KR100875576B1 - 이소말토오스의 제조방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 이소말토오스의 신규의 제조방법과 그 용도를 제공하는 것을 과제로 하고, 이 과제를, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도를 확립함으로써 해결하는 것이다.
Description
본 발명은 이소말토오스의 신규의 제조방법과 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질로부터 이소말토오스를 고수율로 얻기 위한 이소말토오스의 제조방법과 그 용도에 관한 것이다.
이소말토오스는, 발효식품 등에 미량 존재하고 있는 난(難)결정성으로서, 우수한 보습성을 가진 저감미(低甘味) 당질인데, 종래, 글루코오스, 말토오스, 파노오스 등과의 혼합당질로 하여 각종 식품, 화장품, 의약품 등에 폭넓게 사용되고 있는 유용한 당질이다.
이소말토오스는, 천연계에 있어서는 발효식품 등에 미량 존재하는 것에 불과한 희소 당질인데, 공업적으로는 산(酸)촉매를 이용하는 덱스트란의 부분 가수분해 반응, 덱스트라나아제나 이소말토덱스트라나아제 등을 이용하는 효소반응, 글루코오스로부터의 글루코아밀라아제 또는 산촉매를 이용하는 역(逆)합성 반응, 말토오스 또는 말토덱스트린으로부터의 α-글루코시다아제를 이용하는 글루코오스 당전이 반응 등에 의한 제조방법이 알려져 있다.
그러나, 종래법에 의해 얻어지는 반응액 중의 이소말토오스 함유량은, 고형물당 약 10 내지 약 25％(w/w)(이하, 본 명세서에 있어서는 별달리 명시하지 않는 한, 「％（w/w)」을 간단히 「％」로 약기한다.) 정도에 불과하여 이소말토오스의 공업적 제조방법으로서는 순도가 낮아, 도저히 만족할 수 있는 것이 아니었다. 이 문제점을 개선하는 방법으로서, 예를 들면, 일본국 특개 소58-72598호 공보에 개시된 칼럼 크로마토그래피가 있다. 이 방법에 의하면, 고형물당, 이소말토오스 함유량이 약 10 내지 약 25％인 원료당액으로부터 고순도 이소말토오스를 얻을 수 있다. 그러나, 이 이소말토오스의 제조방법에 있어서도, 얻어지는 이소말토오스의 순도, 수율은 원료당액 중의 이소말토오스 함유량에 의존하지 않을 수 없다는 문제점이 있었다.
이와 같은 상황하에서, 이소말토오스를 공업적으로, 대량으로, 또한 염가로 고수율로 제조할 수 있는 신규의 제조방법의 확립이 강하게 고대되고 있었다.
본 발명은, 상기한 종래 기술을 감안하여, 이소말토오스를 공업적으로, 대량으로, 또한 염가로 고수율로 제조할 수 있는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도를 확립하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들이 상기 과제를 해결하는 것을 목적으로 하여 예의 연구하는 중에, 문헌[European Journal of Biochemistry, 제226권, 641 내지 648 페이지(1994년)]에서, 주로, 4개의 글루코오스 잔기가 α-1,3 결합과 α-1,6 결합에 의해 교대로 결합된 구조를 가진 알테르난(alternan)에 가수분해 효소 알테르나나아제(alternanase)를 작용시켜 얻게 되는, 분자 내에 이소말토오스 구조를 가진 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}}의 구조를 가진 4당류(이하, 『환상 4당』으로 약기한다.)의 보고가 있었다.
한편, 본 발명자들은 일본국 특원2000-229557호 명세서에 있어서, 파노오스 등의 전분유래의 당질로부터 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이효소를 사용하는 환상 4당의 제조방법을 개시함과 아울러, 일본국 특원2000-234937호 명세서에서는 상기 α-이소말토실 전이효소와, 말토올리고당 등으로부터 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분원료에 작용시켜 환상 4당을 효율적으로 제조하는 방법을 개시하고 있다.
그 후, 본 발명자들은 상기 α-이소말토실글루코 당질 및 환상 4당이, 이들 분자 내에 이소말토오스 구조를 가지고 있는 것에 착안하여, 이들 당질로부터 이소말토오스를 제조하는 방법에 대해서 연구하였다. 즉, 본 발명자들은, 이들 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 효소반응 메커니즘에 대해서 연구한 결과, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와, 이소말토오스를 유리(遊離)하는 작용을 가진 이소말토오스 유리 효소를 작용시키면 이소말토오스의 생성수율이 비약적으로 향상하고, 더욱이 공업적으로 용이하게 실시할 수 있는 것을 발견하였다.
더욱이 본 발명자들은 이와 같은 제조방법에 의해 얻게 되는 이소말토오스의 용도를 확립해서 본 발명을 완성하였다. 구체적으로는, 본 발명은, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도를 확립하여 본 발명의 과제를 해결한 것이다.
도 1은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 2는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 3은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 4는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 5는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 6은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 7은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 8은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 9는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 10은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 11은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 12는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 13은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 14는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효 소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 15는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 16은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 17은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토트리오스의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 18은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 19는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토트리오스의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 20은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소반응에 의해 얻어진 α-이소말토실말토테트라오스의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 21은 생성물 A의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 22는 생성물 A의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명에서 사용하는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소라 함은, 전분질 로부터 α-이소말토실글루코오스(별명, 파노오스), α-이소말토실말토오스, α-이소말토실말토트리오스, α-이소말토실테트라오스 등의 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 효소를 의미하고, 구체적으로는, 일본국 특원2000-234937호 명세서에 개시된, 2000년 4월 25일부로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동(東)1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 총합 연구소, 특허생물 기탁 센터에 수탁번호 FERM BP-7143로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9, 및 2000년 4월 25일부로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동(東)1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 총합 연구소, 특허생물 기탁 센터에 수탁번호 FERM BP-7144로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, 및 일본국 특원2001-5441호 명세서에 개시된 유전자 재조합형 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성을 가진 폴리펩티드 등을 예시할 수 있다.
그리고 본 발명에서 사용하는 α-이소말토실 전이효소라 함은, 파노오스, 이소말토실말토오스와 같은 α-이소말토실글루코 당질로부터 환상 4당을 생성하는 효소를 의미하고, 일본국 특원2000-229557호 명세서에 개시된 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9(FERM BP-7143) 및 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11(FERM BP-7144) 유래의 α-이소말토실 전이효소, 및 일본국 특원2000-350142호 명세서에 개시된 유전자 재조합형 α-이소말토실 전이효소 활성을 가진 폴리펩티드 등을 예시할 수 있다.
더욱이 본 발명에서 사용하는 이소말토오스 유리 효소는, α-이소말토실글루코 당질이나 환상 4당으로부터 이소말토오스를 유리하는 작용을 가진 효소를 의미하고, 예를 들면, 문헌[Journal of Biochemistry, 제75권, 105 내지 112 페이지(1974년)]에 보고되어 있는 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) T6(NRRL B-4425), 동경 대학 응용 미생물 연구소에서 분양 제공되는 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)(IAM 12103), 및 문헌 [Carbohydrate Research, 제89권, 289 내지 299 페이지(1981년)]에 보고되어 있는 악티노마듀라(Actinomadura) RlO(NRRL B-11411) 등의 미생물 유래의 이소말토덱스트라나아제(EC3.2.1.94)를 예시할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질이라 함은, 예를 들면, 옥수수 전분, 쌀 전분, 밀 전분 등의 지상 전분, 감자 전분, 고구마 전분, 타피오카 전분 등의 지하 전분 및 이들의 부분 가수분해물(전분 부분 분해물)을 의미한다. 상기 전분 부분 분해물은, 통상, 상기한 지상 내지 지하 전분을 물에 현탁하여, 통상, 농도 10％ 이상, 보다 바람직하게는 15％ 내지 65％, 더욱 바람직하게는 20％ 내지 50％의 전분유(澱粉乳)로 하여, 이것을 가열해서 액화하거나, 또는 상기한 지상 내지 지하 전분을 산제(酸劑) 혹은 효소제에 의해 액화해서 얻을 수 있다. 액화의 정도는 비교적 낮게 설정하는 것이 좋은데, 통상, DE 15 미만, 바람직하게는 DE lO 미만, 보다 바람직하게는 DE 9 내지 0.1의 범위로 하는 것이 바람직하다. 산제로 액화할 경우에는, 예를 들면, 염산, 인산, 옥살산 등의 산제에 의해 액화한 후, 통상, 탄산 칼슘, 산화칼슘, 탄산 나트륨 등의 알칼리제를 사용하여 소망의 pH로 중화하는 방법을 채용한다. 효소제로 액화할 경우에는, α-아밀라아제, 특히, 내열성의 액화형 α-아밀라아제를 본 발명에 있어서는 적절하게 사용할 수 있다.
이들 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜서, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취함으로써 이소말토오스를 고수율로 얻을 수 있다. 또한, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킬 때에, α-이소말토실 전이효소, 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제(이하, 『CGTase』로 약기함.), α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 전분 지절(枝切) 효소(이소아밀라아제, 풀룰라나아제 등)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시키거나, 또는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후에, α-이소말토실 전이효소, CGTase, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 이소아밀라아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시킴으로써 이소말토오스를 보다 고수율로 제조할 수 있다. 특히, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜서 얻게 되는 환상 4당에 이소말토오스 유리 효소를 작용시킬 경우, 환상 4당으로부터의 이소말토오스 생성율을 최대 100％까지 향상시키는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서 복수의 효소를 사용할 경우의 순서는, 이소말토오스의 생성 수율, 반응 시간, 반응 조건 등을 감안하면서 설정하면 좋은데, 복수의 효소를 동시에 작용시키는 것도, 또한, 이들 효소의 필요량을 수회로 나누어 상이한 타이밍에서 작용시키는 것도 가능하다. 본 발명에서 사용하는 효소를 작용시킬 때의 pH는, 상기 효소가 그들의 효소활성을 발휘할 수 있는 pH이면 좋고, 통상, pH 4 내지 10, 바람직하게는 pH 5 내지 8의 범위로부터 선택된다. 또한, 효소를 작용시킬 때의 온도는 통상, 10 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 70℃의 범위로부터 선택된다. 효소량은, 각 효소의 반응 조건, 반응 시간을 고려해서 적당히 증감하면 좋은데, 통상, 기질 고형물 그램당, α-이소말토실 전이효소 및 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 각각 0.01 내지 100 단위의 범위로부터, 이소말토오스 유리 효소 및 전분 지절 효소는 각각 1 내지 10,000 단위의 범위로부터, 그리고 CGTase, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 이소아밀라아제는 0.05 내지 7,000 단위의 범위로부터 적당히 선택해서 사용된다. 또한, 이용하는 효소반응 시간은 효소량에 의존하지만, 이소말토오스의 생성 수율을 감안하면서 적당히 선택하면 좋은데, 통상, 1 내지 200시간, 바람직하게는 5 내지 150시간, 10 내지 100시간에서 전체 효소 반응을 완결하도록 설정한다. 한편, 각각의 효소반응시의 pH 및 온도는 본 발명에 있어서의 효소반응이 완료할 때까지의 공정에서 적당히 변경하는 것도 가능하 다.
이렇게 해서 얻어지는 효소반응액 중의 이소말토오스 함유량은 고형물당, 통상, 30％ 이상, 바람직하게는 40％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상, 최대 99％ 이상이나 달한다. 특히, 이들 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, α-이소말토실 전이효소 및 이소말토오스 유리 효소를 동시 또는 이 순서로 첨가할 때에는, 고형물당의 이소말토오스 함유율이 50％ 이상인 효소반응액을 용이하게 얻을 수 있다. 상기 효소반응액은, 통상, 여과, 원심분리 등의 통상적인 방법에 의해 효소반응액 중의 불용물을 제거하고, 이어서, 활성탄에 의해 탈색하고, H형, OH형 이온교환 수지 등으로 탈염하여 정제하고, 농축해서 시럽상 제품으로 하거나, 더욱이 이것을 건조해서 분말상 제품으로 한다. 필요하면, 더욱이, 예를 들면, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등 유기용매를 사용하는 분별, 막분리법 등의 1종 또는 2종 이상을 적당히 조합해서 정제하여 이소말토오스 고함유물로 하는 것도 가능하다. 특히, 이소말토오스 고함유물의 공업적 대량 제조방법으로서는 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피의 채용이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 일본국의 특개 소58-23799호 공보 및 특개 소58-72598호 공보 등에 개시되어 있는, 술폰기를 결합한 스티렌-디비닐벤젠 가교 공중합체 수지의 Na+형, K+형 등의 알칼리 금속형, 및 Ca2+형, Mg2+형 등의 알칼리 토류 금속형의 1종 또는 2종 이상의 강산성 캐타이온(cation) 교환 수지를 이용하는 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피에 의할 때에는, 이소말토오스 고함유물을 공업적으로 고수율, 대량, 용이, 또한 염가로 제조할 수 있다. 상기 강산성 캐타이온 교환 수지의 시판품으로서는, 다우 케미칼사제의 상품명 『다우엑스 50WX2』, 『다우엑스 50WX4』 및 『다우엑스 50WX8』, 로옴 앤드 하아스사제의 상품명 『암바라이트 CG-120』, 東京有機化學 공업사제의 상품명 『ⅩT-1022E』, 三菱化成 공업사제의 상품명 『다이아이온 SK1B』, 『다이아이온 SK1O2』 및 『다이아이온 SK1O4』 등을 예시할 수 있다. 상기 이온교환 수지 칼럼 크로마토그래피에 있어서는, 고정상 방식, 이동상 방식, 의사(擬似) 이동상 방식 중의 어느 방식을 채용하는 것도 가능하다. 이러한 방법에 의하면, 이소말토오스의 고형물당의 순도를, 통상, 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 99％ 이상의 최고 순도까지 향상시키는 것이 가능하다. 한편, 최고 순도의 이소말토오스 이외의 이소말토오스, 즉, 이소말토오스 고함유물은, 통상, 이소말토오스 이외에, 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 기타의 전분 부분 가수분해물, α-이소말토실글루코 당질, 및 α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스(이하, 『개환(開環) 4당』이라 약칭할 경우도 있음.)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을, 고형물당, 통상, 1 내지 60％ 함유하고 있다.
이렇게 해서 얻게 되는 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 양질이고 상품의 단 맛을 가짐과 아울러 충치의 원인의 하나인 덱스트란의 생성을 저해하는 작용을 가지고 있어, 충치를 일으키기 어려운 감미료로서 적절하게 이용된다. 또한, 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 보존 안정성도 우수하다. 특히, 이소말토오스 결정 고함유 제품의 경우에는, 풀룰란, 히드록시에틸 스타치, 폴리비닐피롤리돈 등의 공지의 결합제와 병용하여 정제(錠劑)의 당의제로서도 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난(難)발효성, 호화(糊化) 전분의 노화 방지성 등의 유용한 성질도 겸비하고 있다. 따라서 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 감미료, 정미(呈味) 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서, 식품, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품, 기호품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 각종 물품의 단 맛 부여를 위한 조미료로서도 이용할 수 있다. 필요에 따라서, 예를 들면, 가루엿, 포도당, 프룩토오스, 락토수크로오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 벌꿀, 메이플 슈거, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 프룩토올리고당, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌메틸 에스테르, 스쿠라로스, 아세술팜 K, 사카린, 글라이신, 알라닌 등과 같은 기타의 감미료의 1종 또는 2종 이상과 병용하는 것도 마음대로이고, 필요하면, 덱스트린, 전분, 락토오스 등의 증량제의 1종 또는 2종 이상과 병용하는 것도 마음대로이다.
