1 BLUE"(미합중국의 Stratagene Cloning Systems사 판매의 대장균종에 속하는 미생물) 100㎕을 종래의 면역담당 세포법으로 형질전환하여 유전자 라이브러리를 얻었다.

수득한 유전자 라이브러리로서의 형질 전환체를 통상의 방법으로 제조한 트립톤 10g/l, 효모 추출물 5g/l, 염화 나트륨 5g/l,앰피실린 나트륨염 75㎎/l 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50㎎/l를 함유하는 한천 평판(pH 7.0)에 접종하고 37℃에서 18시간 배양한 다음, 평판위에 생긴 백색 콜로니 약 5,000개를 "HYBOND-N+" (미합중국의 Amersham사 판매의 나일론막)위에 고정하였다. 실험 4에서 밝혀진 서열번호(SEQ ID NO:) 6의 N 말단 영역의 아미노산 9 ~ 15에 근거하여 5' -TAYCCNTTYGARGAYTGGGT-3' 로 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고 [γ-³²P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표지하여 1차 프로우브(probe)로서의 합성 DNA를 얻었다. 나일론막 위에 고정된 콜로니 중에서 1차 프로우브와 강력히 하이브리다이즈된 세개의 콜로니를 종래의 콜로니 하이브리다이제이션법으로 선택하였다. 이들 세개의 콜로니를 상기한 바와 마찬가지로 나일론막위에 고정하였다. 실험 4에서 밝혀진 서열번호(SEQ ID NO:) 7의 아미노산 서열에 근거하여 5' -AAYTAYGAYTAYTAYGARCC-3' 로 나타내어지는 뉴클레오티그서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고 [γ-³²P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표지하여 2차 프로우브로서의 합성 DNA를 얻었다. 나일론막위에 고정된 상기한 세개의 콜로니 중에서 2차 프로우브와 강력히 하이브리다이즈된 한개의 콜로니를 종래의 콜로니 하이브리다이제이션법으로 선택하여 이를 형질 전환체로서의 "TTP4" 로 명명하였다.

형질 전환체 TTP4를 앰피실린의 나트륨염을 100㎍/ml을 함유한 L-브로드(pH7.0)에 종래방식으로 접종하여 37℃에서 24시간 회전 진탕하에 배양하였다. 배양이 끝난후 배양물을 원심분리하여 균체를 얻은 다음, 이것을 종래의 알칼리-SDS법으로 처리하여 재조합 DNA를 추출하였다. 재조합 DNA에 대해 종래의 디데옥시법으로 분석을 한 결과, 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047 유래의 3,345염기쌍으로 된 서열번호(SEQ ID NO:) 8의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA를 함유하고 있었다. 서열번호(SEQ ID NO:) 8에 나온 바와 같이 서열번호(SEQ ID NO:) 8의 염기쌍 596-2,917로 된 뉴클레오티드 서열은 774개 아미노산으로 된 아미노산 서열을 코우드함이 판명되었다.

뉴클레오티드 서열로부터 추정된 아미노산 서열과 실험 4에서 확인된 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 N 말단 및 내부 아미노산 서열, 즉 서열번호(SEQ ID NO:) 1 ~ 3 및 서열번호(SEQ ID NO:) 6 ~ 7을 비교한 결과, 서열번호(SEQ ID NO:) 1 ~ 3은 서열번호(SEQ ID NO:) 8의 아미노산 2 ∼ 6, 308 ~ 312 및 633 ~ 637과 각각 일치한 반면, 서열번호(SEQ ID NO:) 6 ~ 7은 서열번호(SEQ ID NO:) 8의 아미노산 2 ~ 31 및 633 ~ 647과 각각 일치하였다.

이 데이터로부터 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제는 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 아미노산 서열을 가지고 있고, 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047의 효소는 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA에 의해 코우드됨을 알 수 있다. 상기한 방법으로 제조되어 그 뉴클레오티드 서열이 밝혀진 재조합 DNA를 "pTTP4" 로 명명하였다. 도 5에 나온 바와 같이 재조합 DNA는 제한효소 Pst Ⅰ에 의한 인식부위의 하류쪽에 위치하고 있다.

