JPH01104087A - 免疫抑制物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物を用いた免疫抑制物質、就中マイリオ
シンの新しい製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、微生物由来の免疫抑制物質はシリンドロカルボン
（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ　）属、トリボフラジ
ラム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ　）属またはフザリ
ウム（Ｆｕｓｅｒｒｕｍ　）属に属する免疫抑制物質生
産菌株を培養することにより製造できることが知られて
いる。特に、トリボフラジラム属から生産されるシクロ
スポリンは臓器移植の際の拒絶反応防止に広く用いられ
ている。

〔発明の目的〕

本発明者らは、このような事情に鑑み、免疫抑制物質の
生産菌を探索した結果、従来免疫抑制物・質を生産する
ことが知られていないある属に属する微生物から免疫抑
制物質生産菌を見出し、本発明に到達した。

〔発明の構成〕

すなわち、本発明の要旨はイザリア（ＩｓａｒＩａ　）
属に属する免疫抑制物質生産菌を培養し、培養物から免
疫抑制物質を採取することを特徴とする免疫抑制物質の
製造法に関する。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明方法で使用される微生物はイザリア属に属し、培
養物中に充分な景の免疫抑制物質を生産しうる能力を有
する免疫抑制物質生産菌である。

このような菌株としては、たとえば、イザリア属に属す
るシンクレイリー（５ｉｎｃｌａｉｒｉｉ　）菌が挙げ
られ、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ　）にｌ５ａｒｉａ　５ｉｎｃｌａｉ
ｒｉｉ　　ＡＴＣＣＮｏ、２４４００として寄託されて
いる。

本発明に用いる免疫抑制物質生産菌はこの菌株に限定さ
れるものではなく、たとえば、常用される紫外線、高周
波放射線、薬品などによる人工変異手段で変更された変
異株を含むことは勿論である。

本発明に用いる免疫抑制物質生産菌は通常のかび用栄養
源を含む種々の培養基で培養されうる。

たとえば、炭素源としてグルコース、澱粉、グリセリン
、糖水あめ、デキストリン、糖蜜、マルトースなど、お
よび窒素源としてコーンステイープリカー、ペプトン、
イーストエキス、ジャガイモ煎汁、肉汁、大豆粉、小麦
胚芽、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウ
ム、アミノ酸などがあげられ、その他通常の無機塩およ
び面の発育を助け、免疫抑制物質の生産を促進する有機
および無機物や消泡剤などの培養に常用される添加剤を
適当に加えることができる。

培養法は特に限定されるものではないが、好気的な深部
培養法が適している。培養に適当な温度は２０〜３５℃
、好適には２５〜３０℃で培養する。

本発明方法により培養物中に生産された免疫抑制物質は
抽出、吸着など常用される操作を必要に応じて適宜組み
合わせ、培養物中より取り出される。たとえば、培養液
から菌体などの不溶物を濾過、遠心分離などの方法で分
離し、培養濾液をアンバーライトＸＡＤ−２に通液させ
、免疫抑制物質を吸着させることによって取り出される
。かくして得られた免疫抑制物質をさらに、たとえば、
メタノールで溶出させ、溶出部を更に逆相クロマトグラ
フィーにかけて、分画することによって免疫抑制物質の
高度精製物が得られる。

か（して得られた高度精製免疫抑制物質は、ミリオコツ
カム−アルボミセス（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍａｌｂｏ
ｓｙｃｅｓ　）およびマイセリア・ステリリア（Ｍｙｃ
ｅｌｉａ　５ｔｅｒｉｌｉａ）等の菌からも産生される
マイリオシン（Ｍｙｏｒｉｃｉｎ）、別名サーモフィモ
シディン（Ｔｈｅｒ＋ＩＩｏｐｙ＋ｗｏｃｉｄｉｎ　）
　Ｃ米国特許第３，９２８，５７２号明細書参照〕であ
ることを、ＮＭＲ，紫−外線吸収スペクトル、赤外線吸
収スペクトル、マス分析等より推認した。この物質もま
た強い免疫抑制活性を持つものである。

〔作用〕

本発明により、生産される免疫抑制物質は優れた免疫抑
制作用を示しヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウス、ラット
などの哺乳動物に対して、たとえば臓器や骨髄移植の際
の拒絶反応の抑制剤やエリテマトーデス、関節リウマチ
、アレルギーなどの自己免疫疾患またはリンパ球増殖異
常に基づく疾患などにおける予防または治療剤として、
あるいは医学・薬学における試薬として用いることがで
きる。

上記医薬として、本発明の免疫抑制物質を用いる場合に
は担体、賦形剤、希釈剤などと混合して散剤、カプセル
剤、錠剤、注射剤などに製剤化して患者に投与すること
ができる。また、凍結乾燥させてもよい。

その投与量は、疾患、症状、体重、性別、年令などによ
って変わりうるが、たとえば腎移植における拒否反応の
抑制には通常、成人１日当たり０．１〜１０■（力価）
を１日１〜数回に分けて投与される。

