JPH10304881A - トレハロースホスホリラーゼとその製造方法並びに用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 温度安定性に優れた新規のトレハロースホス
ホリラーゼを提供するとともに本酵素の製造方法及び本
酵素を利用したグルコシル転移糖含有糖質並びにその用
途を提供する。 【解決手段】 ｐＨ７．０、１時間保持の条件で６０℃
付近まで安定なトレハロースホスホリラーゼ活性を有す
る新規酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵
素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵
素を培養物から採取する酵素の製造方法と、その酵素を
β−Ｄ−グルコース−１リン酸とそれ以外の糖質に作用
させて得られるグルコシル転移糖含有糖質、並びに、そ
のグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめた組成物によ
り解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なトレハロー
スホスホリラーゼとその製造方法並びに用途に関し、更
に詳細には、無機質のリン酸及び／又はその塩（以下、
不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン
酸」と略称する。）の存在下トレハロースを分解してＤ
−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又
はその塩（以下、不都合が生じない限り、「β−Ｄ−グ
ルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、
逆にβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースと
からトレハロースと無機リン酸を生成する作用を示す新
規トレハロースホスホリラーゼとその製造方法、並び
に、このトレハロースホスホリラーゼを用いて製造され
るグルコシル転移糖含有糖質、さらには、これらを含有
せしめた組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、マルトース、トレハロースなどの
オリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様
な生産方法が各方面から広く検討されるようになってき
た。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホ
スホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、トレハロー
スホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼなど種
々のホスホリラーゼが知られている。

【０００３】例えば、トレハロースホスホリラーゼにつ
いては、エル・アール・マレカル（Ｌ．Ｒ．Ｍａｒｅｃ
ｈａｌ）らが、『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第２４
７巻、３２２３乃至３２２８頁（１９７２年）に、ユー
グレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉ
ｓ）がその細胞内に産生することを報告し、また、村尾
が、『アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第４９
巻、２１１３乃至２１１８頁（１９８５年）に同生物種
起源の酵素の性質について報告している。微生物起源の
トレハロースホスホリラーゼについては、相阪らが特開
平７−５９５８４に、カテラトスポラ・フェルギネア
（Ｃａｔｅｌｌａｔｏｓｐｏｒａ ｆｅｒｒｕｇｉｎｅ
ａ）およびキネオスポリア・オウランチアカ（Ｋｉｎｅ
ｏｓｐｏｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）が産生するこ
とを報告し、また、木沢らが、『バイオサイエンス・バ
イオテクノロジー・アンド・バイオケミストリイ（Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第５９巻、１９０
８乃至１９１２頁（１９９５年）に、ミクロコッカス・
バリアンス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎ
ｓ）が産生することを報告し、さらに、吉田らが、『応
用糖質科学（Ｏｙｏ Ｔｏｓｈｉｔｓｕ Ｋａｇａｋ
ｕ）』、第４２巻、１９乃至２５頁（１９９５年）に、
プレシオモナス・エスピー（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）ＳＨ−３５が産生することを報告している。こ
れらの内、ミクロコッカス・バリアンス（Ｍｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓ）、ユーグレナ・グラシリ
ス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、プレシオモ
ナス・エスピー（Ｐｌｅｓｉｏｍａｏｎａｓ ｓｐ．）
の生産するトレハロースホスホリラーゼの耐熱性はそれ
ぞれ３０℃以下、４０℃以下、４５℃以下と、安定温度
が低く、工業的に利用する上で反応効率が低いばかりで
なく反応中に微生物汚染の懸念がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、工業実施に
有利な温度安定性に優れた新規トレハロースホスホリラ
ーゼを提供するとともに本酵素の製造方法及び本酵素を
利用したグルコシル転移糖含有糖質並びにその用途を提
供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために温度安定性に優れた新規なトレハロー
スホスホリラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物
を広く検索した。その結果、サーモアナエロビウム（Ｔ
ｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）属に属する微生物サ
ーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａ
ｅｒｏｂｉｕｍｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ ３５０４
７）が、本目的に合致する新規トレハロースホスホリラ
ーゼを産生することを見いだし、さらに本酵素の製造方
法及び本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与
体として、各種糖質共存下で作用させ得られるグルコシ
ル転移糖含有糖質並びに該糖質を含有せしめた組成物を
確立して本発明を完成した。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のトレハロースホスホリラ
ーゼは、無機リン酸の存在下でトレハローを分解してＤ
−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成す
る作用を有するサーモアナエロビウム属に属する微生物
から得ることのできる酵素を包含するものである。斯か
るトレハロースホスホリラーゼは、例えば、下記のよう
な作用を示し、理化学的性質を有する場合がある。 （１） 作用 （ａ）無機リン酸存在下でトレハロースを分解してＤ−
グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成
する。 （ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコース
とからトレハロースと無機リン酸を生成し、さらにβ−
Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖質
にグルコシル基の転移を触媒する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８８，０００±５，０００
ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ５．４±０．
５。 （４） 至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応で７０℃付近。 （５） 至適ｐＨ ６０℃、３０分間反応でｐＨ７．０乃至７．５付近。 （６） 温度安定性 ｐＨ７．０、１時間保持の条件で６０℃付近まで安定。 （７） ｐＨ安定性 ４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約６．０乃至９．０。 （８） 活性促進、安定化 本酵素活性は１ｍＭのジチオスレイトールにて促進され
る。 （９） 阻害 本酵素活性は１ｍＭのＣｕ++、Ｐｂ++、Ｚｎ++、Ｈｇ+
+、Ｍｇ++、またはＭｎ++で阻害を受ける。

【０００７】また、斯かるトレハロースホスホリラーゼ
は、例えば、部分アミノ酸配列として配列表における配
列番号１、２又は３に示すアミノ酸配列を含み、全体と
しては配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を
含む場合がある。ところで、斯界においては、所望の蛋
白質を産生する微生物が純化されている場合には、例え
ば、当該微生物に適宜の変異誘起処理を施すことによっ
て、また、所望の蛋白質をコードするＤＮＡが得られて
いる場合には、通常一般の組換えＤＮＡ技術を適用する
ことによって、当該蛋白質の機能性誘導体を得ることは
比較的容易であり、本発明のトレハロースホスホリラー
ゼには、斯かる機能性誘導体も当然のことながら包含さ
れる。ここでいう機能性誘導体とは、上述したようなト
レハロースホスホリラーゼとしての作用を実質的に失わ
ない範囲で、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１又
は複数を他のアミノ酸で置換したもの、そのアミノ酸配
列におけるＮ末端及び／又はＣ末端に１個又は複数のア
ミノ酸を付加したもの、そのアミノ酸配列における中間
部に１個又は複数のアミノ酸を挿入したもの、そのアミ
ノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸が
１個又は２個以上欠失したもの、及び、そのアミノ酸配
列における中間部のアミノ酸が１個又は２個以上欠失し
たものを意味する。以上の如き本発明のトレハロースホ
スホリラーゼは、当該酵素を産生するサーモアナエロビ
ウム属に属する微生物の培養物などの天然の給源から分
離したり、当該微生物を変異誘起剤等で処理して得られ
る変異株の培養物から分離したり、さらには、組換えＤ
ＮＡ技術やペプチド合成法を適用して人工的に合成した
りすることにより、いずれも良好に得ることができる。

【０００８】本発明のＤＮＡは、上述の、本発明のトレ
ハロースホスホリラーゼをコードするＤＮＡすべてを包
含するものである。斯かるＤＮＡとしては、例えば、配
列表における配列番号４に示すアミノ酸配列をコードす
る、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含むＤ
ＮＡや、その機能性誘導体を挙げることができる。ここ
でいう機能性誘導体とは、当該ＤＮＡがコードする蛋白
質が、上述したようなトレハロースホスホリラーゼとし
ての作用を実質的に消失しない範囲で、その塩基配列に
おける塩基の１又は複数を他の塩基で置換したもの、そ
の塩基配列における５′末端及び／又は３′末端に１又
は複数の塩基を付加したもの、その塩基配列における中
間部に１又は複数の塩基を挿入したもの、その塩基配列
における５′末端及び／又は３′末端の塩基が１又は複
数欠失したもの、その塩基配列における中間部の塩基が
１又は複数欠失したもの、及び、これら塩基配列に相補
的な塩基配列のものを意味する。斯かる機能性誘導体と
しては、例えば、配列表の配列番号５に示す塩基配列に
おいて、それがコードするアミノ酸配列を変更すること
なく、塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩基配列
を含んでなるＤＮＡが挙げられる。また、本発明のＤＮ
Ａには、以上の如きＤＮＡのみならず、斯かるＤＮＡの
５′末端及び／又は３′末端に、当該トレハロースホス
ホリラーゼをコードする塩基配列以外のＤＮＡ、例え
ば、開始コドン、終始コドン、シャイン・ダルガノ配
列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適宜の制
限酵素による認識配列、プロモーター、エンハンサー、
ターミネーター等から選ばれる１又は複数を連結してな
るＤＮＡも包含される。

【０００９】本発明においては、斯かるＤＮＡの給源や
調製方法は問わない。例えば、斯かるＤＮＡの天然の給
源として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣ
Ｃ３５０４７）を含む、サーモアナエロビウム属の微生
物を挙げることができ、常法により、当該微生物を培養
して得られる菌体破砕物よりＤＮＡ画分を回収すれば、
本発明のＤＮＡを含むＤＮＡを得ることができる。斯く
して得られるＤＮＡはそれ自体でこの発明に用いること
もできるが、さらに、本発明のＤＮＡを、当該ＤＮＡ含
む断片を自律複製可能なベクターに挿入してなる組換え
ＤＮＡとして得る場合には、この発明を実施する上で極
めて有利なものとなる。当該組換えＤＮＡは、例えば、
通常一般の組換えＤＮＡ技術を上記のようにして得たＤ
ＮＡに適用して遺伝子ライブラリーを作製し、本発明の
トレハロースホスホリラーゼをコードするＤＮＡの塩基
配列、例えば、配列表における配列番号５に示す塩基配
列に基づいて、目的とする組換えＤＮＡを当該遺伝子ラ
イブラリーより選択する、ハイブリダイゼーション法な
どを適用して得ることができる。斯くして得られる組換
えＤＮＡは、大腸菌等の適宜の宿主に導入して得られる
形質転換体を培養したとき増幅され、培養物に通常一般
のアルカリ−ＳＤＳ法などを適用すれば、この発明のＤ
ＮＡの所望量を極めて容易に得られることとなる。一
方、当該微生物の菌体破砕物又はそこから回収されるＤ
ＮＡを鋳型として用い、配列表における配列番号５に示
す塩基配列に基づき化学合成したＤＮＡをプライマーと
して用い、常法にしたがってＰＣＲ法を適用したり、配
列表における配列番号５に示す塩基配列有するＤＮＡを
化学合成することによっても本発明のＤＮＡは容易に得
ることができる。また、先述の機能性誘導体たる本発明
のＤＮＡは、例えば、当該組換えＤＮＡに部位特異的変
異導入法を適用したり、当該組換えＤＮＡを鋳型に用
い、所望の配列に変換せしめた塩基配列有する化学合成
したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法を適用すること
によって得ることができる。

【００１０】また、本発明のＤＮＡは、自律複製可能な
ベクターに挿入された組換えＤＮＡとしての形態のもの
をも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように、
本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用のみならず、後に
詳述するように、本発明のトレハロースホスホリラーゼ
を製造する上においても極めて有用である。斯かる組換
えＤＮＡは、先述のようにして目的とするＤＮＡが一旦
得られれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術を適用すれ
ば、所望のベクターに当該ＤＮＡを挿入して得ることは
容易である。この発明のＤＮＡを挿入し得るベクター
は、適宜の宿主内で自律複製する性質を有しているもの
であればいずれでもよく、例えば、大腸菌を宿主として
用いるｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌
を宿主として用いるｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９
４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種以上の宿主を用
いるｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥ
ｐ７及びｐＢＳ７等はいずれも有利に用いることができ
る。斯かるベクターに本発明のＤＮＡを挿入する方法の
一例を述べると、先ず、上述のようにして得られる本発
明のＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むＤＮＡと、適宜のベク
ターとを制限酵素により切断し、次に、生成したＤＮＡ
断片とベクター断片を連結する。ここで用いられる制限
酵素としては、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ａｌｕ Ｉ、Ｂａ
ｍ ＨＩ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ ＸＩ、Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａ
ｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｂａ
Ｉ、Ｘｈｏ Ｉなどはいずれも有利に用いることがで
きる。また、ＤＮＡ断片とベクター断片の連結の際に、
必要に応じて、例えば、適宜の制限酵素認識配列等を有
する化学合成したＤＮＡを介在させることも随意であ
る。ＤＮＡの連結には、両者をアニーリングした後細胞
内又は細胞外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。

【００１１】さらに、本発明のＤＮＡは、適宜の宿主微
生物に導入された形質転換体としての形態のものをも包
含する。斯かる形質転換体は、本発明のトレハロースホ
スホリラーゼや本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用で
ある。斯かる形質転換体の宿主微生物として、例えば、
大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などはいずれも有利に用
いることができる。斯かる形質転換体は、通常、先述の
ようにして得られる組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入し
て得られ、具体的には、宿主が大腸菌の場合には宿主を
当該組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養す
ればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテン
トセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。以上に
説明した本発明のＤＮＡを得るための個々の方法は、い
ずれも斯界においては慣用であり、例えば、ジェー・サ
ムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボ
ラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行などに詳
述されている。