또한 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물, 특히, 이들의 분말 상 제품은 그대로, 또는 필요에 따라서 적당한 증량제, 부형제, 결합제, 감미료 등의 1종 또는 2종 이상과 병용하여 과립, 원형, 단봉상, 판상, 입방체상, 정제상, 필름상 또는 시이트상 등의 각종 형상으로 성형해서 이용하는 것도 마음대로이다.
더욱이 본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물의 단 맛은, 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 감미로운 맛, 쓴 맛 등의 다른 맛을 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 그 자체가 내산성, 내열성도 크므로 각종 음식물의 단 맛 부여, 정미 개량에, 또한 품질개량을 목적으로 하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 아미노산, 펩티드류, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 초밥용 분말초, 츄카노모토, 텐츠유, 멘츠유, 소스, 케첩, 불고기의 소오스, 커리 루우, 스튜 믹스, 수프 믹스, 우려낸 국물 농축액, 핵산계 조미료, 복합 조미료, 미린, 신(新)미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 전병, 아라레, 오코시, 떡류, 만두, 은단 모양의 담약, 팥소류, 양갱, 물양갱, 킨교쿠, 젤리, 카스테라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠키, 파이, 푸린, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈크림, 와플, 스폰지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 캬라멜, 캔디 등의 양과자, 아이스 크림, 샤베트 등의 빙과, 과실의 시럽절임, 얼음꿀 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 후루츠 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류, 잼, 마마레이드, 시럽절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진츠케, 베타라츠케, 센마이츠케, 랏쿄츠케 등의 절임류, 단무지의 절임믹스, 배추절임의 믹스 등의 절인 야채의 믹스류, 햄, 소세지 등의 축육제품류, 어육 햄, 어육 소시지, 어묵, 오뎅, 튀김 등의 어육제품, 성게알, 물오징어의 젓, 초 다시마, 말린 오징어, 미린 조미한 복어 말림 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 졸임류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 요구르트, 치즈 등의 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림류, 청주, 합성 술, 리큐어, 양주 등의 주류, 커피, 홍차, 코코아, 쥬스, 탄산음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸린 믹스, 핫케이크 믹스, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석 식품, 더욱이 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품, 건강식품 등의 각종 음식물에 유리하게 사용할 수 있다.
더욱이, 가축, 집에서 기르는 새, 기타 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물용의 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외, 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 입안 청량제, 입안 향기제, 양치질제 등의 각종 고형물용 감미제로서, 또는 이들의 정미 개량제, 교미제(矯味劑), 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은, 품질개량제 및/또는 안정제로 하여, 유효성분, 활성성분 또는 생리활성 물질을 함유하는 건강식품, 의약품 등에 배합함으로써, 안정한 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강식품이나 의약품을 얻을 수 있다. 상기 유효성분이나 생리활성 물질로서는, 예를 들면, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, TNF-α, TNF-β, 마크로파아지 유주(遊走)저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼 팩터, 인터류킨 등의 림포카인, 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생 백신, 두묘, 파상풍 톡소이드, 하브 항독소, 인간 면역 글로불린 등의 생물 제제, 페니실린, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생 물질, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, α-글리코실 아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤, 루틴, α-글리코실루틴, 나린진, α-글리코실나린진, 헤스페리딘, α-글리코실헤스페리딘 등의 비타민류, 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소, 약용 인삼 엑기스, 조릿대 엑기스, 매실 엑기스, 소나무 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 프로폴리스 엑기스 등의 엑기스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균, 로얄 젤리 등을 예시할 수 있다.
이상 설명한 각종 조성물에 본 발명의 이소말토오스 또는 이소말토오스 고함유물을 함유시키는 방법은, 이들의 조성물이 완성될 때까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들면, 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정석출, 고화 등 공지의 방법이 적당히 선택된다. 그 양은, 통상, 상기 조성물 중량당 0.1％ 이상, 바람직하게는 1％ 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 99.99％ 배합한다.
이하, 본 발명을 실험예에 의해 구체적으로 설명한다.
실험예 1: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 조제
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃4』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 4.Ow/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히미스트』, 일본국의 아사히 맥주 주식회사제) 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염(水鹽) 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체 배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃에서 20분간 멸균하고, 냉각하여 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 접종하고, 27℃ 및 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성은 약 0.45 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.5 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.95 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 이 상청은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 약 0.45 단위/ml의 활성(총 활성 약 8,110 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.5 단위/ml의 활성(총 활성 약 26,900 단위)을 가지고 있었다. 이 상청은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소 함유 효소제로서 이용할 수 있다.
그리고 상기 효소활성은 다음과 같이 해서 측정하였다. 즉, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성은, 말토트리오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가하고 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액 중에서 주로 생성하는 이소말토실말토오스와 말토오스 중에서 말토오스량을 고속 액체 크로마토그래피(이하, 『HPLC법』이라고 약기한다.)로써 정량하여 실행했다. HPLC법은, 『YMC Pack ODS-AQ303』칼럼(주식회사 Y·M·C제)을 사용하여 칼럼 온도 40℃, 유속 0.5ml/min 물(水)의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사제)를 사용하여 하였다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 말토오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다.
또한, α-이소말토실 전이효소 활성은, 파노오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가하여 35℃에서 30분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액 중에서 주로 생성하는 환상 4당과 글루코오스 중에서 글루코오스량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량하여 실행했다. α-이소말토실 전이효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다.
더욱이 환상 4당 생성활성은, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제)을 농도 2w/v％가 되도록 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가하여 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 100℃에서 10분간 열처리해서 반응을 정지시킨 후, 더욱이 α-글루코시다아제(상품명 『트란스 글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약제) 70 단위/ml와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학 공업 주식회사 판매) 27 단위/ml를 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 5.0) 1ml을 가하여 50℃에서 60분간 처리하고, 그 액을 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시킨 후, 환상 4당량을 상기 HPLC법으로 정량하였다. 환상 4당 생성활성 1 단위는, 상기 조건하에서 1분간에 1μ몰의 환상 4당을 생성하는 효소량으로 정의하였다.
실험예 2: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 단리
<실험예 2-1: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 단리>
실험예 1에서 얻은 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000 rpm, 30분간)하여 회수하고 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 동일 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 400ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성을 8,110 단위와, α-이소말토실 전이효소 활성을 24,700 단위와, 환상 4당 생성활성을 약 15,600 단위 가지고 있었다. 이 조효소액을 일본국의 三菱화학 주식회사제 『Sepabeads FP-DA13』겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 1,000ml)에 사용하였다. 이 때, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, α-이소말토실 전이효소 및 환상 4당의 어느 것이라도 『Sepabeads FP-DA13』겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불순물을 제거하여 Amersham Pharmacia Biotechnology 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소활성 성분은, 『Sephacryl HR S-200』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서, 다시 계속하여 말토테트라오스 OmM으로부터 100mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 OM부근에서 용출하고, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 따라서 α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성획분을 따로따로 수집하여 회수하였다.
더욱이 상기 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소활성 성분은, 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소활성 성분이 용출하고, 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성량, 비활성(比活性), 수율을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
| 공 정 | α-이소말토실 글루코 당질 생성 효소 활성량(단위) | α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 비활성(단위/mg 단백) | 수율(%) |
| 배양 상청 | 8,110 | 0.12 | 100 |
| 황산 암모늄 염석후의 투석액 | 7,450 | 0.56 | 91.9 |
| 이온교환 칼럼 용출액 | 5,850 | 1.03 | 72.1 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 4,040 | 8.72 | 49.8 |
| 소수 칼럼 용출액 | 3,070 | 10.6 | 37.8 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 1,870 | 13.6 | 23.1 |
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 이 효소의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 효소 표품이었다.
<실험예 2-2: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 성질>
실험예 2-1에서 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 140,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+ 비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 1(온도의 영향), 도 2(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 40℃（Ca2+ 비존재), 약 45℃（Ca2+ 1mM 존재), 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0 내지 6.5이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+ 비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉(水冷)한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고 pH 안정성은, 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 3(온도 안정성), 도 4(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 35℃까지(Ca2+ 비존재), 약 40℃까지(Ca2+ 1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
| 금속 이온 | 상대활성(%) | 금속 이온 | 상대활성(%) |
| 무첨가 | 100 | Hg2+ | 4 |
| Zn2+ | 92 | Ba2+ | 65 |
| Mg2+ | 100 | Sr2+ | 80 |
| Ca2+ | 115 | Pb2+ | 103 |
| Co2+ | 100 | Fe2+ | 98 |
| Cu2+ | 15 | Fe3+ | 97 |
| Ni2+ | 98 | Mn2+ | 111 |
| Al3+ | 99 | EDTA | 20 |
표 2의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해서 저해되었다. Ca2+, Mn2+
에 의해서 활성화되는 것도 밝혀졌다.
<실험예 2-3: α-이소말토실 전이효소의 단리>
실험예 2-1에서 얻은 α-이소말토실 전이효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출 시켰을 때, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 겔로부터 용출하여, 이 효소활성 획분을 수집하였다. 다시, 이 회수 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용하는 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 각 정제 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
| 공 정 | α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) | α-이소말토실 전이효소 비활성(단위/mg 단백) | 수율(%) |
| 배양 상청 | 26,900 | 0.41 | 100 |
| 황산 암모늄 염석후의 투석액 | 24,700 | 1.85 | 91.8 |
| 이온교환 칼럼 용출액 | 19,400 | 3.41 | 72.1 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 13,400 | 18.6 | 49.8 |
| 소수 칼럼 용출액 | 10,000 | 21.3 | 37.2 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 6,460 | 26.9 | 24.0 |
<실험예 2-4: α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험예 2-3에서 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.5 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 5(온도의 영향), 도 6(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 45℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 7(온도 안정성), 도 8(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.0 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
| 금속 이온 | 상대활성(%) | 금속 이온 | 상대활성(%) |
| 무첨가 | 100 | Hg2+ | 1 |
| Zn2+ | 88 | Ba2+ | 102 |
| Mg2+ | 98 | Sr2+ | 101 |
| Ca2+ | 101 | Pb2+ | 89 |
| Co2+ | 103 | Fe2+ | 96 |
| Cu2+ | 57 | Fe3+ | 105 |
| Ni2+ | 102 | Mn2+ | 106 |
| Al3+ | 103 | EDTA | 104 |
표 4의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.
상기한 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143) 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 모두가 본 발명에 있어서는 적절하게 사용할 수 있다.
실험예 3: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스#4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히미스트』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7 수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체 배지를, 500ml용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 바실루스 글로비스포루스 C11(FERM BP-7144)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣어서, 가열 멸균, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％를 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서, 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 이 효소활성은 약 0.55 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.8 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 1.1 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18 리터의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 약 0.51 단위/ml의 활성(총 활성 약 9,180 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.7 단위/ml의 활성(총 활성 약 30,400 단위)이었다.
더욱이 상기 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃에서 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조효소액 약 416ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성을 8,440 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 28,000 단위, 환상 4당 생성활성을 약 17,700 단위를 가진 것이 밝혀졌다. 이 조효소액을, 실험예 2-1에 기재한 『Sepabeads FP-DA13』겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소활성, α-이소말토실 전이효소 활성, 환상 4당 생성활성의 모두가, 『Sepabeads FP-DA13』겔에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 비흡착 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 Amersham Pharmacia Biotechnology 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소활성은, 『Sephacryl HR S-200』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여 말토테트라오스 OmM으로부터 100mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실 전이효소활성 성분과 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성성분은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.3M 부근에서 용출하며, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 따라서 α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 획분을 따로따로 수집하여 회수하였다.
실험예 4: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 단리
<실험예 4-1: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 단리>
실험예 3에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopearl 650M』겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M으로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집해서 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 『Sephacryl HR S-200』겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 5에 나타낸다.
[표 5]
| 공 정 | α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 활성량(단위) | α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 비활성 (단위/mg 단백) | 수율(%) |
| 배양 상청 | 9,180 | 0.14 | 100 |
| 황산 암모늄 염석후의 투석액 | 8,440 | 0.60 | 91.9 |
| 이온교환 칼럼 용출액 | 6,620 | 1.08 | 72.1 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 4,130 | 8.83 | 45.0 |
| 소수 칼럼 용출액 | 3,310 | 11.0 | 36.1 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 2,000 | 13.4 | 21.8 |
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 7.5w/v％ 농도의 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 이 효소의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드 는 단일이어서 순도가 높은 효소 표품이었다.
<실험예 4-2: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 성질>
실험예 4-1에서 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 137,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+ 비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 9(온도의 영향), 도 10(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 45℃（Ca2+ 비존재), 약 50℃（Ca2+ 1mM 존재), 최적 pH는 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+ 비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고 pH 안정성은 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 11(온도 안정성), 도 12(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지(Ca2+ 비존재), 약 45℃까지(Ca2+ 1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 10.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
| 금속 이온 | 상대활성(%) | 금속 이온 | 상대활성(%) |
| 무첨가 | 100 | Hg2+ | 4 |
| Zn2+ | 91 | Ba2+ | 65 |
| Mg2+ | 98 | Sr2+ | 83 |
| Ca2+ | 109 | Pb2+ | 101 |
| Co2+ | 96 | Fe2+ | 100 |
| Cu2+ | 23 | Fe3+ | 102 |
| Ni2+ | 93 | Mn2+ | 142 |
| Al3+ | 100 | EDTA | 24 |
표 6의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해서 저해되었다. Ca2+, Mn2+
에 의해서 활성화되는 것도 밝혀졌다.
<실험예 4-3: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 아미노산 서열>
본 발명은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 자체에 관한 발명은 아니며, 또한, 그 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는 일본국 특원2001 -5441호 명세서에 상세히 개시되어 있는 바로부터 할애하는데, 실험예 4-1에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 일본국 특원2001-5441호 명세서에 개시되어 있는 폴리펩티드와 마찬가지로 서열표에 있어서의 서열번호 1에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제36 내지 1284 번째의 아미노산 서열을 가진다.
<실험예 4-4: α-이소말토실 전이효소의 단리>
실험예 3에서 얻은 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유한 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 7에 나타낸다.
[표 7]
| 공 정 | α-이소말토실 전이효소 활성량(단위) | α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg 단백) | 수율(%) |
| 배양 상청 | 30,400 | 0.45 | 100 |
| 황산 암모늄 염석후의 투석액 | 28,000 | 1.98 | 92.1 |
| 이온교환 칼럼 용출액 | 21,800 | 3.56 | 71.7 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 13,700 | 21.9 | 45.1 |
| 소수 칼럼 용출액 | 10,300 | 23.4 | 33.9 |
| 어피니티 칼럼 용출액 | 5,510 | 29.6 | 18.1 |
<실험예 4-5: α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험예 4-4에서 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 102,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소를 2w/v％ 앰폴라인(Amersham Pharmacia Biotechnology사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.6 ±0.5이었다.