〔実施例〕

以ｆに実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例により
何等の限定も受けるものではない。

なお、免疫抑制物質の活性測定は、下記の方法で行なっ
た。

免疫抑制物質の活性測定法としては、マウス、ラットあ
るいはヒトのリンパ球を用いた種々の免疫反応を用いる
ことができるが、たとえば、本発明の免疫抑制物質は、
マウス、ラット、ヒトの同種リンパ球混合反応（同種Ｍ
ＬＲ）を用いることにより、感度よ（測定できる。同種
ＭＬＲとは、同種でしかも主要組繊適合性抗原が異なる
２個体由来のリンパ球、たとえば、肺細胞、リンパ節細
胞、末梢血リンパ球などを混合培養することによって誘
導されるリンパ球の幼若化反応である。この同種ＭＬＲ
は、リンパ球の供与者間の主要組繊適合性抗原の違いを
反映し、誘導される現象でありたとえば、−卵性双生児
のリンパ球の混合培養によるリンパ球の幼若化現象は認
められない、そこで、同種ＭＬＲはたとえば、臓器移植
における供与者−受容者の選択に広く用いられている方
法である。

通常、同種ＭＬＲを行なう場合には、一方のリンパ球を
Ｘ線照射あるいはマイトマイシンＣ処理などを行なうこ
とによって、分裂増殖を阻止した状態で刺激細胞として
用い、他方のリンパ球（反応細胞）の幼若化反応を測定
する方法（ｏｎｅ　ｓａｙ−ＭＬＲ”）を用いることが
できる。

さらに、本発明の免疫抑制物質の活性は、同種ＭＬＲの
際に誘導される主要組織適合性抗原拘束性を有する細胞
障害性Ｔ細胞の誘導を抑制する活性としても測定するこ
とができる。

また、本発明の免疫抑制物質の活性は、同種ＭＬＲの他
に、種々のマイトジェン（コンカナバリンＡ１フイトヘ
マグルチニン、ホークライードマイトジェンなど）の刺
激により誘導されるリンパ球の幼若化反応を抑制する活
性、または、Ｔ細胞、Ｂ細胞などのリンパ球の分裂増殖
を増強もしくは分化を促進する活性を有するようなサイ
トカイン（インターロイキン１．２．３．４．５．６な
ど）により誘導されるリンパ球の分裂増殖反応、または
機能の誘導活性を抑制する活性としても評価することが
できる。さらにこれらサイトカインのＴ細胞、マクロフ
ァージなどからの産生を抑制する活性として評価するこ
とが可能である。

さらに、本発明の免疫抑制物質はマウスなどに腹腔内、
経口、静脈内または皮肉投与をすることによって、たと
えば、異種赤血球などであらかじめ免疫されたマウスの
牌細胞内に誘導される抗異種赤血球抗体を産生ずる形質
細胞の誘導を抑制する活性、または同種マウスの皮膚移
植によりＭ’Ａされる移植片対借主反応、あるいは遅延
型アレルギー、アジュバント関節炎などを抑制する活性
としても評価することができる。

また、自己免疫疾患のモデルマウスであるＭＲＬ／ｆｐ
ｒ＋７ウス、ＮＺＢ／ＷＦ、マウス、ＢＸＳＢマウスな
どに本発明の免疫抑制物質を投与することにより、たと
えば、抗ＤＮＡ抗体の産生、リウマチ因子の産生、腎炎
、リンパ球の増殖異常などの抑制活性あるいは延命効果
としても評価することができる。

〔実施例〕

実施例゛１　（シンクレイリー菌株のジャー培養）ＧＰ
Ｙ培地（１２あたり、グリコース３０ｇ。

ペプトン５ｇ、酵母エキス３　ｇ、　Ｋｌ、ＰＯａ　　
Ｏ，３ｇ、ＫＺＨＰＯａ　　０．３ｇ、ＭｇＳＯ４・７
ＨＲ００，３ｇ、ｐＨ５，５）を５００Ｉｌｄ！容首長
振盪フラスコ２本に１００ｄずつ分注し、１２１°Ｃｌ
２Ｏ分間オートクレーブで滅菌後、ポテトデキストロー
ス寒天培地上で成育したイザリア・シンクレイリーＡＴ
ＣＣＮｏ、２４４００の菌糸体の約１　ｃ４を各フラス
コに接種し、２５℃、６日間往復振盪培４％（１４５ｒ
ｐｍＳ振復巾８ｃｍ）を行なった。得られた培養液を種
母として上記の　　　　　　　゛ＧＰＹ培地５Ｉｌを仕
込んだ１０ｆｆｉ容ジヤーフアーメンタに接種し、２５
℃、ｌＯ日日間通気攪拌培養（ＩＶＶＭ、３００ｒｐｍ
）を行なった。

実施例２（シンクレイリー菌の培養液からの免疫抑制物
質の採取） 実施例１で得られた培養液４．５ｊ！から濾過により菌
体および不溶物を除き、培養濾液４．０２を得た。得ら
れた培養濾液をアンバーライトＸＡＤ−２（φ４０＋ｍ
５Ｘ７５０閣）に通液し、免疫抑制物質を吸着させた。