【００１２】本発明のトレハロースホスホリラーゼの製
造方法は、当該酵素産生能有する微生物を培養し、培養
物から当該酵素を採取することを特徴とするものであ
り、この製造に用いる微生物の種類や培養方法は問わな
い。斯かる微生物としては、例えば、サーモアナエロビ
ウム属に属する微生物、より望ましくは、サーモアナエ
ロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）や、本
発明のＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入してなる形質転
換体を挙げることができる。

【００１３】本発明の製造方法において、微生物の培養
に用いる培地は、当該微生物が生育でき、本発明の酵素
を産生するものであればよく、合成培地および天然培地
のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化でき
る物であればよく、例えば、マルトース、トレハロー
ス、デキストリン、澱粉などの糖質、糖蜜、および酵母
エキスなどの糖含有物などの天然物なども使用すること
ができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源
の種類により適宜選択される。例えば、培養液の糖質の
濃度は、２０ｗ／ｖ％以下が望ましく、菌の生育および
増殖からは、通常、５ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源
としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ
・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス
などの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分と
しては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリ
ウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛
塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが必要
に応じて適宜用いられる。

【００１４】培養には、製造に用いる微生物が良好に生
育する条件を適宜に選択して適用すればよい。例えば、
先述のサーモアナエロビウム属に属する微生物を用いる
場合、通常、温度５０乃至８０℃、好ましくは６０乃至
７０℃、ｐＨ５乃至８、好ましくはｐＨ６．５乃至７．
５から選ばれる条件で、嫌気的に行われる。培養時間は
本微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１
０乃至５０時間である。一方、先述の形質転換体微生物
を用いる場合は、その微生物種にもよるが、通常、温度
２０乃至６５℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気攪拌な
どによる好気的条件下で、培養時間を約１乃至６日間と
すればよい。

【００１５】このようにして、微生物を培養した後、得
られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性
は、通常、培養物の菌体内に認められ、菌体または菌体
処理物を粗酵素として回収すればよく、また、培養物全
体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と
菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例
えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培
養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートする
ことにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用
いる膜濾過分離する手段などが採用される。菌体または
菌体処理物をそのまま粗酵素液として用いることもでき
る。さらに必要ならば部分精製した酵素として用いるこ
とも可能である。なお、例えば、枯草菌等を宿主に用い
た形質転換体の場合には、形質転換に用いた組換えＤＮ
Ａの種類によっては、当該酵素が培養に用いた培地中に
産生される場合がある。このような場合には、当該培養
上清を粗酵素として用いることもできる。

【００１６】菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波破砕
物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、菌体のタン
パク質画分、菌体または菌体処理物の固定化物などがあ
げられる。酵素としては粗酵素または精製酵素のいずれ
も用いられ、菌体処理物を、通常、酵素の精製に用いら
れる方法、例えば、硫安塩析法、アセトンおよびアルコ
ール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮・透析
法などが採用される。

【００１７】更に、菌体および菌体処理物は、通常の手
段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体と
の結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高
分子物質を用いた包括法などが採用される。

【００１８】粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の
手段によって精製することもできる。一例として、菌体
処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、Ｄ
ＥＡＥ−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた
陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ＣＭ
−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた陽イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパール樹
脂（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグ
ラフィー、ウルトロゲル ＡｃＡ４４樹脂（フランス
国、セプラコル社製）を用いたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーにて電気泳動的に単一な酵素を得ることがで
きる。

【００１９】本発明のトレハロースホスホリラーゼの活
性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ
％トレハロースを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６０℃で３０分
間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分
加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコ
ースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを
添加、攪拌し、４０℃に３０分放置した後、５Ｎ塩酸
２．５ｍｌを添加、撹拌し、５２５ｎｍにおける吸光度
を測定する。酵素活性１単位は前記反応条件下で、１分
間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量
とする。また、マルトースホスホリラーゼ及びトレハロ
ースホスホリラーゼの活性は、基質としてのトレハロー
スを、それぞれ、マルトース及びコージビオースに代え
て用いること以外は全て同一の手順により測定すること
ができる。

【００２０】本発明のトレハロースホスホリラーゼを利
用してグルコシル転移糖含有糖質を製造する酵素反応に
際して、基質として、通常、β−Ｄ−グルコース−１リ
ン酸を糖供与体とし、他の適切な糖質、例えば、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フ
コース及びＬ−フコースなどの単糖類を受容体として、
これに本酵素を作用させた場合、それぞれの還元性糖質
にグルコシル基を転移して、グルコシルＤ−キシロシ
ド、グルコシルＤ−ガラクトシド、トレハロース、グル
コシルＤ−フコシド及びグルコシルＬ−フコシドを生成
する。受容体としては２種以上の糖質を同時に用いるこ
とも有利に実施できる。

【００２１】糖供与体としてのβ−Ｄ−グルコース−１
リン酸は、市販の試薬をそのまま用いてもよいし、ま
た、無機質のリン酸及び／又はその塩の存在下で適宜の
ホスホリラーゼをその基質たる糖質に作用させ、生成さ
せて調製してもよい。具体的には、例えば、無機質のリ
ン酸及び／又はその塩の存在下で、トレハロースにトレ
ハロースホスホリラーゼを作用させるか、マルトースに
マルトースホスホリラーゼを作用させるか、あるいはコ
ージビオースにコージビースホスホリラーゼを作用させ
て調製してもよい。さらにまた、これらホスホリラーゼ
の作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸の生成反応
のいずれかを、当該トレハロースホスホリラーゼを利用
したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系内で行う
場合には、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を当該転移糖
生成反応系に直接供給できることとなり、製造コストを
低減したり、製造工程を簡略化することができるので極
めて有利である。なお、ここでいう無機質のリン酸と
は、オルトリン酸のみならず縮合リン酸をも包含する
が、通常、オルトリン酸を用いるのが望ましい。また、
ここでいうその塩とは、前記の無機質のリン酸に由来す
るリン酸イオンの化合物全般を包含するが、通常は、こ
れらのうち、水溶性の高いナトリウム塩やカリウム塩等
を用いるのが望ましい。

【００２２】ここで用いるトレハロースホスホリラーゼ
は、例えば、本発明の当該酵素を用いればよく、マルト
ースホスホリラーゼは、市販の細菌由来の当該酵素を用
いればよい。一方、コージビオースホスホリラーゼは、
同じ出願人により出願された発明「コージビオースホス
ホリラーゼとその製造方法並びに用途」（特願平８−３
１１２３５号）による酵素を用いればよい。その調製方
法の詳細は前記出願明細書に記載されているが、一例を
述べれば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン発行の『ＡＴＣＣカタログ・オブ・バクテリア・ア
ンド・バクテリオファージズ、第１８版』（１９９２
年）、４５２乃至４５６頁に記載のサーモアナエロビウ
ム・ブロッキイ培地でサーモアナエロビウム・ブロッキ
ィ ＡＴＣＣ３５０４７を嫌気条件下で６５℃で培養し
た後、培養液を遠心分離することにより得られる菌体を
超音波処理し、その上清を回収すれば目的とするコージ
ビオースホスホリラーゼ活性ある画分を得ることができ
る。

【００２３】本発明のトレハロースホスホリラーゼを用
いたグルコシル転移糖生成反応における基質濃度は特に
限定されない。一般的には、糖供与体としてβ−Ｄ−グ
ルコース−１リン酸を１乃至２０ｗ／ｗ％（以下、本明
細書では、特にことわらない限りｗ／ｗ％を％と略称す
る。）程度、受容体を１乃至２０％程度が好適である。
一方、前述のごとく、適宜のホスホリラーゼの作用によ
るβ−Ｄ−グルコース−１リン酸生成反応を当該グルコ
シル転移糖生成反応と同一反応系内で行う場合には、以
下のようにするのが望ましい。すなわち、トレハロース
ホスホリラーゼの作用による場合は、当該グルコシル転
移反応の基質たるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸に代え
て、１乃至２０％程度のトレハロースを用い、さらに、
０．５乃至２０ｍＭ程度のリン酸ナトリウムなどのリン
酸塩を共存させる。また、その他のホスホリラーゼの作
用による場合は、当該グルコシル転移反応の基質たるβ
−Ｄ−グルコース−１リン酸に代えて、例えば、１乃至
２０％程度のマルトース又はコージビオースと、０．５
乃至２０ｍＭ程度のリン酸ナトリウムなどのリン酸塩を
共存させ、さらに、用いる糖質に基づき、それぞれ、マ
ルトースホスホリラーゼ又はコージビースホスホリラー
ゼを当該糖質当たり０．１乃至５０単位程度共存させて
おくのが望ましい。

【００２４】反応温度は基質存在下で酵素が失活しない
温度、すなわち７０℃までで行えばよく、好ましくは約
１５乃至６５℃の範囲を用いる。反応ｐＨは、通常、約
４．０乃至９．０の範囲、好ましくはｐＨ約５．０乃至
７．５の範囲に調整すればよい。反応時間は、酵素反応
の進行具合により適宜選択すればよく、通常基質固形物
１ｇ当たり約０．１乃至５０単位の使用量で０．１乃至
１００時間程度である。また、前述のように、その他の
ホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リ
ン酸の生成反応を、当該トレハロースホスホリラーゼを
利用したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系内で
行う場合には、共存させるホスホリラーゼの安定性に応
じて、用いるいずれのホスホリラーゼも失活しない反応
温度や反応ｐＨに調整するのが望ましい。

【００２５】斯くして反応物中には、用いた糖質に応じ
てグルコシル転移糖が生成する。その生成率は、酵素反
応の基質濃度、用いる基質の種類、反応条件などによっ
て異なる。例えば、無機リン酸存在下で１０％のトレハ
ロースと５％のＤ−ガラクトースを基質として用いた場
合、グルコシルガラクトシドの生成率は約３０％であ
る。なお、生成率は本明細書を通じて、反応液中の全糖
質重量に対する、生成した当該転移糖重量の百分率を意
味する。

【００２６】また、反応物中の当該グルコシル転移糖含
量をできるだけ高めるために、反応液中に生成するＤ−
グルコースを分解除去する活性を有する酵素源を共存さ
せ、当該転移反応を促進することも有利に実施できる。
この方法は、前述の、適宜のホスホリラーゼによるβ−
Ｄ−グルコース−１リン酸生成反応を当該グルコシル転
移反応と同一系内で行い糖供与体を直接供給する場合、
反応過程で副生するＤ−グルコースを分解除去し、該転
移反応を促進するのに特に有利に適用できる。

【００２７】Ｄ−グルコース分解活性を有する酵素源と
しては、Ｄ−グルコース分解活性を有する微生物、微生
物の培養物、菌体もしくは菌体処理物またはＤ−グルコ
ース分解活性を有する酵素などがあげられる。Ｄ−グル
コース分解活性を有する微生物としては、Ｄ−グルコー
ス分解活性が高く、転移糖分解活性を有さないか又はほ
とんど有さない微生物であればいずれの微生物でも用い
ることができる。好ましくは酵母が用いられる。Ｄ−グ
ルコース分解活性を有する酵素としては、例えばグルコ
ースオキシダーゼ、カタラーゼ、ピラノースオキシダー
ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼまた
はヘキソキナーゼなどいずれも用いることができる。好
ましくはグルコースオキシダーゼ又はカタラーゼが用い
られる。

【００２８】以上のようにしてグルコシル転移等を生成
せしめた反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などし
て不溶物を除去した後、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ
型イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、
濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に、噴
霧乾燥などの方法で乾燥して粉末状製品にすることも随
意である。

【００２９】また、本発明のグルコシル転移糖含有糖質
は、酵素反応液から当該グルコシル転移糖を分離、精製
して、当該グルコシル転移糖の高含有物とすることもで
きる。その方法としては、例えば、酵母を用いた発酵法
により単糖類を除去する方法（酵母発酵法）、アルカリ
性溶液にして加熱処理することにより還元性糖質を分解
する方法（アルカリ処理法）、膜濾過法、カラムクロマ
トグラフィーなどにより、夾雑糖質を分離除去する方法
が適宜採用できる。とりわけ、特開昭５８−２３７９９
号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示され
ている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロ
マトグラフィーにより、夾雑糖質を除去して目的とする
グルコシル転移糖高含有画分を採取する方法は、工業的
規模で有利に実施できる。この際、公知の固定床方式、
移動床方式、疑似移動床方式のいずれを採用することも
随意である。

【００３０】斯くして夾雑糖質を分離した液は、常法に
より、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活
性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱
塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品に
する。必要ならば、更に、噴霧乾燥などの方法で乾燥し
て粉末状製品にすることも随意である。

【００３１】このようにして得られる本発明のグルコシ
ル転移糖含有糖質は、通常グルコシル転移糖を固形物当
たり５％以上、望ましくは１０％以上含有している。

【００３２】このようにして得られる本発明のグルコシ
ル転移糖含有糖質は、味質良好な甘味を有し、また、浸
透圧調節性、保湿性、照付与性、結晶防止性、澱粉老化
防止性などの性質を有し、また、抗う蝕性、ビフィズス
菌増殖促進性、ミネラル吸収促進性などの機能を有し、
広く飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品、成
形物など、さらには、生活用品、農林水産用品、試薬、
化学工業用品などの各種組成物に有利に利用される。