이 효소활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 13(온도의 영향), 도 14(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 5.5 내지 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 15(온도 안정성), 도 16(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
이 효소활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
[표 8]
| 금속 이온 | 상대활성(%) | 금속 이온 | 상대활성(%) |
| 무첨가 | 100 | Hg2+ | 2 |
| Zn2+ | 83 | Ba2+ | 90 |
| Mg2+ | 91 | Sr2+ | 93 |
| Ca2+ | 91 | Pb2+ | 74 |
| Co2+ | 89 | Fe2+ | 104 |
| Cu2+ | 56 | Fe3+ | 88 |
| Ni2+ | 89 | Mn2+ | 93 |
| Al3+ | 89 | EDTA | 98 |
표 8의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소활성은 Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.
<실험예 4-6: α-이소말토실 전이효소의 아미노산 서열>
본 발명은 α-이소말토실 전이효소 자체에 관한 발명이 아니고, 또한, 그 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는 일본국 특원2000-350142호 명세서에 상세히 개시되어 있는 바로부터 할애하는데, 실험예 4-4에서 얻은 α-이소말토실 전이효소는 일본국 특원2000-350142호 명세서에 개시되어 있는 바와 같이, 서열표에 있어서의 서열번호 2에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제30 내지 1093번째의 아미노산 서열을 가진다.
실험예 5: α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 각종 당질에의 작용
각종 당질(기질)에 대한 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 작용에 대해서 시험하였다. 즉, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소파노오스, α,α-트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 세라기노오스, 말토실글루코시드, 이소말토실글루코시드를 함유하는 용액을 조제하고, 이들 용액에, 실험예 2-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소, 또는 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 표품을 기질 고형물 그램당 각각 2 단위씩 가하여 기질농도를 2％(w/v)로 조제하고, 30℃, pH 6.0에서 24시간 반응시켰다. 효소반응 전후의 반응액을 실리카 겔 박층 크로마토그래피(이하, 『TLC법』이라고 약기한다.) 분석에 사용하였다. TLC법은, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물 혼합액(용량비 6:4:1), 박층 플레이트로서 메르크사제 『키젤겔 60』(알루미늄 플레이트, 20 ×20cm)을 사용하여 2회 전개해서 당질을 분리하고, 이어서 알루미늄 플레이트 위에 황산-메탄올을 분무해서 발색시켜 전체 당질을 검출하고, 더욱이 환원 당질은, 디페닐아민아닐린법으로 발색시켜 검출하는 방법에 의해 실시하였다. TLC법의 결과를 표 9에 나타낸다.
[표 9]
| 기 질 | 효소작용 | 기 질 | 효소작용 |
| C9효소 C11효소 | C9효소 C11효소 | ||
| 말토오스 | ＋ ＋ | 니게로오스 | ＋ ＋ |
| 말토트리오스 | ＋＋ ＋＋ | 네오트레할로오스 | ＋ ＋ |
| 말토테트라오스 | ＋＋＋ ＋＋＋ | 셀로비오스 | - - |
| 말토펜타오스 | ＋＋＋ ＋＋＋ | 겐티비오스 | - - |
| 말토헥사오스 | ＋＋＋ ＋＋＋ | 말티톨 | - - |
| 말토헵타오스 | ＋＋＋ ＋＋＋ | 말토트리이톨 | ＋ ＋ |
| 이소말토오스 | - - | 락토오스 | - - |
| 이소말토트리오스 | - - | 수크로오스 | - - |
| 파노오스 | - - | 에를로오스 | ＋ ＋ |
| 이소파노오스 | ＋＋ ＋＋ | 세라기노오스 | - - |
| 트레할로오스 | - - | 말토실글루코시드 | ＋＋ ＋＋ |
| 코지비오스 | ＋ ＋ | 이소말토실글루코시드 | - - |
주: 효소반응 전후에서,
「-」는 변화없음을 나타내고,
「+」는 기질의 스폿이 약간 감소하고, 다른 생성물이 나타남을 나타내고,
「++」는 기질의 스폿이 상당히 감소하고, 다른 생성물이 나타남을 나타내고,
「+++」는 기질의 스폿이 거의 소실하고, 다른 생성물이 나타남을 나타낸다.
표 9의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는, 시험한 많은 종류의 당질 중에서, 글루코오스 중합도 3 이상이고, 비환원 말단에 말토오스 구조를 가진 당질에 잘 작용하는 것이 밝혀졌다. 또한, 글루코오스 중합도가 2인 당질에서는, 말토오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로스, 말토트리이톨, 에를로오스에도 약간 작용하는 것이 밝혀졌다.
실험예 6: 말토올리고당으로부터의 생성물
농도 1％의 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스 또는 말토펜타오스 수용액에, 실험예 4-1에서 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당, 말토오스 및 말토트리오스에 대하여는 2 단위, 말토테트라오스에 대하여는 0.2 단위, 말토펜타오스에 대하여는 0.1 단위 가하고, 35℃, pH 6.0에서 8시간 작용시킨 후, 100℃에서 10분간 유지하여 효소를 실활시켜서 반응을 정지하였다. 얻어진 효소반응액의 당조성을 HPLC법에 의해 측정하였다. HPLC법으로서는, 『YMC Pack ODS-AQ303』 칼럼(일본국의 주식회사 Y·M·C사제)을 이용하고, 칼럼 온도 40℃, 유속 0.5ml/min 물의 조건하에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계(상품명 『RI-8012』, 일본국의 Tosoh 주식회사제)를 이용해서 하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[표 10]
| 반응에서 생성한 당질의 종류 | 기 질 | |||
| 말토오스 | 말토트리오스 | 말토테트라오스 | 말토펜타오스 | |
| 글루코오스 | 8.5 | 0.1 | 0.0 | 0.0 |
| 말토오스 | 78.0 | 17.9 | 0.3 | 0.0 |
| 말토트리오스 | 0.8 | 45.3 | 22.7 | 1.9 |
| 말토테트라오스 | 0.0 | 1.8 | 35.1 | 19.2 |
| 말토펜타오스 | 0.0 | 0.0 | 3.5 | 34.4 |
| 말토헥사오스 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 4.6 |
| 이소말토오스 | 0.5 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 글루코실말토오스 | 8.2 | 1.2 | 0.0 | 0.0 |
| 글루코실말토트리오스 | 2.4 | 31.5 | 6.8 | 0.0 |
| X | 0.0 | 2.1 | 30.0 | 11.4 |
| Y | 0.0 | 0.0 | 1.4 | 26.8 |
| Z | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 1.7 |
| 기타 | 0.6 | 0.1 | 0.2 | 0.0 |
표 중에서, 글루코실말토오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 파노오스)이고, 글루코실말토트리오스는 α-이소말토실말토오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스)이며, X는 실험예 7에 기재된 α-이소말토실글루코트리오스(별명, 64-O-α-글루코실말토테트라오스)이며, Y는 실험예 7에 기재된 α-이소말토실글루코테트라오스(별명, 65-O-α-글루코실말토펜타오스)이고, Z는 미확인의 당질임.
표 10의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소의 작용의 결과, 기질 말토오스로부터는, 주로 글루코오스와 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 파노오스)가 생성하고, 말토트리오스, 이소말토오스, α-이소말토실말토오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스)를 소량 생성하는 것이 판명되었다. 또한, 기질 말토트리오스로부터는, 주로 말토오스와 α-이소말토실말토오스가 생성하고, 소량이지만 글루코오스, 말토테트라오스, α-이소말토실글루코오스(별명, 62-O-α-글루코실말토오스, 파노오스), 생성물 Ⅹ가 생성하는 것이 밝혀졌다. 기질 말토테트라오스로부터는, 주로 말토트리오스와 생성물 Ⅹ가 생성하고, 소량이지만 말토오스, 말토펜타오스, α-이소말토실말토오스(별명, 63-O-α-글루코실말토트리오스), 생성물 Y가 생성하는 것이 밝혀졌다. 기질 말토펜타오스로부터는, 주로 말토테트라오스와 생성물 Y가 생성하고, 소량이지만 말토트리오스, 말토헥사오스, 생성물 Ⅹ 및 생성물 Z가 생성하는 것이 판명되었다.
기질 말토테트라오스로부터의 주생성물인 생성물 Ⅹ 및 기질 말토펜타오스로부터의 주생성물인 생성물 Y의 단리·정제를 하였다. 분취용 HPLC 칼럼 『YMC-Pack ODS-A R355-15S-15 12A』(일본국의 주식회사 YMC제)을 사용하여 정제함으로써, 상기한 말토테트라오스로부터의 반응물, 말토펜타오스로부터의 반응물 각각으로부터 순도 99.9％ 이상의 생성물 Ⅹ를 고형물 수율 약 8.3％로, 순도 99.9％ 이상의 생성물 Y를 고형물 수율 약 11.5％로 단리하였다.
실험예 7: 생성물의 구조해석
실험예 6의 방법으로 얻은 생성물 Ⅹ 및 생성물 Y를 사용하고, 통상적인 방법에 따라 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석의 결과는 표 11에 정리하였다. NMR 분석의 결과에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼을 도 17(생성물 Ⅹ), 도 18(생성물 Y)에, 13C-NMR 스펙트럼 및 귀속(歸屬)을 도 19(생성물 Ⅹ), 도 20(생성물 Y), 표 12에 정리하였다.
[표 11]
| 분석 메틸화물의 종류 | 조성비 | |
| 생성물 X | 생성물 Y | |
| 2,3,4-트리메틸화물 | 1.00 | 1.00 |
| 2,3,6-트리메틸화물 | 3.05 | 3.98 |
| 2,3,4,6-테트라메틸화물 | 0.82 | 0.85 |
[표 12]
| NMR 화학 시프트값(ppm) | |||
| 글루코오스 번호 | 탄소번호 | 생성물 X | 생성물 Y |
| a | 1a | 100.8 | 100.8 |
| 2a | 74.2 | 74.2 | |
| 3a | 75.8 | 75.7 | |
| 4a | 72.2 | 72.2 | |
| 5a | 74.5 | 74.5 | |
| 6a | 63.2 | 63.1 | |
| b | 1b | 102.6 | 102.6 |
| 2b | 74.2 | 74.2 | |
| 3b | 75.8 | 75.7 | |
| 4b | 72.1 | 72.1 | |
| 5b | 74.0 | 74.0 | |
| 6b | 68.6 | 68.6 | |
| c | 1c | 102.3 | 102.3 |
| 2c | 74.2 | 74.2 | |
| 3c | 76.0 | 76.0 | |
| 4c | 79.6 | 79.5 | |
| 5c | 73.9 | 73.9 | |
| 6c | 63.2 | 63.1 | |
| d | 1d | 102.2 | 102.3 |
| 2d | 74.0(α), 74.4(β) | 74.2 | |
| 3d | 76.0 | 76.0 | |
| 4d | 79.8 | 79.5 | |
| 5d | 73.9 | 73.9 | |
| 6d | 63.2 | 63.1 | |
| e | 1e | 94.6(α), 98.5(β) | 102.1 |
| 2e | 74.2(α), 76.7(β) | 74.0(α), 74.4(β) | |
| 3e | 75.9(α), 78.9(β) | 76.0 | |
| 4e | 79.6(α), 79.4(β) | 79.8 | |
| 5e | 72.6(α), 77.2(β) | 73.9 | |
| 6e | 63.4(α), 63.4(β) | 63.1 | |
| f | 1f | 94.6(α), 98.5(β) | |
| 2f | 74.2(α), 76.7(β) | ||
| 3f | 76.0(α), 78.9(β) | ||
| 4f | 79.6(α), 79.5(β) | ||
| 5f | 72.6(α), 77.2(β) | ||
| 6f | 63.3(α), 63.3(β) | ||
이들 결과로부터, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소에 의한 말토테트라오스로부터의 생성물 Ⅹ는, 말토테트라오스의 비환원 말단 글루코오스의 6위치 히드록실기에 글루코오스기가 α결합한 5당이고, 구조식 1로 나타내어지는 α-이소말토실글루코트리오스(별명, 64-O-α-글루코실말토테트라오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 1:
αD-Glcp(1→6)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)D-Glcp
그리고 말토펜타오스로부터의 생성물 Y는, 말토펜타오스의 비환원 말단 글루코오스의 6위치 히드록실기에 글루코실기가 α결합한 6당이고, 구조식 2로 나타내어지는 α-이소말토실글루코테트라오스(별명, 65-O-α-글루코실말토펜타오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 2:
αD-Glcp(1→6)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)αD-Glcp(1→4)D-Glcp
이상으로부터, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소의 말토올리고당에 대한 작용은 아래와 같이 판단되었다.
(1) 이 효소는, 기질로서, α-1,4 결합으로 된 글루코오스 중합도 2 이상의 당질(말토올리고당)에 작용하여, 그 비환원성 말단의 글루코실 잔기를 다른 분자의 비환원성 말단의 글루코실 잔기의 6위치에 전이하는 작용을 가진 분자간 6-글루코실 전이를 촉매하고, 비환원 말단에 6-O-α-글루코실기를 가진, 글루코오스 중합도가 1 증가한 α-이소말토실글루코 당질(별명, 6-O-α-글루코실말토올리고당)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 생성한다.
(2) 이 효소는, 4-글루코실 전이도 약간 촉매하여, 말토올리고당으로부터 글루코오스 중합도가 1 증가한 말토올리고당과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 약간 생성한다.