さらに水４１を通液し洗浄した。

その後メタノール６１を通液し、免疫抑制物質を溶出さ
せた。これを減圧−縮後、酢酸エチル２０〇−に溶解し
、水２００ａｄで３回分液漏斗にて抽出した。

水抽出部および酢酸エチル部それぞれを減圧濃縮後、凍
結乾燥して免疫抑制物１！２．２３ｇおよび０、３４　
ｇをそれぞれ得た。

実施例３（マイリオシンの採取） 実施例２で得られた水抽出部を凍結乾燥して得られた免
疫抑制物’！２．２３ｇを５ｄの水で溶解し、逆相クロ
マトグラフィー（ＯＤＳ　　ＤＭ−１０２０７フジーデ
ビソン　ケミカル社製）カラム（φ３０ｍｍＸ　ｈ　８
５　ｍ）にかけた、水にて溶出を開始し、漸次メタノー
ルの濃度を上げながら溶出し、分画を行なった。７０％
メタノール溶出部を減圧上濃縮乾固した後、少量の熱メ
タノールに溶解し、放冷によりマイリオシンの結晶を析
出させた０本析出結晶を再度熱メタノールに溶かし、再
結晶操作を行ない純粋なマイリオシン４０■を得た。

〔実験例〕

実験例１　（採取免疫抑制物質の免疫抑制作用の測定） 本発明の免疫抑制物質の活性の測定は、マウス同種リン
パ球混合反応（以下、ＭＬＲと称することもある。）を
用いて行なった。マウス同種ＭＬＲは、反応細胞として
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（Ｈ−２−）の牌細胞を
、刺激細胞としてＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２’）のマウス
牌細胞をマイトマイシンＣ処理したものを用い、等比で
混合培養することによって行なった。

反応細胞の調製法としては、以下の方法で行なった。５
〜６週齢の雄性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスより肺臓
を摘出し、熱不活化牛胎児血清（以下、Ｆｅ２と称する
こともある。）を５％添加したＲＰＭ１１６４０培地（
硫酸カナマイシン６０μｇ／ｒｒｌｌ、Ｌ−グルタミン
２ｍＭ５Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−
２−エタンスルホネート（ＨＥＰＥＳ）１０ｍＭ、０．
１％炭酸水素ナトリウム含有）を用いて、牌細胞の単細
胞浮遊液を得た。

瀉血処理後、１０−’Ｍ２−メルカプトエタノールおよ
び２０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、
１０″個／ｄに調製し、反応細胞浮遊液として用いた。

刺激細胞の調製法は以下の方法で行なった。５〜６週齢
の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスより肺臓を摘出し、ＲＰＭ
１１６４０培地を用いて牌細胞の単細胞浮遊液を得た。

溶血処理後、４０μｇ／ｄマイトマイシンＣで３７℃、
６０分間の処理を行なった。３回洗浄後、１０−’Ｍ２
−メルカプトエタノールおよび２０％ＦＣ３を含むＲＰ
Ｍ１１６４０培地を用いて、１０７個／＃２ｅに調製し
、刺激細胞浮遊液として用いカ。

上述した方法により調製した反応細胞浮遊液５０μｌと
刺激細胞浮遊液５０μｌおよび被検体液１００μｌとを
、９６六マイクロテストプレートに加え、３７℃で５％
炭酸ガスの条件下で４日間培養を行なった。

リンパ球の幼若化反応の測定方法としては、ＭＴＴ　（
Ｃ３（４、５−ｄｉａ＋ｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２
−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌ
ｉｕｓ　ｂｒｏｍｉｄｅ）　）を用いる色素定量法およ
び３Ｈ−チミジンの取り込みを指標とする方法を用いた
。

１）ＭＴＴを用いる色素定量法 培養終了後、各ｗｅｌｌの上清１００μｌを除去し、５
ｍｇ／ｄ　　ＭＴＴ溶液を２０ａ１．ずつ各−ａｌｌに
添加し、４時間、３７°Ｃでインキュベートした。その
後、１０％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．０１規定
塩酸溶液１００．Ｎを加え、−晩３７℃でインキュベー
トし、形成された紫色のホルマザンの結晶を溶解させ、
マイクロプレート吸光光度計を用いて５５０ｎｍにおけ
る吸光度を測定し、マウス同種ＭＬＲのリンパ球幼若化
反応の指標とした。

マウス同種ＭＬＲの抑制は以下の式により抑制率を算出
することにより評価した。

２）３Ｈチミジン取り込みを指標とする方法培養終了後
に、１Ｈチミジン０．５μＣｉ／ｗｅ１１を添加し、４
時間培養後、セルハーベスタ−にて細胞を収集し、細胞
内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーシッンカウ
ンターにて測定し、マウス同種ＭＬＲのリンパ球幼若化
の指標とした。マウス同種ＭＬＲの抑制は、以下の式に
より抑制率を算出し評価した。