【００３３】グルコシル転移糖含有糖質は、そのまま甘
味付けのための調味料として使用することができるが、
必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、ト
レハロース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガ
ー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒ
ドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオ
シド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカ
リン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の一
種または二種以上の適量と混合して使用してもよく、ま
た必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような
増量剤と混合して使用することもできる。

【００３４】また、グルコシル転移糖含有糖質の呈味
は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味
を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大き
いので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品
質改良などに有利に利用できる。

【００３５】例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味
噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシ
ング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、
麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬
の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料に有
利に使用できる。

【００３６】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの
洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果
実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペー
スト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレ
ッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロッ
プ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べ
ったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、
ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセー
ジ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、
イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しな
どの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで
製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻
などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビ
ン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの
酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、
乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミック
ス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープな
どの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、
米飯、麺類、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、
呈味改良に、また、物性改良などに有利に利用できる。

【００３７】また、家畜、家禽、魚などの飼育動物のた
めに飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用す
ることもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リッ
プクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、
口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペー
スト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種
組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤と
して、更には、品質改良剤として有利に利用できる。

【００３８】品質改良剤、安定剤としては、有効成分の
活性などを失い易い各種生理活性物質またはこれを含む
健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、イ
ンターフェロン−α、インターフェロン−β、インター
フェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、
ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ
遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファ
クター、インターロイキン１、インターロイキン２、イ
ンターロイキン６、インターロイキン１２、インターロ
イキン１５、インターロイキン１８などのサイトカイン
含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、
エリトロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホルモン
含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワ
クチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、
ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有
液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カ
ナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラ
ビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エル
ゴステロール、トコフェロール、などのビタミン含有
液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテア
ーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナー
ゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、ス
ッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポ
リスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母な
どの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、
その有効成分の活性を失うことなく、安定で高品質の健
康食品や医薬品などを容易に製造できる。

【００３９】以上述べたように、本発明でいう組成物
は、経口的または非経口的に利用する飲食物、化粧品、
医薬品のみならず、それ以外にも、例えば、生活用品、
農林水産用品、試薬、化学工業用品など広範な用途を有
する。

【００４０】また、これら組成物に、本発明のグルコシ
ル転移糖含有糖質を含有せしめる方法は、その製品が完
成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混
和、溶解、浸漬、浸透、散布、塗布、噴霧、注入、固化
などの公知の方法が適宜選ばれる。その含有せしめる量
は、組成物によっても異なるが、一般的には、グルコシ
ル転移糖として、０．１％以上、望ましくは０．５％以
上の量が好適である。

【００４１】次に実験により本発明をさらに具体的に説
明する。

【００４２】

【実験１】 〈トレハロースホスホリラーゼの生産〉炭素源として
０．５ｗ／ｖ％グルコースに代えて０．５ｗ／ｖ％トレ
ハロースを用いたこと以外は全て『ＡＴＣＣカタログ・
オブ・バクテリア・アンド・バクテリオファージズ、第
１８版』（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン発行、１９９２年）、４５２乃至４５６頁に記載の
サーモアナエロビウム・ブロッキイ培地の調製法に従っ
て、培地を１００ｍｌ容耐圧ボトルに１００ｍｌずつ調
製した後、サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣ
Ｃ３５０４７を接種し、６０℃、４８時間静置培養した
ものを種培養とした。

【００４３】容量１１ｌのステンレスボトル４本に種培
養の場合と同じ組成の培地を約１０ｌずつ入れて、加熱
滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液をこの培
地体積当たり１ｖ／ｖ％接種し、温度６０℃で、約４０
時間静置培養した。

【００４４】培養液約４０ｌを遠心分離して、培養菌体
９２ｇを得た。菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、
超音波破砕した後遠心分離して菌体破砕上清を得た。培
養液ｍｌ当たりに換算するとトレハロースホスホリラー
ゼの活性は、０．３単位／ｍｌであった。

【００４５】

【実験２】 〈トレハロースホスホリラーゼの精製〉実験１で得た菌
体破砕上清をＵＦ膜濃縮し、トレハロースホスホリラー
ゼをｍｌ当たり約３０単位有する濃縮酵素液約３６０ｍ
ｌを回収した。

【００４６】得られた濃縮酵素液のうち３００ｍｌを１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透
析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液上清
（３８０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパールゲル ６５０
ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムク
ロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）にかけた。

【００４７】本発明のトレハロースホスホリラーゼをＤ
ＥＡＥ−トヨパールゲル ６５０ゲルに吸着せしめ、０
Ｍ食塩水から０．５Ｍ食塩水までのリニアグラジエント
により、カラムより溶出させた。約０．１Ｍ食塩で溶出
される酵素活性画分を回収した後、以下の方法で更に精
製を行った。１．５Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析
し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブ
チルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用
いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量１００ｍ
ｌ）を行った。吸着したトレハロースホスホリラーゼを
１．５Ｍ硫安から０．５Ｍ硫安までのリニアグラジエン
トにより、カラムより溶出させ、酵素活性画分を回収し
た。

【００４８】続いて、ウルトロゲル ＡｃＡ４４（フラ
ンス、セプラコル社製）を用いたゲル濾過クロマトグラ
フィー（ゲル量３００ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性
画分を回収した。

【００４９】以上の精製手段により得られた精製酵素標
品の回収率は、活性換算で、菌体破砕上清に対して約２
５％であった。また、精製酵素標品の比活性は蛋白質ｍ
ｇ当たり７８．２単位であった。なお、蛋白質はローリ
ー法に従って牛血清アルブミンを標準にして定量した。

【００５０】精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポ
リアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の
純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い
標品であった。

【００５１】

【実験３】 〈トレハロースホスホリラーゼの性質〉実験２で得たト
レハロースホスホリラーゼ標品をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０ｗ／ｖ％）に供
し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッ
ド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分
子量を測定したところ、分子量８８，０００±５，００
０ダルトンであった。また、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００
ＳＷカラム（φ７．５ｍｍ×６００ｍｍｍ，東ソー株式
会社製）を用いたゲル濾過法により、分子量を測定した
結果、１９０，０００±１０，０００ダルトンであっ
た。

【００５２】精製トレハロースホスホリラーゼ２ｗ／ｖ
％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア・エ
ルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨ
を測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐ
Ｉ）は５．４±０．５であった。

【００５３】本発明のトレハロースホスホリラーゼ活性
に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調
べた。すなわち、温度の影響を調べる際には、活性測定
法における反応温度６０℃に代えて約５０乃至約８５℃
のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際
には、活性測定法において用いられる緩衝液に代えてｐ
Ｈ約４乃至約９のいずれかのｐＨに緩衝能有する緩衝液
を用いて反応を行い、この後、完成測定法と同様に反応
停止し、グルコース生成量を測定した。測定結果を、最
大値に対する相対値として表した結果を図１（温度の影
響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は
ｐＨ７．０、３０分間反応で７０℃付近、至適ｐＨは６
０℃、３０分間反応で７．０乃至７．５であった。本酵
素の温度安定性は、当該酵素を溶解せしめた１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を約４０℃乃至約８５℃のい
ずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵
素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性
は、本酵素をｐＨ約４乃至約１０のいずれかのｐＨに緩
衝能有する緩衝液に当該酵素を溶解せしめ、４℃で２４
時間保持した後、ｐＨを７．０に調整し、残存する酵素
活性を測定することにより求めた。測定結果を最大値に
対する相対値として表した結果を図３（温度安定性）、
図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は６
０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．０
であった。また、本酵素活性は、１ｍＭのＣｕ++、Ｐｂ
++、Ｚｎ++、Ｈｇ++、Ｍｇ++またはＭｎ++で阻害され
た。

【００５４】

【実験４】 〈トレハロースホスホリラーゼの部分アミノ酸配列〉 （１）Ｎ末端アミノ酸配列 実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を蒸留水に
対して透析した後、蛋白量として約４０μｇをＮ末端配
列分析用の試料とした。Ｎ末端配列はプロテインシーケ
ンサー・モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ
社製造、米国）を用い、Ｎ末端から５残基まで分析し
た。得られた配列は配列表における配列番号１に示すア
ミノ酸配列であった。さらに同じ試料を用いて同じ方法
により、より詳細に解析したところ、当該酵素はＮ末端
に、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を有
していることが判明した。

【００５５】（２）中間部部分アミノ酸配列 実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を１０ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した
後、同緩衝液にて１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう希釈し
た。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペ
プチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、
２２時間反応させることによりペプチド化した。生成し
たペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行った。マ
イクロボンダスフェアーＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ
×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製造、米国）を用
い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１ｖ／ｖ％トリフ
ルオロ酢酸−０％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ
％トリフルオロ酢酸−４８ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液
までの１２０分間のリニアーグラジエントの条件で行っ
た。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの
吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドと
よく分離した２ペプチド、ＴＰ１０（保持時間６６分）
及びＴＰ１４（保持時間８６分）を分取し、それぞれを
真空乾燥した後、２００μｌの０．１ｖ／ｖ％トリフル
オロ酢酸−５０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に溶解し
た。これらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供
し、それぞれＮ末端から５残基までアミノ酸配列を分析
した。その結果、ペプチドＴＰ１０からは、配列表にお
ける配列番号２に示すアミノ酸配列が、またペプチドＴ
Ｐ１４からは、配列表における配列番号３に示すアミノ
酸配列が得られた。さらに同じ方法によりより詳細に分
析したところ、ペプチドＴＰ１４はそのＮ末端に配列表
における配列番号７に示すアミノ酸配列を有しているこ
とが判明した。

【００５６】

【実験５】 〈トレハロースホスホリラーゼの糖分解反応における基
質特異性〉Ｄ−グルコース、マルトース、スクロース、
ラクトース、トレハロース、ネオトレハロース、セロビ
オース、メリビオース、コージビオース、イソマルトー
ス、ソホロース、ゲンチオビオース、ニゲロース、ラミ
ナリビオース、マルトペンタオース及び４−Ｏ−α−Ｄ
−グルコシルトレハロースから選ばれる糖質の水溶液
に、実験２の方法で得た精製トレハロースホスホリラー
ゼを糖質固形物グラム当たり１０単位ずつ加え、５ｍＭ
リン酸水素二ナトリウム存在下６０℃、ｐＨ７．０で２
４時間作用させた。反応液中の糖質濃度はいずれも２ｗ
／ｖ％とした。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６
０（メルク社製、アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を
用いた薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略
称する。）に供した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノー
ル：ピリジン：水＝７：３：１（容積比）を用いて室温
で１回展開した後、２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液
を噴霧し、１１０℃で約１０分間加熱して発色させた。
両反応液に由来するスポットを比較し、それぞれの糖質
に対する酵素作用の有無を判定した。結果を表１に示し
た。

【００５７】

【表１】

【００５８】表１に示されるように、本発明のトレハロ
ースホスホリラーゼはトレハロースに極めて高い特異性
で作用してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リ
ン酸とを生成することが判明した。一方、他の糖質には
作用しないことが判明した。

【００５９】

【実験６】 〈トレハロースホスホリラーゼのグルコシル転移糖生成
反応における受容体特異性〉受容体として表２に示す各
種単糖類、オリゴ糖類および糖アルコール類と、供与体
としてβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とを、固形物重量
で等量溶解含有している水溶液に、実験２の方法で得た
精製トレハロースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース
−１リン酸１ｇ当たり１０単位ずつ加え、６０℃、ｐＨ
７．０で２４時間反応させた。酵素反応前後の反応液
を、実験５と同様にＴＬＣに供した後発色させた。両反
応液に由来するスポットを比較し、反応後に新たに生成
したスポットより、転移糖を生成しているかどうかを判
定した。また転移糖と判定されたスポットの発色強度を
肉眼観察することにより、転移糖の生成率を相対的に評
価した。結果を表２に示した。

【００６０】

【表２】

【００６１】表２に示されるように、本発明のトレハロ
ースホスホリラーゼは、β−Ｄ−グルコース−１リン酸
を糖供与体とし、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−
フコース、Ｌ−フコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル
グルコサミンなどの還元性アルドースを受容体としてグ
ルコシル基を良く転移し、グルコシル転移糖を生成する
ことが判った。本発明の酵素の基質特異性を考慮する
と、これらグルコシル転移糖はいずれも非還元生の糖質
と考えられる。なお、β−Ｄ−グルコース−１リン酸に
かえてα−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として
用いた場合、グルコシル転移糖は得られなかった。

【００６２】この実験６により、本発明のトレハロース
ホスホリラーゼによる糖転移反応で生成することが明ら
かとなったグルコシル転移糖のうちのいくつかの詳細な
構造について、次の実験７乃至８を示しながら説明す
る。

【００６３】

【実験７】 〈β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとか
らのグルコシル転移糖〉実験６で得たβ−Ｄ−グルコー
ス−１リン酸とＤ−グルコースとを基質とした酵素反応
液を取りその一部を、濃度１％になるよう１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、この０．５ｍｌにト
レハラーゼ（シグマ社製、米国）１．０単位を加え、４
５℃で２０時間反応させた。その後、トレハラーゼ処理
を施していない先の酵素反応液及びトレハラーゼ処理を
施した酵素反応液それぞれの一部を乾固し、ピリジンに
溶解した後、トリメチルシリル化した。これらを、ガス
クロマトグラフィー（以下、「ＧＬＣ」と略称する。）
に供した。ＧＬＣカラムは、２％シリコンＯＶ−１７／
クロモゾルブＷ（ジー・エル・サイエンス株式会社製）
を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャ
リアーガスは、窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で、カラム
オーブン温度は、１６０℃から３２０℃まで７．５℃／
分の昇温速度で分析した。検出は、水素炎イオン検出器
を用いた。