실험예 8: 전이 수용체 특이성
각종 당질을 사용하여, 이 효소가 당전이 수용체로 될 수 있는가 아닌가의 시험을 하였다. 즉, D-글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, N-아세틸-글루코사민, 소르비톨, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스, 수크로오스, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 또는 γ-사이클로덱스트린을 사용하여 농도 1.6％의 용액(당전이 수용체 용액)을 조제하고, 여기에, 당공여체로서 전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』(농도 4％)을 가하고, 실험예 2-1의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 또는 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를, 당공여체 고형물 그램당, 각각 1 단위씩 가하고, 이것을 30℃, pH 6.0에서 24시간 반응시켰다. 효소반응 후의 반응액을, 당수용체가 단당 또는 이당류인 경우는 가스 크로마토그래피법(이하, 『GLC법』이라 약기한다.)에 의해, 당수용체가 3당류 이상인 경우는 HPLC법에 의해 분석하고, 각각의 당수용체가 이 효소에 의한 당전이 수용체로 되는가 아닌가를 확인하였다. 그리고 GLC법에 있어서, GLC장치는 『GC-16A』(일본국의 주식회사 島津제작소제), 칼럼은 지·엘·사이언스 주식회사제 『2％ 실리콘 OⅤ-17/크로모소르브W』를 충전한 스테인레스제 칼럼(3mmφ×2m), 캐리어 가스는 질소 가스를 유량 40ml/분에서 160℃로부터 320℃까지 7.5℃／분의 속도로 승온하고, 검출은 수소염 이온 검출기로 분석하였다. HPLC에서는, HPLC의 장치는 일본국의 Tosoh 주식회사제 『CCPD』, 칼럼은 『ODS-AQ-303』(일본국의 주식회사 YMC사제), 용리액은 물을 유속 0.5ml/분으로, 검출은 시차 굴절형으로 분석하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[표 13]
| 당 질 | 당전이 생성물 | 당 질 | 당전이 생성물 |
| C9효소 C11효소 | C9효소 C11효소 | ||
| D-글루코오스 | ＋ ＋ | 소르비톨 | - - |
| D-크실로오스 | ＋＋ ＋＋ | 트레할로오스 | ＋＋ ＋＋ |
| L-크실로오스 | ＋＋ ＋＋ | 이소말토오스 | ＋＋ ＋＋ |
| D-갈락토오스 | ＋ ＋ | 이소말토트리오스 | ＋＋ ＋＋ |
| D-푸룩토오스 | ＋ ＋ | 셀로비오스 | ＋＋ ＋＋ |
| D-만노오스 | - - | 겐티비오스 | ＋＋ ＋＋ |
| D-아라비노오스 | ± ± | 말티톨 | ＋＋ ＋＋ |
| D-푸코오스 | ＋ ＋ | 락토오스 | ＋＋ ＋＋ |
| L-소르보오스 | ＋ ＋ | 수크로오스 | ＋＋ ＋＋ |
| L-람노오스 | - - | α-시클로덱스트린 | - - |
| 메틸-α-글루코시드 | ＋＋ ＋＋ | β-시클로덱스트린 | - - |
| 메틸-β-글루코시드 | ＋＋ ＋＋ | γ-시클로덱스트린 | - - |
| N-아세틸글루코사민 | ＋ ＋ |
표 중에서,
「-」는 수용체로의 당전이물이 검출되지 않았음을 나타내고,
「±」는 수용체로의 당전이물이 검출되었으나, 그 생성량이 1% 미만이었음을 나타내며,
「+」는 수용체로의 당전이물이 1% 이상 10% 미만이었음을 나타내고,
「++」는 수용체로의 당전이물이 10% 이상이었음을 나타낸다.
표 13의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는, 그 당전이 수용체로서 여러가지의 당질을 사용할 수 있고, 특히, D-크실로오스, L-크실로오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스 및 수크로오스에 잘 전이하고, 이어서, D-글루코오스, D-프룩토오스, D-푸코오스, L-소르보오스 및 N-아세틸글루코사민에도 전이하며, 더욱이는 D-아라비노오스에도 전이하는 작용을 가진 효소이다.
실험예 9: 배양물로부터의 환상 4당의 조제
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃1』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 5w/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히 미스트』, 일본국의 아사히 맥주 주식회사제) 1.5w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체 배지를, 500ml 용량의 3각 플라스크에 100ml을 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 후, 원심분리해서 균체를 제거하여 배양 상청을 얻었다. 다시 이 배양 상청을 오토클레이브(120℃, 15분간)하고, 방냉한 후, 불용물을 원심분리해서 제거하여 상청을 회수하였다. 이 상청 약 90ml을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사제)를 고형물 그램당 1,500 단위와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매)를 고형물 그램당 75 단위 첨가해서 24시간 처리하고, 이어서 수산화 나트륨으로 pH를 12로 조정하여 2시간 펄펄 끓여 잔존하는 환원당을 분해하였다. 불용물을 여과해서 제거한 후, 일본국의 三菱화학제 이온교환 수지 『다이아이온 PK218』과 『다이아이온 WA30』을 사용해서 탈색, 탈염하고, 더욱이 일본국의 三菱화학제 캐타이온 교환 수지 『다이아이온 SK-1B』와 일본국의 오르가노제 음이온 교환 수지 『IRA411』로써 다시 탈염하고, 활성탄으로 탈색하여 정밀여과한 후, 에바포레이터에서 농축하고, 동결 진공건조하여 고형물로서 약 0.6g의 당질분말을 얻었다. 이 당질분말은 환상 4당을 99.9％ 이상 함유하고 있었다.
실험예 10: 환상 4당의 생성
각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말토실 전이효소의 작용에 의한 환상 4당 생성시험을 하였다. 당질로서, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 아밀로오스, 가용성 전분, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스#100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 또는 글리코겐(굴 조개 유래, 일본국의 和光純藥 주식회사 판매)을 사용하여 이들의 수용액을 따로 따로 조제하였다.
이들 수용액(농도 0.5％)에, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 1 단위와, 실험예 4-4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 10 단위를 가하고, 이들을 30℃, pH 6.0에서 작용 시켰다. 작용 조건은, 아래의 4가지의 계(系)에서 실시하였다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 각종 당질에 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활하고, 계속하여 α-이소말토실 전이효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(2) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(3) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(4) α-이소말토실 전이효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
이들 열실활시킨 반응액 중의 환상 4당의 생성량을 조사하기 위해서, 실험예 1과 마찬가지의 α-글루코시다아제와 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하고, 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하여, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
| 기 질 | 환상 4당 생성량(%) | |||
| α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 작용후, α-이소말토실 전이효소를 작용 | α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 작용 | α-이소말토실글루코 당질 생성 효소만의 작용 | α-이소말토실 전이효소만의 작용 | |
| 말토오스 | 4.0 | 4.2 | 0.0 | 0.0 |
| 말토트리오스 | 10.2 | 12.4 | 0.0 | 0.0 |
| 말토테트라오스 | 11.3 | 21.5 | 0.0 | 0.0 |
| 말토펜타오스 | 10.5 | 37.8 | 0.0 | 0.0 |
| 아밀로오스 | 3.5 | 31.6 | 0.0 | 0.0 |
| 가용성 전분 | 5.1 | 38.2 | 0.0 | 0.0 |
| 전분 부분 분해물 | 6.8 | 63.7 | 0.0 | 0.0 |
| 글리코겐 | 10.2 | 86.9 | 0.0 | 0.0 |
표 14의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험한 어느 당질이라도 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소만의 작용 및 α-이소말토실 전이효소만의 작용에서는 환상 4당은 전혀 생성하지 않았음에 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용함으로써 환상 4당이 생성하였다. 그 생성량은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후에 α-이소말토실 전이효소를 작용시켰을 경우에는 약 11％ 이하로서 비교적으로 낮은 것에 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용하면 어느 당질에서도 환상 4당의 생성량은 향상하고, 특히, 글리코겐에서는 약 87％로 증가하고, 전분 부분 분해물에서는 약 64％로 증가하는 것이 판명되었다.
α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 있어서의 환상 4당의 생성 메커니즘은, 양(兩)효소의 반응특성으로부터 아래와 같이 추찰된다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는, 글리코겐이나 전분 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여 그 글루코오스기를, 다른 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 6위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.
(2) α-이소말토실 전이효소는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 그 이소말토실기를, 다른 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 3위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.
(3) 계속해서, α-이소말토실 전이효소는, 그 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 분자 내 전이 작용에 의해 이소말토실-1,3-이소말토실기를 α-1,4 글루칸 체인으로부터 잘라 떼어버리고, 고리화(環化)하여 환상 4당이 생성한다.
(4) 잘라 떼어버려진 α-1,4 글루칸 체인은, 다시, (1) 내지 (3)의 반응을 경유함으로써 새로이 환상 4당이 생성한다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에서 상기한 바와 같이 양(兩)효소가 반복하여 작용해서 환상 4당의 생성량이 증가한다고 추정된다.
실험예 11: 전분 액화도의 영향
옥수수 전분을 농도 15％의 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 가해서 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.2 내지 2.0％을 가하여, 95℃에서 10분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 약 35℃로 급랭하여 DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 2 단위와, 실험예 4-4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cl1 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 20 단위를 가하고 35℃에서 24시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간 열처리하여 효소를 실활시켰다. 계속해서, 실험예 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제와 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 15에 나타낸다.
[표 15]
| α-아밀라아제 사용량 전분당(當)（％) | DE | 환상 4당 생성율(%) |
| 0.2 | 3.2 | 54.5 |
| 0.4 | 4.8 | 50.5 |
| 0.6 | 7.8 | 44.1 |
| 1.0 | 12.5 | 39.8 |
| 1.5 | 17.3 | 34.4 |
| 2.0 | 20.5 | 30.8 |
표 15의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소에 의한 환상 4당의 생성은, 전분의 액화의 정도에 의해서 영향을 받는데, 액화의 정도가 낮을수록, 즉, DE가 낮은 값일수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율은 높고, 반대로, 액화의 정도가 높을수록, 즉, DE가 높은 값일수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율이 낮은 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, 전분의 부분 분해의 정도는 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합함이 판명되었다.
실험예 12: 전분 부분 분해물 농도의 영향
전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』(DE 약 2 내지 약 5)의 최종농도 0.5 내지 40％의 수용액을 조제하고, 각각에, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 1 단 위와, 실험예 4-4에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 10 단위 가하고, 이들 양(兩)효소를 병용하여 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이어서 실험예 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제와 글루코아밀라아제를 사용하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 16에 나타낸다.
[표 16]
| 파인덱스 농도(%) | 환상 4당 생성량(%) |
| 0.5 | 63.6 |
| 2.5 | 62.0 |
| 5 | 60.4 |
| 10 | 57.3 |
| 15 | 54.6 |
| 20 | 51.3 |
| 30 | 45.9 |
| 40 | 39.5 |
표 16의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 0.5％의 저농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 64％인데 대해, 농도 40％의 고농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 40％로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 환상 4당의 생성량이 변화하는 것이 판명되었다. 이 결과로부터, 환상 4당의 생성량은 전분 부분 분해물의 농도에 의해 변화한다는 것이 판명되었다.
실험예 13: 시클로덱스트린글루카노트란스페라아제 첨가 효과
전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』 수용액(농도 15％)을 조제하고, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 1 단위와, 실험예 4-4에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 고형물 그램당 10 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래의 CGTase를 고형물 그램당 0 내지 0.5 단위 가하고, 이들 두 효소를 병용해서 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이어서 효소반응액을 α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사제)와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매)를 사용하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 이들 결과를 표 17에 나타낸다.
[표 17]
| CGTase 첨가량(단위) | 환상 4당 생성량(%) |
| 0 | 54.6 |
| 2.5 | 60.1 |
| 5 | 63.1 |
| 10 | 65.2 |
표 17의 결과로부터 명백한 바와 같이, CGTase를 첨가함으로써 환상 4당의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다.
실험예 15: 이소말토오스 유리 효소의 조제
덱스트란 3.Ow/v％, 펩톤 0.7w/v％, 인산 2칼륨 0.2w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체 배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣어, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 아르드로박터 글로비포르미스(IAM 12103)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v%을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서, 72시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액 중의 이소말토오스 유리 효소로서의 이소말토덱스트라나아제 활성은 약 16.5 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 후, 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, 이 효소는 약 16 단위/ml의 활성(총 활성 약 288,000 단위)이었다. 한편, 이소말토덱스트라나아제 활성의 측정은, 농도 0.1M 아세트산 완충액(pH 5.5)을 함유하는 농도 1.25w/v％ 덱스트란 수용액 4ml을 기질액으로 하고, 그 기질액에 효소액 1ml을 가하여 40℃에서 20분간 효소반응하고, 그 반응액으로부터 1ml을 취하여, 그것을 소모기 구리액 2ml에 가해서 반응을 정지시킨 후, 생성한 이소말토오스의 환원력을 소모기·넬슨법으로 정량함으로써 실시하였다. 이소말토덱스트라나아제의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 이소말토오스에 상당하는 환원력을 생성하는 효소량으로 정의하였다. 배양 상청 약 18L을 UF막으로 약 2L로 농축한 후, 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치하였다. 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 5mM 인산 완충액(pH 6.8)에 용해 후, 동일 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 400ml을 얻었다. 이 조효소액을 『Sepabeads FP-DA13』겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피(겔량 2L)에 사용하였다. 이소말토덱스트라나아제 활성은, 『Sepabeads FP-DA13 』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 활성획분을 회수하고, 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치하였다. 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 5mM 인산 완충액(pH 6.8)에 용해 후, 동일 완충액에 대하여 투석하여 이소말토덱스트라나아제 활성으로서 161,000 단위를 함유하는 부분 정제 효소액 약 500ml을 얻었다.
실험예 16: α-이소말토실글루코 당질 및 환상 4당으로부터의 이소말토오스의 조제
최종 고형물 농도 0.2％의 파노오스, α-이소말토실말토오스, α-이소말토실트리오스, α-이소말토실테트라오스, 또는 환상 4당 수용액에, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위(환상 4당의 경우, 100 단위 또는 3000 단위)를 가하여 40℃, pH 5.5에서 24시간 작용시키고 100℃에서 20분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소반응액의 당조성을 HPLC법을 이용해서 측정하였다. HPLC는, 『MCIGEL CKO4SS』 칼럼(일본국의 三菱화학 주식회사제)을 사용하고, 칼럼내 온도 80℃, 용리액으로서의 물의 유속 0.5ml/min의 조건에서 실시하고, 검출은 시차 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사제)를 이용해서 하였다. 그 결과를 표 18에 나타낸다.
[표 18]
| 기 질 | 효소량 (단위) | 반응에서 생성한 당질(HPLC 면적 %) | |||||
| G1 | IM | G2 | G3 | G4 | A | ||
| IMG1 | 100 | 35 | 65 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| IMG2 | 100 | 0 | 51 | 49 | 0 | 0 | 0 |
| IMG3 | 100 | 0 | 41 | 0 | 59 | 0 | 0 |
| IMG4 | 100 | 0 | 35 | 0 | 0 | 65 | 0 |
| 환상 4당 | 100 | 0 | 22 | 0 | 0 | 0 | 78 |
| 3000 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
표 중에서, IMGl, IMG2, IMG3, IMG4는 각각, 파노오스, α-이소말토실말토오스, α-이소말토글루코트리오스, 이소말토글루코테트라오스를 의미하고, G1, IM, G2, G3, G4는 각각, 글루코오스, 이소말토오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스를 의미하며, A는 환상 4당으로부터 이소말토오스를 생성하는 과정에서의 중간체를 의미한다.
표 18의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질에 이소말토덱스트라나아제를 작용시킨 결과, 기질로서의 파노오스로부터는 글루코오스와 이소말토오스만이 생성하고, 기질로서의 α-이소말토실말토오스로부터는 이소말토오스와 말토오스만이 생성하며, 기질로서의 α-이소말토실트리오스로부터는 이소말토오스와 말토트리오스만이 생성하고, 기질로서의 α-이소말토실테트라오스로부터는 이소말토오스와 말토테트라오스만이 생성하는 것이 판명되었다. 한편, 기질로서의 환상 4당으로부터는 생성물 A를 중간체로 하여 이소말토오스만이 생성하는 것이 판명되었다.