〔以下余白］ 本発明の免疫抑制物質はメタノール、に懸湯後、ＲＰＭ
１１６４０培地で希釈し、１０および１μｇ　／　ｒｄ
の最後濃度で用いた。なお、メタノールは、最終濃度が
０．１％以下で用い、この場合には、同種ＭＬＲに全く
影響が認められなかった。

本発明の免疫抑制物質（水抽出画分および酢酸エチル抽
出画分）について、１０μｇ　／　ｍｌから１０−’μ
ｇ　／　ｒｔｄｌの範囲の最後濃度で、マウス同種ＭＬ
Ｒにおけるリンパ球幼若化反応の抑制活性を測定した結
、果、第１表に示すように、本発明の免疫抑制物質（酢
酸エチル抽出）のマウス同種ＭＬＲを５０％抑制する濃
度（ＩＣｓｏ）は１．６　ｘｌｏ−’μｇ／ｍ１であり
、水抽出の免疫抑制物質のＩＣｓ。は２．５×１０−１
μｇ／ｍｌであることが明らかとなった。

一方、これらの免疫抑制物質は、１０ＩＩｇ／ｉｄの濃
度でも、マウスＬ９２９ＩＥｌ胞などに対する細胞毒性
は認められなかった（ＩＣ３゜は５０μｇ７’ｍｌ〔以
下余白〕 実験例２（マイリオシンの免疫抑制作用の測定）実施例
１と同様にしてマイリオシンの免疫抑制作用を３Ｈ−チ
ミジン取り込みを指標とする方法により測定し、その結
果を第２表に示した。なお、マイリオシンはメタノール
に懸湯した。また、メタノールの最終濃度は０．０５％
以下で用い、この場合には同種ＭＬＲに全く影響が認め
られなかった。

第２表に示した結果に基づきマイリオシンのマウス同種
ＭＬＲに対するＩＣ，。値はシクロスポリンＡの１０−
”以下であることが明らかとなった。

〔以下余白］ 実験例：（（マイトジェン刺激によるマウス牌細胞幼若
化反応の抑制効果） フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）またはホークライー
ドマイトジェン（ＰＷＭ）刺激によるマウス牌細胞幼若
化反応に対する効果の試験は、以下の方法で行なった。

５〜８週齢の雄性Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスより肺
臓を摘出し、５％熱不活化牛脂児血清を添加したＲＰＭ
１１６４０培地を用いて肺細胞の単細胞浮遊液を得た。

溶血処理後、１０−’Ｍ２−メルカプトエタノールおよ
び２０％０％熱不活化牛脂清を含むＲＰＭ１１６４０培
地を用いて５ｘｌＯ’／ｄに調製しＰＨＡまたはＰＷＭ
を添加した。この細胞浮遊液１００μｌをあらかじめ被
検液１００μｌを入れておいた９６六マイクロテストプ
レートの各ウェルに加えたくマウス牌細胞の数は５Ｘ１
０’個／ウェルである）、３７℃、５％炭酸ガス条件下
で７２時間培養した後、３Ｈ−チミジン０，５μＣｉ／
ウエルを加え１．同条件下でさらに４時間培養した。墳
養終了後、セルハーベスタ−を用いて細胞を回収し、細
胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカ
ウンターにて測定し、マウス牌細胞幼若化反応の指標と
した。その結果を第３表に示す。

〔以下余白〕

第３表から明らかなように本発明の免疫抑制物質は同物
質を含まない対照に比して、ｌ−’ＨＡあるいはＰＷＭ
によって誘導される３１１−チミジン取り込みを強く抑
制した。

実験例４　（ラット肺細胞コンカナバＪンＡ　（Ｃｏｎ
Ａ）刺激培養上清のインターロイキン２（ＩＬ２）によ
り誘導されるＩＬ２依 存性マウス細胞株、ＣＴＬＬ−２の ３Ｈ−チミジン取り込みに対する抑制 効果） ＩＬ２依存性マウス細胞株ＣＴＬＬ−２を３０％牛脂児
血清を含むＲＰＭ１１６４０培地にて２×１０Ｓ個／ｄ
に調製した。この細胞浮遊液５０μｌと、ＩＬ２を含む
ラット牌細胞Ｃｏｎ　Ａ刺激培養上清５０μｌをあらか
じめ被検液１００μ２を入れておいた９６六マイクロテ
ストプレートの各ウェルに加えた。３７℃、５％炭酸ガ
ス条件下で２０．４４および６８８時間培養た後、３Ｈ
−チミジン０．５μＣｉ／ウエルを加え、さらに同条件
下で４時間培養した。培養終了後、セルハーベスタ−を
用いて細胞を回収し、細胞内に取り込まれた放射活性を
液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。そ
の結果を第４表に示す。