【００６４】その結果、本発明のトレハロースホスホリ
ラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グル
コースとからのグルコシル転移糖のピークの保持時間
は、既知糖質トレハロースのそれと一致し、さらに、ト
レハラーゼ処理によりそのピークは消失してＤ−グルコ
ースの生成が認められた。トレハラーゼの基質特異性を
考慮すると、本発明のトレハロースホスホリラーゼによ
るβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとか
らのグルコシル転移糖は、トレハロースであると判断さ
れる。

【００６５】

【実験８】 〈グルコシルＤ−ガラクトシド〉一方、本発明のトレハ
ロースホスホリラーゼによるＤ−ガラクトースへの糖転
移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当
該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べ
た。まず、トレハロースを５％とＤ−ガラクトースを
２．５％及び５ｍＭのリン酸二水素ナトリウムを含む水
溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実験２の方法で得た
精製トレハロースホスホリラーゼをトレハロース１ｇ当
たり１５単位加え、６０℃で７２時間反応させ、次いで
１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７
で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで
分析した。その結果、反応終了液にはトレハロース、Ｄ
−ガラクトース、Ｄ−グルコース及びβ−Ｄ−グルコー
ス−１リン酸のいずれとも保持時間の異なる成分が多量
生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル
転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求
めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約
３０％であった。本反応液の残り全量をｐＨ７．０に調
整し、これに残存するトレハロース１ｇ当たり２５単位
のトレハラーゼを加え、４５℃で２０時間作用させ溶液
中に残存するトレハロースを分解した。次いで１００℃
で１０分間加熱してトレハラーゼを失活させ、活性炭で
脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱
塩して精製し、濃度約５０％まで濃縮して、カラムクロ
マトグラフィーを行い、当該グルコシル転移糖高含有画
分を採取した。

【００６６】分画用樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチ
オン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名
『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、
内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カ
ラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全
長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に
維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これ
に４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、
当該グルコシル転移糖高含有画分を採取した。

【００６７】当該グルコシル転移糖高含有画分を脱塩、
精製し、濃度約４０％に濃縮してオクタデシルシリカゲ
ルを充填したカラム（株式会社ワイエムシー、商品名
『ＹＭＣ−Ｐａｋ ＯＤＳ』）を用いたクロマトグラフ
ィーを行い、当該グルコシル転移糖画分を採取した。採
取された画分を濃度約４０％に濃縮し、再度オクタデシ
ルシリカゲルかラムを用いたクロマトグラフィーに供す
る操作を繰り返し、採取された当該グルコシル転移糖高
含有液を脱塩、精製、濃縮、真空乾燥して、当該グルコ
シル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当
たり収率約２０％で得た。実験７で示した方法に準じて
本粉末標品をＧＬＣで分析したところ、本粉末標品は固
形物当たり当該グルコシル転移糖を約９８％含有してい
た。

【００６８】次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末標
品を酸分解し、ＧＬＣ分析に供した。その結果、当該グ
ルコシル転移糖は酸分解によりほぼ１対１のモル比でＤ
−グルコースとＤ−ガラクトースを生成することが分か
った。また、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル
化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル
化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧ
ＬＣで分析すると２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル
１，５−ジ−Ｏ−アセチルグルシトールと２，３，４，
６−テトラ−Ｏ−メチル１，５−ジ−Ｏ−アセチルガラ
クチトールとが認められた。以上のことは、当該グルコ
シル転移糖が、Ｄ−グルコースとＤ−ガラクトースが１
対１のモル比で結合したものであり、さらに、その結合
には、Ｄ−グルコースの１位のＯＨ基及びＤ−ガラクト
ースの１位のＯＨ基が関与していることを示唆してい
る。

【００６９】当該グルコシル転移糖高含有粉末標品を用
いて、比旋光度及び13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定
することにより本グルコシルガラクトシドの構造をさら
に詳細に調べた。その結果、比旋光度：［α］D 20＝＋
２２３°（ｃ＝０．９７，Ｈ2Ｏ）及び、13Ｃ−ＮＭＲ
スペクトル（１００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒ
ｏｍＴＰＳ９６．１６，９５．９７，７５．３７，７
４．９４，７４．１４，７３．９０，７２．５３，７
２．１１，７１．８０，７０．７６，６４．０３，６
３．３７の各値が得られた。これらの値は、アール・ダ
ブリュー・バッシリー（Ｒ．Ｗ．Ｂａｓｓｉｌｙ）ら
が、『カーボハイドレート・リサーチ』、第２３９巻
（１９９３年）、１９７乃至２０７頁に報告している、
有機合成により調製されたα−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙ
ｒａｎｏｓｙｌ α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉ
ｄｅの文献値とほぼ一致したことから本グルコシルＤ−
ガラクトシドはＤ−グルコースとＤ−ガラクトースが
α，α−１，１結合した２糖類であるグルコシルＤ−ガ
ラクトシド、すなわち、α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒ
ａｎｏｓｙｌ α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ
ｅであることが確認された。

【００７０】

【実験９】 〈急性毒性〉７週齢のｄｄ系マウスを使用して、実験８
の方法で得たグルコシルＤ−ガラクトシド高含有粉末、
後述の実施例Ａ−１２の方法で得たグルコシルＤ−キシ
ロシド高含有粉末、後述の実施例Ａ−１４の方法で得た
グルコシルＤ−フコシド高含有粉末及び後述の実施例Ａ
−１５の方法で得たグルコシルＬ−フコシド含有粉末
を、それぞれ別個に経口投与して急性毒性テストをした
ところ、いずれの物質も投与可能な最大投与量、すなわ
ち５０ｇ／ｋｇマウス体重においても死亡例が認められ
なかった。従って、本発明によるこれら転移糖は、いず
れも毒性の極めて低い物質である。

【００７１】以下、実施例Ａに基づき本発明のトレハロ
ースホスホリラーゼ及び当該トレハロースホスホリラー
ゼをコードする本発明のＤＮＡと、それを利用したグル
コシル転移糖含有糖質の製造方法を説明する。当然のこ
とながら本発明を実施するための方法はこれらに限定さ
れるものではない。

【００７２】

【実施例Ａ−１】 〈酵素液〉サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣ
Ｃ３５０４７を、培養温度を６５℃とした以外は、実験
１と同じ培地組成で、実験１の方法に準じて嫌気ファー
メンターで約３０時間培養した。培養液を遠心分離して
得た菌体を超音波破砕し、さらに遠心分離して得た破砕
液上清をＤＥＡＥ−トヨパール・ゲルに吸着せしめ、０
Ｍ食塩水から０．５Ｍ食塩水までのリニアグラジエント
により溶出させた。約０．１Ｍの食塩で溶出されるトレ
ハロースホスホリラーゼ活性ある画分を回収した。回収
した画分を限外濾過膜にて濃縮して１ｍｌ当たりトレハ
ロースホスホリラーゼ活性約２０単位を有する酵素液
を、もとの培養液の総活性に対して約４０％の収率で得
た。

【００７３】

【実施例Ａ−２】 〈ＤＮＡの調製〉実験１に示した培地と同一組成の培地
１１ｌで、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣ
Ｃ ３５０４７）を、実験１に示した方法に準じて６０
℃で２４時間培養した。遠心分離により培養物から菌体
を分離し、適量のトリス−ＥＤＴＡ−食塩緩衝液（以
下、「ＴＥＳ緩衝液」と略記する。）（ｐＨ８．０）に
浮遊させ、リゾチームを当該菌体浮遊液の体積に対し
０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間イン
キュベートした。その後この処理物を−８０℃で１時間
保持して凍結させた後、ここに、予めＴＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ９．０）を加えて６０℃に加温しておいたＴＥＳ緩衝
液／フェノール混液を加えて充分に攪拌し、さらに氷冷
後遠心分離して形成された上層を採取した。この上層
に、２倍容の冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取
し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）の適量に溶解後、７．
５μｇのリボヌクレアーゼ及び１２５μｇのプロテアー
ゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ここ
に、クロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて
攪拌後、静置して形成される上層を採取し、この上層に
冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取した。沈澱を
冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで濯ぎ真空乾燥して、Ｄ
ＮＡを得た。得られたＤＮＡは、濃度約１ｍｇ／ｍｌと
なるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８
０℃で凍結した。

【００７４】

【実施例Ａ−３】 〈形質転換体と組換えＤＮＡの調製〉実施例Ａ−２の方
法で得たＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、ここに制限酵素Ａｌ
ｕＩを約２０単位加え、３７℃で３０分間インキュベー
トしてＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法
により、鎖長約２，０００乃至５，０００塩基対のＤＮ
Ａ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニン
グ・システムズ製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』を常法により制限酵素Ｓｍ
ａ Ｉを作用させて完全に切断した後、その切断された
プラスミドベクター０．３μｇと先に得たＤＮＡ断片約
３μｇとを宝酒造製『ＤＮＡライゲーション・キット』
を用いて、添付の説明書にしたがって操作して連結し、
得られた組換えＤＮＡで、通常のコンピテントセル法に
よりストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸
菌『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ』１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作
製した。

【００７５】このようにして得た遺伝子ライブラリーと
しての形質転換体を、常法により調製した、１０ｇ／ｌ
トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ 塩化
ナトリウム、７５ｍｇ／ｌ アンピシリンナトリウム塩
及び５０ｍｇ／ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ
７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上に
形成された白色のコロニー約５，０００個をアマシャム
製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別
途、実験４の方法で明らかにした、配列表の配列番号６
に示すＮ末端アミノ酸配列における第９より１５番目ま
でのアミノ酸配列に基づき、５′−ＴＡＹＣＣＮＴＴＹ
ＧＡＲＧＡＹＴＧＧＧＴ−３′で表される塩基配列のオ
リゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−
32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て同位体標識して第一のプローブとしての合成ＤＮＡを
得た。先に得たナイロン膜上に固定されたコロニーのう
ち、当該第一のプローブと顕著な会合を示すコロニー
を、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適用し
て３個のコロニーを選択した。引き続き、選択された３
個のコロニーを先と同様にしてナイロン膜に固定した。
別途、実験４の方法で明らかにした、配列表の配列番号
７に示す部分アミノ酸配列における第１より７番目まで
のアミノ酸配列に基づき、５′−ＡＡＹＴＡＹＧＡＹＴ
ＡＹＴＡＹＧＡＲＣＣ−３′で表される塩基配列のオリ
ゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−32
Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
同位体標識して第二のプローブとしての合成ＤＮＡを得
た。予め選択され、ナイロン膜上に固定された３個のコ
ロニーのうち、当該第二のプローブとも顕著な会合を示
すコロニーを、通常のコロニーハイブリダイゼーション
法を適用して選択し、当該形質転換体を『ＴＴＰ４』と
命名した。

【００７６】この形質転換体ＴＴＰ４を常法にしたが
い、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含
むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２
４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により
培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法に
より組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基
配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当
該組換えＤＮＡは、サーモアナエロビウム・ブロッキイ
（ＡＴＣＣ ３５０４７）に由来する、鎖長３３４５塩
基対の、配列表における配列番号８に示す塩基配列のＤ
ＮＡを含んでいた。配列表の配列番号８に示したとお
り、この塩基配列における第５９６乃至２９１７番目の
塩基は、７７４アミノ酸からなるアミノ酸配列をコード
するものであった。この、塩基配列から推定されたアミ
ノ酸配列と、実験４の方法で確認された本発明のトレハ
ロースホスホリラーゼのＮ末端アミノ酸配列及び中間部
部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１乃
至３及び配列番号６乃至７に示すアミノ酸配列とを比較
したところ、配列表における配列番号１、２及び３に示
すアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８に併記したア
ミノ酸配列における第２乃至６番目、第３０８乃至３１
２番目及び第６３３乃至６３７番目のアミノ酸配列と完
全に一致した。また、配列表における配列番号６及び７
に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列
番号８に併記したアミノ酸配列における第２乃至３１番
目及び第６３３乃至６４７番目のアミノ酸配列と完全に
一致した。以上のことは、本発明のトレハロースホスホ
リラーゼが配列表における配列番号４に示すアミノ酸配
列を有するものであり、当該酵素はサーモアナエロビウ
ム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）においては、
配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによ
りコードされていることを示している。以上のようにし
て調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＴＴ
Ｐ４』と命名した。また、図５に示すように、この組換
えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｐｓｔ Ｉ
による認識部位の下流に位置していた。

【００７７】

【実施例Ａ−４】 〈形質転換体によるトレハロースホスホリラーゼの産
生〉１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及
び５ｇ／ｌ塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容
三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２
１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に
調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌
的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施
例Ａ−３の方法で得た形質転換体ＴＴＰ４を接種し、３
７℃で約２０時間通気攪拌培養したものを種培養液とし
た。次に１０ｌ容ファーメンタに、種培養に用いたのと
同一組成の培地を、種培養の場合に準じて７ｌ調製し、
種培養液７０ｍｌ接種し、約２０時間通気攪拌培養し
た。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離して菌体
を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離によ
り不溶物を除去し、上清を採取した。その上清を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液に対して透析した後、透析液中のトレハ
ロースホスホリラーゼ活性を測定したところ、培養物１
ｌ当たり約７００単位の当該酵素が産生されていた。