실시예 A-4 : 형질 전환체에 의한 트레할로오스 포스포릴라아제 제조

폴리펩톤 l6g/l, 효모 엑스 10g/l 및 염화 나트륨 5g/l을 함유한 수용액 100ml을 500ml 용량의 삼각 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 오토클레이브 처리하고 냉각하여 무균적으로 pH 7.0으로 조정한후, 여기에 앰피실린의 나트륨염 10㎎을 무균적으로 가하여 액체 영양배지로 하였다. 실시예 A-3의 형질 전환체 TTP4을 이 배지에 접종하고 37℃에서 약 20시간 통기교반하에 배양하여 종배양물을 얻었다. 종배양물의 제조방법에 따라 종배양물에 사용한 것과 동일한 신전한 영양배지 7리터를 10리터 용량의 퍼멘터(fermenter)에 넣고 종배양물 70ml을 접종한후 통기 교반하에 약 20시간 배양하였다. 수득한 배양물을 종래방식으로 원심분리하여 균체를 채취한후 이것을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 부유시키고 초음파 처리하여 균체를 파쇄한 다음 원심분리하여 불용물을 제거하고 상청액을 회수하였다. 이 상청액을 10mM 인산 완충액에 대해 투석하고 상청액중의 트레할로오스 포스포릴라아제 활성을 측정한 결과, 배양물 1리터당 약 700 단위의 효소가 생성해 있었다.

1차 대조로서 대장균 XLI-Blue 균주를 상기 형질전환체 배양물에서와 마찬가지로 영양배지에 접종하여 배양하였는데, 단, 이 경우에서 배지에 앰피실린을 첨가하지 않았다. 증식된 균체를 파쇄한 다음 상청액을 채취하여 투석하였다. 2차 대조로서 실험 1의 방법에 따라 더어모아네로븀 브로키이 ATCC 35047을 동일한 성분으로 된 영양배지에서 60℃에서 정치 배양하였는데, 단, 이 경우에서는 앰피실린을 사용하지 않았다. 형질전환체의 경우에서와 마찬가지로 배양물중의 균체를 파쇄한 다음 상청액을 채취하여 투석하였다. 1차 대조로서의 투석액에서는 이 효소의 활성이 전혀 검출되지 않았다. 2차 대조로서의 투석액은 배양물 l리터당 약 2 단위의 효소활성을 나타내었는데, 이것은 형질전환체 TTP4의 경우보다 훨씬 낮은 것이었다.

실험 2의 방법에 준하여 실시예 A-4의 투석액을 "DEAE-TOYOPEARL 650 GEL" 및 "ULTROGEL AcA44 RESIN" 을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하고, 정제효소를 실험 3의 방법에 따라 분석한 결과, SDS-PAGE 에 의한 분자량이 88,000 ± 5,000 달톤이고 겔여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 190,000 ± 10,000 달톤이며, 등전점 폴리아크럴아미드 겔 전기 영동법에 의한 등전점이 5.4 ± 0.5이고, 최적온도 약 70℃, 최적 pH 약 7.0 ~ 7.5, 열적 안정성 60℃ 이하, 그리고 pH 안정성 약 6.0 ~ 9.0 임이 판명되었는데, 이들을 모두가 실험 1 및 2에서 제조한 효소의 경우와 실질적으로 동일하였다. 이들 결과로부터 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 재조합 DNA 기술에 의해 충분히 제조할 수 있고, 이에 따라 효소의 수득율도 유의하게 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

실시예 A-5 : 효소액

실시예 A-3의 형질 전환체 TTP4를 실시예 A-4의 방법으로 영양배지에서 배양하고, 배양물을 원심분리하여 얻은 균체를 초음파로 파쇄한후, 파쇄된 균체 부유액중의 상청액에 대해 트레할로오스 포스포릴라아제 활성을 측정한 결과, 그 활성은 배양물 1리터당 약 0.7 단위이었다. 상청액을 한외여과 멤브레인으로 농축하고 농축액을 투석하여 트레할로오스 포스포릴라아제 활성 약 10 단위/ml인 효소액을 배양물의 전체 효소활성에 대해 약 70%의 수율로 얻었다.