ｃ以下余白〕 第４表から明らかなように、本発明の免疫抑制物質は、
ＩＬ２により誘導されるＣＴＬＬ−２細胞の３Ｈ−チミ
ジン取り込みの上昇を強く抑制した。

実験例５（マウス同種リンパ球混合培養（ＭＬＣ）にお
けるＩＬ２産生に対する抑制効果）マウス同種ＭＬＣは
次のように行なった。すなわち、実験例１と同様に調製
された反応細胞浮遊液および刺激細胞浮遊液をそれぞれ
０．５　Ｉｄずつ、あらかじめ被検液１Ｉ１１を入れて
おいた２４穴マルチデイツシユに加え、３７℃、５％炭
酸ガス条件下で３日間培養した。培養終了後、上清を回
収してマウス同種ＭＬＣの上清とした。

マウス同種ＭＬＣの上清中のＩＬ２活性の測定は次のよ
うに行なった。すなわち、ＩＬ２依存性マウス細胞株Ｃ
ＴＬＬ−２を３０％熱不活化生胎児血清を含むＲＰ　Ｍ
　Ｉ　１６４０培地にて１０’個／Ｉｄに調製し、あら
かじめ上記ＭＬＣの上清を１００μｌ入れておいた９６
六マイクロテストプレートの各ウェルに１００ｐｌずつ
加えた。３７°Ｃ，５％炭酸ガス条件下で２０時間培養
した後、ａＨ−チミジン０．５μＣｉ／ウエルを加え、
さらに同条件下で４時間培養した。培養終了後、セルハ
ーベスタ−を用いて細胞を回収し、細胞内に取り込まれ
た放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて
測定し、ｌＬ２活性の指標とした。その結果を第５表に
示す。

〔以下余白〕

第５表に示したように本発明の免疫抑制物質は　　　ｔ
マウス同種Ｍ　Ｌ　ＣにおけるＩＬ２産生を抑制する　
　　°（ことが示唆された。　　　　　　　　　　　　
　　　　づ実験例６（マウス同種リンパ球混合培養（Ｍ
ＬＣ）　　　／により誘導される同種細胞障害性Ｔ細 胞に対する抑制効果）　　　　　　　　　　２実験例１
と同様の方法にて調製したＢＡＬＢ／　　　　１ｃマウ
ス（Ｈ−２’　）肺細胞浮遊液（２ｘｌｏ’　　　　ｂ
個／ｍｌ）　０．５　ｍｌと、マイトマイシンＣ処理し
たＣｔ＋１５７　Ｂ　Ｌ／６マウス（Ｈ−２’　）肺細
胞浮遊液（２Ｘ゛１０’個／成）０．５ｔｅおよび被検
体１．０戚を２４穴マルチデイツシユに加え、３７°Ｃ
で５％炭酸ガスの条件下で６日間培養を行なった。

培養終了後、遠心により細胞を回収し、１０％　　　胴
ＦＣ３を含むＲＰＭ［１６４０培地にて５Ｘ１０”　　
　ｍ〜６．２５Ｘ１０’個／Ｉｄに調製し、奏効細胞と
し　　　しで用いた。！： 標的細胞としては、刺激細胞と同系（Ｈ−２″′）−の
Ｃ５７Ｂ　Ｌ／ｂマウス由来由来白絹病細胞Ｌｄ　　　
　力を用いた。ＥＬ４細胞ｌＯ″個を１００μＣｉのＪ
ａ！”Ｃｒ０ｎ　（１ｍｃ　ｉ／Ｉｄ）を用いて、３７
：にて１時間インキエベートすることによりＳＩＣ。

ト細胞質内に取り込ませた後、洗浄し、１０４個’ｔｔ
ｒｌに調製し、標的細胞として用いた。

細胞障害活性の測定は、奏効細胞浮遊液０．１　ｄヒ、
標的細胞浮遊液０．１　ｍを、９６穴平底プレー−に加
え、３７°Ｃにて４時間培養した後、上清中＝放出され
る”Ｃｒ量を測定し、以下の式により■胞障害活性を算
出した。

なお、上記方法により誘導された細胞障害性Ｔ田胞は、
刺激細胞（Ｈ−２’　）と同系のＥＬ４細η（Ｈ−２’
）に対しては強い細胞障害活性を示７たが、異系のＭｅ
ｔｈ　Ａ細胞（Ｈ−２’　）に対してｔ全く細胞障害活
性を示さなかったことから、Ｈ−２″′拘束性の同種細
胞障害性Ｔ細胞であること１＜示唆された。

本発明の免疫抑制物質を０．０１〜１μｇ　／　ｍｌの
濃度で添加し、同種細胞障害性Ｔ細胞の誘導に対する影
舌を検討した結果、第６表に示す様に、細胞障害活性が
ほとんど認められず、本発明の免疫抑制物質によって、
同種細胞障害性Ｔ細胞の誘導は著しく抑制された。