【００７８】第一の対照として、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外
はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で、培養
し、培養物から菌体破砕物の上清を採取し、透析した。
第二の対照として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ
（ＡＴＣＣ ３５０４７）を、アンピシリンを含有しな
いこと以外は上述の形質転換体の場合と同一組成の培地
を用い、実験１に示した方法に準じて６０℃で静置培養
し、さらに上述の形質転換体の場合と同じく培養物から
菌体破砕物の上清を採取し、透析した。第一の対照の透
析物には当該酵素活性は全く認められなかった。第二の
対照の透析物には当該酵素活性が認められたが、この場
合は、培養物１ｌ当たり約２単位であり、形質転換体Ｔ
ＴＰ４の場合に比較して明らかに低い値であった。

【００７９】この実施例Ａ−４の方法で得た透析物を、
さらに実験２に示した方法に準じて、ブチルトヨパール
６５０ゲル、ウルトロゲル ＡｃＡ４４を用いたカラ
ムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製
酵素を実験３に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量８８，
０００±５，０００ダルトン、ゲル濾過法による分子量
１９０，０００±１０，０００ダルトン、等電点ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法による等電点５．４±０．
５、トレハロースホスホリラーゼ活性の至適温度７０℃
付近、至適ｐＨ７．０乃至７．５付近、温度安定性は６
０℃付近まで、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．０であ
り、実験１乃至２に示した方法で調製された当該酵素の
理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、
本発明のトレハロースホスホリラーゼは、組換えＤＮＡ
技術によっても良好に製造でき、なお且つ酵素の生産性
も有意に向上することを示している。

【００８０】

【実施例Ａ−５】 〈酵素液〉実施例Ａ−３に示した方法で得た形質転換体
ＴＴＰ４を実施例Ａ−４に示した方法で培養した。培養
液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清
のトレハロースホスホリラーゼ活性を測定した。この活
性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、約０．７単位で
あった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃縮し、その濃縮
液を透析してｍｌ当たりトレハロースホスホリラーゼ活
性約１０単位を有する酵素液を、もとの培養液の総活性
に対して約７０％の収率で得た。

【００８１】

【実施例Ａ−６】 〈トレハロース含有糖液〉マルトースを５％含む２５ｍ
Ｍリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルト
ース１ｇ当たり５単位、実施例Ａ−１の方法で調製した
トレハロースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり５
０単位になるように加え、３０℃で１２０時間反応させ
た。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失
活させた後冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して固形物濃度約７５％のシラップを、原
料固形物当たり収率約９５％で得た。

【００８２】本品は、固形物当たりトレハロースを約４
５％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿
性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌
増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食
物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利
用できる。

【００８３】

【実施例Ａ−７】 〈トレハロース高含有粉末〉実施例Ａ−６の方法で反
応、精製した固形物当たり約４５％のトレハロースを含
有する糖液を原料として、固形物濃度２０％に調整した
後、グルコアミラーゼを固形物１ｇ当たり５単位加えて
ｐＨ４．５、４０℃で１６時間反応させ残存するマルト
ースを分解した。１００℃で３０分間加熱して反応を停
止した後、濃度４０％まで濃縮した。本糖液のトレハロ
ース含有率をさらに高めるため、アルカリ金属型強酸性
カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品
名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用
し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス
製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂
層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０
℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、
これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画
し、トレハロース高含有画分を採取した。更に、精製、
濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハロース高含有粉
末を原料固形物当たり収率約４０％で得た。

【００８４】本品は、固形物当たり約９５％のトレハロ
ースを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性を
有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖
促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化
粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用でき
る。

【００８５】

【実施例Ａ−８】 〈グルコシルＤ−ガラクトシド含有糖液〉トレハロース
及びＤ−ガラクトースをそれぞれ５％及び５ｍＭのリン
酸二水素ナトリウム含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、
これに実施例Ａ−１の方法で調製したトレハロースホス
ホリラーゼをトレハロース１ｇ当たり１０単位になるよ
うに加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を
９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却
し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ
型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して
固形物濃度約７５％のシラップを原料固形物当たり収率
約９５％で得た。

【００８６】本品は、固形物当たりグルコシルＤ−ガラ
クトシドを約２２％含有しており、味質良好な甘味、適
度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定
剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤など
として広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組
成物に有利に利用できる。

【００８７】

【実施例Ａ−９】 〈グルコシルＤ−ガラクトシド含有糖液〉トレハロース
を１０％、Ｄ−ガラクトースを５％及び５ｍＭのリン酸
二水素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、
これに実施例Ａ−１の方法で調製したトレハロースホス
ホリラーゼをトレハロース１ｇ当たり３０単位になるよ
うに加えて６０℃で９６時間反応させた。この反応液を
９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し
た。続いて市販パン酵母を固形物重量当たり湿重量で５
％になるように加えて、１規定の水酸化ナトリウム溶液
を用いて該反応液をｐＨ５乃至６に制御しながら、２７
℃で６時間保持し、反応液中のＤ−グルコースを資化さ
せた。パン酵母を遠心分離により除いた上清を常法に従
って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換
樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して固形物濃度約
７５％のシラップを原料固形物当たり収率約６５％で得
た。

【００８８】本品は、固形物当たりグルコシルＤ−ガラ
クトシドを約４０％含有しており、味質良好な甘味、適
度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定
剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤など
として広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組
成物に有利に利用できる。

【００８９】

【実施例Ａ−１０】 〈グルコシルＤ−ガラクトシド高含有粉末〉実施例Ａ−
８の方法で反応、精製した固形物当たり２２％のグルコ
シルＤ−ガラクトシドを含有する糖液を原料とし、濃度
約４５％に調製した。本糖液のグルコシルＤ−ガラクト
シド含有率を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオ
ン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『Ｘ
Ｔ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径
３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム
４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を
約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持
しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４
０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、グル
コシルＤ−ガラクトシド高含有画分を採取した。更に、
精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、グルコシルＤ−
ガラクトシド高含有粉末を原料固形物当たり収率約２５
％で得た。

【００９０】本品は、固形物当たり約７０％のグルコシ
ルＤ−ガラクトシドを含有しており、味質良好な甘味、
適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定
剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤など
として広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組
成物に有利に利用できる。

【００９１】

【実施例Ａ−１１】 〈グルコシルＤ−キシロシド含有糖液〉トレハロースを
５％、Ｄ−キシロースを２．５％及び５ｍＭのリン酸二
水素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、こ
れに実施例Ａ−１の方法で調製したトレハロースホスホ
リラーゼをトレハロース１ｇ当たり１５単位になるよう
に加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９
０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、
常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イ
オン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して固形
物濃度約７５％のシラップを原料固形物当たり収率約９
５％で得た。

【００９２】本品は、固形物当たり約２０％のグルコシ
ルＤ−キシロシドを含有しており、味質良好な甘味、適
度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成
形物など各種組成物に有利に利用できる。

【００９３】

【実施例Ａ−１２】 〈グルコシルＤ−キシロシド高含有粉末〉実施例Ａ−１
１の方法で反応、精製した固形物当たり約２０％のグル
コシルＤ−キシロシドを含有する糖液を原料として、固
形物濃度約４５％に調整した後、本糖液のグルコシルＤ
−キシロシド含有率を高めるため、アルカリ金属型強酸
性カチオン交換樹脂（ダウケミカル社販売、商品名『ダ
ウエックス５０Ｗ×４』、Ｃａ型）を用いた以外は、実
施例Ａ−１０の方法に従ってカラムクロマトグラフィー
を行い、グルコシルキシロシド高含有画分を採取した。
更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、グルコシ
ルＤ−キシロシド高含有粉末を原料固形物当たり収率約
２５％で得た。

【００９４】本品は、固形物当たり約６０％のグルコシ
ルＤ−キシロシドを含有しており、味質良好な甘味、適
度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成
形物など各種組成物に有利に利用できる。

【００９５】

【実施例Ａ−１３】 〈グルコシルＤ−フコシド含有糖液〉トレハロース５
％、Ｄ−フコース２．５％及び５ｍＭリン酸水素二ナト
リウムを含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施
例Ａ−１の方法で調製したトレハロースホスホリラーゼ
をトレハロース１ｇ当たり２０単位になるように加え、
６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３
０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従
って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換
樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して固形物濃度約
７５％のシラップを原料固形物当たり収率約９５％で得
た。

【００９６】本品は、固形物当たり約２０％のグルコシ
ルＤ−フコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度
の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形
物など各種組成物に有利に利用できる。

【００９７】

【実施例Ａ−１４】 〈グルコシルＤ−フコシド高含有粉末〉トレハロースを
５％、Ｄ−フコースを２．５％及び５ｍＭのリン酸二水
素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これ
に実施例Ａ−１の方法で調製したトレハロースホスホリ
ラーゼをトレハロース１ｇ当たり２０単位になるように
加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液に水酸
化ナトリウムを加えてｐＨ１０以上のアルカリ性に保ち
ながら１００℃で加熱した後、冷却し、常法に従って活
性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂に
より脱塩して精製し、更に濃縮、粉末化してグルコシル
Ｄ−フコシド含有粉末を原料固形物当たり収率約６０％
で得た。

【００９８】本品は、固形物当たり約５０％のグルコシ
ルＤ−フコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度
の保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など
各種組成物に有利に利用できる。

【００９９】

【実施例Ａ−１５】 〈グルコシルＬ−フコシド含有粉末〉トレハロースを５
％、Ｌ−フコースを２．５％及び５ｍＭリン酸二水素ナ
トリウムを含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実
施例Ａ−１の方法で調製したトレハロースホスホリラー
ゼをトレハロース１ｇ当たり１５単位になるように加
え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃
で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法
に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン
交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、粉末化して
グルコシルＬ−フコシド含有粉末を原料固形物当たり収
率約９５％で得た。

【０１００】本品は、固形物当たり約２０％のグルコシ
ルＬ−フコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度
の保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など
各種組成物に有利に利用できる。

【０１０１】

【実施例Ａ−１６】 〈トレハロース含有糖液〉マルトースを５％含む２５ｍ
Ｍリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルト
ース１ｇ当たり５単位、実施例Ａ−５の方法で調製した
トレハロースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり５
０単位になるように加え、３０℃で１２０時間反応させ
た。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失
活させた後冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して固形物濃度約７５％のシラップを、原
料固形物当たり収率約９５％で得た。

【０１０２】本品は、固形物当たりトレハロースを約４
５％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿
性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌
増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食
物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利
用できる。

【０１０３】

【実施例Ａ−１７】 〈グルコシルＤ−フコシド含有糖液〉トレハロース５
％、Ｄ−フコース２．５％及び５ｍＭリン酸水素二ナト
リウムを含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施
例Ａ−５の方法で調製したトレハロースホスホリラーゼ
をトレハロース１ｇ当たり２０単位になるように加え、
６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３
０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従
って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換
樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して固形物濃度約
７５％のシラップを原料固形物当たり収率約９５％で得
た。

【０１０４】本品は、固形物当たり約２０％のグルコシ
ルＤ−フコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度
の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形
物など各種組成物に有利に利用できる。

【０１０５】次に、実施例Ｂに基づき、本発明のグルコ
シル転移糖含有糖質を含有せしめた組成物について説明
する。

【０１０６】

【実施例Ｂ−１】 〈甘味剤〉実施例Ａ−１０の方法で得たグルコシルＤ−
ガラクトシド高含有粉末１重量部に対し、α−グリコシ
ルステビオシド（東洋精糖株式会社製造、商品名α−Ｇ
スィート）０．０５重量部を加えて均一に混合して粉末
甘味剤を製造した。本品は、上品な甘味で、砂糖の約２
倍の甘味を有し、カロリーは甘味度当たり砂糖の約２分
の１となる。したがって、この甘味剤は低カロリー甘味
料として、カロリーの摂取を制限している人、例えば、
肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物に対す
る味付けに好適である。また、この甘味剤は、虫歯誘発
菌による酸の生成も少なく、不溶性グルカンの生成も少
ないことにより、虫歯を抑制する飲食物などの味付けに
も好適である。

【０１０７】

【実施例Ｂ−２】 〈ハードキャンディー〉実施例Ａ−９の方法で得たグル
コシルＤ−ガラクトシド含有糖液３０重量部に対し、還
元麦芽糖水飴（水分２５％）８０重量部を加えて混合溶
解し、減圧下で水分が２％未満になるまで濃縮し、これ
にクエン酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを
混和し、次いで、常法に従って成形しハードキャンディ
ーを製造した。本品は、上品な甘味を有し、吸湿性少な
く、ダレを起こしにくい歯切れの良いハードキャンディ
ーである。

【０１０８】

【実施例Ｂ−３】 〈チューインガム〉実施例Ａ−１２の方法で得たグルコ
シルＤ−キシロシド高含有粉末４重量部に対し、グルコ
ース３重量部および、柔らかくなる程度に加熱溶融した
ガムベース２重量部を加えて混合し、さらに適量のハッ
カ香料を混合した後、常法に従ってロールにより練り合
わせ成形することによってチューインガムを製造した。
本品は、テクスチャー、風味ともに優れた製品である。

