KR100407072B1 - 가잠을 이용한 애매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가잠을 이용한 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii) 인공재배 방법에 관한 것으로서, 야생에서 서식중인 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)를 채집·배양하여 확보한 균주를 살아있는 누에의 유충 또는 번데기에 분무접종하여 감염을 유발시킨 다음 감염된 번데기에서 자실체를 형성시키는 것을 특징으로 한다.

Description

가잠을 이용한 애매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법{Artificial cultivation of Isaria sinclairii using the silkworm}

본 발명은 가잠을 이용하여 동충하초를 인공재배 하는 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 살아있는 가잠의 유충 및 번데기에 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii) 균주를 접종하여 감염을 유발시킨 후 감염된 번데기에 자실체를 형성시켜 동충하초의 일종인 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)를 인공적으로 재배하는 방법에 관한 것이다.

동충하초란 겨울에는 벌레(蟲)상태로 있다가 여름이 되면 버섯(草)이 된다는 뜻에서 유래한 말로서 사상균의 일종인 동충하초균이 온·습도가 알맞는 시기에 곤충의 몸 속으로 들어가 발육·증식하면서 기주곤충을 죽이고 자실체를 형성시키는 일종의 약용버섯을 말한다.

동충하초의 종류는 전 세계적으로 약 300여종이 보고되고 있으며 기주곤충으로는 나비·나방류를 비롯한 매미, 개미, 벌, 잠자리, 풍뎅이, 노린재 등 거의 모든 종의 곤충이 해당된다. 그러나, 동충하초는 기주곤충에 대한 특이성이 있어 모든 종의 곤충에서 무조건 발생되는 것은 아니며 동충하초 종별로 여러 종의 곤충에서 발생하는 다범성 균이 있는 반면에 특정한 곤충에서만 발생하는 균도 있다. 감염 또는 자실체 발생시기도 동충하초 종에 따라 달라지는데 유충기, 번데기, 성충기 등 특정한 시기에만 발생되는 것이 있는가 하면 모든 시기에 고루 발생하는 것도 있다. 발생과정은 곤충표피에 부착된 포자가 균 특성에 알맞는 환경이 조성됐을 때 발아관을 내어 표피를 뚫고 몸안으로 들어가 균사로 증식되며 곤충을 죽인 다음 자실체를 형성하며 자실체에서 형성된 포자가 바람이나 충격에 의해서 다른 곤충의 표피에 부착됨으로서 새로운 세대가 반복되는 경피감염에 의하여 발생한다.

위와 같은 특성을 가진 동충하초는 여러 가지 질병에 대한 약리적 효능 때문에 많은 관심과 연구의 대상이 되고 있다. 동충하초에 관한 기록은 1082년 중국의 문헌 증류본초(證類本草)에서 찾아 볼 수 있으며 1727년 중국에 선교 온 프랑스 선교사 한 분이 시중에서 동충하초를 입수하여 본국에 송부·연구한 것을 과학아카데미에 발표함으로서 서양에 알려지게 되었고 그 후 1892년 쿡(Cook)이란 사람이 "Vegetable Wasps and Plant Worms" 라는 동충하초에 관한 저서를 출간하면서 많은 사람에 알려지게 됐다. 동충하초 중 대표적인 종은 중국의 티벳 지방에서 채취되는 중국동충하초(C.sinensis)로서 예로부터 불로장생의 비약으로 알려져 왔는바 본초비요, 본초강목, 본초종신 등 고의서에 보폐보신(보폐보신), 지혈화담(지혈화담),비정익기(비정익기) 등의 효능이 있는 것으로 기록돼 있으며 최근 연구결과에 의하면 면역기능을 강화시킴으로서 각종 종양과 바이러스 감염에 대한 저항력을 높이는 등의 효과가 있는 것으로 규명됐고 최근에는 중국의 지도자였던 등소평이 상복한 것으로 유명하다.

이러한 여러 가지 효능을 나타내는 동충하초는 세계적으로 300여종이 분포하고 있고 종별로 서로 상이한 효능을 나타내는 것으로 알려지고 있어 차세대 천연의약품 원료로 많은 기대를 모으고 있으나 다른 버섯이나 약용식물에 비해 크기가 작고 분포밀도도 낮아 야외 산속에서 발견 채취가 곤란하여 대중적인 수요는 물론이고 약효검색, 임상시험 등 각종 연구에 필요한 절대량 마저도 확보할 수 없는 문제점을 가지고 있다.