실시예 A-6 : 트레할로오스 함유 당액

말토오스 5%를 함유한 25mM의 인산수소 2칼륨-시트르산 완충액(pH 6.0)에 시판품인 세균성 말토오스 포스포릴라아제를 말토오스 1g당 5 단위와 실시예 A-1의 방법으로 제조한 트레할로오스 포스포릴라아제를 말토오스 1g당 50 단위 가한 다음, 30℃에서 120시간 배양하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 30분 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각하여 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과후 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염 및 정제하여 농축함으로써 트레할로오스를 함유한 75% 시럽상 당액을 고형물당 원료에 대해 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 트레할로오스 약 45%를 함유하며 감미가 양호하고 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품 및 각종 성형물에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-7 : 트레할로오스 고함유 분말

실시예 A-6에서의 반응과 정제에 의해 제조된 고형물당 트레할로오스를 약 45% 함유한 당액을 원료로하여 고형물당 약 20%의 농도가 되도록 한다음, 여기에 고형물당 1g당 글루코아밀라아제를 5 단위 가하여 pH 4.5 및 40℃에서 16시간 유지하여 잔존하는 말토오스를 분해하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 30분 가열하여 효소반응을 정지시키고 약 40%의 용액으로 농축하였다. 트레할로오스 함량을 높이기 위해 "XT-1016" (일본국의 Tokyo Organic Chemical Industries사 판매의 알칼리 금속 강산형 양이온 교환수지, Na형, 가교도 4%)의 물 부유액을 충전한 직경 3㎝, 길이 1m의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4개를 직열로 연결하여 전체 겔층 깊이가 약 4m로 한것을 사용하고 이 수지에 농축액을 5v/v% 통액한후, 40℃의 온수를 칼럼에 SV 0.15의 유속으로 공급하여 용액을 분획한 다음, 트레할로오스 고함유 획분을 채취하였다. 각 획분을 한데 모아 농축하고 진공하에 건조한후 분말화하여 트레할로오스 고함유 분말을 고형물당 원료에 대해 약 40%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 트레할로오스를 약 95% 함유하며 감미가 양호하고 적당한 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품, 의약품 및 각종 성형물에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-8 : 글로코실-D-갈락토시드 함유 당액

트레할로오스 5%, D-갈락토오스 5% 및 5mM 인산 2수소 나트륨을 함유한 수용액을 pH 5.0으로 조정하고 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 10 단위 가하고 60℃에서 72시간 효소 반응시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존하는 효소를 실활하고 냉각하여 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색후 여과하고, H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제하여 다시 농축함으로써 글루코실소르보오스를 함유한 농도 약 75%의 시럽상 당액을 고형물당 원료에 대해 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-갈락토시드를 약 22% 함유하며 감미가 양호하고 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품, 의약품 및 각종 성형물에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-9 : 글루코실-D-갈락토시드 함유 당액

트레할로오스 10%, D-갈락토오스 5% 및 5mM 인산 2수소 나트륨을 함유한 수용액을 pH 6.0로 조정하고 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 30 단위 가하고 60℃에서 96시간 효소 반응시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각한후, 여기에 시판품인 빵효모를 습중량으로 5% 가하고 1N 수산화 나트륨 용액을 가하여 pH를 5 ~ 6으로 조절함과 아울러 반응 온도를 27℃에서 6시간 유지하면서 반응 혼합물중의 D-글루코오스를 동화시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하여 효모를 제거하고 수득한 상청액을 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과, H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제하여 농축함으로써 고형물당 농도 약 75%의 시럽을 고형물당 원료에 대해 약 65%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-갈락토시드를 약 40% 함유하며 고품위의 감미와 적당한 점도와 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품, 의약품 및 각종 성형물에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-10 : 글루코실-D-갈락토시드 고함유 분말

실시예 A-8 에서의 반응과 정제에 의해 제조된 고형물당 글루코실-D-갈락토시드를 약 22% 함유한 당액을 원료로 하여 고형물당 약 45%의 농도가 되도록 하였다. 글루코실-D-갈락토시드의 함량을 높이기 위해 "XT-1016" (일본국의 Tokyo Oranic Chemical Industries사 판매의 알칼리 금속 강산형 양이온 교환수지, Na형, 가교도 4%)의 물부유액을 충전한 직경 3㎝,길이 1m의 자켓부 스테인레스강제 칼럼 4개를 직열로 연결하여 전체 겔층 깊이가 약 4m로 한 것을 사용하고 이 수지에 용액을 5v/v% 통액한 후, 칼럼 내부 온도를 40℃로 유지하면서 40℃의 온수를 칼럼에 SV 0.15의 유속으로 공급하여 용액을 분획한 다음, 글루코실-D-갈락토시드 고함유 획분을 채취하였다. 각 획분을 한데 모아 농축하고 진공하에 건조한후 분말화하여 글루코실-D-갈락토시드 고함유 분말을 고형물당 원료에 대해 약 25%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-갈락토시드를 약 70% 함유하며 고품의의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품 및 각종 성형물에 있어서 감미료, 맛개선제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-11 : 글로코실-D-크실로시드 함유 당액