【０１０９】

【実施例Ｂ−４】 〈チョコレート〉実施例Ａ−１４の方法で得たグルコシ
ルＤ−フコシド高含有粉末１５重量部に対し、カカオペ
ースト４０重量部、カカオバター１０重量部、蔗糖１０
重量部及び全脂粉乳１５重量部を加えて混合し、レファ
イナーを通した。そして粒度を下げた後、コンチェに入
れ、レシチン０．５重量部を加えて、５０℃で二昼夜練
り上げた。次いで、常法に従い成型機に流し込み成型固
化してチョコレートを製造した。本品は、ファットブル
ーム、シュガーブルームの恐れがなく、舌にのせた時の
融け具合、風味ともに良好である。

【０１１０】

【実施例Ｂ−５】 〈カスタードクリーム〉実施例Ａ−１５の方法で得たグ
ルコシルＬ−フコシド含有粉末４００重量部に対し、コ
ーンスターチ５００重量部、マルトース５００重量部及
び食塩５重量部を加え、篩いを通して充分に混合し、さ
らに鶏卵１，４００重量部を加えて攪拌し、これに沸騰
した牛乳５，０００重量部を徐々に加え、さらにこれを
とろ火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊
化して全体が半透明になったとき火を止め、これを冷却
して少量のバニラ香料を加えることによりカスタードク
リームを製造した。本品は、なめらかで光沢を有し、甘
味が強すぎず美味である。

【０１１１】

【実施例Ｂ−６】 〈ういろう〉実施例Ａ−１３の方法で得たグルコシルＤ
−フコシド含有糖液９０重量部に対し、米粉９０重量
部、コーンスターチ２０重量部、砂糖２０重量部、抹茶
粉末１重量部及び水の適量を加えて混練した後、これを
容器に入れて６０分間蒸して抹茶ういろうを製造した。
本品は、照り、口当たり良好で、風味もよいものであっ
た。また、澱粉の老化も抑制され、長時間安定であっ
た。

【０１１２】

【実施例Ｂ−７】 〈べったら漬〉実施例Ａ−８の方法で得たグルコシルＤ
−ガラクトシド含有糖液１重量部に対し、マルトース３
重量部、甘草製剤０．０５重量部、リンゴ酸０．００８
重量部、グルタミン酸ナトリウム０．０７重量部、ソル
ビン酸カリウム０．０３重量部及びプルラン０．２重量
部を均一に混合してべったら漬の素を製造した。大根３
０ｋｇを常法に従って食塩により下漬けし、次いで砂糖
で中漬けしたものを、ここで得たべったら漬の素４ｋｇ
で調製した調味液に漬けて、べったら漬を製造した。本
品は、色艶、香気ともに良好で、適度の甘味を有し歯切
れも良かった。

【０１１３】

【実施例Ｂ−８】 〈乳酸菌飲料〉実施例Ａ−１１の方法で得たグルコシル
Ｄ−キシロシド含有糖液１３０重量部に対し、脱脂粉乳
１７５重量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会
社林原商事販売、登録商標「乳果オリゴ」）５０重量部
を、水１，１５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺
菌し、４０℃に冷却後、これに、常法にしたがって、乳
酸菌のスターターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間
培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌
飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌
を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作
用をも有する。

【０１１４】

【実施例Ｂ−９】 〈スキンクリーム〉実施例Ａ−７の方法で得たトレハロ
ース高含有粉末４重量部に対し、モノステアリン酸ポリ
オキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノス
テアリン酸グリセリン５重量部、α−グリコシルルチン
２重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グ
リセリル１０重量部及び防腐剤の適量を加え、常法に従
って加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール５
重量部、及び精製水６６重量部を更に加え、ホモゲナイ
ザーにかけて乳化し、香料の適量を加えて攪拌混合し、
スキンクリームを製造した。本品は、伸びのよいクリー
ムで、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利
用できる。

【０１１５】

【実施例Ｂ−１０】 〈練歯磨〉実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース含有
糖液１５重量部に対し、第二リン酸カルシウム４５重量
部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン
２５重量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート
０．５重量部、サッカリン０．０２重量部、防腐剤０．
０５重量部及び水１３重量部と混合して練歯磨を得た。
本品は、光沢、洗浄力も良好で、練歯磨として好適であ
る。

【０１１６】

【実施例Ｂ−１１】 〈経管栄養剤〉実験８の方法で得たグルコシルＤ−ガラ
クトシド高含有粉末８０重量部と、乾燥卵黄１９０重量
部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量
部、塩化カリウム１．８５重量部、硫酸マグネシウム４
重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナト
リウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量
部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物
を調製した。この配合物を２５ｇずつラミネートアルミ
製小包に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品
は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して栄
養補給液とし、経管方法により、鼻腔、食道、胃などへ
投与して使用する。

【０１１７】

【実施例Ｂ−１２】 〈いちごジャム〉生いちご１５０重量部、蔗糖６０重量
部、マルトース２０重量部、実施例Ａ−１６の方法で得
たトレハロース含有糖液４０重量部、ペクチン５重量部
及びクエン酸１重量部を鍋で煮詰め、瓶詰めして製品を
得た。本品は風味、色調とも良好なジャムである。

【０１１８】

【実施例Ｂ−１３】 〈加糖練乳〉原乳１００重量部に実施例Ａ−１７の方法
で得たグルコシルＤ−フコシド含有糖液３重量部及び蔗
糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、
次いで濃度約７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品
を得た。本品は温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食
品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に
有利に利用できる。

【０１１９】

【発明の効果】叙上のように本発明は、従来公知のトレ
ハロースホスホリラーゼに比べて、至適温度、温度安定
性における温度の高いトレハロースホスホリラーゼの新
規の発見に基づくものである。本発明のトレハロースホ
スホリラーゼはまた、ｐＨ安定性におけるｐＨ域が広
く、しかも至適ｐＨは安定なｐＨ域内にあり、更に産生
微生物からの酵素生産量も高い。したがって、β−Ｄ−
グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質の存在
下で本発明の酵素を作用させれば、従来公知ではあるが
入手の極めて困難であったグルコシルＤ−ガラクトシド
等を始めとする各種グルコシル転移糖並びに当該転移糖
含有糖質を大量且つ安価に製造することができる。

【０１２０】この様にして製造されるグルコシル転移糖
並びに当該転移糖含有糖質は、上品な甘味の甘味剤、呈
味改良剤、品質改良剤、ボディー付与剤、粘度調節剤、
保湿剤、照付与剤などとして、さらには、栄養補給剤な
どとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種
組成物に供しうることが大きな特徴であることから、本
発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜
産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な
意義のある発明といえる。

【０１２１】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント

【０１２２】配列番号：2 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１２３】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【０１２４】配列番号：4 配列の長さ：773 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Ala Asn Lys Thr Lys Lys Pro Ile Tyr Pro Phe Glu Asp Trp Val Ile 1 5 10 15 Arg Glu Thr Gln Phe Ser Ile Asp Thr Asn Tyr Arg Asn Glu Thr Ile 20 25 30 Phe Thr Leu Ala Asn Gly Tyr Ile Gly Met Arg Gly Thr Phe Glu Glu 35 40 45 Arg Tyr Ser Gly Pro Lys Asn Thr Ser Phe Asn Gly Thr Tyr Ile Asn 50 55 60 Gly Phe Tyr Glu Ile His Asp Ile Val Tyr Pro Glu Gly Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ala Lys Ile Gly Gln Thr Met Leu Asn Val Ala Asp Ser Lys Ile 85 90 95 Ile Lys Leu Tyr Val Asp Gly Glu Glu Phe Asp Leu Leu Gln Gly Lys 100 105 110 Ile Leu Phe Tyr Glu Arg Val Leu Asp Met Lys Lys Gly Phe Val Glu 115 120 125 Arg Lys Val Lys Trp Glu Ser Pro Thr Gly Lys Ile Leu Glu Val Lys 130 135 140 Ile Lys Arg Ile Val Ser Leu Asn Arg Gln His Leu Ala Ala Ile Ser 145 150 155 160 Phe Thr Met Gln Pro Val Asn Phe Thr Gly Lys Ile Arg Phe Val Ser 165 170 175 Ala Ile Asp Gly Asn Val Ser Asn Ile Asn Asp Ser Glu Asp Val Arg 180 185 190 Val Gly Ser Asn Leu Lys Gly Lys Val Leu Lys Thr Ile Asp Lys Ser 195 200 205 Val Glu Gly Leu Lys Gly Trp Ile Val Gln Lys Thr Gln Lys Ser Asn 210 215 220 Phe Ser Tyr Ala Cys Ala Ile Asp Asn Val Leu Val Ala Asp Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Glu Val Ser Asn Ser Leu Glu Glu Asp Gly Val Lys Val Ile Val 245 250 255 Asp Leu Glu Ala Glu Lys Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Phe Ile 260 265 270 Ser Tyr Tyr Thr Ser Lys Asp Phe Asp Glu Asn Lys Leu Val Ala Leu 275 280 285 Ala Leu Glu Glu Ile Glu Lys Ala Lys Asn Asp Gly Phe Glu Thr Ile 290 295 300 Glu Lys Glu Gln Glu Glu Phe Leu Asn Ser Phe Trp Lys Asp Ala Asp 305 310 315 320 Val Ile Ile Glu Gly Asp Lys Ala Leu Gln Gln Gly Ile Arg Phe Asn 325 330 335 Glu Phe His Leu Leu Gln Ser Val Gly Arg Asp Gly Lys Thr Asn Ile 340 345 350 Ala Ala Lys Gly Leu Thr Gly Gly Gly Tyr Glu Gly His Tyr Phe Trp 355 360 365 Asp Ser Asp Ile Tyr Ile Met Pro Phe Phe Leu Tyr Thr Lys Pro Glu 370 375 380 Ile Ala Lys Ala Leu Val Met Tyr Arg Tyr Asn Leu Leu Asp Ala Ala 385 390 395 400 Arg Ser Arg Ala Lys Glu Leu Gly His Lys Gly Ala Leu Tyr Pro Trp 405 410 415 Arg Thr Ile Asp Gly Pro Glu Cys Ser Ala Tyr Phe Pro Ala Gly Thr 420 425 430 Ala Gln Tyr His Ile Asn Ala Asp Ile Val Tyr Ala Leu Lys Arg Tyr 435 440 445 Val Glu Ala Thr Asn Asp Val Asp Phe Leu Tyr Asp Tyr Gly Cys Glu 450 455 460 Ile Leu Phe Glu Thr Ala Arg Phe Trp Glu Asp Leu Gly Ala Tyr Ile 465 470 475 480 Pro Leu Lys Gly Asn Lys Phe Cys Ile Asn Cys Val Thr Gly Pro Asp 485 490 495 Glu Tyr Thr Ala Leu Val Asp Asn Asn Ala Tyr Thr Asn Tyr Met Ala 500 505 510 Lys Met Asn Leu Glu Tyr Ala Tyr Asp Ile Ala Asn Lys Met Lys Lys 515 520 525 Glu Val Pro Gln Lys Tyr Gln Lys Val Ala Ser Lys Leu Asn Leu Lys 530 535 540 Asp Glu Glu Ile Val Ala Trp Lys Lys Ala Ala Asp Asn Met Tyr Leu 545 550 555 560 Pro Tyr Ser Lys Glu Leu Asp Ile Ile Pro Gln Asp Asp Ser Phe Leu 565 570 575 Tyr Lys Glu Arg Ile Thr Val Asp Glu Ile Pro Glu Asp Gln Phe Pro 580 585 590 Leu Leu Leu His Trp His Tyr Leu Asn Ile Tyr Arg Tyr Gln Ile Cys 595 600 605 Lys Gln Pro Asp Val Leu Leu Leu Met Phe Leu Gln Arg Glu Lys Phe 610 615 620 Thr Lys Asp Glu Leu Lys Lys Asn Tyr Asp Tyr Tyr Glu Pro Ile Thr 625 630 635 640 Thr His Asp Ser Ser Leu Ser Pro Ala Ile Phe Ser Ile Leu Ala Asn 645 650 655 Glu Ile Gly Tyr Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Tyr Phe Met Met Thr Ala 660 665 670 Arg Met Asp Leu Asp Asp Tyr Asn Asp Asn Val Lys Asp Gly Ile His 675 680 685 Ala Ala Ser Met Ala Gly Thr Trp Ser Ala Val Val Asn Gly Phe Gly 690 695 700 Gly Met Arg Val Tyr Thr Asn Glu Leu His Phe Glu Pro Arg Leu Pro 705 710 715 720 Lys Glu Trp Asn Leu Leu Ser Phe Asn Val Arg Tyr Lys Gly Arg Lys 725 730 735 Ile Asn Val Lys Leu Thr Lys Glu Asn Val Val Phe Ala Leu Leu Glu 740 745 750 Gly Glu Pro Ile Glu Ile Tyr Tyr Phe Asp Lys Lys Ile Leu Leu Glu 755 760 765 Lys Gly Glu Ile Lys 770