〔以下余白〕

実験例７（インターロイキン３　（ＩＬ３）により誘導
されるＩＬ３依存性マウス細胞株 ＦＤＣＰ２の増殖に対する抑制効果） ＩＬ３依存性マウス細胞株ＦＤＣＰ２を１０％牛脂児血
清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２×１０５個／ｄに
調製した。この細胞浮遊液１００μ２とＩＬ３を含むマ
ウス白血病細胞ＷＥＨＩ３培養上清５０μｌを、あらか
じめ被検体１００μ！を入れておいた９６穴マイクロテ
ストプレートの各ウェルに添加し、３７゛Ｃにて５％炭
酸ガスの条件下で２０時間培養した。培養終了後、ｉＨ
−チミジン０．５μＣ４／ウエルを加え、さらに同条件
下で４時間培養した後、セルハーベスタ−により細胞を
回収し細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレー
シゴンカウンターを用いて測定し、ＩＬ３依存性増殖の
指標とした。

第７表に示したように、本発明の免疫抑制物質は、ＩＬ
３により誘導されるＦＤＣＰ　２細胞の５）ｌ−チミジ
ン取り込みの上昇を（１μｇ／ｄの濃度で約６０％程度
）抑制することから、ＩＬ３依存性の増殖を抑制する活
性を本発明の免疫抑制物質は有していることが示唆され
た。

第７表 −−−１７１９±４３９− ＋　　　　、−−１６２１１±６２９−＋　　免疫抑制
物質　　　１０　２１７９±１９７　　９６．８＋　　
免疫抑制物質　　　１　７０８２±３５０　　６３．０
＋　　免疫抑制物質　　０．１　１１５２６±１５０　
　３２．３＋　　免疫抑制物質　　０．０１　１１８３
８±３７８　　３０．２（表中、「＋」はＩＬ３存在を
、「−」はＩＬ３非存在を意味する。） 実験例８（マウス脚線細胞のインターロイキン１（ＩＬ
Ｉ）応答に対する抑制効果） 雄性７週齢Ｃ３Ｈ／Ｈ□Ｎマウスより胸腺を摘出し、無
血清ＲＰＭ１１６４０培地を用いて単一細胞浮遊液とし
た。同培地で３回洗浄した後、２０％牛胎児血清ｓｘ　
ｌＯ−’Ｍ／２−メルカプトエタノール、２ＸＩＯ−３
Ｍ／ｌ、−グルタミン、＋ｘｉｏ−’Ｍピルビン酸ナト
リウムフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ、ウェルカム社
、ＨＡ１６／１７）１Ｈｇ／ｄおよびヒト・ウルトラピ
エアー・インターロイキン１（ゲンザイム社ＧＵＰｉ−
１）２単位／ｄを含むＲＰＭ１１６４０培地中に１．５
Ｘ１０−’細胞／　ｍｆｌの濃度で浮遊させた。この細
胞浮遊液１００μｌと本発明の免疫抑制物質またはサイ
クロスポリンＡを含む溶液１００μｌとを９６ウエル平
底マイクロテストプレートの各ウェル中で混合し、３７
°Ｃ１５％炭酸ガス条件下で６６時間培養した後、３Ｈ
−チミジンを０．５μＣ４／ウエル加えさらに６時間培
養した。培養終了後、マルチプル・セル・バーヘスター
を用いて各ウェルの細胞をフィルター上に回収し、細胞
中に取り込まれた放射活性をトルエンベースシンナレー
ターを用いた液体シンチレーション法により測定した。

上述の方法により得られた結果を第８表に示す。

表中、ＳＤは標準偏差を表わす、また、抑制率（％）は
以下の式により算出した。

抑制率（％）＝ 第８表 −−１３８９±　４２− ＰＨＡ　　　　　−３２７０±　３１６−ＰＩ（へ十Ｉ
ＬＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１８０
３　　±　１７４０　　　　　　　　０÷免疫抑制物質 ２　　　　　３９７３±　３９　　　９１．８０．２　
　　　４６４６±　８２６　　　８３．９第８表に示し
た様に、本発明の免疫抑制物質は、製炭依存的なＩＬＩ
応答抑制作用を示した。

実験例９（マウス肺臓細胞のインターロイキン６（ＩＬ
６）応答に対する抑制効果） 雄性８週齢Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスより肺臓を摘
出し無血清ＲＰＭ１１６４０培地を用いて単一細胞浮遊
液を得た後、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）により細胞
塊を形成させた。これに０．１６　Ｍ塩化アンモニウム
溶液と０．１７　Ｍ　トリス溶液（ｐＨ７，６５）を９
対１の比率で混合した溶液を加えることにより赤血球を
溶解させた後、無血清ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地で３
回洗浄した。得られた細胞を２０％牛脂児血清、５　Ｘ
　１０−’Ｍ／２−メルカプトエタノール、２ｘ　１０
−３Ｍ／Ｌ−グルタミニ／ｌＸｌ０−”Ｍピルビン酸ナ
トリウムおよびインターロイキン６の供給源としての７
２４ヒト膀胱癌細胞株培養上清２５％ヲ含ムＲＰ　Ｍ　
１１６４０培地中に５ＸＩＯ’ｍ胞／ｄの濃度で浮遊さ
せた。この細胞浮遊液１００μ２と本発明の免疫抑制物
質またはサイクロスポリンＡを含む溶液１００μ２とを
９６ウエル平底マイクロテストプレートの各ウェル中で
混合し、３７’Ｃ，５％炭酸ガス条件下で７２時間培養
した。