따라서 자연계에 서식하는 동충하초의 균주를 확보하여 이를 인공적으로 대량생산코자 하는 연구가 활발히 진행되고 있는바 그중 대표적인 동충하초로서 중국동충하초(C.sinensis), 눈꽃동충하초(P.japonica) 및 번데기동충하초(C.militaris)등이 있다. 중국동충하초(C.sinensis)는 박쥐나방과(Hepialidae)의 유충에서 발생하는 버섯으로서 아직까지 인공재배 방법이 개발되지 않아 인공배지에서 배양된 균사체가 주로 이용되고 있는 실정이며 눈꽃동충하초(P.japonica)와 번데기동충하초(C.militaris)는 인시목 곤충의 유충 및 번데기에서 발생하는 버섯으로서 살아있는 가잠 또는 작잠을 이용한 자연적인 재배방법과 죽은번데기 또는 곡립등의 인공배지를 이용한 재배방법이 개발되어 생산·판매되고 있다. 그 외에도 페실로마이세스속 균주 J300(P. sp J300), 페실로마이세스 파리노사(P. farinosa)등의 재배방법이 개발된 바 약리효능 및 성분검색 결과 상기 동충하초 종별 및 재배방법별로 효능과 성분이 다양한 것으로 규명돼 다양한 종의 동충하초 인공재배방법 개발을 통한 차세대 천연물 의약품 원료로서의 가능성을 확인하였다.

하지만 상기 동충하초 재배방법은 누에유충에 접종하더라도 번데기에서만 감염되고 상족후 번데기에 접종할 경우에는 감염율이 떨어지는 문제점이 있어 누에의 어느 시기에 접종하더라도 생산자가 원하는 시기에 최고의 감염율을 나타내는 동충하초 균주의 선발이 요청돼왔다.

본 발명자들은 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)의 균주(한국미생물보존센터에 기탁된 기탁번호(KCCM-10304))를 가잠의 유충 및 번데기에 접종하여 동충하초를 생산하는 방법을 연구하였는 바 본 균은 기주곤충이 애매미 유충으로서 가잠에 대한 인공재배 연구는 전무한 실정으로서 상기 목적 달성을 위한 재배기술을 개발하기 위하여는 본균의 누에에 대한 감염여부와 자실체 형성여부 확인을 거쳐 최적 접종시기, 접종농도, 접종 온·습도와 자실체 재배 최적기 및 재배온·습도 등의 조건을 규명함으로서 농가에서 대량생산이 가능토록 하는 것이 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제이다.

도 1은Isaria sinclairii의 접종시기별 감염누에 크기를 보인 것이며,

도 2는 본 발명 제품에 대한 사진이다.

본 발명에서 사용한 애매미유충눈꽃동충하초 균주는 우리나라 야산에서 채집한 야생 동충하초에 형성된 포자를 배양하여 얻은 것이다. 구체적으로 야생 동충하초에 형성된 포자를 PDA배지를 이용하여 순수분리한 다음 현미배지에 접종하여 20℃내외의 온도에서 15∼20일간 배양하여 분생포자를 형성시켜 사용하였다.

본발명에 따른 애매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법의 1단계는 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)의 포자를 살아있는 가잠의 유충 및 번데기 표피에 분무접종하여 균의 감염을 유도하는 것이다.

종균접종은 현미배지에서 배양한 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)의 포자를 물에 희석하여 10⁶/ml∼10⁸/ml의 농도로 맞춘 다음 분무기를 사용하여 살아있는 가잠의 2∼5령기 유충과 상족후6∼13일이 경과된 번데기 표피에 고루 살포함으로서 이뤄지게 되는데 이때 감염율 향상을 위해 누에사육이 가능한 온도범위에서 상대습도 95%정도에 12시간 동안 보호하는 것을 특징으로 한다.

유충기에 접종하였을 경우 접종후 표준 누에사육 온·습도에 준하여 1일에 2∼4회 급상하는바 접종일로부터 4∼6일경이면 대부분 감염되어 경화되고 번데기에 접종하였을 경우에도 접종후 표준온·습도에 4∼6일간 보호하면 대부분 감염되어 경화하는바 경화된 누에유충이나 번데기를 칼로 잘라보면 연황색의 동충하초 균사가 체내에 가득차 있는 것을 볼 수 있다.

인공재배의 2단계는 자실체 형성을 유도하기 위하여 감염된 번데기를 온도15∼25℃, 습도95% 조건에 보호하는 것을 특징으로 한다.

보호착수 3∼4일이 경과하면 번데기 표피에 흰색의 균사가 형성되며 자실체가 발아하기 시작하며 이로부터 20여일이 경과되면 평균 12mm크기로 자라게 되는데 이때가 수확적기로서 수확한 동충하초의 무게는 1개체당(감염 번데기+자실체) 1.3∼1.5g정도이다.