【０１２５】配列番号：5 配列の長さ：2319 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCCAACAAAA CGAAGAAACC AATTTACCCT TTTGAAGATT GGGTTATAAG AGAGACGCAG 60 TTTAGTATAG ATACTAACTA TAGAAATGAA ACTATTTTTA CTTTAGCAAA TGGATATATT 120 GGAATGAGAG GAACTTTTGA GGAAAGATAT TCAGGGCCTA AAAATACTTC TTTTAATGGG 180 ACGTATATCA ATGGGTTTTA TGAAATACAC GATATAGTTT ACCCTGAAGG GGGATATGGT 240 TTTGCAAAAA TAGGGCAGAC GATGCTAAAT GTTGCTGATA GCAAAATAAT AAAATTATAT 300 GTAGATGGGG AAGAGTTTGA TTTGTTACAA GGGAAAATCC TCTTTTATGA GAGAGTACTT 360 GACATGAAGA AAGGTTTTGT AGAAAGAAAA GTAAAATGGG AATCCCCTAC AGGAAAAATT 420 TTAGAGGTAA AAATAAAGAG AATTGTATCA TTAAATAGAC AACATTTAGC GGCGATTTCT 480 TTTACTATGC AACCTGTAAA TTTTACCGGA AAAATTAGAT TTGTTTCCGC TATTGACGGA 540 AATGTTTCAA ATATAAATGA TAGTGAAGAT GTAAGAGTAG GGTCAAATTT AAAAGGAAAG 600 GTTTTAAAGA CTATAGATAA AAGTGTAGAG GGTTTAAAAG GGTGGATTGT TCAAAAGACA 660 CAAAAGAGCA ATTTCTCCTA TGCTTGCGCG ATAGACAATG TATTAGTGGC AGATAGCAAA 720 TATGAAGTCT CAAATAGTTT AGAAGAAGAT GGAGTAAAAG TAATTGTAGA TCTAGAGGCT 780 GAAAAAGGCA CCTCATACAC TTTGAATAAA TTTATTTCCT ATTACACTTC AAAGGATTTT 840 GATGAAAATA AATTGGTTGC TCTTGCTTTA GAAGAAATAG AAAAAGCCAA AAATGACGGC 900 TTTGAAACGA TAGAAAAAGA GCAGGAAGAA TTTTTGAATT CTTTTTGGAA AGATGCTGAT 960 GTAATCATAG AAGGAGATAA AGCTCTGCAG CAAGGCATAC GCTTTAATGA ATTTCATCTA 1020 CTTCAATCTG TCGGAAGAGA TGGAAAGACA AATATTGCAG CAAAAGGGCT GACTGGAGGA 1080 GGTTATGAAG GCCATTATTT TTGGGATTCT GATATCTATA TAATGCCTTT CTTTCTTTAT 1140 ACAAAGCCTG AAATTGCAAA AGCTTTGGTA ATGTACAGGT ATAATCTTTT GGATGCAGCA 1200 AGATCCAGGG CAAAGGAATT AGGTCACAAA GGAGCTTTGT ATCCTTGGAG AACGATAGAT 1260 GGTCCTGAAT GTTCTGCTTA CTTTCCAGCT GGTACGGCAC AGTATCACAT AAATGCTGAT 1320 ATAGTTTATG CTTTGAAAAG ATATGTAGAA GCGACGAATG ACGTGGATTT TCTTTATGAC 1380 TACGGTTGTG AAATATTATT TGAAACTGCA AGATTTTGGG AAGATTTAGG AGCGTATATT 1440 CCTCTTAAGG GCAATAAATT CTGCATAAAC TGTGTCACTG GTCCGGATGA GTATACGGCA 1500 TTAGTTGACA ATAACGCTTA TACCAATTAT ATGGCGAAAA TGAATTTGGA ATATGCCTAT 1560 GACATTGCAA ACAAAATGAA AAAAGAAGTG CCTCAAAAAT ATCAAAAAGT CGCTTCTAAA 1620 CTAAATCTAA AGGATGAAGA AATTGTTGCG TGGAAAAAAG CTGCTGACAA TATGTACCTT 1680 CCTTATTCAA AAGAACTTGA TATTATACCA CAGGATGACA GTTTTTTGTA TAAAGAAAGG 1740 ATAACAGTGG ATGAAATACC TGAGGACCAA TTTCCACTTT TATTGCACTG GCATTACCTA 1800 AATATTTACA GATATCAAAT ATGCAAACAG CCTGATGTGT TGCTTTTGAT GTTTTTACAG 1860 AGAGAAAAAT TTACTAAAGA TGAACTTAAA AAGAATTACG ATTATTATGA ACCTATTACC 1920 ACTCACGACT CCTCCTTGTC GCCAGCTATA TTTAGCATAC TAGCCAATGA AATAGGATAT 1980 ACTGACAAGG CTTATAAATA CTTTATGATG ACTGCAAGAA TGGATTTGGA TGACTACAAT 2040 GACAATGTTA AGGACGGAAT TCACGCTGCT TCTATGGCAG GGACATGGAG CGCAGTTGTG 2100 AATGGTTTTG GTGGAATGAG GGTTTATACA AATGAACTGC ATTTTGAGCC GAGATTGCCA 2160 AAAGAATGGA ATTTGCTCTC TTTTAATGTG AGATACAAAG GGAGAAAAAT AAATGTCAAA 2220 TTAACCAAAG AAAATGTTGT GTTTGCATTA TTAGAAGGAG AGCCTATAGA AATCTACTAC 2280 TTTGACAAAA AAATTTTACT TGAAAAAGGA GAAATAAAG 2319

【０１２６】配列番号：6 配列の長さ：30 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント 配列 Ala Asn Lys Thr Lys Lys Pro Ile Tyr Pro Phe Glu Asp Trp Val Ile 1 5 10 15 Arg Glu Thr Gln Phe Ser Ile Asp Thr Asn Tyr Arg Asn Glu 20 25 30

【０１２７】配列番号：7 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Asn Tyr Asp Tyr Tyr Glu Pro Ile Thr Thr His Asp Ser Ser Leu 1 5 10 15

【０１２８】配列番号：8 配列の長さ：3345 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名：サーモアナエロビウム・ブロッキイ 株名：ＡＴＣＣ ３５０４７ 配列の特徴 特徴を表す記号：5' UTR 存在位置：1..595 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：596..2917 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：3'UTR 存在位置：2918..3345 特徴を決定した方法：E 配列 CTGACTGGAA TACACCTGTA GAATATCTTG CAAAAGAGAG CGTATATTTG GTTCAAAATT 60 GGCCGTACAC TGCAAACGTT CTTGTAGAGC AGTATGGAAA AAAGAACATT TTGGCATATC 120 ACGGATGGAC AGGTCCGGTT AAAGAGTCCC ACGTTTTGGG AGGAGAAGTT ATAGGAATAC 180 CAACTGGTGC ACCTAATAAA GAGATGGCTA TAAAGTTTAT GGAATACCTT ATGAGTAAAG 240 AAGTTCAAGA GAAACTTGTC ACTAAATTAG GATGGCCATC CATGAGAAGT GACGCTTATG 300 GGAAGGTTGC AGAGTGGCAA AAACCATATT TTGAAGCTAT AAATGAAGCG TTAAAACATG 360 CAGAACCAAG GCCAAACCTT GTATACTGGG CTGATGTGGA CAAAGCTATA AATGGAGCAT 420 TGAGAGAAAT AATATTTGAA GGCAAAGATA TCAAGACAAC TCTTGACAAA TATCACAACA 480 TGATAGAAGA AGCTAAGAAA GCTGCAGAAA GCAAGTAAAT GTTTTAAATT GTTTTAGTCG 540 GAAACGACTT TGTTTCCGAC TAAAATTTTG AATAAAGTAA GAGTGGAGGA TGGAT 595 ATG GCC AAC AAA ACG AAG AAA CCA ATT TAC CCT TTT GAA GAT TGG GTT 643 Met Ala Asn Lys Thr Lys Lys Pro Ile Tyr Pro Phe Glu Asp Trp Val 1 5 10 15 ATA AGA GAG ACG CAG TTT AGT ATA GAT ACT AAC TAT AGA AAT GAA ACT 691 Ile Arg Glu Thr Gln Phe Ser Ile Asp Thr Asn Tyr Arg Asn Glu Thr 20 25 30 ATT TTT ACT TTA GCA AAT GGA TAT ATT GGA ATG AGA GGA ACT TTT GAG 739 Ile Phe Thr Leu Ala Asn Gly Tyr Ile Gly Met Arg Gly Thr Phe Glu 35 40 45 GAA AGA TAT TCA GGG CCT AAA AAT ACT TCT TTT AAT GGG ACG TAT ATC 787 Glu Arg Tyr Ser Gly Pro Lys Asn Thr Ser Phe Asn Gly Thr Tyr Ile 50 55 60 AAT GGG TTT TAT GAA ATA CAC GAT ATA GTT TAC CCT GAA GGG GGA TAT 835 Asn Gly Phe Tyr Glu Ile His Asp Ile Val Tyr Pro Glu Gly Gly Tyr 65 70 75 80 GGT TTT GCA AAA ATA GGG CAG ACG ATG CTA AAT GTT GCT GAT AGC AAA 883 Gly Phe Ala Lys Ile Gly Gln Thr Met Leu Asn Val Ala Asp Ser Lys 85 90 95 ATA ATA AAA TTA TAT GTA GAT GGG GAA GAG TTT GAT TTG TTA CAA GGG 931 Ile Ile Lys Leu Tyr Val Asp Gly Glu Glu Phe Asp Leu Leu Gln Gly 100 105 110 AAA ATC CTC TTT TAT GAG AGA GTA CTT GAC ATG AAG AAA GGT TTT GTA 979 Lys Ile Leu Phe Tyr Glu Arg Val Leu Asp Met Lys Lys Gly Phe Val 115 120 125 GAA AGA AAA GTA AAA TGG GAA TCC CCT ACA GGA AAA ATT TTA GAG GTA 1027 Glu Arg Lys Val Lys Trp Glu Ser Pro Thr Gly Lys Ile Leu Glu Val 130 135 140 AAA ATA AAG AGA ATT GTA TCA TTA AAT AGA CAA CAT TTA GCG GCG ATT 1075 Lys Ile Lys Arg Ile Val Ser Leu Asn Arg Gln His Leu Ala Ala Ile 145 150 155 160 TCT TTT ACT ATG CAA CCT GTA AAT TTT ACC GGA AAA ATT AGA TTT GTT 1123 Ser Phe Thr Met Gln Pro Val Asn Phe Thr Gly Lys Ile Arg Phe Val 165 170 175 TCC GCT ATT GAC GGA AAT GTT TCA AAT ATA AAT GAT AGT GAA GAT GTA 1171 Ser Ala Ile Asp Gly Asn Val Ser Asn Ile Asn Asp Ser Glu Asp Val 180 185 190 AGA GTA GGG TCA AAT TTA AAA GGA AAG GTT TTA AAG ACT ATA GAT AAA 1219 Arg Val Gly Ser Asn Leu Lys Gly Lys Val Leu Lys Thr Ile Asp Lys 195 200 205 AGT GTA GAG GGT TTA AAA GGG TGG ATT GTT CAA AAG ACA CAA AAG AGC 1267 Ser Val Glu Gly Leu Lys Gly Trp Ile Val Gln Lys Thr Gln Lys Ser 210 215 220 AAT TTC TCC TAT GCT TGC GCG ATA GAC AAT GTA TTA GTG GCA GAT AGC 1315 Asn Phe Ser Tyr Ala Cys Ala Ile Asp Asn Val Leu Val Ala Asp Ser 225 230 235 240 AAA TAT GAA GTC TCA AAT AGT TTA GAA GAA GAT GGA GTA AAA GTA ATT 1363 Lys Tyr Glu Val Ser Asn Ser Leu Glu Glu Asp Gly Val Lys Val Ile 245 250 255 GTA GAT CTA GAG GCT GAA AAA GGC ACC TCA TAC ACT TTG AAT AAA TTT 1411 Val Asp Leu Glu Ala Glu Lys Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Phe 260 265 270 ATT TCC TAT TAC ACT TCA AAG GAT TTT GAT GAA AAT AAA TTG GTT GCT 1459 Ile Ser Tyr Tyr Thr Ser Lys Asp Phe Asp Glu Asn Lys Leu Val Ala 275 280 285 CTT GCT TTA GAA GAA ATA GAA AAA GCC AAA AAT GAC GGC TTT GAA ACG 1507 Leu Ala Leu Glu Glu Ile Glu Lys Ala Lys Asn Asp Gly Phe Glu Thr 290 295 300 ATA GAA AAA GAG CAG GAA GAA TTT TTG AAT TCT TTT TGG AAA GAT GCT 1555 Ile Glu Lys Glu Gln Glu Glu Phe Leu Asn Ser Phe Trp Lys Asp Ala 305 310 315 320 GAT GTA ATC ATA GAA GGA GAT AAA GCT CTG CAG CAA GGC ATA CGC TTT 1603 Asp Val Ile Ile Glu Gly Asp Lys Ala Leu Gln Gln Gly Ile Arg Phe 325 330 335 AAT GAA TTT CAT CTA CTT CAA TCT GTC GGA AGA GAT GGA AAG ACA AAT 1651 Asn Glu Phe His Leu Leu Gln Ser Val Gly Arg Asp Gly Lys Thr Asn 340 345 350 ATT GCA GCA AAA GGG CTG ACT GGA GGA GGT TAT GAA GGC CAT TAT TTT 1699 Ile Ala Ala Lys Gly Leu Thr Gly Gly Gly Tyr Glu Gly His Tyr Phe 355 360 365 TGG GAT TCT GAT ATC TAT ATA ATG CCT TTC TTT CTT TAT ACA AAG CCT 1747 Trp Asp Ser Asp Ile Tyr Ile Met Pro Phe Phe Leu Tyr Thr Lys Pro 370 375 380 GAA ATT GCA AAA GCT TTG GTA ATG TAC AGG TAT AAT CTT TTG GAT GCA 1795 Glu Ile Ala Lys Ala Leu Val Met Tyr Arg Tyr Asn Leu Leu Asp Ala 385 390 395 400 GCA AGA TCC AGG GCA AAG GAA TTA GGT CAC AAA GGA GCT TTG TAT CCT 1843 Ala Arg Ser Arg Ala Lys Glu Leu Gly His Lys Gly Ala Leu Tyr Pro 405 410 415 TGG AGA ACG ATA GAT GGT CCT GAA TGT TCT GCT TAC TTT CCA GCT GGT 1891 Trp Arg Thr Ile Asp Gly Pro Glu Cys Ser Ala Tyr Phe Pro Ala Gly 420 425 430 ACG GCA CAG TAT CAC ATA AAT GCT GAT ATA GTT TAT GCT TTG AAA AGA 1939 Thr Ala Gln Tyr His Ile Asn Ala Asp Ile Val Tyr Ala Leu Lys Arg 435 440 445 TAT GTA GAA GCG ACG AAT GAC GTG GAT TTT CTT TAT GAC TAC GGT TGT 1987 Tyr Val Glu Ala Thr Asn Asp Val Asp Phe Leu Tyr Asp Tyr Gly Cys 450 455 460 GAA ATA TTA TTT GAA ACT GCA AGA TTT TGG GAA GAT TTA GGA GCG TAT 2035 Glu Ile Leu Phe Glu Thr Ala Arg Phe Trp Glu Asp Leu Gly Ala Tyr 465 470 475 480 ATT CCT CTT AAG GGC AAT AAA TTC TGC ATA AAC TGT GTC ACT GGT CCG 2083 Ile Pro Leu Lys Gly Asn Lys Phe Cys Ile Asn Cys Val Thr Gly Pro 485 490 495 GAT GAG TAT ACG GCA TTA GTT GAC AAT AAC GCT TAT ACC AAT TAT ATG 2131 Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Val Asp Asn Asn Ala Tyr Thr Asn Tyr Met 500 505 510 GCG AAA ATG AAT TTG GAA TAT GCC TAT GAC ATT GCA AAC AAA ATG AAA 2179 Ala Lys Met Asn Leu Glu Tyr Ala Tyr Asp Ile Ala Asn Lys Met Lys 515 520 525 AAA GAA GTG CCT CAA AAA TAT CAA AAA GTC GCT TCT AAA CTA AAT CTA 2227 Lys Glu Val Pro Gln Lys Tyr Gln Lys Val Ala Ser Lys Leu Asn Leu 530 535 540 AAG GAT GAA GAA ATT GTT GCG TGG AAA AAA GCT GCT GAC AAT ATG TAC 2275 Lys Asp Glu Glu Ile Val Ala Trp Lys Lys Ala Ala Asp Asn Met Tyr 545 550 555 560 CTT CCT TAT TCA AAA GAA CTT GAT ATT ATA CCA CAG GAT GAC AGT TTT 2323 Leu Pro Tyr Ser Lys Glu Leu Asp Ile Ile Pro Gln Asp Asp Ser Phe 565 570 575 TTG TAT AAA GAA AGG ATA ACA GTG GAT GAA ATA CCT GAG GAC CAA TTT 2371 Leu Tyr Lys Glu Arg Ile Thr Val Asp Glu Ile Pro Glu Asp Gln Phe 580 585 590 CCA CTT TTA TTG CAC TGG CAT TAC CTA AAT ATT TAC AGA TAT CAA ATA 2419 Pro Leu Leu Leu His Trp His Tyr Leu Asn Ile Tyr Arg Tyr Gln Ile 595 600 605 TGC AAA CAG CCT GAT GTG TTG CTT TTG ATG TTT TTA CAG AGA GAA AAA 2467 Cys Lys Gln Pro Asp Val Leu Leu Leu Met Phe Leu Gln Arg Glu Lys 610 615 620 TTT ACT AAA GAT GAA CTT AAA AAG AAT TAC GAT TAT TAT GAA CCT ATT 2515 Phe Thr Lys Asp Glu Leu Lys Lys Asn Tyr Asp Tyr Tyr Glu Pro Ile 625 630 635 640 ACC ACT CAC GAC TCC TCC TTG TCG CCA GCT ATA TTT AGC ATA CTA GCC 2563 Thr Thr His Asp Ser Ser Leu Ser Pro Ala Ile Phe Ser Ile Leu Ala 645 650 655 AAT GAA ATA GGA TAT ACT GAC AAG GCT TAT AAA TAC TTT ATG ATG ACT 2611 Asn Glu Ile Gly Tyr Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Tyr Phe Met Met Thr 660 665 670 GCA AGA ATG GAT TTG GAT GAC TAC AAT GAC AAT GTT AAG GAC GGA ATT 2659 Ala Arg Met Asp Leu Asp Asp Tyr Asn Asp Asn Val Lys Asp Gly Ile 675 680 685 CAC GCT GCT TCT ATG GCA GGG ACA TGG AGC GCA GTT GTG AAT GGT TTT 2707 His Ala Ala Ser Met Ala Gly Thr Trp Ser Ala Val Val Asn Gly Phe 690 695 700 GGT GGA ATG AGG GTT TAT ACA AAT GAA CTG CAT TTT GAG CCG AGA TTG 2755 Gly Gly Met Arg Val Tyr Thr Asn Glu Leu His Phe Glu Pro Arg Leu 705 710 715 720 CCA AAA GAA TGG AAT TTG CTC TCT TTT AAT GTG AGA TAC AAA GGG AGA 2803 Pro Lys Glu Trp Asn Leu Leu Ser Phe Asn Val Arg Tyr Lys Gly Arg 725 730 735 AAA ATA AAT GTC AAA TTA ACC AAA GAA AAT GTT GTG TTT GCA TTA TTA 2851 Lys Ile Asn Val Lys Leu Thr Lys Glu Asn Val Val Phe Ala Leu Leu 740 745 750 GAA GGA GAG CCT ATA GAA ATC TAC TAC TTT GAC AAA AAA ATT TTA CTT 2899 Glu Gly Glu Pro Ile Glu Ile Tyr Tyr Phe Asp Lys Lys Ile Leu Leu 755 760 765 GAA AAA GGA GAA ATA AAG 2917 Glu Lys Gly Glu Ile Lys 770 TAGAAAGTCT CAAAAATTAA AGAAGTATGG AGCCATTGGC ACCATACTTC TTTAATTTTT 2977 TTATATGTCG TTACTTGAAA GGGTGAGTGA CCCGCCTCCT ACACTTAAAT CAAAGTAATA 3037 ATCTCCACTG CCTCGGAAGG AATATACTTT GATATAATAG GTTCCCGTTT GTGTTGGAAT 3097 GTATGTTATT GTCTCCTGCC TTTGTGTTCC AGTTGAACTT TTGACAAGAG TACCAGTTGG 3157 GTCATAGAGG TATATATCGA AATCAGGGTT ATAGTTTGCC CAATCAGGTA TTATGAAAGT 3217 TATTGCAATA GGATATGATG TGTCTGTCAC ATTAAATGTC CAAATGTCAC TGTAACGAGA 3277 CCCAGGAAGT GACTCTTTAG CATAATAGTG GTTTGGCGCA GATATATTAG TTCCTGTGAA 3337 ATTTCCAG 3345