培養終了後、各ウェルから細胞浮遊液５０μεを回収し
、０．７％アガロースゲルを含むＲＰＭｆ１６４０培地
３００μ１１４０％プロティンＡ結合羊赤血球を含む生
理食塩水２０μ！および生理食塩水で３００倍に希釈し
た抗マウスＩｇＧ抗血清２０μｌを試験管内で混合した
後、ローダツク・プレート（ファルコン社１０３４）上
で均一に伸展させた。室温に数分間放置しゲルが固まっ
た後に、３７°Ｃ１５％炭酸ガス条件下で約４時間イン
キュベートした。

無血清ＲＰＭＴ１６４０培地で４０倍に希釈したモルモ
ット補体を各プレートに３００ｕｌ加え、さらに２時間
インキエベートした後に、形成されたプラーク数を実体
顕微鏡下で算定した。

上述の方法により得られた結果を第９表に示す。

表中、ＳＤは標準誤差を表わす、また、抑制率（％）は
以下の式により算出した。

第９表に示した様に、本発明の免疫抑制物質は、濃度依
存的な１１，６応答抑制作用を示した。

実験例１０（マウスの抗羊赤血球抗体産生に対する抑制
効果） 雄性７〜８週齢Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを羊赤血
球（ＳＲＢＣ）で免疫した後、３または４日目に肺臓を
摘出し、プラーク形成細胞（ＰＦＣ）数を測定すること
により、抗羊赤血球抗体産生に対する抑制効果を以下の
様に検討した。

実験１： 免疫実施日の３日前から免疫当日まで本発明の免疫抑制
物質を２■／ｋｇの用量で４日間連続投与した後、５Ｒ
ＢＣ（１ｘｌＯ’個／マウス）で免疫し、その翌日から
さらに３日間連続投与を行なった。免疫後４日目（最終
投与の翌日）に肺臓を摘出し、直接プラーク法により抗
羊赤血球抗体産生細胞数を算定した。また、この際、マ
ウスの体重、胸腺ならびに肺臓の湿重量、肺臓細胞数お
よび血中尿素窒素（ＢＵＮ）値についても併せて測定し
た。

実験２： 免疫実施日の前日および翌日に本発明の免疫抑制物質を
２ｍｇ／ｋｇの用量で２回投与し、免疫（ＳＲＢＣ，ｌ
Ｘｌ０’／マウス）後３日目（最終投与の翌々日）に肺
臓を摘出し、直接プラーク法により抗羊赤血球抗体産生
細胞数を算定した。この際、マウスの体重、胸腺ならび
に肺臓の湿重量および肺臓細胞数についても併せて測定
した。また−比較のためにサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ
）を同じスケジュールで投与し、同様の測定を行なった
ー実験１および２で得られた結果を以下の表に示す。

（以下余白） 第１０表に示した様に、本発明の免疫抑制物質は、７日
間連続投与（実験ｌ）および免疫実施日前後の２回投与
（実験２）のいずれにおいても抗羊赤血球抗体産生に対
する抑制作用すなわち、単位肺臓細胞数（ＩＸＩＯ’個
）当りのＰＦＣ数ならびに全肺臓細胞数当りのＰＦＣ数
を減少させる効果を示した。また、２回投与における単
位肺臓細胞数当りのＰＦＣ数では強力であった。

本発明の免疫抑制物質は、実験２において脚線湿重量を
やや減少させた以外は、体重、肺臓湿重量、肺臓細胞数
およびＢＵＮ値に対してほとんど影響を及ぼさなかった
。一方、サイクロスポリンＡは、脚線湿重量に加えて、
ＩＪＩ臓湿重歩ならびに肺臓細胞数を減少させる作用を
示した。

実験例１１（マウス上９２９細胞に対する細胞毒性） マウス上９２９細胞に対する細胞毒性は以下のように検
討した。

Ｌ９２９細胞をｌＯ％熱不活化牛脂児血清を含むＦ１２
培地で１．５Ｘ１０’個／　ｍｌに調製し、９６穴マイ
クロテストプレートに１００μ２ずつ加え、３７°Ｃ５
％炭酸ガス条件下で２４時間培養した後に被検液１００
μ２を加え、さらに４８時間培養した。培養後、上清を
１００μｌ除去し、生細胞とインキエベートした際、ミ
トコンドリアのサクシネートデヒドロゲナーゼと反応し
、暗青色のホルマザン・プロダクトを生じることが報告
されている（Ｊ、　Ｉｗｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
、　６５巻、５５真、　１９８３年）。

３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，
５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ、５
ｍｇ／戚）、２０　ｕ　ｌを加え、３７°Ｃ１５％炭酸
ガス条件下で４時間反応させ、ホルマザンの結晶を形成
させた後、１０％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．Ｏ
１規定塩酸溶液１００μｉを結晶溶解のために加え、３
７°Ｃで一晩放置し反応させた。反応終了後、各ウェル
の上清１００μｌを吸光度測定用マイクロテストプレー
トに移し、マイクロテストプレート用分光光度計を用い
て６６０ｎｍを対照とした際の５５０ｎｍにおける吸光
度を測定した。以下の式により抑制率を算出し細胞毒性
の指標とした。