트레할로오스 5%, D-크실로오스 2.5% 및 5mM 인산 2수소 나트륨을 함유한 수용액을 pH 5.0으로 조정하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 15 단위 가하여 60℃에서 72시간 효소반응시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존하는 효소를 실활하고 냉각하여 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색후 여과하고, H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제하여 다시 농축함으로써 약 75% 시럽을 고형물당 원료에 대해 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-크실로시드를 약 20% 함유하며 고품위의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품 및 각종 성형물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-12 : 글루코실-D-크실로시드 고함유 분말

실시예 A-11에서의 반응과 정제에 의해 제조된 고형물당 글루코실-D-크실로시드를 약 20% 함유한 당액을 원료로 하여 고형물당 약 45% 농도가 되도록 하였다. 글루코실-D-크실로시드의 함량을 높이기 위해 "DOWEX 50WX4(Ca형)" (미합중국의 Dow Chemical사 판매의 알칼리 토금속 강산형 양이온 교환수지)를 사용한 것외에는 실시예 A-10의 방법에 따라 용액을 칼럼 크로마토그래피 처리하여 글루코실-D-크실로시드 고함유 획분을 채취하였다. 각 획분을 한데 모아 정제하고 농축하고 진공하에 건조한 후 분말화하여 글루코실-D-크실로시드 고함유 분말을 고형물당 약 25%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-크실로시드를 약 60% 함유하며 고품위의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품 및 각종 성형물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-13 : 글루코실-D-푸코시드 함유 당액

트레할로오스 5%, D-푸코오스 2.5% 및 5mM 인산수소 2나트륨을 함유한 수용액을 pH 5.0로 조정하고 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 20 단위 가하고 60℃에서 72시간 효소 반응시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 30분 가열하여 잔존하는 효소를 실활시키고 냉각하여, 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색후 여과하고, H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염하여 정제하고, 다시 농축함으로써 약 75% 시럽을 고형물당 원료에 대해 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-푸코시드를 약 20% 함유하며 고품위의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품, 의약품 및 각종 성형물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-14 : 글루코실-D-푸코시드 고함유 분말

트레할로오스 5%, D-푸코오스 2.5% 및 5mM 인산 2수소 나트륨을 함유한 수용액을 pH 5.0로 조정하고 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 20 단위 가하고 60℃에서 72시간 효소 반응시켰다. 반응 혼합물을, 수산화 나트륨을 가하여 pH 10 이상의 알칼리성 pH로 유지하면서 100℃에서 가열하여 냉각하고 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색후 여과하고, H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제하여 다시 농축함으로써 글루코실-D-푸코시드 함유의 분말을 고형물당 원료에 대해 약 60%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-푸코시드를 약 50% 함유하며 고품위의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가치고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품, 의약품 및 각종 성형물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-15 : 글루코실-L-푸코시드 함유 분말

트레할로오스 5%, L-푸코오스 2.5%및 5mM 인산 2수소 나트륨을 함유한 수용액을 pH 6.0로 조정하고 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 15 단위 가하고 60℃에서 72시간 효소 반응시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 30분간 가열하여 잔존하는 효소를 실활하고 냉각한후 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색후 여과하고, H형 및 OH형 이온교환 수지로 탈염, 정제하여 다시 농축함으로써 글루코실-L-푸코시드 함유의 분말을 고형물당 원료에 대해 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-L-푸코시드를 약 20% 함유하며 고품위의 감미와 적당한 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품, 의약품 및 각종 성형물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-16 : 트레할로오스 함유 당액

말토오스 5%을 함유한 25mM 인산 수소 2칼륨-시트르산 완충액(pH 6.0)에 시판품인 세균성 말토오스 포스포릴라아제를 말토오스 1g당 5 단위와 실시예 A-5의 방법으로 제조한 트레할로오스 포스포릴라아제를 말토오스 1g당 50 단위 가한 다음, 30℃에서 120시간 효소반응시켰다. 반응 혼합물을 100℃에서 30분 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각하여 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과후 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염 및 정제하여 다시 농축함으로써 약 75% 시럽을 고형물당 원료에 대해 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 트레할로오스 약 45%를 함유하며 고품의의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품 및 각종 성형물에 있어서 감미료, 맛 개량제, 안정제, 비피드균 성장 촉진제 및 미네랄 흡수 촉진제로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-17 : 글루코실-D-푸코시드 함유 당액

트레할로오스 5%, D-푸코오스 2.5% 및 5mM 인산 수소 2나트륨을 함유한 수용액을 pH 5.0로 조정하고 여기에 실시예 A-5의 방법으로 얻은 트레할로오스 포스포릴라아제를 트레할로오스 1g당 20 단위 가하고 60℃에서 72시간 효소 반응시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 30분 가열하여 잔존 효소를 실활하고 냉각하여 통상의 방법으로 활성탄에 의한 탈색, 여과후 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의한 탈염 및 정제하여 다시 농축함으로써 약 75% 시럽을 고형물당 원료에 대해 약 95%의 수율로 얻었다.