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のトレハロースホスホリラーゼの酵素活
性に及ぼす温度の影響を示す図である。

【図２】本発明のトレハロースホスホリラーゼの酵素活
性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。

【図３】本発明のトレハロースホスホリラーゼの安定性
に及ぼす温度の影響を示す図である。

【図４】本発明のトレハロースホスホリラーゼの安定性
に及ぼすｐＨの影響を示す図である。

【図５】本発明の組換えＤＮＡの制限酵素地図を示す図
である。図中矢印は、本発明のトレハロースホスホリラ
ーゼをコードするＤＮＡを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/26 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｐ 19/00 Ｃ１２Ｐ 19/00 19/14 Ｚ 19/14 19/18 19/18 Ａ６１Ｋ 37/52 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無機リン酸及び／又はその塩の存在下で
   トレハロースを分解し、Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−
   グルコース−１リン酸及び／又はその塩を生成する作用
   を有するサーモアナエロビウム属に属する微生物から得
   ることのできるトレハロースホスホリラーゼ。
2. 【請求項２】 β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又
   はその塩とＤ−グルコースとから、トレハロースと無機
   リン酸及び／又はその塩を生成し、さらに、β−Ｄ−グ
   ルコース−１リン酸及び／又はその塩を糖供与体とし
   て、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する作用を有
   する、請求項１記載のトレハロースホスホリラーゼ。
3. 【請求項３】 下記の理化学的性質を有する請求項１又
   は２記載のトレハロースホスホリラーゼ。 （１） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８８，０００±５，０００
   ダルトン。 （２） 至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応で７０℃付近。 （３） 至適ｐＨ ６０℃、３０分間反応でｐＨ７．０乃至７．５付近。 （４） 温度安定性 ｐＨ７．０、１時間保持の条件で６０℃付近まで安定。 （５） ｐＨ安定性 ４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約６．０乃至９．０。
4. 【請求項４】 部分アミノ酸配列として配列表における
   配列番号１乃至３に示すアミノ酸配列の１又は複数を含
   む請求項１、２又は３記載のトレハロースホスホリラー
   ゼ。
5. 【請求項５】 配列表における配列番号４に記載のアミ
   ノ酸配列を含む請求項１、２、３又は４記載のトレハロ
   ースホスホリラーゼ。
6. 【請求項６】 遺伝子を発現させて得ることのできる請
   求項１、２、３、４又は５記載のトレハロースホスホリ
   ラーゼ。
7. 【請求項７】 請求項１乃至６記載のトレハロースホス
   ホリラーゼをコードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列表における配列番号５に記載の塩基
   配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列を含む請求項
   ７記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 遺伝子の縮重に基づき、コードするアミ
   ノ酸配列を変えることなく塩基の１又は複数を他の塩基
   で置換した請求項７又は８記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 自律複製可能なベクターに挿入された
    請求項７、８又は９記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 適宜の宿主に導入された請求項７、
    ８、９又は１０記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項１乃６記載のトレハロースホス
    ホリラーゼ産生能を有する微生物を栄養培地に培養し、
    培養物から産生したトレハロースホスホリラーゼを採取
    することを特徴とするトレハロースホスホリラーゼの製
    造方法。
13. 【請求項１３】 微生物がサーモアナエロビウム属に属
    する微生物である請求項１２記載のトレハロースホスホ
    リラーゼの製造方法。
14. 【請求項１４】 微生物がサーモアナエロビウム属に属
    するサーモアナエロビウム・ブロッキイである請求項１
    ２又は１３記載のトレハロースホスホリラーゼの製造方
    法。
15. 【請求項１５】 微生物が請求項１乃至６記載のトレハ
    ロースホスホリラーゼをコードするＤＮＡを適宜の宿主
    に導入してなる形質転換体である請求項１２、１３又は
    １４記載のトレハロースホスホリラーゼの製造方法。
16. 【請求項１６】 生成したトレハロースホスホリラーゼ
    を透析、塩析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロ
    マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着ク
    ロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相ク
    ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
    ー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取
    する請求項１２、１３、１４又は１５記載のトレハロー
    スホスホリラーゼの製造方法。
17. 【請求項１７】 請求項１乃至６記載のトレハロースホ
    スホリラーゼを、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／
    又はその塩とそれ以外の糖質とに作用させるＤ−グルコ
    シル転移糖含有糖質の製造方法。
18. 【請求項１８】 β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／
    又はその塩が、無機リン酸及び／又はその塩の存在下で
    トレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させ
    るか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でマ
    ルトースにマルトースホスホリラーゼを作用させるか、
    または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコージビ
    オースにコージビオースホスホリラーゼを作用させるこ
    とにより生成したものである請求項１７記載のグルコシ
    ル転移糖含有糖質の製造方法。
19. 【請求項１９】 それ以外の糖質が、Ｄ−キシロース、
    Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フコース及び
    Ｌ−フコースから選ばれる糖質である請求項１７又は１
    ８記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
20. 【請求項２０】 反応液中に生成及び／又は残存するグ
    ルコシル転移糖以外の夾雑糖質を除去する手段として、
    酵母発酵法及びカラムクロマトグラフィーから選ばれる
    方法を含む請求項１７、１８又は１９記載のグルコシル
    転移糖含有糖質の製造方法。
21. 【請求項２１】 請求項１乃至６記載のトレハロースホ
    スホリラーゼを無機リン酸及び／又はその塩の存在下で
    マルトースにマルトースホスホリラーゼとともに作用さ
    せるか、又は無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコ
    ージビオースにコージビオースホスホリラーゼとともに
    作用させることを特徴とするトレハロースの製造方法。
22. 【請求項２２】 請求項１７、１８、１９又は２０記載
    のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法によって製造さ
    れたグルコシル転移糖含有糖質。
23. 【請求項２３】 グルコシル転移糖が、グルコシルＤ−
    キシロシド、グルコシルＤ−ガラクトシド、トレハロー
    ス、グルコシルＤ−フコシド又はグルコシルＬ−フコシ
    ドである請求項２２記載のグルコシル転移糖含有糖質。
24. 【請求項２４】 請求項２２又は２３記載のグルコシル
    転移糖含有糖質を含有する組成物。
25. 【請求項２５】 組成物が、飲食物、化粧品、医薬品又
    は成形物であることを特徴とする請求項２４記載の組成
    物。