その結果を第１１表に示す。

第１１表 第１１表から明らかなように、本発明の免疫抑制物質の
マウス上９２９細胞に対する細胞毒性は、１０μｇ／ｄ
以下では全く認められなかった。

実験例１２（種々の培養腫瘍細胞株に対する細胞毒性の
検討） 種々のヒト由来の培養腫瘍細胞株に対する細胞毒性の検
討を以下のように行なった。

ヒト由来の培養腫瘍細胞株に５６２、ＭＯＬＴ４、Ｕ９
３７、ＨＬ６０、ＫＡＴＯＩ［［、ＫＢ、ＰＣ−６、Ｐ
Ｃ−１４およびＣＣＲＦ−ＣＥＭをそれぞれ２０％牛脂
児血清を含むＲＰＭＩＩ６４０培地にて２Ｘ１０’個／
ｄに調製した。この細胞浮遊液５０μｌをあらかじめ被
検液５０μｌを入れておいた９６六マイクロテストプレ
ートの各ウェルに加えた。３７℃、５％炭酸ガス条件下
で７２時間培養し、５■／ｄのＭＴＴ溶液２０ｔｔｌを
加え、さらに同条件下で４時間培養した。生成したホル
マザンの結晶を１０％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０
．０１’規定塩酸溶液１００μｌを加え、３７℃で一晩
放置し反応させた０反応終了後、各ウェルの上清の吸光
度を実験例４と同様に測定した。その結果を示した第１
２表から明らかなように、本発明の免疫抑制物質の種々
のヒト由来の培養腫瘍細胞株に対する細胞毒性は弱く、
５０％の抑制を与える濃度（ｒ　ｃｓａ）は１０ｔｔｇ
／ｄ以上であった。

〔以下余白〕

第１２表 （μｇ７ｍｌ＞　　　　　（％） Ｋ５６２　　　　　０　　　０．９９０　　−０．１　
　、０．８８６　　１０．６ １．０　　０．９０５　　　Ｂ、６ １０．０　　０．９２９　　６．２ １００．０　　０．５８３　　４１．ＩＭＯＬ７４　　
　　０　　　０．６１８　　−０．１　　０．５６０　
　９．４ １．０　　０．５５９　　９．５ １０．０　　０．４９９　　１９．３ １００．０　　０．０７４　　８８．０１１９３７　　
　　　０　　　０．６４２　　−０．１　　０．６１９
　　３．６ １．０　　０．５６７　　１１．７ １０．０　　０．４９７　　２２．６ １００．０　　０．１５６　　７５．７ＨＬ６０　　　
　　０　　　０．６３１　　−０．１　　０．４０２　
　３６．３ １．０　　０．３９０　　３８．２ １０．０　　０．３７７　　４０．３ １００．０　　０．１０１　　８４−．０ＫＡＴＯＩＩ
　　　　　Ｏ０，９６１−０，０１０，９９００ ０，１０，９７２０ １，００，９６１０ １０，００，８６９９，６ １００，００，０４１９５，７ （第１２′Ａのつづき） ＫＢ　　　　　　　　０　　　０．８８８　　−０．０
１　　０．８９８　　　０ ０．１　　　Ｇ、８６５　　　２．６ １．０　　０．８７９　　　１．０ ＰＣ−６００，２７２− ０，０１０，２４４１０，３ ０，１Ｇ、２４５　　　９．９ １．０　　０．２０９　　２３．２ １０．０　　　Ｇ、２０２　　２５．７１００．０　　
　Ｇ、０００　　１００．０ＰＣ−１４００，７８７− ０，０１０，８０１０ ０，１０，７７０２，２ １，００，７３２７，０ １０，００，７５１４，６ １００，００，０？４　　９０．６ ＣＣＲＦ−ＣＥＭ　　　　　０　　　０．７０Ｂ　　　
−０，０１０，６７８４，２ ０，１０，７０９０ １，００，６６０６，８ １０，００，６３７１０，０ １００，００，０１３９８，２ 〔発明の効果〕 上記実施例を含む明細書の記載から明らかなように、従
来免疫抑制物質を生産することが知られていなかったイ
ザリア属に属する菌から、すぐれた免疫抑制作用を存し
、しがも顕著な細胞毒性を発現しない物質、就中マイリ
オシンが生産された。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）イザリア属に属する免疫抑制物質生産菌を培養し
   、培養物から免疫抑制物質を採取することを特徴とする
   免疫抑制物質の製造法。
2. （２）免疫抑制物質がマイリオシンである請求項（１）
   記載の免疫抑制物質の製造法。
3. （３）免疫抑制物質生産菌がイザリア属シンクレイリー
   菌であることを特徴とする請求項（１）または（２）記
   載の免疫抑制物質の製造法。