이 제품은 고형물당 글루코실-D-푸코시드를 약 20% 함유하며 고품위의 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있으므로 음식물, 화장품, 의약품, 의약품 및 각종 성형물에 유리하게 이용할 수 있다.

아래의 실시예 B는 글루코실 전이당을 함유한 본 발명의 당 조성물을 설명하는 것이다.

실시예 B-1 : 감미료

실시예 A-10의 방법으로 제조한 글루코실-D-갈락토시드 고함유 분말 1 중량부에 "αG SWEET"(일본국의 東洋精糖 주식회사 판매의 α-글리코실 스테비오시드) 0.05 중량부를 가하고 이 혼합물을 균일히 혼합하여 분말상 감미료를 제조하였다.

이 제품은 고품질의 감미료로서 수크로오스의 약 2배의 감미력을 가지며, 칼로리는 감미도당 수크로오스의 약 l/2이 된다. 따라서 이 제품은 저칼로리 감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 사람, 예컨대 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물의 감미 부여에 만족스럽게 사용할 수 있다. 또한 이 제품은 충치 유발균에 의한 산의 생성이 적고 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물의 감미 부여에도 적절히 사용할 수 있다.

실시예 B-2 : 하아드 캔디

실시예 A-9의 방법으로 제조한 글루코실-D-갈락토시드를 함유한 당액 30 중량부를 수분함량 25%의 수소첨가 맥아엿 80 중량부에 가하여 혼합, 용해하고, 수득한 용액을 수분함량 약 2% 미만이 될 때까지 감압하에 농축하고, 여기에 시트르산 1 중량부와 적당량의 레몬향료 및 착색제를 가하여 혼화한 다음 이 혼합물을 혼련하여 성형함으로써 하아드 캔디를 제조하였다. 이 제품은 고품질의 감미, 낮은 보습성을 가지며 용해함이 없이 깨물기가 좋다.

실시예 B-3 : 츄잉 검

실시예 A-12의 방법으로 제조한 글루코실-D-크실로시드 고함유 분말 4 중량부에 가열하여 연화, 용융시킨 검 베이스 2 중량부와 글루코오스 3 중량부를 가하고, 다시 적당량의 박하 향료를 가한 다음, 로울에서 반죽하여 혼합물을 성형함으로써 츄잉 검을 제조하였다. 이 제품은 텍스쳐와 풍미가 양호하다.

실시예 B-4 : 초콜렛

실시예 A-14의 방법으로 제조한 글루코실-D-푸코시드 고함유 분말 15 중량부에 카카오 페이스트 40 중량부, 카카오 버터 10 중량부, 수크로오스 10 중량부 및 탈지 우유 15 중량부를 혼합하고, 이 혼합물을 리파이너를 통과시켜 입자크기를 미세하게한 다음, 이 혼합물을 콘체에 넣고 레시틴 0.5 중량부를 혼합하여 50℃에서 이틀 동안 반죽하였다. 반죽한 혼합물을 성형기에서 성형하여 고화시켜 초콜렛을 제조하였다. 이 제품은 지방과 설탕의 백화현상이 없으며 양호한 맛, 풍미를 가지며 혀에서 잘 녹는다.

실시예 B-5 : 커스타드 크리임

실시예 A-15의 방법으로 제조한 글루코실-L-푸코시드 고함유 분말 400 중량부에 옥수수 전분 500 중량부, 말토오스 500 중량부 및 식염 5 중량부를 가하고, 이 혼합물을 체를 통과시켜 충분히 혼합하고 계란 1,400 중량부를 가하여 교반하고, 여기에 끓인 우유 5,000 중량부를 서서히 가한 후 가열하면서 계속 교반하였다. 옥수수 전분이 완전히 호화하여 반투명하게 되었을때 가열을 중지하고 냉각하여 소량의 바닐라 향료를 가함으로써 커스타드 크리임을 제조하였다. 이 제품은 평활한 표면을 가지며 강한 감미가 없는 양호한 맛을 가지고 있다.