이어서, 기질로서의 환상 4당으로부터의 중간체인 생성물 A의 정제와 단리를 하였다. 즉, 분취용 HPLC칼럼 『YMC-Pack ODS-A R355-15S-15 12A』(일본국의 주식회사 YMC사제)을 사용하여 생성물 A를 정제하여 단리함으로써, 상기의 환상 4당으 로부터의 반응물로부터 순도 98.2％ 이상의 생성물 A를 고형물 수율 약 7.2％로서 단리하였다.
생성물 A에 대해서, 통상적인 방법에 따라서 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석 결과는 표 19에 정리하였다. NMR 분석 결과에 대해서는 1H-NMR 스펙트럼을 도 21에 나타내었다. 또한, 13C-NMR 스펙트럼을 도 22에 나타내고, 그것들의 귀속을 표 20에 정리하였다.
[표 19]
| 분석 메틸화물의 종류 | 조성비 |
| 2,3,4-트리메틸화물 | 2.00 |
| 2,4,6-트리메틸화물 | 0.92 |
| 2,3,4,6-테트라메틸화물 | 0.88 |
[표 20]
| 글루코오스 번호 | 탄소 번호 | NMR 화학 시프트값(ppm) |
| a | 1a | 100.7 |
| 2a | 74.2 | |
| 3a | 75.8 | |
| 4a | 72.3 | |
| 5a | 74.5 | |
| 6a | 63.2 | |
| b | 1b | 102.1 |
| 2b | 74.3 | |
| 3b | 75.9 | |
| 4b 5b 6b | 72.6 74.2 68.0 | |
| c | 1c | 100.6 |
| 2c | 72.8 | |
| 3c | 83.0 | |
| 4c | 72.0 | |
| 5c | 73.1 | |
| 6c | 62.9 | |
| e | 1e 2e | 94.9(α), 98.8(β) 74.1(α), 76.6(β) |
| 3e | 75.8(α), 78.7(β) | |
| 4e | 72.1(α), 72.1(β) | |
| 5e | 72.6(α), 76.9(β) | |
| 6e | 68.3(α), 68.3(β) |
이들의 결과로부터, 이소말토덱스트라나아제에 의한 환상 4당으로부터 이소말토오스를 생성할 때의 중간체인 생성물 A는 환상 4당의 α-1,3 결합의 어느 하나가 가수분해해서 개환화한 4당류이고, 구조식 3으로 나타내어지는 α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3 )-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스(개환 4당)인 것이 판명되었다.
구조식 3:
αD-Glcp(1→6)αD-Glcp(1→3)αD-Glcp-(1→6)αD-Glcp
이상으로부터, 이소말토덱스트라나아제의 α-이소말토실글루코 당질에 대한 작용은 아래와 같이 판단된다.
이소말토덱스트라나아제는, 기질로서, 비환원 말단에 6-O-α-글루코실기를 가진 α-이소말토실글루코 당질에 작용하여 그 비환원성 말단의 이소말토실 잔기와 글루코오스(말토올리고당) 잔기 사이의 α-1,4 결합을 특이적으로 가수분해하여 이소말토오스와 글루코오스(말토올리고당)를 생성한다. 또한, 이소말토덱스트라나아제는, 기질로서, 환상 4당에도 작용하여 그 α-1,3 결합을 가수분해하고, 개환하여 중간체로서 개환 4당을 생성하고, 더욱이 개환 4당에도 작용하여 그 α-1,3 결합을 가수분해하여 이소말토오스를 생성한다.
실험예 17: 각종 기질로부터의 이소말토오스의 생성
각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 및 이소말토덱스트라나아제의 작용에 의한 이소말토오스의 생성에 대해서 시험하였다. 즉, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 아밀로오스, 또는 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스＃100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제)과 염화 칼슘을 사용하고, 각각 수용액의 당질 최종농도가 5％, 염화 칼슘 최종농도가 1mM이 되도록 조제하였다. 이어서, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위를 가하고, 이들을 40℃, pH 5.5에서 반응시켰다. 반응 조건은 아래의 두가지의 계에서 실시하였다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 당질에 65시간 작용시킨 후, 효소를 열실활하고, 계속하여 이소말토덱스트라나아제를 65시간 작용시킨 후, 효소를 열실활시켰다.
(2) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제를 병용하여 당질에 65시간 작용시킨 후, 이들 효소를 가열 실활시켰다. 이어서, 가열 처리한 효소반응액 중의 이소말토오스 생성량을 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 21에 나타낸다.
[표 21]
| 기 질 | 이소말토오스 생성량(%) | |
| α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후, 이소말토덱스트라나아제를 작용 | α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제를 병용 | |
| 말토오스 | 6.6 | 7.0 |
| 말토트리오스 | 15.7 | 18.7 |
| 말토테트라오스 | 15.8 | 45.4 |
| 말토펜타오스 | 15.3 | 55.0 |
| 말토헥사오스 | 10.1 | 58.1 |
| 말토헵타오스 | 8.5 | 63.6 |
| 아밀로오스 | 4.0 | 64.9 |
| 전분 부분 분해물 | 3.8 | 62.7 |
표 21의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험한 어떠한 당질로부터도 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 작용에 의해 이소말토오스가 생성하였다. 그 생성량은, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킨 후에 이소말토덱스트라나아제를 작용시켰을 경우에는 약 15％ 이하로서 비교적으로 낮은데 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제를 함께 작용시키면 어떠한 당질에 있어서도 이소말토오스의 생성량은 향상하고, 특 히, 말토헵타오스, 아밀로오스, 전분 부분 분해물에서는 60％ 이상까지 증가하는 것이 판명되었다. 이 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 병용에서의 이소말토오스의 생성 메커니즘은 양(兩)효소의 반응 특성으로부터 아래와 같이 추정된다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는, 아밀로오스나 전분 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여 그 글루코오스기를 다른 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 6위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인이 생성한다.
(2) 이소말토덱스트라나아제는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 그 이소말토실기와 α-1,4 글루칸 체인 사이의 α-1,4 결합을 가수분해하여 이소말토오스와 글루코오스 중합도가 2 감소한 글루칸 체인을 생성한다.
(3) 잘라 떼어버려진 α-1,4 글루칸 체인은, 다시, (1) 내지 (2)의 반응을 받음으로써 새로이 이소말토오스가 생성한다. α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 병용에서, 상기한 바와 같이, 이들 두 효소가 반복하여 작용해서 이소말토오스의 생성량이 증가한다고 추정된다.
실험예 18: 이소아밀라아제의 첨가 효과
전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』 수용액(최종농도 5％, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험예 15에서 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0 내지 250 단위 가하고, 40℃, pH 5.5에서 병용하여 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 22에 나타낸다.
[표 22]
| 이소아밀라아제 첨가량(단위) | 이소말토오스 생성량(%) |
| 0 | 62.7 |
| 50 | 65.1 |
| 250 | 71.1 |
표 22의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이소아밀라아제를 첨가함으로써 이소말토오스의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다.
실험예 19: 전분 부분 분해물 농도의 영향
농도가 다른 8종류의 전분 부분 분해물 『파인덱스＃100』(DE 약 2 내지 약 5) 수용액(최종농도 1 내지 40％의 수용액, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 각각, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 고형물 그램당 250 단위 가하고, 40℃, pH 5.5에서 병용하여 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 23에 나타낸다.
[표 23]
| 파인덱스 농도(%) | 이소말토오스 생성량(%) |
| 1 | 73.0 |
| 2.5 | 72.8 |
| 5 | 71.1 |
| 10 | 67.0 |
| 15 | 63.7 |
| 20 | 60.7 |
| 30 | 55.4 |
| 40 | 50.7 |
표 23의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 1％인 저농도에서는 이소말토오스의 생성량은 약 73％인데 대해, 농도 40％인 고농도에서는 이소말토오스의 생성량은 약 51％로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 이소말토오스의 생성량이 변화하는 것이 판명되었다.
실험예 20: 전분 액화 정도의 영향
옥수수 전분을 농도 15％ 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 가해서 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.2 내지 2.0％을 가하여, 95℃에서 10분간 반응시킨 다음, 120℃에서 오토클레이브하고, 약 40℃로 급랭하여 DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에 최종 전분농도 5％, pH 5.5로 조정한 후, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소 표품을 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 고형물 그램당 250 단위를 가하고, 4O℃에서 65시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 그 결과를 표 24에 나타낸다.
[표 24]
| α-아밀라아제 사용량 (전분 그램당의 ％（w/w)) | DE | 이소말토오스 생성율(％) |
| 0.2 | 3.2 | 71.5 |
| 0.4 | 4.8 | 71.0 |
| 0.6 | 7.8 | 66.2 |
| 1.0 | 12.5 | 59.8 |
| 1.5 | 17.3 | 53.2 |
| 2.0 | 20.5 | 47.9 |
표 24의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제에 의한 이소말토오스 생성율은, 전분의 액화도의 영향을 받고, 액화의 정도가 낮을수록, 즉, DE가 낮은 값일수록 전분으로부터의 이소말토오스의 생성율은 높고, 반대로, 액화의 정도가 높은, 즉, DE가 높은 값일수록 전분으로부터의 이소말토오스의 생성율이 낮은 것이 판명되었다. 구체적으로는, 전분의 부분 분해의 정도는 DE 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합하다는 것이 판명되었다.
실험예 23: 시클로덱스트린글루카노트란스페라아제와 글루코아밀라아제의 첨가 효과
전분 부분 분해물 『파인덱스#100』수용액(최종농도 20％, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 실험예 4-1에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래 CGTase(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소)를 0 내지 0.5 단위 가하고, 이들 효소를 병용하여, 40℃, pH 5.5에서 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 계속해서, 글루코아밀라아제(상품명 『ⅩL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 20 단위 가하고, 50℃에서 24시간 작용시킨 후, 100℃에서 20분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 이들 결과를 표 25에 나타낸다.
[표 25]
| CGTase 첨가량(전분 그램당의 단위수) | 이소말토오스 생성량(％) |
| 0 | 60.7 |
| 0.1 | 62.9 |
| 0.25 | 65.0 |
| 0.5 | 66.4 |
표 25의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 이소말토덱스트라나아제의 효소반응계에 CGTase를 첨가함으로써, 이소말토오스의 생성량이 증가하는 것이 판명되었다. 그리고 상기 글루코아밀라아제는, CGTase 존재하에서 생성한 이소말토오스에 1개 이상의 D-글루코오스 잔기를 결합한 당질로부터 D-글루코오스 잔기를 유리시켜 이소말토오스를 더욱 생성시킬 목적으로 사용한 것이다.
이하, 실시예 A 및 실시예 B에서 본 발명의 이소말토오스 또는 이소말토오스 고함유물의 제조방법과 그 용도에 대해서 상세히 설명한다.
실시예 A-1
옥수수 유래의 피토글리코겐(큐피 주식회사제)의 수용액(약 100L)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험예 4-1의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분 그램당 1 단위와, 실험예 4-4의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 전분 그램당 10 단위 가하여 48시간 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시켰다. 이 효소반응액의 일부를 취하여 HPLC법에 의해 환상 4당의 생성량을 조사한 결과, 당조성으로 약 84％이었다. 그리고 HPLC법은, 『Shodex KS-801 칼럼』(일본국의 昭和電工 주식회사제)을 사용하고, 칼럼 온도 60℃, 유속 0.5ml/min 물의 조건에서 실시하고, 검출은 시차 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사제)를 사용하여 하였다. 이 효소반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 아마노』, 일본국의 天野 엔자임 주식회사제)를 전분 그램당 1500 단위와, 글루코아밀라아제(상품명 『ⅩL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 75 단위를 가하고 24시간 반응시켜 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 더욱이 수산화 나트륨으로 pH를 5.8로 조정하고, 온도 90℃에서 1시간 유지해서 효소를 실활시킨 다음, 불용물을 여별(濾別)하였다. 이 여액을 역침투막(상품명 『호로셋푸 HR5155PI』, 일본국의 東洋紡績 주식회사제)을 사용해서 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법에 따라서, 탈색, 탈염, 여과, 농축함으로써 고형분 약 3,700g을 함유하는 당액 약 6.2kg을 얻었다. 이 당액을 이온교환 수지(상품명『암바라이트 CR-1310(Na+형)형』, 오르가노사제)를 충전한 칼럼(겔량 약 225L)에 사용하고, 칼럼 온도 60℃에서 유속 약 45L/h의 조건으로 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당조성을 상기 HPLC법으로 모니터하여 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 회수하고, 이것을 통상적인 방법에 따라 탈염, 탈색, 여과, 농축하여 고형분 약 2,500g을 함유하는 당액 약 7.5kg을 얻었다. 이 당액의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 99.5％ 이었다. 얻어진 환상 4당 함유 당액을 에바포레이터에서 농도 약 50％까지 농축한 후, 이 농축액 약 5kg을 원통형상 플라스틱 용기에 넣고, 완만하게 회전시키면서 약 20시간 동안 온도를 65℃로부터 20℃까지 강하시켜서 환상 4당을 결정석출시켰다. 계속해서, 원심여과기를 이용해서 분밀(分蜜)하여 환상 4당 결정을 습(濕) 중량으로서 1,360g 회수하고, 다시 60℃에서 3시간 건조하여 환상 4당 결정 분말을 1,170g 얻었다. 이 결정 분말의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당 결정 분말의 순도는 99.9％ 이상으로서 극히 고순도이었다.
이어서, 상기 환상 4당 결정 분말을 탈이온수에 용해하고, 농도 1％, pH 5.5, 온도 50℃로 조정한 후, 실험예 15의 방법으로 조제한 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 500 단위 가하고, pH 5.5, 50℃에서 70시간 반응시켰다. 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고 여과해서 얻게 되는 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 다시, 농도 약 75％로 농축하여 시럽상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 이소말토오스 96.1％, 개환(開環) 4당 2.8％, 및 그 밖의 당질을 1.1％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 난(難)결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난(難)발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료(餌料), 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-2
실시예 A-1의 방법으로 얻어진 시럽상 이소말토오스 고함유물을, 강산성 캐타이온 교환 수지(상품명 『암바라이트 CR-1310』, Na+형, 오르가노 주식회사제)를 사용해서 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 즉, 상기 수지를 내경 12.5cm의 재킷 부착 스테인레스제 칼럼 10개에 충전하고, 이들 칼럼을 직렬로 접속해서 수지층 전체 길이를 16m로 하였다. 칼럼내 온도를 40℃로 유지하면서, 상기 시럽을 수지량에 대하여 1.5v/v％ 가하고, 여기에 40℃의 온수를 SV O.2로 흘려서 분획하고, 용출액의 당조성을 HPLC법으로 모니터하면서 이소말토오스 고함유 획분을 채취하고, 이것을 정제하여 이소말토오스 고함유액을 얻었다. 이소말토오스의 고형물당의 수율은 약 80％이었다. 이 액을 통상적인 방법에 따라 탈색, 탈염, 농축하여 농도 약 75％의 시럽상 이소말토오스 고함유물을 얻었다.