<실시예 1>

Isaria sinclairii의 최적감염조건 구명을 위해 공시누에품종으로서 나용계통(Nd×잠125)과 칠보잠을 사용하였다. 접종시기별 감염율 확인을 위해 각 2령기잠, 3령기잠, 4령기잠, 5령기잠, 5령3일, 5령5일차 누에유충과 상족 후 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 13일차 번데기를 공시하였으며 포자농도별 감염율 조사를 위하여 각 1.0×10⁶/ml, 1.0×10⁷/ml 및 1.0×10⁸/ml의 포자농도를 공시하였다. 또한 접종 후 보호조건별 감염율 확인을 위한 조건으로서 온도는 각 23℃와 28℃, 습도는 각 95%와 75%, 접종시간은 각 12시간과 24시간 조건에 보호하여 가잠에 대한 최적감염조건을 조사하였다.

그 결과 표 1에서 보는바와 같이 1.0×10⁸/ml농도로 포자를 희석 28℃, 95%의 온·습도 조건에 12시간 동안 보호한 다음 누에를 사육하였을 경우 2령기잠과 3령기잠 및 5령기잠 접종 시험구에서는 유충기때 100% 감염되었으며 4령기잠 접종 시험구에서는 유충기때 76%, 상족후 번데기때 6%로 총 82%가 감염되었고 상족후 7∼8일 경과한 번데기에 접종한 시험구에서는 100% 전량 감염되었다.

접종시기별 주 감염시기는 2령기잠 접종 시험구는 2면중, 3령기잠 접종 시험구는 3면중에 감염되었으며 4령기잠 접종시험구는 4면중인 4령4일∼5령1일, 5령기잠 접종시험구는 5령5일∼6일, 상족후 7∼8일차 번데기에 접종한 시험구는 접종 후 4∼5일경에 대부분이 감염되었다.

위와 같은 결과를 고려한 최적 접종시기는 2령∼4령기 누에유충에 접종할 경우 감염된 충체의 크기와 중량이 적게 나가는 관계로 비경제적이란 점을 고려할 때 5령기 누에유충 및 번데기 시기에 접종하는 것이 유리하다.

애매미유충눈꽃동충하초의 누에접종시기별 감염율

접 종 시 기	2령기잠	3령기잠	4령기잠	5령기잠	상족7∼8일차 번데기
감염율(%)	유충기때	100	100	76	100	-
	번데기때	-	-	6	-	100
	계	100	100	82	100	100

5령 누에에 대한 접종시기 및 포자농도별 감염율

접 종 시 기	5 령 기 잠	5 령 3 일	5 령 5 일
포자농도(/ml)	1.0×106	1.0×107	1.0×108	1.0×107	1.0×108	1.0×107	1.0×108
감염율(%)	유충기때	94	96	100	100	100	6	42
	번데기때	2	1	-	-	-	91	58
	계	96	97	100	100	100	97	100

접종후 종균이 발아관을 내어 누에에 감염되기에 적합한 환경 조건은 표 3에서 보는바와 같이 5령누에사육 적온인 23℃에서도 95%의 습도를 유지하며 12시간 동안 보호할 경우 감염이 양호함을 확인하였다.

5령 누에의 접종조건별 감염율

구 분	접종시기	공시 조건	감 염 율 (%)
			유충기 때	번데기 때	계
접종 온도별	5령기잠	23℃	100	-	100
		28℃	100	-	100
접종 습도별	5령5일	75%	7	60	67
		95%	14	86	100
접종 시간별	5령기잠	12hrs	100	-	100
		24hrs	100	-	100

감염된 충체에서 자실체를 발생시키기 위하여는 실시예 2에서 보는바와 같이 상족후 번데기때 접종하여할 필요성이 있는바 상족후 고치를 수견하여 25℃에 보호한 경우에는 상족후 10일차 이후 번데기에 접종하였을 경우 감염율이 크게 떨어져 대량사육시 농가현장에서 활용이 곤란한 문제점이 있는 바 표 4에서 보는바와 같이 고치를 20℃에 보관할 경우 상족후 10일이 경과하여도 97%라는 높은 감염율을 올릴 수 있음을 확인하였다.

상족후 경과기간 및 고치 보호온도별 감염율

상족후 경과기간	6일	7일	8일	9일	10일	13일
고치 보호온도별 감염율(%)	25℃	-	98	-	-	16	8
	20℃	100	100	100	99	97	-

<실시예 2>

감염된 누에 및 번데기를 이용하여 자실체를 발생시키기 위하여 재배온도별, 재배습도별, 발아시 조도별 및 재배대상별로 자실체 형성 여부와 자실체 형성 최적조건을 조사하였다.