실시예 B-6 : 우이로(전분 페이스트)

실시예 A-13의 방법으로 제조한 글루코실-D-푸코시드 함유 당액 90 중량부에 쌀가루 90 중량부, 옥수수 전분 20 중량부, 설탕 20 중량부, 녹차 분말 1 중량부 및 물 적당량을 가하고 균일히 반죽한후 용기에 넣어 60분간 증기찜하여 분말녹차 우이로를 제조하였다. 이 제품은 광택과 깨물기가 양호하고 풍미와 맛도 양호하다. 또한, 전분의 노화도 잘 억제되어 장기간 안정하다.

실시예 B-7 : 베타라-즈케(통무우 피클)

실시예 A-8의 방법으로 제조한 글루코실-D-갈락토시드 함유 당액 1 중량부, 말토오스 3 중량부, 감초 제제 0.05 중량부, 말산 0.008 중량부, 글루탐산 나트륨 0.07 중량부, 소르브산 칼륨 0.03 중량부 및 풀룰란 0.2 중량부를 균일히 혼합하여 베타라-즈케 원료를 제조하였다. 무우 30㎏을 통상의 방법으로 먼저 식염에 절인 다음 설탕으로 절임한 것을 상기 베타라-즈케 원료 4㎏으로 제조한 조미액에 절여 베타라-즈케를 제조하였다. 이 제품은 색깔과 광택 및 향기가 양호하고 적당한 감미를 가지며 깨물기도 양호하다.

실시예 B-8 : 유산균 음료

실시예 A-11의 방법으로 제조한 글루코실-D-크실로시드 함유 당액 130 중량부, 탈지 우유 175 중량부 및 "NYUKAOLIGO"(일본국의 林原상사 판매의 락토수크오스 고함유 분말) 50 중량부를 물 1,150 중량부에 용해하고, 이 용액을 65℃에서 30분간 살균하여 40℃로 냉각하고, 통상의 방법으로 스타아터로서의 유산균 30 중량부를 접종하여 37℃에서 8시간 배양함으로써 소요의 제품을 제조하였다. 이 제품은 유산균을 함유한 음료수로서 맛과 향기가 양호하다. 이 제품은 균을 안정화하고 성장을 촉진하는 올리고당을 함유한다.

실시예 B-9 : 스킨 크리임

실시예 A-7의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 4 중량부에 모노스테아르산 폴리옥시에틸렌 글리콜 2 중량부, 자기 유화형 모노스테아르산 글리세린 5 중량부, α-글리코실 루틴 2 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 트리옥탄산 글리세롤 10 중량부 및 적당량의 방부제를 가하고, 이 혼합물을 통상의 방법으로 가열 용해하였다. 여기에 1,3-부틸렌 글리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 가하여 호모게나이저로 유화하고, 향료를 적당량 혼합하여 스킨 크리임을 제조하였다. 이 제품은 퍼짐성이 좋은 크리임으로서 햇빛 그을음 방지제, 피부 정화제, 피부 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-10 : 치약

인산 수소 칼슘 45 중량부, 소디움 라우릴 술페이트 1.5 중량부, 글리세린 25 중량부, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트 0.5 중량부, 사카린 0.02 중량부 및 방부제 0.05 중량부 및 물 13 중량부를 실시예 A-6의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 당액 15 중량부와 혼합하여 치약을 제조하였다. 이 제품은 광택과 세정력이 우수하여 치약으로 사용하기에 적당하다.

실시예 B-11 : 경관 영양제

아래의 성분으로 된 조성물을 제조하였다: 실험 8의 방법으로 제조한 글루코실-D-갈락토시드 고함유 분말 80 중량부, 건조 난황 190 중량부, 탈지 우유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.85 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴 아미드 0.04 중량부로 된 조성물을 제조하였다. 이 조성물 25 g씩을 라미네이트 알루미늄제 소포에 넣고 가열 밀봉하여 소요의 제품을 제조하였다. 이 제품은 1대분을 약 150 ~ 300ml의 물에 용해하여 영양 보급액으로 하여 경관방법에 의해 비강, 식도, 위 등에 투여하여 사용한다.