이 제품은, 고형물당 약 99.9％ 이상의 극히 고순도의 이소말토오스를 함유하고 있었다. 이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-3
타피오카 전분을 농도 약 20％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1％를 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 다시 약 40℃로 급랭해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻어, 여기에 실험예 2-1의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, CGTase(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0.5 단위가 되도록 가하고, pH 5.5, 온도 40℃에서 64시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, 온도 50℃로 조정한 다음, 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『글루코자임』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 고형물 그램당 10 단위 가하고 24시간 반응시켜, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후, 냉각하여 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하여 H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축하여 건조함으로써 분말화하여 조립(造粒)해서 과립상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 글루코오스 11.0％, 이소말토오스 66.5%, 그 외의 2당류를 2.4％, 3당류 이상을 20.1％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-4
바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 실험예 1의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양 후, SF막을 이용해서 제균 여과하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 다시 그 여액을 UF막 농축하여, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 8.8 단위/ml와 α-이소말토실 전이효소를 26.7 단위/ml를 함유한 농축 효소액 약 1L을 회수하였다. 옥수수 전분을 농도 약 27％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1％ 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『타마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브 하고, 다시 약 40℃로 급랭해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 상기 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 그램당 0.25ml의 비율이 되도록 가하고, 더욱이 실험예 15의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 이소아밀라아제(일본국의 주식회회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, CGTase(일본국의 주식회사 林原 생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0.5 단위가 되도록 가하고, pH 5.5, 온도 40℃에서 70시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃로 가열해서 10분간 유지한 후, 온도 50℃로 조정한 다음, 글루코아밀라아제제(劑)(상품명 『글루코자임』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 20 단위 가하고 24시간 반응시켜, 그 반응액을 95℃로 가열해서 30분간 유지한 후, 냉각하여 여과해서 얻게 되는 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 75％의 시럽상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 글루코오스 32.6％, 이소말토오스 59.4％, 기타의 2당류를 1.2％, 3당류 이상을 6.8％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 A-5
실시예 A-4의 방법으로 얻어진 이소말토오스 함유 시럽을 원당액(原糖液)으로 하고, 이소말토오스의 함량을 높이기 위해서, 실시예 A-2의 방법에 준해서 염형 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 한 후, 이소말토오스 고함유 획분을 채취하고, 이것을 정제하고, 농축해서 이소말토오스 고함유 시럽을 고형물당 약 60％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 글루코오스 4.8％, 이소말토오스 85.3％, 기타의 2당류를 3.9％, 3당류 이상을 6.0％ 함유하고 있었다. 이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호물 등에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 B-1: 감미료
실시예 A-1의 방법에 의해 얻은 분말상 이소말토오스 고함유물 0.8 중량부에, 트레할로오스 함수결정(등록상표 『Treha』, 일본국의 주식회사 林原상사 판매) 0.2 중량부, α-글리코실스테비오시드(상품명 『αG 스위트』, 일본국의 東洋精糖 주식회사 판매) 0.01 중량부, 및 L-아스파르틸―L-페닐알라닌메틸 에스테르(상품명 『아스파루테에무』) 0.01 중량부를 균일하게 혼합하고, 과립 성형기에서 과립상 감미료를 얻었다.
이 제품은, 단 맛의 질이 좋고, 수크로오스의 약 2배의 감미도를 가지고 있다.
이 제품은, 난결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성을 가진 이소말토오스를 함유하는 저감미료 조성물이다. 또한, 이 제품은, 실온 보존하에서 변질 열화의 우려가 없고, 안정하다.
실시예 B-2: 하드 캔디
농도 55％ 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-2의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 50 중량부를 가열 혼합하고, 이어서 감압하에서 수분 2％ 미만이 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 0.6 중량부 및 적당량의 레몬 향료와 착색료를 혼화하고, 통상적인 방법에 따라서 성형하여 제품을 얻었다.
이 제품은 씹는 느낌, 정미, 풍미 모두가 양호하고, 수크로오스의 결정석출도 일어나지 않으며, 흡습성이 적은 안정한 고품질의 하드 캔디이다.
실시예 B-3: 츄잉 검
츄잉 검 베이스 3 중량부를 유연해질 정도로 가열 용융하고, 여기에 무수 결정 말티톨 2 중량부, 크실리톨 2 중량부, 실시예 A-5의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 2 중량부, 및 트레할로오스 함수결정 1 중량부를 가하고, 다시 적당량의 향료와 착색료를 혼합하여, 통상적인 방법에 따라 로울러에 의해 혼련하여, 성형, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 텍스처, 정미, 풍미가 양호하고, 낮은 충치 유발성, 저칼로리의 츄잉 검으로서 바람직하다.
실시예 B-4: 분말 펩티드
40％ 식품용 대두 펩티드 용액(상품명 『하이뉴트 S』, 일본국의 不二製油 주식회사 판매) 1 중량부에 실시예 A-4의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 2 중량부를 혼합하고, 플라스틱제 바트에 넣어 50℃에서 감압건조하여 분쇄해서 분말 펩티드를 얻었다.
이 제품은 풍미양호하고, 프레 믹스, 빙과 등의 저칼로리 제과재료로서 유용할뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 난소화성의 식물(食物)섬유, 정장(整腸) 재료, 건강식품 재료로서도 유용하다.
실시예 B-5: 욕용제(浴用劑)
유자의 껍질 주스 1 중량부에 대하여, 실시예 A-3의 방법으로 얻은 과립상 이소말토오스 고함유물 10 중량부 및 환상 4당 1 중량부의 비율로 혼합하고, 분말화하여 유자의 껍질 엑기스 함유 이소말토오스 함유 분말을 얻었다.
이 분말 5 중량부에, 소염(燒鹽) 90 중량부, 트레할로오스 함수결정 2 중량부, 무수 규산 1 중량부 및 α-글루코실 헤스페리딘(상품명 『αG 헤스페리딘』, 일본국의 주식회사 林原 판매) 0.5 중량부를 혼합해서 욕용제를 제조하였다.
이 제품은, 유자의 향기도 풍부해서, 입욕용의 온수에 100 내지 10,000배로 희석해서 이용하면 좋고, 입욕 후는 피부가 산뜻하고 매끈매끈하며, 냉기를 느끼지 않는 고품질의 욕용제이다.
실시예 B-6: 화장용 크림
모노스테아르산 폴리옥시에틸렌글리콜 2 중량부, 자기 유화형 모노스테아르산 글리세린 5 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 2 중량부, α-글루코실 루틴(상품명 『αG루틴』, 일본국의 주식회사 林原 판매) 1 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 트리옥탄산 글리세린 10 중량부 및 방부제 적당량을 통상적인 방법에 따라 가열 용해하고, 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 가하고, 호모게나이저로써 유화하고, 더욱이 향료 적당량을 가해서 교반혼합하여 화장용 크림을 제조하였다.
이 제품은, 항산화성을 가지고, 안정성이 높으며, 고품질의 햇볕에 탐 방지제, 피부 미화제, 색백제 등으로서 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 B-7: 치약
제2인산 칼슘 45 중량부, 라우릴 황산 나트륨 1.5 중량부, 글리세린 25 중량부, 폴리옥시에틸렌소르비탄라우레이트 0.5 중량부, 실시예 A-5의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 15 중량부, 사카린 0.02 중량부 및 방부제 0.05 중량부를 물 13 중량부와 혼합해서 치약을 얻었다.
이 제품은, 계면활성제의 세정력을 저하함이 없고, 싫은 맛을 개량하며, 사 용후에 느끼는 감도 양호하다.
실시예 B-8: 유동식용 고체제제
실시예 A-1의 방법으로 얻은 분말상 이소말토오스 고함유물 1OO 중량부, 트레할로오스 함수결정 200 중량부, 말토테트라오스 고함유 분말 200 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 나이아신 아미드 0.04 중량부로 된 배합물을 조제하고, 이 배합물 25 그램씩을 방습성 라미네이트 자루에 충전하고, 히이트 시일해서 제품을 얻었다.
이 제품은, 정장작용이 우수한 유동식이다. 1 자루분을 약 150 내지 300ml의 물에 용해해서 유동식으로 하여, 경구적 또는 비강, 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 의해 이용되어 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-9: 정제
아스피린 50 중량부에 실시예 A-2의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 14 중량부, 콘 스타치 4 중량부를 충분히 혼합한 후, 통상적인 방법에 따라서 타정기(打錠機)에 의해 타정하여 두께 5.25mm, 1정당 680mg의 정제를 제조하였다.
이 제품은 이소말토오스의 부형성을 이용한 것으로서, 흡습성이 없고, 물리 적 강도도 충분히 있고, 더욱이 수중에서의 붕괴는 극히 양호하다.
실시예 B-10: 당의정
중량 150mg의 소정(素錠)을 심제(芯劑)로 하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 얻은 분말상 이소말토오스 고함유물 40 중량부, 풀룰란(평균 분자량 20만) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크 25 중량부 및 산화 티탄늄 3 중량부로 된 바탕액을 사용하여, 정제 중량이 약 230mg이 될 때까지 당의(糖衣)하고, 이어서, 환상 4당 결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 마무리액을 사용하여 당의하고, 다시 왁스액으로 광택을 내어 광택이 있는 외관이 좋은 당의제를 얻었다. 이 제품은 내충격성도 우수하고, 고품질을 장기간 유지한다.
실시예 B-11: 외상치료용 고약
실시예 A-5의 방법으로 얻은 시럽상 이소말토오스 고함유물 100 중량부 및 말토오스 300 중량부에, 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 다시 10w/v％ 풀룰란 수용액 200 중량부를 가해서 혼합하여 적당한 퍼짐성, 부착성을 나타내는 외상치료용 고약을 얻었다.
이 제품은 이소말토오스에 의해 요오드, 메탄올의 휘산이 방지되고, 경시 변화가 적으며 상품가치가 높은 고약이다.
또한, 이 제품은, 요오드에 의한 살균 작용뿐만 아니라, 말토오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하므로 치유 기간이 단축되며, 창면도 깨끗하게 낫는다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은, 이소말토오스의 신규의 제조방법과 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 비존재하 또는 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜서, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-l,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이어서, 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법과 그 용도에 관한 발명이다.
이러한 본 발명에 의하면, 이 분야에 있어서 유용한 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물을 공업적으로 대량으로 또한, 염가로 고수율로 제조할 수 있게 되었다. 이러한 본 발명에 의한 이소말토오스 및 이소말토오스 고함유물은 난(難)결정성이고, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식물, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등에 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명은 이렇게도 현저한 작용 효과를 나타내는 발명이어서, 이 분야에 공헌하는 바, 실로 큰 의의가 있는 발명이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
<120> Process for producing isomaltose and uses thereof
<130> WO899
<150> JP 130,922/01
<151> 2001-04-27
<160> 2
<210> 1
<211> 5180
<212> DNA
<213> Microorganism
<220>
<221> CDS
<222> (877)...(4728)
<400> 1
atctaccggt ttttgtgaag tttggcagta ttcttccgat gaatttgaac gcgcaatatc 60
aagtgggcgg gaccattggc aacagcttga cgagctacac gaatctcgcg ttccgcattt 120
atccgcttgg gacaacaacg tacgactgga atgatgatat tggcggttcg gtgaaaacca 180
taacttctac agagcaatat gggttgaata aagaaaccgt gactgttcca gcgattaatt 240
ctaccaagac attgcaagtg tttacgacta agccttcctc tgtaacggtg ggtggttctg 300
tgatgacaga gtacagtact ttaactgccc taacgggagc gtcgacaggc tggtactatg 360
atactgtaca gaaattcact tacgtcaagc ttggttcaag tgcatctgct caatccgttg 420
tgctaaatgg cgttaataag gtggaatatg aagcagaatt cggcgtgcaa agcggcgttt 480
caacgaacac gaaccatgca ggttatactg gtacaggatt tgtggacggc tttgagactc 540
ttggagacaa tgttgctttt gatgtttccg tcaaagccgc aggtacttat acgatgaagg 600
ttcggtattc atccggtgca ggcaatggct caagagccat ctatgtgaat aacaccaaag 660
tgacggacct tgccttgccg caaacaacaa gctgggatac atgggggact gctacgttta 720
gcgtctcgct gagtacaggt ctcaacacgg tgaaagtcag ctatgatggt accagttcac 780
ttggcattaa tttcgataac atcgcgattg tagagcaata aaaggtcggg agggcaagtc 840
cctcccttaa tttctaatcg aaagggagta tccttg 876
atg cgt cca cca aac aaa gaa att cca cgt att ctt gct ttt ttt aca 924
Met Arg Pro Pro Asn Lys Glu Ile Pro Arg Ile Leu Ala Phe Phe Thr
1 5 10 15
gcg ttt acg ttg ttt ggt tca acc ctt gcc ttg ctt cct gct ccg cct 972
Ala Phe Thr Leu Phe Gly Ser Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Pro Pro
20 25 30
gcg cat gcc tat gtc agc agc cta gga aat ctc att tct tcg agt gtc 1020
Ala His Ala Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val
35 40 45
acc gga gat acc ttg acg cta act gtt gat aac ggt gcg gag ccg agt 1068
Thr Gly Asp Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser
50 55 60
gat gac ctc ttg att gtt caa gcg gtg caa aac ggt att ttg aag gtg 1116
Asp Asp Leu Leu Ile Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val
65 70 75 80
gat tat cgt cca aat agc ata acg ccg agc gcg aag acg ccg atg ctg 1164
Asp Tyr Arg Pro Asn Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu
85 90 95
gat ccg aac aaa act tgg tca gct gta gga gct acg att aat acg aca 1212
Asp Pro Asn Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr
100 105 110
gcc aat cca atg acc atc acg act tcc aat atg aag att gag att acc 1260
Ala Asn Pro Met Thr Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr
115 120 125
aag aat cca gta cga atg acg gtc aag aag gcg gac ggc act acg cta 1308
Lys Asn Pro Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu
130 135 140
ttc tgg gaa cca tca ggc gga ggg gta ttc tca gac ggt gtg cgc ttc 1356
Phe Trp Glu Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe
145 150 155
ctt cat gcc aca ggg gat aat atg tat ggc atc cgg agc ttc aat gct 1404
Leu His Ala Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala
165 170 175
ttt gat agc ggg ggt gac ctg ctg cgg aat tcg tcc aat cat gcc gcc 1452
Phe Asp Ser Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala
180 185 190
cat gcg ggt gaa cag gga gat tcc ggt ggt ccg ctt att tgg agt acg 1500
His Ala Gly Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr
195 200 205
gca gga tat gga cta tta gtc gat agc gat ggc ggc tac ccc tat aca 1548
Ala Gly Tyr Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr
210 215 220
gat agc aca acc ggt caa atg gag ttt tat tat ggt ggg acc cct cct 1596
Asp Ser Thr Thr Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro
225 230 235 240
gag gga cgt cgt tat gcg aaa caa aac gtg gaa tat tat att atg ctc 1644
Glu Gly Arg Arg Tyr Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu
245 250 255
gga acc ccc aag gaa att atg acc gac gta ggg gaa atc aca ggg aaa 1692
Gly Thr Pro Lys Glu Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys
260 265 270
ccg cct atg ctg cct aag tgg tcg ctt gga ttc atg aac ttt gag tgg 1740
Pro Pro Met Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp
275 280 285
gat acg aat caa acg gag ttt acg aat aat gtg gat acg tat cgt gcc 1788