재배온도별로는 15℃, 20℃, 25℃ 및 30℃의 정온조건과 감염누에의 변온조건을 주었을 경우 자실체 형성여부를 확인하기 위하여 1일 12시간 간격으로 18℃↔23℃(변온간격 : 5℃) 및 15℃↔25℃(변온간격 : 10℃)조건에 보호하였으며 재배습도별로는 70∼80%와 95%, 발이시 조도별로는 100Lux와 2,000Lux, 재배대상별로는 감염누에, 상족후 미화용된 감염번데기 및 화용된 감염번데기를 공시하였다.

그 결과 감염된 누에유충 및 미 화용된 번데기에서는 표 5와 표 6에서 보는바와 같이 모든 시험조건에서 균사 또는 분생포자만 발생하고 자실체가 전혀 발생되지 않았으며 특히 감염된 누에유충의 경우에는 충체속에 들어있는 잠분의 영향으로 표피에 균사가 발생하다 시일이 경과함에 따라 전량 부패한 반면 화용된 번데기에서는 표 6, 표 7에서 보는 바와 같이 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii) 고유의 자실체가 발생된 바 자실체 형성조건으로서는 20℃, 95%의 온·습도 조건에서 자실체 형성율이 가장 높았으며 형성된 자실체도 가장 왕성하게 생장하였다.

감염 누에 유충의 재배 온·습도 및 조도별 자실체 형성여부

재 배 온 도 (℃)	정 온 조 건	변 온 조 건
	18	23	28	18↔23	15↔25
재 배 습 도 (%)	95	75	95	95	95	95	95
발이시 조도(lux)	100	100	100	2,000	100	100	100
자실체 형성 여부	미형성	미형성	미형성	미형성	미형성	미형성	미형성

재배대상별 자실체 형성여부

재배대상	감염누에	감염번데기(미화용)	감염번데기(화용)
자실체 형성여부	미형성	미형성	형성

※ 재배온·습도 : 20℃, 95% o 발이시 조도 : 100lux 내외

감염 번데기의 재배온도별 자실체 형성율 및 생장량

재배온도(℃)	15	20	25	30
자실체 형성율(%)	67	99	62	-
개체당 자실체 수(개)	55	68	49	-
자실체 길이(mm)	3	12	8	-

본 발명에 따른 애매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법은 1단계로 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)의 포자를 살아있는 가잠의 유충 및 번데기 표피에 분무접종하여 균의 감염을 유도하는 것이고, 종균접종은 현미배지에서 배양한 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)의 포자를 물에 희석하여 10⁶ml∼10⁸/ml의 농도로 맞춘 다음 분무기를 사용하여 살아있는 가잠의 2∼5령기 유충과 상족후 6∼13일이 경과된 번데기 표피에 고루 살포함으로서 이뤄지게 되는데 이때 감염율 향상을 위해 누에사육이 가능한 온도범위에서 상대습도 95%정도에 12시간 동안 보호하고, 유충기에 접종하였을 경우 접종후 표준 누에사육 온·습도에 준하여 1일에 2∼4회 급상하는바 접종일로부터 4∼6일경이면 대부분 감염되어 경화되고 번데기에 접종하였을 경우에도 접종후 표준온·습도에 4∼6일간 보호하면 대부분 감염되어 경화하는바 경화된 누에유충이나 번데기를 칼로 잘라보면 연황색의 동충하초 균사가 체내에 가득차 있는 것을 볼 수 있으며, 인공재배의 2단계로 자실체 형성을 유도하기 위하여 감염된 번데기를 온도15∼25℃, 습도95% 조건에 보호하여, 보호착수 3∼4일이 경과하면 번데기 표피에 흰색의 균사가 형성되며 자실체가 발아하기 시작하며 이로부터 20여일이 경과되면 평균 12mm크기로 자라게 되는데 이때가 수확적기로서 수확한 동충하초의 무게는 1개체당(감염 번데기+자실체) 1.3∼1.5g정도이다.

Claims (4)

1. 애매미유충눈꽃동충하초(Isaria sinclairii) 균주의 포자를 살아있는 가잠의 유충 및 번데기에 분무접종하여 감염시키는 단계; 및

   상기 감염된 번데기로부터 자실체를 형성시키는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 애매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 균포자의 분무접종은 균포자를 물로 106/ml∼108/ml의 농도로 희석하여 2령, 3령, 4령, 5령기의 누에 유충과 번데기 표피에 살포한 후 습도 95%의 조건에 12시간동안 보호하여 감염을 유발시키는 것을 특징으로 하는 매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   번데기에 접종할 경우 분무접종하기 전 누에고치를 20℃이하 온도에 보호함으로서 감염율을 향상시키는 것을 특징으로 하는 애매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법.
4. 제 2 항에 있어서,

   감염된 번데기로부터 자실체를 형성시키는 조건은 온도 15∼25℃, 습도 95%임을 특징으로 하는 애매미유충눈꽃동충하초의 인공재배 방법.