실시예 B-12 : 딸기잼

생딸기 150 중량부, 수크로오스 60 중량부, 말토오스 20 중량부, 실시예 A-16의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 당액 40 중량부, 펙틴 5 중량부 및 시트르산 1 중량부를 혼합하여 남비속에서 끓여 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 맛, 향기 및 색깔이 양호하다.

실시예 B-13 : 가당 연유

신선한 우유 100 중량부에 수크로오스 1 중량부와 실시예 A-17의 방법으로 제조한 글루코실-D-푸코시드 함유 당액 3 중량부를 용해하고 이 용액을 플레이트 히이터에서 가열하여 살균한후 농도 약 70%로 농축하여 무균적으로 캔에 포장하여 소요의 제품을 얻었다. 이 제품은 온화한 감미, 향기 및 맛을 가지므로 유아용 식품, 과실, 커피, 코코아 및 차 등의 조미용으로 유리하게 사용할 수 있다.

상기한 설명으로부터 명백한 바와 같이 본 발명은 종래의 트레할로오스 포스포릴라아제의 경우보다 높은 최적 온도와 열적 안정성을 가진 신규의 트레할로오스 포스포릴라아제의 발견에 근거하여 된 것이다. 본 발명에 의한 트레할로오스 포스포릴라아제는 최적 pH가 존재하는 비교적 넓은 범위의 pH 안정성을 가지고 있다. 트레할로오스 포스포릴라아제는 이 효소를 만족스럽게 고수율로 생성할 수 있는 미생물을 이용하여 제조할 수 있다. 따라서 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 기타 당의 존재하에 당 공여체로서의 β-D-글루코오스-1-인산에 작용시키면 종래 공지되어 있기는 하지만 얻을 수가 거의 없었던 글루코실-D-갈락토시드를 비롯한 글루코실 전이당을 공업적인 규모로 비교적 저렴하게 제조할 수 있다.

글루코실 진이당 및 이것을 함유한 당 조성물을 비교적 고품위 감미를 가진 감미료, 맛개선제, 품질 개량제, 부형제, 점도 조절제, 습도 조절제, 광택 부여제 및 보충 영양제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 및 성형물에 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 우수한 특징들로 인하여 식품, 화장품 및 의약품 등의 분야는 물론이거니와 농업, 어업, 축산업 및 화학공업에 기여하는 바가 다대하다.

[서열표]

(1) 서열번호(SEQ ID NO:) 1의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 5 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(B) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(v) 단편형 : N말단 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 1:

(2) 서열번호(SEQ ID NO:) 2의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 5 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(v) 단편형 : 내부 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 2:

(3) 서열번호(SEQ ID NO:) 3의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 5 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(v) 단편형 : 내부 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 3:

(4) 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 773 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 4:

(5) 서열번호(SEQ ID NO:) 5의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 2319 염기쌍

(B) 서열의 형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 5:

(6) 서열번호(SEQ ID NO:) 6의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 30 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(v) 단편형 : N말단 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 6:

(7) 서열번호(SEQ ID NO:) 7의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 15 아미노산

(B) 서열의 형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(v) 단편형 : 내부 단편

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 7:

(8) 서열번호(SEQ ID NO:) 8의 정보 :

(i) 서열의 특징 :

(A) 서열의 길이 : 3345 염기쌍

(B) 서열의 형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 2본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : Genomic DNA

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 더어모아네로븀 브로키이(Thermoanaerobium brokii)

(F) 주명 : ATCC 35047

(ix) 특징 :

(A1) 특징을 나타내는 기호 : 1-595 5'-UTR

(C1) 특징을 결정하는 방법 : E

(A2) 특징을 나타내는 기호 : 596-2917 mat Peptide

(C2) 특징을 결정하는 방법 : S

(A3) 특징을 나타내는 기호 : 2916-3345 3'-UTR

(C3) 특징을 결정하는 방법 : E

(xi) 서열번호(SEQ ID NO:) 8:

도 1은 온도가 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

도 2는 pH가 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

도 3은 온도가 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 안정성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

도 4는 pH가 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제의 안정성에 미치는 영향을 나타내는 그래프.

도 5는 본 발명의 재조합 DNA의 제한지도이다. 도면에 있어서 화살표는 본 발명의 트레할로오스 포스포릴라아제를 코우드하는 DNA를 나타낸다.

Claims (16)

1. (가) 무기 인산 또는 그 염의 존재하에 트레할로오스를 가인산 분해(phosphorolysis)하여 D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산 또는 그 염을 생성하고,

   (나) 아래의 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 아미노산 서열을 가진 트레할로오스 포스포릴라아제.