Asp Thr Asn Gln Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala
290 295 300
aaa aat atc ccc ata gat gct tac gcc ttc gac tat gac tgg aaa aag 1836
Lys Asn Ile Pro Ile Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys
305 310 315 320
tac ggg gaa acc aac tat ggt gaa ttc gcg tgg aat acg act aat ttc 1884
Tyr Gly Glu Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe
325 330 335
cct tct gcg tca acg act tct tta aag tca aca atg gat gct aaa ggc 1932
Pro Ser Ala Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly
340 345 350
atc aaa atg atc gga att aca aaa ccc cgc atc gtt acg aag gat gct 1980
Ile Lys Met Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala
355 360 365
tca gcg aat gtg acg acc caa ggg acg gac gcg aca aat ggc ggt tat 2028
Ser Ala Asn Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr
370 375 380
ttt tat cca ggc cat aac gag tat cag gat tat ttc att ccc gta act 2076
Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr
385 390 395 400
gtg cgt agt atc gat cct tac aat gct aac gaa cgt gct tgg ttc tgg 2124
Val Arg Ser Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp
405 410 415
aat cat tcc aca gat gcg ctt aat aaa ggg atc gta ggt tgg tgg aat 2172
Asn His Ser Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn
420 425 430
gac gag acg gat aaa gta tct tcg ggt gga gcg tta tat tgg ttt ggc 2220
Asp Glu Thr Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly
435 440 445
aat ttc aca aca ggc cac atg tct cag acg atg tac gaa ggg ggg cgg 2268
Asn Phe Thr Thr Gly His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg
450 455 460
gct tac acg agt gga gcg cag cgt gtt tgg caa acg gct aga acc ttc 2316
Ala Tyr Thr Ser Gly Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe
465 470 475 480
tac cca ggt gcc cag cgg tat gcg act acg ctt tgg tct ggc gat att 2364
Tyr Pro Gly Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile
485 490 495
ggc att caa tac aat aaa ggc gaa cgg atc aat tgg gct gcc ggg atg 2412
Gly Ile Gln Tyr Asn Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met
500 505 510
cag gag caa agg gca gtt atg cta tcc tcc gtg aac aat ggc cag gtg 2460
Gln Glu Gln Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val
515 520 525
aaa tgg ggc atg gat acc ggc gga ttc aat cag cag gat ggc acg acg 2508
Lys Trp Gly Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr
530 535 540
aac aat ccg aat ccc gat tta tac gct cgg tgg atg cag ttc agt gcc 2556
Asn Asn Pro Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala
545 550 555 560
cta acg cct gtt ttc cga gtg cat ggg aac aac cat cag cag cgc cag 2604
Leu Thr Pro Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln
565 570 575
cca tgg tac ttc gga tcg act gcg gag gag gcc tcc aaa gag gca att 2652
Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile
580 585 590
cag ctg cgg tac tcc ctg atc cct tat atg tat gcc tat gag aga agt 2700
Gln Leu Arg Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser
595 600 605
gct tac gag aat ggg aat ggg ctc gtt cgg cca ttg atg caa gcc tat 2748
Ala Tyr Glu Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr
610 615 620
cca aca gat gcg gcc gtc aaa aat tac acg gat gct tgg atg ttt ggt 2796
Pro Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly
625 630 635 640
gac tgg ctg ctg gct gca cct gtg gta gat aaa cag cag acg agt aag 2844
Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys
645 650 655
gat atc tat tta ccg tct ggg tca tgg att gac tat gcg cga ggc aat 2892
Asp Ile Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn
660 665 670
gca ata act ggc ggt caa acc atc cga tat tcg gtt aat ccg gac acg 2940
Ala Ile Thr Gly Gly Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr
675 680 685
ttg aca gac atg cct ctc ttt att aaa aaa ggt gcc att att cca aca 2988
Leu Thr Asp Met Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr
690 695 700
cag aaa gtg cag gat tac gta ggg cag gct tcc gtc act tcc gtt gat 3036
Gln Lys Val Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp
705 710 715 720
gtg gat gtg ttt ccg gat acg acg cag tcg agt ttc acg tac tac gat 3084
Val Asp Val Phe Pro Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp
725 730 735
gat gat ggc gcc agt tat aac tat gag agc ggc act tat ttt aag caa 3132
Asp Asp Gly Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln
740 745 750
aat atg act gct cag gat aat ggg tca ggc tcg tta agt ttt act tta 3180
Asn Met Thr Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu
755 760 765
gga gca aag agt ggc agt tac acg ccg gct ctc caa tcc tat atc gtt 3228
Gly Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val
770 775 780
aag ctg cac ggt tct gct gga act tct gtt acg aat aac agc gca gct 3276
Lys Leu His Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala
785 790 795 800
atg aca tct tat gca agc ttg gaa gca tta aaa gct gct gct ggg gaa 3324
Met Thr Ser Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu
805 810 815
ggc tgg gcg act ggg aag gac att tat ggg gat gtc acc tat gtg aaa 3372
Gly Trp Ala Thr Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys
820 825 830
gtg acg gca ggt aca gct tct tct aaa tct att gct gtt aca ggt gtt 3420
Val Thr Ala Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val
835 840 845
gct gcc gtg agc gca act act tcg caa tac gaa gct gag gat gca tcg 3468
Ala Ala Val Ser Ala Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser
850 855 860
ctt tct ggc aat tcg gtt gct gca aag gcg tcc ata aac acg aat cat 3516
Leu Ser Gly Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His
865 870 875 880
acc gga tat acg gga act gga ttt gta gat ggt ttg ggg aat gat ggc 3564
Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly
885 890 895
gct ggt gtc acc ttc tat cca aag gtg aaa act ggc ggt gac tac aat 3612
Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn
900 905 910
gtc tcc ttg cgt tat gcg aat gct tca ggc acg gct aag tca gtc agt 3660
Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser
915 920 925
att ttt gtt aat gga aaa aga gtg aag tcc acc tcg ctc gct aat ctc 3708
Ile Phe Val Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu
930 935 940
gca aat tgg gac act tgg tct aca caa tct gag aca ctg ccg ttg acg 3756
Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr
945 950 955 960
gca ggt gtg aat gtt gtg acc tat aaa tat tac tcc gat gcg gga gat 3804
Ala Gly Val Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp
965 970 975
aca ggc aat gtt aac atc gac aac atc acg gta cct ttt gcg cca att 3852
Thr Gly Asn Val Asn Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile
980 985 990
atc ggt aag tat gaa gca gag agt gct gag ctt tct ggt ggc agc tca 3900
Ile Gly Lys Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser
995 1000 1005
ttg aac acg aac cat tgg tac tac agt ggt acg gct ttt gta gac ggt 3948
Leu Asn Thr Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly
1010 1015 1020
ttg agt gct gta ggc gcg cag gtg aaa tac aac gtg aat gtc cct agc 3996
Leu Ser Ala Val Gly Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser
1025 1030 1035 1040
gca gga agt tat cag gta gcg ctg cga tat gcg aat ggc agt gca gcg 4044
Ala Gly Ser Tyr Gln Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala
1045 1050 1055
acg aaa acg ttg agt act tat atc aat gga gcc aag ctg ggg caa acc 4092
Thr Lys Thr Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr
1060 1065 1070
agt ttt acg agt cct ggt acg aat tgg aat gtt tgg cag gat aat gtg 4140
Ser Phe Thr Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val
1075 1080 1085
caa acg gtg acg tta aat gca ggg gca aac acg att gcg ttt aaa tac 4188
Gln Thr Val Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr
1090 1095 1100
gac gcc gct gac agc ggg aac atc aac gta gat cgt ctg ctt ctt tca 4236
Asp Ala Ala Asp Ser Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser
1105 1110 1115 1120
act tcg gca gcg gga acg ccg gtt tct gag cag aac ctg cta gac aat 4284
Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn
1125 1130 1135
ccc ggt ttc gag cgt gac acg agt caa acc aat aac tgg att gag tgg 4332
Pro Gly Phe Glu Arg Asp Thr Ser Gln Thr Asn Asn Trp Ile Glu Trp
1140 1145 1150
cat cca ggc acg caa gct gtt gct ttt ggc gtt gat agc ggc tca acc 4380
His Pro Gly Thr Gln Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr
1155 1160 1165
acc aat ccg ccg gaa tcc ccg tgg tcg ggt gat aag cgt gcc tac ttc 4428
Thr Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe
1170 1175 1180
ttt gca gca ggt gcc tat caa caa agc atc cat caa acc att agt gtt 4476
Phe Ala Ala Gly Ala Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Ile Ser Val
1185 1190 1195 1200
cct gtt aat aat gta aaa tac aaa ttt gaa gcc tgg gtc cgc atg aag 4524
Pro Val Asn Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys
1205 1210 1215
aat acg acg ccg acg acg gca aga gcc gaa att caa aac tat ggc gga 4572
Asn Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly
1220 1225 1230
tca gcc att tat gcg aac ata agt aac agc ggt gtt tgg aaa tat atc 4620
Ser Ala Ile Tyr Ala Asn Ile Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr Ile
1235 1240 1245
agc gta agt gat att atg gtg acc aat ggt cag ata gat gtt gga ttt 4668
Ser Val Ser Asp Ile Met Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Val Gly Phe
1250 1255 1260
tac gtg gat tca cct ggt gga act acg ctt cac att gat gat gtg cgc 4716
Tyr Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg
1265 1270 1275 1280
gta acc aaa caa taa 4731
Val Thr Lys Gln
acaaacaacc agctctcccg ttaatgggag ggctggttgt ttgttatgat aatccatcta 4791
tttagagtgg attaaacgtt ttgaagtgct tgctgaactt cttgcacaat ggataacgcc 4851
gcggtgcggg cacttgagaa agcacgttct gcaagctctc ccttacctgt acagccgtct 4911
ccgcagaagt agaaaggaac gttttccacg cgtatcggca gcagattatt ggaagcaatg 4971
tttttcacgc tggaaaccat cgctttcttg gaaacccgtt tcacggctgt gacatcgcgc 5031
cagcctggat aatgtttatc aaataaggct tccatttgga ggttcttctc ttccaggtac 5091
gctttgcgct gctcctcgtt atcaaagcgg tcgcttaagt atgcgatacc ttgcagcagc 5151
tgcccgcctt ctggtactag tgtgtgatc 5180
<210> 2
<211> 3869
<212> DNA
<213> Microorganism
<220>
<221> CDS
<222> (241)...(3519)
<400> 2
tcatcgctac tggcaatcgg attcaaacaa atggctgcag ctcgcacaga cgattgtgga 60
aagggaatat ctgatttaac catacggcgg tcgcgattga ttgaatagga ttcgtggccg 120
cctaatattg aaagggggga tgcgtggagc agcgcatgca cggcgaggaa taactgttgt 180
tggagcctct aagtcattca tgtttagcaa acaaatttcg gtacgaaagg ggaaatgttt 240
atg tat gta agg aat cta aca ggt tca ttc cga ttt tct ctc tct ttt 288
Met Tyr Val Arg Asn Leu Thr Gly Ser Phe Arg Phe Ser Leu Ser Phe
1 5 10 15
ttg ctc tgt ttc tgt ctc ttc gtc ccc tct att tat gcc att gat ggt 336
Leu Leu Cys Phe Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Tyr Ala Ile Asp Gly
20 25 30
gtt tat cat gcg cca tac gga atc gat gat ctg tac gag att cag gcg 384
Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly Ile Asp Asp Leu Tyr Glu Ile Gln Ala
35 40 45
acg gag cgg agt cca aga gat ccc gtt gca ggc gat act gtg tat atc 432
Thr Glu Arg Ser Pro Arg Asp Pro Val Ala Gly Asp Thr Val Tyr Ile
50 55 60
aag ata aca acg tgg ccc att gaa tca gga caa acg gct tgg gtg acc 480
Lys Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser Gly Gln Thr Ala Trp Val Thr
65 70 75 80
tgg acg aaa aac ggt gtc aat caa gct gct gtc gga gca gca ttc aaa 528
Trp Thr Lys Asn Gly Val Asn Gln Ala Ala Val Gly Ala Ala Phe Lys
85 90 95
tac aac agc ggc aac aac act tac tgg gaa gcg aac ctt ggc act ttt 576
Tyr Asn Ser Gly Asn Asn Thr Tyr Trp Glu Ala Asn Leu Gly Thr Phe
100 105 110
gca aaa ggg gac gtg atc agt tat acc gtt cat ggc aac aag gat ggc 624
Ala Lys Gly Asp Val Ile Ser Tyr Thr Val His Gly Asn Lys Asp Gly
115 120 125
gcg aat gag aag gtt atc ggt cct ttt act ttt acc gta acg gga tgg 672
Ala Asn Glu Lys Val Ile Gly Pro Phe Thr Phe Thr Val Thr Gly Trp
130 135 140
gaa tcc gtt agc agt atc agc tct att acg gat aat acg aac cgt gtt 720
Glu Ser Val Ser Ser Ile Ser Ser Ile Thr Asp Asn Thr Asn Arg Val
145 150 155 160
gtg ctg aat gcg gtg ccg aat aca ggc aca ttg aag cca aag atc aac 768