   SEQ ID NO: 4

   

   
2. 청구항 1에 있어서, D-글루코오스와 β-D-글루코오스-1-인산 또는 그 염으로부터 트레할로오스와 무기 인산 또는 그 염을 생성하고, β-D-글루코오스-1-인산 또는 그 염을 당 공여체로 사용하여 글루코실기의 기타 당으로의 전이반응을 촉진하는 트레할로오스 포스포릴라아제.
3. 청구항 1의 트레할로오스 포스포릴라아제를 생성하는 더어모아네로븀속(Thermoanaerobium屬)에 속하는 미생물을 영양배지 중에서 배양하여 트레할로오스 포스포릴라아제를 생성시키고, 생성된 트레할로오스 포스포릴라아제를 배양물로부터 채취하는 것을 포함하는 트레할로오스 포스포릴라아제의 제조방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 미생물이 더어모아네로븀 브로키이종(Thermoanaerobium brockii種)의 일종인 제조방법.
5. 청구항 3에 있어서, 상기 미생물은, 청구항 1의 트레할로오스 포스포릴라아제를 코우드하는 DNA를, 대장균, 바실루스속 미생물, 악티노마이세스 및 효모로 된 군으로부터 선택되는 숙주속에 도입함으로써 제조되는 형질 전환체인 제조방법.
6. 청구항 3에 있어서, 생성된 트레할로오스 포스포릴라아제를 투석, 염석, 겔 여과, 농축, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동으로 된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기술에 의해 채취하는 제조방법.
7. 청구항 1의 트레할로오스 포스포릴라아제를 β-D-글루코오스-1-인산 또는 그 염과, D-크실로오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, D-푸코오스 및 L-푸코오스로 된 군으로부터 선택되는 기타의 당질에 작용시켜 D-글루코실 전이당을 생성시키는 단계를 포함하는 D-글루코실 전이당 함유 당 조성물의 제조방법.
8. 청구항 7에 있어서, β-D-글루코오스-1-인산 또는 그 염은, 무기 인산 또는 그 염의 존재하에 트레할로오스에 트레할로오스 포스포릴라아제를 작용시키거나, 무기 인산 또는 그 염의 존재하에 말토오스에 말토오스 포스포릴라아제를 작용시키거나, 혹은 무기 인산 또는 그 염의 존재하에 코지비오스에 코지비오스 포스포릴라아제를 작용시켜 생성되는 제조방법.
9. 청구항 7에 있어서, 효소반응 도중에 생성된 글루코실 전이당 또는 반응 혼합물 중에 잔존하는 글루코실 전이당 이외의 불순물을 제거하는 방법으로서 각종 칼럼 크로마토그래피와 효모를 이용하는 발효법으로 된 군으로부터 선택되는 기술을 포함하는 제조방법.
10. 무기 인산 또는 그 염의 존재하에 말토오스 포스포릴라아제와 더불어 청구항 1의 트레할로오스 포스포릴라아제를 말토오스에 작용시켜 트레할로오스를 생성시키거나, 혹은 무기 인산 또는 그 염의 존재하에 코지비오스 포스포릴라아제와 더불어 트레할로오스 포스포릴라아제를 코지비오스에 작용시켜 트레할로오스를 생성시키는 단계를 포함하는 트레할로오스의 제조방법.
11. 청구항 10의 제조방법에 의해 제조된, 글구코실-D-크실로시드, 글루코실-D-갈락토시드, 글루코실-D-푸코시드 및 글루코실-L-푸코시드로 된 군으로부터 선택되는 글루코실 전이당을 함유하는 당 조성물.
12. 청구항 11의 당 조성물을 함유하는 음식물, 화장품 또는 성형물의 형태의 조성물.
13. 청구항 11의 당 조성물을 음식물, 화장품, 의약품 또는 성형물의 재료에 배합하는 단계를 포함하는, 음식물, 화장품, 의약품 또는 성형물의 형태의 조성물의 제조방법.
14. 서열번호(SEQ ID NO:) 4의 아미노산 서열을 가진 트레할로오스 포스포릴라아제를 코우드하는 DNA.

    SEQ ID NO: 4

    

    
15. 청구항 14에 있어서, 자율 복제 가능한 벡터속에 도입된 DNA.
16. 청구항 14에 있어서, 대장균, 바실루스속의 미생물, 악티노마이세스 및 효모로 된 군으로부터 선택되는 숙주속에 도입된 DNA.

Images