Val Leu Asn Ala Val Pro Asn Thr Gly Thr Leu Lys Pro Lys Ile Asn
165 170 175
ctt tcc ttt acg gcg gat gat gtc ctc cgc gta cag gtt tct cca acc 816
Leu Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Leu Arg Val Gln Val Ser Pro Thr
180 185 190
gga aca gga acg tta agc agt gga ctt agt aat tac aca gtt tca gat 864
Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ser Gly Leu Ser Asn Tyr Thr Val Ser Asp
195 200 205
acc gcc tca acc act tgg ctt aca act tcc aag ctg aag gtg aag gtg 912
Thr Ala Ser Thr Thr Trp Leu Thr Thr Ser Lys Leu Lys Val Lys Val
210 215 220
gat aag aat cca ttc aaa ctt agt gtg tat aag cct gat gga acg acg 960
Asp Lys Asn Pro Phe Lys Leu Ser Val Tyr Lys Pro Asp Gly Thr Thr
225 230 235 240
ttg att gcc cgt caa tat gac agc act acg aat cgt aac att gcc tgg 1008
Leu Ile Ala Arg Gln Tyr Asp Ser Thr Thr Asn Arg Asn Ile Ala Trp
245 250 255
tta acc aat ggc agt aca atc atc gac aag gta gaa gat cat ttt tat 1056
Leu Thr Asn Gly Ser Thr Ile Ile Asp Lys Val Glu Asp His Phe Tyr
260 265 270
tca ccg gct tcc gag gag ttt ttt ggc ttt gga gag cat tac aac aac 1104
Ser Pro Ala Ser Glu Glu Phe Phe Gly Phe Gly Glu His Tyr Asn Asn
275 280 285
ttc cgt aaa cgc gga aat gat gtg gac acc tat gtg ttc aac cag tat 1152
Phe Arg Lys Arg Gly Asn Asp Val Asp Thr Tyr Val Phe Asn Gln Tyr
290 295 300
aag aat caa aat gac cgc acc tac atg gca att cct ttt atg ctt aac 1200
Lys Asn Gln Asn Asp Arg Thr Tyr Met Ala Ile Pro Phe Met Leu Asn
305 310 315 320
agc agc ggt tat ggc att ttc gta aat tca acg tat tat tcc aaa ttt 1248
Ser Ser Gly Tyr Gly Ile Phe Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Lys Phe
325 330 335
cgg ttg gca acc gaa cgc acc gat atg ttc agc ttt acg gct gat aca 1296
Arg Leu Ala Thr Glu Arg Thr Asp Met Phe Ser Phe Thr Ala Asp Thr
340 345 350
ggg ggt agt gcc gcc tcg atg ctg gat tat tat ttc att tac ggt aat 1344
Gly Gly Ser Ala Ala Ser Met Leu Asp Tyr Tyr Phe Ile Tyr Gly Asn
355 360 365
gat ttg aaa aat gtg gtg agt aac tac gct aac att acc ggt aag cca 1392
Asp Leu Lys Asn Val Val Ser Asn Tyr Ala Asn Ile Thr Gly Lys Pro
370 375 380
aca gcg ctg ccg aaa tgg gct ttc ggg tta tgg atg tca gct aac gag 1440
Thr Ala Leu Pro Lys Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser Ala Asn Glu
385 390 395 400
tgg gat cgt caa acc aag gtg aat aca gcc att aat aac gcg aac tcc 1488
Trp Asp Arg Gln Thr Lys Val Asn Thr Ala Ile Asn Asn Ala Asn Ser
405 410 415
aat aat att ccg gct aca gcg gtt gtg ctc gaa cag tgg agt gat gag 1536
Asn Asn Ile Pro Ala Thr Ala Val Val Leu Glu Gln Trp Ser Asp Glu
420 425 430
aac acg ttt tat att ttc aat gat gcc acc tat acc ccg aaa acg ggc 1584
Asn Thr Phe Tyr Ile Phe Asn Asp Ala Thr Tyr Thr Pro Lys Thr Gly
435 440 445
agt gct gcg cat gcc tat acc gat ttc act ttc ccg aca tct ggg aga 1632
Ser Ala Ala His Ala Tyr Thr Asp Phe Thr Phe Pro Thr Ser Gly Arg
450 455 460
tgg acg gat cca aaa gcg atg gca gac aat gtg cat aac aat ggg atg 1690
Trp Thr Asp Pro Lys Ala Met Ala Asp Asn Val His Asn Asn Gly Met
465 470 475 480
aag ctg gtg ctt tgg cag gtc cct att cag aaa tgg act tca acg ccc 1728
Lys Leu Val Leu Trp Gln Val Pro Ile Gln Lys Trp Thr Ser Thr Pro
485 490 495
tat acc cag aaa gat aat gat gaa gcc tat atg acg gct cag aat tat 1776
Tyr Thr Gln Lys Asp Asn Asp Glu Ala Tyr Met Thr Ala Gln Asn Tyr
500 505 510
gca gtt ggc aac ggt agc gga ggc cag tac agg ata cct tca gga caa 1824
Ala Val Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Arg Ile Pro Ser Gly Gln
515 520 525
tgg ttc gag aac agt ttg ctg ctt gat ttt acg aat acg gcc gcc aaa 1872
Trp Phe Glu Asn Ser Leu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Thr Ala Ala Lys
530 535 540
aac tgg tgg atg tct aaa cgc gct tat ctg ttt gat ggt gtg ggt atc 1920
Asn Trp Trp Met Ser Lys Arg Ala Tyr Leu Phe Asp Gly Val Gly Ile
545 550 555 560
gac ggc ttc aaa aca gat ggc ggt gaa atg gta tgg ggt cgc tca aat 1968
Asp Gly Phe Lys Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp Gly Arg Ser Asn
565 570 575
act ttc tca aac ggt aag aaa ggc aat gaa atg cgc aat caa tac ccg 2016
Thr Phe Ser Asn Gly Lys Lys Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr Pro
580 585 590
aat gag tat gtg aaa gcc tat aac gag tac gcg cgc tcg aag aaa gcc 2064
Asn Glu Tyr Val Lys Ala Tyr Asn Glu Tyr Ala Arg Ser Lys Lys Ala
595 600 605
gat gcg gtc tcc ttt agc cgt tcc ggc acg caa ggc gca cag gcg aat 2112
Asp Ala Val Ser Phe Ser Arg Ser Gly Thr Gln Gly Ala Gln Ala Asn
610 615 620
cag att ttc tgg tcc ggt gac caa gag tcg acg ttt ggt gct ttt caa 2160
Gln Ile Phe Trp Ser Gly Asp Gln Glu Ser Thr Phe Gly Ala Phe Gln
625 630 635 640
caa gct gtg aat gca ggg ctt acg gca agt atg tct ggc gtt cct tat 2208
Gln Ala Val Asn Ala Gly Leu Thr Ala Ser Met Ser Gly Val Pro Tyr
645 650 655
tgg agc tgg gat atg gca ggc ttt aca ggc act tat cca acg gct gag 2256
Trp Ser Trp Asp Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Pro Thr Ala Glu
660 665 670
ttg tac aaa cgt gct act gaa atg gct gct ttt gca ccg gtc atg cag 2304
Leu Tyr Lys Arg Ala Thr Glu Met Ala Ala Phe Ala Pro Val Met Gln
675 680 685
ttt cat tcc gag tct aac ggc agc tct ggt atc aac gag gaa cgt tct 2352
Phe His Ser Glu Ser Asn Gly Ser Ser Gly Ile Asn Glu Glu Arg Ser
690 695 700
cca tgg aac gca caa gcg cgt aca ggc gac aat acg atc att agt cat 2400
Pro Trp Asn Ala Gln Ala Arg Thr Gly Asp Asn Thr Ile Ile Ser His
705 710 715 720
ttt gcc aaa tat acg aat acg cgc atg aat ttg ctt cct tat att tat 2448
Phe Ala Lys Tyr Thr Asn Thr Arg Met Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Tyr
725 730 735
agc gaa gcg aag atg gct agt gat act ggc gtt ccc atg atg cgc gcc 2496
Ser Glu Ala Lys Met Ala Ser Asp Thr Gly Val Pro Met Met Arg Ala
740 745 750
atg gcg ctt gaa tat ccg aag gac acg aac acg tac ggt ttg aca caa 2544
Met Ala Leu Glu Tyr Pro Lys Asp Thr Asn Thr Tyr Gly Leu Thr Gln
755 760 765
cag tat atg ttc gga ggt aat tta ctt att gct cct gtt atg aat cag 2592
Gln Tyr Met Phe Gly Gly Asn Leu Leu Ile Ala Pro Val Met Asn Gln
770 775 780
gga gaa aca aac aag agt att tat ctt ccg cag ggg gat tgg atc gat 2640
Gly Glu Thr Asn Lys Ser Ile Tyr Leu Pro Gln Gly Asp Trp Ile Asp
785 790 795 800
ttc tgg ttc ggt gct cag cgt cct ggc ggt cga aca atc agc tac acg 2688
Phe Trp Phe Gly Ala Gln Arg Pro Gly Gly Arg Thr Ile Ser Tyr Thr
805 810 815
gcc ggc atc gat gat cta ccg gtt ttt gtg aag ttt ggc agt att ctt 2736
Ala Gly Ile Asp Asp Leu Pro Val Phe Val Lys Phe Gly Ser Ile Leu
820 825 830
ccg atg aat ttg aac gcg caa tat caa gtg ggc ggg acc att ggc aac 2784
Pro Met Asn Leu Asn Ala Gln Tyr Gln Val Gly Gly Thr Ile Gly Asn
835 840 845
agc ttg acg agc tac acg aat ctc gcg ttc cgc att tat ccg ctt ggg 2832
Ser Leu Thr Ser Tyr Thr Asn Leu Ala Phe Arg Ile Tyr Pro Leu Gly
850 855 860
aca aca acg tac gac tgg aat gat gat att ggc ggt tcg gtg aaa acc 2880
Thr Thr Thr Tyr Asp Trp Asn Asp Asp Ile Gly Gly Ser Val Lys Thr
865 870 875 880
ata act tct aca gag caa tat ggg ttg aat aaa gaa acc gtg act gtt 2928
Ile Thr Ser Thr Glu Gln Tyr Gly Leu Asn Lys Glu Thr Val Thr Val
885 890 895
cca gcg att aat tct acc aag aca ttg caa gtg ttt acg act aag cct 2976
Pro Ala Ile Asn Ser Thr Lys Thr Leu Gln Val Phe Thr Thr Lys Pro
900 905 910
tcc tct gta acg gtg ggt ggt tct gtg atg aca gag tac agt act tta 3024
Ser Ser Val Thr Val Gly Gly Ser Val Met Thr Glu Tyr Ser Thr Leu
915 920 925
act gcc cta acg gga gcg tcg aca ggc tgg tac tat gat act gta cag 3072
Thr Ala Leu Thr Gly Ala Ser Thr Gly Trp Tyr Tyr Asp Thr Val Gln
930 935 940
aaa ttc act tac gtc aag ctt ggt tca agt gca tct gct caa tcc gtt 3120
Lys Phe Thr Tyr Val Lys Leu Gly Ser Ser Ala Ser Ala Gln Ser Val
945 950 955 960
gtg cta aat ggc gtt aat aag gtg gaa tat gaa gca gaa ttc ggc gtg 3168
Val Leu Asn Gly Val Asn Lys Val Glu Tyr Glu Ala Glu Phe Gly Val
965 970 975
caa agc ggc gtt tca acg aac acg aac cat gca ggt tat act ggt aca 3216
Gln Ser Gly Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr Gly Thr
980 985 990
gga ttt gtg gac ggc ttt gag act ctt gga gac aat gtt gct ttt gat 3264
Gly Phe Val Asp Gly Phe Glu Thr Leu Gly Asp Asn Val Ala Phe Asp
995 1000 1005
gtt tcc gtc aaa gcc gca ggt act tat acg atg aag gtt cgg tat tca 3312
Val Ser Val Lys Ala Ala Gly Thr Tyr Thr Met Lys Val Arg Tyr Ser
1010 1015 1020
tcc ggt gca ggc aat ggc tca aga gcc atc tat gtg aat aac acc aaa 3360
Ser Gly Ala Gly Asn Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Val Asn Asn Thr Lys
1025 1030 1035 1040
gtg acg gac ctt gcc ttg ccg caa aca aca agc tgg gat aca tgg ggg 3408
Val Thr Asp Leu Ala Leu Pro Gln Thr Thr Ser Trp Asp Thr Trp Gly
1045 1050 1055
act gct acg ttt agc gtc tcg ctg agt aca ggt ctc aac acg gtg aaa 3456
Thr Ala Thr Phe Ser Val Ser Leu Ser Thr Gly Leu Asn Thr Val Lys
1060 1065 1070
gtc agc tat gat ggt acc agt tca ctt ggc att aat ttc gat aac atc 3504
Val Ser Tyr Asp Gly Thr Ser Ser Leu Gly Ile Asn Phe Asp Asn Ile
1075 1080 1085
gcg att gta gag caa taa 3522
Ala Ile Val Glu Gln
1090
aaggtcggga gggcaagtcc ctcccttaat ttctaatcga aagggagtat ccttgatgcg 3582
tccaccaaac aaagaaattc cacgtattct tgcttttttt acagcgttta cgttgtttgg 3642
ttcaaccctt gccttgcttc ctgctccgcc tgcgcatgcc tatgtcagca gcctagggga 3702
aaatctcatt tcttcgagtg tcaccggaga taccttgacg ctaactgttg ataacggtgc 3762
gccgagtgat gacctcttga ttgttcaagc ggtgcaaaac ggtattttga aggtggatta 3822
tcgtccaaat agcataacgc cgagcgcgaa gacgccgatg ctggatc 3869
Claims (26)
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- 아래의 (1) 내지 (3)의 공정을 포함해서 되는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.(1) 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질을 기질로서 이용하고, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 2 이상의 당질로부터, 환원력을 증가하는 일 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 작용을 가지며, 서열표에서 서열번호 1에 병기된 아미노산 서열에서의 제36 내지 1284번째의 아미노산 서열을 갖는 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시켜, 상기 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 공정;(2) 얻어진 α-이소말토실글루코 당질에 이소말토덱스트라나아제를 작용시켜 이소말토오스를 생성하는 공정; 및(3) 얻어진 이소말토오스를 채취하는 공정.
- 제20항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소가 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 이소말토오스의 제조방법.(1) 작용비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 2 이상의 당질로부터 환원력을 증가하는 일 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질을 생성함.(2) 분자량SDS-겔 전기 영동법에 의해 117,000 내지 160,000 달톤(3) 등전점앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해 pI 4.7 내지 5.7(4) 최적 온도pH 6.0, 60분간 반응에서, 40 내지 45℃1mMCa2+ 존재하에서는 45 내지 50℃(5) 최적 pH35℃, 60분간 반응에서, pH 6.0 내지 6.5(6) 온도 안정성pH 6.0, 60분간 유지에서 35 내지 40℃까지 안정1mMCa2+ 존재하에서는 40 내지 45℃까지 안정(7) pH 안정성4℃, 24시간 유지에서 pH 4.5 내지 10.0의 범위에서 안정
- 제20항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질 생성 효소를 작용시킬 때에, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실 전이함으로써, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성하는 작용을 가지며, 서열표에서 서열번호 2에 병기된 아미노산 서열에서의 제30 내지 1093번째의 아미노산 서열을 가진 α-이소말토실 전이 효소, 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제, 또는 이소아밀라아제 및 풀룰라나아제로부터 선택되는 전분 지절 효소를 병용하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
- 제22항에 있어서, α-이소말토실 전이 효소가 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 이소말토오스의 제조방법.(1) 작용비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질로부터 α-이소말토실 전이함으로써, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성함.(2) 분자량SDS-겔 전기 영동법에 의해 82,000 내지 132,000 달톤(3) 등전점앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해 pI 5.0 내지 6.1(4) 최적 온도pH 6.0, 30분간 반응에서, 45 내지 50℃(5) 최적 pH35℃, 30분간 반응에서, pH 5.5 내지 6.0(6) 온도 안정성pH 6.0, 60분간 유지에서 40℃까지 안정(7) pH 안정성4℃, 24시간 유지에서 pH 4.0 내지 9.0의 범위에서 안정
- 제20항에 있어서, 이소말토덱스트라나아제를 작용시킨 후에, 글루코아밀라아제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
- 제20항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질이 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 이소말토오스의 제조방법.
- 제20항에 있어서, 이소말토오스를 채취하는 공정에서, 알칼리 금속형 또는 알칼리 토류 금속형 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 이용하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법.
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